KR20210058038A

KR20210058038A - 인터루킨-36 감마를 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20210058038A
Application number: KR1020190144978A
Authority: KR
Inventors: 최현정; 노민수; 김형준; 박원석; 진선희
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-05-24

Abstract

본 명세서는 인터루킨-36 감마를 포함하는 피부 미백용 조성물을 개시한다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 의한 조성물은 IL-36G를 유효성분으로 포함하여 멜라닌 생성 세포에서의 멜라닌 생성량을 효과적으로 억제함으로써 피부 미백 효과를 제공할 수 있으며, 이에 더하여 기미 또는 흑자와 같은 과색소성 피부 질환의 증상을 완화 또는 치료하는 데에도 효과적일 수 있다.

Description

인터루킨-36 감마를 포함하는 피부 미백용 조성물{COMPOSITION FOR SKIN WHITENING COMPRISING INTERLEUKIN-36 GAMMA}

본 명세서에는 인터루킨-36 감마를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물이 개시된다.

성체 멜라닌 세포는 피부 표피의 기저막(basal epidermis)에 존재하며, UV와 같은 외부 인자에 의해 멜라닌 색소를 생성하여 생성된 멜라닌 색소를 주변 각질세포에 전달하여 해당 각질세포의 DNA 손상을 억제하는 역할을 한다. 그러나 이러한 성체 멜라닌 세포의 활성은 유전적인 요인, 호르몬 및 여러 질병 요인에 따라 비정상적으로 조절되어 정상적인 색소 생성단계를 벗어나게 되며 이에 따라 과다한 색소 생성 및 과증식으로 인한 기미 혹은 흑자와 같은 과색소성 질환이 발생한다.

이러한 과색소성 질환은 진피에 위치한 멜라닌 세포의 비정상적인 활성에 의해 일어나는 것으로 알려져 있으며, 구체적으로, 피부색을 결정하는데 관여하는 다양한 인자 중 멜라닌 생성을 증가시키는 인자와 감소시키는 인자 사이의 균형이 깨지게 될 경우, 과도한 멜라닌 생성으로 인하여 피부에 과색소 침착증이 생긴다. 따라서 피부 미백을 위해서는 멜라닌 생성을 증가시키는 인자를 감소시키는 것도 방법이지만 원래 피부가 가지고 있는 멜라닌 생성 억제 인자를 찾아 발현을 증가시키거나 그 인자 자체를 활용하는 방법도 있다.

한편, 각질 형성 세포와 같은 피부 세포가 만들어 내는 사이토카인 중 인터루킨-36 감마(interleukin-36 gamma, IL-36G, IL-36γ)는 지금까지 면역 반응 또는 염증 반응 관련 인자로서 연구 및 보고되어 왔을 뿐, IL-36G가 멜라닌 세포에 미치는 영향에 대해서는 연구가 진행되어 있지 않은 실정이다.

국제공개공보 제2019/099483호 대한민국 등록특허공보 제10-1949429호

일 측면에서, 본 발명은 IL-36G를 함유하여 멜라닌 생성량을 억제하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 일 측면에서, 본 발명은 피부 미백용 물질을 효과적으로 스크리닝하여 멜라닌 생성 억제를 통한 피부 미백에 사용하거나 멜라닌 생성 관련 피부 질환을 진단하거나 그 진단을 위한 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에서, 인터루킨-36 감마(IL-36G) 또는 그의 발현을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명은 다른 측면에서, 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질을 처리한 피부세포에서, 시험 물질 처리 전후의 IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 다른 측면에서, 피험자의 피부세포 시료로부터, IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 상기 측정된 발현 정도가 정상치보다 낮으면 멜라닌 생성 관련 피부 질환 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 멜라닌 생성 관련 피부 질환 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명에 의한 조성물은 IL-36G 또는 그의 발현을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하여 멜라닌 생성 세포에서의 멜라닌 생성량을 효과적으로 억제함으로써 피부 미백 효과를 제공할 수 있으며, 이에 더하여 기미 또는 흑자와 같은 과색소성 피부 질환의 증상을 완화 또는 치료하는 데에도 효과적일 수 있다.

또한, 일 측면에서, 본 발명에 의한 스크리닝 방법을 이용하면, 피부 미백용 물질을 쉽고 효과적으로 스크리닝할 수 있고, 본 발명에 의한 진단 방법을 이용하여 멜라닌 생성 기능에 문제가 있을 가능성이 있는지 여부를 미리 체크할 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 시험예 1에 따른 멜라닌 생성 억제 효능 평가 시험 결과를 나타낸 도면이다 (도 1a. 실험 진행 및 물질 처리 시기; 도 1b. 멜라닌 생성 세포 색깔 사진; 도 1c. 상대적인 멜라닌 생성량. *p<0.05, **p<0.01).
도 2a 내지 도 2i는 시험예 2에 따른 멜라닌 생성 관련 유전자들의 발현 감소 효능 평가 시험 결과를 나타낸 도면이다 (도 2a-도 2d. 각 유전자들의 상대적 mRNA 수준, 도 2e. 각 유전자들의 웨스턴 블롯팅 검정 결과, 도 2f- 도 2i. 각 유전자들의 상대적 단백질 수준).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"란 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오티드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"란 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체를 의미한다. 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match)뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.

본 발명은 일 측면에서, 인터루킨-36 감마(IL-36G) 또는 그의 발현을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 조성물에 관한 것일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 IL-36G 또는 그의 발현을 증가시키는 물질은 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 0.1 중량%로 포함될 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 조성물 중 IL-36G의 함량은 0.001 중량% 이상, 0.005 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.03 중량% 이상, 0.05 중량% 이상 또는 0.07 중량% 이상일 수 있고, 또한, 0.1 중량% 이하, 0.08중량% 이하, 0.06 중량% 이하, 0.04 중량% 이하, 0.02 중량% 이하, 0.007 중량% 이하 또는 0.003 중량% 이하일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과를 제공할 수 있으며, 또한, 상기 조성물은 멜라닌 형성-관련 단백질의 발현을 저해하여 피부 미백 효과를 제공할 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 멜라닌 형성-관련 단백질은, 멜라닌 형성-관련 증가인자인, 티로시나아제(tyrosinase, TYR), TYRP1(tyrosinase-related protein 1) 및 DCT(dopachrome tautomerase) 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 우수한 피부 미백 효과를 제공하며, 또한 과색소성 피부 질환, 예를 들어 기미 또는 흑자 등을 예방하거나 그 증상을 완화 및 치료하는 데에도 효과적일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 조성물은 식품, 약학 또는 화장료 조성물일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 IL-36G 또는 그의 발현을 증가시키는 물질은 리포솜(liposome), 세포막 투과성 펩타이드(cell permeable peptide, CPP) 등과 같은 담체를 이용하여 상기 조성물에 포함될 수 있다.

상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 환제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바, 티백 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업계의 통상의 기술자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 또한 상기 식품은 건강기능식품일 수도 있다.

상기 조성물은 단순 섭취, 음용, 주사 투여, 스프레이 투여 또는 스퀴즈 투여 등 다양한 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업계의 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능식품 제품일 수 있다.

상기 외에, 본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않으나 본 발명의 일 측면에 따른 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 60 중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 연질 및 경질 캅셀제, 과립제(顆粒劑), 산제, 세립제, 액제, 유탁제(乳濁濟) 또는 펠렛제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 주사제, 점적제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수도 있는데, 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물의 적용량 또는 투여량은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 유효성분 투여량 결정은 당업계 통상의 기술자의 수준 내에 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 클렌징워터, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디클렌저 및 바디에센스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 상기 IL-36G 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어지는 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

상기 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조절제, 알코올, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

본 발명은, 다른 측면에서, 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질을 처리한 피부세포에서, 상기 시험 물질 처리 전후의 IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 방법은, 상기 시험 물질 처리 전에 비하여 시험 물질 처리 후에 IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도가 증가한 경우, 상기 시험 물질을 피부 미백용 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

즉, 시험 물질 처리 시의 피부세포 시료 내에서의 IL-36G 유전자의 발현 정도가 상기 시험 물질 처리 전의 피부세포 시료 내에서보다 높을 경우, 해당 시험 물질을 피부 미백용 물질로 판단할 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에서, 피험자의 피부세포 시료로부터, IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 상기 측정된 발현 정도가 정상치보다 낮으면 멜라닌 생성 관련 피부 질환 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 멜라닌 생성 관련 피부 질환 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 피부세포는 멜라닌 생성 세포일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 IL-36G 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 사용하여 측정하는 것일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blotting), 웨스턴블로팅(western blotting) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "많거나 적음", "높거나 낮음"은 기준이 되는 양과 비교하여 차이가 있음을 의미하는 것으로서, 그 양이 기준이 되는 양에 비하여 1.5배 이상, 2배 이상, 바람직하게는 2.2배 이상 증가 또는 감소되어 양에 차이가 생긴 경우를 나타낸다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예, 시험예 및 제형예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 실시예, 시험예 및 제형예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이러한 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[시험예 1] IL-36G의 멜라닌 생성 억제 효능 평가 실험

IL-36G의 멜라닌 생성 억제 효능을 평가하기 위하여, 인간 정상 피부 멜라닌 생성 세포(normal human epidermal melanocytes, HEMs)에 IL-36G(제품번호: 2320-IL, R&D systems)를 처리한 후 멜라닌 생성량을 측정하였다.

구체적으로, 중간 정도 색소가 있는 공여자의 신생아 포피로부터의 인간 정상 피부 멜라닌 생성 세포(HEMs)(Cascade Biologics, Portland, OR))를 6-웰 평판 배양기에서 배양하되 2X10⁵ cells/well씩 시딩하고, 배지는 HMGS(Human Melanocyte Growth Supplement)(Cascade Biologics)를 포함한 254 배지(Cascade Biologics)를 사용하여 5% (v/v) CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃의 온도 조건에서 배양하였다. 2일에 한 번씩 IL-36G (1000ng/ml, 2000ng/ml)가 들어있는 배지로 갈아주면서 6일동안 배양한 다음, 트립신 처리에 의해 멜라닌 생성 세포를 수확하고 PBS로 2번 세척하였다. 1000xg에서 5분 동안 원심분리 후, e-tube에 세포를 모아 사진을 찍었다. 사진 촬영 후, 1N NaOH에 세포를 80℃에서 30분 동안 용해시키고 용해물을 96-웰 플레이트에 3회 옮긴 다음, 마이크로플레이트 리더(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정함으로써 무처리 대조군과 비교하여 상대적인 멜라닌 양을 측정하였다. 하이드로퀴논(hydroquinone, HQ)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)는 멜라닌 생성을 억제하는 양성 대조군으로 사용되었다.

결과는 도 1b 및 도 1c에 나타내었다. 도 1a는 실험 진행 일정 및 세포 배양 기간(6일) 동안 IL-36G 처리(tIL-36γ) 시기 및 수확(harvest) 시기를 나타낸 것이며, 도 1b는 무처리(control), 및 IL-36G(IL-36γ)(1000ng/ml, 2000ng/ml)와 하이드로퀴논(HQ)을 처리한 멜라닌 세포 사진을 나타낸 것이며, 도 1c는 무처리 대조군(control) 대비 상대적인 멜라닌 생성량(Relative melanin content, %)을 나타낸 것이다. 도 1b 및 도 1c에서 tIL-36γ는 IL-36G 처리를 나타낸다. (*p<0.05, **p<0.01; Student's t-test).

도 1b의 결과로부터, 무처리 대조군에 비하여, IL-36G 및 HQ 처리 시, 멜라닌 생성이 억제되어 색이 더 연한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 IL-36G 2000ng/ml 처리 시에는 멜라닌 생성 세포의 색이 양성 대조군인 HQ과 비슷한 수준으로 연한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 1c의 결과로부터, IL-36G 처리 시 유의한 수준으로 멜라닌 생성량이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 IL-36G 2000ng/ml 처리 시에는 양성 대조군이 HQ 보다도 멜라닌 생성량 억제 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] IL-36G에 의한 멜라닌 생성 관련 인자 발현 감소 효능 평가 시험

IL-36G에 의한 멜라닌 생성 관련 인자 발현 감소 효능을 평가하기 위하여, 상기 시험예 1의 인간 멜라닌 세포에 IL-36G를 처리하였으며, IL-36G는 상기 시험예 1과 동일한 제품을 사용하였다.

<시험예 2-1> Q-RT-PCR

상기 시험예 1의 인간 멜라닌 세포를 HMGS를 포함한 254 배지(Cascade Biologics)에서 5% (v/v) CO2 인큐베이터 내에서 37℃의 온도 조건으로 배양한 다음, 배양된 인간 멜라닌 세포에 IL-36G를 각각 0ng/ml, 1000ng/ml 및 2000ng/ml 농도로 처리하여 상기와 동일한 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 인간 멜라닌 세포의 총 mRNA를 추출하고 AB7500 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용한 실시간 역전사 효소 고중합반응 (Quantitative real-time PCR, Q-RT-PCR)을 수행하여 멜라닌 생성 관련 효소인 MITF(melanogenesis-associated transcription factor), 티로시나아제(tyrosinase, TYR), DCT(dopachrome tautomerase) 및 TYRP1(tyrosinase-related protein 1) 유전자의 상대적인 발현량을 측정하였다. 이 때 프라이머는 택맨 프라이머 세트(TaqMan expression primer sets, Applied Biosystems)를 사용하였으며, 구체적으로, MITF에 대한 프라이머는 제품번호 Hs01117294_m1, 티로시나아제에 대한 프라이머는 제품번호 Hs00165976_m1, DCT에 대한 프라이머는 제품번호 Hs01098278_m1, TYRP1에 대한 프라이머는 제품번호 Hs00167051_m1의 프라이머들을 사용하였다. 대조군 유전자로는 GAPDH(human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 프라이머 제품번호: Hs02786624_g1)을 사용하였다.

<시험예 2-2> 웨스턴 블롯팅 검정 및 단백질 수준 정량

상기 시험예 1의 인간 멜라닌 세포를 HMGS를 포함한 254 배지(Cascade Biologics)에서 5% (v/v) CO₂ 인큐베이터 내에서 37

의 온도 조건으로 배양한 다음, 배양된 인간 멜라닌 세포에 IL-36G를 2000 ng/ml로 처리하여 상기와 동일한 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 인간 멜라닌 세포의 단백질 샘플을 추출하고, 모든 용해물은 2 Х 램라이 시료 완충액(2 Х Laemmli sample buffer, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% [v/v] glycerol, 2% [w/v] SDS, 5% [v/v]

-mercaptoethanol, 및 0.01% [w/v] bromophenol blue) (Bio-Rad, Hercules사, CA, USA)을 이용하여 준비하였다. 모든 세포 단백질은 Bradford solution (Bio-Rad)을 이용하여 측정하였다. 그 후, 상기 시료는 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 멤브레인(Bio-Rad)으로 이전하였다. TBST(25 mM Tris, 140 mM NaCl, 및 0.05% [v/v] Tween® 20) 내의 4% (w/v) 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹한 뒤, 멤브레인을 특정 1차 항체들과 함께 오버나이트(overnight) 배양시켰다. 단백질 검출을 위하여, 상기 멤브레인은 HRP-컨쥬게이티드 이차 항체를 이용하여 배양하였고, 신호는 SuperSignal® West Dura HRP Detection Kit (Pierce사, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 무처리 대조군(Control) 대비 MITF, TYR, DCT 및 TYRP1의 상대적인 단백질 수준(Relative protein)을 정량하였다. 웨스턴 블롯팅 검정에 사용한 항체 정보는 다음과 같다: 항-MITF 항체 (제품번호: MS-771-P1, Thermo Scientific), 항-TYR 항체 (제품번호: 05-647, Sigma-Aldrich), 항-DCT 항체 (제품번호: ab74073, Abcam), 항-TYRP1 항체 (제품번호: ab3312, Abcam), 항-β-액틴 항체 (제품번호: A5441, Sigma-Aldrich).

그 결과는 도 2a 내지 도 2i에 나타내었다. 도 2a 내지 도 2d는 대조군 유전자 GAPDH 대비 IL-36G에 의한 MITF, TYR, DCT 및 TYRP1 유전자의 상대적인 발현량 변화(Relative mRNA/GAPDH)를 나타낸 것이며, 도 2e는 MITF, TYR, DCT 및 TYRP1에 대한 웨스턴 블롯팅 검정 결과를 나타낸 것이며, 도 2f 내지 도 2i는 IL-36G에 의한 MITF, TYR, DCT 및 TYRP1의 단백질 수준을 정량한 결과를 나타낸 것이다. 도 2a 내지 도 2d의 모든 값은 인간 GAPDH에 대한 상대적인 유전자의 평균 발현 수준±SD (n=3)로 나타냈으며, 통계 검정으로는 스튜던트 t-테스트를 사용하였다 (*p<0.05, **p<0.01). 도 2a 내지 도 2i에서 tIL-36γ는 IL-36G 처리를 나타낸다.

도 2a 내지 도 2i의 결과로부터, IL-36G의 처리에 의해, 티로시나아제, DCT 및 TYRP1의 발현량이 유의한 수준으로 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, IL-36G는 멜라닌 생성 관련 증가 인자인 티로시나아제, DCT 및 TYRP1의 발현량을 감소시킴으로써 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[제형예 1] 연질캅셀제

IL-36G 20μg, L-카르니틴 80~140mg, 대두유 180mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 6mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1캡슐에 충진하여 연질캅셀제를 제조하였다.

[제형예 2] 정제

IL-36G 20μg, 갈락토올리고당 200mg, 유당 60mg 및 맥아당 140mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester)를 6mg을 첨가하여 타정기로 타정하여 정제를 제조하였다.

[제형예 3] 과립제

IL-36G 20μg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조하였다.

[제형예 4] 드링크제

IL-36G 20μg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 충진한다. 병에 충진한 후 130℃ 에서 4~5 초간 살균하여 드링크제를 제조하였다.

[제형예 5] 주사제

IL-36G 50μg, 주사용 멸균증류수 적량, pH조절제 적량을 이용하여 통상적인 방법으로 주사제를 제조하였다.

[제형예 6] 유연화장수(스킨로션)

IL-36G 0.1 중량%, L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00 중량%, 수용성 콜라겐 (1% 수용액) 1.00 중량%, 시트르산나트륨 0.10 중량%, 시트르산 0.05중량%, 감초 엑기스 0.20 중량%, 1,3-부틸렌글리콜 3.00 중량%, 정제수 잔량을 이용하여 유연화장수(스킨로션)을 제조하였다.

[제형예 7] 크림

IL-36G 0.1 중량%, 폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트 2.00 중량%, 자기유화형 모노스테아르산글리세린 5.00 중량%, 프로필렌글리콜 4.00 중량%, 스쿠알렌 6.00 중량%, 트리2-에틸헥산글리세릴 6.00 중량%, 스핑고당지질 1.00 중량%, 1,3-부틸렌글리콜 7.00 중량%, 밀랍 5.00 중량%, 정제수 잔량을 사용하여 크림형 제제를 제조하였다.

[제형예 8] 팩

IL-36G 0.1 중량%, 폴리비닐알코올 13.00 중량%, L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00 중량%, 라우로일히드록시프롤린 1.00 중량%, 수용성 콜라겐 (1% 수용액) 2.00 중량%, 1,3-부틸렌글리콜 3.00 중량%, 에탄올 5.00 중량%, 정제수 잔량을 사용하여 팩을 제조하였다.

[제형예 9] 건강식품

하기 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 건강 식품을 제조하였다.

성분	함량
IL-36G	10 ㎍
비타민 혼합물
비타민 A 아세테이트	70 ㎍
비타민 E	1.0 ㎎
비타민 B1	0.13 ㎎
비타민 B2	0.15 ㎎
비타민 B6	0.5 ㎎
비타민 B12	0.2 ㎍
비타민 C	10 ㎎
비오틴	10 ㎍
니코틴산아미드	1.7 ㎎
엽산	50 ㎍
판토텐산 칼슘	0.5 ㎎
무기질 혼합물
황산제1철	1.75 ㎎
산화아연	0.82 ㎎
탄산마그네슘	25.3 ㎎
제1인산칼륨	15 ㎎
제2인산칼슘	55 ㎎
구연산칼륨	90 ㎎
탄산칼슘	100 ㎎
염화마그네슘	24.8 ㎎

상기 비타민 및 무기질 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 예로 혼합 조성하였으나, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

[제형예 10] 건강음료

성분	함량
IL-36G	15 ㎍
구연산	1000 ㎎
올리고당	100 g
매실농축액	2 g
타우린	1 g
정제수	잔량
총 부피	900 ㎖

상기 표 2와 같이 총 부피 900㎖가 되도록 잔량의 정제수를 첨가하여 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2리터 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강음료를 제조하였다.

Claims

인터루킨-36 감마(IL-36G) 또는 그의 발현을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IL-36G 또는 그의 발현을 증가시키는 물질은 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 0.1 중량%로 포함되는, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 형성-관련 단백질의 발현을 저해하는, 피부 미백용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 멜라닌 형성-관련 단백질은, 티로시나아제(tyrosinase, TYR), TYRP1(tyrosinase-related protein 1) 및 DCT(dopachrome tautomerase) 중에서 선택되는 하나 이상인, 피부 미백용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 과색소성 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물인, 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 또는 화장료 조성물인, 조성물.
피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
상기 시험 물질을 처리한 피부세포에서, 상기 시험 물질 처리 전후의 IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 방법은,
상기 시험 물질 처리 전에 비하여 시험 물질 처리 후에 IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도가 증가한 경우, 상기 시험 물질을 피부 미백용 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는, 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 피부세포는 멜라닌 생성 세포인, 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 사용하여 측정하는 것인, 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던블롯팅(northern blotting), 웨스턴블롯팅(western blotting) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법.
피험자의 피부세포 시료로부터,
IL-36G 유전자의 mRNA 또는 IL-36G 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계;
상기 측정된 발현 정도가 정상치보다 낮으면 멜라닌 생성 관련 피부 질환의 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 멜라닌 생성 관련 피부 질환 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 피부세포는 멜라닌 생성 세포인, 멜라닌 생성 관련 피부 질환 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.