KR20210087924A

KR20210087924A - 연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물을 이용한 항염증, 항알러지용 또는 항산화용 조성물

Info

Publication number: KR20210087924A
Application number: KR1020210088601A
Authority: KR
Inventors: 정용환; 이종철; 이도승; 고미희; 함영민; 오유진; 최수진
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크; 더로터스 주식회사
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: KR102296348B1; KR20200078725A; KR102357619B1

Abstract

본 발명은 LPS로 염증 반응이 유발시킨 마우스 대식세포인 RAW264.7에서 항염증 활성을 보임과 함께 IgE로 활성화시킨 마우스 비만세포주 RBL-2H3(rat basophilic leukemia)에서 탈과립 억제 활성을 보이고 또한 항산화 활성을 가지는 연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물을 이용한 항염증 또는 항알러지용 조성물을 개시한다.

Description

연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물을 이용한 항염증, 항알러지용 또는 항산화용 조성물{Anti-inflammatory, Anti-allergic Anti-oxidative Composition Using an Extract of Nelumbo nucifera or Mallotus japonicus}

본 발명은 연꽃(Nelumbo nucifera) 추출물 또는 예덕나무(Mallotus japonicus) 추출물을 이용한 항염증, 항알러지용 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 조직의 손상을 비롯하여 외부의 물리적, 화학적 자극 및 다양한 감염원에 대한 방어 반응으로서 손상된 조직을 수복하고 재생하려는 기전이다(Zamora R et al., Mol. Med. 6: 347-373 (2000); Mariathasan S and Monack DM. Nat. Rev. Immunol. 7: 31-40 (2007); Lee HN et al., Korean J. Food Sci. Technol. 43: 65-71 (2011)). 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 지속적으로 또는 과도하게 발생된 만성 염증반응은 조직의 손상을 유발한다. 이러한 염증반응은 위, 대장, 방광 그리고 전립선암으로의 진행을 유도하며, 류마티스 관절염, 만성 감염 등 다양한 질환의 원인이 된다(Hofseth LJ and Ying L. Biochim. Biophys. Acta 1765: 74-84 (2006); Yun HY et al., Rev. Neurobiol. 10: 291-316 (1996); Stuehr DJ et al., P. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7773-7777 (1991)).

염증반응이 일어나면 대식세포와 단핵구 등 면역세포들은 nitric oxide(NO), prostagladin E2(PGE2), tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12 등의 염증 매개물질을 분비한다(Guha M and Mackman N. Cell Signal. 13: 85-94 (2001)). 염증반응의 대표적인 예로, pathogen associated molecular patterns(PAMPs)에 의한 대식세포의 toll like receptor(TLR) 신호전달체계 활성화를 들 수 있다. 그람 음성 세균의 외막(outer membrane)에 존재하는 엔도톡신(endotoxin)의 일종인 lipopolysaccharide(LPS)는, 외부 미생물에 존재하는 염증성 매개물질인 PAMPs에 속한다. 세균이 인체 내로 침투하는 경우, 대식세포 표면에서 TLR4는 MD-2 또는 CD14 등의 도움을 받아 LPS를 인식하며(Miyake K. Trends Microbiol. 12: 186-192 (2004)), 하위 신호전달체계의 활성화를 유도하며 궁극적으로 전사인자인 nuclear factor-κB(NF-κB)를 활성화한다(Youn HS. Korean. J. Food Sci. Technol. 39:481-487 (2007); Youn HS. Korean. J. Food Sci. Technol. 41: 477-482 (2009)). 핵으로 이동한 NF-κB는 염증성 cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12 등), inducible nitiric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)의 유전자 발현을 유도하며, iNOS에 의하여 발생된 산화질소(nitric oxide; NO)는 염증발생을 심화시킨다(Noh KH et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 40: 625-634 (2011); Weisz A et al., Biochem. J. 316: 209-215 (1996)). 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입힘으로써 염증과 암을 포함한 다양한 병리적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다(Gupta SC et al., Exp Biol Med., 236:658-671, (2011); Riehemann et al., FEBS Lett., 442:89-94(1999)).

염증의 치료제에는 이부프로펜과 같은 합성의약품, 항히스타민제, 스테로이드, 코티손, 면역억제제, 면역 항진제 등이 사용되고 있으나 치료효과가 일시적이거나 단순 증상완화, 과민반응, 면역체계 악화 등의 부작용이 많이 있고 염증의 근본적인 치료가 어렵다. 현재 항염증제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)도 장기간 복용하게되면 위장관 장애, 간 장애, 신 장애 등의 심각한 부작용을 야기한다고 알려져 있다(Rainsford KD., Subcell biochem., 42:3-27, 2007; Guruprasad P. Aithal.,Rheumatology., 7:139-150, 2011; Praveen P. N. Rao et al.,Pharmaceuticals., 3:1530-1549, 2010).

따라서 항염 활성을 가지면서 부작용이 적고 효과가 지속적인 새로운 약물의 개발이 요구되고 있으며 독성이 적은 천연물을 활용한 기술개발이 이루어지고 있다. 한국 등록특허 제101303198호에서는 도토리 추출물의 항염증 효과를 개시하고 있으며, 한국 등록특허 제100556524호에서는 동백 추출물, 한국 등록특허 제100536857호에서는 다래 추출물, 한국 등록특허 제101310980호에서는 구기자 추출물, 한국 등록특허 제101385768호에서는 어성초 추출물의 항염증 효과를 개시하는 등 천연물을 이용한 연구가 활발하게 이루어지고 있으나 상업적으로 유용한 물질의 개발은 요원한 실정이다.

한편 알러지는 외부에서 침입한 이물질 또는 외부 환경 자극에 의해 체내 면역계가 지나치게 이상반응하여 화분증, 두드러기, 비염, 천식, 아토피 등을 일으키는 것을 말한다. 다른 사람에게는 문제없는 물질이 특정인에게 알러지를 일으킬수 있다. 또한 외부 자극에 의해 일어나므로 환경성 질환으로 분류되기도 한다.

알러지 반응은 Ⅰ형 anaphylaxis형, Ⅱ형 세포용해형, Ⅲ형 면역복합체형, Ⅳ형 세포중개형, Ⅴ형 자극성 과민반응형의 5가지 유형으로 분류되는데, 대부분은 제Ⅰ형에 속하며, 일반적으로 알러지 반응이라 하면 제Ⅰ형과 동일한 의미로 사용된다(Roitt I et al. Immunology 6th eds. U.S.A.. Mosby. 323-383 (2001)).

비만세포(mast cell)나 호염기구(basophil)는 항원 자극에 의한 알러지 유발 염증성 매개체들의 분비를 통해 알러지 질환을 일으키는 주요한 세포로 알려져 있다(Blank, U. et al., Allergy 68(9):1093-101(2013); Schroeder JT. Adv Immunol 101:123-61(2009); Galli, S. J. New Eng. J. Med. 328:257-265(1993)). 제Ⅰ형 알러지는 음식, 집먼지, 진드기, 꽃가루 등의 특정한 항원에 의해 유도되는데, 항원에 인체가 노출되면 T-조력세포(T-helper cell)와 B 세포가 순차적으로 활성화되어 IgE가 생성된다. 구체적으로 생체에 침입한 알러지원은 항원제시세포에 의해 인지되며, 이 항원제시세포는 알러지원 제시를 통해 Th0 세포(T helper cell type 0)를 Th2 세포(T-helper cell type 2)로 분화시킨다. 이렇게 분화된 Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TNF-α과 같은 사이토카인을 분비하며, 이들은 골수에서의 산성백혈구 발달을 촉진시켜 염증이 발생한 조직으로 산성백혈구를 유도할 뿐만 아니라, B세포에 작용하여 IgE 항체의 생성을 유도한다.

이렇게 생성된 IgE는 비만세포 수용체(FcRIα)와 결합하여 복합체를 형성하는데, 동일한 항원에 재감작되어 IgE가 교차결합 하였을 때 비만세포가 활성화되어, 세포질 내의 칼슘이온(Ca++) 농도가 상승한다. 칼슘이온 농도의 상승은 세포막의 콜레스테롤이나 세포 골격계 등 여러 종류의 세포 내 조절인자에 작용하여 과립을 세포막에 이동시킴과 동시에 과립의 공포화, 과립 상호의 융합 및 과립과 세포막의 융합 등을 거쳐 탈과립을 일으킨다. 탈과립이 되면 히스타민, 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔(leukotriene), 세로토닌(serotonin), Th2 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-16, TNF-α이 분비되어 혈관확장, 혈관투과성 항진, 기관지 평활근의 수축 등의 알러지 반응이 일어나게 되고, Th2, 호산구, 호중구, 단핵구 등의 염증세포들이 활성화되어 염증반응이 일어나게 된다(Chang TW and Shiung YY. J Allergy Clin Immunol 117(6):1203-12 (2006); Abul K. et al., 세포분자면역학. 제6판. 서울:이퍼블릭. 191-217, 451-71 (2008);Schwartz LB et al., J Immunol. 126(4):1290-4 (1981); Toru H, et al., J Allergy Clin Immunol. 102(3):491-502(1998)).

현재 항알러지 약물로서는 항히스타민제(alkylamines, desloratadine 등), 비만세포 안정화제(cromoglycate 등), 류코트리엔 차단제(montelukast 등), 항-IgE 항체(Omalizumab) 등이 사용되고 있으나, 이러한 약물은 그 효과가 일시적인 경우가 대부분이고 부작용이 심한 경우도 많다. 따라서 알러지 질환의 예방 및 개선효과를 가지면서 부작용이 적고 효과가 지속적인 새로운 물질의 개발이 여전히 필요하다고 할 수 있으며, 독성이 적은 천연물을 활용한 기술개발이 이루어지고 있다.

생체 내 정상적인 세포대사과정에서 생성되거나 여러 환경오염 및 화학물질의 노출 등에 의해 생성되는 과산화 라디칼(superoxide radical, O₂ㆍ), 수산화 라디칼(hydroxyl radical, OHㆍ), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 단일체 산소(singlet oxygen, ¹O₂) 등을 총칭하여 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이라고 한다.

이들 활성 산소는 반응성 매우 커서 생체 분자들과 빠르게 반응하여 생체막의 지질 산화, 단백질 변성, DNA 손상 등을 초래하며, 암, 동맥경화증, 당뇨병, 자가면역질환, 노화, 뇌졸중, 파킨슨병 등 각종 질환의 발병 위험성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Chem. Res. 14: 393 (1981); Arch. Biophys. 247: 1-11 (1986); Science 221: 1256-1264 (1983)).

생명체는 지속적으로 발생하는 이러한 산화적 스트레스에 대응하기 위한 항산화 체계를 갖추고 있는데, 이러한 항산화 체계는 크게 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 카탈라아제, 글루타티온 퍼옥시다아제, 글루타티온 환원효소, 글루타티온 S-전이효소 등에 의한 효소적 체계와 식이에 의하여 섭취되는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 항산화 무기질 등의 항산화제에 의한 비효소적 체계로 구분된다(Annu. Rev. Nutr., 16, pp33-50 (1996)). 효소적 체계와 비효소적 체계는 상호 보완적으로 작용하여 생체에서 생성되는 산화성 물질을 무독화시킨다.

항산화제는 활성 산소와 반응함으로써 활성 산소에 의한 생체 손상을 억제하거나 최소화하는 것으로, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA, Butylated hydroxyanisole), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT, Butylated hydroxytoluene), 프로필 갈레이트(PG, Propyl galate), 터셔리부틸 하이드로퀴논(TBHQ, Teritiarybutyl hydroquinone) 등의 합성 항산화제와 엽록소, 녹차 추출물, 프로롤리스 추출물, 클로렐라, 비타민 E, 비타민 C, 스쿠알레, 플라보노이드, 대나무 잎 추출물 등의 천연 항산화제로 구분될 수 있는데, 합성 항산화제의 경우 발암 및 심혈관 계열에 부작용을 유발하는 것으로 알려지면서 보다 안전하고 뛰어난 효과를 가지는 식물 유래 항산화제에 관한 연구가 활발하게 수행되고 있다(Korean J. Food Sci. Technol. 34:889-892 (2002)).

최근 항산화 활성을 보이는 물질을 탐색하기 위한 항산화 활성 측정 기법으로서 TRAP 법(Anal Biochem., 28, pp300-306. 1989), DPPH 법(Nature 181:1198-1200 (1958)), ABTS 법(Methods Enzymol. 234: 279-293 (1994); Clin. Sci. 84: 407-412 (1993); Free Rad. Biol. Med. 20: 933-956 (1996)), ORAC 법(Free Rad. Biol. Med. 18:29-36 (1995)), TOSC 법(Free Rad. Biol. Med. 24(3):480-493 (1998); Toxicol. Appl. Pharmacol. 156(2):96-105 (1999)), Potassium ferricyanide 법(Jpn, J. of Nutr. 44:307-315, 1986), SOD 유사활성 측정법(Eur J Biochem 47:469-474, 1974) 등 다양한 방법이 개발되어 있다.

본 발명은 연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물의 항염증 활성과 항알러지 활성 그리고 항산화 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물을 이용한 항알러지용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물을 이용한 항산화용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은, 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 연꽃 추출물을 LPS로 염증 반응이 유발시킨 마우스 대식세포인 RAW264.7에 처리할 때 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보이고, 염증성 사이토카인인 IL-6 및 iNOS의 생성 억제 활성을 보이며 또한 IgE로 활성화시킨 마우스 비만세포주 RBL-2H3(rat basophilic leukemia)에 처리할 경우에는 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 생성 억제시켜 탈과립 억제 활성을 보임을 확인하였을 뿐만 아니라, 예덕나무 추출물과 혼합하여 처리할 경우, 연꽃 추출물 단독 처리로는 활성을 보이지 않던 IL-1β, iNOS 및 COX-2에 대해서도 그 생성 억제 활성을 보이며, 탈과립 억제 활성은 더욱 증가함을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 DPPH 법에 의하여 연꽃 잎 추출물 단독 그리고 예덕나무 껍질 추출물과의 혼합물이 항산화 활성을 가짐을 확인하였다.

본 발명자들은 나아가 연꽃 추출물 단독으로는 시험 균주인 그람음성균 세균과 그람양성균 세균 그리고 효모 모두에 대해 항미생물 활성이 없었지만 예덕나무 추출물과의 혼합물은 대부분의 세균 및 효모 등의 시험 균주에 대해 항미생물 활성을 보였으며, DPPH 라디칼 소거 활성을 통해 본 항산화 활성도 연꽃 추출물 단독의 경우보다 훨씬 높은 활성을 보임을 확인하였다.

본 발명은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 일 측면에 있어서 본 발명은 연꽃 추출물, 예덕나무 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 항염증용 조성물에 관한 것이고, 다른 측면에 있어서는 연꽃 추출물, 예덕나무 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 항알러지용(또는 항히스타민) 조성물에 관한 것이며, 또 다른 측면에 있어서는 예덕나무 추출물 또는 그것의 연꽃 추출물과의 혼합물을 유효성분으로 하는 항미생물 조성물에 관한 것이며, 또 다른 측면에 있어서는 연꽃 추출물, 예덕나무 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물"이란 추출 대상인 연꽃 또는 예덕나무의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 수피(껍질), 뿌리 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출 대상으로 연꽃 잎 또는 예덕나무 껍질을 사용하고 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매, 특히 60% 내지 90%의 에탄올 수용액으로 추출(침지 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로서 정의될 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유종, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

또 본 명세서에서, "항알러지"는 아래에서 정의되는 알러지 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 예방(발병 억제 또는 지연)을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "알러지 질환"은 비만세포의 탈과립 등 비만세포의 활성화가 매개된 알러지 반응으로 인하여 초래되는 병리적 증상을 의미하며, 이러한 알러지 질환에는 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천식(asthma), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 알러지성 접촉성 피부염(allergic contact dermatitis), 알러지성 각막염 등이 포함된다.

또 본 명세서에서, "항미생물"은 세균 또는 효모의 증식 억제 또는 사멸 유도를 포함하는 의미이다. 바람직하게는 상기 세균 또는 효모는 아래의 실험예에서 확인되듯이, 본 발명의 유효성분이 항미생물 활성을 보이는 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur)를 의미한다. 특히 본 발명의 항미생물 조성물은 여드름 유발균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대해 항균 활성을 보인다는 점에서 여드름 치료 또는 예방 등의 약제학적 조성물 또는 화장품 조성물로 제품화되어 사용될 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물, 항알러지용 조성물, 항미생물용 조성물 또는 항산화용 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성, 알러지성 질환의 개선 활성 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 염증성 질환, 알러지성 질환 등의 개선, 치료, 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 항염증 효과, 항알러지 효과의 상승·보강을 위하여 또는 피부 보호 활성(자외선에 의한 피부 손상 억제, 피부 보습 등) 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 건강기능식품공전상의 '관절염 개선' 기능성을 가진 MSM(dimethylsulfonylmethane), '관절염 개선' 기능성과 '피부 보습' 기능성을 가진 N-아세틸글루코사민 등과, 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '과민 면역반응 완화'로 개별적으로 기능성을 인정받은 Enterococcus faecalis 가열 처리 건조 분말, 구아바 잎 추출물 등의 복합물, 다래 추출물, 소엽 추출물, 피카오프레토 분말 등의 복합물, PLAG(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 등과, '과민피부상태 개선'으로 개별적으로 기능성을 인정받은 L. sakei Probio 65, 감마리놀렌산 함유 유지, 과채 유래 유산균인 L.plantarum CJLP133, 프로바이오틱스 ATP 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.

이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.

또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 의약외품 제제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있고, 의약외품 제제로 제제화할 경우 치약 등으로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 항염증용 조성물이 화장품 조성물로 파악될 경우 그 용도는 염증성 피부 트러블 억제, 염증성 피부 자극 완화 등의 용도로 이해될 수 있고, 본 발명의 항알러지용 조성물이 화장품 조성물로 파악될 경우 그 용도는 알러지성 피부 트러블 억제, 알러지성 피부 자극 완화 등의 용도로 이해될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 피부 트러블 개선, 아토피 피부염 개선 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다. 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 샴푸, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항염증 활성, 항알러지 활성을 나타내는 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 연꽃 추출물 또는 예덕나무 추출물을 이용한 항염증 또는 항알러지용 조성물을 제공할 수 있으며, 더불어 항미생물용 조성물과 항산화용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 약품, 식품, 화장품으로 제품화되어 사용될 수 있다.

도 1은 NO 생성 억제 활성과 세포독성 실험 결과이다.
도 2는 염증성 사이토카인 등의 생성 억제 활성 실험 결과이다.
도 3은 탈과립 억제 활성 실험 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 시료의 제조

연꽃의 잎과 예덕나무 껍질을 각각 건조 분쇄하여 20배 중량의 70% 에탄올에 침지시킨 후, 24시간 동안 실온에서 교반 시켜 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압 농축하고 동결건조하여 분말상의 추출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 연꽃 잎 추출물(NEN-70)과 연꽃 잎 추출물과 예덕나무 껍질 추출물을 동량으로 섞은 혼합물(MAJ-70)을 본 실험을 위한 시료로 사용하였다.

<실험예> 항염증 활성, 항알러지 활성, 항균 활성 및 항산화 활성 실험

<실험예 1> 항염증 활성 실험

1.1 세포 배양

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7을 구입하여, 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/mL), 및 streptomycin (100 g/mL)을 첨가하여 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.)에서 보관하였다. 이들 세포들은 37℃ 에서 95% air, 5% CO₂ 가습 공기 조건 하 포화 상태(subconfluence)에서 배양하였으며, 3일마다 계대배양하였다.

1.2 NO(Nitric oxide) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁴cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 분주하고, LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 염증 반응을 유도한 뒤 2시간 후 실시예를 시료를 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO^2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 L와 Griess 시약 100 L를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

결과를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하여 보면 실시예 시료는 모두 대체로 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함을 알 수 있다.

1.3 세포독성 평가 - LDH assay

RAW 264.7 세포 (1.5×10⁵ cells/mL)를 DMEM 배지에 시험 약물과 LPS (1 μg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) 활성을 non-radioactive cytotoxicity assay kit (progma, USA)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심분리하여 얻은 배양 배지 50 μL와 reconstituted substrate mix를 50 μL를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 μL의 stop solution을 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

결과를 도 1에 함께 나타내었다. 도 1을 참조하여 보면 실시예의 시료는 최고 처리농도 100 ㎍/mL에서도 특별히 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있다.

1.4 염증성 사이토카인 등의 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁴cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 분주하고, 24시간 후 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 염증 반응을 유도한 뒤 2시간 후 실시예를 시료를 처리하여 24시간 배양하였다.

그 후 세포를 PBS(Phosphate buffered saline)로 2번 세척 후 Trizol(Invitrogen)과 chloroform(Sigma)를 넣고 반응시켜 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 이용하여 정량 후 역전사 연쇄중합반응 키트인 Superscript kit(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 구체적으로 역전사 반응은 1 의 total RNA를 random hexamers (50ng), dNTP (1mM)을 넣고 65에서 5분간 반응시키고 10X RT buffer, 25mM MgCl_2,0.1M DTT, RNase OUT, Superscript 역전사 효소 (200U)로 25 10분, 50 50분, 85 5분 그리고 37 20분 동안 반응시켜 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 합성된 cDNA로부터 사이토카인과 COX-2, iNOS 유전자를 증폭시키기 위하여 Premix kit(Bioneer)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 1 cDNA, 1 l의 5'과 3' primer를 섞고 증류수로 전체를 20 로 맞춘 다음, 95 30초, 55 40초, 72 1분을 설정하여 30 cycle 반응시켰다. 사용된 프라이머 서열은 아래의 [표 1]과 같고 내부 표준물질로서 β-actin을 사용하였다. 반응 후 아가로오스 겔 상에서 발현량을 비교하고 정량화하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

프라이머

TNF-α	F: 5' CTGAGACAATGAACGCTACA 3'(서열번호 1)
	R: 5' TTCTTCCACATCTATGCCAC 3'(서열번호 2)
IL-6	F: 5' CACTTCACAAGTCGGAGGCTT 3'(서열번호 3)
	R: 5' GCAAGTGCATCATCGTTGTTC 3'(서열번호 4)
IL-1β	F: 5' CTTTGAAGAAGAGCCCATCC 3'(서열번호 5)
	R: 5' TTTGTCGTTGCTTGGTTCTC 3'(서열번호 6)
COX-2	F: 5' GTCAAAGACACTCAGGTAGA 3'(서열번호 7)
	R: 5' CTGTACTCCTGGTCTTCAAT 3'(서열번호 8)
iNOS	F: 5' GAGTTCGAGACTTCTGTGA 3'(서열번호 9)
	R: 5' GGCGATCTGGTAGTAGTG 3'(서열번호 10)
β-actin	F: 5' TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC 3'(서열번호 11)
	R: 5' TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG 3'(서열번호 12)

도 2를 참조하여 보면, 실시예의 시료는 모두 IL-6 억제 활성에 있어서는 농도 의존적으로 높은 활성을 보이고, 나머지 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-1β), COX-2와 iNOS 생성 억제 활성에 있어서 연꽃 잎 추출물(NEN-70)은 단독으로는 활성을 보이지 않거나(TNF-α,및 IL-1β) 활성을 보이는데(COX-2와 iNOS), 그것의 예덕나무 껍질 추출물과의 혼합물(MAJ-70)은 모든 염증성 인자들에 대해서 농도 의존적으로 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다.

<실험예 2> 항알러지 활성 실험 - β-hexosaminidase assay

RBL-2H3 세포주를 10% FBS(Fetal bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM(Dulbeccos' modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

RBL-2H3 세포주를 anti-DNP-BSA-IgE(0.5 ㎍/ml)로 활성화시킨 뒤, 실시예의 시료를 처리하고 안티젠(DNP-HSA) 200ng/㎖을 처리하고 20분 동안 배양하였다. 10분간 ice bath에 처리하여 반응을 정지시킨 후 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 002㎖의 상등액에 002㎖의 기질액 1mM p-NAG(pnitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)를 처리한 후, 이를 37℃, 5% CO₂에서 60분간 반응시킨 다음 01M Na₂CO₃/NaHCO₃ 02ml를 가하여 반응을 정지시켰다. 405 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 케토티펜(Ketotifen)은 양성 대조군으로 사용하였다.

도 3에서 확인되듯이, 실시예의 시료는 모두 대체로 농도 의존적으로 탈과립 억제 활성을 보이고,특히 혼합물(MAJ-70)이 더 높은 억제 활성을 보였다.

<실험예 3> 항미생물 활성 실험

본 실험에 사용한 균주는 아래의 표 2와 같다. 배지는 tryptic soy agar/broth(TSA/TSB; Difco 사, USA), gifu anaerobic medium agar/broth(GMA agar/broth; Nissui 사, Japan), yeast mold agar/broth(YM agar/broth; Difco 사, USA), nutrient agar(NA agar; Difco 사, USA)를 사용하였다.

항균력 측정은 Disc diffusion assay 방법을 응용하였으며, 각 균주는 10㎖의 액체배지에 접종하고 각 배양온도(37℃ 또는 30℃)에서 18시간씩 3회 계대배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였다.

각 시험균 농도를 0.5 McFarland로 10⁶~10⁸ CFU/mL(또는 625 nm에서의 O.D.값이 0.08~0.1이면 약 10⁸ CFU/mL) 되게 한 후 200 μL를 도말하여 균접종 평판배지를 만들어 사용하였다.

각 시료 40㎕를 paper disc(Whatman No.5, 8 ㎜)에 천천히 흡수 시킨 후, 용매를 완전히 증발시켰다. 균 접종 평판배지 표면에 disc를 부착하고 각 시험균의 최적온도(37℃ 또는 30℃)에서 1 또는 2일 배양한 후 disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, ㎜, 지름)의 크기를 측정하여 항균 활성 비교하였다. 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.

표 3을 참조하여 보면, 연꽃 잎 추출물(NEM-70)은 항균 활성을 보이지 않았으나 혼합물은(MAJ-70)은 거의 모든 시험 균주에 대해서 항균 활성을 나타내었다.

항균성 시험용 평판 배지 조제는 각각의 시험균 농도를 650nm에서 O.D값 0.4(10⁶cfu/)가 되게 한 후 pour-plate 방법에 따라 배지가 분주된 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 응고시켜 균접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 시료의 농도는 50%(v/v)로 사용하였으며, 각각의 시료는 멸균된 paper disc에 20㎕씩 천천히 흡수시킨 후, 용매를 완전히 증발시켰다. 시험용 평판배지 표면에 disc를 밀착시키고 각각의 배양온도에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 항균활성을 분석하였다. 양성대조군으로는 각각의 균주에 따른 항생제를 사용하였으며, 음성대조군으로는 추출물 희석시 사용한 50% EtOH을 사용하였다.

<실험예 4> 항산화 활성 실험

항산화활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma)를 이용하여 시료의 라디칼 소거 효과(radical scavenging effect)를 측정하는 Blois법을 활용하였다(Blois, 1958). DPPH 약 2 mg을 EtOH 15 mL에 녹여 DPPH용액을 제조하였다. 이 용액 12 mL에 DMSO 6.25 mL를 첨가한 후, 517 nm의 파장에서 대조군의 흡광도가 0.94~0.97이 되도록 EtOH로 희석하여 10초간 진탕시켰다. 그리고 용매 1 mL에 분말로 추출된 실시예 시료 1 mg을 섞은 후 충분히 녹이고, 준비된 DPPH 450 μL에 시료용액 50μL를 넣어 섞은 후 실온에서 10분간 방치하였다가 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 50% 라디칼 소거 활성에 해당하는 시료의 농도(IC₅₀, ㎍/ml)로 아래의 표 4에 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성(IC₅₀, ㎍/ml)

시료	IC₅₀
NEN-70	42.16
MAJ-70	23.55

상기 표 4의 결과는 연꽃 잎 추출물이 단독으로 사용될 때보다 예덕나무 껍질 추출물과 혼합으로 사용될 경우가 훨씬 높은 항산화 활성을 가짐을 보여준다.

Claims

연꽃 추출물, 예덕나무 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 항염증용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 연꽃 추출물은 연꽃 잎의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물이고,
상기 예덕나무 추출물은 예덕나무 껍질의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
연꽃 추출물, 예덕나무 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 항알러지용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 연꽃 추출물은 연꽃 잎의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물이고,
상기 예덕나무 추출물은 예덕나무 껍질의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
예덕나무 추출물 또는 그것의 연꽃 잎 추출물과의 혼합물을 유효성분으로 하는 항미생물용 조성물로서,
상기 항미생물은 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur)에 대한 항미생물 활성인 것을 특징으로 하는 조성물.