KR20210071019A

KR20210071019A - 변형된 MHC 클래스 II DRα1 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20210071019A
Application number: KR1020217012762A
Authority: KR
Inventors: 아서 바덴바크; 로베르토 메자-로메로; 할리나 오프너
Original assignee: 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티; 더 유나이티드 스테이츠 거번먼트 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 베테란스 어페어즈
Priority date: 2018-10-05
Filing date: 2019-10-04
Publication date: 2021-06-15
Also published as: EP3860644A1; JP2022504217A; AU2019355062A1; CN113164573B; CA3114446A1; WO2020072992A1; US11945855B2; CN113164573A; US20210380660A1; JP7511551B2

Abstract

변형된 DRα1 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시 양태에서, 폴리펩티드는 변형된 DRα1 도메인, 항원성 펩티드 및 선택적으로 링커 서열을 포함한다. 재조합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물, 상기 재조합 폴리펩티드 또는 약학적 조성물을 사용하여 염증성 질환을 치료하는 방법 및 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 컨스트럭트 또한 제공된다.

Description

변형된 MHC 클래스 II DRα1 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법

본 개시 내용은 재조합 치료 단백질, 특히 변형된 일부 MHC 분자 및 염증성 질환 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본 출원은 2018년 10 월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 62/741,941의 혜택을 주장하며, 이는 전체가 여기에 참조로 포함됩니다.

<정부 지원에 대한 인정>

이 발명은 국립 보건원에서 수여하는 보조금 번호 R42AI122574와 재향 군인 부에서 수여하는 보조금 번호 5 I01 BX000226-10 및 1IK6BX004209에 따라 정부의 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 이 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.

다발성 경화증 (Multiple sclerosis; MS)은 중추 신경계의 백색 및 회색 물질 모두에서 가장 일반적인 만성 염증 질환으로, 전 세계 약 2 백만 명 이상, 미국에서 최소 40만 명에 영향을 미친다 (GBD 2015 Neurological Disorders Collaborator Group, Lancet Neurol. 16 : 877-897, 2017). 다발성 경화증의 염증 과정은 종종 신경 퇴행성 손상을 동반하는 자가 면역 기반 탈수초화에 의해 매개된다. 현재 다발성 경화증에는 치료법이 없다. 따라서, 다발성 경화증 환자들은 질병 징후를 개선하기 위해 질병 수정 요법에 의존해야 한다 (Wingerchuk et al., Mayo Clin. Proc. 89:225-240, 2014). 다발성 경화증의 재발 및 완화 형태에 대해 약 15 가지 질병 수정 약물을 사용할 수 있다 (Reich et al., N. Engl. J. Med. 378 : 169-180, 2018). 그러나 다발성 경화증에 대한 치료법의 개선은 계속해서 필요하다.

본 명세서에는 변형된 MHC 클래스 II (major histocompatibility class II) DRα1 폴리펩티드가 개시된다. 이러한 변형된 DRα1 폴리펩티드는 CD74에 대한 친화력이 변화하고 분자의 구조에 뚜렷한 영향 없이 CD74에 결합하기 위해 대식세포 이동 억제 인자(macrophage migration inhibitory factor; MIF)와 경쟁할 수 있는 능력을 보인다.

일부 실시 양태에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 14에 상응하는 위치에 글루타민 잔기를 포함하는 MHC 클래스 II DRα1 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 개시된다 (일부 경우 L14Q 돌연변이 또는 DRα1-MOG-35-55 컨스트럭트 경우 L50Q로 지칭됨). 글루타민 잔기는 이 위치에서 천연 류신 잔기를 대체한다 (도 1). 일부 예에서, DRα1 도메인은 인간 DRα1 도메인이다. 재조합 DRα1 도메인의 서열은 일부 예에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.

다른 실시 양태에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 14에 대응하는 위치에 글루타민 잔기를 포함하는 DRα1 도메인, 항원성 펩티드, 및 선택적으로 링커 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 개시된다. 한 예에서, 링커 서열은 제 1 글리신-세린 스페이서, 트롬빈 절단 부위 및 제 2 글리신-세린 스페이서를 포함한다. 항원성 펩티드는 인간 또는 마우스 MOG-35-55와 같은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (myelin oligodendrocyte glycoprotein; MOG) 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.

또한 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4 내지 6을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 발현 컨스트럭트 (construct) 및/또는 벡터에 포함된다. 또한 발현 컨스트럭트 (construct) 또는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포주가 개시된다.

일부 실시 양태에서, 개시된 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 예를 들어 약학적으로 허용되는 담체 (carrier)와 함께 약학적 조성물에 포함된다. 일부 예에서, 조성물은 적어도 5 mg/kg의 재조합 폴리펩티드를 포함한다.

본 명세서에는 개시된 재조합 폴리 펩타이드 또는 약제학적 조성물 (예를 들어, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 폴리 펩타이드를 포함하는 조성물)을 염증성 장애를 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 장애를 치료하는 방법이 추가로 개시된다. 일부 예에서, 대상체는 다발성 경화증 (또는 그의 마우스 모델, EAE)을 갖는다.

본 개시의 전술한 특징 및 다른 특징은 첨부된 도면을 참조하여 진행되는 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 HLA 클래스 II α1 도메인 (서열번호: 7 내지 19)의 위치 18 (Q18, 화살표)에서 잔기를 보여주는 아미노산 서열 정렬이다. 이 잔기는 DM 및 DO 조절 분자 (DM and DO regulatory molecules)를 제시하는 비항원 (non-antigen)의 도메인을 포함하여 대부분의 인간 및 마우스 클래스 II α1 도메인에서 보존되어 있다. 그러나 DRα1은 이 위치에 류신 (L)이 있다. 이 잔기는 이 정렬에서 위치 18로 표시된다. 그러나 결정 구조 (crystal structure)에서 이 잔기는 위치 14에 있다.
도 2a 및 2b는 DRα1-hMOG-35-55, 인간 MHC 클래스 II DR- 유래 RTL302 (DRβ1501로부터의 인간 β1 도메인에 이어 인간 DRα1 도메인이 뒤 따름;이 RTL은 항원성 펩티드를 포함하지 않고 스페이서도 포함하지 않음), 인간 클래스 II DR-유래 RTL312 (인간 MOG-35-55 펩타이드,이어서 글리신-세린 스페이서, 트롬빈 절단 부위, 글리신-세린 스페이서, DRβ1501의 DRβ1 도메인 및 DRα1 도메인)의 결합을 보여준다. , 인간 클래스 II- 유래 DP2 컨스트럭트 (RTL600; 항원성 펩티드, 글리신-세린 스페이서, 트롬빈 절단 부위, 글리신-세린 스페이서, DPβ1 도메인 및 DPα1 도메인) 및 DP4 컨스트럭트 (RTL600; 항원성 펩티드, 글리신-세린 스페이서, 트롬빈 절단 부위, 글리신-세린 스페이서, DP4β1 도메인 및 DPα1 도메인)와 CD74의 결합을 나타낸 도이다. 또한, 마우스 MHC 클래스 II 유래 RTL551 (마우스 MOG-35-55, 글리신-세린 스페이서, 트롬빈 절단 부위, 글리신-세린 스페이서, IAb β1 도메인 및 IAb α1 도메인)와 코팅된 rhCD74 (coated rhCD74, C27S)의 결합이 테스트되었다. 결합 실험 (Binding experiment)은 각 단백질 리간드의 등몰 농도 (equimolar concentration, 250nm)를 사용하여 수행되었다.
도 2b는 야생형 버전과 비교하여 DRα1 돌연변이체의 부분 아미노산 서열을 보여주는 정렬을 나타낸 도이다. DRα1-hMOG-35-55 (인간 MOG-35-55 펩티드가 있는 DRα1; 서열번호 20) 및 DRhQ (글루타민 치환이 있는 DRα1-hMOG-35-55; 서열번호 21)에 더하여, DRα1-mMOG-35-55 (마우스 MOG-35-55 펩티드가 있는 DRα1; 서열번호 22) 및 DRmQ (글루타민 치환된 DRα1-mMOG-35-55; 서열번호 23)를 합성하였다. 화살표는 돌연변이 유발의 위치를 나타낸다. DRα1-hMOG 와 DRα1-mMOG는 위치 9 (P 대신 S)에서도 다르다.
도 3a는 DRα1-hMOG-35-55, DRα1-mMOG-35-55 및 DRhQ가 DR?1-hMOG-35-55 간의 면역학적 차이를 평가하기 위해 Fab G4로 프로브된 DRα1- 유래 컨스트럭트를 보여주는 그래프이다.
도 3b는 이차 구조 함량의 차이를 평가하기 위해 원편광 이색성 (Circular dichroism)을 사용한 도이다.
도 4a 내지 4c는 CD74에 대한 DRα1 결합 부위를 찾기 위해 설계된 전략을 보여주는 도이다.
도 4a는 CD74에 결합하는 영역(들)을 찾기 위해 중첩 펩티드 (전장 (서열 번호 24) 및 P1-P7, 각각 서열 번호 25 내지 31)를 보여주는 개략도이다. 마우스 CD74 (도 4b) 또는 마우스 H2M (도 4c)을 단백질 A/G 비드에 흡착된 특정 단일 클론 항체로 면역 침전시킨 다음, 중첩된 펩타이드 ( "모두") 또는 개별 펩타이드의 풀을 첨가하였다. 면역 복합체를 광범위하게 세척하고 결합된 펩타이드를 1 % SDS를 포함하는 전기 영동 샘플 버퍼로 용리하였다. 용출된 물질은 Tris-Tricine에서 SDS- 펩티드 겔에 의한 전기 영동에 의해 분석되었다. 그리고 나서 젤은 BioRad Molecular Imager FX에서 발형광단 (fluorophore)에 대해 스캔하였다.
도 5a-5c는 CD74 또는 Fab G5에 대한 P2 또는 P7 펩티드의 결합을 보여주는 일련의 패널이다. 펩티드 P2 및 P7은 각각 단백질 A/G 비드 및 단백질 L 비드에 흡착된 면역 침전된 마우스 CD74 또는 FabG4에 결합하는 능력에 대해 개별적으로 테스트되었다 (도 5a). P2만이 CD74와 Fab G4에 결합할 수 있었다. P7은 어떤 대상에도 결합할 수 없었다. DRα1-hMOG-35-55 폴리펩티드에서 P2 펩티드의 위치는 도 5b에 나타나 있다. 경쟁 실험 결과 DRα1-hMOG-35-55는 750 nM의 상대 친화도 (relative affinity, K_D)로 FITC-표지된 P2 펩티드 (FITC-labeled P2 peptide )와 면역 침전된 CD74 (immunoprecipitated CD74)의 결합을 능가할 수 있음을 보여주었다 (도 5c).
도 6a 및 6b는 rhCD74에 대한 컨스트럭트의 결합을 보여주는 그래프이다. 컨스트럭트 DRα1-hMOG-35-55 및 DRhQ는 결합 중에 ELISA 플레이트에서 G4 Fab가 있거나 없는 직접 결합 분석에 의해 rhCD74에 대한 직접 결합이 평가되었다 (도 6a). K_D 계산된 폴리펩티드는 DRα1-hMOG-35-55의 경우 0.65 μM이고 DRhQ의 경우 0.089 μM이다. 경쟁 실험에서, DRhQ는 DRα1-hMOG-35-55에 비해 CD74에 결합하는 rhMIF에 대해 더 높은 활성을 나타내었다 (도 6b).
도 7a 및 7b는 EAE 마우스에서 컨스트럭트의 효과를 보여주는 그래프이다. 8 내지 12 주령의 C57BL/6 WT 수컷 마우스를 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 면역화하였다. DRhQ 또는 DRα1-hMOG-35-55 단백질 (도 7a) 또는 DRα1-mMOG-35-55 또는 DRmQ (도 7b) (0.1ml 중 100μg)를 > 2.0의 EAE 점수에서 시작하여 5 일 동안 매일 마우스를 피하주사한 후, EAE의 임상 징후에 대해 점수를 매겼다 (상단 패널). 마우스 그룹에 대한 평균 EAE 점수 및 SD는 면역화 후 8 일부터 27 일까지 매일 계산되었고 전체 실험에 걸쳐 EAE 점수 곡선을 수치적으로 통합하여 각 마우스에 대해 합산되었다 (CDI, 총 질병 부하를 나타냄; 하단 패널).
도 8은 ERK 1/2 인산화 분석을 보여주는 도이다. EAE 마우스의 2 백만 개의 비장 세포 (splenocyte cell)를 비히클 (vehicle), DRhQ 또는 DRα1-hMOG-35-55로 30분 동안 처리한 다음 세포를 프로테아제 (protease) 및 포스파타제 (phosphatase) 억제제의 존재하에 용해시켰다. P-ERK 1/2 및 총 ERK 1/2 (T-ERK 1/2)를 평가하기 위해 상층액을 전기 영동 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. DRα1-hMOG (나타내지않음) 및 DRhQ는 시험관 내에서 ERK 1/2 인산화를 하향 조절할 수 있었다.
도 9a는 DRα1-hMOG-35-55 컨스트럭트에서 관련 아미노산 잔기의 위치를 나타내고 CD74와 접촉하는 도킹 모델에 의해 나타난 DRhQ의 카툰 렌더링 구조 모델 (cartoon-render structure model)이다. Q 잔기 사이드 체인 (side chain)은 위치 14에서 강조되었다. 항원성 MOG 펩티드는 밝은 회색으로 표시되고 MOG 펩티드에서 W3에 대한 사이트 체인이 표시되었다.
도 9b는 도 1에 기재된 분자로부터의 여러 α1 도메인을 보여준다 (Protein Data Bank에서 제공). PyMOL (Schrodinger, Portland OR)을 사용하여 β1-strand-loop-β-strand 영역을 정렬하였다. 위치 14는 막대로 강조 표시되었다. 도 1의 아미노산 잔기 번호와 도1의 결정 구조의 번호가 다르다는 점을 유의하라. 도 1의 Q18은 대부분의 결정 구조에서 아미노산 잔기 14에 해당하며 도메인의 β-스트랜드 1의 끝에 위치한다.
<서열번호>
본원 또는 첨부된 서열 목록에 나열된 모든 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R.§ 1.822에 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 염기 및 아미노산에 대한 표준 단일 문자 약어를 사용하여 표시된다. 적어도 일부 경우에, 각 핵산 서열의 한 가닥 만 표시되지만, 상보적 가닥은 표시된 가닥에 대한 참조에 의해 포함되는 것으로 이해된다.
서열번호 1은 L14Q 치환(밑줄)을 갖는 예시적인 인간 DRα1 폴리펩티드의 아미노산 서열이다:
IKEEHVIIQAEFYQNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITN
서열번호 2는 예시적인 DRhQ 폴리펩티드의 아미노산 서열이다. DRhQ는 항원성 펩티드 인간 MOG-35-55 (밑줄), 스페이서 (굵은체), 두 스페이서와 변형된 DRα1 도메인 (검은색 대문자 텍스트) 사이의 트롬빈 절단 부위 (대문자 이탤릭체)를 포함한다. DRα1 부분의 L14Q (L50Q) 돌연변이는 밑줄이 그어져 있다:
MEVGWYRPPFSRVVHLYRNGK GGGGS LVPR GSGGGGIKEEHVIIQAEFYQNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITN
서열번호 3은 예시적인 DRmQ 폴리펩티드의 아미노산 서열이다. DRmQ는 항원성 펩타이드 마우스 MOG-35-55 (밑줄), 스페이서 (굵은체), 두 스페이서와 변형된 DRα1 도메인 (검은색 대문자 텍스트) 사이의 트롬빈 절단 부위 (대문자 이탤릭체)를 포함한다. DRα1 부분의 L14Q (L50Q) 돌연변이에 밑줄이 그어져 있다:
MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK GGGGS LVPR GSGGGGIKEEHVIIQAEFYQNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITN
서열번호 4는 인간 L14Q DRα1을 코딩하는 예시적인 핵산이다. 돌연변이를 암호화하는 코돈에는 밑줄이 그어져 있다:
ATCAAAGAAGAACATGTGATCATCCAGGCCGAGTTCTATCAGAATCCTGACCAATCAGGCGAGTTTATGTTTGACTTTGATGGTGATGAGATTTTCCATGTGGATATGGCAAAGAAGGAGACGGTCTGGCGGCTTGAAGAATTTGGACGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGGTGCATTGGCCAACATAGCTGTGGACAAAGCCAACTTGGAAATCATGACAAAGCGCTCCAACTATACTCC
서열번호 5는 DRhQ를 암호화하는 예시적인 핵산이다. DRα1 부분에서 L14Q (L50Q) 돌연변이를 암호화하는 코돈에는 밑줄이 그어져 있다.
ATGGAAGTTGGTTGGTACCGTCCGCCGTTCTCCCGTGTTGTTCACCTGTACCGTAACGGTAAAGGAGGTGGAGGCTCACTAGTGCCCCGAGGCTCTGGAGGTGGAGGCATCAAAGAAGAACATGTGATCATCCAGGCCGAGTTCTATCAGAATCCTGACCAATCAGGCGAGTTTATGTTTGACTTTGATGGTGATGAGATTTTCCATGTGGATATGGCAAAGAAGGAGACGGTCTGGCGGCTTGAAGAATTTGGACGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGGTGCATTGGCCAACATAGCTGTGGACAAAGCCAACTTGGAAATCATGACAAAGCGCTCCAACTATACTCCGATCACCAATTAA
서열번호 6은 DRmQ를 암호화하는 예시적인 핵산이다. DRα1 부분에서 L14Q (L50Q) 돌연변이를 암호화하는 코돈에는 밑줄이 그어져 있다:
ATGGAAGTTGGTTGGTACCGTTCCCCGTTCTCCCGTGTTGTTCACCTGTACCGTAACGGTAAAGGAGGTGGAGGCTCACTAGTGCCCCGAGGCTCTGGAGGTGGAGGCATCAAAGAAGAACATGTGATCATCCAGGCCGAGTTCTATCAAAATCCTGACCAATCAGGCGAGTTTATGTTTGACTTTGATGGTGATGAGATTTTCCATGTGGATATGGCAAAGAAGGAGACGGTCTGGCGGCTTGAAGAATTTGGACGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGGTGCATTGGCCAACATAGCTGTGGACAAAGCCAACTTGGAAATCATGACAAAGCGCTCCAACTATACTCCGATCACCAATTAA
서열번호 7 내지 19는 인간 및 마우스 클래스 II α1 도메인이다.
서열번호 20 내지 23은 인간 및 마우스 DRα1-MOG-35-55 컨스트럭트이다.
서열번호 24 내지 31은 DRα1의 전장 및 P1-P7 펩티드이다.
서열번호 32 내지 64는 예시적인 항원성 펩티드이다.

MS와 실험적 자가 면역 뇌척수염 (experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE)의 두 동물 모델 및 MS 피험자 모두에서 여러 증거가 자가 면역 질환 과정에서 자가 반응성 (autoreactive) 미엘린 특이적 (myelin-specific) CD4+ T 세포의 역할을 뒷받침한다 (Steinman, Cell 85 : 299- 302, 1996; Zamvil et al., Annu. Rev. Immunol. 8 : 579-621, 1990; Chitnis, Int. Rev. Neurobiol. 79 : 43-72, 2007). MS의 초기 염증 단계를 만성 진행 단계로 유도하는 것으로 생각되는 주요 사이토카인은 최초로 기술된 사이토카인인 대식세포 이동 억제인자 (migration inhibitory factor ; MIF) 및 이의 조상 기능 동족체인 D-도파크롬 상호변이 효소 (D-dopachrome tautomerase; D-DT)이다 (Chitnis, Int. Neurobiol. 79 : 43-72, 2007). MIF 및 D-DT 수준이 증가는 MS의 임상 악화 마커 및 EAE의 질병 진행에 대한 요건과 관련이 있다 (Benedek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114 : E8421-E8429, 2017 ; Niino et al., J. Neurol. Sci. 179 (S1-2) : 127-131, 2000; Powell et al., J. Immunol. 175 : 5611-5614, 2005; Meza-Romero et al., J Immunol.192 : 4164-4173, 2014).

RTL1000이라 불리는 강력한 생물학적 치료와 2 세대 유도체인 DRα1-human (h) MOG-35-55는 MIF/D-DT 수용체인 CD74에 단단히 결합하고 인산화된 세포 외 신호 관련 키나제[phosphorylated extracellular signal-related kinases, (p) ERK 1/2]를 통한 MIF/D-DT와 하위신호의 결합을 경쟁적으로 억제함은 이전에 연구되었다 (Vandenbark et al., J. Immunol. 171:127-133, 2003; Benedek et al., J. Neuroinflammation 12:123, 2015). RTL1000 및 DRα1-hMOG-3-55는 임상 징후가 시작된 후 EAE로 마우스를 치료할 수 있으며, 결과적으로 T 세포 및 대식세포 활성화를 억제하고 중추 신경계로 이동하고 질병의 심각성을 감소시킨다 severity (Vandenbark et al., J. Immunol. 171:127-133, 2003; Benedek et al., Eur. J. Immunol. 43:1309-1321, 2013; Meza-Romero et al., J. Immunol. 192:4164-4173, 2014). RTL 치료는 또한 항염증성 대식세포/소교세포(microglia) 수를 향상시키고, 재수초화 (re-myelination)를 촉진하며, 급성 및 만성 EAE의 중증도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Meza-Romero et al., J. Immunol. 192:4164-4173, 2014).

본원에서, 본 발명자들은 CD74에 대한 컨스트럭트의 친화성을 변경하는 DRα1-hMOG-35-55 컨스트럭트 (DRhQ로 지칭)의 위치 50에서 류신에 대한 글루타민의 아미노산 치환 (L50Q)은 결합력은 8 내지 10배 증가시킴을 확인하였다. 이 치환 원편광 이색성 (circular dichroism) 및 항체 프로빙에 의해 평가된 분자의 구조에 영향을 미치지 않았으며, 결합 친화력이 증가하여 DRhQ가 동족 CD74 수용체에 대한 MIF 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 대응되는 것으로 해석되었다. DRhQ를 사용하여 WT C57BL/6 마우스를 치료하면 비장 세포에서 시험관 내 pERK 1/2 인산화를 배경 수준으로 감소시켰다. 마지막으로, L50Q 치환은 심각한 EAE의 지속적인 임상 징후를 치료하는 컨스트럭트의 능력을 크게 향상시켰다.

I. 용어

달리 명시되지 않는 한, 기술 용어는 일반적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 1994년 옥스퍼드 대학 출판부에서 출판한 Benjamin Lewin, Genes V, 켄드루 외 (Kendrew et al) (ISBN 0-19-854287-9) (eds.), 1994년 블랙웰 사이언스 Ltd의 분자생물학 백과사전 (ISBN 0-632-02182-9) 및 1995년 VCH에서 출판된 분자 생물학과 생명공학: 포괄적인 책상 참조자료 (ISBN 1-56081-569-8)에서 찾을 수 있다.

달리 설명되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본원이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 유사하게, "또는" 이라는 단어는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 "and"를 포함하도록 의도된다. 따라서 "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공됨을 이해해야 할 것이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시 내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기술된다.

본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 여기에 언급된 모든 GenBank 수탁 번호는 2018 년 10 월 5 일 GenBank에 있는 그대로 참조로 통합된다. 상충되는 경우 용어 설명을 포함하여 본 명세서가 우선한다. 또한 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

본 개시의 다양한 실시예의 검토를 용이하게 하기 위해, 특정 용어에 대한 다음 설명을 제공한다:

항원 (antigen): 동물에 주입되거나 흡수되는 조성물을 포함하여 동물의 항체 생성 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질. 항원은 이종 면역원에 의해 유도된 것을 포함하여 특정 체액성 또는 세포성 면역의 산물과 반응한다. 용어 "항원"은 모든 관련 항원성 에피토프 (antigenic epitope)를 포함한다. "에피토프 (Epitope)"또는 "항원 결정 인자 (antigenic determinant)" 또는 "항원 펩티드 (antigenic peptide)"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원상의 부위를 지칭한다. 한 구체 예에서, T 세포는 에피토프가 MHC 분자와 함께 제시될 때 에피토프에 반응한다. 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질의 3 차 폴딩에 의해 병치된 비연속 아미노산 모두에서 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출될 때 유지되는 반면 3 차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리할 때 손실된다. 에피토프는 일반적으로 고유한 공간 형태로 3 개 이상, 보다 일반적으로 8 개 이상의 아미노산 (예 : 약 8-50 또는 8-23 아미노산)을 포함한다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은 예를 들어 x- 선 결정학 (x-ray crystallography) 및 2 차원 핵 자기 공명 (two-dimensional nuclear magnetic resonance)을 포함한다.

항원은 조직 특이적 항원 또는 질병 특이적 항원일 수 있다. 조직 특이적 항원이 질병 특이적 항원일 수도 있기 때문에 이러한 용어는 배타적이지 않다. 조직 특이적 항원은 단일 조직과 같은 제한된 수의 조직에서 발현된다. 조직 특이적 항원은 중추 또는 말초 신경계에서 발현되는 항원과 같으나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 조직에 의해 발현될 수 있다.

CD74 : CD74 분자, 주요 조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex), 클래스 II 불변 사슬 (invariant chain) 또는 Ii라고도 한다. CD74는 항원 제시를 조절하는 샤페론 (chaperone)이다. 또한 대식세포 이동 억제 인자 (migration inhibitory factor; MIF)에 대한 세포 표면 수용체이기도 하다. CD74에 대한 핵산 및 단백질 서열은 공개되어 있다. 예를 들어, GenBank 수탁 번호 NM_001025158, NM_004355 및 NM_001025159는 예시적인 인간 CD74 핵산 서열을 개시하고, GenBank 수탁 번호 NP_001020329, NP_004346 및 NP_001020330은 예시적인 인간 CD74 아미노산 서열을 개시한다. 유사하게, GenBank 수탁 번호 NM_001042605 및 NM_010545는 예시적인 마우스 CD74 핵산 서열을 개시하고, GenBank 수탁 번호 NP_001036070 및 NP_034675는 예시적인 마우스 CD74 아미노산 서열을 개시한다. 이들 서열 각각은 2018 년 10 월 5 일 GenBank에 존재하는 바와 같이 본원에 참고로 포함된다.

대조군 : "대조군"은 실험 샘플과의 비교에 사용되는 샘플 또는 표준을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 대조군은 건강한 대상체 또는 건강한 대상체 집단으로부터 수득된 샘플이다. 다른 실시 양태에서, 대조군은 과거 대조군 또는 표준 참조 값 또는 값의 범위 (예를 들어, 이전에 테스트된 대조군 샘플, 예를 들어 기준선 또는 정상값, 예를 들어 건강한 대상체의 CD74 발현 또는 활성 수준)이다. 추가의 예에서, 대조군은 치료 전 대상체로부터 나온 것이다 (예를 들어, MHC 클래스 II β1α1 폴리펩티드 또는 MHC 클래스 II α1 도메인 폴리펩티드로 치료하기 전에 CD74 발현 또는 활성 수준).

도메인 : 특정 기능과 동일시 될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 분리된 부분. 예를 들어, MHC 클래스 II 분자를 구성하는 α 및 β 폴리펩티드는 각각 두 개의 도메인인 α1, α2 및 β1, β2를 갖는 것으로 인식된다. 다양한 도메인은 일반적으로 아미노산 서열을 연결하여 결합된다. 한 구체 예에서, 전체 도메인 서열은 링커 또는 인접 도메인의 전부 또는 일부를 포함하도록 서열을 확장함으로써 재조합 분자에 포함된다. 예를 들어, MHC 클래스 II 분자의 α1 도메인을 선택할 때, 선택된 서열은 α 사슬의 아미노산 잔기 번호 1에서 전체 α1 도메인을 통해 α1 도메인의 카르복시 말단에 있는 아미노산 84까지 확장될 수 있다. 다양한 MHC 분자 도메인의 정확한 아미노산 수는 포유 동물의 종과 종 내의 유전자 부류에 따라 다르다. 재조합 분자에서 사용하기 위한 서열의 선택은 아미노산 수에 기반한 정확한 구조적 정의보다는 도메인 기능의 유지를 필요로 한다. 당업자는 선택된 도메인의 전체 아미노산 서열보다 다소 적은 양이 이용되더라도 도메인 기능이 유지될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, α1 도메인의 아미노 또는 카르복시 말단에 있는 다수의 아미노산은 도메인 기능에 영향을 주지 않고 생략될 수 있다. 특정 선택된 도메인의 기능적 활성은 본 개시 내용에 의해 제공된 MHC 클래스 II 폴리펩티드 (예를 들어, α1 폴리펩티드), 예를 들어 T 세포 증식 및/또는 CD74 결합 분석의 맥락에서 평가될 수 있다.

유효량 : 진행을 억제하거나 질병 또는 상태의 회귀를 유발하거나 질병 또는 상태로 인한 증상을 완화할 수있는 특정 화합물의 용량 또는 양. 예를 들어, 이것은 염증 및/또는 자가 면역 장애와 같은 장애를 치료하거나 억제하는 데 필요한 개시된 MHC 분자의 양 또는 용량일 수 있다. 한 실시 양태에서, 유효량은 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 염증 또는 자가 면역 장애 또는 다른 질환 또는 장애를 치료하거나 억제하는 것과 같이 대상체에서 원하는 반응을 유도하는 양이다.

염증 (Inflammation) : 염증 인자를 격리하는 역할을 하는 조직 손상에 의해 유발되는 국부적인 보호 반응. 염증은 병원체, 손상된 세포 또는 자극제와 같은 유해한 자극에 대한 혈관 조직의 복잡한 생물학적 반응에 의해 조정된다. 조직의 치유 과정을 시작하는 것은 물론 유해한 자극을 제거하려는 유기체의 보호 시도이다. 염증 반응은 염증 부위에 전신 또는 국소적으로 백혈구가 축적되는 것을 특징으로한다. 염증 반응은 백혈구 수, 다형 핵 호중구 (polymorphonuclear neutrophils; PMN) 수, 내강 강화 화학 발광 (luminal enhanced chemiluminescence)과 같은 PMN 활성화 정도, 또는 사이토 카인의 양으로 측정한다.

1차 염증 장애는 염증 자체에 의해 발생하는 장애이다. 2 차 염증 장애는 다른 장애의 결과인 염증이다. 염증은 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 염증성 폐질환 [inflammatory lung disease, 만성 폐색성 폐질환 포함)], 염증성 장질환 [inflammatory bowel disease (궤양성 대장염 및 크론병 포함)], 치주 질환 (periodontal disease), 류마티스성 다발 근통 (polymyalgia rheumatica), 죽상 동맥경화증 (atherosclerosis), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's Syndrome), 천식 (asthma), 알레르기성 비염 (allergic rhinitis) 및 피부 질환 (피부 근염 및 건선 포함) 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 다수의 염증성 질환으로 이어질 수 있다. 염증성 성분 (다발성 경화증을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 포함하는 자가 면역 질환도 염증성 질환으로 간주된다.

질병 억제 또는 치료 : 질병 "억제"는 예를 들어 염증성 또는 자가 면역 장애와 같은 질병의 소인이 있는 것으로 알려진 사람에서 질병의 완전한 발달을 억제하는 것을 의미한다. 질병의 억제는 예를 들어 질병 또는 장애가 있거나 질병 또는 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서 부분적 억제에서 질병의 실질적인 완전한 억제에 이르는 범위에 걸쳐있을 수 있다. 일부 예에서, 용어 "억제하는"은 질병의 발병 또는 진행을 감소시키거나 지연시키는 것을 지칭한다. 질병 "치료"는 염증 또는 자가 면역 장애의 징후 또는 증상과 같은 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 의미한다. 질병 또는 장애를 억제 또는 치료하기 위해 유효량의 약학적 화합물이 투여되는 대상체는 이러한 장애에 대한 표준 진단 기술, 예를 들어, 증상, 가족력의 기초 또는 질병이나 장애를 발생시키기 위한 위험 인자에 의해 확인될 수 있다.

링커 : 두 분자 (예 : 두 개의 폴리펩티드)를 공유적으로 연결하는 분자. 링커 (예 : 펩티드 링커 또는 화학적 링커)는 예를 들어 α1 도메인과 항원성 펩티드 사이에 본 개시 내용의 재조합 MHC 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 일반적으로 길이가 2 개 내지 25 개 아미노산인 펩티드 링커 서열 (예 : 5-10, 10-15, 15-20 또는 20-25 개 아미노산)은 Chaudhary et al.에 의해 알려진 글리신(4)-세린 스페이서 (Nature 339 : 394-397, 1989)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유사하게, 화학적 링커 [예 : 티올 결합 (thiol bond) 또는 가교제 (crosslinking)]도 사용할 수 있다.

MHC 클래스 II : MHC 클래스 II 분자는 두 개의 비공유 결합 단백질인 α 사슬과 β 사슬로 형성된다. α 사슬은 α1 및 α2 도메인을 포함하고 β 사슬은 β1 및 β2 도메인을 포함한다. 항원이 맞는 틈새 (cleft)는 α1과 β1 도메인의 상호 작용에 의해 형성된다. α2 및 β2 도메인은 α 및 β 사슬을 APC의 세포막에 고정시키는 막 횡단 Ig- 폴드 유사 도메인 (transmembrane Ig-fold like domains)이다. MHC 클래스 II 복합체는 항원과 관련이 있을 때 (적절한 공동 자극 신호가 있는 경우) CD4 T 세포를 자극한다. CD4 T 세포의 주요 기능은 염증 반응을 시작하고 면역계의 다른 세포를 조절하며 항체 합성을 위해 B 세포에 도움을 제공하는 것이다.

약학적으로 허용되는 담체 : Remington : The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21st 30 Edition (2005)에서 여기에 개시된 단백질의 제약적 전달에 적합한 구성과 제형을 설명한다.

재조합 : 재조합 핵산 또는 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는 서열을 가지고 있거나 또는 두 개 이상의 다른 분리된 서열 세그먼트 (segment)의 인공 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이러한 인공적인 조합은 종종 화학적 합성 또는 유전 공학 기술과 같은 핵산의 분리된 부분을 인공적으로 조작하여 수행된다.

서열 동일성 (Sequence identity): 2 개의 핵산 서열 또는 2 개의 아미노산 서열 간의 유사성은 서열 간의 유사성 (similarity)으로 표현되며, 그렇지 않으면 서열 동일성이라고도 한다. 서열 동일성은 자주 동일성 (또는 유사성 또는 상 동성)의 관점에서 측정된다. 백분율이 높을수록 두 서열이 더 유사하다. 상당한 양의 서열 동일성을 갖고 서로 동일하거나 유사하게 기능하는 폴리펩티드 또는 이의 도메인 (예 : 다른 종의 동일한 단백질)을 '상동체 (homolog)'라고 부를 수 있다.

비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 알려져있다: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Higgins & Sharp, Comput. Appl. Biosci. 5: 151-153, 1989; Corpet et al., Nucl. Acids Res. 16, 10881-90, 1988; Huang et al., Comput. Appl. Biosci. 8, 155-65, 1992; and Pearson, Methods Mol. Biol. 24:307-331, 1994. Altschul 등 (J. Mol. Biol. 215 : 403-410, 1990)은 서열 정렬 방법 및 상 동성 계산에 대한 자세한 고려 사항을 제시한다. NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)는 National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷을 포함한 여러 소스에서 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용할 수 있다.

그럼에도 불구하고 높은 수준의 서열 동일성을 나타내지 않는 핵산 서열은 유전 코드의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해 유사한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 핵산 서열의 변화는 모두 실질적으로 동일한 단백질을 코딩하는 다중 핵산 분자를 생성하기 위해 이러한 축퇴를 사용하여 이루어질 수 있음이 이해된다.

대상체 : 살아있는 다세포 척추 동물 유기체, 인간 및 비인간 포유류를 모두 포함하는 범주.

II. DRα 도메인

본원에는 MHC 클래스 II DRα1 도메인 또는 이의 단편을 포함하고 MHC 클래스 II α2, β1 또는 β2 도메인을 포함하지 않고, 서열번호 1의 아미노산 14에 해당하는 아미노산 위치에 존재하는 류신 (L)에 대한 글루타민 (Q)의 치환을 포함하는 분리된 재조합 폴리펩티드가 개시된다. 포유류 MHC 클래스 II DRα 사슬 단백질의 아미노산 서열 및 이들 단백질을 코딩하는 핵산은 당업계에 잘 알려져 있으며 GenBank를 포함한 수많은 공급원에서 이용 가능하다. 예시적인 서열은 Das 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 3543-3547, 1983) (인간 HLA DRα)에 제공되어 있고 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 인간 DRα 폴리펩티드는 GenBank 수탁 번호 NP_061984 (2018 년 10 월 5 일에 GenBank에 존재하는 바와 같이 본원에 참고로 포함)이다. 추가 MHC 클래스 II DRα 폴리펩티드는 당업자에 의해, 예를 들어 IMGT/HLA 데이터베이스 (월드 와이드 웹 (ebi.ac.uk/imgt/hla/)에서 이용 가능)와 같은 공용 데이터베이스로부터 식별될 수 있다.

특정 구체 예에서, MHC 클래스 II α1 도메인은 인간 HLA-DRA 폴리펩티드이다. α1 도메인은 포유류 MHC 클래스 II α 사슬 단백질에 잘 정의되어 있다. 일부 예에서, MHC 클래스 II α 사슬은 성숙한 α 폴리펩티드를 생산하기 위해 단백질 분해적으로 (proteolytically) 제거된 폴리펩티드를 트래피킹 (trafficking)하는 데 관여하는 리더 서열을 포함한다.

α1 도메인은 성숙 α 사슬의 약 1 내지 90 아미노산 잔기를 포함할 수 있지만, 당업자는 이 도메인의 C- 말단 컷오프가 반드시 정확하게 정의되지는 않음을 인식할 것이며, 예를 들어, 성숙한 α 사슬의 아미노산 잔기 70 내지 100 사이의 어느 지점에서나 발생할 수 있다. 일부 예에서, α1 도메인은 성숙한 MHC 클래스 II DRα 도메인의 아미노산 1 내지 70, 1 내지 71, 1 내지 72, 1 내지 73, 1-74, 1 내지 75, 1 내지 76, 1 내지 77, 1 내지 78, 1 내지 79, 1 내지 80, 1 내지 81, 1 내지 82, 1 내지 83, 1 내지 84, 1 내지 85, 1 내지 86, 1 내지 87, 1 내지 88, 1 내지 89, 1 내지 90, 1 내지 91, 1 내지 92, 1 내지 93, 1 내지 94, 1 내지 95, 1 내지 96, 1 내지 97, 1 내지 98, 1 내지 99 또는 1 내지 100을 포함한다. 다른 예에서, α1 도메인은 전장 DR α1 폴리펩티드의 약 20 내지 120 잔기 (예를 들어 약 20 내지 110, 24 내지 110, 24 내지 109, 25 내지 100, 25 내지 109, 26 내지 110, 26 내지 109, 30 내지 120, 32 내지 120, 32 내지 115, 26 내지 90, 26 내지 85, 26 내지 84 잔기 또는 다른 중첩된 영역 잔기)를 포함한다. 일부 예에서, DRα1 도메인은 N- 말단 메티오닌을 포함하지 않으며; 그러나, N- 말단 메티오닌은 예를 들어 박테리아, 효모 또는 포유 동물 시스템에서의 발현의 결과로 존재할 수 있다.

추가 예에서, DRα1 도메인은 5'- 및/또는 3'- 말단에서 몇 개의 아미노산의 결실 또는 추가, 예를 들어 약 1 내지 25 개 아미노산의 추가 또는 결실, 예를 들어 5'- 또는 3'- 말단 또는 이들의 조합으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개 아미노산의 추가 또는 결실을 포함할 수 있다 (예를 들어, 한쪽 말단에서 결실 및 다른 말단에 첨가). α1 도메인의 구성은 또한 포유류 종과 문제의 특정 α 사슬에 따라 이러한 매개 변수 외부에서 달라질 수 있다. 당업자는 아미노산 서열의 정확한 수치 파라미터 (parameter)가 도메인 기능의 유지 (예를 들어, CD74 결합 또는 하향 조절)보다 덜 중요하다는 것을 인식할 것이다.

일부 실시 양태에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 14에 상응하는 위치에 글루타민 잔기를 포함하는 DRα1 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 개시된다. 재조합 폴리펩티드는 MHC 클래스 II α2, β1, 또는 β2 도메인을 포함하지 않는다. 일부 예에서, 재조합 DRα1 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 추가 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 이의 단편과 적어도 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.

예를 들어, DRα1 폴리펩티드는 아미노산 서열이 서열번호 1 또는 이의 단편과 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 아미노산 서열의 서열번호 1의 상동체 (homolog) 또는 이종상동체 (ortholog)일 수 있다. 예시적인 서열은 월드 와이드 웹에서 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 프로그램 및 본원에 제시된 아미노산 서열을 사용하여 얻을 수 있다. 일부 예에서, 상동체는 변경된 2 차 구조, CD74에 대한 결합 및/또는 마우스에서 EAE 억제와 같은 서열번호 1의 폴리펩티드의 기능을 유지한다.

다른 실시 양태에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 14에 상응하는 위치에 글루타민 잔기를 포함하는 DRα1 도메인 또는 그의 단편 및 항원성 펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드가 개시된다. 재조합 폴리펩티드는 MHC 클래스 II α2, β1 또는 β2 도메인을 포함하지 않는다. 일부 예에서, 재조합 폴리펩티드는 링커 (예를 들어, DRα1 폴리펩티드와 항원성 펩티드 사이의 링커)를 추가로 포함한다. 링커는 펩티드 링커 또는 화학적 링커 (예 : 화학적 가교제)일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 항원성 펩티드는 인간 또는 마우스 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질 (myelin oligodendrocyte glycoprotein; MOG) 35-55이다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 추가 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 이들의 단편과 적어도 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일한 서열을 갖는다. 예를 들면, 폴리펩티드의 DRα1 부분은 아미노산 서열이 서열번호 1 또는 이의 단편과 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 서열번호 1의 상 동체 또는 이종상동체일 수 있다. 예시적인 서열은 월드 와이드 웹에서 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 프로그램 및 본원에 제시된 아미노산 서열을 사용하여 얻을 수 있다. 일부 예에서, 폴리펩티드는 변경된 2 차 구조, CD74에 대한 결합 및/또는 마우스에서 EAE 억제와 같은 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 폴리펩티드의 기능을 보유한다. 폴리펩티드에 포함될 수 있는 추가 항원성 펩티드는 아래에서 논의된다.

재조합 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 1 내지 3)의 사소한 변형은 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를 초래할 수 있다 (예를 들어, 서열번호 1 내지 3과 비교하여). 이러한 변형은 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 의도적일 수 있거나 자발적일 수 있다. 이러한 변형에 의해 생성된 모든 폴리펩티드가 여기에 포함된다. 따라서, MHC 클래스 II DRα1 폴리펩티드의 구체적이고 비제한적인 예는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 보존적 변이체이다 (예 : 보존적 아미노산 치환, 예를 들어 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어 1 내지 10 개의 보존적 치환, 2 내지 5 개의 보존적 치환, 4 내지 9 개의 보존적 치환, 예컨대 1, 2, 5 또는 10 개의 보존적 치환).

개시된 재조합 DRα1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 (예를 들어, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나를 암호화) 및/또는 이의 임의의 상동체 또는 변이체는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭과 같은 표준 접근법에 의해 생성될 수 있다. 일부 예에서, 재조합 폴리펩티드는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산에 의해 암호화된다. 추가 구현 예에서, 핵산은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나 또는 그것의 단편과 적어도 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는다.

일부 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 1 내지 3)는 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 컨스트럭트 (예를 들어, 서열번호 4 내지 6 중 임의의 하나를 포함하는 핵산 컨스트럭트)로부터의 원핵 또는 진핵 세포에서 발현 될 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 컨스트럭트 (예 : 발현 컨스트럭트)는 또한 프로모터, 인핸서 및/또는 3 '조절 영역과 같은 조절 요소를 포함 할 수 있으며, 그 선택은 단백질이 발현되는 세포의 유형에 따라 결정된다. 컨스트럭트는 선택된 세포 유형에서 재조합 폴리펩티드를 발현하기에 적합한 벡터에 도입된다.

폴리펩티드의 발현 및 정제를 위해 수많은 원핵 및 진핵 시스템이 알려져있다. 예를 들어, 강하고 조절된 프로모터 및 효율적인 리보솜 결합 부위를 폴리펩티드 암호화 컨스트럭트의 상류 (upstream)에 배치함으로써 이종성 (heterologous) 폴리펩티드를 원핵 세포에서 생산할 수 있다. 적합한 프로모터 서열은 베타-락타 마제 (beta-lactamase), 트립토판 (trp), 파지 T7 (phage T7) 및 람다 P_L 프로모터 (lambda P_L promoters)를 포함한다. 박테리아 또는 포유류 세포에서 이종성 단백질을 생산하기 위한 방법 및 플라스미드 벡터는 Sambrook 등 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Sambrook 등 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001); Ausubel 등 (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 및 2000의 참고자료); Ausubel 등 (., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999)에 나타나 있다.

다량의 단백질 발현에 적합한 원핵 세포는 대장균 (Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 포함한다. 종종 높은 수준으로 발현된 단백질은 불용성 봉입체 (inclusion bodies)에서 발견된다. 이러한 응집체로부터 단백질을 추출하는 방법은 예를 들어 Sambrook 등 (2001, 15 장 참조)에 나타나있다. 원핵 세포에서 재조합 폴리펩티드의 재조합 발현은 융합 단백질의 최적 발현 및 정제를 위해 설계된 상용 시스템 (commercial system)을 사용하여 편리하게 얻을 수 있다. 이러한 융합 단백질은 일반적으로 정제를 촉진하는 태그를 포함한다. 그러한 시스템의 예는 다음을 포함한다 : pMAL 단백질 융합 및 정제 시스템 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA); GST 유전자 융합 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ); 및 pTrcHis 발현 벡터 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 추가 시스템에는 His6- 태그 (예 : Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 또는 스트렙타비딘 결합 펩티드 (예 : Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)가 포함된다. 예를 들어, pMAL 발현 시스템은 발현 된 단백질에 말토오스 결합 단백질을 추가하는 벡터를 사용한다. 융합 단백질은 E. coli에서 발현된다. 융합 단백질은 아밀로스 컬럼을 사용하여 조 세포 추출물로부터 정제된다. 필요한 경우, 말토오스 결합 단백질 도메인은 인자 Xa와 같은 적절한 프로테아제로 처리하여 융합 단백질로부터 절단될 수 있다. 이어서, 말토오스 결합 단편은 제 2 아밀로스 칼럼을 통과하여 제제로부터 제거될 수 있다.

재조합 폴리펩티드는 또한 Invitrogen (Carlsbad, CA)에 의해 생산된 Pichia pastoris, Drosophila, Baculovirus 및/또는 Sindbis 발현 시스템을 포함하는 진핵 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster ovary; CHO), 원숭이 신장 (COS), HeLa, Spodoptera frugiperda 및 Saccharomyces cerevisiae와 같은 진핵 세포도 재조합 폴리펩티드를 발현하는 데 사용할 수 있다. 이들 세포에서 사용하기에 적합한 조절 영역은 포유 동물 세포의 경우 CMV, 아데노 바이러스 또는 SV40과 같은 바이러스 프로모터, 효모 세포의 경우 3- 포스포 글리세레이트 키나제 (3-phosphoglycerate kinase) 또는 알코올 탈수소 효소 (alcohol dehydrogenase)에 대한 프로모터를 포함한다.

벡터는 예를 들어 인산 칼슘 (calcium phosphate) 또는 인산 스트론튬 (strontium phosphate)으로 침전, 전기 천공 (electroporation), 리포펙션 (lipofection), DEAE 덱스트란, 미세 주입, 원형질체 융합 또는 미세 발사체 건 (microprojectile gun)에 의해 순수한 DNA (형질 감염)로서 수용 세포 (예 : 진핵 세포)에 도입 될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의한 감염에 의해 도입 될 수 있다. 예를 들어 레트로 바이러스, 아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스를 사용하는 시스템이 개발되었다.

포유 동물 세포에서 생성된 DRα1 폴리펩티드 (예를 들어, 본원에 기재된 것들)는 단백질이 상층액으로 방출된 후 추출될 수 있고 항 -MHC 또는 다른 항체를 사용하여 제조된 면역 친화성 컬럼을 사용하여 정제 될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 예를 들어 β-글로빈 (β-globin)과 함께 키메라 단백질 (chimeric protein)로 발현될 수 있다. 이후 β-글로빈에 대한 항체는 키메라 단백질을 정제하는 데 사용된다. β-글로빈 유전자와 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 사이에서 조작된 상응하는 프로테아제 절단 부위는 번역 후 두 폴리펩티드 단편을 서로 분리하는 데 사용된다. β-글로빈 키메라 단백질을 생성하는 데 유용한 한 가지 발현 벡터는 pSG5 (Stratagene, La Jolla, CA)이다.

원핵 세포에서 재조합 폴리펩티드의 발현은 당화되지 않은 폴리펩티드를 초래할 것이다. 자연적으로 발생하는 글리코실화 표적 부위에서 폴리펩티드의 글리코 실화는 포유 동물 세포와 같은 적합한 진핵 발현 시스템에서 폴리펩티드의 발현에 의해 달성될 수 있다. 다른 예에서, 재조합 폴리펩티드는 N- 연결 글리코실화, 인산화, 또는 다른 변형을 위한 하나 이상의 부위와 같은 원하는 번역 후 변형 부위를 포함하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발에 의해).

발현된 단백질의 정제는 일반적으로 6M 우레아 (urea)를 포함하는 염기성용액 (일반적으로 약 pH 10)에서 수행된다. 정제된 단백질의 접힘은 중성 pH (일반적으로 약 pH 7.4에서 인산염 완충 식염수)에서 완충 용액에 대한 투석으로 이루어진다. 단백질 정제의 다른 방법도 알려져 있으며 여기에 개시된 재조합 폴리펩티드와 함께 사용할 수 있다.

III. 항원성 펩티드

일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드는 직접 또는 펩티드 또는 화학적 링커를 통해 DRα1 도메인에 공유 결합된 항원성 펩티드를 포함한다. APC 표면상의 MHC 복합체에서 항원의 제시는 일반적으로 전체 항원 펩티드를 포함하지 않는다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,468,481 참조). 오히려 MHC II의 경우 β1과 α1 도메인 사이의 홈 (groove)에 위치하거나 MHC I의 경우 α1과 α2 도메인 사이의 홈에 위치한 펩티드는 일반적으로 전체 폴리펩티드 항원의 작은 선형 단편이다. Janeway & Travers (Immunobiology : The Immune System in Health and Disease, 1997)에서 논의된 바와 같이, MHC 클래스 I 분자의 펩타이드 홈에 위치한 펩타이드는 결합 포켓의 크기에 의해 제한되며 일반적으로 8 내지 15 개 (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개 아미노산)의 아미노산 길이, 보다 일반적으로 8 내지 10 개 아미노산 길이 (그러나 가능한 예외는 Collins et al., Nature 371 : 626-629, 1994 참조)이다. 대조적으로, MHC 클래스 II 분자의 펩타이드 홈에 위치한 펩타이드는 이러한 방식으로 제한되지 않으며 일반적으로 길이가 3 내지 50 개 이상의 아미노산 (예 : 8 내지 30, 10 내지 25 또는 15 내지 23 아미노산 길이)이다. 일부 예에서, MHC 클래스 II 분자의 펩티드 홈에 위치한 펩티드는 길이가 약 15 내지 23 개 아미노산이다. 펩티드 단편은 합성 펩티드 합성 기계의 사용과 같은 표준 접근법에 의해 제조될 수 있거나 재조합 폴리펩티드의 일부로 발현될 수 있다.

일부 예에서, 항원성 펩티드는 미엘린 단백질 (예를 들어, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질 (myelin oligodendrocyte glycoprotein; MOG), 미엘린 염기성 단백질 (myelin basic protein; MBP) 또는 프로테오 지질 단백질 (proteolipid protein; PLP))과 같은 신경 또는 중추 신경계 단백질로부터의 펩티드를 포함한다. 특정 예에서 항원성 펩티드는 각각 서열번호 2의 아미노산 1 내지 21 또는 서열번호 3의 1 내지 21로 예시되는 인간 또는 마우스 MOG-35-55 펩티드를 포함한다. 다른 예에서, 항원성 펩티드는 광 수용체 간 레티노이드 결합 단백질 (interphotoreceptor retinoid binding protein; IRBP), 어레스틴 (arrestin), 포스두신 (phosducin) 또는 리커빈 (recoverin)과 같은 망막 단백질로부터의 펩티드이다. 추가 항원성 펩티드에는 타입 II 콜라겐 (콜라겐 II), 피브리노겐-α (fibrinogen-α), 비멘틴 (vimentin), α-에놀라제 (α-enolase), 인간 연골 당단백질-39 (human cartilage glycoprotein-39), α2 글리아딘 (α2 gliadin) 또는 인슐린의 펩티드가 포함된다. 일부 예에서, 항원성 펩티드는 인산화 (phosphorylation), 글리코실화 (glycosylation) 또는 시트룰화 (citrullination)와 같은 번역 후 변형을 포함한다. 예시적인 항원성 펩타이드의 서열은 표 1 및 국제 특허 Publ. WO 2012/103365 및 미국 특허 Publ. 2012/0276127 에 제공되며, 둘 다 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 당업자는 특정 질환 또는 장애와 관련된 추가 항원성 펩티드를 확인할 수 있다.

일부 예에서, 항원성 펩티드는 선택된 항원성 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 DRα1 폴리펩티드를 코딩하는 컨스트럭트의 5 '말단에 작동 가능하게 연결함으로써 MHC 클래스 II DRα1 폴리펩티드에 공유적으로 연결되어, 발현된 펩티드에서 항원성 펩티드는 DRα1 도메인의 아미노 말단에 연결된다. 다른 예에서, 항원성 펩티드는 발현된 펩티드에서 항원성 펩티드가 연결되도록 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열을 DRα1 폴리펩티드를 코딩하는 컨스트럭트의 3 '말단에 작동 가능하게 연결함으로써 DRα1 폴리펩티드에 공유 결합된다. DRα1 도메인의 카르복시-말단에. 이 결과를 얻는 한 가지 편리한 방법은 항원 펩티드를 코딩하는 서열을 DRα1 도메인 코딩 영역을 증폭하는 데 사용되는 PCR 프라이머에 통합하는 것이다. 일부 예에서, 링커 펩티드 서열을 코딩하는 서열은 항원성 펩티드와 DRα1 폴리펩티드 사이에 포함된다. 그러나, 항원성 펩티드가 MHC 클래스 II α1 도메인 코딩 영역의 5 '말단 (또는 3'말단)에 정확하게 연결될 필요는 없다. 예를 들어, 항원 성 펩티드 코딩 영역은 DRα1 도메인 코딩 서열의 5 '또는 3'말단의 처음 몇 개 (전형적으로 처음 10 개 이내) 코돈 내의 α1 도메인에 삽입될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 항원성 펩티드를 DRα1 도메인에 연결하기 위한 유전 시스템은 상이한 항원성 펩티드를 갖는 다수의 DRα1 도메인이 생성되는 경우에 특히 유용하다. 설명된 시스템은 고유한 제한 부위가 DRα1 도메인 (예를 들어, α1 도메인의 5 ' 또는 3'말단)에 포함된 발현 벡터의 구축을 허용한다. 이러한 컨스트럭트와 함께, 항원 펩티드 코딩 서열의 라이브러리가 만들어지며, 각각의 항원 코딩 영역은 선택된 제한 효소에 대한 부위가 측면에 위치한다. DRα1 도메인에 특정 항원을 포함시키는 것은 (a) 선택된 제한 효소로 항원 코딩 영역을 방출하고, (b) 동일한 제한 효소로 DRα1 도메인 컨스트럭트를 절단하고, (c) DRα1 도메인 컨스트럭트에 항원 코딩 영역을 연결함으로써 간단하게 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 많은 수의 DRα1 도메인-펩티드 항원 컨스트럭트가 단시간에 만들어지고 발현될 수 있다.

일부 예에서, 항원은 펩티드 링커에 의해 DRα1 도메인 폴리펩티드에 공유 결합된다. 일부 예에서, 링커는 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 글리신-세린 스페이서, 예를 들어 GGGGS (서열번호 52)를 포함한다. 일부 예에서, 링커는 2 개의 글리신-세린 스페이서를 포함한다. 비 제한적인 예에서, 재조합 폴리펩티드는 항원성 펩티드와 DRα1 폴리펩티드 사이에 제 1 글리신-세린 스페이서, 트롬빈 절단 부위 및 제 2 글리신-세린 스페이서를 포함할 수 있다.

일부 예에서, 항원은 디설파이드 (disulfide) 결합에 의해 DRα1 도메인 폴리펩티드에 공유 결합된다. 일부 예에서, 디설파이드 연결은 DRα1 도메인 폴리펩티드에서 자연 발생 시스테인 잔기 (예 : DRα1 도메인의 시스테인 잔기)를 이용하고 있다. 당업자는 DRα1 도메인 폴리펩티드에서 적합한 시스테인 잔기를 확인할 수 있다. 다른 예에서, 디설파이드 결합은 돌연변이 유발에 의해 DRα1 도메인 폴리펩티드에 도입된 시스테인 잔기와 같은 DRα1 도메인 폴리펩티드에서 비 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기를 이용하여 형성된다. 추가 예에서, 이황화 결합은 펩티드 항원에서 자연 발생 시스테인 잔기를 이용하여 형성된다. 추가의 예에서, 디설파이드 연결은 돌연변이 유발에 의해 펩티드 항원에 도입된 시스테인 잔기와 같은 펩티드 항원에서 비 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기를 이용하여 형성된다.

IV. 장애를 치료 또는 억제하는 방법

본원에는 염증 및/또는 자가 면역 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 대상체에서 장애를 치료 또는 억제하는 방법이 개시된다. 개시된 방법은 서열번호 1의 아미노산 위치 14 (서열번호 1로 예시 됨)에 상응하는 위치에 글루타민 잔기를 갖는 MHC 클래스 II DRα1 도메인 폴리펩타이드 또는 항원성 펩타이드 (서열번호 2 및 3으로 예시 됨)에 공유적으로 연결된 서열번호 1의 아미노산 위치 14에 상응하는 위치에 글루타민 잔기가 있는 MHC 클래스 II DRα1 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산 재조합 폴리펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 비제한적 예에서, 대상체는 다발성 경화증을 갖고, MOG-35-55 펩티드에 연결된 서열번호 1의 아미노산 위치 14에 상응하는 위치에 글루타민 잔기를 갖는 MHC 클래스 II DRα1 도메인 폴리펩티드 (예 : 서열번호 2 내지 3)를 투여받는다.

일부 실시 양태에서, 방법은 치료를 위한 장애가 있는 대상체를 선택하고 유효량의 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드, 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 개시된 재조합 폴리펩티드 또는 핵산을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 대상체는 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 류마티스 관절염, I 형 진성 당뇨병 (type I diabetes mellitus), 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease), 다발성 근염 (polymyositis), 피부 근염 (dermatomyositis), 내분비 부전 (multiple endocrine failure), 슈미트 증후군 (Schmidt's syndrome),자가 면역 포도막염 (autoimmune uveitis), 체강병 (celiac disease), 애디슨 병 (Addison's disease), 부신염 (adrenalitis), 그레이브스 병 (Graves' disease), 갑상선염 (thyroiditis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis),자가 면역 갑상선 질환, 악성 빈혈 (pernicious anemia), 위 위축 (gastric atrophy), 만성 간염 (chronic hepatitis), 루포이드 간염 (lupoid hepatitis), 죽상 동먁경화증 (atherosclerosis), 조산성 치매 (presenile dementia0, 탈수초성 질환 (demyelinating diseases), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 아 급성 피부 홍반성 루푸스 (subacute cutaneous lupus erythematosus), 부갑상선 기능 저하증 (hypoparathyroidism), 드레슬러 증후군 (Dressler's syndrome), 중증 근무력증 (myasthenia gravis),자가 면역성 혈소판 감소증 (autoimmune thrombocytopenia), 특발성 혈소판 감소성 자반병 (idiopathic thrombocytopenic purpura), 용혈성 빈혈 (hemolytic anemia), 보통 천포창 (pemphigus vulgaris), 천포창 (pemphigus), 포진형 피부염 (dermatitis herpetiformis), 탈모증 아르카타 (alopecia arcata), 유사천포창 (pemphigoid), 피부 경화증 (scleroderma), 진행성 전신성 경화증 (progressive systemic sclerosis), CREST 증후군 [석회증 (calcinosis,), 레이노 현상 (Raynaud's phenomenon), 식도 운동 이상 (esophageal dysmotility), 수지경화증 (sclerodactyly), 모세 혈관 확장증 (telangiectasia), 성인 발병 당뇨병 [adult onset diabetes mellitus (II 형 당뇨병)], 남성 및 여성 자가 면역 불임 (male and female autoimmune infertility), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 크론병 (Crohn's disease), 혼합 결합 조직 질환 (mixed connective tissue disease), 청소년 다발성 괴사, polyarteritis nedosa, 전신성 괴사설 혈관염 (systemic necrotizing vasculitis), 연소성 류마티스성 관절염 (juvenile onset rheumatoid arthritis), 사구체 신염 (glomerulonephritis), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 아토피성 비염 (atopic rhinitis), 굿 파스츄어 증후군 (Goodpasture's syndrome), 샤가스 병 (Chagas' disease), 유육종증 (sarcoidosis), 류마티스 열 (rheumatic fever), 천식 (asthma), 재발성 유산 (recurrent abortion), 항 인지질 증후군 (anti-phospholipid syndrome), 농부의 폐 (farmer's lung), 다형 홍반 (erythema multiforme), 심장 절개 후 증후군 (post cardiotomy syndrome), 쿠싱 증후군 (Cushing's syndrome), 자가 면역 활성 증후군 간염 (autoimmune chronic active hepatitis), 조류 애호가의 폐 (bird-fancier's lung), 알레르기 질환 (allergic disease), 알레르기 성 뇌척수염 (allergic encephalomyelitis), 독성 표피 괴사 (toxic epidermal necrolysis), 알 포트 증후군 (Alport's syndrome), 폐포염 (alveolitis), 알레르기성 폐포 염 (allergic alveolitis), 섬유성 폐포염 (fibrosing alveolitis), 간질성 폐질환 (interstitial lung disease), 결절성 홍반 (erythema nodosum), 괴저성 농피증 (pyoderma gangrenosum), 수혈 반응 (transfusion reaction), 한센병 (leprosy), 말라리아 (malaria), 괴저증 (leishmaniasis), 수혈증 (trypanosomiasis), Takayasu의 동맥염 (Takayasu's arteritis), 류마티스성 다발근통 (polymyalgia rheumatica), 측두 동맥염 (temporal arteritis), 주혈 흡충증 (schistosomiasis), 거대세포 동맥염 (giant cell arteritis), 회충증 (ascariasis), 아스페르길루스증 (aspergillosis), Sampter 증후군 (Sampter's syndrome), 습진 (eczema), 림프종 육아종증 (lymphomatoid granulomatosis), Behcet의 질병 (Behcet's disease), Caplan의 증후군 (Caplan's syndrome), Kawasaki의 질병 (Kawasaki's disease), 뎅기열 (dengue), 뇌척수염(encephalomyelitis), 심내막염 (endocarditis), 심내막심근섬유증 (endomyocardial fibrosis), 내안구염 (endophthalmitis), erythema elevatum et diutinum, 건선 (psoriasis) , 태아 적아모세포증 (erythroblastosis fetalis), 호산구성 근막염 (eosinophilic faciitis), 슐만 증후군 (Shulman's syndrome), 펠티 증후군 (Felty's syndrome), 필라리아증 (filariasis),모양체염 (cyclitis), 만성 모양체염 (chronic cyclitis), 이시성 모양체염 (heterochronic cyclitis), 푹 모양체염 (Fuch's cyclitis), IgA 신병증 (IgA nephropathy), 헤녹-스콘라인 자반증 (Henoch-Schonlein purpura), 사구체 신염 (glomerulonephritis), 이식편대숙주질환 (graft versus host disease), 이식 거부 (transplantation rejection), 인간 면역 결핍 바이러스 감염 (human immunodeficiency virus infection), 에코 바이러스 감염 (echovirus infection), 심근병증 (cardiomyopathy), 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 파보바이러스 감염 (parvovirus infection), 풍진 바이러스 감염 (rubella virus infection), 예방 접종 후 증후군 (post vaccination syndromes), 선천성 풍진 감염 (congenital rubella infection), 호지킨 및 비호지킨 림프종 (Hodgkin's and Non-Hodgkin's lymphoma), 신장암 (renal cell carcinoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 이튼-램버트 증후군 (Eaton-Lambert syndrome), 재발성 다발 연골염 (relapsing polychondritis), 악성 흑색종 (malignant melanoma), 한랭 글로불린 혈증 (cryoglobulinemia), 발덴스트림 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulemia), Epstein-Barr 바이러스 감염, 이하선염 바이러스 (rubulavirus) 및 Evan의 증후군 (Evan's syndrome)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 및/또는 자가 면역 질병 또는 장애를 가지고 있다..

다발성 질환을 포함 하나 이에 제한되지 않는 염증성 및 / 또는자가 면역 질환 또는 장애를 갖는다.

추가 염증성 질환에는 골관절염 (osteoarthritis), 염증성 폐 질환 (만성 폐색성 폐 질환 포함), 치주 질환 (periodontal disease), 류마티스 다발 근통 (polymyalgia rheumatica), 죽상 동맥경화증 (atherosclerosis), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 알레르기성 비염 (allergic rhinitis) 및 피부 질환 (피부 근염 및 건선 포함) 등이 포함된다.

다른 실시 양태에서, 대상체는 망막 장애, 예를 들어 색소성 망막염 (retinitis pigmentosa), 원추형 이영양증 (cone-rod dystrophy), Leber 선천성 무색소증 (Leber congenital amaurosis) 또는 황반병증 [maculopathy (예를 들어, 연령-관련 황반변성, 스타가르트-유사 황반 변성, 노른자모양 이상증(vitelliform macular dystrophy, 베스트 병), Malattia Leventinese (Doyne의 벌집형 망막 이영양증), 당뇨병성 황반병증, 잠복성 황반 이영양증 (occult macular dystrophy) 및 셀로판 황반 병증 (cellophane maculopathy))]. 다른 예에서, 망막 장애는 자가 면역성 망막증, 당뇨병성 망막증 또는 혈관성 망막증과 같은 망막증 (retinopathy)을 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 장애는 망막 박리 또는 녹내장을 포함한다. 망막 장애는 진행성 (예를 들어, 망막 변성 또는 녹내장) 또는 급성 (예를 들어, 망막 박리) 일 수 있다. 추가 예에서, 대상체는 포도막염 (uveitis) 또는 시신경염 (neuritis)이 있는 대상체이다. 다른 구현 예에서, 대상체는 뇌졸중 (허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중과 같은)을 앓았다. 또 다른 예에서, 대상체는 물질 중독이 있는 대상체, 예를 들어 메탐페타민 (methamphetamine) 및 알코올 남용을 포함하는 물질 중독에 의해 유도된 인지 또는 신경 정신 장애가 있는 대상체이다.

일부 실시 양태에서, 대상체는 DRα1 도메인 또는 서열번호 1의 아미노산 위치 14에 상응하는 위치에서 류신을 글루타민으로 치환을 포함하는 DRα1 도메인의 일부 (예를 들어, CD74에 결합할 수 있거나 CD74의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 α1 도메인의 일부)를 포함하는 유효량의 조성물이 투여된다. 한 예에서, 조성물은 변형된 DRα1-MOG-35-55를 포함한다 (예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 3).

본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 또는 핵산 (예를 들어, 개시된 재조합 폴리펩티드 또는 핵산의 유효량)을 포함하는 약학적 조성물은 선택된 특정 투여 방식에 따라 적절한 고체 또는 액체 담체와 함께 제제화 될 수 있다. 본 개시 내용에 유용한 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제는 당업자에게 공지 된 것들을 포함한다. Remington : The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21st Edition (2005)을 참조하라. 예를 들어, 비경구 제형은 일반적으로 물, 생리식염수, 기타 균형 잡힌 염 용액, 수성 덱스트로스 (aqueous dextrose), 글리세롤 등과 같은 약학적 및 생리 학적으로 허용되는 유체 비히클인 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물 (예를 들어, 분말, 환약, 정제 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트 (magnesium stearate)를 포함할 수 있다.

생물학적으로 중성인 담체에 더하여, 투여될 약학적 조성물은 습윤제 또는 유화제, 보존제, pH 완충제 등과 같은 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들어 나트륨 아세테이트 또는 소르비탄 모노 라우레이트 (sorbitan monolaurate)를 함유할 수 있다. 포함될 수 있는 부형제는 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 혈장 제제와 같은 다른 단백질이다. 약학적 조성물의 투여 형태는 선택된 투여 방식에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 주사 가능한 유체 이외에 국소, 흡입, 경구 및 좌약 제형이 사용될 수 있다. 국소 제제에는 점안액, 연고, 스프레이, 패치 등이 포함될 수 있다. 흡입 제제는 액체 (예를 들어, 용액 또는 현탁액) 일 수 있으며 미스트, 스프레이 등을 포함한다. 경구 제형은 액체 (예를 들어, 시럽, 용액 또는 현탁액) 또는 고체 (예를 들어, 분말, 알약, 정제 또는 캡슐) 일 수 있다. 좌약 제제는 고체, 겔 또는 현탁액 형태일 수도 있다. 고체 조성물의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이다.

일부 예에서, 약학적 조성물은 의도된 목적을 달성하는 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 재조합 폴리펩티드 또는 그의 일부 (또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)의 투여를 위한 양 및 요법은 담당 임상의에 의해 결정될 수 있다. 치료 적용을 위한 유효 용량은 치료할 상태의 특성 및 중증도, 특정 DRα1 도메인 또는 이의 일부 및/또는 선택한 항원성 펩티드, 환자의 연령 및 상태, 기타 임상 요인에 따라 달라진다. 전형적으로, 용량 범위는 약 0.1μg/kg 체중 내지 약 100mg/kg 체중일 것이다. 다른 적합한 범위는 약 100 μg/kg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 500 μg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 예를 들어, 약 1mg/kg, 약 2mg/kg, 약 3mg/kg, 약 4mg/kg, 또는 약 5mg/kg 체중의 용량을 포함한다. 투여 일정은 단백질에 대한 대상체의 민감도와 같은 여러 임상 요인에 따라 한 달에 한 번에서 매일까지 다양할 수 있다. 투약 일정의 예는 한 달에 한 번, 격주로, 주에 한 번, 주에 두 번, 주에 세 번 또는 매일 투여되는 약 1 mg/kg; 주 1 회, 주 2 회, 주 3 회 또는 매일 약 2.5 mg/kg의 용량; 주 1 회, 주 2 회, 주 3 회 또는 매일 약 5 mg/kg의 용량; 주 1 회, 주 2 회, 주 3 회 또는 매일 약 10 mg/kg의 용량; 또는 주 1 회, 주 2 회, 주 3 회 또는 매일 약 30mg/kg의 용량이다.

하나 이상의 개시된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 정확한 투여량의 개별 투여에 적합한 단위 투여 형태로 제형화 될 수 있다. 하나의 구체적이고 비 제한적인 예에서, 단위 투여 량은 약 1ng 내지 약 5g의 재조합 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10μg 내지 1g, 약 100mg 내지 500mg, 또는 약 10mg 내지 100mg)를 함유할 수 있다. 투여되는 활성 화합물 (들)의 양은 치료되는 대상체, 고통의 중증도 및 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 이러한 범위 내에서, 투여될 제형은 치료되는 대상체에서 원하는 효과를 달성하는 데 효과적인 양의 활성 성분 (들)을 함유할 것이다.

재조합 폴리펩티드는 국소, 경구, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 비강 내, 피내, 척수강 내, 피하, 안구 내, 흡입을 통해 또는 좌약을 통해 다양한 방식으로 조직이 효과적인 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수있다. 한 예에서, 화합물은 피하로 피험자에게 투여된다. 다른 예에서, 화합물은 대상에게 정맥 내로 투여된다.

일부 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 국소 또는 국소 적용을 위해 불활성 매트릭스에 포함될 수 있다. 일부 예에서, 제형은 예를 들어 유리체 내 주사를 위해 눈에 주사될 수 있다. 불활성 매트릭스의 한 예로서, 리포좀은 난포 스파티딜콜린 (phosphatidylcholine; PC)과 같은 디팔미토일 포스파티딜콜린 (dipalmitoyl phosphatidylcholine; DPPC)으로부터 제조될 수 있다. 양이온성 및 음이온성 리포솜을 포함하는 리포솜은 당업자에게 공지된 표준 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 하나 이상의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 리포좀은드랍 (drop) 형태로 또는 수성 기반 크림으로 국소적으로 적용되거나 안구 내 주사 될 수 있다. 국소 적용을 위한 제형에서, 재조합 폴리펩티드는 눈 표면의 마모로 인해 리포솜 캡슐이 분해됨에 따라 시간이 지남에 따라 천천히 방출된다. 안내 주사용 제형에서 리포솜 캡슐은 세포 소화로 인해 분해된다. 이들 제형은 모두 점진적 감소의 약물 전달 시스템 (slow release drug delivery system)의 장점을 제공하여, 대상체가 시간이 지남에 따라 실질적으로 일정한 농도의 재조합 폴리펩티드에 노출될 수 있도록 한다. 한 예에서, DRα1 폴리펩티드는 DMSO 또는 알코올과 같은 유기 용매에 용해될 수 있으며 폴리 무수물 (polyanhydride), 폴리 (글리콜) 산, 폴리 (락트) 산 또는 폴리 카프로락톤 중합체를 함유할 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 임플란트의 크기, 모양 및 제형 및 이식 절차의 유형에 따라 눈의 다양한 부위에 이식될 수 있는 전달 시스템에 포함될 수 있다. 적합한 부위는 전방, 전방 세그먼트, 후방 챔버, 후방 세그먼트, 유리 체강 (vitreous cavity), 맥락막 위 공간, 결막 하, 상공 막, 각막 내, 외막 및 공막을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

일부 예에서, 개시된 재조합 폴리펩티드의 유효량 (예를 들어, 치료적 유효량)은 대상체에서 장애 (예를 들어, 염증 및/또는 자가 면역 장애)를 치료 또는 억제하는데 필요한 재조합 폴리펩티드의 양일 수 있다. 다른 예에서, 개시된 재조합 폴리펩티드의 치료적 유효량은 망막 장애, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 또는 물질 중독과 관련된 장애 (예를 들어, 물질 중독으로 인한 인지 또는 신경 정신 장애)를 치료하거나 억제하는 데 필요한 재조합 폴리펩티드의 양일 수 있다.

본 개시 내용은 또한 하나 이상의 개시된 재조합 폴리펩티드와 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 제제의 조합을 포함한다. 일부 예에서, 재조합 폴리펩티드는 비 스테로이드성 항염증 약물, 코르티코 스테로이드 (corticosteroids), 메토트렉세이트 (methotrexate), 항 -TNF 화합물, 마이코 페놀레이트 (mycophenolate), 아미노살리실레이트 (aminosalicylates), 항생제, 인터페론, 글라티라머 아세테이트 (glatiramer acetate), 항체 요법 (예 : 리툭시맙 또는 밀라투주맙) 또는 면역 억제제 또는 면역 조절 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 또는 자가 면역 장애에 대한 하나 이상의 요법의 유효량과 함께 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 재조합 폴리펩티드는 유전자 요법, 비타민 또는 미네랄 보충제 (비타민 A, C 및/또는 E 또는 아연 및/또는 구리와 같은), 항 혈관 신생 요법 (예 : 라니비주맙 또는 베바시주맙), 광응고 (photocoagulation), 광역학 요법, 루테인 (lutein) 또는 제아잔틴 (zeaxanthin), 코르티코 스테로이드 (corticosteroids) 또는 면역 억제제를 포함 하나 이에 제한되지 않는 망막 장애에 대한 하나 이상의 요법의 유효 용량과 조합하여 투여될 수 있다. 특정 질환에 대한 적절한 병용 요법은 당업자에 의해 선택될 수 있다. 용어 "병용 투여" 또는 "공동-투여"는 활성제의 동시 및 순차적 투여를 모두 지칭한다.

예 1

재료 및 방법

Fab, 항체 및 기타 시약. G4는 인간 IgG 라이브러리에서 파생된 DRα1 도메인에 반응하는 인간 Fab이며 Technion Israel의 Yoram Reiter 박사로부터 기증받았다. 항-인간 MOG 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. CHAPS, T20 및 소 혈청 알부민은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 항 -CD74 항체는 Everest Biotech에서 구입하였다. UltraPureTM TRIS는 Invitrogen에서 구입하였다. 벡터 pET21d (+)는 Novagen에서 구입하였다. BL21 (DE3)은 New England Biolabs에서 구입하였다. IPTG는 Inalco에서 구입하였다.

DRα1컨스트럭트의 클로닝, 발현 및 정제. DRα1 컨스트럭트의 정제가 보고되었다 (Vandenbark et al., J. Immunol. 171 : 127-133, 2003). 간단히 말해서, 인간 MOG-35-55 펩티드, 유연한 링커 및 아미노산 잔기 15 내지 97의 MHC 클래스 II DRα1 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 합성 DNA 단편 및 돌연변이 L50Q를 포함하는 유사한 합성 DNA 단편 DRα1 도메인은 고수준 발현 벡터 pET21d (+) (Novagen)에 클로닝되었다. 이들 클론을 E. coli 균주 BL21 (DE3) (New England Biolabs)로 형질 전환하고, 50μg ml의 항생제 카르베니실린을 함유하는 LB- 한천 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 각 클론에서 3 개의 개별 콜로니를 선택하고 항생제가 보충된 LB 브로스 (LB broth)에서 성장하여 관심있는 단백질의 IPTG 유도 생산을 테스트하였다. 확인 후, 100ml 하룻밤 배양액을 준비하고 항생제가 보충된 LB를 4X 1L 플라스크에 접종하는데 사용하였다. 표적 단백질 합성의 유도는 IPTG의 대수 성장점 (logarithmic growth point)에서 최종 농도 2mM까지 첨가하여 수행되었다. 배양물을 37℃에서 추가로 4 시간 동안 인큐베이션하고, 원심 분리에 의해 수확하고, 박테리아 페이스트를 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동시켰다.

펠렛을 초음파 처리 완충액 (50mM Tris, 300mM NaCl, 2mM EDTA pH 8.0)에 재현탁하고 초음파 처리하여 세포를 파괴하고 봉입체 (inclusion bodies)를 방출하였다. 이들 봉입체에 함유된 단백질을 20mM 에탄올아민, 6M 우레아, pH 10 완충액에 4 ° C에서 부드럽게 교반하면서 밤새 용해시켰다. 용해된 단백질을 음이온 교환 컬럼을 통해 통과시키고 용해 완충액에서 NaCl 구배로 단백질을 용리하여 정제하였다. 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다. 관심 단백질을 포함하는 이러한 분획을 함께 모으고 20mM Tris, pH 8.5에 대해 투석하고 5mg/ml로 농축하고 플래시 냉동한 다음 사용할 때까지 -80 ° C에서 1ml 분취량 (aliquot)으로 보관하였다.

아미노산 서열 정렬. 관심있는 모든 다른 클래스 II α1 도메인 서열을 NCBI에서 검색하고 BLAST 웹 사이트 (NIH)의 BLAST 2 개 이상의 서열을 사용하여 정렬한 다음 수동으로 최적화하여 관련 영역을 표시하였다.

원편광 이색성 (circular dichroism)에 의한 단백질의 구조 분석. AVIV 분광기를 사용하여 원적외선 (180-260 nm)의 흡광도에 의해 2 차 구조 함량을 테스트하기 전에 단백질을 해동하고 SDS-PAGE (데이터는 표시되지 않음)로 분석하였다. 단백질은 순도가 95 % 이상이었다. 100 마이크로 리터의 각 폴리펩티드를 1mg/ml 농도의 20mM Tris 완충액 pH 8.5에서 제조하고 CD 큐벳에 넣었다. 단백질은 매 0.5nm 간격으로 측정하는 0.1mm 광 경로 길이 (light path length)를 통해 180nm에서 260nm까지의 원거리 UV 스펙트럼에서 흡광도를 스캔하였다. 20mM Tris 버퍼 만 포함하는 샘플도 스캔하고 단백질 판독값에서 신호를 뺐다. 각 단백질에 대해 최소 3 번의 스캔을 평균하고 몰타 원도 (molar ellipticity)로 플롯하였다.

CD74에 대한 DRα1 컨스트럭의 결합 및 경쟁 분석. 이러한 실험은 다음과 같이 Maxisorp 플레이트 (Nunc)를 사용하여 ELISA에 의해 수행되었다. 결합 및 경쟁 실험 전에 단백질은 라이신 사이드 체인 1 차 아민 (lysine side chain primary amines)을 표적으로 하는 Alexa Fluor 488 (Invitrogen) 또는 비오틴 (Pierce Biotechnology)으로 표지되었다. 비접합 Alexa Fluor 488 또는 비오틴은 Superdex 75 10/300 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 제거하였다. 결합 실험을 위해, 재조합 인간 CD74 (rhCD74) 컨스트럭트가 생산되었고 (데이터는 표시되지 않음) 설계, 생산 및 정제가 이미 설명되었다 (Benedek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114 : E8421-E8429). , 2017). 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 또는 4 ° C에서 밤새 0.1 ㎍/ml의 농도로 TBS에서 rhCD74 (C27S)로 코팅하였다. TBS에서 5 % BSA 및 0.0125 % Tween 20 (T20)으로 차단한 후, 0.0125 % T20이 포함된 차단 버퍼에서 준비된 DRα1-MOG 컨스트럭트를 실온에서 3 시간 동안 포획한 후 양 고추 냉이 과산화 효소 (horseradish peroxidase; HRP)에 접합된 스트렙타비딘 (streptavidin)으로 검출하였다. 데이터는 Prism 소프트웨어에 로드되고 상대적 친화도를 결정하기 위해 하나 또는 두 개의 결합 부위 방정식에 맞춰졌다.

경쟁 실험을 위해 ELISA 플레이트는 TBS에서 0.5 μg/ml의 농도로 실온에서 MIF로 코팅되었다. 이어서 플레이트를 TBS 내 5 % BSA 및 0.0125 % T20으로 밤새 차단한 다음, 25 ° C에서 1.5 시간 동안 5 % BSA / TBS + 0.0125 % T20에서 제조된 연속 희석된 DRα1 컨스트럭트와 함께 rhCD74를 함유하는 경쟁 혼합물을 첨가하였다. 결합된 rhCD74는 추정되는 MIF / D-DT 결합 부위에서 떨어진 영역에서 인간 CD74를 특이적으로 인식하는 단일 클론 항체로 검출되었다. 450 nm에서의 흡광도를 결정하고 데이터를 Prism으로 분석했으며, 매개 변수는 소프트웨어에 포함된 경쟁 방정식으로 계산되었다. DRα1-hMOG-35-55와 P2 펩타이드 (다음 섹션 참조) 간의 경쟁을 위해 마우스 CD74를 DR * 1501 Tg 마우스 비장 세포로부터 면역 침전시키고 경쟁 실험하였다. 2.5μl의 P2 펩타이드를 DRα1-hMOG-35-55 단백질의 농도를 높이면서 사용하였다. 결합된 펩타이드는 2 % SDS로 면역 침전에서 용출되었고 16.5 % PAG Tris / Tricine에서 분석되었다. 겔을 FITC에 대해 스캔하고 밀도 측정법으로 형광을 정량화하였다. P2 형광 대 DRα1 경쟁자가 플롯되고 데이터가 Prism으로 분석되었다. 상대 밀도값은 One-binding site 방정식에 적합하였다.

DRα1-hMOG-35-55에서 CD74- 결합 에피토프의 매핑 (Mapping ). DRα1-MOG 단백질과 그 모분자인 RTL1000에 높은 친화도로 결합할 수 있는 Fab가 이전에 설명되었다 (Meza-Romero et al., J. Immunol. 192 : 4164-4173, 2014). 그러나 DRα1 도메인의 결합 영역은 아직 결정되지 않았다. G4 Fab에 대한 에피토프를 매핑하기 위해 DRα1 도메인의 전체 길이를 덮는 일련의 7 개의 중첩 N- 말단 -FITC 표지된 펩티드를 합성하였다. 이들 펩티드는 비장 세포 및 면역 흡착된 G4로부터 단백질 L 비드로의 In1- 면역 침전된 마우스 CD74에 결합하는 능력에 대해 시험되었다.

면역 침강 및 웨스턴 블롯 실험. 면역 침전 후, 0.1 % CHAPS/TEN 버퍼 (50mM Tris, 2mM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.4)에서 14-16 시간 동안 결합 실험에서 개별 펩티드를 분석하였다. 면역 복합체를 50μl의 2 % SDS/ESB (전기 영동 샘플 버퍼)로 20 분 동안 용출한 다음 비 환원 조건에서 10-20 % SDS-PAGE에서 전기 영동으로 분석하였다. 전기 영동 후, 젤은 FITC 표지된 펩티드에 대해 스캔되었다. 병렬 실험에서 면역 침전된 마우스 H2M을 사용하여 펩티드 세트의 결합을 테스트하였다. H2M 분자는 Class II α1 도메인에 결합하지만 다른 영역에서 결합하므로 결합하는 동안 α1 도메인 합성 펩타이드에 대해 다른 선택성을 보여야한다. 우리는 또한 G4가 DRα1 구조가 rhCD74에 결합하는 것을 차단하기 때문에 동일한 펩티드 세트를 인식하는 G4 및 CD74의 가능성을 테스트하였다. 이와 관련하여 G4 Fab는 Protein L 비드에 결합된 다음 P2 또는 P7 펩티드가 면역 복합체에 적용되었다. 결합된 물질은 전술한 바와 같이 용출되었고, 전기 영동에 의해 분석되었고, 겔은 FITC 표지 물질에 대해 스캔되었다. 웨스턴 블롯 실험은 PVDF (공극 크기 0.1μm)로 단백질을 전달하는 표준 기술을 사용하여 수행한 다음 TBS에서 5 % BSA 및 0.05 % T20으로 차단하였다.

ERK 1/2 인산화 차단. EAE 마우스의 2 백만 개의 비장 세포를 시험관 내에서 37 ° C에서 20mM Tris pH 8.5, 25μg의 DRhQ 또는 DRα1-hMOG-35-55로 30 분 동안 처리하였다. 그런 다음 세포를 회전시키고 프로테아제 및 인산염 억제제가 보충된 RIPA 완충액으로 용해시켰다. 세포 용해를 얼음 위에서 30 분 동안 진행하고 핵과 세포 기관을 포함하는 파편을 4 ° C에서 10 분 동안 14,000 rpm으로 원심 분리하여 제거하였다. 상층액을 수집하고 환원 조건 하에서 10-20 % 구배 겔에서 SDS-PAGE에 적용하였다. 전기 영동 후, 단백질을 PVDF로 옮기고 막을 먼저 p-ERK 1/2에 대해 프로브하고 스트립한 다음 항 총 ERK 1/2 항체로 프로브를 조사하였다.

EAE 유도. 8-12 주령의 C57BL / 6 WT 수컷 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하였다. 모든 절차는 연방, 주 및 기관 지침에 따라 승인되고 수행되었다. 마우스를 옆구리의 4 개 부위에서 피하로 200μg의 마우스 MOG-35-55 펩티드의 에멀젼 0.2ml 및 400μg의 열 사멸 Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco)를 함유하는 완전한 Freund 's adjuvant (Meza-Romero et al ., J. Immunol. 192 : 4164-4183, 2014)를 넣어 면역화하였다. 또한, 마우스는 면역화 후 0 일 및 2 일에 List Biological Laboratories의 백일해 독소 (Ptx)를 복강 내로 주사하였다 (각각 마우스 당 75 및 200ng). DRα1-hMOG-35-55, DRhQ, DRα1-mMOG-35-55 및 DRmQ 단백질 (0.1ml에서 100μg)을 > 2.0의 EAE 점수에서 시작하여 5 일 동안 매일 피하로 주사하였고, 마우스를 전술한 바와 같이 결합된 뒷다리 및 앞다리 마비 점수의 6 점 척도로 등급이 매겨진 EAE의 임상 징후에 대해 점수를 매겼다 (Meza-Romero et al., J. Immunol . 192 : 4164-4183, 2014). 마우스 그룹에 대한 평균 EAE 점수 및 SD를 면역화 후 8 일부터 27 일까지 매일 계산하고 전체 실험에 걸쳐 EAE 점수 곡선을 수치적으로 통합하여 각 마우스에 대해 합산하였다 (CDI, 총 질병 부하를 나타냄).

데이터 분석. EAE 심각도 데이터와 결합 및 경쟁 결과에 대한 방정식 피팅 데이터를 비교하는 통계 분석은 Prism 소프트웨어 패키지 (GraphPad)를 사용하여 계산되었다.

예 2

변형된 DRα1 폴리펩티드의 생산 및 분석

DRα1-hMOG-35-55, DRα1-mMOG-35-55, DRhQ 및 DRmQ 단백질의 생산은 비슷했으며, 이는 L50Q 치환이 전사 및 발현 속도에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 단백질 수율은 일관되게 ~ 90 ~ 100mg/LB 브로스의 리터였다. Fab G4를 사용하여 정제된 단백질을 검출하였다. 이전 연구에서, Fab G4는 독립형 (stand-alone) 도메인으로서, 더 큰 컨스트럭트의 일부 (여기에 설명된 것과 같이) 또는 2 도메인 재조합 단백질 (RTL1000과 같은)의 일부로서, 다른 맥락에서 DR 11 도메인을 감지한 것으로 나타났다.

몇몇 인간 클래스 II α1 도메인의 정렬 분석 (도 1)은 다른 인간 또는 마우스 클래스 II와 공유되지 않는 DRα1 도메인의 독특한 특성을 드러냈다. 이 독특한 특징은 정렬에 사용된 대부분의 서열에서 위치 18에있는 글루타민 (Q) 잔기를 보여준다 (도 1의 Q18, 화살표; 서열번호 1의 아미노산 위치 14). 그러나 DRα1 도메인은 위치 18에 류신 (L)이 있습니다. 다른 펩타이드 제시 클래스 II 도메인과 함께이 Q18 잔기는 비 항원 제시 단백질 DMα1 및 DOα1 사이에서도 보존되어 있다. 분석된 모든 클래스 II α1 도메인 1 차 서열과 PDB (Protein Data Blank)에 저장된 결정 구조에서 이 영역은 분자의 대부분 바깥 쪽을 가리키는 폴리펩티드의 N- 말단에서 β- 가닥 1과 β- 가닥 2 사이의 루프에 위치한다.

L18 대 Q18의 기능적 역할을 탐구하기 위해, ELISA 실험에서 결합 분석은 마우스 및 인간 기원에서 이전에 구축된 여러 RTL을 사용하여 수행되었다. 도 2a는 Q18 (DP2, DP4 및 마우스 유래 RTL551 (IAb))을 갖는 폴리펩티드가 L18을 갖는 컨스트럭트보다 ELISA 분석에서 rhCD74에 더 큰 결합 활성을 나타냄을 보여준다. L18 대 Q18 (DRα1-MOG-35-55컨스트럭트의 위치 50)이 CD74 수용체에 대해 상이한 결합 친화성을 가질 수 있는지를 조사하기 위해 돌연변이 체 폴리펩티드를 생산하였다 (도 2B에 나타낸 서열).

인간 Fab G4 (DRα1 도메인을 인식하는)는 L50Q 치환이 DRα1 컨스트럭트의 면역학적 인식에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위한 도구로 사용되었다. Fab G4는 DRα1-hMOG-35-55 및 DRα1-mMOG-35-55와 동일한 방식으로 DRhQ 돌연변이체와 교차 반응하였다 (도 3a). DRhQ와 DRα1-MOG-35-55 단백질의 2 차 구조 함량을 나란히 비교하기 위해 원편광 이색성 (circular dichroism) 분광계에서 단백질의 원거리 UV 스캐닝을 수행하였다 (도 3b). 이전 연구에서 DRα1-hMOG-35-55는 상당한 양의 알파-나선 및 베타 시트 이차 구조를 포함한다는 것이 밝혀졌다 (Meza-Romero et al., J. Immunol. 192 : 4164-4183, 2014). 모든 분자는 190nm에서 높은 포지티브 흡광도를 보였으며, 주요 특징은 α- 나선 요소를 나타낸다. 215nm에서는 β- 시트 2 차 구조의 존재를 나타낸다. 전반적으로 이러한 결과는 세 가지 단백질이 구조적으로 유사하다는 것을 보여주며, 이는 컨스트럭트의 β- 시트 플랫폼에서 글루타민 (Q)에 대한 류신 (L)의 대체가 알파-나선 함량을 최소로만 변경했지만 분자 바닥의 베타 시트 구조의 양은 변경하지는 않았음을 시사한다.

DRα1 단백질의 전체 길이에 걸쳐있는 7 개의 겹치는 펩티드가 설계되었다 (도 4a). 이들 펩티드는 형광 스캐닝에 의해 검출되기 위해 아미노산 서열의 N- 말단에 FITC 부분을 포함하였다. 이 중 P1은 전장 펩타이드의 용해도 문제로 인해 변형되어야 했으며 두 번째 펩타이드 (P6)는 합성할 수 없었다. 펩티드는 마우스 비장 세포로부터 면역 침전된 CD74를 결합하기 위해 개별적으로 그리고 풀로 사용되었다. 첫 번째 접근법으로 모든 펩타이드의 칵테일을 ln1- 면역 침전된 CD74를 함유하는 단백질 A/G 비드에 동시에 첨가하였다. 도 4b에 나타난 바와 같이, 면역 침전된 마우스 CD74에 결합된 단 두 개의 펩타이드인 P2와 P5만이 경미하게 존재한다. 이를 확인하기 위해, 동일한 조건에서 개별 펩타이드가 단백질 A/G-ln1-CD74 복합체에 첨가하였다. 그림 4B에 표시된 것처럼, P2와 P5 펩타이드만 마우스 CD74에 명확하게 결합되었다. P2는 결합력이 강한 반면 P5는 친화력이 낮았다.

이 전략의 유용성을 테스트하기 위해 면역 침전된 H2M으로 실험을 실행하였다. 다른 펩티드 (또는 펩티드 세트)가 H2M에 결합할 것이라는 가설이 세워졌다. 도 4c에서 볼 수 있듯이, 이 단백질에 결합된 겹치는 펩타이드의 다른 세트로, 이전 실험의 결과를 검증한다. 이 이후의 실험은 P7 펩티드가 면역 침전된 H2M 및 약간의 P4에 강하게 결합됨을 보여주었다 (도 4c). 이 결과는 DR/DM 복합체의 공개된 결정 구조와 일치한다 (Pos et al., Cell 151 : 1557-1568, 2012). 이 두 분자의 인터페이스는 DM과 DR의 알파 사슬에 의해 지배된다. DM은 DRα1 영역의 N- 말단에서 멀리 떨어진 DRα1 도메인의 측면에 결합하고 DRβ1 도메인과 접촉하지 않고 펩타이드 결합 홈에 가깝다.

이전 논문에서, G4 Fab가 CD74에 결합하는 DRα1 컨스트럭트를 차단하는 데 효과적이라는 것이 입증되었다 (Meza-Romero et al., J. Immunol. 192 : 4164-4173, 2014). 따라서 P2가 Protein L 결합된 G4 Fab와 상호 작용하는지 여부를 확인하고 면역 침전된 CD74와의 결합을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 잠재적으로 P7 펩티드는 G4 또는 CD74에 결합하지 않을 것이다. 예상대로 P2 펩티드만이 G4에 결합할 수 있었으며, 이는 G4와 CD74가 DRα1 폴리펩티드에 동일한 결합 부위를 가지고 있음을 보여준다 (도 5a). 도 5b는 P2 펩티드 위치를 갖는 DRα1 도메인의 개략도를 보여준다. P2 펩타이드가 CD74에 결합하는 인터페이스와 연관되어 있는지 확인하기 위해 DRα1-hMOG-35-55와 P2 펩타이드가 mCD74에 결합하기 위해 서로 경쟁하는지 여부를 확인하기 위해 경쟁 실험을 수행하였다. 결과는 DRα1-hMOG-35-55가 750 nM의 상대 친화성 (K_D)으로 FITC 표지된 P2 펩티드와 면역 침전된 CD74의 결합을 능가할 수 있음을 보여주었다 (도 5c).

DRα1-hMOG-35-55, DRhQ, DRα1-mMOG-35-55 및 DRmQ를 포함한 DRα1-MOG의 수용체에 대한 결합을 평가하였다. 재조합 인간 CD74 (C27S)를 ELISA 플레이트에 코팅한 후 차단 후 DRα1 컨스트럭트를 RT에서 1 ~ 1.5 시간 동안 포획하고 항 -MOG 항체로 검출하였다. 결과는 Prism 소프트웨어에 입력되었고 K_D는 곡선을 1- 사이트 특이적 결합 방정식에 적합하게 계산하였다. 도 6a 및 표 2에 도시된 바와 같이, 이러한 결과는 DRα1 컨스트럭트의 위치 50 (또는 정렬에서 18 위치, 또는 서열 번호 1에서 14 위치)에서 류신을 글루타민으로 대체하면 돌연변이 단백질의 결합 능력이 증가했음을 나타낸다.

DRhQ 돌연변이체는 컨스트럭트의 대응 야생형 버전과 비교할 때 수용체에 대해 8 ~ 10 배 더 높은 친화 도로 결합하였다 (표 2의 K_D 참조). 이는 L50을 포함하는 영역이 DRα/CD74 상호작용의 도킹 모델 (Meza-Romero et al., Metab. Brain Dis. 31:249-255, 2016; Wingerchuk et al., Mayo Clin. Proc. 89:225-240, 2014) 과 위에서 논의된 P2 펩타이드 실험에 의해 제안된 대로 CD74에 DRα 컨스트럭트의 결합 부위의 일부가 될 가능성이 있음을 확인한다. 경쟁 실험은 직접 결합 결과와 일치했다 (도 6b). 경쟁 실험에서 DRhQ는 DRα1-hMOG-35-55 (DRHQ IC50=0.28μM vs DRα1-hMOG-35-55 IC50=1.6μM)보다 CD74에 바인딩된 MIF보다 8~10배 더 높은 성능을 보였고, 이 영역이 결합 상호 작용에 기여하는 보다 직접적인 역할을 지지한다고 주장한다. 반면 DRα1-mMOG-35-55와 그 파생물인 DRmQ는 서로 큰 차이를 보이지 않았으며 기본적으로 DRhQ와 비교했을 때 중간 경쟁 활동을 보였다.

도 7a에 도시된 바와 같이, DRhQ 컨스트럭트로 C57BL/6 수컷 마우스를 처리하면 DRα1-hMOG-35-55 컨스트럭트를 함유하는 네이티브 L50과 비교하여 진행중인 EAE의 심각도가 현저하게 감소했다. 대조적으로, CD74에 대한 MIF 결합을 차단하는 능력이 다르지 않은 DRmQ 컨스트럭트를 사용한 처리 (위 참조)는 DRα1-mMOG-35-55 컨스트럭트를 포함하는 L50과 비교하여 EAE에 대한 처리 효과에서 차이가 없었다 ( 도 7b).

연구에 따르면 MIF는 세포 표면에서 CD74/CD44와의 상호 작용을 통해 ERK 1/2 인산화를 유도하는 주요 전-염증성 사이토카인이라는 것을 보여준다 (Leng et al., J. Exp. Med. 197 : 1467-1476, 2003). EAE 마우스에서 채취한 비장 세포는 p-ERK 1/2의 상향 조절된 수준을 보였으며, 이는 염증 과정과 관련된 진행중인 활성 신호 전달 캐스케이드를 나타낸다. DRα1-MOG 컨스트럭트로 처리할 때 이 인산화는 30 분 배양 후 시험관 내에서 하향 조절되었다. 이는 지속적인 염증 반응이 있는 동물의 비장 세포를 컨스트럭트와 함께 처리하면 ERK 1/2 인산화의 하향 조절이 발생했음을 시사한다 (도 8).

Protein Data Bank에 보관된 여러 인간 및 마우스 클래스 II 분자의 결정 구조에서 Q 아미노산 잔기는 β- 가닥 1과 도메인의 N- 말단에 위치한 β- 가닥 2 사이의 루프에서 β- 가닥 1의 끝에 위치한다. (도 9a 및 9b). 사실, 이 루프는 TSST-1 독소가 클래스 II의 a1 도메인에 결합하는 데 관여했으며(Karp et al., Nature 346:474-476, 1990; Kim et al., Science 266:1870-1874, 1994) 클래스 II와 불변 체인(invariant chain, Ii, CD74) 사이의 연관성은 TSST가 클래스 II에 결합하는 것을 방지하여 잠재적DLS 공유 또는 중복되는 에피토프임을 암시한다(Karp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 9657-9661, 1992). 단백질-단백질 도킹 알고리즘을 사용하여 CD74와 DRα1-hMOG-35-55 사이의 인터페이스 존재를 예측하였고 (Meza-Romero et al., Metab. Brain Dis. 31 : 249-255, 2016; Wingerchuk et al. al., Mayo Clin. Proc. 89 : 225-240, 2014) 컨스트럭트에서 아미노산 잔기 F48, L50, P52, D53 및 S55가 이 인터페이스의 중요한 구성 요소임을 정의하였다 (도 9A에서 F12, L14, P16, D17 및 S19). 따라서 DRα1-hMOG-35-55 및 DRα1-mMOG-35-55에 Q 돌연변이를 도입하여 각각 DRhQ 및 DRmQ 변이체를 생성하였다. 면역학적 및 생물 물리학적 관점에서 이러한 새로운 돌연변이는 부모 분자와 구별할 수 없다. 두 단백질 모두 Fab G4에 대해 동일한 수준과 품질의 교차 반응을 나타내어 에피토프가 구조적으로 변형되지 않았음을 시사한다 (도 3a). 마찬가지로, 두 구조 모두 원편광 이색성 분광법에 의해 동일한 프로파일을 보여주어 이차 구조가 돌연변이체 DRhQ (도 3b) 및 DRmQ (미도시)에서 보존되었음을 나타낸다.

이전 실험 연구는 DRα1-MOG-35-55 (Benedek et al., Eur. J. Immunol. 43 : 1309-1321, 2013)에 추가하여 RTL1000이 CD74에 결합하고 MIF 결합을 차단할 수도 있음을 시사하였다 (Benedek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114 : E8421-E8429, 2017). DRα1 도메인 아미노산 서열에 걸쳐 있는 겹치는 펩타이드 세트를 사용함으로써, 주요 결합 부위는 도킹 알고리즘 (Meza-Romero et al. al., Cytokine 88 : 62-70, 2016; Meza-Romero et al., Metab. Brain Dis. 31 : 249-255, 2016)에 의해 예측된 대로 DR domain1 도메인의 N-말단으로 좁혀졌다 (도 4a 및 4b). 이러한 모든 아미노산 잔기는 면역 침전된 마우스 CD74 및 Fab G4에 결합하는 것으로 나타난 P2 펩티드의 핵심을 구성한다 (도 5a). 또한, DRα1-hMOG-35-55는 면역 정제된 마우스 CD74 (도 5c)에 결합하기 위해 P2 펩티드를 능가하여 두 리간드가 동일한 영역의 수용체에 결합 함을 나타낸다. 여러 마우스 및 인간 MHC 클래스 II 분자의 결정 구조를 면밀히 조사한 결과 이러한 잔기가 α1 도메인의 N- 말단에 있는 β1 및 β2 가닥 사이의 루프에 위치하는 것으로 나타났다. 도킹 모델에 따르면, 이 루프 내의 은 CD74의 잔기와 밀접하게 접촉한다 (도 9a).

우리는 또한 인간 CD74의 재조합 버전에 대한 결합 및 MIF가 수용체에 결합하는 것을 방지하거나 능가하는 활성에 대해이 새로운 변종을 테스트하였다. 우리의 결과는 Q-harboring 변이체가 직접 결합 ELISA 분석에서 CD74에 대해 K_D 8-10 배 더 높은 친화성을 보였음을 나타내며, 이는 이 위치의 Q가 상호 작용에 유리하게 영향을 미친다는 것을 시사한다 (도 6a, 표 2). 따라서, DRhQ는 8 내지 10 배 더 높은 IC50으로 CD74 수용체에 결합하는 MIF에 비해 더 많은 경쟁 활성을 나타냈다 (도 6B, 표 2). 직접 결합 및 경쟁 실험에 의해 평가된 이 더 높은 친화성은 실험 동물에서 EAE를 치료하는 약물의 효능에 반영되었다. 도 7a 내지 도 7b에 나타낸 바와 같이, 이들 컨스트럭트는 이러한 수준의 질병 중증도를 갖는 DRα1-hMOG-35-55를 사용한 치료 효과의 결여와 비교하여 마우스에서 질병 점수를 현저하게 감소시킬 수 있었다. 이들 실험은 EAE 마우스로부터 수확된 비장 세포가 염증 과정과 관련된 진행중인 활성 신호 전달 캐스케이드를 나타내는 p-ERK 1/2의 상향 조절된 수준을 보였으며 ERK 1/2의 인산화가 시험관 내 DRhQ 처리에 의해 하향 조절될 수 있음을 입증한다 (도 8).

본 개시의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예를 고려하여, 예시된 실시예는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 인식해야 한다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음의 청구 범위에 의해 정의된다. 따라서 우리는 이러한 주장의 범위와 정신 내에 있는 모든 것을 발명으로 주장한다.

<110> Oregon Health & Science University United States Government as Represented by the Department of Veterans Affairs Meza-Romero, Roberto Vandenbark, Arthur A. Offner, Halina <120> RECOMBINANT POLYPEPTIDES COMPRISING MODIFIED MHC CLASS II DRa1 DOMAINS AND METHODS OF USE <130> 899-101380-09 <150> US 62/741,941 <151> 2018-10-05 <150> PCT/US2019/054850 <151> 2019-10-04 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified DRalpha1 polypeptide <400> 1 Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Gln Asn Pro 1 5 10 15 Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe 20 25 30 His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe 35 40 45 Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala 50 55 60 Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr 65 70 75 80 Pro Ile Thr Asn <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DRhQ polypeptide <400> 2 Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu 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Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe 35 40 45 Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met 50 55 <210> 22 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial DRalpha1-mMOG-35-55 sequence <400> 22 Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Arg Val Val His Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe 35 40 45 Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met 50 55 <210> 23 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial DRmQ sequence <400> 23 Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Arg Val Val His Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe 35 40 45 Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met 50 55 <210> 24 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified DRalpha1 <400> 24 Met Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Gln 1 5 10 15 Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu 20 25 30 Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu 35 40 45 Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn 50 55 60 Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Pro Ile Thr Asn 85 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide P1 <400> 25 Met Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Gln 1 5 10 15 Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide P2 <400> 26 Gln Ala Glu Phe Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe 1 5 10 15 Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide P3 <400> 27 Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val 1 5 10 15 Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide P4 <400> 28 Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg 1 5 10 15 Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide P5 <400> 29 Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe 1 5 10 15 Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala 20 25 30 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide P6 <400> 30 Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala 1 5 10 15 Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn 20 25 30 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide P7 <400> 31 Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg 1 5 10 15 Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn 20 <210> 32 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MOG-35-55 <400> 32 Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Asn Gly Lys 20 <210> 33 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse MOG-35-55 <400> 33 Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Asn Gly Lys 20 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IRBP 1177-1191 <400> 34 Ala Asp Gly Ser Ser Trp Glu Gly Val Gly Val Val Pro Asp Val 1 5 10 15 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arrestin 291-310 <400> 35 Asn Arg Glu Arg Arg Gly Ile Ala Leu Asp Gly Lys Ile Lys His Glu 1 5 10 15 Asp Thr Asn Leu 20 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosducin 65-96 <400> 36 Lys Glu Arg Met Ser Arg Lys Met Ser Ile Gln Glu Tyr Glu Leu Ile 1 5 10 15 His Gln Asp Lys Glu Asp Glu Gly Cys Leu Arg Lys Tyr Arg Arg Gln 20 25 30 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recoverin 48-52 <400> 37 Gln Phe Gln Ser Ile 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recoverin 64-70 <400> 38 Lys Ala Tyr Ala Gln His Val 1 5 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recoverin 62-81 <400> 39 Pro Lys Ala Tyr Ala Gln His Val Phe Arg Ser Phe Asp Ala Asn Ser 1 5 10 15 Asp Gly Thr Leu 20 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recoverin 149-162 <400> 40 Glu Lys Arg Ala Glu Lys Ile Trp Ala Ser Phe Gly Lys Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen II 261-274 <400> 41 Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly 1 5 10 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen II 259-273 <400> 42 Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro 1 5 10 15 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen II 257-270 <400> 43 Glu Pro Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified collagen II257-270 <400> 44 Ala Pro Gly Ile Ala Gly Phe Lys Ala Glu Gln Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fibrinogen-alpha 40-59 <400> 45 Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys 1 5 10 15 Ser Asp Glu Asp 20 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fibrinogen-alpha 616-625 <400> 46 Thr His Ser Thr Lys Arg Gly His Ala Lys Ser Arg Pro Val Arg Gly 1 5 10 15 Ile His Thr Ser 20 <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fibrinogen-alpha 79-91 <400> 47 Gln Asp Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser 1 5 10 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fibrinogen-alpha 121-140 <400> 48 Asn Asn Arg Asp Asn Thr Tyr Asn Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser 1 5 10 15 Arg Ile Glu Val 20 <210> 49 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vimentin 59-79 <400> 49 Gly Val Tyr Ala Thr Arg Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Leu 20 <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vinmentin 26-44 <400> 50 Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ser Ala Leu <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vimentin 256-275 <400> 51 Ile Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp 1 5 10 15 Val Arg Gln Gln 20 <210> 52 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vimentin 415-433 <400> 52 Leu Pro Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Pro Leu <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-enolase 5-21 <400> 53 Lys Ile His Ala Arg Glu Ile Phe Asp Ser Arg Gly Asn Pro Thr Val 1 5 10 15 Glu <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human cartilege glycoprotein 39 259-271 <400> 54 Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu 1 5 10 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> myelin basic protein 85-99 <400> 55 Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 1 5 10 15 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> myelin basic protein 145-164 <400> 56 Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg 1 5 10 15 Asp Ser Arg Ser 20 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteolipid protein 139-151 <400> 57 Cys His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly 1 5 10 15 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteolipid protein 95-116 <400> 58 Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Ala Thr 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOG 1-25 <400> 59 Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val 1 5 10 15 Gly Asp Glu Val 20 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOG 94-116 <400> 60 Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu Ala 1 5 10 15 Ala Met Glu Leu Lys Val Glu 20 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOG 145-160 <400> 61 Val Phe Leu Cys Leu Gln Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOG 194-208 <400> 62 Leu Val Ala Leu Ile Ile Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu 1 5 10 15 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha2-gliadin 61-71 <400> 63 Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro 1 5 10 <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-2 gliadin 58-77 <400> 64 Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu 1 5 10 15 Pro Tyr Pro Gln 20

Claims

서열번호 1의 14번째 아미노산 위치에 대응하는 위치에 글루타민 (glutamine) 잔기를 포함하는 DRα1 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제1항에 있어서, DRα1 도메인은 인간 DRα1 도메인인 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 1에 대해 적어도 90 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 항원성 펩티드 (antigenic peptide)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제6항에 있어서, 링커 (linker)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제7항에 있어서, 링커는 펩티드 링커 (peptide linker) 또는 화학적 가교제 (chemical crosslinker)를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제7항에 있어서, 링커가 제1 글리신-세린 스페이서 (first glycine-serine spacer), 트롬빈 절단 부위 (thrombin cleavage site) 및 제2 글리신-세린 스페이서 (second glycine-serine spacer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드가 MOG-35-55인 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제10항에 있어서, MOG-35-55가 인간 또는 마우스 MOG-35-55인 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제10항에 있어서, 재조합 폴리펩티드가 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 또는 이로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제13항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 컨스트럭트 (construct).
제14항의 발현 컨스트럭트를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 폴리펩티드의 유효량 또는 제13항의 핵산 분자의 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체 (carrier); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제16항에 있어서, 조성물이 적어도 5 mg/kg의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제16항 또는 제17항의 약학적 조성물의 유효량을 염증성 장애가 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장애를 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 염증성 장애가 다발성 경화증 (multiple sclerosis) 또는 실험적 자가 면역 뇌병증 (experimental autoimmune encephalopathy; EAE)인 방법.