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KR20200086322A - Rna 치료제를 포함하는 엑소좀 - Google Patents

Rna 치료제를 포함하는 엑소좀 Download PDF

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KR20200086322A
KR20200086322A KR1020207016299A KR20207016299A KR20200086322A KR 20200086322 A KR20200086322 A KR 20200086322A KR 1020207016299 A KR1020207016299 A KR 1020207016299A KR 20207016299 A KR20207016299 A KR 20207016299A KR 20200086322 A KR20200086322 A KR 20200086322A
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다누 굽타
저스틴 힌
조엘 노르딘
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Abstract

본 발명은 mRNA, 원형 RNA, miRNA, shRNA, 원형 RNA 및/또는 DNA 분자와 같은 핵산(NA)-기반 치료제를 포함하는 세포외 소포(extracellular vesicle: EV) 치료제에 관한 것이다. 이 NA 치료제는 창의적으로 조작된 단백질 및 EV로의 적재를 강화하고 표적 세포 내부로 NA 카고 분자의 방출을 촉진하는 NA 조작 전략을 사용하여 EV에 적재된다.

Description

RNA 치료제를 포함하는 엑소좀
본 발명은 mRNA, 원형 RNA, miRNA, shRNA 및 다양한 다른 RNA 치료제와 같은 내생적으로 적재된 RNA 치료제를 포함하는 세포외 소포(extracellular vesicle: EV) 치료제에 관한 것이다.
핵산-기반 치료제는 빠른 발걸음으로 임상적 유용성에 접근하고 있다. 유전자 치료, mRNA-기반 치료, 짧은 올리고뉴클레오타이드- 및 siRNA-기반 치료제는 RNA 치료제 환경 내의 많은 양상 중 일 예시일 뿐이다. 빠른 소거, 뉴클레아제 활성, 기관-특이적 분포의 결여, 및 낮은 세포흡수 효율로 인해 노출된 핵산, 대표적으로 RNA를 생체 내에 전달하는 것이 어렵기 때문에, 특화된 전달 소포는 일반적으로 생물활성적 전달을 이루기 위한 수단으로 필수적이다. 이것은 특히 비-간성(non-hepatic) 표적 및 mRNA 및 유전자 치료와 같은 고분자량의 RNA 치료제의 경우에 해당된다.
세포외 소포(엑소좀과 같은)는 전형적으로 대부분의 세포 유형에서 생산되고 인체의 자연적인 단백질, 핵산, 펩타이드, 지질, 및 다양한 다른 분자의 세포 간 운반 시스템으로 기능하는 나노미터-크기의 소포이다. RNA-함유 EV는 다수의 잠재적 치료 용도를 가지며 이미 유전자 치료, mRNA 전달, 및 다양한 설정의 짧은 핵산의 전달을 위한 전달 소포로 연구되어 왔다. WO2010/119256은 엑소좀을 사용한 핵산 전달 분야의 기초 발명을 기술하며 몇몇 유형의 핵산 카고(nucleic acid cargo)를 전달하기 위한 엑소좀의 유용성을 교시한다. 공개되지 않은 출원 PCT/GB2017/051479는 모세포에 형성된 EV로 관심 RNA를 끓어들이는 RNA-결합 단백질의 도움을 받아 다양한 유형의 RNA 치료제를 내생적으로 적재하기 위한 개선된 방법을 교시한다. US14/502,494는 표적화 및 모듈화 엑소좀 적재(Targeted And Modular Exosome Loading: TAMEL) 시스템으로 불리는 시스템을 이용하여 특정 RNA 종을 적재하는데에 RNA-결합 단백질을 이용하는 다른 방법을 기술한다.
하지만, 이러한 장점에도 불구하고, 특이적이고 효율적인 방법으로 EV에 크고 작은 RNA 카고를 적재하는 기술을 개선하는 분야에서 여전히 상당한 여지가 있다. 또한 어떤 전달 시스템이든 표적 세포에 실제로 생물활성적으로 전달하는 것이 주요 방향이며 선행기술은 이에 관해서도 개선의 여지가 있다.
US14/502,494 및 상응하는 문헌 참조(Hung 및 Leonard, Journal of Extracellular Vesicles 2016, 5: 31027)에 기술된 TAMEL 적재 시스템에는 본 발명이 극복하고자 하는 많은 단점이 있다. TAMEL 시스템의 주요 단점은 mRNA를 기능적으로 전달할 수 없다는 것, 즉 세포가 엑소좀에 노출될 때 TAMEL 시스템을 통해 엑소좀에 적재된 mRNA가 세포에 의해 번역되지 않는다는 것이다. 본 발명은 이런 카고 mRNA의 생물활성적 전달을 달성한다.
Tutucci 등[An improved MS2 system for accurate reporting of the mRNA life cycle. Nat Methods. 2018 Jan; 15(1): 81-89]은 RNA 위치화 및 생활주기를 연구하기 위해 MS2 단백질의 사용을 검토하고 TAMEL 시스템을 통해 사용한 MS2 단백질이 매우 높은 친화도로 RNA에 결합한다는 것을 제시하였다. 이러한 강한 결합은 mRNA 조절 연구에서 문제가 된다고 이 논문에 의해 보고되었다. MS2의 강한 결합은 적재되는 임의의 RNA/핵산이 방출되지 않을 것이라는 것을 의미하기 때문에 우리는 EV를 적재하는 상황에서 이런 고친화적 결합은 다시 문제가 될 것이라 생각한다. mRNA의 방출을 막는 것은 일반적인 번역을 막을 것이고 이는 US14/502,494에서 관찰된 mRNA가 번역되지 않는 이유를 설명할 것이다.
TAMEL 시스템은 모든 엑소좀에 핵산을 적재하는 것으로 보이지 않으며, 적재된 엑소좀에는 매우 작은 수의 핵산이 적재된다(이러한 가변성 및 낮은 수준 적재의 단점은 아래에서 상세히 논의함). 이러한 가변성 및 낮은 수준의 적재, 그리고 적재된 작은 수의 핵산이 이후 방출될 것 같지 않고 따라서 생물활성적이지 않다는 사실은 TAMEL 시스템이 많은 단점을 갖는다는 것을 의미한다. TAMEL 시스템은 임상적으로 적절한 양의 생물활성적 핵산을 적재하고 전달하기에 적합하지 않다. 본 발명은 이러한 중요한 단점을 극복한다.
TAMEL 시스템의 다른 단점은 박테리오파지 단백질을 적용하기 때문에 생산된 EV를 환자에 전달할 때 원치않은 면역반응이 유발될 수 있다는 것이다. 본 발명은 이러한 단점 또한 극복한다.
그러므로 본 발명의 목적은 핵산(NA)-기반 치료제의 적재 및 그 이후 EV-매개로 치료제를 표적 세포에 전달하는 것과 연관된 상기와 같은 문제를 극복하는 것 및 이 분야에 존재하는 요구를 충족시키는 것, 예를 들어 문제의 NA 치료제를 올바른 세포 내 구획에 도달하게 하는 것이다.
본 발명은 NA 카고를 적재하고 방출하기 위한 신규 EV 조작 기술을 이용하여 이러한 목적을 달성한다. 이는 문제의 NA가 EV에 고효율로 적재되는 것뿐만 아니라 효과적으로 방출되는 것을 보장하는 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 작제물의 조작을 통해 달성된다. 첫째 양상에서, 이는 적어도 하나의 핵산(NA)-결합 도메인 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 적어도 하나의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포외 소포(EV)를 제공함에 따라 달성되며, 여기서 적어도 하나의 NA-결합 도메인은 푸밀리오(Pumilio) 및 FBF 상동성 단백질(PUF), Cas6, 및/또는 NA 압타머(aptamer)-결합 도메인, 또는 이들의 임의의 유도체 및/또는 도메인 및/또는 유사체 중 하나 또는 둘 이상이다. 이 NA-결합 도메인은 유리하게는 몇 카피로 존재할 수 있고, 각 NA 카고 분자 또한 다수의 카피로 존재하면서 각각 또는 모든 카피가 NA-결합 도메인을 위한 복수의 결합 부위를 가질 수 있다. 중요하게는, 융합 폴리펩타이드의 일부를 형성하고 NA 카고 분자와 상호작용을 담당하는 이 NA-결합 도메인은 방출가능한 NA-결합 도메인이고, 이는 NA 카고 분자와의 결합이 가역적이고 방출가능한 상호작용이라는 것을 의미한다. EV-생산 세포 내 NA 카고 분자의 과발현은 NA-결합 도메인과 NA 카고 분자 사이의 상호작용이 가능하도록 하는 충분히 높은 위치 농도를 달성하게 하는 반면, 표적 위치(표적 세포의 내부와 같은) 내 NA 결합 분자의 낮은 농도는 NA 카고 분자의 효과적인 방출을 가능하게 하여 생물활성적인 전달을 가능하게 한다는 것을 본 발명자들이 깨달았기 때문에, NA-결합 도메인과 NA 카고 분자 사이의 방출가능한 결합은 특히 유리하다.
본 발명은 또한 창의적인 융합 폴리펩타이드 작제물 그 자체에 관한 것이고, 또한 이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 문제의 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 관한 것일 뿐만 아니라, 안정성 및 강화된 능력을 위해 조작된 NA 카고 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
추가 양상에서, 본 발명은 융합 폴리펩타이드 작제물 및 NA 카고 분자를 포함하는 EV의 개체군에 관한 것일 뿐만 아니라, EV, EV 개체군, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 작제물, 및/또는 임의의 상기 생물거대분자를 함유하는 세포 및/또는 다른 벡터(아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스, HSV, RSV, 등의 바이러스와 같은)의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 EV를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 적어도 (i) 적어도 하나의 적합한 폴리뉴클레오타이드 작제물을 EV-생산 세포에 도입하는 단계, (ii) 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화되는 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물을 상기 EV-생산 세포에서 발현하는 단계, 및 (iii) (ii)단계에서 얻을 수 있는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 EV를 상기 EV-생산 세포로부터 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 RNA 카고 분자를 세포 내로 전달하는 시험관 내 방법에 관한 것으로, 이 방법은 표적 세포(전형적으로 표적 세포 개체군)를 적어도 하나의 EV 및/또는 적어도 하나의 EV 개체군과 접촉시키는 것을 포함한다.
요약하자면, 본 발명은 다수의 NA 치료제 카고를 EV-매개로 전달하는 신규한 적재 및 방출 전략을 제공한다. 유리하게는, 본 발명은 모두 진행생물 사이에 고도로 보존된 단백질을 사용하고, 따라서 환자에 전달될 때 불리한 면역 반응을 일으키지 않을 것이다.
도 1: 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드 작제물을 사용하여 NA 카고 분자를 적재한 EV의 개략도.
도 2: 엑소좀 폴리펩타이드로서의 CD63과 NA-결합 도메인으로서의 PUF(이 경우 NA-결합 PUF 도메인은 인간 PUM1 단백질로부터 얻음) 또는 Cas6을 포함하는 융합 폴리펩타이드 작제물을 사용하여 NanoLuc(RTM) 및 p21을 암호화하는 mRNA 카고 분자를 MSC-유래 EV에 적재하는 것을 나타낸 그래프. 이 실험은 또한 NA-결합 도메인을 위한 결합 부위 수를 다르게 한 것, 즉 0, 3 및 6 결합 부위로 다르게 한 것을 포함함. 엑소좀 폴리펩타이드 CD63만을 발현한 경우에는 EV에 어떠한 mRNA도 적재되지 않았음(우측). PUF(막대그래프 좌측 세트: 두 개의 PUF 도메인이 CD63의 N 말단 및 C 말단 모두에 측면연결됨, 즉 총 4개의 PUF 작제물)(좌측으로부터 막대그래프 두번째 세트: 하나의 PUF 도메인이 CD63의 N 말단 및 C 말단 모두에 측면연결됨) 및 돌연변이된 Cas6(오른쪽으로부터 두번째)를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 발현한 경우에는 EV 근원 세포 내 발현 상에서 NanoLuc(RTM) 및 p21 mRNA 모두 적재되었음. NanoLuc(RTM)의 적재는 EV당 대략 45 카피의 mRNA까지로 p21의 적재 보다 전체적으로 더 효과적이었음.
도 3: 헌팅틴(huntingtin) 표적화 shRNA의 EV-매개 전달 상에서 시험관 내 표적 세포 내 유전자 발현의 침묵 현상. 각각 EV 폴리펩타이드로서의 CD63 또는 CD81과 결합된 NA-결합 도메인으로서의 PUF(인간 PUM 단백질로부터 얻음) 또는 Cas6를 포함하는 융합 폴리펩타이드 작제물 및 shRNA를 발현하도록 양막 세포가 조작됨. AE-EV를 세포 배양으로부터 수집하고 시험관 내에서 표적 세포에 첨가함. Y축은 NA 카고 분자 내 결합 부위의 수가 증가함에 따른 헌팅틴 발현 수준이 감소된 정도를 나타내며, 항-헌팅틴 shRNA를 적재한 PUF-CD63-PUF를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 사용한 경우 대략 80% 넉다운됨.
도 4: NanoLuc(RTM) mRNA의 HEK EV-매개 전달 후 표적 Huh7 세포 내 리포터 시스템으로서의 NanoLuc(RTM)의 발현. 융합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 NA-결합 도메인, 이 경우 PUFx2-CD63-PUFx2(두 개의 NA-결합 폴리펩타이드가 엑소좀 폴리펩타이드 CD63의 N 말단 및 C 말단 모두에 삽입됨), PUF-CD63-PUF, 및 Cas6-CD9-Cas6을 위한 0, 3, 또는 6 결합 부위를 포함하도록 NanoLuc(RTM) mRNA 카고 분자를 조작함. Y 축은 ㎍ 단백질 너머로 표준화한 관련 빛(발광) 단위(RLU)를 나타내며, 결합 부위의 수가 증가함에 따라 전달 및/또는 번역이 강화됨을 나타냄. 인간 PUM1 및 디. 메라노가스터(D. melanogaster)의 푸밀리오 단백질로부터 얻은 NA-결합 PUF 또한 이 검정법에서 평가함.
도 5: 서열번호 1 내지 6의 서열.
본 발명은 시험관 내 및/또는 생체 내에서 표적 세포에 생물활성적 방식으로 NA 카고를 도입 및 전달하기 위한 신규한 조작 접근법을 사용하여, EV-전달 NA 치료제의 적재를 개선하고, 방출을 조절하고, 효과를 강화하는 것에 관한 것이다.
편의성과 명확성을 위해, 본 명세서에서 사용된 특정 용어를 모아 아래에 설명한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 특징, 양상, 실시형태, 또는 대안이 마쿠쉬 형태로 기재된 경우, 당업자에게 본 발명은 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구원성의 하위그룹의 용어로 기재된 것으로 인식될 것이다. 당업자에게 또한 본 발명은 마쿠쉬 그룹의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 임의의 조합의 용어로 기재된 것으로 인식될 것이다. 또한, 본 발명의 양상 및/또는 실시형태 중 하나와 연결되어 기술된 실시형태 및 특징은 또한 본 발명의 다른 양상 및/또는 실시형태 모두에 준용된다. 예를 들어, EV와 연결하여 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩타이드는 본 명세서의 모든 다른 양상, 교시 및 실시형태, 예를 들어 EV의 생산 방법 또는 본 명세서에 기술된 상응하는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 관한 양상 및/또는 실시형태와 함께 개시되고, 관련되고, 호환되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 특정 양상에 연결하여 기술된 특정 실시형태, 예를 들어 특정 의학적 징후를 치료하는 것에 관한 양상에 관련하여 기술된 것으로 융합 폴리펩타이드 및 선택적으로 NA 약물 카고 분자를 포함하는 EV의 투여 경로 또한 자연히 약제학적 조성물에 속하는 것과 같은 다른 양상 및/또는 실시형태와 연관될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 확인된 모든 폴리펩타이드 및 단백질은 폴리펩타이드를 융합하는 통상적인 전략을 사용하여 융합 단백질 내에 자유롭게 결합될 수 있다. 비제한적인 예시로, 본 명세서에 기술된 NA-결합 도메인(폴리펩타이드 기원의)은 하나 또는 둘 이상의 엑소좀 폴리펩타이드와 임의의 조합으로 자유롭게 결합될 수 있고, 선택적으로 본 명세서의 모든 다른 폴리펩타이드 도메인, 영역, 서열, 펩타이드, 그룹, 예컨대 임의의 다합체화 도메인, 방출 도메인, 및/또는 표적화 펩타이드와 결합될 수 있다. 또한, 엑소좀 폴리펩타이드 및/또는 NA-결합 도메인은 하나 이상의 엑소좀 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 NA-결합 도메인을 포함하는 작제물을 생성하기 위해 서로 결합될 수 있다. 또한, 임의의 그리고 모든 특징(예를 들어 마쿠쉬 그룹의 임의의 그리고 모든 구성원)은 임의의 그리고 모든 다른 특징(예를 들어 임의의 다른 마쿠쉬 그룹의 임의의 그리고 모든 구성원), 예컨대 임의의 엑소좀 폴리펩타이드와 결합될 수 있는 임의의 NA-결합 도메인과 자유롭게 결합될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 단수형 EV에 관해 그리고/또한 별개의 자연적 나노입자-유사 소포로서 EV에 관해 교시할 때, 이러한 모든 교시가 복수의 EV 및 EV 개체군에 동등하게 연관되고 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일반적인 언급으로, 본 발명에 따른 엑소좀 폴리펩타이드, EV-생산 세포 근원, 부가적인 도메인 및 펩타이드, NA 카고 분자, 및 모든 다른 양상, 실시형태, 및 대안은 본 발명의 범위 및 요지를 벗어나지 않으면서 임의의 그리고 모든 가능한 조합으로 자유롭게 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열(각각 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열)은 임의의 주어진 분자가 이와 관련된 원하는 기술적 효과를 수행하는 능력을 보유하는 한 본래의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 서열로부터 상당히 벗어날 수 있다. 본 출원에 따른 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본래의 서열과 비교하여 가능한 높은 서열 동일성(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 또는 예컨대 90% 또는 그 이상)이 바람직하지만, 이들의 생물학적 특성이 유지되는 한 (예를 들어 BLAST 또는 ClustalW를 사용하여 계산된) 50%까지 벗어날 수 있다. 예컨대 몇몇 폴리펩타이드의 결합(융합)은 각 폴리펩타이드의 특정 단편이 대체 및/또는 변형될 수 있고, 그리고/또는 서열이 다른 아미노산 연속의 삽입에 의해 가로막힐 수 있음을 의미하고, 이는 주요 특성(예컨대 NA-결합, EV로의 트래피킹, 표적화 능력, 등)이 보존되는 한 본래 서열로부터 벗어나는 것이 상당할 수 있음을 의미한다. 따라서 유사한 추론이 자연적으로 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 적용된다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질과 연관하여 본 명세서에 언급된 임의의 수탁번호(accession number) 또는 서열번호는 단지 예시일 뿐이고 정보만을 위한 것일 뿐이며, 모든 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 당업자가 이해할 수 있는 바와 같은 일반적인 의미가 부여되어야 할 것이다. 따라서, 전술한 바와 같이, 당업자는 본 발명이 본 명세서에 적용된 특이적인 서열번호 및/또는 수탁번호뿐만 아니라, 이의 변이체 및 유도체도 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 관련된 모든 수탁번호는 UniProtKB 수탁번호이고, 본 명세서에 언급된 모든 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 이해되는 통상적인 의미에 따라 해석되어야 한다.
용어 "세포외 소포" 또는 "EV" 또는 "엑소좀"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 형태의 세포로부터 얻을 수 있는 임의의 소포 유형, 예를 들어 미세소포(microvesicle)(예컨대, 세포의 원형질막으로부터 분리된 임의의 소포), 엑소좀(예컨대, 엔도-리소솜 경로로부터 파생된 임의의 소포), 자멸사체(apoptotic body)(예컨대, 자멸사 세포로부터 획득 가능한), 미세입자(예컨대, 혈소판으로부터 파생될 수 있음), 엑토솜(ectosome)(예컨대, 혈청 내 호중구 및 단핵구로부터 파생될 수 있음), 프로스타토솜(prostatosome)(예컨대, 전립선암 세포로부터 얻을 수 있음), 또는 카디오솜(cardiosome)(예컨대, 심장세포로부터 파생될 수 있음), 등에 관한 것으로 이해되어야 한다. EV의 크기는 상당히 다양할 수 있지만 전형적으로 나노-크기 유체역학적 직경, 즉, 1000㎚ 미만의 직경을 갖는다. 분명히, EV는 생체 내, 생체 외, 및 시험관 내에서 임의의 세포 유형으로부터 파생될 수 있다. 바람직한 EV는 엑소좀 및 미세소포를 포함하지만, 다른 EV 또한 다양한 상황에서 유리할 수 있다. 또한, 상기 용어는 또한 세포외 소포 모방체, 예를 들어 막 분출(membrane extrusion), 음파처리(sonication), 또는 다른 기술, 등을 통해 얻어지는 세포 막-기반 소포에 관한 것으로 이해되어야 한다. EV의 의료적 및 과학적 사용과 응용을 기술할 때, 본 발명은 일반적으로 복수의 EV, 즉 수천, 수백만, 수십억, 심지어는 수조의 EV를 포함할 수 있는 EV 개체군에 관한 것임이 당업자에게 자명할 것이다. 아래의 실험 부분에서 볼 수 있듯이, EV는 단위 부피당(예를 들어 ㎖당) 105, 108, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1018, 1025, 1030 EV(종종 "입자"로 지칭됨), 또는 임의의 다른 더 큰 수, 더 작은 수 또는 이 사이의 수와 같은 농도로 존재할 수 있다. 같은 맥락에서, 예컨대 엑소좀 폴리펩타이드 및 관심 NA 카고 분자가 결합할 수 있는 NA-결합 도메인 사이의 특정 융합 폴리펩타이드를 포함하는 EV에 관한 것일 수 있는 용어 "개체군"은 이 개체군을 구성하는 복수의 독립체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 다시 말해, 다수로 표현될 때 개별 EV는 EV 개체군을 구성한다. 따라서, 자연히, 본 발명은 개별 EV 및 EV를 포함하는 개체군 모두에 관한 것임이 당업자에게 자명할 것이다. 생체 내에 적용할 경우 EV의 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, NA 카고 분자의 치료적 활성, 효과, 및 잠재력, EV에 존재하는 임의의 표적화 모이어티, 약제학적 조성물, 등에 따라 상당히 다양할 수 있다. 또한, 본 발명의 EV는 NA 카고 분자에 더해 부가적인 치료제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 부가적인 치료제는 적어도 하나의 치료적 소분자 약물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 치료적 소분자 약물은 DNA 손상제, DNA 합성을 저해하는 물질, 미세소관(microtubule) 및 튜불린(tubulin) 결합제, 대사길항제, 산화적 손상 유도제, 항-혈관신생제, 내분비요법, 항-에스트로겐, 톨-유사 수용체(Toll-like receptor) 아고니스트 또는 안타고니스트와 같은 면역-조절제, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제, 키나제(kinase) 저해제와 같은 신호전달 저해제, 열충격 단백질 저해제, 레티노이드(retinoid), 성장인자 수용체 저해제, 항-유사분열 화합물, 항염증제, 세포주기 조절제, 전사인자 저해제, 및 세포자멸사 유도제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 실시형태에서, 이 부가적인 치료제는 부가적인 치료적 핵산-기반 물질일 수 있다. 이러한 부가적인 핵산-기반 치료제는 단일-가닥 RNA 또는 DNA, 이중-가닥 RNA 또는 DNA, siRNA와 같은 올리고뉴클레오타이드, 접합-전환(splice-switching) RNA, CRISPR 가이드 가닥, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 또는 다른 RNA 또는 DNA 벡터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 2'-0-Me, 2'-0-알릴, 2'-0-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, 포스포로티오산염(phosphorothioate), 트라이사이클로-DNA, 등과 같이 화학적으로 합성 그리고/또는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산-기반 물질이 특히 중요하다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 EV는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있는 부가적인 치료제를 포함할 수 있다. 이러한 단백질 및/또는 펩타이드는 EV 내부에 존재하거나, EV 막 내에 삽입되거나 또는 EV 막과 결합하여 존재할 수 있고, 또는 EV로부터 소포외 환경으로 도출될 수 있다. 이러한 치료적 단백질 및/또는 펩타이드 물질은 항체, 인트라바디(intrabody), 단일 사슬 가변 단편(scFv), 애피바디(affibody), 이중 및 다중특이적 항체 또는 바인더, 애피바디, 다핀(darpin), 수용체, 리간드, 예컨대 효소 대체 치료 또는 유전자 편집을 위한 효소, 종양 억제제(비-제한적 예시로 p53, p21, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7, 및/또는 ST15을 포함) 바이러스 또는 박테리아 저해제, 세포 구성요소 단백질, DNA 및/또는 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로티나제, 인테그라아제, 전사인자, 성장인자, 세포자멸사 저해제 및 유도제, 독소(예를 들어 슈도모나스 외독소), 구조단백질, NT3/4와 같은 신경영양인자, 뇌-유래 신경영양인자(BDNF) 및 신경성장인자(NGF) 및 2.5S 베타 서브유닛과 같은 이의 개별 서브유닛, 이온채널, 막 수송체, 단백질항상성인자, 세포신호 관련 단백질, 번역- 및 전사 관련 단백질, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 단백질 결합 단백질, 지질 결합 단백질, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan: GAG) 및 GAG-결합 단백질, 대사단백질, 세포 스트레스 조절 단백질, 염증 및 면역 시스템 조절 단백질, 미토콘드리아 단백질, 및 열충격 단백질, 등을 포함하는 비-제한적인 예시의 군으로부터 선택될 수 있다.
용어 "엑소좀 폴리펩타이드", "엑소좀 단백질", "엑소좀 운반 단백질", "EV 단백질" 및 "EV 폴리펩타이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 폴리펩타이드 작제물(전형적으로 엑소좀 폴리펩타이드에 추가로 NA-결합 도메인, 예컨대 NA-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함함)을 적합한 소포 구조물로, 즉 적합한 EV로 운반하는데 이용될 수 있는 임의의 폴리펩타이드에 관한 것으로 이해될 것이다. 보다 구체적으로, 이들 용어는 융합 단백질 작제물을 EV와 같은 소포 구조물로 운반, 트래피킹 또는 왕복수송할 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 이러한 엑소좀 폴리펩타이드의 예시는 예를 들어 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71(트랜스페린 수용체로도 알려져 있음) 및 이의 엔도솜 분류 도메인, 즉 트랜스페린 수용체 엔도솜 분류 도메인, CD133, CD138(신데칸-1), CD235a, ALIX, AARDC1, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, 신데칸-2, 신데칸-3, 신데칸-4, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, TNFR 및 gp130과 같은 인터루킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 구성요소, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, TSG101, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 다른 엑소좀 폴리펩타이드, 및 이들의 임의의 조합 또는 유도체가 있으나, 폴리펩타이드 작제물을 EV에 운반할 수 있는 수많은 다른 폴리펩타이드가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서, NA 카고 분자의 적재를 돕도록 융합 단백질이 EV에 존재하는 형태를 위해 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드는 NA-결합 도메인에 융합된다. 이러한 융합 단백질은 또한 그들의 기능을 최적화하기 위해 링커, 막관통 도메인, 사이토솔 도메인, 다합체화 도메인, 등을 포함하는 다양한 다른 구성요소를 포함할 수 있다.
용어 "NA-결합 도메인" 또는 "NA-결합 폴리펩타이드" 또는 "NA-결합 단백질"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 뉴클레오타이드 스트레치에 결합할 수 있는 임의의 도메인에 관련된다. 이 NA-결합 도메인은 RNA, DNA, RNA 및 DNA의 혼합체, shRNA와 같은 NA의 특정 유형, miRNA, mRNA, gRNA, pri-miRNA, pre-miRNA, 원형 RNA, piRNA, tRNA, rRNA, snRNA, IncRNA, 리보자임, 미니-서클 DNA, 플라스미드 DNA, 등에 결합할 수 있다. 또한, 이 NA-결합 도메인은 2'-0-Me, 2'-0-알릴, 2'-0-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, 포스포로티오산염, 트라이사이클로-DNA, 등과 같은 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 또한, 이 NA-결합 도메인은 NA의 특정 서열, 반복과 같은 도메인, 또는 스템루프 또는 헤어핀과 같은 NA 모티프에 결합할 수 있다. 이 NA-결합 도메인을 위한 결합 부위는 관심 NA 카고 분자에 자연히 발생할 수 있고 그리고/또는 EV 적재 및 생물활성적 전달을 더욱 강화하기 위해 NA 카고 분자에 조작될 수 있다. 핵산에 대한 NA-결합 도메인의 결합 친화력은 핵산이 엑소좀에 왕복수송되도록 충분히 높은 친화력으로 결합하는 정도이지만 핵산이 표적 세포에 전달되어 생물활성적이도록 이후 표적 세포로의 핵산의 방출을 막을 정도로 높지 않은 정도이다. 따라서, 중요하게는 그리고 선행기술과 완전히 대조적으로, 본 발명은 방출가능한 NA-결합 도메인의 도움으로 NA 카고 분자가 적재된 EV에 관한 것이며, 이 NA-결합 도메인은 엑소좀 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드의 일부분을 형성한다. 본 발명의 NA-결합 도메인은 프로그래밍 가능하고, NA-결합 도메인과 NA 카고 분자 사이의 친화력을 변경할 수 있도록 선택되었기 때문에, NA-결합 도메인과 적어도 하나의 NA 카고 분자를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 EV의 생산이 가능하고(여기서 이 융합 폴리펩타이드 작제물의 NA-결합 도메인은 프로그래밍 가능하고, 가역적이고, 변경 가능한 방식으로 NA 카고 분자에 상호작용함), EV에 적재하는 것과 EV 내 및/또는 표적세포 내 또는 표적세포에 연결되도록 NA 카고 분자의 방출 모두 가능하다. 이것은 단지 MS2 단백질을 사용하여 mRNA 분자를 엑소좀에 적재하는 선행기술과 완전하게 대조되고, 또한 선행기술은 MS2 단백질이 mRNA에 결합한 채로 남기 때문에 방출 및 이후의 번역이 저해된다.
본 발명은 첫째로 3가지 군의 NA-결합 도메인, 다시 말해 PUF 단백질, CRISPR-관련 폴리펩타이드(Cas) 및 특히 Cas6 및 Cas13, 및 다양한 유형의 NA-결합 압타머(aptamer)에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 단백질(PUM 단백질로 부를 수 있는), 예를 들어 인간 푸밀리오 동족체 1(PUM1), PUM1의 2배체인 PUMx2 또는 PUFx2, 등, 또는 임의의 PUF(PUM) 단백질로부터 얻을 수 있는 임의의 NA-결합 도메인의 모든 관련 단백질 및 도메인을 포함하는 용어 PUF 단백질을 사용한다. PUF 단백질은 전형적으로 8개의 연속적인 PUF 반복(각각 약 40개의 아미노산, 종종 두 관련 서열 Csp1 및 Csp2에 측면배치됨)의 존재로 특정된다. 각 반복은 방향족 및 염기성 잔기를 포함하는 '핵심 일치성'(core consensus)을 갖는다. RNA 결합에는 PUF 반복의 전체 클러스터가 필요하다. 특히, 이 같은 영역은 또한 단백질 상호-조절인자와 상호작용하고 PUF 단백질 돌연변이의 결함을 폭넓게 구제하기에 충분하므로, 이 PUF 단백질을 본 발명에 사용되는 돌연변이에 매우 적합하게 만든다. 또한, PUF 단백질은 적당한 친화력으로 NA 카고 분자에 결합하는 방출가능한 NA-결합 도메인의 매우 바람직한 예시이며, 이에 따라 방출, PUF 단백질을 NA 카고에 가역적으로 부착하는 것이 가능하다. PUF 단백질은 대부분의 진핵생물에서 발견되며 배발생 및 발달에 관여한다. PUF는 RNA에 결합하고 일반적으로 36개의 아미노산을 함유하며 8개의 반복으로 이루어지는 하나의 도메인을 가지며, 이 도메인은 전형적으로 본 특허출원에서 RNA 결합을 위해 이용된다. 각 반복은 특정 뉴클레오타이드에 결합하며, 이는 일반적으로 13번 아미노산으로부터의 적층 상호작용으로 특이성을 부여하는 12 및 16번 위치의 아미노산이다. 자연적으로 발생하는 PUF는 뉴클레오타이드 아데노신, 우라실 및 구아노신과 결합할 수 있고, 조작된 PUF는 또한 뉴클레오타이드 사이토신과 결합할 수 있다. 따라서 이 시스템은 모듈식이고, 이 PUF 도메인에 결합하는 8-뉴클레오타이드 서열은 이 반복 도메인의 결합 특이성 전환에 의해 변화될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 PUF 단백질은 자연적이거나 RNA 분자 어느 곳이든 결합하도록 조작되거나, 또는 대안적으로 다른 서열에 대한 다른 결합 친화력을 갖는 PUF 단백질을 선택하고 이 서열을 함유하는 RNA 분자를 조작한 것일 수 있다. 또한, 서열-특이적 방식으로 16-뉴클레오타이드에 결합하는 조작 및/또는 이중화된 PUF 도메인이 있으며, 이를 NA 카고 분자에 대한 특이성을 더욱 증가시키기 위해 이용할 수 있다. 따라서 이 PUF 도메인은 상이한 친화력 및 서열 길이로 임의의 서열에 결합되도록 변형될 수 있고, 이는 시스템을 고도로 모듈화되도록 만들고 본 발명에 따른 임의의 RNA 카고 분자에 적응할 수 있도록 만든다. 본 발명에 따른 NA-결합 도메인으로 사용될 수 있는 PUF 단백질 및 이의 영역 및 유도체는 다음의 비-제한적 리스트의 PUF 단백질을 포함한다: 씨. 엘레강스(C. elegans) 유래 FBF, FBF/PUF-8/PUF-6,-7,-10, 모두; 디. 멜라노가스터(D. melanogaster) 유래 푸밀리오; 에스. 세레비지에(S. cerevisiae) 유래 Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf4p/Ygl014wp/Ygl023p, Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf3p, 모두; 딕티오스텔리움(Dictyostelium) 유래 PufA; 인간 PUM1(푸밀리오 1, 때로는 PUF-8R이라고도 함) 및 이들의 임의의 도메인, 적어도 둘의 PUM1 유래 NA-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 임의의 절단 또는 변형 또는 조작된 PUF 단백질, 예를 들어 PUF-6R, PUF-9R, PUF-10R, PUF-12R, 및 PUF-16R 또는 이들의 유도체; 및 제노프스(Xenopus) 유래 X-Puf1. 본 발명에 따른 특히 적합한 NA-결합 PUF는 다음을 포함한다: PUF 531(비-제한적 예시로 서열번호 1에 예시됨), PUF mRNA loc(때로는 PUF엔지니어드 또는 PUFeng라고도 함)(비-제한적 예시로 서열번호 2에 예시됨), 및/또는 PUFx2(비-제한적 예시로 서열번호 3에 예시됨), 및 이들의 임의의 유도체, 도메인, 및/또는 영역. 이 PUF/PUM 단백질은 인간 기원으로 선택될 수 있어 매우 유리하다. 서열번호 1 내지 3의 서열은 도 5에 나타내었다.
US14/502,494에서 사용된 제조사 단백질과 같은 박테리오파지 기원의 단백질 보다는 인간 기원의 단백질이 불리한 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮기 때문에 유익하다. 또한, MS2는 박테리오파지 기원의 스템루프와 상호작용하고, 이는 PUF 단백질과 달리 선택된 NA 분자에 도입되기 위해 필요한 원핵생물의 NA 서열 및 모티프를 의미한다. 분명히, 이 박테리오파지 기원 및 구조의 스템루프 구조체의 삽입은 mRNA 번역을 방해할 수 있고, 비-기능적 mRNA 카고 분자, 또는 심지어 면역독성을 유발할 수 있다.
따라서, 유리한 실시형태에서, 본 발명은 엑소좀 단백질에 융합된 진핵생물의 NA-결합 단백질에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 이 NA-결합 도메인은 PUF 패밀리 단백질, 예를 들어 PUF531, PUF엔지니어드, 및/또는 PUFx2 유래의 것이다. 중요하게는, PUF 단백질은 바람직하게는 mRNA 또는 shRNA의 EV-매개 전달에 사용되며, PUF 단백질의 서열-특이성에 따라 NA 약물 카고의 고도로 조절되고 특이적인 적재를 가능하게 한다. 바람직한 실시형태에서, 이 PUF 단백질은 유리하게는 막관통 또는 용해성 엑소좀 단백질과 결합한다. 유리한 융합 단백질 작제물은 다음의 비-제한적 예시를 포함한다: CD63-PUF531, CD63-PUFx2, CD63-PUF엔지니어드, CD81-PUF531, CD81-PUFx2, CD81-PUF엔지니어드, CD9-PUF531, CD9-PUx2, CD9-PUF엔지니어드, 및 다른 막관통-기반 융합 단백질, 바람직하게는 하나, 둘 또는 셋 이상의 PUF 단백질에 융합된 테트라스파닌(tetraspanin) 기반 엑소좀 단백질. PUF 단백질 및 적어도 하나의 용해성 엑소좀 단백질을 포함하는 유리한 융합 단백질은 다음의 비-제한적 예시를 포함한다: 신테닌-PUF531, 신테닌-PUx2, 신테닌-PUF엔지니어드, 신데칸-PUF531, 신데칸-PUx2, 신데칸-PUF엔지니어드, Alix-PUF531, Alix-PUx2, Alix-PUF엔지니어드뿐만 아니라, PUF 단백질에 융합된 임의의 용해성 엑소좀 단백질.
PUF 단백질이 표적 NA 카고 분자에 대한 변경 가능한 서열-특이성을 갖는다는 사실은 이를 엑소좀 폴리펩타이드에 융합하기 위한 이상적인 NA-결합 도메인으로 만든다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, EV는 방출가능한 NA-결합 도메인을 (엑소좀 단백질을 함유하는 융합 단백질의 파트너로) 사용하여 NA 카고 분자를 적재하고, 여기서 이 NA-결합 도메인과 NA 카고 분자 사이의 상호작용은 유리하게는 표적 뉴클레오타이드 서열에 대한 특이성을 기반으로 하고, (2차 구조는 서열 특이성을 가능하게 하지 못하기 때문에) 표적 뉴클레오타이드 2차 구조를 기반으로 하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 이 NA 카고 분자는 NA-결합 도메인으로 선택된 PUF 단백질의 표적 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 조작되거나 그리고/또는 자연적으로 함유한다. 이러한 표적 뉴클레오타이드 서열은 상기와 같은, 예를 들어, mRNA의 3'UTR의 일부일 수 있거나 mRNA, shRNA, miRNA, IncRNA, DNA, 등과 같은 임의의 NA 카고 분자에 도입될 수 있고, 이는 PUF 단백질이 NA 카고 분자에 결합하는 것을 가능하게 한다. 이 NA 카고 분자 상의 PUF 결합 부위는 전형적으로는 단지 4개의 뉴클레오타이드 및 조합의 스템루프를 인식하는 MS2와 같은 많은 다른 RNA-결합 단백질에 의해 결합되는 서열보다 길고, 따라서 표적 결합 부위 상의 바람직한 뉴클레오티드 스트레치는 예를 들어 NA-결합 도메인의 변경 가능한 서열 특이성에 따라 5 뉴클레오타이드(nt), 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 또는 심지어 20 nt 및 더 길 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이 PUF 단백질은 자연적 및/또는 인공적으로 발생하는 6 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 12 nt, 또는 16 nt 길이의 NA 카고 분자 결합 부위에 특이적이다.
CRISPR-관련 폴리펩타이드(Cas)는 NA-결합 도메인의 다른 군을 나타내며, 특히 Cas6(비-제한적 예시로 서열번호 4에 예시함, 이 서열을 도 5에 나타내었음) 및 Cas13 뿐만 아니라 임의의 다른 RNA 결합 Cas 분자를 포함할 수 있다. Cas6는 전구체 CRISPR RNA(crRNA)에 높은 친화력으로 결합하고, 이후 예를 들어 Cas9로의 혼성화를 위해 이를 가공 처리한다. 이 RNA 분자의 절단율은 조정될 수 있고 고도로 정의될 수 있으며, 따라서 RNA 분자 및 Cas6 사이의 회합 시간 또한 매우 정확한 방식으로 정의될 수 있고, 이는 본 발명의 목적을 위해 중요하다. Cas6 또는 Cas13의 돌연변이 형태가 RNA 절단 효율을 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. Cas6 또는 Cas13의 돌연변이 형태가 RNA 결합 친화력을 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이것은 RNA 카고 분자가 수용 세포 내에 방출될 때 유리할 것이다. 정의된 회합 시간은 RNA 분자를 생산 세포가 아닌 소포 내부에 방출하기 위해 조정될 수 있다. Cas6가 인식할 수 있는 RNA 서열은 관심 NA 분자에 삽입되도록 조작될 수 있다. Cas13은 정의된 RNA 표적에 단지 결합하기만 하고 이를 분해하지 않도록 조작될 수 있다. sgRNA 분자의 서열 변경을 통해, Cas13-sgRNA 복합체는 20 내지 30 뉴클레오타이드 사이의 임의의 RNA 서열에 결합하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질 유래의 NA-결합 도메인을 사용하는 것은 짧은 RNA, 예를 들어 shRNA 또는 miRNA를 전달하는데 특히 유리하다. 이러한 경우에 선택된 Cas 폴리펩타이드의 절단 활성은 예컨대 shRNA 카고 분자를 예컨대 Cas6가 결합된 결합 부위로부터 방출하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PUF 단백질의 경우와 마찬가지로, Cas 단백질은 방출가능한 NA-결합 도메인의 매우 바람직한 예시이며, 이는 NA 카고 분자에 적절한 친화력으로 결합하여 Cas 단백질이 NA 카고에 방출가능하게, 가역적으로 부착될 수 있도록 한다. PUF-기반 NA-결합 도메인과 같이, Cas 단백질은 표적 NA 카고 분자에 대해 프로그래밍 가능하고 변경 가능한 서열 특이성을 갖는 방출가능하고 비가역적인 NA-결합 도메인을 나타내며, 이는 더 낮은 총 친화력에서 더 높은 특이성을 가능하게 하고, 이에 따라 EV에 NA 카고를 적재하는 것과 표적 위치에 NA 카고를 방출하는 것 모두를 가능하게 한다.
NA 압타머-결합 도메인은 본 발명에 따른 NA-결합 도메인의 다른 군이다. 이러한 NA 압타머-결합 도메인은 NA-기반 압타머에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 도메인, 영역, 아미노산 스트레치, 또는 온전한 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 압타머는 표적 항원에 대한 항체의 친화력과 유사하게 분자를 인식하기 위해 2차적 및/또는 3차적 구조를 형성하는 RNA 서열이다. 따라서 이들 RNA 분자는 특정 아미노산 서열을 높은 친화력으로 인식할 수 있다. 본 발명에서 RNA 압타머는 특정 아미노산 서열을 인식하기 위해 NA 분자 내 특정 뉴클레오타이드 서열 삽입을 통해 적용된다. 이러한 아미노산 서열은 압타머(NA 카고 분자 내 및/또는 그 옆에 조작될 수 있음)가 결합하도록 엑소좀 운반 폴리펩타이드 내 및/또는 그 옆에 조작될 수 있고, 이에 따라 엑소좀 폴리펩타이드의 도움으로 NA 카고 분자를 EV로 왕복운송할 수 있다. 적합한 특성을 갖는 두 압타머는 히스티딘(His) 아미노산 스트레치에 대해 높은 친화력을 갖는 His-압타머(비-제한적 예시로 서열번호 5에 예시됨)와 HIV Tat 도메인에 대한 압타머(비-제한적 예시로 서열번호 6에 예시됨)이다. 이 압타머 서열은 바람직하게는 mRNA의 3' 및/또는 5' 비번역 영역 또는 비-암호화 RNA의 불특정 영역에 삽입된다. 또한 엑소좀 운반 단백질에 대한 특이성 및 결합성을 증가시키기 위해 둘 또는 셋 이상의 압타머가 하나의 NA 카고 분자에 결합될 수 있다. 서열번호 5 및 6의 서열은 도 5에 나타내었다. 중요하게는, 본 발명의 모든 NA-결합 도메인은 NA 카고 분자, 예를 들어 mRNA, shRNA, 또는 miRNA에 대한 프로그래밍 가능하고, 서열-특이적이고, 가역적이고, 방출가능한 결합을 제공하며, 이는 선행기술의 고-친화적, 비가역적 결합과 완전하게 대조된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, NA-결합 도메인은 PUF 단백질 또는 Cas 단백질이며, 이들은 쉽게 프로그래밍 가능하고 NA 카고 분자에 가역적이고 방출가능하게 결합되는 서열 특이성이 있다. 중요하게는, NA-결합 도메인으로서의 Cas 단백질 및 PUF 단백질의 서열 특이성은 바람직하게는 표적 NA 분자 상의 적어도 6 nt, 바람직하게는 적어도 8 nt와 상호작용하는 것을 기반으로 하며, 이는 낮은 친화력 상호작용으로 결합할 때 NA 카고 분자의 고생산적 EV-매개 전달을 가능하게 한다. 이 NA 카고 분자 상의 적어도 6 nt 결합 부위는 바람직하게는 뉴클레오타이드의 연속적인 서열 내에 존재한다. 따라서 이 NA 카고 분자의 결합 부위는 바람직하게는 두 코돈 길이에 상응한다.
첫째 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 핵산(NA)-결합 도메인 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 세포외 소포(EV)에 관한 것이며, 여기서 이 적어도 하나의 NA-결합 도메인은 하나 또는 둘 이상의 PUF, CRISPR-관련(Cas) 폴리펩타이드, 및/또는 NA 압타머-결합 도메인일 수 있다. NA-결합 도메인의 존재에 따라, EV는 전형적으로 적어도 하나의 NA 카고 분자를 더 포함한다. 일반적으로, 각각 및 모두의 EV에 포함되는 NA 카고 분자의 수는 상당하고, 이는 일반적으로 매우 낮은 적재 효율을 보이는 선행기술에 비해 분명하게 개선된 것이다. 본 발명의 경우, 융합 폴리펩타이드 작제물의 창의적인 설계는 적어도 하나의 NA 카고 분자가 매우 효과적으로 EV로 (융합 폴리펩타이드의 도움으로) 운반되고 유의하게 개선된 방출 공정이 뒤따른다는 것을 의미한다. 이 NA-결합 도메인(융합 폴리펩타이드에 포함됨)과 NA 카고 분자 사이 결합의 방출가능한 성질은 이것이 생물활성적 NA 분자를 표적 세포 내 및/또는 가까이로 전달하는 것을 가능하게 하면서 EV-생산 세포(일반적으로 NA 카고 분자가 과발현됨) 내 NA 카고 분자가 결합하는 것을 허락하기 때문에 본 발명의 주요 양상이다.
따라서, 선행기술과 달리, 프로그래밍 가능한 NA-결합 도메인과 NA 카고 분자 사이의 더 낮은 친화성 상호작용은 EV-생산 세포 내에 효과적으로 EV를 적재하는 본 발명을 가능하게 하고, 또한 적합한 위치(전형적으로 표적 세포의 내부)에 NA 카고의 방출을 가능하게 하며, 이 위치에서 NA 카고 분자와 NA-결합 도메인 사이 상호작용의 낮은 친화력 및 방출가능한 성질은 매우 유리하다. 또한, 단지 4 nt 및 스템루프에 결합하는 고-친화성 RNA-결합 단백질로 MS2를 제시할 뿐인 선행기술과 달리, 본 발명은 더 길고 이에 따라 더 특이적인 뉴클레오타이드 스트레치, 예를 들어 6 nt의 길이, 또는 8 nt의 길이에 서열-특이적 저-친화적 또는 중간-친화적 결합을 허락한다.
결합 부위의 더 긴 길이는 다양한 변형된 결합 친화력을 갖는 결합 부위를 생성하기 위해 도입되는 다양한 다른 돌연변이를 가능하게 하고, 따라서 위에서 언급한 프로그래밍 가능한 낮은 친화성 상호작용을 가능하게 한다. 예를 들어, 6 또는 8 뉴클레오타이드 영역에 단일점 돌연변이를 도입하는 것은 이 결합 친화력을 미묘하게 변화시키겠지만, 이에 반해 MS2의 더 짧은 4 뉴클레오타이드 결합 영역의 단일 돌연변이조차 RNA에 대한 MS2의 결합 친화력에 상당한 영향을 미친다는 것이 알려져 있다. 핵산의 더 긴 길이는 핵산에 대한 단백질의 결합 친화력에 영향을 미치는 하나 또는 둘 이상의 돌연변이를 도입하기 위한 더한 범위를 제공한다. 유사하게, 결합에 더 긴 뉴클레오타이드 스트레치를 요구하는 것은 더 긴 뉴클레오타이드 서열과 상호작용할 수 있는 더 큰 수의 아미노산을 초래하며, 따라서 이들 상호작용 아미노산의 돌연변이를 위한 더 많은 가능성을 제공하고, 또한 다양한 결합 친화력을 갖는 더 큰 범위의 가능한 단백질 돌연변이를 생산한다. PUF, Cas6 및 Cas13의 더 긴 뉴클레오타이드 결합 부위 및 더 큰 단백질 결합 부위는 MS2 단백질 또는 MS2 RNA 서열의 돌연변이에 따른 것보다 훨씬 큰 범위의 다양한 친화력을 돌연변이를 통해 가능하게 한다는 장점을 제공한다. 따라서, 이 더 긴 서열은 특히 카고 핵산 방출의 개선이 필요한 경우 관심의 개별 카고에 대한 결합 친화력을 손질하기 위해 핵산 및/또는 결합 단백질을 조작하는데에 훨씬 큰 가능성을 제공한다. 위에서 설명한 바와 같이, 뉴클레오타이드 카고에 대한 결합 친화력의 조절 능력 및 이에 따른 뉴클레오타이드 카고의 방출가능성의 변형 및 조절은 생물활성적 핵산의 전달 및 방출을 초래하는 선행기술을 뛰어넘는 본 발명의 중요한 장점이다.
일 실시형태에서, NA 카고 분자는 shRNA, miRNA, mRNA, gRNA, pri-miRNA, pre-miRNA, 원형 RNA, piRNA, tRNA, rRNA, snRNA, IncRNA, 리보자임, 미니-서클 DNA, 플라스미드 DNA를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 본질적으로는 NA 분자의 임의의 유형이 본 발명에 따른 EV에 포함될 수 있다. 단일-가닥 및 이중-가닥 NA 분자 모두 본 발명의 범위 내에 있으며, 이 NA 분자는 자연적으로 발생될 수 있고(RNA 또는 DNA와 같이) 또는 화학적으로 합성된 RNA 및/또는 DNA 분자일 수 있으며, 2'-0-Me, 2'-0-알릴, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, 포스포로티오산염, 트라이사이클로-DNA, 등과 같이 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 중요하게는, 비록 본 발명이 NA 카고 분자(예를 들어, mRNA, 원형 RNA, shRNA, 등)의 내생적 적재를 위해 매우 적합하지만, EV-생산 세포를 문제의 이 NA 분자에 노출시키거나 그리고/또는 그 자체를 EV와 함께 상호-항온처리 또는 제형화하여 NA 분자를 외생적으로 적재하는 것에도 적용될 수 있다.
특정 실시형태에서, NA-결합 도메인은 Cas6 또는 Cas13이고 NA 카고 분자는 shRNA이다. shRNA 카고와 함께 Cas6/Cas13의 조합은 Cas6/Cas13의 본래 활성이 Cas6 또는 Cas13이 결합한 NA-결합 도메인으로부터 shRNA를 자를 것이고, 이에 따라 융합 단백질과 NA-결합 도메인 사이의 복합체로부터 shRNA가 방출되기 때문에 유리하다. 추가로, shRNA는 세포질 내에 방출되어 기능하기 위해 어떠한 캡(cap) 또는 폴리A 테일(polyA tail)도 필요로 하지 않기 때문에 잘려진 shRNA는 그 즉시 높은 활성으로 유전자를 침묵시킬 준비가 된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명에 따른 NA 카고 분자는 (i) 융합 폴리펩타이드의 NA-결합 도메인을 위한 적어도 하나의 결합 부위 및 (ii) 치료적 폴리뉴클레오타이드 도메인을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 이 NA 카고 분자는 적어도 둘의 결합 부위를 포함하고, 더욱 바람직하게는 더 높은 수의 결합 부위, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 그 이상의 수의 결합 부위를 포함한다. 발명자들은 4 내지 8 결합 부위를 포함하는 것이 NA 카고 분자의 방출 및 생물활성적 전달에 부정적인 영향없이 EV로 NA 카고 분자를 적재하는데 최적임을 깨달았다. 이 NA-결합 도메인을 위핸 결합 부위는 3' 및/또는 5' UTR 내 및/또는 그 옆에 및/또는 NA 카고 분자의 암호화 영역에 위치한 서열 최적화를 통해 유전적으로 조작될 수 있다.
본 발명에 따른 NA 카고 분자는 이의 치료적 부분의 방출을 가능하게 하기 위해 유리하게는 적어도 하나의 결합 부위 및 치료적 폴리뉴클레오타이드 도메인 사이에 적어도 하나의 분할 부위(cleavage site)를 포함할 수 있다.
일반적으로, NA 카고 분자는 다양한 기능, 예를 들어 관심 단백질(치료적 활성을 갖는 단백질과 같은)의 암호화, 표적과의 안티센스 상호작용을 통한 표적 뉴클레오타이드 서열의 침묵, 스플라이싱(splicing)의 전환 및/또는 차단, 예컨대 RNase H-매개 절단 또는 RISC 복합체 매개 RNA 간섭(RNAi)을 통한 표적 뉴클레오타이드 서열의 매개 절단을 수행하도록 의도될 수 있다. 특히 관심있는 실시형태에서, NA 카고 분자는 하나 이상의 기능을 수행할 수 있고, 예를 들어 관심 단백질을 암호화할 수 있고 예컨대 안내 기능을 가질 수 있는 NA 서열을 포함할 수 있다. 이의 특히 유리한 예시는 CRISPR-관련 단백질[Cas, Cas9(비-제한적 예시로 수탁번호 Q99ZW2를 갖는 Cas9를 서열번호 7에 나타냄), 및/또는 Cas6과 같은]을 암호화하고 또한 CRISPR-관련 단백질을 유전자 편집을 위한 표적 서열 및/또는 예컨대 상동직접수선을 위한 정확한 DNA 가닥으로 향하게 하는 안내 가닥을 포함하는 NA 분자이다. 이러한 실시형태에서, NA 분자에 분할 부위를 포함하는 것은 NA 카고 분자에 의해 암호화된 단백질 및 이 NA 카고 분자에 포함된 안내 가닥 중 하나 또는 둘 다의 방출을 가능하게 하기 위해 특히 유리하다.
NA 카고 분자에 의해 암호화될 수 있는 단백질의 비-제한적인 예시는 다음을 포함한다: 항체, 인트라바디, 단일 사슬 가변 단편, 애피바디, 효소, 수송체, 종양 억제제(비-제한적 예시로 p53, p21, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7, 및/또는 ST15를 포함함), 바이러스 또는 박테리아 저해제, 세포 구성요소 단백질, DNA 및/또는 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로티나제, 인테그라아제, 전사인자, 성장인자, 세포자멸사 저해제 및 유도제, 독소, 구조 단백질, 신경영양인자, 막 수송체, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 열충격 단백질, CRISPR-관련 단백질, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 카스파제(caspase) 및 이들의 임의의 조합 및/또는 유도체.
NA 카고 분자 및 융합 폴리펩타이드 작제물의 설계는 적재, 방출 및 생물활성적 전달, 예컨대 표적 세포 및/또는 특정 기관, 조직, 및 신체의 구성요소로의 생물활성적 전달을 위한 열쇠이다. 본 발명자들은 특히 유리한 실시형태가 적어도 하나의 NA-결합 도메인에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에(즉, 일측면에 또는 각 측면에 적어도 하나의 NA-결합 도메인이) 놓인 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV라는 것을 발견하였다. 대안적으로, 예를 들어 외생적 적재를 강화하기 위해 NA-결합 도메인이 EV의 외측에 드러나는 것이 바람직할 때, NA-결합 도메인은 엑소좀 폴리펩타이드의 적어도 하나의 위치[예를 들어 CD63의 외소포 루프(extravesicular loop)]에 삽입되는 다양한 경우일 수 있다. 이 엑소좀 폴리펩타이드는 C 및/또는 N 말단적으로 바로 측면에 접해질 수 있으나, 가장 유리한 설계는 엑소좀 폴리펩타이드 및 NA-결합 도메인 모두의 활성을 유지하기 위한 공간 및 유연성을 제공하기 위해 엑소좀 폴리펩타이드 및 NA-결합 도메인 사이에 링커 펩타이드를 포함하는 것이다. 이러한 링커는 유리하게는 특정 수의 반복을 함유하는 글리신-세린(glycine-serine: GS) 링커일 수 있다. 본 발명자들은 너무 체계적이지 않게 융합 단백질을 만들지 않고 충분한 유연성을 제공하기 위해 1 내지 4 반복이 가장 유리하다는 것을 깨달았으나, 더 긴 링커 및 비-GS-기반 링커 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 위에서 언급한 바와 같이, NA 카고 분자의 외생적 적재를 포함한 적용을 위해, EV는 바람직하게는 엑소좀의 표면 상에 NA 결합 도메인을 노출시키기 위해, 적어도 하나의 NA 결합 도메인이 N 말단, 및/또는 C 말단 및/또는 엑소좀 폴리펩타이드의 임의의 외소포(즉, EV의 외측에 존재하는) 영역 상에 융합된 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함한다.
융합 폴리펩타이드 작제물의 엑소좀 폴리펩타이드 구성요소의 설계 및 선택은 효과적인 EV 형성, EV로의 NA 적재, 및 NA 카고 분자 방출의 열쇠이다. 엑소좀 단백질은 다음의 비-제한적 예시로부터 선택될 수 있다: CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, AARDC1, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 신데칸-4, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, TNFR, gp130, Fc 수용체, 인터루킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 구성요소, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 다른 엑소좀 폴리펩타이드, 및 이들의 임의의 조합.
위에서 언급했듯이, 본 발명에 따른 EV에는 융합 폴리펩타이드의 도움으로 NA 카고 분자가 적재된다. 이론에 구애됨 없이, 이 적재는 조작된 EV와 NA 카고 분자를 항온처리함에 따른 EV-생산 세포 내부 또는 외생적인 EV의 형성과 관련하여 발생하는 것으로 추측된다. 이 융합 폴리펩타이드는 일반적으로 NA 카고 분자(EV-생산 세포에서 상호-발현되는 mRNA 분자와 같은)에 결합할 수 있고 이를 이후 EV로 방출되는 소포 내로 운반할 수 있다. 언급했듯이, 이 NA 카고 분자는 융합 폴리펩타이드와 같은 EV-생산 세포 내에 발현될 수 있고 그리고/또는 EV가 형성되면 EV 내로 외생적으로 적재될 수 있고 선택적으로 정제될 수 있다. EV 생산이 단일 세포에서 단일 단계로 수행되므로, EV-생산 세포 내 NA 카고의 상호-발현은 매우 유리한 실시형태이고, 이는 공정의 크기 조절 및 상위 및 하위 공정 단순화를 가능하게 한다. 이 NA 카고 분자(예컨대, mRNA, shRNA, miRNA, 원형 RNA, DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 등)는 융합 폴리펩타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드 작제물로부터 발현되거나, 다른 작제물로부터 발현될 수 있다. 두 방법 모두 장점을 갖는다: 하나의 작제물을 사용하는 경우 융합 폴리펩타이드 및 NA 카고 분자 모두 함께 번역/전사되는 것이 보장되는 반면 둘 이상의 작제물을 사용하는 경우 두 구성요소의 상이한 발현, 예컨대 융합 폴리펩타이드 또는 NA 카고 분자의 더 높은 수준의 발현이 가능하다. 바람직한 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드 및/또는 NA 카고 분자가 발현되는 폴리뉴클레오타이드 작제물은 유리하게는 NA-적재 EV의 일관성, 재생산성 및 고효율 생산을 가능하게 하기 위해 EV-생산 세포에 안정적으로 도입된다. 바람직한 실시형태에서, EV-생산 세포는 이 융합 폴리펩타이드 및 NA 카고 분자를 포함하는 바이시스트로닉(bicistronic) 또는 멀티시스트로닉(multicistronic) 벡터(또한 작제물 또는 폴리뉴클레오타이드, 등으로 알려진)로 안정적으로 형질감염 및/또는 형질도입된다. 이러한 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 작제물은 (i) NA-결합 도메인 및 엑소좀 단백질을 포함하는 융합 폴리펩타이드, 및 (ii) 관심 NA 카고 분자, 예를 들어 mRNA, shRNA, miRNA, 또는 임의의 다른 유형의 NA 카고 분자 모두의 발현이 가능하도록 예컨대 IRES 요소 또는 2A 펩타이드 결합을 포함할 수 있다. 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 벡터를 사용하는 것에 더해, 다중 또는 양방향 프로모터는 본 발명에 따른 EV에 적재되는 두 관심 구성요소를 암호화하는 단일 작제물을 안정하게 삽입하기 위한 다른 다루기 쉬운 방법을 제시한다. 비록 단일 작제물을 사용하는 것이 융합 폴리펩타이드(및 이에 따른 NA-결합 도메인)와 NA 카고 분자 자체의 등몰(equimolar) 농도를 가능하게 하기 위해 유리하지만, 분명하게, 대안적인 실시형태에서, 둘 또는 셋 이상의 작제물(예를 들어 플라스미드) 또한 EV-생산 세포 내로 형질감염 및/또는 형질도입될 수 있다. 중요하게는, 본 발명의 EV-생산 세포는 일반적으로 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물이 과발현되도록 설계되어 NA 카고 분자가 EV-생산 세포 내에서 적절한 농도로 생산될 수 있게 하고, 이에 따라 NA-결합 도메인이 NA 분자에 가역적으로, 방출가능하게 부착하는 것을 가능하게 한다. 이 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 EV-생산 세포 내 비교적 높은 NA 카고 분자 농도를 생성할 수 있게 하면서, 같은 때 NA 카고 분자의 농도가 낮은 표적 세포로 NA 카고 분자를 방출할 수 있게 하는 중요한 수단이다. 이것은 특히 PUF 및 Cas 단백질과 관련이 있다.
추가 실시형태에서, 본 발명에 따른 EV는 관심 세포, 조직, 기관, 및/또는 구획으로 표적화 전달을 가능하게 하는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 이 표적화 모이어티는 융합 폴리펩타이드 자체에 포함될 수 있고, 이는 특히 EV의 표면 상에 표적화 모이어티의 노출을 가능하게 하기 위해 엑소좀 폴리펩타이드를 막관통 도메인과 함께 사용할 때 유리하다. 표적화 모이어티는 단백질, 펩타이드, 항체의 단일사슬 단편 또는 임의의 다른 유도체, 등일 수 있다. 이 표적화 모이어티는 또한 EV에 포함되는 별도의 폴리펩타이드 작제물의 일부를 형성할 수 있다. 또한, 본 발명의 EV에 포함되는 융합 폴리펩타이드는 생물활성적 전달을 강화하기 위해 다양한 추가 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 모이어티 및/또는 도메인은 다음 기능적 도메인의 비-제한적 예시를 포함할 수 있다: (i) EV 형성 및/또는 적재를 개선하기 위해 융합 폴리펩타이드를 이합체화, 삼합체화, 또는 다합체화하는 다합체화 도메인, (ii) 입체적 장애를 피하고 유연성을 제공하기 위한 위에서 언급한 링커, (iii) 자가 절단 활성을 갖는 인테인(intein) 같은 시스-절단 요소와 같은 융합 폴리펩타이드 및/또는 NA 카고의 특정 부분의 방출에 유용한 방출 도메인, (iv) 수용 세포 내 RNA의 방출을 개선하기 위한 RNA 절단 도메인, 예를 들어 Cas6, Cas13과 같은 뉴클레아제를 암호화하는 도메인, (v) HA2, VSVG, GALA, B18, 등과 같은 탈엔도솜 도메인(endosomal escape domain), 및/또는 (vi) 핵 위치 신호(nuclear localization signal: NLS).
본 발명은 또한 NA 카고 분자의 다양한 창의적인 변경에 관한 것으로, 이는 고효율적 적재, 방출 및 생물활성적 전달의 열쇠이다. 예를 들어, 선형 또는 원형으로 NA 카고 분자를 설계하여 적재 효율 및 안정성과 같은 양상을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또한, 서열의 설계 최적화를 통해 NA 카고의 2차 및 3차 구조에 영향을 줄 수도 있고, 이는 NA 결합 도메인의 표적 NA에 대한 접근성을 쉽게 하여 적재를 도울 수 있다.
또 다른 유리한 실시형태에서, NA 카고 분자는 이의 적재 강화, 방출 개선, 조직-특이적 활성 증가, 및/또는 안정성 증가를 통해 능력을 증가시키기 위한 추가 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, NA 카고 분자는 다음 중 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다: (i) 우선적인 세포 및/또는 조직 특이적 활성을 유도하기 위한 miRNA 결합 부위, 이러한 부위는 선택적으로 조직 및/또는 세포 유형 특이적임, (ii) 하나의 긴 폴리A 테일 또는 둘 이상의 폴리 폴리A 테일(예를 들어 2 또는 3 또는 심지어는 4 폴리A 테일)과 같은 적어도 하나의 안정화 도메인, (iii) 뉴클레아제 분해를 억제하기 위한 5' 및/또는 3' UTR 내 적어도 하나의 스템루프 구조, (iv) NA 카고 분자의 전사를 유도하기 위한 RNA 중합효소, (v) mRNA 안정성을 높이기 위한 코돈-최적화 서열, (vi) mRNA 번역 효율을 높이기 위한 5' 및/또는 3' 말단 내 적어도 하나의 혼성 UTR, 및/또는 (vii) 리보자임.
위에서 언급했듯이, EV는 전형적으로 단일 소포가 아닌 실질적으로 복수의 소포로 존재하며, 그러므로 본 발명은 또한 EV의 개체군에 관한 것이다. 유리한 실시형태에서, 이러한 개체군에 걸쳐 EV당 NA 카고 분자의 평균수는 평균 1 이상이며, 바람직하게는 10 이상, 그리고 보다 바람직하게는 100 이상이다. 하지만, 이 개체군에 걸쳐 어떠한 NA 카고 분자도 포함하지 않는 EV가 있을 수 있으며, 그러므로 본 발명은 또한 EV당 NA 카고 분자를 평균 1 미만으로 포함하는 EV 개체군에 관한 것이다.
중요하게는, 선행기술은 전형적으로 단지 EV 중 적은 일부에만 RNA 카고를 적재한다. 예를 들어, US14/502,494에 기술된 TAMEL 시스템은 EV에 특히 엑소좀에 정량화할 수 있는 적재를 가능하게 하는 것으로 보이지 않는다. 이는 TAMEL 시스템이 단일 EV의 0 내지 1 이하 퍼센트의 적재를 초래하는 것처럼 나타낸다. TAMEL 시스템의 발명자들은 TAMEL 시스템을 사용할 때 RNA 분자의 엑소좀 내 적재가 최대 7배 강화된다고 보고한 반면, 본 발명은 예컨대 mRNA 및 다른 NA 카고 분자의 생산적 적재를 (i) 융합 단백질 내 NA-결합 도메인이 없는 EV 및/또는 NA 카고 분자 내 NA-결합 도메인 결합 부위가 없는 EV, (ii) 융합 단백질 자체가 없는 EV(예를 들어 도 2에 나타낸 바와 같이), (iii) NA 카고 분자가 단지 수동적으로 적재된 비-조작 EV, 및/또는 (iv) 주어진 내부 NA 대조 분자와 비교하여 전형적으로 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 25배, 그러나 빈번하게는 적어도 50배, 및 바람직하게는 적어도 70배 개선한다. 따라서, 본 발명은 주어진 EV 개체군에 상당히 더 많은 NA 카고 분자를 적재하는 방법을 제공하며, 중요하게는 본 발명은 또한 선행기술과 비교하여 상당히 더 높은 비율의 EV를 적재할 수 있게 한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 모든 EV 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및/또는 적어도 95%가 문제의 NA 카고 분자를 포함하는 EV 개체군에 관한 것이다.
위에서 언급했듯이, 본 발명과 US14/502,494 및 다른 선행기술문헌 사이의 결정적인 차이는 EV의 전체 개체군에 걸쳐 융합 폴리펩타이드의 비효과적이고 중요하게는 고르지 못한 분포에 관한 것이다. 예를 들어, US14/502,494에서 사용되는 MS2 단백질은 단지 EV 중 적은 일부에만 존재하고, 이는 EV 개체군에 걸쳐 고르지 못한 적재 분포를 초래한다. 반대로, 본 발명의 융합 단백질은 전체 EV 개체군에 걸쳐 고르게 분포하며, 이는 본질적으로 각각 및 모든 EV가 본 발명에 따른 적어도 하나의 융합 폴리펩타이드 및 일반적으로 적어도 하나의 NA 카고 분자를 포함한다는 것을 의미한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 본질적으로는 두 EV 하위개체군을 포함하는 EV 조성물에 관한 것이며, 여기서 (i) 첫째 EV 하위개체군은 EV당 평균 둘 이상의 융합 폴리펩타이드(NA-결합 도메인 및 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는)를 포함하고, (ii) 둘째 EV 하위개체군은 EV당 평균 둘 이상의 융합 폴리펩타이드와 결합된 문제의 NA 카고 분자를 포함한다. 대조적으로, 선행기술, 예를 들어 US14/502,494는 EV당 매우 적은 융합 폴리펩타이드, 전형적으로 10 EV당 1 미만의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 EV를 교시하며, 이는 이 융합 단백질에 의존하는 NA 카고 분자의 생산적인 적재 및 전달이 본 발명의 경우보다 현저히 낮을 것임을 암시한다. 이론에 구애받지 않고, 선행기술이 EV로의 융합 단백질 적재를 높이는데 실패한 이유는 MS2 및 유사 비-진핵생물성 단백질이 엑소좀으로 효과적으로 수송하지 못하고 그리고/또는 이들이 독성을 일으킨다는 본 발명에 의해 다루어지는 두 가지 문제로부터 야기된다고 추측된다.
다른 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 NA-결합 도메인 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 창의적인 융합 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서 이 적어도 하나의 NA-결합 도메인은 PUF, Cas, 및/또는 NA 압타머-결합 도메인 중 하나 또는 둘 이상이다. 유리한 실시형태에서, 이 융합 폴리펩타이드는 특정 기능을 이 폴리펩타이드에 부여하는 추가적인 영역, 도메인, 서열, 및/또는 모이어티를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 이 융합 폴리펩타이드에 포함되는 추가적인 도메인의 비-제한적인 예시는 (i) 다합체화 도메인, (ii) 링커, (iii) 방출 도메인, (iv) RNA 절단 도메인, (v) 탈엔도솜 모이어티, (vi) 단백질분해효소 특이적 절단 부위, (vii) 인테인 및/또는 (viii) 표적화 모이어티를 포함한다.
다합체화 도메인은 융합 폴리펩타이드의 이합체화, 삼합체화, 또는 임의의 더 높은 수의 다합체화를 가능하게 하고, 이는 융합 폴리펩타이드가 EV 내부로 분류되고 트래피킹되는 것을 증가시키며 또한 EV-생산 세포에 의해 생산되는 소포의 수율 증가에도 기여할 수 있다. 링커는 융합 폴리펩타이드 작제물 및 상응하는 폴리뉴클레오타이드 작제물의 유연성을 증가시키기에 유용하고, 또한 입체 장해를 피하고 융합 폴리펩타이드의 기능성을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 방출 도메인은 본래의 융합 폴리펩타이드로부터 특정 부분 또는 도메인의 방출을 위해 융합 폴리펩타이드 작제물에 포함될 수 있다. 이는 이 융합 폴리펩타이드 부분의 방출이 NA 카고의 생물활성적 전달을 증가시키는 경우 및/또는 융합 폴리펩타이드의 특정 기능이 더 작은 작제물의 부분일 때 더 잘 작동하는 경우에 특히 유리하다. 적합한 방출 도메인은 인테인과 같은 시스-절단 서열, Kaede, KikGR, EosFP, tdEosFP, mEos2, PSmOrange, GFP-유사 덴드라(Dendra) 단백질 Dendra 및 Dendra2, CRY2-CIBN, 등과 같은 빛 유도 단량체적 또는 이합체적 방출 도메인을 포함할 수 있다. 또한 NA-절단 도메인은 유리하게는 NA 카고의 절단을 일으키기 위해 융합 폴리펩타이드에 포함될 수 있다. NA 절단 도메인의 비-제한적 예시는 Cas6, Cas13, 조작된 PUF 뉴클레아제, 부위 특이적 RNA 뉴클레아제 등과 같은 엔도뉴클레아제를 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 탈엔도솜 및 이에 따른 EV 자체 및 EV NA 카고 분자의 생물활성적 전달 강화를 위한 탈엔도솜 도메인을 포함할 수 있다. 전달을 강화하기 위한 다른 전략은 EV를 세포, 조직, 및/또는 기관 또는 다른 신체 구성요소에 표적화하는 것이다. 표적화는 다양한 방법, 예를 들어 표적화 펩타이드의 사용으로 달성할 수 있다. 이러한 표적화 펩타이드는 몇 개의 아미노산 내지 100개의 아미노산, 예컨대 3 내지 100개의 아미노산, 3 내지 30개의 아미노산, 5 내지 25개의 아미노산, 예컨대 7개의 아미노산, 12개의 아미노산, 20개의 아미노산, 등의 길이일 수 있다. 또한 본 발명의 표적화 펩타이드는 수용체, 수용체 리간드, 등과 같은 전장의 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 표적화 펩타이드는 항체 및 항체 유도체, 예컨대 단클론 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 다른 항체 도메인, 등을 더 포함할 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 관한 것이다. 이 폴리뉴클레오타이드 작제물은 다양한 상이한 형태 및/또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다. 예를 들어, 이 폴리뉴클레오타이드는 본질적으로 선형, 원형일 수 있고 그리고/또는 임의의 2차 및/또는 3차 및/또는 더 높은 차수의 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 예컨대 플라스미드와 같은 벡터, 임의의 원형 DNA 폴리뉴클레오타이드, 미키-서클, 아데노바이러스와 같은 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, mRNA, 및/또는 변형된 mRNA에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 작제물은 폴리뉴클레오타이드에 특정 기능성을 부여하기 위해 하나 또는 둘 이상의 부위 또는 도메인을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 작제물의 안정성이 폴리A 테일 또는 스템루프와 같은 안정화 도메인의 사용을 통해 강화될 수 있고, 이 폴리뉴클레오타이드 작제물은 선택적으로 세포-유형 특이적일 수 있고, 유도가능한 프로모터, 링커, 등일 수 있는 특정 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 이 폴리A 테일은 선택적으로 Cas6 또는 Cas13 절단 부위의 업스트림에 삽입되어 안정화 폴리A 테일을 보유하는 mRNA의 절단을 초래할 수 있다.
또한 본 발명은 EV를 생산하기 위한 다양한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 (i) EV-생산 세포에 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물을 도입하는 단계, (ii) 이 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화된 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물을 이 EV-생산 세포에서 발현시키는 단계, 및 선택적으로 (iii) (ii)단계로부터 생산되며 관심 폴리펩타이드를 포함하는 EV를 이 EV-생산 세포로부터 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 어떤 실시형태에서, 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물이 사용될 수 있고, 다른 실시형태에서는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 작제물이 적용될 수 있다. 이론에 구해받지 않고, 폴리뉴클레오타이드 작제물이 도입(EV의 목적 및 용도에 따라 일시적으로 또는 안정적으로)된 EV-생산 세포는 이 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EV(엑소좀과 같은)를 생산하는 것으로 추측된다. 이 EV는 이후 전형적으로 세포 배양 배지로부터 선택적으로 수집될 수 있고, 특정 용도로 사용되기 전에 선택적으로 추가로 정제될 수 있다. 유리한 실시형태에서, 이 방법에 의해 생산된 EV는 융합 폴리펩타이드 작제물의 도움으로 EV에 적재되는 NA 카고 분자를 더 포함할 수 있다. 전형적으로, 단일 EV는 몇몇 카피의 NA 카고 분자를 포함하지만, 단일 EV는 또한 둘 이상의 유형의 NA 약물 카고 분자를 포함할 수 있다. 둘 이상의 유형의 NA 약물 카고를 포함하는 EV의 비-제한적 예시로, 단일 EV(즉, 단일 유형의 EV 개체군)는 예컨대 gRNA NA 약물 카고 분자 및 mRNA 약물 카고 분자를 포함할 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 (i) 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물 및/또는 (ii) 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 EV를 포함하는 세포에 관한 것이다. EV-생산 세포는 예컨대 1차 세포, 세포주, 다세포 유기체에 존재하는 세포, 또는 본질적으로 임의의 다른 유형의 세포 근원 및 EV-생산 세포 재료의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "근원 세포" 또는 "EV 근원 세포" 또는 "모세포" 또는 "세포 근원" 또는 "EV-생산 세포" 또는 임의의 다른 유사한 용어는 적합한 조건 하에서, 예를 들어 부유 배양 또는 부착 배양 또는 임의의 다른 배양 시스템 유형에서 EV를 생산할 수 있는 임의의 세포 유형에 관한 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 근원 세포는 또한 생체 내에서 엑소좀을 생산하는 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 근원 세포는 넓은 범위의 세포 및 세포주, 예를 들어 중간엽 줄기세포[예컨대 골수, 지방조직, 와튼 젤리(Wharton's jelly), 출산전후 조직(perinatal tissue), 태반, 치아싹, 제대혈, 피부 조직, 등으로부터 얻을 수 있음], 섬유아세포, 양막 세포 및 보다 구체적으로는 선택적으로 다양한 초기 마커를 발현하는 양막 상피 세포, 골수성 억제 세포(myeloid suppressor cell), M2 양극화 대식세포(M2 polarized macrophage), 지방세포, 상피 세포, 섬유아세포, 등으로부터 선택될 수 있다. 특정 관심 세포주는 인간 탯줄 내피 세포(HUVEC), 인간 배아 신장(HEK) 세포, 미세혈관 또는 림프 내피 세포와 같은 내피 세포주, 적혈구, 적혈구 전구세포, 연골세포, 다른 기원의 MSC, 양막 세포, 양막 상피(AE) 세포, 양수천자를 통해 또는 태반으로부터 얻어지는 임의의 세포, 기도 또는 폐포 상피 세포, 섬유아세포, 내피 세포, 등을 포함한다. 또한, B 세포, T 세포, NK 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포(DC)와 같은 면역 세포도 본 발명의 범위 내에 있으며, 본질적으로 EV를 생산할 수 있는 임의의 세포 유형도 여기에 포함된다. 일반적으로, EV는 본질적으로 임의의 세포 근원으로부터 파생되거나, 1차 세포 근원 또는 불멸화 세포주일 수 있다. 이 EV 근원 세포는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 및 임의의 방법에 의해 파생된 다른 줄기 세포를 포함하는 임의의 배아, 태아, 및 성체 줄기 세포 유형일 수 있다. 신경 질환을 치료할 때, 근원 세포, 예를 들어 1차 뉴런, 성상세포, 희돌기교세포, 소교 세포, 및 신경전구세포로 이용하는 것을 고려할 수 있다. 이 근원 세포는 치료할 환자의 환경 내 동종이계, 자가유래, 또는 이종발생성, 즉 환자 자신 또는 관련없거나 일치하거나 일치하지 않는 기증자로부터의 세포일 수 있다. 특정 상황에서, 동종이계 세포는 이들이 특정 징후를 겪는 환자의 자가유래 세포로부터는 얻을 수 없을 면역-조절 효과를 제공할 수 있으므로 의료적 관점에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, 전신성, 말초성 및/또는 신경성 염증을 치료하는 상황에서, 동종이계 MSC 또는 AE는 이들 세포로부터 얻을 수 있는 EV가 예컨대 대식세포 및/또는 호중구 표현형 스위칭(각각 전-염증성 M1 또는 N1 표현형으로부터 항염증성 M2 또는 N2 표현형으로)을 통해 면역-조절을 가능하게 할 수 있으므로 바람직할 수 있다.
위에서 언급했듯이, 바람직한 실시형태에서 본 발명의 EV-생산 세포는 (i) NA-결합 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 (ii) NA 카고 분자를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물로 안정적으로 형질감염 및/또는 형질도입된다. 매우 바람직한 실시형태에서, EV-생산 세포는 단일세포 클론의 클론 선택을 위한 클론 선택 프로토콜을 거치게 된다. 따라서, 매우 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 융합 폴리펩타이드 및 NA 카고 분자를 포함하는 EV를 생산하기 위해 형질감염 및/또는 형질도입되는 EV-생산 세포의 단일 세포 클론 개체군에 관한 것이다. 이 단일 클론은 한계희석법, 단일-세포 구분법, 및/또는 클로닝 실린더를 사용한 개별 세포 분리법을 사용하여 얻을 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 RNA 카고 분자의 세포 내 전달을 위한 시험관 내 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 유리하게는 시험관 내 및/또는 생체 외에서 수행될 수 있다. 이 방법은 표적 세포와 본 발명에 따른 적어도 하나의 EV 또는 보다 일반적으로는 본 발명에 따른 EV 개체군을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 RNA 카고 분자의 전달 방법은 임의의 생물학적 시스템(인간과 같은)에 존재하는 세포에 본 명세서의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것을 포함할 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 전형적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제 또는 유사물과 제형화한 다음의 성분 중 하나 또는 둘 이상을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다: (i) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물, (ii) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물, (iii) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 EV, (iv) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 세포, 및/또는 (v) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 EV 개체군. 또한, 본 발명은 의약 용도의 (i) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물, (ii) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물, (iii) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 EV, (iv) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 세포, 및/또는 (v) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 EV 개체군, 및 (vi) 위에서 언급된 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 다양한 질환의 예방 및/또는 치료 및/또는 완화의 용도에 관한 것이다. 질환 및 상태의 비-제한적 예시는 다음의 비-제한적 예시를 포함한다: 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 전신홍반루푸스, 사르코이드증, 특발성 폐섬유증, 건선, 종양괴사인자(TNF) 수용체-관련 주기성 증후군(tumor necrosis factor receptor-associated periodic syndrome: TRAPS), 인터류킨-1 수용체 길항제의 결핍증(deficiency of the interleukin-1 receptor antagonist: DIRA), 자궁내막증, 자가면역성 간염, 경피증, 근염, 뇌졸중, 급성 척추 손상, 혈관염, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 급성심근경색증, ARDS, 패혈증, 뇌수막염, 뇌염, 간부전, 비알코올성지방간염(non-alcoholic steatohepatitis: NASH), 비알코올성지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD), 신부전, 심부전 또는 임의의 급성 또는 만성적 기관부전 및 관련된 근본적인 병인, 이식편대숙주질환, 뒤쉔 근육 영양장애(Duchenne muscular dystrophy) 및 다른 근육 영양장애, 고쉐병(Gaucher disease), 파브리병(Fabry's disease), MPS I, II(헌터증후군), 및 III, A, B, 및 C형 니만피크병(Niemann-Pick disease), 폼페병(Pompe disease), 등과 같은 리소솜 저장 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 다른 트라이뉴클레오타이드 반복-관련 질환을 포함하는 신경퇴행성질환, 치매, ALS, 암-유도성 악액질, 식욕부진(anorexia), 2형 당뇨병, 및 다양한 암. 사실상 암의 모든 유형이 본 발명의 관련 질환 표적, 예를 들어 급성림프구성백혈병(Acute lymphoblastic leukemia: ALL), 급성 골수성 백혈병, 부신피질암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 소뇌 또는 뇌의, 기저세포암종, 담관암, 방광암, 골종양, 뇌간교종(Brainstem glioma), 뇌암, 뇌종양[소뇌성상세포종(cerebellar astrocytoma), 뇌성상세포종(cerebral astrocytoma)/악성뇌교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 시각경로 및 시상하부 신경교종(visual pathway and hypothalamic glioma)], 유방암, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 림프종, 유암종(Carcinoid tumor)(소아기, 위장), 기원불명원발암종(Carcinoma of unknown primary), 중추신경계 림프종, 소뇌성상세포종/악성 뇌교종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 대장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직성 소원형세포종양(Desmoplastic small round cell tumor), 자궁내막암, 뇌실막세포종(Ependymoma), 식도암, 두개외 배아세포종(Extracranial germ cell tumor), 생식선외 배아세포종, 간외담관암, 안종양(Eye Cancer)(안내 흑색종(Intraocular melanoma), 망막모세포종), 담낭암, 위암(Gastric(Stomach) cancer), 위장관 카르시노이드 종양, 위장관기질종양(Gastrointestinal stromal tumor: GIST), 배아세포종양(두개외, 생식선외, 또는 난소), 임신영양막종양(Gestational trophoblastic tumor), 신경교종(뇌줄기 신경교종, 뇌성상세포종, 시각경로(visual pathway) 및 시상하부 신경교종), 위유암종(Gastric carcinoid), 모발상세포백혈병(Hairy cell leukemia), 두경부암, 심장암, 간세포성(간) 암, 호지킨 림프종, 하인두암(Hypopharyngeal cancer), 안내흑색종(Intraocular Melanoma), 섬세포암종(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암(신장세포암), 후두암, 백혈병(급성 림프아구성(급성림프구 백혈병으로도 불림), 급성 골수성(급성 골수성 백혈병으로도 불림), 만성 림프구성(만성 림프구성 백혈병으로도 불림), 만성 골수성(만성 골수성 백혈병으로도 불림), 모발상세포 백혈병(hairy cell leukemia)], 입술 및 구강, 비강암, 지방육종, 간암(원발성), 폐암(비소세포, 소세포), 림프종, AIDS-관련 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨, 수모세포종, 머켈세포암종(Merkel Cell Carcinoma), 악성중피종, 잠복 원발성 전이성 편평 경부암(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary), 구강암(Mouth Cancer), 다발성 내분비선종증(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome), 다발성골수종/형질세포종양(Plasma Cell Neoplasm), 균상식육종(Mycosis Fungoides), 골수이형성(Myelodysplastic)/골수증식성(Myeloproliferative) 질환, 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(급성, 만성), 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두암종, 신경모세포종, 구강암, 구인두암, 골육종(Osteosarcoma)/뼈의 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma of bone), 난소암, 난소상피암(표면 상피적-기질성 종양(Surface epithelial-stromal tumor)), 난소 배아세포종(Ovarian germ cell tumor), 난소 경계악성종양(Ovarian low malignant potential tumor), 췌장암, 췌장 섬세포 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종(Pheochromocytoma), 송과체 성상세포종(Pineal astrocytoma), 송과체 배아세포종(Pineal germinoma), 송과체모세포종(Pineoblastoma) 및 천막상 원시 신경외배엽종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 뇌하수체선종(Pituitary adenoma), 가슴막폐모세포종(Pleuropulmonary blastoma), 전립선암, 직장암, 신장세포암종(신장암), 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종(종양 육종의 유잉 패밀리(Ewing family of tumors sarcoma), 카포시육종, 연조직 육종, 자궁육종), 시자리 증후군(Sezary syndrome), 피부암(비흑색종(nonmelanoma), 흑색종), 소장암, 편평세포, 편평 경부암(Squamous neck cancer), 위암, 천막상 원시 신경외배엽종양(Supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선암(Thymic carcinoma), 갑상선암, 신우(renal pelvis) 및 요관(ureter)의 이행세포암(Transitional cell cancer), 요도암, 자궁암, 자궁육종, 질암, 음문암, 발텐스트롬마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 및/또는 빌름스종양(Wilm's tumor)이다.
본 발명에 따른 EV는 전형적으로는 치료할 질환 및/또는 EV, 문제의 NA 카고 분자, 또는 EV 개체군의 특성에 의존하여, 다양한 상이한 투여경로, 예를 들어 귀(auricular(otic)), 협측(buccal), 결막, 피부, 치아, 전기-침투(electro-osmosis), 자궁경내(endocervical), 내시경술(endosinusial), 기관내(endotracheal), 장관, 경막외(epidural), 양막외(extra-amniotic), 체외(extracorporeal), 혈액투석, 침윤, 간질(interstitial), 복강내, 양막내(intra-amniotic), 동맥내, 관절내, 담도내(intrabiliary), 기관지내, 활액낭내(intrabursal), 심장내, 연골내, 미골부내(intracaudal), 해면내(intracavernous), 강내(intracavitary), 뇌내, 수조내(intracisternal), 각막내, 치관내(intracoronal)(치아), 관상동맥내, 해면체내(intracorporus cavernosum), 피부내, 디스크내(intradiscal), 관내(intraductal), 십이지장내, 경막내, 표피내, 식도내, 위내(intragastric), 잇몸내(intragingival), 회장내(intraileal), 병변내, 내강내, 림프내, 수질내, 수막내(intrameningeal), 근육내, 안구내, 난소내, 심강내(intrapericardial), 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 장내(intrasinal), 척수내, 활액내, 힘줄내(intratendinous), 고환내, 척추강내, 흉곽내, 관내(intratubular), 종양내, 고막내(intratympanic), 자궁내, 혈관내, 정맥내, 정맥내대량주입(intravenous bolus), 정맥내방울주입(intravenous drip), 심실내, 방광내(intravesical), 유리체내, 이온도입법(iontophoresis), 관류(irrigation), 후두, 코, 코위(nasogastric), 밀봉붕대법(occlusive dressing technique), 안구, 구강, 구강인두(oropharyngeal), 이외, 비경구, 경피(percutaneous), 관절주위(periarticular), 경막주위(peridural), 신경주위(perineural), 치주(periodontal), 직장, 호흡(흡입), 안구뒤(retrobulbar), 연조직, 지주막하, 결막하, 피하, 설하, 점막하(submucosal), 국부(topical), 경피(transdermal), 경점막, 경태반(transplacental), 경기관(transtracheal), 경고막(transtympanic), 요관, 요도, 및/또는 질 투여, 및/또는 상기 투여경로의 임의의 조합을 통해 인간 또는 동물 대상에 투여될 수 있다.
실시예 및 실험 부분
재료 및 방법
Figure pct00001
작제물 설계 및 클로닝
다양한 NA-결합 도메인 및 이의 변이체(예컨대 PUF, 변이된 PUF, PUFx2, Cas6, 변이된 Cas6, Cas13, 변이된 Cas13, 등)를 몇몇 엑소좀 폴리펩타이드(CD81, CD63, CD9, 신테닌, 신데칸, Alix, CD133, 등)와 조합하여 평가하였다. ORF를 전형적으로 합성하여 생성하였고 포유동물 발현 벡터 pSF-CAG-Amp에 클로닝하였다. 간략하게, 합성한 DNA 및 벡터 플라스미드를 제조사의 지시(NEB)에 따라 NotI 및 SalI 효소로 소화시켰다. 제한효소처리, 정제된 DNA 단편을 제조사의 지시(NEB)에 따라 T4 리가제를 사용하여 결찰하였다. 암피실린-보충된 플레이트에서 박테리아 형질전환으로 성공적으로 결찰된 경우를 선별하였다. 형질감염을 위한 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 'maxi-prep'으로 생성하였다.
Figure pct00002
세포 배양 및 형질감염
실험 설계 및 검정법에 따라, 특정 경우에, 통상적인 2D 세포 배양에서 비-바이러스적 순간적 형질감염 및 EV 생산을 수행하였고, 다른 경우에 안정한 세포주를 제작하기 위해 바이러스-매개 형질도입을 적용하였으며, 상이한 유형의 바이오리액터 및/또는 진탕배양기에서 전형적으로 배양하였다. 간단 명료함을 위해, 본 명세서에서는 몇 가지의 실시예만을 언급한다.
HEK293T 세포를 15㎝ 접시에 접종(접시 당 9x106 세포)하고 ATCC의 권고에 따라 혈청-함유 DMEM 내에 밤새 두었다. 다음날 세포 상에 리포플랙스된(lipoplexed) DNA를 직접 첨가하여 세포를 순간 형질감염시켰다. 간략하게, DNA 및 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine: PEI)을 상온에서 20분간 함께 배합하기 전 5분간 OptiMEM 내에서 분리하여 항온처리하였다. 리포플랙스된 DNA 및 세포를 6시간 동안 상호-항온처리한 다음 48시간 동안 조건배양배지를 OptiMEM으로 교체하였다. 접시, 플라스크 및 다른 세포 배양 용기에서 평가된 다른 세포 및 세포주는 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 와튼젤리-유래 MSC(WJ-MSC), 양막 세포, 양막 상피 세포, 섬유아세포, 다양한 내피 및 상피 세포, 뿐만 아니라 다양한 면역 세포 및 세포주를 포함하였다.
다양한 융합 폴리펩타이드 작제물 및 NA 카고 분자 조합을 위한 바이러스적 형질도입 및 안정한 세포주의 제작의 경우에, BM-MSC, WJ-MSC, 섬유아세포, 양막 상피 세포, 섬유아세포, 다양한 내피 및 상피 세포와 같은 세포 근원을 전형적인 렌티바이러스(LV) 형질도입을 사용하여 바이러스-형질도입하였다. 전형적으로, 감염 24시간 전, 6-웰 플레이트에 100.000개 세포(예컨대 섬유아세포, MSC, 등) 또는 200.000개 세포(예컨대 HEK293T)를 플레이팅한다. 2㎕의 LV 및 선택적으로 폴리브렌(Polybrene)[또는 브로민화 헥사다이메트린(hexadimethrine bromide), 웰 상 최종 농도 8㎍/㎖]을 첨가하고, 형질도입 24시간 후 형질도입된 세포의 세포 배지를 신선한 완전배지로 교체한다. 형질도입 72시간 후, 일반적으로 7일 동안 퓨로마이신(puromycin) 선별(4 내지 6㎍/㎖)을 수행하고, 그 다음 융합 폴리펩타이드의 안정적인 발현을 분석한다.
안정한 세포를 2D 배양 또는 바이오리액터에서 배양하였고 엑소좀 준비를 위해 이후 조건배지를 수득하였다. 다양한 준비 및 정제 단계를 수행하였다. 표준 작업흐름은 상등액의 전-청소, 여과-기반 농축, 단백질 오염물의 크로마토그래피-기반 제거, 및 시험관 내 및/또는 생체 내 검정을 위해 적합한 완충제로 얻어진 엑소좀 조성물의 선택적 제형화의 단계를 포함한다.
Figure pct00003
검정법 및 분석
웨스턴블롯은 EV 내 폴리펩타이드의 풍부화를 평가하기 위한 매우 편리한 분석방법이다. 간략하게, 제조사의 지시(Invitrogen, Novex PAGE 4-12% 겔)에 따라 SDS-PAGE를 수행하였고, 여기서 1×1010　엑소좀 및 20㎍ 세포 용해물을 각 웰에 로딩하였다. 제조사의 지시[Immobilon(RTM), Invitrogen]에 따라 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 PVDF 막으로 이동시켰다. 막을 Odyssey 블로킹 완충액(Licor)으로 블로킹하고 공급자의 지시(1차 항체 - Abeam, 2차 항체 - Licor)에 따라 NA-결합 도메인 폴리펩타이드 및/또는 엑소좀 단백질에 대한 항체로 탐침조사하였다. 680 및 800㎚ 파장에서 분자탐침을 가시화하였다.
EV의 크기를 결정하기 위해, 분석 소프트웨어가 갖추어진 NanoSight(RTM) 기기 또는 특별한 경우 입자 매트릭스 장치로 나노입자 추적 분석을 수행하였다. NanoSight(RTM) 상의 기록을 위해, 모든 획득-후 설정으로 13 또는 15의 카메라 레벨 및 자동 기능을 사용하였다. EV의 형태 및 크기를 확인 및 평가하기 위해 종종 전자현미경법 및 현광현미경법을 사용하였다.
다양한 방법, 전형적으로 TFF와 같은 여과와 크기별 배제 액체 크로마토그래피(size exclusion liquid chromatography) 및/또는 비드-용출 액체 크로마토그래피의 조합을 사용하여 EV를 분리 및 정제하였다. 전형적으로, EV-함유 배지를 수집하고 300g에서 5분 동안 저속 회전을 적용한 다음 큰 입자 및 세포 파편을 제거하기 위해 10분 동안 2000g 회전을 적용하였다. 상등액을 0.22㎛ 시린지 필터로 여과하고 상이한 정제 단계를 적용하였다. 큰 부피를 희석여과(diafiltrate)하고 100 kDa 컷오프 필터를 갖는 Vivaflow 50R tangential flow(TFF) 장치(Sartorius) 또는 100 또는 300 kDa 컷오프 할로우 파이버 필터를 갖는 KR2i TFF 시스템(SpectrumLabs)을 사용하여 대략 20㎖로 농축하였다. 이후 전농축된 배지를 AKTAprime plus 또는 AKTA Pure 25 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare Life Sciences)에 연결된 비드-용출 칼럼[HiScreen(RTM) 또는 HiTrap(RTM) Capto Core 700 칼럼, GE Healthcare Life Sciences] 상에 로딩하였다. 이 절차에서 칼럼 평형, 시료 로딩 및 칼럼 청소를 위한 흐름률 설정은 제조사의 지시에 따라 선택하였다. 시료를 UV 흡광도 크로마토그램에 따라 수집하고 Amicon Ultra-15 10 kDa 분자량 컷-오프 회전-필터(Millipore)를 사용하여 최종부피 100㎕로 농축하고 추가 하위 분석 때까지 -80℃에 보관하였다. 단백질 및 RNA 용출 프로파일을 평가하기 위해, 배지를 100 kDa 및 300 kD 할로우 파이버 필터를 사용한 KR2i TFF 시스템으로 농축 및 희석여과하고 시료를 Tricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow(S4FF) 칼럼(GE Healthcare Life Sciences) 상에서 분석하였다.
Figure pct00004
실시예
실시예 1. 골수-유래 MSC를 통상의 조직 배양 플라스크에서 배양하고 mRNA 카고 분자 및 융합 폴리펩타이드 작제물의 적재 및 발현을 가능하게 하기 위해 PEI 형질감염을 사용하여 순간 형질감염시켰다. 도 2는 BM-MSC로부터 얻은 EV에 NanoLuc(RTM) 및 p21을 암호화하는 mRNA 카고 분자가 적재된 것을 나타낸다. 엑소좀 폴리펩타이드로 CD63과 NA-결합 도메인으로 PUF 또는 Cas6을 포함하는 융합 폴리펩타이드 작제물을 사용하여 이 적재를 달성하였다. 또한 이 실험에는 암호화 영역의 3' 및/또는 5' 플랭크의 상이한 장소에 삽입된, NA-결합 도메인을 위한 결합 부위의 수, 즉 0, 3 및 6 결합 부위로 다양화하는 것도 포함된다.
TFF 및 SEC의 연속 조합을 사용하여 MSC-EV를 정제하였다. 엑소좀 폴리펩타이드 CD63 단독 발현은 어떤 mRNA도 EV에 적재되지 않았다(도 2 그래프의 칼럼 중 우측 세트). PUF(칼럼 중 좌측 세트: 두 개의 PUF 도메인이 N 말단 및 C 말단적으로 CD63에 플랭킹됨, 즉, 총 4개의 PUF 작제물)(좌측에서 칼럼 중 두 번째 세트: 하나의 PUF 도메인이 N 말단 및 C 말단적으로 CD63에 플랭킹됨) 및 변이된 Cas6(우측에서 두 번째)를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 발현은 EV 근원 세포 내 발현 상 NanoLuc(RTM) 및 p21 mRNA 모두 상당히 적재되었다. NanoLuc(RTM)의 적재가 p21의 적재보다 EV당 약 45카피의 mRNA까지 전체적으로 더 효과적이었다.
실시예 2. 헌팅틴 표적화 shRNA의 EV-매개 전달 상에서 표적 세포(HEK293 세포) 내 시험관 내 유전자 발현의 침묵. 진탕배양기에서 배양한 양막 세포를 각각 EV 폴리펩타이드로서 CD63 또는 CD81과 조합된 NA-결합 도메인으로서 PUF 또는 Cas6를 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 shRNA를 포함하는 EV를 분비하도록 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 형질도입하였다. 초원심분리를 이용하여 상등액으로부터 EV를 정제하였다. 도 3의 Y축은 NA 카고 분자 내 결합 부위의 수가 증가함에 따라 어떻게 헌팅틴 발현 수준이 감소하는지를 보여주며, 항-헌팅틴 shRNA를 적재하기 위한 PUF-CD63-PUF를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 사용하여 약 80% 넉다운이 초래된다.
실시예 3. NanoLuc(RTM) mRNA의 EV-매개 전달 후 표적 Huh7 세포 내 리포터 시스템으로서의 NanoLuc(RTM)의 발현. 리포터 NanoLuc(RTM) mRNA 카고를 EV 내에 적재하기 위한 다양한 융합 폴리펩타이드 작제물을 발현시키기 위해 HEK293T 세포를 안정적으로 형질도입하였다. 융합 폴리펩타이드 작제물, 이 경우 PUFx2-CD63-PUFx2(두 개의 PUF NA-결합 폴리펩타이드가 엑소좀 폴리펩타이드 CD63의 N 말단 및 C 말단 모두에 삽입됨), PUF-CD63-PUF, 및 Cas6-CD9-Cas6을 포함하는 NA-결합 도메인을 위한 0, 3, 또는 6 결합 부위를 포함하도록 이 NanoLuc(RTM) mRNA 카고 분자를 조작하였다(도 4).
비드-용출 LC와 조합된 TFF 기반으로 HEK-유래 EV를 정제한 후, 이 EV를 HEK 세포에 이 검정을 위하여 Huh7 표적 세포의 6-웰 플레이트 내 웰당 107개 EV의 최적 농도로 첨가하였다. 도 4의 Y축은 단백질 ㎍에 대해 정규화된 관련 광(발광) 단위(RLU)를 나타내며, 상이한 융합 폴리펩타이드 작제물을 사용하여 결합 부위 수를 증가시킴에 따라 전달 및/또는 번역이 증가하는 것을 나타낸다. 따라서, 도 4는 본 발명이 이후 세포에 의해 성공적으로 전사되는 mRNA를 세포에 생물활성적으로 전달할 수 있는 EV를 제공한다는 것을 증명한다. 이것은 단지 EV를 RNA로 적재할 수 있지만 성공적으로 전사되도록 표적 세포의 세포질로 이 RNA를 전달하지 못하는 선행기술을 뛰어넘는 본 발명의 상당한 장점이다.
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Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365

Claims (28)

  1. 적어도 하나의 핵산(NA)-결합 도메인 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 적어도 하나의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 세포외 소포(extracellular vesicle: EV)로서,
    상기 적어도 하나의 NA-결합 도메인은 PUF, Cas6, Cas13, 및/또는 NA 압타머-결합 도메인 중 하나 또는 둘 이상인, EV.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 NA 카고 분자(cargo molecule)를 더 포함하는, EV.
  3. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 NA 카고 분자는 상기 융합 폴리펩타이드의 도움으로 상기 EV로 운반되는, EV.
  4. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NA 카고 분자는 shRNA, miRNA, mRNA, gRNA, pri-miRNA, pre-miRNA, 원형 RNA, piRNA, tRNA, rRNA, snRNA, IncRNA, 리보자임, 미니-서클 DNA, 및/또는 플라스미드 DNA를 포함하는 군으로부터 선택되는, EV.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 NA 카고 분자는 (i) 상기 NA-결합 도메인을 위한 적어도 하나의 결합 부위 및 (ii) 치료적 폴리뉴클레오타이드 도메인을 포함하는, EV.
  6. 제5항에 있어서, 상기 NA 카고 분자는 상기 적어도 하나의 결합 부위 및 상기 치료적 폴리뉴클레오타이드 도메인 사이에 절단 부위를 포함하는, EV.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NA 카고 분자는 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는, EV.
  8. 제7항에 있어서, 상기 치료적 폴리펩타이드는 항체, 인트라바디, 단일 사슬 가변 단편, 애피바디, 효소, 수송체, 종양 억제제, 바이러스 또는 박테리아 저해제, 세포 구성요소 단백질, DNA 및/또는 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로티나제, 인테그라제, 전사인자, 성장인자, 세포자멸사 저해제 및 유도제, 독소, 구조 단백질, 신경영양인자, 막 수송체, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 열충격 단백질, CRISPR-관련 단백질, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, EV.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 NA-결합 도메인에 의해 N- 및/또는 C-말단적으로 측면연결된 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 적어도 하나의 NA-결합 도메인은 엑소좀 폴리펩타이드 서열 내에 삽입되는, EV.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀 폴리펩타이드는 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, AARDC1, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 신데칸-4, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터루킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 구성요소, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 다른 엑소좀 폴리펩타이드, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, EV.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 더 포함하는, EV.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NA 카고 분자는 선형, 원형, 원형화된, 및/또는 임의의 2차 및/또는 3차 및/또는 다른 구조를 갖는, EV.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NA 카고 분자는,
    (i) miRNA 결합을 위한 부위로서, 선택적으로 조직 및/또는 세포 유형 특이적인, 상기 부위;
    (ii) 폴리A 테일 또는 스템루프와 같은 적어도 하나의 안정화 도메인; 또는,
    (iii) 적어도 하나의 5' 및/또는 3' 말단 혼성 UTR,
    중 하나 또는 둘 이상을 포함하는, EV.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 EV 개체군.
  15. 제14항에 있어서, 상기 EV 개체군 전체에 걸쳐 EV당 NA 카고 분자의 평균수가 EV당 1 이상인, EV 개체군.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 개체군은 적어도 둘의 하위개체군을 포함하며,
    첫째 EV 하위개체군은 EV당 평균 하나 이상의 융합 폴리펩타이드를 포함하고,
    둘째 EV 하위개체군은 EV당 평균 하나 이상의 융합 폴리펩타이드와 결합된 문제의 NA 카고 분자를 포함하는, EV 개체군.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및/또는 적어도 95%의 모든 EV가 적어도 하나의 NA 카고 분자를 포함하는, EV 개체군.
  18. 적어도 하나의 NA-결합 도메인 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드 작제물로서,
    상기 적어도 하나의 NA-결합 도메인은 PUF, Cas6, Cas13, 및/또는 NA 압타머-결합 도메인 중 하나 또는 둘 이상인, 폴리펩타이드 작제물.
  19. 제18항에 있어서,
    (i) 적어도 하나의 다합체화 도메인;
    (ii) 적어도 하나의 링커;
    (iii) 인테인과 같은 적어도 하나의 방출 도메인;
    (iv) 적어도 하나의 RNA 절단 도메인;
    (v) 적어도 하나의 탈엔도솜 모이어티, 및/또는,
    (vi) 적어도 하나의 표적화 모이어티,
    중에서 하나 또는 둘 이상을 선택적으로 더 포함하는, 폴리펩타이드 작제물.
  20. 제18항 또는 제19항에 따른 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 본질적으로 선형이고, 원형화되고, 그리고/또는 임의의 2차 및/또는 3차 및/또는 더 높은 차수의 구조를 갖고 그리고/또는 플라스미드, 원형 DNA 폴리뉴클레오타이드, 바이러스, 아데노-관련 바이러스, mRNA, 변형된 mRNA, 및/또는 미니-서클과 같은 벡터를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 작제물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 EV를 생산하는 방법으로서,
    (i) EV-생산 세포에 제20항 또는 제21항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물을 도입하는 단계;
    (ii) 상기 EV-생산 세포에서 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화되는 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물을 발현시켜 EV를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. (i) 제20항 또는 제21항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물 및/또는 (ii) 제18항 또는 제19항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물 및/또는 (iii) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV를 포함하는 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포는 단클론성 세포 및/또는 단클론성 세포주인, 세포.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 세포는 제18항 또는 제19항에 따른 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 적어도 하나의 모노시스트로닉(monocistronic), 바이시스트로닉(bicistronic) 또는 멀티시스트로닉(multicistronic) 폴리뉴클레오타이드 작제물 및 적어도 하나의 NA 카고 분자를 포함하도록 안정하게 변형되는, 세포.
  26. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV 및/또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV 개체군 및/또는 제20항 또는 제21항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물을 표적 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 적어도 하나의 RNA 카고 분자의 세포 내 전달을 위한 시험관 내 방법.
  27. (i) 제20항 또는 제21항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물, (ii) 제18항 또는 제19항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물, (iii) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV, (iv) 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 세포, 및/또는 (v) 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV 개체군, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 의약에서 사용하기 위한, (i) 제20항 또는 제21항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물, (ii) 제18항 또는 제19항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물, (iii) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV, (iv) 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 세포, (v) 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV 개체군, 및/또는 (vi) 제27항에 따른 약제학적 조성물.
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