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KR20200127170A - Pah 유전자 기능 복원을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Pah 유전자 기능 복원을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20200127170A
KR20200127170A KR1020207024199A KR20207024199A KR20200127170A KR 20200127170 A KR20200127170 A KR 20200127170A KR 1020207024199 A KR1020207024199 A KR 1020207024199A KR 20207024199 A KR20207024199 A KR 20207024199A KR 20200127170 A KR20200127170 A KR 20200127170A
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KR
South Korea
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amino acid
seq
capsid protein
nucleotide
pah
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Application number
KR1020207024199A
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English (en)
Inventor
앨버트 반즈 세이무어
씨민 세어 아메드
제이슨 보크 라이트
세레나 니콜 돌리브
제임스 앤서니 맥스위건
제이미 미첼 프라우트
다니엘 로렌 수키어션
Original Assignee
호몰로지 메디슨, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 호몰로지 메디슨, 인크. filed Critical 호몰로지 메디슨, 인크.
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Abstract

본 명세서는 세포에서 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH) 유전자 기능을 복원할 수 있는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 제공한다. 또한 AAV 조성물의 사용 방법, 및 AAV 조성물의 제조를 위한 패키징 시스템을 제공한다.

Description

PAH 유전자 기능 복원을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2018년 2월 1일 출원된 미국 가출원 제62/625,149호, 및 2018년 5월 16일 출원된 미국 가출원 제62/672,377호에 대한 우선권을 청구하고, 이들 전체 개시 내용은 참조하여 본 명세서에 편입시킨다.
전자 제출된 서열 목록에 관한 참조
ASCII 텍스트 파일로 전자 제출된 서열 목록의 내용 (명칭: HMT-024PC_SeqList_ST25.txt; 크기: 367,287 바이트; 및 생성일: 2019년 1월 30일)은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
페닐케톤뇨증 (PKU)은 대부분의 사례가 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH) 유전자의 돌연변이로 인해 초래되는 상염색체 열성 유전병이다. PAH 유전자는 다량체화 시에 L-페닐알라닌 (Phe)의 L-티로신 (Tyr)으로의 히드록실화를 촉매하는 간 효소를 코딩한다. PAH 활성의 감소 또는 실활은 페닐알라닌 축적 및 이의 페닐 피루베이트 (페닐케톤이라고도 함)로의 전환을 야기시킨다. 페닐알라닌 물질대사에서 이러한 이상은 신경 성숙 및 미엘린 합성을 손상시켜서, 정신 지체, 발작 및 다른 심각한 의료 문제를 일으킨다.
현재, PKU에 대한 치료는 존재하지 않는다. 표준 치료는 고량의 페닐알라닌을 함유하는 음식물을 최소화하는 식이 관리이다. 태어나서부터 저페닐알라닌 분유를 사용한 식이 관리는 대체로 장애의 신경학적 결과의 발생을 예방한다. 그러나, 저단백질 식이를 하더라도, 아이들은 여전히 성장 지체를 앓고, 성인은 종종 골다공증 및 비타민 결핍을 겪는다. 게다가, 평생 식이 치료의 준수는 특히 학령 이후에는 어렵다.
거대 중성 아미노산 (LNAA) 보충, 보조인자 테트라히드로비옵테린 요법, 효소 대체 요법, 및 유전자 변형 프로바이오틱 요법을 포함한, 신규 치료 전략이 최근에 부상하였다. 그러나, 이들 전략은 단점을 갖고 있다. LNAA 보충법은 저 Phe 식이를 준수하지 않는 성인에게만 적합하다. 보조인자 테트라히드로비옵테린은 일부 경증 형태의 PKU에서만 사용할 수 있다. PAH에 대한 대체제, 예를 들어 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL)의 투여에 의한 효소 대체는 효능을 저하시키고/시키거나 부작용을 초래하는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 유전자 변형 프로바이오틱 요법의 경우에는, PAL-발현 이. 콜라이의 병원성이 우려되었다.
유전자 요법은 PKU를 치유할 고유한 기회를 제공한다. 렌티바이러스 벡터를 포함한, 레트로바이러스 벡터는 숙주 세포 게놈으로 핵산을 통합시킬 수 있다. 그러나, 이들 벡터는 그들의 게놈으로의 비표적화된 삽입으로 인해서 안정성 문제가 제기될 수 있다. 예를 들어, 벡터가 종양 억제인자 유전자를 파괴하거나 또는 종양유전자를 활성화시킬 위험성이 있어서, 악성종을 초래하게 된다. 실제로, 감마레트로바이러스 벡터로 CD34+ 골수 전구체를 형질도입시켜 X-연관 중증 복합 면역결핍증 (SCID)을 치료하기 위한 임상 시험에서, 10명 환자 중 4명에서 백혈병이 발생되었다 (Hacein-Bey-Abina et al., J Clin Invest. (2008) 118(9):3132-42).
뉴클레아제-기반 유전자 편집 기술, 예컨대 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 및 크리스퍼 (CRISPR, clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat) 기술이 PKU 환자에서 PAH 유전자의 결함을 교정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이들 기술 각각은 의도하는 표적 부위와 서열이 유사한 인간 게놈 내 표적외 부위 돌연변이의 잠재성으로 인해 안정성 문제를 제기한다.
따라서, PKU 환자에서 PAH 유전자 기능을 효율적이고 안전하게 복원할 수 있는 개선된 유전자 요법 조성물 및 방법에 대한 당분야의 요구가 존재한다.
본 명세서는 세포에서 PAH 유전자 기능을 복원할 수 있는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 조성물, 및 PAH 유전자 기능 (예를 들어, PKU)의 감소와 연관된 질환을 치료하는 이의 사용 방법을 제공한다. 또한, 아데노-연관 바이러스 조성물을 제조하기 위한 패키징 시스템을 제공한다.
따라서, 일 양상에서, 본 개시는 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH) 유전자의 돌연변이를 교정하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은
(a) AAV 캡시드; 및
(b) (i) PAH 유전자 내 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 엘리먼트; (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 5'의 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 3'의 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈
을 포함하는 복제-결함 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 세포에 형질도입시키는 단계를 포함하고,
세포는 외생성 뉴클레아제 또는 외생성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 동시-형질도입하거나 또는 동시-투여하지 않고 형질도입된다.
일정 구현예에서, 세포는 간세포, 신장 세포, 또는 뇌, 뇌하수체, 부신, 췌장, 방광, 담낭, 결장, 소장, 또는 유방의 세포이다. 일정 구현예에서, 세포는 포유동물 대상체에 존재하고 AAV는 대상체의 세포를 형질도입시키는데 유효한 양으로 대상체에게 투여된다.
다른 양상에서, 본 개시는 PAH 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
(a) AAV 캡시드; 및
(b) (i) PAH 유전자의 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 엘리먼트; (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 5'의 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 3'의 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈
을 포함하는 복제-결함 AAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
외생성 뉴클레아제 또는 외생성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 대상체에게 동시-투여되지 않는다.
일정 구현예에서, 질환 또는 장애는 페닐케톤뇨증이다. 일정 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다.
다른 양상에서, 본 개시는
(a) AAV 캡시드; 및
(b) (i) PAH 유전자의 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 엘리먼트; (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 5'의 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열 5'; 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 3'의 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈
을 포함하는 복제-결함 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 제공한다.
하기 구현예들은 각각의 전술된 양상에 적용된다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열의 적어도 일부분을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 코딩한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 24에 기재된 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 침묵적으로 변경된다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139, 또는 143에 기재된 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열을 포함하고, 임의로 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 PAH 코딩 서열에 삽입된 비천연 인트론을 포함한다. 일정 구현예에서, 비천연 인트론은 헤모글로빈 베타 유전자의 제1 인트론 및 마우스의 미니트 (minute) 바이러스 (MVM) 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 비천연 인트론은 SEQ ID NO: 28-30, 및 120-130 중 어느 하나와 적어도 90%가 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 비천연 인트론은 SEQ ID NO: 28-30, 및 120-130 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 코딩한다. 일정 구현예에서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 5'에서 3'으로, PAH 코딩 서열의 제1 부분, 인트론, 및 PAH 코딩 서열의 제2 부분을 포함하고, 제1 부분 및 제2 부분은 함께 스플라이싱될 때, 완전한 PAH 코딩 서열을 형성한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 24에 기재된 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 침묵적으로 변경된다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25 또는 116에 기재된 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 5'에서 3'으로, 리보솜 스키핑 엘리먼트, 및 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열에 대해 3'에 폴리아데닐화 서열을 더 포함한다. 일정 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 외생성 폴리아데닐화 서열이고, 임의로 외생성 폴리아데닐화 서열은 SV40 폴리아데닐화 서열이다. 일정 구현예에서, SV40 폴리아데닐화 서열은 SEQ ID NO: 31-34, 및 이의 상보성 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손에 존재한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손 1에 존재한다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 리보솜 스키핑 엘리먼트에 대해 5'에 스플라이스 억셉터를 더 포함한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론에 존재한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 35에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열은 제1 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일하다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열은 제2 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일하다.
일정 구현예에서, 제1 게놈 영역은 제1 편집창에 위치되고, 제2 게놈 영역은 제2 편집창에 위치된다. 일정 구현예에서, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 36 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진고, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 제1 게놈 영역은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 제2 게놈 영역은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 각각의 5' 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열은 독립적으로 약 100개 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68), PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및/또는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A를 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는
(a) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G;
(b) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A;
(c) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A;
(d) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A;
(e) PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G;
(f) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C;
(g) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68); 및/또는
(h) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A를 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 (c) 및 (d), (f) 및 (g), 및/또는 (b) 및 (h)의 변형을 포함한다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 36-44, 111, 115, 및 142 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 45, 112, 117, 144에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46-54, 113, 118, 134, 136, 및 145 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, 교정 게놈은 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 5'의 5' 반전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 3'의 3' 반전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 18과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 19와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 20과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 21과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 26과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 27과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55-63, 114, 119, 135, 137, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55-63, 114, 119, 135, 137, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서,
(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
(b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
(c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
(d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
(e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다.
일정 구현예에서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이고; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서,
(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
(b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
(c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
(d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
(e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다.
일정 구현예에서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 68에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 V이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이고; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서,
(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나;
(b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Y이거나;
(c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나;
(d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나;
(e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
(f) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
(g) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
(h) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
(i) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다.
일정 구현예에서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합 효율은 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에게 투여될 때 적어도 1%이다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도는 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 인식된 마우스에게 투여될 때 적어도 0.5%이다.
다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서에 개시된 AAV를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 AAV의 재조합 제조를 위한 패키징 시스템을 제공하고, 패키징 시스템은
(a) 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열;
(b) 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열 ; 및
(c) 본 명세서에 개시된 바와 같은 교정 게놈 또는 전달 (transfer) 게놈을 포함하고, 패키징 시스템은 AAV를 형성하도록 캡시드에 교정 게놈 또는 전달 게놈을 밀봉하기 위해 세포에서 작동된다.
일정 구현예에서, 패키징 시스템은 Rep 뉴클레오티드 서열 및 Cap 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 교정 게놈을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일정 구현예에서, Rep 뉴클레오티드 서열은 AAV2 Rep 단백질을 코딩한다. 일정 구현예에서, AAV2 Rep 단백질은 78/68 또는 Rep 68/52이다. 일정 구현예에서, AAV2 Rep 단백질은 SEQ ID NO: 22의 AAV2 Rep 아미노산 서열과 최소 백분율의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 최소 백분율의 서열 동일성은 AAV2 Rep 단백질을 코딩하는 아미노산 서열의 길이 전반에서 적어도 70%이다.
일정 구현예에서, 패키징 시스템은 제3 벡터를 더 포함하고, 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 벡터이다. 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스 벡터는 독립적인 제3 벡터이다. 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스 벡터는 제1 벡터와 통합된다. 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스 벡터는 제2 벡터와 통합된다. 일정 구현예에서, 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.
일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 및 사이토메갈로바이러스 (CMV)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스이다. 일정 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 E1, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함한다. 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)이다. 일정 구현예에서, HSV 게놈은 UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 HSV 유전자를 포함한다.
일정 구현예에서, 제1 벡터 및 제3 벡터는 제1 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 일정 구현예에서, 제2 벡터 및 제3 벡터의 뉴클레오티드는 제2 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 일정 구현예에서, 제1 벡터 및 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스에 클로닝된다. 일정 구현예에서, 제2 벡터 및 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스에 클로닝된다.
다른 양상에서, 본 개시는 AAV의 재조합 제조를 위한 방법을 제공하고, 방법은 AAV를 형성하도록 캡시드에 교정 게놈 또는 전달 게놈을 밀봉시키기 위해 작동되는 조건 하에서 세포에 본 명세서에 기술된 바와 같은 패키징 시스템을 도입시키는 단계를 포함한다.
도 1A 는 pHMI-hPAH-hAC-008 벡터의 맵이다.
도 1B 는 pHMI-hPAH-h1C-007 벡터의 맵이다.
도 1C 는 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 벡터의 맵이다.
도 2 는 pCOH-WT-PAH ("WT PAH"), pCOH-CO-PAH ("CO PAH pCOH"), 및 pHMI-CO-PAH ("CO PAH pHMI") 벡터로부터 인간 PAH의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯의 이미지이다. 5x105 HEK 293 세포를 1 ㎍의 벡터로 형질감염시켰다. 세포의 용해물은 형질감염 이후 48시간에 수집하였다. 인간 PAH의 발현은 항-PAH 항체 (Sigma HPA031642)를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 검출하였다. 항-GAPDH 항체 (Millipore MAB 374)로 검출되는 GAPDH 단백질의 양은 로딩 대조군으로서 도시되었다.
도 3A 는 편집 표적 부위의 선형 증폭 ("LAM-농축") 또는 PCR 증폭 ("앰플리콘") 이후에 PAH cDNA의 정량을 보여주는 그래프이다.
도 3B 는 액적 디지털 PCR (ddPCR)에 의한 pHMI-hPAH-hA-002 벡터 통합의 정량적 분석을 보여주는 그래프이다.
도 4A 는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 디자인 및 마우스 게놈으로 이의 예상되는 통합을 도시한다.
도 4B 는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터에 의해 편집된 대립유전자를 PCR를 통해 검출하기 위한 방법을 예시하는 다이아그램이다. 2개 쌍의 프라이머를 디자인하였다: 제1 쌍은 미편집된 대립유전자 ("대조군 PCR")로부터 867 bp DNA를 증폭시킬 수 있었고; 제2 쌍은 편집된 대립유전자 ("편집된 대립유전자 PCR")로부터 2459 bp DNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있었다.
도 4C 는 도 4A에 예시된 바와 같이 대조군 PCR ("대조군 PCR") 및 편집된 대립유전자 PCR ("Edit PCR")로부터의 PCR 생성물을 보여주는 DNA 전기영동의 이미지이다. AAVHSC 캡시드에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터는 2마리 야생형 신생 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 체중 kg 당 2x1013 벡터 게놈의 용량이 주사되었다. 간 샘플은 2주 이후에 수집되었다. 염수 처리된 마우스 유래 간 샘플 및 3T3 마우스 섬유아세포의 세포 샘플은 편집된 대립유전자 PCR을 위한 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 5A 는 편집된 대립유전자를 ddPCR을 통해 정량하기 위한 방법을 예시하는 다이아그램이다. 제1 프라이머 쌍은 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 제1 서열을 증폭시키도록 디자인되었고, 제1 프로브 ("벡터 프로브")는 제1 서열과 하이브리드화하도록 디자인되었다. 제2 프라이머 쌍은 벡터 근처 마우스 게놈 상의 제2 서열을 증폭시키도록 디자인되었고, 제2 프로브 ("유전자좌 프로브")는 제2 서열과 하이브리드화하도록 디자인되었다. DNA 샘플은 유적 (oil droplet)으로 분할하였다. DNA의 농도는 하나의 유적이 무작위적으로 벡터 입자 및 게놈 DNA 입자를 함유할 확률을 유의하게 감소시키기 위해서 20 ㎕ 당 600 pg으로 최적화시켰다 (p<0.001). 게놈으로 벡터의 통합 시에, 동일 유적 내 벡터 프로브 및 유전자좌 프로브의 이중 양성 비율이 증가된다.
도 5B 는 도 5A에 기술된 방법을 사용해 예상되는 결과를 예시하는 다이아그램이다. 다이아그램에서, 각각의 도트는 단일 유적을 나타낸다. 음성 벡터 프로브 신호이지만 양성 유전자좌 프로브 신호를 갖는 도트는 미편집된 대립유전자를 나타내는 한편, 양성 벡터 프로브 신호이지만 양성 유전자좌 프로브 신호를 갖는 도트는 편집된 대립유전자를 나타낸다.
도 5C 는 도 5A에 기술된 방법을 사용하여 마우스 간으로부터 생성된 데이터를 도시하는 그래프이다. AAVHSC 캡시드에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터는 2마리 야생형 신생 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 체중 kg 당 2x1013 벡터 게놈의 용량이 주사된다. 간 샘플은 2주 이후에 수집하였다. 하나의 샘플이 도 5A에 기술된 방법을 사용해 분석되었다. 벡터 프로브 및 유전자좌 프로브 이중 양성 유적이 검출되었다.
도 5D 는 염수 처리 마우스 유래 간 및 pHMI-hPAH-mAC-006 플라스미드를 함유하는 샘플로부터 생성된 데이터를 도시하는 그래프이다. 소수의 프로브 및 유전자좌 프로브 이중 양성 유적이 검출되어서, 샘플이 하나의 유적이 무작위적으로 벡터 입자 및 게놈 DNA 입자를 함유할 확률이 매우 낮도록 충분히 희석되었다는 것을 시사한다.
도 5E 는 도 5D의 그래프의 정량을 도시한 그래프 및 다른 샘플로부터 생성된 그래프이다. 2마리의 대조군 마우스는 각각 간에서 0% 및 0.0395%의 편집된 대립유전자를 가졌고, pHMI-hPAH-mAC-006 벡터로 처리된 2마리 마우스는 간에서 각각 2.504% 및 2.783% 편집된 대립유전자를 가졌다.
도 6 은 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 투여 이후 간에서 PAH의 mRNA 발현을 도시한 그래프이다. RNA를 추출하여 역전사시켰다. 프라이머 및 프로브 쌍은 편집된 대립유전자로부터 PAH 발현을 특이적으로 검출하도록 디자인되었다. 각각의 PAH 발현 수준은 내생성 Hprt의 발현 수준에 대해 정규화된다.
도 7A 는 벡터 및 마우스 PAH 게놈 유전자좌 카피수를 측정하기 위한 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 ddPCR을 통해서 측정된, 마우스 혈액 샘플에서 AAVHSC 캡시드에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 형질도입 효율을 도시하는 그래프이다. 세포 당 벡터 게놈의 개수 ("세포 당 VG")는 벡터의 수 대 마우스 PAH의 게놈 유전자좌의 카피수의 측정된 비율로부터 계산된다.
도 7B 는 마우스 PAH 유전자좌 및 인간 PAH 유전자좌로 통합된 AAV 벡터 ("페이로드")로부터 통합된 DNA의 빈도를 측정하기 위한 프라이머 프로브 세트를 사용한 다중화 ddPCR을 통해 측정된 마우스 혈액 샘플에서의 편집 효율 백분율을 도시하는 그래프이다. 편집 빈도는 별개 핵산 분자에서 페이로드 및 표적 DNA의 동시-분할의 예상 확률을 초과하는 단일 유적 내 페이로드 및 표적 DNA의 검출된 동시-분할을 기반으로 계산하였다.
도 7C 는 AAVHSC 캡시드에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 투여 이후에 마우스에서 기준치 대비 혈청 페닐알라닌 수준의 백분율을 도시하는 그래프이다. 처리된 동물 및 대조군 동물 (AAV 투여를 받지 않은 마우스)에서의 평균 수준이 그래프화된다.
도 7D 는 AAVHSC 캡시드에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터가 주사된 각각의 개별 마우스 또는 AAV 투여를 받지 않은 각각의 대조군 마우스에서 기준치 대비 혈청 페닐알라닌 수준의 백분율을 도시한 그래프이다. p 값은 대조군 분포에 대해 ANOVA를 통해 계산하였다.
도 7E 는 기준치 대비 혈청 페닐알라닌 수준의 백분율 및 편집 효율 백분율 간 상관성을 도시하는 그래프이다.
도 7F 는 hPAH-mAC-006 벡터 (중간 패널), 비통합 Pah 이식유전자 벡터 (우측 패널), 또는 염수 대조군 (좌측 패널)이 주사된 마우스의 간 샘플에서 PAH 서열을 포함하는 아마도 바이러스 DNA 및 Pah mRNA의 인 시츄 하이브리드화 (ISH)를 도시한 이미지의 세트이다.
도 8A 는 벡터에 특이적인 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 ddPCR을 통해 측정된, AAVHSC15 캡시드에 패키징된 벡터가 투여된 마우스에서 인간 및 마우스 간세포에서의 hPAH-hAC-008 벡터 및 hPAH-hAC-008-HBB 벡터의 형질도입 효율을 도시한 그래프이다. y-축은 마우스 또는 인간 세포의 게놈에 대해 측정된 벡터의 개수를 의미한다.
도 8B 는 미변형 또는 변형 hPAH-hAC-008 벡터가 투여된 마우스 유래 간 샘플에서 침묵 코돈 변경을 갖는 PAH 서열을 포함하는 가능한 바이러스 DNA 및 인간 Pah mRNA의 인 시츄 하이브리드화를 도시한 일련의 사진이다. 프로브는 미변형 또는 변형 hPAH-hAC-008 벡터에 의해 편집된 유전자 좌위로부터 전사된 mRNA 만을 검출하였다.
도 8C 는 다중화 ddPCR을 통해 측정된, 인간 간세포가 이식된 마우스 유래 마우스 및 인간 간세포에서 hPAH-hAC-008 벡터의 편집 효율의 백분율을 도시한 그래프이다. 도면의 좌측 절반은 hPAH-hAC-008-HBB 벡터가 처리된 동물의 편집 효율을 의미하고, 우측 절반은 hPAH-hAC-008 벡터가 처리된 동물의 것을 의미한다. p 값은 ANOVA로 계산하였다.
도 9A 는 마우스에서 PAH 유전자의 편집 효율을 결정하기 위해 사용되는 어세이의 개략도를 도시한다.
도 9B 는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 또는 비히클 대조군이 투여된 마우스 유래 세포에서 PAH 유전자 편집 효율을 도시한 그래프이다.
도 10A 는 AAVHSC15 캡시드 또는 비히클 대조군에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 투여 이후 마우스에서 기준치 대비 혈청 페닐알라닌 수준의 평균 백분율을 도시한 그래프이다.
도 10B 는 AAVHSC15 캡시드 또는 비히클 대조군에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 투여 이후 마우스에서 기준치 대비 혈청 티로신 수준의 평균 백분율을 도시한 그래프이다.
도 10C 는 AAVHSC15 캡시드 또는 비히클 대조군에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터를 받은 마우스에스 혈청 페닐알라닌 및 혈청 티로신 수준 간 비율을 도시한 그래프이다.
도 11A 는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 또는 비히클 대조군이 투여된 마우스로부터 수득된 세포에서 평균 PAH 유전자 편집 효율 및 형질도입 효율을 도시한 그래프이다.
도 11B 는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (AAVHSC15-mPAH) 및 또는 비히클 대조군이 투여된 마우스에서 수득된 세포에서, 마우스 GAPDH의 발현 수준에 대해 정규화된, 발현된 PAH mRNA의 상대적 분량을 도시한 그래프를 도시한다.
도 12A 는 HuLiv 인간화 간 마우스 모델을 도시한 개략도이다.
도 12B 는 AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터의 투여 이후 1주차 및 6주차에 마우스로부터 수득된 세포에서의 평균 PAH 유전자 편집 효율을 도시한다.
도 13 은 AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터가 투여된 HuLiv 마우스로부터 수득된 세포에서, ddPCR 및 차세대 시퀀싱 (NGS)으로 결정된, 평균 PAH 유전자 편집 효율을 도시한 그래프이다.
도 14 는 대조군 마우스와 비교한, AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터 (hPAH-032) 또는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (mPAH-006)가 정맥내로 투여된 PAH 녹-아웃 마우스 모델 (PAH ENU2) 마우스의 평균 혈청 페닐알라닌 수준을 도시한 그래프이다.
도 15A 는 인간 PAH 발현 및 혈청 Phe 수준 간 관련성을 도시한 그래프이다.
도 15B 는 AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터가 처리된 2종의 상이한 HuLiv 마우스에서 인간 GAPDH 대비 인간 PAH의 발현을 도시한 그래프이다.
도 16 은 AAVHSC15 캡시드에서 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (우측)가 처리된 PAHENU2 마우스에서 마우스 PAH 유전자 발현 및 처리된 (좌측) HuLiv 마우스에서 인간 PAH 유전자 발현을 도시한 그래프이다.
도 17A, 17B, 17C, 17D, 17E 는 각각 pKITR-hPAH-mAC-006-HCR, pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR, pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3, pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3, 및 pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1의 벡터 맵을 도시한다.
본 개시는 세포에서 PAH 유전자 기능을 복원할 수 있는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 조성물을 제공하였다. 또한 아데노-연관 바이러스 조성물을 제조하기 위한 패키징 시스템을 제공한다.
I. 정의
본 명세서에서 사용되는, 용어 "복제-결함 아데노-연관 바이러스"는 Rep 및 Cap 유전자가 결여된 게놈을 포함하는 AAV를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "PAH 유전자"는 제한없이 PAH 유전자의 코딩 영역, 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 및 전사 조절 영역을 포함하는, 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH) 유전자를 의미한다. 인간 PAH 유전자는 Entrez Gene ID 5053로 확인된다. PAH mRNA의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 24로서 제공된다. PAH 폴리펩티드의 예시적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23으로서 제공된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "PAH 유전자 내 돌연변이의 교정"은 야생형 PAH 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 PAH 유전자를 생성시키기 위해 돌연변이체 PAH 유전자 내 표적 유전자좌에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 의미한다. 일정 구현예에서, "PAH 유전자 내 돌연변이의 교정"은 야생형 PAH 폴리펩티드 또는 이의 기능적 균등체가 돌연변이체 PAH 유전자 좌위로부터 (예를 들어, 내생성 PAH 유전자 프로모터의 제어 하에서) 발현되도록, 야생형 PAH 폴리펩티드의 적어도 일부분 또는 이의 기능적 균등체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이체 PAH 유전자에 삽입시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "교정 게놈"은 PAH 유전자 내 유전자 결함을 교정하기 위해 표적 유전자좌로 상동성 재조합을 통해서 편집 엘리먼트 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합)를 통합시킬 수 있는 재조합 AAV 게놈을 의미한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 인간 PAH 유전자에 존재한다. 당업자는 5' 상동성 팔부, 편집 엘리먼트, 및 3' 상동성 팔부를 포함하는 교정 게놈의 일부분이 표적 유전자좌 (예를 들어, 인간 PAH 유전자)에 대해 센스 또는 안티센스 배향일 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "편집 엘리먼트"는 표적 유전자좌에 통합될 때 표적 유전자좌를 변형시키는 교정 게놈의 일부분을 의미한다. 편집 엘리먼트는 표적 유전자좌에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "표적 유전자좌"는 편집 엘리먼트에 의해 변형되는 뉴클레오티드간 결합 (예를 들어, 인간 PAH 유전자의 영역 또는 뉴클레오티드간 결합) 또는 염색체의 영역을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "상동성 팔부"는 표적 유전자좌에 측접하는 게놈과 실질적으로 동일한 편집 엘리먼트의 5' 또는 3'에 위치된 교정 게놈의 일부분을 의미한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 인간 PAH 유전자에 존재하고, 상동성 팔부는 표적 유전자좌에 측접하는 게놈과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "분기군 F 캡시드 단백질"은 본 명세서의 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-736, 138-736, 및 203-736에 각각 기재된 VP1, VP2, 또는 VP3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 AAV VP1, VP2, 또는 VP3 캡시드 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 2개 뉴클레오티드 서열 또는 2개 아미노산 서열 간 동일성은 정렬된 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 개수를 더 긴 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 전체 길이로 나누어서 결정된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "PAH 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애"는 PAH 유전자의 변이에 의해 초래되거나, 그로 인해 악화되거나, 또는 그와 유전적으로 연결된 임의의 질환 또는 장애를 의미한다. 일정 구현예에서, PAH 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애는 페닐케톤뇨증 (PKU)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "침묵적으로 변경"은 코딩서열 또는 스터퍼 (stuffer)-삽입된 코딩 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 (예를 들어, 뉴클레오티드 치환에 의한) 유전자의 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 변경을 의미한다. 코돈 변경은 당분야에 공지된 임의의 방법으로 통해 수행될 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, [Mauro & Chappell (2014) Trends Mol Med. 20(11):604-13]에 기재된 바와 같음). 이러한 침묵 변경은 표적 유전자에 대해 직렬상동 (paralogous)인 다른 유전자 또는 위유전자의 유전자좌로 교정 게놈의 통합 가능성을 감소시킨다는 점에서 유리하다. 이러한 침묵 변경은 또한 편집 엘리먼트 및 표적 유전자 간 상동성을 감소시켜서, 상동성 팔부 대신에 편집 엘리먼트에 의해 매개되는 바람직하지 않은 통합을 감소시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "코딩 서열"은 출발 코돈에서 시작하여 중지 코돈에서 종결되는, 폴리펩티드를 코딩하는 상보성 DNA (cDNA)의 일부분을 의미한다. 유전자는 선택적 스플라이싱 및/또는 선택적 번역 개시로 인해 하나 이상의 코딩 서열을 가질 수 있다. 코딩 서열은 야생형일 수 있거나 또는 침묵적으로 변경될 수 있다. 예시적인 야생형 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 24에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 유전자의 "인트론-삽입된 코딩 서열"은 유전자의 코딩 서열에 삽입된 하나 이상의 인트론을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일정 구현예에서, 인트론 중 적어도 하나는 비천연 인트론으로서, 다시말해서, 유전자의 천연 인트론과 상이한 서열을 갖는다. 일정 구현예에서, 인트론-삽입된 코딩 서열 내 모든 인트론은 비천연 인트론이다. 비천연 인트론은 상이한 종 유래 인트론의 서열, 또는 동일한 종 유래 상이한 유전자 내 인트론의 서열을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 비천연 인트론 서열의 적어도 일부분은 합성일 수 있다. 당업자는 비천연 인트론 서열이 당분야에 공지된 임의의 공통 스플라이싱 모티프를 도입시켜서 RNA 스플라이싱을 매개하도록 디자인될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 예시적인 공통 스플라이싱 모티프는 [Sibley et al., (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21]에 제공되어 있고, 이의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 비천연 인트론의 삽입은 스터퍼 서열이 최적 크기 (예를 들어, 4.5-4.8 kb)에 도달하도록 벡터의 조정을 가능하게 하므로, 벡터 패키징의 효율 및 강건성을 촉진시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 인트론의 적어도 하나는 유전자의 천연 인트론이다. 일정 구현예에서, 인트론-삽입된 코딩 서열 내 모든 인트론은 유전자의 천연 인트론이다. 비천연 또는 천연 인트론은 코딩 서열 내 임의의 뉴클레오티드간 결합에서 삽입될 수 있다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 비천연 또는 천연 인트론은 효율적인 스플라이싱을 촉진하는 것으로 예측되는 뉴클레오티드간 결합에 삽입된다 (예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 문헌 [Zhang (1998) Human Molecular Genetics, 7(5):919-32] 참조). 일정 구현예에서, 하나 이상의 비천연 또는 천연 인트론은 2개의 내생성 엑손을 연결하는 뉴클레오티드간 결합에 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리보솜 스키핑 엘리먼트"는 하나의 mRNA 분자의 번역으로부터 2개의 펩티드 사슬의 생성을 초래할 수 있는 짧은 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일정 구현예에서, 리보솜 스키핑 엘리먼트는 X1X2EX3NPGP의 공통 모티프를 포함하는 펩티드를 코딩하고, 여기서 X1 은 D 또는 G이고, X2 는 V 또는 I이고, X3 은 임의의 아미노산이다 (SEQ ID NO: 75). 일정 구현예에서, 리보솜 스키핑 엘리먼트는 토세아-아시그나 바이러스 2A 펩티드 (T2A), 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드 (P2A), 구제역 바이러스 2A 펩티드 (F2A), 말 비염 A 바이러스 2A 펩티드 (E2A), 세포질 다각체병 바이러스 2A 펩티드 (BmCPV 2A), 또는 누에나방 (B.　mori)의 무름병 바이러스 2A 펩티드 (BmIFV 2A)를 코딩한다. T2A 펩티드 및 P2A 펩티드의 예시적인 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 76 및 77에 기재되어 있다. T2A 엘리먼트 및 P2A 엘리먼트의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO: 78 및 79에 기재되어 있다. 일정 구현예에서, 리보솜 스키핑 엘리먼트는 N-말단에서 Gly-Ser-Gly의 서열을 더 포함하는 펩티드를 코딩하고, 임의로 Gly-Ser-Gly의 서열은 GGCAGCGGA의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 이론에 국한하고 싶지 않지만, 리보솜 스키핑 엘리먼트는 제1 펩티드 사슬의 번역을 종결하고 제2 펩티드 사슬의 번역을 재개시하거나; 또는 코딩된 펩티드의 내재성 프로테아제 활성에 의해 리보솜 스키핑 엘리먼트에 의해 코딩되는 펩티드 서열 내 펩티드 결합의 절단에 의하거나, 또는 환경 (예를 들어, 시토졸) 내 다른 프로테아제에 의해 기능한다고 가정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리보솜 스키핑 펩티드"는 리보솜 스키핑 엘리먼트에 의해 코딩되는 펩티드를 의미한다.　
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리아데닐화 서열"은 RNA로 전사될 때 폴리아데닐화 신호 서열을 구성하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리아데닐화 서열은 천연 (예를 들어, PAH 유전자 유래) 유래일 수 있거나 또는 외생성일 수 있다. 외생성 폴리아데닐화 서열은 포유동물 또는 바이러스 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SV40 폴리아데닐화 서열)일 수 있다.
본 개시에서, PAH 유전자 내 뉴클레오티드 위치는 출발 코돈의 제1 뉴클레오티드에 대해 명시된다. 출발 코돈의 제1 뉴클레오티드는 위치 1이고; 출발 코돈의 제1 뉴클레오티드에 대해 5'의 뉴클레오티드는 음수를 가지며; 출발 코돈의 제1 뉴클레오티드에 대해 3'의 뉴클레오티드는 양수를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는, 인간 PAH 유전자의 뉴클레오티드 1은 NCBI 참조 서열: NG_008690.1의 뉴클레오티드 5,473이고, 인간 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -1은 NCBI 참조 서열: NG_008690.1의 뉴클레오티드 5,472이다.
본 개시에서, PAH 유전자 내 엑손 및 인트론은 NCBI 참조 서열: NG_008690.1의 뉴클레오티드 5473인, 출발 코돈의 제1 뉴클레오티드를 포괄하는 엑손에 대해 명시된다. 출발 코돈의 제1 뉴클레오티드를 포괄하는 엑손은 엑손 1이다. 엑손 1에 대한 3'의 엑손은 5'에서 3'으로, 엑손 2, 엑손 3 등이다. 엑손 1에 대한 3'의 인트론은 5'에서 3'으로, 인트론 1, 인트론 2 등이다. 따라서, PAH 유전자는 5'에서 3'으로, 엑손 1, 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 인간 PAH 유전자의 엑손 1은 NCBI 참조 서열: NG_008690.1의 뉴클레오티드 5001-5532이고, 인간 PAH 유전자의 인트론 1은 NCBI 참조 서열: NG_008690.1의 뉴클레오티드 5533-9704이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "통합"은 교정 게놈과 표적 유전자좌 간에 상동성 재조합을 통한 (예를 들어, PAH 유전자의) 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 도입을 의미한다. 편집 엘리먼트의 통합은 (예를 들어, PAH 유전자의) 표적 유전자좌 내 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 일으킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합 효율"은 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합이 발생된 형질도입된 개체군 중 세포의 백분율을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도"는 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합이 발생된 형질도입된 세포 개체군 중 대립유전자의 백분율을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표준 AAV 투여 조건"은 간세포 절제 이후에 마우스에 이식된 인간 간세포의 형질도입을 의미하고, AAV는 실시예 5, 섹션 b의 방법에서 제공된 바와 같이, 정맥내로 체중 킬로그램 당 1 Х 1013 벡터 게놈의 용량으로 투여된다.
대상체에게 AAV의 투여 상황에서 본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 바람직한 예방적 또는 치료적 효과를 달성하는 AAV의 양을 의미한다.
II. 아데노-연관 바이러스 조성물
일 양상에서, 본 명세서는 PAH 유전자 기능이 감소되거나 또는 그렇지 않으면 결함이 있는 세포에서 PAH 발현을 복원시키는데 유용한 신규한 복제-결함 AAV 조성물을 제공한다. 이러한 AAV 조성물은 PAH 유전자 내 돌연변이의 교정 또는 PAH 발현의 복원에서 매우 효율적이며, 이러한 교정을 촉진하기 위해서 외생성 뉴클레아제 (예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 뉴클레아제 (TALEN), 또는 RNA-가이드된 뉴클레아제 예컨대 Cas9)의 작용을 통한 표적 유전자좌에서의 게놈의 절단을 요구하지 않는다. 따라서, 일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 AAV 조성물은 외생성 뉴클레아제 또는 외생성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 AAV는 AAV 캡시드; 및 PAH 유전자 내 표적 유전자좌를 편집하기 위한 교정 게놈을 포함한다. 본 명세서에 개시된 AAV 조성물에 사용할 수 있는 AAV 캡시드 단백질은 제한없이 분기군 A AAV, 분기군 B AAV, 분기군 C AAV, 분기군 D AAV, 분기군 E AAV, 및 분기군 F AAV의 AAV 캡시드 단백질 및 이의 유도체를 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAVrh10의 AAV 캡시드 단백질 또는 이의 유도체이다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 포함한다.
임의의 AAV 분기군 F 캡시드 단백질 또는 이의 유도체가 본 명세서에 개시된 AAV 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다. 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다. 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 68에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 V이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Y이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 일정 구현예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다. 일정 구현예에서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 8의 아미노산 203-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 138-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 8의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 8의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 8의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 203-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 11의 아미노산 138-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 11의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 11의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 11의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 13의 아미노산 203-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 13의 아미노산 138-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 13의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 13의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 13의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 13의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 13의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 13의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질을 포함한다.
일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 1-736의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 분기군 F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, AAV 캡시드는 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질; 및 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 분기군 F 캡시드 단백질을 포함한다.
본 명세서에 개시된 AAV 조성물에서 유용한 교정 게놈은 일반적으로 (i) PAH 유전자 내 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 엘리먼트, (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 5'의 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 3'의 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' 상동성 팔부, 편집 엘리먼트, 및 3' 상동성 팔부를 포함하는 교정 게놈의 일부는 PAH 유전자 좌위에 대해 센스 또는 안티센스 배향일 수 있다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 5'에 5' 반전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 3'에 3' 반전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 교정 게놈에서 사용되는 편집 엘리먼트는 표적 유전자좌에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 매개할 수 있다.
일정 구현예에서, 표적 유전자좌에서 상동성 재조합을 통해 올바르게 통합될 때, 편집 엘리먼트는 야생형 PAH 폴리펩티드 또는 이의 기능적 균등체가 돌연변이체 PAH 유전자 좌위로부터 발현되도록, 돌연변이체 PAH 유전자로 PAH 코딩 서열의 적어도 일부분을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 삽입시킨다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 완전한 PAH 코딩 서열 (예를 들어, 야생형 PAH 코딩 서열 또는 침묵적으로 변경된 PAH 코딩 서열)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 1359를 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열 (예를 들어, 야생형 또는 침묵적으로 변경된 PAH 코딩 서열에 삽입된 인트론 포함)을 포함한다.
일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 야생형 PAH 폴리펩티드 (예를 들어, SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 가짐)를 코딩한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 야생형 (예를 들어, SEQ ID NO: 24에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함)이다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 야생형 PAH 유전자의 해당 엑손과 100% 미만 (예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵적으로 변경된다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다). 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 116에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다).
일정 구현예에서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 야생형 PAH 폴리펩티드 (예를 들어, SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 가짐)를 코딩한다. 일정 구현예에서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 PAH 코딩 서열에 삽입된 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12)의 인트론을 포함한다. 인트론은 PAH 유전자의 천연 인트론 서열, 상이한 종 또는 동일 종 유래 상이한 유전자로부터의 인트론 서열, 및/또는 합성 인트론 서열을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 비천연 인트론은 길이가 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1,500개, 또는 2,000개 뉴클레오티드 이하이다. 이론에 국한하고 싶지 않지만, 인트론은 예를 들어 핵에서 세포질로 mRNA 이출의 전사적 침묵화 및 증강을 감소시킴으로써, 이식 유전자 발현을 증가시킬 수 있다고 가정한다. 당업자는 합성 인트론 서열이 당분야에 공지된 임의의 공통 스플라이싱 모티프를 도입시켜 RNA 스플라이싱을 매개하도록 디자인될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다 (예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 [Sibley et al., (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21] 참조). 예시적인 인트론 서열은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 [Lu et al. (2013) Molecular Therapy 21(5): 954-63], 및 [Lu et al. (2017) Hum. Gene Ther. 28(1): 125-34]에 제공되어 있다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 임의 종 (예를 들어, 인간, 마우스 또는 토끼)에서의 헤모글로빈 베타 유전자의 제1 인트론을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 인간 HBB 유전자의 제1 인트론 (예를 들어, SEQ ID NO: 28과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열 포함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 마우스 HBB 유전자의 제1 인트론 (예를 들어, SEQ ID NO: 29와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열 포함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 마우스 미니트 바이러스 (MVM) 인트론 (예를 들어, SEQ ID NO: 30과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열 포함)를 포함한다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 120과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 키메라 MVM 인트론 (본 명세서에서 ChiMVM라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 121과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, SV40 인트론을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 122와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, 아데노바이러스 삼부체 리더 인트론 (예를 들어, 본 명세서에서 AdTPL이라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 123과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, 미니 β-글로빈 인트론 (본 명세서에서 MiniBGlobin이라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 124과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, AdV/Ig 키메라 인트론 (본 명세서에서 AdVIgG라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 125와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, β-글로빈 스플라이스 도너 영역 및 IgG 중쇄 스플라이스 억셉터 영역을 포함하는 키메라 인트론인, β-글로빈 Ig 중쇄 인트론 (본 명세서에서 BglobinIg라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어, SEQ ID NO: 126과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, 야생형 MVFM 인트론의 변이체인, Wu MVM 인트론 (본 명세서에서 Wu MVM이라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 127과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, HCR1 엘리먼트 (본 명세서에서 OptHCR이라고도 함)를 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 128과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, β-글로빈 인트론 (본 명세서에서 또한 Bglobin이라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 129와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, 인자 IX 인트론 (본 명세서에서 tFIX 또는 FIX 인트론이라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 예를 들어 SEQ ID NO: 130과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진, ch2BLood 인트론 (본 명세서에서 BloodEnh라고도 함)을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 야생형 PAH 폴리펩티드 (예를 들어, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 가짐)를 코딩한다. 일정 구현예에서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 함께 스플라이싱될 때, 완전한 PAH 코딩 서열을 형성하는 PAH 코딩 서열의 일부를 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 야생형 (예를 들어, SEQ ID NO: 24에 기재된 뉴클레오티드 서열 포함)이다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 야생형 PAH 유전자의 해당 엑손과 100% 미만 (예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 되도록 침묵적으로 변경된다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다). 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 116에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일정 구현예에서, 인트론-삽입된 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 116과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 116에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 인트론-삽입된 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 80, 81, 82, 131, 132, 또는 143에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 인트론-삽입된 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 80, 81, 82, 131, 132, 또는 143과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 인트론-삽입된 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 80, 81, 82, 131, 132, 또는 143에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
인트론은 PAH 코딩 서열 내 임의 위치에 삽입될 수 있다. 일정 구현예에서, 인트론은 2개의 천연 엑손을 연결하는 뉴클레오티드간 결합에 해당하는 위치에 삽입된다. 일정 구현예에서, 인트론은 천연 엑손 8 및 엑손 9를 연결하는 뉴클레오티드간 결합에 해당하는 위치에 삽입된다. 일정 구현예에서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 5'에서 3'으로, PAH 코딩 서열의 제1 부분, 인트론, 및 PAH 코딩 서열의 제2 부분을 포함하고, 여기서 제1 부분 및 제2 부분은 함께 스플라이싱될 때, 완전한 PAH 코딩 서열 (예를 들어, 야생형 PAH 코딩 서열, 또는 침묵적으로 변경된 PAH 코딩 서열)을 형성한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 65에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 67에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 3'에서 5'으로, SEQ ID NO: 64에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 PAH 코딩 서열의 제1 부분, 또는 이의 침묵적으로 변경된 변이체 (예를 들어, SEQ ID NO: 65에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어짐); 인트론 (예를 들어, SEQ ID NO: 28, 29, 또는 30에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어짐); 및 SEQ ID NO: 66에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 PAH 코딩 서열의 제2 부분, 또는 이의 침묵적으로 변경된 변이체 (예를 들어, SEQ ID NO: 66에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어짐)를 포함한다.
일정 구현예에서, PAH 코딩 서열은 변형된 스플라이스 도너 부위를 포함한다. 일정 구현예에서, 스플라이스 도너 부위-변형된 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 138 또는 139에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 스플라이스 도너 부위-변형된 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 138 또는 139와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 스플라이스 도너 부위-변형된 PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 138 또는 139에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열에 대해 3'에 전사 종결인자를 더 포함한다. 일정 구현예에서, 전사 종결인자는 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, 외생성 폴리아데닐화 서열)을 포함한다. 일정 구현예에서, 외생성 폴리아데닐화 서열은 SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보성 서열을 포함)을 포함한다. 일정 구현예에서, SV40 폴리아데닐화 서열은 SEQ ID NO: 31에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 5'에서 3'으로 PAH 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 25에 기재된 뉴클레오티드 서열 포함) 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 80에 기재된 뉴클레오티드 서열 포함), 및 SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31에 기재된 뉴클레오티드 서열 포함)을 포함한다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SV40 폴리아데닐화 서열에 대해 5'에 ID 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO: 31에 기재된 뉴클레오티드 서열 포함)를 더 포함할 수 있다. ID 카세트는 차세대 시퀀싱 실험을 수행할 때 확인 목적을 위해 사용될 수 있는 서열을 제공한다. 일정 구현예에서, ID 카세트는 SEQ ID NO: 33에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, ID 카세트는 SEQ ID NO: 33과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, ID 카세트는 SEQ ID NO: 33에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 5'에서 3'으로 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열, ID 카세트, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열에 대해 5'에 리보솜 스키핑 엘리먼트를 더 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 5'에서 3'으로, 리보솜 스키핑 엘리먼트; PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열; 및 임의로 전사 종결인자 (예를 들어, 폴리아데닐화 서열)을 포함한다. 일정 구현예에서, 상기에 언급된 편집 엘리먼트는 상동성 재조합을 통해서 PAH 유전자의 엑손 (예를 들어, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손에 존재)으로 통합되어서, 5'에서 3'으로 표적 유전자좌에 대해 5'에 PAH 유전자의 일부분; 리보솜 스키핑 엘리먼트; PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열; 및 전사 종결인자 (예를 들어, 폴리아데닐화 서열)를 포함하는 재조합 서열을 생성시킬 수 있고, 여기서 리보솜 스키핑 엘리먼트는 표적 유전자좌에 대해 5'에서의 PAH 유전자의 일부분 및 완전한 PAH 코딩 서열과 인 프레임으로 존재하도록 위치된다. 이러한 재조합 서열의 전사 및 번역은 코딩된 리보솜 스키핑 펩티드의 5' 부분 융합된 표적 유전자좌에 대한 5'의 PAH 유전자의 일부분에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 PAH 폴리펩티드의 완전한 아미노산 서열에 융합된 코딩된 리보솜 스키핑 펩티드의 3' 부분을 포함하는 제2 폴리펩티드를 생성시킨다.
일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손 (예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 또는 엑손 13)에 존재한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자의 엑손 (예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 또는 엑손 13) 내 뉴클레오티드간 결합이다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자 내 서열이고, 여기서 이 서열의 5' 말단은 PAH 유전자의 엑손 (예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 또는 엑손 13) 또는 ASCL1 (Achaete-scute homolog 1) 및 PAH 사이의 유전자간 영역 내에 존재하고, 이 서열의 3' 말단은 PAH 유전자 또는 PAH 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF1) 사이의 유전자간 영역 내 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3에 존재한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3 내 뉴클레오티드간 결합이다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자 내 서열이고, 여기서 이 서열의 5' 말단은 PAH 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3 내에 존재하고, 이 서열의 3' 말단은 PAH 유전자 또는 PAH 및 IGF1 사이의 유전자간 영역 내 임의의 뉴클레오티드일 수 있다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 리보솜 스키핑 엘리먼트에 대해 5'에 스플라이스 억셉터를 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 5'에서 3'으로, 스플라이스 억셉터; 리보솜 스키핑 엘리먼트; PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열; 및 임의로 전사 종결인자 (예를 들어, 폴리아데닐화 서열)를 포함한다. 일정 구현예에서, 상기 언급된 편집 엘리먼트는 상동성 재조합을 통해 PAH 유전자의 인트론 (예를 들어, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론 내에 존재)에 통합되어서 5'에서 3'으로, 인트론의 내생성 스플라이스 억셉터가 아닌 내생성 스플라이스 도너 부위를 포함하는 표적 유전자좌에 대해 5'의 PAH 유전자의 일부분; 스플라이스 억셉터; 리보솜 스키핑 엘리먼트, PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열; 및 전사 종결인자 (예를 들어, 폴리아데닐화 서열)를 포함하는 재조합 서열을 생성시킬 수 있고, 리보솜 스키핑 엘리먼트는 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열과 인 프레임으로 존재하도록, 그리고 PAH의 인트론의 내생성 스플라이스 도너로 스플라이스 억셉터의 스플라이싱이 표적 유전자좌에 대해 5'의 PAH 유전자의 일부분과 인 프레임으로 배치되도록, 위치된다. 이 재조합 서열의 발현은 코딩된 리보솜 스키핑 펩티드의 5' 부분에 융합된 표적 유전자좌에 대해 5'의 PAH 유전자의 일부분에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 코딩된 리보솜 스키핑 펩티드의 3' 부분에 융합된 PAH 폴리펩티드의 완전한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 생성시킨다.
일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론 (예를 들어, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 인트론 10, 인트론 11, 또는 인트론 12)에 존재한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자의 인트론 (예를 들어, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 인트론 10, 인트론 11, 또는 인트론 12) 내 뉴클레오티드간 결합이다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자 내 서열이고, 이 서열의 5' 말단은 PAH 유전자의 인트론 (예를 들어, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 인트론 10, 인트론 11, 또는 인트론 12) 내에 존재하고, 이 서열의 3' 말단은 PAH 유전자 또는 PAH 및 IGF1 사이의 유전자간 영역 내 임의 뉴클레오티드일 수 있다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론 1, 인트론 2, 또는 인트론 3 내에 존재한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자의 인트론 1, 인트론 2, 또는 인트론 3 내 뉴클레오티드간 결합이다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자 내 서열이고, 이 서열의 5' 말단은 PAH 유전자의 인트론 1, 인트론 2, 또는 인트론 3 내에 존재하고, 이 서열의 3' 말단은 PAH 유전자 또는 PAH 및 IGF1 사이의 유전자간 영역 내 임의 뉴클레오티드일 수 있다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 PAH 유전자 내 서열이고, 이 서열의 5' 말단은 PAH 유전자의 인트론 1에 존재하고, 이 서열의 3' 말단은 PAH 유전자 또는 PAH 및 IGF1 사이의 유전자간 영역 내 임의 뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 모든 편집 엘리먼트는 야생형 PAH 유전자에 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 더 포함할 수 있다. 이러한 제한 엔도뉴클레아제 부위는 제한 단편 길이 다형성 분석을 기반으로 하거나 또는 표적 유전자좌 및 이의 측접 영역, 또는 이로부터 증폭된 핵산의 핵산 시퀀싱 분석을 통해서 표적 유전자좌에서 편집 엘리먼트의 통합을 갖는 세포의 확인을 가능하게 한다.
본 명세서에 개시된 임의의 모든 편집 엘리먼트는 표적 유전자좌로 통합될 때 PAH 폴리펩티드에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 초래하는 하나 이상의 뉴클레오티드 변경을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 돌연변이체 PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드의 기능성 균등체이고, 다시 말해서, 야생형 PAH 폴리펩티드와 같은 기능을 할 수 있다. 일정 구현예에서, 기능적으로 균등한 PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드에 존재하지 않는 적어도 하나의 특징, 예를 들어 PAH 단백질 (예를 들어, 이량체 또는 사량체)을 안정화시키는 능력, 또는 단백질 분해에 저항하는 능력을 더 포함한다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 편집 엘리먼트는 적어도 0, 1, 2, 10, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 뉴클레오티드를 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 1 내지 5000개, 1 내지 4500개, 1 내지 4000개, 1 내지 3000개, 1 내지 2000개, 1 내지 1000개, 1 내지 500개, 1 내지 200개, 1 내지 100개, 1 내지 50개, 또는 1 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열 또는 이의 일부분 (예를 들어, 완전한 인간 PAH 코딩 서열, 또는 인간 PAH 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 1359), 5' 비번역 영역 (UTR), 3' UTR, 프로모터, 스플라이스 도너, 스플라이스 억셉터, 비코딩 RNA를 코딩하는 서열, 인슐레이터, 유전자 또는 이의 조합을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 35, 83, 또는 84에 기재된 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 35, 83, 또는 84에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 35, 83, 또는 84에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 147, 148, 149, 150, 151, 152, 또는 153에 기재된 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 147, 148, 149, 150, 151, 152, 또는 153에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 147, 148, 149, 150, 151, 152, 또는 153에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
본 명세서에 개시된 교정 게놈에서 사용되는 상동성 팔부는 PAH 유전자 또는 게놈 상의 근처 유전자의 임의 영역에 대해 유도될 수 있다. 상동성 팔부의 정확한 정체 및 위치는 편집 엘리먼트 및/또는 표적 유전자좌의 정체에 따라 결정된다.
본 명세서에 개시된 교정 게놈에서 채택되는 상동성 팔부는 표적 유전자좌 (예를 들어, PAH 유전자 내 표적 유전자좌)에 측접하는 게놈과 실질적으로 동일하다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해서 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%)의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 제1 게놈 영역에 대해 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%) 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 제2 게놈 영역에 대해 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 팔부는 각각 표적 유전자좌 (예를 들어, PAH 유전자 내 표적 유전자좌)에 측접하는 제1 및 제2 게놈 영역과 각각 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%)가 동일하다. 일정 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 팔부는 각각 표적 유전자좌 (예를 들어, PAH 유전자 내 표적 유전자좌)에 측접하는 제1 및 제2 게놈 영역과 각각 100%가 동일하다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및/또는 3' 상동성 팔부 및 표적 유전자좌에 측접하는 게놈의 해당 영역의 뉴클레오티드 서열의 편차는 뉴클레오티드 서열의 비코딩 편차를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다.
당업자는 상동성 팔부가 상동성 재조합에 의해 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합을 매개할 수 있기 위해서 표적 유전자좌에 측접하는 게놈 서열과 100% 동일할 필요는 없다는 것을 이해하게 될 것이다. 예를 들어, 상동성 팔부는 발현 수준 또는 특이성을 개선시키기 위해 디자인된 하나 이상의 변형 (예를 들어, 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 결실), 및/또는 인간 개체군에서의 하나 이상의 유전자 변이를 포함할 수 있다. 인간 유전자 변이는 표적 게놈에 전용인 유전적인 변이 및 신규한 변이 둘 모두를 포함하고, 단순 뉴클레오티드 다형성, 삽입, 결실, 재배열, 반전, 중복, 미세-반복부, 및 이의 조합을 포괄한다. 이러한 변이는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, dnSNP의 데이터베이스 (Sherry et al. Nucleic Acids Res. 2001; 29(1):308-11), Database of Genomic Variants (Nucleic Acids Res. 2014; 42(Database issue):D986-92), ClinVar (Nucleic Acids Res. 2014; 42(Database issue): D980-D985), Genbank (Nucleic Acids Res. 2016; 44(Database issue): D67-D72), ENCODE (genome.ucsc.edu/encode/terms.html), JASPAR (Nucleic Acids Res. 2018; 46(D1): D260-D266), 및 PROMO (Messeguer et al. Bioinformatics 2002; 18(2):333-334; Farre et al. Nucleic Acids Res. 2003; 31(13):3651-3653)에서 확인할 수 있으며, 이들 각각은 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 당업자는 상동성 팔부가 표적 유전자좌에 측접하는 게놈 서열과 100% 동일하지 않은 상황에서, 상동성 팔부와 게놈 사이의 상동성 재조합은 사용된 상동성 팔부의 서열과 동일하게 되도록 표적 유전자좌에 측접하는 게놈 서열을 변경시킬 수 있다는 것을 더욱 이해하게 될 것이다.
일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역은 제1 편집창에 위치되고, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역은 제2 편집창에 위치되고, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역은 제1 편집창에 위치되고, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고; 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역은 제2 PAH 표적화 유전자좌에 위치되고, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 제1 및 제2 편집창은 상이하다. 일정 구현예에서, 제1 편집창은 제2 편집창에 대해 5'에 위치된다. 일정 구현예에서, 제1 게놈 영역은 제1 게놈 영역이 위치하는 제1 편집창의 서열에 비해서 짧은 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 제1 게놈 영역은 제1 게놈 영역이 위치하는 제1 편집창의 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 제2 게놈 영역은 제2 게놈 영역이 위치하는 제2 편집창의 서열에 비해 짧은 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 제2 게놈 영역은 제2 게놈 영역이 위치하는 제2 편집창의 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역은 SEQ ID NO: 36에 기재된 서열을 갖는다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역은 SEQ ID NO: 45에 기재된 서열을 갖는다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역 및 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역은 각각 SEQ ID NO: 36 및 45에 기재된 서열을 갖는다.
일정 구현예에서, 제1 및 제2 편집창은 동일하다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌는 편집창 내 뉴클레오티드간 결합 또는 뉴클레오티드 서열이고, 제1 게놈 영역은 표적 유전자좌에 대해 5'의 편집창의 제1 부분으로 이루어지고, 제2 게놈 영역은 표적 유전자좌에 대해 3'의 편집창의 제2 부분으로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집창의 제1 부분은 편집창의 5' 말단에서부터 표적 유전자좌에 대해 5'에 인접한 뉴클레오티드까지의 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집창의 제2 부분은 표적 유전자좌에 대해 3'에 인접한 뉴클레오티드로부터 편집창의 3' 말단까지의 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집창의 제1 부분은 편집창의 5' 말단으로부터 표적 유전자좌에 대해 5'에 인접한 뉴클레오티드까지의 서열로 이루어지고, 편집창의 제2 부분은 표적 유전자좌에 대해 3'에 인접한 뉴클레오티드로부터 편집창의 3' 말단까지의 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집창은 SEQ ID NO: 36 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 편집창의 제1 및 제2 부분은 실질적으로 동등한 길이를 갖는다 (예를 들어, 더 짧은 부분의 길이 대 더 긴 부분의 길이의 비율은 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 또는 0.99 초과임).
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 약 50 내지 약 4000개 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 100 내지 약 3000개, 약 200 내지 약 2000개, 약 500 내지 약 1000개 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 약 800개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 약 100개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 약 50 내지 약 4000개 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 100 내지 약 3000개, 약 200 내지 약 2000개, 약 500 내지 약 1000개 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 약 800개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 약 100개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 팔부의 각각은 독립적으로 약 50 내지 약 4000개 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 100 내지 약 3000개, 약 200 내지 약 2000개, 약 500 내지 약 1000개 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 팔부는 약 800개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일정 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 팔부는 실질적으도 동등한 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 팔부는 비대칭적인 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일정 구현예에서, 뉴클레오티드 길이의 비대칭성은 5' 및 3' 상동성 팔부 간 90% 이하의 길이 차이, 예컨대 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 이하의 길이 차이로 정의된다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68), PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및/또는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A를 포함한다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는
(a) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G;
(b) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A;
(c) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A;
(d) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A;
(e) PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G;
(f) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C;
(g) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68); 및/또는
(h) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A
를 포함한다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는
(a) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G;
(b) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A;
(c) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A;
(d) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A;
(e) PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G;
(f) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C;
(g) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68); 및/또는
(h) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A
를 포함한다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 임의로 상기 기재된 위치에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는, SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%)의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 인간 개체군에서 하나 이상의 유전자 변이를 더 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 또는 44에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 또는 44에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%)의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 인간 개체군에서 하나 이상의 유전자 변이를 더 포함한다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및 3' 상동성 팔부 각각은 각각 SEQ ID NO: 36 및 45에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%)의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지며, 임의로 5' 상동성 팔부는 상기 기개된 위치에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및 3' 상동성 팔부는 각각 SEQ ID NO: 36 및 45, 37 및 45, 38 및 45, 39 및 45, 40 및 45, 41 및 45, 42 및 45, 43 및 45, 또는, 44 및 45에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및 3' 상동성 팔부는 각각 SEQ ID NO: 36 및 45, 37 및 45, 38 및 45, 39 및 45, 40 및 45, 41 및 45, 42 및 45, 43 및 45, 또는 44 및 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 69 또는 72에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 69 또는 72에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 70 또는 73에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 70 또는 73에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및 3' 상동성 팔부는 각각 SEQ ID NO: 69 및 70, 또는 72 및 73에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및 3' 상동성 팔부는 각각 SEQ ID NO: 69 및 70, 또는 72 및 73에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 111, 115, 또는 142에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 111, 115, 또는 142에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 112, 117, 또는 144에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 112, 117, 또는 144에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및 3' 상동성 팔부는 각각 SEQ ID NO: 111 및 112, 115 및 117, 또는 142 및 144에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' 상동성 팔부 및 3' 상동성 팔부는 각각 SEQ ID NO: 111 및 112, 115 및 117, 또는 142 및 144에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 85, 86, 113, 118, 134, 136, 또는 145와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%)가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 85, 86, 113, 118, 134, 136, 또는 145에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 85, 86, 113, 118, 134, 136, 또는 145에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 교정 게놈은 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 5'에 5' 반전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 3'에 3' 반전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 임의의 AAV 혈청형 또는 이의 변이체 유래 ITR 서열은 본 명세서에 개시된 교정 게놈에서 사용될 수 있다. 5' 및 3' ITR은 동일한 혈청형의 AAV 또는 상이한 혈청형의 AAV로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 개시된 교정 게놈에서 사용을 위한 예시적인 ITR는 본 명세서에서 SEQ ID NO: 18-21에 기재되어 있다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열 및 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서로 실질적으로 상보적 (예를 들어, 5' 또는 3' ITR의 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오티드 위치에서의 미스매치를 제외하고 서로 상보적)이다.
일정 구현예에서, 5' ITR 또는 3' ITR은 AAV2로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR 둘 모두는 AAV2로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:18과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖거나, 또는 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:19와 적어도 95% (예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:18과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:19와 적어도 95% (예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 35에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 엘리먼트, SEQ ID NO:18의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO:19의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46-54 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO:18의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO:19의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 5'에서 3'으로 SEQ ID NO:18의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO: 46-54 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO:19의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 5' ITR 또는 3' ITR은 AAV5로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR 둘 모두는 AAV5로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:20과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖거나, 또는 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:21과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:20과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:21과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 35에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 엘리먼트, SEQ ID NO:20의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO:21의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46-54 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO:20의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO:21의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 5'에서 3'으로 SEQ ID NO:20의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO: 46-54 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO:21의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열 및 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서로 실질적으로 상보적 (예를 들어, 5' 또는 3' ITR 내 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오티드 위치에서의 미스매치를 제외하고 서로 상보적)이다.
일정 구현예에서, 5' ITR 또는 3' ITR은 Rep 단백질에 의한 분해능을 감소시키거나 또는 폐기시키도록 변형된다 ("비분해성 (non-resolvable) ITR"). 일정 구현예에서, 비분해성 ITR은 말단 분해 부위의 뉴클레오티드 서열에 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 이러한 변형은 전달 게놈이 감염된 세포에서 복제된 이후에 AAV의 자기-상보적, 이중 가닥 DNA 게놈의 형성을 가능하게 한다. 예시적인 비분해성 ITR 서열은 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제7,790,154호 및 제9,783,824호 참조). 일정 구현예에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 26과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 26과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 26에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 27과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 27과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 27에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 26에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 3' ITR은 SEQ ID NO: 27에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 26에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 3' ITR은 SEQ ID NO: 19에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 3' ITR은 야생형 AAV2 게놈 서열로부터 유래된 추가의 뉴클레오티드 서열이 측접된다. 일정 구현예에서, 3' ITR은 야생형 AAV2 ITR에 인접하는 야생형 AAV2 서열로부터 유래된 추가의 37 bp 서열이 측접한다. 예를 들어, [Savy et al., Human Gene Therapy Methods (2017) 28(5): 277-289] (이의 전문은 참조로 본 명세서에 편입됨)을 참조한다. 일정 구현예에서, 추가의 37 bp 서열은 3' ITR의 내부에 있다. 일정 구현예에서, 37 bp 서열은 SEQ ID NO: 140에 기재된 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 141과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 141에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 3' ITR의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 141과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 일정 구현예에서, 3' ITR의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 141에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 교정 게놈은 약 0.5 내지 약 8 kb (예를 들어, 약 1 내지 약 5, 약 2 내지 약 5, 약 3 내지 약 5, 약 4 내지 약 5, 약 4.5 내지 약 4.8, 또는 약 4.7 kb)의 길이를 갖는다.
일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 87, 88, 114, 119, 135, 137, 또는 146과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%)가 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 87, 88, 114, 119, 135, 137, 또는 146에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 87, 88, 114, 119, 135, 137, 또는 146에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일정 구현예에서, 복제-결함 AAV는 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열, 및 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 18의 5' ITR), 5' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 115의 5' 상동성 팔부), 스플라이스 억셉터 (예를 들어, SEQ ID NO: 14의 스플라이스 억셉터), 2A 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 74의 2A 엘리먼트), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 116의 PAH 코딩 서열), SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31의 SV40 폴리아데닐화 서열), 3' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 117의 3' 상동성 팔부), 및 3' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 19의 3' ITR)를 포함하는 전달 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열, 및 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 18의 5' ITR), 5' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 115의 5' 상동성 팔부), 스플라이스 억셉터 (예를 들어, SEQ ID NO: 14의 스플라이스 억셉터), 2A 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 74의 2A 엘리먼트), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 116의 PAH 코딩 서열), SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31의 SV40 폴리아데닐화 서열), 3' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 117의 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 19의 3' ITR)를 포함하는 전달 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; 및/또는 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 및 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 18의 5' ITR), 5' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 115의 5' 상동성 팔부), 스플라이스 억셉터 (예를 들어, SEQ ID NO: 14의 스플라이스 억셉터), 2A 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 74의 2A 엘리먼트), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 116의 PAH 코딩 서열), SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31의 SV40 폴리아데닐화 서열), 3' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 117의 3' 상동성 팔부), 및 3' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 19의 3' ITR)를 포함하는 전달 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
일정 구현예에서, 복제-결함 AAV는 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; 및/또는 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
본 명세서에 개시된 AAV 조성물은 그들이 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 높은 효율로 세포에서 PAH 유전자를 교정할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 편집 효율은 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에 투여될 때 적어도 1% (예를 들어, 적어도 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도는 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에게 투여될 때 적어도 0.5% (예를 들어, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다.
PAH 유전자의 편집 효율을 결정하는 임의의 방법이 적용될 수 있다. 일정 구현예에서, 개별 세포는 형질도입된 세포의 개체군으로부터 분리되고, PAH 유전자의 표적 유전자좌로 올바르게 통합된 편집 엘리먼트의 존재를 확인할 수 있는 PCR 프라이머 를 사용한 단일-세포 PCR가 수행된다. 이러한 방법은 비변형된 표적 유전자좌를 선택적으로 증폭시키는 PCR 프라이머를 사용한 동일 세포의 단일-세포 PCR을 더 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포의 유전자형을 결정할 수 있다. 예를 들어, 단일 세포 PCR이 세포가 편집된 표적 유전자좌 및 비변형된 표적 유전자좌 둘 모두를 갖는다는 것을 보여준다면, 그 세포는 편집된 PAH 유전자에 대해 이형접합으로 간주된다.
추가로 또는 대안적으로, 일정 구현예에서, 선형 증폭 매개 PCR (LAM-PCR),정량적 PCR (qPCR) 또는 디지털 액적 PCR (ddPCR)이 오직 편집된 PAH 대립유전자만을 검출하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 형질도입된 세포의 개체군으로부터 추출된 DNA에 대해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 샘플 내 총 게놈의 개수 및 미편집된 PAH 대립유전자의 개수를 결정하기 위해서 (동일 반응 또는 개별 반응으로) 추가의 qPCR 또는 ddPCR을 더 포함할 수 있다. 이들 개수는 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도를 결정하는데 사용될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일정 구현예에서, PAH 유전자좌는 표적 유전자좌에 측접하는 PAH 유전자의 영역에 결합하는 프라이머를 사용한 PCR을 통해서, 또는 교정 게놈 내 영역 (예를 들어, 그 유전자좌에 비천연적인 외생성 서열을 포함하는 영역)에 결합하는 프라이머를 사용한 LAM-PCR을 통해서 형질도입된 세포의 개체군으로부터 추출된 DNA로부터 증폭될 수 있다. 최종 PCR 앰플리콘은 형질도입된 세포의 개체군에 존재하는 편집 및 미편집 PAH 대립유전자의 상대적인 개수를 결정하기 위해 단일 분자 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술을 사용해 개별적으로 시퀀싱될 수 있다. 이들 개수는 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도를 결정하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시는 약학적으로 허용가능한 부형제, 보강제, 희석제, 비히클 또는 담체, 또는 이의 조합과 함께 본 명세서에 개시된 AAV를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 조성물의 활성 성분과 배합될 때, 의도하지 않은 면역 반응과 같은, 파괴적 생리학적 반응을 초래하지 ?方? 성분이 생물학적 활성을 유지할 수 있게 하는, 임의의 재료를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 포스페이트 완충 염수, 에멀션 예컨대 오일/물 에멀션, 및 습윤제를 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 다음의 문헌들에 기술된 것과 같은 충분히 공지된 통상의 방법을 통해 제제화된다: Remington's Pharmaceutical Sciences, current Ed., Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA; A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al, 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al, 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
III. 사용 방법
다른 양상에서, 본 개시는 세포에서 PAH 폴리펩티드를 발현하거나 또는 PAH 유전자 내 돌연변이를 교정하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 본 명세서에 개시된 복제-결함 AAV를 세포에 형질도입시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 PAH 유전자 내 돌연변이의 교정 또는 PAH 발현의 복원에서 매우 효과적으로, 이러한 교정을 촉진시키기 위해 외생성 뉴클레아제 (예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 뉴클레아제 (TALEN), 또는 RNA-가이드된 뉴클레아제 예컨대 Cas9)의 작용에 의한 표적 유전자좌에서 게놈의 절단을 요구하지 않는다. 따라서, 일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 외생성 뉴클레아제 또는 외생성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 동시-형질도입 또는 동시-투여없이 본 명세서에 개시된 바와 같은 복제-결함 AAV를 세포에 형질도입시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법은 PAH 유전자에 돌연변이를 보유하는 임의 세포에 적용될 수 있다. 당업자는 PAH를 활성적으로 발현하는 세포에 특히 관심이 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 따라서, 일정 구현예에서, 방법은 간, 신장, 뇌, 뇌하수체, 부신, 췌장, 방광, 담낭, 결장, 소장, 또는 유방의 세포에 적용된다. 일정 구현예에서, 방법은 간세포 및/또는 신장 세포에 적용된다.
본 명세서에 개시된 방법은 연구 목적을 위해 시험관내에서 수행될 수 있거나 또는 치료 목적으로 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
일정 구현예에서, 형질도입시키려는 세포는 포유동물 대상체에 존재하고 AAV는 대상체의 세포를 형질도입시키기에 유효한 양으로 대상체에게 투여된다. 따라서, 일정 구현예에서, 본 개시는 PAH 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 일반적으로 본 명세서에 개시된 바와 같은 복제-결함 AAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체는 인간 대상체일 수 있거나 또는 인간 간 세포를 함유하는 설치류 대상체 (예를 들어, 마우스)일 수 있다. 적합한 마우스 대상체는 제한없이 인간 간의 세포 (예를 들어, 인간 간세포)가 생착된 마우스를 포함한다. PAH 유전자 돌연변이와 연관된 임의의 질환 또는 장애는 본 명세서에 개시된 방법을 사용해 치료될 수 있다. 이러한 질환 또는 장애는 제한없이 페닐케톤뇨증을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 외생성 뉴클레아제 또는 외생성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 동시-형질도입 또는 동시-투여하지 않고 형질도입된다.
본 명세서에 개시된 방법은 그들이 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 높은 효율로 세포의 PAH 유전자를 교정할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합 효율은 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에 투여될 때 적어도 1% (예를 들어, 적어도 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다. 일정 구현예에서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도는 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에게 투여될 때 적어도 0.5% (예를 들어, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 AAV 조성물에 의한 세포의 형질도입은 본 명세서에 제공된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 임의의 형질도입 방법에 의해 수행될 수 있다. 일정 구현예에서, 세포는 50,000; 100,000; 150,000; 200,000; 250,000; 300,000; 350,000; 400,000; 450,000; 또는 500,000의 감염 다중도 (MOI), 또는 세포의 최적 형질도입을 제공하는 임의의 MOI로 AAV와 접촉될 수 있다.
일정 구현예에서, 전술한 방법은 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열, 및 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 18의 5' ITR), 5' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 115의 5' 상동성 팔부), 스플라이스 억셉터 (예를 들어, SEQ ID NO: 14의 스플라이스 억셉터), 2A 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 74의 2A 엘리먼트), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 116의 PAH 코딩 서열), SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31의 SV40 폴리아데닐화 서열), 3' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 117의 3' 상동성 팔부), 및 3' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 19의 3' ITR)를 포함하는 전달 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열, 및 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 18의 5' ITR), 5' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 115의 5' 상동성 팔부), 스플라이스 억셉터 (예를 들어, SEQ ID NO: 14의 스플라이스 억셉터), 2A 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 74의 2A 엘리먼트), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 116의 PAH 코딩 서열), SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31의 SV40 폴리아데닐화 서열), 3' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 117의 3' 상동성 팔부), 및 3' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 19의 3' ITR)를 포함하는 전달 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; 및/또는 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 및 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 18의 5' ITR), 5' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 115의 5' 상동성 팔부), 스플라이스 억셉터 (예를 들어, SEQ ID NO: 14의 스플라이스 억셉터), 2A 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 74의 2A 엘리먼트), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 116의 PAH 코딩 서열), SV40 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 31의 SV40 폴리아데닐화 서열), 3' 상동성 팔부 (예를 들어, SEQ ID NO: 117의 3' 상동성 팔부), 및 3' ITR 엘리먼트 (예를 들어, SEQ ID NO: 19의 3' ITR)를 포함하는 전달 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 복제-결함 AAV를 적용한다.
일정 구현예에서, 전술한 방법은 (a) SEQ ID NO: 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; (b) SEQ ID NO: 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질; 및/또는 (c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 복제-결함 AAV를 적용한다.
본 명세서에 개시된 AAV 조성물은 제한없이, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비내, 국소 또는 피내 경로를 포함한 임의의 적절한 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 일정 구현예에서, 조성물은 정맥내 주사 또는 피하 주사를 통한 투여를 위해 제제화된다.
IV. AAV 패키징 시스템
다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서에 개시된 복제-결함 AAV의 재조합 제조를 위한 패키징 시스템을 제공한다. 이러한 패키징 시스템은 일반적으로 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열; 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열; 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 PAH 유전자의 교정을 위한 교정 게놈 또는 PAH 유전자의 발현을 위한 전달 게놈을 포함하고, 여기서 패키징 시스템은 AAV를 형성하도록 캡시드에 교정 게놈의 밀봉을 위해 세포에서 작동된다.
일정 구현예에서, 패키징 시스템은 Rep 뉴클레오티드 서열 및 Cap 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 교정 게놈 또는 전달 게놈을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 패키징 시스템에서 사용되는 "벡터"는 세포로 핵산을 도입시키기 위한 비히클인 핵산 (예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 코스미드, 인공 염색체 등)을 의미한다.
임의의 AAV Rep 단백질은 본 명세서에 기술된 바와 같은 패키징 시스템에 적용될 수 있다. 패키징 시스템의 일정 구현예에서, Rep 뉴클레오티드 서열은 AAV2 Rep 단백질을 코딩한다. 적합한 AAV2 Rep 단백질은 제한없이 Rep 78/68 또는 Rep 68/52를 포함한다. 패키징 시스템의 일정 구현예에서, AAV2 Rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22의 AAV2 Rep 아미노산 서열과 최소 백분율의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 최소 백분율의 서열 동일성은 AAV2 Rep 단백질의 아미노산 서열 길이에 걸쳐 적어도 70% (예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)이다. 패키징 시스템의 일정 구현예에서, AAV2 Rep 단백질은 SEQ ID NO: 22에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
패키징 시스템의 일정 구현예에서, 패키징 시스템은 제3 벡터, 예를 들어 헬퍼 바이러스 벡터를 더 포함한다. 제3 벡터는 독립적인 제3 벡터일 수 있거나, 제1 벡터와 통합될 수 있거나, 또는 제2 벡터와 통합될 수 있다. 일정 구현예에서, 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.
패키징 시스템의 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 (헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 포함), 폭스 바이러스 (예컨대 백시니아 바이러스), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 및 배큘로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 패키징 시스템의 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스가 아데노바이러스인 경우에, 아데노바이러스 게놈은 E1, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함한다. 패키징 시스템의 일정 구현예에서, 헬퍼 바이러스가 HSV인 경우, HSV 게놈은 UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 HSV 유전자를 포함한다.
패키징 시스템의 일정 구현예에서, 제1, 제2, 및/또는 제3 벡터는 하나 이상의 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 일정 구현예에서, 제1 벡터 및 제3 벡터는 제1 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 일정 구현예에서, 제2 벡터 및 제3 벡터는 제2 형질감염 플라스미드 내에 함유된다.
패키징 시스템의 일정 구현예에서, 제1, 제2, 및/또는 제3 벡터는 하나 이상의 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다. 일정 구현예에서, 제1 벡터 및 제3 벡터는 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다. 일정 구현예에서, 제2 벡터 및 제3 벡터는 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다.
추가 양상에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 바와 같은 AAV의 재조합 제조를 위한 방법이 제공되고, 여기서 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이 AAV를 형성하도록 캡시드에 교정 게놈의 밀봉을 위해 작동되는 조건 하에서 기술된 바와 같은 패키징 시스템으로 세포를 형질감염 또는 형질도입시키는 단계를 포함한다. AAV의 재조합 제조를 위한 예시적인 방법은 일시적 형질감염 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1, 제2, 및 임의로 제3 벡터를 함유하는 하나 이상의 형질감염 플라스미드 사용), 바이러스 감염 (예를 들어, 하나 이상의 재조합 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 폭스바이러스 (예컨대 백시니아 바이러스), 헤르페스 바이러스 (본 명세서에 기술된 바와 같은 제1, 및 제2, 및 임의로 제3 벡터를 함유하는, HSV, 사이토메갈로바이러스, 또는 배큘로바이러스 포함), 및 안정한 생산자 세포주 형질감염 또는 감염 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열 및/또는 하나 이상의 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 포유동물 또는 곤충 세포와 같은 안정한 생산자 세포, 및 형질감염 플라스미드 또는 재조합 헬퍼 바이러스의 형태로 전달되는 본 명세서에 기술된 바와 같은 교정 게놈 사용)을 포함한다.
V. 실시예
본 명세서에 개시된 재조합 AAV 벡터는 시험관내 및 생체내에서 고도의 효율적인 유전자 편집을 매개한다. 하기 실시예는 AAV 분기군 F 캡시드 (예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되되는, 미국 특허 제9,623,120호에 개시된, AAVHSC7, AAVHSC15 또는 AAVHSC17)에 패키징될 수 있는 교정 벡터를 제공하고, 소정 인간 질환, 예컨대 페닐케톤뇨증에서 돌연변이된 PAH 유전자의 발현의 효율적인 복원을 입증한다. 이들 실시예는 제한이 아닌 예시로 제공된다.
실시예 1: PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-hAC-008
a) PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-hAC-008
도 1A에 도시된 바와 같은, PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-hAC-008는 5'에서 3'으로, 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 표적화된 통합 제한 카세트 ("TI RE"), 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함한다. 이들 엘리먼트의 서열은 표 1에 기재되어 있다. 5' 상동성 팔부는 인간 PAH 출발 코돈으로부터 상류에 야생형 게놈 서열 800개 뉴클레오티드를 포함하고, 따라서 일부 PKU 환자에서 관찰되는 바와 같은 PAH 발현에 영향을 미치는 출발 코돈 및/또는 5' 비번역 영역 (UTR) 내 돌연변이를 교정하는 능력을 갖는다. 3' 상동성 팔부는 출발 코돈으로부터 하류에 야생형 게놈 서열 800개 뉴클레오티드를 포함한다. 인간 게놈으로 PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-hAC-008의 통합은 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 및 표적화된 통합 제한 카세트를 PAH 출발 코돈 표적 유전자좌에 삽입 (즉, PAH 유전자의 뉴클레오티드 1-3을 치환)시켜서, PAH 유전자의 5' UTR, 코딩 서열, 또는 3' UTR 내 돌연변이로 인해 손상된 야생형 PAH 단백질의 발현을 복원시킨다.
Figure pct00001
b) PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-h1C-007
도 1B에 도시된 바와 같은, PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-h1C-007은 5'에서 3'으로, 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 스플라이스 억셉터, 2A 엘리먼트, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 표적화된 통합 제한 카세트 ("TI RE"), 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함한다. 이들 엘리먼트의 서열은 표 2에 기재되어 있다. 5' 상동성 팔부는 인트론 1에 위치하는, 인간 PAH의 뉴클레오티드 2128로부터 상류에 800개 뉴클레오티드의 야생형 게놈 서열을 포함한다. 3' 상동성 팔부는 인간 PAH의 뉴클레오티드 2127로부터 하류에 800개 뉴클레오티드의 야생형 게놈 서열을 포함한다. 인간 게놈으로 PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-h1C-007의 통합은 5'에서 3'으로 하기 엘리먼트: 내생성 PAH의 엑손 1, 이의 5' 스플라이스 도너로부터 뉴클레오티드 2127의 인트론 1의 일부분, 벡터 pHMI-hPAH-h1C-007의 스플라이스 억셉터, 2A 엘리먼트, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 프리-mRNA로 PAH 유전자좌의 전사를 가능하게 한다. 이러한 프리-mRNA의 스플라이싱은 5'에서 3'으로, 하기 엘리먼트: 내생성 PAH의 엑손 1, 2A 엘리먼트 (PAH 엑손 1과 인 프레임), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (2A 엘리먼트와 인 프레임), 및 SV40 폴리아데닐화 서열를 포함하는 mRNA를 생성시킨다. 2A 엘리먼트는 2종의 폴리펩티드의 생성을 야기시킨다: 2A 펩티드의 N-말단부와 융합된 엑손 1의 말단에서 종결된 절단된 PAH 펩티드, 및 전체 길이 PAH 폴리펩티드와 융합된 2A 펩티드로부터의 프롤린. 그러므로, 벡터 pHMI-hPAH-h1C-007의 통합은 PAH 유전자의 코딩 서열 또는 3' UTR 내 돌연변이로 인해 손상된 야생형 PAH 단백질의 발현을 복원시킬 수 있다.
Figure pct00002
상기 2종의 벡터에 채택된 침묵 변경은 발현 벡터 pCOH-WT-PAH, pCOH-CO-PAH, 및 pHMI-CO-PAH의 비교를 통해 입증된 바와 같이, PAH 단백질의 발현을 유의하게 개선시켰다. pCOH-WT-PAH 벡터는 SEQ ID NO: 24에 기재된 야생형 PAH 코딩 서열에 작동적으로 연결된 CBA 프로모터를 포함한다. pCOH-CO-PAH 및 pHMI-CO-PAH 벡터는 각각이 SEQ ID NO: 25에 기재된 바와 같은 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열에 작동적으로 연결된 CBA 프로모터를 포함한다. pCOH-CO-PAH 및 pHMI-CO-PAH 벡터는 매우 유사하였다. 각각의 벡터는 PAH가 천연적으로 결핍된 HEK 293 세포로 형질감염시켰다. 도 2에 도시된 바와 같이, VG-GT-CO-PAH ("CO-hPAH")는 VG-GT-PAH ("WT-hPAH")에 비해 특히 더 높은 인간 PAH의 발현 수준을 일으켰다.
실시예 2: PAH 교정 벡터 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 및 이의 변이체
효율적인 유전자 편집을 촉진시키는 상동성 팔부 서열을 동정하기 위해서, 130종 교정 벡터를 디자인하였고, 이들 중 70종을 인간 간세포 암종 세포에서 시험하였다. pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 벡터가 시험관내에서 최고 편집 효율을 나타내었다. 이 실시예는 이러한 벡터의 구조 및 이의 변이체를 제공한다.
a) PAH 교정 벡터 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1
도 1C에 도시된 바와 같은, PAH 교정 벡터 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1은 5'에서 3'으로, 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 스플라이스 억셉터, P2A 엘리먼트, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함한다. 이들 엘리먼트의 서열은 표 3에 기재되어 있다. 5' 상동성 팔부는 인간 PAH의 뉴클레오티드 -686 내지 274의 야생형 게놈 서열을 포함하고, 이의 3' 말단은 인트론 1에 위치된다. 3' 상동성 팔부는 인간 PAH의 뉴클레오티드 415 내지 1325의 야생형 게놈 서열을 포함한다. 인간 게놈으로 PAH 교정 벡터 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1의 통합은 5'에서 3'으로, 하기 엘리먼트: 내생성 PAH의 엑손 1, 이의 5' 스플라이스 도너로부터 뉴클레오티드 274의 인트론 1의 일부분, 벡터 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1의 스플라이스 억셉터, P2A 엘리먼트, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 프리-mRNA로 PAH 유전자좌의 전사를 가능하게 한다. 이러한 프리-mRNA의 스플라이싱은 5'에서 3'으로, 하기 엘리먼트: 내생성 PAH의 엑손 1, P2A 엘리먼트 (PAH 엑손 1과 인 프레임), 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열 (P2A 엘리먼트와 인 프레임), 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 mRNA를 생성시킨다. P2A 엘리먼트는 2종 폴리펩티드의 생성을 야기시킨다: P2A 펩티드의 N-말단부와 융합된 엑손 1의 말단에서 종결된 절단된 PAH 펩티드, 및 전체 길이 PAH 폴리펩티드와 융합된 P2A 펩티드로부터의 프롤린. 그러므로, 벡터 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1의 통합은 PAH 유전자의 코딩 서열 또는 3' UTR 내 돌연변이로 인해 손상된 야생형 PAH 단백질의 발현을 복원시킬 수 있다.
Figure pct00003
b) PAH 교정 벡터 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1의 변이체
pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 벡터의 8종 변이체는 PAH 유전자 좌위의 발현을 개선시키도록 디자인되었다. pHMIA-hPAH-hI1C-032.2 내지 pHMIA-hPAH-hI1C-032.9로 명명된 이들 변이체는 오직 5' 상동성 팔부만이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다. 상이한 엘리먼트의 서열은 표 4에 기재되어 있다.
Figure pct00004
pHMIA-hPAH-hI1C-032.2 벡터는 전사물로 개선된 리보솜 동원을 위한 코작 (Kozak) 서열을 최적화시키도록 디자인되었다. PAH 유전자의 각각 위치 -2, 4, 6, 7, 및 9에 뉴클레오티드 C, G, G, G, 및 G를 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
pHMIA-hPAH-hI1C-032.3 벡터는 발현을 억제할 수 있는 PAH 유전자의 5' UTR 내 단일 사중체를 제거하도록 디자인되었다. PAH 유전자의 각각 위치 -467 및 -465에 뉴클레오티드 A 및 A를 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
pHMIA-hPAH-hI1C-032.4 벡터는 발현을 증가시키기 위해 사이클릭 AMP 반응 엘리먼트를 최적화시키도록 디자인되었다. PAH 유전자의 위치 -181에 뉴클레오티드 A를 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
pHMIA-hPAH-hI1C-032.5 벡터는 발현을 증가시키기 위해 2종의 사이클릭 AMP 반응 엘리먼트를 최적화시키기 위해 디자인되었다. PAH 유전자의 각각 위치 -214, -212, -211, 및 -181에 뉴클레오티드 G, C, A, 및 A를 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
pHMIA-hPAH-hI1C-032.6 벡터는 인간에서 변경된 PAH 발현과 상관있는, SNP rs1522295의 소수 대립유전자를 도입시키기 위해 디자인되었다. PAH 유전자의 위치 194에 뉴클레오티드 G를 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
pHMIA-hPAH-hI1C-032.7 벡터는 발현을 증가시키도록 5' UTR 내 글루코코르티코이드 결합 부위를 최적화시키기 위해 디자인되었다. PAH 유전자의 각각 위치 -433 및 -432에 뉴클레오티드 C 및 C를 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
pHMIA-hPAH-hI1C-032.8 벡터는 개선된 발현을 위해 2개 글루코코르티코이드 결합 부위 및 단일 AP2 결합 부위를 변형시키기 위해 디자인되었다. PAH 유전자의 각각 위치 -433 및 -432에 뉴클레오티드 C 및 C를 갖고, PAH 유전자의 위치 -394 내지 -388에 뉴클레오티드 서열 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68)을 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
pHMIA-hPAH-hI1C-032.9 벡터는 발현을 억제할 수 있는 5' UTR 내 3개의 G-사중체를 파괴하기 위해 디자인되었다. PAH 유전자의 뉴클레오티드 위치 -467, -465, -341, -339, -225, -211, 및 -203의 각각에 뉴클레오티드 A를 갖는 것이 pHMIA-hPAH-hI1C-032.1과 상이하다.
실시예 3: 시험관내 인간 PAH 유전자 편집
이 실시예는 이전 실시예에 기술된 것들과 같은, PAH 교정 벡터를 조사하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-hA-002, PAH 코딩 서열이 야생형 (즉, 침묵적으로 변경되지 않음)인 pHMI-hPAH-hAC-008의 변이체, 및 PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-h1-001, PAH 코딩 서열이 야생형 (즉, 침묵적으로 변경되지 않음)인 pHMI-hPAH-h1C-007의 변이체가 표적화된 통합의 평가를 위해 조사되었다. K562 세포를 150,000의 MOI로 AAVHSC17에 패키징된 pHMI-hPAH-hA-002 벡터로 형질도입시켰다. 세포의 게놈 DNA는 48시간 후에 수집하였다. 각각 상동성 팔부의 바깥쪽에 위치하는, 서열 ccaaatcccaccagctcact (SEQ ID NO: 89) 및 tcccatgaaactgaggtgtga (SEQ ID NO: 90)을 갖는 단일 바이오틴화 프라이머가 선형 증폭을 통해 DNA 샘플을 증폭시키는데 개별적으로 사용되었다. 편집 및 미편집된 대립유전자 모두가 편중되지 않고 증폭되었다. 증폭된 DNA 샘플을 풀링하였고 스트렙타비딘 풀다운으로 농축하였다. pHMI-hPAH-hA-002 통합이 존재하는 대립유전자의 개수는 PAH_게놈 세트 1 프라이머/프로브 세트를 사용한 ddPCR을 통해 측정하였다.
도 3A, 좌측 패널 ("LAM-농축")에 도시된 바와 같이, pHMI-hPAH-hA-002 벡터 ("R1 ATG")가 형질도입된 세포 유래 샘플에서 바람직한 통합이 검출되었지만, pHMI-hPAH-h1-001 벡터 ("R1 인트론")가 형질도입된 세포 또는 비형질도입 세포 ("R1 WT") 유래 샘플에서는 검출되지 않았다. 도 3A의 우측 패널 ("앰플리콘")에서, 벡터 통합량은 SV40_FAM 세트 1 프라이머/프로브 세트를 사용한 ddPCR을 통해 측정되었다. 양성 신호는 pHMI-hPAH-hA-002 벡터 ("T001 Frag")가 형질도입된 세포와 pHMI-hPAH-h1-001 벡터 ("T002 Frag")가 형질도입된 세포 둘 모두로부터의 샘플에서 검출되어, 이들 세포가 벡터 통합을 겪었다는 것을 의미하였다.
표적화된 통합을 정량하기 위해서, 표 6에 표시된 바와 같은, 3개의 프라이머 및 프로브 세트가 ddPCR에 의한 통합의 검출을 위해 디자인되었다. PAH_게놈 세트 1은 pHMI-hPAH-hA-002의 표적화된 통합 이후에 미편집된 게놈 및 편집된 게놈을 검출하였다. SV40_FAM 세트 1은 편집된 게놈 및 비통합된 벡터에 존재한 SV40 폴리아데닐화 서열 내 서열을 검출하였다. PAH_HA 세트 1은 편집 및 미편집된 게놈 둘 모두를 비롯하여, 비통합된 벡터에 존재한 상동성 팔부 내 영역을 검출하였다.
DNA 샘플은 유적으로 분할하였다. DNA의 농도는 하나의 유적이 무작위적으로 2종 DNA 분자 (예를 들어, 벡터 입자 및 게놈 DNA 입자)를 가질 확률을 유의하게 감소시키기 위해서 20 ㎕ 당 600 pg의 농도로 최적화시켰다 (p<0.001). PAH_게놈 세트 1을 통해 확인된 DNA의 수량 (수량_게놈)은 미편집 및 편집 게놈의 총량을 나타냈다. SV40_FAM 세트 1로 확인된 DNA의 수량 (수량_페이로드)은 편집된 게놈 및 비통합된 벡터의 총량을 나타냈다. PAH_HA 세트 1로 확인된 DNA의 수량 (수량_HA)은 미편집된 게놈, 편집된 게놈, 및 비통합된 벡터의 총량을 나타냈다. 따라서, 편집된 게놈의 수량은 하기 식: 수량_게놈 + 수량_페이로드 - 수량_HA을 통해 계산할 수 있다. 올바른 통합을 갖는 게놈의 분율은 편집된 게놈의 수량을 수량_게놈으로 나누어서 계산할 수 있다.
Figure pct00005
도 3B에 도시된 바와 같이, 상기 프라이머/프로브 세트로 측정된, pHMI-hPAH-hA-002 벡터의 올바른 통합을 갖는 게놈의 비율은 17.86%였다. pHMI-hPAH-hA-002 벡터가 형질도입되지 않은 대조군 세포에서 통합이 검출되지 않았다.
실시예 4: 마우스 간에서 생체내 PAH 유전자 편집
이 실시예는 마우스 PAH 유전자를 편집할 수 있는 PAH 교정 벡터를 조사하고, 마우스 간에서 그들의 편집 효율을 결정하기 위한 동물 모델을 제공한다.
a) 야생형 마우스에서 마우스 PAH 유전자의 편집
특정 예에서, 본 명세서는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터를 사용한 마우스 게놈의 생체내 편집을 제공한다. pHMI-hPAH-mAC-006 벡터는 pHMI-hPAH-hAC-008 벡터와 유사하지만, 인간 PAH 유전자보다는 마우스 PAH 유전자를 편집할 수 있었다 (도 4A). 특히, pHMI-hPAH-mAC-006은 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 표적화된 통합 제한 카세트 ("TI RE"), 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. 이들 엘리먼트의 서열은 표 6에 기재되어 있다. 5' 상동성 팔부는 마우스 PAH 출발 코돈을 포함하고, 그로부터 상류에 야생형 게놈 서열을 포함하였고, 따라서 마우스 PAH 유전자의 출발 코돈 및/또는 5' 비번역 영역 (UTR) 내 돌연변이를 교정하는 능력을 가졌다. 3' 상동성 팔부는 마우스 PAH의 출발 코돈으로부터 하류에 야생형 게놈 서열을 포함하였다. 마우스 게놈으로 PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-mAC-006의 통합은 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 및 표적화된 통합 제한 카세트를 마우스 PAH 유전자의 출발 코돈에서 삽입 (즉, 마우스 PAH 유전자의 뉴클레오티드 1-3을 치환)시킬 수 있어서, 마우스 세포에서 야생형 인간 PAH 단백질을 발현시킬 수 있었다. 벡터 단독은 프로모터 서열을 포함하지 않았고, 게놈 통합없이 독립적인 PAH 발현을 구동시킬 수 없었다.
Figure pct00006
pHMI-hPAH-mAC-006 벡터를 AAVHSC17 캡시드에 패키징시켰고 2마리 야생형 신생 마우스에게 꼬리 정맥을 통해서 정맥내로 체중 kg 당 2x1013 벡터 게놈의 용량으로 주사되었다. 2마리 대조군 마우스는 꼬리 정맥을 통해서 염수 주사를 받았다. 간 샘플은 2주 이후에 수집하였다.
PCR 방법은 마우스 게놈으로 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 통합을 검출하기 위해 개발되었다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 제1 프라이머 쌍 (SEQ ID NO: 62 및 63)은 미편집된 대립유전자로부터 867 bp DNA를 증폭시키기 위해 디자인되었고 ("대조군 PCR"); 제2 프라이머 쌍 (SEQ ID NO: 64 및 65)은 편집된 대립유전자로부터 2459 bp DNA를 특이적으로 증폭시키기 위해 디자인되었다 ("편집된 대립유전자 PCR"). 도 4C에 도시된 바와 같이, 염수 처리 마우스 유래 간 샘플 및 3T3 마우스 섬유아세포의 세포 샘플은 편집된 대립유전자에 해당되는 PCR 산물을 생성시키지 않았는데 반해서, pHMI-hPAH-mAC-006 벡터가 주사된 2마리 마우스 유래 간 샘플은 편집된 대립유전자에 해당하는 PCR 산물을 생성시켰다. 모든 4종 샘플은 미편집된 대립유전자에 해당하는 PCR 산물의 유사한 수준을 생성시켜서, 샘플들이 품질이 비슷하였다는 것을 시사한다.
ddPCR 방법은 마우스 게놈으로 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 통합을 정량하기 위해 개발되었다. 표 7에 표시된 바와 같이, 프라이머 및 프로브의 2개 세트는 ddPCR을 통한 통합의 검출을 위해 디자인되었다. mPAH_ATG_gDNA_FAM 세트 1은 pHMI-hPAH-mAC-006의 표적화된 통합 이후에 미편집된 게놈 및 편집된 게놈을 검출하였다. SV40_FAM 세트 1은 편집된 게놈 및 비통합된 벡터에 존재한, SV40 폴리아데닐화 서열 내 서열을 검출하였다 (도 5A).
DNA 샘플은 유적으로 분할하였다. DNA의 농도는 하나의 유적이 무작위적으로 벡터 입자 및 게놈 DNA 입자를 함유할 확률을 유의하게 감소시키기 위해서 20 ㎕ 당 600 pg로 최적화시켰다 (p<0.001) (도 5C 및 5D). 게놈으로 벡터의 통합 시에, 동일 유적 내 벡터 프로브 및 유전자좌 프로브의 이중 양성 비율이 증가된다 (도 5B). 도 5E에 도시된 바와 같이, 2마리 대조군 마우스는 각각 간에서 0% 및 0.0395%의 편집된 대립유전자를 가졌고, pHMI-hPAH-mAC-006 벡터가 처리된 2마리 마우스는 각각 간에서 2.504% 및 2.783%의 편집된 대립유전자를 가졌다. 따라서, 소정 조건 하에서 간에서 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 전체 통합 효율은 약 2.6%였다. 각각의 개별 세포에 대한 통합 효율은 벡터가 모든 세포에 형질도입되지 않았기 때문에, 더 높을 것으로 예상된다.
Figure pct00007
편집된 대립유전자로부터 발현되는 mRNA의 상대적 수량은 ddPCR을 통해 결정하였다. SV40_FAM 세트 1은 편집된 대립유전자로부터 인간 PAH를 특이적으로 검출하는데 사용되었다. 각각의 PAH 발현 수준은 내생성 Hprt의 발현 수준에 대해 정규화되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 대조군 마우스는 인간 PAH의 발현을 보이지 않아서, 프라이머 및 프로브가 내생성 마우스 PAH와 교차 반응하지 않았다는 것을 시사한다. 야생형 수준에 대한 PAH 발현율은 Hprt에 대한 내생성 마우스 PAH 신호에 대해 정규화된 Hprt 대비 인간 PAH 신호를 기반으로 계산하였다. pHMI-hPAH-mAC-006 벡터로 처리된 2마리 마우스는 내생성 마우스 PAH 수준 대비 각각 5.378% 및 4.846% mRNA 수준을 가졌다. 따라서, 소정 조건 하에서 간에서 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 전체 mRNA 수준은 약 5% 였다. 각각의 개별 세포에 대한 mRNA 수준은 벡터가 모든 세포에 형질도입되지 않았기 때문에, 더 높을 것으로 예상된다.
b) pah 녹아웃 마우스에서 마우스 PAH 유전자의 편집
한 실험에서, 표현형 교정에서 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 효율은 PAH 녹아웃 마우스 모델 (PAH ENU2)을 사용해 결정하였다. 간략하게, AAVHSC15 캡시드에 패키징된 hPAH-mAC-006 벡터는 정맥내로, 5연속일간, 이들 마우스에게 체중 킬로그램 당 1.16 Х 1014 벡터 게놈의 용량으로 투여되었다. 혈청 페닐알라닌 (Phe)은 질량 분광법을 통해서 5개월 동안 매주 측정하였다. 5개월 이후에, DNA는 간 샘플로부터 추출되었고, 세포 당 벡터 게놈의 개수는 벡터 및 인간 PAH 게놈 유전자좌 카피수를 측정하기 위해서 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 ddPCR을 통해 분석하였다.
형질도입 효율 (세포 당 벡터 게놈의 개수 ("세포 당 VG")로 측정됨)은 벡터, 및 마우스 및 인간 PAH 게놈 유전자좌 카피수를 측정하기 위해 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 ddPCR을 통해 결정하였다. 편집 빈도는 마우스 PAH 유전자좌 및 인간 PAH 유전자좌에 통합된 AAV 벡터 ("페이로드")로부터의 편집 엘리먼트 DNA의 빈도를 측정하기 위해 프라이머 프로브 세트를 사용한 다중화 ddPCR을 통해 측정하였다. 간략하게, 단일 DNA 가닥을 유적으로 분할하였다. 각각의 유적은 페이로드의 존재 또는 부재와 함께 인간 또는 마우스 PAH DNA의 존재에 대해 시험하였다. 편집 빈도는 개별 핵산 분자에서 표적 DNA 및 페이로드의 동시-분할의 예상 확률을 초과하는 단일 유적 내 표적 DNA 및 페이로드의 검출된 동시-분할을 기반으로 계산하였다.
PAH 녹아웃 마우스는 혈액 중 증가된 페닐알라닌 (Phe) 수준의 표현형을 가졌다. 표현형 변화를 조사하기 위해서, AAV 벡터의 투여 이후에 Phe의 혈청 수준을 측정하였고, 그 수준 비율은 0 시간에서의 기준치에 대해 계산하였고, 수준 백분율을 AAV 벡터를 받지 않은 대조군 마우스와 비교하였다.
AAVHSC15 캡시드에 패키징된 hPAH-mAC-006 벡터가 투여된 마우스는 세포 당 약 8 내지 18 벡터 게놈의 형질도입 효율 (도 7A), 및 대립유전자의 개수 대비 약 4.4%의 평균 편집 효율 (도 7B)을 보였다. 이러한 편집 효율은 적어도 5개월 동안 약 50% 까지 마우스의 혈청에서 Phe 수준을 감소시키기에 충분한 PAH의 발현 수준을 뒷받침하였고 (도 7C 및 7D), 표현형 변화는 편집 효율과 상관있었다 (도 7E). Pah 유전자좌에서 벡터의 올바른 상동성 재조합은 페이로드와 하이브리드화된 제1 프라이머, 및 우측 상동성 팔부로부터 하류의 게놈 서열과 하이브리드화된 제2 프라이머를 사용하여 편집된 게놈 유전자좌로부터 증폭된 PCR 산물의 길이를 통해 검증되었다 (데이터 미도시).
상동성 재조합이 편집된 대립유전자에 임의의 게놈 변경을 도입시켰는지 여부를 결정하기 위해서, 상동성 팔부에 해당하는 게놈 영역 내 DNA 서열은 심층 시퀀싱 (Illumina)을 통해 더 분석하였다. 샘플은 모두 고품질 서열 판독치를 가졌고, 모든 위치는 20,000 판독치 이상의 심도로 시퀀싱되었다. 삽입 및 결실 (이하 "indel")은 indel 품질 필터 및 가닥 편향 필터가 구비된 Somatic Variant Callers를 통해서 확인하였다. 특히, 10개 연속 G를 포함하는 우측 상동성 팔부 내 영역은 대조군 및 처리 동물 둘 모두에서 약 0.02-0.05%의 상승된 indel 비율을 보였다. 이러한 유전자좌를 비롯하여, 몇몇 다른 유전자좌에서 Indel은 진짜 변화에 대한 필터를 통과하지 않았고, 추가 분석을 위해 제거되었다. 표 8에 표시된 바와 같이, 미처리된 대조군 동물은 0.002-0.006%의 indel 비율을 보였다. 처리 동물 1은 0.031%의 Indel 비율을 가졌고; 처리 동물 2는 필터를 통과한 indel을 갖지 않았으며; 처리 동물 3은 대조군 동물과 유사한 indel 비율을 가졌다. 모든 확인된 indel은 비번역 영역에 존재하였다.
Figure pct00008
상기 결과는 게놈에 PAH 코딩 서열을 삽입하는 교정 벡터를 사용하여 PAH 결핍 표현형을 반전시키는 실현가능성을 입증하였다.
생체내 형질도입 후 개별 마우스 간세포에서 인간 PAH의 발현을 검출하기 위해서, RNA 인 시츄 하이브리드화 (ISH)는 상기 기술된 바와 같이 침묵 코돈 변경을 갖는 인간 PAH RNA의 >1kb에 특이적인 프로브를 사용하여 간 조직 절편 상에서 수행하였다 (Advanced Cell Diagnostics, Inc., Hayward, CA). 도 7F에 도시된 바와 같이, 이러한 프로브는 인간 PAH RNA 및 hPAH-mAC-006 벡터가 형질도입된 마우스 간세포 내 PAH 서열을 포함하는 가능한 바이러스 DNA를 검출하였지만, 내생성 마우스 Pah RNA와 교차 하이브리드화하지 않았다. 동일한 침묵 코돈 변경을 갖는 인간 Pah RNA의 발현을 구동시키는 CMV 프로모터를 포함하는 이식유전자 구성체가 형질도입된 마우스의 간 샘플이 양성 대조군으로서 사용되었다.
c) PAH 교정 벡터 pHMI-hPAH-mAC-006
pHMI-hPAH-mAC-006 벡터는 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. 이들 엘리먼트의 서열은 표 9에 기재되어 있다.
Figure pct00009
d) pHMI-hPAH-mAC-006이 투여된 마우스에서 PAH 유전자 편집 효율
도 9A는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터를 받은 마우스에서 PAH 유전자의 편집 효율을 결정하기 위해 사용된 어세이의 개략도를 도시한다. ddPCR 및 LAM-NGS (LAM-PCR 이후 차세대 시퀀싱 (NGS))는 본 명세서에 기술되고 도 9A에 표시된 바와 같이 수행되었다. 도 9B는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 또는 비히클 대조군이 투여된 마우스의 세포에서 결정된 PAH 유전자 편집 효율의 그래프를 도시한다. 도 9B에 도시된 바와 같이, HMI-hPAH-mAC-006 벡터가 투여된 마우스에서 PAH 유전자 편집 효율은 대립유전자의 개수 대비 약 8%인 것으로 결정되었다. 편집된 영역에서 오류는 검출되지 않았다.
e) 마우스 모델에서 고페닐알라닌혈증의 지속적인 표현형 교정
한 실험에서, 표현형 교정에서 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 효능은 PAH 녹아웃 마우스 모델 (PAH ENU2)을 사용해 결정되었다. pHMI-hPAH-mAC-006 벡터는 AAVHSC15 캡시드에 패키징되었고 정맥내로 마우스에게 체중 kg 당 1 Х 1014 벡터 게놈의 용량으로 투여되었다. 표현형 변화를 조사하기 위해서, AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터의 투여 이후 페닐알라닌 (Phe) 및 티로신 (Tyr)의 혈청 수준은 7주간 매주 측정되었고, 수준 백분율은 0시의 기준치에 대해 계산되었으며, 수준 백분율은 비히클 대조군을 받은 대조군 마우스와 비교하였다. 총 4마리의 마우스는 AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터가 투여되었고, 2마리 마우스는 비히클 대조군이 투여되었다. 도 10에 도시된 바와 같이, Phe의 혈청 수준의 유의한 감소 (도 10A; *는 비히클 대비 2원 ANOVA로 반복 측정하여 p<0.0001; 시간 대비 2원 ANOVA로 반복 측정하여 p<0.0001을 의미) 및 Tyr의 혈청 수준의 유의한 증가 (도 10B; *는 비히클 대비 2원 ANOVA로 반복 측정하여 p<0.05; 시간 대비 2원 ANOVA로 반복 측정하여 p<0.0003을 의미)가 벡터를 받은 마우스에서 관찰되었다. 도 10C는 벡터 또는 비히클 대조군을 받은 마우스에서 혈청 Phe 및 혈청 Tyr 간 비율을 도시한다 (*는 비히클 대비 2원 ANOVA로 반복 측정하여 p< 0.002; 시간 대비 2원 ANOVA로 반복 측정하여 p<0.0004를 의미).
도 11A는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 또는 비히클 대조군이 투여된 마우스로부터 수득된 세포의 PAH 유전자 편집 효율 및 형질도입 효율을 보여주는 그래프를 도시한다. 도 11A의 좌측 y-축은 편집 효율의 백분율을 의미하고 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (AAVHSC15-mPAH)가 투여된 마우스가 대립유전자의 개수에 대해 약 5% 편집 효율을 가졌다는 것을 보여준다. 도 11A의 우측 y-축은 세포 당 벡터 게놈의 개수를 의미하고 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (AAVHSC15-mPAH)가 투여된 마우스가 세포 당 약 140 벡터 게놈의 형질도입 효율을 가졌다는 것을 보여준다.
도 11B는 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (AAVHSC15-mPAH) 또는 비히클 대조군이 투여된 마우스로부터 수득된 세포의, 마우스 GAPDH의 발현 수준에 대해 정규화된, 발현된 PAH mRNA의 상대량을 보여주는 그래프를 도시한다. 도시된 바와 같이, pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (AAVHSC15-mPAH)가 투여된 마우스로부터 수득된 세포는 비히클 대조군이 투여된 마우스와 비교하여 인간 PAH mRNA의 유의한 수준을 가졌다 (*는 비히클 대비 양측 만 위트니 (Mann Whitney) 검정에 의한 p<0.005를 의미).
실시예 5: 마우스 모델에서 인간 PAH 유전자의 생체내 편집
이 실시예는 마우스 모델에서 인간 PAH 유전자의 편집에 있어서, 이전 실시예에 기술된 것과 같은, PAH 교정 벡터를 조사하기 위한 동물 모델을 제공한다.
a) 마우스 모델에서 인간 혈액 세포 중 인간 PAH의 편집
간략하게, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스를 준치사량 조사를 통해 골수둔감화 (myeloblated)시켰고 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포를 이식하였다. 생착 수준은 유세포측정을 통해 말초 혈액 중 인간 및 마우스 CD45+ 세포의 양을 확인하여 12주 이후부터 결정하였고, 50% 초과로 순환성 인간 CD45+ 세포를 갖는 마우스를 선택하였다. AAVHSC17 캡시드로 패키징된 hPAH-hAC-008 벡터는 4개 그룹으로 균등하게 분배된 12마리의 이러한 마우스에게 정맥내로 투여되었다. 제1 및 제2 마우스 그룹은 체중 킬로그램 당 1.54 Х 1013 벡터 게놈의 용량을 받았고, 제3 및 제4 마우스 그룹은 체중 킬로그램 당 2.1 Х 1012 벡터 게놈의 용량을 받았다. 마우스는 주사 후 6주차에 안락사되었다. 혈액, 골수 및 비장 조직의 샘플을 수집하였고, 게놈 DNA를 추출하였다.
마우스 및 인간 세포에서 편집 빈도는 마우스 PAH 유전자좌 및 인간 PAH 유전자좌에 통합된 AAV 벡터 ("페이로드")로부터 통합된 DNA의 빈도를 측정하기 위한 프라이머 프로브 세트를 사용해 다중화 액적 디지털 PCR (ddPCR)을 통해 측정하였다. 간략하게, 단일 DNA 가닥을 유적에 분할하였다. 각각의 유적은 페이로드의 존재 또는 부재와 함께 인간 또는 마우스 PAH DNA의 존재에 대해 시험되었다. 편집 빈도는 개별 핵산 분자에서 표적 DNA 및 페이로드의 동시-분할의 예상 확률을 초과하는 단일 유적 내 표적 DNA 및 페이로드의 검출된 동시-분할을 기반으로 계산하였다.
표 10에 표시된 바와 같이, 인간 세포의 편집은 용량 의존적인 방식으로 골수 샘플에서 검출되었다. 특히, 마우스 세포에서 편집이 검출되지 않았으므로, 편집은 인간 게놈에 특이적이었다.
Figure pct00010
도 8A는 AAVHSC15 캡시드에 패키징된 벡터가 투여된 마우스에서 인간 및 마우스 간세포에서의 hPAH-hAC-008 벡터 및 hPAH-hAC-008-HBB 벡터의 형질도입 효율을 도시한다.
b) HBB 인트론을 포함하는 벡터를 사용한 마우스 모델에서 인간 간세포 중 인간 PAH의 편집
hPAH-hAC-008 벡터는 임의의 인트론없이 완전한 인간 PAH 코딩 서열을 포함한다. 인간 HBB 유전자의 제1 인트론 (SEQ ID NO: 28의 뉴클레오티드 서열을 가짐)이 인간 PAH 코딩 서열의 뉴클레오티드 912 및 913 사이에 첨가된 것인, 변형된 벡터 hPAH-hAC-008-HBB는 벡터로부터 전사되는 RNA 분자의 핵 이출 및 안정성을 개선시키기 위해 생성되었다. 뉴클레오티드 912 및 913 사이의 뉴클레오티드간 결합은 코돈의 침묵 변경을 통해 파괴되지 않은, 천연 PAH 유전자의 엑손 8 및 엑손 9 사이의 스플라이싱 부위에 해당된다.
벡터는 AAVHSC15 캡시드로 패키징되었고, 마우스에게 정맥내로 체중 킬로그램 당 1 Х 1013 벡터 게놈의 용량으로 투여되었다. 투여 후 6주차에, 간 샘플을 수집하였고, 침묵적으로 변경된 인간 PAH mRNA 및 가능하게 PAH 서열을 포함하는 바이러스 DNA의 국재화를 인시츄 하이브리드화를 통해 조사하였다. 도 8B에 도시된 바와 같이, HBB 인트론의 첨가는 mRNA의 핵 이출을 실질적으로 개선시켰다. 이러한 결과는 PAH 코딩 서열 내 인트론의 첨가가 잠재적으로 PAH 유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있고, 이러한 특징이 PAH 교정 벡터의 디자인에 포함될 수 있다는 것을 입증하였다.
c) 마우스 모델에서 인간 간세포의 인간 PAH의 편집
간략하게, 통상 ERG® 녹아웃 마우스라고 하는, C57Bl/6 배경의 Fah -/- Rag2 -/- Il2rg -/- 마우스가 간 인간화용 모델로서 사용되었다. 이 마우스는 면역결핍이고 티로신 이화작용 효소 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제 (Fah)가 결여되었다. 마우스 간세포의 절제는 보호 약물 2-(2-니트로-4-트리플루오로메틸벤조일)-1,3-시클로헥산디온 (NTBC)의 투여 중지를 통해 유도시켰다. 마우스는 인간 간세포가 접목되었고, 우로키나제-발현 아데노바이러스가 인간 간세포의 재증식을 증강시키기 위해 투여되었다. 생착은 CuRx™ 니티시논 (20-0026) 및 SMX/TMP 항생제 (20-0037)의 예방적 처치의 적절한 용법과 함께 동물 일생 동안 지속되었다. 동물들은 체중이 평균 22 그램이었고, 통상 수명은 18개월 내지 24개월이었다.
hPAH-hAC-008 또는 hPAH-hAC-008-HBB 벡터는 AAVHSC15 캡시드에 패키징되었고, 마우스에게 정맥내로 체중 킬로그램 당 1 Х 1013 벡터 게놈의 용량으로 투여되었다. 투여 후 6주차에, 간 샘플을 수집하였고, 인간 및 마우스 간세포를 분리하였으며 간 관류 이후에 Miltenyi autoMACS 컬럼을 사용해 정제하였다. DNA를 추출하였고, 유전자 편집 효율은 상기 기술된 바와 동일한 ddPCR 방법을 사용해 측정하였다.
도 8C에 도시된 바와 같이, 모든 대립유전자 중에서 편집된 대립유전자의 백분율로서 측정된, 인간 간세포에서 편집 효율의 백분율은 hPAH-hAC-008 벡터가 처리된 동물에서 2.2%였고, hPAH-hAC-008-HBB 벡터가 처리된 동물에서 4.3%였다. 편집은 양쪽 동물 유래 마우스 간세포에서 검출되지 않았다. 양쪽 동물로부터의 마우스 간세포에서 편집 검출의 결여는 마우스 간세포도 역시 형질도입되었으므로 형질도입 효율의 결여에 의한 것은 아닌 듯하다 (도 8A). 개별 실험에서, hPAH-hAC-008 벡터에 의한 인간 게놈의 편집은 인간 게놈의 대립유전자의 개수 대비 2.131%의 비율로 검출되었는데 반해, 간 샘플에서 마우스 게놈의 편집은 마우스 게놈의 대립유전자 개수 대비 0.05% 비율로 검출되었다. 이들 결과는 hPAH-hAC-008 벡터 또는 이의 변형된 형태에 의한 PAH 유전자의 인간-특이적 편집을 보여주었고, 간세포에서 편집 효율을 조사하기 위한 생체내 모델을 제공하였다.
d) 마우스 모델에서 인간 간세포 중 인간 PAH의 편집
한 실험에서, 통상 FRG® 녹아웃 마우스 (본 명세서에서 HuLiv 마우스라고도 함)라고 하는, C57Bl/6 배경의 Fah -/- Rag2 -/- Il2rg -/- 마우스가 상기 기술된 바와 같이, 간 인간화용 모델로서 사용되었다 (도 12A 참조).
pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터는 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 스플라이싱 억셉터, 2A 엘리먼트, 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. 이들 엘리먼트의 서열은 표 11에 기재되어 있다.
Figure pct00011
pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터는 AAVHSC15 캡시드에 패키징되었고, 마우스에게 정맥내로 체중 킬로그램 당 1 Х 1014 벡터 게놈의 용량으로 투여되었다. AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터를 받은 3마리 마우스 유래 간 샘플을 수집하였고, 인간 및 마우스 간세포를 분리 및 정제하였으며, DNA를 추출하였다. 유전자 편집 효율은 상기 기술된 바와 동일한 ddPCR 방법을 사용해 측정하였다.
인간 간세포에서 PAH 유전자 편집의 지속성은 벡터의 투여 이후 1주차 및 6주차에 처리된 마우스로부터 수득된 세포 내 모든 대립유전자 중에서 편집된 대립유전자의 백분율을 결정하여 측정하였다. 도 12B에 도시된 바와 같이, 약 4% PAH 유전자 편집이 벡터 투여 후 1주차 마우스로부터 수득된 세포에서 측정되었고, 약 7% 편집이 벡터 투여 후 6주차 마우스로부터 수득된 세포에서 측정되었다.
pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터에 의해 매개되는 게놈 편집은 HuLiv 마우스에서 인간 간세포에 특이적인 것으로 확인되었다. 도 13에 도시된 바와 같이, 벡터의 투여 후 1주차에, PAH 유전자 편집 (ddPCR 및 NGS로 결정)은 인간 게놈의 대립유전자 개수에 대해 약 3% 내지 3.5%의 비율로 검출되었는데 반해서, 간 샘플에서 마우스 게놈의 편집은 마우스 게놈의 대립유전자 개수 대비 0%에 가까웠다. 벡터의 투여 이후 6주차에, 편집은 인간 게놈의 대립유전자 개수 대비 약 5% 내지 6.5%의 비율로 검출되었다. *는 마우스 값과 비교하여 p<0.0025를 의미한다.
더 나아가서, pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터는 인간 이외 세포에서 비효과적인 것으로 확인되었다. 도 14에 도시된 바와 같이, PAH 녹아웃 마우스 (PAH ENU2) 마우스는 정맥내로 AAVHSC15 캡시드에 패키징된 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터 (hPAH-032)가 체중 킬로그램 당 1 Х 1014 벡터 게놈의 용량으로 투여되었을 때, 혈청 페닐알라닌의 수준은 주사 후 최대 3주까지 대조군 투여된 마우스와 유사하였다. 대조적으로, pHMI-hPAH-mAC-006 벡터 (mPAH-006)가 투여된 마우스는 주사후 1주만에 혈청 Phe 수준의 감소를 보였다.
도 15A는 인간 PAH 발현 및 혈청 Phe 수준 간 관련성을 보여준다. 도시된 바와 같이, PAHENU2 마우스에서 pHMI-hPAH-mAC-006 벡터를 사용한 실험에서 모은 데이터에서, 10%의 인간 PAH 발현이 PAHENU2 마우스에서 표현형을 교정한다. 따라서, 내생성 수준 대비 인간 PAH 발현의 10%는 페닐알라닌혈증을 교정하는데 필요한 수준 (예를 들어, 치료적 수준)인 것으로 결정되었다.
발현의 치료적 수준은 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터에서 검출되었다. 인간 간세포에서 인간 PAH 발현은 pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터 (hPAH-032)가 체중 킬로그램 당 1 Х 1014 벡터 게놈의 용량으로 투여된 HuLiv 마우스에서 인간 GAPDH에 대해 측정되었다. 도 15B에 도시된 바와 같이, 벡터가 처리된 2마리의 상이한 HuLiv 마우스에서 인간 PAH의 발현을 측정하기 위한 2종의 상이한 발현 프로브를 사용하여,인간 PAH 발현은 인간 간세포에서 10% 초과인 것으로 결정되었다. 벡터가 투여된 HuLiv 마우스의 인간 간세포에서 PAH 유전자 편집 범위는 3회의 상이한 실험에 걸쳐서 13마리의 상이한 마우스에서 약 5% 내지 약 11%인 것으로 측정되었다.
pHMIK-hPAH-hI1C-032 벡터는 인간 PAH 유전자를 표적화하는 것이 확인되었고 HuLiv 마우스에서 편집된 mRNA 교정된 수준을 야기시켰다. 표현형 교정에 필요한 PAH mRNA 수준이 (PAH 녹아웃 마우스 모델 (PAH ENU2)을 사용하여) 마우스 모델에서 최초로 확립되었다. 이것은 내생성 수준에 대해서 약 10%의 PAH 발현인 것으로 결정되었다 (도 15A 참조). 도 16에 도시된 바와 같이, GAPDH 발현 대비 인간 PAH 유전자 발현은 약 44.9%인 것으로 결정되었고 (좌측), GAPDH 발현 대비 마우스 PAH 유전자 발현은 약 39.7%인 것으로 결정되었다 (우측).
실시예 6: 인간 PAH 교정 벡터
이 실시예는 인간 PAH 교정 벡터 pKITR-hPAH-mAC-006-HCR, pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR, pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3, pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3, 및 pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1을 제공한다. 벡터의 개략도는 각각 도 17A, 17B, 17C, 17D, 및 17E에 도시된다.
a) pKITR-hPAH-mAC-006-HCR, pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR, 및 pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1
벡터 pKITR-hPAH-mAC-006-HCR 및 pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR은 PAH 코딩 서열로 HCR 인트론을 삽입시켜 생성시켰다. 벡터 pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1은 PAH 코딩 서열에 HBB1 인트론을 삽입시켜 생성시켰다. HCR 및 HBB1 인트론은 간 및 혈액 세포주에서 높은 발현을 보이는 인트론을 결정하기 위해 루시퍼라제 리포터를 사용한 인트론 스크리닝 실험에서 그들 성능을 기반으로 선택하였다. 스크린에서 사용된 인트론은 표 12에 기재되어 있다.
Figure pct00012
pKITR-hPAH-mAC-006-HCR은 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 이에 삽입된 HCR 인트론을 갖는 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 표적화된 통합 제한 카세트 ("TI RE"), 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR은 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 스플라이스 억셉터, 2A 엘리먼트, 이에 삽입된 HCR 인트론을 갖는 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1은 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 이에 삽입된 HBB 인트론을 갖는 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 표적화된 통합 제한 카세트 ("TI RE"), 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. 이들 엘리먼트의 서열은 표 13에 기재되어 있다.
Figure pct00013
b) pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3 및 pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3벡터
pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3 및 pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3은 스플라이스 도너 부위를 변형시켜 생성시켰다. 스플라이스 도너는 각각 도 17C 및 17D에 표시된 바와 같이 변형되었다. pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3은 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 스플라이스 도너 변경을 갖는 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 표적화된 통합 제한 카세트 ("TI RE"), 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3은 5'에서 3'으로 하기 유전자 엘리먼트: 5' ITR 엘리먼트, 5' 상동성 팔부, 스플라이싱 억셉터, 2A 엘리먼트, 스플라이스 도너 변경을 갖는 침묵적으로 변경된 인간 PAH 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 3' 상동성 팔부, 및 3' ITR 엘리먼트를 포함하였다. 이들 엘리먼트의 서열을 표 14에 기재되어 있다.
Figure pct00014
* * *
본 발명은 본 명세서에 기술된 특별한 구현예에 의해 범주가 제한되는 것이 아니다. 실제로, 기술된 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 전술된 설명 및 수반되는 도면을 통해서 당업자에게 자명해 질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범주 내에 포함시키고자 한다.
본 명세서에서 인용되는 모든 참조 (예를 들어, 출판물 또는 특허 또는 특허 출원)는 각각의 개별 참조 (예를 들어, 출판물 또는 특허 또는 특허 출원)가 모든 목적을 위해 그 전체로 참조로 편입된다고 특별히 개별적으로 표시된 바와 동일한 정도로 모든 목적으로 위해 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다. 다른 구현예들이 하기 청구항 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> HOMOLOGY MEDICINES, INC. <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RESTORING PAH GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF <130> 610062: HMT-024PC <150> 62/625,149 <151> 2018-02-01 <150> 62/672,377 <151> 2018-05-16 <160> 153 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adeno-associated AAV9 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 2 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> novel AAV isolate <400> 2 Met Thr Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Gln Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 3 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> novel AAV isolate <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu 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cacgaggggc gttactgtgc 540 ggagatgcac cacgcaagag acaccctttg taactctctt ctcctcccta gtgcgaggtt 600 aaaaccttca gccccacgtg ctgtttgcaa acctgcctgt acctgaggcc ctaaaaagcc 660 agagacctca ctcccgggga gccagcatgt ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg 720 gcaggaaact ctctgacttt ggacaggtga gccacggcag cctgagctgc tcagttaggg 780 gaatttgggc ctccagagaa agagatccga agactgctgg tgcttcctgg tttcataagc 840 tcagtaagaa gtctgaattc gttggaagct gatgagaata tccaggaagt caacagacaa 900 atgtcctcaa caattgtttc taagtaggag aacatctgtc ctcggtggct ttcacaggaa 960 <210> 43 <211> 968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.8 vector 5' homology arm <400> 43 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta gctgtagttt 120 tctgaagtca gcgcacagca aggcagtgtg cttagaggtt aacagaaggg aaaacaacaa 180 caacaaaaat ctaaatgaga atcctgactg tttcagctgg gggtaagggg ggcggattat 240 tcatataatt gttccaccag acggtcgcag gcttagtcca attgcagaga acacgctgtt 300 cttcgcccca ggcttctgag agtcccggaa gtgcctaaac ctgtctaatc gacggggctt 360 gggtggcccg tcgctccctg gcttcttccc tttacccagg gcgggcagcg aagtggtgcc 420 tcctgcgtcc cccacaccct ccctcagccc ctcccctccg gcccgtcctg ggcaggtgac 480 ctggagcatc cggcaggctg ccctggcctc ctgcgtcagg acaacgccca cgaggggcgt 540 tactgtgcgg agatgcacca cgcaagagac accctttgta actctcttct cctccctagt 600 gcgaggttaa aaccttcagc cccacgtgct gtttgcaaac ctgcctgtac ctgaggccct 660 aaaaagccag agacctcact cccggggagc cagcatgtcc actgcggtcc tggaaaaccc 720 aggcttgggc aggaaactct ctgactttgg acaggtgagc cacggcagcc tgagctgctc 780 agttagggga atttgggcct ccagagaaag agatccgaag actgctggtg cttcctggtt 840 tcataagctc agtaagaagt ctgaattcgt tggaagctga tgagaatatc caggaagtca 900 acagacaaat gtcctcaaca attgtttcta agtaggagaa catctgtcct cggtggcttt 960 cacaggaa 968 <210> 44 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.9 vector 5' homology arm <400> 44 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta gctgtagttt 120 tctgaagtca gcgcacagca aggcagtgtg cttagaggtt aacagaaggg aaaacaacaa 180 caacaaaaat ctaaatgaga atcctgactg tttcagctga gagtaagggg ggcggattat 240 tcatataatt gttataccag acggtcgcag gcttagtcca attgcagaga actcgcttcc 300 caggcttctg agagtcccgg aagtgcctaa acctgtctaa tcgacagagc ttgggtggcc 360 cgtcgctccc tggcttcttc cctttaccca gggcgggcag cgaagtggtg cctcctgcgt 420 cccccacacc ctccctcagc ccctcccctc cggcccgtcc taggcaggtg acctgaagca 480 tccagcaggc tgccctggcc tcctgcgtca ggacaacgcc cacgaggggc gttactgtgc 540 ggagatgcac cacgcaagag acaccctttg taactctctt ctcctcccta gtgcgaggtt 600 aaaaccttca gccccacgtg ctgtttgcaa acctgcctgt acctgaggcc ctaaaaagcc 660 agagacctca ctcccgggga gccagcatgt ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg 720 gcaggaaact ctctgacttt ggacaggtga gccacggcag cctgagctgc tcagttaggg 780 gaatttgggc ctccagagaa agagatccga agactgctgg tgcttcctgg tttcataagc 840 tcagtaagaa gtctgaattc gttggaagct gatgagaata tccaggaagt caacagacaa 900 atgtcctcaa caattgtttc taagtaggag aacatctgtc ctcggtggct ttcacaggaa 960 <210> 45 <211> 911 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 ctgggatggg atgtggaatc cttctagatt tcttttgtaa tatttataaa gtgctctcag 60 caaggtatca aaatggcaaa attgtgagta actatcctcc tttcattttg ggaagaagat 120 gaggcatgaa gagaattcag acagaaactt actcagacca ggggaggcag aaactaagca 180 gagaggaaaa tgaccaagag ttagccctgg gcatggaatg tgaaagaacc ctaaacgtga 240 cttggaaata atgcccaagg tatattccat tctccgggat ttgttggcat tttcttgagg 300 tgaagaattg cagaatacat tctttaatgt gacctacata tttacccatg ggaggaagtc 360 tgctcctgga ctcttgagat tcagtcataa agcccaggcc agggaaataa tgtaagtctg 420 caggcccctg tcatcagtag gattagggag aagagttctc agtagaaaac agggaggctg 480 gagagaaaag aatggttaat gttaacgtta atataactag aaagactgca gaacttagga 540 ctgattttta tttgaatcct taaaaaaaaa aatttcttat gaaaatagta catggctctt 600 aggagacaga acttattgta cagaggaaca gcgtgagagt cagagtgatc ccagaacagg 660 tcctggctcc atcctgcaca tagttttggt gctgctggca atacggtccc cacaactgtg 720 ggaaggggtt aggggcaggg atctcatcag gaaagcatag gggtttaaag ttctttatag 780 agcacttaga agattgagaa tccacaaatt atattaataa caaacaaagt agtgtcgtgt 840 tatatagtaa atgtgaattt gcagacacat ttagggaaaa gttataatta aaaaaatagg 900 ctgtatatat a 911 <210> 46 <211> 3537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.1 vector correction genome <400> 46 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta gctgtagttt 120 tctgaagtca gcgcacagca aggcagtgtg cttagaggtt aacagaaggg aaaacaacaa 180 caacaaaaat ctaaatgaga atcctgactg tttcagctgg gggtaagggg ggcggattat 240 tcatataatt gttataccag acggtcgcag gcttagtcca attgcagaga actcgcttcc 300 caggcttctg agagtcccgg aagtgcctaa acctgtctaa tcgacggggc ttgggtggcc 360 cgtcgctccc tggcttcttc cctttaccca gggcgggcag cgaagtggtg cctcctgcgt 420 cccccacacc ctccctcagc ccctcccctc cggcccgtcc tgggcaggtg acctggagca 480 tccggcaggc tgccctggcc tcctgcgtca ggacaacgcc cacgaggggc gttactgtgc 540 ggagatgcac cacgcaagag acaccctttg taactctctt ctcctcccta gtgcgaggtt 600 aaaaccttca gccccacgtg ctgtttgcaa acctgcctgt acctgaggcc ctaaaaagcc 660 agagacctca ctcccgggga gccagcatgt ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg 720 gcaggaaact ctctgacttt ggacaggtga gccacggcag cctgagctgc tcagttaggg 780 gaatttgggc ctccagagaa agagatccga agactgctgg tgcttcctgg tttcataagc 840 tcagtaagaa gtctgaattc gttggaagct gatgagaata tccaggaagt caacagacaa 900 atgtcctcaa caattgtttc taagtaggag aacatctgtc ctcggtggct ttcacaggaa 960 aagcttctga cctcttctct tcctcccaca gggcagcgga gctactaact tcagcctgct 1020 gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg tccaccgctg tgctggagaa 1080 ccctgggctg gggaggaaac tgtcagactt cgggcaggag acttcataca ttgaggataa 1140 ctgtaaccag aatggcgcca tctctctgat cttcagcctg aaggaggaag tgggcgccct 1200 ggcaaaggtg ctgcgcctgt ttgaggagaa cgacgtgaat ctgacccaca tcgagtcccg 1260 gccttctaga ctgaagaagg acgagtacga gttctttacc cacctggata agcggtccct 1320 gccagccctg acaaacatca tcaagatcct gaggcacgac atcggagcaa ccgtgcacga 1380 gctgtctcgg gacaagaaga aggataccgt gccctggttc cctcggacaa tccaggagct 1440 ggatagattt gccaaccaga tcctgtctta cggagcagag ctggacgcag atcaccctgg 1500 cttcaaggac ccagtgtatc gggcccggag aaagcagttt gccgatatcg cctacaatta 1560 taggcacgga cagccaatcc ctcgcgtgga gtatatggag gaggagaaga agacctgggg 1620 cacagtgttc aagaccctga agagcctgta caagacacac gcctgctacg agtataacca 1680 catcttcccc ctgctggaga agtattgtgg ctttcacgag gacaatatcc ctcagctgga 1740 ggacgtgagc cagttcctgc agacctgcac aggctttagg ctgaggccag tggcaggact 1800 gctgagctcc cgggacttcc tgggaggact ggccttcaga gtgtttcact gcacccagta 1860 catcaggcac ggctccaagc caatgtatac accagagccc gacatctgtc acgagctgct 1920 gggccacgtg cccctgttta gcgatagatc cttcgcccag ttttcccagg agatcggact 1980 ggcatctctg ggagcacctg acgagtacat cgagaagctg gccaccatct attggttcac 2040 agtggagttt ggcctgtgca agcagggcga tagcatcaag gcctacggag caggactgct 2100 gtctagcttc ggcgagctgc agtattgtct gtccgagaag ccaaagctgc tgcccctgga 2160 gctggagaag accgccatcc agaactacac cgtgacagag ttccagcccc tgtactatgt 2220 ggccgagtct tttaacgatg ccaaggagaa ggtgagaaat ttcgccgcca caatccctag 2280 gcccttcagc gtgcggtacg acccttatac ccagaggatc gaggtgctgg ataatacaca 2340 gcagctgaag atcctggctg actcaatcaa tagcgaaatc ggaatcctgt gctccgccct 2400 gcagaaaatc aaatgaggta ccgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 2460 aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 2520 tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 2580 tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa ggatccctgg gatgggatgt 2640 ggaatccttc tagatttctt ttgtaatatt tataaagtgc tctcagcaag gtatcaaaat 2700 ggcaaaattg tgagtaacta tcctcctttc attttgggaa gaagatgagg catgaagaga 2760 attcagacag aaacttactc agaccagggg aggcagaaac taagcagaga ggaaaatgac 2820 caagagttag ccctgggcat ggaatgtgaa agaaccctaa acgtgacttg gaaataatgc 2880 ccaaggtata ttccattctc cgggatttgt tggcattttc ttgaggtgaa gaattgcaga 2940 atacattctt taatgtgacc tacatattta cccatgggag gaagtctgct cctggactct 3000 tgagattcag tcataaagcc caggccaggg aaataatgta agtctgcagg cccctgtcat 3060 cagtaggatt agggagaaga gttctcagta gaaaacaggg aggctggaga gaaaagaatg 3120 gttaatgtta acgttaatat aactagaaag actgcagaac ttaggactga tttttatttg 3180 aatccttaaa aaaaaaaatt tcttatgaaa atagtacatg gctcttagga gacagaactt 3240 attgtacaga ggaacagcgt gagagtcaga gtgatcccag aacaggtcct ggctccatcc 3300 tgcacatagt tttggtgctg ctggcaatac ggtccccaca actgtgggaa ggggttaggg 3360 gcagggatct catcaggaaa gcataggggt ttaaagttct ttatagagca cttagaagat 3420 tgagaatcca caaattatat taataacaaa caaagtagtg tcgtgttata tagtaaatgt 3480 gaatttgcag acacatttag ggaaaagtta taattaaaaa aataggctgt atatata 3537 <210> 47 <211> 3537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.2 vector correction genome <400> 47 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta gctgtagttt 120 tctgaagtca gcgcacagca aggcagtgtg cttagaggtt aacagaaggg aaaacaacaa 180 caacaaaaat ctaaatgaga atcctgactg tttcagctgg gggtaagggg ggcggattat 240 tcatataatt gttataccag acggtcgcag gcttagtcca attgcagaga actcgcttcc 300 caggcttctg agagtcccgg aagtgcctaa acctgtctaa tcgacggggc ttgggtggcc 360 cgtcgctccc tggcttcttc cctttaccca gggcgggcag cgaagtggtg cctcctgcgt 420 cccccacacc ctccctcagc ccctcccctc cggcccgtcc tgggcaggtg acctggagca 480 tccggcaggc tgccctggcc tcctgcgtca ggacaacgcc cacgaggggc gttactgtgc 540 ggagatgcac cacgcaagag acaccctttg taactctctt ctcctcccta gtgcgaggtt 600 aaaaccttca gccccacgtg ctgtttgcaa acctgcctgt acctgaggcc ctaaaaagcc 660 agagacctca ctcccgggga gccaccatgg cggcggcggt cctggaaaac ccaggcttgg 720 gcaggaaact ctctgacttt ggacaggtga gccacggcag cctgagctgc tcagttaggg 780 gaatttgggc ctccagagaa agagatccga agactgctgg tgcttcctgg tttcataagc 840 tcagtaagaa gtctgaattc gttggaagct gatgagaata tccaggaagt caacagacaa 900 atgtcctcaa caattgtttc taagtaggag aacatctgtc ctcggtggct ttcacaggaa 960 aagcttctga cctcttctct tcctcccaca gggcagcgga gctactaact tcagcctgct 1020 gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg tccaccgctg tgctggagaa 1080 ccctgggctg gggaggaaac tgtcagactt cgggcaggag acttcataca ttgaggataa 1140 ctgtaaccag aatggcgcca tctctctgat cttcagcctg aaggaggaag tgggcgccct 1200 ggcaaaggtg ctgcgcctgt ttgaggagaa cgacgtgaat ctgacccaca tcgagtcccg 1260 gccttctaga ctgaagaagg acgagtacga gttctttacc cacctggata agcggtccct 1320 gccagccctg acaaacatca tcaagatcct gaggcacgac atcggagcaa ccgtgcacga 1380 gctgtctcgg gacaagaaga aggataccgt gccctggttc cctcggacaa tccaggagct 1440 ggatagattt gccaaccaga tcctgtctta cggagcagag ctggacgcag atcaccctgg 1500 cttcaaggac ccagtgtatc gggcccggag aaagcagttt gccgatatcg cctacaatta 1560 taggcacgga cagccaatcc ctcgcgtgga gtatatggag gaggagaaga agacctgggg 1620 cacagtgttc aagaccctga agagcctgta caagacacac gcctgctacg agtataacca 1680 catcttcccc ctgctggaga agtattgtgg ctttcacgag gacaatatcc ctcagctgga 1740 ggacgtgagc cagttcctgc agacctgcac aggctttagg ctgaggccag tggcaggact 1800 gctgagctcc cgggacttcc tgggaggact ggccttcaga gtgtttcact gcacccagta 1860 catcaggcac ggctccaagc caatgtatac accagagccc gacatctgtc acgagctgct 1920 gggccacgtg cccctgttta gcgatagatc cttcgcccag ttttcccagg agatcggact 1980 ggcatctctg ggagcacctg acgagtacat cgagaagctg gccaccatct attggttcac 2040 agtggagttt ggcctgtgca agcagggcga tagcatcaag gcctacggag caggactgct 2100 gtctagcttc ggcgagctgc agtattgtct gtccgagaag ccaaagctgc tgcccctgga 2160 gctggagaag accgccatcc agaactacac cgtgacagag ttccagcccc tgtactatgt 2220 ggccgagtct tttaacgatg ccaaggagaa ggtgagaaat ttcgccgcca caatccctag 2280 gcccttcagc gtgcggtacg acccttatac ccagaggatc gaggtgctgg ataatacaca 2340 gcagctgaag atcctggctg actcaatcaa tagcgaaatc ggaatcctgt gctccgccct 2400 gcagaaaatc aaatgaggta ccgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 2460 aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 2520 tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 2580 tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa ggatccctgg gatgggatgt 2640 ggaatccttc tagatttctt ttgtaatatt tataaagtgc tctcagcaag gtatcaaaat 2700 ggcaaaattg tgagtaacta tcctcctttc attttgggaa gaagatgagg catgaagaga 2760 attcagacag aaacttactc agaccagggg aggcagaaac taagcagaga ggaaaatgac 2820 caagagttag ccctgggcat ggaatgtgaa agaaccctaa acgtgacttg gaaataatgc 2880 ccaaggtata ttccattctc cgggatttgt tggcattttc ttgaggtgaa gaattgcaga 2940 atacattctt taatgtgacc tacatattta cccatgggag gaagtctgct cctggactct 3000 tgagattcag tcataaagcc caggccaggg aaataatgta agtctgcagg cccctgtcat 3060 cagtaggatt agggagaaga gttctcagta gaaaacaggg aggctggaga gaaaagaatg 3120 gttaatgtta acgttaatat aactagaaag actgcagaac ttaggactga tttttatttg 3180 aatccttaaa aaaaaaaatt tcttatgaaa atagtacatg gctcttagga gacagaactt 3240 attgtacaga ggaacagcgt gagagtcaga gtgatcccag aacaggtcct ggctccatcc 3300 tgcacatagt tttggtgctg ctggcaatac ggtccccaca actgtgggaa ggggttaggg 3360 gcagggatct catcaggaaa gcataggggt ttaaagttct ttatagagca cttagaagat 3420 tgagaatcca caaattatat taataacaaa caaagtagtg tcgtgttata tagtaaatgt 3480 gaatttgcag acacatttag ggaaaagtta taattaaaaa aataggctgt atatata 3537 <210> 48 <211> 3537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.3 vector correction genome <400> 48 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta gctgtagttt 120 tctgaagtca gcgcacagca aggcagtgtg cttagaggtt aacagaaggg aaaacaacaa 180 caacaaaaat ctaaatgaga atcctgactg tttcagctga gagtaagggg ggcggattat 240 tcatataatt gttataccag acggtcgcag gcttagtcca attgcagaga actcgcttcc 300 caggcttctg agagtcccgg aagtgcctaa acctgtctaa tcgacggggc ttgggtggcc 360 cgtcgctccc tggcttcttc cctttaccca gggcgggcag cgaagtggtg cctcctgcgt 420 cccccacacc ctccctcagc ccctcccctc cggcccgtcc tgggcaggtg acctggagca 480 tccggcaggc tgccctggcc tcctgcgtca ggacaacgcc cacgaggggc gttactgtgc 540 ggagatgcac cacgcaagag acaccctttg taactctctt ctcctcccta gtgcgaggtt 600 aaaaccttca gccccacgtg ctgtttgcaa acctgcctgt acctgaggcc ctaaaaagcc 660 agagacctca ctcccgggga gccagcatgt ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg 720 gcaggaaact ctctgacttt ggacaggtga gccacggcag cctgagctgc tcagttaggg 780 gaatttgggc ctccagagaa agagatccga agactgctgg tgcttcctgg tttcataagc 840 tcagtaagaa gtctgaattc gttggaagct gatgagaata tccaggaagt caacagacaa 900 atgtcctcaa caattgtttc taagtaggag aacatctgtc ctcggtggct ttcacaggaa 960 aagcttctga cctcttctct tcctcccaca gggcagcgga gctactaact tcagcctgct 1020 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catcaggcac ggctccaagc caatgtatac accagagccc gacatctgtc acgagctgct 1920 gggccacgtg cccctgttta gcgatagatc cttcgcccag ttttcccagg agatcggact 1980 ggcatctctg ggagcacctg acgagtacat cgagaagctg gccaccatct attggttcac 2040 agtggagttt ggcctgtgca agcagggcga tagcatcaag gcctacggag caggactgct 2100 gtctagcttc ggcgagctgc agtattgtct gtccgagaag ccaaagctgc tgcccctgga 2160 gctggagaag accgccatcc agaactacac cgtgacagag ttccagcccc tgtactatgt 2220 ggccgagtct tttaacgatg ccaaggagaa ggtgagaaat ttcgccgcca caatccctag 2280 gcccttcagc gtgcggtacg acccttatac ccagaggatc gaggtgctgg ataatacaca 2340 gcagctgaag atcctggctg actcaatcaa tagcgaaatc ggaatcctgt gctccgccct 2400 gcagaaaatc aaatgaggta ccgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 2460 aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 2520 tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 2580 tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa ggatccctgg gatgggatgt 2640 ggaatccttc tagatttctt ttgtaatatt tataaagtgc tctcagcaag gtatcaaaat 2700 ggcaaaattg tgagtaacta tcctcctttc attttgggaa gaagatgagg catgaagaga 2760 attcagacag aaacttactc agaccagggg aggcagaaac taagcagaga ggaaaatgac 2820 caagagttag ccctgggcat ggaatgtgaa agaaccctaa acgtgacttg gaaataatgc 2880 ccaaggtata ttccattctc cgggatttgt tggcattttc ttgaggtgaa gaattgcaga 2940 atacattctt taatgtgacc tacatattta cccatgggag gaagtctgct cctggactct 3000 tgagattcag tcataaagcc caggccaggg aaataatgta agtctgcagg cccctgtcat 3060 cagtaggatt agggagaaga gttctcagta gaaaacaggg aggctggaga gaaaagaatg 3120 gttaatgtta acgttaatat aactagaaag actgcagaac ttaggactga tttttatttg 3180 aatccttaaa aaaaaaaatt tcttatgaaa atagtacatg gctcttagga gacagaactt 3240 attgtacaga ggaacagcgt gagagtcaga gtgatcccag aacaggtcct ggctccatcc 3300 tgcacatagt tttggtgctg ctggcaatac ggtccccaca actgtgggaa ggggttaggg 3360 gcagggatct catcaggaaa gcataggggt ttaaagttct ttatagagca cttagaagat 3420 tgagaatcca caaattatat taataacaaa caaagtagtg tcgtgttata tagtaaatgt 3480 gaatttgcag acacatttag ggaaaagtta taattaaaaa aataggctgt atatata 3537 <210> 49 <211> 3537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.4 vector correction genome <400> 49 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta gctgtagttt 120 tctgaagtca gcgcacagca aggcagtgtg cttagaggtt aacagaaggg aaaacaacaa 180 caacaaaaat ctaaatgaga atcctgactg tttcagctgg gggtaagggg ggcggattat 240 tcatataatt gttataccag acggtcgcag gcttagtcca attgcagaga actcgcttcc 300 caggcttctg agagtcccgg aagtgcctaa acctgtctaa tcgacggggc ttgggtggcc 360 cgtcgctccc tggcttcttc cctttaccca gggcgggcag cgaagtggtg cctcctgcgt 420 cccccacacc ctccctcagc ccctcccctc cggcccgtcc tgggcaggtg acctggagca 480 tccggcaggc tgccctggcc tcctgagtca ggacaacgcc cacgaggggc gttactgtgc 540 ggagatgcac cacgcaagag acaccctttg taactctctt ctcctcccta gtgcgaggtt 600 aaaaccttca gccccacgtg ctgtttgcaa acctgcctgt acctgaggcc ctaaaaagcc 660 agagacctca ctcccgggga gccagcatgt ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg 720 gcaggaaact ctctgacttt ggacaggtga gccacggcag cctgagctgc 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1620 cacagtgttc aagaccctga agagcctgta caagacacac gcctgctacg agtataacca 1680 catcttcccc ctgctggaga agtattgtgg ctttcacgag gacaatatcc ctcagctgga 1740 ggacgtgagc cagttcctgc agacctgcac aggctttagg ctgaggccag tggcaggact 1800 gctgagctcc cgggacttcc tgggaggact ggccttcaga gtgtttcact gcacccagta 1860 catcaggcac ggctccaagc caatgtatac accagagccc gacatctgtc acgagctgct 1920 gggccacgtg cccctgttta gcgatagatc cttcgcccag ttttcccagg agatcggact 1980 ggcatctctg ggagcacctg acgagtacat cgagaagctg gccaccatct attggttcac 2040 agtggagttt ggcctgtgca agcagggcga tagcatcaag gcctacggag caggactgct 2100 gtctagcttc ggcgagctgc agtattgtct gtccgagaag ccaaagctgc tgcccctgga 2160 gctggagaag accgccatcc agaactacac cgtgacagag ttccagcccc tgtactatgt 2220 ggccgagtct tttaacgatg ccaaggagaa ggtgagaaat ttcgccgcca caatccctag 2280 gcccttcagc gtgcggtacg acccttatac ccagaggatc gaggtgctgg ataatacaca 2340 gcagctgaag atcctggctg actcaatcaa tagcgaaatc ggaatcctgt gctccgccct 2400 gcagaaaatc aaatgaggta ccgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 2460 aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 2520 tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 2580 tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa ggatccctgg gatgggatgt 2640 ggaatccttc tagatttctt ttgtaatatt tataaagtgc tctcagcaag gtatcaaaat 2700 ggcaaaattg tgagtaacta tcctcctttc attttgggaa gaagatgagg catgaagaga 2760 attcagacag aaacttactc agaccagggg aggcagaaac taagcagaga ggaaaatgac 2820 caagagttag ccctgggcat ggaatgtgaa agaaccctaa acgtgacttg gaaataatgc 2880 ccaaggtata ttccattctc cgggatttgt tggcattttc ttgaggtgaa gaattgcaga 2940 atacattctt taatgtgacc tacatattta cccatgggag gaagtctgct cctggactct 3000 tgagattcag tcataaagcc caggccaggg aaataatgta agtctgcagg cccctgtcat 3060 cagtaggatt agggagaaga gttctcagta gaaaacaggg aggctggaga gaaaagaatg 3120 gttaatgtta acgttaatat aactagaaag actgcagaac ttaggactga tttttatttg 3180 aatccttaaa aaaaaaaatt tcttatgaaa atagtacatg gctcttagga gacagaactt 3240 attgtacaga ggaacagcgt gagagtcaga gtgatcccag aacaggtcct ggctccatcc 3300 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gatgagaata tccaggaagt caacagacaa 900 atgtcctcaa caattgtttc taagtaggag aacatctgtc ctcggtggct ttcacaggaa 960 aagcttctga cctcttctct tcctcccaca gggcagcgga gctactaact tcagcctgct 1020 gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg tccaccgctg tgctggagaa 1080 ccctgggctg gggaggaaac tgtcagactt cgggcaggag acttcataca ttgaggataa 1140 ctgtaaccag aatggcgcca tctctctgat cttcagcctg aaggaggaag tgggcgccct 1200 ggcaaaggtg ctgcgcctgt ttgaggagaa cgacgtgaat ctgacccaca tcgagtcccg 1260 gccttctaga ctgaagaagg acgagtacga gttctttacc cacctggata agcggtccct 1320 gccagccctg acaaacatca tcaagatcct gaggcacgac atcggagcaa ccgtgcacga 1380 gctgtctcgg gacaagaaga aggataccgt gccctggttc cctcggacaa tccaggagct 1440 ggatagattt gccaaccaga tcctgtctta cggagcagag ctggacgcag atcaccctgg 1500 cttcaaggac ccagtgtatc gggcccggag aaagcagttt gccgatatcg cctacaatta 1560 taggcacgga cagccaatcc ctcgcgtgga gtatatggag gaggagaaga agacctgggg 1620 cacagtgttc aagaccctga agagcctgta caagacacac gcctgctacg agtataacca 1680 catcttcccc ctgctggaga agtattgtgg ctttcacgag gacaatatcc ctcagctgga 1740 ggacgtgagc cagttcctgc agacctgcac aggctttagg ctgaggccag tggcaggact 1800 gctgagctcc cgggacttcc tgggaggact ggccttcaga gtgtttcact gcacccagta 1860 catcaggcac ggctccaagc caatgtatac accagagccc gacatctgtc acgagctgct 1920 gggccacgtg cccctgttta gcgatagatc cttcgcccag ttttcccagg agatcggact 1980 ggcatctctg ggagcacctg acgagtacat cgagaagctg gccaccatct attggttcac 2040 agtggagttt ggcctgtgca agcagggcga tagcatcaag gcctacggag caggactgct 2100 gtctagcttc ggcgagctgc agtattgtct gtccgagaag ccaaagctgc tgcccctgga 2160 gctggagaag accgccatcc agaactacac cgtgacagag ttccagcccc tgtactatgt 2220 ggccgagtct tttaacgatg ccaaggagaa ggtgagaaat ttcgccgcca caatccctag 2280 gcccttcagc gtgcggtacg acccttatac ccagaggatc gaggtgctgg ataatacaca 2340 gcagctgaag atcctggctg actcaatcaa tagcgaaatc ggaatcctgt gctccgccct 2400 gcagaaaatc aaatgaggta ccgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 2460 aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 2520 tttatttgta accattataa gctgcaataa 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gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 3840 ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 3900 cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caa 3943 <210> 58 <211> 3943 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.4 vector correction genome (+ ITRs) <400> 58 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag 180 ggttagggag gtcctgcata tgcggccgct tcaggagcag ttgtgcgaat agctggagaa 240 caccaggctg gatttaaacc cagatcgctc ttacatttgc tctttacctg ctgtgctcag 300 cgttcacgtg ccctctagct gtagttttct gaagtcagcg cacagcaagg cagtgtgctt 360 agaggttaac agaagggaaa acaacaacaa caaaaatcta aatgagaatc ctgactgttt 420 cagctggggg taaggggggc ggattattca tataattgtt ataccagacg gtcgcaggct 480 tagtccaatt gcagagaact cgcttcccag gcttctgaga gtcccggaag tgcctaaacc 540 tgtctaatcg acggggcttg ggtggcccgt cgctccctgg cttcttccct ttacccaggg 600 cgggcagcga agtggtgcct cctgcgtccc ccacaccctc cctcagcccc tcccctccgg 660 cccgtcctgg gcaggtgacc tggagcatcc ggcaggctgc cctggcctcc tgagtcagga 720 caacgcccac gaggggcgtt actgtgcgga gatgcaccac gcaagagaca ccctttgtaa 780 ctctcttctc ctccctagtg cgaggttaaa accttcagcc ccacgtgctg tttgcaaacc 840 tgcctgtacc tgaggcccta aaaagccaga gacctcactc ccggggagcc agcatgtcca 900 ctgcggtcct ggaaaaccca ggcttgggca ggaaactctc tgactttgga caggtgagcc 960 acggcagcct gagctgctca gttaggggaa tttgggcctc cagagaaaga gatccgaaga 1020 ctgctggtgc ttcctggttt cataagctca gtaagaagtc tgaattcgtt ggaagctgat 1080 gagaatatcc aggaagtcaa cagacaaatg tcctcaacaa ttgtttctaa gtaggagaac 1140 atctgtcctc ggtggctttc acaggaaaag cttctgacct cttctcttcc tcccacaggg 1200 cagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg 1260 acctatgtcc accgctgtgc tggagaaccc tgggctgggg aggaaactgt cagacttcgg 1320 gcaggagact tcatacattg aggataactg taaccagaat ggcgccatct ctctgatctt 1380 cagcctgaag gaggaagtgg gcgccctggc aaaggtgctg cgcctgtttg aggagaacga 1440 cgtgaatctg acccacatcg 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gagaagaaga cctggggcac agtgttcaag accctgaaga gcctgtacaa 1860 gacacacgcc tgctacgagt ataaccacat cttccccctg ctggagaagt attgtggctt 1920 tcacgaggac aatatccctc agctggagga cgtgagccag ttcctgcaga cctgcacagg 1980 ctttaggctg aggccagtgg caggactgct gagctcccgg gacttcctgg gaggactggc 2040 cttcagagtg tttcactgca cccagtacat caggcacggc tccaagccaa tgtatacacc 2100 agagcccgac atctgtcacg agctgctggg ccacgtgccc ctgtttagcg atagatcctt 2160 cgcccagttt tcccaggaga tcggactggc atctctggga gcacctgacg agtacatcga 2220 gaagctggcc accatctatt ggttcacagt ggagtttggc ctgtgcaagc agggcgatag 2280 catcaaggcc tacggagcag gactgctgtc tagcttcggc gagctgcagt attgtctgtc 2340 cgagaagcca aagctgctgc ccctggagct ggagaagacc gccatccaga actacaccgt 2400 gacagagttc cagcccctgt actatgtggc cgagtctttt aacgatgcca aggagaaggt 2460 gagaaatttc gccgccacaa tccctaggcc cttcagcgtg cggtacgacc cttataccca 2520 gaggatcgag gtgctggata atacacagca gctgaagatc ctggctgact caatcaatag 2580 cgaaatcgga atcctgtgct ccgccctgca gaaaatcaaa tgaggtaccg atccagacat 2640 gataagatac 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aggccagtgg caggactgct gagctcccgg gacttcctgg gaggactggc 2040 cttcagagtg tttcactgca cccagtacat caggcacggc tccaagccaa tgtatacacc 2100 agagcccgac atctgtcacg agctgctggg ccacgtgccc ctgtttagcg atagatcctt 2160 cgcccagttt tcccaggaga tcggactggc atctctggga gcacctgacg agtacatcga 2220 gaagctggcc accatctatt ggttcacagt ggagtttggc ctgtgcaagc agggcgatag 2280 catcaaggcc tacggagcag gactgctgtc tagcttcggc gagctgcagt attgtctgtc 2340 cgagaagcca aagctgctgc ccctggagct ggagaagacc gccatccaga actacaccgt 2400 gacagagttc cagcccctgt actatgtggc cgagtctttt aacgatgcca aggagaaggt 2460 gagaaatttc gccgccacaa tccctaggcc cttcagcgtg cggtacgacc cttataccca 2520 gaggatcgag gtgctggata atacacagca gctgaagatc ctggctgact caatcaatag 2580 cgaaatcgga atcctgtgct ccgccctgca gaaaatcaaa tgaggtaccg atccagacat 2640 gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt 2700 tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca 2760 agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 2820 tttttaagga tccctgggat gggatgtgga atccttctag atttcttttg taatatttat 2880 aaagtgctct cagcaaggta tcaaaatggc aaaattgtga gtaactatcc tcctttcatt 2940 ttgggaagaa gatgaggcat gaagagaatt cagacagaaa cttactcaga ccaggggagg 3000 cagaaactaa gcagagagga aaatgaccaa gagttagccc tgggcatgga atgtgaaaga 3060 accctaaacg tgacttggaa ataatgccca aggtatattc cattctccgg gatttgttgg 3120 cattttcttg aggtgaagaa ttgcagaata cattctttaa tgtgacctac atatttaccc 3180 atgggaggaa gtctgctcct ggactcttga gattcagtca taaagcccag gccagggaaa 3240 taatgtaagt ctgcaggccc ctgtcatcag taggattagg gagaagagtt ctcagtagaa 3300 aacagggagg ctggagagaa aagaatggtt aatgttaacg ttaatataac tagaaagact 3360 gcagaactta ggactgattt ttatttgaat ccttaaaaaa aaaaatttct tatgaaaata 3420 gtacatggct cttaggagac agaacttatt gtacagagga acagcgtgag agtcagagtg 3480 atcccagaac aggtcctggc tccatcctgc acatagtttt ggtgctgctg gcaatacggt 3540 ccccacaact gtgggaaggg gttaggggca gggatctcat caggaaagca taggggttta 3600 aagttcttta tagagcactt agaagattga gaatccacaa attatattaa taacaaacaa 3660 agtagtgtcg tgttatatag taaatgtgaa tttgcagaca catttaggga aaagttataa 3720 ttaaaaaaat aggctgtata tatacctgca ggtctagata cgtagataag tagcatggcg 3780 ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 3840 ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 3900 cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caa 3943 <210> 62 <211> 3951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.8 vector correction genome (+ ITRs) <400> 62 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag 180 ggttagggag gtcctgcata tgcggccgct tcaggagcag ttgtgcgaat agctggagaa 240 caccaggctg gatttaaacc cagatcgctc ttacatttgc tctttacctg ctgtgctcag 300 cgttcacgtg ccctctagct gtagttttct gaagtcagcg cacagcaagg cagtgtgctt 360 agaggttaac agaagggaaa acaacaacaa caaaaatcta aatgagaatc ctgactgttt 420 cagctggggg taaggggggc ggattattca tataattgtt ccaccagacg gtcgcaggct 480 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cccagttttc ccaggagatc ggactggcat ctctgggagc acctgacgag 2220 tacatcgaga agctggccac catctattgg ttcacagtgg agtttggcct gtgcaagcag 2280 ggcgatagca tcaaggccta cggagcagga ctgctgtcta gcttcggcga gctgcagtat 2340 tgtctgtccg agaagccaaa gctgctgccc ctggagctgg agaagaccgc catccagaac 2400 tacaccgtga cagagttcca gcccctgtac tatgtggccg agtcttttaa cgatgccaag 2460 gagaaggtga gaaatttcgc cgccacaatc cctaggccct tcagcgtgcg gtacgaccct 2520 tatacccaga ggatcgaggt gctggataat acacagcagc tgaagatcct ggctgactca 2580 atcaatagcg aaatcggaat cctgtgctcc gccctgcaga aaatcaaatg aggtaccgat 2640 ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa 2700 aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc 2760 aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg 2820 tgggaggttt tttaaggatc cctgggatgg gatgtggaat ccttctagat ttcttttgta 2880 atatttataa agtgctctca gcaaggtatc aaaatggcaa aattgtgagt aactatcctc 2940 ctttcatttt gggaagaaga tgaggcatga agagaattca gacagaaact tactcagacc 3000 aggggaggca 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cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 3900 tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca a 3951 <210> 63 <211> 3943 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32.9 vector correction genome (+ ITRs) <400> 63 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag 180 ggttagggag gtcctgcata tgcggccgct tcaggagcag ttgtgcgaat agctggagaa 240 caccaggctg gatttaaacc cagatcgctc ttacatttgc tctttacctg ctgtgctcag 300 cgttcacgtg ccctctagct gtagttttct gaagtcagcg cacagcaagg cagtgtgctt 360 agaggttaac agaagggaaa acaacaacaa caaaaatcta aatgagaatc ctgactgttt 420 cagctgagag taaggggggc ggattattca tataattgtt ataccagacg gtcgcaggct 480 tagtccaatt gcagagaact cgcttcccag gcttctgaga gtcccggaag tgcctaaacc 540 tgtctaatcg acagagcttg ggtggcccgt cgctccctgg cttcttccct ttacccaggg 600 cgggcagcga agtggtgcct cctgcgtccc ccacaccctc cctcagcccc 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atgggaggaa gtctgctcct ggactcttga gattcagtca taaagcccag gccagggaaa 3240 taatgtaagt ctgcaggccc ctgtcatcag taggattagg gagaagagtt ctcagtagaa 3300 aacagggagg ctggagagaa aagaatggtt aatgttaacg ttaatataac tagaaagact 3360 gcagaactta ggactgattt ttatttgaat ccttaaaaaa aaaaatttct tatgaaaata 3420 gtacatggct cttaggagac agaacttatt gtacagagga acagcgtgag agtcagagtg 3480 atcccagaac aggtcctggc tccatcctgc acatagtttt ggtgctgctg gcaatacggt 3540 ccccacaact gtgggaaggg gttaggggca gggatctcat caggaaagca taggggttta 3600 aagttcttta tagagcactt agaagattga gaatccacaa attatattaa taacaaacaa 3660 agtagtgtcg tgttatatag taaatgtgaa tttgcagaca catttaggga aaagttataa 3720 ttaaaaaaat aggctgtata tatacctgca ggtctagata cgtagataag tagcatggcg 3780 ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 3840 ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 3900 cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caa 3943 <210> 64 <211> 912 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc 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tgcagacctg cacaggcttt 720 aggctgaggc cagtggcagg actgctgagc tcccgggact tcctgggagg actggccttc 780 agagtgtttc actgcaccca gtacatcagg cacggctcca agccaatgta tacaccagag 840 cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt ttagcgatag atccttcgcc 900 cagttttccc ag 912 <210> 66 <211> 447 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gaaattggcc ttgcctctct gggtgcacct gatgaataca ttgaaaagct cgccacaatt 60 tactggttta ctgtggagtt tgggctctgc aaacaaggag actccataaa ggcatatggt 120 gctgggctcc tgtcatcctt tggtgaatta cagtactgct tatcagagaa gccaaagctt 180 ctccccctgg agctggagaa gacagccatc caaaattaca ctgtcacgga gttccagccc 240 ctctattacg tggcagagag ttttaatgat gccaaggaga aagtaaggaa ctttgctgcc 300 acaatacctc ggcccttctc agttcgctac gacccataca cccaaaggat tgaggtcttg 360 gacaataccc agcagcttaa gattttggct gattccatta acagtgaaat tggaatcctt 420 tgcagtgccc tccagaaaat aaagtaa 447 <210> 67 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> from start of exon 9 to stop codon of silently altered PAH coding sequence <400> 67 gagatcggac 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agcaaggcag tgtgcttaga ggttaacaga agggaaaaca acaacaacaa 300 aaatctaaat gagaatcctg actgtttcag ctgggggtaa ggggggcgga ttattcatat 360 aattgttata ccagacggtc gcaggcttag tccaattgca gagaactcgc ttcccaggct 420 tctgagagtc ccggaagtgc ctaaacctgt ctaatcgacg gggcttgggt ggcccgtcgc 480 tccctggctt cttcccttta cccagggcgg gcagcgaagt ggtgcctcct gcgtccccca 540 caccctccct cagcccctcc cctccggccc gtcctgggca ggtgacctgg agcatccggc 600 aggctgccct ggcctcctgc gtcaggacaa cgcccacgag gggcgttact gtgcggagat 660 gcaccacgca agagacaccc tttgtaactc tcttctcctc cctagtgcga ggttaaaacc 720 ttcagcccca cgtgctgttt gcaaacctgc ctgtacctga ggccctaaaa agccagagac 780 ctcactcccg gggagccagc 800 <210> 70 <211> 800 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 tccactgcgg tcctggaaaa cccaggcttg ggcaggaaac tctctgactt tggacaggtg 60 agccacggca gcctgagctg ctcagttagg ggaatttggg cctccagaga aagagatccg 120 aagactgctg gtgcttcctg gtttcataag ctcagtaaga agtctgaatt cgttggaagc 180 tgatgagaat atccaggaag tcaacagaca aatgtcctca acaattgttt ctaagtagga 240 gaacatctgt cctcggtggc tttcacagga atgaatgacc attgctttag ggggttgggg 300 atctggcctc cagaactgcc accaattagc tgtgtgtctt tggacaagtt actgtccctc 360 tctgttgtct gtttactctt ctgtacactg aaggggctgg tccctaatga tctgggatgg 420 gatgtggaat ccttctagat ttcttttgta atatttataa agtgctctca gcaaggtatc 480 aaaatggcaa aattgtgagt aactatcctc ctttcatttt gggaagaaga tgaggcatga 540 agagaattca gacagaaact tactcagacc aggggaggca gaaactaagc agagaggaaa 600 atgaccaaga gttagccctg ggcatggaat gtgaaagaac cctaaacgtg acttggaaat 660 aatgcccaag gtatattcca ttctccggga tttgttggca ttttcttgag gtgaagaatt 720 gcagaataca ttctttaatg tgacctacat atttacccat gggaggaagt ctgctcctgg 780 actcttgaga ttcagtcata 800 <210> 71 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> targeted integration restriction cassette <400> 71 tacgtacgat cgtcga 16 <210> 72 <211> 800 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 aatggttcca aaattttcta tggttaagaa tcacctggga tggttttgaa atggcagatt 60 ctaagacaac ttgattcaac aggtttaggt aaagcccagg gaactgcatt ataagaagga 120 atcacctgta attttggagt caagatccaa ggaacactca ttgagaaaca ctgatttaca 180 aagtgcatgg agagaaatgg agcaagtgaa gggggatcag catggtgaaa tataggctgt 240 taggagtgct attgactaac tgtctggtga ctggaccaga gtaaatcttt tactttgcaa 300 gaaacaggac taaattccca tattatgtcc atagcaaagg gaattatgta gaaaaattga 360 taattaggag cctgagttct tgaccagcct ccactaccta tgtggcctca ggtgagttat 420 tttctccctt tggctctaag ttttccccat ctgtaatgta agggagttta actagatgag 480 cactaaggac aaatcaattt ctgtgagtca attattatga aataccatgt gggcatcaaa 540 tgccaagtgg aaagcataga taaagaagtg attgtgcacc tgggctgagg ggaacaaaca 600 tttcctaaga gaattgagac ccaaaagagc ctttaaggaa ggtgagatct tggaaaggga 660 aatttggtga atactctaat gaggagctaa aaaggcaaga aagaaagcag cttggctgga 720 aaggaggttc ctgtaggtgg gcctccagag attcggtacc acagaaactg ccaaacatca 780 gcaagaagcc atggggatgg 800 <210> 73 <211> 800 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 agcgtttgag ggattctaaa tagaaggaca agagtaaaaa tgtcaggctg gatcgatgca 60 ggccactaag aaatggattc aggtgatggc agtgggaaga aaggacctga tgcccagagg 120 catttctgga gaagatgaga 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silently altered coding sequence (human HBB first intron) <400> 80 atgtccaccg ctgtgctgga gaaccctggg ctggggagga aactgtcaga cttcgggcag 60 gagacttcat acattgagga taactgtaac cagaatggcg ccatctctct gatcttcagc 120 ctgaaggagg aagtgggcgc cctggcaaag gtgctgcgcc tgtttgagga gaacgacgtg 180 aatctgaccc acatcgagtc ccggccttct agactgaaga aggacgagta cgagttcttt 240 acccacctgg ataagcggtc cctgccagcc ctgacaaaca tcatcaagat cctgaggcac 300 gacatcggag caaccgtgca cgagctgtct cgggacaaga agaaggatac cgtgccctgg 360 ttccctcgga caatccagga gctggataga tttgccaacc agatcctgtc ttacggagca 420 gagctggacg cagatcaccc tggcttcaag gacccagtgt atcgggcccg gagaaagcag 480 tttgccgata tcgcctacaa ttataggcac ggacagccaa tccctcgcgt ggagtatatg 540 gaggaggaga agaagacctg gggcacagtg ttcaagaccc tgaagagcct gtacaagaca 600 cacgcctgct acgagtataa ccacatcttc cccctgctgg agaagtattg tggctttcac 660 gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg agccagttcc tgcagacctg cacaggcttt 720 aggctgaggc cagtggcagg actgctgagc tcccgggact tcctgggagg actggccttc 780 agagtgtttc actgcaccca gtacatcagg cacggctcca agccaatgta tacaccagag 840 cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt ttagcgatag atccttcgcc 900 cagttttccc aggttggtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca atagaaactg 960 ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg cactgactct ctctgcctat 1020 tggtctattt tcccaccctt aggagatcgg actggcatct ctgggagcac ctgacgagta 1080 catcgagaag ctggccacca tctattggtt cacagtggag tttggcctgt gcaagcaggg 1140 cgatagcatc aaggcctacg gagcaggact gctgtctagc ttcggcgagc tgcagtattg 1200 tctgtccgag aagccaaagc tgctgcccct ggagctggag aagaccgcca tccagaacta 1260 caccgtgaca gagttccagc ccctgtacta tgtggccgag tcttttaacg atgccaagga 1320 gaaggtgaga aatttcgccg ccacaatccc taggcccttc agcgtgcggt acgaccctta 1380 tacccagagg atcgaggtgc tggataatac acagcagctg aagatcctgg ctgactcaat 1440 caatagcgaa atcggaatcc tgtgctccgc cctgcagaaa atcaaatga 1489 <210> 81 <211> 1475 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH intron-inserted silently altered coding sequence (mouse HBB first intron) <400> 81 atgtccaccg ctgtgctgga gaaccctggg ctggggagga aactgtcaga cttcgggcag 60 gagacttcat acattgagga taactgtaac cagaatggcg ccatctctct gatcttcagc 120 ctgaaggagg aagtgggcgc cctggcaaag gtgctgcgcc tgtttgagga gaacgacgtg 180 aatctgaccc acatcgagtc ccggccttct agactgaaga aggacgagta cgagttcttt 240 acccacctgg ataagcggtc cctgccagcc ctgacaaaca tcatcaagat cctgaggcac 300 gacatcggag caaccgtgca cgagctgtct cgggacaaga agaaggatac cgtgccctgg 360 ttccctcgga caatccagga gctggataga tttgccaacc agatcctgtc ttacggagca 420 gagctggacg cagatcaccc tggcttcaag gacccagtgt atcgggcccg gagaaagcag 480 tttgccgata tcgcctacaa ttataggcac ggacagccaa tccctcgcgt ggagtatatg 540 gaggaggaga agaagacctg gggcacagtg ttcaagaccc tgaagagcct gtacaagaca 600 cacgcctgct acgagtataa ccacatcttc cccctgctgg agaagtattg tggctttcac 660 gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg agccagttcc tgcagacctg cacaggcttt 720 aggctgaggc cagtggcagg actgctgagc tcccgggact tcctgggagg actggccttc 780 agagtgtttc actgcaccca gtacatcagg cacggctcca agccaatgta tacaccagag 840 cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt ttagcgatag atccttcgcc 900 cagttttccc aggttggtat ccaggttaca aggcagctca caagaagaag ttgggtgctt 960 ggagacagag gtctgctttc cagcagacac taactttcag tgtcccctgt ctatgtttcc 1020 ctttttagga gatcggactg gcatctctgg gagcacctga cgagtacatc gagaagctgg 1080 ccaccatcta ttggttcaca gtggagtttg gcctgtgcaa gcagggcgat agcatcaagg 1140 cctacggagc aggactgctg tctagcttcg gcgagctgca gtattgtctg tccgagaagc 1200 caaagctgct gcccctggag ctggagaaga ccgccatcca gaactacacc gtgacagagt 1260 tccagcccct gtactatgtg gccgagtctt ttaacgatgc caaggagaag gtgagaaatt 1320 tcgccgccac aatccctagg cccttcagcg tgcggtacga cccttatacc cagaggatcg 1380 aggtgctgga taatacacag cagctgaaga tcctggctga ctcaatcaat agcgaaatcg 1440 gaatcctgtg ctccgccctg cagaaaatca aatga 1475 <210> 82 <211> 1451 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH intron-inserted silently altered coding sequence (MVM intron) <400> 82 atgtccaccg ctgtgctgga gaaccctggg ctggggagga aactgtcaga cttcgggcag 60 gagacttcat acattgagga taactgtaac cagaatggcg ccatctctct gatcttcagc 120 ctgaaggagg aagtgggcgc cctggcaaag gtgctgcgcc tgtttgagga gaacgacgtg 180 aatctgaccc acatcgagtc ccggccttct agactgaaga aggacgagta cgagttcttt 240 acccacctgg ataagcggtc cctgccagcc ctgacaaaca tcatcaagat cctgaggcac 300 gacatcggag caaccgtgca cgagctgtct cgggacaaga agaaggatac cgtgccctgg 360 ttccctcgga caatccagga gctggataga tttgccaacc agatcctgtc ttacggagca 420 gagctggacg cagatcaccc tggcttcaag gacccagtgt atcgggcccg gagaaagcag 480 tttgccgata tcgcctacaa ttataggcac ggacagccaa tccctcgcgt ggagtatatg 540 gaggaggaga agaagacctg gggcacagtg ttcaagaccc tgaagagcct gtacaagaca 600 cacgcctgct acgagtataa ccacatcttc cccctgctgg agaagtattg tggctttcac 660 gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg agccagttcc tgcagacctg cacaggcttt 720 aggctgaggc cagtggcagg actgctgagc tcccgggact tcctgggagg actggccttc 780 agagtgtttc actgcaccca gtacatcagg cacggctcca agccaatgta tacaccagag 840 cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt ttagcgatag atccttcgcc 900 cagttttccc agaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt 960 aattacctgg agcacctgcc 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tcatcaagat cctgaggcac 300 gacatcggag caaccgtgca cgagctgtct cgggacaaga agaaggatac cgtgccctgg 360 ttccctcgga caatccagga gctggataga tttgccaacc agatcctgtc ttacggagca 420 gagctggacg cagatcaccc tggcttcaag gacccagtgt atcgggcccg gagaaagcag 480 tttgccgata tcgcctacaa ttataggcac ggacagccaa tccctcgcgt ggagtatatg 540 gaggaggaga agaagacctg gggcacagtg ttcaagaccc tgaagagcct gtacaagaca 600 cacgcctgct acgagtataa ccacatcttc cccctgctgg agaagtattg tggctttcac 660 gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg agccagttcc tgcagacctg cacaggcttt 720 aggctgaggc cagtggcagg actgctgagc tcccgggact tcctgggagg actggccttc 780 agagtgtttc actgcaccca gtacatcagg cacggctcca agccaatgta tacaccagag 840 cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt ttagcgatag atccttcgcc 900 cagttttccc aggagatcgg actggcatct ctgggagcac ctgacgagta catcgagaag 960 ctggccacca tctattggtt cacagtggag tttggcctgt gcaagcaggg cgatagcatc 1020 aaggcctacg gagcaggact gctgtctagc ttcggcgagc tgcagtattg tctgtccgag 1080 aagccaaagc tgctgcccct ggagctggag aagaccgcca tccagaacta 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attttggagt caagatccaa ggaacactca ttgagaaaca ctgatttaca 180 aagtgcatgg agagaaatgg agcaagtgaa gggggatcag catggtgaaa tataggctgt 240 taggagtgct attgactaac tgtctggtga ctggaccaga gtaaatcttt tactttgcaa 300 gaaacaggac taaattccca tattatgtcc atagcaaagg gaattatgta gaaaaattga 360 taattaggag cctgagttct tgaccagcct ccactaccta tgtggcctca ggtgagttat 420 tttctccctt tggctctaag ttttccccat ctgtaatgta agggagttta actagatgag 480 cactaaggac aaatcaattt ctgtgagtca attattatga aataccatgt gggcatcaaa 540 tgccaagtgg aaagcataga taaagaagtg attgtgcacc tgggctgagg ggaacaaaca 600 tttcctaaga gaattgagac ccaaaagagc ctttaaggaa ggtgagatct tggaaaggga 660 aatttggtga atactctaat gaggagctaa aaaggcaaga aagaaagcag cttggctgga 720 aaggaggttc ctgtaggtgg gcctccagag attcggtacc acagaaactg ccaaacatca 780 gcaagaagcc atggggatgg aagcttctga cctcttctct tcctcccaca gggcggtacc 840 agatctggca gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 900 cccggcccta ggggtaccat gtccaccgct gtgctggaga accctgggct ggggaggaaa 960 ctgtcagact tcgggcagga 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atgaagagaa 480 tttggggggg gggacttact cagaaccaag gagggagaaa ttaaacagag agggaaatga 540 acaggagtta gcccggagcc tgaagcacct tggggattat gctgggggtg gagggaatcc 600 attgtcctcc ctagggaggg cttgcagaac atgttctttt ctgtgatatt tgtactttcc 660 ccagattgca aatcatggtt tgtacactga gattcagtct ctggaggtaa tatgcctttt 720 ctagcttttc cttggacagg actaaggggt tgagggttgc ctggagtcag agaaatttgt 780 gttaaagaag gttgatatga 800 <210> 113 <211> 3227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 006 vector correction genome <400> 113 agcattagct tccatttatg cagtgtaaat ggtgagaaca gccccgactg aatacccaga 60 gcatcatctc gtctgtgtca ttcatgcaca taacatatct cagcgaggtg gcccttctgt 120 cctctttgca gagacccagc caccatacta gtacctagag aactggctgg atttcagccc 180 cgatacctcc gggcttttgc tcatgttcgc ctcatagggt catctgggtg gttgcctaag 240 gaaaagtatg tcatggagac taacttgctt ggcattgaat aaaaggtgag ttgagagtgg 300 agcgtgttta aattgcaatc ctgcctctat ttctgtgctt gcagggaaca gtcatcctta 360 attgctatcc tccatcatca tcatgattat ttctggtttt tctctggttg cggagaatcc 420 atactccagg tattccaatg tctcagcatt gccaggcctg tctgagcgtc aggatgtagg 480 tagtctgggc tctctgcctt ctattcttgt ccaggatact ctgccaaaag aatcatgttg 540 tggctgccac ccctcccaca aagcctcccg cttgggtcag tccaggactg gagttgggta 600 tggactgttc atgtctatcc actgctacgt cagggcaaca cccactgaga gtgaccttgt 660 agactgcagt gggagacacc cttcaaaacc tctcctctcc tgtcctgaga gccaggttaa 720 aaccatcagc cccgcatcct gagtgcaaac ttttcctaac cctgctgcta agctagacac 780 ctcacttact gagagccagc atgtccaccg ctgtgctgga gaaccctggg ctggggagga 840 aactgtcaga cttcgggcag gagacttcat acattgagga taactgtaac cagaatggcg 900 ccatctctct gatcttcagc ctgaaggagg aagtgggcgc cctggcaaag gtgctgcgcc 960 tgtttgagga gaacgacgtg aatctgaccc acatcgagtc ccggccttct agactgaaga 1020 aggacgagta cgagttcttt acccacctgg ataagcggtc cctgccagcc ctgacaaaca 1080 tcatcaagat cctgaggcac gacatcggag caaccgtgca cgagctgtct cgggacaaga 1140 agaaggatac cgtgccctgg ttccctcgga caatccagga gctggataga tttgccaacc 1200 agatcctgtc ttacggagca gagctggacg cagatcaccc tggcttcaag gacccagtgt 1260 atcgggcccg gagaaagcag tttgccgata tcgcctacaa ttataggcac ggacagccaa 1320 tccctcgcgt ggagtatatg gaggaggaga agaagacctg gggcacagtg ttcaagaccc 1380 tgaagagcct gtacaagaca cacgcctgct acgagtataa ccacatcttc cccctgctgg 1440 agaagtattg tggctttcac gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg agccagttcc 1500 tgcagacctg cacaggcttt aggctgaggc cagtggcagg actgctgagc tcccgggact 1560 tcctgggagg actggccttc agagtgtttc actgcaccca gtacatcagg cacggctcca 1620 agccaatgta tacaccagag cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt 1680 ttagcgatag atccttcgcc cagttttccc aggagatcgg actggcatct ctgggagcac 1740 ctgacgagta catcgagaag ctggccacca tctattggtt cacagtggag tttggcctgt 1800 gcaagcaggg cgatagcatc aaggcctacg gagcaggact gctgtctagc ttcggcgagc 1860 tgcagtattg tctgtccgag aagccaaagc tgctgcccct ggagctggag aagaccgcca 1920 tccagaacta caccgtgaca gagttccagc ccctgtacta tgtggccgag tcttttaacg 1980 atgccaagga gaaggtgaga aatttcgccg ccacaatccc taggcccttc agcgtgcggt 2040 acgaccctta tacccagagg atcgaggtgc tggataatac acagcagctg aagatcctgg 2100 ctgactcaat caatagcgaa atcggaatcc tgtgctccgc cctgcagaaa atcaaatgag 2160 aattcaaggc ctctcgagcc tctagaacta tagtgagtcg tattacgtag atccagacat 2220 gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt 2280 tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca 2340 agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 2400 tttttaagct ttacgtacga tcgtcgagca gctgttgtcc tggagaacgg agtcctgagc 2460 agaaaactct cagactttgg gcaggtaagc ctgttgggct tccactgcta ggagagaatt 2520 ggttccccac atgtgaaagc agtctgggaa atgctggtat ttccagtctc ctaaggctac 2580 taagaaatat gactttattt agaggcgagg aaaatgccca ggaagtcaac tgatgagact 2640 agtcttaaca agttgaggat acagaaagtt ggggatctga gctgctacca acatctgtgt 2700 gtctttgggt ggctcattgg tatcctctgc ctattggctt tatcttctgt acactgaaag 2760 gaaatggctg gtccttagtc acctggggtg ggagtcccta tctctccagg gatacttatt 2820 caatcctttc ttctgggtat caaaatgaca agcttgtaag aaactgtcct ctttcggctt 2880 tcaggaggtg atgtcgcatg aagagaattt gggggggggg acttactcag aaccaaggag 2940 ggagaaatta aacagagagg 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gtggccgagt cttttaacga tgccaaggag aaggtgagaa atttcgccgc 2220 cacaatccct aggcccttca gcgtgcggta cgacccttat acccagagga tcgaggtgct 2280 ggataataca cagcagctga agatcctggc tgactcaatc aatagcgaaa tcggaatcct 2340 gtgctccgcc ctgcagaaaa tcaaatgaga attcaaggcc tctcgagcct ctagaactat 2400 agtgagtcgt attacgtaga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 2460 acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 2520 tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 2580 tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaagctt tacgtacgat cgtcgagcag 2640 ctgttgtcct ggagaacgga gtcctgagca gaaaactctc agactttggg caggtaagcc 2700 tgttgggctt ccactgctag gagagaattg gttccccaca tgtgaaagca gtctgggaaa 2760 tgctggtatt tccagtctcc taaggctact aagaaatatg actttattta gaggcgagga 2820 aaatgcccag gaagtcaact gatgagacta gtcttaacaa gttgaggata cagaaagttg 2880 gggatctgag ctgctaccaa catctgtgtg tctttgggtg gctcattggt atcctctgcc 2940 tattggcttt atcttctgta cactgaaagg aaatggctgg tccttagtca cctggggtgg 3000 gagtccctat ctctccaggg atacttattc aatcctttct tctgggtatc aaaatgacaa 3060 gcttgtaaga aactgtcctc tttcggcttt caggaggtga tgtcgcatga agagaatttg 3120 ggggggggga cttactcaga accaaggagg gagaaattaa acagagaggg aaatgaacag 3180 gagttagccc ggagcctgaa gcaccttggg gattatgctg ggggtggagg gaatccattg 3240 tcctccctag ggagggcttg cagaacatgt tcttttctgt gatatttgta ctttccccag 3300 attgcaaatc atggtttgta cactgagatt cagtctctgg aggtaatatg ccttttctag 3360 cttttccttg gacaggacta aggggttgag ggttgcctgg agtcagagaa atttgtgtta 3420 aagaaggttg atatgacctg caggtctaga tacgtagata agtagcatgg cgggttaatc 3480 attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 3540 ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 3600 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 3635 <210> 115 <211> 960 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta gctgtagttt 120 tctgaagtca gcgcacagca aggcagtgtg cttagaggtt aacagaaggg aaaacaacaa 180 caacaaaaat ctaaatgaga atcctgactg tttcagctgg gggtaagggg ggcggattat 240 tcatataatt gttataccag acggtcgcag gcttagtcca attgcagaga actcgcttcc 300 caggcttctg agagtcccgg aagtgcctaa acctgtctaa tcgacggggc ttgggtggcc 360 cgtcgctccc tggcttcttc cctttaccca gggcgggcag cgaagtggtg cctcctgcgt 420 cccccacacc ctccctcagc ccctcccctc cggcccgtcc tgggcaggtg acctggagca 480 tccggcaggc tgccctggcc tcctgcgtca ggacaacgcc cacgaggggc gttactgtgc 540 ggagatgcac cacgcaagag acaccctttg taactctctt ctcctcccta gtgcgaggtt 600 aaaaccttca gccccacgtg ctgtttgcaa acctgcctgt acctgaggcc ctaaaaagcc 660 agagacctca ctcccgggga gccagcatgt ccactgcggt cctggaaaac ccaggcttgg 720 gcaggaaact ctctgacttt ggacaggtga gccacggcag cctgagctgc tcagttaggg 780 gaatttgggc ctccagagaa agagatctga agactgctgg tgcttcctgg tttcataagc 840 tcagtaagaa gtctgaattc gttggaagct gatgagaata tccaggaagt caacagacaa 900 atgtcctcaa caattgtttc taagtaggag aacatctgtc ctcggtggct ttcacaggaa 960 <210> 116 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silently altered PAH coding sequence <400> 116 tccaccgctg tgctggagaa ccctgggctg gggaggaaac tgtcagactt cgggcaggag 60 acttcataca ttgaggataa ctgtaaccag aatggcgcca tctctctgat cttcagcctg 120 aaggaggaag tgggcgccct ggcaaaggtg ctgcgcctgt ttgaggagaa cgacgtgaat 180 ctgacccaca tcgagtcccg gccttctaga ctgaagaagg acgagtacga gttctttacc 240 cacctggata agcggtccct gccagccctg acaaacatca tcaagatcct gaggcacgac 300 atcggagcaa ccgtgcacga gctgtctcgg gacaagaaga aggataccgt gccctggttc 360 cctcggacaa tccaggagct ggatagattt gccaaccaga tcctgtctta cggagcagag 420 ctggacgcag atcaccctgg cttcaaggac ccagtgtatc gggcccggag aaagcagttt 480 gccgatatcg cctacaatta taggcacgga cagccaatcc ctcgcgtgga gtatatggag 540 gaggagaaga agacctgggg cacagtgttc aagaccctga agagcctgta caagacacac 600 gcctgctacg agtataacca catcttcccc ctgctggaga agtattgtgg ctttcacgag 660 gacaatatcc ctcagctgga ggacgtgagc cagttcctgc agacctgcac aggctttagg 720 ctgaggccag tggcaggact gctgagctcc cgggacttcc tgggaggact ggccttcaga 780 gtgtttcact gcacccagta catcaggcac ggctccaagc 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tatattccat tctccgggat ttgttggcat tttcttgagg 300 tgaagaattg cagaatacat tctttaatgt gacctacata tttacccatg ggaggaagtc 360 tgctcctgga ctcttgagat tcagtcataa agcccaggcc agggaaataa tgtaagtctg 420 caggcccctg tcatcagtag gattagggag aagagttctc agtagaaaac agggaggctg 480 gagagaaaag aatggttaat gttaacgtta atataactag aaagactgca gaacttagga 540 ctgattttta tttgaatcct taaaaaaaaa atttcttatg aaaatagtac atggctctta 600 ggagacagaa cttattgtac agaggaacag cgtgagagtc agagtgatcc cagaacaggt 660 cctggctcca tcctgcacat agttttggtg ctgctggcaa tacggtcccc acaactgtgg 720 gaaggggtta ggggcaggga tctcatcagg aaagcatagg ggtttaaagt tctttataga 780 gcacttagaa gattgagaat ccacaaatta tattaataac aaacaaagta gtgtcgtgtt 840 atatagtaaa tgtgaatttg cagacacatt tagggaaaag ttataattaa aaaaataggc 900 tgtatatata 910 <210> 118 <211> 3713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 032 correction vector genome <400> 118 gcttcaggag cagttgtgcg aatagctgga gaacaccagg ctggatttaa acccagatcg 60 ctcttacatt tgctctttac ctgctgtgct cagcgttcac gtgccctcta 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ctctgggagc 2220 acctgacgag tacatcgaga agctggccac catctattgg ttcacagtgg agtttggcct 2280 gtgcaagcag ggcgatagca tcaaggccta cggagcagga ctgctgtcta gcttcggcga 2340 gctgcagtat tgtctgtccg agaagccaaa gctgctgccc ctggagctgg agaagaccgc 2400 catccagaac tacaccgtga cagagttcca gcccctgtac tatgtggccg agtcttttaa 2460 cgatgccaag gagaaggtga gaaatttcgc cgccacaatc cctaggccct tcagcgtgcg 2520 gtacgaccct tatacccaga ggatcgaggt gctggataat acacagcagc tgaagatcct 2580 ggctgactca atcaatagcg aaatcggaat cctgtgctcc gccctgcaga aaatcaaagg 2640 taagcctatc cctaaccctc tcctcggtct cgattctacg tgatcttgtg gaaaggacga 2700 aacaccgggg aattcaaggc ctctcgagcc tctagaatcc ccgagacgtt tcgtctcggg 2760 atcactatag tgagtcgtat tacgtacaca gtgcagggga aagaatagta gagatccaga 2820 catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 2880 ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa 2940 acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga 3000 ggttttttaa ctgggatggg atgtggaatc cttctagatt tcttttgtaa 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gcctggggtg 420 agctcatcac ctctggttcc tcagtgcaag gcactaaagt ctcttggcac tgagttctta 480 caacttgttc caggggatat ttggtggttg atggtcacca cccatgtgtc atggtccctg 540 agcatccccc gccaccccac tgctccctat tttggcagtt actgtcaccc tctagggatg 600 cagggatgca gtttacctat ctagagtgcg gtgatcaggt ggggaagtac aaatggcaat 660 tgacagctag agagcttgaa accctcccac ttggctctgc tcaccctgga ctctgggaga 720 cctcagctgc ccagcagtgg aggctggggc agcagagggg ccagacctgg gagcccagaa 780 gcctggatct gagtctgact cactgctgac ctttgacccc tggaggcttg ggcaagctga 840 ggaacttctc tggtcttaat cctgtgggtg actgaccatg ccttcttctt tttcctacag 900 <210> 131 <211> 1977 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 006-HCR vector PAH coding sequence <400> 131 atgtccaccg ctgtgctgga gaaccctggg ctggggagga aactgtcaga cttcgggcag 60 gtaagtttta tggaatgtga atcataattc aatttttcaa catgcgttag gagggacatt 120 tcaaactctt ttttacccta gactttccta ccatcaccca gagtatccag ccaggagggg 180 aggggctaga gacaccagaa gtttagcagg gaggagggcg tagggattcg gggaatgaag 240 ggatgggatt cagactaggg ccaggaccca 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actgcaccca gtacatcagg cacggctcca agccaatgta tacaccagag 840 cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt ttagcgatag atccttcgcc 900 cagttttccc aggagatcgg actggcatct ctgggagcac ctgacgagta catcgagaag 960 ctggccacca tctattggtt cacagtggag tttggcctgt gcaagcaggg cgatagcatc 1020 aaggcctacg gagcaggact gctgtctagc ttcggcgagc tgcagtattg tctgtccgag 1080 aagccaaagc tgctgcccct ggagctggag aagaccgcca tccagaacta caccgtgaca 1140 gagttccagc ccctgtacta tgtggccgag tcttttaacg atgccaagga gaaggtgaga 1200 aatttcgccg ccacaatccc taggcccttc agtgtgcgtt acgaccctta tacccagagg 1260 atcgaggtgc tggataatac acagcagctg aagatcctgg ctgactcaat caatagcgaa 1320 atcggaatcc tgtgctccgc cctgcagaaa atcaaatga 1359 <210> 139 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 032-SD.3 vector PAH coding sequence <400> 139 tccaccgctg tgctggagaa ccctgggctg gggaggaaac tgtcagactt cgggcaggag 60 acttcataca ttgaggataa ctgtaaccag aatggcgcca tctctctgat cttcagcctg 120 aaggaggaag tgggcgccct ggcaaaggtg ctgcgcctgt ttgaggagaa cgacgtgaat 180 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gaggagaaga agacctgggg cacagtgttc aagaccctga agagcctgta 1320 caagacacac gcctgctacg agtataacca catcttcccc ctgctggaga agtattgtgg 1380 ctttcacgag gacaatatcc ctcagctgga ggacgtgagc cagttcctgc agacctgcac 1440 aggctttagg ctgaggccag tggcaggact gctgagctcc cgggacttcc tgggaggact 1500 ggccttcaga gtgtttcact gcacccagta catcaggcac ggctccaagc caatgtatac 1560 accagagccc gacatctgtc acgagctgct gggccacgtg cccctgttta gcgatagatc 1620 cttcgcccag ttttcccagg agatcggact ggcatctctg ggagcacctg acgagtacat 1680 cgagaagctg gccaccatct attggttcac agtggagttt ggcctgtgca agcagggcga 1740 tagcatcaag gcctacggag caggactgct gtctagcttc ggcgagctgc agtattgtct 1800 gtccgagaag ccaaagctgc tgcccctgga gctggagaag accgccatcc agaactacac 1860 cgtgacagag ttccagcccc tgtactatgt ggccgagtct tttaacgatg ccaaggagaa 1920 ggtgagaaat ttcgccgcca caatccctag gcccttcagc gtgcggtacg acccttatac 1980 ccagaggatc gaggtgctgg ataatacaca gcagctgaag atcctggctg actcaatcaa 2040 tagcgaaatc ggaatcctgt gctccgccct gcagaaaatc aaaggtaagc ctatccctaa 2100 ccctctcctc ggtctcgatt ctacgtgatc ttgtggaaag gacgaaacac cggggaattc 2160 aaggcctctc gagcctctag aatccccgag acgtttcgtc tcgggatcac tatagtgagt 2220 cgtattacgt acacagtgca ggggaaagaa tagtagagat ccagacatga taagatacat 2280 tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 2340 ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 2400 caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaa 2455 <210> 151 <211> 1723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 006-HBB1 vector editing element <400> 151 atgtccaccg ctgtgctgga gaaccctggg ctggggagga aactgtcaga cttcgggcag 60 gagacttcat acattgagga taactgtaac cagaatggcg ccatctctct gatcttcagc 120 ctgaaggagg aagtgggcgc cctggcaaag gtgctgcgcc tgtttgagga gaacgacgtg 180 aatctgaccc acatcgagtc ccggccttct agactgaaga aggacgagta cgagttcttt 240 acccacctgg ataagcggtc cctgccagcc ctgacaaaca tcatcaagat cctgaggcac 300 gacatcggag caaccgtgca cgagctgtct cgggacaaga agaaggatac cgtgccctgg 360 ttccctcgga caatccagga gctggataga tttgccaacc agatcctgtc 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tccagcccct gtactatgtg gccgagtctt ttaacgatgc caaggagaag gtgagaaatt 1320 tcgccgccac aatccctagg cccttcagcg tgcggtacga cccttatacc cagaggatcg 1380 aggtgctgga taatacacag cagctgaaga tcctggctga ctcaatcaat agcgaaatcg 1440 gaatcctgtg ctccgccctg cagaaaatca aatgagaatt caaggcctct cgagcctcta 1500 gaactatagt gagtcgtatt acgtagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg 1560 acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat 1620 tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca 1680 ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taa 1723 <210> 152 <211> 1607 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 006-SD.3 vector editing element <400> 152 atgtccaccg ctgtgctgga gaaccctggg ctggggagga aactgtcaga cttcgggcag 60 gagacttcat acattgagga taactgtaac cagaatggcg ccatctctct gatcttcagc 120 ctgaaggagg aagtgggcgc cctggcaaag gtgctgcgcc tgtttgagga gaacgacgtg 180 aatctgaccc acatcgagtc ccggccttct agactgaaga aggacgagta cgagttcttt 240 acccacctgg ataagcggtc cctgccagcc ctgacaaaca tcatcaagat cctgaggcac 300 gacatcggag caaccgtgca cgagctgtct cgggacaaga agaaggatac cgtgccctgg 360 ttccctcgga caatccagga gctggataga tttgccaacc agatcctgtc ttacggagca 420 gagctggacg cagatcaccc tggcttcaag gacccagtgt atcgggcccg gagaaagcag 480 tttgccgata tcgcctacaa ttataggcac ggacagccaa tccctcgcgt ggagtatatg 540 gaggaggaga agaagacctg gggcacagtg ttcaagaccc tgaagagcct gtacaagaca 600 cacgcctgct acgagtataa ccacatcttc cccctgctgg agaagtattg tggctttcac 660 gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg agccagttcc tgcagacctg cacaggcttt 720 aggctgaggc cagtggcagg actgctgagc tcccgggact tcctgggagg actggccttc 780 agagtgtttc actgcaccca gtacatcagg cacggctcca agccaatgta tacaccagag 840 cccgacatct gtcacgagct gctgggccac gtgcccctgt ttagcgatag atccttcgcc 900 cagttttccc aggagatcgg actggcatct ctgggagcac ctgacgagta catcgagaag 960 ctggccacca tctattggtt cacagtggag tttggcctgt gcaagcaggg cgatagcatc 1020 aaggcctacg gagcaggact gctgtctagc ttcggcgagc tgcagtattg tctgtccgag 1080 aagccaaagc tgctgcccct ggagctggag aagaccgcca tccagaacta caccgtgaca 1140 gagttccagc ccctgtacta tgtggccgag tcttttaacg atgccaagga gaaggtgaga 1200 aatttcgccg ccacaatccc taggcccttc agtgtgcgtt acgaccctta tacccagagg 1260 atcgaggtgc tggataatac acagcagctg aagatcctgg ctgactcaat caatagcgaa 1320 atcggaatcc tgtgctccgc cctgcagaaa atcaaatgag aattcaaggc ctctcgagcc 1380 tctagaacta tagtgagtcg tattacgtag atccagacat gataagatac attgatgagt 1440 ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg 1500 ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca 1560 ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaa 1607 <210> 153 <211> 1837 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 032-SD.3 vector editing element <400> 153 ctgacctctt ctcttcctcc cacagggcgg taccagatct ggcagcggag agggcagagg 60 aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctaggggta cctccaccgc 120 tgtgctggag aaccctgggc tggggaggaa actgtcagac ttcgggcagg agacttcata 180 cattgaggat aactgtaacc agaatggcgc catctctctg atcttcagcc tgaaggagga 240 agtgggcgcc ctggcaaagg tgctgcgcct gtttgaggag aacgacgtga atctgaccca 300 catcgagtcc cggccttcta gactgaagaa ggacgagtac gagttcttta cccacctgga 360 taagcggtcc ctgccagccc tgacaaacat catcaagatc ctgaggcacg acatcggagc 420 aaccgtgcac gagctgtctc gggacaagaa gaaggatacc gtgccctggt tccctcggac 480 aatccaggag ctggatagat ttgccaacca gatcctgtct tacggagcag agctggacgc 540 agatcaccct ggcttcaagg acccagtgta tcgggcccgg agaaagcagt ttgccgatat 600 cgcctacaat tataggcacg gacagccaat ccctcgcgtg gagtatatgg aggaggagaa 660 gaagacctgg ggcacagtgt tcaagaccct gaagagcctg tacaagacac acgcctgcta 720 cgagtataac cacatcttcc ccctgctgga gaagtattgt ggctttcacg aggacaatat 780 ccctcagctg gaggacgtga gccagttcct gcagacctgc acaggcttta ggctgaggcc 840 agtggcagga ctgctgagct cccgggactt cctgggagga ctggccttca gagtgtttca 900 ctgcacccag tacatcaggc acggctccaa gccaatgtat acaccagagc ccgacatctg 960 tcacgagctg ctgggccacg tgcccctgtt tagcgataga tccttcgccc agttttccca 1020 ggagatcgga ctggcatctc tgggagcacc tgacgagtac atcgagaagc tggccaccat 1080 ctattggttc acagtggagt ttggcctgtg caagcagggc gatagcatca aggcctacgg 1140 agcaggactg ctgtctagct tcggcgagct gcagtattgt ctgtccgaga agccaaagct 1200 gctgcccctg gagctggaga agaccgccat ccagaactac accgtgacag agttccagcc 1260 cctgtactat gtggccgagt cttttaacga tgccaaggag aaggtgagaa atttcgccgc 1320 cacaatccct aggcccttca gtgtgcgtta cgacccttat acccagagga tcgaggtgct 1380 ggataataca cagcagctga agatcctggc tgactcaatc aatagcgaaa tcggaatcct 1440 gtgctccgcc ctgcagaaaa tcaaaggtaa gcctatccct aaccctctcc tcggtctcga 1500 ttctacgtga tcttgtggaa aggacgaaac accggggaat tcaaggcctc tcgagcctct 1560 agaatccccg agacgtttcg tctcgggatc actatagtga gtcgtattac gtacacagtg 1620 caggggaaag aatagtagag atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 1680 cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 1740 atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 1800 gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaa 1837

Claims (154)

  1. 세포에서 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH) 유전자 내 돌연변이를 교정하기 위한 방법으로서, 방법은
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) (i) PAH 유전자의 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 엘리먼트; (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 5'의 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 3'의 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈
    을 포함하는 복제-결함 아데노-연관 바이러스 (AAV)로 세포를 형질도입시키는 단계를 포함하고,
    세포는 외생성 뉴클레아제 또는 외생성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 동시-형질도입 또는 동시-투여없이 형질도입되는 것인, 교정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포는 간세포, 신장 세포, 또는 뇌, 뇌하수체, 부신, 췌장, 방광, 담낭, 결장, 소장, 또는 유방의 세포인 교정 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포는 포유동물 대상체에 존재하고, AAV는 대상체의 세포를 형질도입시키는데 유효한 양으로 대상체에게 투여되는 것인 교정 방법.
  4. PAH 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 방법은
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) (i) PAH 유전자의 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 엘리먼트; (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 5'의 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 3'의 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교정 게놈,
    을 포함하는 복제-결함 AAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    외생성 뉴클레아제 또는 외생성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 대상체에게 동시-투여되지 않는 것인, 치료 방법.
  5. 제4항에 있어서, 질환 또는 장애는 페닐케톤뇨증인 치료 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인 치료 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열의 적어도 일부분을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 것인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 24에 기재된 서열을 포함하는 것인 방법.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 코딩 서열은 침묵적으로 변경되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139, 또는 143에 기재된 서열을 포함하는 것인 방법.
  13. 제7항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열을 포함하고, 임의로 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 PAH 코딩 서열에 삽입된 비천연 인트론을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 비천연 인트론은 헤모글로빈 베타 유전자의 제1 인트론 및 마우스의 미니트 바이러스 (MVM) 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 비천연 인트론은 SEQ ID NO: 28-30, 및 120-130 중 어느 하나와 적어도 90%가 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 비천연 인트론은 SEQ ID NO: 28-30, 및 120-130 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 것인 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 5'에서 3'으로 PAH 코딩 서열의 제1 부분, 인트론, 및 PAH 코딩 서열의 제2 부분을 포함하고, 제1 부분 및 제2 부분은 함께 스플라이싱될 때, 완전한 PAH 코딩 서열을 형성하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 24에 기재된 서열을 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, PAH 코딩 서열은 침묵적으로 변경되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139, 또는 143에 기재된 서열을 포함하는 것인 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것인 방법.
  24. 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 엘리먼트는 5'에서 3'으로 리보솜 스키핑 엘리먼트, 및 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열에 대해 3'에 폴리아데닐화 서열을 더 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 폴리아데닐화 서열은 외생성 폴리아데닐화 서열이고, 임의로 외생성 폴리아데닐화 서열은 SV40 폴리아데닐화 서열인 방법.
  27. 제26항에 있어서, SV40 폴리아데닐화 서열은 SEQ ID NO: 31-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손에 존재하는 것인 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손 1에 존재하는 것인 방법.
  30. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 엘리먼트는 리보솜 스키핑 엘리먼트에 대해 5'에 스플라이스 억셉터를 더 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론에 존재하는 것인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론 1에 존재하는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 35에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열은 제1 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열은 제2 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 게놈 영역은 제1 편집창에 위치하고, 제2 게놈 영역은 제2 편집창에 위치하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 36 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 게놈 영역은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 게놈 영역은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 각각은 독립적으로 약 100 내지 약 2000 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68), PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및/또는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A를 포함하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부는
    (a) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G;
    (b) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A;
    (c) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A;
    (d) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A;
    (e) PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G;
    (f) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C;
    (g) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68); 및/또는
    (h) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A
    를 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 5' 상동성 팔부는 (c) 및 (d), (f) 및 (g), 및/또는 (b) 및 (h)의 변형을 포함하는 것인 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 36-44, 111, 115, 및 142 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 45, 112, 117, 144에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46-54, 113, 118, 134, 136, 및 145 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 5'에 5' 반전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 3'에 3' 반전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 18과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 19와 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 것인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 20과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 21과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 것인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 26과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 27과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 것인 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55-63, 114, 119, 135, 137, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55-63, 114, 119, 135, 137, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드는 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 포함하는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
    (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
    (c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
    (d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
    (e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
    (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
    (c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
    (d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
    (e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 68에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 V이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인 방법.
  66. 제65항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나;
    (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Y이거나;
    (c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나;
    (d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나;
    (e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
    (f) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
    (g) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
    (h) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
    (i) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합 효율은 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에게 투여될 때 적어도 1%인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도는 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에게 투여될 때 적어도 0.5%인 방법.
  70. 복제-결함 아데노-연관 바이러스 (AAV)로서,
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) (i) PAH 유전자의 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 엘리먼트; (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'의 제1 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 5'의 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'의 제2 게놈 영역에 대해 상동성을 갖는 편집 엘리먼트의 3'의 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열를 포함하는 교정 게놈
    을 포함하는, 복제-결함 아데노-연관 바이러스 (AAV).
  71. 제70항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열의 적어도 일부분을 포함하는 것인 AAV.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열을 포함하는 것인 AAV.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 것인 AAV.
  74. 제73항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 24에 기재된 서열을 포함하는 것인 AAV.
  75. 제73항에 있어서, PAH 코딩 서열은 침묵적으로 변경되는 것인 AAV.
  76. 제75항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139, 또는 143에 기재된 서열을 포함하는 것인 AAV.
  77. 제71항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열을 포함하고, 임의로 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 PAH 코딩 서열에 삽입된 비천연 인트론을 포함하는 것인 AAV.
  78. 제77항에 있어서, 비천연 인트론은 헤모글로빈 베타 유전자의 제1 인트론 및 마우스의 미니트 바이러스 (MVM) 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 AAV.
  79. 제78항에 있어서, 비천연 인트론은 SEQ ID NO: 28-30, 및 120-130 중 어느 하나와 적어도 90%가 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  80. 제79항에 있어서, 비천연 인트론은 SEQ ID NO: 28-30, 및 120-130 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 것인 AAV.
  82. 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 인트론-삽입된 코딩 서열은 5'에서 3'으로 PAH 코딩 서열의 제1 부분, 인트론, 및 PAH 코딩 서열의 제2 부분을 포함하고, 제1 부분 및 제2 부분은 함께 스플라이싱될 때 완전한 PAH 코딩 서열을 형성하는 것인 AAV.
  83. 제82항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 24에 기재된 서열을 포함하는 것인 AAV.
  84. 제82항에 있어서, PAH 코딩 서열은 침묵적으로 변경되는 것인 AAV.
  85. 제84항에 있어서, PAH 코딩 서열은 SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139, 또는 143에 기재된 서열을 포함하는 것인 AAV.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 코딩 서열의 제1 부분은 SEQ ID NO: 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, PAH 코딩 서열의 제2 부분은 SEQ ID NO: 66 또는 67에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  88. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 엘리먼트는 5'에서 3'으로 리보솜 스키핑 엘리먼트, 및 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열을 포함하는 것인 AAV.
  89. 제88항에 있어서, 편집 엘리먼트는 PAH 코딩 서열 또는 PAH 인트론-삽입된 코딩 서열에 대해 3'에 폴리아데닐화 서열을 더 포함하는 것인 AAV.
  90. 제89항에 있어서, 폴리아데닐화 서열은 외생성 폴리아데닐화 서열이고, 임의로 외생성 폴리아데닐화 서열은 SV40 폴리아데닐화 서열인 AAV.
  91. 제90항에 있어서, SV40 폴리아데닐화 서열은 SEQ ID NO: 31-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 AAV.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손에 존재하는 것인 AAV.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 엑손 1에 존재하는 것인 AAV.
  94. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 엘리먼트는 리보솜 스키핑 엘리먼트에 대해 5'에 스플라이스 억셉터를 더 포함하는 것인 AAV.
  95. 제94항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론에 존재하는 것인 AAV.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 표적 유전자좌에 대해 5'의 뉴클레오티드는 PAH 유전자의 인트론 1에 존재하는 것인 AAV.
  97. 제70항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 엘리먼트는 SEQ ID NO: 35에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 AAV.
  98. 제70항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열은 제1 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 것인 AAV.
  99. 제70항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열은 제2 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 것인 AAV.
  100. 제70항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 게놈 영역은 제1 편집창에 위치하고, 제2 게놈 영역은 제2 편집창에 위치하는 것인 AAV.
  101. 제100항에 있어서, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 36 또는 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 편집창은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 제2 편집창은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  104. 제70항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 게놈 영역은 SEQ ID NO: 36에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  105. 제70항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 게놈 영역은 SEQ ID NO: 45에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  106. 제70항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 각각은 독립적으로 약 100개 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 AAV.
  107. 제70항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68), PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및/또는 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A를 포함하는 것인 AAV.
  108. 제70항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부는
    (a) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -2에 해당하는 C, PAH 유전자의 뉴클레오티드 4에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 6에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 7에 해당하는 G, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 9에 해당하는 G;
    (b) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -467에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -465에 해당하는 A;
    (c) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -181에 해당하는 A;
    (d) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -214에 해당하는 G, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -212에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A;
    (e) PAH 유전자의 뉴클레오티드 194에 해당하는 G;
    (f) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -433에 해당하는 C, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -432에 해당하는 C;
    (g) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -394 내지 -388에 해당하는 ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68); 및/또는
    (h) PAH 유전자의 뉴클레오티드 -341에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -339에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -225에 해당하는 A, PAH 유전자의 뉴클레오티드 -211에 해당하는 A, 및 PAH 유전자의 뉴클레오티드 -203에 해당하는 A
    를 포함하는 것인 AAV.
  109. 제108항에 있어서, 5' 상동성 팔부는 (c) 및 (d), (f) 및 (g), 및/또는 (b) 및 (h)의 변형을 포함하는 것인 AAV.
  110. 제70항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 36-44, 111, 115, 및 142 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  111. 제70항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 상동성 팔부는 SEQ ID NO: 45, 112, 117, 144에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  112. 제70항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 46-54, 113, 118, 134, 136, 및 145 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 AAV.
  113. 제70항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 5' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 5'에 5' 반전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 3' 상동성 팔부 뉴클레오티드 서열의 3'에 3' 반전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 AAV.
  114. 제113항에 있어서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 18과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 19와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 AAV.
  115. 제113항에 있어서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 20과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 21과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 AAV.
  116. 제113항에 있어서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 26과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 27과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 AAV.
  117. 제70항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55-63, 114, 119, 135, 137, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 AAV.
  118. 제70항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 게놈은 SEQ ID NO: 55-63, 114, 119, 135, 137, 및 146 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 AAV.
  119. 제70항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드는 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 포함하는 것인 AAV.
  120. 제70항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV.
  121. 제120항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인 AAV.
  122. 제121항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
    (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
    (c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
    (d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
    (e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C인 AAV.
  123. 제121항에 있어서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV.
  124. 제70항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV.
  125. 제124항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인 AAV.
  126. 제125항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
    (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
    (c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
    (d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
    (e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C인 AAV.
  127. 제125항에 있어서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV.
  128. 제70항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 분기군 F 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV.
  129. 제128항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 68에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 V이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 151에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 160에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 206에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 590에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인 AAV.
  130. 제129항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 2에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 312에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나;
    (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 65에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Y이거나;
    (c) SEQ ID NO: 2의 아미노산 77에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 690에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나;
    (d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 119에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 468에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나;
    (e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 626에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 718에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나;
    (f) SEQ ID NO: 2의 아미노산 296에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 464에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 681에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나;
    (g) SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 687에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나;
    (h) SEQ ID NO: 2의 아미노산 346에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는
    (i) SEQ ID NO: 2의 아미노산 501에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 505에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 706에 해당하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C인 AAV.
  131. 제129항에 있어서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV.
  132. 제70항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합 효율은 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에게 투여될 때 적어도 1%인 AAV.
  133. 제70항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자좌로 편집 엘리먼트의 통합의 대립유전자 빈도는 AAV가 표준 AAV 투여 조건 하에서 외생성 뉴클레아제의 부재 하에 인간 간세포가 이식된 마우스에게 투여될 때 적어도 0.5%인 AAV.
  134. 제70항 내지 제133항 중 어느 한 항의 AAV를 포함하는 약학 조성물.
  135. 복제-결함 AAV의 재조합 제조를 위한 패키징 시스템으로서, 패키징 시스템은
    (a) 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열;
    (b) 제119항 내지 제131항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AAV 분기군 F 캡시드 단백질을 코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열; 및
    (c) 제70항 내지 제118항, 제132항, 및 제133항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 교정 게놈을 포함하고,
    패키징 시스템은 AAV를 형성하도록 캡시드에 교정 게놈을 밀봉시키기 위해 세포에서 작동되는 것인 패키징 시스템.
  136. 제135항에 있어서, 패키징 시스템은 Rep 뉴클레오티드 서열 및 Cap 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 교정 게놈을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 것인 패키징 시스템.
  137. 제135항 또는 제136항에 있어서, Rep 뉴클레오티드 서열은 AAV2 Rep 단백질을 코딩하는 것인 패키징 시스템.
  138. 제137항에 있어서, AAV2 Rep 단백질은 78/68 또는 Rep 68/52인 패키징 시스템.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서, AAV2 Rep 단백질은 SEQ ID NO: 22의 AAV2 Rep 아미노산 서열과 최소 백분율의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 최소 백분율의 서열 동일성은 AAV2 Rep 단백질을 코딩하는 아미노산 서열의 길이 전반에서 적어도 70%인 패키징 시스템.
  140. 제136항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 벡터를 더 포함하고, 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 벡터인 패키징 시스템.
  141. 제140항에 있어서, 헬퍼 바이러스 벡터는 독립적인 제3 벡터인 패키징 시스템.
  142. 제140항에 있어서, 헬퍼 바이러스 벡터는 제1 벡터와 통합되는 것인 패키징 시스템.
  143. 제140항에 있어서, 헬퍼 바이러스 벡터는 제2 벡터와 통합되는 것인 패키징 시스템.
  144. 제140항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 패키징 시스템.
  145. 제140항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 및 사이토메갈로바이러스 (CMV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 패키징 시스템.
  146. 제145항에 있어서, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스인 패키징 시스템.
  147. 제146항에 있어서, 아데노바이러스 게놈은 E1, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함하는 것인 패키징 시스템.
  148. 제145항에 있어서, 헬퍼 바이러스는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)인 패키징 시스템.
  149. 제148항에 있어서, HSV 게놈은 UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 HSV 유전자를 포함하는 것인 패키징 시스템.
  150. 제140항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 벡터 및 제3 벡터는 제1 형질감염 플라스미드 내에 함유되는 것인 패키징 시스템.
  151. 제140항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 벡터 및 제3 벡터의 뉴클레오티드는 제2 형질감염 플라스미드 내에 함유되는 것인 패키징 시스템.
  152. 제140항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 벡터 및 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스에 클로닝되는 것인 패키징 시스템.
  153. 제140항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 벡터 및 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스에 클로닝되는 것인 패키징 시스템.
  154. 복제-결함 AAV의 재조합 제조를 위한 방법으로서, 방법은 AAV를 형성하도록 캡시드에 교정 게놈의 밀봉을 위해 작동되는 조건 하에서 세포에 제135항 내지 제153항 중 어느 한 항의 패키징 시스템을 도입시키는 단계를 포함하는 것인, 제조 방법.
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