KR20210124179A - 변형된 ctla4 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

일부 양태에서, 리간드에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드뿐만 아니라 이를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드가 제공된다.

Description

변형된 CTLA4 및 이의 사용 방법

상호 참조

본 출원은 2018년 11월 2일에 출원된 PCT 출원 제PCT/CN2018/113643호의 우선권을 주장하며, 이 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

본 개시의 배경

면역계는 유기체를 질환으로부터 보호하는 숙주 방어 시스템이다. 면역계의 기능장애는 자가면역 질환, 염증성 질환 및 암과 같은 광범위한 질환을 초래할 수 있다. 면역계의 적절한 기능을 조정하는 것을 도와 인체를 다양한 질환 및 병태로부터 보호할 수 있는 개선된 치료 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.

본 개시의 요약

특정 구현예에서, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 위치 18, 40, 68, 77, 86, 92, 107, 117, 118, 및 122로부터 선택된 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩타이드가 본원에 기재된다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 아바타셉트(abatacept)(서열번호: 2)와 비교하여 CD80 및/또는 CD86에 대한 향상된 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 위치 68에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 위치 40에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 위치 16, 24, 25, 27, 28, 29, 33, 41, 42, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 58, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 69, 70, 80, 85, 93, 94, 96, 및 105로부터 선택된 하나 이상의 위치에 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.

특정 구현예에서, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 S18R, S18N, A24S, G27DKA, G27DK, G27K, G27R, G27W, G27Y, G27E, G27KK, A29T, A40T, A49P, A50T, G68F, G68K, G68W, G68Y, G68H, G68D, G68E, L77V, D86N, C92S, C92Y, K93V, K93W, K93P, K93C, K93F, K93R, V94L, G105S, G107D, P117S, E118K, D122H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드가 본원에 기재된다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 아바타셉트(서열번호: 2)와 비교하여 CD80 및/또는 CD86에 대한 향상된 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G68F를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 A40T를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 K93M을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27H를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 P117S를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 A24E, G27H, G27D, A29S, R33W, D41G, T51N, K93M, K93N, 및 G105D로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 G27DKA/R33W, G27DKA/G68F, R33W/G68F, G27R/G68Y, G27H/G68F, G27DK/G68F, G27DK/G68D, G27DK/G68E, G27D/G68F, G27E/G68F, G27H/G68D, G27H/G68E, G27DKA/G68F, G27H/G68F, G27DK/G68F, G27DKA/G68F/D122H, G27DKA/G68F/A40T/D122H, G27DKA/G68F/A40T/P117S, G27DKA/G68F/L77V, G27DKA/G68F/C92S/K93M, G27DK/G68F/A49P/A50T, G27DK/G68F/A40T/D86N/G105S, G27KK/G68F, G27DKA/G68F/P117S, G27DKA/G68F/A49P/A50T, G27DK/G68F/A40T, G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S, G27DK/G68F/L77V, G27DK/G68F/C92S/K93M, G27DK/G68F/P117S, G27DKA/G68F/G105S, G27DKA/G68F/D86N, G27DK/G68F/D122H, G27DK/G68F/A40T/G105S, G27DK/G68F/G105S, G27DK/G68F/D86N, G27DKA/G68F/A40T, G27DKA/G68F/K93M, G27DK/G68F/K93M, 및 G27DKA/A40T/G68F/K93M으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/A40T/G68F/K93M의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/A40T의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/K93M의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/A40T/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27H/G68F의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/K93M의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/A40T의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/L77V의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/D122H의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 최대 1, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함한다.

특정 구현예에서, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 폴리펩타이드의 아미노산 치환은 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드가 본원에 기재된다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 제1 아미노산 서열에 융합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 아미노산 서열은 IgG Fc 영역을 코딩한다. 일부 구현예에서, IgG Fc 영역은 인간 IgG 분자로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 제2 아미노산 서열은 서열번호: 2의 아미노산 125-357에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 6의 아미노산 1-359에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커를 통해 함께 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 1 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 표 7로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 Q(서열번호: 82) 또는 GGGGS(서열번호: 54)를 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 아바타셉트(서열번호: 2)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 또는 적어도 300배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 아바타셉트(서열번호: 2)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 또는 적어도 300배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 벨라타셉트(belatacept)(서열번호: 3)의 친화성보다 CD80에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 벨라타셉트(서열번호: 3)의 친화성보다 CD86에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 벨라타셉트(서열번호: 3)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 벨라타셉트(서열번호: 3)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 CD80에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 CD86에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 5의 친화성보다 CD80에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 5의 친화성보다 CD86에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타낸다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드-약물 접합체가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드-약물 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 기재된다.

일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크(endotoxic shock), 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 전신성 소아 특발성 관절염(systemic onset juvenile idiopathic arthritis, JIA), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 천식, 골반 염증성 질환(pelvic inflammatory disease), 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병(Peyronie's Disease), 셀리악병(coeliac disease), 담낭 질환, 모소 질환(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 혈관염, 외과적 유착(surgical adhesion), 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염(lyme arthritis), 수막뇌염(meningoencephalitis), 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 자가면역 장애, 췌장염, 수술로 인한 외상, 이식편대숙주 질환, 이식 거부, 심장 질환, 골 흡수, 화상 환자, 심근 경색, 파제트병(Paget's disease), 골다공증, 패혈증, 간/폐 섬유증, 치주염, 저위산증(hypochlorhydia), 고형 종양(신세포암), 간암, 다발성 골수종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 신경암, 및 B-세포 악성종양(예컨대, 캐슬만병(Casteleman's disease), 특정 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 다발성 골수종)을 포함한다.

특정 구현예에서, 대상체의 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩타이드가 본원에 기재된다.

일부 구현예에서, 병태는 이식 거부, 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 전신성 소아 특발성 관절염(JIA), 염증성 장 질환(IBD), 전신 홍반 루푸스(SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 셀리악병, 담낭 질환, 모소 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 외과적 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 자가면역 장애, 췌장염, 수술로 인한 외상, 이식편대숙주 질환, 심장 질환, 골 흡수, 화상 환자, 심근 경색, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간/폐 섬유증, 치주염, 저위산증, 고형 종양(신세포암), 간암, 다발성 골수종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 신경암, 및 B-세포 악성종양(예컨대, 캐슬만병, 특정 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 다발성 골수종)을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드-약물 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, 용기 내에 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드-약물 접합체를 포함하는 키트가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, 대상체의 병태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드-약물 접합체의 용도가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 벡터를 포함하는 세포가 본원에 기재된다.

일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 또는 곤충 세포이다.

참조에 의한 포함

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

본 개시내용의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 개시내용의 특징 및 이점은 본 개시내용의 원리가 이용되는 예시적인 구현예, 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 예시적인 폴리펩타이드(CTLA4-Fc 돌연변이체)에 대한 경쟁적 결합 분석의 예시이다.
도 2a 및 2b는 각각 CD80 및 CD86에 대한 그의 상대적 결합 친화성을 입증하는, 예시적인 폴리펩타이드에 대한 경쟁적 결합 분석의 대표적인 결과를 보여준다.
도 3a 및 3b는 각각 CD80 및 CD86에 대한 그의 상대적 결합 친화성을 입증하는, 예시적인 폴리펩타이드에 대한 또 다른 경쟁적 결합 분석의 대표적인 결과를 보여준다.
도 4는 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 입증하는, 예시적인 폴리펩타이드에 대한 T 세포 증식 분석의 대표적인 결과를 보여준다.
도 5는 면역 자극시 T 세포로부터의 IL-2 분비에 대한 예시적인 폴리펩타이드의 억제 효과를 조사하기 위한 분석의 원리를 예시한다.
도 6a-6c는 면역 자극시 T 세포로부터의 IL-2 분비에 대한 억제 효과를 입증하는, 예시적인 폴리펩타이드에 대한 IL-2 분비 분석의 대표적인 결과를 보여준다.

본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 시스템 및 방법은 달리 나타내지 않는 한 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학, 마이크로어레이 및 시퀀싱 기술의 통상적인 기법 및 설명을 이용할 수 있으며, 이는 당업자의 기술에 속한다. 이러한 통상적인 기법은 중합체 어레이 합성, 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 및 결찰, 올리고뉴클레오타이드의 시퀀싱, 및 표지를 사용한 혼성화의 검출을 포함한다. 적합한 기법은 본원의 실시예를 참조하여 구체적으로 예시될 수 있다. 그러나, 물론 동등한 통상적인 절차도 사용될 수 있다. 이러한 통상적인 기법 및 설명은 문헌[Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, et al., Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); and Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012) (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger , Principles of Biochemistry, 6^th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2012); R.I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6^th Ed., Wiley-Blackwell (2010); and Berg et al., Biochemistry, 5^th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002)]과 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 확인될 수 있고, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본 조성물, 연구 도구 및 시스템 및 방법을 설명하기 전에, 본 개시내용은 설명된 특정 시스템 및 방법, 조성물, 표적 및 용도에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하는데, 이것은 물론 달라질 수 있기 때문이다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 양태만을 설명하기 위한 것이고 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것으로 이해되어야 한다.

명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수의 세포를 포함하고, 이의 혼합물을 포함한다.

용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계에 관례에 따르면 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 언급하지 않는 한, 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 가정되어야 한다.

용어 "폴리펩타이드," "올리고펩타이드," "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함)뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드가 상기 정의에 포함된다. 본원에 기재된 폴리펩타이드는 항체를 기반으로 하기 때문에, 폴리펩타이드는 단일 사슬 또는 결합된 사슬로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.

용어 "아미노산"은 자연, 비자연, 및 합성 아미노산을 지칭하며, 비제한적으로 D 또는 L 광학 이성질체 모두, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱(peptidomimetic)을 포함한다. 표준 단일 글자 또는 세 글자 코드가 아미노산을 지정하는 데 사용된다.

용어 "천연 L-아미노산"은 글리신(G), 프롤린(P), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 시스테인(C), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W), 히스티딘(H), 리신(K), 아르기닌(R), 글루타민(Q), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 세린(들), 및 트레오닌(T)의 L 광학 이성질체 형태를 의미한다.

서열에 적용되고 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "비자연발생"은 포유동물에서 발견되는 야생형 또는 자연발생 서열에 대한 대응물을 갖지 않거나, 이에 상보적이지 않거나, 또는 이와 높은 정도의 상동성을 갖거나, 또는 비자연발생 잔기(예컨대 뉴클레오타이드 유사체)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, 비자연발생 폴리펩타이드 또는 단편은 적합하게 정렬될 때 천연 서열과 비교하여 99%, 98%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% 이하 또는 심지어 낮은 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다.

용어 "친수성" 및 "소수성"은 물질이 물과 갖는 친화성의 정도를 지칭한다. 친수성 물질은 물에 대해 강한 친화성을 가져, 물에 용해되거나, 물과 혼합되거나 물에 의해 젖는 경향이 있는 반면, 소수성 물질은 물에 대한 친화성이 실질적으로 부족하여, 물을 밀어내고 물을 흡수하지 않는 경향이 있고 물에 용해되지 않거나 혼합되지 않거나 또는 물에 의해 젖지 않는 경향이 있다. 아미노산은 이들의 소수성에 기초하여 특성화될 수 있다. 많은 척도가 개발되었다. 예는 문헌[Levitt, M, et al., J Mol Biol(1976) 104:59]에 의해 개발된 척도이며, 이는 문헌[Hopp, TP, et al., Proc Natl Acad Sci U S A(1981) 78:3824]에 열거되어 있다. "친수성 아미노산"의 예는 아르기닌, 리신, 트레오닌, 알라닌, 아스파라긴, 및 글루타민이다. 친수성 아미노산 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 세린, 및 글리신이 특히 관심이 있다. "소수성 아미노산"의 예는 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 류신, 이소류신, 및 발린이다.

단백질에 적용될 때 "단편"은 치료적 및/또는 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유할 수 있거나 보유하지 않을 수 있는 천연 생물학적 활성 단백질의 절단된 형태이다. 단백질에 적용될 때 "변이체"는 생물학적 활성 단백질의 치료적 및/또는 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 천연 생물학적 활성 단백질에 대해 서열 상동성을 갖는 단백질이다. 예를 들어, 변이체 단백질은 참조 생물학적 활성 단백질과 비교하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 단백질 모이어티"는 예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발, 코딩 유전자의 합성, 삽입에 의해서와 같이 의도적으로, 또는 돌연변이를 통해 우연히 변형된 단백질을 포함한다.

폴리펩타이드의 맥락에서, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열 내의 서로 이웃하는 잔기가 폴리펩타이드의 1차 구조에서 인접하는 아미노에서 카르복실 말단 방향의 폴리펩타이드 내의 아미노산의 순서이다. "부분 서열"은 한쪽 또는 양쪽 방향으로 추가 잔기를 포함하는 것으로 알려진 폴리펩타이드의 부분의 선형 서열이다.

본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드," 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표지 성분과의 접합에 의해서와 같이 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형은, 예를 들어, "캡", 하나 이상의 자연발생 뉴클레오타이드를 유사체로 치환하는 것, 뉴클레오타이드간 변형, 예를 들어, 하전되지 않은 연결(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)을 갖는 것 및 하전된 연결(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예를 들어, 단백질(예컨대, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터컬레이터를 갖는 것(예컨대, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터(예컨대, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 연결(예컨대, 알파 아노머성 핵산 등)을 갖는 것, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 또한, 당에 일반적으로 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 활성화되어 추가의 뉴클레오타이드에 대한 추가의 연결을 제조할 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 그룹으로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태를 함유할 수 있으며, 이는 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보사이클릭 당 유사체, α-아노머성 당, 에피머성 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스(lyxose), 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스(sedoheptulose), 비고리형 유사체 및 무염기(abasic) 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 메틸 리보사이드를 포함한다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 대안적인 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기는, 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), (O)NR₂("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂("포름아세탈")로 대체되는 구현예를 포함하고, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 선택적으로 에테르(-O-) 연결, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜(araldyl)을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20 C)이다. 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하는 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.

"융합 파트너"는 본원에 기재된 CTLA4 변이체 서열에 융합된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 파트너는 N- 및/또는 C-말단에서 CTLA4 변이체 서열에 융합될 수 있다. 예시적인 융합 파트너는, 비제한적으로, 알부민, 트랜스페린, 아드넥틴(adnectin)(예컨대, 알부민-결합 또는 약동학 연장(PKE) 아드넥틴, Fc 도메인, 및 구조화되지 않은 폴리펩타이드, 예컨대 XTEN 및 PAS 폴리펩타이드(예컨대 아미노산 Pro, Ala, 및/또는 Ser으로 구성된 형태적으로 무질서한 폴리펩타이드 서열), 또는 전술한 어느 것의 단편을 포함한다. 융합 파트너는 비제한적으로, 정제, 제조가능성, 반감기 연장, 향상된 생물물리적 특성(예컨대 용해도 또는 안정성), 감소된 면역원성 또는 독성 등을 포함하는 임의의 목적을 위해 변형된 CTLA4 변이체 서열에 융합될 수 있다.

항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합된, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 구성된다. 각 사슬 내의 CDR은 FR에 의해 밀접하게 결합되어 있으며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 본원에 사용된 바와 같이, CDR은 어느 하나의 접근법에 의해 또는 두 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.

항체의 "불변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.

"링커 서열"은 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 융합된 N- 및 C-말단 모두를 갖는 아미노산 서열을 지칭한다. 링커 서열은 예컨대, 그의 말단이 CTLA4 변이체 서열 및 융합 파트너 서열에 융합된(어느 하나의 순서로) 융합 단백질에 존재할 수 있다. 예시적인 링커 서열은 0개의 아미노산(즉, 존재하는 링커 서열가 없음) 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 또는 100개의 아미노산 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 10, 5 내지 40, 5 내지 30, 5 내지 20, 또는 5 내지 10개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 5 내지 20개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 10 내지 20개의 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 특정 예시적인 링커 서열은 세린 및 글리신 잔기가 풍부할 수 있으나, 링커 서열은 이러한 서열에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

"숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(들)에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별적인 세포 또는 세포 배양을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래의 모 세포와 반드시 완전히 동일한 것은 아닐 수 있다(형태 또는 게놈 DNA 보체에서). 숙주 세포는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체내에서 형질감염된 세포를 포함한다.

용어 "Fc 영역"은 온전한 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 바와 같은 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 Fc 영역은, 일부 경우, 2개의 불변 도메인인 CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기 또는 Pro230으로부터 이의 카르복실-말단까지 이어지는 것으로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 번호는 Kabat(Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)에서와 같은 EU 지수의 번호이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인인 CH2 및 CH3을 포함한다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 여전히 보유한다. 다른 경우, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역의 효과기 기능을 갖지 않을 수 있다. 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예컨대 천연 서열 Fc 영역에 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 이와 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 또한, 비제한적으로, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 랫트를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포에서 관심있는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 바람직하게는 발현할 수 있는 구조체를 의미한다. 벡터의 예는, 비제한적으로, 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파아지 벡터, 양이온 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함한다.

용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 가져오기에 충분한 제제의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 대상체 및 치료되는 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 활성제의 유효량은 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 성분은 적어도 유효량, 또는 적어도 임의의 본원에 기재된 것과 같은 특정 목표 또는 목적과 관련된 것과 같은 원하는 결과를 생성하기에 효과적인 양을 갖는 것으로 본원에 기재될 수 있다.

용어 "유효량"은 또한 적절한 이미징 방법에 의한 검출을 위해 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 제제, 따라야 할 투여 요법, 다른 화합물과 조합하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 이미지화될 조직, 및 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약제학적 허용가능한 부형제"는 활성 성분과 조합될 때 성분이 생물학적 활성을 보유하게 하고 대상체의 면역계와 반응하지 않는 임의의 물질을 포함한다. 예는, 비제한적으로, 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대 인산 완충 식염수 용액, 물, 유화액, 예컨대 오일/물 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 인산 완충 식염수 또는 정상(0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화된다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000 참고).

개요

일 양태에서, 본 개시내용은 개선된 표적 결합 친화성을 갖는 CTLA4(세포독성 T-림프구-관련 항원 4) 변이체 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대, 변형된 CTLA4 융합 단백질, 이를 포함하는 조성물 및 키트, 및 이의 사용 방법을 제공한다.

T-세포 림프구는 특정 병원체에 대한 적응 반응(adaptive response)을 제공함으로써 세포 매개 면역에 중요한 역할을 한다. 일부 경우, T-헬퍼 세포 항원 반응은 T-세포 수용체가 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 MHC(주 조직적합성 복합체)에 결합된 항원에 결합함으로써 제1 신호전달 경로의 활성화를 필요로 하고, 한편, 또한 T-세포의 표면 상의 CD28 단백질이 APC의 표면 상의 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)에 결합함으로써, 공자극 신호를 생성할 수 있는 제2 신호전달 경로의 활성화를 필요로 한다. CD28이 APC의 표면 상의 CD80 및 CD86에 결합함으로써 매개된 공자극 경로는 T-세포 활성화 및 분화에 역할을 할 수 있으며, 또한 조직 이동 및 말초 내성 유도에 중요할 수 있다. 활성화된 T-세포는 또한 이들의 세포 표면 상에 CD80 및 CD86에 더 높은 친화성으로 결합할 수 있는 CD28의 유사체인 CTLA4를 발현할 수 있다. 일부 경우, CTLA4 발현은 CD80 및 CD86에의 경쟁적 결합, CD80/86-CD28 상호작용의 차단 및 T-세포 활성화의 종결을 초래한다. 일부 경우, 이러한 신호전달 경로는 항원에 대한 T-세포 반응의 크기뿐만 아니라 항원에 대한 하류 반응을 결정하고, 예컨대, CD80/CD86 및 CD28 및/또는 CTLA4 사이의 상호작용 중 하나 이상을 차단함으로써 하나 이상의 공자극 신호를 조절하는 제제는 조절되지 않은 면역 반응으로부터 비롯되는 장애를 치료하는 데 효과적일 수 있다.

일부 구현예에서, CD80 또는 CD86에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 CTLA4 변이체 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 CTLA4 변이체 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 개선된 면역억제 활성, 예컨대, T 세포 활성화에 대한 향상된 억제 효과를 갖는다. 특정 이론에 구속되기 바라지 않지만, 일부 구현예에서, CD80 또는 CD86에 대한 결합 친화성의 개선은 적어도 부분적으로 아미노산 서열 서열번호: 1을 갖는 천연 인간 CTLA4 단백질과 비교하여 하나 이상의 위치에서의 돌연변이의 결과이다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 서열은 천연 CTLA4 단백질(서열번호: 1)과 비교하여 CD80 또는 CD86에 대한 결합 도메인에서 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함하여, 잠재적인으로 그의 리간드 CD80 또는 CD86에 대한 결합 친화성에 영향을 미치는 구성 변화를 유도한다.

일부 구현예에서, 융합 파트너 서열에 융합된 CTLA4 변이체 서열을 포함하는 융합 단백질인 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 특정 이론에 구속되기 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 융합 파트너 서열의 선택은 천연 CTLA4 단백질(서열번호: 1) 또는 일부 다른 CTLA4 융합 단백질, 예컨대 아미노산 서열 서열번호: 2를 갖는 아바타셉트 또는 아미노산 서열 서열번호: 3을 갖는 벨라타셉트와 비교하여 대상 폴리펩타이드의 다양한 이점(예컨대, 안정성, 용해도, 전달가능성, 생체이용률, 또는 생산성)에 기여한다.

서열 동일성

2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 2개의 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열이 하기에 기재된 바와 같이 최대 대응을 위해 정렬될 때 동일하면 "동일"하다고 한다. 2개의 서열 사이의 비교는 전형적으로 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은 기본 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene 세트에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 몇 개의 정렬 체계를 구현한다: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730. 비제한적으로 BLAST 알고리즘을 포함하는 대안적인 정렬 프로그램이 이용가능하며, 이는 또한 예컨대 기본 파라미터를 사용하여 서열 동일성을 평가하는 데 사용될 수 있다.

바람직하게는, "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우(예컨대, 적어도 20개의 위치)에 걸쳐 2개의 최적 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭), 예컨대 20 퍼센트 이하(예컨대 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트)의 갭을 포함할 수 있다. 백분율은 전형적으로 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 매치된 위치의 수를 산출하고, 매치된 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.

본원에서 확인된 아미노산 서열에 대한 서열 동일성은 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 후, 제2의 참조 폴리펩타이드 서열 또는 이의 부분과 동일한 질의 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 퍼센트 동일성은 전체 정의된 폴리펩타이드 서열의 길이에 걸쳐 측정될 수 있거나, 또는 더 짧은 길이에 걸쳐, 예를 들어, 더 큰 정의된 폴리펩타이드 서열로부터 취한 단편, 예를 들어, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 70 또는 적어도 150개의 연속적인 잔기의 단편의 길이에 걸쳐 측정될 수 있다. 이러한 길이는 단지 예시적이며, 표, 도면 또는 서열 목록에서 본원에 나타낸 서열에 의해 뒷받침되는 임의의 단편 길이가 백분율 동일성이 측정될 수 있는 길이를 설명하는 데 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 퍼센트 동일성은 본원에 제공된 서열과 같은 언급된 참조 서열의 전장에 대해 결정된다. 예를 들어, 본 개시내용의 2개의 아미노산 서열(또는 이의 더 짧은 길이) 사이의 서열 비교는 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에 의해 온라인으로 제공되는 컴퓨터 프로그램 Blastp(단백질-단백질 BLAST)에 의해 수행될 수 있다. 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 백분율 아미노산 서열 동일성(이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 하기 식에 의해 계산된다:

상기 식에서, X는 서열　정렬 프로그램 BLAST에 의해 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 동일한 매치로서 스코어된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 A 또는 B 중 더 짧은 것에서 아미노산 잔기의 총 수이다.

CTLA4 변이체

본 개시내용은 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 이의 용도, 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 CTLA4의 변이체인 아미노산 서열(CTLA4 변이체 서열)을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본원에 제공된 바와 같은 CTLA4의 변이체는 천연 CTLA4 서열과 관련된 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. CTLA4의 변이체의 변이체는 천연 CTLA4 서열(서열번호: 1)의 적어도 일부와 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.

천연 CTLA4 단백질은 CD80 또는 CD86을 받고 이에 결합하는 3차원 구성을 형성할 수 있는 그의 세포외 도메인 또는 보다 구체적으로 그의 결합 도메인을 통해 CD80 및 CD86에 결합할 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 CTLA4의 변이체는 천연 CTLA4 단백질의 세포외 도메인 또는 결합 도메인와 관련된 그의 아미노산 서열의 적어도 일부를 통해 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. 일부 경우, CTLA4의 변이체는 천연 CTLA4 서열의 세포외 도메인의 일부 또는 전체, 예컨대, 서열번호: 1의 아미노산 36-161, 또는 아바타셉트(서열번호: 2)의 아미노산 1-124에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 일부 경우, CTLA4의 변이체는 천연 CTLA4 서열의 결합 도메인, 예컨대, 서열번호: 1의 아미노산 58-149, 또는 서열번호: 2의 아미노산 21-112에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.

천연 CTLA4 단백질의 세포외 도메인은 서열번호: 1에서 아미노산 36-161 또는 서열번호: 2에서 아미노산 1-124와 같은 서열을 포함할 수 있고, 천연 CTLA4 단백질의 결합 도메인은 아미노산 1 및 21 사이의 어느 곳에서 시작하고 아미노산 112 및 124 사이의 어느 곳에서 끝나는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 바와 같은 CTLA4의 변이체는 아미노산 1 및 8, 8 및 16, 또는 16 및 21 사이의 어느 곳에서 시작하고, 서열번호: 2의 아미노산 112 및 124 사이의 어느 곳에서 끝나는 아미노산 서열과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 바와 같은 CTLA4의 변이체는 아미노산 1 및 21 사이의 어느 곳에서 시작하고, 서열번호: 2의 아미노산 112 및 115, 115 및 118, 118 및 121, 또는 121 및 124 사이의 어느 곳에서 끝나는 아미노산 서열과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 바와 같은 CTLA4의 변이체는 아미노산 1 및 8, 8 및 16, 또는 16 및 21 사이의 어느 곳에서 시작하고, 서열번호: 2의 아미노산 112 및 115, 115 및 118, 118 및 121, 또는 121 및 124 사이의 어느 곳에서 끝나는 아미노산 서열과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노 서열을 포함할 수 있다.

본원에 제공된 바와 같이, CTLA4의 변이체는 천연 CTLA4 서열, 예컨대, 서열번호: 1의 적어도 일부, 예컨대, 천연 CTLA4 서열의 세포외 도메인 또는 결합 도메인, 예컨대, 서열번호: 1의 아미노산 36-161 또는 서열번호: 2의 아미노산 1-124, 또는 서열번호: 1의 아미노산 56-147 또는 서열번호: 2의 아미노산 21-112와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우, CTLA4의 변이체는 천연 CTLA4 서열의 적어도 일부, 예컨대, 서열번호: 1의 아미노산 36-161, 서열번호: 2의 아미노산 1-124, 서열번호: 1의 아미노산 56-147, 또는 서열번호: 2의 아미노산 21-112와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 돌연변이를 갖는다. 일부 경우, CTLA4의 변이체는 천연 CTLA4 서열의 적어도 일부, 예컨대, 서열번호: 1의 아미노산 36-161, 서열번호: 2의 아미노산 1-124, 서열번호: 1의 아미노산 56-147, 또는 서열번호: 2의 아미노산 21-112와 비교하여 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 돌연변이를 갖는다.

돌연변이

본원에 제공된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 대상 폴리펩타이드는 참조 서열, 예컨대, CTLA4 단백질의 적어도 일부에 대해 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 돌연변이는 아미노산 잔기에 대한 결실, 삽입 또는 부가, 또는 대체 또는 치환일 수 있다. "결실"은 하나 이상의 아미노산 잔기의 부재로 인한 아미노산 서열의 변화를 지칭한다. "삽입" 또는 "부가"는 참조 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가를 초래하는 아미노산 서열의 변화를 지칭한다. "대체" 또는 "치환"은 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산에 의해 대체하는 것을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락에서, 참조 서열, 예컨대, 천연 CTLA4 단백질의 적어도 일부에 대한 대상 폴리펩타이드의 돌연변이는 대상 폴리펩타이드 또는 이의 분획을 참조 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다.

돌연변이는 돌연변이 부위에 의해 식별될 수 있다. 돌연변이 부위는 결실, 부가, 또는 치환이 발생하는 참조 서열 상의 위치이다. 참조 서열 상의 아미노산 잔기는 N-말단에서 C-말단으로 번호가 매겨지며, 돌연변이 부위는 결실, 부가, 또는 치환이 발생하는 아미노산 잔기의 넘버링이다. 예를 들어, 참조 서열 상의 위치 26은 N-말단으로부터 시작하는 26번째 아미노산 잔기가 위치하는 위치이다.

본 개시내용의 맥락에서, 참조 서열 상의 특정 위치 및 특정 위치 바로 이후(또는 특정 위치에서의 아미노산 잔기가 마지막 아미노산 잔기인 경우 특정 위치 이후)의 위치 사이에 하나 이상의 아미노산의 부가는 특정 위치에서의 아미노산 잔기를 하나를 초과하는 아미노산 잔기로 치환하는 것으로서 고려된다. 예를 들어, 돌연변이체 아미노산 서열 XYYZ는 참조 아미노산 서열 XYZ와 비교하여 제2 위치에서의 Y의 YY로의 치환을 갖는 것으로 간주되며, X, Y, 및 Z는 각각 개별 아미노산 잔기를 나타낸다. 따라서, 본 개시내용의 맥락에서, 특정 위치에서의 하나의 돌연변이는 특정 위치에서의 하나의 아미노산 잔기의 결실, 또는 특정 위치에서의 아미노산 잔기의 또 다른 아미노산 잔기 또는 하나를 초과하는 아미노산 잔기로의 치환을 의미하는 것으로 의도된다.

참조 서열에 대한 돌연변이를 설명하기 위해, 1글자 아미노산 코드가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 대상 폴리펩타이드가 참조 서열에 대해 "G26I"로 기재될 수 있는 위치 26에서의 G에서 I로의 돌연변이를 포함한다고 하면, 참조 서열에 따르면 글리신(G) 잔기인 26번째 아미노산 잔기가 대상 폴리펩타이드 또는 이의 부분에서 알라닌 잔기에 의해 치환되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 맥락에서, 예를 들어, 대상 폴리펩타이드가 참조 서열에 대해 "G26del"로 기재될 수 있는 위치 26에서의 글리신(G) 잔기의 결실을 포함한다고 하면, 참조 서열에 따르면 글리신(G) 잔기인 26번째 아미노산 잔기가 대상 폴리펩타이드 또는 이의 부분에 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 맥락에서, 예를 들어, 대상 폴리펩타이드가 "G26_ins" 다음에 부가된 아미노산 잔기에 의해 기재될 수 있는 위치 26에서의 글리신(G) 잔기 이후의 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가를 포함한다고 하면, 열거된 하나 이상의 아미노산 잔기가 글리신(G)인 26번째 아미노산 잔기, 및 27번째 아미노산 사이에 부가되거나 또는 (26번째 아미노산 잔기가 참조 서열에 따르면 마지막 아미노산 잔기인 경우) 글리신(G)인 26번째 아미노산 잔기 후에 부가된다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 서열번호. 2의 아미노산 1-124에 대해 하나 이상의 돌연변이를 갖는 CTLA4 변이체 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드에서의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 위치 16, 18, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 40, 41, 42, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 68, 69, 70, 77, 80, 85, 86, 92, 93, 94, 96, 105, 106, 107, 122, 117, 118, 또는 이들의 임의의 조합과 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 위치 18, 24, 27, 29, 33, 40, 41, 49, 50, 51, 68, 77, 86, 92, 93, 94, 105, 107, 122, 117, 118, 또는 이들의 임의의 조합과 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 위치 18, 40, 68, 77, 86, 92, 107, 117, 118, 및 122와 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 임의의 유형의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 위치 16, 18, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 40, 41, 42, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 68, 69, 70, 77, 80, 85, 86, 92, 93, 94, 96, 105, 106, 107, 122, 117, 118, 또는 이들의 임의의 조합과 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 결실을 포함한다. 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 임의의 유형의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 위치 16, 18, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 40, 41, 42, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 68, 69, 70, 77, 80, 85, 86, 92, 93, 94, 96, 105, 106, 107, 122, 117, 118, 또는 이들의 임의의 조합과 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 임의의 유형의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 위치 18, 24, 27, 29, 33, 40, 41, 49, 50, 51, 68, 77, 86, 92, 93, 94, 105, 107, 122, 117, 118, 또는 이들의 임의의 조합과 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 임의의 유형의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 위치 18, 40, 68, 77, 86, 92, 107, 117, 118, 및 122와 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 임의의 하나 이상의 위치에 임의의 유형의 치환을 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 S18R, S18N, A24S, A24E, G27D, G27DK, G27DKA, G27E, G27H, G27K, G27KK, G27R, G27W, G27Y, A29S, A29T, A29H, A29Y, T30N, V32I, R33W, A40T, D41G, D41N, A49P, A50T, A50M, T51N, M53Y, M54K, N56D, L61E, S64P, I65S, G68D, G68E, G68F, G68H, G68K, G68W, G68Y, S70F, L77V, M85A, D86N, C92S, C92Y, K93C, K93N, K93F, K93M, K93P, K93R, K93V, K93W, K93Q, V94L, G105S, G105D, I106F, G107D, P117S, E118K, D122H, 또는 이의 임의의 적절한 조합과 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 S18R, S18N, A24S, G27DKA, G27DK, G27K, G27R, G27W, G27Y, G27E, G27KK, A29T, A40T, A49P, A50T, G68F, G68K, G68W, G68Y, G68H, G68D, G68E, L77V, D86N, C92S, C92Y, K93V, K93W, K93P, K93C, K93F, K93R, V94L, G105S, G107D, P117S, E118K, D122H, 또는 이의 임의의 적절한 조합과 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 기재된 바와 같은, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 임의의 하나 이상의 위치에 임의의 유형의 돌연변이를 가질 수 있고, 예를 들어, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 위치 27에서의 아미노산 G는 임의의 유형의 아미노산 또는 아미노산 잔기의 그룹, 예컨대, D, DK, DKA, E, H, K, KK, R, W, 또는 Y로 치환될 수 있거나, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 위치 93에서의 아미노산 K는 임의의 유형의 아미노산 또는 아미노산 잔기의 그룹, 예컨대, N, F, M, V, W, P, C, F, 또는 R로 치환될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 돌연변이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 표 5의 어느 하나, 예컨대, G27DKA/R33W, G27DKA/G68F, R33W/G68F, G27R/G68Y, G27H/G68F, G27DK/G68F, G27DK/G68D, G27DK/G68E, G27D/G68F, G27E/G68F, G27H/G68D, G27H/G68E, G27DKA/G68F, G27H/G68F, G27DK/G68F, G27DKA/G68F/D122H, G27DKA/G68F/A40T/D122H, G27DKA/G68F/A40T/P117S, G27DKA/G68F/L77V, G27DKA/G68F/C92S/K93M, G27DK/G68F/A49P/A50T, G27DK/G68F/A40T/D86N/G105S, G27KK/G68F, G27DKA/G68F/P117S, G27DKA/G68F/A49P/A50T, G27DK/G68F/A40T, G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S, G27DK/G68F/L77V, G27DK/G68F/C92S/K93M, G27DK/G68F/P117S, G27DKA/G68F/G105S, G27DKA/G68F/D86N, G27DK/G68F/D122H, G27DK/G68F/A40T/G105S, G27DK/G68F/G105S, G27DK/G68F/D86N, G27DKA/G68F/A40T, G27DKA/G68F/K93M, G27DK/G68F/K93M, 또는 G27DKA/A40T/G68F/K93M와 같이, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 돌연변이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/A40T/G68F/K93M의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/A40T의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/K93M의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/A40T/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27H/G68F의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/K93M의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/A40T의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/L77V의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/P117S의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/D122H의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드 내의 CTLA4 변이체 서열은 서열번호: 6의 아미노산 1-126에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

결합 친화성

상기 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 대상 폴리펩타이드는 CTLA4 결합 도메인을 포함하고 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합할 수 있다. 대상 폴리펩타이드는 전형적으로 CD80, Cd86, 또는 모두에 대해 높은 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, CD80은 인간 CD80이다. 일부 구현예에서, CD86은 인간 CD86이다.

용액에서 또는 어레이 상에 고정화된 CD80 또는 CD86에 대한 분자의 결합 친화성은 당업계에 공지된 검출 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 기술의 예는 경쟁적 결합 분석 및 샌드위치 분석과 같은 면역학적 기술; 공초점 스캐너, 공초점 현미경, 또는 CCD 기반 시스템 및 기술과 같은 기기를 사용한 형광 검출, 예컨대 형광, 형광 편광(FP), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 전반사 형광(total internal reflection fluorescence, TIRF), 형광 상관 분광학(fluorescence correlation spectroscopy FCS); 비색/분광 기술; 표면에 흡착된 물질의 질량 변화를 측정하는 표면 플라즈몬 공명(SPR); 통상적인 방사성 동위원소 결합 및 섬광 근접 분석(scintillation proximity assay, SPA)을 포함하는 방사성 동위원소를 사용하는 기술; 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectroscopy, MALDI) 및 MALDI-비행 시간(TOF) 질량 분광법과 같은 질량 분광법; 단백질 필름의 두께를 측정하는 광학 방법인 타원편광반사법(ellipsometry); 표면에 흡착되는 물질의 질량을 측정하는 매우 민감한 방법인 수정 진동자 저울(quartz crystal microbalance, QCM); 원자력 현미경(AFM), 주사력 현미경(SFM) 또는 주사 전자 현미경(SEM)과 같은 주사 프로브 현미경; 및 전기화학적, 임피던스, 음향, 마이크로파, 및 IR/라만 검출과 같은 기술을 포함한다. 예컨대, 문헌[Mere L, et al.,"Miniaturized FRET assays and microfluidics : key components for ultra-high-throughput screening," Drug Discovery Today 4(8):363-369 (1999), and references cited therein; Lakowicz J R, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1999), or Jain KK : Integrative Omics , Pharmacoproteomics , and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa , N.J .: Humana Press, 2007]을 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

본원에 제공된 일부 구현예에서, CD80 또는 CD86에 대한 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다. Biacore® 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템(GE Healthcare, Chicago IL)이 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 SPR 분석 시스템은, 비제한적으로, Biacore X100, Biacore T200, Biacore 3000 또는 Biacore 4000 기기, 및 상업적인 센서 칩 시리즈를 포함한다. Biacore 시스템의 전형적인 적용에서, 상호작용 동역학은 다양한 분석물 농도에 걸쳐 시간의 함수로서 상호작용을 모니터링한 다음, 전체 데이터 세트를 상호작용을 설명하는 수학적 모델에 피팅함으로써 분석된다. 결합 단계(샘플 주사 동안)는 결합 및 해리 과정 모두에 대한 정보를 함유하는 반면, 해리 단계(샘플 주사 후, 완충액 흐름이 해리된 분석물 분자를 제거하는 경우) 동안에는 해리만이 발생한다. 당업자는 제조사의 매뉴얼에 따라 결합 친화성 분석을 수행하기 위한 적절한 파라미터 및/또는 조건을 선택하거나 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성은 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성은 실온에서, 예컨대 약 22 내지 25℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성은 37℃ 이하의 온도에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다.

일 양태에서, 본 개시내용은 CD80, CD86, 또는 모두에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 아바타셉트, 예컨대, 서열번호: 2의 것보다 더 큰 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드는 아바타셉트(서열번호: 2)의 것보다 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2, 적어도 2.2, 적어도 2.4, 적어도 2.6, 적어도 2.8, 적어도 3, 적어도 3.5, 적어도 4, 적어도 4.5, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 또는 적어도 300배 큰 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다. 본 개시내용의 맥락에서, CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성은 동일한 실험 조건하에서 동일한 결합 분석에 의해 결정된 바와 같이, 예를 들어, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 2개의 상이한 분자 사이에서 비교된다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드는 서열번호: 2와 비교하여 CD80에 대해 개선된 결합 친화성을 갖지만, 서열번호: 2와 비교하여 CD86에 대해 상대적으로 유사하거나 더 낮은 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드는 서열번호: 2와 비교하여 CD86에 대해 개선된 결합 친화성을 갖지만, 서열번호: 2와 비교하여 CD80에 대해 상대적으로 유사하거나 더 낮은 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드는 서열번호: 2와 비교하여 CD80 및 CD86 모두에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 벨라타셉트, 예컨대, 서열번호: 3의 것보다 큰 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드는 벨라타셉트(서열번호: 3)의 것보다 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2, 적어도 2.2, 적어도 2.4, 적어도 2.6, 적어도 2.8, 적어도 3, 적어도 3.5, 적어도 4, 적어도 4.5, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 또는 적어도 100배 큰 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 4, 5, 또는 모두의 것보다 큰 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 서열번호: 4, 5, 또는 모두의 것보다 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2, 적어도 2.2, 적어도 2.4, 적어도 2.6, 적어도 2.8, 적어도 3, 적어도 3.5, 적어도 4, 적어도 4.5, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 또는 적어도 100배 큰 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 낮은 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 것보다 낮은 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 것보다 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2, 적어도 2.2, 적어도 2.4, 적어도 2.6, 적어도 2.8, 적어도 3, 적어도 3.5, 적어도 4, 적어도 4.5, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 또는 적어도 100배 큰 CD80, CD86, 또는 모두에 대한 결합 친화성을 갖는다.

CD80 또는 CD86에 대한 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성은 k_a, k_d 또는 K_D를 특징으로 할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "k_a"는 항원에 대한 폴리펩타이드의 결합 속도 상수를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "k_d"는 단백질-단백질 복합체로부터 폴리펩타이드의 해리 속도 상수를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "K_D"는 단백질-단백질 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, K_D는 2개의 동역학 속도 상수의 비율 k_d/k_a로서 정의된다. 평형 해리 상수가 작을수록 대상 폴리펩타이드 및 CD80 또는 CD86가 서로에 대해 더 강하게 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 적어도 10² M^-1s^-1, 적어도 5×10² M^-1s^-1, 적어도 10³ M^-1s^-1, 적어도 5×10³M^-1s^-1, 적어도 10⁴ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁴ M^-1s^-1, 적어도 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁵ M^-1s^-1, 적어도 10⁶ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁶ M^-1s^-1, 적어도 10⁷ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁷ M^-1s^-1, 적어도 10⁸ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁸ M^-1s^-1, 적어도 10⁹ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁹ M^-1s^-1의 k_a로 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위의 k_a로 CD80에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 10⁵ M^-1s^-1 및 10⁵ M^-1s^-1, 5×10⁵ M^-1s^-1 내지 1×10⁶ M^-1s^-1, 7.5×10⁵ M^-1s^-1 내지 2.5×10⁶ M^-1s^-1, 또는 1×10⁵ M^-1s^-1 내지 5×10⁶ M^-1s^-1의 k_a로 CD80에 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 적어도 10² M^-1s^-1, 적어도 5×10² M^-1s^-1, 적어도 10³ M^-1s^-1, 적어도 5×10³M^-1s^-1, 적어도 10⁴ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁴ M^-1s^-1, 적어도 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁵ M^-1s^-1, 적어도 10⁶ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁶ M^-1s^-1, 적어도 10⁷ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁷ M^-1s^-1, 적어도 10⁸ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁸ M^-1s^-1, 적어도 10⁹ M^-1s^-1, 적어도 5×10⁹ M^-1s^-1의 k_a로 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위의 k_a로 CD86에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 10⁵ M^-1s^-1 내지 10⁵ M^-1s^-1, 5×10⁵ M^-1s^-1 내지 1×10⁶ M^-1s^-1, 7.5×10⁵ M^-1s^-1 내지 2.5×10⁶ M^-1s^-1, 또는 1×10⁵ M^-1s^-1 내지 5×10⁶ M^-1s^-1의 k_a로 CD86에 결합한다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 2 s^-1 이하, 1.5 s^-1 이하, 1 s^-1 이하, 0.5 s^-1 이하, 0.1 s^-1 이하, 5×10^-2 s^-1 이하, 10^-2 s^-1 이하, 5×10^-3 s^-1 이하, 10^-3 s^-1 이하, 5×10^-4 s^-1 이하, 10^-4 s^-1 이하, 5×10^-5 s^-1 이하, 10^-5 s^-1 이하, 5×10^-6 s^-1 이하, 10^-6 s^-1 이하, 5×10^-7 s^-1 이하, 10^-7 s^-1 이하, 5×10^-8 s^-1 이하, 10^-8 s^-1 이하의 k_d로, 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위의 k_d 속도로 CD80에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 2 s^-1 이하, 1.5 s^-1 이하, 1 s^-1 이하, 0.5 s^-1 이하, 0.1 s^-1 이하, 5×10^-2 s^-1 이하, 10^-2 s^-1 이하, 5×10^-3 s^-1 이하, 10^-3 s^-1 이하, 5×10^-4 s^-1 이하, 10^-4 s^-1 이하, 5×10^-5 s^-1 이하, 10^-5 s^-1 이하, 5×10^-6 s^-1 이하, 10^-6 s^-1 이하, 5×10^-7 s^-1 이하, 10^-7 s^-1 이하, 5×10^-8 s^-1 이하, 10^-8 s^-1 이하의 k_d로, 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위의 k_d 속도로 CD86에 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 5×10^-6 M 이하, 10^-6 M 이하, 5×10^-7 M 이하, 10^-7 M 이하, 5×10^-8 M 이하, 10^-8 M 이하, 5×10^-9 M 이하, 10^-9 M 이하, 5×10^-10 M 이하, 10¹⁰ M 이하, 5×10^-11 M 이하, 10^-11 M 이하, 5×10^-12 M 이하, 10^-12 M 이하, 5×10^-13 M 이하, 10^-13M 이하, 5×10⁴⁴ M 이하, 10^-14 M 이하, 5×10^-15M 이하, 10^-15 M 이하의 K_D로, 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위의 K_D로 CD80에 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드는 5×10^-6 M 이하, 10^-6 M 이하, 5×10^-7 M 이하, 10^-7 M 이하, 5×10^-8 M 이하, 10^-8 M 이하, 5×10^-9 M 이하, 10^-9 M 이하, 5×10^-10 M 이하, 10¹⁰ M 이하, 5×10^-11 M 이하, 10^-11 M 이하, 5×10^-12 M 이하, 10^-12 M 이하, 5×10^-13 M 이하, 10^-13M 이하, 5×10⁴⁴ M 이하, 10^-14 M 이하, 5×10^-15M 이하, 10^-15 M 이하의 K_D로, 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위의 K_D로 CD86에 결합한다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드의 동역학 특성은 비교 분석에서 아바타셉트(서열번호: 2)와 비교하여 개선된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아바타셉트의 상응하는 k_a의 대략 1.1 내지 1000배 범위의 k_a 속도로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아바타셉트의 상응하는 k_a의 약 1.1, 약 1.2, 약 1.5, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 5, 약 7.5, 약 10, 약 20, 약 50, 약 100, 약 200, 약 500, 약 750, 또는 약 1000배인 k_a 속도로, 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위 내의 k_a 속도로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아바타셉트의 상응하는 k_a의 대략 0.0001 내지 0.99배 범위의 k_d 속도로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아바타셉트의 상응하는 k_a의 약 0.0001, 약 0.0002, 약 0.001, 약 0.002, 약 0.005, 약 0.01, 약 0.02, 약 0.05, 약 0.075, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.075, 약 0.75, 약 0.8, 약 0.9, 약 0.92, 약 0.94, 약 0.96, 약 0.98, 또는 약 0.99배인 k_d 속도로, 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위 내의 k_a 속도로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아바타셉트의 상응하는 K_D의 대략 0.0001 내지 0.99배 범위의 K_D 속도로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아바타셉트의 상응하는 K_D의 약 0.0001, 약 0.0002, 약 0.001, 약 0.002, 약 0.005, 약 0.01, 약 0.02, 약 0.05, 약 0.075, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.075, 약 0.75, 약 0.8, 약 0.9, 약 0.92, 약 0.94, 약 0.96, 약 0.98, 또는 약 0.99배인 k_d 속도로, 또는 이들 값 중 어느 2개 사이의 임의의 범위 내의 k_a 속도로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드의 결합은 pH 의존성을 갖는다. 일부 구현예에서, pH 의존성은 pH 7.4 및 pH 6.0에서 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합 친화성 사이의 비율로서 정의된다. pH 의존성은 pH 7.4로부터 pH 6.0까지의 결합 친화성의 감소 배수, 또는 pH 7.4로부터 pH 6.0까지의 결합 친화성의 증가 배수의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, pH 의존성은 pH 6.0에서의 K_D 값 및 pH 7.4에서의 K_D 값 사이의 비율로서 계산되며, pH 의존성, 즉, 비율은 pH 7.4로부터 pH 6.0까지의 친화성 감소의 배수를 나타낸다. 본원에 기재된 대상 폴리펩타이드의 pH 의존성이 1보다 크면, 폴리펩타이드가 pH 7.4에서의 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 그의 결합이 pH 6.0에서보다 높은 pH 의존적 방식으로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다는 것을 의미한다. 본원에 기재된 대상 폴리펩타이드의 pH 의존성이 1보다 낮으면, 폴리펩타이드가 pH 6.0에서의 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 그의 결합이 pH 7.4에서보다 높은 pH 의존적 방식으로 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 결합한다는 것을 의미한다. 중성 조건(예컨대, pH가 약 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5임) 하에서 결합을 유지하지만 산성 조건 하에서는 유의하게 감소하는 능력은 산성 조건(예컨대, 리소좀 내부, 예컨대, pH가 7.0 미만, 또는 약 6.5, 6.0, 5.5, 또는 5.0임)에서 대상 폴리펩타이드를 그의 결합 파트너(예컨대, CD80 또는 CD86)로부터 해리시킨다. 일부 구현예에서, 중성 조건 하에서 결합을 유지하지만 산성 조건 하에서는 유의하게 감소하는 능력은 대상 폴리펩타이드가 산성 조건 하에서 리소좀에 의한 분해를 피하게 하고 다시 중성 조건 하에서 그의 결합 파트너(예컨대, CD80 및 CD86)에 결합할 수 있는 혈장으로 되돌려 보낸다. 임의의 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 이러한 pH 의존적 결합 패턴(예컨대, 산성 조건보다 중성 조건 하에서 더 높은 결합 친화성)을 갖는 대상 폴리펩타이드는 pH 비의존적 방식으로 결합하는 다른 동일한 폴리펩타이드에 비해 항원 중화 및 제거의 측면에서 우수한 특성을 갖는다고 여겨진다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 대상 폴리펩타이드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100 이상과 같이 1보다 높은 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 결합 친화성의 pH 의존성을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 것보다 높은 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 결합 친화성의 pH 의존성을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 것보다 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80배 높은 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 결합 친화성의 pH 의존성을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 서열번호: 3의 것보다 높은 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 결합 친화성의 pH 의존성을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 서열번호: 3의 것보다 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50배 높은 CD80, CD86, 또는 둘 모두에 대한 결합 친화성의 pH 의존성을 갖는다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 CD80 또는 CD86에의 결합에 대해 다른 단백질에 대해 경쟁적 억제 효과를 나타낸다. CD80 또는 CD86에 대한 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성은 CD80 또는 CD86에 대한 결합 친화성을 갖는 다른 단백질에서 경쟁적 억제를 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 경쟁적 억제 분석은 참조 폴리펩타이드, 예컨대, 천연 CTLA4 단백질(서열번호: 1), 아바타셉트(서열번호: 2), 벨라타셉트(서열번호: 3), 서열번호: 4 또는 5, CD28 또는 이의 기능적 동등물, 또는 본원에 제공된 바와 같은 상이한 대상체 폴리펩타이드가 숙주 세포, 예컨대, 면역 세포, 예컨대, 라모스(Ramos) 세포(인간 버킷 림프종 세포)에서 발현되는 경우 수행될 수 있다. 일부 경우, 참조 폴리펩타이드는 정제되고 마이크로비드와 같은 고체 지지체에 부착된다. 이후, 검출가능한 표지로 태깅된, 예컨대, 바이오틴 또는 형광 태그와 접합된 CD80 또는 CD86 분자는 숙주 세포에 의해 발현되거나 고체 지지체에 부착된 참조 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션된다. 일부 예에서, 대상 폴리펩타이드는 대상 폴리펩타이드가 검출가능하게 표지된 CD80 또는 CD86 분자에의 결합에 대해 참조 폴리펩타이드와 경쟁할 수 있는 인큐베이션에 첨가된다. 이러한 경쟁은 숙주 세포의 표면에 남아 있거나 고체 지지체에 부착된 검출가능하게 표지된 CD80 또는 CD86 분자를 조사함으로써 측정될 수 있다. 측정은 CD80 또는 CD86 분자를 태깅하는 데 사용되는 검출가능한 표지에 따라 당업자에게 이용가능한 임의의 기술에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어, 형광 표지가 사용되는 경우, 유세포 분석법, 형광 이미징, 또는 형광 분광분석법이 사용될 수 있는 반면, 자기 또는 전기 전도성 표지가 각각 사용되는 경우 자기력 또는 전기 임피던스를 측정하는 다른 접근법이 사용될 수 있다. 이러한 경우, 참조 폴리펩타이드와 비교하여 CD80 또는 CD86에 대한 대상 폴리펩타이드의 상대적 결합 친화성은 세포 표면에 남아 있거나 고체 지지체에 부착된 CD80 또는 CD86 분자에 반비례한다. 다른 경우, 참조 폴리펩타이드와 비교하여 CD80 또는 CD86에 대한 대상 폴리펩타이드의 상대적 결합 친화성은 세포 표면에 남아 있거나 고체 지지체에 부착된 CD80 또는 CD86 분자에 비례하며, 여기서 시험될 대상 폴리펩타이드는 숙주 세포에 의해 발현되거나 고체 지지체에 부착되고, 참조 폴리펩타이드는 CD80 또는 CD86 분자에의 결합에 대해 경쟁하는 데 사용된다. 당업자에게 이용가능한 경쟁적 억제 분석의 다른 형식이 또한 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성을 조사하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,251,581호에 기재된 바와 같은 발광 산소 채널링(LOCI) 경쟁 분석 또는 이의 변형, 예컨대, AlphaLISA® 경쟁 분석이 대상 폴리펩타이드의 결합 친화성을 측정하는 데 적용될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 면역억제 활성을 나타낸다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드는 면역 세포의 활성화, 예컨대, 면역 세포 증식 또는 사이토카인, 예컨대, IL2의 분비를 억제할 수 있다.

비제한적으로 DNA 합성 세포 증식 분석, 대사 세포 증식 분석, 증식 마커를 검출하는 분석 및 ATP 농도를 측정하는 분석을 포함하는 상이한 유형의 분석이 세포의 증식을 평가하는 데 이용가능하다. DNA 합성 세포 증식 분석에서, 증식하는 세포의 DNA는 방사성이 되도록 표지되고, 표지는 세척되고, 필터에 부착된 다음, 섬광 계수기를 사용하여 측정될 수 있다. 대사 세포 증식 분석에서, MTT, XTT, MTS 및 WST와 같은 테트라졸륨 염이 사용될 수 있는데, 이는 대사 활성 세포에서 환원되어 포르마잔 염료를 형성하고 이후에 배지의 색상을 변화시킨다. 증식 마커를 검출하는 분석에서, 단일클론 항체가 Ki-67, PCNA, 토포이소머라제 IIB, 및 포스포-히스톤 H3과 같은 세포 증식 및/또는 세포 주기 조절을 위한 일반적인 마커를 표적화하는 데 사용될 수 있다. ATP 농도의 측정을 위해, 효소 루시퍼라제 및 그의 기질 루시페린을 사용하는 ATP의 생물발광 기반 검출이 사용될 수 있다.

CFSE(카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르) 세포 증식 분석은 림프구의 증식 및 T 세포의 증식에 대한 대상 폴리펩타이드의 효과를 측정하는 데 사용될 수 있다. CFSE는 림프구 분열을 모니터링하는 효과적이고 인기있는 수단이다. CFSE는 수명이 긴 세포내 분자를 형광 염료인 카르복시플루오레세인으로 공유적으로 표지할 수 있다. 따라서, CFSE 표지된 세포가 분열할 때, 그의 자손은 카르복시플루오레세인 태그된 분자의 수의 절반을 타고 나므로, 각각의 세포 분열은, 예를 들어, 유세포 분석법 또는 형광 이미징을 통해 세포 형광의 상응하는 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 경우, 일차 T 세포 또는 Jurkat 세포와 같은 불멸화된 세포주가 활성화시에 이러한 분석을 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 이용가능한 MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨) 또는 BrdU와 같은 다른 세포 증식 표지, 또는 무표지 세포 증식 계수와 같은 측정 기술이 또한 그의 면역억제 활성을 나타내는 T 세포 증식에 대한 대상 폴리펩타이드의 억제 효과를 조사하기 위해 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 적어도 천연 CTLA4 단백질(서열번호: 1), 아바타셉트(서열번호: 2), 벨라타셉트(서열번호: 3), 또는 서열번호: 4 또는 5만큼 효과적으로 T 세포의 증식을 억제한다. 추가의 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 적어도 아바타셉트(서열번호: 2) 또는 벨라타셉트(서열번호: 3)만큼 효과적으로 T 세포의 증식을 억제한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 대상 폴리펩타이드는 0.001-100 ug/mL, 0.01-100 ug/mL, 0.1-100 ug/mL, 1-100 ug/mL, 10-100 ug/mL, 0.01-1 ug/mL, 0.01-10 ug/mL 또는 0.1-10 ug/mL의 농도에서 T 세포의 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 억제한다.

T 세포의 또 다른 양태는 IL2와 같은 사이토카인의 생산 및 방출을 포함한다. 대상 폴리펩타이드의 면역억제 활성은 대상 폴리펩타이드의 존재하에 활성화된 T 세포로부터의 IL2 분비를 측정하는 분석에 의해 측정될 수 있다. IL2 분비는 당업계에서 임의의 이용가능한 기술, 예를 들어, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석)에 의해 측정될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포 증식 분석 또는 사이토카인 생산 분석에서, 대상 폴리펩타이드의 억제 효과는 일련의 상이한 농도의 대상 폴리펩타이드의 억제 효과를 시험함으로써 조사될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드의 IC₅₀은 이러한 분석에서 계산될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 천연 CTLA4 단백질(서열번호: 1), 아바타셉트(서열번호: 2), 벨라타셉트(서열번호: 3), 또는 서열번호: 4 또는 5의 IC₅₀의 약 0.0001 내지 10배 범위의 IC₅₀ 값으로, CD80 및/또는 CD86에 결합하고, T 세포 증식과 같은 세포 성장, 또는 IL2 생산과 같은 사이토카인 생산을 억제한다. 특정 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 천연 CTLA4 단백질(서열번호: 1), 아바타셉트(서열번호: 2), 벨라타셉트(서열번호: 3), 또는 서열번호: 4 또는 5의 IC₅₀의 약 0.0001 내지 0.0005배, 약 0.0005 내지 0.001배, 약 0.001 내지 0.002배, 약 0.002 내지 0.005배, 약 0.005 내지 0.0075배, 약 0.0075 내지 0.01배, 약 0.01 내지 0.02배, 약 0.02 내지 0.05배, 약 0.05 내지 0.075배, 약 0.075 내지 0.1배, 약 0.1 내지 0.2배, 약 0.2 내지 0.5배, 약 0.5 내지 0.75배, 약 0.75배 내지 1배, 약 1 내지 5배, 또는 약 5 내지 10배 범위의 IC₅₀ 값, 또는 전술한 값 중 어느 2개의 값의 범위 내의 IC₅₀ 값으로 CD80 및/또는 CD86에 결합하고, T 세포 증식과 같은 세포 성장, 또는 IL2 생산과 같은 사이토카인 생산을 억제한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 아바타셉트(서열번호: 2)의 IC₅₀의 약 0.001 내지 0.01배, 약 0.002 내지 0.0075배, 약 0.0025 내지 약 0.005배, 또는 약 0.003 내지 0.004배 범위의 IC₅₀ 값으로 T 세포 증식을 억제한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 벨라타셉트(서열번호: 3)의 IC₅₀의 약 0.075 내지 0.75배, 약 0.1 내지 0.5배, 또는 약 0.2 내지 약 0.3배의 범위의 IC₅₀ 값으로 T 세포 증식을 억제한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 아바타셉트(서열번호: 2)의 IC₅₀의 약 0.005 내지 0.05배, 약 0.0075 내지 0.025배, 또는 약 0.01 내지 약 0.015배 범위의 IC₅₀ 값으로 T 세포에 의한 IL2 분비를 억제한다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 벨라타셉트(서열번호: 3)의 IC₅₀의 약 0.075 내지 0.75배, 약 0.1 내지 0.5배, 또는 약 0.2 내지 약 0.3배 범위의 IC₅₀ 값으로 T 세포에 의한 IL2 분비를 억제한다.

융합 단백질 및 다른 변형

일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 CTLA4 변이체 서열 및 융합 파트너 서열을 포함하는 융합 단백질인 폴리펩타이드를 제공한다.

본원에 제공된 바와 같은 융합 파트너 서열은 비제한적으로, 반감기 연장, 단백질 정제 및/또는 제조의 촉진, 향상된 생물물리적 특성, 예컨대 증가된 용해도 또는 안정성, 및 감소된 면역원성 또는 독성을 포함하는 기능적 특성, 또는 임의의 다른 목적을 부여할 수 있다. 예를 들어, 대상 융합 단백질은 연장된 생체내 반감기를 나타내어, 치료 요법에서 덜 빈번한 투여(예컨대 주당 2회, 주당 1회, 또는 격주 1회 투여 등)를 촉진할 수 있다. 예시적인 대상 폴리펩타이드는 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민), PK 연장(PKE) 아드넥틴, XTEN, Fc 도메인, 또는 전술한 것 중 어느 것의 단편, 또는 전술한 것 중 어느 것의 조합과 같은 융합 파트너에 융합된 본원에 기재된 바와 같은 CTLA4 변이체 서열을 포함한다. 융합 단백질은, 선택적으로 링커 서열을 코딩하는 서열에 의해 분리된, 동일한 리딩 프레임에서 CTLA4 변이체 서열 및 융합 파트너 서열을 코딩하는 핵산을 발현함으로써 생산될 수 있다. 융합 단백질은 임의의 순서의 CTLA4 변이체 서열 및 융합 파트너 서열, 예컨대, CTLA4 변이체 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 하나 이상의 융합 파트너, 또는 CTLA4 변이체 서열의 N-말단 및 C-말단 모두에 연결된 하나 이상의 융합 파트너를 포함할 수 있다. 융합은 CTLA4 변이체 서열의 어느 하나의 말단(즉, N- 또는 C-말단)에 융합 파트너를 부착시킴으로써 형성될 수 있으며, 즉 융합 파트너-CTLA4 변이체 또는 CTLA4 변이체-융합 파트너 배열이다. 추가로, CTLA4 변이체 서열은, 선택적으로 어느 하나의 말단 또는 양쪽 말단에 링커와 함께, 양쪽 말단에서 하나 이상의 융합 파트너에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, CTLA4 변이체 서열은 면역글로불린 Fc 도메인("Fc 도메인"), 또는 이의 단편 또는 변이체, 예컨대 기능적 Fc 영역에 융합될 수 있다. 기능적 Fc 영역은 FcRn에 결합할 수 있지만, 효과기 기능은 보유하지 않는다. FcRn에 결합하는 Fc 영역 또는 이의 단편의 능력은 당업계에 공지된 표준 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 이러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 평가될 수 있다.

예시적인 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 서브클래스로부터 유래되지만, 다른 서브클래스(예컨대, IgG2, IgG3, 및 IgG4)가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드에서 사용될 수 있는 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인의 예시적인 서열은 표 6의 서열번호: 7 또는 서열번호: 2의 아미노산 131-357을 포함한다.

일부 구현예에서, 융합 단백질에 사용되는 Fc 영역은 Fc 분자의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 1-16(즉, DKTHTCPPCPAPELLG)에 걸친 코어 힌지 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 부분적으로 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 힌지 영역 내의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기로 인해 다량체성 구조(예컨대, 이량체)를 채택할 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 힌지 영역 내의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기는 세린으로 대체될 수 있으며, 예컨대 서열번호: 2의 아미노산 131-257이다. 다른 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 코어 힌지 서열의 측면에 있는 CH1 및 CH2 영역으로부터 유래된 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 힌지 서열은 GSTHTCPPCPAPELLG를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

일부 구현예에서, 힌지 서열은 바람직한 약동학, 생물물리적, 및/또는 생물학적 특성을 부여하는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 힌지 서열은 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS, EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS, EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS, DKTHTCPPCPAPELLGGPS, 및 DKTHTCPPCPAPELLGGSS를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 18에서의 잔기 P는 Fc 효과기 기능을 제거하기 위해 S로 대체될 수 있고; 이러한 대체는 서열 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS, EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS, 및 DKTHTCPPCPAPELLGGSS를 갖는 힌지에서 예시된다. 또 다른 구현예에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 1-2에서의 잔기 DK는 잠재적인 클립 부위를 제거하기 위해 GS로 대체될 수 있고; 이러한 대체는 서열 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS에서 예시된다. 또 다른 구현예에서, 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역(즉, 도메인 CH₁―CH₃)의 위치 103에서의 C는 경쇄의 부재하에 부적절한 시스테인 결합 형성을 방지하기 위해 S로 대체될 수 있고; 이러한 대체는 서열 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS, EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS, 및 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS에서 예시된다.

일부 구현예에서, Fc 도메인은 표 6으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 서열번호: 2의 아미노산 125-357에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. Fc 도메인의 C-말단 리신은 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 선택적 성분인 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 C-말단의 리신이 생략된 것을 제외하고 표 6으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 대상 폴리펩타이드는 서열번호: 6의 아미노산 1-359에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 알부민 결합 서열에 융합된 CTLA4 변이체 서열을 포함하는 대상 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 혈청 알부민에의 융합은 대상 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 반감기를 증가시킬 수 있다. 예시적인 알부민 결합 서열은, 비제한적으로, 스트렙토코커스 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인(예컨대, Makrides et al., J Pharmacol . Exp . Ther . 277:534-542(1996) 및 Sjolander et al., J, Immunol . Methods 201:115-123(1997)), 또는 예컨대, 문헌[Dennis, et al., J Biol . Chem . 277:35035-35043(2002)]에 기재된 것과 같은 알부민 결합 펩타이드를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 CTLA4 변이체 서열은 혈청 알부민(비제한적으로, 인간 혈청 알부민 포함)과 직접 융합된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 CTLA4 변이체 서열은 지방산을 이용하여 아실화된다. 일부 경우, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진한다. 예컨대, 문헌[Kurtzhals, et al., Biochem . J 312:725-731(1995)]을 참고한다. CTLA4 변이체 서열은 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 이의 일부를 포함하는 융합 단백질로서 생산될 수 있다. 이러한 융합 구조체는 CHO와 같은 진핵 숙주 세포에서, 또는 대장균(E. coli)과 같은 박테리아에서 CTLA4 변이체, 또는 이의 단편의 발현을 향상시키는 데 적합할 수 있다. 예시적인 HSA 부분은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,766,883호, 및 PCR 공개 WO 제97/24445호에 개시된 바와 같이 N-말단 폴리펩타이드(아미노산 1-369, 1-419, 및 아미노산 1로 시작하는 중간 길이)를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 HSA의 C-말단 및 N-말단 각각에 부착된, CTLA4 변이체, 또는 이의 단편을 갖는 HAS 단백질을 포함할 수 있다. 예시적인 HSA 구조체는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,876,969호에 개시되어 있다.

CTLA4 변이체 서열은 XTEN 분자와 융합될 수 있다. XTEN 분자는 구조화되지 않은 재조합 중합체, 구조화되지 않은 재조합 폴리펩타이드(URP)로도 지칭되고, 일반적으로 문헌[Schellenberger et al., Nat Biotechnol., 2009 December; 27(12): 1186-90, 미국 공개 제2012/0220011호, 미국 특허 제7,846,445호, 및 제WO/2012/162542호]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. CTLA4 변이체 서열의 반감기는 XTEN 분자의 구조를 변경함으로써, 예컨대, 그의 크기를 변경함으로써 달라질 수 있다. 예를 들어, XTEN 분자는 적어도 1, 2, 5, 10, 12, 15, 20, 또는 25시간 이상과 같은 1 내지 50시간의 범위와 같은 원하는 반감기를 달성하기 위해 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 아드넥틴, 예컨대 알부민 결합 또는 PKE 아드넥틴에 융합된 CTLA4 변이체 서열을 포함한다. 예시적인 아드넥틴은 미국 공개 제2011/0305663호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 아드넥틴은 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인을 기반으로 할 수 있으며, 혈청 알부민에 결합할 수 있다. 아드넥틴은 서열번호: 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열번호: 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열번호: 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프 중 하나 이상을 포함할 수 있거나, 또는 서열번호: 48, 49, 50, 51, 및 52-72로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하거나, 또는 미국 공개 제2011/0305663호의 서열번호 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20, 및 24-44에 각각 상응하는 서열번호: 48, 49, 50, 51, 또는 52-72과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.

특정 구현예에서, 융합 파트너 및 CTLA4 변이체는 링커 서열을 통해 융합된다. 예시적인 링커 서열은 표 7로부터 선택되는 서열, 또는 이의 조합을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 서열은 0(즉, 존재하는 링커 서열이 없음) 내지 100개 이상의 아미노산, 예컨대 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 및 up to 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 또는 11개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 링커 서열의 예시적인 비제한적인 길이는 1 내지 100개의 아미노산, 1 내지 40개의 아미노산, 1 내지 20개의 아미노산, 1 내지 10개의 아미노산, 또는 3 내지 5개의 아미노산 길이를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 대상 폴리펩타이드는 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 융합된다. 폴리펩타이드 또는 이의 단편은, 예를 들어, 폴리펩타이드의 생물학적(예컨대, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 폴리펩타이드를 페길화하기 위해, 폴리펩타이드는 전형적으로 하나 이상의 PEG 그룹이 폴리펩타이드에 부착되는 조건 하에 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응된다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같이, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 PEG의 임의의 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, EP 0 154 316(Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384(Ishikawa et al)에 개시된 것과 같은 단백질을 페길화하는 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체, 예컨대, PEG는 종래의 화학적 방법, 예컨대, 화학적 접합을 사용하여, N- 또는 C-말단에서 또는 내부 위치에서 본원에 기재된 대상 폴리펩타이드에 공유적으로 부착될 수 있다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, PEG 모이어티는, 일단 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드에 부착되면, 수용성, 용액에서의 높은 이동도, 낮은 독성 및 낮은 면역원성, 연장된 순환 수명, 증가된 안정성, 신체로부터 신속한 제거, 및 신체 내의 변경된 분포에 기여할 수 있다.

대상 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 다른 반감기 연장 기술은 비제한적으로, XTEN(Schellenberger et al., Nat. Biotechnol . 27:1186-1192, 2009) 및 Albu 태그(Trussel et al., Bioconjug Chem . 20:2286-2292, 2009)를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은, 비제한적으로, 다양한 기능적 목적을 위한 접합, 융합, 및 부착 화학과 같은 화학적 변형을 갖는 CTLA4 변이체 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

대상 폴리펩타이드의 면역학적 반응성을 변경하는 제제가 본원에 제공된 바와 같은 대상 폴리펩타이드를 변형하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드에 대해 낮은 면역원성을 갖는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시키는 제제가 변형에 사용된다. 면역학적 반응성을 감소시키는 제제는, 비제한적으로 항염증제 및 면역억제제를 포함한다. 항염증제는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID) 및 코르티코스테로이드를 포함한다. NSAID는 비제한적으로, 살리실레이트, 예컨대, 아세틸살리실산; 디플루니살(diflunisal), 살리실산, 및 살살레이트(salsalate); 프로피온산 유도체, 예컨대, 이부프로펜(ibuprofen); 나프록센(naproxen); 덱시부프로펜(dexibuprofen), 덱스케토프로펜(dexketoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 옥사프로진(oxaprozin), 페노프로펜(fenoprofen), 록소프로펜(loxoprofen), 및 케토프로펜(ketoprofen); 아세트산 유도체, 예컨대 인도메타신(indomethacin), 디클로페낙(diclofenac), 톨메틴(tolmetin), 아세클로페낙(aceclofenac), 술린닥(sulindac), 나부메톤(nabumetone), 에토돌락(etodolac), 및 케토로락(ketorolac); 에놀산 유도체, 예컨대 피록시캄(piroxicam), 로르녹시캄(lornoxicam), 멜록시캄(meloxicam), 이속시캄(isoxicam), 테녹시캄(tenoxicam), 페닐부타존(phenylbutazone), 및 드록시캄(droxicam); 안트라닐산 유도체, 예컨대 메페남산(mefenamic acid), 플루페남산(flufenamic acid), 메클로페남산(meclofenamic acid), 및 톨페남산(tolfenamic acid); 선택적 COX-2 억제제, 예컨대 셀레콕십(celecoxib), 루미라콕십(lumiracoxib), 로페콕십(rofecoxib), 에토리콕십(etoricoxib), 발데콕십(valdecoxib), 피로콕십(firocoxib), 및 파레콕십(parecoxib); 설폰아닐리드(sulfonanilide), 예컨대 니메술리드(nimesulide); 및 기타, 예컨대 클로닉신(clonixin), 및 리코펠론(licofelone)을 포함한다. 코르티코스테로이드는 비제한적으로, 코르티손(cortisone), 덱사메타손(dexamethasone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니손(prednisone), 및 프레드니솔론(prednisolone)을 포함한다. 면역억제제는 비제한적으로 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 설파살라진(sulfasalazine), 레플루노미드(leflunomide), 에타네르셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), D-페니실라민(D-penicillamine), 경구 금 화합물, 주사가능한 금 화합물(근육내 주사), 미노사이클린(minocycline), 나트륨 금 티오말레이트(sodium gold thiomalate), 아우라노핀(auranofin), D-페니실라민(D-penicillamine), 로벤자리트(lobenzarit), 부실라민(bucillamine), 악타리트(actarit), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미조리빈(mizoribine), 사이클로스포린(cyclosporine), 및 타크롤리무스(tacrolimus)를 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드에 대해 높은 면역원성을 갖는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드의 면역원성을 증가시키는 제제가 변형에 사용된다. 면역학적 반응성을 향상시키는 제제는, 비제한적으로, 박테리아 수퍼항원을 포함한다. 고체 지지체에 대한 결합을 촉진하는 제제는, 비제한적으로, 바이오틴 또는 아비딘을 포함한다. 면역원 담체는, 비제한적으로, 임의의 생리학적으로 허용가능한 완충액을 포함한다. 생물반응 변형제는 사이토카인, 특히 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨-2, 인터루킨-4, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 및 감마-인터페론을 포함한다.

다른 기능적 모이어티는 신호 펩타이드, 면역학적 반응성을 향상시키거나 감소시키는 제제, 고체 지지체에 대한 결합을 촉진하는 제제, 백신 담체, 생물반응 변형제, 상자성 표지 및 약물을 포함한다. 신호 펩타이드는 새로 합성된 단백질을 세포막, 일반적으로 진핵 세포 내의 소포체, 및 박테리아의 내부 막 또는 내부 및 외부막 모두를 통해 보내는 짧은 아미노산 서열이다. 신호 펩타이드는 전형적으로 폴리펩타이드의 N-말단 부분에 있고, 전형적으로 세포로부터 폴리펩타이드의 생합성 및 분비 사이에서 효소적으로 제거된다. 이러한 펩타이드는 합성된 분자의 분비를 허용하기 위해 대상 항체 또는 이의 단편에 혼입될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 화학적으로 기능적 모이어티에 접합된다. 전형적으로, 모이어티는 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지이다. 이러한 접합된 폴리펩타이드는, 예를 들어, 종양 부담의 정량화, 및 전이성 병소의 이미징 및 종양 이미징과 같은 검출 시스템에서 유용하다. 이러한 표지는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로, 방사성 동위원소, 효소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물 기질 보조인자 및 억제제를 포함한다. 이러한 표지의 사용을 설명하는 특허의 예의 경우, 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 참고한다. 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 대상 폴리펩타이드에 공유 결합되거나, 재조합으로 결합되거나, 항체, 단백질 A, 또는 바이오틴-아비딘 복합체와 같은 2차 시약을 통해 대상 폴리펩타이드에 접합될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 하나 이상의 약물 모이어티에 접합된다. 적합한 약물 모이어티는 면역억제제를 포함한다. 대상 폴리펩타이드에 접합될 수 있는 면역억제제의 비제한적인 예는 글루코코르티코이드, 세포정지제(cytostatic agent), 항체, 이뮤노필린(immunophilin), 스타틴 및 다른 제제, 예컨대 인터페론(예컨대, INF-β 및 INF-γ)에 작용하는 약물, 오피오이드, TNF 결합제(예컨대, 인플릭시맙(infliximab), 에타네르셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 쿠르쿠민(curcumin) 및 카테킨(catechin)), 미코페놀레이트(mycophenolate), IL-1 수용체 길항제, 및 다른 소분자 제제(예컨대, 핀골리모드(fingolimod), 미리오신(myriocin))을 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드는, 비제한적으로, 하이드로코르티손(hydrocortisone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니손(methylprednisone), 덱사메타손(dexamethasone), 베타메타손(betamethasone), 트리암시놀론(triamcinolone), 베클로메타손(beclometasone), 플루드로코르티손 아세테이트(fludrocortisone acetate), 데옥시코르티코스테론 아세테이트(deoxycorticosterone acetate), 및 알도스테론(aldosterone)을 포함한다. 예시적인 세포정지제는 비제한적으로 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 백금 화합물, 메토트렉세이트(methotrexate), 아자티오프린(azathioprine), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 피리미딘 유사체, 단백질 합성 억제제, 및 항생제, 예컨대 닥티노마이신(dactinomycin), 안트라사이클린(anthracycline), 미토마이신 C(mitomycin C), 블레오마이신(bleomycin) 및 미트라마이신(mithramycin)을 포함한다. 예시적인 면역억제 항체는, 비제한적으로, 항-CD20 항체, 항-IL2 수용체 항체(다클리주맙(daclizumab), 바실릭시맙(basiliximab)), 캄파트-1H(Campath-1H), 항-α_4β1 인테그린(integrin) 항체, 항-IL-15 항체, 항-IL-6 수용체 항체, 및 항-CD3 항체(muromonab)를 포함한다. 이뮤노필린에 작용하는 예시적인 제제는 비제한적으로 사이클로스포린(cyclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 및 시롤리무스(sirolimus)를 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 항염증제에 접합된다. 항염증제의 비제한적인 예는 비스테로이드성 항염증제, 예컨대 이부프로펜, 아스피린, 나프록센, 디플루니살, 케토프로펜, 나부메톤, 피록시캄, 디클로페낙, 인도메타신, 술린닥, 톨메틴, 에토돌락, 케토로락, 옥사프로진, 및 셀레콕십, 및 면역억제 활성도 갖는 글루코코르티코이드를 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 항신생물제에 접합된다. 비제한적인 예는 방사성 동위원소, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 예컨대 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 빈데신 설페이트(vindesine sulfate), 아드리아마이신(adriamycin), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 카르보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine, 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신 하이드로클로라이드(duanorubicin hydrochloride), 독소루비신 하이드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride), 에토포시드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 로무스틴(lomustine), 메클로로레타민 하이드로클로라이드(mechlororethamine hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 펜토스타틴(pentostatin), 피포브로만(pipobroman), 프로카르바제 하이드로클로라이드(procarbaze hydrochloride), 스트렙토조토신(streptozotocin), 탁솔(taxol), 티오구아닌(thioguanine), 및 우라실 머스타드(uracil mustard)이다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 독소, 예컨대, 면역독소에 접합된다. 다양한 면역독소가 대상 조성물에 사용될 수 있다. 적합한 면역독소는, 예를 들어, 문헌[Monoclonal Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, Thorpe et al. (1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190; Vitatta (1987) Science 238:1098-1104; and Winter and Milstein (1991) Nature 349:293-299]에서 발견될 수 있다. 적합한 독소는, 비제한적으로, 리신, 방사성 핵종, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소, 리신 A 사슬, 진균 독소, 예컨대 레스트릭토신(restrictocin) 및 포스포리파제 효소를 포함한다. 일반적으로, 문헌["Chimeric Toxins," Olsnes and Pihl, Pharmac. Ther. 15:355-381 (1981); and "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy," eds. Baldwin and Byers, pp. 159-179, 224-266, Academic Press (1985)]을 참고한다.

화학적으로 기능적인 모이어티는 예를 들어 대상 폴리펩타이드 및 기능적 모이어티를 코딩하는 융합 유전자를 생성함으로써 재조합으로 제조될 수 있다. 대안적으로, 대상 폴리펩타이드는 다양한 잘 확립된 화학적 절차 중 어느 것에 의해 모이어티에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 모이어티가 단백질인 경우, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(iminothiolane, IT), 이미도에스테르의 이기능적 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl(dimethyl adipimidate HCl)), 활성 에스테르(예컨대, 디석신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate)), 알데히드(예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 커플링제가 사용될 수 있다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다제 민감성 링커, 디메틸 링커, 또는 이황화 함유 링커(Chari et al. Cancer Research, 52: 127-131(1992))가 사용될 수 있다. 모이어티는 항체, 단백질 A, 또는 바이오틴-아비딘 복합체와 같은 2차 시약을 통해 공유 결합되거나 접합될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 대상 폴리펩타이드는 2개의 상이한 결합 도메인을 가질 수 있으므로 이중특이적이며, 하나는 CD80 또는 CD86에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인이고, 다른 하나는 상이한 분자에 결합할 수 있는 도메인이다. 다른 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 CD80 및 CD86 이외의 2개를 초과하는 상이한 분자에 특이적이다.

폴리펩타이드의 생산

일 양태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 본 개시내용의 다른 양태는 또한 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포가 또한 제공된다.

대상 폴리펩타이드는 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 클로닝하고, 클론을 적합한 벡터 내로 통합하고, 벡터를 숙주 세포 내로 형질도입함으로써 재조합 폴리펩타이드로서 생산될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 일부 경우, 대상 폴리펩타이드는 융합 단백질이고, 융합 파트너 서열을 코딩하는 핵산, 예컨대, 면역글로불린 불변 영역은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 원하는 융합 단백질을 코딩하는 생식계열 DNA 또는 cDNA의 증폭 및 변형에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 야생형 아바타셉트를 코딩하는 핵산은 일상적인 돌연변이유발 기술을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 대상 폴리펩타이드를 생성하기 위해 돌연변이유발을 위한 주형으로서 합성 및 사용될 수 있고; 대안적으로, 변이체를 코딩하는 핵산은 직접 합성될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드는 또 다른 단백질, 예컨대, 융합 파트너, 예컨대 항체 불변 영역 및/또는 가요성 링커 서열을 코딩하는 또 다른 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 CTLA4 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이 문맥에서 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인프레임에 남아 있도록 2개의 핵산이 결합되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 또한 변형될 수 있으며, 예를 들어, 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원하는 숙주 세포에서 대상 폴리펩타이드의 최적화된 발현을 달성하기 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 코돈 최적화 방법에서, 천연 코돈은 유전자의 참조 세트로부터의 가장 빈번한 코돈에 의해 치환되며, 각 아미노산에 대한 코돈 번역 비율은 높도록 설계된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드의 CTLA4 변이체 서열 및/또는 융합 파트너 서열에 적용될 수 있는 원하는 단백질의 발현을 위한 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 추가의 예시적인 방법은 문헌[Kanaya et al., Gene, 238:143-155(1999), Wang et al., Mol. Biol. Evol., 18(5):792-800(2001), 미국 특허 제5,795,737호, 미국 공개 제2008/0076161호 및 WO 제2008/000632호]에 기재되어 있다.

본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 예시된 폴리펩타이드의 기능적 등가물 및 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드을 포함한다. 기능적 등가물은 보존적 아미노산 치환을 갖는 폴리펩타이드, 융합을 포함하는 유사체, 및 돌연변이체일 수 있다.

원하는 경우, 재조합 폴리뉴클레오타이드는 유전자 생성물의 발현 및 정제의 검출을 용이하게 하는 이종 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 β-갈락토시다제, β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이들의 유도체와 같은 리포터 단백질을 코딩하는 것을 포함한다. 정제를 용이하게 하는 다른 이종 서열은 면역글로불린, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 및 말토스-결합 단백질(MBP)의 Myc, HA(인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 유래), His-6, FLAG, 또는 Fc 부분과 같은 에피토프를 코딩할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드는 상기 기재된 바와 같은 다양한 화학적으로 기능적인 모이어티에 접합될 수 있다. 일반적으로 사용되는 모이어티는 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 표지, 신호 펩타이드, 면역학적 반응성을 향상시키거나 감소시키는 제제, 고체 지지체에 대한 결합을 촉진하는 제제, 백신 담체, 생물반응 변형제, 상자성 표지 및 약물을 포함한다. 모이어티는 재조합으로 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 폴리뉴클레오타이드에 공유 결합될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드는 추가의 서열, 예컨대 동일한 전사 단위 내에 추가의 코딩 서열, 제어 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 폴리아데닐화 부위, 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하의 추가의 전사 단위, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 및 형질전환을 허용하는 서열을 포함할 수 있고, 임의의 이러한 구조체는 본원에 기재된 임의의 다양한 구현예에 따라 바람직할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 클로닝 방법, PCR, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 수득될 수 있다. 당업자는 본원에 제공된 서열 데이터를 사용하여 DNA 합성기를 사용하거나 상업적인 서비스로부터 주문함으로써 원하는 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다.

원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 이는 결국 복제, 증폭 및 발현을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다양한 벡터가 본원에 제공된다. 또한 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 발현 벡터의 선택가능한 라이브러리가 제공된다.

본 개시내용의 벡터는 일반적으로 클로닝 및 발현 벡터로 분류된다. 클로닝 벡터는 이들이 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 복제 사본을 수득하는 데 유용하거나, 또는 향후 회수를 위해 저장소에 폴리뉴클레오타이드를 보관하는 수단으로서 유용하다. 발현 벡터(및 이러한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포)는 이들이 함유하는 폴리뉴클레오타이드로부터 생산된 폴리펩타이드를 수득하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 융합 단백질이고, 발현 벡터는 이미 융합 파트너 서열, 예컨대, 항체 불변 영역 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, CTLA4 변이체 서열만을 포함하는 본 개시내용의 단백질을 대상 융합 단백질로 전환시키는 한 가지 접근법은 CTLA4 변이체-코딩 서열이 벡터 내의 Fc-코딩 서열에 작동가능하게 연결되도록 CTLA4 변이체 서열을 코딩하는 핵산을 이미 면역글로불린 Fc를 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입하는 것이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 CTLA4 단백질의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩할 수 있다. CTLA4 단백질을 코딩하는 핵산은 신호 펩타이드가 CTLA4 단백질-코딩 핵산의 아미노 말단에 인플레임(in-frame)으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 CTLA4 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 신호 펩타이드일 수 있다. 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 당업계에 공지된 임의의 벡터, 예컨대, 박테리아, 포유동물, 효모, 곤충 및 파아지 디스플레이 발현 시스템에 사용하기 위한 벡터를 포함한다.

적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 당업계에서 이용가능한 많은 수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가 복제하는 능력을 갖거나, 특정 제한 엔도뉴클레아제를 위한 단일 표적을 보유할 수 있거나, 마커 유전자를 가질 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예컨대, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, pUC18, mp18, mp19, 파아지 DNA(사상성 및 비사상성 파아지 DNA 포함), 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 다른 클로닝 벡터는 Clontech, BiORad, Stratagene, 및 Invitrogen과 같은 상업적인 공급업체로부터 이용가능하다.

대상 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 단백질 및 폴리펩타이드를 생산하기 위한 숙주 벡터 시스템을 수득하는 데 유용하다. 전형적으로, 이러한 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 대상 폴리펩타이드를 위한 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 파아지미드, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드 등을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 효모, 조류, 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 많은 발현 벡터가 이용가능하다. 발현 벡터의 한 가지 예는 전사가 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 프로모터/인핸서에 의해 구동되는 pcDNA3(Invitrogen, San Diego, Calif.)이다. 본원에 기재된 바와 같은 대상 폴리펩타이드를 발현하기 위한 특히 유용한 발현 벡터의 2가지 유형은 파아지 디스플레이 벡터 및 박테리아 디스플레이 벡터이다.

원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 원하는 특정 방식으로 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예컨대, 글리코실화) 및 가공(예컨대, 절단)은 대상 폴리펩타이드의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 일차 전사체, 글리코실화, 및 인산화의 적절한 가공을 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 비제한적으로 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NSO(임의의 면역글로불린 사슬을 내인성으로 생산하지 않는 쥣과 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함한다.

재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포주는 조작될 수 있다. 바이러스 복제 원점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택가능한 마커에 의해 제어된 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 농축된 배지에서 1-2일 동안 성장할 수 있고, 이후 선택적 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이들의 염색체 내로 안정적으로 통합하고 성장하여 결국 세포주 내로 클로닝되고 확장될 수 있는 중심을 형성하게 한다. 이 방법은 대상 폴리펩타이드를 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용될 수 있다.

대상 폴리펩타이드 분자가 재조합 발현에 의해 생산되면, 그것은 면역글로불린 분자의 정제를 위한 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피 후 특정 항원에 대한 친화성), 원심분리, 분별 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 대상 폴리펩타이드는 정제를 용이하게 하기 위해 본원에 제공되거나 당업계에 공지된 이종 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드는 상업적으로 이용가능한 특히 폴리-히스티딘 태그(0His-tag), FLAG-태그, 헤마글루티닌 태그(HA-tag) 또는 myc-태그를 재조합으로 부가하고 적합한 정제 방법을 이용함으로써 정제될 수 있다.

치료 방법

또 다른 양태에서, 병태, 질환 또는 장애, 예컨대, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암, 또는 이식 거부를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유동물에서 염증성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우, 염증성 장애는 다발성 경화증이다. 다른 경우, 염증성 장애는 자가면역 질환이다. 자가면역 질환의 예는 비제한적으로 급성 파종 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis, ADEM), 애디슨병(Addison's disease), 항인지질 항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome, APS), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 셀리악병, 크론병, 진성 당뇨병(유형 1), 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome, GBS), 하시모토병(Hashimoto's disease), 다발성 경화증, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 안구간대경련 근간대경련 증후군(opsoclonus myoclonus syndrome, OMS), 시신경염(optic neuritis), 오드 갑상선염(Ord's thyroiditis), 천포창(pemphigus), 다발관절염(polyarthritis), 원발성 쓸개관 간경화증(primary biliary cirrhosis), 건선, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환(IBD), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis, JIA), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 전신 홍반 루푸스(SLE), 천식(asthma), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 측두 동맥염(temporal arteritis)("거대 세포 동맥염"으로도 알려짐), 온난 자가면역 용혈 빈혈(warm autoimmune hemolytic anemia), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 전신성 탈모증(alopecia universalis), 샤가스병(Chagas' disease), 만성 피로 증후군, 자율신경장애(dysautonomia), 자궁내막증(endometriosis), 화농성 한선염(hidradenitis suppurativa), 간질성 방광염(interstitial cystitis), 신경근긴장증(neuromyotonia), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 백반증(vitiligo), 및 외음부 통증(vulvodynia)을 포함한다. 다른 장애는 골 흡수 장애 및 혈전증(thrombosis)을 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드는 활액낭염(bursitis), 루푸스(lupus), 급성 파종 뇌척수염(ADEM), 애디슨병, 항인지질 항체 증후군(APS), 재생불량성 빈혈, 자가면역 간염, 셀리악병, 크론병, 진성 당뇨병(유형 1), 굿파스튜어 증후군, 그레이브병, 길랑-바레 증후군(GBS), 하시모토병, 염증성 장 질환, 홍반 루프스, 중증 근무력증, 안구간대경련 근간대경련 증후군(OMS), 시신경염, 오드 갑상선염, 골관절염, 포도망막염, 천포창, 다발관절염, 원발성 쓸개관 간경화증, 라이터 증후군, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염, 온난 자가면역 용혈 빈혈, 베게너 육아종증, 전신성 탈모증, 샤가스병, 만성 피로 증후군, 자율신경장애, 자궁내막증, 화농성 한선염, 간질성 방광염, 신경근긴장증, 유육종증, 경피증, 궤양성 대장염, 백반증, 외음부 통증, 맹장염(appendicitis), 동맥염, 관절염, 안검염(blepharitis), 세기관지염(bronchiolitis), 기관지염(bronchitis), 자궁경부염(cervicitis), 담관염(cholangitis), 담낭염(cholecystitis), 융모양막염(chorioamnionitis), 대장염(colitis), 결막염(conjunctivitis), 방광염(cystitis), 누선염(dacryoadenitis), 피부근염, 심장내막염(endocarditis), 자궁내막염(endometritis), 장염(enteritis), 전장염(enterocolitis), 상과염(epicondylitis), 부고환염(epididymitis), 근막염(fasciitis), 섬유염(fibrositis), 위염(gastritis), 위장염(gastroenteritis), 치은염(gingivitis), 간염, 한선염(hidradenitis), 회장염(ileitis), 홍채염(iritis), 후두염(laryngitis), 유방염(mastitis), 수막염(meningitis), 척수염(myelitis), 심근염(myocarditis), 근염(myositis), 신염(nephritis), 배꼽염(omphalitis), 난소염(oophoritis), 고환염(orchitis), 골염(osteitis), 이염(otitis), 췌장염, 이하선염(parotitis), 심막염(pericarditis), 복막염, 인두염(pharyngitis), 흉막염(pleuritis), 정맥염(phlebitis), 폐렴(pneumonitis), 직장염(proctitis), 전립선염(prostatitis), 신우신염(pyelonephritis), 비염(rhinitis), 난관염(salpingitis), 부비강염(sinusitis), 구내염(stomatitis), 활막염(synovitis), 건염(tendonitis), 편도선염(tonsillitis), 포도막염, 질염(vaginitis), 혈관염, 또는 외음부염(vulvitis)의 치료에 사용된다.

추가의 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유동물에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우, 암은 간세포 암종이다. 다른 경우, 암은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 흉선, 뇌, 폐, 편평 세포, 피부, 눈, 망막아종(retinoblastoma), 안구내 흑색종(intraocular melanoma), 구강 및 구인두, 방광, 위, 위장, 췌장, 방광, 유방, 자궁경부, 머리, 목, 신장, 신장, 간, 난소, 전립선, 결장직장, 식도, 고환, 부인과, 갑상선, CNS, PNS, AIDS 관련(예컨대, 림프종 및 카포시 육종) 또는 바이러스 유도된 암이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드는 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 전신성 소아 특발성 관절염(JIA), 전신 홍반 루푸스(SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군, 캐슬만병(Castleman's disease), 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 셀리악병, 담낭 질환, 모소 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 외과적 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 자가면역 장애, 췌장염, 수술로 인한 외상, 이식편대숙주 질환, 이식 거부, 심장 질환, 골 흡수, 화상 환자, 심근 경색, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간/폐 섬유증, 치주염, 저위산증, 고형 종양(신세포암), 전립선 및 방광암, 췌장암, 신경암, 및 B-세포 악성종양(예컨대, 캐슬만병, 특정 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 다발성 골수종)의 치료에 사용된다.

일부 구현예에서, 치료될 대상체는 포유동물, 예컨대 인간이다. 다른 경우, 포유동물은 마우스, 랫트, 고양이, 개, 토끼, 돼지, 양, 말, 소, 염소, 게르빌루스 쥐, 햄스터, 기니어 피그, 원숭이 또는 임의의 다른 포유동물이다. 이러한 많은 포유동물은 염증성 질환, 고형 종양 및/또는 다른 암을 포함하는 특정 질환 또는 장애에 대한 전임상 모델로서 당업계에 알려진 대상체일 수 있다(예컨대, Talmadge et al., 2007 Am. J. Pathol. 170:793; Kerbel, 2003 Canc. Biol. Therap. 2(4 Suppl 1):S134; Man et al., 2007 Canc. Met. Rev. 26:737; Cespedes et al., 2006 Clin. TransL Oncol. 8:318).

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 제2 제제와 함께 포유동물에서 질환, 병태 또는 장애를 치료하기 위해 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드를 사용하는 방법을 제공한다. 제2 제제는 대상 폴리펩타이드와 함께, 전에, 또는 후에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 제2 제제는 면역억제제이다. 대상 폴리펩타이드와 조합하여 사용될 수 있는 면역억제제는 비제한적으로 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니손, 덱사메타손, 베타메타손, 트리암시놀론, 베클로메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론 아세테이트, 알도스테론, 사이클로포스파미드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 피리미딘 유사체, 단백질 합성 억제제, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, 라파마이신, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 미코페놀산, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린, 미코페놀레이트 모페틸(MMF), 항-흉선세포 글로불린, 항-CD20 항체 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-IL2 수용체 항체(다클리주맙, 바실릭시맙) 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 캄파트-1H, 항-α_4β1 인테그린 항체 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-IL-15 항체 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-IL-6 수용체 항체 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD3 항체(muromonab) 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-MHC 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD2 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD4 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD11a/CD 18 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD7 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD27 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD80 및/또는 항-CD86 항체(예컨대, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 등), 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD40 항체(예컨대, ATCC HB-9110), 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD45 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD58 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD137 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-ICOS 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-CD150 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-OX40 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 항-4-1BB 항체, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편, 및 저분자량 부착 길항제, 예컨대 LFA-1 길항제, 셀렉틴 길항제 및 VLA-4 길항제를 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 다른 면역조절 화합물, 예컨대, 비제한적으로, 가용성 gp39(CD40 리간드(CD40L), CD154, T-BAM, TRAP로도 알려짐), 가용성 CD29, 가용성 CD40, 가용성 CD80(예컨대, ATCC 68627), 가용성 CD86, 가용성 CD28(예컨대, 68628), 가용성 CD56, 가용성 Thy-1, 가용성 CD3, 가용성 TCR, 가용성 VLA-4, 가용성 VCAM-1, 가용성 LECAM-1, 가용성 ELAM-1, 가용성 CD44, gp39와 반응하는 항체(예컨대, ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 및 ATCC HB-12056), CD28과 반응하는 항체(예컨대, ATCC HB-11944 또는 Martin et al.(J. Clin. Immun. 4(1):18-22, 1980에 의해 기재된 바와 같은 mAb 9.3), LFA-1과 반응하는 항체(예컨대, ATCC HB-9579 및 ATCC TIB-213), LFA-2와 반응하는 항체, IL-12와 반응하는 항체, IFN-γ와 반응하는 항체, CD48과 반응하는 항체, 임의의 ICAM과 반응하는 항체(예컨대, ICAM-1(ATCC CRL-2252), ICAM-2 및 ICAM-3), CTLA4와 반응하는 항체(예컨대, ATCC HB-304), Thy-1과 반응하는 항체, CD56과 반응하는 항체, CD29와 반응하는 항체, TCR과 반응하는 항체, VLA-4와 반응하는 항체, VCAM-1과 반응하는 항체, LECAM-1과 반응하는 항체, ELAM-1과 반응하는 항체, CD44와 반응하는 항체와 조합하여 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 제2 제제는 항바이러스제이다. 항바이러스제는 비제한적으로 텔라프레비르(telaprevir), 보세프레비르(boceprevir), 세미프레비르(semiprevir), 소포스부비르(sofosbuvir), 다클라스타비르(daclastavir), 아수나프레비르(asunaprevir), 라미부딘(lamivudine), 아데포비르(adefovir), 엔테카비르(entecavir), 테노포비르(tenofovir), 텔비부딘(telbivudine), 인터페론 알파 및 페길화된 인터페론 알파를 포함한다. 다른 구현예에서, 제2 제제는 본원에 기재된 염증성 병태의 증상을 경감시키는 작용을 하는 제제이다. 항염증제는 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID) 및 코르티코스테로이드를 포함한다. NSAID는 비제한적으로, 살리실레이트, 예컨대 아세틸살리실산; 디플루니살, 살리실산, 및 살살레이트; 프로피온산 유도체, 예컨대 이부프로펜; 나프록센; 덱시부프로펜, 덱스케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진, 페노프로펜, 록소프로펜, 및 케토프로펜; 아세트산 유도체, 예컨대 인도메타신, 디클로페낙, 톨메틴, 아세클로페낙, 술린닥, 나부메톤, 에토돌락, 및 케토로락; 에놀산 유도체, 예컨대 피록시캄, 로르녹시캄, 멜록시캄, 이속시캄, 테녹시캄, 페닐부타존, 및 드록시캄; 안트라닐산 유도체, 예컨대 메페남산, 플루페남산, 메클로페남산, 및 톨페남산; 선택적 COX-2 억제제, 예컨대 셀레콕십, 루미라콕십, 로페콕십, 에토리콕십, 발데콕십, 피로콕십, 및 파레콕십; 설폰아닐리드, 예컨대 니메술리드; 및 기타, 예컨대 클로닉신, 및 리코펠론을 포함한다. 코르티코스테로이드는 비제한적으로, 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 및 프레드니솔론을 포함한다.

추가 구현예에서, 제2 제제는 항암제(예컨대 화학치료제)이다. 화학치료제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사산물, 인터컬레이팅 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항-호르몬, 혈관형성 억제제, 및 항안드로겐으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 화학치료제, 세포독성제, 및 비펩타이드 소분자의 비제한적인 예는 Gleevec®(Imatinib Mesylate), Velcade®(bortezomib), Casodex(bicalutamide), Iressa®(gefitinib), 및 아드리아마이신(Adriamycin)뿐만 아니라 다수의 화학치료제를 포함한다. 화학치료제의 비제한적인 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN^TM); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan); 아지리딘(aziridine), 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸아멜라민(methylamelamine), 예컨대 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드(triethylenethiophosphaoramide) 및 트리메틸롤 멜라민(trimethylol melamine); 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 펜네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard); 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 님무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신(actinomycin), 안트라마이신(anthramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼리케아마이신(calicheamicin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 카소덱스™(Casodex™), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 푸로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데놉테린(denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine), 안드로겐(androgen), 예컨대 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스탄올(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone); 항부신제(anti-adrenal), 예컨대 아미노글루테티미드(aminoglutethimide) 미토탄(mitotane), 트리로스탄(trilostane); 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지퀀(diaziquone); 엘포미틴(elfomithine); 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨 니트레이트(gallium nitrate); 하이드록시우레아(hydroxyurea); 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide); 프로카르바진(procarbazine); PSK.R™^.; 라족산(razoxane); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지퀀(triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민(2,2',2''-trichlorotriethylamine); 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside)("Ara-C"); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide); 티오테파(thiotepa); 탁산(taxane), 예컨대 파클리탁셀(paclitaxel)(TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(docetaxel)(TAXOTERE™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 레티노산(retinoic acid); 에스페라미신(esperamicin); 카페시타빈(capecitabine); 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 예를 들어 타목시펜,(NolvadexTM), 락록시펜(raloxifene), 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜(4-hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY 117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene, Fareston); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 류프롤라이드(leuprolide), 및 고세렐린(goserelin); 클로람부실(chlorambucil); 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌(6-thioguanine); 머캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin); 빈블라스틴(vinblastine); 백금; 에토포시드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미토마이신 C(mitomycin C); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(navelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); 캄포테신-11(camptothecin-11, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO)을 포함하는 항에스트로겐과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제가 적합한 화학치료 세포 컨디셔너가 또한 포함된다. 원하는 경우, 대상 폴리펩타이드는 일반적으로 처방되는 항암 약물, 예컨대 헤르셉틴®(Herceptin®), 아바스틴®(Avastin®), 에르비툭스®(Erbitux®), 리툭산®(Rituxan®), 탁솔®(Taxol®), 아리미덱스®(Arimidex®), 탁소테레®(Taxotere®), ABVD, AVICINE, 아바고보맙(Abagovomab), 아크리딘 카르복사미드(Acridine carboxamide), 아데카투무맙(Adecatumumab), 17-N-알릴아미노-17-데메톡시젤다나마이신(17-N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin), 알파라딘(Alpharadin), 알보시딥(Alvocidib), 3-아미노피리딘-2-카르복스알데히드 티오세미카르바존(3-Aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone), 아모나피드(Amonafide), 안트라센디온(Anthracenedione), 항-CD22 면역독소, 항신생물, 항종양원성 허브, 아파지퀀(Apaziquone), 아티프리모드(Atiprimod), 아자티오프린(Azathioprine), 벨로테칸(Belotecan), 벤다무스틴(Bendamustine), BIBW 2992, 비리코다르(Biricodar), 브로스탈리신(Brostallicin), 브리오스타틴(Bryostatin), 부티오닌 설폭시민(Buthionine sulfoximine), CBV(chemotherapy), 칼리쿨린(Calyculin), 세포-주기 비특이적 항신생물 제제, 디클로로아세트산, 디스코데르몰리드(Discodermolide), 엘사미트루신(Elsamitrucin), 에노시타빈(Enocitabine), 에포틸론(Epothilone), 에리불린(Eribulin), 에베로리무스(Everolimus), 엑사테칸(Exatecan), 엑시술린드(Exisulind), 페루지놀(Ferruginol), 포로데신(Forodesine), 포스페스트롤(Fosfestrol), ICE 화학치료 요법, IT-101, 이멕손(Imexon), 이미퀴모드(Imiquimod), 인돌로카르바졸(Indolocarbazole), 이로풀벤(Irofulven), 라니퀴다르(Laniquidar), 라로탁셀(Larotaxel), 레날리도미드(Lenalidomide), 루칸트론(Lucanthone), 루르토테칸(Lurtotecan), 마포스파미드(Mafosfamide), 미토졸로미드(Mitozolomide), 나폭시딘(Nafoxidine), 네다플라틴(Nedaplatin), 올라파립(Olaparib), 오르타탁셀(Ortataxel), PAC-1, 포포(Pawpaw), 픽산트론(Pixantrone), 프로테아좀 억제제(Proteasome inhibitor), 레베카마이신(Rebeccamycin), 레시퀴모드(Resiquimod), 루비테칸(Rubitecan), SN-38, 살리노스포라미드 A(Salinosporamide A), 사파시타빈(Sapacitabine), 스탠포드 V(Stanford V), 스와인소닌(Swainsonine), 탈라포르핀(Talaporfin), 타리퀴다르(Tariquidar), 테가푸르-우라실(Tegafur-uracil), 테모다르(Temodar), 테세탁셀(Tesetaxel), 트리플라틴 테트라니트레이트(Triplatin tetranitrate), 트리스(2-클로로에틸)아민(Tris(2-chloroethyl)amine), 트록사시타빈(Troxacitabine), 우라무스틴(Uramustine), 바디메잔(Vadimezan), 빈플루닌(Vinflunine), ZD6126, 및 조수퀴다르(Zosuquidar)와 조합하여 사용될 수 있다.

구체적 용량은 선택된 특정 폴리펩타이드, 따라야 할 투여 요법, 다른 제제와 조합하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여될 조직, 및 운반되는 신체 전달 시스템에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 치료 주기 과정 동안 평균 주당 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 70 mg의 범위 내로 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드는 주당 약 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55 mg의 범위 내로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 주당 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55 mg의 범위 내로 대상체에게 투여된다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 치료 주기 과정 동안 평균 일당 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 mg 초과의 양으로 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드는 치료 주기의 과정 동안 평균 일당 약 6 내지 10 mg, 약 6.5 내지 9.5 mg, 약 6.5 내지 8.5 mg, 약 6.5 내지 8 mg, 또는 약 7 내지 9 mg의 양으로 대상체에게 투여된다.

일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 일당 약 0.01 mg/kg-50 mg/kg의 범위 이내, 예컨대 일당 약 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 또는 50 mg/kg, 또는 약 이의 미만 또는 약 이의 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 주당 약 0.1 mg/kg-400 mg/kg의 범위 이내, 예컨대 주당 약 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 또는 400 mg/kg, 또는 약 이의 미만 또는 약 이의 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 월당 약 0.4 mg/kg-1500 mg/kg의 범위 이내, 예컨대 월당 약 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 또는 1000 mg/kg, 또는 약 이의 미만 또는 약 이의 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 주당 약 0.1 mg/m²-200 mg/m²의 범위 이내, 예컨대 주당 약 1 mg/m², 5 mg/m², 10 mg/m², 15 mg/m², 20 mg/m², 25 mg/m², 30 mg/m², 35 mg/m², 40 mg/m², 45 mg/m², 50 mg/m², 55 mg/m², 60 mg/m², 65 mg/m², 70 mg/m², 75 mg/m², 100 mg/m², 125 mg/m², 150 mg/m², 175 mg/m², 또는 200 mg/m², 또는 약 이의 미만 또는 약 이의 초과로 대상체에게 투여된다. 표적 용량은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 표적 용량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30개 이상, 또는 이의 초과의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 주당 약 1 mg/kg의 용량은 주의 과정 동안 매주 약 1 mg/kg, 2주마다 투여되는 약 2 mg/kg, 또는 4주마다 투여되는 약 4 mg/kg의 용량으로 매주 전달될 수 있다. 투여 일정은 본원에 기재된 임의의 투여 일정을 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 임의의 요법에 따라 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리펩타이드는 약 0.1 mg/m²-500 mg/m²의 범위, 예컨대 약 1 mg/m², 5 mg/m², 10 mg/m²,15 mg/m², 20 mg/m², 25 mg/m², 30 mg/m², 35 mg/m², 40 mg/m², 45 mg/m², 50 mg/m², 55 mg/m², 60 mg/m², 65 mg/m², 70 mg/m², 75 mg/m², 100 mg/m², 130 mg/m², 135 mg/m², 155 mg/m², 175 mg/m², 200 mg/m², 225 mg/m², 250 mg/m², 300 mg/m², 350 mg/m², 400 mg/m², 420 mg/m², 450 mg/m², 또는 500 mg/m², 또는 약 이의 미만 또는 약 이의 초과로 대상체에게 투여된다.

대상 폴리펩타이드의 용량은 약, 적어도 약, 또는 최대 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000 mg 또는 mg/kg, 또는 그 안에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. mg/kg의 투여량은 대상체의 총 체중의 kg당 대상 폴리펩타이드의 mg 양을 지칭하는 것으로 고려된다. 환자에게 다중 용량이 제공되는 경우, 용량은 양이 다양할 수 있거나 동일할 수 있는 것으로 고려된다.

약제학적 조성물

또 다른 양태에서, 대상 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제, 예컨대 비제한적으로 불활성 고체 희석제 및 충전제, 희석제, 멸균 수용액 및 다양한 유기 용매, 침투 향상제, 가용화제 및 보조제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)).

대상 약제학적 조성물은, 예를 들어, 정제, 캡슐, 환제, 분말, 지속 방출 제제, 용액, 현탁액으로서 경구 투여에 적합한 형태, 멸균 용액, 현탁액 또는 유화액으로서 비경구 주사에 적합한 형태, 연고 또는 크림으로서 국소 투여에 적합한 형태, 또는 좌제로서 직장 투여를 위한 적합한 형태일 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 대상 폴리펩타이드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형 물품, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT^™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 일부 지속 방출 제제는 몇 주 내지 몇 개월, 또는 심지어 최대 몇 년 동안 분자를 방출할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 약제학적 조성물은 적어도 몇 주 동안, 예컨대 적어도 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 본원에 기재된 바와 같은 대상 폴리펩타이드를 방출한다. 추가 구현예에서, 대상 약제학적 조성물은 몇 개월 동안, 예컨대 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 동안 본원에 기재된 바와 같은 대상 폴리펩타이드를 방출한다.

약제학적 조성물은 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 활성 성분으로서 대상 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있고, 통상적인 약제학적 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 그것은 다른 의약 또는 약제학적 제제, 담체, 보조제 등을 포함할 수 있다.

예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액 중의 활성 폴리펩타이드 및/또는 PEG 변형된 폴리펩타이드의 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 이러한 투여 형태는 원하는 경우 히스티딘 및/또는 포스페이트와 같은 염을 이용하여 적합하게 완충될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 대상 폴리펩타이드 및 주사에 적합한 약제학적 부형제를 함유하는 주사용 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물에서의 예시적인 성분 및 제제의 양은 본원에 기재된 바와 같다.

본 개시내용의 조성물이 주사에 의한 투여를 위해 혼입될 수 있는 형태는 참깨 오일, 옥수수 오일, 면실유, 또는 땅콩 오일뿐만 아니라 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로스, 또는 멸균 수용액, 및 유사한 약제학적 비히클을 갖는, 수성 또는 유성 현탁액, 또는 유화액을 포함한다.

식염수 중의 수용액이 주사에 사용될 수 있다. 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등(및 적합한 이의 혼합물), 사이클로덱스트린 유도체, 및 식물성 오일이 또한 사용될 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 분산액의 경우 원하는 입자 크기를 유지하기 위해 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써 그리고 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편을 원하는 양으로 상기 열거된 바와 같은 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 특정 바람직한 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이는 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편, 및 경구 투여에 적합한 약제학적 부형제를 함유하는 경구 투여용 약제학적 조성물을 제공한다.

일부 구현예에서, (i) 유효량의 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편; 선택적으로 (ii) 유효량의 제2 제제; 및 (iii) 경구 투여에 적합한 약제학적 부형제를 함유하는 경구 투여를 위한 고체 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 (iv) 유효량의 제3 제제를 추가로 함유한다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 섭취에 적합한 액체 약제학적 조성물이다. 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 별개의 투여 형태, 예컨대 각각 분말로서 또는 과립으로서 미리 정해진 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 카세제(cachet), 또는 정제, 또는 액체 또는 에어로졸 스프레이, 용액, 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 현탁액, 수중유 유화액, 또는 유중수 액체 유화액으로서 제공될 수 있다. 이러한 투여 형태는 임의의 약학 방법에 의해 제조될 수 있으며, 전형적으로 활성 성분을 하나 이상의 필요한 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 혼합한 다음, 필요한 경우 생성물을 원하는 형태로 성형함으로써 제조된다.

본 개시내용은 활성 성분을 포함하는 무수 약제학적 조성물 및 투여 형태를 추가로 포함하는데, 물이 일부 폴리펩타이드의 분해를 촉진할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 물은 시간 경과에 따른 제제의 반감기 또는 안정성과 같은 특징을 결정하기 위해 장기 보관을 자극하는 수단으로서 약제학적 분야에서 첨가된다(예컨대, 5%). 무수 약제학적 조성물 및 투여 형태는 무수 또는 낮은 수분 함유 성분 및 낮은 수분 또는 낮은 습도 조건을 사용하여 제조될 수 있다. 락토스를 함유하는 약제학적 조성물 및 투여 형태는 제조, 포장, 및/또는 보관 동안 수분 및/또는 습도와의 실질적인 접촉이 예상되는 경우 무수로 제조될 수 있다. 무수 약제학적 조성물은 그의 무수 성질이 유지되도록 제조 및 보관될 수 있다. 따라서, 무수 조성물은 적합한 제제 키트에 포함될 수 있도록 물에 대한 노출을 방지하는 것으로 알려진 물질을 사용하여 포장될 수 있다. 적합한 포장의 예는, 비제한적으로, 밀봉된 호일, 플라스틱 등, 단위 용량 용기, 블리스터 팩, 및 스트립 팩을 포함한다.

본 개시내용의 대상 폴리펩타이드는 통상적인 약제학적 배합 기술에 따라 약제학적 담체와 밀접히 혼합되어 조합될 수 있다. 담체는 투여하기 원하는 제제 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 경구 투여 형태를 위한 조성물을 제조할 때, 경구 액체 제제(예컨대, 현탁액, 용액, 및 엘릭시르) 또는 에어로졸의 경우 예를 들어 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제 등과 같은 담체; 또는 락토스의 사용을 이용하지 않는 일부 구현예에서 경구 고체 제제의 경우 전분, 당, 미세결정 셀룰로오스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 및 붕해제와 같은 담체로서, 임의의 일반적인 약제학적 매질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 담체는 고체 경구 제제와 함께 분말, 캡슐, 및 정제를 포함한다. 원하는 경우, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다.

약제학적 조성물 및 투여 형태에 사용하기에 적합한 결합제는, 비제한적으로, 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 기타 전분, 젤라틴, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 알긴산 나트륨, 알긴산, 다른 알기네이트, 분말화된 트라가칸트, 구아 검, 셀룰로오스 및 그의 유도체(예컨대, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스), 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 전호화된 전분, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 및 이의 혼합물을 포함한다.

약제학적 조성물 및 투여 형태에 사용하기 위한 적합한 충전제의 예는, 비제한적으로, 탈크, 탄산 칼슘(예컨대, 과립 또는 분말), 미세결정 셀룰로오스, 분말화된 셀룰로오스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 전호화된 전분, 및 이의 혼합물을 포함한다.

수성 환경에 노출될 때 붕해되는 정제를 제공하기 위해 붕해제가 조성물에 사용될 수 있다. 너무 많은 붕해제는 병에서 붕해될 수 있는 정제를 생성할 수 있다. 너무 적은 붕해제는 봉해가 일어나기에 불충분할 수 있으며, 따라서 투여 형태로부터 활성 성분(들)의 방출 속도 및 정도를 변경할 수 있다. 따라서, 활성 성분(들)의 방출을 불리하게 변경하기에 너무 적거나 너무 많지 않은 충분한 양의 붕해제가 투여 형태를 형성하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 붕해제의 양은 제제의 유형 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에게 쉽게 인식될 수 있다. 약 0.5 내지 약 15 중량 퍼센트의 붕해제, 또는 약 1 내지 약 5 중량 퍼센트의 붕해제가 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 약제학적 조성물 및 투여 형태를 형성하는 데 사용될 수 있는 붕해제는, 비제한적으로, 한천-한천, 알긴산, 탄산 칼슘, 미세결정 셀룰로오스, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨(polacrilin potassium), 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 기타 전분, 전호화된 전분, 기타 전분, 점토, 기타 알긴, 다른 셀룰로오스, 검 또는 이의 혼합물을 포함한다.

약제학적 조성물 및 투여 형태를 형성하는 데 사용될 수 있는 윤활제는, 비제한적으로, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 경 미네랄 오일, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 설페이트, 탈크, 수소화된 식물성 오일(예컨대, 땅콩 오일, 면실유, 해바라기 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일, 및 대두 오일), 아연 스테아레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레이트, 한천, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 추가의 윤활제는, 예를 들어, 실로이드 실리카 겔(syloid silica gel), 합성 실리카의 응고된 에어로졸, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 윤활제는 선택적으로 약제학적 조성물의 약 1 중량 퍼센트 미만의 양으로 첨가될 수 있다.

수성 현탁액 및/또는 엘릭시르가 경구 투여에 필요한 경우, 그 안의 활성 성분은 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 이의 다양한 조합과 같은 희석제와 함께, 다양한 감미제 또는 향미제, 착색제 또는 염료 및, 원하는 경우 유화제 및/또는 현탁화제와 조합될 수 있다.

정제는 코팅되지 않거나 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시켜 장기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공하기 위해 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다. 경구용 제제는 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.

약제학적 조성물 및 투여 형태를 형성하기 위해 사용될 수 있는 계면활성제는, 비제한적으로, 친수성 계면활성제, 친유성 계면활성제, 및 이의 혼합물을 포함한다. 즉, 친수성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있거나, 친유성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있거나, 또는 적어도 하나의 친수성 계면활성제 및 적어도 하나의 친유성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있다.

더 낮은 HLB 값을 갖는 계면활성제는 더 친유성이거나 소수성이고, 오일에서 더 큰 용해도를 갖는 반면, 더 높은 HLB 값을 갖는 계면활성제는 더 친수성이고, 수용액에서 더 큰 용해도를 갖는다. 친수성 계면활성제는 일반적으로 약 10을 초과하는 HLB 값을 갖는 화합물뿐만 아니라 HLB 척도가 일반적으로 적용되지 않는 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성 이온 화합물인 것으로 간주된다. 유사하게, 친유성(즉, 소수성) 계면활성제는 약 10 이하의 HLB 값을 갖는 화합물이다. 그러나, 계면활성제의 HLB 값은 산업적, 약제학적 및 화장용 유화액의 제제화를 가능하게 하기 위해 일반적으로 사용되는 단지 대략적인 지침이다.

친수성 계면활성제는 이온성 또는 비이온성일 수 있다. 적합한 이온성 계면활성제는, 비제한적으로, 알킬암모늄 염; 푸시드산 염; 아미노산, 올리고펩타이드, 및 폴리펩타이드의 지방산 유도체; 아미노산, 올리고펩타이드, 및 폴리펩타이드의 글리세라이드 유도체; 레시틴 및 수소화된 레시틴; 리소레시틴 및 수소화된 리소레시틴; 인지질 및 이의 유도체; 리소인지질 및 이의 유도체; 카르니틴 지방산 에스테르 염; 알킬설페이트의 염; 지방산 염; 나트륨 도쿠세이트; 아실 락틸레이트; 모노- 및 디-글리세라이드의 모노- 및 디-아세틸화된 타르타르산 에스테르; 석시닐화된 모노- 및 디-글리세라이드; 모노- 및 디-글리세라이드의 시트르산 에스테르; 및 이의 혼합물을 포함한다.

전술한 그룹 내에서, 이온성 계면활성제는, 예로서: 레시틴, 리소레시틴, 인지질, 리소인지질 및 이의 유도체; 카르니틴 지방산 에스테르 염; 알킬설페이트의 염; 지방산 염; 나트륨 도쿠세이트; 아실 락틸레이트; 모노- 및 디-글리세라이드의 모노- 및 디-아세틸화된 타르타르산 에스테르; 석시닐화된 모노- 및 디-글리세라이드; 모노- 및 디-글리세라이드의 시트르산 에스테르; 및 이의 혼합물을 포함한다.

이온성 계면활성제는 레시틴, 리소레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티드산, 리소포스파티딜세린, PEG-포스파티딜에탄올아민, PVP-포스파티딜에탄올아민, 지방산의 락틸릭 에스테르, 스테아로일-2-락틸레이트, 스테아로일 락틸레이트, 석시닐화된 모노글리세라이드, 모노/디글리세라이드의 모노/디아세틸화된 타르타르산 에스테르, 모노/디글리세라이드의 시트르산 에스테르, 콜리사르코신(cholylsarcosine), 카프로에이트, 카프릴레이트, 카프레이트, 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올레에이트, 리신올레에이트, 리놀레에이트, 리놀레네이트, 스테아레이트, 라우릴 설페이트, 테트라세실 설페이트, 도쿠세이트, 라우로일 카르니틴, 팔미토일 카르니틴, 미리스토일 카르니틴, 및 이의 염 및 혼합물의 이온화된 형태일 수 있다.

친수성 비이온성 계면활성제는, 비제한적으로, 알킬글루코시드(alkylglucoside); 알킬말토시드(alkylmaltoside); 알킬티오글루코시드(alkylthioglucoside); 라우릴 마크로골글리세라이드(lauryl macrogolglyceride); 폴리옥시알킬렌 알킬 에테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르; 폴리옥시알킬렌 알킬페놀, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 알킬 페놀; 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀 지방산 에스테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 지방산 모노에스테르 및 폴리에틸렌 글리콜 지방산 디에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 지방산 에스테르; 폴리글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세라이드, 식물성 오일, 수소화된 식물성 오일, 지방산, 및 스테롤로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원을 이용한 폴리올의 친수성 에스테르교환 생성물; 폴리옥시에틸렌 스테롤, 유도체, 및 이의 유사체; 폴리옥시에틸화된 비타민 및 이의 유도체; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 및 이의 혼합물; 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르 및 트리글리세라이드, 식물성 오일, 및 수소화된 식물성 오일로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원을 이용한 폴리올의 친수성 에스테르교환 생성물을 포함할 수 있다. 폴리올은 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 펜타에리트리톨, 또는 당류일 수 있다.

다른 친수성 비이온성 계면활성제는, 비제한적으로, PEG-10 라우레이트, PEG-12 라우레이트, PEG-20 라우레이트, PEG-32 라우레이트, PEG-32 디라우레이트, PEG-12 올레에이트, PEG-15 올레에이트, PEG-20 올레에이트, PEG-20 di올레에이트, PEG-32 올레에이트, PEG-200 올레에이트, PEG-400 올레에이트, PEG-15 스테아레이트, PEG-32 디스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-20 디라우레이트, PEG-25 글리세릴 트리올레에이트, PEG-32 디올레에이트, PEG-20 글리세릴 라우레이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-20 글리세릴 스테아레이트, PEG-20 글리세릴 올레에이트, PEG-30 글리세릴 올레에이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-40 글리세릴 라우레이트, PEG-40 팜 핵유, PEG-50 수소화된 피마자유, PEG-40 피마자유, PEG-35 피마자유, PEG-60 피마자유, PEG-40 수소화된 피마자유, PEG-60 수소화된 피마자유, PEG-60 옥수수 오일, PEG-6 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, PEG-8 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, 폴리글리세릴-10 라우레이트, PEG-30 콜레스테롤, PEG-25 피토 스테롤(phyto sterol), PEG-30 소야 스테롤(soya sterol), PEG-20 트리올레에이트, PEG-40 소르비탄 올레에이트, PEG-80 소르비탄 라우레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, POE-9 라우릴 에테르, POE-23 라우릴 에테르, POE-10 올레일 에테르, POE-20 올레일 에테르, POE-20 스테아릴 에테르, 토코페릴 PEG-100 석시네이트, PEG-24 콜레스테롤, 폴리글리세릴-10올레에이트, 트윈 40, 트윈 60, 수크로스 모노스테아레이트, 수크로스 모노라우레이트, 수크로스 모노팔미테이트, PEG 10-100 노닐 페놀 시리즈, PEG 15-100 옥틸 페놀 시리즈, 및 폴록사머를 포함한다.

적합한 친유성 계면활성제는, 예로서 지방 알콜; 글리세롤 지방산 에스테르; 아세틸화된 글리세롤 지방산 에스테르; 저급 알콜 지방산 에스테르; 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르; 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르; 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리옥시에틸화된 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르; 당 에스테르; 당 에테르; 모노- 및 디-글리세라이드의 락트산 유도체; 글리세라이드, 식물성 오일, 수소화된 식물성 오일, 지방산 및 스테롤로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원을 이용한 폴리올의 소수성 에스테르교환 생성물; 오일 가용성 비타민/비타민 유도체; 및 이의 혼합물을 포함한다. 이 그룹 내에서, 바람직한 친유성 계면활성제는 글리세롤 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물을 포함하거나, 또는 식물성 오일, 수소화된 식물성 오일, 및 트리글리세라이드로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원을 이용한 폴리올의 소수성 에스테르교환 생성물이다

일 구현예에서, 조성물은 화합물의 양호한 가용화 및/또는 용해를 보장하고 화합물의 침전을 최소화하기 위해 가용화제를 포함한다. 이것은 비경구용 조성물, 예컨대, 주사용 조성물에 특히 유리할 수 있다. 가용화제는 또한 친수성 약물 및/또는 다른 성분, 예컨대 계면활성제의 용해도를 증가시키기 위해, 또는 조성물을 안정하거나 균질한 용액 또는 분산액으로서 유지하기 위해 첨가될 수 있다.

적합한 가용화제의 예는, 비제한적으로, 알콜 및 폴리올, 예컨대 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 벤질 알콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄디올 및 이의 이성질체, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 트랜스쿠톨, 디메틸 이소소르비드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐알콜, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 다른 셀룰로오스 유도체, 사이클로덱스트린 및 사이클로덱스트린 유도체; 약 200 내지 약 6000의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 에테르, 예컨대 테트라하이드로퍼퍼릴 알콜 PEG 에테르(글리코푸롤) 또는 메톡시 PEG; 아미드 및 다른 질소 함유 화합물, 예컨대 2-피롤리돈, 2-피페리돈, ε-카프로락탐, N-알킬피롤리돈, N-하이드록시알킬피롤리돈, N-알킬피페리돈, N-알킬카프로락탐, 디메틸아세타미드 및 폴리비닐피롤리돈; 에스테르, 예컨대 에틸 프로피오네이트, 트리부틸시트레이트, 아세틸 트리에틸시트레이트, 아세틸 트리부틸 시트레이트, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 에틸 부티레이트, 트리아세틴, 프로필렌 글리콜 모노아세테이트, 프로필렌 글리콜 디아세테이트, ε-카프로락톤 및 이의 이성질체, δ-발레로락톤 및 이의 이성질체, β-부티로락톤 및 이의 이성질체; 및 당업계에 공지된 다른 가용화제, 예컨대 디메틸 아세타미드, 디메틸 이소소르비드, N-메틸 피롤리돈, 모노옥타노인, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 및 물을 포함한다.

가용화제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 예는, 비제한적으로, 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 디메틸아세타미드, N-메틸피롤리돈, N-하이드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 200-100, 글리코푸롤, 트랜스쿠톨, 프로필렌 글리콜, 및 디메틸 이소소르비드를 포함한다. 특히 바람직한 가용화제는 소르비톨, 글리세롤, 트리아세틴, 에틸 알콜, PEG-400, 글리코푸롤 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.

포함될 수 있는 가용화제의 양은 특별히 제한되지 않는다. 주어진 가용화제의 양은 생체 허용가능한 양으로 제한될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일부 상황에서, 예를 들어 약물의 농도를 최대화하기 위해 생체 허용가능한 양을 훨씬 초과하는 가용화제의 양을 포함하는 것이 유리할 수 있으며, 과도한 가용화제는 조성물을 대상체에게 제공하기 전에 증류 또는 증발과 같은 통상적인 기술을 사용하여 제거된다. 따라서, 존재하는 경우, 가용화제는 약물, 및 다른 부형제의 조합된 중량을 기준으로, 10 중량%, 25 중량%, 50 중량%, 100 중량%, 또는 최대 약 200 중량%의 중량 비율일 수 있다. 원하는 경우, 5%, 2%, 1% 또는 그 이하와 같이 매우 적은 양의 가용화제가 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 가용화제는 약 1 중량% 내지 약 100 중량%, 보다 전형적으로 약 5 중량% 내지 약 25 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 첨가제 및 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 첨가제 및 부형제는, 비제한적으로, 디택키파이어(detackifier), 소포제, 완충제, 중합체, 항산화제, 보존제, 킬레이트제, 점성조절제, 긴장제(tonicifier), 향미제, 착색제, 착취제(odorant), 불투명화제(opacifier), 현탁화제, 결합제, 충전제, 가소제, 윤활제, 및 이의 혼합물을 포함한다.

또한, 산 또는 염기가 가공을 용이하게 하거나, 안정성을 향상시키거나, 또는 다른 이유로 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염기의 예는 아미노산, 아미노산 에스테르, 암모늄 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 나트륨 하이드록사이드, 나트륨 수소 카르보네이트, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 카르보네이트, 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 합성 알루미늄 실리케이트, 합성 하이드로칼사이트(hydrocalcite), 마그네슘 알루미늄 하이드록사이드, 디이소프로필에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 트리이소프로판올아민, 트리메틸아민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 등을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 산, 예컨대 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알칸설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 부티르산, 카르본산, 시트르산, 지방산, 포름산, 푸마르산, 글루콘산, 하이드로퀴노설폰산, 이소아스코르브산, 락트산, 말레산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 탄닌산, 타르타르산, 티오글리콜산, 톨루엔설폰산, 요산 등의 염인 염기가 또한 적합하다. 다양성자 산(polyprotic acid)의 염, 예컨대 인산 나트륨, 인산 수소 이나트륨, 및 제일인산 나트륨이 또한 사용될 수 있다. 염기가 염인 경우, 양이온은 임의의 간편하고 약제학적으로 허용가능한 양이온, 예컨대 암모늄, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 등일 수 있다. 예는, 비제한적으로, 나트륨, 칼륨, 리튬, 마그네슘, 칼슘 및 암모늄을 포함할 수 있다.

적합한 산은 약제학적으로 허용가능한 유기 또는 무기산이다. 적합한 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 붕산, 인산 등을 포함한다. 적합한 유기산의 예는 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알칸설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 부티르산, 카본산, 시트르산, 지방산, 포름산, 푸마르산, 글루콘산, 하이드로퀴노설폰산, 이소아스코르브산, 락트산, 말레산, 메탄설폰산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 탄닌산, 타르타르산, 티오글리콜산, 톨루엔설폰산, 요산 등을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드 조성물 및 사용 설명서를 함유하는 단위 용량을 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 하나 이상의 추가의 시약, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사성독성제, 또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료 단백질(예컨대, 항체)을 함유하는 하나 이상의 단위 용량을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 제공되거나 키트와 함께 제공되거나, 키트와 동반되는 임의의 글, 또는 기록된 자료를 포함한다.

본 개시내용의 키트는 또한 진단제 및/또는 다른 치료제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서 질환, 병태 또는 장애의 상태 또는 존재를 진단하기 위한 진단 방법에서 사용될 수 있는 본 개시내용의 대상 폴리펩타이드 및 진단제를 포함한다.

실시예

하기 실시예는 본 개시내용의 다양한 구현예를 예시하는 목적으로 제공되며, 본 개시내용을 어떤 방식으로도 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 실시예는 본원에 기재된 방법과 함께 현재 바람직한 구현예를 대표하고, 예시적이며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 개시내용의 사상 내에 포함되는 그 안의 변경 및 다른 사용은 당업자에게 일어날 것이다.

실시예 1: 결합 친화성 분석

모든 SPR 측정은 BIAcore 　3000 기기(GE Biosciences, Piscataway, N.J.)에서 수행하였다.　 BIAcore 　소프트웨어 -BIAcore 　3000 제어 소프트웨어 V3.2를 BIAcore 　3000 기기의 작동 및 제어에 사용하였다. BiaEvaluation 소프트웨어 V4.1d를 BIAcore 　3000 기기의 SPR 데이터의 분석에 사용하였고, 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어 버전 5를 사용하여 플롯팅하였다. CD80 또는 CD86에 대한 CTLA4 변이체의 결합 친화성을 25℃에서 HBS-EP 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% P20)에서 측정하였다. 친화성 연구를 위한 유속은 30 μL/분이었다. 표시된 CTLA4 변이체를 칩의 참조 채널을 구축하기 위한 리간드로서 사용하였다. 고정화된 리간드에 대한 분석물(CD80 / CD86) 결합을 측정하였고, sIL-6R의 농도는 1.2 내지 100 nM(3x 희석)이다. 각 샘플을 칩 결합된 펩타이드에 결합시키기 위해 30 μL/분의 유속으로 3분 동안 주입하였다. 다음으로, 분석물이 없는 결합 완충액을 동일한 유속으로 칩 상에 보내 결합된 분석물을 해리시켰다. 500초 후, 재생 용액(1M 포름산)을 주입하여 남아있는 결합된 분석물을 제거하였다. 데이터를 모두 BiaEvaluation 소프트웨어 V4.1에 포함된 Kinetics Wizard 및 수동 피팅 프로그램을 사용하여 분석하였다. k_a는 온-레이트(on-rate)이고; k_d는 오프-레이트(off-rate)이며; K_D는 평형 해리 상수이고; 상대적 친화성은 K_D(아바타셉트) / K_D(변이체)로서 계산된다. k_a, k_d, K_D 및 아바타셉트 대비 친화성(샘플 70# 또는 103#)이 표 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 및 1-8에 나타나 있다.

모든 SPR 측정은　 BIAcore 　3000 기기(GE Biosciences, Piscataway, N.J.) 상에서 수행하였다.　

표 1-1 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD80 결합 친화성

표 1-2 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD86 결합 친화성

표 1-3 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD80 결합 친화성

표 1-4 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD86 결합 친화성

표 1-5 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD80 결합 친화성

표 1-6 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD86 결합 친화성

표 1-7 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD80 결합 친화성

표 1-8 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD86 결합 친화성

실시예 2: CD80 및 CD86에 대한 결합 친화성의 pH 의존성의 결정

pH 7.4 및 pH 6.0에서 SPR을 동시에 측정하고, K_D 값을 실시예 1에 상세히 설명된 프로토콜에 따라 계산하였다. pH 의존성을 pH 6.0에서의 K_D 값 및 pH 7.4에서의 K_D 값 사이의 비율로서 계산하였고, 이는 pH 7.4에서 pH 6.0으로의 친화성 감소의 배수를 나타낸다. 본원에 기재된 대상 변이체의 pH 의존성이 1보다 큰 경우, 그것은 변이체가 pH 7.4에서의 CD80 또는 CD86에 대한 그의 결합이 pH 6.0보다 높은 pH 의존적 방식으로 CD80 또는 CD86에 결합한다는 것을 의미한다. 본원에 기재된 대상 변이체의 pH 의존성이 1보다 낮은 경우, 그것은 변이체가 pH 6.0에서의 CD80 또는 CD86에의 그의 결합이 pH 7.4보다 높은 pH 의존적 방식으로 CD80 또는 CD86에 결합한다는 것을 의미한다. SPR을 예시적인 변이체 133# 및 142# 상에서 측정하였고, 아바타셉트 및 벨라타셉트를 참조로 사용하였다. 수득된 KD 값이 각각 하기 표 2-1 및 3-1에 제공되어 있다. pH 7.4에서의 결합 친화성과 pH 6.0에서의 결합 친화성을 비교함으로써 결정된 pH 의존성이 각각 표 2-2 및 3-2에 제공되어 있다. 표 2-2 및 3-2에 나타낸 바와 같이, 예시적인 변이체 133# 및 142# 모두는 아바타셉트보다 CD80 및 CD86 친화성 결합에 대해 더 높은 pH 의존성을 나타내었고, 이는 pH 7.4에서 pH 6.0으로의 결합 친화성의 더 유의한 감소를 나타내며; 예시적인 변이체 133#은 벨라타셉트보다 CD80 및 Cd86 친화성 결합에 대해 더 높은 pH 의존성을 나타내었고; 예시적인 변이체 142#는 아바타셉트 및 벨라타셉트 모두보다 CD86 친화성 결합에 대해 훨씬 더 높은 pH 의존성을 나타내었다. 이러한 데이터는 항원 중화 및 제거의 측면에서 이러한 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 우수한 특성을 나타낸다.

표 2-1 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD80 결합 친화성

표 2-2 예시적인 CTLA4 변이체의 CD80 결합 친화성에 대한 pH 의존성

표 3-1 예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 CD86 결합 친화성

표 3-2 예시적인 CTLA4 변이체의 CD86 결합 친화성에 대한 pH 의존성

실시예 3: 상대적 결합 친화성의 평가

예시적인 CTLA4-Ig 변이체를 경쟁적 억제 분석에 의해 CD80 및 CD86에 대한 이들의 결합 친화성에 대해 조사하였다. 이 경쟁적 억제 분석에서, 아바타셉트(WT CTLA4-Ig) 구조체를 라모스(Ramos) 세포(인간 버킷 림프종 세포) 내로 형질감염시키고, 아바타셉트를 라모스 세포의 세포 표면 상에 발현 및 제시하였다. 이후, 도 1에 나타낸 바와 같이, 아바타셉트를 발현하는 라모스 세포를 바이오틴 접합된 CD80 또는 CD86과 함께 인큐베이션하였고, 이는 세포 표면 상에 발현된 아바타셉트에 의해 결합될 수 있다. 이후, 예시적인 CTLA4-Ig 변이체 또는 참조 변이체(예컨대, 아바타셉트 또는 벨라타셉트)를 인큐베이션된 세포에 첨가하였다. CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴에의 결합에 대한 나중에 첨가된 예시적인 CTLA4-Ig 변이체 및 표면-제시된 아바타셉트 사이의 경쟁은 표면 결합된 CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴의 일부를 세포 표면에서 떨어뜨릴 것이다. 세포 표면에서 떨어지는 CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴의 양은 아바타셉트와 비교하여 CD80 또는 CD86에 대한 예시적인 변이체의 결합 친화성에 비례할 수 있다. 그 결과, 세포 표면에 남아 있는 CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴의 양은 예시적인 변이체의 상대적 결합 친화성에 반비례한다. 세포 표면 결합된 CD80 또는 CD86의 양을 세포를 스트렙타비딘-APC와 함께 배양한 후 유세포 분석법에 의해 조사하였고, 이를 세포 표면 결합된 APC 염료에 의해 야기된 형광 신호 수준에 의해 표시하였다. 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 형광 신호가 낮을수록, 조사된 CD80 또는 CD86에 대한 예시적인 변이체의 결합 친화성은 높다. 예를 들어, 예시적인 변이체, 돌연변이체 142#(각각 도 2a 및 2b에서 곡선 #1 및 #6에 의해 입증됨) 및 133#(곡선 #2 및 #7)은 아바타셉트(곡선 #4 및 #9) 및 벨라타셉트(곡선 #3 및 #8)과 비교하여 CD80 및 CD86에 대해 더 높은 친화성을 나타내었다.

실시예 4: 상대적 결합 친화성의 평가

예시적인 CTLA4-Ig 변이체를 이들의 CD80 및 CD86에 대한 결합 친화성에 대해 상이한 경쟁적 억제 분석에 의해 조사하였다. 이 경쟁적 억제 분석에서, CD28-Ig 구조체는 라모스 세포(인간 버킷 림프종 세포) 내로 형질감염시키고, CD28-Ig를 라모스 세포의 표면 상에 발현 및 제시하였다. CD28은 T 세포 활성화에서 중요한 공자극 수용체일 수 있으므로, CD80 및 CD86에 대해 자연적인 결합 친화성을 가질 수 있다. 이후, CD28-Ig를 발현하는 라모스 세포를 세포 표면 상에 발현된 CD28-Ig에 의해 결합될 수 있는 바이오틴 접합된 CD80 또는 CD86과 함께 인큐베이션하였다. 이후, 예시적인 CTLA4-Ig 변이체 또는 참조 변이체(예컨대, 아바타셉트 또는 벨라타셉트)를 인큐베이션된 세포에 첨가하였다. CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴에의 결합에 대한 나중에 첨가된 예시적인 CTLA4-Ig 변이체 및 표면 제시된 CD28 사이의 경쟁은 표면 결합된 CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴의 일부를 세포 표면에서 떨어뜨릴 것이다. 세포 표면으로부터 떨어져 나가는 CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴의 양은 CD28과 비교하여 CD80 또는 CD86에 대한 예시적인 변이체의 결합 친화성에 비례할 수 있다. 그 결과, 세포 표면 상에 남아 있는 CD80-바이오틴 또는 CD86-바이오틴의 양은 예시적인 변이체의 상대적 결합 친화성에 반비례한다. 세포 표면 결합된 CD80 또는 CD86의 양을 세포를 스트렙타비딘-APC와 함께 인큐베이션한 후 유세포 분석법에 의해 조사하였고, 이를 세포 표면 결합된 APC 염료에 의해 야기된 형광 신호 수준에 의해 표시하였다. 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 형광 신호가 낮을수록, 조사된 CD80 또는 CD86에 대한 예시적인 변이체의 결합 친화성은 높다. 예를 들어, 예시적인 변이체, 돌연변이체 142#(각각 도 3a 및 3b에서 곡선 #11 및 #16에 의해 입증됨) 및 133#(곡선 #12 및 #17)은 아바타셉트(곡선 #14 및 #19) 및 벨라타셉트(곡선 #13 및 #8)와 비교하여 CD80 및 CD86에 대해 더 높은 친화성을 나타내었다.

실시예 5: T 세포 증식에 대한 면역억제 효과의 평가

예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 면역억제 효과를 일차 T 세포 증식에 대한 예시적인 CTLA4-Ig의 억제 효과를 시험하는 분석에서 조사하였다. 실험에서, T 세포를 건강한 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리하고, 세포 증식을 추적하기 위해 사용된 형광 염색 염료 카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)에 의해 표지하였다. 단리된 일차 T 세포를 세포 배양 디쉬 상에 코팅된 항-CD3 항체 OKT3 및 CD86-Fc에 의해 자극시켰다. 상이한 농도의 아바타셉트 또는 예시적인 CTLA4-Ig 변이체를 T 세포 배양에 첨가하였고, 이는 T 세포의 증식을 억제할 수 있었다. 37℃에서 4일 배양 후, T 세포를 이들의 증식의 유세포 분석법에 적용하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 각 시험된 예시적인 변이체 및 아바타셉트에 대해 절반 최대 억제 농도(IC₅₀)를 계산하였다.

실시예 6: IL2 분비에 대한 면역억제 효과의 평가

예시적인 CTLA4-Ig 변이체의 면역억제 효과를 T 세포의 IL12 분비에 대한 예시적인 CTLA4-Ig의 억제 효과를 시험하는 분석에서 조사하였다. Raji 세포(인간 B-림프구)는 표면 상에서 CD80 및 CD86을 발현할 수 있다. Jurkat 세포(인간 T-림프구)는 PHA(Phytohaemagglutinin P)에 의해 자극되는 경우 그의 표면 수용체 CD28을 활성화시킬 수 있다. 따라서, 도 5에 도시된 바와 같이, PHA의 존재하에, 공동 배양된 Raji 세포 및 Jurkat 세포는 함께 결합된 이들의 표면 CD28 및 CD80/CD86을 가질 수 있고, 이는 Jurkat 세포의 활성화 및 활성화된 Jurkat 세포로부터 IL2의 분비를 야기할 수 있다. 실험에서, Jurkat 세포 및 Raji 세포를 PHA의 존재하에 공동배양하고, 공동 배양에 상이한 농도의 아바타셉트 또는 예시적인 CTLA4-Ig 변이체를 첨가하였고, 이는 도 5에 예시된 바와 같이, Jurkat 세포의 활성화 및 따라서 IL2 분비를 억제할 수 있었다. 예시적인 변이체의 면역억제 활성이 높을수록 IL2가 더 낮은 수준으로 검출된다. IL2 분비를 5 μg/mL PHA의 24시간 자극 후 ELISA에 의해 조사하였다. 도 6a-6c에 나타낸 바와 같이, 각 시험된 예시적인 변이체 및 아바타셉트에 대해 IC₅₀을 계산하였다. 예시적인 폴리펩타이드의 더 많은 시험 결과가 표 4에 나타나 있다.

표 4. IL2 분비에 대한 예시적인 폴리펩타이드의 IC₅₀

실시예 1-6에서 시험된 예시적인 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 표 5에 열거된 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드이다.

표 5. 예시적인 폴리펩타이드의 돌연변이

본 개시내용의 바람직한 구현예가 본원에 표시되고 기재되었지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 수많은 변형, 변화, 및 치환이 당업자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 개시내용의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고 이러한 청구항 및 이들의 균등물의 범위 내의 방법 및 구조물이 이에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

표 6. Fc 서열

표 7. 링커 서열

표 8. 서열 목록

Claims (70)

1. 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 서열번호: 2에 대해 위치 18, 40, 68, 77, 86, 92, 107, 117, 118, 및 122로부터 선택된 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 아바타셉트(abatacept)(서열번호: 2)와 비교하여 CD80 및/또는 CD86에 대한 향상된 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 위치 68에 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 위치 40에 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 대해 위치 16, 24, 25, 27, 28, 29, 33, 41, 42, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 58, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 69, 70, 80, 85, 93, 94, 96, 및 105로부터 선택된 하나 이상의 위치에 돌연변이를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이는 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
7. 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 서열번호: 2에 대해 S18R, S18N, A24S, G27DKA, G27DK, G27K, G27R, G27W, G27Y, G27E, G27KK, A29T, A40T, A49P, A50T, G68F, G68K, G68W, G68Y, G68H, G68D, G68E, L77V, D86N, C92S, C92Y, K93V, K93W, K93P, K93C, K93F, K93R, V94L, G105S, G107D, P117S, E118K, D122H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
8. 제7항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 아바타셉트(서열번호: 2)와 비교하여 CD80 및/또는 CD86에 대한 향상된 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA를 포함하는 폴리펩타이드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G68F를 포함하는 폴리펩타이드.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 A40T를 포함하는 폴리펩타이드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 K93M을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
13. 제1항 내지 제7항 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
14. 제1항 내지 제7항 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27H를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 P117S를 포함하는 폴리펩타이드.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 A24E, G27H, G27D, A29S, R33W, D41G, T51N, K93M, K93N, 및 G105D로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 G27DKA/R33W, G27DKA/G68F, R33W/G68F, G27R/G68Y, G27H/G68F, G27DK/G68F, G27DK/G68D, G27DK/G68E, G27D/G68F, G27E/G68F, G27H/G68D, G27H/G68E, G27DKA/G68F, G27H/G68F, G27DK/G68F, G27DKA/G68F/D122H, G27DKA/G68F/A40T/D122H, G27DKA/G68F/A40T/P117S, G27DKA/G68F/L77V, G27DKA/G68F/C92S/K93M, G27DK/G68F/A49P/A50T, G27DK/G68F/A40T/D86N/G105S, G27KK/G68F, G27DKA/G68F/P117S, G27DKA/G68F/A49P/A50T, G27DK/G68F/A40T, G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S, G27DK/G68F/L77V, G27DK/G68F/C92S/K93M, G27DK/G68F/P117S, G27DKA/G68F/G105S, G27DKA/G68F/D86N, G27DK/G68F/D122H, G27DK/G68F/A40T/G105S, G27DK/G68F/G105S, G27DK/G68F/D86N, G27DKA/G68F/A40T, G27DKA/G68F/K93M, G27DK/G68F/K93M, 및 G27DKA/A40T/G68F/K93M으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/A40T/G68F/K93M의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/A40T의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/K93M의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/A40T/P117S의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F/P117S의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27H/G68F의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
24. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DKA/G68F의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
25. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/K93M의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
26. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/A40T의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
27. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
28. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/L77V의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
29. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/P117S의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
30. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2에 대해 아미노산 치환 G27DK/G68F/D122H의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 최대 1, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
33. 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 서열번호: 2의 아미노산 1-124에 대한 폴리펩타이드의 아미노산 치환은 제7항 내지 제32항 중 어느 한 항에 언급된 아미노산 치환으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 아미노산 서열에 융합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
35. 제34항에 있어서, 제2 아미노산 서열은 IgG Fc 영역을 코딩하는 것인 폴리펩타이드.
36. 제35항에 있어서, IgG Fc 영역은 인간 IgG 분자로부터의 것인 폴리펩타이드.
37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 제2 아미노산 서열은 서열번호: 2의 아미노산 125-357에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 것인 폴리펩타이드.
38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호: 6의 아미노산 1-359에 대해 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 것인 폴리펩타이드.
39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커를 통해 함께 융합되는 것인 폴리펩타이드.
40. 제39항에 있어서, 링커는 1 내지 10개의 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 링커는 표 7로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
42. 제39항 또는 제40항에 있어서, 링커는 아미노산 서열 Q(서열번호: 82) 또는 GGGGS(서열번호: 54)를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 아바타셉트(서열번호: 2)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 또는 적어도 300배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 아바타셉트(서열번호: 2)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 또는 적어도 300배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 벨라타셉트(belatacept)(서열번호: 3)의 친화성보다 CD80에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 벨라타셉트(서열번호: 3)의 친화성보다 CD86에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 벨라타셉트(서열번호: 3)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 벨라타셉트(서열번호: 3)의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 CD80에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 CD86에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 5의 친화성보다 CD80에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 5의 친화성보다 CD86에 대한 더 큰 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD80에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD80에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 때 CD86에 대한 서열번호: 4의 친화성보다 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30배 큰 CD86에 대한 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리펩타이드.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드-약물 접합체.
58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제57항의 폴리펩타이드-약물 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 질환 또는 병태는 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 전신성 소아 특발성 관절염(JIA), 염증성 장 질환(IBD), 전신 홍반 루푸스(SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 셀리악병, 담낭 질환, 모소 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 외과적 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 자가면역 장애, 췌장염, 수술로 인한 외상, 이식편대숙주 질환, 이식 거부, 심장 질환, 골 흡수, 화상 환자, 심근 경색, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간/폐 섬유증, 치주염, 저위산증, 고형 종양(신세포암), 간암, 다발성 골수종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 신경암, 및 B-세포 악성종양(예컨대, 캐슬만병, 특정 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 다발성 골수종)을 포함하는 것인 방법.
60. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 병태를 치료하는데 사용하기 위한 폴리펩타이드.
61. 제60항에 있어서, 병태는 이식 거부, 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 전신성 소아 특발성 관절염(JIA), 염증성 장 질환(IBD), 전신 홍반 루푸스(SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 셀리악병, 담낭 질환, 모소 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 외과적 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 자가면역 장애, 췌장염, 수술로 인한 외상, 이식편대숙주 질환, 심장 질환, 골 흡수, 화상 환자, 심근 경색, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간/폐 섬유증, 치주염, 저위산증, 고형 종양(신세포암), 간암, 다발성 골수종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 신경암, 및 B-세포 악성종양(예컨대, 캐슬만병, 특정 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 다발성 골수종)을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
62. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제57항의 폴리펩타이드-약물 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
63. 용기 내에 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제57항의 폴리펩타이드-약물 접합체를 포함하는 키트.
64. 대상체의 병태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제57항의 폴리펩타이드-약물 접합체의 용도.
65. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
66. 제65항의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
67. 제66항의 벡터를 포함하는 세포.
68. 제67항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
69. 제67항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
70. 제67항에 있어서, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 또는 곤충 세포인 세포.

Images