KR20210029798A - Hiv-1 검출을 위한 합성 펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 의학 진단 분야에 관된 것이고, 구체적으로 HIV-1 검출을 위한 합성 펩타이드에 관된 것이다. 상기 합성 펩타이드는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이를 거쳐 얻어진다. 이는 항 HIV-1 항체를 더 잘 검출할 수 있고, 잠재적인 “거짓 음성” 및 “거짓 양성” 결과를 더 잘 방지할 수 있다.
Description
관련 출원의 교차 인용
본 발명은 2018년 8월 9일에 중국 특허청에 제출한 출원번호가 201810904120.2 이고 발명의 명칭이 “HIV-1 검출을 위한 합성 펩타이드”인 중국 특허출원의 우선권을 주장하며, 그 모든 내용은 참조로서 본 발명에 인용된다.
본 발명은 의학 진단 분야에 관된 것이고, 구체적으로 HIV-1 검출을 위한 합성 펩타이드에 관된 것이다.
인간 면역 결핍 바이러스(HIV)로 인한 에이즈는 1980 년대에 발견된 이래 전 세계로 퍼져 나갔다. 세계 보건기구(WHO)에 따르면 2016 년 말 현재 전 세계적으로 약 3,670 만 명이 HIV에 감염되었다. 2017년 6월 30일 현재 중국에는 718,000 명의 HIV 감염/에이즈 환자가 있다. HIV는 주로 인체의 조력자 T 림프구 시스템을 공격하여 CD4 분자 세포에 선택적으로 침입하여 신체의 면역 능력을 파괴하여 면역 체계가 저항력을 잃게 하며, 종종 심각한 기회 감염으로 인해 다양한 질병과 암을 유발하여 결국 에이즈로 이어진다. 지금까지 에이즈를 치료하고 예방할 수 있는 효과적인 약물과 백신이 없기 때문에 HIV 감염은 오늘날 세계에서 가장 심각한 전염병 및 공중 보건 문제가 되었다.
HIV 바이러스는 지질 외피를 가진 RNA 레트로 바이러스이며 단일 카피 유전자 RNA는 길이가 약 9.2 ~ 9.8Kb이다. HIV에는 세 가지 주요 구조 유전자 env, gag 및 pol이 있으며, 이들은 서로 다른 기능을 하는 단백질, 즉 항원을 암호화한다. HIV가 몸에 침투한 후 일반적으로 약 6 주 내에 항체가 생성된다. HIV 전구체 P55 항체와 핵심 단백질 P24 항체가 처음 혈청에 나타난 다음 외부 외피 단백질 GP120 항체와 막 횡단 당단백질 gp41 항체가 나타났다. 현재 발견된 HIV에는 주로 HIV-1과 HIV-2가 있으며, 알려진 에이즈 바이러스 균주는 M, N, O, P의 4 가지가 있으며 그 중 M과 N이 가장 널리 퍼져 있으며 P 형 사례는 전 세계적으로 둘 뿐이고, O 형도 100,000 명에 불과하며 주로 중서부 아프리카에 집중되어 있다. 이런 몇 가지 유형은 생물학적 특성이 매우 유사하며 게놈은 40 % ~ 50 % 상 동원성을 구비한다. 현재 중국에서는 HIV-1 유형이 널리 퍼져 있다.
HIV 항원 및 핵산 검사를 위한 장비, 시약 및 인건비가 아주 높기 때문에 HIV 항체 검사는 여전히 HIV 검사 시장의 주류이다. 현재 HIV 항체 검출 물질은 민감도와 특이성을 개선하고 잠복기(window period)를 단축하며 한편으로는 빠르고 간편한 방향으로 발전하고 있다. 이러한 발전 추세에 부합하기 위해서 본 기술분야에서는 HIV-1 항체 검출에 적용할 수 있는 HIV-1 재조합 단백질도 제공되어야한다.
본 발명은 총적으로 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염의 진단을 위한 방법 및 물질에 관한 것이고, 더 구체적으로 본 발명은 HIV-1형 항체와 결합하는 반응원성 합성 펩타이드 및 그 응용에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 예를 들어 항 HIV-1 항체를 더 잘 검출할 수 있고, 잠재적인 “거짓 음성” 및 “거짓 양성” 결과를 더 잘 방지할 수 있도록 진단 실험실을 위한 수단, 구체적으로 특이성 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명은 합성 펩타이드를 제공하고 이는 돌연변이 부위를 포함하는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이고;
상기 돌연변이 부위는
T77이 V, N 또는 S로 치환된 것;
N101이 D, E 또는 Q로 치환된 것;
G105가 K, H 또는 R로 치환된 것;
P124가 D 또는 E로 치환된 것;
K127이 D, E 또는 Q로 치환된 것에서 선택되는 적어도 하나이거나;
또는, 상기 임의의 하나의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 구비하는 아미노산 서열이고 99%보다 큰 민감도 및/또는 99.4%보다 큰 특이성을 구비한다.
선행기술에 비해 본 발명에 공개된 합성 펩타이드는 하나 또는 다수의 아미노산 돌연변이 부위를 통해 민감도가 100%에 달하고 특이성이 99.75% 이상에 달할 수 있다.
본 발명의 실시예의 목적, 과제의 해결 수단 및 장점을 보다 명확하게 하기 위해, 아래 본 발명의 실시형태 중 과제의 해결 수단에 대해 명확하고 완전하게 설명한다. 실시형태에 구체적인 조건이 명시되지 않은 경우 기존 조건 또는 제조업체가 권장하는 조건에 따라 수행한다. 제조업체가 명시되지 않은 시약 또는 기기는 모두 상업적으로 구입할 수 있는 기존 제품이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명와 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가진다. 예시적인 방법 및 재료가 아래에 설명되지만, 본문에 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시에 사용될 수도 있다.
본 발명은 합성 펩타이드를 제공하고 이는 돌연변이 부위를 포함하는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이고;
상기 돌연변이 부위는
T77이 V, N 또는 S로 치환된 것;
N101이 D, E 또는 Q로 치환된 것;
G105가 K, H 또는 R로 치환된 것;
P124가 D 또는 E로 치환된 것;
K127이 D, E 또는 Q로 치환된 것에서 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개이거나;
또는, 상기 임의의 하나의 서열과 적어도 80%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%의 서열 동일성을 구비하는 아미노산 서열이다.
일부 실시형태에서, 본 발명이 제공하는 합성 펩타이드, 키트 또는 검출 방법은99%보다 큰, 99.1%보다 큰, 99.2%보다 큰, 99.3%보다 큰, 99.4%보다 큰, 99.5%보다 큰, 99.6%보다 큰, 99.7%보다 큰, 99.8%보다 큰, 99.9%보다 큰 민감도를 구비한다.
일부 실시형태에서, 본 발명이 제공하는 합성 펩타이드, 키트 또는 검출 방법은 99.4%보다 큰(예를 들면 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 99.9% 이상 또는 더 높음)의 특이성을 구비한다.
상기 민감도 및 특이성은 본 발명의 실시예 중의 실험에 의해 결정된다.
HIV-1 감염의 초기 단계에서 예를 들면 포유류, 인간 등 피험자의 생물학적 샘플은 HIV-1 항체 수준이 낮아 쉽게 검출되지 않는다. 본 발명의 합성 펩타이드를 이용한 검출 방법은 선행기술의 검출 방법보다 민감도와 특이도가 높기 때문에, 본 발명의 합성 펩타이드는 선행기술보다 HIV 조기 진단 또는 에이즈 조기 진단에 더 적합하다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 예를 들면 적어도 30개의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명이 제공하는 합성 펩타이드는 예를 들어 정제 처리를 거치고, 특히 동물, 특히 포유 동물, 특히 영장류, 특히 인간에서 HIV-1 바이러스의 확인 및/또는 농축에 적합하다. HIV-1 레트로 바이러스는 가장 흔하며 전 세계 여러 지역에서 지배적이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 T77이 V, N 또는 S로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 N101이 D, E 또는 Q로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 G105가 K, H 또는 R로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 P124가 D 또는 E로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 K127이 D, E 또는 Q로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는
R18이 S로 치환된 것;
Q95가 E로 치환된 것;
L106이 E로 치환된 것;
L123이 K로 치환된 것;
N130이 K로 치환된 것 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 R18이 S로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 Q95가 E로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 L106이 E로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 L123이 K;로 치환된 것을 포함한다.
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 N130이 K로 치환된 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는
R18을 S로 치환; T77을 V, N 또는 S로 치환; Q95를 E로 치환; N101을 D, E 또는 Q로 치환; G105를 K, H 또는 R로 치환; L106을 E로 치환; L123을 K로 치환; P124를 D 또는 E로 치환; K127을 D, E 또는 Q로 치환; N130을 K로 치환한 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는
T77을 V로 치환; Q95를 E로 치환하거나 비치환; N101을 D, E 또는 Q로 치환; G105를 K, H 또는 R로 치환; L106을 E로 치환하거나 비치환; P124를 D 또는 E로 치환; K127을 D, E 또는 Q로 치환한 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 R18을 S로 치환하거나 비치환; T77을 V, N 또는 S로 치환; Q95를 E로 치환하거나 비치환; N101을 D, E 또는 Q로 치환; G105를 K, H 또는 R로 치환; L106을 E로 치환하거나 비치환; L123을 K로 치환하거나 비치환; P124를 D 또는 E로 치환; K127을 D, E 또는 Q로 치환; N130을 K로 치환하거나 비치환한 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 돌연변이 부위는 R18을 S로 치환; T77을 S로 치환; Q95를 E로 치환하거나 비치환; N101을 D, E 또는 Q로 치환; G105를 K, H 또는 R로 치환; L106을 E로 치환하거나 비치환; L123을 K로 치환; P124를 D로 치환; K127을 D, E 또는 Q로 치환; N130을 K로 치환한 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 합성 펩타이드에는 신호 강도를 가리키는 지시제가 라벨링된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 신호 강도를 가리키는 지시제는 형광물질, 양자점, 디곡시제닌 표지 프로브, 비오틴, 방사성 동위원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 마이크로스피어, 전자 밀도 물질, 화학 발광 마커, 초음파 조영제, 광민감제, 콜로이드 금 또는 효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명은 상기 합성 펩타이드를 포함하는 제품을 제공하고, 예를 들면 미세적정 플레이트(그 위에는 상기 합성 펩타이드가 도포될 수 있음)이다.
본 발명은 분리된 핵산 분자를 더 제공하고, 이는 상술한 합성 펩타이드를 암호화한다.
본 발명은 벡터를 더 제공하고, 이는 상술한 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 숙제세포를 더 제공하고, 이는 상기 벡터에 의해 형질 전환된다.
상기 숙주세포는 진핵 세포일 수 있고 예를 들면 포유동물 세포이다.
본 발명은 상술한 합성 펩타이드의 제조 방법을 더 제공하고, 이는
상술한 핵산 분자를 발현시키는 단계 a); 또는
화학 합성을 진행하고 아미노산을 첨가하여 완전한 폴리펩타이드를 얻는 단계 b)를 포함한다.
상기 단계 a)의 합성 방법을 통해 잘 알려진 친화도 정제(affinity purification)를 사용하여 발현된 폴리펩타이드를 농축시킬 수 있다.
화학적 합성은 당업자에게 공지된 기기, 예를 들면 자동화 펩타이드 합성기를 사용하여 합성할 수 있고, 예를 들면 Applied BioSystems 등 시중의 자동화 펩타이드 합성기를 사용하여 펩타이드 합성을 통해 얻는다.
본 발명은 변형된 합성 펩타이드를 더 제공하고, 상술한 합성 펩타이드를 신호 강도를 가리키는 지시제로 라벨링하여 얻어진다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 신호 강도를 가리키는 지시제는 형광물질, 양자점, 디곡시제닌 표지 프로브, 비오틴, 방사성 동위원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 마이크로스피어, 전자 밀도 물질, 화학 발광 마커, 초음파 조영제, 광민감제, 콜로이드 금 또는 효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광물질은 Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-카르복시-4′, 5′-디클로로-2′, 7′-디메톡시 플루오레세인, 5-카르복시-2′, 4′, 5′, 7′-테트라클로로 플루오레세인, 5-카르복시 플루오레세인, 5-카르복시 로다민, 6- 카르복시 로다민, 6-카르복시 테트라메틸 로다민, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, 단실 클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD(7-니트로벤조-2-oxa-1, 3-디아졸), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green514, Pacific Blue, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레졸 퍼플, 크레실 블루 퍼플, 브릴리언트 크레실 블루, 파라아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 숙시닐 플루오레세인, 희토류 금속 크립테이트, 트리-2-피리딜 디아민 유로퓸, 유로퓸 크립테이트 또는 킬레이트, 디아민, 안토시아닌, La Jolla 블루 염료, 알로피코시아닌, allococyanin B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, Phycoyanin, phycoerythrin R, REG, 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 레드, ROX, TAMRA, TET, TRIT(테트라메틸 로다민 이소 메르캅탄), 테트라메틸 로다민 및 텍사스 레드 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방사성 동위원소는 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb 및 83Sr 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 효소는 겨자무과산화효소, 알칼리인산분해효소 및 글루코스산화효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광 마이크로스피어는 폴리스티렌 형광 마이크로스피어이고, 내부에는 희토류 형광 이온 유로퓸이 피복된다.
본 발명은 상술한 합성 펩타이드 또는 상술한 변형된 합성 펩타이드를 포함하는 키트를 더 제공한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 키트는 면역학적으로 허용가능한 희석제, 완충 용액, 프로테아제 억제제, 항체 비특이적 결합을 차단하기 위한 차단제, HIV-1 항체에 대해 친화력을 구비하는 제2 항체 중 하나 또는 다수를 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 프로테아제 억제제는 PMSF, EDTA, NaN3, pepstantin, leupeptin, aprotinin, Indinavir, Ritonavir, Nelfinavir, Amprenavir, Kaletra에서 선택되는 하나 또는 다수를 포함할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, HIV-1 항체에 대해 친화력을 구비하는 제2 항체는 항 인간 Fc 단편의 항체를 사용할 수 있고, 종은 마우스, 래트, 토끼, 개, 양, 말 또는 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, HIV-1 항체에 대해 친화력을 구비하는 제2 항체에는 상기 신호 강도를 가리키는 지시제가 라벨링된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 항체 비특이적 결합을 차단하기 위한 차단제는 BSA, FBS를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 완충 용액은 인산 완충 용액(PBS), Tris 완충 용액(TBS), Tris 완충 용액-TWEEN(TBST) 또는 Tris 완충 용액-Triton(TBST)이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 키트는 예를 들면 상기 미세적정 플레이트를 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 키트가 상기 변형된 합성 펩타이드를 포함할 경우 상기 키트는 상기 신호 강도를 가리키는 지시제를 검출하기 위한 시약을 더 포함한다.
상기 신호 강도를 가리키는 지시제를 검출하기 위한 시약은 당업자에게 공지된 것이고, 일례로 지시제가 겨자무과산화효소(HRP)일 경우 대응되는 시약은 과산화수소수 및 루미놀일 수 있고, 지시제가 비오틴일 경우 대응되는 시약은 아비딘 등일 수 있다.
본 발명은 항 HIV-1 항체의 검출 방법을 더 제공하고, 이는 생물학적 샘플과 상술한 합성 펩타이드, 또는 상술한 변형된 합성 펩타이드, 또는 상술한 키트 중의 시약을 접촉시켜 면역복합체를 형성하는 단계를 포함한다.
본문에 사용된 용어 “검출”은 연구 샘플 중 타깃 분자의 존재 또는 수준을 지량 또는 정성 검출함을 가리킨다. 예를 들면 항 HIV-1 항체가 생물학적 샘플에서의 존재 또는 수준을 지량 또는 정성 검출한다.
상기 면역복합체 중 상기 합성 펩타이드 또는 상기 변형된 합성 펩타이드의 존재를 검출하여 상기 생물학적 샘플 중 HIV-1 항체의 존재를 지시한다.
상기 방법은 진단 또는 비진단 목적이고, 체내 또는 체외에서 진행된다.
본문에 사용된 용어 “진단”또는 “의학적 진단”은 의학적 각도로 사람들의 정신 및 체질 상태를 판단하는 것이다. 구체적으로 어느 질병 또는 병증이 피험자의 증상 및 징후의 과정을 해석할 수 있다. 예를 들면 본문에 따른 합성 펩타이드를 사용하여 피험자의 HIV-1 감염 또는 에이즈 존재를 결정한다.
본 발명은 상술한 합성 펩타이드, 또는 상술한 변형된 합성 펩타이드, 또는 상술한 키트가 HIV-1 진단제의 제조에서의 응용을 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 본문은 HIV 검출을 위한 재조합 단백질을 획득하거나 설계하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 아래 단계중 하나 또는 다수를 포함할 수 있다.
인간 면역 결핍 바이러스 외피 단백질을 선택하고, 단백질 세그먼트의 일부를 선택하며, 일부 부위에 대한 돌연변이 설계를 하고, 발현 및 정제를 통해 해당 재조합 단백질을 제조하며, 활성 및 특이성 스크리닝을 통해 활성이 높고 특이성이 우수한 재조합 단백질을 얻는다.
서열 단편을 합성하고 이를 pMD18-T 벡터와 같은 벡터에 연결하여 표적 단편을 포함하는 T 벡터를 구축한다.
부위 지정 돌연변이 유발 설계를 통해 pMD18-T 벡터와 같은 특정 돌연변이 표적 단편을 포함하는 벡터를 구축한다.
재조합 단백질 제조 방법: 업스트림 프라이머(예: EcoRI 절단 부위 포함) 및 다운 스트림 프라이머(예: BamH I 절단 부위 포함)를 설계하고, 표적 단편을 포함하는 벡터를 T 벡터와 같은 주형으로 사용하여 표적 유전자를 증폭하였다. 이중 효소 분해 및 정제 후 pET-28a와 같은 벡터에 연결하고, E. coli BL21과 같은 세포를 형질 전환하며, 양성 클론을 선별한 후 단일 콜로니를 골라서 50ul /ml Kan을 함유한 LB 배지와 같은 배지에 접종하였다. 37도와 같은 적정 온℃에서 진탕 배양하고; OD600이 0.6 ~ 0.8에 도달 한 후 1.0mM IPTG를 첨가하고, 37℃에서 2 ~ 4 시간 동안 배양을 유도하고, 총 단백질을 추출하고, SDS-PAGE으로 재조합 단백질 발현을 확인하였다. NI 이온 킬레이트 컬럼을 사용하여 표적 단백질에 대해 1차 정제를 수행하고 SP 컬럼을 사용하여 표적 단백질에 대해 2차 정제를 수행하며 SDS-PAGE를 사용하여 재조합 단백질의 순도를 확인하였다.
본 발명은 HIV-1 관련 질병을 진단하는 방법을 더 제공하고, 이는
생물학적 샘플과 본 발명에 따른 합성 펩타이드, 변형된 합성 펩타이드 또는 키트 중의 시약을 접촉시켜 면역복합체를 형성하는 단계;
상기 면역복합체 중 상기 합성 펩타이드 또는 상기 변형된 합성 펩타이드의 존재를 검출하여, 상기 생물학적 샘플 중 HIV-1 항체의 존재를 지시하는 단계를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 HIV-1 관련 질병은 HIV-1 감염 또는 에이즈이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 HIV-1 관련 질병은 초기 단계의 HIV-1 감염 또는 초기 감염의 에이즈이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 포유동물 유래이고 예를 들면 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 세포 배양 상청, 타액, 뇌척수액, 정액, 전립선액, 조직 또는 조직 용해액 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명은 상기 합성 펩타이드, 변형된 합성 펩타이드 또는 키트가 HIV-1 진단에서의 응용을 더 제공한다.
선행기술에 비해 본 발명이 제공하는 합성 펩타이드는 하나 또는 다수의 아미노산 돌연변이 부위를 통해 민감도가 100%에 달하고 특이성이 99.75% 이상에 달할 수 있다.
아래 실시예를 결부하여 본 발명의 실시형태를 상세히 설명한다.당업자는 아래 실시예가 본 발명을 설명하기 위한 것일뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해할 것이다. 실시예에서 구체적인 조건이 명시되지 않은 경우 기존 조건 또는 제조업체가 권장하는 조건에 따라 수행한다. 제조업체가 명시되지 않은 시약 또는 기기는 모두 상업적으로 구입할 수 있는 기존 제품이다.
실시예 1
재조합 단백질의 설계
유전자 합성을 통해 SEQ ID NO: 1인 유전자 서열을 암호화하는 유전자 서열을 합성하고, X77 (X77은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열의 77 번 부위를 나타내며, 이하 동일), X95, X101, X105, X106, X124, X127 부위의 아미노산에 대해 돌연변이 설계를 진행한다.
X77 부위의 아미노산은 T로부터 V 또는 N 또는 S로 돌연변이되고, X95 부위의 아미노산은 Q로부터 E로 돌연변이되며, X101 부위의 아미노산은 N로부터 E 또는 D 또는 Q로 돌연변이되고, X105 부위의 아미노산은 G로부터 K 또는 H 또는 R,로 돌연변이되며, X106 부위의 아미노산은 L로부터 E로 돌연변이되고, X124 부위의 아미노산은 P로부터 D 또는 E로 돌연변이되며, X127 부위의 아미노산은 K로부터 D 또는 E 또는 Q로 로 돌연변이된다.
상기 돌연변이 방식에 따라 돌연변이 클론을 구축하고 그중 하나의 과제의 해결 수단은 아래와 같은 것을 포함한다.
X77, X101, X105, X124, X127는 각각 V, E, K, D, D를 HIV-Ag-1로 명명하며;
각각 N, D, H, E, E를 HIV-Ag-2로 명명하고;
각각 S, Q, R, D, Q를 HIV-Ag-3로 명명하며;
각각 S, D, R, E, E를 HIV-Ag-4로 명명하고;
각각 V, D, K, E, D를 HIV-Ag-5로 명명하며;
각각 N, E, H, D, E를 HIV-Ag-6로 명명하고;
각각 V, Q, R, D, Q를 HIV-Ag-7로 명명하며;
각각 S, Q, K, E, D를 HIV-Ag-8로 명명하고;
각각 N, Q, H, E, Q를 HIV-Ag-9로 명명한다.
pMD18-T벡터(TaKara 다롄 보 바이오, 아이템 넘버: 6011)에 구축한다. SEQ ID NO: 1의 유전자 서열 구축 클론을 pMD18-T-HIV-Ag-0으로 명명하고, 돌연변이 클론을 각각 pMD18-T-HIV-Ag-1 내지 pMD18-T-HIV-Ag-9로 명명하며 추후 증폭과 핵산 단편의 보관에 사용한다.
실시예 2
재조합 단백질의 설계
실시예 1의 기초상에서 HIV-Ag-1 내지 HIV-Ag-9 중 서열X18, X95, X106, X123 및 X130의 아미노산에 대해 돌연변이 설계를 진행한다.
X18 부위의 아미노산은 R로부터 S로 돌연변이되고, X95 부위의 아미노산은 Q로부터 E로 돌연변이되며, X106 부위의 아미노산은 L로부터 E로 돌연변이되고, X123 부위의 아미노산은 L로부터 K로 돌연변이되며, X130 부위의 아미노산은 N로부터 K로 돌연변이된다. 새로운 서열을 각각 HIV-Ag-10 내지 HIV-Ag-18로 명명한다. pMD18-T에 구축한다. 각각 pMD18-T-HIV-Ag-10 내지 pMD18-T-HIV-Ag-18로 명명하여 추후 증폭과 핵산 단편의 보관에 사용한다.
실시예 3
재조합 단백질 발현 벡터의 구축, 유도 발현 및 정제
재조합 단백질 발현 벡터의 구축 및 유도 발현: 업스트림 프라이머(예: EcoRI 절단 부위 포함) 및 다운 스트림 프라이머(예: BamH I 절단 부위 포함)를 설계하고, pMD18-T-HIV-Ag-0 내지 pMD18-T-HIV-Ag-18을 주형으로 사용하여 표적 유전자를 증폭한다. 표적 유전자 정제 후, EcoR I(TaKara다롄 보 바이오, 아이템 넘버: 1010A) 및 BamH I 제한성 내부 가수분해 효소(TaKara다롄 보 바이오, 아이템 넘버: 1040A)를 사용하여 이중 절단을 진행하고, 37℃에서 2h 배양하였다. 절단 후의 산물을 정제하고 마찬가지로 절단된 벡터pET-28a와 연결하며 22℃에서 2h 배양하고 16℃에서 2h 배양하였다. 열 충격법으로 연결 산물을 E. coli BL21 Competent (NEB (New England Biolabs), 아이템 넘버: C2530H)로 형질 전환하고 50ug / ml Kan이 포함된 LB 플레이트에 도포하고 37 ℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 양성 클론을 선택하고 균액 PCR 식별 및 이중 절단 식별 후 시퀀싱을 한다. 완전히 정확한 시퀀싱을 갖는 양성 단일 클론을 선별하여 50ug/ml Kan을 포함하는 LB 배지에 접종하고 37℃에서 진탕 배양하였다. OD600이 0.6 ~ 0.8에 도달 한 후 1.0 mM IPTG를 첨가하고 37℃에서 2 ~ 4 시간 동안 배양을 유도하고, 총 단백질을 추출하고, SDS-PAGE으로 재조합 단백질 발현을 확인하였다. 재조합 단백질의 N-말단에 있는 6 * HIS 태그를 통해 니켈 이온 킬레이트 정제 및 SP 컬럼 정제를 통해 순도 96 %의 단백질을 얻었다. 생성된 단백질은 각각 HIV-Ag-0 내지 HIV-Ag-18로 명명하였다.
실시예 4
돌연변이 클론 HIV-Ag-1 내지 HIV-Ag-9 재조합 항원이 효소 면역 제품 공법에서의 응용 및 활성 및 특이성 평가
효소 면역 검출은 아래 방식으로 조작하였다.
코팅: 50mM CB PH 9.6 코팅 용액에 100ng / ml의 작업 농도로 재조합 단백질을 첨가하고 폴리스티렌 플레이트에 웰당 100ul를 혼합하여 첨가한 다음 4℃에서 18 ~ 20 시간 동안 코팅한다.
차단: 코팅된 플레이트를 꺼내 상온에서 30분 동안 평형을 유지하고, 플레이트를 세척액으로 2 회 세척한 다음 각 웰에 150ul의 차단 용액을 첨가하여 37℃에서 2 시간 동안 차단한다. 톡톡 두드려 건조시킨 후 습도가 30 % 미만인 전자 건조 오븐에 넣어 24 시간 동안 건조시켜 준비한다.
라벨링: 재조합 단백질은 권장 방법에 따라 HRP로 라벨링하고 50ng/ml의 효소 작업 용액으로 희석한 다음 균일하게 혼합한다(효소 희석 용액 배합 방법: 20mM PB 150mM NaCl 0.5 % BSA 0.05 % Tween-200 0.1 % P300).
반응 모드 및 반응 시간 : 테스트 할 샘플 50ul + 샘플 희석액 50ul을 37℃ 항온 박스에서 60 분 동안 반응시키고; 플레이트를 5 회 세척하고 두드려 건조하고 100ul 표지된 재조합 단백질 -HRP 작업 용액을 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 반응시키며; 플레이트를 5회 세척하고 현색제 A와 B를 각각 50ul 씩 첨가하고 30 분 동안 현색시키며; 정지액 50ul 을 첨가하고 450nm 및 630nm 이중 파장 검출 사용한다. 검출은 10 분 이내에 판독해야 한다.
500 개의 HIV-1 양성 혈청과 3000 개의 HIV-1 항체 음성 혈청으로 시판되는 키트로 성능 비교 실험을 진행하였고, 결과는 표 1에 나타냈다. 본 발명의 재조합 단백질은 HIV-1 항체 검출에 사용 시 기존 제품보다 민감도가 상승되고 특이성이 현저히 개선되었다.
| 500개의 HIV 샘플에서 양성 개수를 검출(민감도) | 3000개의 HIV 음성 샘플 검출 개수를 검출(특이성/거짓 양성 비율) | |
| 대조 시약(시중에서 구매) | 499(99.8%) | 18(99.40%/0.60%) |
| HIV-Ag-0 | 498(99.6%) | 24(99.20%/0.80%) |
| HIV-Ag-1 | 500(100%) | 6(99.80%/0.20%) |
| HIV-Ag-2 | 500(100%) | 8(99.76%/0.24%) |
| HIV-Ag-3 | 500(100%) | 8(99.76%/0.24%) |
| HIV-Ag-4 | 500(100%) | 5(99.83%/0.17%) |
| HIV-Ag-5 | 500(100%) | 7(99.87%/0.13%) |
| HIV-Ag-6 | 500(100%) | 6(99.80%/0.20%) |
| HIV-Ag-7 | 500(100%) | 7(99.75%/0.25%) |
| HIV-Ag-8 | 500(100%) | 9(99.79%/0.21%) |
| HIV-Ag-9 | 500(100%) | 9(99.79%/0.21%) |
실시예 5
돌연변이 클론 HIV-Ag-1 내지 HIV-Ag-18 재조합 항원이 효소 면역 공법에서의 활성 평가
효소 면역 검출은 아래 방식으로 조작하였다.
코팅: 50mM CB PH 9.6 코팅 용액에 100ng / ml의 작업 농도로 재조합 단백질을 첨가하고 폴리스티렌 플레이트에 웰당 100ul를 혼합하여 첨가한 다음 4℃에서 18 ~ 20 시간 동안 코팅한다.
차단: 코팅된 플레이트를 꺼내 상온에서 30분 동안 평형을 유지하고, 플레이트를 세척액으로 2 회 세척한 다음 각 웰에 150ul의 차단 용액을 첨가하여 37℃에서 2 시간 동안 차단한다. 톡톡 두드려 건조시킨 후 습도가 30 % 미만인 전자 건조 오븐에 넣어 24 시간 동안 건조시켜 준비한다.
라벨링: 재조합 단백질은 권장 방법에 따라 HRP로 라벨링하고 50ng/ml의 효소 작업 용액으로 희석한 다음 균일하게 혼합한다(효소 희석 용액 배합 방법: 20 mM PB 150 mM NaCl 0.5% BSA 0.05% Tween-200 0.1% P300).
반응 모드 및 반응 시간 : 테스트 할 샘플 50ul + 샘플 희석액 50ul을 37℃ 항온 박스에서 60 분 동안 반응시키고; 플레이트를 5 회 세척하고 두드려 건조하고 100ul 표지된 재조합 단백질 -HRP 작업 용액을 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 반응시키며; 플레이트를 5회 세척하고 현색제 A와 B를 각각 50ul 씩 첨가하고 30 분 동안 현색시키며; 정지액 50ul 을 첨가하고 450nm 및 630nm 이중 파장 검출 사용한다. 검출은 10 분 이내에 판독해야 한다.
500 개의 HIV-1 양성 혈청에 대해 1:200의 비율로 샘플 희석액을 사용하여 희석 후 테스트할 샘플로 하여 활성을 측정하였다. 결과는 표 2에 나타냈으며, 돌연변이 후 500개의 양성 샘플 희석후 측정된 평균 민감도는 현저히 상승하였다.
| 클론 명칭 | 500개 HIV 샘플을 1:200비율로 희석 후 검출한 평균 OD600 판독 값 |
| HIV-Ag-1 | 0.732 |
| HIV-Ag-10 | 0.856 |
| HIV-Ag-2 | 0.794 |
| HIV-Ag-11 | 1.122 |
| HIV-Ag-3 | 0.642 |
| HIV-Ag-12 | 0.989 |
| HIV-Ag-4 | 1.254 |
| HIV-Ag-13 | 1.261 |
| HIV-Ag-5 | 0.901 |
| HIV-Ag-14 | 1.101 |
| HIV-Ag-6 | 1.264 |
| HIV-Ag-15 | 1.367 |
| HIV-Ag-7 | 0.892 |
| HIV-Ag-16 | 1.299 |
| HIV-Ag-8 | 0.697 |
| HIV-Ag-17 | 1.189 |
| HIV-Ag-9 | 1.103 |
| HIV-Ag-18 | 1.179 |
마지막으로 설명할 것은, 이상의 실시예는 본 발명의 과제의 해결 수단을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명에 대한 한정이 아니다. 비록 전술한 각 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하였으나, 당업자는 전술한 각 실시예에 기재된 과제의 해결 수단을 수정하거나 그중의 일부 또는 전부 기술특징에 대해 등가 대체가 가능하며, 이런 수정 또는 대체는 상응한 과제의 해결 수단의 본질이 본 발명의 각 실시예의 과제의 해결 수단의 범위를 벗어나지 않음을 이해할 것이다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 특이성 펩타이드는 항 HIV-1 항체를 더 잘 검출할 수 있고 잠재적인 “거짓 음성” 및 “거짓 양성” 결과를 더 잘 방지할 수 있다. 본 발명이 제공하는 합성 펩타이드 검출 방법을 사용하면 민감도와 특이성이 각각 100% 및 99.75% 이상에 달한다. 본 발명의 특이성 펩타이드는 높은 민감도 및 특이성을 구비하여 HIV-1 감염의 조기 진단에 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> 둥관시펑지생물과학기술유한회사
<120> HIV-1 검출을 취한 합성 펩타이드
<130> PI19031058
<150> CN2018109041202
<151> 2018-08-09
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> 인간 면역 결핍 바이러스
<400> 1
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1 5 10 15
Gln Arg Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
20 25 30
Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val
35 40 45
Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser
50 55 60
Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Thr Ser Trp Ser
65 70 75 80
Asn Lys Ser Leu Ser Glu Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Met Gln Trp
85 90 95
Glu Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Thr Leu Ile Glu
100 105 110
Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Leu Pro Leu Leu Lys Leu
115 120 125
Asp Asn Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asp
130 135
Claims (15)
- 합성 펩타이드에 있어서,
이는 돌연변이 부위를 포함하는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이고;
상기 돌연변이 부위는
T77이 V, N 또는 S로 치환된 것;
N101이 D, E 또는 Q로 치환된 것;
G105가 K, H 또는 R로 치환된 것;
P124가 D 또는 E로 치환된 것;
K127이 D, E 또는 Q로 치환된 것에서 선택되는 적어도 하나이거나;
또는, 상기 임의의 하나의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 구비하는 아미노산 서열이고 99%보다 큰 민감도 및/또는 99.4%보다 큰 특이성을 구비하며;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 T77이 V, N 또는 S로 치환된 것을 포함하고;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 N101이 D, E 또는 Q로 치환된 것을 포함하며;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 G105가 K, H 또는 R로 치환된 것을 포함하고;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 P124가 D 또는 E로 치환된 것을 포함하며;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 K127이 D, E 또는 Q로 치환된 것을 포함하는 합성 펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 돌연변이 부위는
R18이 S로 치환된 것;
Q95가 E로 치환된 것;
L106이 E로 치환된 것;
L123이 K로 치환된 것;
N130이 K로 치환된 것 중 적어도 하나를 더 포함하고,
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 R18이 S로 치환된 것을 포함하며;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 Q95가 E로 치환된 것을 포함하고;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 L106이 E로 치환된 것을 포함하며;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 L123이 K;로 치환된 것을 포함하고;
바람직하게, 상기 돌연변이 부위는 N130이 K로 치환된 것을 포함하는 합성 펩타이드. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 합성 펩타이드에는 신호 강도를 가리키는 지시제가 라벨링되고;
바람직하게, 상기 신호 강도를 가리키는 지시제는 형광물질, 양자점, 디곡시제닌 표지 프로브, 비오틴, 방사성 동위원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 마이크로스피어, 전자 밀도 물질, 화학 발광 마커, 초음파 조영제, 광민감제, 콜로이드 금 또는 효소 중 어느 하나를 포함하는 합성 펩타이드. - 제1항 또는 제2항에 따른 합성 펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
- 제4항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제5항에 따른 벡터에 의해 형질 전환되는 숙주세포.
- 제1항 또는 제2항에 따른 합성 펩타이드의 제조 방법에 있어서,
제4항에 따른 핵산 분자를 발현시키는 단계 a); 또는
화학 합성을 진행하고 아미노산을 첨가하여 완전한 폴리펩타이드를 얻는 단계 b)를 포함하는 합성 펩타이드의 제조 방법. - 변형된 합성 펩타이드에 있어서,
이는 제1항 또는 제2항에 따른 합성 펩타이드를 신호 강도를 가리키는 지시제로 라벨링하여 얻어지고
바람직하게, 상기 신호 강도를 가리키는 지시제는 형광물질, 양자점, 디곡시제닌 표지 프로브, 비오틴, 방사성 동위원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 마이크로스피어, 전자 밀도 물질, 화학 발광 마커, 초음파 조영제, 광민감제, 콜로이드 금 또는 효소 중 어느 하나를 포함하는 변형된 합성 펩타이드. - 제1항 또는 제2항에 따른 합성 펩타이드 또는 제8항에 따른 변형된 합성 펩타이드를 포함하는 키트에 있어서,
바람직하게, 면역학적으로 허용가능한 희석제, 완충 용액, 프로테아제 억제제, 항체 비특이적 결합을 차단하기 위한 차단제, HIV-1 항체에 대해 친화력을 구비하는 제2 항체 중 하나 또는 다수를 더 포함하고
바람직하게, 상기 키트가 제8항에 따른 변형된 합성 펩타이드를 포함할 경우 상기 키트는 상기 신호 강도를 가리키는 지시제를 검출하기 위한 시약을 더 포함하는 키트. - 비진단 목적의 항 HIV-1 항체의 체외 검출 방법에 있어서,
생물학적 샘플과 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 합성 펩타이드, 또는 제8항에 따른 변형된 합성 펩타이드, 또는 제9항에 따른 키트 중의 시약을 접촉시켜 면역복합체를 형성하는 단계; 및
상기 면역복합체 중 상기 합성 펩타이드 또는 상기 변형된 합성 펩타이드의 존재를 검출하여, 상기 생물학적 샘플 중 HIV-1 항체의 존재를 지시하는 단계를 포함하는 비진단 목적의 항 HIV-1 항체의 체외 검출 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 합성 펩타이드, 또는 제8항에 따른 변형된 합성 펩타이드, 또는 제9항에 따른 키트가 HIV-1 진단제의 제조에서의 응용.
- HIV-1 관련 질병의 진단 방법에 있어서,
생물학적 샘플과 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 합성 펩타이드, 또는 제8항에 따른 변형된 합성 펩타이드, 또는 제9항에 따른 키트 중의 시약을 접촉시켜 면역복합체를 형성하는 단계; 및
상기 면역복합체 중 상기 합성 펩타이드 또는 상기 변형된 합성 펩타이드의 존재를 검출하여, 상기 생물학적 샘플 중 HIV-1 항체의 존재를 지시하는 단계를 포함하는 HIV-1 관련 질병의 진단 방법. - 제10항, 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 포유동물 유래 샘플이고, 바람직하게 인간 유래 샘플인 방법. - 제10항, 제12항, 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 세포 배양 상청, 타액, 뇌척수액, 정액, 전립선액, 조직 또는 조직 용해액 중 적어도 하나를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 합성 펩타이드, 또는 제8항에 따른 변형된 합성 펩타이드, 또는 제9항에 따른 키트가 HIV-1 진단에서의 응용.
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