KR20210046730A - Wnt 헥사펩티드에 대한 용액상 경로 - Google Patents
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Abstract
본 개시 내용은 일반적으로 폴리펩티드 합성 분야에 관한 것으로, 보다 특히 Wnt 헥사펩티드 Foxy-5 및 이의 보호 유도체 및 펩티드 단편의 용액상(solution phase) 합성에 관한 것이다.
Description
본 개시 내용은 일반적으로 폴리펩티드 합성 분야에 관한 것으로, 보다 특히 Wnt 헥사펩티드 Foxy-5의 용액상(solution phase) 합성에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 신규한 트리-, 테트라- 및 펜타펩티드의 용액상 합성에 관한 것이다.
Foxy-5는 포르밀화된, Wnt5a-유도 헥사펩티드 및 Wnt-5a 모방체로서 현재 여러 일반적인 형태의 암에서 종양 확산을 예방하기 위해 후보 약물로 개발중인 잠재적인 항 전이 활성을 가진다.
Foxy-5는 아미노산 서열 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_ID NO 1, 도 1)을 가진다. 정맥내 투여시, Foxy-5는 wnt-5a 수용체인, Frizzled-2 및 -5에 결합하고, 이를 활성화하여, wnt-5a-매개 신호 전달을 활성화한다. 증가된 wnt-5a 신호 전달은 내피 종양 세포 이동 및 침입을 억제할 수 있다.
Foxy-5는 결장암 환자에서 발견된 종양 조직의 Wnt-5a 단백질 결핍을 보완하여, 전이 위험을 줄인다. 3기 대장암 환자에 대한 최근 후향성 연구의 하위 분석에 따르면, Wnt 5a의 낮은 발현을 갖는 환자의 비율이 2기 대장암 (CRC) 환자의 이전 연구에서 관찰된 것보다 상당히 더 높음을 보여준다. CRC 3기 종양의 환자는 원발성 종양에 인접한 림프절에 종양 세포가 존재한다는 점에서 2기와 다르므로, 더욱 공격적이고 빠르게 진행한다. 종양 단계가 덜 진행된 환자의 약 45%와 비교하여, 3기 환자의 70% 가까이에서 낮은 수준의 Wnt-5a가 관찰되었다. 이는 Wnt-5a 수준이 질환의 진행 과정에 상당히 영향을 미친다는 가설을 뒷받침한다.
약물 후보의 안정성 프로파일, 약동학 및 2상 용량 결정을 문서화하기 위해 Foxy-5에 대한 완료된 1b상 연구를 기반으로, Foxy-5는 현재 2상 임상 시험 연구를 위해 제안되는데, 상기 연구에서 결장암 환자의 치료는 수술이 실시되기 전 진단 시점에 시작될 것이다. 최대 12주 동안 또는 화학 요법이 시작될 때까지 처리가 지속되는 것으로 의도된다.
Foxy-5 및 이의 제조 방법은 국제공개공보 WO06130082 A1에서 설명된다. 지금까지 수행된 전임상 및 임상 연구를 위한 원료의약품 (API)은 고전적인 고체상 펩티드 합성 (SPPS)에 의해 생산되었으며, Foxy-5는 선형 1+1+1+1+1+1 경로에 의해 생산된다 (도 2 참조).
따라서, 서열 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH은 Fmoc-전략 (Fmoc = 플루오레닐메틸옥시카르보닐)을 사용하여 C-말단 아미노산 Leu을 수반하는 2-클로로트리틸 수지에서 만들어진다. 합성은 SPPS 반응기에서 수행되며, 교차 커플링, 아세틸화, 및 N-α-탈보호 절차로 이루어진다. 커플링은 용매로서 DMF (N,N-디메틸포름아마이드) 또는 DMF/DCM (디클로로메탄)에서 수행된다. 필요한 경우, 활성화 시약 및 염기의 존재하에 N-α-보호 아미노산 유도체를 선행 아미노산에 커플링하는 것으로 이루어진다. 활성화제 없이 포름산은 활성 에스터와 커플링된다.
커플링이 완료되지 않은 경우, 계속될 수 있거나 절차가 반복될 수 있다. 부산물로 결실 서열이 형성되는 것을 피하기 위해, 커플링 단계 이후 체계적인 아세틸화 절차 (캡핑)가 수행되거나 또는 리커플링(recoupling) 단계 이후 리커플링이 수행되는 경우, DMF, 아세트산 무수물, 및 피리딘을 사용한다.
DMF로 수지를 세척하고, DMF에서 피페리딘으로 Fmoc-기를 절단하며, 이후 DMF로 세척하는 것으로 이루어진 N-α-탈보호 절차가 아세틸화에 뒤따른다. 불완전한 절단의 경우, 전술한 바와 같이 N-α-탈보호 절차가 반복될 수 있다. 각 단일 단계에 대해, 용매 및/또는 시약이 첨가되며, 반응 혼합물이 교반된 다음, 여과하여 수지로부터 용매 및/또는 시약을 제거한다.
수지가 완전한 펩티드 서열 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH을 수반할 때까지 커플링, 아세틸화, 및 N-α-탈보호 절차가 반복된다. 포름산 활성 에스터의 최종 커플링 후, 아세틸화는 수행되지 않는다. SPPS는 펩티드 수지를 DMF 및 IPA로 세척한 후, 감압 하에 건조함으로써 완료된다.
수지로부터의 펩티드 절단 및 측쇄 보호기의 수반되는 절단은 적절한 스캔빈저 (예컨대, 물 및 EDT)의 존재하에 펩티드 수지를 TFA로 처리하여 달성된다. 이어서, 수득된 조(crude) 펩티드는 ACN 농도구배 용출 (포름산 및 아세트산 시스템)을 이용하는 역상 컬럼에서 2차원 분취 HPLC에 의해 정제된다.
적절한 순도의 풀링된 분획이 동결 건조된다. 동결 건조물은 HPLC에 의해 분석되고, 순도에 대해 설정된 기준을 준수하지 않은 경우, 전술한 바와 같이, 2차원 분취 HPLC에 의해 선택적으로 재정제된다.
상기 개략된 SPPS 접근법은 전임상 및 초기 임상 연구에 충분한 재료를 발생시켰지만, 추가 임상 연구 및 최종 상업적 목적을 위해서는, 대규모 합성에 더 적합한 합성이 요구되며, 이에 따라 상품의 비용을 줄일 수 있고, 더 큰 배치의 Foxy-5를 사용할 수 있다.
따라서, 추가 임상 시험 공급 및 최종 상업적 목적 모두를 위한 멀티-kg 규모의 Foxy-5를 수득할 수 있는, 신뢰할 수 있는 합성 경로가 요구된다.
본 개시 내용은 "Foxy-5"(즉, For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)로 알려진 포르밀화된 헥사펩티드 및 또한 이의 보호 유도체를 포함하는, 이의 다양한 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사펩티드 단편을 제조하기 위한 여러 용액-상 방법을 제공한다. 본원에서 제공된 방법은 전통적인 고체상 합성에 비해, 낮은 원료 비용, 공정 중간체 정제의 용이성, 단편 조립의 용이성, 높은 카이랄 순도, 및 상업적 확장에 대한 적응성 등을 포함하되, 이에 제한되지 않는 여러 이점을 가지며, 아래에서 더 자세히 설명된다.
따라서, Foxy-5에 대한 확장가능한 합성 경로를 제공하는 것이 본 발명의 주요 목적이다. 약물 물질 제조의 추후 GMP(우수 의약품 제조관리 기준, Good Manufacturing Practice)의 목적을 위해, 상기 확장가능한 합성 경로에 적절한 Key 중간체를 식별하고 특성화하는 것이 추가적인 목표이다.
일반적으로 고체상 화학과 관련된 제품 비용 및 다루기 힘든 확장성을 고려하여, 용액상 화학적 경로 개발에 중점을 두었다. 따라서, 본 개시 내용은 단편 커플링 전략을 사용하여, Foxy-5 또는 이의 중간체 및 전구체를 제조하기 위한 용액상 방법을 제공한다.
3개의 상이한 접근법이 시험되었다:
·
3개의 디펩티드가 커플링되어 최종 헥사펩티드를 형성하는, 2+2+2 커플링 전략,
·
2개의 트리펩티드가 커플링되는, 3+3 커플링 전략,
·
테트라펩티드가 순차적으로 신장되는, 4+1+1 커플링 전략, 및
·
트리펩티드가 순차적으로 신장되는, 3+1+1+1 커플링 전략.
2+2+2 접근법에서 , Foxy-5의 주쇄는 3개의 독립적인 key 디펩티드 단편, KD-1, KD-2 및 KD-3의 커플링으로 조립된다. 3개의 상이한 접근법 a, b 및 c가 고안되었다 (도 5, 도 6 및 도 6a 참조). 이들 3개의 디펩티드의 용액상 단편 합성에 이어, 수렴(convergent) 방식으로 헥사펩티드가 형성되었다. 2+2+2 접근법의 보호기 전략은 N-말단 보호기 (Cbz)의 가수소 분해, 또는 단편의 N-말단 보호기 (Fmoc)의 염기 촉매 탈보호를 기초로 하며, 측쇄에 산 불안정 보호기의 사용을 포함하였다. 또한, 모든 중간체는 용액상 화학으로 접근될 수 있다. 3개의 모든 2+2+2 접근법에 대해, Met N-포르밀기는 3개의 모든 디펩티드 단편이 커플링된 후 합성의 최종 단계에서 도입된다.
3+3 접근법에서 , Foxy-5의 주쇄는 2개의 트리펩티드 단편의 용액상 단편 커플링으로 조립된다. Key 트리펩티드 KT-1 및 KT-2를 사용하는 3+3 접근법의 한 버전에서 (도 7), 포르밀기는 초기에, 즉 트리펩티드 단편 KT-1의 합성에서 도입된다. 3+3 접근법의 두번째 버전에서, 2개의 상이한 트리펩티드 단편, KT-1* 및 KT-2*의 커플링을 통해 헥사펩티드의 백본(backbone)이 확립된 후 포르밀기가 처음 도입된다 (도 7a).
본 발명의 제1 양태에서 신규한 트리펩티드 Met-Asp-Gly 및 이의 보호 유도체, For-Met-Asp(OtBu)-Gly (Key 트리펩티드-1, KT-1) 및 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly (Key 트리펩티드-1*, KT-1*)가 제공된다.
본 발명의 제2 양태에서 신규한 트리펩티드 Cys-Glu-Leu 및 이의 보호 유도체, Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-O-Me (Key 트리펩티드-2, KT-2) 및 Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (Key 트리펩티드-2*, KT-2*)가 제공된다.
본 발명의 제3 양태에서 신규한 트리펩티드 유도체 KT-1 및 KT-2의 커플링을 기반으로, 대안으로는 신규한 트리펩티드 유도체 KT-1* 및 KT-2*의 커플링을 기반으로, 보호된 형태의 헥사펩티드 Foxy-5의 생산 방법이 제공되며, 이는 커플링에 (실제 경로에 따라) 전반적 탈보호 또는 N-탈보호가 뒤따를 수 있고, 이어서, N-포르밀화 및 최종 측쇄 탈보호에 의해 원하는 헥사펩티드 Foxy-5를 수득한다.
3+1+1+1 접근법 에서, Foxy-5의 주쇄는 트리펩티드 단편 KT-2 또는 KT-2*와 아미노산 Gly, Asp 및 Met의 보호 유도체의 순차적인 용액상 커플링으로 조합되어, 보호된 형태의 Foxy-5 또는 헥사펩티드 Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH를 형성한다. 실제 경로에 따라, 전반적 탈보호 또는 N-탈보호에 이어, N-포르밀화 및 최종 측쇄 탈보호로 원하는 헥사펩티드 Foxy-5를 수득한다.
본 발명의 제4 양태에서 신규한 트리펩티드 유도체 KT-2 또는 KT-2*와 아미노산 Gly, Asp 및 Met의 보호 유도체의 순차적인 커플링을 기반으로, 보호된 형태의 헥사펩티드 Foxy-5의 생산 방법이 제공되며, 커플링 순서에 (특정 시작 트리펩티드에 따라) 전반적 탈보호 또는 N-탈보호가 뒤따를 수 있고, 이어서, N-포르밀화 및 최종 측쇄 탈보호에 의해 원하는 헥사펩티드 Foxy-5를 수득한다.
도 1은 Foxy-5의 화학 구조를 보여준다. Foxy-5는 포르밀화된 N-말단이 있는 6개의 아미노산으로 이루어진 선형 펩티드이다. 모든 광학 활성 아미노산 잔기는 L-배열로 있다. Foxy-5의 분자식은 C26H42N6O12S2이고, 분자량은 694.8 g/mol (평균 질량)이다.
도 2는 Foxy-5에 대한 SPPS 경로의 합성 계획을 보여준다.
도 3은 Key 트리펩티드 1 (KT-1), 즉 For-Met-Asp(OtBu)-Gly (도면 상단) 및 Key 트리펩티드 1* (KT-1*), 즉 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly의 화학 구조를 보여준다. 모든 광학 활성 아미노산 잔기는 L-배열로 있다. KT-1의 분자식은 C16H27N3O7S이고, 분자량은 405 g/mol (평균 질량)이다.
도 4는 Key 트리펩티드 2 (KT-2), Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (상단) 및 Key 트리펩티드 2* (KT-2*), Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-O-tert-Bu (하단)의 구조를 보여준다.
도 5는 산 불안정 보호기(acid-labile protection group) 전략에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 2+2+2 전략을 보여준다.
도 6은 가수소분해성 보호기(hydrogenolytic protection group) 전략에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 2+2+2 전략을 보여준다.
도 6 a는 염기 불안정 보호기(base-labile protection group) 전략에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 2+2+2 전략을 보여준다.
도 7은 Key 트리펩티드 1 (KT-1)와 Key 트리펩티드 2 (KT-2)의 커플링 이후, 류신 메틸 에스터의 비누화 및 tert-부틸 및 트리틸 보호기의 탈보호에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+3 전략을 보여준다.
도 7 a는 Key 트리펩티드 1* (KT-1*)와 Key 트리펩티드 2* (KT-2*)의 커플링 이후, DBU를 이용한 Fmoc의 탈보호, 포름산과의 커플링, tert-부틸 및 트리틸 보호기의 탈보호에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+3 전략을 보여주어 원하는 Foxy-5를 제공한다.
도 8은 아미노산 Gly, Asp 및 포르밀-Met를 이용한 Key 트리펩티드 2 (KT-2)의 순차적인 신장에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+1+1+1 전략을 보여준다.
도 8a는 아미노산 Fmoc-Gly, Fmoc-Asp-OtBu 및 Fmoc-Met를 이용한 Key 트리펩티드 2* (KT-2*)의 순차적인 신장에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+1+1+1 전략을 보여준다. 생성된 헥사펩티드는 DBU를 이용한 Fmoc의 탈보호, 포름산과의 커플링 및 tert-부틸 및 트리틸 보호기의 탈보호를 거쳐 원하는 Foxy-5를 제공한다.
약자
Fmoc = 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fluorenylmethoxycarbonyl)
Boc = tert - 부틸옥시카보닐(tert - 부틸oxycarbonyl)
For = 포르밀(formyl)
Trt = 트리페닐 메틸 (트리틸) (Triphenyl 메틸 (Trityl))
Cbz = 카복시벤질(carboxybenzyl)
DCHA = 디사이클로헥실아민(dicyclohexylamine)
tBu = tert - 부틸(tert - Butly)
THF = 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)
DMF = N, N-디메틸포름아마이드(N, N-Dimethylformamide)
TEA = 트리에틸아민(Triethylamine)
Bn = 벤질(Benzyl)
TFA = 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)
TIS =트리이소프로필실란(Triisopropylsilane)
HOBt = 1 -하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole)
HOSu = N-하이드록시숙신이미드(Hydroxysuccinimide)
DCM = 디클로로메탄(Dichloromethane)
HOAt = 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole)
EDAC, HCl = 1-에틸-3-(3'디메틸아미노프로필)카보디이미드, HCl (1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimide, HCl)
DIPEA = 디이소프로필아민(Diisopropylamine)
DIPE = 디이소프로필에터(Diisopropylether)
DBU = 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7엔(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)
아미노산 약자:
Met = 메티오닌
Asp = 아스파라진
Gly = 글리신
Cys = 시스테인
Glu = 글루탐산
Leu = 류신
Foxy-5 = For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu
도 2는 Foxy-5에 대한 SPPS 경로의 합성 계획을 보여준다.
도 3은 Key 트리펩티드 1 (KT-1), 즉 For-Met-Asp(OtBu)-Gly (도면 상단) 및 Key 트리펩티드 1* (KT-1*), 즉 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly의 화학 구조를 보여준다. 모든 광학 활성 아미노산 잔기는 L-배열로 있다. KT-1의 분자식은 C16H27N3O7S이고, 분자량은 405 g/mol (평균 질량)이다.
도 4는 Key 트리펩티드 2 (KT-2), Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (상단) 및 Key 트리펩티드 2* (KT-2*), Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-O-tert-Bu (하단)의 구조를 보여준다.
도 5는 산 불안정 보호기(acid-labile protection group) 전략에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 2+2+2 전략을 보여준다.
도 6은 가수소분해성 보호기(hydrogenolytic protection group) 전략에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 2+2+2 전략을 보여준다.
도 6 a는 염기 불안정 보호기(base-labile protection group) 전략에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 2+2+2 전략을 보여준다.
도 7은 Key 트리펩티드 1 (KT-1)와 Key 트리펩티드 2 (KT-2)의 커플링 이후, 류신 메틸 에스터의 비누화 및 tert-부틸 및 트리틸 보호기의 탈보호에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+3 전략을 보여준다.
도 7 a는 Key 트리펩티드 1* (KT-1*)와 Key 트리펩티드 2* (KT-2*)의 커플링 이후, DBU를 이용한 Fmoc의 탈보호, 포름산과의 커플링, tert-부틸 및 트리틸 보호기의 탈보호에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+3 전략을 보여주어 원하는 Foxy-5를 제공한다.
도 8은 아미노산 Gly, Asp 및 포르밀-Met를 이용한 Key 트리펩티드 2 (KT-2)의 순차적인 신장에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+1+1+1 전략을 보여준다.
도 8a는 아미노산 Fmoc-Gly, Fmoc-Asp-OtBu 및 Fmoc-Met를 이용한 Key 트리펩티드 2* (KT-2*)의 순차적인 신장에 기반한 Foxy-5 형성을 위한 3+1+1+1 전략을 보여준다. 생성된 헥사펩티드는 DBU를 이용한 Fmoc의 탈보호, 포름산과의 커플링 및 tert-부틸 및 트리틸 보호기의 탈보호를 거쳐 원하는 Foxy-5를 제공한다.
약자
Fmoc = 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fluorenylmethoxycarbonyl)
Boc = tert - 부틸옥시카보닐(tert - 부틸oxycarbonyl)
For = 포르밀(formyl)
Trt = 트리페닐 메틸 (트리틸) (Triphenyl 메틸 (Trityl))
Cbz = 카복시벤질(carboxybenzyl)
DCHA = 디사이클로헥실아민(dicyclohexylamine)
tBu = tert - 부틸(tert - Butly)
THF = 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)
DMF = N, N-디메틸포름아마이드(N, N-Dimethylformamide)
TEA = 트리에틸아민(Triethylamine)
Bn = 벤질(Benzyl)
TFA = 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)
TIS =트리이소프로필실란(Triisopropylsilane)
HOBt = 1 -하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole)
HOSu = N-하이드록시숙신이미드(Hydroxysuccinimide)
DCM = 디클로로메탄(Dichloromethane)
HOAt = 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole)
EDAC, HCl = 1-에틸-3-(3'디메틸아미노프로필)카보디이미드, HCl (1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimide, HCl)
DIPEA = 디이소프로필아민(Diisopropylamine)
DIPE = 디이소프로필에터(Diisopropylether)
DBU = 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7엔(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)
아미노산 약자:
Met = 메티오닌
Asp = 아스파라진
Gly = 글리신
Cys = 시스테인
Glu = 글루탐산
Leu = 류신
Foxy-5 = For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu
본원의 요약에서 언급한 바와 같이, Foxy-5 헥사펩티드 서열을 조립하기 위한 4개의 상이한 용액상 접근법, 2+2+2 경로 (3개 버전), 3+3 경로 (2개 버전), 4+1+1 경로 및 3+1+1+1 경로 (2개 버전)가 고안되었다. 전략은 이하에서 더욱 자세히 설명된다.
2+2+2 커플링 전략
2+2+2 경로 A (도 5)
제1 key 디펩티드 KD-1a (Boc-Met-Asp(OtBu)-OH)의 합성은 시판되는 Boc-Met-OH 및 HAsp(OtBu)-Ome의 커플링으로 시작된다. 그 다음, 생성된 디펩티드 Boc-Met-Asp(OtBu)-Ome는 C-말단에서 선택적으로 탈보호된다.
이어서, 제2 key 디펩티드, KD-2a (Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH)는 H-Cys-OH 및 아세톤으로부터 아세토니드 H-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH을 형성한 후, 숙신이미드 에스터 Cbz-Gly-Osu와 커플링하여 제조된다.
제3 디펩티드 KD-3a, (H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu)의 합성은 시판되는 출발 물질 Cbz-Glu(OtBu)-OH 및 H-Leu-OtBu의 커플링을 포함한다. Pd/C를 통한 수소화에 의한 후속 Cbz-탈보호로 중간체 디펩티드 H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 수득한다.
3개의 key 디펩티드 KD-1a, KD-2a 및 KD-3a로부터 경로 A에 의한 Foxy-5 의 합성은 디펩티드 KD-2a Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH 및 KD-3a H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu을 커플링함으로써 최종적으로 개시되고, 탈보호 후 테트라펩티드 Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 5)가 수득된다. 그 다음, 표준 커플링 시약의 존재하에 디펩티드 KD-1a, Boc-Met-Asp(OtBu)-OH는 테트라펩티드 Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu와 커플링된다. 전반적 탈보호는 생성된 보호 헥사펩티드를 강산으로 처리하여 수행된다. 그 다음, 후속 포르밀화로 조(crude) 형태의 표적 화합물 Foxy-5를 수득한다.
2+2+2 경로 B ( 도 6 )
제1 key 디펩티드 KD-1b (Cbz-Met-Asp(OBn)-OSu)의 합성은 해당 메티오닌 유도체로부터 숙신이미드 에스터 Cbz-Met-Osu의 형성을 포함한다. 염기성 조건하, 활성 에스터와 시판되는 H-Asp(OBn)-OH의 커플링으로 Cbz-Met-Asp(OBn)-OH 디펩티드를 수득하고, 이는 HOSu로 또한 활성화되며, 제1 디펩티드 KD-1, Cbz-Met-Asp(OBn)-Osu로 이어진다.
제2 key 디펩티드의 경우, KD-2b (H-Gly-Cys(Bn)-OH) 시스테인은 초기에 측쇄에서 벤질 보호되어 H-Cys(Bn)-OH가 수득된다. 그 다음, 시판되는 숙신이미드-활성 글리신 빌딩 블록(building block) Boc-Gly-OSu은 벤질-보호 시스테인 빌딩 블록과 커플링되어 Boc-탈보호 후 원하는 디펩티드 KD-2b, H-Gly-Cys(Bn)-OH가 수득된다.
제3 key 디펩티드, KD-3b (H-Glu(OBn)-Leu-OBn)는 활성 에스터 Boc-Glu(OBn)-OSu 및 시판되는 H-Leu-Obn의 커플링으로 형성된다.
3개의 디펩티드 단편 KD-1b, KD-2b 및 KD-3b로부터 경로 B에 의한 Foxy-5의 합성은 보호 key 디펩티드 KD-1b (Cbz-Met-Asp(OBn)-Osu) 및 KD-2b (H-Gly-Cys(Bn)-OH)의 커플링에 의해 최종적으로 개시되어 보호 테트라펩티드 Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-OH (SEQ_ID NO 12)가 수득된 후, KD-3b (H-Glu(OBn)-Leu-OBn)와 커플링되어 Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-Glu(OBn)-Leu-OBn (SEQ_ID NO 13)가 수득된다. 그 다음, 이러한 보호 헥사펩티드는 Pd/C를 통한 수소화에 의해 전반적으로 탈보호되어 헥사펩티드 Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_ID NO 14)가 수득되고, 이는 마지막 화학적 단계에서 포르밀화되어 조 형태의 원하는 헥사펩티드 Foxy-5가 수득된다..
테트라펩티드 Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_ID NO 8) 및 Met-Asp-Gly-Cys-OH (SEQ_ID NO 11)와 본원에 기술된 이들 2개의 보호 유도체, Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 5) 및 Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-OH (SEQ_ID NO 12)는 신규한 화합물이라는 점이 주목된다. 마찬가지로, 보호 헥사펩티드 Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-Glu(OBn)-Leu-OBn (SEQ_ID NO 13)는 신규한 화합물이다.
2+2+2 경로 C (도 6a)
제1 key 디펩티드 KD-1c, Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH 의 합성은 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC)을 이용한, 시판되는 Fmoc-Met-OH 및 H-Asp(OtBu)-OH의 커플링으로 수행되었다.
제2 key 디펩티드 KD-2c, Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH의 합성은 보호 디펩티드가 시판되므로 배제되었다.
제3 key 디펩티드 KD-3c, Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu 의 합성은 EDAC, HCl, HOBt 및 DIPEA의 존재하에 고희석 DCM에서 시판되는 t-부틸 류시네이트.HCl와 Fmoc-Glu-(OtBu)를 커플링하여 수행되었다.
3개의 디펩티드 단편 KD-1c, KD-2c 및 KD-3c로부터 경로 C에 의한 Foxy-5의 합성은 보호 key 디펩티드 KD-3c, Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu와 KD-2c, Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH의 커플링으로 최종적으로 개시되어 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 수득하고, 이는 이어서 KD-1c, Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH와 반응하여 보호 헥사펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)를 수득하고, 이어서 DCM에서 DBU로 Fmoc 탈보호를 한 다음, EDC.HCl, HOBt.H2O 및 DIPEA의 존재하에 포름산과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 15)을 수득한다.
이러한 보호 헥사펩티드 (SEQ_ID NO 15)를 TFA/(i-Pr)3SiH/DTT의 칵테일에서 용해 및 교반하여 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)하였다. 반응 완료 후, 조 생성물은 THF/MTBE로 침전시켜 97% 수율 (9.5 gr)의 고체로 수득하였다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 97.6% 순도로 수득하였다.
3+3 커플링 전략 (
도 7 및 7a
)
단편 KT-1 (For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)의 합성은 글리신을 글리신 메틸 에스터로 전환함으로써 개시된다. 시판되는 Fmoc-Asp-(O-tBu)와 이의 커플링으로 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Ome를 수득한다. Fmoc 탈보호에 이어, 시판되는 For-Met-OH와의 커플링으로 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe를 수득한다. 후자를 메틸 에스터의 가수분해하여 원하는 단편 KT-1을 수득한다.
포르밀기 (또는 또 다른 아실기)의 추후 선택적 도입을 허용하기 위해, 단편 KT-1, KT-1* (Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)의 변형 버전도 또한 만들어지고, 여기서 디펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OMe는 먼저 Fmoc 탈보호된 후, 시판되는 Fmoc-Met-OH와 커플링된다.
단편 KT-2 (Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe)의 합성은 L-류신을 이의 메틸 에스터로 전환함으로써 개시된다. 시판되는 Fmoc-Glu-(OtBu)와 이의 아미드 결합 형성으로 Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-OMe를 수득한다. 탈보호 및 시판되는 Fmoc-Cys(Trt)-OH와의 추가 커플링으로 원하는 단편 KT-2를 수득한다.
대체 단편 KT-2* ( Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu) 의 합성은 t-부틸 류시네이트.HCl와 Fmoc-Glu-(OtBu)의 커플링으로 실현되어 Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu (즉, KD-3c)가 수득된다. 디펩티드는 분리되지 않고 (DBU로 Fmoc 탈보호 후) Fmoc-Cys(Trt)-OH와 직접 커플링되어 원하는 단편 KT-2*가 수득된다.
트리펩티드 단편 KT-1 및 KT-2로부터 Foxy-5의 합성은 KT-2의 Fmoc-탈보호를 시작으로 실현된다. KT-1와의 후속 커플링으로 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe를 수득한다. 염기성 조건하, 이의 비누화로 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH를 수득하고, 후자를 tert-부틸 및 트리틸 보호기의 탈보호하여 조 형태의 원하는 헥사펩티드 Foxy-5를 수득한다.
대안으로 (도 7a), 트리펩티드 단편 KT-1* 및 KT-2*로부터 Foxy-5의 합성은 KT-2*의 Fmoc-탈보호를 시작으로 실현된다. KT-1*와의 후속 커플링으로 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)를 수득하고, 이어서 DBU로 Fmoc 탈보호한 후, 포름산과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH를 수득한다. 이러한 보호 헥사펩티드는 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)되어 조 형태의 Foxy-5가 수득된다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 97.6% 순도로 수득하였다.
4+1+1 커플링 전략
4+1+1 커플링 전략에 의한 Foxy-5의 합성은 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 Fmoc-Asp-OtBu 및 Fmoc-Met와의 순차적인 커플링에 이어, Fmoc 제거, 포르밀화 및 탈보호에 의해 개시된다. 테트라펩티드 자체는 본원에서 전술된 디펩티드 단편 KD-3c Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu 및 KD-2c Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH의 커플링에 의해 수득된다.
이어서, 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)는 Fmoc-Asp-OtBu와 커플링되어 보호 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 10)가 수득되고, 이어서 Fmoc-메티오닌과 커플링되어 보호 헥사펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)가 수득된다. 이는 이어서 DBU로 Fmoc 탈보호를 거친 후, 포름산과 커플링되어 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 15)가 수득된다. 이러한 보호 헥사펩티드는 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)되어 조 형태의 Foxy-5가 수득된다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 97.6% 순도로 수득하였다.
3+1+1+1 커플링 전략 (
도 8 및 8a
)
3+1+1+1 커플링 전략에 의한 Foxy-5의 합성은 단편 KT-2 (Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe)와 Fmoc-Gly-OH의 순차적인 커플링으로 개시되어 보호 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NOSEQ_ID NO 7)가 수득되고, 이어 Fmoc-Asp-OtBu와 커플링되어 보호 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 9)가 수득되고, 포르밀-메티오닌과 커플링되어 보호된 형태의 Foxy-5, 즉 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 3)가 수득된다.
Foxy-5 자체의 합성은 위의 3+3 커플링 전략과 동일한 전략, 즉 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OH (SEQ_ID NO 4)를 수득하기 위한 류신 메틸 에스터의 비누화 및 조 형태의 Foxy-5를 수득하기 위한 트리틸 및 tert-부틸 보호기의 최종 제거에 의해 최종적으로 달성된다.
대안으로, 3+1+1+1 커플링 전략에 의한 Foxy-5의 합성은 단편 KT-2* ( Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu) 과 Fmoc-Gly-OH의 순차적인 커플링으로 개시되어 보호 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)가 수득되고, 이어 Fmoc-Asp-OtBu와 커플링되어 보호 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 10)가 수득되고, 이어 Fmoc-메티오닌과 커플링되어 보호 헥사펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)가 수득된다. 이는 이어서 DBU로 Fmoc 탈보호를 거친 후, 포름산과 커플링되어 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 15)가 수득된다. 이러한 보호 헥사펩티드는 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)되어 조 형태의 Foxy-5가 수득된다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 97.6% 순도로 수득하였다.
트리펩티드 For-Met-Asp-Gly-OH 및 본원에 기재된 보호 유도체, For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe 및 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH는 신규한 화합물이라는 점이 주목된다. 마찬가지로, 트리펩티드 Met-Asp-Gly 및 본원에 기재된 보호 유도체, Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe, Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OtBu 및 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH (KT-1*)는 신규한 화합물이다. 마찬가지로, 트리펩티드 Cys-Glu-Leu-OH 및 본원에 기재된 보호 유도체, Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe, (Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu) 및 Cys-Glu-Leu-OMe는 신규한 화합물이다.
테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 7) 및 Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6), 보호 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 9) 및 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 10), 및 보호 Foxy-5 유도체 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 3) 및 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 15)는 모두 신규한 화합물이라는 점이 추가로 주목된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서,
a)
PG
1
-Cys(PG
2
)Glu(OPG
3
)-Leu-OR
1
b)
PG
5
-Met-Asp(OPG
4
)-Gly-OR
2
c)
PG
1
-Gly-Cys(PG
2
)Glu(OPG
3
)-Leu-OR
1
로부터 선택된 Foxy-5 (For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)의 보호 트리펩티드 단편이 제공되며,
여기서 PG1은 H 및 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 또는 Boc와 같은 보호기로부터 선택되고, PG2는 H 및 아세토니드 (슈도프롤린, ψMe,MePro), 트리틸 (Trt)로부터 선택된 보호기로부터 선택되고, PG3은 H 및 tert-부틸 (tBu)로부터 선택되는 보호기로부터 선택되고, PG5는 포르밀기 또는 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)와 같은 염기-민감성 보호기이며, PG4는 H 및 tert-부틸 (tBu)로부터 선택되는 보호기로부터 선택되고, 및 R1 및 R2는 H 및 메틸, 에틸 또는 tert-부틸 (tBu)와 같은 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
바람직한 일 구체예에서 PG 1 -Cys(PG 2 )Glu(OPG 3 )-Leu-OR 1 인 Foxy-5의 보호 트리펩티드 단편이 제공되며, 여기서 PG1, PG2, PG3 및 R1은 위에서 정의된 바와 같다. 특히 바람직한 일 구체예에서 상기 트리펩티드 단편은 Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe이다.
또 다른 바람직한 구체예에서 PG 5 -Met-Asp(OPG 4 )-Gly-OR 2 인 Foxy-5의 보호 트리펩티드 단편이 제공되며, PG5, PG4 및 R2는 위에서 정의된 바와 같다. 특히 바람직한 일 구체예에서 상기 트리펩티드 단편은 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OtBu이다.
본 발명의 추가 양태에서, Foxy-5의 보호 유도체, PG 5 -Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 제조하기 위한 용액상 방법을 제공하며, 상기 방법은:
a.
디펩티드 Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu (KD-3c)를 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH (KD-2c)와 커플링하여 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 수득하고, PG 5 -Met-Asp(OtBu)-OH와 커플링하는 단계, 또는
b.
트리펩티드 PG 5 -Met-Asp(OtBu)-Gly-OH를 Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (KT-2*)와 커플링하는 단계, 또는
c.
트리펩티드 Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (KT-2*)를 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp-OtBu 및 PG 5 -Met와 순차적으로 커플링하는 단계, 또는
d.
테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 Fmoc-Asp-OtBu 및 PG 5 -Met와 순차적으로 커플링하는 단계
선택적으로 이어서 컬럼 크로마토그래피에 의해 조 헥사펩티드를 정제한 다음, 유기 용매로부터 고체로서 침전시키는 단계를 포함하고, 여기서 PG 5 는 포르밀기 또는 Fmoc와 같은 염기 민감성 보호기이다.
추가 양태에서 본 발명은 PG 5 -Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 Foxy-5 (For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)로 전환하기 위한 용액상 방법을 제공하며, 상기 방법은:
PG 5 = 포르밀인 경우:
i.
For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_NO 15)의 탈보호로 조 형태의 Foxy-5를 수득하는 단계,
또는 PG 5 = Fmoc와 같은 염기 민감성 보호기인 경우:
ii.
헥사펩티드 PG 6 -Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu로부터 PG 5 를 제거한 다음, 포름산과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_NO 15)를 수득하는 단계,
iii. For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_NO 15)의 탈보호로 조 형태의 Foxy-5를 수득하는 단계,
이어서:
a.
선택적으로 컬럼 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제한 뒤, 선택적으로 유기 용매로부터 고체로서 침전시키는 단계,
b.
선택적으로 결정형과 같은 고형의 알칼리 또는 산성 염으로서 형성된 Foxy-5 헥사펩티드를 침전시키는 단계
를 포함한다.
바람직한 구현예에서, PG5는 Fmoc이다.
실시예
2+2+2 경로
실시예 1 - Key 디펩티드 KD-1a
Boc-Met-Asp(OtBu)-OH
의 제조
표적 디펩티드의 메틸 에스터 Boc-Met-Asp(OtBu)-OMe의 합성을 다음과 같이 수행하였다: Boc-Met-OH (2.6 g, 10.4 mmol, 1.0 eq)를 DMF (건조) (25 ml)에서 용해시키고, DCC (2.2 g, 10.4 mmol, 1.0 eq), 및 HOAt (1.4 g, 10.4 mmol, 1.0 eq)를 첨가하였다. 건조 100 ml 둥근 바닥 플라스크에서 DMF (건조) (50 ml)에 H-Asp(OtBu)-OMe·HCl (2.5 g, 10.4 mmol, 1.0 eq)를 DIPEA (1.8 ml, 10.4 mmol, 1.0 eq)와 합쳤다. 두 용액 모두 0℃로 냉각하였다. 10분 후, 아스파르트산염 유도체를 포함하는 용액을 메티오닌 용액에 드롭(drop) 방식으로 전달하였다. 반응을 72시간에 걸쳐 실온으로 온도를 가하였다. 수성 산 (0.5 M 시트르산) 및 염기 (sat. NaHCO3)을 워크업 후, 수득된 물질을 LCMS로 분석하였다. 일부 용매 신호 (EtOAc) 및 불순물이 관찰되었지만, 신호는 Boc-Met-Asp(OtBu)-OMe 화합물의 구조와 일치하였다.
후속 단계에서, 중간체 메틸 에스터 Boc-Met-Asp(OtBu)-OMe (3.5 g, 8.1 mmol, 1.0 eq)를 1,4-디옥산/MeOH (14:1) (75 ml)에서 용해시키고, 새로 제조된 3.6 M NaOH (aq) 용액, (2.3 ml, 8.5 mmol, 1.0 eq)을 첨가하였다. 반응을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 샘플링하였다. LCMS 분석은 출발 물질이 완전히 소모되었음을 나타내었다. 2.031분 (70 면적%)에 주요 신호는 표적 분자 Boc-Met-Asp(OtBu)-OH 질량 (M = 420 g/mol, found: m/z+ = 421 [M+H]+, 443 [M+Na]+)을 보여주었다. Boc-Met-Asp-OH로 식별될 수 있는 부산물이 관찰되었고; 따라서, 비누화 반응을 위한 짧은 반응 시간 (<18 시간)이 권장된다. 표적 화합물, Key 디펩티드 KD-1a (Boc-Met-Asp(OtBu)-OH)를 63% 수율, 70 면적% (LCMS) 순도로 수득하였다.
실시예 2 - Key 디펩티드 KD-2a
Cbz-Gly-Cys(ψ
Me,Me
Pro)-OH
의 제조
250 ml 둥근 바닥 플라스크에 L-시스테인 염산염 일수화물 (5.0 g, 28.5 mmol) 및 아세톤 (80 ml, 1088 mmol) (p.a. 품질)을 첨가하였다. 그 다음, 반응 (0.36 molar)을 1.5시간 동안 가열 환류하였다. 30분 후, 백색 현탁액은 두꺼운 슬러리로 변하였다. 과량의 아세톤을 여과하고 후속적으로 제거하여 백색 무정형의 고체 4.7 g을 수득하였다. 1H NMR 분석은 약 50%의 미반응 시스테인이 남아 있음을 나타내었다. 프롤린 아세토니드의 수율 및 품질을 개선하기 위해, 백색 무정형의 고체 (4.72 g)를 더 희석된 반응 혼합물 (0.14 M)에서 아세톤 (200 ml)으로 2번 처리하였다. 현탁액을 2시간 동안 환류하였다. 이어서, 현탁액을 실온으로 서서히 냉각시킨 다음, 0℃에서 30분 동안 냉각시켰다. 얼음처럼 차가운 현탁액을 p3 유리 필터를 통해 여과하고, 아세톤 (2 x 10 ml)으로 헹구었다. 잔류 아세톤을 진공에서 제거하였다. 원하는 아세토니드 H-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH (4.4 g, 27 mmol, 95 % 수율)를 백색 분말로서 우수한 수율과 순도로 수득하였다. 생성물의 1H NMR (DMSO) 스펙트럼은 표적 분자 구조와 일치하였고, 출발 물질 H-Cys-OH의 신호를 나타내지 않았다.
후속 단계에서, 아세토니드 중간체 H-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH (1.0 g, 6.2 mmol, 1.0 eq)를 DMF (50 ml)에 용해시키고, 트리에틸아민 (2.6 ml, 19 mmol, 3.0 eq)을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 시판되는 Cbz-Gly-OSu (2.4 g, 6.2 mmol, 1.0 eq)을 첨가하고, 혼합물이 현탁액으로 남아있는 기간 동안 반응 혼합물을 18시간 동안 교반하였다.
pH = 4가 될 때까지 1,4-디옥산 (10.11 ml, 10.11 mmol)에 4M 염산을 첨가하여 반응 혼합물을 산성화하였다. 이 시점에 고체가 침전되었고; 이를 여과에 의해 수집하였다. 잔류물은 주로 Et3N·HCl 염으로 이루어졌다. 250 ml 물을 여과액에 첨가하고, EtOAc (3 x 50 ml)로 추출하였다. 이어서, 결합된 유기상을 염수 (2 x 50 ml)로 세척하고, Na2SO4상에 건조시키고, 여과하고 농축하여 회백색 고체 (1.58 g)를 수득하였다. 결합된 유기상의 LCMS 분석은 디펩티드 Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH (M = 352 g/mol, found: m/z-= 351 [M-H]-, 703 [2M-H]-)를 나타내는 2.003분 (77 면적%)에서의 주요 신호를 보여주었다. 1.779분 (9 면적%)에서, Cbz-Gly-OH를 관찰하였다 (1.887분에서 숙신이미드 에스터 Cbz-Gly-OSu 는 관찰되지 않았으며, 이는 출발 물질의 가수분해를 나타냄).
이어서, 수성상을 pH = 1로 추가로 산성화하고, EtOAc (3 x 50 ml)로 다시 추출하였다. 결합된 유기상을 염수 (3 x 50 ml)로 세척하고, Na2SO4상에 건조시키고, 여과하고 농축하여, 황색 오일 (2.60 g)을 수득하였다. LCMS 분석은 2.006 분 (66 면적%)에서 표적 분자를 보여주었다. 주요 부산물 신호를 1.778분 (20 면적%)에서 관찰하였고, 이는 Cbz-Gly-OH로부터 기인하였다. 추가 정제 없이, 디펩티드 Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH의 결합된 수율은 4.2 g (70% LCMS 순도 기준, 83%)이었다. 주요 불순물은 Cbz-Gly-OH로 식별되었다.
실시예 2a -대체 디펩티드 KD-1c
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH
의 제조
WO1990008773A1에 따라, Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Met-OSu를 0℃, 3.5시간 동안 테트라하이드로퓨란 (THF, 200 ml)에서 Fmoc-Met-OH (14.87 g), N-하이드록시숙신이미드 (HOSu, 5.52 g), 및 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC, 8.26 g)의 반응으로 원위치(in situ)에서 제조하였다. 침전된 디시클로헥실우레아 (DCU)를 여과로 제거하였고, THF 여과액을 40 ml의 N 수산화 나트륨이 첨가된 220 ml의 10:1 물/THF 중의 H-Asp(OtBu)-OH의 차가운 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 고체 시트르산 (20 g)을 EtOAc (600 ml)와 함께 첨가하였다. EtOAc 층을 분리하고, 10% 시트르산 및 염수로 세척하고 건조시켰다 (황산 마그네슘). EtOAc 용액의 증발로 잔류물을 수득하며, 이를 200 ml의 EtOAc에 용해시키고, 디사이클로헥실아민 (DCHA, 7.84 ml)으로 처리하여 17.93 g의 원하는 생성물의 DCHA 염을 침전시켰다 (녹는점 159-162℃).
실시예 3 - Key 디펩티드 KD-3a
H-Glu(OBn)-Leu-Obn
의 제조
250 ml 둥근 바닥 플라스크에서, 시판되는 Cbz-Glu(OtBu)-OH (5.0 g, 14.8 mmol, 1.0 eq)의 냉각된 용액을 무수 MeCN (25 ml) 중에 HOAt (2.4 g, 17.8 mmol, 1.2 eq), 및 DCC (3.7 g, 17.8 mmol, 1.2 eq)와 합쳤다. 이 용액에 무수 MeCN (50 ml) 중 H-Leu-OtBu·HCl (3.3 g, 14.8 mmol, 1.0 eq) 및 DIPEA (2.58 ml, 14.82 mmol)의 혼합물을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물 (0.2 molar)을 0℃에서 교반하면서, 18시간 동안 실온으로 점진적으로 증가시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 9.1 g (70 면적%의 HPLC 순도 기준, 최대 83% 수율)의, 여러 시간 동안 방치시 서서히 고형화되는, 두꺼운 황색 오일을 수득하였다. 이의 일부 (5.2 g)를 50 ml EtOAc에 현탁시키고, 30 ml H2O를 첨가하였다. 유기상을 세척하고 증발시켰다; 2.9 g의 백색 고체를 수득하였다. HPLC 분석은 4.105분 (76 면적%)에서 생성물을 나타내었다. 1H NMR 분석은 표적 분자와 일치하였고, 크로마토그래피 없이, 계산된 52%의 수율 및 76%의 평균 순도 (HPLC 분석 기준), 및 1H NMR 분석 기준 95% 순도를 가진 63%의 수율로 Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 후속 반응에 사용하였다.
최종적으로, 철저한 촉매 스크리닝 후, 이어서 Noblyst Pd/C 촉매 유형 P1141을 사용하여 Cbz 탈보호를 수행하고, 표적 디펩티드 KD-3a, H-Glu(OBn)-Leu-OBn를 수득하였다. 이러한 반응을 위해, Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (1.5 g, 3.0 mmol, 1.0 eq)를 MeOH (20 ml)에 용해시키고, Pd (활성 탄소에 10%, 유형 Noblyst P1141) (500 mg, 470 μmol, 0.2 eq)를 첨가하였다. H2는 1시간 동안 용액을 통해 버블링되었다. 이어서, 반응을 수소 대기 (1 기압)하에 18시간 동안 교반하였다. HPLC 분석 (18시간 후 수행함)은 출발 물질의 완전한 전환을 보였으며, 3.391분에 주로 톨루엔 신호를 보였고, 2.843분에 표적 분자 신호를 보였다. 반응 혼합물을 P3 유리 필터에서 셀라이트를 통해 여과시켰다. 잔류물을 MeOH (3 x 1 ml)으로 헹구고, 여과액을 진공에서 농축시켰다. 표적 화합물 HGlu(OtBu)-Leu-OtBu을 황색 오일, 1.02 g (92% 수율) 및 HPLC 분석 기준 95 면적% 순도로 수득하였다. 이 물질을은 수득한대로 후속 반응에 사용하였다.
실시예 3a - 대체 Key 디펩티드 KD-3c
Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu
의 제조
EDAC, HCl (2.0 eq), 및 HOBt (2.0 eq) 및 DIPEA (5.0 eq)의 존재하에 고희석 (50 vol) 디클로로메탄에서 50 gr t-부틸 류시네이트.HCl을 1.3 eq Fmoc-Glu-(OtBu)와 초기에 0-5℃에서 1시간 동안, 이어서 15-20℃에서 1시간 동안 커플링하여, 디펩티드 Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu (KD-3c)를 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 동일성을 확인하였다. Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH와의 반응을 위해, 생성물 분리를 생략하고, 디클로로메탄 용액을 수성 워크업 후, 실시예 4a에서 직접 사용하였다.
실시예 4 - 테트라펩티드
Gly-Cys(ψ
Me,Me
Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu
(SEQ_ID NO 5)의 제조
후속 반응은 DCC 및 HOAt의 존재하에 디펩티드 H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu 및 Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH의 커플링을 포함하였다.
커플링 반응을 다음과 같이 수행하였다: H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (898 mg, 2.4 mmol, 1.0 eq)를 건조 DMF (20 ml)에서 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, DCC (498 mg, 2.4 mmol, 1.0 eq) 및 HOAt (328 mg, 2.4 mmol, 1.0 eq)을 첨가하였다. 혼합물에 Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-OH (850 mg, 2.4 mmol, 1.0 eq)을 첨가하며, 반응 혼합물을 교반하고, 18시간 동안 실온으로 점진적으로 온도를 증가시켰다.
반응 혼합물을 P3 유리 필터에서 셀라이트를 통해 여과시켰다. 잔류물을 DMF (2x5ml)으로 헹구었다. 여과액에 100 ml H2O을 첨가하여, 유백색의 콜로이드성 용액이 형성되었다. EtOAc (50 ml)를 첨가하였다. 상 분리는 매우 느렸고, 혼합물에 약 20 gr의 NaCl를 첨가하기로 결정하여, 혼합물이 약간 맑아지고 투명한 상 분리가 나타났다. 이어서, 수성상을 EtOAc (50 ml)로 2번 추출하였다. 생성된 수성상은 LCMS 분석을 위해 샘플링되었고, 생성물을 포함하지 않는다. 표준 절차에 따라 결합된 유기상을 워크업하여, 1.41 g의 황색 오일을 수득하였고, 이는 Et2O와 함께 증발하여 회백색의 부피가 큰 고체 (1.41 g, 58% 수율, 70% 순도 기준)로 고형화되었다. LCMS 분석은 2.034분에서의 신호에 해당하는 (M = 224 g/mol, found: m/z+ =225 [M+H]+, 449 [M+Na]+) 약 6 면적% DCC가 존재하였다는 것을 나타내었다. 2.297분에, 미지의 화합물이 m/z+ = 452, 579 (16 면적%)로 관찰되었다. 표적 분자 Cbz-Gly-Cys(Ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu가 2.404분에 (76 면적%) (M = 706 g/mol, found: m/z+ = 707 [M+H]+, 729 [M+Na]+) 관찰되었다.
이어서, 디펩티드 Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu의 탈보호 반응에서 이전에 언급한 Noblyst P1141 촉매를 이용하여, Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu의 후속 Cbz-탈보호를 수행하였다. 특히, 스크리닝 실험에서 좋은 반응성을 보이고 출발 물질이 반응 시간 18시간 이내에 완전히 전환되었기 때문에 이러한 촉매를 선택하였다. 그러므로, 이러한 조건을 또한 테트라펩티드 Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu의 선택적 Cbz-탈보호에도 적용하였다. 초기 실험 반응은 테트라펩티드 (Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu)의 수소화가 만족스러운 반응 속도를 위해 디펩티드 Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu에서 사용된 것보다 더 많은 Pd/C를 필요로 한다는 것을 나타내었다.
이러한 반응을 위해, Cbz-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (700 mg, 1.0 mmol, 1.0 eq)을 MeOH (10 ml)에서 용해시키고, Pd/C (Noblyst P1141, 10% (w/w) Pd, 60% H2O) (700 mg, 40 μmol, 4 mol%)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 대기 (1 기압)하에 교반하였다. 반응은 HPLC 분석으로 이어졌다.
5시간 반응 시간 후, 여전히 23 면적%의 출발 물질이 관찰되었다. 24시간 후, HPLC 분석은 12 면적%의 출발 물질이 여전히 남아있음을 나타내었다. 이어서, 추가 양의 Pd/C cat. (200 mg)를 첨가하였다. 72시간 총 반응 시간 후, HPLC 분석은 출발 물질이 거의 완전히 소모되었음 (0.84 면적% 남음)을 나타내었다. 반응 혼합물을 P3 유리 필터에서 하이플로(hyflo)를 통해 여과시키고, MeOH (3x5 ml)으로 헹구었다. 여과액을 진공에서 농축시켜 550 mg의 황색 오일을 수득하였다. HPLC 분석은 1.929분 (81 면적%)에 표적 분자 질량 (M = 572 g/mol, found: m/z+ 573 [M+H]+)을 나타내는 주요 신호를 보여주었다.
테트라펩티드 H-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (550 mg, 0.78 mmol, 79 % 수율)을 80% 순도 (LCMS 기준)로 수득하였다.
실시예 4a - 대체 테트라펩티드
Fmoc
-
Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu
(SEQ_ID NO 6)의 제조
수득된 디펩티드 KD-3c Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu의 후속 반응은 상기 언급된 (실시예 3a) 디클로로메탄 용액을 사용하여 수행한다. DBU로 Fmoc 탈보호가 달성되었고, DIPEA (3 eq), EDC.HCl (2.0 eq) 및 HOBt (2.0 eq)의 존재하에 1.3 eq Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH (시판됨)와의 커플링을 수행하여, 보호 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 수득한다. DCM 층을 물과 염수로 세척하며, 10-15 vol으로 농축하고, 분리 없이 다음 단계 (실시예 5a)에서 그대로 사용한다.
실시예 5 - 헥사펩티드
Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Ψ
Me,Me
Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu
(SEQ_ID NO 2)의 제조
이어서, 헥사펩티드 Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 수득하기 위한 Boc-Met-Asp(OtBu)-OH 및 H-Gly-Cys(ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu의 펩티드 커플링을 커플링 시약 DCC 및 첨가제 HOAt의 존재하에 DMF에서 18시간 동안 실온에서 수행하였다.
이러한 반응을 위해, Boc-Met-Asp(OtBu)-OH (200 mg, 0.48 mmol, 1.0 eq)를 DMF (2.0 ml)에서 용해시키고, 얼음 배치에서 냉각시켰다. 투명한 용액에 HOAt (65 mg, 0.48 mmol, 1.0 eq), 및 DCC (98 mg, 0.48 mmol, 1.0 eq)를 첨가하였다. 15분 후, HCys(Ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (272 mg, 0.48 mmol, 1.0 eq)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 서서히 온도를 가면서 18시간 동안 교반하였다. 이어서, 표준 절차에 따라 반응 혼합물을 워크업하였다. 워크업된 배치의 LCMS 분석은 2.760분 머무름 시간 (M = 974 g/mol, found: m/z+ = 975 [M+H]+, 997 [M+Na]+)에서 표적 분자 Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 보여주었다. 표적 분자 Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Ψ Me,Me Pro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 백색의 부피가 큰 고체로서, 84% 의 순도 기준 (LCMS) 76% 수율(420 mg, 0.36 mmol)로 수득하였다.
실시예 5a 대체 헥사펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)의 제조 및 이의 Foxy-5로의 전환
농축 DCM 용액으로서 상기 실시예 4a에서 수득된 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)는 먼저 DBU와 반응하여 Fmoc 탈보호를 달성한다. 다음 커플링 단계를 진행하기 전에, 실리카 플러그를 통해 반응물을 통과시켜 DBU를 제거한다. 실리카 플러그 처리 후, DIPEA (3.0 eq), EDC.HCl (2.0 eq), 및 HOBt.H2O (2.0 eq)의 존재하에 DCM 용액은 상기 실시예 2a에서 DCHA 염으로 수득된 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH (KD-1c)와 반응하여 (유리 후), 보호 Foxy-5 유도체 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)를 조 형태로 수득한다. 이어서, DBU로 Fmoc 탈보호를 거친 후, EDC.HCl, HOBt.H2O 및 DIPEA 의 존재하에 포름산과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 15)를 수득한다. 이러한 보호 헥사펩티드를 TFA/(i-Pr)3SiH/DTT의 칵테일에서 용해 및 교반하여 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)하였다. 반응 완료 후, 조 생성물은 THF/MTBE로 침전시켜 고체로 수득하였다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 >90% 수율 및 약 97% 순도로 수득하였다.
3+3 경로
실시예 6 - 단편 KT-1 및 KT-1*(각각
For-Met-Asp(OtBu)-Gly-O
H 및
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)
의 제조
실시예 6a -트리펩티드 KT-1* (Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)의 제조에서 포르밀-메티오닌 대신 Fmoc-메티오닌1 1 To allow for optional later introduction of the 포르밀기. 을 사용한 실시예
글리신 메틸 에스터 (25 gr)를 DIPEA (1.0 eq), EDAC, HCl (2.0 eq), 및 HOBt (2.0 eq)의 존재하에 DMF에서 Fmoc-Asp(OtBu)-OH와 반응시켰다. 표준 워크업 후, 15% EtOAc/n-헥산을 사용하여 조 생성물을 실리카 겔 상에서 정제하였다. 이의 1 gr을 Fmoc-Met와 커플링하여 보호 트리펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe (2.0 gr, 72.7%)를 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 동일성을 확인하였다.
실시예 6b -단편 KT-1 (For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)의 제조
실시예 6a에 개략된 절차에 따라 글리신 메틸 에스터를 Fmoc-Asp(OtBu)-OH와 커플링하여 보호 디펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OMe를 수득하였다. 이의 Fmoc 탈보호는 DBU로 달성되었고, DIPEA (1.0 eq), EDAC, HCl (2.0 eq), 및 HOBt (2.0 eq)의 존재하에 DCM에서 시판되는 For-Met-OH와 커플링하여 원하는 단편 KT-1을 수득한다.
실시예 7 - 단편 KT-2 (
Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe
)의 제조
Fmoc 류신 (250 gr)을 메탄올에서 용해시키고, 티오닐 클로라이드를 처리하여 정량적 수율의 Fmoc 메틸 류시네이트로 전환시켰다. 디클로로메탄에서 DBU를 사용한 Fmoc 탈보호로 원하는 류신 메틸 에스터 (76 gr, 전체 수율 74%)를 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 동일성을 확인하였다. 다음으로, EDAC, HCl (2.0 eq), 및 HOBt (2.0 eq)의 존재하에 고희석 디클로로메탄에서, 10 gr 류신 메틸 에스터와 Fmoc-Glu-(OtBu)을 초기에 0-5℃에서 1시간 동안 이어서 15-20℃에서 1시간 동안 커플링하여, 디펩티드 Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OMe (7.2 gr, 전체 수율 55%)을 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 동일성을 확인하였다. 다음 단계에서 Fmoc 시스테인과의 반응을 위해, 생성물 분리를 생략하고, 디클로로메탄 용액을 수성 워크업 후, 직접 사용하였다. 따라서, 수득된 디펩티드 Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OMe의 후속 반응은 상기 언급된 디클로로메탄 용액을 사용하여 수행하였다. Fmoc 탈보호는 DBU로 달성되고, EDAC, HCl (1.2 eq), 및 HOBt (1.2 eq)의 존재하에 Fmoc-Cys(Trt)-OH와 커플링하여 단편 KT-2 Fmoc-Cys(Trt)-Glu-(OtBu)-Leu-OMe (6.6 gr, 두 커플링 반응에 걸쳐 전체 수율 88%)을 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 동일성을 확인하였다.
실시예 8 - 대체 트리펩티드 단편
Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu
(KT-2*)의 제조.
EDAC, HCl (2.0 eq), 및 HOBt (2.0 eq) 및 DIPEA (5.0 eq)의 존재하에 고희석 (50 vol) 디클로로메탄에서 50 gr t-부틸 류시네이트.HCl을 초기에 0-5℃에서 1시간 동안, 이어서 15-20℃에서 1시간 동안 커플링하여 디펩티드 Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu (KD-3c)을 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 동일성을 확인하였다. 다음 단계에서 Fmoc-Cys(Trt)-OH와의 반응을 위해, 생성물 분리를 생략하고, 디클로로메탄 용액을 수성 워크업 후, 직접 사용하였다. 따라서, 수득된 디펩티드 KD-3c의 후속 반응은 상기 언급된 디클로로메탄 용액을 사용하여 수행하였다. Fmoc 탈보호는 DBU로 달성되고, EDAC, HCl (1.2 eq), HOBt (1.2 eq) 및 DIPEA (5 eq)의 존재하에 1.3 eq Fmoc-Cys(Trt)-OH와 커플링하여 조 트리펩티드 KT-2*를 얻고, 용리제로서 EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔 (100-200)상에서 크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체 (148 gr, 두 커플링 반응에 걸쳐 전체 수율 68%)로서 트리펩티드 KT-2* Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu 을 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 동일성을 확인하였다.
상기 단축 반응을 75 gr t-부틸 류시네이트.HCl로부터 반복하여 208 gr KT-2*를 수득하였다.
실시예 9a - 트리펩티드 단편 KT-1 및 KT-2의 커플링 후 탈보호에 의한 Foxy-5의 제조.
2개의 트리펩티드 단편, KT-1 및 KT-2로부터 Foxy-5의 합성은 KT-2의 Fmoc-탈보호를 시작으로 실현된다. KT-1와의 후속 커플링으로 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe를 수득한다. 이어서, 염기성 조건하에, 비누화로 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH를 수득하고, 후자를 O-tBu 및 트리틸 보호기의 탈보호하여 조 형태의 원하는 헥사펩티드 Foxy-5를 수득한다.
실시예 9b - 트리펩티드 단편 KT-1* 및 KT-2*의 커플링에 이어서 Fmoc 제거, 포르밀화 및 탈보호에 의한 Foxy-5의 제조
2개의 트리펩티드 단편, KT-1* 및 KT-2*로부터 Foxy-5의 합성은 KT-2*의 Fmoc-탈보호를 시작으로 실현된다. KT-1*와의 후속 커플링으로 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)를 수득하고, 이어서 DCM에서 DBU로 Fmoc 탈보호한 후, EDC.HCl, HOBt.H2O 및 DIPEA의 존재하에 포름산과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 15)를 수득한다. 이러한 보호 헥사펩티드를 TFA/(i-Pr)3SiH/DTT의 칵테일에서 용해 및 교반하여 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)하였다. 반응 완료 후, 조 생성물은 THF/MTBE로 침전시켜 고체로 수득하였다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 > 90% 수율 및 약 97% 순도로 수득하였다.
4+1+1 경로
실시예 10 -테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)와 Fmoc-Asp-OtBu 및 Fmoc-Met의 순차적인 커플링 후, Fmoc 제거, 포르밀화 및 탈보호에 의한 Foxy-5의 제조.
상기 실시예 4a에서 수득된 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)는 먼저 DBU와 반응하여 Fmoc 탈보호를 달성한다. 다음 커플링 단계를 진행하기 전에, 실리카 플러그를 통해 반응물을 통과시켜, 원치 않는 아스파르트이미드 부산물의 형성을 유도하는 것으로 이전 실험에서 발견된 DBU를 제거한다. Fmoc-Asp-OtBu와 커플링 전에 DBU의 제거는 아스파르트이미드 형성을 효과적으로 억제한다. 실리카 플러그 처리 후, DIPEA, EDAC, HCl (1.2 eq), 및 HOBt (1.2 eq)의 존재하에 DCM 용액은 Fmoc-Asp(OtBu)와 반응하여, 보호 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 3)를 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 생성물 동일성을 확인하였다.
수득된 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 3)의 Fmoc 탈보호는 DBU로 달성되고, DIPEA (3.0 eq), EDC.HCl (2.0 eq), 및 HOBt.H2O (2.0 eq)의 존재하에 용매로 DCM-THF (50 vol + 10 vol)에서 Fmoc-Met와 커플링하여 보호 헥사펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)를 조 형태로 수득하였다.
실시예 4로부터 수득된 헥사펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4) 의 Fmoc 탈보호는 DCM (50 vol)에서 DBU로 달성되고, 이어서 EDC.HCl (4.0 eq), HOBt.H2O (4.0 eq) 및 DIPEA (4.0 eq)의 존재하에 포름산 (3.0 eq)과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 15)를 수득하고, 이를 1.5 시간 동안 TFA (10 vol)/ (i-Pr)3SiH (TIS, 1.7 vol)/DTT (1.7 eq)의 칵테일에서 용해 및 교반하여 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)하였다. 반응 완료 후, 조 생성물은 THF/MTBE로 침전시켜 97% 수율 (9.5 gr)의 고체로 수득하였다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 97.6% 순도로 수득하였다.
3+1+1+1 경로
실시예 11 -Foxy-5에 대한 선형 용액상 접근법의 타당성
상기 수득된 KT-2 (Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe)은 DCM에서 DBU와 반응하여 Fmoc 탈보호를 달성하고, 이어서 DIPEA, EDAC, HCl (1.2 eq), 및 HOBt (1.2 eq)의 존재하에 Fmoc-Gly-OH와 반응하여 보호 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 7)를 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 생성물 동일성을 확인하였다. 조 생성물을 DCM에서 DBU를 이용하여 유사한 방식으로 추가로 반응시켜 Fmoc 탈보호를 달성하고, 이어서 DIPEA, EDAC, HCl (1.2 eq), 및 HOBt (1.2 eq)의 존재하에 Fmoc-Asp(OtBu)와 반응시켜 보호 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 9)을 수득하고, 이를 실리카 겔 정제 및 메탄올에서 슬러리화한 후 백색 고체로 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 생성물 동일성을 확인하였다. 수득된 펜타펩티드의 Fmoc 탈보호는 DBU로 달성하고, DIPEA (1.0 eq), EDAC, HCl (2.0 eq), 및 HOBt (2.0 eq)의 존재하에 DCM에서 시판되는 For-Met-OH와 커플링하여 보호 Foxy-5 유도체 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe (SEQ_ID NO 3)를 수득하고, 이를 염기성 조건하에 비누화로 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH (SEQ_ID NO 4)를 수득하고, 후자를 O-tBu 및 트리틸 보호기의 탈보호하여 조 형태의 원하는 헥사펩티드 Foxy-5를 수득한다.
실시예 12 - Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)
상기 실시예 8에서 수득된 KT-2* (Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu)은 DCM (50 vol)에서 DBU와 반응하여 Fmoc 탈보호를 달성하고, 이어서 DIPEA (3 eq), EDC.HCl (2.0 eq), 및 HOBt (2.0 eq) 의 존재하에 1.3 eq. Fmoc-Gly-OH와 반응하여 보호 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 수득하였다. TLC에 의해 우수한 전환이 관찰되었고, DCM 층을 물과 염수로 세척하였다. 최종 유기 층을 10-15 vol으로 농축시키고, 분리 없이 다음 단계에서 그대로 사용하였다.
실시예 13 - Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 10)
농축 DCM 용액으로서 상기 수득된 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)은 먼저 DBU와 반응하여 Fmoc 탈보호를 달성한다. 다음 커플링 단계를 진행하기 전에, 실리카 플러그를 통해 반응물을 통과시켜, 이전 실험에서 원치 않는 아스파르트이미드 부산물의 형성을 유도하는 것으로 밝혀진 DBU를 제거한다. Fmoc-Asp-OtBu와 커플링 전에 DBU의 제거는 아스파르트이미드 형성을 효과적으로 억제한다. 실리카 플러그 처리 후, DIPEA, EDAC, HCl (1.2 eq), 및 HOBt (1.2 eq)의 존재하에 DCM 용액은 Fmoc-Asp(OtBu)와 반응하여 보호 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 3)를 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분석법으로 생성물 동일성을 확인하였다.
단축 반응은 148 gr 및 220 gr 출발 물질에서 시작하여 2번 반복되어, 각각 107 및 163 gr 생성물 (이론의 58.1% 및 59.2%)을 수득하였다.
실시예 14 - Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)
실시예 13으로부터 수득된 펜타펩티드 Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 10)의 Fmoc 탈보호는 DBU로 달성되고, DIPEA (3.0 eq), EDC.HCl (2.0 eq), 및 HOBt.H2O (2.0 eq)의 존재하에 용매로서 DCM-THF (50 vol + 10 vol)에서 Fmoc-Met와 커플링하여 보호 Foxy-5 유도체 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)를 조 형태로 수득하였다. 용리제로서 DCM/THF를 사용한 컬럼 크로마토그래피로 정제를 수행하였다. 정제된 생성물을 DIPE에서 슬러리화하여 백색 고체를 수득하였다.
역용매를 사용한 침전 및 크로마토그래피와 같은 다양한 조건하에 정제를 여러 번 수행하였다. 최상의 용액은 컬럼 크로마토그래피 이후 DIPE에서 슬러리화되는 것으로 밝혀졌으며, 25 gr 규모에서 78%의 수율 및 95.4 % 화학적 순도를 보였다.
실시예 15 - For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu, (SEQ_ID NO 15)
실시예 14로부터 수득된 헥사펩티드 Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)의 Fmoc 탈보호는 DCM (50 vol)에서 DBU로 달성되고, 이어서 EDC.HCl (4.0 eq), HOBt.H2O (4.0 eq) 및 DIPEA (4.0 eq)의 존재하에 포름산 (3.0 eq)과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ NO 15)를 수득하였다.
반응은 각각 4, 18 및 18 gr 출발 물질로부터 3번 수행되어, 75-83%의 수율 및 67.5 - 77.2%의 화학적 순도를 보였다.
실시예 16 - For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5), (SEQ_ID NO 1)
실시예 15로부터 수득된 14 gr 의 헥사펩티드를 1.5 시간 동안 TFA (10 vol)/ (i-Pr)3SiH (TIS, 1.7 vol)/DTT (1.7 eq)의 칵테일에서 용해 및 교반하여 전반적으로 탈보호 (Trt 및 tBu 기)하였다. 반응 완료 후, 조 생성물은 THF/MTBE로 침전시켜 97% 수율 (9.5 gr)의 고체로 수득하였다. 크로마토그래피 정제로 원하는 헥사펩티드 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (Foxy-5)를 97.6% 순도로 수득하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> WntResearch AB
<120> SOLUTION PHASE ROUTES FOR WNT HEXAPEPTIDES
<130> 138735
<160> 15
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Formyl-methionine
<220>
<223> Peptide
<400> 1
Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> (Tert-Butoxycarbonyl)-methionine
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aspartic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Leucine tert-butylester
<400> 2
Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> (Fluorenylmethoxycarbonyl)-aspartic acid tert-butylester
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Leucine tert-butylester
<400> 3
Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Formyl-methionine
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aspartic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Leucine tert-butylester
<400> 4
Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Cysteine acetonide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Leucine tert-butylester
<400> 5
Gly Cys Glu Leu
1
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> (Fluorenylmethoxycarbonyl)-glycine
<220>
<223> Synthetide peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Leucine tert-butylester
<400> 6
Gly Cys Glu Leu
1
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> (Fluorenylmethoxycarbonyl)-glycine
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Leucine tert-butylester
<400> 7
Gly Cys Glu Leu
1
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 8
Gly Cys Glu Leu
1
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> (Fluorenylmethoxycarbonyl)-aspartic acid tert-butylester
<220>
<223> Synthetic sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Leucine-methylester
<400> 9
Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> (Fluorenylmethoxycarbonyl)-aspartic acid tert-butylester
<220>
<223> Syntheti peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Leucine-methylester
<400> 10
Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 11
Met Asp Gly Cys Cys
1 5
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Carboxybenzyl-methionine
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aspartic acid benzylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Benzylcysteine
<400> 12
Met Asp Gly Cys
1
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Carboxybenzyl-methionine
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aspartic acid benzylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Benzylcysteine
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glutamic acid benzylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Leucine benzylester
<400> 13
Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 14
Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> (Tert-Butoxycarbonyl)-methionine
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aspartic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Trityl-cystein
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glutamic acid tert-butylester
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Leucine tert-butylester
<400> 15
Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
Claims (11)
- a) PG 1 -Cys(PG 2 )Glu(OPG 3 )-Leu-OR 1
b) PG 5 -Met-Asp(OPG 4 )-Gly-OR 2
c) PG 1 -Gly-Cys(PG 2 )Glu(OPG 3 )-Leu-OR 1
로부터 선택되는 Foxy-5 (For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)의 보호 펩티드 단편으로서,
PG1은 H 및 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 또는 Boc와 같은 보호기로부터 선택되고, PG2는 H 및 아세토니드 (슈도프롤린, ψMe,MePro), 트리틸 (Trt)로부터 선택되는 보호기로부터 선택되며, PG3는 H 및 tert-부틸 (tBu)로부터 선택되는 보호기로부터 선택되고, PG5는 포르밀기 또는 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)와 같은 염기-민감성 보호기이며, PG4는 H 및 tert-부틸 (tBu)로부터 선택되는 보호기로부터 선택되고, 및 R1과 R2는 H 및 메틸, 에틸 또는 tert-부틸 (tBu)와 같은 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되는 것인 Foxy-5의 보호 펩티드 단편. - 제1항에 있어서, PG 1 -Cys(PG 2 )Glu(OPG 3 )-Leu-OR 1 인 것인 Foxy-5의 보호 트리펩티드 단편.
- 제1항에 있어서, PG 5 -Met-Asp(OPG 4 )-Gly-OR 2 인 것인 Foxy-5의 보호 트리펩티드 단편.
- 제1항에 있어서, PG 1 -Gly-Cys(PG 2 )Glu(OPG 3 )-Leu-OR 1 인 것인 Foxy-5의 보호 테트라펩티드 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (Key 트리펩티드-2*, KT-2*)인 것인 Foxy-5의 보호 트리펩티드 단편.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly (Key 트리펩티드-1*, KT-1*)인 것인 Foxy-5의 보호 트리펩티드 단편
- 제1항 또는 제4항에 있어서, Fmoc-Gly-Cys(PG 2 )Glu(OPG 3 )-Leu-OtBu인 것인 Foxy-5의 보호 테트라펩티드 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고형인 것인 Foxy-5의 보호 펩티드 단편.
- 제8항에 있어서, 결정형인 것인 Foxy-5의 보호 펩티드 단편.
- Foxy-5의 보호 유도체인 PG 5 -Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 제조하기 위한 용액상 방법으로서, 상기 방법은:
a. 디펩티드 Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu (KD-3c)를 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH (KD-2c)와 커플링하여 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 수득하고, 이어서 PG 5 -Met-Asp(OtBu)-OH와 커플링하는 단계, 또는
b. 트리펩티드 PG 5 -Met-Asp(OtBu)-Gly-OH를 Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (KT-2*)와 커플링하는 단계, 또는
c. 트리펩티드 Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu (KT-2*)를 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp-OtBu 및 PG 5 -Met와 순차적으로 커플링하는 단계, 또는
d. 테트라펩티드 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 6)를 Fmoc-Asp-OtBu 및 PG 5 -Met와 순차적으로 커플링하는 단계
선택적으로 컬럼 크로마토그래피에 의해 조 헥사펩티드를 정제한 다음, 유기 용매로부터 고체로서 침전시키는 단계를 포함하고, 여기서 PG 5 는 포르밀기 또는 Fmoc와 같은 염기 민감성 보호기인 것인 용액상 방법. - PG 5 -Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu를 Foxy-5 (For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)로 전환하기 위한 용액상 방법으로서, 상기 방법은:
PG 5 = 포르밀인 경우:
i. For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_NO 15)의 탈보호로 조 형태의 Foxy-5를 수득하는 단계,
또는 PG 5 = Fmoc와 같은 염기 민감성 보호기인 경우:
ii. 헥사펩티드 PG 6 -Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu로부터 PG 5 를 제거한 다음, 포름산과 커플링하여 For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_NO 15)를 수득하는 단계,
iii. For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_NO 15)의 탈보호로 조 형태의 Foxy-5를 수득하는 단계,
이어서:
a. 선택적으로 컬럼 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제한 뒤, 선택적으로 유기 용매로부터 고체로서 침전시키는 단계,
b. 선택적으로 결정형과 같은 고형의 알칼리 또는 산성 염으로서 형성된 Foxy-5 헥사펩티드를 침전시키는 단계
를 포함하는 것인 용액상 방법.
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