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KR20210118833A - 킬 스위치를 갖는 공여 t 세포 - Google Patents

킬 스위치를 갖는 공여 t 세포 Download PDF

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KR20210118833A
KR20210118833A KR1020217023088A KR20217023088A KR20210118833A KR 20210118833 A KR20210118833 A KR 20210118833A KR 1020217023088 A KR1020217023088 A KR 1020217023088A KR 20217023088 A KR20217023088 A KR 20217023088A KR 20210118833 A KR20210118833 A KR 20210118833A
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KR
South Korea
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hprt
cells
lymphocytes
seq
nucleic acid
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Pending
Application number
KR1020217023088A
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English (en)
Inventor
밍 얀
크리스토퍼 왈터 알마
제프리 필립 시몬스
제프리 에스. 바틀렛
치-린 리
Original Assignee
씨에스엘 베링 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨에스엘 베링 엘엘씨 filed Critical 씨에스엘 베링 엘엘씨
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Abstract

본 개시된 방법은 일반적으로 T 세포 요법의 부작용을 예방, 치료, 억제, 조절 또는 겸감하기 위한 것에 관한 것으로, 상기 T 세포 요법은 면역 재구성을 촉진하고 이식편 대 악성 종양 효과를 유도하고/하거나 종양 세포를 표적화 하도록 설계되어 있다. 일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩한다.

Description

살해 스위치를 갖는 공여체 T 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 개시 내용은 2018년 12월 23일자로 출원된 미국 가특허출원 US 62/784,494의 출원일의 이익을 주장하며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시 내용은 일반적으로 유전자 요법, 특히, 조혈 줄기 세포 및/또는 림프구, 예를 들어, 발현 벡터로 형질 도입된 T 세포에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 CRISPR-Cas 시스템을 통해서와 같은 같은 유전자 편집에 관한 것이다.
동종 이계 조혈 줄기 세포 이식 (allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation: 알로-HSCT)은 혈액학적 악성 종양 및 유전성 혈액 세포 장애, 예를 들어, 겸상 적혈구 병에 대한 치료 요법이다. 알로-HSCT와 관련된 문제는 공여체 세포의 적절한 공급원의 식별을 포함한다. 일치된 관련 공여체 (matched-related donor: MRD) 및 일치된 비관련 공여체 (matched unrelated donor: MUD)는 보다 낮은 관련 위험을 갖는 HSC의 공급원을 제공하지만, 이러한 공여체의 이용 가능성은 거의 모든 사람이 직계 공여체 (전형적으로는 부모 또는 형제자매)를 갖고 있는 일배체 동일 (haplo-identical) 공여체의 이용 가능성과 비교하여 유의하게 감소한다. 그러나, 알로-HSCT에 대한 일배체 동일 공여체의 사용과 관련된 합병증이 존재하며, 성공적인 알로-HSCT에 대한 장애물로 남아 있는 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 발병 가능성이 가장 중요하다. 알로-HSCT를 받은 환자의 약 절반은 치료를 필요로 하는 GvHD를 발병하며, 환자들 중 10% 이상은 이로 인해 사망할 수 있는 것으로 여겨진다. GvHD는 위장관, 피부, 점막, 간 및 폐를 비롯한 여러 기관계와 관련된 이질 증상을 나타낸다. 면역 억제 약물은 GvHD를 예방하고 감소시키기 위한 중심 전략으로서 사용되었다. 현재, 코르티코스테로이드에 의한 GvHD에 대한 코르티코스테로이드의 표준 치료는 다수의 환자가 스테로이드 불응성 질환을 발병하기 때문에 매우 제한된 성공을 갖는다. 급성 및 만성 GvHD의 치료에 가장 좋은 2차 및 3차 접근법이 무엇인지에 대한 명확한 합의는 없다 (문헌 [Jamil, M.O. & Mineishi, S. Int J Hematol (2015) 101: 452] 참조).
GvHD 발병의 위험을 감소시키기 위해, 일배체 동일 이식편은 종종 T 세포 고갈된다. 그러나, 공여체 T 세포의 부족은 이식 수여체를 면역 약화시키며 이식된 환자의 증가된 치명적인 감염율을 초래할 수 있다. 또한, 보다 최근의 연구는 공여체 T 세포의 존재가 CD4+ 및 CD8+ T 세포 생착에 필요한 연장된 기간 (최대 2년) 동안 T 세포 면역을 제공하는 것에 추가하여 반복 HSCT에 대한 잠재적 필요성을 감소시킴으로써 공여체 세포 생착을 유의하게 개선시키는 것으로 나타났다.
알로-HSCT 악성 종양 환경에서, 공여체 T 세포의 존재에 의해 제공되는 이점은 항종양 활성 또는 이식편 대 종양 (graft-versus-tumor: GVT) 효과 (이식편 대 백혈병 - GVL로도 또한 공지됨)를 포함한다. HSCT 후의 재발 이후 질병의 관해를 초래하는 공여체 림프구 주입 (donor lymphocyte infusion: DLI)의 최초 보고가 1990년에 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia: CML) 환자에서 있었다. DLI 이전에, HSCT 후의 재발 환자는 질병에 걸렸을 가능성이 높으며, 두 번째 이식을 받은 환자는 거의 없었을 것이다. CML의 성공 이후, DLI는 급성 백혈병 및 골수종과 같은 다른 혈액학적 악성 종양에 활용되었다.
그러므로, 중요한 도전은 지속적인 관해를 가능하게 하는 책임이 있지만 GvHD와 관련된 독성에 대한 책임도 또한 있는 GVT 효과의 적절한 균형에 관한 것이다.
개시 내용의 간단한 개요
사람 줄기 세포를 변형시키기 위한 유전자 요법 전략은 많은 사람 질병을 치료할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있다. 공여체 T 세포의 양성 기여를 유지하면서 GvHD를 최소화하는 접근법이 개발될 때까지, 알로-HSCT의 완전한 치료 가능성은 실현되지 않을 것으로 여겨진다.
본 개시 내용의 제1 양태는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터이며, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase: HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 발현 제어 서열은 Pol III 프로모터 또는 Pol II 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Pol III 프로모터는 7sk 프로모터, 돌연변이된 7sk 프로모터, H1 프로모터 또는 EF1a 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터는 서열 번호 15의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 제2 양태는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터이며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 발현 제어 서열은 Pol III 프로모터 또는 Pol II 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Pol III 프로모터는 7sk 프로모터, 돌연변이된 7sk 프로모터, H1 프로모터 또는 EF1a 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터는 서열 번호 15의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 제3 양태는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질 도입된 숙주 세포이며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 상기 발현 벡터에 의한 형질 도입 후 HPRT가 실질적으로 결핍된다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 림프구, 예를 들어, T 세포이다.
본 개시 내용의 제4 양태는 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물이며, 여기서, 상기 숙주 세포는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제로 제형화되며, 상기 숙주 세포는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질 도입되었으며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 상기 발현 벡터에 의한 형질 도입 후 HPRT가 실질적으로 결핍된다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 림프구, 예를 들어, T 세포이다.
본 개시 내용의 제5 양태는 발현 벡터로 숙주 세포 집단을 형질 도입하는 단계, 및 상기 형질 도입된 숙주 세포 집단을 적어도 퓨린 유사체와 접촉시킴으로써 HPRT 결핍 세포를 양성 선택하는 단계를 포함하는, 실질적인 HPRT 결핍 세포를 생성하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6-티오구아닌 (6TG) 및 6-머캅토퓨린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 제6 양태는 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 상기 HSC 이식편의 투여 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및, 임의로, 부작용이 발생하는 경우, 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 메토트렉세이트 (MTX) 또는 마이코페놀산 (MPA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 6TG의 양은 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위이다.
일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구는 단일 볼루스로서 투여된다. 일부 실시 형태에서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함한다.
본 개시 내용의 제7 양태는 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; 및 HSC 이식편의 투여와 동시에 또는 이의 투여 후에 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 1회 이상의 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 6TG의 양은 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구는 단일 볼루스로서 투여된다. 일부 실시 형태에서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함한다.
본 개시 내용의 제9 양태는 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여함으로써 적어도 부분적 이식편 대 악성 종양 효과를 유도하는 단계; 및 잔류 질환 또는 질환 재발의 검출 후에 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈액학적 암을 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 1회 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하여 GvHD 또는 CRS 중 적어도 하나의 증상을 억제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 6TG의 양은 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구는 단일 볼루스로서 투여된다. 일부 실시 형태에서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함한다.
본 개시 내용의 제9 양태는 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클로 형질 감염시킴으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 상기 HSC 이식편의 투여 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및, 임의로, 부작용이 발생하는 경우, MTX를 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다.
일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 Cas 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas12 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 Cas12a 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 Cas12b 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 가이드 RNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질, Cas12a 단백질 또는 Cas12b 단백질)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 가이드 RNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질, Cas12a 단백질 또는 Cas12b 단백질)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 전달 비히클은 나노캡슐이다. 일부 실시 형태에서, 상기 전달 비히클은 하나 이상의 표적화 모이어티 (moiety)를 포함하는 나노캡슐이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 1회 이상의 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 6TG의 양은 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구는 단일 볼루스로서 투여된다. 일부 실시 형태에서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함한다.
본 개시 내용의 제10 양태는 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클로 형질 감염시킴으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여함으로써 적어도 부분적 이식편 대 악성 종양 효과를 유도하는 단계; 및 잔류 질환 또는 질환 재발의 검출 후에 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈액학적 암을 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법이다.
일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 Cas 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas12 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 Cas12a 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 Cas12b 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 가이드 RNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질, Cas12a 단백질 또는 Cas12b 단백질)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 Cas12b 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 가이드 RNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질, Cas12a 단백질 또는 Cas12b 단백질)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 전달 비히클은 나노캡슐이다. 일부 실시 형태에서, 상기 전달 비히클은 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 나노캡슐이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 1회 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하여 GvHD 또는 CRS 중 적어도 하나의 증상을 억제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 6TG의 양은 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구는 단일 볼루스로서 투여된다. 일부 실시 형태에서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함한다.
본 개시 내용의 제11 양태는 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하는 단계; (b) 상기 단리된 림프구를 발현 벡터로 형질 도입하는 단계; (c) 상기 형질 도입된 단리된 림프구를 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 변형된 림프구 제제를 제공하는 단계; (d) 조혈 줄기 세포 이식 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 제제를 환자에게 투여하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 환자에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 발병 후 메토트렉세이트 또는 마이코페놀산을 투여하는 단계를 포함하는, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT) 결핍 림프구 환자를 치료하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제는 퓨린 유사체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 6TG의 양은 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위이다.
본 개시 내용의 제12 양태는 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하는 단계; (b) 상기 단리된 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클과 접촉시켜 HPRT 결핍 림프구 집단을 제공하는 단계; (c) 상기 HPRT 결핍 림프구 집단을 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 변형된 림프구 제제를 제공하는 단계; (d) 조혈 줄기 세포 이식 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 제제를 환자에게 투여하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 환자에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 발병 후 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, HPRT 결핍 림프구 환자를 치료하는 방법이다.
일부 실시 형태에서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제는 퓨린 유사체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 6TG의 양은 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위이다.
일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 서열 번호 25~39로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분은 Cas 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas12 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 Cas12a 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 Cas12b 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 전달 비히클은 나노캡슐이다. 일부 실시 형태에서, 상기 전달 비히클은 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 나노캡슐이다.
본 개시 내용의 제13 양태는 조혈 줄기 세포 이식 후 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위한 변형된 림프구 제제의 용도이며, 여기서, 상기 변형된 림프구 제제는 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하고; (b) 상기 단리된 림프구를 발현 벡터로 형질 도입하고; (c) 상기 형질 도입된 단리된 림프구를 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 상기 변형된 림프구 제제를 제공함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 제14 양태는 조혈 줄기 세포 이식 후 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위한 변형된 림프구 제제의 용도이며, 여기서, 상기 변형된 림프구 제제는 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하고; (b) 상기 단리된 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클과 접촉시켜 HPRT 결핍 림프구 집단을 제공하고; (c) 상기 HPRT 결핍 림프구 집단을 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 상기 변형된 림프구 제제를 제공함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 전달 비히클은 나노캡슐이다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 gRNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질, Cas12a 단백질 또는 Cas12b 단백질)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 gRNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질, Cas12a 단백질 또는 Cas12b 단백질)을 포함한다.
본 개시 내용의 제15 양태는 (i) 렌티바이러스 발현 벡터 (여기서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하고, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다); 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 제16 양태는 (i) 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA; 및 (ii) Cas 단백질을 포함하는 키트이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas12a이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas12b이다.
본 개시 내용의 제17 양태는 (i) 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 gRNA; 및 (ii) Cas 단백질을 포함하는 나노캡슐이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 중합체성 쉘을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체성 나노캡슐은 양으로 하전된 2개의 상이한 단량체, 적어도 하나의 중성 단량체 및 가교제로 구성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체성 나노캡슐은 이미다졸기를 갖는 단량체를 포함하지 않는다.
본 개시 내용의 제18 양태는 나노캡슐로 형질 감염된 숙주 세포이며, 여기서, 상기 나노캡슐은 (i) 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 gRNA; 및 (ii) Cas 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 중합체성 쉘을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 양으로 하전된 2개의 상이한 단량체, 적어도 하나의 중성 단량체 및 가교제로 구성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체성 나노캡슐은 이미다졸기를 갖는 단량체를 포함하지 않는다.
본 개시 내용의 제19 양태는 조혈 줄기 세포 이식 후 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위한 변형된 림프구 제제의 용도이며, 여기서, 상기 변형된 림프구 제제는 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하고; (b) 상기 단리된 림프구를 나노캡슐과 접촉시키고, 여기서, 상기 나노캡슐이 (i) 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 gRNA; 및 (ii) Cas 단백질을 포함하고; (c) 상기 HPRT 결핍 림프구 집단을 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 변형된 림프구 제제를 제공함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 gRNA는 서열 번호 25~39 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 제20 양태는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 나노캡슐이며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 중합체성 쉘을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체성 나노캡슐은 양으로 하전된 2개의 상이한 단량체, 적어도 하나의 중성 단량체 및 가교제로 구성된다.
다른 "오프 스위치 (off switch)" 방법과 비교하여, 본 개시 방법에 따라 치료되는 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell: HSC) (T 세포 포함)는 "자살 유전자"를 발현할 필요가 없다. 오히려, 본 개시 방법은 혈액 세포에 바람직하지 않은 효과를 일으키지 않는 내인성 유전자의 녹다운 또는 녹아웃 및 전반적으로 우수한 결과를 제공한다. 출원인은 본 출원에서 기재된 방법에 따른 유전자 변형된 세포의 생체외 6TG 화학 선택을 고려해 볼 때 HSC (또는 림프구) 집단이 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제 (예를 들어, 메토트렉세이트 (MTX))에 의한 투여를 통해 생체내에서 세포의 정량적 제거를 허용하는 대상체에게 투여하기 위해 제공될 수 있다는 것을 제안한다. 또한, 본 개시 방법에 따른 치료는 "살해 스위치 (kill switch)"를 포함하지 않는 요법보다 잠재적으로 보다 높은 용량 및 공여체 T 세포의 보다 적극적인 요법을 제공한다. 또한, 변형된 T 세포의 수를 조절하기 위한 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제의 사용은 기존의 GvHD 치료 방법과 임상적으로 상용 가능하며, 즉, 여기서, MTX는 상기 개시된 변형된 T 세포를 투여받지 않는 환자에서 GvHD 증상의 완화를 돕는데 사용된다.
출원인은 또한 단순 포진 티미딘 키나아제 유전자로 형질 도입된 공여체 림프구와 비교하여, 본 개시 방법에 따른 치료가 면역원성을 비롯한 제한 사항들을 완화하여 세포의 제거를 초래하고 향후 주입 가능성을 배제한다는 것을 제안한다 (문헌 [Zhou X, Brenner MK, "Improving the safety of T-Cell therapies using an inducible caspase-9 gene," Exp Hematol. 2016 Nov;44(11):1013-1019], 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함됨). 또한, 출원인은 본 방법이 HSV-tk 공여체 림프구의 바람직하지 않은 제거를 초래하지 않고 GvHD 이외의 다른 동시 임상 병태에 대해 간시클로비르의 사용을 허용한다 (예를 들어, 본 개시 방법이 활용될 때, 간시클로비르는 알로-HSCT 환경에서 흔한 CMV 감염을 제어하기 위해 투여되는 것을 배제하지 않음)는 것을 제안한다.
도 1은 HPRT를 녹다운시키도록 구성된 발현 벡터 또는 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 페이로드 (예를 들어, Cas 단백질 및 gRNA)를 포함하는 나노캡슐과 T 세포를 접촉시키는 일반적인 방법을 예시한 것이다. 상기 도면은 변형된 T 세포에 의한 치료의 부작용이 관찰되는 경우와 같이 살해 스위치가 활성화될 수 있다는 것을 추가로 예시한다.
도 2는 sh734 (또한 서열 번호 1 참조)의 이차 구조 및 이론적 일차 DICER 절단 부위 (화살표)를 예시한 것이다. 이차 구조는 약 -30.9 kcal/mol의 MFE 값을 갖는다.
도 3은 sh616 (또한 서열 번호 5 참조)에 대한 이차 RNA 구조 및 최소 자유 에너지 (dG)를 예시한 것이다.
도 4는 sh211 (또한 서열 번호 6 참조)에 대한 이차 RNA 구조 및 최소 자유 에너지 (dG)를 예시한 것이다.
도 5는 sh734의 변형된 버전 (sh734.1) (또한 서열 번호 7 참조)을 예시한 것이다. 이차 구조는 -36.16 kcal/mol의 MFE 값을 갖는다.
도 6은 인공 miRNA734 (111nt)의 드노보 (de novo) 디자인을 예시한 것이다. 5' 및 3' DROSHA 표적 부위 및 5' 및 3' DICER 절단 부위는 이차 구조에서 화살표로 표시된다 (또한 서열 번호 8 참조).
도 7은 인공 miRNA211 (111nt)의 드노보 디자인 (또한 서열 번호 8 참조)을 예시한 것이다.
도 8은 본래 miRNA 16-2 구조로부터 유래된 3세대 miRNA 스캐폴드인 miRNA-3G 백본에 내장된 sh734 (또한 서열 번호 11 참조)를 예시한 것이다.
도 9는 본래 miRNA 16-2 구조로부터 유래된 3세대 miRNA 스캐폴드인 miRNA-3G 백본에 내장된 sh211 (또한 서열 번호 10 참조)을 예시한 것이다.
도 10은 사람 7sk 프로모터 돌연변이를 예시한 것이다. 돌연변이 (화살표) 및 결실은 TATA 상자 (키가 크고 얇은 상자)에 대해 7sk 프로모터에서 시스-원위 서열 인핸서 (distal sequence enhancer: DSE) 및 근위 서열 인핸서 (proximal sequence enhancer: PSE) 요소 (길고 넓은 상자)에 도입되었다. 이들 돌연변이 및 기타는 문헌 [Boyd, D.C., Turner, P.C., Watkins, N.J., Gerster, T. & Murphy, S. Functional Redundancy of Promoter Elements Ensures Efficient Transcription of the Human 7SK Gene in vivo, Journal of Molecular Biology 253, 677-690 (1995)]에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
도 11은 변형된 T 세포를 제조하고 이를 필요로 하는 환자에게 이러한 변형된 T 세포를 투여하는 단계들을 예시하는 흐름도이다.
도 12a 및 12b는 6TG에 의한 변형된 세포 (LV 형질 도입을 통한 HPRT 녹다운 또는 CRISPR/Cas9 나노캡슐을 통한 녹아웃)의 성공적인 생체외 선택 및 확장을 도시한 것이다. 이러한 초기 예비 실험은 K562 세포 (사람 불멸화 골수성 백혈병 세포주)에서 수행되었다 (rsh7-GFP = HPRT를 녹다운시키기 위한 HPRT/GFP 렌티바이러스 벡터에 대한 짧은 헤어핀; 나노RNP-HPRT = HPRT를 녹아웃시키기 위한 CRISPR/Cas9 리보핵단백질 나노캡슐). 도 12a는 MOI (multiplicity of infectio; 감염 다중도)=5에서 shHPRT-GFP 벡터로 형질 도입된 K562 세포가 10일 내에 shHPRT를 보유하는 95% 초과 세포의 상태에 도달하도록 6TG로 생체외 선택될 수 있다는 것을 예시한 것이다. 도 12b는 CRISPR RNP 나노캡슐을 통한 HPRT 녹아웃 세포가 또한 600 nM 또는 900 nM의 6TG 하에 10일 내에 전체 집단 중 95% 초과에 도달할 수 있다는 것을 예시한 것이다. 이러한 데이터는 6TG 화학 선택을 통해 높은 함량의 유전자 변형 세포를 생산할 가능성을 시사한다.
도 13a는 CEM 세포에 대한 6TG (생체외)에 의한 양성 선택의 효과를 예시한 것이다.
도 13b는 CEM 세포의 HPRT 녹아웃 집단이 6TG의 처리하에 3 일차부터 17 일차까지 증가하였다는 것을 예시한 것이다.
도 14a 및 14b는 K562 세포에 대한 MTX에 의한 음성 선택의 효과를 예시한 것이다.
도 15a 및 15b는 CEM 세포에 대한 MTX 또는 MPA에 의한 음성 선택의 효과를 예시한 것이다.
도 16은 K562 세포에 대한 MTX에 의한 음성 선택의 효과를 예시한 것이다.
도 17은 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP)의 합성을 위한 드노보 경로를 예시한 것이다.
도 18은 6TG의 존재하에 HPRT 결핍 세포의 선택을 예시한 것이다.
도 19는, 환자의 면역계가 적어도 부분적으로 재구성될 수 있도록, 변형된 T 세포를 제조하고 줄기 세포 이식 후 이러한 변형된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계들을 예시하는 흐름도이다.
도 20은, 변형된 T 세포가 GVM 효과 유도에 도움이 되도록, 변형된 T 세포를 제조하고 줄기 세포 이식 후 이러한 변형된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계들을 예시하는 흐름도이다.
도 21은 변형된 T 세포 (HRPT 결핍된 CAR-T 세포)를 제조하고 이를 필요로 하는 환자에게 이러한 변형된 T 세포를 투여하는 단계들을 예시하는 흐름도이다.
도 22는 HPRT 수준의 상대적인 발현을 예시하며, HPRT 결핍 세포가 퓨린 유사체로 선택될 수 있는 지점에서의 컷오프를 추가로 예시한 것이다.
도 23은 온 표적 (on target) 및 오프 표적 (off target) 효과에 대해 검사된 다양한 가이드 RNA를 예시하는 표를 제시한 것이다.
도 24는 HPRT 녹아웃 Jurkat 세포에서 발광 대 6TG 농도를 나타내는 그래프를 제공하는 것이다.
도 25는 HPRT 녹아웃 및 야생형 Jurkat 세포의 웨스턴 블롯을 제공하는 것이며, 여기서, 액틴은 단백질 대조군으로서 사용되었다.
도 26은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP) 대 HPRT 녹아웃 생존 이점의 그래프를 제시한 것이며, 여기서, 상기 그래프는 시간에 대한 생존 세포의 백분율을 제공한다.
도 27은 GFP 대 HPRT 녹아웃 세포의 형광 활성화 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting: FACS)로부터 수득된 데이터를 제공하는 것이다.
도 28은 야생형 Jurkat 세포에 대한 메토트렉세이트 (MTX) 용량 반응의 결정을 제시하는 그래프를 제공하는 것이며, 여기서, 상기 그래프는 생존 세포의 백분율을 나타낸다.
도 29는 HPRT 녹아웃 및 야생형 Jurkat 세포에 대한 메토트렉세이트 용량 반응의 결정을 예시하는 그래프를 제공하는 것이며, 여기서, 상기 그래프는 용량 반응 대 메토트렉세이트 농도의 변화를 예시한다.
도 30a는 렌티바이러스 벡터 TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP에 의한 HPRT 녹다운 Jurkat T 세포 형질 도입체에 상응하는 FACS 데이터를 제공하는 것이다.
도 30b는 렌티바이러스 벡터 TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734로 형질 도입된 HPRT 녹다운 Jurkat T 세포에 상응하는 FACS 데이터를 제공하는 것이다.
도 31은 렌티바이러스 벡터 TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP 또는 TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734에 의한 HPRT 녹다운 CEM 세포 형질 도입체를 사용한 6TG 선택을 예시하는 그래프를 제공하는 것이다.
도 32는 본 개시 내용의 일부 실시 형태에 따른 렌티바이러스 벡터 내에 포함된 요소들을 예시한 것이다. 상기 도면은 다른 요소들에 대한 특정 요소들의 상대적 배향을 추가로 예시한 것이다. 예를 들어, 7sk 구동 sh734 요소는 UbC 구동 GFP와 비교하여 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 또한, 상기 도면은 7sk 구동 sh734 요소가 다른 벡터 요소의 업스트림 또는 다운스트림, 예를 들어, UbC 구동 GFP의 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다는 것을 예시한 것이다.
도 33은 4개의 벡터 중 하나로 형질 도입된 후 GFP를 발현하는 세포의 백분율 그래프를 제공하는 것이다.
서열 목록
본 출원에 첨부된 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에 규정된 바와 같이 뉴클레오타이드 염기에 대해 표준 문자 약어 및 아미노산에 대해 3개의 문자 코드를 사용하여 표시된다. 서열 목록은 본 출원에 참조로 포함되는, 2019년 12월 19일자로 생성된 26KB의 "Calimmune-072WO_ST25.txt"라는 명칭의 ASCII 텍스트 파일로서 제출된다.
정의
명백히 반대로 명시되지 않는다면, 하나 이상의 단계 또는 행위를 포함하는 본 출원의 청구범위의 임의의 방법들에서, 상기 방법의 단계들 또는 행위들의 순서는 상기 방법의 단계들 또는 행위들을 인용하는 순서에 반드시 제한되지 않는다는 것을 또한 이해해야 한다.
본 출원에서 사용되는 "한 (a)", "한 (an)" 및 "상기 (the)"라는 단수 용어는 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는다면 복수의 지시 대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는다면 "및"을 포함하도록 의도된다.
본 명세서 및 청구범위에서 본 출원에 사용되는 "적어도 하나"라는 문구는, 하나 이상의 요소들의 목록과 관련하여, 요소들의 목록 중 임의의 하나 이상의 요소들로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소들의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하지는 않으며 요소들의 목록 중 요소들의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는, 구체적으로 확인된 요소들과 관련되든 관련되지 않든 "적어도 하나"라는 문구가 언급하는 요소들의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소들 이외의 다른 요소들이 임의로 존재할 수 있도록 또한 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 하나의 실시 형태에서, B가 존재하지 않고 (및 B 이외의 다른 요소들을 임의로 포함함) 하나 초과의 A를 임의로 포함하는 적어도 하나; 또 다른 실시 형태에서, A가 존재하지 않고 (및 A 이외의 다른 요소들을 임의로 포함함) 하나 초과의 B를 임의로 포함하는 적어도 하나; 더 또 다른 실시 형태에서, 하나 초과의 A를 임의로 포함하는 적어도 하나 및 하나 초과의 B를 임의로 포함하는 적어도 하나 (및 다른 요소들을 임의로 포함함) 등을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "~을 포함하는 (comprising)", "~을 포함하는 (including)", "~을 갖는 (having)" 등이라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며 동일한 의미를 갖는다. 유사하게, "~을 포함한다 (comprises)", "~을 포함한다 (includes)", "~을 갖다 (has)" 등은 상호 교환적으로 사용되며 동일한 의미를 갖는다. 구체적으로, 상기 용어들 각각은 "적어도 다음"을 의미하는 개방 용어로 해석되어야 하며, 또한 추가의 특징들, 제한 사항들, 양태들 등을 배제하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "성분 a, b 및 c를 갖는 장치"는 장치가 적어도 성분 a, b 및 c를 포함한다는 것을 의미한다. 유사하게, "단계 a, b 및 c를 포함하는 방법"이라는 문구는 방법이 적어도 단계 a, b 및 c를 포함한다는 것을 의미한다. 또한, 단계 및 공정이 특정 순서로 본 출원에서 개략적으로 서술될 수 있지만, 통상의 기술자는 주문 단계 및 공정이 다양할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 본 출원에 사용되는 "또는"은 상기에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉, 다수의 요소들 또는 요소들의 목록 중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 이들 중 하나 초과 및 임의로 목록에 없는 추가의 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 때의 "~로 이루어진"과 같이 명백히 반대로 명시되는 용어만은 다수의 요소들 또는 요소들의 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본 출원에서 사용되는 "또는"이라는 용어는 "둘 중 하나", "~ 중 하나", "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배타적인 용어가 앞에 올 때 배타적인 대안 (즉, "하나 또는 다른 하나, 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로만 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용될 때의 "~로 필수적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 일반적인 의미를 가져야 한다.
본 출원에서 사용되는 "투여하다" 또는 "투여하는"이라는 용어는 본 출원에서 기재된 것들을 비롯하여 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 사람 환자)에게 조성물, 제형 또는 특정 작용제를 제공하는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "Cas 단백질"이라는 용어는 Cas 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 의미한다. Cas 단백질은 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat: 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복체) 관련 뉴클레아제로도 또한 지칭될 수 있다. CRISPR은 이동 유전 요소 (바이러스, 전이 요소 및 접합 플라스미드)에 대해 방어를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 대해 상보적인 서열 및 표적 침입 핵산을 포함한다. CRISPR 클러스터는 전사되어 CRISPR RNA (crRNA)로 가공된다. Cas 단백질로는 Cas9 단백질, Cas9 상동체에 의해 인코딩되는 Cas9 유사 단백질, Cas9 유사 합성 단백질, Cpf1 단백질, Cpf1 상동체에 의해 인코딩되는 단백질, Cpf1 유사 합성 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, 및 이의 변이체 및 변형이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. Cas 단백질의 추가 예로는 Cpf1, C2c1, C2c3,　Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 또한 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, C2c1, C2c3,　Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, and Cas13c이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시 형태에서, Cas 단백질은 클래스 2 CRISPR 관련 단백질이다. 본 출원에서 정의되는 "클래스 2 유형 CRISPR-Cas 시스템"은 단일 단백질과 이펙터 복합체 (예를 들어, Cas9)로서 기능하는 CRISPR-Cas 시스템을 지칭한다. 본 출원에서 정의되는 "클래스 2 유형 II CRISPR-Cas 시스템"은 이의 cas 유전자 중 Cas9 유전자를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 지칭한다. "클래스 2 유형 II- A CRISPR-Cas 시스템"은 cas9 및 Csn2 유전자를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 지칭한다. "클래스 2 유형 ll-B CRISPR-Cas 시스템"은 cas9 및 cas4 유전자를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 지칭한다. "클래스 2 유형 ll-C CRISPR-Cas 시스템"은 Cas9 유전자를 포함하지만 Csn2 및 Cas4 유전자를 포함하지 않는 CRISPR-Cas 시스템을 지칭한다. "클래스 2 유형 V CRISPR-Cas 시스템"은 이의 cas 유전자 중 cas12 유전자 (Cas12a, 12b 또는 12c 유전자)를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 지칭한다. "클래스 2 유형 VI CRISPR-Cas 시스템"은 이의 Cas 유전자 중 Cas13 유전자 (Cas13a, 13b 또는 13c 유전자)를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 지칭한다. 각각의 야생형 Cas 단백질은 하나 이상의 동족 폴리뉴클레오타이드 (가장 일반적으로는 RNA)와 상호 작용하여 핵 단백질 복합체 (가장 일반적으로는 리보핵단백질 복합체)를 형성한다. 추가의 Cas 단백질은 문헌 [Haft et. al., "A Guild of 45 CRISPR-Associated (Cas) Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes, PLoS Comput. Biol., 2005, Nov; 1(6): e60]에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, Cas 단백질은 변형된 Cas 단백질, 예를 들어. 본 출원에서 확인되는 임의의 Cas 단백질의 변형된 변이체이다.
본 출원에서 사용되는 "Cas9" 또는 "Cas9 단백질"이라는 용어는 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 상보적 서열을 보유하는 CRISPR RNA (crRNA)에 의해 안내되는 최소 엔도뉴클레아제 활성 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 내에서 포스포디에스테르 결합의 절단)을 나타낼 수 있는 효소 (야생형 또는 재조합)를 지칭한다. Cas9 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 세균 및 고세균과 같은 원핵 생물 공급원을 비롯한 다양한 생물학적 공급원 중 임의의 것으로부터 유래된 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 세균 Cas9로는 악티노박테리아 (Actinobacteria) (예를 들어, 악티노마이세스 네슬룬디 (Actinomyces naeslundii)) Cas9, 아퀴피케 (Aquificae) Cas9, 박테로이데테스 (Bacteroidetes) Cas9, 클라미디에 (Chlamydiae) Cas9, 클로로플렉시 (Chloroflexi) Cas9, 시아노벡테리아 (Cyanobacteria) Cas9, 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia) Cas9, 피브로박테레스 (Fibrobacteres) Cas9, 피르미쿠테스 (Firmicutes) Cas9 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) Cas9, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) Cas9, 리스테리아 이노쿠아 (Listeria innocua) Cas9, 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae) Cas9, 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans) Cas9 및 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium) Cas9), 푸소박테리아 (Fusobacteria) Cas9, 프로테오박테리아 (Proteobacteria) (예를 들어, 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitides), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 및 캄필로박터 라리 (Campylobacter lari) Cas9, 스피로카에테스 (Spirochaetes) (예를 들어, 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola)) Cas9 등이 포함된다. 고세균 Cas 9로는 유리아케오타 (Euryarchaeota) Cas9 (예를 들어, 메타노코커스 마리팔루디스 (Methanococcus maripaludis) Cas9) 등이 포함된다. 다양한 Cas9 및 관련 폴리펩타이드는 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Makarova et al. (2011) Nature Reviews Microbiology 9:467-477], [Makarova et al. (201 1) Biology Direct 6:38], [Haft et al. (2005) PLOS Computational Biology I:e60] 및 [Chylinski et al. (2013) RNA Biology 10:726-737]; [K. Makarova et al., An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. (2015) Nat. Rev. Microbio. 13:722-736]; 및 [B. Zetsche et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. (2015) Cell. 163(3):759-771]에서 검토된다.
기타 Cas9 폴리펩타이드로는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다 (Francisella tularensis subsp. novicida) Cas9, 파스퇴렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) Cas9, 마이코플라스마 칼리셉티쿰 균주 F (Mycoplasma gallisepticum str. F) Cas9, 니트라티프락토르 살수기니스 균주 DSM 16511 (Nitratifractor salsuginis str. DSM 16511) Cas9, 파르비바쿨룸 라바멘티보란스 (Parvibaculum lavamentivorans) Cas9, 로세부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinalis) Cas9, 나이세리아 시네라 (Neisseria cinera) Cas9, 글루콘아세토박터 디아조트로피쿠스 (Gluconacetobacter diazotrophicus) Cas9, 아조스피릴륨 (Azospirillum) B510 Cas9, 스파에로카에타 글로부스 균주 버디 (Spaerochaeta globus str. Buddy) cas9, 플라보박테리움 콜룸나레 (Flavobacterium columnare) Cas9, 플루비콜라 타펜시스 (Fluviicola taffensis) Cas9, 박테로이데스 코프로필루스 (Bacteroides coprophilus) Cas9, 마이코플라스마 모빌레 (Mycoplasma mobile) Cas9, 락토바실러스 파르시미니스 (Lactobacillus farciminis) Cas9, 스트렙토코커스 파스퇴리아누스 (Streptococcus pasteurianus) Cas9, 락토바실러스 존소니이 (Lactobacillus johnsonii) Cas9, 스태필로코커스 슈딘테르메디우스 (Staphlococcus pseudintermedius) Cas9, 필리팍터 알로시스 (Filifactor alocis) Cas9, 트레포네마 덴티콜라 Cas9, 레지오넬라 뉴모필라 균주 파리스 (Legionella pneumophila str. Paris) Cas9, 수테렐라 와즈워텐시스 (Sutterella wadsworthensis) Cas9 및 코리네박터 디프테리아 (Corynebacter diptheriae) Cas9가 포함된다. "Cas9"라는 용어는 Cas9의 임의의 이소형을 비롯한 임의의 Cas9 계열의 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 본 출원에서 구체적으로 명시되거나 제공된 것들 이외의 다양한 Cas9 동족체, 상동체 및 변이체의 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 당해 분야의 통상의 기술자의 범위 내에서, 따라서, 본 개시 내용의 사상 및 범위 내에서 공개적으로 이용 가능하다.
본 출원에서 사용되는 "Cas12" 또는 "Cas12 단백질"이라는 용어는 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e와 같은 Cas12 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 Cas12 단백질을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, Cas12 단백질은 기능적 Cas12 단백질, 특히, 애시드아미노코커스 종 균주 (Acidaminococcus sp. strain) BV3L6 (Uniprot 엔트리: U2UMQ6; Uniprot 엔트리 명칭: CS12A_ACISB) 유래의 Cas12a/Cpf1 단백질 또는 프란시셀라 툴라렌시스 (Uniprot 엔트리: A0Q7Q2; Uniprot 엔트리 명칭: CS12A_FRATN) 유래의 Cas12a/Cpf1 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85% (또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 Cas12 단백질은 자연에서 발견되는 단백질과 실질적으로 동일한 Cas12 폴리펩타이드 또는 자연에서 발견되는 Cas12 단백질과 적어도 85%의 서열 동일성 (또는 적어도 90%의 서열 동일성 또는 적어도 95%의 서열 동일성 또는 적어도 96%의 서열 동일성 또는 적어도 97%의 서열 동일성 또는 적어도 98%의 서열 동일성 또는 적어도 99%의 서열 동일성)을 갖고 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 Cas12 폴리펩타이드일 수 있다. Cas12a 단백질의 예로는 FnCas12a, AsCas12a, LbCas12a, Lb5Cas12a, HkCas12a, OsCas12a, TsCas12a, BbCas12a, BoCas12a　또는 Lb4Cas12a가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니며; 상기　Cas12a는 바람직하게는 LbCas12a이다. Cas12b 단백질의 예로는 AacCas12b, Aac2Cas12b, AkCas12b, AmCas12b, AhCas12b, AcCas12b가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 "유효량"이라는 문구는 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 찾고 있는 조직, 시스템, 동물 또는 사람의 진단적, 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 본 출원에서 기재된 조성물 또는 제형의 양을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "발현 카세트"라는 용어는 RNA를 발현할 수 있는 벡터 내의 하나 이상의 유전자 서열, 및 일부 실시 형태에서는 이후의 단백질을 지칭한다. 상기 발현 카세트는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 관심 대상 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 관심 대상 유전자, 및 발현을 위한 분자 (예를 들어, RNAi)를 인코딩하는 적어도 하나의 추가의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 카세트 내의 핵산이 RNA로 전사되고, 필요에 따라, 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되고, 형질 전환된 세포 (예를 들어, 형질 도입된 줄기 세포)에서 활성에 필요한 적절한 번역 후 변형을 겪고, 적절한 세포내 구획으로 표적화되거나 세포외 구획으로의 분비를 표적화함으로써 생물학적 활성을 위한 적절한 구획으로 전위될 수 있도록, 상기 발현 카세트는 벡터 내에서 위치적으로 및 순차적으로 배향된다. 일부 실시 형태에서, 상기 카세트는 벡터 내로 즉시 삽입되도록 배치된 이의 3' 및 5' 말단을 가지며, 예를 들어, 이것은 각 말단에 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다.
본 출원에서 사용되는 "기능적 핵산"이라는 용어는 단백질을 인코딩하는 전사물과 직접 상호 작용함으로써 단백질의 발현을 감소시키는 능력을 갖는 분자를 지칭한다. siRNA 분자, 리보자임 및 안티센스 핵산은 예시적인 기능적 핵산을 구성한다.
본 출원에서 사용되는 "유전자"라는 용어는 광범위하게는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 분절을 지칭한다. 유전자는 코딩 서열, 프로모터 영역, 시스-조절 서열, 조절 단백질에 대한 특이적 인지 서열인 비발현 DNA 분절, 유전자 발현에 기여하는 비발현 DNA 분절, 목적하는 파라미터들 또는 이들의 조합을 갖도록 설계된 DNA 분절을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 서열을 포괄한다.
본 출원에서 사용되는 "유전자 침묵"이라는 용어는 유전자, 전사물 및/또는 폴리펩타이드 산물의 하향 조절, 녹다운, 분해, 저해, 억제, 억압, 예방 또는 발현 감소를 기술하는 것을 의미한다. 유전자 침묵 및 간섭은 또한 mRNA 전사물의 폴리펩타이드로의 번역 방지를 기술한다. 일부 실시 형태에서, 번역은 mRNA 전사물을 분해하거나 mRNA 번역을 차단함으로써 예방, 억제 또는 감소된다.
본 출원에서 사용되는 "유전자 발현"이라는 용어는 생물학적 활성 폴리펩타이드가 DNA 서열로부터 생성되는 세포 과정을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"라는 용어는 특정 표적 핵산을 표적화하고 절단하는 뉴클레아제 활성을 갖는 CRISPR 이펙터를 지시할 수 있는 RNA 분자를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "조혈 세포 이식 (transplant)" 또는 "조혈 세포 이식 (transplantation)"이라는 용어는 골수 이식, 말초 혈액 줄기 세포 이식, 제정맥 혈액 이식, 또는 만능 조혈 줄기 세포의 임의의 다른 공급원을 지칭한다. 유사하게, "줄기 세포 이식 (transplant)" 또는 "이식 (transplant)"이라는 용어는 약제학적으로 허용되는 담체와 접촉 (예를 들어, 현탁)되는 줄기 세포를 포함하는 조성물을 지칭한다. 이러한 조성물은 카테터를 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "숙주 세포"라는 용어는 본 개시 내용의 방법을 사용하여 변형되는 세포를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 발현 벡터를 발현할 수 있는 포유 동물 세포이다. 적합한 포유 동물 숙주 세포로는 사람 세포, 쥐과 동물 세포, 비사람 영장류 세포 (예를 들어, 붉은털 원숭이 세포), 사람 선조 세포 또는 줄기 세포, 293 세포, HeLa 세포, D17 세포, MDCK 세포, BHK 세포 및 Cf2Th 세포가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는 조혈 선조 세포/줄기 세포 (예를 들어, CD34 양성 조혈 선조 세포/줄기 세포), 단핵구, 대식 세포, 말초 혈액 단핵 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 또는 수지상 세포와 같은 조혈 세포이다. 본 개시 내용의 발현 벡터로 형질 도입되는 조혈 세포 (예를 들어, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 및/또는 단핵구/대식 세포)는 동종 이계 또는 자가 유래이거나, 일치된 형제로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 조혈 선조 세포/줄기 세포는 CD34 양성이며, 환자의 골수 또는 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 단리된 CD34 양성 조혈 선조 세포/줄기 세포 (및/또는 본 출원에서 기재된 다른 조혈 세포)는 본 출원에서 기재된 바와 같은 발현 벡터로 형질 도입된다.
본 출원에서 사용되는 "하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제" 또는 "HPRT"라는 용어는 HPRT1 유전자 (예를 들어, 서열 번호 12 참조)에 의해 인코딩되는 퓨린 대사에 관여하는 효소를 지칭한다. HPRT1은 X 염색체 상에 위치하므로, 남성에서 단일 카피로 존재한다. HPRT1은 5-포스포리보실 1-피로포스페이트의 5-포스포로보실 기를 퓨린으로 전이시킴으로써 하이포크산틴을 이노신 모노포스페이트로, 구아닌을 구아노신 모노포스페이트로의 전환을 촉매하는 트랜스퍼라아제를 인코딩한다. 상기 효소는 재생 퓨린 합성에 사용하기 위해 분해된 DNA로부터 퓨린을 회수하는 기능을 주로 한다.
본 출원에서 사용되는 "인델 (indel)"이라는 용어는 삽입과 결실의 블렌드로 명명된 돌연변이를 지칭한다. 이것은 차이가 원래 서열 삽입 또는 서열 결실에 기인한 것인지 알 수 없는 2개의 대립 유전자들 사이의 길이 차이를 지칭한다. 삽입/결실에서의 뉴클레오타이드의 수가 3으로 나누어지지 않고 이것이 단백질 코딩 영역에서 발생하는 경우, 이것은 또한 프레임시프트 돌연변이이다 (프레임시프트 돌연변이는 일반적으로 돌연변이 후 코돈을 판독하여 다른 아미노산을 코딩하도록 할 것이다).
본 출원에서 사용되는 "렌티바이러스"라는 용어는 분열 세포 및 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇 가지 예로는 사람 후천성 면역 결핍 증후군 (human acquired immunodeficiency syndrome: AIDS)의 병인체인 사람 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV; HIV 유형 1 및 HIV 유형 2 포함); 양에서 뇌염 (비스나 (visna)) 또는 폐렴 (매디 (maedi))을 유발하는 비스나-매디; 염소에서 면역 결핍, 관절염 및 뇌병증을 유발하는 염소 관절염-뇌염 바이러스; 말에서 자가 면역 용혈성 빈혈 및 뇌병증을 유발하는 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이에서 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역 결핍 바이러스 (feline immunodeficiency virus: FIV); 소에서 림프절 병증, 림프구 증가증 및 가능하게는 중추 신경계 감염을 유발하는 소 면역 결핍 바이러스 (bovine immune deficiency virus: BIV); 및 사람 이하 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 유발하는 유인원 면역 결핍 바이러스 (simian immunodeficiency virus: SIV)가 포함된다.
본 출원에서 사용되는 "렌티바이러스 벡터"라는 용어는 렌티바이러스로부터 유래된 핵산의 임의의 형태를 나타내기 위해 사용되며, 형질 도입을 통해 유전 물질을 세포 내로 전달하는데 사용된다. 상기 용어는 렌티바이러스 벡터 핵산, 예를 들어, 이러한 핵산의 캡슐화 형태인 DNA 및 RNA, 및 바이러스 벡터 핵산이 포장된 바이러스 입자를 포괄한다.
본 출원에서 사용되는 "녹 다운" 또는 "녹다운"이라는 용어는, 유전자 발현에 대한 RNAi의 효과와 관련하여 사용될 때, 유전자 발현의 수준이 억제되거나 실질적으로 동일한 조건이지만 RNAi의 부재하에 검사될 때 일반적으로 관찰되는 수준 미만으로 감소된다는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "녹 아웃" 또는 "녹아웃"이라는 용어는 내인성 유전자의 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 지칭한다. 이것은 일반적으로 유전자의 일부를 결실시키거나 일부를 제2 서열로 대체함으로써 달성되지만, 또한 유전자에 대한 다른 변형, 예를 들어, 중요한 아미노산의 돌연변이, 인트론 접합부의 제거 등에 기인할 수 있다. 따라서, "녹 아웃" 작제물은 세포 내로 도입될 때 세포에서 내인성 DNA에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 억제 (부분 또는 완전)를 초래하는 DNA 작제물과 같은 핵산 서열이다. 일부 실시 형태에서, "녹아웃"은 점 돌연변이, 삽입, 결실, 프레임시프트, 또는 과오 돌연변이와 같은 돌연변이를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "감염 다중도" 또는 "MOI"라는 용어는 감염 표적 (예를 들어, 세포)에 대한 작용제 (예를 들어, 파지 또는 보다 일반적으로는 바이러스,　세균)의 비율을 의미한다. 예를 들어, 바이러스 입자로 접종된 세포 그룹을 언급할 때, 감염 다중도 또는 MOI는 정의된 공간에 존재하는 표적 세포 수에 대한 바이러스 입자 수의 비율이다.
본 출원에서 사용되는 "미니 세포 (minicell)"라는 용어는 이분열 동안 세포 분열과 DNA 분리의 조정 장애에 의해 초래되는 무핵 형태의 세균 세포를 지칭한다. 미니 세포는, 특정 상황에서 자발적으로 생성 및 방출되고 미니 세포와는 대조적으로 특정 유전자 재배열 또는 에피솜 유전자 발현으로 인한 것인 다른 작은 소포체와 구별된다. 본 개시 내용의 미니 세포는 이분열 동안 세포 분열과 DNA 분리의 조정 장애에 의해 초래되는 무핵 형태의 이. 콜라이 (E. coli) 또는 다른 세균 세포이다. 원핵 생물의 염색체 복제는 미드 세포 (mid-cell) 격막 형성을 포함하는 정상 이분열과 관련이 있다. 이. 콜라이에서, 예를 들어, minCD와 같은 min 유전자의 돌연변이는 세포 분열 동안 세포극에서 격막 형성 억제를 제거하여 정상 딸 세포와 무핵 미니 세포의 생성을 초래할 수 있다. 문헌 [de Boer et al., 1992]; [Raskin & de Boer, 1999]; [Hu & Lutkenhaus, 1999]; [Harry, 2001]을 참조한다. 미니 세포는, 특정 상황에서 자발적으로 생성 및 방출되고 미니 세포와는 대조적으로 특정 유전자 재배열 또는 에피솜 유전자 발현으로 인한 것인 다른 작은 소포체와 구별된다. 본 개시 내용을 실시하기 위해, 미니 세포가 온전한 세포벽 ("온전한 미니 세포")을 갖는 것이 바람직하다. min 오페론 돌연변이에 추가하여, 무핵 미니 세포는 또한 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis)의 divIVB1에서와 같이 격막 형성에 영향을 미치는 다양한 다른 유전자 재배열 또는 돌연변이에 따라 생성된다. 문헌 [Reeve and Cornett, 1975]; [Levin et al., 1992]을 참조한다. 미니 세포는 또한 세포 분열/염색체 분리에 관여하는 단백질의 유전자 발현 수준의 동요에 따라 형성될 수 있다. 예를 들어, minE의 과발현은 극 분열 및 미니 세포의 생성을 초래한다. 유사하게, 무염색체 미니 세포는, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)의 smc 돌연변이 (문헌 [Britton et al., 1998]), 바실러스 서브틸리스의 spoOJ 결실 (문헌 [Ireton et al., 1994]),이. 콜라이의 mukB 돌연변이 (문헌 [Hiraga et al., 1989]) 및 이. 콜라이의 parC 돌연변이 (문헌 [Stewart and D'Ari, 1992])와 같은 염색체 분리의 결함으로 인해 생성될 수 있다. 유전자 산물은 트랜스로 (in trans) 공급될 수 있다. 예를 들어, 높은 카피 수의 플라스미드에서 과발현될 때, CafA는 세포 분열 속도를 증진시키고/시키거나 복제 후 염색체 분할을 억제할 수 있어 (문헌 [Okada et al., 1994]), 연쇄 세포와 무핵 미니 세포의 형성을 초래한다 (문헌 [Wachi et al., 1989]; [Okada et al., 1993]). 미니 세포는 그람 양성 또는 그람 음성 기원의 모든 모든 세포에서 생성될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "돌연변이된"이라는 용어는 각각의 서열의 본래, 야생형, 표준 또는 참조 버전, 즉, 비돌연변이 서열로부터의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 같은 서열의 변화를 지칭한다. 돌연변이된 유전자는 돌연변이된 유전자 산물을 초래할 수 있다. 돌연변이된 유전자 산물은 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 비돌연변이된 유전자 산물과 상이할 것이다. 일부 실시 형태에서, 돌연변이된 유전자 산물을 초래하는 돌연변이된 유전자는 상응하는 비돌연변이된 뉴클레오타이드 서열과 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "나노캡슐"이라는 용어는 하나 이상의 성분, 예를 들어, 하나 이상의 단백질 및/또는 하나 이상의 핵산을 캡슐화하는 쉘, 예를 들어, 중합체성 쉘을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 약 200 나노미터 (nm) 이하, 예를 들어, 약 1 내지 200 nm, 또는 약 5 내지 약 200 nm, 또는 약 10 내지 약 150 nm, 또는 15 내지 100 nm, 또는 약 15 내지 약 150 nm, 또는 약 20 내지 약 125 nm, 또는 약 50 내지 약 100 nm, 또는 약 50 내지 약 75 nm의 평균 직경을 갖는다. 다른 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 약 10 nm 내지 약 20 nm, 약 20 내지 약 25 nm, 약 25 nm 내지 약 30 nm, 약 30 nm 내지 약 35 nm, 약 35 nm 내지 약 40 nm, 약 40 nm 내지 약 45 nm, 약 45 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 55 nm, 약 55 nm 내지 약 60 nm, 약 60 nm 내지 약 65 nm, 약 70 내지 약 75 nm, 약 75 nm 내지 약 80 nm, 약 80 nm 내지 약 85 nm, 약 85 nm 내지 약 90 nm, 약 90 nm 내지 약 95 nm, 약 95 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 110 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 약 1 시간 또는 약 2 시간 또는 약 3 시간 또는 약 4 시간 또는 약 5 시간 또는 약 6 시간 또는 약 12 시간 또는 약 1일 또는 약 2일 또는 약 1 주일 또는 약 1 개월 내에 분해되도록 설계된다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐의 표면은 약 1 내지 약 15 밀리볼트 (mV) (예를 들어, 표준 포스페이트 용액 중에서 측정될 때)의 전하를 가질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 나노캡슐의 표면은 약 1 내지 약 10 mV의 전하를 가질 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "양으로 하전된 단량체" 또는 "양이온성 단량체"라는 용어는 순 양전하, 즉 +1, +2, +3을 갖는 단량체를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 상기 양으로 하전된 단량체는 양으로 하전된 기를 포함하는 단량체이다. 본 출원에서 사용되는 "음으로 하전된 단량체" 또는 "음이온성 단량체"라는 용어는 순 음전하, 즉 -1, -2, -3을 갖는 단량체를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 상기 음으로 하전된 단량체는 음으로 하전된 기를 포함하는 단량체이다. 본 출원에서 사용되는 "중성 단량체"라는 용어는 순 중성 전하를 갖는 단량체를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "중합체"라는 용어는 단독중합체, 공중합체, 상호 침투 네트워크 및 올리고머를 포함하는 것으로서 정의된다. 따라서, 중합체라는 용어는 본 출원에서 단독중합체, 공중합체, 상호 침투 중합체 네트워크 등과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. "단독중합체"라는 용어는 단일 종의 단량체로부터 유도된 중합체로서 정의된다. "공중합체"라는 용어는 2개의 단량체 종의 공중합에 의해 수득된 공중합체, 3개의 단량체 종으로부터 수득된 공중합체 ("3원 공중합체"), 4개의 단량체 종으로부터 수득된 공중합체 ("4원 공중합체") 등을 비롯한 하나 초과의 단량체 종으로부터 유도된 중합체로서 정의된다. "공중합체"라는 용어는 랜덤 공중합체, 교대 공중합체, 그래프트 공중합체 및 블록 공중합체를 포함하는 것으로서 추가로 정의된다. 상기 용어가 일반적으로 사용되는 공중합체는 상호 침투 중합체 네트워크를 포함한다. "랜덤 공중합체"라는 용어는, 쇄의 임의의 주어진 부위에서 주어진 단량체 단위를 찾을 확률이 인접 단위의 성질과 무관한 거대 분자를 포함하는 공중합체로서 정의된다. 랜덤 공중합체에서, 단량체 단위의 순서 분포는 베르누이 통계를 따른다. "교대 공중합체"라는 용어는 교대 순서로 2종의 단량체 단위를 포함하는 거대 분자를 포함하는 공중합체로서 정의된다.
본 출원에서 사용되는 "가교제"라는 용어는 2개 이상의 분자 쇄들, 도메인들 또는 다른 모이어티들 사이에 연결 (예를 들어, 분자내 연결 또는 분자간 연결)을 제공하는 결합 또는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 가교제는 분자 쇄들 사이에 연결을 형성하여 연결된 분자를 형성하는 분자이다.
본 출원에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터, 신호 서열, 인핸서 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 여기서, 상기 발현 제어 서열은 적절한 분자 (예를 들어, 전사 활성 인자 단백질)가 발현 제어 서열에 결합될 때 상기 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다.
본 출원에서 사용되는 "프로모터"라는 용어는 RNA 중합체라아제가 결합하는 폴리뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA)의 인지 부위를 의미한다. RNA 중합체라아제는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사한다. 일부 실시 형태에서, 포유 동물 세포에서 작동하는 프로모터는, 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 업스트림에 위치한 AT 풍부 영역 및/또는 전사 개시로부터 70 내지 80개 염기 업스트림에서 발견된 또 다른 서열, CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다)을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제"라는 용어는, 일반적으로 안전하고 무독성이며 생물학적으로나 그렇지 않은 경우에도 바람직한 약제학적 제형을 제조하는데 유용한 담체 또는 부형제를 지칭하며, 사람의 약제학적 용도 뿐만 아니라, 수의학적 용도로도 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "레트로바이러스"라는 용어는 숙주 세포 게놈에 통합되는 cDNA 카피로 레트로바이러스 역전사 효소에 의해 역전사되는 RNA 게놈을 갖는 바이러스를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 간단히 말하자면, 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 관심 대상 유전자를 인코딩하는 핵산을 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다. 비리온을 생성하기 위해, gag, pol 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 패키징 성분을 함유하지 않는 패키징 세포주를 작제한다 (문헌 [Mann et al., Cell, Vol. 33:153-159, 1983]). 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 이러한 세포주 내로 도입될 때, 상기 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자 내로 패키징된 다음 배양 배지 내로 분비되도록 한다. 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전달에 사용한다.
본 출원에서 사용되는 "siRNA" 또는 "소간섭 RNA"라는 용어는, RNAi (RNA 간섭), 즉, 표적 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 mRNA의 절단을 통해 표적 유전자의 발현을 억제하는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 수십 개의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 이중 가닥 RNA를 지칭한다. RNA 간섭 ("RNAi")은 다수의 진핵 생물 전체에 걸쳐 보존되는 유전자 발현의 전사 후 억제 방법이며, 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 갖는 센스 RNA 및 이에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 RNA로 구성된 이중 가닥 RNA가 세포 등에 도입되어 표적 유전자의 mRNA의 분해를 선택적으로 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 지칭한다. RNAi는 세포에 존재하는 짧은 (즉, 약 30개 미만의 뉴클레오타이드) 이중 가닥 RNA 분자에 의해 유도된다 (문헌 [Fire A. et al.,　Nature,　391: 806-811, 1998]). siRNA가 세포 내로 도입될 때, siRNA와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 유전자의 mRNA 발현은 억제된다.
본 출원에서 사용되는 "작은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"라는 용어는 안티센스 영역, 루프 부분 및 센스 영역을 포함하는 RNA 분자를 지칭하며, 여기서, 상기 센스 영역은 상기 안티센스 영역과 염기쌍을 형성하여 듀플렉스 줄기를 형성하는 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 전사 후 가공 후, 상기 작은 헤어핀 RNA는 RNase III 계열의 구성원인 상기 효소에 의해 매개되는 절단 이벤트에 의해 소간섭 RNA로 전환된다. 본 출원에서 사용되는 "전사 후 가공"이라는 문구는, 전사 후에 발생하며, 예를 들어, 상기 효소 및/또는 Drosha에 의해 매개되는 mRNA 가공을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "대상체"라는 용어는 사람, 마우스 또는 영장류와 같은 포유 동물을 지칭한다. 전형적으로, 상기 포유 동물는 사람 (호모 사피엔스)이다.
본 출원에서 사용되는 "실질적 HPRT 결핍"이라는 용어는, HPRT 유전자 발현의 수준이 적어도 약 55%까지 감소된 세포, 예를 들어, 숙주 세포를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 55%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 60%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 65%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 70%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 75%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 80%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 85%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 90%까지 감소된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 95%까지 감소된다. 다른 실시 형태에서, 잔류 HPRT 유전자 발현은 최대 약 40%이다. 다른 실시 형태에서, 잔류 HPRT 유전자 발현은 최대 약 35%이다. 다른 실시 형태에서, 잔류 HPRT 유전자 발현은 최대 약 30%이다. 다른 실시 형태에서, 잔류 HPRT 유전자 발현은 최대 약 25%이다. 다른 실시 형태에서, 잔류 HPRT 유전자 발현은 최대 약 20%이다. 다른 실시 형태에서, 잔류 HPRT 유전자 발현은 최대 약 15%이다. 다른 실시 형태에서, 잔류 HPRT 유전자 발현은 최대 약 10%이다.
본 출원에서 사용되는 "형질 도입하다" 또는 "형질 도입"이라는 용어는 형질 감염에 의해서 보다는 오히려 감염에 의한 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하는 유전자(들)의 전달을 지칭한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 (세포 내로의 핵산의 도입을 위한 발현 벡터로서 사용되는 변형된 레트로바이러스)에 의해 운반되는 항-HPRT 유전자는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포 내로 형질 도입될 수 있다. 따라서, "형질 도입된 유전자"는 렌티바이러스 또는 벡터 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포에 도입된 유전자이다. 바이러스 벡터 (예를 들어, "형질 도입 벡터")는 유전자를 "표적 세포" 또는 숙주 세포 내로 형질 도입한다.
본 출원에서 사용되는 "형질 감염"이라는 용어는 비-바이러스 방법에 의해 네이키드 DNA를 세포 내로 도입하는 과정을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "형질 도입"이라는 용어는 바이러스 벡터를 사용하여 세포 게놈 내로의 외래 DNA의 도입을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "치료", "치료하는" 또는 "치료하다"라는 용어는 특정 병태와 관련하여 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환 및/또는 당해 질환에 기인하는 역효과에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "치료"는 대상체, 특히, 사람에서 질환 또는 장애의 모든 치료를 포함하며, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 질환 또는 장애가 대상체에서 발생하는 것을 예방하는 것, (b) 질환 또는 장애를 억제하는 것, 즉 이의 발달을 저지하는 것; 및 (c) 질환 또는 장애를 경감 또는 완화하는 것, 즉, 질환 또는 장애의 퇴행을 유발하는 것 및/또는 하나 이상의 질환 또는 장애 증상을 완화시키는 것을 포함한다. "치료"는 또한 질환, 장애 또는 병태의 부재하에도 약리학적 효과를 제공하기 위해 작용제의 전달 또는 요법의 투여를 포괄할 수 있다. "치료"라는 용어는 숙주, 바람직하게는 포유 동물 대상체, 보다 바람직하게는 사람에서 질환 또는 장애를 경감시키기 위한 본 개시 내용의 화합물의 투여를 지칭하기 위해 일부 실시 형태에서 사용된다. 따라서, "치료"라는 용어는, 특히 숙주가 질병에 걸리기 쉽지만 질환으로 진단되지 않을 때, 숙주에서 장애가 발생하는 것을 예방하는 것; 장애를 억제하는 것; 및/또는 장애를 완화 또는 역전시키는 것을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 방법이 장애를 예방하는 것에 관한 것인 한, "예방하다"라는 용어는 질환 상태가 완전히 좌절될 것을 요구하지 않는 것으로 이해된다. 오히려, 본 출원에서 사용되는 예방이라는 용어는 본 개시 내용의 화합물의 투여가 질환의 발병 전에 일어날 수 있도록 장애에 걸리기 쉬운 집단을 식별하는 통상의 기술자의 능력을 지칭한다. 상기 용어는 질환 상태가 완전히 방지되어야 한다는 것을 의미하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 세포 내로의 또 다른 핵산 분자의 진입, 예를 들어, 전달, 수송 등을 매개할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 삽입된다. 벡터는 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 바이러스 벡터는 전달된 핵산의 진입을 매개하는 핵산(들)에 추가하여 다양한 바이러스 성분을 포함할 수 있다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 수많은 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 (렌티바이러스 벡터 포함) 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
발현 벡터
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 발현을 위한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 발현 벡터)를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 HPRT 유전자를 녹다운시키거나 그렇지 않으면 HPRT 유전자 발현의 감소를 유발하도록 설계된 작용제를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현은 적어도 약 80% 이상까지 감소된다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA는 상기 발현 벡터에서 발현을 위한 유일한 이식 유전자이다.
일부 실시 형태에서, 상기 발현을 위한 이식 유전자로서 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열로 필수적으로 이루어진 발현 벡터가 제공되며, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 구체적으로, 일부 실시 형태에서, 상기 발현을 위한 유일한 이식 유전자로서 제1 핵산 서열로 필수적으로 이루어진 발현 벡터가 제공되며, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
추가의 양태에서, 상기 이식 유전자로서 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공되며, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 상기 제1 핵산 서열은 발현을 위한 유일한 요소이다. 구체적으로, 일부 실시 형태에서, 상기 발현을 위한 유일한 이식 유전자로서 제1 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공되며, 상기 제1 핵산 서열은 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터이다. 다른 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 게놈은 일반적으로 5' 긴 말단 반복 (long terminal repeat: LTR), gag 유전자, pol 유전자, env 유전자, 보조 유전자 (nef, vif, vpr, vpu) 및 3' LTR로 구성된다. 상기 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5로 호칭되는 3개의 영역으로 나누어진다. 상기 U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. 상기 U5 영역은 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 상기 R (반복) 영역은 U3 및 U5 영역을 분리하고, R 영역의 전사된 서열은 바이러스 RNA의 5' 및 3' 말단 모두에 나타난다. 예를 들어, 문헌 ["RNA Viruses: A Practical Approach", Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)]; [O Narayan and Clements (1989) J. Gen. Virology, Vol. 70:1617-1639]; [Fields et al. (1990) Fundamental Virology Raven Press.; Miyoshi H, Blamer U, Takahashi M, Gage F H, Verma I M. (1998) J Virol., Vol. 72(10):8150 7]; 및 미국 특허 US 6,013,516을 참조한다. HSC를 감염시키는데 사용된 렌티바이러스 벡터의 예는 다음 간행물에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다: 문헌 [Evans et al., Hum Gene Ther., Vol. 10:1479-1489, 1999]; [Case et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 96:2988-2993, 1999]; [Uchida et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 95:11939-11944, 1998]; [Miyoshi et al., Science, Vol. 283:682-686, 1999]; 및 [Sutton et al., J. Virol., Vol. 72:5781-5788, 1998].
일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 변형된 렌티바이러스이므로 분열 세포 및 비분열 세포 모두를 감염시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 렌티바이러스 게놈은 바이러스 복제에 필요한 렌티바이러스 단백질에 대한 유전자가 결핍되어 있으므로 표적 세포에서의 복제와 같은 바람직하지 않은 복제를 방지한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 게놈의 복제에 필요한 단백질은 재조합 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 생성 동안 패키징 세포주에서 트랜스로 제공된다.
일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스의 5' 및 3' 긴 말단 반복 (LTR)으로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 렌티바이러스의 5' LTR로부터의 R 및 U5 서열 및 렌티바이러스로부터의 불활성화된 또는 자가 불활성화된 3' LTR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
렌티바이러스 발현 벡터의 추가의 성분 (및 이러한 벡터의 합성 및/또는 생성 방법)은 미국 출원 공개 US 2018/0112220에 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 서열 번호 16과 적어도 90%의 동일성을 갖는 TL20c 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 서열 번호 16과 적어도 95%의 동일성을 갖는 TL20c 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 서열 번호 17과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 서열 번호 17과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 WPRE 요소 또는 Rev 반응 요소 (예를 들어, 각각 서열 번호 18 및 19 참조) 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 고려되는 렌티바이러스 벡터는 통합 또는 비통합 (통합 결함 렌티바이러스로도 또한 지칭됨)일 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "통합 결함 렌티바이러스" 또는 "IDLV"라는 용어는 바이러스 게놈을 숙주 세포의 게놈 내로 통합하는 능력이 결여된 인테그라아제를 갖는 렌티바이러스를 지칭한다. 일부 적용에서, 통합 렌티바이러스 벡터의 사용은 통합 렌티바이러스에 의해 유도된 잠재적인 삽입 돌연변이 유발을 방지할 수 있다. 통합 결함 렌티바이러스 벡터는 전형적으로 렌티바이러스 인테그라아제 유전자를 돌연변이시키거나 LTR의 부착 서열을 수정함으로써 생성된다 (예를 들어, 문헌 [Sarkis et al.,　Curr. Gene. Ther.,　6: 430-437 (2008)] 참조). 렌티바이러스 인테그라아제는 HIV-1 Pol 영역에 의해 코딩되며, 상기 영역은 역전사, 핵 이동 및 바이러스 입자 조립을 비롯한 다른 중요한 활성을 코딩하므로 삭제될 수 있다. 인테그라아제 단백질을 변경하는 pol의 돌연변이는 다음 2개의 클래스 중 하나로 분류된다: 인테그라아제 활성에만 선택적으로 영향을 미치는 것 (클래스 I); 또는 다면 발현 효과를 갖는 것 (클래스 II). 인테그라아제 단백질의 N 말단 및 C 말단 및 촉매 코어 영역 전체에 걸친 돌연변이는 입자 형성 및 역전사를 비롯한 여러 기능에 영향을 미치는 클래스 II 돌연변이를 생성한다. 클래스 I 돌연변이는 촉매 활성, DNA 결합, 선형 에피솜 가공 및 인테그라아제의 다량체화에 대한 영향을 제한한다. 가장 흔한 클래스 I 돌연변이 부위는 D64, D116 및 E152를 비롯하여 인테그라아제의 촉매 코어에 있는 잔기의 트라이어드 (triad)이다. 각각의 돌연변이는 NILV의 이식 유전자 발현을 유지하면서 정상 통합 벡터보다 최대 4 로그 미만의 통합 빈도로 통합을 효율적으로 억제하는 것으로 나타났다. 통합을 억제하는 또 다른 대안적인 방법은 각각 5' 및 3' LTR의 말단에서 U3 영역의 12개 염기쌍 영역 또는 U5 영역의 11개 염기쌍 영역 내의 인테그라아제 DNA 부착 부위 (LTR att 부위)에 돌연변이를 도입하는 것이다. 이러한 서열은 인테그라아제 매개된 말단 가공 후에 노출되는 보존된 말단 CA 디뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 보존된 CA/TG 디뉴클레오타이드에서의 단일 또는 이중 돌연변이는 통합 빈도의 최대 3 내지 4 로그 감소를 초래하지만; 이것은 효율적인 바이러스 형질 도입에 필요한 다른 모든 바이러스 기능을 보유한다.
일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated virus: AAV) 벡터이다. 본 출원에서 사용되는 "아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터"라는 용어는 (차례로 본 출원에서 언급되는 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는) AAV 벡터 게놈을 함유하는 AAV 바이러스 입자를 의미한다. 이것은 모든 혈청형들의 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV-1 내지 AAV-9, 보다 바람직하게는 AAV-1, AAV-2, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9 및 이들의 조합을 포함하는 것을 의미한다. 상이한 혈청형들의 조합으로부터 생성된 AAV 벡터는 하이브리드 AAV 벡터로서 지칭될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-4, AAV-5 및 AAV-6 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 AAV 벡터는 AAV-5 벡터이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 AAV 벡터는 AAV-2 역위 말단 반복 (ITR)을 포함하는 AAV-5 벡터이다. 본 개시 내용은 자연 발생 바이러스 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 캡시드 단백질의 변이체를 포함하는 AAV 벡터를 또한 고려한다.
HPRT 유전자의 녹다운을 유발하기 위한 성분
일부 실시 형태에서, HPRT 유전자를 녹다운시키도록 설계된 작용제를 인코딩하는 핵산 서열은 RNA 간섭제 (RNAi)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 RNAi 간섭제는 shRNA, 마이크로RNA 또는 이들의 하이브리드이다.
RNAi
일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 RNAi를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다. RNA 간섭은 복잡한 다단계 효소 과정, 예를 들어, 서열 특이적 이중 가닥 소간섭 RNA (siRNA)를 포함하는 과정을 통해 동종 전사물의 분해를 촉발시킴으로써 유전자 발현의 전사 후 침묵을 수행하는 접근법이다. RNAi 경로에 대한 단순화 모델은 각각 리보뉴클레아제 효소를 포함하는 2 단계를 기반으로 한다. 제1 단계에서, 트리거 RNA (dsRNA 또는 miRNA 1차 전사물)는 RNase II 효소인 DICER 및 Drosha에 의해 짧은 간섭 RNA (siRNA)로 처리된다. 제2 단계에서, siRNA는 효과기 복합체 RNA 유도 침묵 복합체 (RNA-induced silencing complex: RISC)에 적재된다. 상기 siRNA는 RISC 조립 동안 풀리며, 단일 가닥 RNA는 mRNA 표적과 하이브리드화한다. 유전자 침묵은 RNase H 효소 아르고너트 (Argonaute) (슬라이서)에 의한 표적화 mRNA의 핵산 분해의 결과인 것으로 여겨진다. siRNA/mRNA 듀플렉스가 불일치를 포함하면, mRNA는 절단되지 않는다. 오히려, 유전자 침묵은 번역 억제의 결과이다.
일부 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 억제 또는 침묵 핵산이다. 본 출원에서 사용되는 "침묵 핵산"은 유전자 발현을 억제하기 위해 특정 서열과 상호 작용할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 침묵 핵산의 예로는 RNA 듀플렉스 (예를 들어, siRNA, shRNA), 잠금 핵산 (locked nucleic acid: "LNA"), 안티센스 RNA, siRNA 또는 shRNA의 센스 및/또는 안티센스 서열을 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드, DNA자임 또는 리보자임이 포함된다. 통상의 기술자는 유전자 발현의 억제가 반드시 특정 열거된 서열로부터의 유전자 발현일 필요는 없으며, 예를 들어, 당해 특정 서열에 의해 제어되는 서열로부터의 유전자 발현일 수 있다는 것을 인식할 것이다.
간섭 RNA를 작제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 간섭 RNA는 2개의 개별 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있으며, 여기서, 한 가닥은 센스 가닥이고, 다른 가닥은 안티센스 가닥이며, 여기서, 상기 안티센스 및 센스 가닥은 자가 상보적이고 (즉, 각각의 가닥은 다른 가닥의 뉴클레오타이드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 예를 들어, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 듀플렉스 또는 이중 가닥 구조를 형성한다); 상기 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 이의 부분 (즉, 바람직하지 않은 유전자) 내의 뉴클레오타이드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 표적 핵산 서열 또는 이의 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 대안으로, 간섭 RNA는 상기 자가 상보적인 센스 및 안티센스 영역이 핵산 기반 또는 비핵산 기반 링커(들)에 의해 연결된 단일 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있다. 상기 간섭 RNA는 자가 상보적인 센스 및 안티센스 영역을 갖는 듀플렉스, 비대칭 듀플렉스, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 이차 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 여기서, 상기 안티센스 영역은 개별 표적 핵산 분자 또는 이의 부분에서 뉴클레오타이드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 상기 간섭 RNA는 2개 이상의 루프 구조 및 자가 상보적인 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 줄기를 갖는 원형 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 여기서, 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 이의 부분 내의 뉴클레오타이드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서, 상기 원형 폴리뉴클레오타이드는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 생성하기 위해 생체내 또는 시험관내에서 가공될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 간섭 RNA 코딩 영역은 센스 영역, 안티센스 영역 및 루프 영역을 갖는 자가 상보적인 RNA 분자를 인코딩한다. 발현될 때, 이러한 RNA 분자는 바람직하게는 "헤어핀" 구조를 형성하며, 본 출원에서 "shRNA"로서 지칭된다. 일부 실시 형태에서, 상기 루프 영역은 일반적으로 약 2 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 길이이다 (단지 예로서, 서열 번호 20 참조). 다른 실시 형태에서, 상기 루프 영역은 약 6 내지 약 9개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 영역 및 상기 안티센스 영역은 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 전사 후 가공 후, 상기 작은 헤어핀 RNA는 RNase III 계열의 구성원인 DICER 효소에 의해 매개되는 절단 이벤트에 의해 siRNA로 전환된다. 상기 siRNA는 상동성을 공유하는 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 추가의 세부 사항은 문헌 [Brummelkamp et al., Science 296:550-553, (2002)]; [Lee et al, Nature Biotechnol., 20, 500-505, (2002)]; [Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol 20:497-500, (2002)]; [Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958, (2002)]; [Paul, Nature Biotechnol, 20, 505-508, (2002)]; [Sui, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 99(6), 5515-5520, (2002)]; 및 [Yu et al. Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052, (2002)]에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
shRNA
일부 실시 형태에서, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1 (본 출원에서 "sh734"로서 지칭됨)과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 96%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열은 변형될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형은 다음을 포함한다: (i) hsa-miR-22 루프 서열 (예를 들어, CCUGACCCA) (서열 번호 21)의 도입; (ii) 5' - 3' 뉴클레오타이드 스페이서, 예를 들어, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드 (예를 들어, TA)를 갖는 것의 부가; (iii) 5' 개시 변형, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드 (예를 들어, G)의 부가; 및/또는 (iv) 2개의 뉴클레오타이드 5' 및 3'의 줄기 및 루프 (예를 들어, 5' A 및 3' T)로의 부가. 일반적으로, 1세대 shRNA는 작은 RNA의 이종 혼합으로 가공되며, 전구체 전사물의 축적은 생체 내에서 서열 의존적 및 독립적인 비특이적 오프 표적 효과 모두를 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, DICER 처리 및 특이성에 대한 현재의 이해를 기반으로, sh734의 구조 및 DICER 처리성 및 효율성을 최적화하는 설계 규칙이 적용되었다 (또한 문헌 [Gu, S., Y. Zhang, L. Jin, Y. Huang, F. Zhang, M.C. Bassik, M. Kampmann, and M.A. Kay. 2014. Weak base pairing in both seed and 3' regions reduce RNAi off-targets and enhances si/shRNA designs. Nucleic Acids Research 42:12169-12176] 참조).
일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열은 헤어핀 루프 (서열 번호 20)에 2개의 뉴클레오타이드 5' 및 3' (예를 들어, 각각 G 및 C)을 부가함으로써 변형되어 가이드 가닥을 약 19개 뉴클레오타이드에서부터 약 21개 뉴클레오타이드 길이까지 연장시키고 루프를 hsa-miR-22 루프 CCUGACCCA (서열 번호 21)로 교체하여 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 96%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 2의 서열을 갖는다. 서열 번호 2에 의해 인코딩된 shRNA는 서열 번호 1과 비교하여 HPRT의 유사한 녹다운을 달성하는 것으로 여겨진다. 마찬가지로, 서열 번호 2에 의해 인코딩된 shRNA의 발현에 의한 HPRT의 녹다운을 통해 실질적으로 HPRT 결핍된 세포는 티오구아닌 유사체 (예를 들어, 6TG)를 사용한 선택을 허용하는 것으로 여겨진다.
일부 실시 형태에서, 상기 벡터 내에 존재하는 RNAi는 핵산 분자, 예를 들어, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것을 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터 내에 존재하는 RNAi는 핵산 분자, 예를 들어, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것을 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자는 숙주 세포의 세포질에서 발견된다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 하나를 갖는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 5 (본 출원에서 "shHPRT 616"으로서 지칭됨)와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 5와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 5와 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 5와 적어도 96%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 5와 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 5와 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 5와 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 5의 서열을 갖는다 (또한 도 3 참조).
일부 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 6 (본 출원에서 "shHPRT 211"로서 지칭됨)과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6과 적어도 96%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6과 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6과 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6과 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6의 서열을 갖는다 (또한 도 4 참조).
일부 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7 (본 출원에서 "shHPRT 734.1"로서 지칭됨)과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다 (또한 도 5 참조). 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7과 적어도 96%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7과 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7과 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 더 추가의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7과 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 7의 서열을 갖는다 (또한 도 5 참조).
마이크로RNA
마이크로RNA (miR)는 표적 유전자의 발현을 전사 후 조절하는 비-코딩 RNA의 그룹이다. 이러한 단일 가닥 분자는 세포질에서 번역을 방지하기 위해 표적 mRNA의 3' 비번역 영역 (untranslated region: UTR)에 결합하는 다른 단백질과 miRNA 매개성 침묵 복합체 (miRNA-mediated silencing complex: miRISC) 복합체를 형성하는 것으로 여겨진다.
일부 실시 형태에서, shRNA 서열은 마이크로-RNA 이차 구조 내에 내장된다 ("마이크로-RNA 기반 shRNA"). 일부 실시 형태에서, HPRT를 표적화하는 shRNA 핵산 서열은 마이크로-RNA 이차 구조 내에 내장된다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 수반되는 경로 포화 및 세포독성 또는 오프 표적 효과 없이 HPRT를 표적화하는 shRNA의 이용과 동등한 것으로 여겨지는 HPRT 발현의 녹다운을 달성하기 위해 HPRT 내의 코딩 서열을 표적화한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 드노보 인공 마이크로RNA shRNA이다. 이러한 드노보 마이크로-RNA 기반 shRNA는 문헌 [Fang, W. & Bartel, David P. The Menu of Features that Define Primary MicroRNAs and Enable De Novo Design of MicroRNA Genes. Molecular Cell 60, 131-145]에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8과 적어도 80%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8과 적어도 96%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8과 적어도 98%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8과 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 8 ("miRNA734-Denovo")의 서열을 갖는다 (또한 도 6 참조). 서열 번호 8의 RNA 형태는 서열 번호 22를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9와 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9와 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9와 적어도 96%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9와 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9와 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9와 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 서열 번호 9 ("miRNA211-Denovo")의 핵산 서열을 갖는다 (또한 도 7 참조). 서열 번호 9의 RNA 형태는 서열 번호 23을 갖는다.
다른 실시 형태에서, 상기 마이크로-RNA 기반 shRNA는 3세대 miRNA 스캐폴드 변형된 miRNA 16-2 (이하, "miRNA-3G")이다 (예를 들어, 도 8 및 9 참조). 이러한 miRNA-3G 분자의 합성은 문헌 [Watanabe, C., Cuellar, T.L. & Haley, B. "Quantitative evaluation of first, second, and third generation hairpin systems reveals the limit of mammalian vector-based RNAi," RNA Biology 13, 25-33 (2016)]에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10과 적어도 80%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10과 적어도 96%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10과 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10과 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10과 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 10 ("miRNA211-3G")의 핵산 서열을 갖는다 (또한 도 9 참조).
일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11과 적어도 80%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11과 적어도 96%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11과 적어도 98%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11과 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, 상기 miRNA-3G는 서열 번호 11 ("miRNA734-3G")의 핵산 서열을 갖는다 (또한 도 8 참조).
일부 실시 형태에서, 상기 sh734 shRNA는 17개 뉴클레오타이드 염기쌍 줄기 및 4개 뉴클레오타이드 루프를 갖는 miRNA-451 (서열 번호 24 참조) 구조를 모방하도록 구성된다 (miR-451은 약물-수송체 단백질 P-당단백질을 조절한다). 특히, 이러한 구조는 DICER에 의한 가공을 필요로 하지 않는다. pre-451 mRNA 구조는 Ago2 및 후속적으로 폴리(A) 특이적 리보뉴클레아제 (PARN)에 의해 절단되어 성숙 miRNA-451 구조적 모방체를 생성하는 것으로 여겨진다. Ago-shRNA는 내인성 miR-451의 구조를 모방하고 DICER 독립적인 이점을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 이것은 가변적인 3'-5' 엑소뉴클레오 분해 활성 (23-26nt 성숙)에 의해 승객 적재 (passenger loading)의 오프 표적 효과를 제한하는 것으로 여겨진다 (문헌 [Herrera-Carrillo, E., and B. Berkhout. 2017. DICER-independent processing of small RNA duplexes: mechanistic insights and applications. Nucleic Acids Res. 45:10369-10379] 참조). 단일 RNAi 활성 가이드의 효율적인 감소된 오프 표적 효과, 세포 RNAi DICER 기구의 불포화, 및 선천적 RIG-I 반응을 촉발할 가능성이 적은 보다 짧은 RNA 듀플렉스를 비롯하여 shRNA의 대안적 DICER 독립적 처리를 활용하는 이점이 존재하는 것으로 또한 여겨진다.
RNAi의 대안
RNAi의 도입에 대한 대안으로서, 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 전령 RNA (mRNA)의 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단백질을 인코딩하는 핵산과 특이적으로 하이브리드화하고 단백질의 전사 또는 번역을 방해한다. 일부 실시 형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA를 표적화하고 이의 복제 및/또는 전사를 방해한다. 다른 실시 형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 pre-mRNA (즉, mRNA의 미성숙 단일 가닥인 전구체 mRNA) 및 mRNA를 비롯한 RNA와 특이적으로 하이브리드화한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, RNA의 단백질 번역 부위로의 전위, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 생성하기 위한 RNA의 스플라이싱, 및 RNA에 관여하거나 RNA에 의해 촉진될 수 있는 촉매 활성에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 간섭의 전반적인 효과는 표적 단백질 발현을 조절, 감소 또는 억제하는 것이다.
일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 엑손 스키핑 작용제 또는 엑손 스키핑 이식 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 "엑손 스키핑 이식 유전자" 또는 "엑손 스키핑 작용제"라는 문구는 엑손 스키핑을 생성할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 인코딩하는 임의의 핵산을 지칭한다. "엑손 스키핑"은 단백질 생산 동안 pre-mRNA 수준에서 건너뛰어 제거되는 엑손을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 내의 스플라이스 부위 또는 조절 요소를 방해할 수 있는 것으로 여겨진다. 이것은 유전적 돌연변이의 존재에도 불구하고 절단된 부분 기능적 단백질을 초래할 수 있다. 일반적으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이 특이적일 수 있으며, 엑손 스키핑을 유도하기 위해 pre-전령 RNA의 돌연변이 부위에 결합할 수 있다.
엑손 스키핑 이식 유전자는 엑손 스키핑을 초래할 수 있는 작용제를 인코딩하고, 이러한 작용제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 유전적 돌연변이의 존재에도 불구하고 절단된 부분 기능적 단백질을 유도하기 위해 엑손 내의 스플라이스 부위 또는 조절 요소를 방해할 수 있다. 추가로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이 특이적일 수 있으며, 엑손 스키핑을 유도하기 위해 pre-전령 RNA의 돌연변이 부위에 결합할 수 있다. 엑손 스키핑을 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 AON으로서 지칭된다. 이러한 AON은 핵에 국한되고 스플라이싱 또는 다른 RNA 가공 반응에 관여하는 작은 RNA 분자의 클래스인 소핵 RNA ("snRNA")를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 이를 설계하는 방법 및 관련 제조 방법의 예는, 예를 들어, 미국 출원공개 US 2015/0225718, US 2015/0152415, US 2015/0140639, US 2015/0057330, US 2015/0045415, US 2014/0350076, US 2014/0350067 및 US 2014/0329762에 개시되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. reference herein in their entireties.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 발현 벡터는 HPRT의 발현 동안 엑손 스키핑을 초래하거나 HPRT 중복 돌연변이 (예를 들어, 엑손 4에서의 중복 돌연변이)를 유발하는 엑손 스키핑 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함한다 (문헌 [Baba S, et al. Novel mutation in HPRT1 causing a splicing error with multiple variations. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2017 Jan 2;36(1):1-6] 참조, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다).
일부 실시 형태에서, HPRT는 스플라이시오솜 트랜스-스플라이싱에 의해 변형된 돌연변이 서열로 대체되어 HPRT를 촉진할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이것은 (1) 표적 RNA에서 코딩 서열을 대체하기 위한 돌연변이된 코딩 영역, (2) 5' 또는 3' 스플라이스 부위 및/또는 (3) 결합 도메인, 즉, 표적 HPRT RNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 필요로 한다. 일부 실시 형태에서, 3개의 모든 구성요소가 요구된다.
프로모터
다양한 프로모터를 사용하여 본 개시 내용의 발현 벡터 내에 도입된 핵산 서열 각각의 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, RNAi (예를 들어, 항-HPRT shRNA)를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 Pol III 프로모터 또는 Pol II 프로모터 중 하나로부터 선택된 제1 프로모터로부터 발현될 수 있다. 마찬가지로, 또 다른 예로서, HPRT를 하향 조절하기 위한 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 Pol III 프로모터 또는 Pol II 프로모터 중 하나로부터 선택된 제1 프로모터로부터 발현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 프로모터는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 프로모터는 HIV LTR (예를 들어, TAR)의 적어도 일부를 포함한다.
적합한 프로모터의 비제한적 예로는 RNA 중합체라아제 I (pol I), 중합체라아제 II (pol II) 또는 중합체라아제 III (pol III) 프로모터가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. "RNA 중합체라아제 III 프로모터" 또는 "RNA pol III 프로모터" 또는 "중합체라아제 III 프로모터" 또는 "pol III 프로모터"란, 세포 내 이의 본래의 맥락에서 RNA 중합체라아제 III과 결합하거나 상호 작용하여 이의 작동 가능하게 연결된 유전자를 전사하는 임의의 무척추 동물, 척추 동물 또는 포유 동물 프로모터, 예를 들어, 사람, 쥐, 돼지, 소, 영장류, 유인원 등, 또는 선택된 숙주 세포에서 RNA 중합체라아제 III과 상호 작용하여 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 전사하는 천연 또는 조작된 이의 임의의 변이체를 의미한다. 본 개시 내용의 발현 벡터에 사용하기에 적합한 RNA pol III 프로모터는 사람 U6, 마우스 U6 및 사람 H1 기타가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
pol II 프로모터의 예로는 Ef1 알파, CMV 및 유비퀴틴이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 특이적 pol II 프로모너로는 안키린 프로모터 (문헌 [Sabatino DE, et al., Proc Natl Acad Sd USA. (24):13294-9 (2000)]), 스펙트린 프로모터 (문헌 [Gallagher PG, et al., J Biol Chem. 274(10):6062- 73, (2000)]), 트랜스페린 수용체 프로모터 (문헌 [Marziali G, et al., Oncogene. 21(52):7933-44, (2002)]), 밴드 3/음이온 수송체 프로모터 (문헌 [Frazar TF, et al., MoI Cell Biol (14):4753-63, (2003)]), 밴드 4.1 프로모터 (문헌 [Harrison PR, et al., Exp Cell Res. 155(2):321-44, (1984)]), BcI- Xl 프로모터 (문헌 [Tian C, et al., Blood 15;101(6):2235-42 (2003)]), EKLF 프로모터 (문헌 [Xue L, et al., Blood. 103(11):4078-83 (2004), Epub 2004 Feb 5]), ADD2 프로모터 (문헌 [Yenerel MN, et al., Exp Hematol. 33(7):758-66 (2005)]), DYRK3 프로모터 (문헌 [Zhang D, et al., Genomics 85(1): 117-30 (2005)]), SOCS 프로모터 (문헌 [Sarna MK, et al., Oncogene 22(21):3221-30 (2003)]), LAF 프로모터 (문헌 [To MD, et al., bit J Cancer l;115(4):568-74, (2005)]), PSMA 프로모터 (문헌 [Zeng H, et al., JAndrol (2):215-21, (2005)]), PSA 프로모터 (문헌 [Li HW, et al., Biochem Biophys Res Commun 334(4): 1287-91, (2005)]), 프로바신 프로모터 (문헌 [Zhang J, et al.,145(l):134-48, (2004), Epub 2003 Sep 18]), ELAM-I 프로모터/E-셀렉틴 (문헌 [Walton T, et al., Anticancer Res. 18(3A):1357-60, (1998)]), 시냅신 프로모터 (문헌 [Thiel G, et al., ProcNatl Acad Sd USA., 88(8):3431-5(1988)]), 빌레브란트 인자 프로모터 (문헌 [Jahroudi N, Lynch DC. MoI Cell -5zo/.14(2):999-1008, (1994)]), FLTl (문헌 [Nicklin SA, et al., Hypertension 38(l):65-70, (2001)]), Tau 프로모터 (문헌 [Sadot E, et al., JMoI Biol. 256(5):805-12, (1996)]), 타이로시나아제 프로모터 (문헌 [Lillehammer T, et al., Cancer Gene Ther. (2005)]), 팬더 프로모터 (문헌 [Burkhardt BR, et al., Biochim Biophys Acta. (2005)]), 뉴론 특이적 엔올라아제 프로모터 (문헌 [Levy YS, et al., JMolNeurosci.21(2):121-32, (2003)]), hTERT 프로모터 (문헌 [Ito H, et al., Hum Gene Ther 16(6):685-98, (2005)]), HRE 반응 요소 (문헌 [Chadderton N, et al., IntJRadiat Oncol Biol Phys.62(l):2U-22, (2005)]), lck 프로모터 (문헌 [Zhang DJ, et al., J Immunol. 174(11):6725- 31, (2005)]), MHCII 프로모터 (문헌 [De Geest BR, et al., Blood. 101(7):2551-6, (2003), Epub 2002 Nov 21]) 및 CDl Ic 프로모터 (문헌 [Lopez-Rodriguez C, et al., J Biol Chem. 272(46):29120-6 (1997)])가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시 형태에서, HPRT를 녹다운시키도록 설계된 작용제의 발현을 구동시키는 프로모터는 RNA pol III 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, HPRT를 녹다운시키도록 설계된 작용제의 발현을 구동시키는 프로모터는 7sk 프로모터 (예를 들어, 7SK 사람 7S K RNA 프로모터)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 수탁 번호 AY578685 (호모 사피엔스 세포주 HEK-293 7SK RNA 프로모터 영역, 완전한 서열, 수탁 번호 AY578685)에 의해 제공되는 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 96%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 98%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14와 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 14에 제시된 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이용된 7sk 프로모터는 상기 7sk 프로모터와 비교하여 이의 핵산 서열 내에 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 결실을 포함한다. 적합한 7sk 프로모터 돌연변이는 문헌 [Boyd, D.C., Turner, P.C., Watkins, N.J., Gerster, T. & Murphy, S. Functional Redundancy of Promoter Elements Ensures Efficient Transcription of the Human 7SK Gene in vivo. Journal of Molecular Biology 253, 677-690 (1995)]에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터 내의 기능적 돌연변이 또는 결실은 시스-조절 요소에서 이루어져 sh734를 포함하는 프로모터 구동 이식 유전자의 발현 수준을 조절한다. 기재된 돌연변이는 Pol III 프로모터에 의해 구동되는 sh734 발현 수준들 사이의 상관 관계를 확립하고 6TG 요법 및 장기간 안정성 및 안전성의 존재하에 안정한 선택을 수행하는 기능을 도입하는데 사용된다. 7sk 프로모터 돌연변이의 위치는 도 10에 도시되어 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 96%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 98%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 15와 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 7sk 프로모터는 서열 번호 15에 제시된 핵산 서열을 갖는다.
다른 실시 형태에서, 상기 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 사용될 수 있는 조직 특이적 프로모터의 몇몇 비제한적인 예로는 lck (예를 들어, 문헌 [Garvin et al., MoI. Cell Biol. 8:3058-3064, (1988)] 및 [Takadera et al., MoI. Cell Biol. 9:2173-2180, (1989)] 참조), 미오게닌 (문헌 [Yee et al., Genes and Development 7:1277-1289 (1993)]) 및 틸 (thyl) (문헌 [Gundersen et al., Gene 113:207-214, (1992)])이 포함된다.
프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 조합에 대한 비제한적인 예로는 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00001
벡터의 제조
일부 실시 형태에서, 발현 카세트, 예를 들어, HPRT를 녹다운시키도록 구성된 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트는 렌티바이러스 발현 벡터와 같은 발현 벡터 내로 삽입되어 발현을 위한 적어도 하나의 이식 유전자를 갖는 벡터를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 pTL20c, pTL20d, FG, pRRL, pCL20, pLKO.1 puro, pLKO.1, pLKO.3G, Tet-pLKO-puro, pSico, pLJM1-EGFP, FUGW, pLVTHM, pLVUT-tTR-KRAB, pLL3.7, pLB, pWPXL, pWPI, EF.CMV.RFP, pLenti CMV Puro DEST, pLenti-puro, pLOVE, pULTRA, pLJM1-EGFP, pLX301, pInducer20, pHIV-EGFP, Tet-pLKO-neo, pLV-mCherry, pCW57.1, pLionII, pSLIK-Hygro 및 pInducer10-mir-RUP-PheS로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 AnkT9W 벡터, T9Ank2W 벡터, TNS9 벡터, 렌티글로빈 HPV569 벡터, 렌티글로빈 BB305 벡터, BG-1 벡터, BGM-1 벡터, d432βAγ 벡터, mLAβΔγV5 벡터, GLOBE 벡터, G-GLOBE 벡터, βAS3-FB 벡터, V5 벡터, V5m3 벡터, V5m3-400 벡터, G9 벡터 및 BCL11A shmir 벡터로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 pTL20c, pTL20d, FG, pRRL 및 pCL20으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 더 다른 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 pTL20c이다.
일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호 13과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호 13과 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호 13과 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호 13과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호 13과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 서열 번호 13의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 17과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 17과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 17과 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 17과 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 17과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 17과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 17의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 16과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 TL20 바이러스 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 16과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 TL20 바이러스 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 16과 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 TL20 바이러스 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 16과 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 TL20 바이러스 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 16과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 TL20 바이러스 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 16과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 TL20 바이러스 백본을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라스미드는 서열 번호 16의 핵산 서열을 갖는 TL20 바이러스 백본을 포함한다.
하나 이상의 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 다른 벡터 요소에 대해 상이한 배향으로 (예를 들어, 도 32 사이의 7sk 프로모터의 배향 비교) 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 상기 7sk 구동 sh734 요소는 실시예에 기재된 UbC 구동 GFP와 같은 이식 유전자와 비교하여 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 상이한 위치, 즉, 다른 벡터 요소의 업스트림 또는 다운스트림, 예를 들어, UbC 구동 GFP의 업스트림 또는 다운스트림의 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다른 벡터 요소에 대한 7sk 발현 카세트의 상이한 위치 및/또는 배향은 sh734의 발현을 증진시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 업스트림에 위치한다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 다운스트림에 위치한다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트 및 다른 벡터 요소, 예를 들어, UbC 구동 GFP는 동일한 방향으로 배향된다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트 및 다른 벡터 요소, 예를 들어, UbC 구동 GFP는 반대 방향으로 배향된다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 순방향으로 배향된다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 역방향으로 배향된다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 업스트림에 위치하며 순방향으로 배향된다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 업스트림에 위치하며 역방향으로 배향된다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 다운스트림에 위치하며 순방향으로 배향된다.
일부 실시 형태에서, 상기 7sk/sh734 발현 카세트는 UbC 구동 GFP와 같은 다른 벡터 요소에 대해 다운스트림에 위치하며 역방향으로 배향된다.
HPRT를 하향 조절하거나 HPRT를 녹아웃시키기 위한 작용제의 비-바이러스 전달
일부 실시 형태에서, HPRT 유전자를 녹다운시키도록 설계된 작용제 (RNAi를 포함하는 발현 작제물 포함)는 나노캡슐의 다른 비-바이러스 전달 비히클을 통해 전달될 수 있다. 이러한 방법을 통한 이러한 작용제의 전달은 발현 벡터로부터 발현된 RNAi 또는 다른 작용제를 사용하여 HPRT의 하향 조절을 실행하는 것에 대한 대안을 나타낸다. 본 출원에 추가로 기재된 바와 같이, 안티센스 RNA, 엑손 스키핑을 위해 설계된 올리고뉴클레오타이드, 또는 나노캡슐을 사용하는 유전자 편집 기구를 전달하는 것이 가능하다.
일반적으로, 나노캡슐은 중합체 막 또는 코팅으로 둘러싸인 저장소 또는 공동에 활성 분자가 국한되는 전형적인 코어-쉘 구조를 나타내는 소포체 시스템 (vesicular system)이다. 일부 실시 형태에서, 전형적인 나노캡슐의 쉘은 중합체 막 또는 코팅으로 제조된다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 생분해성 또는 생침식성 중합체성 물질로부터 유래되며, 즉, 상기 나노캡슐은 생분해성 및/또는 침식성 중합체성 나노캡슐이다. 예를 들어, 녹다운 및/또는 녹아웃을 위한 성분은 폴리락타이드-폴리글리콜라이드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)과 같은 하나 이상의 생분해성 중합체를 포함하는 나노캡슐 내에 캡슐화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체성 나노캡슐은 양으로 하전된 2개의 상이한 단량체, 적어도 하나의 중성 단량체 및 가교제로 구성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 효소적으로 분해 가능한 나노캡슐이다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 펩타이드에 의해 가교된 얇은 중합체 쉘 및 단일 단백질 코어로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 나노캡슐은 특이적으로 인식 가능하고 프로테아제에 의해 절단될 수 있도록 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 절단 가능한 가교제는 프로테아제 또는 또 다른 효소의 기질인 펩타이드 서열 또는 구조를 포함한다.
나노캡슐의 예로는 미국 특허 US 9,782,357에 기재된 것들; 미국 출원공개 US 2017/0354613 및 US 2015/0071999에 기재된 것들; 및 국제공개공보 WO 2016/085808 및 WO 2017/205541에 기재된 것들이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 이들의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 전술된 간행물에 기재된 나노캡슐은 녹다운 및/또는 녹아웃을 위한 성분, 예를 들어, Cas 단백질 및/또는 gRNA를 운반 및/또는 캡슐화하도록 변형될 수 있다. 다른 적합한 나노캡슐, 이의 합성 방법 및/또는 캡슐화 방법은 미국 출원공개 US 2011/0274682에 추가로 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다 HPRT의 녹다운 또는 녹아웃을 유발하기 위한 성분을 운반 및/또는 캡슐화하도록 변형될 수 있는 또 다른 적합한 나노캡슐은 국제공개공보 WO 2013/138783, WO 2013/033717 및 WO 2014/093966에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 생체내에서 특정 세포 유형 (예를 들어, T 세포, CD34 조혈 줄기 세포 및 선조 세포)을 표적화하도록 구성된다. 예를 들어, 상기 나노캡슐은 중합체 나노캡슐에 커플링된 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적화 모이어티는 상기 중합체 나노캡슐을 특정 세포 유형에 전달하고, 여기서, 상기 세포 유형은 면역 세포, 혈액 세포, 심장 세포, 폐 세포, 시각 세포, 간 세포, 신장 세포, 뇌 세포, 중추 신경계 세포, 말초 신경계 세포, 암 세포, 바이러스에 감염된 세포, 줄기 세포, 피부 세포, 장 세포 및/또는 청각 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적화 모이어티는 항체이다.
일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 적어도 하나의 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 2 내지 6개의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적화 모이어티는 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적화 모이어티는 CD117, CD10, CD34, CD38, CD45, CD123, CD127, CD135, CD44, CD47, CD96, CD2, CD4, CD3 및 CD9 마커들 중 어느 하나를 표적화한다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적화 모이어티는 CD29, CD44, CD90, CD49a-f, CD51, CD73 (SH3), CD105 (SH2), CD106, CD166 및 Stro-1 마커들을 비롯한 사람 중간엽 줄기 세포 CD 마커 중 어느 하나를 표적화한다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적화 모이어티는 CD34, CD38, CD45RA, CD90 및 CD49를 비롯한 사람 조혈 줄기 세포 CD 마커 중 어느 하나를 표적화한다.
이러한 나노캡슐에 적합한 페이로드는 합성 올리고뉴클레오타이드, shRNA, miRNA, 및 HPRT를 표적화하는 Ago-shRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 페이로드는 Pol III 또는 Pol II 구동 프로모터 카세트에서 발현될 수 있다.
다른 실시 형태에서, HPRT를 하향 조절하기 위한 작용제는 유전자 조작된 미생물에 의해 생성된 나노 크기의 캡슐인 바이오 나노캡슐 내에 제형화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 바이오 나노캡슐은 바이러스 단백질 유래 또는 변형된 바이러스 단백질 유래 입자, 예를 들어, 바이러스 표면 항원 입자 (예를 들어, B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg) 입자)이다. 다른 실시 형태에서, 바이오 나노캡슐은 지질 이중층 막 및 바이러스 단백질 유래 또는 변형된 바이러스 단백질 유래 입자, 예를 들어, 바이러스 표면 항원 입자를 포함하는 나노 크기의 캡슐이다. 이러한 입자는 진핵 세포, 예를 들어, 효모, 곤충 세포 및 포유 동물 세포로부터 정제될 수 있다. 캡슐의 크기는 약 10 nm 내지 약 500 nm의 범위일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 캡슐의 크기는 약 20 nm 내지 약 250 nm의 범위일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 캡슐의 크기는 약 80 nm 내지 약 150 nm의 범위일 수 있다.
안티센스 RNA
안티센스 RNA (asRNA)는 세포 내에서 전사되는 전령 RNA (mRNA) 가닥에 상보적인 단일 가닥 RNA이다. 임의의 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 안티센스 RNA는 세포 내로 도입되어 염기쌍을 형성하고 번역 기구를 물리적으로 방해함으로써 상보적 mRNA의 번역을 억제할 수 있는 것으로 여겨진다. 달리 말하자면, 안티센스 RNA는 특정 mRNA와의 상보적 관계를 나타내는 단일 가닥 RNA 분자이다.
안티센스 RNA는 유전자 조절에 활용될 수 있으며, 특히 단백질 합성에 사용되는 mRNA 분자를 표적화할 수 있다. 상기 안티센스 RNA는 상보적 mRNA와 물리적으로 쌍을 형성하고 결합할 수 있으므로 번역 기구에서 가공되는 mRNA의 능력을 억제할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 포스포로티오에이트- 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HPRT mRNA의 코딩 영역 내의 표적 서열에 이용될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 상기에서 기재된 바와 같이 표적화된 나노입자를 사용하여 특정 세포 집단 및 해부학적 부위 세포에 전달될 수 있다.
엑손 스키핑
본 출원에서 언급된 바와 같이, 엑손 스키핑은 HPRT 결핍을 초래하는 HPRT 유전자 내에 결함을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오타이드 (변형된 올리고뉴클레오타이드 포함)는 나노캡슐에 의해 전달될 수 있으며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 스플라이싱되지 않은 HPRT mRNA를 표적화하고 활성에 필요한 인트론의 조기 종결 또는 스키핑을 매개하도록 설계된다. HPRT 중복 돌연변이, 예를 들어, Exon 4의 중복 돌연변이 (문헌 [Baba S, et al., "Novel mutation in HPRT1 causing a splicing error with multiple variations," Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2017 Jan 2;36(1):1-6] 참조)는 HPRT 단백질의 스플라이싱 오류 및 기능적 불활성화를 유발하기 위해 도입될 수 있다. 스플라이시오솜 트랜스-플라이싱에 의해 변형된 돌연변이 서열에 의한 HPRT의 교체는 HPRT를 녹다운시키기 위한 잠재적인 치료 전략이다. 이것은 (1) 표적 RNA에서 코딩 서열을 대체하기 위한 돌연변이된 코딩 영역, (2) 5' 또는 3' 스플라이스 부위 및/또는 (3) 결합 도메인, 예를 들어, 표적 RNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 필요로 하는 것으로 여겨진다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제 저항성이 되도록 구조적으로 변형될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 백본 또는 비천연 뉴클레오사이드간 연결을 갖는다. 변형된 백본을 갖는 이러한 올리고뉴클레오타이드는 백본에 인 원자를 보유하는 것들과 골격에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오사이드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드도 또한 올리고뉴클레오타이드로 간주될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 당 및 뉴클레오타이드 단위의 뉴클레오사이드간 연결, 즉, 백본 모두가 신규한 기로 대체되도록 변형된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 우수한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 이러한 올리고머 화합물 중 하나인 올리고뉴클레오타이드 모방체는 펩타이드 핵산 (peptide nucleic acid: PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당 백본은 백본, 특히, 아미노에틸글리신 백본을 포함하는 아미드로 대체된다. 상기 핵 염기는 유지되며, 상기 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 핵염기 (당해 분야에서는 간단히 "염기"로서 종종 지칭됨) 개질 또는 치환을 포함할 수 있다. 특정 핵 염기는 본 개시 내용의 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들로는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 비롯하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 약 0.6 내지 약 1.2℃까지 증가시키는 것으로 나타났으며, 현재 바람직하게는 염기 치환이며, 보다 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때이다.
HPRT를 녹아웃시키기 위한 유전자 편집
본 개시 내용은 또한 HPRT의 녹아웃을 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 접근법은 또한 HPRT를 녹아웃시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 세포는 HPRT 표적화 CRISPR/Cas9 RNP 또는 HPRT 표적화 CRISPR/Cas12a RNP로 처리될 수 있다. 본 출원에서 제공되는 "리보핵단백질 복합체"는 핵 단백질 및 리보핵산을 포함하는 복합체 또는 입자를 지칭한다. 본 출원에서 제공되는 "핵 단백질"은 핵산 (예를 들어, RNA, DNA)에 결합할 수 있는 단백질을 지칭한다. 상기 핵 단백질이 리보핵산에 결합하는 경우, 이는 "리보핵단백질"로서 지칭된다. 상기 리보핵단백질과 상기 리보핵산 사이의 상호 작용은, 예를 들어, 공유 결합에 의해 직접적이거나, 예를 들어, 비공유 결합 (예를 들어, 정전기적 상호 작용 (예를 들어, 이온 결합, 수소 결합, 할로겐 결합), 반 데르 발스 상호 작용 (예를 들어, 쌍극자-쌍극자, 쌍극자 유도 쌍극자, 런던 분산), 고리 적층 (파이 효과), 소수성 상호 작용 등)에 의해 간접적일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 리보핵단백질은 리보핵산에 비공유적으로 결합된 RNA 결합 모티프를 포함한다. 예를 들어, 상기 RNA 결합 모티프에서 양으로 하전된 방향족 아미노산 잔기 (예를 들어, 라이신 잔기)는 RNA의 음성 핵산 포스페이트 백본과 정전기적 상호 작용을 형성하여 리보핵단백질 복합체를 형성할 수 있다. 리보핵단백질의 비제한적 예로는 리보솜, 텔로머라아제, RNAseP, hnRNP, CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 및 소핵 RNP (snRNP)가 포함된다. 상기 리보핵단백질은 효소일 수 있다. 실시 형태에서, 상기 리보핵단백질은 엔도뉴클레아제이다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 리보핵단백질 복합체는 엔도뉴클레아제 및 리보핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 CRISPR 관련 단백질 9이다. 일부 실시 형태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 CRISPR 관련 단백질 12a이다.
일부 실시 형태에서, 상기 리보핵산은 가이드 RNA이다 (예를 들어, 서열 번호 25~39 참조). 일부 실시 형태에서, 상기 CRISPR 관련 단백질 9는 리보핵산에 결합되어 리보핵단백질 복합체를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9이며, 상기 리보핵산은 가이드 RNA이다. 일부 실시 형태에서, 상기 CRISPR 관련 단백질 12a는 리보핵산에 결합되어 리보핵단백질 복합체를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas12a이며, 상기 리보핵산은 가이드 RNA이다. 일부 실시 형태에서, 상기 CRISPR 관련 단백질 12b는 리보핵산에 결합되어 리보핵단백질 복합체를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas12b이며, 상기 리보핵산은 가이드 RNA이다. 이와 같이, 상기 가이드 RNA (또는 gRNA)는 핵 단백질과 결합하여 리보핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 리보뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 하나 이상의 RNA 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 gRNA는 표적 부위에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 상보적 뉴클레오타이드 서열은 표적 부위에 대한 리보핵단백질 복합체의 결합을 매개하여 리보핵단백질 복합체의 서열 특이성을 제공할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 표적 핵산에 대해 상보적이다.
일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA (예를 들어, 서열 번호 25~39 중 어느 하나)는 표적 핵산 서열에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 50%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 55%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 60%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 65%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 70%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 75%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 80%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 85%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 90%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 96%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 97%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 98%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA의 상보체는 표적 핵산의 약 99%의 서열 동일성을 갖는다.
본 출원에서 제공되는 바와 같은 표적 핵산 서열은 세포에 의해 발현되는 핵산 서열이다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적 핵산 서열은 외인성 핵산 서열이다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적 핵산 서열은 내인성 핵산 서열이다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적 핵산 서열은 세포 유전자의 일부를 형성한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 세포 유전자 또는 이의 단편에 대해 상보적이다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 대해 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보적이다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 세포 유전자 서열에 대해 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보적이다. 일부 실시 형태에서, 상기 가이드 RNA는 세포 유전자 서열에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 사람 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 (HPRT) 유전자 (서열 번호 12) 내의 서열을 표적화하는 gRNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 상기 gRNA 및 유전자 편집에 필요한 또 다른 성분은 나노캡슐 내에 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 사람의 염색체 X 내의 서열을 표적화하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 염색체 X 내의 위치를 갖는 서열을 표적화하는 gRNA를 포함하며, 여기서, 상기 표적화된 서열은 약 14 내지 약 28개의 연속 염기쌍 범위의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 염색체 X 내의 위치를 갖는 서열을 표적화하는 gRNA를 포함하며, 여기서, 상기 표적화된 서열은 약 15 내지 약 26개의 연속 염기쌍 범위의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 염색체 X 내의 위치를 갖는 서열을 표적화하는 gRNA를 포함하며, 여기서, 상기 표적화된 서열은 약 16 내지 약 24개의 연속 염기쌍 범위의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 염색체 X 내의 위치를 갖는 서열을 표적화하는 gRNA를 포함하며, 여기서, 상기 표적화된 서열은 약 17 내지 약 22개의 연속 염기쌍 범위의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 염색체 X 내의 위치를 갖는 서열을 표적화하는 gRNA를 포함하며, 여기서, 상기 표적화된 서열은 약 18 내지 약 22개의 연속 염기쌍 범위의 길이를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 96%의 동일성을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 동일성을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 98%의 동일성을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 99%의 동일성을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 25~39 중 어느 하나를 포함하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 나노캡슐이며, 상기 gRNA 및 유전자 편집을 위한 또 다른 성분 (예를 들어, Cas 단백질)은 상기 나노캡슐 내에 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내에 위치한 표적 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내에 위치한 표적 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내에 위치한 표적 서열과 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내에 위치한 표적 서열과 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내에 위치한 표적 서열과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 gRNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내에 위치한 표적 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 gRNA를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내의 표적 서열의 상보체는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내의 표적 서열의 상보체는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내의 표적 서열의 상보체는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 약 134460145 내지 약 134500668 범위의 위치에서 염색체 X 내의 표적 서열의 상보체는 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 99%의 동일성을 갖는다.
숙주 세포
본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 신규한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. "숙주 세포" 또는 "표적 세포"는 본 개시 내용의 조성물, 예를 들어, 발현 벡터 또는 나노캡슐을 사용하여 형질 전환 (즉, 형질 도입 또는 형질 감염)되는 세포를 의미한다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 HPRT를 녹다운시키도록 구성된 핵산을 인코딩하는 발현 벡터에 의한 형질 도입 후 실질적으로 HPRT 결핍되게 된다. 다른 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 HPRT의 녹아웃을 유발하도록 설계된 성분을 포함하는 나노캡슐에 의한 형질 감염 후 실질적으로 HPRT 결핍되게 된다. HPRT를 녹다운시키기 위해 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 도입하거나 HPRT를 녹아웃시키기 위해 나노캡슐로 숙주 세포를 형질 감염시키는 방법은 공동 계류 중인 미국 특허 출원 US 16/038,643에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 단리 및/또는 정제된다.
일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 발현 벡터를 발현할 수 있는 포유 동물 세포이다. 적합한 포유 동물 숙주 세포로는 사람 세포, 쥐과 동물 세포, 비사람 영장류 세포 (예를 들어, 붉은털 원숭이 세포), 사람 선조 세포 또는 줄기 세포, 293 세포, HeLa 세포, D17 세포, MDCK 세포, BHK 세포 및 Cf2Th 세포가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는 조혈 선조 세포/줄기 세포 (예를 들어, CD34 양성 조혈 선조 세포/줄기 세포), 단핵구, 대식 세포, 말초 혈액 단핵 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 또는 수지상 세포와 같은 조혈 세포이다.
본 개시 내용의 발현 벡터로 형질 도입되거나 나노캡슐로 형질 감염되는 조혈 세포 (예를 들어, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 및/또는 단핵구/대식 세포)는 동종 이계 또는 자가 유래이거나, 일치된 형제로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 조혈 선조 세포/줄기 세포는 CD34 양성이며, 환자의 골수 또는 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 단리된 CD34 양성 조혈 선조 세포/줄기 세포 (및/또는 본 출원에서 기재된 다른 조혈 세포)는 본 출원에서 기재된 바와 같은 발현 벡터로 형질 도입된다.
일부 실시 형태에서, 상기 변형된 숙주 세포는 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포 또는 형질 도입된 숙주 세포는 PLASMA-LYTE A (예를 들어, 정맥내 투여를 위한 멸균 비발열성 등장액; 여기서, 1 리터의 PLASMA-LYTE A는 140 mEq 나트륨, 5 mEq 칼륨, 3 mEq 마그네슘, 98 mEq 클로라이드, 27 mEq 아세테이트 및 23 mEq 글루코네이트의 이온 농도를 갖는다)와 함께 제형화된다. 다른 실시 형태에서, 상기 숙주 세포 또는 형질 도입된 숙주 세포는 PLASMA-LYTE A 용액 중에서 제형화되며, 상기 용액은 약 8% 내지 약 10% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약 2x107개 미만의 숙주 세포/형질 도입된 숙주 세포가 PLASMA-LYTE A 및 DMSO를 포함하는 제형의 mL당 존재한다.
일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 본 개시 내용에 따른 발현 벡터에 의한 형질 도입 후 실질적으로 HPRT 결핍되게 된다. 일부 실시 형태에서, HPRT 유전자 발현의 수준은 적어도 약 80%까지 감소된다. 20% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현을 갖는 세포는 6TG와 같은 퓨린 유사체에 민감하여 상기 퓨린 유사체에 의한 선택을 가능하게 하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 도 22 참조). 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 적어도 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 적어도 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 적어도 하나를 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포의 형질 도입은 시험관내, 생체외 또는 생체내 숙주 세포를 본 개시 내용의 발현 벡터 및 형질 도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 화합물과 접촉시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 형질 도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 화합물은 프로스타글란딘 EP 수용체 신호 전달 경로를 자극하는 화합물, 즉, 상기 하나 이상의 화합물의 부재하에 프로스타글란딘 EP 수용체의 다운스트림의 세포 신호 전달 활성과 비교하여 상기 하나 이상의 화합물과 접촉된 세포에서 프로스타글란딘 EP 수용체의 다운스트림의 세포 신호 전달 활성을 증가시키는 하나 이상의 화합물이다. 일부 실시 형태에서, 상기 형질 도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 화합물은 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 프로스타글란딘 EP 수용체 리간드이다. 다른 실시 형태에서, 상기 형질 도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 화합물으로는 레트로넥틴 (재조합 사람 피브로넥틴 단편의 63 kD 단편, Takara로부터 입수 가능); 렌티부스트 (막 밀봉 폴록사머, Sirion Biotech로부터 입수 가능), 프로타민 설페이트, 사이클로스포린 H 및 라파마이신이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 형질 도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 화합물로는 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 F127)가 포함된다.
약제학적 조성물
본 개시 내용은 또한 본 출원에서 개시된 바와 같은 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 비-바이러스 전달 비히클 (예를 들어, 나노캡슐)을 포함하는 약제학적 조성물을 비롯한 조성물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 유효량의 본 출원에서 기재된 바와 같은 발현 벡터 및/또는 비-바이러스 전달 비히클 중 적어도 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 유효량의 발현 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 유효량은 대상체의 신체 크기, 체중, 연령, 건강, 성별, 민족성 및 바이러스 역가와 같은 요인에 기초하여 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 (a) HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 에멀젼으로서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 미셀 내에 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 중합체 내에 캡슐화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 리포좀 내에 캡슐화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 미니 세포 또는 나노캐슐 내에 캡슐화된다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 (a) 각각의 나노캡슐이 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 페이로드 (예를 들어, Cas9 단백질 또는 Cas12a 단백질 및/또는 gRNA, 예를 들어, 서열 번호 25~39 중 어느 하나의 gRNA)를 포함하는 나노캡슐 집단; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 중합체 나노캡슐이다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 리보핵단백질 또는 리보핵단백질 복합체의 특정 유형의 세포로의 전달을 용이하게 하기 위해 적어도 하나의 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 침식성 또는 생분해성이다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 pH 민감성 가교제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 50 nm 내지 약 250 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 200 나노미터 (nm) 이하의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 1 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 5 내지 약 200 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 10 내지 약 150 nm, 또는 15 내지 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 15 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 20 내지 약 125 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 50 내지 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 중합체 나노캡슐은 약 50 내지 약 75 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐의 표면은 약 1 내지 약 15 밀리볼트 (mV) (예를 들어, 표준 포스페이트 용액 중에서 측정될 때)의 전하를 가질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 나노캡슐의 표면은 약 1 내지 약 10 mV의 전하를 가질 수 있다.
"약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"이라는 문구는 동물 또는 사람에게 투여될 때 불리한 알러지성 또는 기타 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔터티 및 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 발현 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 사람에게 투여하기에 적합한 약제와 같은 약제를 제형화하는데 사용하기에 허용되는 용매, 완충액, 용액, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 담체에 의한 화합물의 제형화 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, (17th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985)]; 및 [Goodman & Gillman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics (11th Edition, McGraw-Hill Professional, 2005)]에 기재되어 있고, 이들의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은, 투여된 침묵 핵산이 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg 범위의 농도를 달성하도록 허용하는 임의의 농도로 본 출원에서 개시된 발현 벡터, 나노캡슐 또는 조성물 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 상기 발현 벡터를 약 0.1 중량% 내지 약 99.9 중량%의 양으로 포함할 수 있다. 임의의 약제학적 조성물 내에 포함되기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체로는 물, 완충수, 식염수, 예를 들어, 생리 식염수 또는 평형 식염수 용액, 예를 들어, Hank 또는 Earle 평형 용액, 글리신, 히알루론산 등이 포함된다. 상기 약제학적 조성물은 정맥내, 근육내 또는 피하 투여와 같은 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 뿐만 아니라 멸균 주사용 용액 또는 분산액에 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 용매, 희석제 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카복시메틸셀룰로오스 및 이들의 혼합물, 식물성 오일 (예를 들어, 올리브유), 주사 가능한 유기 에스테르 (예를 들어, 에틸 올리에이트)가 포함된다.
상기 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 투여 형태 (dosage form)는, 예를 들어, 정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립을 포함할 수 있다. 이러한 고형 투여 형태에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 시트르산 나트륨 및/또는 인산 이칼슘 및/또는 충전재 또는 증량제, 예를 들어, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산; 결합제, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로오스 및 아카시아; 보습제, 예를 들어, 글리세롤; 붕해제, 예를 들어, 한천-한천, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 실리케이트 및 탄산 나트륨; 습윤제, 예를 들어, 아세틸 알코올, 글리세롤 모노스테아레이트; 흡수제, 예를 들어, 카올린 및 벤토나이트 점토; 및/또는 윤활제, 예를 들어, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 경구 투여를 위한 액체 투여 형태는, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함할 수 있다. 액상 투여 형태는 불활성 희석제, 예를 들어, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및/또는 유화제, 예를 들어, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일 (예를 들어, 면실유, 옥수수유, 배아유, 피마자유, 올리브유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 전달을 증진시키기 위해 침투 촉진제를 포함할 수 있다. 침투 촉진제는 올레산, 라우르산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 리클라인에이트, 모노올레인, 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세릴 1-모노카프레이트, 모노 및 디-글리세라이드 및 이의 생리학적으로 허용되는 염과 같은 지방산을 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산, 살리실레이트 (예를 들어, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트, 호모바닐레이트)와 같은 킬레이트화제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 캡슐화된 형태로 본 출원에서 개시된 발현 벡터 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)과 같은 생분해성 중합체에 의해 캡슐화될 수 있거나, 리포좀에 캡슐화되거나 마이크로에멀젼 내에 분산될 수 있다. 리포좀은, 예를 들어, 리포펙틴 또는 리포펙타민일 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물은 무핵 세균 미니 세포 내에 또는 이러한 세포 상에 본 출원에서 개시된 발현 벡터를 포함할 수 있다 (문헌 [Giacalone et al, Cell Microbiology 2006, 8(10): 1624-33]). 본 출원에서 개시된 발현 벡터는 나노입자와 조합될 수 있다.
안정한 생산자 세포주
본 개시 내용의 또 다른 양태는 바이러스 역가를 생성하기 위한 안정한 생산자 세포주이며, 여기서, 상기 안정한 생산자 세포주는 GPR, GPRG, GPRT, GPRGT 또는 GPRT-G 패킹 세포주 중 하나로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 상기 안정한 생산자 세포주는 GPRT-G 세포주로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 상기 안정한 생산자 세포주는 (a) 항-HPRT shRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 재조합 플라스미드 내로 클로닝하여 발현 벡터를 합성하고 (즉, 상기 합성 벡터는 본 출원에서 기재된 벡터 중 어느 하나일 수 있다); (b) 상기 합성 벡터로부터 DNA 단편을 생성하고; (c) (i) 상기 합성 벡터로부터 생성된 DNA 단편 및 (ii) 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 유래된 DNA 단편으로부터 연쇄 동일 서열 (concatemer) 어레이를 형성하고; (d) 패키징 세포주 중 하나를 상기 형성된 연쇄 동일 서열 어레이로 형질 감염시키고; (e) 안정한 생산자 세포주를 단리함으로써 생성된다. 안정한 생산자 세포주를 형성하는 추가의 방법은 2016년 5월 12일자로 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2016/031959에 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
키트
일부 실시 형태는 본 출원에서 기재된 바와 같은 발현 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 포함하는 키트이다. 상기 키트는 용기를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 용기는 상기 발현 벡터 또는 조성물을 경구 또는 비경구 투여 형태로 포함하는 병일 수 있고, 각각의 투여 형태는 상기 발현 벡터의 단위 용량을 포함한다. 상기 키트는 본 출원에서 기재된 방법에 따른 대상체의 치료를 표시하는 라벨 등을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 다른 실시 형태는 본 출원에서 기재된 바와 같은 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 페이로드를 포함하는 나노캡슐 집단을 포함하는 조성물을 포함하는 키트이다.
일부 실시 형태에서, 상기 키트는 추가의 활성제를 포함할 수 있다. 상기 추가의 활성제는 상기 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 수용하는 용기와 완전히 별개인 용기에 수용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 키트는 1회 이상의 용량의 퓨린 유사체 (예를 들어, 6TG) 및 임의로 조건화 및/또는 화학 선택을 위한 퓨린 유사체를 투여하기 위한 설명서 (이러한 단계는 본 출원에서 추가로 기재됨)를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 키트는 1회 이상의 용량의 MTX 또는 MPA 및 임의로 본 출원에서 기재된 바와 같은 음성 선택을 위한 MTX 또는 MPA를 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
실질적인 HPRT 결핍 림프구 ("변형된 림프구")의 제조
본 개시 내용의 하나의 양태는 HPRT 결핍 림프구, 예를 들어, T 세포 (본 출원에서 "변형된 림프구" 또는 "변형된 T 세포"로도 또한 지칭됨)를 생산하는 방법이다. 도 11을 참조하면, 숙주 세포, 즉, 림프구 (예를 들어, T 세포)는 먼저 공여체로부터 수집된다 (단계 110). 조혈 줄기 세포 (HSC)가 또한 공여체로부터 수집되는 실시 형태에서, 상기 림프구, 예를 들어, T 세포는 수집된 HSC 이식편과 동일한 공여체 또는 상이한 공여체로부터 수집될 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 상기 세포는 HSC 이식편을 위한 세포와 동시에 또는 상이한 시간에 수집될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 동일한 동원된 말초 혈액 HSC 수확물로부터 수집된다. 일부 실시 형태에서, 이것은 CD34 음성 분획 (공여체 이식편에 대한 표준 치료에 따라 수집된 CD34 양성 세포), 또는 선조 T 세포 이식편이 예상되는 경우에는 CD34 양성 HSC 이식편의 일부일 수 있다.
통상의 기술자는 상기 세포가 임의의 수단에 의해 수집될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 상기 세포는 성분 채집 (apheresis), 백혈구 성분 채집 (leukapheresis) 또는 단순 정맥 채혈을 통해 수집될 수 있다. 상기 HSC 이식편이 변형을 위한 세포와 동시에 수집되는 실시 형태에서, 상기 HSC 이식편은, 예를 들어, 수집된 림프구, 예를 들어, T 세포의 조작 및 테스트를 위한 시간이 가능하도록 냉동 보존된다. T 세포의 비제한적인 예로는 T 헬퍼 T 세포 (예를 들어, Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Tfh), 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마 델타 T 세포 및 세포독성 림프구 (cytotoxic lymphocyte: CTL)가 포함된다.
상기 세포의 수집 후, 상기 림프구, 예를 들어, T 세포는 단리된다 (단계 120). 상기 림프구, 예를 들어, T 세포는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 임의의 수단에 의해 수집된 세포 응집체로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, CD3+ 세포는 CD3 마이크로비드 및 MACS 분리 시스템 (Miltenyi Biotec)을 통해 수집된 세포로부터 단리될 수 있다. 상기 CD3 마커는 모든 T 세포 상에 발현되고 T 세포 수용체와 관련되는 것으로 여겨진다. 사람 말초 혈액 림프구 중 약 70 내지 약 80% 및 흉선 세포 중 약 65~85%는 CD3+인 것으로 여겨진다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD3+ 세포는 CD3 마이크로비드로 자성 라벨링된다. 그 다음, 상기 세포 현탁액은 MACS 분리기의 자기장에 배치된 MACS 컬럼에 로딩된다. 자성 라벨링된 CD3+ 세포는 상기 컬럼에 유지된다. 라벨링되지 않은 세포는 통과하고, 이러한 세포 분획은 CD3+ 세포가 고갈된다. 자기장으로부터 상기 컬럼을 제거한 후, 자성으로 보유된 CD3+ 세포는 양성 선택된 세포 분획으로서 용출될 수 있다.
대안으로, CD62L+ T 세포는 IBA life sciences CD62L Fab 스트렙타머 단리 키트를 통해 상기 수집된 세포로부터 분리될 수 있다. 사람 CD62L+ T 세포의 단리는 양성 선택에 의해 수행된다. PBMC는 자성 CD62L Fab 스트렙타머로 라벨링된다. 라벨링된 세포는 자석 측면의 튜브 벽을 향해 이동하는 강력한 자석에서 단리된다. 이러한 CD62L 양성 세포 분획을 수집하고, 강력한 자석에 비오틴을 첨가하여 모든 라벨링 시약으로부터 세포를 분리한다. 상기 자성 스트렙타머는 튜브 벽을 향해 이동하고, 라벨링되지 않은 세포는 상청액에 남는다. 비오틴은 세척으로 제거된다. 생성된 세포 제제는 90% 초과의 순도를 갖는 CD62L+ T 세포가 매우 풍부하다. 어떠한 고갈 단계 및 컬럼도 필요하지 않다.
대안적인 실시 형태에서, 상기 림프구, 예를 들어, T 세포는 단계 120에서 단리되지 않지만, 오히려 단계 110에서 수집된 세포의 응집체는 후속 변형에 사용된다. 일부 실시 형태에서는 세포의 응집체가 후속 변형에 사용될 수 있지만, 일부 경우에는 변형 방법이 세포의 총 응집체 내의 특정 세포 집단에 대해 특이적일 수 있다. 이것은 여러 가지 방식으로, 예를 들어, 유전자 벡터 전달을 표적화함으로써 또는, 예를 들어, 특정 세포 유형, 즉, T 세포의 HPRT에 대한 shRNA의 발현을 표적화함으로써 유전자 변형을 특정 세포 유형에 표적화하여 수행될 수 있다.
상기 T 세포의 단리 후, 상기 T 세포는 HPRT 활성을 감소시키기 위해 (단계 130), 즉, HPRT 유전자의 발현을 감소시키기 위해 처리된다. 예를 들어, 상기 T 세포는 약 50% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 45% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 40% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 35% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 30% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 25% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 20% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 15% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현, 약 10% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현 또는 약 5% 이하의 잔류 HPRT 유전자 발현을 갖도록 처리될 수 있다.
상기 림프구, 예를 들어, T 세포는 여러 방법에 따라 변형될 수 있다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 본 출원에서 기재된 바와 같은 발현 벡터, 예를 들어, HPRT 유전자에 표적화된 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터에 의한 형질 도입에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함할 수 있으며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 또 다른 예로서, 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함할 수 있으며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 나노캡슐 내에 캡슐화된다.
대안으로, 상기 림프구, 예를 들어, T 세포는 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 페이로드를 포함하는 나노캡슐에 의한 형질 감염에 의해 변형될 수 있으며, 즉, 유전자 편집 접근법은 HPRT를 녹아웃시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 본 출원에서 기재된 바와 같은 HPRT 표적화 CRISPR/Cas9 RNP, CRISPR/Cas12a RNP 또는 CRISPR/Cas12b RNP로 처리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 gRNA를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 나노캡슐은 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 gRNA를 포함할 수 있다.
상기 T 세포가 단계 130에서 변형된 후, HPRT 결핍 T 세포 집단이 선택 및/또는 확장된다 (단계 140). 일부 실시 형태에서, 상기 배양은 생착을 위한 증진된 능력을 갖는 세포 (예를 들어, 중추 기억 또는 T 줄기 세포 표현형)를 동시에 선택 및 확장할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 14일 미만이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 7일 미만이다.
일부 실시 형태에서, 세포를 선택 및 확장하는 단계는 생체외 HPRT 결핍 (또는 실질적인 HPRT 결핍) 림프구, 예를 들어, T 세포의 집단을 구아노신 유사체 항대사 물질 (예를 들어, 6-티오구아닌 (6TG), 6-머캅토퓨린 (6-MP) 또는 아자티오퓨린 (AZA))으로 처리하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 림프구, 예를 들어, T 세포는 6-티오구아닌 ("6TG")의 존재하에 배양되므로 단계 130에서 변형되지 않은 세포를 사멸시킨다. 6TG는 상기 세포에서 dGTP 생합성을 방해할 수 있는 구아닌 유사체이다. 티오-dG는 복제 동안 구아닌 대신에 DNA 내에 통합될 수 있으며, 통합될 때 종종 메틸화된다. 이러한 메틸화는 적절한 불일치 DNA 복구를 방해할 수 있으며, 세포 주기 정지 및/또는 아폽토시스를 초래할 수 있다. 6TG는 신속하게 분열하는 세포에 대한 독성으로 인해 특정 유형의 악성 종양 환자를 치료하기 위해 임상적으로 사용되었다. 6TG의 존재하에, HPRT는 6TG의 세포 내 DNA 및 RNA로의 통합을 담당하여 적절한 폴리뉴클레오타이드 합성 및 대사의 차단을 초래하는 효소이다 (도 18 참조). 다른 한편으로, 상기 회수 경로는 HPRT 결핍 세포에서 차단된다 (도 18 참조). 따라서, 세포는 퓨린 합성을 위해 드노보 경로를 사용한다 (도 17 참조). 그러나, HPRT 야생형 세포에서, 세포는 상기 회수 경로를 사용하며, 6TG는 HPRT의 존재하에 6TGMP로 전환된다. 6TGMP는 인산화에 의해 티오구아닌 디포스페이트 (thioguanine diphosphate: TGDP) 및 티오구아닌 트리포스페이트 (thioguanine triphosphate: TGTP)로 전환된다. 동시에, 데옥시리보실 유사체는 효소 리보뉴클레오타이드 리덕타아제를 통해 형성된다. 6TG가 매우 세포독성인 것을 고려해 볼 때, 이것은 세포를 기능적 HPRT 효소로 사멸시키기 위한 선택 작용제로서 사용될 수 있다.
그 다음, 상기 생성된 HPRT 결핍 세포는 생체외에서 퓨린 유사체와 접촉된다. 녹다운 접근법의 경우, 잔류 HPRT는 세포에 여전히 있을 수 있고 HPRT 녹다운 세포는 다양한 퓨린 유사체에 대해 내성이 있지만 높은 투약량/양에서 사멸될 것으로 여겨진다. 이러한 상황에서, 생체외 선택에 사용되는 퓨린 유사체의 농도는 약 15 μM 내지 약 200 nM의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 생체외 선택에 사용되는 퓨린 유사체의 농도는 약 10 μM 내지 약 50 nM의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 생체외 선택에 사용되는 퓨린 유사체의 농도는 약 5 μM 내지 약 50 nM의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 농도는 약 2.5 μM 내지 약 10 nM의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 2 μM 내지 약 5 nM의 범위이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 μM 내지 약 1 nM의 범위이다.
녹아웃 접근법의 경우, HPRT는 HPRT 녹아웃 세포로부터 완전히 제거되거나 거의 완전히 제거될 수 있으며 상기 생성된 HPRT 결핍 세포는 퓨린 유사체에 대해 높은 내성을 가질 것으로 여겨진다. 일부 실시 형태에서, 이러한 경우에 생체외 선택에 사용되는 퓨린 유사체의 농도는 약 200 μM 내지 약 5 nM의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 이러한 경우에 생체외 선택에 사용되는 퓨린 유사체의 농도는 약 100 μM 내지 약 20 nM의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 농도는 약 80 μM 내지 약 10 nM의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 60 μM 내지 약 10 nM의 범위이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 40 μM 내지 약 20 nM의 범위이다.
다른 실시 형태에서, 세포의 변형 (예를 들어, HPRT의 녹다운 또는 녹아웃을 통해)은 HPRT 결핍 세포에 대한 생체외 선택이 필요하지 않도록, 즉, 6TG 또는 기타 유사한 화합물에 의한 선택이 필요하지 않도록 충분히 효율적일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 생성된 HPRT 결핍 세포는 퓨린 유사체 및 크산틴 옥시다아제 (xanthine oxidase: XO)의 억제제인 알로퓨리놀 둘 다와 접촉된다. XO를 억제함으로써, HPRT에 의해 대사되는 6TG를 보다 많이 이용 가능하다. 6TG가 HPRT에 의해 대사될 때, 이것은 상기 세포에 대한 독성 대사 산물인 6TGN (6TGN은 모노포스페이트 (6TGMP), 디포스페이트 (6TGDP) 및 트리포스페이트 (6TGTP)을 포괄한다)을 형성한다 (도 14 참조). (예를 들어, 문헌 [Curkovic et. al., Low allopurinol doses are sufficient to optimize azathioprine therapy in inflammatory bowel disease patients with inadequate thiopurine metabolite concentrations. Eur J Clin Pharmacol. 2013 Aug;69(8):1521-31]; [Gardiner et. al. Allopurinol might improve response to azathioprine and 6-mercaptopurine by correcting an unfavorable metabolite ratio. J Gastroenterol Hepatol. 2011 Jan;26(1):49-54]; [Seinen et. al. The effect of allopurinol and low-dose thiopurine combination therapy on the activity of three pivotal thiopurine metabolizing enzymes: results from a prospective pharmacological study. J Crohns Colitis. 2013 Nov;7(10):812-9]; 및 [Wall et. al. Addition of Allopurinol for Altering Thiopurine Metabolism to Optimize Therapy in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Pharmacotherapy. 2018 Feb;38(2):259-270] 참조, 각각의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다).
일부 실시 형태에서, 알로퓨리놀은 퓨린 유사체의 도입 전에 상기 생성된 HPRT 결핍 세포에 도입된다. 다른 실시 형태에서, 알로퓨리놀은 퓨린 유사체의 도입과 동시에 상기 생성된 HPRT 결핍 세포에 도입된다. 또 다른 실시 형태에서, 알로퓨리놀은 퓨린 유사체의 도입 후에 상기 생성된 HPRT 결핍 세포에 도입된다.
선택 및 확장 후, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 산물이 테스트된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 산물은 표준 방출 테스트 (예를 들어, 활성, 마이코플라스마, 생존력, 안정성, 표현형 등; 문헌 [Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 4 March 2017 92-101] 참조, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다)에 따라 테스트된다.
다른 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 산물은 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제 (예를 들어, MTX 또는 MPA)에 대한 민감도에 대해 테스트된다. MTX와 MPA를 둘 다 포함하는 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 퓨린의 드노보 합성을 억제하지만 상이한 작용 기전을 갖는 것으로 여겨진다. 예를 들어, MTX는 테트라하이드로폴레이트 (THF) 합성에 참여하는 효소인 디하이드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR)를 경쟁적으로 억제하는 것으로 여겨진다. DHFR은 디하이드로폴레이트에서 활성 테트라하이드로폴레이트로의 전환을 촉매한다. 엽산은 DNA 합성에 필요한 뉴클레오사이드 티미딘의 드노보 합성에 필요하다. 또한, 폴레이트는 퓨린 및 피리미딘 염기 생합성에 필수적이므로, 합성은 억제될 것이다. 마이코페놀산 (MPA)은 이노신-5'-모노포스페이트 (IMP)로부터 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP)의 드노보 합성에 필수적인 효소인 이노신-5'-모노포스페이트 데하이드로게나아제 (IMPDH)의 강력하고 가역적인 비경쟁적 억제제이다.
따라서, MTX 또는 MPA 둘 다를 포함하는 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제는 DNA, RNA, 티미딜레이트 및 단백질의 합성을 억제한다. MTX 또는 MPA는 DHFR을 억제하여 드노보 경로를 억제한다. HPRT-/- 세포에서, 어떠한 기능적 회수 또는 드노보 경로도 없어 어떠한 퓨린 합성도 초래하지 않으므로, 상기 세포는 사멸한다. 그러나, HPRT 야생형 세포는 기능적 회수 경로를 가지며, 이의 퓨린 합성은 발생하고 상기 세포는 생존한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 실질적으로 HPRT 결핍된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단 중 적어도 약 70%는 MTX 또는 MPA에 민감하다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단 중 적어도 약 75%는 MTX 또는 MPA에 민감하다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단 중 적어도 약 80%는 MTX 또는 MPA에 민감하다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단 중 적어도 약 85%는 MTX 또는 MPA에 민감하다. 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단 중 적어도 약 90%는 MTX 또는 MPA에 민감하다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단 중 적어도 약 95%는 MTX 또는 MPA에 민감하다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단 중 적어도 약 97%는 MTX 또는 MPA에 민감하다.
일부 실시 형태에서, 리바바린 (IMPDH 억제제); VX-497 (IMPDH 억제제) (문헌 [Jain J, VX-497: a novel, selective IMPDH inhibitor and immunosuppressive agent, J Pharm Sci. 2001 May;90(5):625-37] 참조); 로메트렉솔 (DDATHF, LY249543) (GAR 및/또는 AICAR 억제제); 티오펜 유사체 (LY254155) (GAR 및/또는 AICAR 억제제), 푸란 유사체 (LY222306) (GAR 및/또는 AICAR 억제제) (문헌 [Habeck et al., A Novel Class of Monoglutamated Antifolates Exhibits Tight-binding Inhibition of Human Glycinamide Ribonucleotide Formyltransferase and Potent Activity against Solid Tumors, Cancer Research 54, 1021-2026, Feb. 1994] 참조); DACTHF (GAR 및/또는 AICAR 억제제) (문헌 [Cheng et. al. Design, synthesis, and biological evaluation of 10-methanesulfonyl-DDACTHF, 10-methanesulfonyl-5-DACTHF, and 10-methylthio-DDACTHF as potent inhibitors of GAR Tfase and the de novo purine biosynthetic pathway; Bioorg Med Chem. 2005 May 16;13(10):3577-85] 참조); AG2034 (GAR 및/또는 AICAR 억제제) (문헌 [Boritzki et. al. AG2034: a novel inhibitor of glycinamide ribonucleotide formyltransferase, Invest New Drugs. 1996;14(3):295-303] 참조); LY309887 (GAR 및/또는 AICAR 억제제) ((2S)-2-[[5-[2-[(6R)-2-아미노-4-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로-1H-피리도[2,3-d]피리미딘-6-일]에틸]티오펜-2-카보닐]아미노]펜탄디오산); 알림타 (LY231514) (GAR 및/또는 AICAR 억제제) (문헌 [Shih et. al. LY231514, a pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-based antifolate that inhibits multiple folate-requiring enzymes, Cancer Res. 1997 Mar 15;57(6):1116-23] 참조); dmAMT (GAR 및/또는 AICAR 억제제), AG2009 (GAR 및/또는 AICAR 억제제); 포로데신 (이뮤실린 H, BCX-1777; 상표명 문데신 및 포도신) (퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제 [PNP]의 억제제) (문헌 [Kicska et. al., Immucillin H, a powerful transition-state analog inhibitor of purine nucleoside phosphorylase, selectively inhibits human T lymphocytes (T-cells), PNAS April 10, 2001. 98 (8) 4593-4598] 참조); 및 이뮤실린-G (퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제 [PNP]의 억제제)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 대체 작용제가 MTX 또는 MPA 대신에 사용될 수 있다.
단계 110 내지 140에 따라 생성된 변형된 T 세포의 MTX 또는 MPA에 대한 민감성을 고려해 볼 때, MTX 또는 MPA (또는 다른 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제)는 본 출원에서 기재된 바와 같이 HPRT 결핍 세포를 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, MTX 또는 MPA의 유사체 또는 유도체는 MTX 또는 MPA를 대체할 수 있다. MTX의 유도체는 미국 특허 US 5,958,928 및 국제공개공보 WO 2007/098089에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
치료 방법
일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, 단계 110 내지 140에 따라 제조된 T 세포는 환자에게 투여된다 (단계 150). 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 (또는 본 출원에서 기재된 바와 같은 CAR T 세포 또는 TCR T 세포)는 단일 투여 (예를 들어, 단일 볼루스, 또는 설정 기간, 예를 들어, 약 1 내지 약 1 내지 4시간 또는 그 이상에 걸친 투여)로 상기 환자에게 제공된다. 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 다중 투여가 이루어진다. 다중 용량의 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포가 투여되는 경우, 각각의 용량은 동일하거나 상이할 수 있다 (예를 들어, 용량 증가, 용량 감소).
일부 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 용량의 양은 CD3 양성 T 세포 함량/대상체 체중 kg에 기초하여 결정된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 총 용량은 약 0.1 x 106개/체중 kg 내지 약 730 x 106/체중 kg의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 총 용량은 약 1 x 106개/체중 kg 내지 약 500 x 106/체중 kg의 범위이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 총 용량은 약 1 x 106개/체중 kg 내지 약 400 x 106/체중 kg의 범위이다. 추가의 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 총 용량은 약 1 x 106개/체중 kg 내지 약 300 x 106/체중 kg의 범위이다. 더 추가의 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 총 용량은 약 1 x 106개/체중 kg 내지 약 200 x 106/체중 kg의 범위이다.
다중 용량이 제공되는 경우, 투여 빈도는 약 1주 내지 약 36주의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 다중 용량이 제공되는 경우, 상기 변형된 T 세포의 각 용량은 약 0.1 x 106개/체중 kg 내지 약 240 x 106/체중 kg의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 각 용량은 약 0.1 x 106개/체중 kg 내지 약 180 x 106/체중 kg의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 각 용량은 약 0.1 x 106개/체중 kg 내지 약 140 x 106/체중 kg의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 각 용량은 약 0.1 x 106개/체중 kg 내지 약 100 x 106/체중 kg의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포의 각 용량은 약 0.1 x 106개/체중 kg 내지 약 60 x 106/체중 kg의 범위이다. 다른 투여 전략은 문헌 [Gozdzik J et al., Adoptive therapy with donor lymphocyte infusion after allogenic hematopoietic SCT in pediatric patients, Bone Marrow Transplant, 2015 Jan;50(1):51-5]에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 단독으로 또는 전체 치료 전략의 일부로서 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 HSC 이식 후, 예를 들어, HSC 이식 후 약 2 내지 약 4주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 이식 후 면역 결핍을 예방 또는 경감시키기 위해 HSC 이식편의 투여 후 투여된다. 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 단기간 (예를 들어, 약 3 내지 약 9개월) 면역 재구성 및/또는 방어를 제공할 수 있다. 또 다른 예로서, 및 다른 구체예에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 이식편 대 악성 종양 (graft-versus-malignancy: GVM) 효과 또는 이식편 대 종양(GVT) 효과를 유도하는데 도움이 되는 암 요법의 일부로서 투여된다. 추가의 예로서, 상기 변형된 T 세포는 HPRT 결핍되고 암 요법 전략의 일부로서 투여되는 CAR T 세포 또는 TCR 변형된 T 세포이다. 이러한 치료 각각에 따른 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 투여는 본 출원에서 보다 상세하게 기재되어 있다. 물론, 통상의 기술자는 임의의 기저 병태에 대한 다른 치료가 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 투여 전에, 투여 후에 또는 동시에 일어날 수 있다는 것을 인식할 것이다.
환자에 대한 림프구, 예를 들어, T 세포의 투여는 본 출원에서 인용된 것들을 비롯한 원치 않는 부작용을 초래할 수 있다. 예를 들어, 이식편 대 숙주 질환은 환자가 변형된 T 세포 (예를 들어, HPRT의 녹다운 또는 녹아웃을 통해)를 비롯한 림프구로 치료된 후에 발생할 수 있다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 투여 후, 단계 150에서, 상기 환자는 GvHD를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 부작용의 발생에 대해 모니터링된다. GvHD (또는 GvHD의 증상)와 같은 임의의 부작용이 발생하는 경우, 부작용, 예를 들어, GvHD를 억제, 감소, 제어 또는 경감시키기 위한 노력으로, MTX 또는 MPA를 단계 160에서 상기 환자에게 (생체내) 투여하여 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 적어도 일부를 제거한다. 일부 실시 형태에서, MTX 또는 MPA는 단일 용량으로 투여된다. 다른 실시 형태에서, 다중 용량의 MTX 및/또는 MPA가 투여된다.
본 개시 내용의 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 (일단 생체외에서 선택되고 환자 또는 포유 동물 대상체에게 투여됨)는 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제 (MTX 또는 MPA 둘 모두 포함)에 대한 민감성을 고려할 때 조절 가능한 "온"/"오프" 스위치의 역할을 할 수 있는 것으로 여겨진다. 상기 조절 가능한 스위치는 임의의 부작용이 발생하는 경우에 상기 환자에 대한 MTX의 투여를 통해 생체내에서 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 적어도 일부를 선택적으로 사멸시킴으로써 면역계 재구성의 조절을 가능하게 한다. 이러한 조절 가능한 스위치는 부작용이 감소되거나 경감된 후에 추가의 면역계 재구성이 가능하도록 하기 위해 MTX 투여 후 추가로 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포를 상기 환자에게 투여함으로써 추가로 조절될 수 있다. 마찬가지로, 상기 조절 가능한 스위치는 임의의 부작용이 발생하는 경우에 MTX의 투여를 통해 생체내에서 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 적어도 일부를 선택적으로 사멸시킴으로써 이식편 대 악성 종양 효과의 조절을 가능하게 한다. 다시 말하지만, 상기 GVM 효과는 일단 부작용이 감소되거나 경감되면 추가 분취량의 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포를 상기 환자에게 후속적으로 투여함으로써 미세 조정될 수 있다. 이러한 동일 원리는 CAR T 세포 요법 또는 TCR 변형된 T 세포 요법에 적용되며, 여기서, 다시 상기 CAR T 세포 또는 TCR 변형된 T 세포는 MTX 투여를 통해 선택적으로 켜지거나 꺼질 수 있다. 이를 고려하여, 당해 분야의 통상의 기술자는 환자의 치료를 감독하는 임의의 의료 전문가가 부작용을 억제하거나 내성을 갖거나 허용 가능한 범위 내에서 면역계 재구성 및/또는 GVM 효과의 균형을 유지할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 상기에 의해, 환자 치료는 부작용을 경감시키면서 증진될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 100 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 90 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 80 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 70 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 60 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 50 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 40 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 30 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 20 mg/m2/주입 내지 약 20 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 10 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 8 mg/m2/주입의 범위이다. 다른 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2.5 mg/m2/주입 내지 약 7.5 mg/m2/주입의 범위이다. 또 다른 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 5 mg/m2/주입이다. 더 추가의 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 7.5 mg/m2/주입이다.
일부 실시 형태에서, 2 내지 6회의 주입이 이루어지며, 상기 주입은 각각 동일한 투약량 또는 상이한 투약량 (예를 들어, 투약량 증가, 투여량 감소 등)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 투여는 매주 또는 격월 단위로 이루어질 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 조절되지 않은 부작용, 예를 들어, GvHD가 적어도 일부 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포, 및 면역계의 재구성, 암의 표적화 또는 GVM 효과의 유도에 대한 T 세포의 수반되는 효과를 보존하면서 해결되도록 적정된다 (titrated). 이와 관련하여, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 이점 중 적어도 일부는 부작용, 예를 들어, GvHD를 개선하면서 여전히 인식될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 추가의 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 MTX 치료 후, 즉, 부작용, 예를 들어, GvHD의 해결, 억제 또는 제어 후에 투여된다.
일부 실시 형태에서, 상기 대상체는, 예를 들어, HSC 이식 후 부작용을 제어 또는 예방하기 위해 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 투여 전에 MTX의 용량을 투여받는다. 일부 실시 형태에서, 기존의 MTX 치료는 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포의 투여 전에 중단된 다음, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포에 의한 치료 후 부작용의 발생시에 동일하거나 상이한 용량 (및 동일하거나 상이한 투여 일정 사용)으로 재개된다. 이와 관련하여, 통상의 기술자는 필요에 따라 그리고 의료 산업에서 공지된 표준 치료에 따라 MTX를 투여할 수 있다.
추가의 치료 전략
도 19는 증상의 발생시 GvHD를 감소, 억제 또는 제어하는 하나의 방법을 예시한 것이다. 처음에, 세포는 단계 210에서 공여체로부터 수집된다. 상기 세포는 이식을 위해 HSC를 제공한 동일한 공여체 (단계 260 참조) 또는 상이한 공여체로부터 수집될 수 있다. 그 다음, 림프구는 상기 수집된 세포로부터 단리되고 (단계 220), HPRT 결핍되도록 (즉, HPRT의 녹다운 또는 녹아웃을 통해) 처리된다 (단계 230). 상기 단리된 세포를 처리하는 방법은 본 출원에 제시되어 있다. 실질적으로 HPRT 결핍되는 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단에 도달하기 위해, 상기 처리된 세포는 본 출원에서 기재된 바와 같이 양성 선택되고 확장된다 (단계 240). 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 추후에 사용하기 위해 저장된다. HSC 이식편을 받기 전에 (단계 260), 환자는 표준 치료 (단계 250) (예를 들어, 고용량 조건화 방사선, 화학 요법 및/또는 퓨린 유사체 치료, 또는 저용량 조건화 방사선, 화학 요법 및/또는 퓨린 유사체 치료)에 따라 골수 소멸성 조건화로 처리된다. 일부 실시 형태에서, 상기 환자는 조건화 요법에 의한 처리 후 약 24 내지 약 96시간에 HSC 이식편으로 치료된다 (단계 260).
도 20는 증상의 발생시 GvHD를 감소, 억제 또는 제어하는 하나의 방법을 예시한 것이다. 처음에, 세포는 단계 310에서 공여체로부터 수집된다. 상기 세포는 이식을 위해 HSC를 제공한 동일한 공여체 (단계 335 참조) 또는 상이한 공여체로부터 수집될 수 있다. 그 다음, 림프구는 상기 수집된 세포로부터 단리되고 (단계 320), HPRT 결핍되도록 처리된다 (단계 330). 상기 단리된 세포를 처리하는 방법은 본 출원에 제시되어 있다. 실질적으로 HPRT 결핍되는 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 집단에 도달하기 위해, 상기 처리된 세포는 본 출원에서 기재된 바와 같이 선택되고 확장된다 (단계 340). 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 추후에 사용하기 위해 저장된다. 예를 들어, 혈액암과 같은 암에 걸린 환자는 암의 발병 및 병기 결정 시점에 환자에게 이용 가능한 표준 치료 (예를 들어, 생물 제제를 비롯한 방사선 및/또는 화학 요법)에 따라 치료될 수 있다 (단계 315). 상기 환자는 또한 HSC 이식의 후보일 수 있으며, 그렇다면 조건화 요법 (단계 325)이 (예를 들어, 고용량 조건화 방사선 또는 화학 요법에 의해) 실시된다. 악성 종양의 경우, 일부 실시 형태에서는 환자가 혈관계를 완전히 또는 가능한 한 완전에 가깝게 "제거하여 (wipe out)" 가능한 한 많은 악성 종양 세포를 사멸시키고자 하는 것으로 여겨진다. 이러한 조건화 요법의 목표는 암 세포를 집중적으로 치료하여 암 재발 가능성을 낮추고, 면역계를 불활성화하여 줄기 세포 이식 거부의 가능성을 감소시키고, 공여체 세포가 골수로 이동할 수 있도록 하는 것이다. 일부 실시 형태에서, 조건화는 사이클로포스파마이드, 사이타라빈 (AraC), 에토포사이드, 멜팔란, 부설판 또는 고용량 전신 방사선 조사 중 하나 이상의 투여를 포함한다. 그 다음, 상기 환자는 동종 이계 HSC 이식편으로 치료된다 (단계 335). 일부 실시 형태에서, 상기 동종 이계 HSC 이식편은 적어도 부분적 GVM, GVT 또는 GVL 효과를 유도한다. 이식 후, 상기 환자는 잔류 또는 재발 질환에 대해 모니터링된다 (단계 350). 이러한 잔류 또는 재발 질환이 존재하는 경우, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포 (단계 340에서 생성)는 GVM, GVT 또는 GVT 효과가 유도될 수 있도록 상기 환자에게 투여된다 (단계 360). 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 여러 투여 과정에 걸쳐 단일 투여로 주입될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 HSC 이식 후 약 1일 내지 약 21일에 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 T 세포는 HSC 이식 후 약 1일 내지 약 14일에 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 HSC 이식 후 약 1일 내지 약 7일에 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 HSC 이식 후 약 2일 내지 약 4일에 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구, 예를 들어, T 세포는 HSC 이식편과 동시에 또는 HSC 이식의 수시간 (예를 들어, HSC 이식 후 1, 2, 3 또는 4 시간) 이내에 투여된다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 변형된 CAR T 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 암 환자를 치료하는 방법이며, 상기 변형된 CAR T 세포는 HPRT 결핍된다. 도 21은 암 환자를 치료한 후 임의의 유해한 부작용을 감소, 억제 또는 제어하는 하나의 방법을 예시한 것이다. 처음에, 세포는 단계 410에서 공여체로부터 수집된다. 그 다음, 림프구는 상기 수집된 세포로부터 단리되고 (단계 420), HPRT 결핍되는 CAR T 세포를 제공하도록 변형된다.
실시예
실시예 1 - 6TG 선택을 통한 HPRT 녹다운 대 녹아웃
K562 세포를, HPRT를 녹다운시키도록 설계된 핵산 서열 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 (MOI=1/2/5)로 형질 도입시키거나; 0 일차에 HPRT (100 ng/5x104개 세포)를 녹아웃시키기 위해 CRISPR/Cas9 및 sgRNA를 포함하는 나노캡슐로 형질 감염시켰다. 6TG를 3일차부터 14일차까지 배지에 첨가하였다. 상기 배지를 3 내지 4일마다 다시 채웠다. GFP를 유동 기계에서 분석하였으며, InDel%를 T7E1 검정으로 분석하였다. 도 12a는 형질 도입된 K562 세포의 GFP+ 집단이 6TG의 처리하에 3일차부터 14일차까지 증가한 반면, GFP+ 집단이 처리 없이 거의 안정적이었다는 것을 예시한 것이다. 도 12b는 K562 세포의 HPRT 녹아웃 집단이 6TG에 의한 처리하에 3일차부터 14일차까지 증가하였으며, 보다 높은 투약량 (900 nM)의 6TG가 300/600 nM의 6TG의 투약량과 비교하여 보다 신속한 선택을 초래하였다는 것을 예시한 것이다. 6TG 선택 과정은 3일차부터 14일차까지 동일 농도의 300 nM 6TG에서 HPRT 녹다운 세포 (MOI=1)와 비교하여 HPRT 녹아웃 세포에서 보다 신속하게 발생하였다는 것에 유의해야 한다. 녹다운과 녹아웃 사이의 차이는 녹아웃 접근법에 의한 HPRT의 완전한 제거와 비교하여 RNAi 녹다운 접근법에 의한 일정 수준의 잔류 HPRT에 의해 설명될 수 있었다 (또한 도 22 참조). 따라서, HPRT 녹아웃 세포는 6TG에 대해 훨씬 더 높은 내성을 갖는 것으로 여겨졌으며, HPRT 녹다운 세포와 비교하여 보다 높은 투약량의 6TG (900 nM)에서 훨씬 더 신속하게 성장하는 것으로 여겨졌다.
CEM 세포를, HPRT를 녹다운시키도록 설계된 핵산 서열 및 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질 도입시키거나, 0 일차에 HPRT에 대한 CRISPR/Cas9 및 sgRNA를 포함하는 나노캡슐로 형질 감염시켰다. 6TG를 3일차부터 17일차까지 배지에 첨가하였다. 상기 배지를 3 내지 4일마다 다시 채웠다. GFP를 유동 기계에서 분석하며, InDel%를 T7E1 검정으로 분석한다. 도 13a는 형질 도입된 K562 세포의 GFP+ 집단이 6TG의 처리하에 3일차부터 17일차까지 증가한 반면, GFP+ 집단이 처리 없이 거의 고정적이었다는 것을 예시한 것이다. 도 13b는 CEM 세포의 HPRT 녹아웃 집단이 6TG의 처리하에 3일차부터 17일차까지 증가하였으며, 보다 높은 투약량 (900 nM)의 6TG가 300/600 nM의 6TG의 투약량과 비교하여 보다 신속한 선택을 초래한다는 것을 도시한 것이다. 6TG 선택 과정은 3일차부터 17일차까지 동일 농도의 6TG에서 HPRT 녹다운 세포 (MOI=1) 보다는 오히려 HPRT 녹아웃 세포에서 보다 신속하게 발생하였다는 것에 유의해야 한다.
실시예 2 - MTX 또는 MPA에 의한 음성 선택
형질 도입 또는 형질 감염된 K562 세포 (예를 들어, 실시예 1의 세포)를 0일차부터 14일차까지 MTX의 유무하에 배양하였다. 상기 배지를 3 내지 4일마다 다시 채웠다. GFP를 유동 기계에서 분석하였으며, InDel%를 T7E1 검정으로 분석하였다. 도 14a는 형질 도입된 K562 세포의 GFP- 집단이 0.3 μM의 MTX 처리하에 감소되었다는 것을 도시한 것이다. 다른 한편으로, 상기 세포 집단은 MTX 없이 안정적이었다. 도 14b는 형질 감염된 K562 세포가 HPRT 녹다운 집단과 비교하여 보다 신속한 속도로 0.3 μM의 MTX에 의한 처리하에 제거되었다는 것을 예시한 것이다.
형질 도입 또는 형질 감염된 CEM 세포 (예를 들어, 실시예 1의 세포)를 0일차부터 14일차까지 MTX의 유무하에 배양하였다. 상기 배지를 3 내지 4일마다 다시 채웠다. GFP를 유동 기계에서 분석하였으며, InDel%를 T7E1 검정으로 분석하였다. 도 15a는 형질도입된 K562의 GFP- 집단이 1 μM의 MPA 또는 0.3 μM의 MTX 또는 10 μM의 MPA의 처리하에 감소된 반면, 상기 세포 집단이 미처리 그룹에 대해 안정적이었다는 것을 도시한 것이다. 도 15b는 CEM 세포의 HPRT 녹아웃 집단이 1 μM의 MPA 또는 0.3μM의 MTX 또는 10μM의 MPA의 처리하에 보다 신속한 속도로 제거되었다는 것을 예시한 것이다.
실시예 3 - K562 세포에 대한 MTX에 의한 음성 선택
K562 세포를, (i) 16의 희석 배율의 TL20cw-GFP 바이러스 수프, (ii) 16의 희석 배율의 TL20cw-Ubc/GFP-7SK/sh734 바이러스 수프 (GFP 및 HPRT를 녹다운시키도록 설계된 shRNA를 순차적으로 인코딩하는 것); 또는 (iii) 16의 희석 배율의 TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP 바이러스 수프 (HPRT를 녹다운시키도록 설계된 shRNA 및 GFP를 순차적으로 인코딩하는 것) 중 하나로 형질 도입시켰다 (도 16 참조). 1024의 희석 배율의 TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP 바이러스 수프 (HPRT를 녹다운시키도록 설계된 shRNA를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 것)에 의해 K562 세포를 또한 형질 도입시켰다 (또한 도 16에 도시됨). 형질 도입 후 3일째에, 모든 세포를 0.3 μM의 MTX 3을 함유하는 배지로 배양하였다. 도 16에서 예시된 바와 같이, GFP+ 집단 중 90% 초과에서 시작하여, GFP 또는 GFP-sh734 형질 도입된 세포는 GFP+ 집단의 감소를 나타내지 않은 반면, sh734-GFP-형질 도입된 세포는 GFP+ 집단의 탈선택을 나타냈다 (고희석 (1024) 및 저희석 (16) 수준 모두에서). sh734-GFP-형질 도입된 세포 및 GFP-sh734-형질 도입된 세포에 대한 벡터 카피 수 (vector copy number: VCN)에 대한 상대적 sh734 발현을 측정하였다. 그 결과는 메토트렉세이트가 sh734-저발현 렌티바이러스 벡터 (TL20cw-UBC/GFP-7SK/sh734)가 아니라 sh734-고발현 렌티바이러스 벡터 (TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP)로 형질 도입된 세포만 탈선택할 수 있었는 것을 제시하였다. 본 실시예에 의하면, 상이한 벡터 설계들 (심지어 동일한 shRNA를 갖는 것들)은 shRNA 헤어핀의 발현에 영향을 미치며 형질 도입된 세포가 MTX 처리에 의해 선택될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 것으로 입증되었다.
실시예 4 - 변형된 T 세포의 형질 감염/형질 도입, 선택 및 확장
대량 버피 (buffy) 팩 (호주 적십자 혈액 서비스)로부터 유도된 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 사용하여 1차 사람 T 세포 정제를 수행하여 다운스트림 적용을 위한 충분한 수의 T 세포를 농축할 수 있다. 동종 항원에 반응하는 T 세포 증식의 평가와 같은 미래의 T 세포 기능 분석을 위해 나머지 세포를 냉동 보존할 것이다. 정제된 T 세포를 48 시간 동안 고정된 항-CD3 및 재조합 사람 (rh) IL-2 (현재 공개된 프로토콜 REF에 따름)로 시험관 내에서 자극한 후, HPRT 유전자의 변형을 위해 렌티바이러스로 형질 도입하거나 DNA 함유 나노입자로 형질 감염시킬 것이다. 이러한 변형된 T 세포를 배양한 후 (2~3일), rhIL-2의 존재하에 최대 14일 동안 추가로 확장시킬 것이다. 배양 조건 전체에 걸쳐, 형광 추적자 (예를 들어, GFP)의 검출 및 HPRT 유전자 발현 수준의 검출을 위한 정량적 RT-PCR (qPCR)에 의해 결정될 때 유전자 변형을 성공적으로 거친 세포의 비율을 평가하기 위해 샘플을 수집할 것이다.
유전자 변형 후 14일에, 6-티오구아닌 (6TG)을 사용하여 유전자 변형된 T 세포의 선택을 수행하여 변형되지 않은 모든 T 세포의 음성 선택에 필요한 용량을 평가할 것이다. 6TG 용량의 적정은 또한 이러한 선택 방법에 대한 잠재적 공여체 의존적 민감성 및 이것이 퓨린 유사체에 대한 공지된 TPMT 유전자형 의존적 민감성과 어떻게 관련될 수 있는지 평가할 수 있도록 한다. 6TG 용량 적정에 대한 연구는 또한 shRNA 발현 수준을 기반으로 한 용량-창 변동성 (dose-window variability)을 평가하는데 도움이 될 것이다. 선택을 수행한 후, 다양한 사이토카인 조합 (IL-2/IL-7/IL-15/IL-21)의 선택에 의한 변형된 T 세포의 확장을 수행할 것이다. 메토트렉세이트의 사용을 통한 "킬 스위치" 활성화에 대한 민감성에 대해 확장된 T 세포 집단을 최종적으로 테스트할 것이다.
실시예 5 - 변형된 1차 사람 T 세포의 기능적 평가
유전자 변형 및 배양 조건의 잠재적 결과에 대한 이해를 얻기 위해, 시험관내 방법을 사용하여 상기 변형된 T 세포의 기능적 능력을 평가할 것이다. 나이브 (naive) T 세포, 이펙터 T 세포 서브 타입, 기억 T 세포 서브 타입, 조절 T 세포 등의 평가를 포함하고 세포 표면 T 세포 마커, 예를 들어, CD3/CD4/CD8/CD25/ CD27/CD28/CD45RA/RO/CD56/CD62L/CD127 또는 FoxP3 및 CD44를 포함하는 상기 배양물 내의 T 세포 서브 타입 비율을 표현형 분류할 것이다. 확장된 배양 조건의 결과로서의 T 세포 소진의 잠재적 발생도 또한 유세포 분석을 사용하여 평가할 것이다. 바이러스 펩타이드에 반응하는 유전자 변형된 T 세포의 기능적 능력을 T 세포 증식 및 사이토카인 방출 검정을 사용하여 평가할 것이다. 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus: EBV) 및 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV)와 같은 바이러스 유래의 바이러스 펩타이드에 대한 이러한 기능적 반응은 면역 억제의 맥락에서 재활성화되는 주요 바이러스이며, 병원 환자와 관련이 있다.
최종적으로, 시험관내 증식 검정을 사용하는 냉동 보존된 (및 유전자형 분류된) 일배체 동일 공여체 PBMC에 대한 동종 반응성에 대해 각각의 공여체 변형된 T 세포 배양물을 평가할 것이다. 이것은 이식 맥락에서 잠재적인 동종 반응성을 모방하고 측정하도록 설계된다. 유전자 변형된 T 세포 풀 내의 조절 T 세포 구획의 기능적 능력을 이러한 맥락에서 잠재적으로 평가할 수 있다.
실시예 6 - 메토트렉세이트 투여 후 "잔류" 유전자 변형된 T 세포 집단의 표현형 및 기능적 특성화
킬 스위치 유도 및 GvHD 또는 CRS와 같은 병태의 해결 후 수여자 내에 존재하는 잔류 유전자 변형된 세포의 능력에 대한 이해는 적절한 수와 관련 기능으로 확장 및 재구성되는 유전자 변형된 세포의 능력이다. 따라서, 공여체 세포 고갈에 대한 최소 임계값 (threshold) 수준에 이어서 적절한 확장성 및 기능적 활성을 이해하는 것이 중요하다. 제3자에 의해 수행된 임상 시험에 따르면, 킬 스위치 활성화는 2 시간 이내에 생체내 공여체 T 세포 중 >99% 고갈을 초래하고 GvHD 및 CRS 증상의 해결은 24~48 시간 이내에 발생하는 것으로 나타났다. 또한, 수여자에 잔류하는 변형된 세포 중 <1%는 GvHD 또는 CRS의 재활성화를 초래하지 않고 재확장할 수 있다. 사멸 스위치의 활성화가 적극적으로 확장하는 공여체 동종 반응성 T 세포의 우선적 사멸을 초래하므로, GvHD/CRS의 재발로 이어질 가능성이 있는 T 세포 레퍼토리의 고갈을 초래한다는 가설이 제시된다. 재확장된 세포의 생체외 분석은 잔류 레퍼토리가 바이러스 항원을 인식하고 이에 반응할 수 있다는 것을 나타내는데, 이는 수여자가 면역 약화되지 않을 것임을 나타낸다. 또한, 이러한 시험의 수여자들은 100일까지 질병이 없는 상태를 유지하였으며, 이러한 제한된 후속 기간을 초과한 데이터는 아직 이용 가능하지 않다. 최종적으로, 이러한 세포의 고갈이 공여체 세포 관련 합병증으로 인해 추후에 필요한 경우, 잔류/재확장된 집단이 두 번째 통과에서 킬 스위치 유도에 민감한 상태로 남아 있는지 여부를 결정할 것이다.
실시예 7 - 마우스 모델에서의 생체내 개념 증명 연구
GvHD 내성 및 GvHD 민감성 사람화 NSG 마우스 모두에서 변형된 T 세포의 생체내 거동 및 특성을 탐구하기 위해, 동물 연구를 수행할 것이다. 초기 연구는 변형된 T 세포에서 T 세포 생착 및 MTX 유도 "킬 스위치" 기능을 평가하는 것을 목표로 한다. 이러한 연구를 GvHD 내성 마우스에서 수행할 것이다. 후속 연구는 GvHD의 마우스 모델을 확립하는 것을 목표로 하여 "킬 스위치"를 테스트할 임상적으로 관련된 생체내 환경을 제공할 것이다. MTX 반응성에 대한 이해와 함께 T 세포 용량, 분포 및 기능에 대한 명확한 이해를 바탕으로, 백혈병 챌린지 (challenge)를 받은 GvHD에 민감성 마우스에서 생체 내 POC 연구를 수행할 것이다. GVT 반응을 시작하는 능력을 유지하면서 GvHD를 최소화하기 위해 MTX "킬 스위치"를 촉발하여 변형된 T 세포를 조작할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
실시예 8 - T 세포 용량, 생착, 분포, 생존 및 메토트렉세이트 민감성 이해
지속적인 생착을 위한 최적의 T 세포 용량을 확립하기 위해, MHC KO NSG 마우스 (GvHD 내성)를 상이한 용량의 변형된 T 세포로 이식할 것이다. 상이한 시점에서, 림프 및 비림프 기관의 T 세포 분포를 분석할 것이다.
본 출원에서 언급된 바와 같이 결정된 최적의 T 세포 용량 (i)을 사용하여, 생착 후 24 내지 48 시간에 상이한 용량의 메토트렉세이트로 마우스를 처리할 것이다. 변형된 T 세포가 얼마나 신속하게 제거되는지 이해하도록 설계된 분석 시간 경과에서, 림프 및 비림프 기관 중의 잔류 T 세포의 수를 결정할 것이다.
시간 경과에 따라 상기 변형된 T 세포 이식편의 수명 및 이러한 T 세포의 MTX 민감성을 탐구하기 위한 병행 연구를 시작할 것이다. 최적 용량의 변형된 T 세포를 투여받은 마우스는 6개월 지난 후 MTX 유도된 "킬 스위치"를 촉발시킬 것이다. 림프 및 비림프 기관 중 잔류 T 세포의 수를 이전에 결정된 최적 분석 시간에서 결정할 것이다. 변형된 T 세포가, 후기 발병 급성 또는 만성 GvHD의 경우일 수 있는 바와 같이, 후기 시점에서 촉발될 때 MTX "킬 스위치"에 얼마나 잘 반응할 수 있는지를 나타낼 것이다.
실시예 9 - GvHD 마우스 모델의 확립 및 특성화 및 변형된 T 세포 이식편의 분석
GvHD를 시작하기 위해, 방사선 조사 조건화된 NSG 마우스를 조건화 후 2~24 시간 이내에 최적 용량의 변형된 T 세포로 이식할 것이다. 공개된 문헌으로부터, GvHD는 약 25 일차까지 이들 마우스에서 발병하며 (신체 자세, 활동, 모피 및 피부 상태 및 체중 감소 모니터링), 약 55 일차까지 질환 평가 변수에 도달한다 (GvHD의 임상 증상과 함께 >20% 체중 감소). 질환 진행이 유의하게 느리거나 보다 공격적일 경우, 최적 용량보다 각각 더 높거나 더 낮은 T 세포 용량을 테스트할 수 있다 (문헌에 근거한 약 106~107개 T 세포).
최적화된 T 세포 용량 및 질병 동력학으로, T 세포 생착을 시간 경과 분석에서 탐구할 것이다. 상이한 기관의 T 세포 씨딩 (seeding)은 GvHD의 특징이며, 이를 본 발명의 모델에서 탐구할 것이다. 관찰된 GvHD의 발병 및 중증도에 의해 시간 경과 분석 시점을 결정할 것이다.
상기 변형된 T 세포가 림프 기관에서 명확하게 검출 가능한 경우, T 세포 (CD4+ 및 CD8+) 기능을 분석할 것이다. T 세포를 다양한 자극 (예를 들어, PMA, CD3/CD28)으로 시험관 내에서 자극하고 표현형, 증식, 사이토카인 생산 및 생체 외 항종양 세포독성에 대해 분석할 것이다. 잠복 바이러스 재활성화에 반응하는 능력의 척도로서 바이러스 펩타이드, 예를 들어, CMV, EBV 및 FLU (Proimmune ProMix CEF 펩타이드 풀)에 반응하는 능력에 대해 T 세포를 구체적으로 분석할 것이다.
실시예 10 - GvHD 모델에서의 메토트렉세이트 유도된 "킬 스위치"의 활성화
이전에 결정된 최적 조건에 따라 NSG 마우스를 방사선 조사하고 변형된 T 세포로 이식할 것이다. GvHD의 급성기 또는 만성기에서, 마우스에게 최적 용량을 비롯한 다양한 용량의 MTX로 투여할 것이다. 말초 혈액 중 변형된 T 세포의 백분율을 실험의 종료까지 매주 결정할 것이다. 마우스가 진행성 질환 발병으로부터 구제될 수 있는지 확인하기 위해 GvHD 발생을 모니터링할 것이다. 전신 수준에서 GvHD의 중증도를 이해하기 위해 변형된 T 세포의 다양한 기관으로의 침윤을 정량화할 것이다.
실시예 11 - GVT/GvHD 마우스 모델에서의 변형된 T 세포 POC
이전에 결정된 최적 조건에 따라 NSG 마우스를 방사선 조사하고 변형된 T 세포로 이식할 것이다. 방사선 조사 후 24일 이내에, 백혈병을 확립하기 위해 일정 용량의 P815 H2-Kd 세포주를 마우스에게 투여할 것이다. 생체내 생체 분포 및 종양 성장 평가를 위한 GFP를 발현하도록 상기 P815 세포를 이전에 형질 도입할 것이다. GvHD의 발병시, 마우스를 최적 용량의 MTX로 처리하고, 실험의 종료까지 백혈병 부담뿐만 아니라 질환 진행을 모니터링할 것이다.
실시예 12 - HPRT 녹아웃 가이드 RNA
도 23 및 하기 표는 온 표적 및 오프 표적 효과에 대해 검사된 다양한 가이드 RNA를 제시한다. 본 출원에서 기재된 것들과 같은 나머지 녹아웃 실험을 위한 리드 gRNA로서 "IDT-4" (서열 번호 36)를 선택하였다. 서열 번호 39 ("Nat Paper")는 문헌 [Yoshioka, S. et al. (2016). Development of a mono-promoter-driven CRISPR/Cas9 system in mammalian cells. Scientific Reports, 5, 18341]으로부터 유도되었으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
Figure pct00002
실시예 13 - 6-TG에 대한 HPRT 표적화 녹아웃 내성
방법
Cas9 및 tracrRNA와 함께 가이드 RNA (gRNA; GS-4; IDT-4로 명명됨)를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체로 Jurkat 세포를 전기 천공하였다. tracrRNA를 통해 gRNA로 형질 전환된 것으로 확인된 세포를 형광 활성화 세포 분류 (fluorescence activated cells sorting: FACS)를 이용하여 정제한 후, 72시간 동안 배양하였다. 그 다음, 증가하는 농도의 6-티오구아닌 (6-TG)을 상기 형질 도입된 배양 세포에 투여하여 내성을 평가하였다. 야생형 (변형되지 않음) Jurkat 세포를 대조군으로서 사용하였다.
결과
발광 (ATP 검출)을 사용하여 세포 생존성을 평가하였다. IDT-4 변형된 세포는 증가하는 용량의 6-TG (최대 10 uM까지 테스트됨)에 대한 내성을 나타냈다. 변형되지 않은 Jurkat 세포 (야생형)는 증가하는 농도의 6-TG 농도에 따라 세포 생존성의 감소를 나타냈다 (도 24 참조).
웨스턴 블롯을 사용하여 변형되지 않은 (WT) 및 IDT-4 변형된 Jurkat 세포를 또한 HPRT 단백질에 대해 분석하였다 (도 25 참조). 변형되지 않은 Jurkat 세포 (WT)는 예상 크기 (25 kDA)에서 검출 가능한 수준의 HPRT를 나타냈지만, IDT-4 변형된 세포는 검출 불가능한 수준의 HPRT를 나타냈다. 액틴 단백질 검출(하단 패널)을 단백질 로딩 대조군으로서 사용하였다.
실시예 14 - 장기간 세포 생존성 / 생존
방법
HPRT 녹아웃 Jurkat 세포 (가이드 RNA IDT-4로 변형됨; 실시예 1에 기재된 바와 같음; HPRT-/-로 명명됨)를 GFP 단독 (WT GFP)을 발현하도록 변형된 Jurkat 세포와 함께 대략 동일한 비율로 혼합하였다.
배양물에서 GFP+ 세포의 비율을 재평가하기 전에 세포를 18일 동안 표준 배양 조건하에 배양하였다.
결과
18 일차에 세포의 GFP 비율은 1 일차와 실질적으로 유사하였으며 (도 26 참조), 시간 경과에 따른 GFP+ 야생형 세포의 시작 비율의 유의한 변화가 없었는데 (도 27 참조), 이는 HPRT 단백질 결핍된 세포에 생존 이점 또는 단점이 없다는 것을 나타낸다. 이것은 6-TG의 존재하에 변형된 세포의 생존 이점이 활성 HPRT 효소의 부재로 인한 것이다는 것을 추가로 확인한다.
실시예 15 - HPRT 녹아웃 Jurkat 세포 - 메토트렉세이트 민감성
방법 및 결과
(A) MTX 용량 반응
Jurkat 세포 (변형되지 않음; WT)를 증가하는 농도의 메토트렉세이트 (MTX)와 함께 배양하여 WT 세포를 사멸시키는 데 필요한 MTX 투약량 창을 결정하였다 (도 28 참조). HPRT 녹아웃 (IDT-4 변형됨) Jurkat 세포의 후속 평가를 위해 0.00625 내지 0.025 μM MTX의 용량 범위를 선택하였다.
(B) HPRT 녹아웃 MTX 용량 반응
MTX에 대한 HPRT 녹아웃 (IDT-4 변형됨) Jurkat 세포의 용량 반응을 변형되지 않은 Jurkat 세포 (WT)와 비교하여 MTX에 대한 민감성을 결정하였다 (도 29 참조). HPRT 녹아웃 (IDT-4 변형됨) Jurkat 세포는 5일 동안 배양하였을 때 야생형 세포와 비교하여 0.00625 및 0.0125 μM의 농도에서 MTX에 대한 증가된 민감성을 나타냈다.
실시예 16 - HPRT 녹다운 Jurkat 세포
방법
Jurkat T 세포를 (A) TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP 또는 (B) TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734의 렌티바이러스 벡터로 변형시켰다. 실온에서 90분 동안 2,500 rpm에서 원심 분리한 후 37°C에서 60분 동안 인큐베이션함으로써, 8 ng/ml의 폴리브렌과 함께 1 ml의 희석되지 않은 바이러스 함유 배지 (virus containing medium: VCM)를 사용하는 각각의 렌티바이러스 벡터로 Jurkat 세포를 형질 도입하였다. 그 다음, 유세포 계측을 사용하여 형질 도입 효율 (GFP 양성 세포)을 결정하기 전에, 상기 세포를 형질 도입 및 VCM 제거 후 4일 동안 배양하였다.
결과
Jurkat 세포는 스핀 접종 후 4 일차에 높은 형질 도입 효율을 나타냈으며, sh734-GFP (도 30a 참조)는 4 일차에 76.2% GFP+ 세포를 초래하고, GFP-sh734 바이러스 (도 30b 참조)는 77.2% GFP+ 세포를 초래하였다. 변형된 Jurkat 세포를 3일 동안 6-TG 선택 (10 uM, 6-TG에 대한 야생형의 변형되지 않은 Jurkat 세포의 민감성을 평가하기 위해 생성된 이전 데이터를 기반으로 함)하에 두었다. 선택 프로토콜은 상기 변형된 세포주 각각에 대해 87% (도 30a 참조) 및 90% (도 30b 참조) GFP+ 세포로의 증가를 초래하였는데, 이는 변형되지 않은 세포의 사망 및 sh734 함유 세포의 증진된 생존을 나타낸다.
실시예 17 - HPRT 녹다운 CEM T 세포
방법
CEM T 세로를 TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP (sh734-GFP) 및 TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734 (GFP-sh734)의 렌티바이러스 벡터로 변형시켰다.
실온에서 90분 동안 2,500 rpm에서 원심 분리한 후 37°C에서 60분 동안 인큐베이션함으로써, 10 ng/ml의 폴리브렌과 함께 1 ml의 희석되지 않은 바이러스 함유 배지 (VCM)로 CEM 세포를 스핀 감염시켰다. GFP+ 세포의 비율을 유세포 계측법에 의해 4일 후에 결정하였다. 형질 도입 효율은 상대적으로 낮았다.
변형된 CEM 세포에 대해 총 17일 동안 5 uM 6-TG에 의한 6-TG 선택을 실시하였다. 상기 sh734를 포함하는 세포는 6-TG에 의해 성공적으로 선택되었으며, sh734-GFP의 경우 28.8% GFP+ 및 GFP-sh734의 경우 42.4% GFP+로 증가하는데, 이는 이러한 세포가 형질 도입되지 않은 세포에 비해 생존 이점을 갖는다는 것을 나타낸다 (도 31 참조).
실시예 18 - 벡터 제조 - HPRT 녹다운
7SK/sh734를 포함하는 발현 카세트를 pTL20cw 벡터 내에 삽입하여 후보 벡터를 제조하였다 (예를 들어, 도 32 참조). 구체적으로, 짧은 헤어핀을 포함하는 하기 표에 열거된 벡터를 생성하였다.
Figure pct00003
실시예 19 - 형질 도입/형질 감염
K562 또는 Jurkat 세포를, HPRT를 녹다운시키도록 설계된 핵산 서열 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 (0.1~5의 MOI)로 형질 도입시키거나; HPRT (100 ng/5x104개 세포)에 대한 CRISPR/Cas9 및 sgRNA를 포함하는 나노캡슐로 형질 감염시켰다.
실시예 20 - HPRT 및 6TG 내성의 녹다운
형질 도입/형질 감염 후 3 일차 또는 4 일차에 6-TG 스톡 용액을 형질 도입/형질 감염된 K562 또는 Jurkat 세포를 함유하는 배지에 첨가하였다. 6-TG를 14 일차 이상까지 최종 농도, 예를 들어, K562 세포에 대해 300 nM 및 Jurkat 세포에 대해 2.5 uM로 유지하였다. 상기 배지를 3 내지 4일마다 다시 채웠다. GFP를 유동 기계에서 분석하였고, VCN을 VCN ddPCR 검정으로 분석하였으며, InDel%를 T7E1 검정으로 분석하였다. 결과는 도 33 및 하기 표에 제공되어 있다.
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추가의 실시 형태
제1 추가의 실시 형태는 공여체 샘플로부터 HPRT 결핍 림프구를 생성하는 단계; 생체외에서 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 상기 HSC 이식편의 투여 후 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및, 임의로, 부작용이 발생하는 경우, 메토트렉세이트 (MTX)를 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 치료되는 환자는 감염과 싸우고 생착을 지원하고 질병 재발을 예방하기 위한 T 세포를 투여받는 이점을 받는다. 또한, GvHD가 발생하는 경우, T 세포는 1회 이상의 용량의 MTX 투여를 통해 제거될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 결핍 림프구는 HPRT 유전자의 녹아웃을 통해, 예를 들어, HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 페이로드 (예를 들어, 서열 번호 25~39 중 어느 하나의 서열을 갖는 가이드 RNA를 포함하는 페이로드)를 포함하는 나노캡슐 집단에 의한 림프구의 형질 감염에 의해 생성된다. 다른 실시 형태에서, 상기 HPRT 결핍 림프구는 HPRT 유전자의 녹다운을 통해, 예를 들어, RNA 간섭제를 인코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 서열 번호 1, 2 및 5~11 중 어느 하나의 서열을 갖는 shRNA를 인코딩하는 핵산)을 포함하는 발현 벡터에 의한 림프구의 형질 도입에 의해 생성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 (예를 들어, 6-티오구아닌 (6TG), 6-머캅토퓨린 (6-MP) 또는 아자티오프린 (AZA))와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 양성 선택은 상기 생성된 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 제2 작용제 (알로퓨리놀)와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG이다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구는 단일 볼루스로서 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 림프구는 다중 용량으로서 투여된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 용량은 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 MTX는 GvHD의 진단시에 임의로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 투여되는 MTX의 양은 약 2 mg/m2/주입 내지 약 8 mg/m2/주입의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 MTX는 적정된 용량으로 투여된다.
본 개시 내용의 방법은 퓨린의 재활용을 촉진하는 효소 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 인코딩하는 유전자의 변형을 통해 퓨린 회수 경로를 이용하는 것으로 여겨진다. 유전자 녹아웃 또는 유전자 녹다운을 통한 HPRT 발현의 억제는 상기 변형된 세포가 생존을 위해 드노보 퓨린 생합성 경로에만 의존하도록 만든다. 변형되지 않은 세포에서, HPRT를 통해 전환되는 퓨린 유사체 6-티오구아닌 (6TG)의 전달은 궁극적으로 6-티오구아닌 뉴클레오타이드 (6TGN)의 축적을 초래하며, 이는 S기 동안 DNA로의 통합을 포함하는 여러 메커니즘을 통해 세포에 대해 독성이 있다. 유전자 변형된 세포내 HPRT 효소의 억제 및 다양한 백혈병 뿐만 아니라 중증 염증성 질환의 치료에 이미 사용되는 약물인 6TG에 의한 후속 치료는 변형되지 않은 세포에 비해 이러한 세포에 생존 이점을 제공하므로, 시험관 내에서 및 잠재적으로는 생체 내에서 변형된 세포를 선택하는 메커니즘을 제공한다. 또한, 메토트렉세이트 (MTX)에 의해서와 같이 이러한 HPRT 효소 결핍 세포에서 드노보 퓨린 생합성 경로의 억제는 세포 아폽토시스 (또한 비기능적 퓨린 회수 경로로 인함)를 초래하여 또 다른 승인된 약물을 변형된 세포에서 "킬 스위치" 유도제로서 사용할 수 있는 메커니즘을 제공한다.
제2 추가의 실시 형태는 조혈 줄기 세포 ("HSC")에서 HPRT 발현을 감소 또는 제거하는 성분을 포함하는 조성물이다. 일부 실시 형태에서, 상기 HSC는 림프계 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 림프계 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 HPRT 유전자의 녹다운을 유발하는 제1 성분을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 조성물은 HPRT 유전자의 녹아웃을 유발하는 제1 성분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 HPRT 유전자를 녹다운시키도록 구성된 작용제를 인코딩하는 제1 핵산 (예를 들어, RNA 간섭제 (RNAi))을 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 HSC를 표적화하도록 구성된 것과 같은 나노캡슐 내에 통합될 수 있다.
제3 추가의 실시 형태는 HPRT의 녹다운을 유발하기 위한 RNAi를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 렌티바이러스 발현 벡터는 HSC와 같은 선택 가능한 유전적으로 변형된 세포를 생산하는데 적합하다. 일부 실시 형태에서, 상기 생체외에서 형질 도입된 HSC는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산은 HPRT를 표적화하는 작은 헤어핀 리보핵산 분자 ("shRNA")를 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 상기 PRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가지며, 여기서, 상기 제1 핵산 서열은 7sk 프로모터 또는 이의 돌연변이된 변이체에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 PRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 가지며, 여기서, 상기 제1 핵산 서열은 7sk 프로모터 또는 이의 돌연변이된 변이체에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 PRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 가지며, 여기서, 상기 제1 핵산 서열은 7sk 프로모터 또는 이의 돌연변이된 변이체에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 PRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 1의 서열을 가지며, 여기서, 상기 제1 핵산 서열은 7sk 프로모터 또는 이의 돌연변이된 변이체에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 2의 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 5, 6 및 7 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 5, 6 및 7 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 5, 6 및 7 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 5, 6 및 7 중 어느 하나와 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열은 서열 번호 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 핵산 서열은 Pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 Pol III 프로모터는 호모 사피엔스 세포주 HEK-293 7sk RNA 프로모터 (예를 들어, 서열 번호 14 참조)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Pol III 프로모터는 서열 번호 14와 비교하여 이의 핵산 서열에 단일 돌연변이를 포함하는 7sk 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Pol III 프로모터는 서열 번호 14와 비교하여 이의 핵산 서열에 다중 돌연변이를 포함하는 7sk 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Pol III 프로모터는 서열 번호 14와 비교하여 이의 핵산 서열에 결실을 포함하는 7sk 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Pol III 프로모터는 서열 번호 14와 비교하여 이의 핵산 서열에 돌연변이와 결실 둘 다를 포함하는 7sk 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 핵산 서열은 서열 번호 14와 적어도 95%의 동일성을 갖는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 핵산 서열은 서열 번호 14와 적어도 97%의 동일성을 갖는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 핵산 서열은 서열 번호 14와 적어도 98%의 동일성을 갖는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 핵산 서열은 서열 번호 14와 적어도 99%의 동일성을 갖는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 핵산 서열은 서열 번호 14를 갖는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
제4 추가의 실시 형태는 HPRT 유전자를 표적화하는 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나와 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 마이크로-RNA 기반 shRNA를 인코딩하는 핵산 서열은 본 출원에서 기재된 것들 중 어느 것을 비롯한 Pol III 또는 Pol II 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
제5 추가의 실시 형태는 (a) HPRT를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 제1 부분; 및 (b) HPRT를 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 서열의 발현을 구동하는 제1 프로모터를 인코딩하는 제2 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시 형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 (c) 중심 폴리퓨린 관 요소 (central polypurine tract element)를 인코딩하는 제3 부분; 및 (d) Rev 반응 요소 (서열 번호 19)를 인코딩하는 제4 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 WPRE 요소 (예를 들어, 서열 번호 18을 포함하는 WPRE 요소)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 절연체를 추가로 포함한다.
제6 추가의 실시 형태는 발현 벡터로 형질 도입되거나 나노캡슐로 형질 감염된 HSC (예를 들어, CD34+ HSC)이며, 각각은 HPRT 발현을 감소시키도록 설계된 작용제 (예를 들어, HPRT의 녹다운을 위한 RNAi)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HSC는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 형질 도입된 HSC는 이의 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 세포 (예를 들어, 생체외에서 확장될 수 있는 T 세포)를 받는 이점을 받은 형질 도입된 HSC로 치료받은 환자에게 투여되어 감염과 싸우고, 생착을 지원하고, 질환 재발을 예방할 수 있는 세포 치료제를 구성한다.
제7 추가의 실시 형태는 발현 벡터 중 어느 하나로 형질 도입된 숙주 세포이며, 여기서, 상기 숙주 세포는 HPRT 결핍되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
제 8 추가의 실시 형태는 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물이며, 여기서, 상기 숙주 세포는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 숙주 세포를 발현 벡터로 형질 도입함으로써 유도된 HPRT 결핍 숙주 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
제9 추가의 실시 형태는 발현 벡터로 숙주 세포 집단을 형질 도입하는 단계, 및 상기 형질 도입된 숙주 세포 집단을 적어도 퓨린 유사체와 접촉시킴으로써 HPRT 결핍 세포를 양성 선택하는 단계를 포함하는, HPRT 결핍 세포를 생성하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 퓨린 유사체는 6TG 및 6-머캅토퓨린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
제10 추가의 실시 형태는 공여체 샘플로부터 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 상기 HSC 이식편의 투여 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및, 임의로, 부작용이 발생하는 경우, 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
제 11 추가의 실시 형태는 공여체 샘플로부터 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; 및 HSC 이식편의 투여와 동시에 또는 이의 투여 후에 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 1회 이상의 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
제12 추가의 실시 형태는 공여체 샘플로부터 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여함으로써 적어도 부분적 이식편 대 악성 종양 효과를 유도하는 단계; 및 잔류 질환 또는 질환 재발의 검출 후에 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈액학적 암을 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 1회 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하여 GvHD 또는 CRS 중 적어도 하나의 증상을 억제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
제13 추가의 실시 형태는 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하는 단계; (b) 상기 단리된 림프구를 발현 벡터로 형질 도입하는 단계; (c) 상기 형질 도입된 단리된 림프구를 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 변형된 림프구 제제를 제공하는 단계; (d) 조혈 줄기 세포 이식 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 제제를 환자에게 투여하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 환자에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 발병 후 메토트렉세이트 또는 마이코페놀산을 투여하는 단계를 포함하는, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT) 결핍 림프구 환자를 치료하는 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
제14 추가의 실시 형태는 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 엔도뉴클레아제 및 HRT를 표적화하는 gRNA를 포함하는 전달 비히클로 형질 감염시킴으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 상기 HSC 이식편의 투여 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및, 임의로, 부작용이 발생하는 경우, MTX를 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다.
제15 추가의 실시 형태는 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9, Cas12a, Cas12b) 및 HRT 유전자를 표적화하는 gRNA를 포함하는 전달 비히클로 형질 감염시킴으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 상기 HSC 이식편의 투여 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및, 임의로, 부작용이 발생하는 경우, MTX를 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이다.
제16 추가의 실시 형태는 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질 도입된 림프구이며, 상기 제1 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 shRNA는 서열 번호 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 림프구는 상기 발현 벡터에 의한 형질 도입 후 HPRT가 실질적으로 결핍된다. 일부 실시 형태에서, 상기 림프구는 T 세포이다.
본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. 더 추가의 실시 형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 사용할 필요가 있는 경우, 실시 형태의 양태는 변형될 수 있다.
본 개시 내용이 다수의 예시적인 실시 형태를 참조하여 기재되었지만, 본 개시 내용의 원리의 사상 및 범위 내에 속하는 다수의 다른 변형 및 실시 형태가 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 보다 구체적으로, 합리적인 변형 및 수정이 본 개시 내용의 사상을 벗어나지 않고 전술한 개시 내용, 도면 및 첨부된 청구범위의 범위 내에서 본 발명의 조합 배열의 성분 부분 및/또는 배열에서 가능하다. 구성 부품 및/또는 배열의 변경 및 변형에 추가하여, 대체 용도도 또한 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
<110> YAN, Ming ALMA, Christopher Walter SYMONDS, Geoffrey BARTLETT, Jeffrey LEE, Chi-Lin <120> DONOR T-CELLS WITH KILL SWITCH <130> Calimmune-072WO <150> US 62/784,494 <151> 2018-12-23 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: shHPRT 734 <400> 1 aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcctttt tt 52 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Modified sh734 <400> 2 aggatatgcc cttgactatg ccctgaccca gcatagtcaa gggcatatcc t 51 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: shRNA targeting an HPRT gene <400> 3 aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcc 46 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: shRNA targeting an HPRT gene <400> 4 tcctatacgg gaactgataa acaggctgta tcagttcccg tatagg 46 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: shHPRT 616 <400> 5 gcaggcagta taatccaaat acctgaccca 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ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt 3840 cctcctctcc tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga 3900 cctgcagccc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 3960 cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 4020 aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 4080 acctgtcgtg ccagcggatc cgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac 4140 tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 4200 aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 4260 gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctgtcgactg cagaggcctg 4320 catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 4380 acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 4440 gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 4500 tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 4560 cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 4620 gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 4680 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 4740 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 4800 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 4860 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 4920 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 4980 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 5040 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 5100 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 5160 tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 5220 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 5280 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 5340 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 5400 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 5460 tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 5520 agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 5580 gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 5640 ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 5700 gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 5760 cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 5820 acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 5880 cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 5940 cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 6000 ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 6060 tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 6120 atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 6180 tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 6240 actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 6300 aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 6360 ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 6420 ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 6480 cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 6540 aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 6565 <210> 18 <211> 592 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: WPRE Sequence <400> 18 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592 <210> 19 <211> 769 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: REV response element <400> 19 aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat 60 tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag 120 agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg 180 cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca 240 gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 300 gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 360 gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 420 tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 480 ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 540 ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 600 ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 660 cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 720 atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggaccg 769 <210> 20 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Hairpin loop sequence of sh734 <400> 20 ttgtccgac 9 <210> 21 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hsa-miR-22 loop sequence <400> 21 ccugaccca 9 <210> 22 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: miRNA734 de novo (RNA form) <400> 22 acccguacau auuuuugugu agcucuaguu uauagucaag ggcauauccu uguguuuuuu 60 uugaaggaua ugcccuugac uauaaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111 <210> 23 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: miRNA211 de novo (RNA form) <400> 23 acccguacau auuuuugugu agcucuaguu auaaaucaag gucauaaccu uguguuuuuu 60 uugaagguua ugaccuugau uuauaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: miRNA 451 hairpin sequence <400> 24 aaaccgttac cattactgag tttagtaatg gtaatggttc tc 42 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 25 gttatggcga cccgcagccc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 26 gcgggtcgcc ataacggagc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 27 cgtgacgtaa agccgaaccc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 28 ggcacggaaa gcgaccacct 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 29 catgcgtatt tgacacacga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 30 gctaagtgct agagttacgg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 31 gaggcgcggg atccgcagtg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA <400> 32 ttattactgt tccccgccag 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: IN-1 <400> 33 attatgctga ggatttggaa 20 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: IDT-1 <400> 34 gatgatctct ctcaacttta ac 22 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: IDT-6 <400> 35 catacctaat cattatgctg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: IDT-4 <400> 36 ggttatgacc ttgatttatt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: IDT-2 <400> 37 catggactaa ttatggacag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: IDT-3 <400> 38 tagccctctg tgtgctcaag 20 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Nat Paper <400> 39 gccctggccg gttcaggccc acg 23

Claims (145)

  1. 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 제1 핵산 서열이 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase: HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA가 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는, 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 shRNA가 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 shRNA가 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 shRNA가 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 제어 서열이 Pol III 프로모터 또는 Pol II 프로모터를 포함하는, 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Pol III 프로모터가 7sk 프로모터, 돌연변이된 7sk 프로모터, H1 프로모터 또는 EF1a 프로모터인, 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 7sk 프로모터가 서열 번호 14와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 7sk 프로모터가 서열 번호 14와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  9. 제6항에 있어서, 상기 7sk 프로모터가 서열 번호 14의 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  10. 제6항에 있어서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터가 서열 번호 15와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  11. 제6항에 있어서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터가 서열 번호 15와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  12. 제6항에 있어서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터가 서열 번호 15의 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  13. 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 제1 핵산 서열이 HPRT를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA가 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는, 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 shRNA가 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  15. 제13항에 있어서, 상기 shRNA가 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  16. 제13항에 있어서, 상기 shRNA가 서열 번호 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 제어 서열이 Pol III 프로모터 또는 Pol II 프로모터를 포함하는, 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 Pol III 프로모터가 7sk 프로모터, 돌연변이된 7sk 프로모터, H1 프로모터 또는 EF1a 프로모터인, 발현 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 7sk 프로모터가 서열 번호 14와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  20. 제18항에 있어서, 상기 7sk 프로모터가 서열 번호 14와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  21. 제18항에 있어서, 상기 7sk 프로모터가 서열 번호 14의 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  22. 제18항에 있어서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터가 서열 번호 15와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  23. 제18항에 있어서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터가 서열 번호 15와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  24. 제18항에 있어서, 상기 돌연변이된 7sk 프로모터가 서열 번호 15의 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질 도입된 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가 형질 도입 후에 HPRT가 실질적으로 결핍되는, 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 숙주 세포가 T 세포인, 숙주 세포.
  27. 제26항에 있어서, 상기 T 세포가 헬퍼 CD4+ T 세포, 세포독성 CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 조절 CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포, 점막 관련 불변 T 세포 및 감마 델타 T 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  28. 제25항에 있어서, 상기 숙주 세포가 림프구인, 숙주 세포.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 숙주 세포가 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  30. 숙주 세포 집단을 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터로 형질 도입하는 단계; 및 상기 형질 도입된 숙주 세포 집단을 적어도 퓨린 유사체와 접촉시킴으로써 HPRT 결핍 세포를 양성 선택하는 단계를 포함하는, HPRT 결핍 세포를 생성하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6TG 및 6-머캅토퓨린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  32. 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell: HSC) 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 상기 HSC 이식편의 투여 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및, 임의로, 부작용이 발생하는 경우, 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제가 메토트렉세이트 (MTX) 또는 마이코페놀산 (MPA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6-티오구아닌 (6TG)인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 6TG의 양이 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위인, 방법.
  37. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 림프구가 단일 볼루스로서 투여되는, 방법.
  39. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  42. 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; 및 HSC 이식편의 투여와 동시에 또는 이의 투여 후에 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 방법이 1회 이상의 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제가 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  45. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6TG인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 6TG의 양이 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위인, 방법.
  48. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 림프구가 단일 볼루스로서 투여되는, 방법.
  50. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  53. 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질 도입함으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여함으로써 적어도 부분적 이식편 대 악성 종양 효과를 유도하는 단계; 및 잔류 질환 또는 질환 재발의 검출 후에 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈액학적 암을 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 적어도 1회 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하여 GvHD 또는 CRS 중 적어도 하나의 증상을 억제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제가 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6TG인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 6TG의 양이 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위인, 방법.
  59. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 림프구가 단일 볼루스로서 투여되는, 방법.
  61. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여되는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  64. 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클로 형질 감염시킴으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여하는 단계; 및 상기 HSC 이식편의 투여 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 부작용을 경감시키면서 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 서열 번호 25~39로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 Cas 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질을 포함하는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas12 단백질을 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 Cas12 단백질이 Cas12a 단백질인, 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 Cas12 단백질이 Cas12b 단백질인, 방법.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 1회 이상의 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제가 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6TG인, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 6TG의 양이 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위인, 방법.
  77. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  78. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 림프구가 단일 볼루스로서 투여되는, 방법.
  79. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여되는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  82. 제64항에 있어서, 상기 전달 비히클이 나노캡슐인, 방법.
  83. 제64항에 있어서, 상기 전달 비히클이 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 나노캡슐인, 방법.
  84. 공여체 샘플로부터 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 생성하되, 여기서, 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구가 상기 공여체 샘플 내의 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클로 형질 감염시킴으로써 생성되는 단계; 생체외에서 상기 실질적인 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하여 변형된 림프구 집단을 제공하는 단계; HSC 이식편을 환자에게 투여함으로써 적어도 부분적 이식편 대 악성 종양 효과를 유도하는 단계; 및 잔류 질환 또는 질환 재발의 검출 후에 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈액학적 암을 이의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 적어도 1회 용량의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 상기 환자에게 투여하여 GvHD 또는 CRS 중 적어도 하나의 증상을 억제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제가 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6TG인, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 6TG의 양이 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위인, 방법.
  90. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 선택이 상기 생성된 실질적 HPRT 결핍 림프구를 퓨린 유사체 및 알로퓨리놀 모두와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  91. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 림프구가 단일 볼루스로서 투여되는, 방법.
  92. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량의 상기 변형된 림프구가 상기 환자에게 투여되는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 각각의 용량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 240 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 변형된 림프구의 총 투약량이 약 0.1 x 106개 세포/kg 내지 약 730 x 106개 세포/kg을 포함하는, 방법.
  95. 제84항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
  96. 제84항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 서열 번호 25~39로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
  97. 제84항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 Cas 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질을 포함하는, 방법.
  99. 제97항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas12 단백질을 포함하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 Cas12 단백질이 Cas12a 단백질인, 방법.
  101. 제99항에 있어서, 상기 Cas12 단백질이 Cas12b 단백질인, 방법.
  102. 제84항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 비히클이 나노캡슐인, 방법.
  103. 제84항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 비히클이 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 나노캡슐인, 방법.
  104. (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하는 단계; (b) 상기 단리된 림프구를 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질 도입하는 단계; (c) 상기 형질 도입된 단리된 림프구를 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 변형된 림프구 제제를 제공하는 단계; (d) 조혈 줄기 세포 이식 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 제제를 환자에게 투여하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 환자에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 발병 후 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, HPRT 결핍 림프구 환자를 치료하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제가 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제가 퓨린 유사체를 포함하는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6TG인, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 6TG의 양이 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위인, 방법.
  109. (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하는 단계; (b) 상기 단리된 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클과 접촉시켜 HPRT 결핍 림프구 집단을 제공하는 단계; (c) 상기 HPRT 결핍 림프구 집단을 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 변형된 림프구 제제를 제공하는 단계; (d) 조혈 줄기 세포 이식 후 치료학적 유효량의 상기 변형된 림프구 제제를 환자에게 투여하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 환자에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 발병 후 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, HPRT 결핍 림프구 환자를 치료하는 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 디하이드로폴레이트 리덕타아제 억제제가 MTX 또는 MPA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제가 퓨린 유사체를 포함하는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 퓨린 유사체가 6TG인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 6TG의 양이 약 1 내지 약 15 μg/mL의 범위인, 방법.
  114. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
  115. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 서열 번호 25~39로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
  116. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분이 Cas 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질을 포함하는, 방법.
  118. 제116항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas12 단백질을 포함하는, 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 Cas12 단백질이 Cas12a 단백질인, 방법.
  120. 제118항에 있어서, 상기 Cas12 단백질이 Cas12b 단백질인, 방법.
  121. 제109항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 비히클이 나노캡슐인, 방법.
  122. 제109항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 비히클이 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 나노캡슐인, 방법.
  123. 조혈 줄기 세포 이식 후 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위한 변형된 림프구 제제의 용도로서, 여기서, 상기 변형된 림프구 제제가 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하고; (b) 상기 단리된 림프구를 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질 도입하고; (c) 상기 형질 도입된 단리된 림프구를 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 상기 변형된 림프구 제제를 제공함으로써 생성되는, 용도.
  124. 조혈 줄기 세포 이식 후 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위한 변형된 림프구 제제의 용도로서, 여기서, 상기 변형된 림프구 제제가 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하고; (b) 상기 단리된 림프구를 HPRT를 녹아웃시키도록 구성된 성분을 포함하는 전달 비히클과 접촉시켜 실질적 HPRT 결핍 림프구 집단을 제공하고; (c) 상기 HPRT 결핍 림프구 집단을 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 상기 변형된 림프구 제제를 제공함으로써 생성되는, 용도.
  125. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  126. (i) 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 가이드 RNA; 및 (ii) Cas 단백질을 포함하는 키트.
  127. 제126항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는, 키트.
  129. 제126항 또는 제127항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는, 키트.
  130. (i) 서열 번호 25~39 중 어느 하나를 포함하는 가이드 RNA; 및 (ii) Cas 단백질을 포함하는 키트.
  131. 제130항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  132. (i) 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 gRNA; 및 (ii) Cas 단백질을 포함하는 나노캡슐.
  133. 제132항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 나노캡슐.
  134. 제132항 또는 제133항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는, 나노캡슐.
  135. 제132항 또는 제133항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 서열 번호 25~39 중 어느 하나와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는, 나노캡슐.
  136. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노캡슐이 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함하는, 나노캡슐.
  137. 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노캡슐이 중합체성 쉘을 포함하는, 나노캡슐.
  138. 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 나노캡슐이 양으로 하전된 2개의 상이한 단량체, 적어도 하나의 중성 단량체 및 가교제로 구성되는, 나노캡슐.
  139. 제132항 내지 제138항 중 어느 한 항의 나노캡슐로 형질 감염된 숙주 세포.
  140. 조혈 줄기 세포 이식 후 림프구 주입의 이점을 이의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위한 변형된 림프구 제제의 용도로서, 여기서, 상기 변형된 림프구 제제가 (a) 공여체 대상체로부터 림프구를 단리하고; (b) 상기 단리된 림프구를 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항의 나노캡슐과 접촉시키고; (c) 상기 HPRT 결핍 림프구 집단을 HPRT 결핍 림프구를 양성 선택하는 작용제에 노출시켜 변형된 림프구 제제를 제공함으로써 생성되는, 용도.
  141. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 발현 벡터 중 어느 하나를 캡슐화하는 나노캡슐.
  142. 제141항에 있어서, 상기 나노캡슐이 중합체성 쉘을 포함하는, 나노캡슐.
  143. 제141항에 있어서, 중합체성 나노캡슐이 양으로 하전된 2개의 상이한 단량체, 적어도 하나의 중성 단량체 및 가교제로 구성되는, 나노캡슐.
  144. 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 제1 핵산 서열이 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA가 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 상기 발현 벡터가 발현을 위한 또 다른 이식 유전자를 포함하지 않는, 발현 벡터.
  145. 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 발현 제어 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 제1 핵산 서열이 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT)를 녹다운시키기 위한 shRNA를 인코딩하며, 여기서, 상기 shRNA가 서열 번호 2, 5, 6 및 7 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 상기 shRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열이 발현을 위한 유일한 서열인, 발현 벡터.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2021294317A1 (en) * 2020-06-26 2023-02-23 Csl Behring Llc Donor T-cells with kill switch
CN116162621A (zh) * 2021-11-25 2023-05-26 中国科学院大连化学物理研究所 Dna双链序列及应用和肺腺癌细胞增殖抑制剂或在肺腺癌药物

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5015896A (en) 1995-03-27 1996-10-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing methotrexate derivative
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
EP1766010B1 (en) 2004-06-28 2011-02-16 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
WO2007098089A2 (en) 2006-02-17 2007-08-30 Novacea, Inc. Treatment of hyperproliferative diseases with methotrexate n-oxide and analogs
WO2007148971A2 (en) 2006-06-21 2007-12-27 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Vectors with modified initiation codon for the translation of aav-rep78 useful for production of aav in insect cells
EP2291523B1 (en) * 2008-06-24 2014-12-17 CSL Behring GmbH Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life
CN105779453A (zh) 2008-10-24 2016-07-20 萨雷普塔治疗公司 用于dmd的多外显子跳跃组合物
PL2499249T3 (pl) 2009-11-12 2019-03-29 Univ Western Australia Cząsteczki antysensowne i sposoby leczenia patologii
US9283194B2 (en) 2010-04-16 2016-03-15 The Regents Of The University Of California Methods for protease assisted protein delivery
TR201808037T4 (tr) * 2011-04-20 2018-06-21 Univ California Tek bir döngüde kombine koşullandırma ve kemo seçimine yönelik yöntem.
WO2013033717A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 The Regents Of The University Of California Enzyme responsive nanocapsules for protein delivery
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
US9782357B2 (en) 2012-03-16 2017-10-10 The Regents Of The University Of California RNAi molecule delivery platform based on single-siRNA and shRNA nanocapsules
US9499817B2 (en) 2012-09-06 2016-11-22 The University Of Chicago Antisense polynucleotides to induce exon skipping and methods of treating dystrophies
CA2932542C (en) 2012-12-14 2023-06-06 The Regents Of The University Of California Viral vector nanocapsule for targeting gene therapy and its preparation
CA2906812A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Improved compositions for treating muscular dystrophy
EP3730615A3 (en) * 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
US10813951B2 (en) * 2013-11-22 2020-10-27 Cellectis Method of engineering chemotherapy drug resistant T-cells for immunotherapy
CN107530445B (zh) 2014-11-26 2021-01-05 加利福尼亚大学董事会 用于蛋白质递送的隐形纳米胶囊
US20180298340A1 (en) * 2015-04-24 2018-10-18 The Regents Of The University Of California Systems for detecting, monitoring or treating diseases or conditions using engineered cells and methods for making and using them
CN108026543A (zh) 2015-05-18 2018-05-11 卡琳缪恩股份有限公司 用于hiv的治疗的基因疗法及其用途
KR20180114008A (ko) * 2016-02-19 2018-10-17 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 짧은 헤어핀 rna(shrna734) 및 유전자 변형된 세포를 양성으로 선택하고 제거하기 위한 이의 용도
WO2017205541A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 The Regents Of The University Of California Growth-factor nanocapsules with tunable release capability for bone regeneration
JP7410856B2 (ja) * 2017-07-18 2024-01-10 シーエスエル・ベーリング・ジーン・セラピー・インコーポレイテッド ドナー改変細胞の選択のための調節可能スイッチ
AU2018302098A1 (en) * 2017-07-18 2020-02-20 Csl Behring Gene Therapy, Inc. Compositions and methods for treating beta-hemoglobinopathies

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