KR20210102922A

KR20210102922A - 신규 조성물

Info

Publication number: KR20210102922A
Application number: KR1020217020810A
Authority: KR
Inventors: 니스 록키 드; 마리 엘리자베스 마그누손
Original assignee: 제임스 쿡 유니버시티; 퍼시픽 바이오테크놀로지스 (오스트레일리아) 피티와이 엘티디
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2021-08-20
Also published as: AU2019394365C1; PH12021551298A1; GB2594835B; AU2021102541A4; IL283692B1; IL283692B2; MX2021006675A; WO2020113279A1; BR112021011007A2; AU2019394365A1; GB2612927A; EP3890761A1; GB2612927B; ZA202103962B; AU2019394365B2; EP3890761A4; GB202302412D0; CN113365647A; US20220031780A1; IL283692A

Abstract

본 발명의 분야는 아스파라고프시스의 바이오매스로부터 적어도 하나의 생물활성제를 오일로 추출하여 조성물을 형성함을 포함하여, 아스파라고프시스 오일 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이들 조성물은 반추 동물 또는 유사-반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는데 적합하다.

Description

신규 조성물

본 발명의 분야는 반추 동물(ruminant animal)에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는데 적합한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

메탄 (CH₄)은 자연 생태계 (예를 들어, 습지, 바다 및 호수)와 무척추 동물 및 척추 동물, 예를 들어 흰개미 및 반추 동물의 위장관에서 발견되는 메탄생성 (methanogenic) 미생물에 의해 주로 생산되는 온실 가스 (GHG)이다. 매년 ~429-507 Tg의 CH₄가 하이드록실 (OH) 라디칼과의 반응을 통해 대기로부터 제거되고 ~40 Tg가 성층권으로부터 제거되며; ~30 Tg가 토양에서 CH₄-산화 박테리아에 의해 제거된다.

그럼에도 불구하고, 인위생성 (anthropogenic) GHG 배출량은 급격히 증가하고 있으며, 지금 대기 중 CH₄ 농도는 1800년대 초보다 2배 이상 높다. 메탄은 태양 적외선을 흡수하는데 매우 효과적이며 지구 온난화 잠재력이 CO₂보다 25배 더 크다. 결과적으로, 대기 중 이의 축적은 기후 변화에 상당히 기여한다. 인위생성적 CH₄의 주요 원인 중 하나는 반추 동물 가축을 포함한 농업 활동에 기인할 수 있다.

최근 UN 보고서에 따르면, 소-사육은, CO₂ 당량으로 측정하여, 교통편 (transportation)보다 더 많은 지구 온난화 온실 가스를 생성한다. 호주에서는, 반추 동물이 총 GHG 배출량의 약 10%에 기여하는 것으로 추정된다. 반추 동물은 반추위에서 및, 보다 적게는, 대장에서 사료의 혐기성 미생물 발효의 부산물로서 CH₄를 생성한다. 반추 동물 미생물 군집은 매우 다양하며 박테리아, 원생동물, 곰팡이 및 박테리오파지로 구성되어 집합적으로 섭취된 유기물(organic matter; OM)을 발효시키는 작용을 하여 CO₂, H₂, 휘발성 지방산 (VFA) 및 포르메이트를 야기한다. 반추위에 존재하는 메탄생성 고세균은 이러한 최종 생성물을 사용하여 CH₄를 생성한다. CH₄의 생성이 H₂의 분압을 감소시켜 반추위 발효(ruminal fermentation)를 억제할 수 있지만, 이것은 또한 반추 동물 영양에 필수적인 VFA의 형성에 사용할 수 있는 에너지와 탄소의 양도 감소시킨다. 반추 동물에서 생성되는 대부분의 CH₄는 동물에 의해 발산되고 내뿜어지며 총 에너지 섭취량의 최대 12% 손실을 나타낸다.

장내 CH₄ 형성을 감소시키는 완화 전략이 중요하며, 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법이 주요 과제를 나타낸다.

하나의 측면에서, 본 발명은 아스파라고프시스(Asparagopsis) 오일 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 아스파라고프시스의 바이오매스(biomass)를 제공하는 단계; 적어도 하나의 오일을 제공하는 단계; 및 바이오매스로부터 적어도 하나의 생물활성제(bioactive agent)를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건하에서 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시켜 아스파라고프시스 오일 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 하나의 실시양태에서, 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시키는 단계는 적어도 하나의 오일에서 바이오매스를 균질화(homogenising)함을 포함할 수 있다. 상기 방법의 또 다른의 실시양태에서, 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시키는 단계 후에 바이오매스를 적어도 하나의 오일로부터 분리할 수 있다.

상기 방법의 또 다른 측면에서, 적어도 하나의 오일 (밀리리터 단위)에 대한 바이오매스 (그램 단위)의 비율은 0.3:1 이상일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 오일 (밀리리터 단위)에 대한 바이오매스 (그램 단위)의 비율은 0.6:1 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 오일 (밀리리터 단위)에 대한 바이오매스 (그램 단위)의 비율은 0.9:1 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 오일 (밀리리터 단위)에 대한 바이오매스 (그램 단위)의 비율은 1.2:1 이상이다.

상기 방법의 또 다른 측면에서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 생물활성제를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건은 적어도 1일의 기간 동안 수행될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 추출은 2일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 3일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 4일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 5일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 6일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 7일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 8일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 9일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 10일 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 추출은 11일 동안 수행된다.

상기 방법의 또 다른 측면에서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 생물활성제를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건은 약 4℃의 온도에서 수행될 수 있다.

상기 방법의 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 오일로부터 바이오매스를 분리하는 단계 이전에, 적어도 하나의 오일과 접촉하는 바이오매스를 가열할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 가열은 적어도 하나의 생물활성제를 포함할 수 있는 겔이 적어도 하나의 생물활성제를 적어도 하나의 오일로 방출하도록 수행된다. 하나의 실시양태에서, 가열은 60℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 실시양태에서, 가열은 1시간의 기간 동안 수행될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에서, 아스파라고프시스의 바이오매스는 아스파라고프시스 탁시포르미스(Asparagopsis taxiformis)일 수 있다. 또 다른 측면에서, 아스파라고프시스의 바이오매스는 아스파라고프시스 아르마타(Asparagopsis armata)일 수 있다. 또 다른 측면에서, 아스파라고프시스의 바이오매스는 아스파라고프시스 탁시포르미스 및 아스파라고프시스 아르마타일 수 있다.

상기 방법의 하나의 실시양태에서, 아스파라고프시스의 바이오매스를 제공하는 단계는 바이오매스의 공기 건조를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스의 바이오매스를 제공하는 단계는 바이오매스를 적어도 하나의 오일로 수집함을 포함한다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 오일은 식용유(edible oil)를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 식용유는 아몬드유, 살구유, 아르간유(argan oil), 아보카도유, 브라질 너트유(Brazil nut oil), 카놀라유, 캐슈유(cashew oil), 코코넛유, 평지유(colza oil), 옥수수유, 코프라유, 면실유, 디아실글리세롤유, 아마씨유, 자몽 종자유, 포도씨유, 헤이즐넛유, 대마유, 레몬유, 아마인유, 마카다미아유, 겨자유, 올리브유, 오렌지유, 팜유, 팜 핵유, 땅콩유, 피칸유, 잣유, 피스타치오유, 호박씨유, 평지씨유, 쌀겨유, 잇꽃유, 호마유(sesame oil), 대두유, 해바라기유, 호두유, 및 식물유, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 생물활성제는 항-메탄생성제(anti-methanogenic agent)일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 생물활성제는 브로모클로로아세트산 (BCA), 브로모포름 (BF), 디브로모아세트산 (DBA), 및 디브로모클로로메탄 (DBCM)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-메탄생성제는 BF이다. 또 다른 실시양태에서, 항-메탄생성제는 DBCM이다. 또 다른 실시양태에서, 항-메탄생성제는 BF 및 DBCM이다.

또 다른 측면에서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출되는 적어도 하나의 생물활성제의 수준은 등가량의 바이오매스로부터 물로 추출되는 적어도 하나의 생물활성제의 수준에 비해 증가한다. 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 생물활성제는 항-메탄생성제이며, 여기서 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출되는 항-메탄생성제의 수준은 25℃에서 65주 동안 저장 후 20% 이상 감소되지 않으며, 여기서 적어도 하나의 항-메탄생성제는 BF 및/또는 DBCM이다.

하나의 실시양태에서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출되는 적어도 하나의 생물활성제의 수준은 25℃에서 12주 동안 저장 후 상당히 감소하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출되는 적어도 하나의 생물활성제의 수준은 4℃에서 65주 동안 저장 후 상당히 감소하지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 0.1 밀리그램의 브로모포름을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 1 밀리그램의 브로모포름을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 2 밀리그램의 브로모포름을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 3 밀리그램의 브로모포름을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 4 밀리그램의 브로모포름을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 오일과 적어도 하나의 항-메탄생성제를 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 아스파라고프시스는 아스파라고프시스 탁시포르미스일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스는 아스파라고프시스 아르마타일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스는 아스파라고프시스 탁시포르미스 및 아스파라고프시스 아르마타일 수 있다.

상기 실시양태에서, 적어도 하나의 오일은 식용유를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 식용유는 아몬드유, 살구유, 아르간유, 아보카도유, 브라질 너트유, 카놀라유, 캐슈유, 코코넛유, 평지유, 옥수수유, 코프라유, 면실유, 디아실글리세롤유, 아마씨유, 자몽 종자유, 포도씨유, 헤이즐넛유, 대마유, 레몬유, 아마인유, 마카다미아유, 겨자유, 올리브유, 오렌지유, 팜유, 팜 핵유, 땅콩유, 피칸유, 잣유, 피스타치오유, 호박씨유, 평지씨유, 쌀겨유, 잇꽃유, 호마유, 대두유, 해바라기유, 호두유, 및 식물유, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.

아스파라고프시스 오일 조성물의 또 다른 측면에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제는 브로모클로로아세트산 (BCA), 브로모포름 (BF), 디브로모아세트산 (DBA), 및 디브로모클로로메탄 (DBCM)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.

아스파라고프시스 오일 조성물의 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준은 25℃에서 12주 동안 저장 후 상당히 감소하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준은 4℃에서 65주 동안 저장 후 상당히 감소하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준은 25℃에서 65주 동안 저장 후 20% 이상 감소하지 않는다. 상기 실시양태에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제는 BF 및/또는 DBCM일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준은 4℃ 또는 25℃에서 65주 동안 저장 후 50% 이상 감소하지 않는다. 이러한 실시양태에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제는 DBA일 수 있다.

하나의 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 0.1 밀리그램의 적어도 하나의 항-메탄생성제의 농도를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 1 밀리그램의 적어도 하나의 항-메탄생성제의 농도를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 2 밀리그램의 적어도 하나의 항-메탄생성제의 농도를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 3 밀리그램의 적어도 하나의 항-메탄생성제의 농도를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 추출물 밀리리터 당 적어도 4 밀리그램의 적어도 하나의 항-메탄생성제의 농도를 가질 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키기 위한 사료 보충제(feed supplement)를 제공하며, 상기 보충제는 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 반추 동물용 사료를 제공하며, 여기서 상기 사료는 본원에 기술된 바와 같은 사료 보충제로 보충된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 반추 동물에게 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 아스파라고프시스 오일 조성물을 투여함을 포함하여 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준의 유지를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 바람직한 휘발성 지방산은 아세테이트 및 프로피오네이트를 포함할 수 있으며, 여기서 유지는 아세테이트 대 프로피오네이트의 비율 감소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 분해된 유기물 및/또는 건조물(dry matter)의 수준의 유지를 포함할 수 있다.

상기 방법의 또 다른 측면에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 3%에 상응하는 용량으로 투여될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 2%에 상응하는 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 1%에 상응하는 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 0.5%에 상응하는 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 0.25%에 상응하는 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 0.125%에 상응하는 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 0.067%에 상응하는 용량으로 투여될 수 있다.

상기 방법의 또 다른 측면에서, 반추 동물은 반추아목 (Ruminantia) 및 낙타아목 (Tylopoda)의 구성원으로부터 선택될 수 있다. 이러한 측면의 하나의 실시양태에서, 반추 동물은 소 또는 양일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 반추 동물은 소이다.

도 1은 1, 3, 5, 7 및 10일 동안, 아스파라고프시스 탁시포르미스의 바이오매스를 오일 또는 물에 균질화하여 제조된 조성물을 포함하여 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일 또는 물로 ("shred") 또는 비-균질화된 바이오매스를 오일 또는 물로 ("intact") 추출하여 제조된 조성물에서 생활성 브로모포름 (항-메탄생성제)의 양을 보여준다. 검정 다이아몬드는 72시간 동안 메탄올에 침지시킨 동결건조 바이오매스를 사용한 표준 추출 방법을 나타낸다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.
도 2는 6개월의 기간에 걸쳐 상이한 조건하에 저장할 때 조성물로부터의 생활성 브로모포름 (항-메탄생성제)의 손실(%)을 보여준다: 주위 조건에서 (25℃±10℃); 에어컨이 설치된 방에서; 4℃ 냉장고에서; 및 -20℃ 냉동고에서. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.
도 3은 t = 0에서 및 4, 8, 12, 및 65주의 저장 (4℃ 또는 25℃에서) 후, 아스파라고프시스 탁시포르미스의 바이오매스를 오일 또는 물에 균질화하여 제조된 조성물을 포함하여 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일 또는 물로 ("shred") 또는 비-균질화된 바이오매스를 오일 또는 물로 ("intact") 추출하여 제조된 조성물에서 생활성 브로모포름 (항-메탄생성제)의 보유를 보여준다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.
도 4는 t = 0에서 및 4, 8, 12, 및 65주의 저장 (4℃; "Fridge", 또는 25℃; "RT"에서) 후, 아스파라고프시스의 온전한 바이오매스를 오일로 추출하여 제조된 조성물에서 생활성 DBCM (항-메탄생성제)의 보유를 보여준다. 오일에서의 DBCM:나프탈렌 (IS)의 비율이 표시된다. 동일한 위첨자를 가진 막대는 유의한 차이가 없다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.
도 5는 t = 0에서 및 4, 8, 12, 및 65주의 저장 (4℃; "Fridge", 또는 25℃; "RT"에서) 후, 아스파라고프시스 탁시포르미스의 바이오매스를 오일에 균질화하여 제조된, 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일로 추출하여 제조된 조성물에서 생활성 DBCM (항-메탄생성제)의 보유를 보여준다. 오일에서의 DBCM:나프탈렌 (IS)의 비율이 표시된다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3. 이 데이터는 DBCM:IS 비율에서 통계적 차이가 없음을 보여준다.
도 6은 10일의 기간에 이어 표시된 온도 (25℃/"RT" 또는 4℃/"Fridge")에서 즉시 저장 (0주) 동안 아스파라고프시스의 온전한 바이오매스를 오일로 추출하여 제조된 조성물에서 생활성 DBA의 양을 보여준다. 오일에서의 DBA:나프탈렌 (IS)의 비율이 표시된다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.
도 7은 10일의 기간에 이어 표시된 온도 (25℃/"RT" 또는 4℃/"Fridge")에서 즉시 저장 (0주) 동안 아스파라고프시스의 균질화된 바이오매스를 오일로 추출하여 제조된 조성물에서 생활성 DBA의 양을 보여준다. 오일에서의 DBA:나프탈렌 (IS)의 비율이 표시된다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.
도 8은 동일한 용적의 오일로 균질화된 다양한 양의 바이오매스를 사용하여, 오일로 추출된 생활성 브로모포름 (항-메탄생성제)의 양을 보여준다. 젤라틴성 샘플의 가열은 겔로부터 분리될 수 있는 오일 분획으로의 생활성 물질의 분배를 도왔다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.
도 9는 동일한 용적의 오일로 균질화된 다양한 양의 바이오매스를 사용하여, 아스파라고프시스 탁시포르미스의 바이오매스를 오일에 균질화하여 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일로 추출하여 제조된 조성물에서 생활성 브로모포름 (항-메탄생성제)의 수준 (mg/g dw 바이오매스)을 보여준다. 젤라틴성 샘플의 가열은 젤로부터 분리될 수 있는 오일 분획으로의 생활성 물질의 분배를 도왔다. 데이터는 평균 ± se로 표시된다, n = 3.

본 발명은 반추 동물에 의한 총 가스 생산 (TGP) 및/또는 메탄 (CH₄) 생산을 감소시키는데 적합한 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함한 생활성 아스파라고프시스 오일 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명자들은 생활성 특성을 갖는 할로겐화 2차 대사산물을 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물을 제조할 수 있음을 보여주었으며, 중요하게도 본 발명자들은 또한 아스파라고프시스 오일 조성물 중의 할로겐화 2차 대사산물의 수준이 장기간에 걸쳐 안정함을 보여주었다.

도 1은 생활성 분자를 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물이 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일과 접촉시킴으로써 제조될 수 있고, 생활성 물질의 수준이 바이오매스를 오일에 균질화함으로써 증가됨을 보여준다. 도 3은 균질화를 하거나 하지 않고서 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일과 접촉시킴으로써 제조된 아스파라고프시스 오일 조성물이, 실온 (25℃) 또는 4℃에서 저장할 때, 연장된 기간에 걸쳐 높은 수준의 생활성 물질을 유지함을 보여준다.

따라서, 본 발명은 아스파라고프시스 오일 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

(a) 아스파라고프시스의 바이오매스를 제공하는 단계;

(b) 적어도 하나의 오일을 제공하는 단계; 및

(c) 바이오매스로부터 적어도 하나의 항-메탄생성제를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건하에서 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시키는 단계.

아스파라고프시스는 두 가지 자유-생활 생활사 단계를 갖는 이형 생활사를 갖는다 - 배우체 (큰 잎 모양)와 포자체 (또는 사분포자체-더 작은 필라멘트 형태). 역사적으로, 사분포자체는 별도의 속 (Falkenbergia)으로 인식되었다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "아스파라고프시스"는 아스파라고프시스 속, 및 아스파라고프시스 속에 속하는 것으로 현재 알려진 다른 분류학상 분류를 지칭한다.

전 세계에 존재하는 아스파라고프시스에는 열대/아열대 (아스파라고프시스 탁시포르미스)와 온대 (아스파라고프시스 아르마타)의 적어도 두 개의 인정된 종이 있다.

하나의 실시양태에서, 아스파라고프시스의 종은 아스파라고프시스 탁시포르미스 또는 아스파라고프시스 아르마타로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 아스파라고프시스가 속한 갈고리풀과(Bonnemaisoniaceae)의 홍조 해조류의 다른 속에 속하는 종(예를 들면, 참갈고리풀(Bonnemaisonia), 델리세아(Delisea), 프틸로니아(Ptilonia), 렙토필리스(Leptophyllis) 및 플뢰로블레파리델라(Pleuroblepharidella))으로부터 선택된 적어도 한 종의 홍조 해양 대형조류의 바이오매스가 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 아스파라고프시스의 바이오매스 대신 사용된다. 이론에 결부시키고자 함이 없이, 갈고리풀과의 홍조 해조류의 6개 속(예를 들면, 아스파라고프시스, 참갈고리풀, 델리세아, 프틸로니아 및 렙토필리스 플뢰로블레파리델라)은 본원에 기술된 항-메탄생성 화합물을 포함하여 생활성 특성을 갖는 생활성 할로겐화 2차 대사 산물을 생산하고 저장한다.

본원에서 사용되는 용어 "바이오매스를 제공하는"은 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시키기 직전에 물로부터 제거된 아스파라고프시스의 바이오매스의 제공 또는 사용을 포함한다. 하나의 실시양태에서 아스파라고프시스의 바이오매스는 이의 환경으로부터 수집되고 적어도 하나의 오일에 직접 배치된다. 또 다른 실시양태에서 아스파라고프시스의 바이오매스는 이의 환경으로부터 바이오매스를 제거한지 5, 4, 3, 2, 또는 1시간 내에 적어도 하나의 오일과 접촉된다.

하나의 실시양태에서, 물은 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시키기 전에 바이오매스를 블롯 건조(blotting dry)시켜 바이오매스로부터 제거된다.

하나의 실시양태에서 아스파라고프시스의 바이오매스는 아스파라고프시스의 동결 건조된 바이오매스가 아니다.

또 다른 실시양태에서 아스파라고프시스의 바이오매스는 아스파라고프시스의 공기 건조된 바이오매스가 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "적어도 하나의 오일"은 단일 유형의 오일, 또는 단일 유형의 오일을 포함하는 조성물, 또는 둘 이상의 오일의 혼합물, 또는 둘 이상의 오일의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함한다. 적어도 하나의 오일은 동물에게 적용, 투여 또는 공급하기에 적합한 오일을 포함한다.

하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 오일은 식용유를 포함한다.

하나의 실시양태에서, 식용유는 아몬드유, 살구유, 아르간유, 아보카도유, 브라질 너트유, 카놀라유, 캐슈유, 코코넛유, 평지유, 옥수수유, 코프라유, 면실유, 디아실글리세롤유, 아마씨유, 자몽 종자유, 포도씨유, 헤이즐넛유, 대마유, 레몬유, 아마인유, 마카다미아유, 겨자유, 올리브유, 오렌지유, 팜유, 팜 핵유, 땅콩유, 피칸유, 잣유, 피스타치오유, 호박씨유, 평지씨유, 쌀겨유, 잇꽃유, 호마유, 대두유, 해바라기유, 호두유, 및 식물유, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본원에서 사용되는 용어 "오일"은 전형적으로 주위 온도 및 압력에서 액체인 임의의 비극성, 소수성 물질을 의미한다. 오일은 동물, 식물 또는 석유화학제품으로부터 유도될 수 있으며, 전형적으로 높은 탄소 및 수소 함량을 갖는다. 오일은 바람직하게는 식용유이고, 바람직하게는 반추 동물에 의해 소화될 수 있다. 전형적으로, 식물 기원의 오일은 식물의 종자 또는 열매로부터 추출되며, 전형적으로 주로 트리글리세라이드로 구성된다. 용어 "식물유"는 오일이 주로 또는 독점적으로 식물 기원임을 나타내는 일반적인 용어이며, 식물 기원 또는 상이한 기원의 하나 이상의 오일의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명자들은 생물활성제가 아스파라고프시스의 바이오매스에서 오일로 빠르게 추출됨을 입증하였다. 예를 들면, 도 1은 24시간 이내에, 균질화된 바이오매스/오일 혼합물로부터 추출된 브로모포름의 수준이 메탄올을 사용하여 동결 건조된 바이오매스로부터 추출된 브로모포름의 수준보다 더 높다는 것을 입증한다. 도 1은 또한 72시간 이내에, 균질화되지 않은 바이오매스/오일 혼합물로부터 추출된 브로모포름의 수준이 동결 건조된 바이오매스로부터 추출된 브로모포름의 수준과 동일하다는 것을 입증한다. 도 1은 또한 120시간 이내에, 균질화되지 않은 바이오매스/오일 혼합물로부터 추출된 브로모포름의 수준이 메탄올을 사용하여 동결 건조된 바이오매스로부터 추출된 브로모포름의 수준보다 더 높다는 것을 입증한다.

본원에서 사용되는 용어 "접촉"은 바이오매스와 적어도 하나의 오일을 혼합하여 바이오매스/오일 혼합물을 형성하고, 바이오매스로부터 하나 이상의 생물활성제를 바이오매스/오일 혼합물의 오일로 추출하기에 적합한 시간과 온도에서 바이오매스 오일 혼합물을 유지하는 것을 포함한다.

접촉이라는 용어는 상이한 적절한 온도에서 바이오매스 오일 혼합물을 유지하는 것을 포함한다.

바이오매스가 적어도 하나의 오일과 접촉할 수 있는 온도는 항-메탄생성제가 오일로부터 현저하게 증발/승화하지 않고/않거나 접촉이 일어나는 온도에서 현저하게 분해되지 않는 한 제한되지 않는다. 온도는 -78℃ 내지 -50℃, -50℃ 내지 -20℃, -20℃ 내지 -5℃, -5℃ 내지 0℃, -5℃ 내지 4℃, 0℃ 내지 4℃, 4℃ 내지 10℃, 10℃ 내지 20℃, 20℃ 내지 25℃, 25℃ 내지 30℃, 30℃ 내지 40℃, 40℃ 내지 50℃, 50℃ 내지 60℃, 60℃ 내지 70℃, 70℃ 내지 80℃, 80℃ 내지 90℃, 및 90℃ 내지 100℃로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 -78℃, -20℃, -5℃, 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 및 30℃로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 온도는 바람직하게는 약 4℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 바람직하게는 약 25℃이다. 적절한 온도는 냉동고, 냉장고, 에어컨 등을 사용하여 달성될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "실온"은 정상적인 주위 온도를 나타내기 위해 사용된다. 당업계의 숙련가가 인지하는 바와 같이, 주위 조건은 실온이 섭씨 영하에서 40℃ 이상까지 다양할 수 있도록 지리적 위치 및 연중 시간에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 실온은 약 20℃ 내지 약 25℃로 간주되며, 퀸즈랜드 타운스빌에서 수행된 실험의 목적상 실온은 약 25℃를 의미하는 것으로 간주된다.

본 발명자들은 다량의 아스파라고프시스의 바이오매스가 상대적으로 적은 용적의 오일과 접촉하는 경우, 하나 이상의 생물활성제가 오일로 추출되는 것을 방해하는 겔 형성이 일어남을 입증하였다. 추출된 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)의 수율을 증가시키기 위해, 겔 및/또는 바이오매스 및/또는 오일을 가열하여 적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)를 적어도 하나의 오일에 더 많이 방출할 수 있다. 예를 들면, 도 8 및 9는 적어도 하나의 오일과 접촉된 바이오매스의 샘플을 60℃에서 1시간 동안 가열하면 샘플의 비가열에 비해 오일로 추출되는 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)가 최대 20% 더 많다는 것을 입증한다 (도 8 및 9에서 "120g + 가열" vs "120g"에 대한 데이터 참조).

적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)를 적어도 하나의 오일에 방출하기 위해 적어도 하나의 오일과 접촉된 바이오매스가 가열될 수 있는 온도는 적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)가 오일로부터 현저하게 증발/승화하지 않고/않거나 가열이 일어나는 온도에서 현저하게 분해되지 않는 한 제한되지 않는다. 온도는 25℃ 내지 30℃, 30℃ 내지 40℃, 40℃ 내지 50℃, 50℃ 내지 60℃, 60℃ 내지 70℃, 70℃ 내지 80℃, 80℃ 내지 90℃, 및 90℃ 내지 100℃로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 및 80℃로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 온도는 바람직하게는 약 60℃이다.

적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)를 적어도 하나의 오일에 방출하기 위해 적어도 하나의 오일과 접촉된 바이오매스가 가열될 수 있는 기간은 적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)가 오일로부터 현저하게 증발/승화하지 않고/않거나 가열 동안 현저하게 분해되지 않는 한 제한되지 않는다. 기간은 1초 내지 1분, 1분 내지 2분, 2분 내지 5분, 5분 내지 10분, 10분 내지 20분, 20분 내지 30분, 30분 내지 40분, 40분 내지 50분, 50분 내지 60분, 60분 내지 70분, 70분 내지 80분, 80분 내지 90분, 1.5시간 내지 2시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 4시간, 및 4시간 내지 5시간으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기간은 1분, 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 및 3시간으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 오일과 접촉된 바이오매스가 가열되는 기간은 바람직하게는 약 1시간이다.

적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)를 적어도 하나의 오일에 방출하기 위해 바이오매스/오일 혼합물이 가열되지 않을 때, 바이오매스로부터 적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건하에서 바이오매스가 적어도 하나의 오일과 접촉할 수 있는 시간의 양은 특별히 제한되지 않는다. 당업계의 숙련가가 인지하는 바와 같이, 오일 중 적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)의 농도는 적어도 하나의 오일 중 적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)의 양이 최대화되도록 평형 수준에 도달하거나 거의 도달하는 것이 바람직하다. 따라서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 생물활성제 (예를 들어, 항-메탄생성제)를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건하에서 바이오매스와 적어도 하나의 오일의 접촉은 1분 내지 1시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 4시간, 4시간 내지 5시간, 5시간 내지 6시간, 6시간 내지 12시간, 12시간 내지 24시간, 1일 내지 2일, 2일 내지 3일, 3일 내지 4일, 4일 내지 5일, 5일 내지 6일, 6일 내지 7일, 7일 내지 8일, 8일 내지 9일, 9일 내지 10일, 10일 내지 14일, 2주 내지 3주, 및 3주 내지 1개월로 구성된 그룹으로부터 선택된 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접촉은 1분, 2분, 5분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 5시간, 10시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 및 2주로 구성된 그룹으로부터 선택된 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접촉은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 4, 6, 7, 8, 9, 또는 10일의 기간 동안 수행될 수 있다.

바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시키는 단계는 또한 바이오매스를 적어도 하나의 오일에 균질화시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "균질화"는 바이오매스를 분해하여 그후 적어도 하나의 오일로 추출될 수 있는 바이오매스로부터의 적어도 하나의 항-메탄생성제의 방출을 용이하게 하는 것을 의미한다. 균질화는 크러싱, 그라인딩, 밀링, 블렌딩(blending), 절단, 슬라이싱 또는 다이싱과 같은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 균질화는 동물에 대한 사료 공급원에의 조성물 중의 바이오매스, 생물활성제 및/또는 오일의 균일한 분포가 촉진되도록 균질 혼합물을 수득하기 위해 수행될 수 있다.

하나의 실시양태에서 생물활성제는 동물, 바람직하게는 반추 동물에 대해 생물학적 효과를 갖는 제제이다. 생물학적 효과는 동물의 행동 또는 생리학에 대한 임의의 영향일 수 있거나, 심지어 상기 동물 내의 미생물에도 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 생물학적 효과는 메탄생성의 억제일 수 있다. 메탄생성의 억제를 담당하는 생물활성제는 특별히 제한되지 않으며, 2차 대사산물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 메탄생성을 억제하는 모든 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 아스파라고프시스는 할로겐화 저분자량 화합물, 특히 브롬화 및 염소화 할로포름을 포함한 2차 대사산물을 생산한다. 이들 화합물 중 다수는 강력한 항균 특성을 가지며 그람 양성균과 그람 음성균 뿐만 아니라 마이코박테리아 및 진균 활성을 포함한 광범위한 미생물을 억제하며, 따라서 본원에 기술된 효과에 기여하는데 관여할 수 있다. 아스파라고프시스로부터의 2차 대사산물은 또한 원생동물을 억제한다.

하나의 실시양태에서 생물활성제는 총 가스 생산 (TGP)을 감소시키는 제제, 및/또는 반추 동물에 의해 생성된 메탄을 감소시키는 제제이다.

본원에서 사용되는 용어 "감소"는 기준과 비교하여 물질의 양의 감소를 포함한다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함한 조성물을 투여받지 않은 동물 또는 동물들에 비해, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 투여받은 반추 동물 또는 동물들에 의해 생산된 총 가스 및/또는 메탄의 양의 감소. 감소는 혐기성 발효를 시뮬레이션하는 인공 반추위 시스템으로 시험관내에서 측정하거나, 호흡실에 갇힌 동물로 생체내에서 측정할 수 있다. 반추 동물에 의한 장내 메탄생성을 평가하는 것은 당업자의 지식과 기술 내에 있다.

본원에서 사용되는 용어 '총 가스 생산을 감소시키는'은 생산된 가스의 총 양, 예를 들면 위장관에서 생산된 총 가스의 양의 감소를 지칭한다. 이 용어는 예를 들변 본원에 기술된 시스템에서 혐기성 발효의 결과로 생성된 모든 가스의 총 용적을 포함한다. 반추 동물의 반추위 및 장에서의 발효는 메탄을 포함한 가스의 생산을 야기한다. 본 발명은 위장관에서 생산된 가스의 총 양을 감소시키는 것과 같이 이러한 과정을 감소시키는 것을 목표로 한다. 반추 동물에 의한 총 가스 생산을 평가하는 것은 당업자의 지식과 기술 내에 있다.

본원에서 사용되는 용어 '메탄 생산을 감소시키는'은 위장관에서 생산된 메탄의 감소를 지칭한다. 이 용어는 예를 들면 본원에 기술된 시스템에서 혐기성 발효의 결과로 생성된 메탄의 비체적을 포함한다. 반추 동물의 반추위 및 장에서의 발효는 메탄의 생산을 야기한다. 본 발명은 위장관에서 생산되는 메탄의 총량을 감소시키는 것과 같이 이러한 과정을 감소시키는 것을 목표로 한다. 반추 동물에 의한 메탄 생산을 평가하는 것은 당업자의 지식과 기술 내에 있다.

본원에서 사용되는 용어 "혐기성 발효"는 생체내, 예를 들면, 반추 동물에서의 혐기성 발효를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "항-메탄생성제"는 반추 동물에서 메탄생성을 억제하는 임의의 생활성 화합물을 의미한다. 이러한 화합물은 전형적으로 적어도 다음을 포함하는 할로겐화 2차 대사산물이다: 브로모클로로아세트산, 브로모클로로메탄, 2-브로모에탄설폰산, 클로랄 수화물, 클로로포름, 요오도프로판, 브로모포름 (BF), 디브로모아세트산 (DBA), 및 디브로모클로로메탄 (DBCM).

예를 들면, 본 발명자들은 도 4, 5, 6 및 7에서, 디브로모클로로메탄 (DBCM) 및/또는 디브로모아세트산 (DBA)을 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물이 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일과 접촉시키고 균질화하여 제조될 수 있음을 입증하였다. 높은 수준의 생활성 물질이 오일로 추출되며, DBCM에 대해 나타낸 바와 같이 이러한 수준은 실온 (RT) 또는 4℃ (Fridge)에서 저장할 때 연장된 기간 동안 유지된다.

하나의 실시양태에서 항-메탄생성제는 브로모클로로아세트산 (BCA), 브로모포름 (BF), 디브로모아세트산 (DBA), 및 디브로모클로로메탄 (DBCM)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

하나의 실시양태에서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 항-메탄생성제를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건하에서 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉한 후, 상기 바이오매스는 상기 적어도 하나의 오일로부터 분리된다. 적어도 하나의 오일로부터의 바이오매스의 분리는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 분리 방법은 원심분리, 경사여과, 여과, 증류, 또는 분리 깔때기 또는 기타 동등한 수단의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

접촉되는 바이오매스와 적어도 하나의 오일의 양은 적어도 하나의 오일로 추출되는 적어도 하나의 생활성 물질의 양을 변경하도록 달라질 수 있다.

본 발명자들은 또한 적어도 하나의 생활성 물질의 양이 적어도 하나의 오일에 대한 아스파라고프시스의 바이오매스의 비율을 변경함으로써 조절될 수 있음을 입증하였다. 예를 들면, 도 8 및 9는 브로모포름의 수준이 적어도 하나의 오일의 비율에 대한 아스파라고프시스의 바이오매스의 비율을 증가시킴으로써 증가될 수 있음을 보여준다.

따라서, 일부 실시양태에서 적어도 하나의 오일에 대한 바이오매스의 비율은 0.01 g:1 mL, 0.05 g:1 mL, 0.1 g:1 mL, 0.2 g:1 mL, 0.3 g:1 mL, 0.4 g:1 mL, 0.5 g:1 mL, 0.6 g:1 mL, 0.7 g:1 mL, 0.8 g:1 mL, 0.9 g:1 mL, 1 g:1 mL, 1.1 g:1 mL, 1.2 g:1 mL, 1.3 g:1 mL, 1.4 g:1 mL, 및 1.5 g:1 mL로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 오일에 대한 바이오매스의 비율은 0.3 g:1 mL 이상, 0.6 g:1 mL 이상, 0.9 g:1 mL 이상, 및 1.2 g:1 mL 이상으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 하나의 실시양태에서 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 아스파라고프시스 오일 조성물이 제공된다.

본 발명자들은 이전에, 동결 건조되고 분쇄된 아스파라고프시스 종이 껍질을 벗긴 목화씨(decorticated cottonseed; DCS)의 양성 대조군에 비해 소에서 생체내 총 가스 생산 및 메탄 생산을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 중요하게도, 껍질을 벗긴 목화씨는 다른 고 에너지 곡물에 비해 CH₄ 생산을 상당히 감소시키기 때문에 소를 위한 사료 보충제로 사용된다. DCS에 비해, 총 가스 생산의 감소는 종들 사이에서 유사하였으며, 이것은 아스파라고프시스와 같은 대형조류가 고 에너지 곡물에 비해 반추 동물 TGP 및 CH₄ 생산을 감소시키고 일부 대형조류는 DCS 양성 대조군에 비해 반추 동물 TGP 및 CH₄ 생산을 감소시킴을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 CH₄ 생산이 일반적으로 TGP와 동일한 패턴을 따른다는 것을 보여 주었다.

이에 따라, 하나의 실시양태에서 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에 의해 생산된 총 가스 및/또는 생산된 메탄을 감소시키는데 사용될 수 있다.

따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 반추 동물에게 유효량의 본 발명의 아스파라고프시스 오일 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 상기 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 생산된 총 가스의 양은 기준에 비해 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소된다. 하나의 실시양태에서 기준은 동물이 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 투여받지 않을 때 생산된 총 가스의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 기준은 동물이 껍질을 벗긴 목화씨를 투여받을 때 생산된 총 가스의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 기준은 껍질을 벗긴 목화씨가 시험관내 혐기성 발효에 적용될 때 생산된 총 가스의 양이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 생산된 메탄의 양은 기준에 비해 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 또는 10% 감소된다. 하나의 실시양태에서 기준은 동물이 유효량의 아스파라고프시스 오일 조성물을 투여받지 않을 때 생산된 메탄의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 기준은 동물이 껍질을 벗긴 목화씨를 투여받을 때 생산된 메탄의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 기준은 동물이 곡물 짚을 조사료 성분(pelleted commercial shipper ration) [회분, 72; 조 단백질 (CP) 112; 중성 세제 섬유 (aNDFom) 519; 산 세제 섬유 (ADFom) 338의 화학적 조성 (g/ kg DM), 코발트, 셀레늄 및 반추위 개질제는 없음]으로 하는 루핀, 귀리, 보리, 밀을 기본으로 하고 본원에서 '루핀 식이'라고 하는 추가량의 파쇄된 루핀을 갖는 펠렛화 시판 발송자 식량을 투여받을 때 생산된 메탄의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 기준은 루핀 식이가 시험관내 혐기성 발효에 적용될 때 생산된 메탄의 양이다.

하나의 실시양태에서, 시험관내 반추위 발효에 의해 생산된 메탄의 양은 껍질을 벗긴 목화씨가 시험관내 반추위 발효에 적용될 때 생산된 메탄의 양에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된다.

하나의 실시양태에서, 생산된 메탄의 양은 반추 동물이 껍질을 벗긴 목화씨를 투여받을 때 생산된 메탄의 양에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된다.

본 발명자들은 또한 이전에, 공기 건조되고 분쇄된 아스파라고프시스가 양에서 루핀 식이의 양성 대조군에 비해 메탄 생산을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 입증하였다.

하나의 실시양태에서, 생산된 메탄의 양은 반추 동물이 루핀 식이를 투여받을 때 생산된 메탄의 양에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된다.

"유효량"이란, 개선, 예를 들어, 기준 또는 대조군과 비교하여 메탄 생산량 감소, 기준 또는 대조군과 비교하여 생산된 총 가스량의 감소, 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준 유지, 기준 또는 대조군과 비교하여 아세테이트 대 프로피오네이트 비율의 감소, 기준 또는 대조군과 비교하여 생체중, 건조물 섭취량 및/또는 유기물 섭취량의 유지를 허용하기에 충분한 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 양을 의미한다. 본 발명의 의미 내에서, 메탄 환원 효과는 문헌 [T. Hano, J. Gen. Appl . Microbiol ., 1993, 39, 35-45]에 기술된 것과 같은 인공 반추위 시스템으로 또는 반추 동물에 생체내 경구 투여에 의해 반추위에서 측정할 수 있다.

따라서, 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 바람직하게는 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 16.67, 10, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%에 해당하는 용량으로 투여된다.

반추 동물에게 투여되는 유기물의 원하는 % 수준에 해당하는 용량을 달성하는데 필요한 오일의 용적을 계산하기 위해, 본원에 기술된 아스파라고프시스 오일 조성물의 유기물 양 %는 정의된 용적의 적어도 하나의 오일과 접촉된 아스파라고프시스 바이오매스의 생중량 (fw)으로부터 계산한다. 블롯 건조 아스파라고프시스의 생중량 대 건조 중량 (dw) 비율은 10이다 (즉, 30 g fw = 3 g dw). 이전 데이터를 기준으로 유기물 (OM)의 함량이 dw의 80%라고 가정하여, 바이오매스/오일 중 아스파라고프시스로부터 기원한 OM의 상응하는 함량을 계산할 수 있다. 예를 들면, 100 mL의 적어도 하나의 오일에 30 g 생중량 (fw) 아스파라고프시스 바이오매스를 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물의 경우 0.024 아스파라고프시스 유기물/mL에 상응한다. 사료 중의 원하는 포함 수준이 100 g 사료에서 0.1% 아스파라고프시스 OM이라면, 사료 100g 당 4.17 mL의 30 g fw/100 mL 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다.

바이오매스/오일 중 아스파라고프시스로부터 기원하는 OM의 상응하는 함량은 dw의 유기물 (OM) %의 상이한 함량으로부터 계산할 수 있다. 예를 들면, 이전 데이터를 기준으로 dw의 50%, 55%, 60%, 70%, 75%의 유기물 (OM) 함량을 사용하여 바이오매스/오일 중 아스파라고프시스로부터 기원하는 OM의 상응하는 함량을 계산할 수 있다.

상기 나타낸 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 바람직하게는 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%에 상응하는 용량으로 투여된다. 따라서, 30 g fw/100 mL 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 사용되는 경우, 사료 100 g 당 적어도 125 mL, 83.3 mL, 41.7 mL, 20.8 mL, 10.4 mL, 5.2 mL, 또는 2.8 mL가 필요하다. 60 g fw/100 mL 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 사용되는 경우, 사료 100 g 당 적어도 62.5 mL, 41.7, 20.8 mL, 10.4 mL, 5.2 mL, 2.6 mL, 또는 1.4 mL가 필요하다. 120 g fw/100 mL 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 사용되는 경우, 사료 100 g 당 적어도 31.25 mL, 20.8 mL, 10.4 mL, 5.2 mL, 2.6 mL, 1.3 mL 또는 0.69 mL가 필요하다.

예를 들면, 400 kg 반추 동물 (예를 들어, 거세소)이 1일당 체중의 2.5% 내지 3%의 사료를 섭취한다면, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 양에 비례하는 용량으로 투여된다. 400 kg 반추 동물의 경우에, 사료의 80%가 유기물인 경우, 동물이 1일당 체중의 약 2.5%를 섭취한다면 (8 kg의 유기물을 함유하여 10 kg), 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 3.3 리터의 30 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 1.6 리터의 60 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 1.1 리터의 90 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 833 mL의 120 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 666 mL의 150 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다.

반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 330 mL의 30 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 167 mL의 60 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 111 mL의 90 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 83 mL의 120 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 67 mL의 150 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다.

반추 동물에게 투여되는 유기물의 원하는 % 수준에 상응하는 용량을 달성하는데 필요한 바이오매스를 포함하는 조성물을 계산하기 위해, 본원에 기술된 아스파라고프시스 오일 조성물의 유기물 양 %를 정의된 용적의 적어도 하나의 오일과 접촉된 아스파라고프시스 바이오매스의 생중량 (fw)으로부터 계산한다. 블롯 건조 아스파라고프시스의 생중량 대 건조 중량 (dw) 비율은 10이다 (즉, 30 g fw = 3 g dw). 이전 데이터를 기준으로 유기물 (OM)의 함량이 dw의 80%라고 가정하여, 바이오매스/오일 중 아스파라고프시스로부터 기원한 OM의 상응하는 함량을 계산할 수 있다. 예를 들면, 100 mL의 적어도 하나의 오일에 30 g 생중량 (fw) 아스파라고프시스 바이오매스를 포함하는 아스파라고프시스 조성물의 경우 0.024 아스파라고프시스 유기물/mL에 상응하고, 총 최종 용적 중의 유기물의 양이 계산되고 계산에 포함된다.

본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 유효량은 본원에 기술된 시험관내 및 생체내 용량-반응 연구를 포함하여 본원에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 시험관내 반추위 발효가 아세테이트 및 프로피오네이트를 포함한 휘발성 지방산의 수준, 메탄 생산, 및 총 가스 생산에 대한 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스의 양의 효과를 조사하는데 사용될 수 있음을 입증하였다. 따라서, 시험관내 반추위 발효는 개선, 예를 들어, 기준 또는 대조군과 비교하여 메탄 생산량 감소, 기준 또는 대조군과 비교하여 생산된 총 가스량의 감소, 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준 유지, 또는 기준 또는 대조군과 비교하여 아세테이트 대 프로피오네이트 비율의 감소를 허용하기에 충분한 유효량일 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 용량을 특성화하는데 사용될 수 있다.

반추 동물은 처음에는 동물의 첫 번째 위 방(stomach chamber) 내에서 식물성 음식을 연화시키고 부분적으로 발효시킨 다음 현재는 되새김질 거리(cud)라고 알려진 반-소화 덩어리를 역류시켜 이를 다시 씹음으로써 식물성 음식을 소화하는 우제류(Artiodactyla) 목의 포유류이다.

식물 물질을 더욱 분해하고 소화를 촉진하기 위해 되새김질하는 과정을 "반추"라고 한다. 반추 동물은 4개의 방, 즉 반추위, 봉소위, 겹주름위 및 주름위가 있는 소화관을 갖는다. 처음 두 개의 방인 반추위와 봉소위에서, 음식은 타액과 혼합되어 고체 및 액체 물질의 층으로 분리된다. 고체는 서로 뭉쳐서 되새김질 거리 또는 볼루스를 형성한다. 그후 되새김질 거리를 역류시키고 천천히 씹어 타액과 완전히 혼합하여 섬유질을 더욱 분해한다. 섬유, 특히 셀룰로스는 공생 혐기성 박테리아, 원생 동물 및 곰팡이에 의해 이러한 방에서 포도당으로 분해된다. 이제 내용물의 액체 부분에 있는 분해된 섬유질은 반추위를 통해 다음 위 방인 겹주름위를 통과한다. 겹주름위에 있는 음식은 단위(monogastric stomach)에서처럼 소화된다. 소화된 장 내용물은 마침내 소장으로 보내지며, 여기서 영양분의 흡수가 일어난다. 셀룰로스의 분해에 의해 생성되는 거의 모든 포도당은 공생 박테리아에 의해 사용된다. 반추 동물은 박테리아에 의해 생성된 휘발성 단쇄 지방산 (VFA), 즉 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 발레레이트 및 이소발레레이트로부터 에너지를 얻는다.

중요하게도, 본 발명자들은 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 반추위 발효를 손상시키지 않으면서 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 특성을 가지고 있음을 보여주었다.

예를 들면, 본 발명자들은 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 반추위 발효를 손상시키지 않으면서, 예를 들면, 하나 이상의 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준을 유지하면서 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 특성을 가지고 있음을 보여주었다. 본 발명자들은 또한 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 반추위 발효를 손상시키지 않으면서, 예를 들면, 일일 사료 섭취량 및/또는 동물 생체중에 상당한 영향을 미치지 않으면서 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 특성을 가지고 있음을 보여주었다.

본원에서 사용되는 용어 "유효 수준의 유지"는 처리 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 투여) 후 동물 또는 동물들에서의 물질의 양이 본 발명의 아스파라고프시스 오일 조성물을 투여받지 않은 동물 또는 동물들에서의 물질의 양을 포함한 대조군 또는 기준과 유의하게 다르지 않음을 의미한다.

예를 들면, "바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준"은 바람직한 휘발성 지방산의 양이 기준 또는 대조군과 비교하여 메탄 생산량 감소; 기준 또는 대조군과 비교하여 생산된 총 가스량의 감소; 기준 또는 대조군과 비교하여 아세테이트 대 프로피오네이트 비율의 감소; 또는 기준 또는 대조군과 비교하여 생체중, 건조물 섭취량 및/또는 유기물 섭취량의 유지와 같은 상태의 개선을 허용하기에 충분하다는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

탄수화물 대사는 주로 셀룰로스와 전분의 발효를 통해 반추위 미생물의 성장을 위한 에너지를 제공한다. 불용성 중합체는 반추위 미생물로부터의 세포외 효소에 의해 올리고당과 가용성 당으로 전환된다. 생성된 당은 다양한 형태의 휘발성 지방산 중 하나, 이산화탄소 및 수소로 발효된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 휘발성 지방산 - 아세트산, 프로피온산 및 부티르산 - 은 각각 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트라고도 한다.

휘발성 지방산은 다양한 효율을 갖는 1차 탄소 및 에너지 공급원으로서 동물에 의해 사용된다. 프로피온산은 동물에서 포도당 신합성을 위한 주요 대사 전구체이기 때문에 높은 수준의 프로피온산이 바람직하다. 6탄당을 아세트산으로 발효시키는 것은, 이 과정에서 탄소와 수소가 이산화탄소 또는 중요하게는 메탄의 형태로 분출을 통해 손실되기 때문에, 상대적으로 비효율적이다. 다른 한편으로, 프로피온산의 생산은 수소를 사용하며 탄소 또는 메탄의 손실을 초래하지 않는다.

그후 반추위에서 아세트산에 비해 프로피온산의 몰 비율을 증가시킴으로써, 또는 또 다른 실시양태에서, 총 휘발성 지방산 농도 (즉, 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 합)를 증가시킴으로써 반추 동물의 사료 이용 효율 및/또는 성장 속도를 개선하는 것이 가능해진다.

본 발명자들은 소에서 총 VFA 생산에 부정적인 영향을 미치지 않으면서, 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스의 존재하에 시험관내 및 생체내 혐기성 발효에서 생산된 총 가스 및/또는 생산된 메탄의 감소를 입증하였다. 중요하게도, 본 발명자들은 유기물 또는 건조물 섭취/분해의 양을 감소시키지 않는 아스파라고프시스의 용량에서; 아세테이트 대 프로피오네이트 비율을 감소시키는 용량에서; 아세테이트의 양을 감소시키는 용량에서; 프로피오네이트의 양을 증가시키는 용량에서; 및/또는 시험관내 및 생체내에서 총 가스 및 메탄 생산을 억제하는 아스파라고프시스의 용량에서 아스파라고프시스가 소에서 VFA의 양을 감소시키지 않는다는 것을 보여주었다.

중요하게는, 본 발명자들은 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 소에서 총 가스 및 메탄 생산을 억제하는 아스파라고프시스의 용량에서 VFA의 양을 감소시키지 않음을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 아세테이트 대 프로피오네이트 비율을 감소시키는 용량에서; 아세테이트의 양을 감소시키는 용량에서; 프로피오네이트의 양을 증가시키는 용량에서; 및/또는 시험관내 및 생체내에서 메탄 생산을 억제하는 아스파라고프시스의 용량에서 양에서 유기물 또는 건조물 섭취/분해의 양을 감소시키지 않는다는 것을 보여주었다. 예를 들면, 본 발명자들은 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 유지 에너지의 1.2배를 먹인 양에서 유기물 또는 건조물 섭취/분해의 양을 감소시키지 않는다는 것을 보여주었다.

따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 아스파라고프시스 오일 조성물을 상기 반추 동물에게 투여하는 단계(여기서, 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준이 유지된다)를 포함하여 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

하나의 실시양태에서, 바람직한 휘발성 지방산은 아세테이트 및 프로피오네이트이다.

본원에서 사용되는 용어 "휘발성 지방산" ("VFA")은 반추위에 있는 사료 성분의 혐기성 미생물 발효의 최종 생성물을 포함한다. 통상의 VFA는 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레레이트, 및 이소발레레이트를 포함한다. VFA는 반추위에 의해 흡수되고 에너지 및 지질 합성을 위해 동물에 의해 사용된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 존재하에 반추위 발효에서 생산된 총 VFA는 적어도 80 mmol/L이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 존재하에 반추 발현에서 생산된 총 VFA는 적어도 65 mmol/L이다.

본 발명자들은 또한 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 반추위 발효로부터 분해된 유기물 또는 건조물의 양, 또는 건조물 섭취를 감소시키지 않는 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스의 용량에서 소에서 VFA 양을 감소시키지 않는다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 양의 건조물 섭취량 또는 생체중을 감소시키지 않는다는 것을 입증하였다. 예를 들면, 본 발명자들은 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 유지 에너지의 1.2배를 먹인 양의 건조물 섭취량 또는 생체중을 감소시키지 않는다는 것을 입증하였다. 이것은 아스파라고프시스와 같은 적색 해조류가 반추위 발효를 손상시키지 않으면서 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시킴을 나타낸다.

따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 상기 반추 동물에게 투여하는 단계를 포함하여 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준이 유지된다. 또 다른 실시양태에서 아세테이트 대 프로피오네이트의 비율이 감소된다. 또 다른 실시양태에서, 분해된 유기물 및/또는 건조물의 수준이 유지된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 상기 반추 동물에게 투여하는 단계 (여기서 건조물 섭취량은 유지된다)를 포함하여 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "유기물" 및 "건조물"은 동물이 주어진 시간, 전형적으로 24시간 동안 섭취하는 사료의 양 (각각 유기물 또는 무수물 기준)을 의미한다. 유기물 및 건조물 섭취 및/또는 분해를 계산하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 건조물 및 유기물은 각각 사료의 양의 90% 및 80%일 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 바람직하게는 적어도 16.67, 10, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%에 상응하는 용량으로 투여된다.

바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 분해된 유기물 및/또는 건조물의 양을 유지하기 위해 반추 동물에게 투여되는 유기물의 바람직하게는 적어도 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%에 상응하는 용량으로 투여된다.

또 다른 실시양태에서, 분해된 유기물 또는 건조물의 양 둘 다가 유지되며, 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준이 유지된다.

바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준을 유지하기 위해 반추 동물에게 투여되는 유기물의 바람직하게는 적어도 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%에 상응하는 용량으로 투여된다.

중요하게는, 본 발명자들은 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 총 가스 및 메탄 생산을 억제하는 아스파라고프시스의 용량에서 프로피오네이트의 양을 증가시키고, 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스가 분해된 유기물 또는 건조물의 양을 감소시키지 않는 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스의 용량에서 프로피오네이트의 양을 증가시킴을 입증하였다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 상기 반추 동물에게 투여하는 단계를 포함하여 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 분해된 유기물 또는 건조물의 양이 유지되고/되거나 아세테이트 대 프로피오네이트의 비율이 감소된다.

바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 아세테이트 대 프로피오네이트의 비율을 감소시키기 위해 반추 동물에게 투여되는 유기물의 바람직하게는 적어도 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%에 상응하는 용량으로 투여된다.

하나의 실시양태에서 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 투여 후 아세테이트 대 프로피오네이트의 비율 (C2/C3 비율)이 부정적인 영향을 받지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 투여 후 아세테이트 대 프로피오네이트의 비율 (C2/C3 비율)이 감소된다.

또 다른 실시양태에서, 프로피오네이트의 몰 농도는 부정적인 영향을 받지 않는다.

저 품질 섬유질 사료의 반추위 발효는 반추 동물에서 메탄 생산의 주요 공급원이다.

반추 동물의 예는 아래에 열거되어 있다. 그러나, 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 소, 염소, 양 및 라마와 같은 가축의 식량용 첨가제로서 사용된다. 본 발명은 소와 양에서 특히 유용하다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 상기 반추 동물은 반추아목 (Ruminantia) 및 낙타아목 (Tylopoda) 아목의 구성원으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 반추 동물은 소 또는 양이다. 추가의 실시양태에서, 상기 반추 동물은 소이다.

"투여한다" 및 "투여된"이란 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 동물의 위장관에 도입하는 작용을 의미한다. 보다 특히, 이러한 투여는 경구 경로에 의한 투여이다. 이러한 투여는 특히 동물용 사료에 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 보충함으로써 수행될 수 있으며, 그후 이렇게 보충된 사료는 동물에 의해 섭취된다. 투여는 또한 위관 또는 상기 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 동물의 위장관으로 직접 도입할 수 있게 하는 임의의 다른 수단을 사용하여 수행될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 유효량은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 16.67, 10, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%이다.

예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물의 식이에서 이용 가능한 유기물의 바람직하게는 적어도 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%의 용량으로 투여된다.

예를 들면, 반추 동물이 하루에 이의 생체중의 대략 2.5-3%의 사료를 먹는다면, 400kg 반추 동물은 하루에 10-12 kg의 사료를 먹을 수 있다. 예를 들면, 400 kg 반추 동물 (예를 들어, 거세소)이 하루당 이의 생체중의 2.5% 내지 3%의 사료를 먹는다면, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 반추 동물에게 투여되는 유기물의 양에 비례하는 용량으로 투여된다. 400 kg 반추 동물의 경우에, 사료의 80%가 유기물일 때, 동물이 하루당 이의 생체중의 약 2.5% (10 kg, 유기물 8 kg 함유)를 먹는다면, 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 3.3 리터의 30 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 1.6 리터의 60 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 1.1 리터의 90 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 833 mL의 120 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 666 mL의 150g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 330 mL의 30 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 167 mL의 60 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 111 mL의 90 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 83 mL의 120 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 67 mL의 120 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다.

유효량은 1회 이상의 용량으로 상기 반추 동물에게 투여될 수 있다.

유효량은 또한 매일 기준으로 1회 이상의 용량으로 상기 반추 동물에게 투여될 수 있다.

본원에서 1일당 체중 kg당 양으로 정의된 투여량은 주어진 처리 기간 동안, 예를 들어 처리 일주일 또는 한 달 동안 투여되는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 평균 양과 관련된다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 매일, 격일 등으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 방법은 처방된 투여량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 매일 투여를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 상기 일일 투여량을 산출하는 양으로, 동물에게 먹이를 줄 때마다 동물의 급여 동안 투여된다.

본 발명의 방법은 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250 또는 350일의 기간 동안 상기 기술된 투여량 섭생에 따른 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 측면은 본 방법의 방법이 장내 메탄생성을 감소시키는데 매우 지속적인 효과를 제공한다는 사실에 있으며, 예를 들어, 반추위 또는 내장 미생물의 내성 증가의 결과로서 효과는 연장된 처리 기간에 걸쳐 감소하지 않으며, 이에 의해 반추 동물의 장기간 처리를 특히 실행 가능하게 한다.

따라서, 총 가스 생산 및 CH₄ 생산량을 감소시킴을 포함하는 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스의 유의한 효과를 고려할 때, 하나의 실시양태에서 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 바람직하게는 영양학적으로 중요한 발효 매개변수에 영향을 주지 않으면서 본원에 기술된 효과 (예를 들어, CH₄ 생산량 감소)를 초래하는 형태로 투여된다.

아스파라고프시스에 의해 생산되는 다양한 2차 대사산물 중에서, 브로모포름 (CHBr₃)은 가장 풍부하고 생물학적으로 활성인 것 중 하나이다. 그러나, 브로모포름 및 화학적으로 관련된 화합물 (예를 들어, 브로모클로로메탄)은 정제된 화학물질로서 안전하지 않으며 반추 동물에서 메탄생성의 억제를 포함하여 인간 및 동물 적용에 허용되지 않는다.

아스파라고프시스의 온전한 동결 건조된 분쇄된 바이오매스가 반추 동물에서 메탄생성을 억제하기 위한 사료 보충제로서 사용될 수 있지만, 이것은 브로모포름과 같은 생활성 화합물의 손실을 최소화하고 활성을 유지하기 위해 급여 전에 신중하게 처리할 필요가 있다. 현재 아스파라고프시스의 바이오매스 제조에 가장 효과적인 방법은 사료 보충제로 사용하기 위해 바이오매스를 즉시 동결시킨 다음 후속적으로 동결 건조하는 것이다. 그러나, 본 발명자들은 온전한 바이오매스가 즉시 동결되지 않고/않거나 공기 건조되는 경우 브로모포름의 주요 손실이 있음을 이전에 발견하였다. 또한, 동결 건조된 바이오매스가 주위 온도 (66% 손실) 또는 심지어 냉장 조건 (32% 손실)하에서 저장되는 경우 6개월 후 큰 손실이 있으며, 동결 건조된 물질의 동결 (20% 손실)은 장기 저장 (> 6개월)을 위한 유일한 실용적 옵션이다.(도 2) 이러한 처리 및 저장 조건은 문헌 [Vucko et al. (J. Appl . Phycol. 2017, 29, 1577-1586)]에 기술되어 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일과 접촉시켜 제조한 아스파라고프시스 오일 조성물이 실온 또는 4℃에서 저장하더라도 연장된 기간 동안 높은 수준의 생활성을 보유함을 발견하였다. 예를 들면, 상기한 바와 같이, 도 3은 균질화의 존재 또는 부재하에 아스파라고프시스의 바이오매스를 오일과 접촉시켜 제조한 아스파라고프시스 오일 조성물이 실온 또는 4℃에서 저장할 때 연장된 기간 동안 높은 수준의 생활성을 보유함을 보여준다. 따라서 본 발명의 방법은 아스파라고프시스 오일 조성물을 실온에서 장기 저장 (> 6개월)에 적합한 형태로 생산할 수 있게 한다.

본 발명은 야생에서 수확한 아스파라고프시스의 바이오매스를 운송, 건조 및/또는 저장하는 동안 일어날 수 있는 생활성 성분의 손실을 상당히 감소시킨다. 본 발명은 또한 보존된 온전한 바이오매스 또는 생활성 추출물의 블렌딩된 생성물을 수득하기 위한 단계의 수를 감소시키고, 따라서 현재 처리 기술에 상당한 개선을 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 바람직하게는 2차 대사산물이 유효하게 (예를 들어, 치료적으로 유효하게) 유지되는 형태로 투여된다.

본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 여러 방법 중 하나로 반추 동물에게 투여될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 동물용 의약품으로서 고체 형태로 투여될 수 있거나, 부형제에 분배하여 동물에게 직접 공급될 수 있거나, 건식 형태로 사료 재료와 물리적으로 혼합될 수 있거나, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 용액으로서 제공되고 그후 사료 재료에 분무될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 동물에게 투여하는 방법은 숙련가의 기량 내에 있는 것으로 간주된다.

사료 재료와 조합하여 사용되는 경우, 사료 재료는 바람직하게는 곡물/건초/사일리지/잔디-기반이다. 이러한 사료 재료 중에는 직접 방목되거나 보존된 마초 건초로서 제조된 개량 및/또는 열대 풀 또는 콩과 식물 기반 마초, 임의의 사료 성분 및 식품 또는 사료 산업 부산물 뿐만 아니라 바이오-연료 산업 부산물 및 옥수수 가루 및 이의 혼합물, 또는 사육장 및 낙농장 식량, 예를 들어 곡물 함량이 높은 것이 포함된다.

메탄 생산에 대해 감소 효과가 나타나는 한 투여 시간은 중요하지 않다. 사료가 반추위에 보유되는 한, 언제든지 투여가 가능하다. 그러나, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 바람직하게는 메탄이 생성되는 시간쯤에 반추위에 존재하기 때문에, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 바람직하게는 사료와 함께 또는 사료 직전에 투여된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 상기 동물용의 사료에 상기 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 보충함으로써 반추 동물에게 투여된다. 본 발명의 의미 내에서 "보충"은 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 동물용 사료에 직접 혼입하는 작용을 의미한다. 따라서, 동물은, 급여할 때, 예를 들어, 동물 사료에 함유된 섬유질 및/또는 곡물의 소화율을 증가하는 작용을 할 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 섭취한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 주제는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하는 반추 동물용 사료 보충제에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 또한 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키기 위한 사료 보충제를 제공하며, 상기 보충제는 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함한다.

하나의 실시양태에서, 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물은 상기 동물용 식량에 상기 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 보충함으로써 상기 반추 동물에게 투여된다.

상기 논의된 바와 같이, 하나의 실시양태에서 본 발명은 반추 동물에서 VFA의 수준을 유지한다. 따라서, 이 방법은 반추 동물이 예를 들어 섬유질 및 곡물을 기본으로 하는 사료로부터 에너지를 유지할 수 있도록 하고, 그 결과, 동일한 칼로리 섭취에서 시작하여, 총 가스 및 CH₄ 생산을 완화하면서 대사에 이용 가능한 에너지를 유지할 수 있다.

이것은 축산업자에게 유리하며 따라서 이들은 이용 가능한 대사 가능 에너지 단위당 사료의 비용을 최적화할 수 있다. 이것은 또한 상당한 경제적 이익을 나타낸다.

본 발명자들은 반추 동물에게 유효량의 동결 건조된 분쇄된 아스파라고프시스를 투여하는 것이 자발적 사료 섭취에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 이전에 입증하였다. 따라서, 본 발명은 분해된 유기물 및/또는 건조물의 수준이 유지되는 방법을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "동물 사료 보충제"는 활성 성분을 포함하는 농축된 첨가제 프리믹스(premix)를 지칭하며, 프리믹스 또는 보충제는 본 발명에 따른 보충 사료를 형성하기 위해 동물의 사료 또는 식량에 첨가될 수 있다. 용어 "동물 사료 프리믹스", "동물 사료 보충제" 및 "동물 사료 첨가제"는 일반적으로 유사하거나 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되며 일반적으로 상호교환 가능한 것으로 간주된다. 전형적으로, 본 발명의 동물 사료 보충제는 분말 또는 압축되거나 과립화된 고체의 형태이다. 실제로, 가축은 전형적으로 동물 사료 보충제를 식량에 예를 들어 소위 탑-드레스(top-dress)로서 직접 첨가함으로써 동물 사료 보충제를 먹일 수 있거나, 배합 동물 사료 또는 릭 블럭(lick block)과 같은 제품의 준비 또는 제조에 사용될 수 있으며, 이것은 이후에 더 상세히 설명될 것이다. 본 발명은 이와 관련하여 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 보충제는 전형적으로 16-2500 g/동물/일 범위의 양으로 동물에게 공급된다.

하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 보충제는 실제 개별 동물 섭취량 (예를 들어, g / kg DM 섭취량)을 기준으로 한 양으로 투여된다.

본 발명의 동물 사료 보충제는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하며, 사료에 첨가될 때, 아스파라고프시스 오일 조성물이 사료의 유기물의 적어도 0.067, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, 10 또는 16.67%에 상응하는 양으로 존재하도록 제형화된다.

예를 들면, 반추 동물이 하루에 대략 5 kg의 유기물을 먹는다면, 동물 사료 보충제는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하며, 사료에 첨가될 때, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 1일당 208 mL의 용량으로 투여되도록 제형화된다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 208 mL의 30 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 104 mL의 60 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 0.1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 52 mL의 120 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 2082 mL의 30 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 1041 mL의 60 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다. 반추 동물에게 투여되는 유기물의 1%에 상응하는 용량을 야기하기 위해 520 mL의 120 g fw/100 mL 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 보충제는 10-100 wt% 범위의 양으로 존재하는 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하며, 바람직하게는 상기 양은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97 또는 99 wt% 과량이다.

동물의 특정 유형 및 그 동물이 수용되어 있는 상황을 고려하여 보충제에 포함될 성분의 이상적인 양 및 식량 또는 배합 동물 사료 등의 제조에 사용할 보충제의 양을 정확하게 결정하는 것은 훈련된 전문가의 기술 내에 있다. 각 성분의 바람직한 투여량이 본원에 제공된다.

본 발명의 동물 사료 보충제는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 임의의 추가 성분을 포함할 수 있다. 이것은 전형적으로 원하는 제품 형태를 제조하는데 필요한 잘 알려진 부형제를 포함할 수 있으며, 사료의 품질을 개선하고/하거나 보충제를 소비하는 동물의 성능을 개선하는 것을 목표로 하여 추가 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 부형제의 적합한 예는 락토스, 수크로스, 만니톨, 전분 결정질 셀룰로스, 탄산수소나트륨, 염화나트륨 등과 같은 담체 또는 충전제, 및 아라비아 검, 트라가칸트 검, 알긴산 나트륨, 전분, PVP 및 셀룰로스 유도체 등과 같은 결합제를 포함한다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 사료 첨가제의 예는 비타민, 아미노산 및 미량 원소, 소화율 촉진제 및 장내 플로라 안정화제 등을 포함한다.

본 발명자들은 동결 건조된 분쇄된 딕티오타 (Dictyota), 오에도고늄 (Oedogonium), 및 클라도포라 파텐티라메아 (Cladophora patentiramea)가 반추위 발효로부터의 총 가스 생산 및 CH₄ 생산을 감소시킴을 입증하였다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 아스파라고프시스 아르마타 , 아스파라고프시스 탁시포르미스 , 딕티오타 종 (예를 들어, 딕티오타 바르타이레시), 오에도고늄 종, 울바 종, 및 클라도포라 파텐티라메아로 구성된 그룹으로부터 선택된 대형조류 중 적어도 하나의 종의 유효량을 상기 반추 동물에게 투여함을 추가로 포함한다.

따라서, 하나의 측면에서 본 발명은 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물 및 해양 대형조류 또는 해양 대형조류 오일 추출물을 포함하는 조성물을 상기 반추 동물에게 투여하는 단계를 포함하여 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

하나의 실시양태에서 조성물의 해양 대형조류는 아스파라고프시스 아르마타 , 아스파라고프시스 탁시포르미스, 딕티오타 종 (예를 들어, 딕티오타 바르타이레시), 오에도고늄 종, 울바 종, 및 클라도포라 파텐티라메아로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 측면은 이전에 본원에 정의된 바와 같은 보충제를 포함하는 배합 동물 사료 및 릭 블럭과 같은 제품에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 '배합 동물 사료 조성물'은 동물 사료로서 사용하기에 적합하고 다양한 천연 또는 비-천연 기재 또는 원료 및/또는 첨가제로부터 블렌딩되는 조성물을 의미한다. 여기서, 특히, 용어 '배합된'은 본원에서 본 발명의 동물 사료 조성물을 임의의 자연 발생 원료와 구별하기 위해 사용된다. 이러한 블렌드 또는 배합 사료는 표적 동물의 특정 요건에 따라 제형화된다. 상업적으로 제조된 배합 사료에 사용되는 주요 성분은 전형적으로 밀기울, 쌀겨, 옥수수 가루, 곡물, 예를 들어 보리, 밀, 호밀 및 귀리, 대두박, 알팔파 가루, 목화씨 가루, 밀 분말 등을 포함한다. 상업적 배합 사료는 전형적으로 15% 이상의 조단백질 및 70% 이상의 소화 가능한 총 영양소를 포함할 것이지만, 본 발명은 이와 관련하여 특별히 제한되지 않는다. 액체, 고체 뿐만 아니라 반고체 배합 동물 사료 조성물이 본 발명의 범위 내에 포함되며, 고체 및 반고체 형태가 특히 바람직하다. 이러한 조성물은 전형적으로 음식 타입(meal type), 펠릿 또는 크럼블(crumble)로서 제조된다. 실제로, 가축은 전형적으로 본 발명의 것과 같은 배합 사료와 사일리지 또는 건초 등과의 조합물을 공급받을 수 있다. 전형적으로 배합 동물 사료는 0.3-10 kg/동물/일의 범위 내의 양으로 공급된다. 동물의 유형 및 그 동물이 수용되어 있는 상황을 고려하여 배합 동물 사료에 포함시키고자 하는 이들 성분의 적당한 양을 결정하는 것은 훈련된 전문가의 기술 내에 있다.

본 발명의 배합 동물 사료 조성물은 당업계에서 전형적으로 사용되는 임의의 추가 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 당업계의 숙련가들에 의해 알려진 바와 같이, 이 문맥에서 용어 '사료 첨가제'는 사료의 품질 및 동물 기원으로부터의 식품의 품질을 개선하거나 동물의 성능을 개선하고, 예를 들어 사료 재료의 향상된 소화율을 제공하기 위한 목적으로 동물 영양에 사용되는 제품을 지칭한다. 비제한적인 예는 방부제, 항산화제, 유화제, 안정화제, 산도 조절제 및 사일리지 첨가제와 같은 기술적 첨가제; 감각 첨가제, 특히 향료 및 착색제; 비타민, 아미노산 및 미량 원소와 같은 (추가) 영양 첨가제; 및 소화율 향상제 및 장내 플로라 안정제와 같은 (추가) 축산 첨가제를 포함한다.

당업계의 숙련가들에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 배합 동물 사료 조성물은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 임의의 추가 성분 또는 첨가제를 포함할 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하는 릭 스톤(lick stone) 또는 릭 블럭(lick block)을 제공한다. 당업계의 숙련가들에게 알려진 바와 같이, 이러한 릭 스톤 또는 블럭은 천연 목초지 및 경작 목초지 중 하나 또는 둘 다를 방목하는 반추 동물에게 미네랄 보충제 (뿐만 아니라 단백질 및 탄수화물)를 공급하는데 특히 편리하다. 본 발명에 따른 이러한 릭 블럭 또는 릭 스톤은 전형적으로, 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물 이외에, 다양한 유형의 결합제, 예를 들어 시멘트, 석고, 석회, 인산 칼슘, 탄산염, 및/또는 젤라틴; 및 임의로 비타민, 미량 원소, 미네랄 염, 감각 첨가제 등과 같은 추가 첨가제를 포함한다.

본 발명의 추가의 측면은 반추 동물에서 위장 메탄 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 '위장 메탄생성 감소 (reducing gastro-intestinal methanogenesis)' 및 '위장 메탄 생산 감소 (reducing gastro-intestinal methane production)'는 위장관에서 메탄 가스 생산의 감소를 지칭한다. 앞서 설명한 바와 같이, 반추 동물의 반추위 및 장에서의 발효는 소위 메탄생성균 (methanogen)에 의한 메탄 가스의 생산을 야기한다. 본 발명은 이러한 과정을 줄이는 것, 예를 들어 위장관으로부터 직접적으로 메탄 배설을 감소시키는 것을 목표로 한다. 동물에 의한 메탄 배설을 평가하는 것은 당업계의 전문가의 지식과 기술 범위 내에 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 반추위 및 장에서의 메탄 생산은 건강한 동물에서 일반적으로 발생하는 과정이며 메탄생성을 감소시켜도 반추 동물의 일반적인 건강 상태 또는 웰빙을 향상시키거나 저하시키지 않는다.

따라서, 본 발명의 처리방법은 비-치료적 처리방법이며, 즉 이 방법은 특정 병태를 앓고 있는 동물의 건강을 개선하지 않고, 특정 질병이나 병태를 예방하지 않으며, 임의의 다른 방식으로, 즉 본 발명의 처리방법을 제공받지 않은 반추 동물에 비해 반추 동물의 건강에 영향을 주지도 않는다. 본 발명의 방법의 이점은 앞서 설명된 바와 같은 환경적 및/또는 경제적 측면으로 제한된다.

상기로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물의 경구 투여를 포함한다. 바람직하게는 처리는 상기 정의된 바와 같은 배합 동물 사료 조성물 및/또는 동물 사료 보충제 제품의 경구 투여를 포함하지만, 당업계의 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이 다른 액체, 고체 또는 반고체 경구 섭취 가능한 조성물이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 사용될 수 있다.

전술한 바에 따르면, 본 발명의 여전히 추가의 측면은 반추 동물에서 위장 메탄 생산의 비-치료적 감소를 위한 본원에 기술된 바와 같은 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 반추 동물을 위한 사료를 제공하며, 여기서 상기 사료는 본원에 기술된 사료 보충제로 보충된다.

또 다른 측면에서 본 발명은 반추 동물에 의한 메탄 생산을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 동물에게 본원에 기술된 사료 보충제 또는 본원에 기술된 사료를 투여하는 단계를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "저장 수명"은 적어도 하나의 오일 중의 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제의 양 또는 수준이 조성물이 저장되는 기간 및 온도 동안 상당히 감소되지 않음을 나타내기 위해 사용된다. 즉, 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제의 수준의 상당한 감소가 있기 전에 경과된 시간의 양이 저장 수명을 나타내기 위해 취해진다. 용어 "안정성"은 저장 수명의 지표로도 사용된다. 적어도 하나의 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제의 '안정성'은 시간 경과에 따라 항-메탄생성제의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.

생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제의 수준은 전형적으로 이것이 오일로 추출되면 시간이 지남에 따라 감소하며, 이것은 저장 조건에 따라 좌우될 것이다. 수준의 감소는 오일로부터의 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제의 증발 또는 승화와 같은 다수의 이유 때문일 수 있다. 이것은 또한 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제와 그 자체의 반응, 오일 추출물 중의 잔류 수분, 공기 중의 산소 또는 기타 가스, 오일 중의 다른 성분, 또는 오일 자체와의 반응 때문일 수 있으며, 다수의 할로겐화 화합물에서 전형적인 바와 같이 빛 및/또는 열에 의해 매개될 수 있다. 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제가 여전히 소비하기에 허용 가능하도록 감소되는 수준은 제품의 최종 용도 및 생성될 수 있는 분해 부산물과 같은 여러 요인에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 적어도 하나의 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제가 감소될 수 있는 수준은 4℃ 또는 25℃에서 저장 후 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이하일 수 있으며, 이것은 여전히 사용하기에 허용 가능할 것이다. 하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 생활성 (예를 들어, 항-메탄생성) 제제의 수준은 25℃에서 65주 저장 후 20% 이하까지 감소될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준은 4℃ 또는 25℃에서 65주 저장 후 50% 이하까지 감소될 수 있다.

약어

명세서 전체에 걸쳐 여러 약어가 사용된다. 의심을 피하기 위해, 이들 약어는 아래에 정의된다:

ANOVA 분산 분석

BCA 브로모클로로아세트산

BF 브로모포름

d 일(들)

DBA 디브로모아세트산

DBCM 디브로모클로로메탄

DCM 디클로로메탄

dw 건조 중량

eq. 당량(들)

fw 생중량

GC 가스 크로마토그래피

HPLC 고 성능/압력 액체 크로마토그래피

IS 내부 표준

MS 질량분석법

MTBE 메틸 3급-부틸 에테르

n 샘플의 수

OM 유기물

RT 실온

VFA 휘발성 지방산(들)

wk 주(들)

본 발명은 이하에서 실시예에 의해 추가로 기술될 것이며, 이것은 당업계의 통상의 숙련가가 본 발명을 수행하는데 도움을 주기 위한 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1: 아스파라고프시스 오일 조성물의 제조

아스파라고프시스 탁시포르미스 (배우체 단계)는 Magnetic Island (QLD, Australia)로부터 수집하였다. 아스파라고프시스 아르마타는 태즈메이니아 브루니섬 클라우디 베이, 43°.43'94" S; 147°.21'.52" E로부터 수집하였다. 신선한 바이오매스를 블롯 건조시키고 샘플 (6 Х 30.0 g 생중량 (fw))을 별도의 250 mL 유리병 (Schott)에 수집하였으며, 각각에는 100 mL의 식물유 (홈브랜드 혼합 식물유, 카놀라유 95%, 해바라기유 5%)을 사전-충전하였다. 비교 샘플 (6 Х 30.0 g 생중량 (fw))을 또한 식물유 대신에 100 mL의 milliQ 물에 수집하였다. 모든 병은 안전하게 뚜껑을 닫고 추가 처리를 위해 실험실로 즉시 수송하기 위해 얼음에 저장하였다.

바이오매스의 샘플 (6 Х 30.0 g fw)을 또한 건조 중량 (dw)을 측정하고 바이오매스 (3 Х 30.0 g fw) 중의 브로모포름 함량을 측정하기 위해 지퍼락 백에 수집하였다.

실험실 (수집 시간으로부터 4시간 미만)에서, 각 용매 (오일 또는 물) 중의 바이오매스는 IKA ultra-turrax T-25를 사용하여 60초 동안 분쇄함으로써 균질화하였으며 (오일의 경우 n = 3 및 물의 경우 n = 3), 각 용매에 대한 남은 세 개의 레플리케이트 중의 바이오매스는 그대로 유지시켰다. 그후 바이오매스를 갖는 모든 병 (n = 12)을 냉장고 (4℃)에 저장하였다. 수집 (0일) 후 1일, 3일, 5일, 7일, 10일에 조류에 존재하는 항-메탄생성제를 대표하는 브로모포름 함량에 대해 샘플을 분석하였다.

브로모포름의 분석을 위해, 1.5 mL의 추출 용매 (오일 또는 물)를 각 레플리케이트 병으로부터 수집하고 원심분리 (12,000 g, 1분)하여 고체를 제거하였다. 브로모포름 (BF)을 아래에 기술된 바와 같이 메틸 3급-부틸 에테르 (MTBE) 또는 메탄올을 사용하여 1.0 mL의 생성된 정화 용액으로부터 추출하였다.

물을 용매로서 사용하는 샘플의 경우, 1.0 mL의 나프탈렌-에테르 용액 (메틸 3급-부틸 에테르 (MTBE) 중의 10 μg.mL^-1의 나프탈렌)을 사용하여 각 레플리케이트 병으로부터 1.0 mL 하위샘플에서 브로모포름을 추출하였다. 나프탈렌은 내부 표준으로 작용하였으며 MTBE는 추출 용매였다. MTBE 상을 수집하고 아래에 기술된 바와 같이 GC/MS로 분석하였다.

오일을 용매로서 사용하는 샘플의 경우, 1.0 mL의 나프탈렌-메탄올 용액 (HPLC-등급 메탄올 중의 10 μg.mL^-1의 나프탈렌)을 사용하여 각 레플리케이트 병으로부터 1.0 mL 하위샘플에서 브로모포름을 추출하였다. 메탄올 층의 분석 전에 샘플을 4℃에서 2시간 동안 분배되도록 하였다. 분배 조건은 상이한 용매 (헥산, 메탄올, MTBE, DCM) 및 기간 (30분 내지 48시간)을 사용하여 이전 실험을 기반으로 선택되었다. 메탄올 상을 수집하고 아래에 기술된 바와 같이 GC/MS로 분석하였다.

아스파라고프시스 탁시포르미스의 온전한 또는 균질화된 바이오매스로부터 할로겐화 대사산물을 오일 또는 물로 추출하기 위한 실험 설계는 아래에 나타내어져 있다.

브로모포름의 건조 중량 및 함량의 측정을 위해, 바이오매스를 즉시 동결한 다음 동결-건조시켰다 (Virtiz benchtop 2K, -55℃, 120 μbar, 48시간). 건조된 바이오매스를 칭량하여 건조 중량을 결정한 다음 1 mm 입자로 되도록 분쇄하고, 밀봉된 병(sealed jar)에 -20℃에서 저장하였다.

브로모포름을 Machado 등 (J Appl Phycol, 28 (2016) 3117-3126)에 기술된 바와 같이 수정하여 Paul 등 (Mar. Ecol. Prog. Ser., 306 (2006) 87-101)에 따라 GC/MS (Zebron ZB-wax 모세 컬럼이 장착된 Agilent 7890c, 30 m Х 0.25 mm Х 0.25 μm, Phenomenex, Australia)로 정량하였다. 간단히 말해서, 분석 조건은 Paul 등에 의해 기술된 바와 같이 다음의 온도 매개변수를 갖는 비분할 모드의 펄스 주입 (1 μL, 35 psi)이었다: 주입 포트 (250℃), GC/MS 인터페이스 (300℃) 및 오븐 (40℃에서 1분 동안 유지, 16℃.min^-1로 250℃로 상승시킨 다음 250℃에서 2분 동안 유지). 헬륨이 2 mL.min^-1로 운반 가스로서 사용되었다. 각 방법 (수성, 오일, 바이오매스)에 대해 별도의 표준 곡선을 완성하고 내부 표준에 대한 표적 화합물의 피크 면적 비율로부터 각 샘플에서 표적 화합물의 농도를 계산하였다. 브로모포름은 이의 특징적인 이온 단편 (m/z 250, 252, 254, 256 [1:2:2:1]의 분자 이온 클러스터)을 기반으로 하여 상업용 표준 (Sigma Aldrich, Australia)과의 비교에 의해 확인하였다. 용액 중의 브로모포름의 농도를 추출된 건조 바이오매스의 양으로 정규화하고 mg 브로모포름/g dw 바이오매스로서 보고하였다.

블롯 건조 아스파라고프시스 30 g 샘플의 건조 중량은 약 3 g으로 측정되었다. 도 1은 상이한 추출 방법 (물을 용매로 사용하는 것 vs 오일을 용매로 사용하는 것; 및 온전한 바이오매스를 사용하는 것 vs 균질화/파쇄된 바이오매스를 사용하는 것)으로부터의 결과를 보여주며, 여기서 바이오매스는 최대 10일의 기간 동안 용매 (물 또는 오일)와 접촉된다. 결과는 조류의 건조 중량 그램 당 추출된 BF의 양 (mg)으로 플롯팅된다. 비교를 위해 이전에 기술된 방법을 사용하여 BF를 또한 추출하였다. 이 방법은 바이오매스 샘플을 동결-건조하는 단계 및 바이오매스를 메탄올과 72시간 동안 접촉시켜 BF를 메탄올로 추출하는 단계를 포함하였다.

도 1은 물로 추출된 아스파라고프시스 바이오매스가 오일으로 추출된 아스파라고프시스 바이오매스보다 BF를 덜 산출하고; 아스파라고프시스 바이오매스로부터 오일로 추출된 BF의 수준이 등가량의 바이오매스로부터 물로 추출된 BF의 수준에 비해 증가됨을 보여준다. 이 데이터는 아스파라고프시스의 바이오매스로부터 오일로 생활성 제제인 BF를 추출하여 아스파라고프시스 오일 조성물을 형성함을 입증한다.

추출 용매로서 사용될 때, 온전한 또는 균질화된 바이오매스는 유사한 결과를 제공하였다. 이러한 샘플로부터 추출된 BF의 양은 오일을 용매로서 사용하는 경우 (24시간 후)보다 대략 50% 더 낮았으며, 침지 시간 (최대 10일)의 기간 동안 대략 30-40% 더 낮게 유지되었다.

도 1은 또한 오일에 바이오매스를 균질화하면 최단 시간 (1일)에 가장 많은 양의 브로모포름이 추출되고, 오일 중의 온전한 바이오매스의 BF 함량은 단지 약 7일의 침지/추출 후에 균질화된 바이오매스와 유사한 수준에 도달함을 보여준다. 이 데이터는 아스파라고프시스의 바이오매스로부터 오일로의 생활성 제제인 BF의 추출의 속도가 적어도 하나의 오일에 바이오매스를 균질화함으로써 증가됨을 입증한다.

도 1은 또한 오일 사용에 의한 추출 효율이 바이오매스가 온전한지 또는 균질화되었는지에 따라 좌우되었음을 보여준다. 놀랍게도, 오일로 추출한 균질화된 바이오매스는 동결 건조된 바이오매스를 72시간 동안 메탄올로 추출하는 방법에 비해 24시간 후에도 훨씬 더 많은 BF를 산출하였다. 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 메탄올에 72시간 동안 침지하여 추출한 동결 건조된 샘플은 약 15 mg의 BF/g 조류 (dw)만을 제공하는 반면 오일에 단지 24시간 동안 침지한 균질화된 조류 샘플은 약 17.8 mg의 BF/g 조류 (dw)를 제공하였으며, 이것은 동결 건조된 바이오매스를 메탄올로 추출하는 것을 능가하는 상당한 개선을 나타낸다. 이 데이터는 아스파라고프시스의 바이오매스로부터 오일로의 생활성 제제인 BF의 추출 수준이 적어도 하나의 오일에 바이오매스를 균질화함으로써 증가됨을 입증한다.

실시예 2: 아스파라고프시스 오일 조성물의 저장 수명

본 발명의 아스파라고프시스 오일 조성물의 저장 수명 (예를 들어 안정성)을 평가하였다. 브로모포름 (BF) 및 디브로모클로로메탄 (DBCM)과 같은 생활성 화합물의 비율을 조사하고 시간의 함수로서 내부 표준 (IS; 나프탈렌)과 비교하였다. 비율의 감소는 화합물의 손실 및 이에 따라 단축된 저장 수명을 야기하는 생활성 오일 조성물의 안정성 감소를 나타낸다.

아스파라고프시스 바이오매스를 오일 또는 물로 추출한지 10일 후, 바이오매스를 제거하였다. (바이오매스를 갖는) 아스파라고프시스 오일 조성물을 100 μm 나일론 메쉬를 통해 여과한 다음 원심분리하였다 (3200 g, 15분). 그후 각 처리 (오일 또는 물)의 각 레플리케이트로부터의 정화된 용액을 30 mL 유리 병 (Schott) 2개로 분리하고, 이 병 중 하나는 4℃에 저장하고 다른 하나는 25℃에서 저장하였다 (온도 당 n = 3, 총 24개의 병). 0, 4, 8, 12 및 65주 저장 후 하위샘플 (1mL)을 수집하고 상기한 바와 같이 분석하였다. 아래 실험 설계에 나타낸 바와 같이 저장이 시작된 날부터 0주를 계산하였다:

동결 건조된 바이오매스를 또한 동일한 시간 간격으로 브로모포름의 함량에 대해 분석하였으며, 동결 건조기에서 바이오매스를 제거한 날부터 0주를 계산하였다.

표준 저장 방법에 따라 -20℃에서 저장한 동결 건조된 바이오매스는 표준 메탄올 추출 방법 사용시 시간에 따른 손실을 보이지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).

도 3은 본 발명의 아스파라고프시스 오일 조성물의 시간 경과에 따른 안정성을 보여준다. 물 추출물에서 알 수 있는 바와 같이, 4℃와 25℃ 둘 다에서 12주 저장시 생활성 물질인 브로모포름이 상당히 손실되었다. 따라서 물 샘플은 이러한 샘플에 대해 추가로 분석하지 않았다.

이와 달리, 처리 (균질화 또는 온전)를 위해 오일로 추출한 생활성 물질인 브로모포름의 수준은 4℃에서 또는 25℃에서 저장하든 상관없이 12주에 걸쳐 상당히 감소하지 않았다 (도 3). 놀랍게도, 65주 후 처리 (균질화 또는 온전)를 위해 4℃에서 저장한 아스파라고프시스 오일 조성물 중의 브로모포름의 상당한 감소는 없었다. 65주 동안 25℃에서 저장한 아스파라고프시스 오일 조성물은 원래의 추출된 브로모포름의 15 내지 20%가 손실되었다. 시간에 따른 BF의 겉보기 '이득'은 분석적 분산 때문일 수 있다. 이 데이터는 아스파라고프시스를 오일로 추출하여 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물이 연장된 기간에 걸쳐 안정함을 입증한다. 특히, 이 데이터는 아스파라고프시스를 오일로 추출하여 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물 중의 생활성 BF의 수준이 연장된 기간에 걸쳐 안정함을 보여준다.

시간 경과에 따른 DBCM:IS 비율의 결과가 도 4 (온전한 바이오매스) 및 도 5 (균질화된 바이오매스)에 나타내어져 있다. DBCM이 65주 저장 기간 전반에 걸쳐 검출되었다. 중요하게도, 각 처리 (온전한 바이오매스 vs 균질화 바이오매스, 또는 4℃ vs 25℃ 저장) 내에서 DBCM:IS의 비율의 유의한 차이는 없었으며, 이것은 DBCM을 항-메탄생성제의 마커로서 사용하여 모든 샘플에 대해 탁월한 저장 수명을 입증하였다. 시간 경과에 따른 DBCM:IS 비율의 겉보기 '이득'은 분석적 분산 때문일 수 있다. 이 데이터는 아스파라고프시스를 오일로 추출하여 형성된 아스파라고프시스 오일 조성물 중의 DBCM 수준이 연장된 기간에 걸쳐 안정함을 입증한다.

도 6 및 7은 아스파라고프시스의 바이오매스로부터 오일로 생활성 제제인 DBA를 추출하여 아스파라고프시스 오일 조성물을 형성함을 입증한다.

상기 결과를 고려할 때, 정화된 오일 조성물 (즉 아스파라고프시스 바이오매스가 제거됨)은 4℃에서 적어도 1년 (65주) 및 실온 (25℃)에서 적어도 12주의 안정한 저장 수명을 가짐을 알 수 있다. 이와 달리, 물 추출물은 저장 온도에 관계없이 8주간 안정된 상태를 유지하다가 그 이후에는 분해되었다. 저장 배지 (수성 또는 유성)에 관계없이 낮은 온도에서 저장하면 더 긴 저장 수명을 제공할 것으로 예상되기 때문에, 이 결과는 놀랍다.

실시예 3: 오일로의 바이오매스 추출 최대화

최단 시간에 오일에서 검출된 가장 높은 농도의 생활성 물질 (브로모포름)을 제공한 실시예 1로부터의 추출 방법 (예를 들어, 오일에서 균질화 및 추출)을 사용하여 추출될 수 있는 아스파라고프시스 바이오매스의 최대량을 정량화하였다.

아스파라고프시스 탁시포르미스 (배우체 단계)는 Magnetic Island (QLD, Australia)로부터 수집하였다. 신선한 바이오매스를 블롯 건조시키고 다음 질량의 샘플을 100 mL의 식물유가 사전-충전된 별도의 250 mL 유리병에 수집하였다: 30.0 g, 60.0 g, 90.0 g, 및 120.0 g fw (각 양에 대해 n = 3). 모든 병은 안전하게 뚜껑을 닫고 추가 처리 및 분석을 위해 실험실로 즉시 수송하기 위해 얼음에 저장하였다. 블롯팅된 바이오매스 (30.0g fw)의 레플리케이트 샘플 (n = 3)을 또한 아래 실험 설계에 나타낸 바와 같이 건조 중량의 측정을 위해 수집하였다:

실험실에서, 바이오매스를 오일에서 균질화 (IKA ultra-turrax T-25)하고, 샘플은 상기한 바와 같이 브로모포름의 정량화 전에 24시간 동안 4℃에서 저장하였다.

도 8 및 9는 (동일한 용적의 오일에서) 상이한 양의 아스파라고프시스 바이오매스로부터 추출된 생활성 물질 (브로모포름)의 양을 보여준다. 도 8은 아스파라고프시스 바이오매스:오일 비율이 증가함에 따라 오일로 추출되는 생활성 물질의 양이 상응하게 증가함을 보여준다. 이 데이터는 아스파라고프시스의 바이오매스로부터 오일로의 생활성 물질, 브로모포름의 수준이 바이오매스 대 오일의 비율을 증가시킴으로써 증가됨을 입증한다.

더 높은 비율의 바이오매스:오일에서, 고체 불투명 겔이 형성되며 바이오매스를 오일에 완전히 균질화하는 것이 불가능하였다. 예를 들면, 90 g 또는 120 g의 균질화된 바이오매스가 100 ml의 오일로 균질화되었을 때 고체 불투명 겔이 형성되었다. 이러한 겔화는 GC/MS 분석을 위해 메탄올로 분배하는데 필요한 1 mL의 정화된 오일을 분리하는 것을 매우 힘들게 하였다.

겔을 포함하는 120g-처리로부터의 하위샘플을 원심분리 전에 가열 (1시간, 60℃, 수조)하였다. 이것은 가열되지 않은 샘플의 원심분리에 비해 오일에서 20% 더 높은 수율의 생활성 물질을 야기하였다 (도 8 및 9 참조). 아스파라고프시스는 전형적으로 수용성인 황산화 세포벽 다당류를 함유한다. 이론에 결부시키고자 함이 없이, 추출된 다당류, 오일, 및 바이오매스 위와 내부의 잔류 외부 및 내부 물 사이에 겔/에멀젼이 형성되었다고 상정된다. 더 높은 비율의 바이오매스:오일에서 많은 양의 다당류가 추출됨에 따라, 이것이 겔의 형성을 초래하였다. 겔이 생활성제 (예를 들어, 브로모포름)를 포함하는 것이 분명하며; 겔을 가열하면 브로모포름이 방출되고, 이것은 그후 아스파라고프시스 오일 조성물의 오일로 옮겨진다.

실시예 4: 아스파라고프시스 오일 조성물의 생체내 메탄 생산의 감소 시험 .

누공형성 거세소 (Bos indicus)를 생체내 먹이 시험에 사용하였다. 모든 동물은 실험 기간이 시작되기 전에 호흡실에서 누공형성되고 훈련된다. 초기에는 거세소를 4일 동안 그룹 군 (소 마당)에서 Flinders 목건초에 수용하였다. 이어서, 거세소를 두 그룹으로 나누고 처리군, 대조군 (Flinders 목건초 단독) 및 아스파라고프시스 오일 조성물 보충군에 할당하였다. 아스파라고프시스 오일 조성물의 용량 선택은 메탄 감소 가능성을 조사한 이전의 시험관내 연구로부터 수득된 결과를 기반으로 한다.

블롯 건조 아스파라고프시스의 생중량 대 건조 중량 비율은 10 (즉, 30 g fw = 3 g dw)이다. 유기물 (OM)의 함량이 dw의 80%라고 가정하면 (Machado et al., 2014), 시험된 바이오매스/오일 혼합물에서 아스파라고프시스로부터 기원한 OM의 해당 함량은 0.024 - 0.096 g OM.mL^-1 범위이다 (표 1):

표 1. 증가하는 비율에서 바이오매스/오일 혼합물 중의 아스파라고프시스 바이오매스로부터 기원하는 유기물의 함량, 및 0.1 - 3% OM 아스파라고프시스의 사료 당량의 용량에 필요한 용적^** .

** 이 용적은 바이오매스로부터 분리되는 오일을 기준으로 한다. 예를 들면, 120 g fw 해조류를 100 mL 오일에 첨가하면 혼합물의 최종 용적이 증가한다. 90% 물 (fw:dw 비율 10)이고, 계산의 용이성을 위해, 아스파라고프시스의 밀도가 물과 같다고 가정하면, 이에 따라 바이오매스:오일 혼합물의 용적이 첨가되는 바이오매스의 양에 따라 증가한다 (즉, 100 mL 오일 + 150 g fw 아스파라고프시스 = 15 g dw 아스파라고프시스에 상응하는 250 mL 혼합물 = 12 g OM 아스파라고프시스 / 250 mL = 0.048 g 아스파라고프시스 OM / mL 균질 혼합물).

위에 논의된 데이터에 기반하여, 바이오매스:오일의 비율이 150g fw:100mL를 능가하면, 균질한 혼합물이 형성되지 않을 수 있다. 1% OM 아스파라고프시스의 용량이 바이오매스:오일 비율 ≥ 120 g/100 mL에서 실용적이다. 0.2% OM 아스파라곱 시스의 용량이 생체내 동물에서 메탄생성을 억제하는데 효과적인 것으로 입증되었으며, 따라서 120g fw 바이오매스/100mL 오일 혼합물을 위해 100 g 사료에 단지 2.08 mL 용적의 오일 (또는 4.6 mL의 바이오매스/오일 혼합물)을 첨가할 필요가 있다.

반추 동물에게 투여되는 유기물의 원하는 % 수준에 상응하는 용량을 달성하기 위해 필요한 오일의 용적을 계산하기 위해, 본원에 기술된 아스파라고프시스 오일 조성물의 유기물 양 %를 정의된 용적의 적어도 하나의 오일과 접촉되는 아스파라고프시스 바이오매스의 생중량 (fw)으로부터 계산한다. 블롯 건조 아스파라고프시스의 생중량 대 건조 중량 (dw) 비율은 10 (즉, 30 g fw 3 g dw)이다. 이전 데이터에 기반하여 유기물 (OM)의 함량이 dw의 80%이라고 가정하여, 바이오매스/오일에서 아스파라고프시스로부터 기원하는 OM의 상응하는 함량을 계산할 수 있다. 예를 들면, 100 mL의 적어도 하나의 오일에 30 g 생중량 (fw) 아스파라고프시스 바이오매스를 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물은 0.024 아스파라고프시스 유기물/ mL에 해당한다. 원하는 요금 포함 수준이 100 g 사료에서 0.1% 아스파라고프시스 OM이면, 사료 100g 당 4.17 mL의 30 g fw/100 mL 아스파라고프시스 오일 조성물이 필요하다.

Flinders 목건초 및 물 공급을 자유롭게 섭취하게 하면서 연구 기지에서 개별 군으로 거세소를 할당한다. 아스파라고프시스 오일 조성물 보충하의 동물은 아스파라고프시스 오일 조성물의 완전한 섭취와 동물 간의 처리 섭취의 일관성을 보장하기 위해 아침 사료 전에 반추위에 직접 투여되거나, 상기한 바와 같이 사료에 아스파라고프시스 오일 조성물이 첨가된다. 48시간에 걸친 메탄 생산의 측정을 위해 개방-회로 호흡 실에 들어가기 전에 상이한 식이에 대한 14일의 적응 기간이 제공된다. 동물의 메탄 생산을 7, 14, 21 및/또는 29일의 처리 후 측정하여 시간 경과에 따른 동물의 메탄 생산 감소에 있어서의 아스파라고프시스 오일 조성물의 효능을 평가한다. 31일 후 아스파라고프시스 오일 조성물을 중단하고 동물을 작은 방목지에 재할당한다. 아스파라고프시스 오일 조성물을 반추위 내에 삽입한지 4시간 후 또는 급여 후 (예를 들어, 아스파라고프시스 오일 조성물 처리 1, 15, 22, 및 30일에) 반추위 샘플을 수집하여 VFA 생산 및 아세테이트 대 프로피오네이트 비율의 변화를 평가하였다. 생체중, 및 제공된 및 거부된 사료를 매일 측정하고 총 건조물 (DM) 섭취량과 총 유기물 (OM) 섭취량을 계산하여 평균 개별 DM 및 OM 섭취량을 결정한다. 시험된 모든 시점에서, 평균 메탄 생산량을 계산한다.

실시예 5: 양에서 아스파라고프시스 오일 조성물의 생체내 메탄 생산 감소 시험 .

방법론

Merino cross wether를 아스파라고프시스 오일 조성물의 일일 포함 비율 (유기물, OM 기준)에 기반하여 5개 그룹 중 하나에 할당한다 [0 (대조군), 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0%]. 포함 비율 (OM 섭취 %)은 표 1 및 실시예 4에 나타낸 계산을 사용하여 표시된 대로 계산한다.

양을 동물 사육 조건하에 유지시키고 연구 전반에 걸쳐 1.2 X 유지비로 곡물 짚을 조사료 성분 [회분, 72; 조 단백질 (CP) 112; 중성 세제 섬유 (aNDFom) 519; 산 세제 섬유 (ADFom) 338의 화학적 조성 (g/ kg DM), 코발트, 셀레늄 및 반추위 개질제는 없음]으로 하는 루핀, 귀리, 보리, 밀을 기본으로 하는 펠렛화 시판 발송자 식량을 공급받았다. 실험 기간이 시작되기 전에 모든 양에게 Co bullet을 투여한다.

으깬 루핀 200g (루핀 식이)과 분쇄된 재료를 혼합하여 처음 2주에 걸쳐 아스파라고프시스 오일 조성물에 양을 점차적으로 적응시킨다. 그후 아스파라고프시스 오일 조성물/루핀 혼합물을 펠렛화 식량에 첨가하고, 혼합하여 추가로 75 d 동안 공급한다.

사료 섭취량을 매일 기록하고, 시험 전반에 걸쳐 14 d 간격으로 생체중 (LW)을 측정한다.

개별 동물 메탄 생산량 (g/ kg DM 섭취량)에 대한 세 가지 측정을 수행하며, 첫 번째는 30 d 아스파라고프시스 오일 조성물 포함 후 수행한 다음 시험 기간 전반에 걸쳐 21 d 간격으로 수행하였다. Li (2013) [PhD thesis; Eremophila glabra reduced methane production in sheep, University of Western Australia]에 의해 기술된 바와 같이 개방 회로 호흡 실을 사용한 24시간 메탄 측정 동안 급여당 사료 (펠렛/루핀)는 1.0 X 유지비로 비례해서 감소되어 일정한 섭취를 보장한다.

각 메탄 측정 후, 휘발성 지방산 (VFA) 농도의 측정을 위해 위관에 의해 최대 50 mL의 반추위액을 수집한다.

통계 분석

통계 분석은 선형 혼합 모델을 각 반응 변수에 피팅하여 수행한다. 이 모델은 실험 설계 (특정 그룹 및 챔버에 동물 할당), 데이터의 구조 (반복 측정) 및 발생하는 결측 값을 설명할 수 있다. 혼합 모형에서 "고정 효과"는 처리 효과 (아스파라고프시스 탁시포르미스의 상이한 포함 비율), 시간 효과 (샘플링 일자), 처리와 시간의 상호작용, 및 임의의 공변량으로 구성되었다. 초기 생체중은 생체중을 분석할 때 공변량으로서 포함된다. 이것은 또한 다른 반응 변수에 대한 잠재적 공변량으로서 시험된다.

모델의 모든 다른 항에 대해 조정된, 처리 및 시간의 모든 조합에 대한 평균을 계산한다. 시간, 처리 및 이들의 상호작용의 전반적인 효과를 시험하기 위해 p-값을 계산한다. 평균 쌍을 비교하기 위해 최소 유의차 (P = 0.05)를 계산한다.

다음이 측정된다:

· 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하는 사료의 섭취량

· 생체내 분해된 건조물

· 동물 생체중

· 총 VFA 농도

· 이소-부티레이트를 제외한 (아세테이트, 프로피오네이트를 포함하는) 개별 VFA I의 몰 비율

· 메탄 방출 (g/ kg DM 섭취량)

Claims

(a) 아스파라고프시스(Asparagopsis)의 바이오매스(biomass)를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 오일을 제공하는 단계; 및
(c) 바이오매스로부터 적어도 하나의 생물활성제(bioactive agent)를 적어도 하나의 오일로 추출하기 위한 조건하에서 바이오매스를 적어도 하나의 오일과 접촉시켜 아스파라고프시스 오일 조성물을 형성하는 단계를 포함하여, 아스파라고프시스(Asparagopsis) 오일 조성물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)가 바이오매스를 적어도 하나의 오일에 균질화(homogenising)함을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c) 이후, 상기 적어도 하나의 오일로부터 상기 바이오매스를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 바이오매스 대 적어도 하나의 오일의 비율이 0.3 g:1 mL 이상, 0.6 g:1 mL 이상, 0.9 g:1 mL 이상 또는 1.2 g:1 mL 이상인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일의 기간 동안 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)가 약 4℃의 온도에서 수행되는 방법.
제3항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 오일로부터 상기 바이오매스를 분리하는 단계 이전에, 적어도 하나의 오일과 접촉된 바이오매스가 적어도 하나의 생물활성제를 포함하는 겔이 상기 적어도 하나의 생물활성제를 적어도 하나의 오일로 방출하도록 가열되는 방법.
제7항에 있어서, 적어도 하나의 오일과 접촉된 바이오매스가 60℃의 온도로 가열되는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 적어도 하나의 오일과 접촉된 바이오매스가 1시간의 기간 동안 가열되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 아스파라고프시스가 아스파라고프시스 탁시포르미스 및/또는 아스파라고프시스 아르마타인 방법.
제1항에 있어서, 아스파라고프시스의 바이오매스를 제공하는 단계가 바이오매스의 공기 건조를 포함하지 않는 방법.
제1항에 있어서, 아스파라고프시스의 바이오매스를 제공하는 단계가 바이오매스를 적어도 하나의 오일에 수집함을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 오일이 식용유(edible oil)를 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 식용유가 아몬드유, 살구유, 아르간유(argan oil), 아보카도유, 브라질 너트유(Brazil nut oil), 카놀라유, 캐슈유(cashew oil), 코코넛유, 평지유(colza oil), 옥수수유, 코프라유, 면실유, 디아실글리세롤유, 아마씨유, 자몽 종자유, 포도씨유, 헤이즐넛유, 대마유, 레몬유, 아마인유, 마카다미아유, 겨자유, 올리브유, 오렌지유, 팜유, 팜 핵유, 땅콩유, 피칸유, 잣유, 피스타치오유, 호박씨유, 평지씨유, 쌀겨유, 잇꽃유, 호마유(sesame oil), 대두유, 해바라기유, 호두유, 및 식물유, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 생물활성제가 브로모클로로아세트산 (BCA), 브로모포름 (BF), 디브로모아세트산 (DBA), 및 디브로모클로로메탄 (DBCM)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출된 적어도 하나의 생물활성제의 수준이 등가량의 바이오매스로부터 물로 추출된 적어도 하나의 생물활성제의 수준에 비해 증가되는 방법.
제1항에 있어서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출된 적어도 하나의 생물활성제의 수준이 25℃에서 12주 동안 저장 후 유의하게 감소되지 않는 방법.
제1항에 있어서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출된 적어도 하나의 생물활성제의 수준이 4℃에서 65주 동안 저장 후 유의하게 감소되지 않는 방법.
제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 생물활성제가 항-메탄생성제(anti-methanogenic agent)인 방법.
제19항에 있어서, 항-메탄생성제가 BF 및/또는 DBCM인 방법.
제19항에 있어서, 바이오매스로부터 적어도 하나의 오일로 추출된 항-메탄생성제의 수준이 25℃에서 65주 동안 저장 후 20% 이상 감소되지 않고, 여기서 적어도 하나의 항-메탄생성제가 BF 및/또는 DBCM인 방법.
제1항에 있어서, 아스파라고프시스 오일 조성물이 추출물 mL 당 적어도 0.1 mg의 브로모포름을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 아스파라고프시스 오일 조성물이 추출물 mL 당 적어도 1 mg의 브로모포름을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 아스파라고프시스 오일 조성물이 추출물 mL 당 적어도 2 mg의 브로모포름을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 아스파라고프시스 오일 조성물이 추출물 mL 당 적어도 3 mg의 브로모포름을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 아스파라고프시스 오일 조성물이 추출물 mL 당 적어도 4 mg의 브로모포름을 포함하는 방법.
제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 아스파라고프시스 오일 조성물.
적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 항-메탄생성제를 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 상기 아스파라고프시스가 아스파라고프시스 탁시포르미스 및/또는 아스파라고프시스 아르마타인 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 오일이 식용유를 포함하는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제30항에 있어서, 식용유가 아몬드유, 살구유, 아르간유, 아보카도유, 브라질 너트유, 카놀라유, 캐슈유, 코코넛유, 평지유, 옥수수유, 코프라유, 면실유, 디아실글리세롤유, 아마씨유, 자몽 종자유, 포도씨유, 헤이즐넛유, 대마유, 레몬유, 아마인유, 마카다미아유, 겨자유, 올리브유, 오렌지유, 팜유, 팜 핵유, 땅콩유, 피칸유, 잣유, 피스타치오유, 호박씨유, 평지씨유, 쌀겨유, 잇꽃유, 호마유, 대두유, 해바라기유, 호두유, 및 식물유, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제가 브로모클로로아세트산 (BCA), 브로모포름 (BF), 디브로모아세트산 (DBA), 및 디브로모클로로메탄 (DBCM)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준이 25℃에서 12주 동안 저장 후 유의하게 감소되지 않는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준이 4℃에서 65주 동안 저장 후 유의하게 감소되지 않는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제가 BF 및/또는 DBCM인 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준이 25℃에서 65주 동안 저장 후 20% 이상 감소되지 않고, 여기서 적어도 하나의 항-메탄생성제가 BF 및/또는 DBCM인 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제의 수준이 4℃ 또는 25℃에서 65주 동안 저장 후 50% 이상 감소되지 않고, 여기서 적어도 하나의 항-메탄생성제가 DBA인 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제가 추출물 mL 당 적어도 0.1 mg의 농도를 갖는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제가 추출물 mL 당 적어도 1 mg의 농도를 갖는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제가 추출물 mL 당 적어도 2 mg의 농도를 갖는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제가 추출물 mL 당 적어도 3 mg의 농도를 갖는 아스파라고프시스 오일 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 하나의 항-메탄생성제가 추출물 mL 당 적어도 4 mg의 농도를 갖는 아스파라고프시스 오일 조성물.
유효량의 제27항 또는 제28항에 따르는 아스파라고프시스 오일 조성물을 포함하는, 반추 동물(ruminant animal)에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키기 위한 사료 보충제(feed supplement).
제43항에 따르는 사료 보충제가 보충된, 반추 동물용 사료.
유효량의 제27항 또는 제28항에 따르는 아스파라고프시스 오일 조성물을 반추 동물에게 투여함을 포함하여, 반추 동물에서 총 가스 생산 및/또는 메탄 생산을 감소시키는 방법.
제45항에 있어서, 바람직한 휘발성 지방산의 유효 수준의 유지를 포함하는 방법.
제46항에 있어서, 바람직한 휘발성 지방산이 아세테이트 및 프로피오네이트를 포함하고, 여기서 유지가 아세테이트 대 프로피오네이트의 비율 감소를 포함하는 방법.
제45항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 분해되는 유기물(organic matter) 및/또는 건조물(dry matter)의 수준의 유지를 포함하는 방법.
제45항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 아스파라고프시스 오일 조성물이 반추 동물에게 투여되는 유기물의 적어도 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.067%에 해당하는 용량으로 투여되는 방법.
제45항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 반추 동물이 반추아목 (Ruminantia) 및 낙타아목 (Tylopoda)의 구성원으로부터 선택되는 방법.
제45항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 반추 동물이 소 또는 양인 방법.
제45항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 반추 동물이 소인 방법.