KR20200070247A

KR20200070247A - 골연골 수복을 유도하는 다능성 간세포

Info

Publication number: KR20200070247A
Application number: KR1020207010507A
Authority: KR
Inventors: 나오스케 카메이; 마리 데자와; 미츠오 오치
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠; 도호쿠 다이가쿠
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2018-10-17
Publication date: 2020-06-17
Also published as: US20200237828A1; JPWO2019078262A1; SG11202003507QA; CA3079500A1; CN111225676A; WO2019078262A1; US20220313741A1; EP3698802A4; JP7489016B2; AU2018352904A1; EP3698802A1

Abstract

다종계통으로 분화할 수 있는 스트레스 내성이 있는 (Muse)세포는, 간엽계 간세포(MSC) 집단에 존재하는 단계 특이적인 배항원 3(SSEA-3) 양성세포이다. Muse 세포는, 배성간세포로서의 모든 배아로 분화하는 다능성을 가진다. 본 연구에서는, 골연골 손상을 수복하기 위한 Muse 세포 이식의 유효성을 조사하는 것을 목적으로 하였다. Muse 세포는, 인간 골수 MSC로부터 단리하였다. 골연골 손상은, 면역부전 래트의 슬개구에 발생시켰다. 그 래트에 세포를 주사하고, 3 그룹으로 나누었다: 대조그룹에는, PBS를 주사하였다; 비Muse 세포 그룹에는, 5×10⁴개의 SSEA-3 음성의 비Muse 세포를 주사하였다; Muse 세포그룹에는, 5×10⁴개의 SSEA-3 양성의 Muse 세포를 주사하였다. 수복된 조직은, Muse 그룹에 있어서 처치 후의 12주에서 거의 평활한 균질표면을 가지고, 대조 및 비Muse 그룹에서는 수복조직은 검출되지 않았다. 조직학적 평가에 따르면, 처치 후의 4주 및 12주에서 다른 그룹과 비교하여, Muse 그룹에서는 골연골 손상부위에서 보다 양호한 수복을 나타내었다. Muse 세포는 골연골 손상의 치료를 위한 새로운 유망한 세포원일 수 있다.

Description

골연골 수복을 유도하는 다능성 간세포

본 발명은, 재생의료에 이용되는 세포제제 및/또는 의약조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 골연골 손상의 치료 또는 수복에 유효한 다능성 간세포를 포함하는 세포제제 또는 의약조성물에 관한 것이다.

연골병변은, 자기수복능력이 한정되어 있는 것이나 관절기능의 저하에 기인하는 관절장애의 원인이 되며, 이것은 특히 고령환자의 중대한 장애에 해당한다(비특허문헌 1)[1].

골수자극기술이나 골연골 이식 등의 방법을 이용한 몇 가지 임상시험이 연골 수복을 개선하는 시도로서 행하여지고 있었는데, 성공은 한정적인 것이었다. 1994년에 Brittberg 등은, 자가연골이식(ACI)이라고 불리는 제1 세대의 세포치료를 실시하였다(비특허문헌 2)[2]. Ochi 등은, 아테로콜라겐겔을 연골세포와 조합하여 사용함으로써, ACI를 개변하여, 양호한 임상 전귀(轉歸)를 가져왔다(비특허문헌 3)[3]. 하지만, 인택트한 연골의 이환율, 탈분화, 및 2단계의 외과적 처치 때문에, 성공은 여전히 한정적이었다.

최근, 재생의료분야에 있어서, 간세포를 이용한 세포요법이 다양한 질환에 대하여 연구가 이루어지고, 임상응용으로의 가능성이 기대되고 있는 간세포로서, 배성간세포(ES 세포), 신경간/전구세포(NSPC), 인공다능성 간세포(iPS 세포), 제대혈 간세포(UCBC)가 알려져 있다.

또한, 골수간엽계 세포획분(MSC)은, 성체로부터 단리되어, 예를 들어 골, 연골, 지방세포, 신경세포, 골격근 등으로 분화하는 능력을 가지는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4 및 5). 하지만, MSC는 다양한 세포를 포함하는 세포그룹으로, 그 분화능의 실체를 알 수 없으며, 치료효과에 편차가 크다. 또한, 성체 유래의 다능성 간세포로서 iPS 세포(특허문헌 1)가 보고되어 있는데, iPS 세포의 수립에는, 간엽계 세포인 피부섬유아 세포획분으로 특정 유전자나 특정 화합물을 체세포로 도입한다는 매우 복잡한 조작을 필요로 하는 것과 더불어, iPS 세포가 높은 종양형성능력을 가지는 것으로부터, 임상응용으로의 매우 높은 장애가 존재하고 있다.

과거 10년 동안에, 간엽계 간세포(MSC)를 쉽게 단리할 수 있게 되어, 다양한 조직으로부터 매우 접근하기 쉽고, 더욱이 매우 신속하게 증식하는 것으로부터, 임상응용을 위한 세포 베이스의 치료법으로서 널리 사용되고 있다. 더욱이, 삼배엽계로 폭넓게 분화할 수 있다(비특허문헌 6)[4].

본 발명자 중 한 사람인 데자와의 연구에 의하여, 간엽계 세포획분에 존재하고, 유도조작없이 얻어지는 SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면항원으로서 발현하고 있는 다능성 간세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse 세포)가 간엽계 세포획분이 가지는 다능성을 담당하고 있어, 조직재생을 목표로 한 질환치료에 응용할 수 있을 가능성이 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, Muse 세포는, 간엽계 세포획분을 다양한 스트레스로 자극함으로써 농축할 수 있다는 것도 알 수 있었다(특허문헌 2; 비특허문헌 7).

하지만, 태아발육부전에 따르는 뇌장애의 개선 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여, 기대되는 치료효과가 얻어지는 것을 명확하게 한 예는 없다.

특허문헌 1: 일본특허공보 제4183742호 특허문헌 2: 국제공개공보 제2011/007900호

비특허문헌 1: A. Movasheri, et al., Histol. Histopathol., vol.24, p.347-366(2009) 비특허문헌 2: M. Brittberg, et al., N. Engl. J. Med., vol.331, p.889-895(1994) 비특허문헌 3: M. Ochi, et al., J. Bone. Joint Surg. Br., vol.84, p.571-578(2002) 비특허문헌 4: M. Dezawa, et al., J. Clin. Investi., vol.113, p.1701-1710(2004) 비특허문헌 5: M. Dezawa, et al., Science, vol.309, p.314-317(2005) 비특허문헌 6: K. Tamai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.108, p.6609-6614(2011) 비특허문헌 7: S. Wakao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.108, p.9875-9880(2011)

본 발명은, 재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, Muse 세포를 함유하는, 골연골 손상을 수복하기 위한 세포제제 및/또는 의약조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 면역부전 래트 모델에, Muse 세포를 주입 또는 투여함으로써, Muse 세포가 골연골 손상부위에 국소적으로 축적하여, 손상부위에 있어서 연골세포로 분화하여, 골연골 손상을 수복할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하와 같다.

[항목 1] 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 골연골 손상을 치료 또는 수복하기 위한 세포제제.

[항목 2] 외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분을 포함하는, 상기 [항목 1]에 기재된 세포제제.

[항목 3] 상기 다능성 간세포가, CD105 양성인, 상기 [항목 1] 또는 [항목 2]에 기재된 세포제제.

[항목 4] 상기 다능성 간세포가, CD117 음성 및 CD146 음성인, 상기 [항목 1] 내지 [항목 3] 중 어느 한 항에 기재된 세포제제.

[항목 5] 상기 다능성 간세포가, CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인, 상기 [항목 1] 내지 [항목 4] 중 어느 한 항에 기재된 세포제제.

[항목 6] 상기 다능성 간세포가, CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인, 상기 [항목 1] 내지 [항목 5] 중 어느 한 항에 기재된 세포제제.

[항목 7] 상기 다능성 간세포가, 이하의 성질 모두를 가지는 다능성 간세포인, 상기 [항목 1] 내지 [항목 6] 중 어느 한 항에 기재된 세포제제:

(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐.

[항목 8] 상기 다능성 간세포가, 골연골 손상부위에 축적하는 능력을 가지는, 상기 [항목 1] 내지 [항목 7] 중 어느 한 항에 기재된 세포제제.

[항목 9] 상기 다능성 간세포가, 연골세포로 분화하는 능력을 가지는, 상기 [항목 1] 내지 [항목 8] 중 어느 한 항에 기재된 세포제제.

본 발명은, 골연골 손상을 앓고 있는 대상에 대하여, Muse 세포를 손상부위에 직접 또는 정맥 등으로부터 투여함으로써, Muse 세포가 손상부위에 있어서 연골세로로 분화한다는 골연골 조직재생 메커니즘에 의하여, 골연골 손상, 특히 섬유조직에 의하여 덮여진 연골하골을 수복할 수 있다.

도 1은, 처치 후의 4주 및 12주에 있어서의, 대조그룹, 비Muse 그룹, 및 Muse 그룹에서의 수복된 조직의 육안적 소견을 나타낸다. 12주에서는, Muse 그룹은, 정상 조직과 동일 레벨로 백색의 조직에 의하여 손상부위가 완전히 보충되었다.
도 2는, 육안에 의한 평점 시스템을 나타내고, 처치 후의 4주에서는, Muse 그룹에서 개선 경향이 보였다. 또한, 12주에서는, Muse 그룹은, 다른 그룹보다 유의하게 양호한 결과를 나타내었다. *P<0.05.
도 3의 (A)는, 4주 및 12주에 있어서의 사프라닌O/퍼스트그린 염색을 이용한 수복조직의 조직학적 평가를 나타낸다. 도 3의 (B) 및 (C)는, 12주에 있어서의 H&E 염색상을 나타낸다. 스케일바: A 및 B: 500㎛, C: 100㎛.
도 4는, 4주 및 12주에서 Sellers 스케일을 이용한 조직학적 스코어링을 행한 결과를 나타내고, 비Muse 그룹 및 대조그룹의 어느 것과도 달리, Muse 그룹에 있어서, 조직학적으로 유의한 차이가 인정되었다. *P<0.05.

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는, 골연골 손상을 치료 또는 수복하기 위한 세포제제 또는 의약조성물에 관한 것이다.

1. 적용질환

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 세포제제 또는 의약조성물을 이용하여 변형성 관절증, 외상성 연골손상, 관절류마티스, 및 암 등의 골연골 손상에 관련하는 질환 또는 증후상태의 치료, 수복 또는 완화에 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, '골연골 손상'이란, 한정되지 않지만, 상기 질환 등에 기인한 골 및/또는 연골의 손상, 그리고 사고 및 외과적 조작의 결과에 의하여 발생한 손상을 가리킨다. 여기에서, '손상'이란, 정상적인 구조 또는 기능의 변화를 의미하고, 일반적으로 사용되는 용어와 같은 의미를 가지며, 장애, 변성, 외상, 또는 결손과 마찬가지로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 사용할 때, '골'이란, 주로 히드록시아파타이트, 콜라겐(주로 I형 콜라겐)의 형태로 침착된 칼슘 및 인산의 성분, 및 골세포(예를 들어, 골아세포, 골세포, 및 파골세포), 그리고 진짜 연골내골의 내부에서 형성하는 골수를 포함하는 석회화(광화)된 결합성의 조직을 말한다. 골조직은, 다른 조직(연골조직을 포함)과는 유의하게 다르다. 구체적으로는, 골조직은, 세포, 및 이상성(二相性)의 매체(광화, 무기성분(주로, 히드록시아파타이트 결정) 및 유기성분(주로, I형 콜라겐)을 포함)로 구성되는 맥관화한 조직이다. 글리코사미노글리칸은, 2% 미만의 이러한 유기성분 및 1% 미만의 이상성 매체 자신, 또는 골조직 자체를 구성한다. 더욱이, 연골조직과 비교하여, 골조직에 존재하는 콜라겐은, 매우 조직화된 평행의 배치로 존재한다.

본 발명에 있어서 사용할 때, '연골'이란, 연골세포 또는 연골세포양세포, 세포간질(예를 들어, I형, II형, IX형, 및 XI형 콜라겐), 프로테오글리칸(예를 들어, 콘드로이틴황산프로테오글리칸, 케라탄황산프로테오글리칸, 및 데르마탄황산프로테오글리칸), 및 기타 단백질을 포함하는 결합조직을 말한다. 연골에는, 관절연골 및 비관절연골이 포함된다.

'관절연골'은, 관절 내의 골의 연접표면을 덮고, 2개의 대향하는 골표면의 사이의 마찰저감 접합부분으로서의 기능을 하는 무혈관의 비무기화결합조직을 말한다. 관절연골에 의하여, 뼈끼리 직접 접촉하지 않고 운동하는 것이 가능하다. 관절연골은, 인접하는 활막의 혈관 및 피복되는 골의 혈관으로부터 부분적으로 영양소를 얻고 있다. 관절연골은, II형 및 IX형의 콜라겐 및 다양한 프로테오글리칸을 포함하고, 연골내성 골형성에 관련하는 X형 콜라겐을 포함하지 않는다. 관절연골은 골 위를 덮고 있고, 연골 아래의 골을 연골하골이라고 한다. 손상이 연골과 연골하골까지 확산된 것을 골연골 손상(연골전층결손)이라고 하고, 연골층까지에서 멈춘 것을 연골손상(연골부분손상)이라고 한다. 본 발명에 있어서, '연골손상'이란, 상기 '골연골 손상' 및 '연골손상'을 포함하는 것이다.

'비관절연골'은, 관절표면을 피복하지 않는 연골을 말하고, 섬유연골(관절원판, 섬유연골원판, 결합섬유연골, 및 관절둘레섬유연골) 및 탄성연골이 포함된다. 섬유연골에서는, 미크로폴리사카라이드망이 돌출된 콜라겐다발과 결합되어, 연골세포가 초자연골 또는 관절연골보다 광범위하게 산재하고 있다. 관절원판은 충격에 노출되고, 또한 빈번하게 운동하는 관절(예를 들어, 무릎의 반월판)에서 관찰된다. 이와 같은 관절의 예에는, 측두하악골, 흉쇄관절, 손관절, 및 무릎관절이 포함되는데, 이것으로 한정되지 않는다. 이차연골결합은, 섬유연골의 반원판에 의하여 형성된다. 대향하는 양 표면에 밀접하게 접착하는 이와 같은 섬유연골원판은, 연골의 박층이 개재된 섬유조직의 동심원상의 링으로 구성된다. 이와 같은 섬유연골원판의 예는, 척수의 추간판이다. 결합섬유연골은, 이러한 관절의 골표면의 사이에 개재되고, 추체의 사이 및 치골의 사이를 약간 이동하는 것이 가능하다. 관절둘레섬유연골은, 몇 개의 관절강(엉덩이부의 관골구 및 어깨의 관절와 등)의 둘레부를 둘러싼다.

2. 세포제제

(1) 다능성 간세포(Muse 세포)

본 발명의 세포제제에 사용되는 다능성 간세포는, 본 발명자 중 한 사람인 데자와가, 인간생체 내에 그 존재를 발견하고, 'Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포'라고 명명한 세포이다. Muse 세포는, 골수액, 지방조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(Epub)(published on Jan 17, 2014))이나 진피결합조직 등의 피부조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합조직에도 산재한다. 또한, 이러한 세포는, 다능성 간세포와 간엽계 간세포의 양쪽의 성질을 가지는 세포이고, 예를 들어 각각의 세포표면 마커인 'SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)'과 'CD105'의 더블양성으로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 이들의 항원마커를 지표로서 생체조직으로부터 분리할 수 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법, 및 특징 등의 상세는, 국제공개공보 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Wakao 등(2011, 상술)에 의하여 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계 세포를 배양하고, 그것을 Muse 세포의 모집단으로서 이용하는 경우, SSEA-3 양성 세포의 모두가 CD105 양성세포인 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 세포제제에 있어서는, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 간세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우에는, 단순히 SSEA-3을 항원마커로서 Muse 세포를 정제하여, 사용할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서는, 골연골 손상(후유증을 포함)을 치료하기 위한 세포제제에 있어서 사용될 수 있는, SSEA-3을 항원마커로서, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 조직으로부터 분리된 다능성 간세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 단순히 'SSEA-3 양성세포'라고 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, '비Muse 세포'란, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 조직에 포함되는 세포로서, 'SSEA-3 양성세포' 이외의 세포를 가리킨다.

간단하게는, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 세포표면 마커인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하거나, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체를 모두 이용하여, 생체조직(예를 들어, 간엽계 조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기에서, '생체'란, 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는, 수정란이나 포배기보다 발생단계가 앞인 배아는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생단계의 배아는 포함된다. 포유동물에는, 한정되지 않지만, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포는, 생체의 조직으로부터 직접 마커를 가지고 분리되는 점에서, 배성간세포(ES 세포)나 iPS 세포와 명확하게 구별된다. 또한, '간엽계 조직'이란, 골, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수, 제대, 제대혈 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는, 골수나 피부, 지방조직으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리수단을 이용하여, 섬유아세포나 골수간엽계 간세포 등의 배양간엽계 세포로부터 Muse 세포를 분리하여도 좋다. 한편, 본 발명의 세포제제에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는, 세포이식을 받는 리시피엔트에 대하여 자가여도 좋고, 또는 타가여도 좋다.

상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 SSEA-3 양성, 및 SSEA-3과 CD105의 이중양성을 지표로 하여서 생체조직으로부터 분리할 수 있는데, 인간 성인 피부에는, 다양한 타입의 간세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 하지만, Muse 세포는, 이들 세포와 같지 않다. 이와 같은 간세포 및 전구세포에는 피부유래 전구세포(SKP), 신경제간세포(NCSC), 멜라노블라스트(MB), 혈관주위세포(PC), 내피전구세포(EP), 지방유래간세포(ADSC)를 들 수 있다. 이러한 세포에 고유 마커의 '비발현'을 지표로서, Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는, CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF인자(폰빌레브란트 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커), 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있으며, 더욱이 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 더욱이 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 이하:

(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐

으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성질을 가져도 좋다. 본 발명의 일 국면에서는, 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포는, 상기 성질을 모두 갖는다. 여기에서, 상기 (i)에 대하여, '텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음'이란, 예를 들어 TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 이용하여 텔로머레이스 활성을 검출한 경우에, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머레이스 활성이 '낮다'란, 예를 들어 체세포인 인간섬유아세포와 같은 정도의 텔로머레이스 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela 세포에 비하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머레이스 활성을 가지고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 대하여, Muse 세포는, in vitro 및 in vivo에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계, 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지고, 예를 들어 in vitro에서 유도배양함으로써, 간(肝)세포, 신경세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, in vivo에서 정소로 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 더욱이, 정맥주사에 의하여 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주(遊走) 및 생착하여, 조직에 따른 세포로 분화하는 능력을 가진다. 상기 (iii)에 대하여, Muse 세포는, 부유배양에서는 증식속도 약 1.3일로 증식하는데, 부유배양에서는 1세포로부터 증식하고, 배양체양세포 덩어리를 만들어 14일간 정도에서 증식이 멈춘다라고 하는 성질을 가지는데, 이들 배양체양세포 덩어리를 접착배양으로 가지고 가면, 다시 세포증식이 개시되어, 세포 덩어리로부터 증식한 세포가 확산되어 간다. 더욱이, 정소로 이식한 경우, 적어도 반년 동안은 암화하지 않는다는 성질을 가진다. 또한, 상기 (iv)에 대하여, Muse 세포는, 셀프리뉴얼(자기복제)능을 가진다. 여기에서, '셀프리뉴얼'이란, 1개의 Muse 세포로부터 부유배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체양세포 덩어리에 포함되는 세포로부터 3배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있는 동시에, 배양체양세포 덩어리의 세포를 다시 1세포로 부유배양으로 가지고 감으로써, 다음 세대의 배양체양세포 덩어리를 형성시키고, 거기에서 다시 3배엽성의 분화와 부유배양에서의 배양체양세포 덩어리를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 좋다.

또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포획분은, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포에 외적 스트레스 자극을 주고, 그 외적 스트레스에 내성의 세포 이외의 세포를 사멸시켜, 살아남은 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 이하의 성질의 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 가지는 SSEA-3 양성 및 CD105 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분이어도 좋다.

(i) SSEA-3 양성;

(ii) CD105 양성;

(iii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;

(iv) 삼배엽으로 분화하는 능력을 가짐;

(v) 종양성증식을 나타내지 않음; 및

(vi) 셀프리뉴얼능을 가짐.

상기 외적 스트레는, 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건 하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크로의 폭로 하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결처리, 유해물질 존재 하에서의 배양, 활성산소 존재 하에서의 배양, 기계적 자극 하에서의 배양, 진동처리 하에서의 배양, 압력처리 하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 것 또는 복수의 조합이어도 좋다. 예를 들어, 상기 프로테아제에 의한 처리시간은, 세포에 외적 스트레스를 주기 위하여 합계 0.5~36시간 행하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는, 배양용기에 접착한 세포를 벗길 때, 세포 덩어리를 단일세포로 각각으로 할 때, 또는 조직으로부터 단일세포를 회수할 때에 이용되는 농도라면 좋다. 프로테아제는, 세린프로테아제, 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루타민산 프로테아제 또는 N말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 더욱이, 상기 프로테아제가 트리프신, 콜라게나아제 또는 디스파아제인 것이 바람직하다.

(2) 세포제제의 조제 및 사용

본 발명의 세포제제는, 한정되지 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 생리식염수나 적절한 완충액(예를 들어, 인산완충생리식염수)에 현탁시킴으로써 얻어진다. 이러한 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리한 Muse 세포수가 적은 경우에는, 세포이식 전에 세포를 배양하고, 소정의 세포농도가 얻어질 때까지 증식시켜도 좋다. 한편, 이미 보고되어 있는 바와 같이(국제공개공보 WO2011/007900호 팸플릿), Muse 세포는, 종양화하지 않으므로, 생체조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 상태로 포함되어 있어도 암화의 가능성이 낮아 안전하다. 또한, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상의 증식배지(예를 들어, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α-최소필수배지(α-MEM))에 있어서 행할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 국제공개공보 WO2011/007900호 팸플릿을 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물(예를 들어, 항생물질, 혈청) 등을 선택하고, 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 인간 대상으로 본 발명의 세포제제를 투여하는 경우에는, 인간의 장골로부터 수 mL 정도의 골수액을 채취하고, 예를 들어 골수액으로부터의 접착세포로서 골수간엽계 간세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포를 분리할 수 있는 세포량에 도달할 때까지 증가시킨 후, Muse 세포를 SSEA-3의 항원마커를 지표로서 분리하여서, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다. 또는, 예를 들어 Muse 세포를 SSEA-3의 항원마커를 지표로서 분리한 후, 유효한 치료량에 도달할 때까지 세포를 배양하여 증가시킨 후, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다.

또한, Muse 세포의 세포제제로의 사용에 있어서는, 그 세포를 보호하기 위하여 디메틸술폭시드(DMSO)나 혈청알부민 등을, 세균의 혼입 및 증식을 방지하기 위하여 항생물질 등을 세포제제에 함유시켜도 좋다. 더욱이, 제제 상 허용되는 다른 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)이나 간엽계 간세포에 포함되는 Muse 세포 이외의 세포 또는 성분을 세포제제에 함유시켜도 좋다. 당업자는 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포제제에 첨가할 수 있다. 이와 같이, Muse 세포는, 각종 첨가물을 포함하는 의약조성물로서 사용하는 것도 가능하다.

상기에서 조제되는 세포제제 중에 함유하는 Muse 세포수는, 골연골 손상에 있어서의 원하는 효과(예를 들어, 골·연골의 재생, 골연골 손상에 관련된 각종 질환의 소실 등)가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 사용하는 세포의 상태 등을 고려하여, 적절히 조정할 수 있다. 후술하는 실시예에 있어서는, 대퇴골의 일부를 결손시킨 래트 골연골 손상 모델에 대하여, Muse 세포 이식에 의한 각종 효과를 검토하였다. 약 200~300g의 래트에 대하여는, SSEA3 양성 세포를 5×10⁴세포/마리로 관절내 투여함으로써, 매우 뛰어난 효과가 얻어졌다. 이러한 결과로부터 포유동물 1개체당 1.6~2.5×10⁵세포/kg을 체중환산한 세포량을 투여함으로써 뛰어난 효과가 얻어지는 것이 기대된다. 한편, 대상으로 하는 개체는 래트, 인간을 포함하는데 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 세포제제는, 원하는 치료효과가 얻어질 때까지, 복수회(예를 들어, 2~10회), 적절히 간격(예를 들어, 1일에 2회, 1일에 1회, 1주에 2회, 1주에 1회, 2주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회)을 두고 투여되어도 좋다. 따라서, 대상의 상태에도 따르지만, 치료상 유효량으로서는, 예를 들어 1개체당 1×10³세포~2×10⁷세포에서 1~10회의 투여량이 바람직하다. 1개체에 있어서의 투여총량으로서는, 한정되지 않지만, 1×10³세포~2×10⁸세포, 1×10⁴세포~1×10⁸세포, 2×10⁴세포~5×10⁷세포, 5×10⁴세포~2×10⁷세포, 1×10⁵세포~1×10⁷세포 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 세포제제는, 특별히 한정되지 않지만, 골연골 손상부위(예를 들어, 관절, 대퇴골 등)에 직접 투여되어도 좋고, 또한 정맥 내에 투여되어도 좋다.

3. 래트 골연골 결손 모델의 제작

본 명세서에 있어서는, 본 발명의 세포제제에 의한 골연골 손상의 치료효과를 검토하기 위하여 래트 골연골 결손 모델을 구축하여, 사용할 수 있다. 그 모델로서 사용되는 래트에는, 한정되지 않지만, 일반적으로 면역부전 래트(예를 들어, F344/NJcl-rnu/rnu), Wistar계 래트, Spraugue Dawley(SD)계 래트를 들 수 있다. 후술하는 실시예에 있어서는, 래트의 대퇴골에 직경 1mm의 구형의 선단을 가지는 금속드릴에 의하여 골연골을 결손시킨 래트 모델을 사용하였다. 본 발명의 세포제제는 인간 유래의 Muse 세포이므로, 그 제제를 투여한 래트와는 이종의 관계에 있다. 통상, 모델 동물에 있어서 이종의 세포 등이 투여되는 실험에서는, 이종세포의 생체 내에서 거절반응을 억제하기 위하여, 이종세포의 투여 전 또는 동시에 면역억제제(시클로스포린 등)가 투여된다.

4. Muse 세포에 의한 치료효과

본 발명의 실시형태에서는, 본 발명의 세포제제는, 골연골 손상 환자의 골 및 연골의 기능을 정상적으로 회복시킬 수 있다. 본 명세서에 있어서 사용할 때, 골연골 기능의 '회복'이란, 골연골 손상(결손을 포함)에 따르는 각종 기능장애의 치료, 수복 및 완화를 의미하고, 일례로서, 일상생활에 지장이 없을 정도로까지 골연골 손상을 완화하는 것을 의미한다. 또한, 골연골의 기능을 '회복한다'란, 골연골 손상에 기인한 기능장애가 개선, 완화, 또는 제거되어, 골연골 손상 전의 상태로 돌아가는 것을 의미한다. 또한, 골연골 기능의 회복의 평가에는, 한정되지 않지만, 조직학적 평가로서, 일반적으로는, 골연골 조직의 염색에 사프라닌O/퍼스트그린을 사용하는 Sellers에 의한 조직학적 스코어링을 이용하여 행할 수 있다[8].

이하의 실시예에 의하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것이 전혀 아니다.

실시예

본 연구의 동물실험에 관한 수법은, 히로시마대학 동물실험의 가이드라인에 따라서 실시되었다. 모든 프로토콜은, 히로시마대학대학원 생물의학연구과 실험동물과학연구시설위원회에 의하여 승인되어, 사용되었다.

실시예 1: 세포조제

인간골수 MSC(hBMSC; Lonza, Basel, Switzerland)를 구입하고, 이것을 10% 소태아혈청(FBS), 0.1mg/ml 카나마이신, 및 1% Glutamax(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 포함하는 이글 최소필수배지(α-MEM) 중에서, 37℃에서 5% CO₂로 배양하였다. hBMSC가 90~100% 컨플루언트(confluent)에 도달한 후, 0.25% 트립신-에틸렌디아민사초산을 이용하여 1:2의 비로 계대배양하였다. Kuroda 등에 의한 프로토콜에 따랐다[5]. 간단하게 설명하면, hBMSC를 SSEA-3의 발현 유무에 따라서, Muse 세포(SSEA-3⁺) 및 비Muse 세포(SSEA-3^-)로 분리하였다. hBMSC를 SSEA-3 항체(1:100; Merck Millipore, Darmstadt, Germany)와 함께 인큐베이트하고, 항체희석액 중에서 Allophycocyanin을 콘주게이트한 항래트 IgM(Jackson Immuno Research, West Grove, PA)에 의하여 검출하고, Special Order Research Product인 FACS Aria II(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 의하여 선별하였다.

실시예 2: 골연골 결손 부위로의 세포주입

본 실시예는, 16마리의 생후 10주된 면역부전 래트(32개의 무릎)(F344/NJcl-rnu/rnu)로 행하였다. 직경 1mm의 구형의 선단을 가지는 시판의 금속드릴을 이용하여, 대퇴골의 슬개골구 내에 골연골 결손(직경 2mm, 깊이 2mm)을 좌우에 제작하였다. 무릎관절을 닫은 직후에, 래트의 무릎을 3그룹에 불균일하게 분포시켰다(표 1): 대조그룹-PBS 주사; 비Muse 그룹-비Muse 세포의 관절내 주사(5×10⁴); Muse 그룹-Muse 세포의 관절내 주사(5×10⁴). 세포를 50㎕의 PBS에 현탁시켰다.

[표 1]

실시예 3: 육안적 및 조직학적인 평가법

(1) 육안적인 평가법

처치 후의 4주 및 12주에서, 치사량의 펜토바르비탈나트륨을 복강 내에 주사하고, 래트를 도살하였다. Wayne 등[6][7]에 의한 육안적 스코어링 시스템을 이용하여, 대퇴과를 육안적으로 평가하였다. '14'가 가장 좋고, '0'이 가장 나빴다(표 2).

표 2. 육안적 스코어링 시스템

[표 2-1]

[표 2-2]

[표 2-3]

[표 2-4]

(2) 조직학적인 평가법

수복조직을 파라포름알데히드를 포함하는 인산 완충용액(4%) 내에서 1일간 고정하고, 10% EDTA(Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan)에서 4주간, 탈회한 후, 파라핀블록에 포리하였다. 시료를 5㎛ 절편으로 화살표 형상으로 절단하였다. 조직학적 평가를 위하여, 절편을 사프라닌O/퍼스트그린(Muto Pure Chemicals Co. Ltd., Japan)으로 염색하고, Sellers 스케일의 조직학적 스코어링을 행하였다(표 3)[8]. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 이용하여, 수복 조직의 세포밀도를 평가하였다.

표 3. 수복조직의 조직학적 평가를 위한 Sellers 스케일

[표 3-1]

[표 3-2]

[표 3-3]

[표 3-4]

[표 3-5]

[표 3-6]

[표 3-7]

[표 3-8]

실시예 4: 면역염색

처리 후의 4주 및 12주에서, 절편을 항원회수시약(Immunoacitve, Matsunami Glass Ind., Osaka, Japan)으로 전처리하고, 내인성 페록시다아제 활성을 블록하기 위하여, 0.3% H₂O₂에 침지한다. 절편을 블로킹 용액(Protein Block Serum-Free; Dako, Carpinteria, CA)으로 블로킹하고, I형 콜라겐(1:250, Daiichi Fine Chemical, Toyama, Japan) 및 II형 콜라겐(1:250, Daiichi Fine Chemical)에 대한 마우스모노클로날 항체와 함께 인큐베이트한다. 시각화를 위한 반응은, 아비딘-비오틴페록시다아제계(Vectastain Elite ABC 키트; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 이용하여 행하고, 3,3'-디아민벤지딘(Peroxidase Substrate 키트, Vector Laboratories, Inc.)을 이용하여 절편을 착색한다.

실시예 5: 각종 실험 결과

(1) 육안적 소견

4주에서 대조 및 비Muse 그룹의 슬개구에 있어서 손상부 주변이 쉽게 고정되고, 수복조직은 검출되지 않았다. 또한, 4주 및 12주에서, Muse 그룹 및 비Muse 그룹과 비교하여, 대조그룹에 있어서, 인접하는 연골의 변성을 수반하는 변형성 관절증변화가 증가하였다. 12주에서, 비Muse 그룹에서는, 손상부의 깊이는, 갈색조직으로 채워져, 감소하였다. 한편, Muse 그룹에서는, 백색조직으로 완전히 손상부가 피복되고, 이것은 주위조직에 따라서 평활하고, 균질한 표면을 가지며, 손상부 주변을 명확하게 특정하는 것이 곤란하다(도 1). 육안적 스코어링에서는, 처치 후의 4주에서는 3그룹간에 유의한 차가 없었는데, 대조, 비Muse 그룹, Muse 그룹의 순서로 개선 경향이 보였다(대조그룹: 0.8±0.4; 비Muse 그룹: 1.3±0.5, Muse 그룹: 1.8±0.8). 하지만, Muse 그룹의 육안적인 결과는, 결함부의 보충에 의하여 측정하면, 처치 후, 12주에서 다른 그룹의 결과보다도 유의하게 양호하였다(대조그룹: 0.5±0.6, 비Muse 그룹: 1.5±0.5, Muse 그룹: 10.0±1.5)(도 2). 각각의 파라미터의 육안적 스코어를 표 4에 나타내었다.

표 4. 육안적 스코어

[표 4-1]

[표 4-2]

[표 4-3]

[표 4-4]

* 대조와 비교하여 유의하게 양호함(p<0.05)

(2) 조직학적 소견 및 스코어링

4주 및 12주에서, 대조그룹 및 비Muse 그룹의 도살시에는, 섬유조직은 소량이었는데, 손상부위에 수복조직은 보이지 않았다. 4주에서의 Muse 그룹에 있어서는, 연골의 치환은 없으며, 연골하골의 수복을 수반하는 손상의 부분적 수복이 보였다. 또한, 12주에서의 Muse 그룹에 있어서는, 연골손상의 수복이 확인되며, 연골하골의 완전 수복이 수반되고 있었는데, 섬유조직으로 덮여, 통합에 더하여, 골연골 접합이 관찰되었다(도 3의 (A)). 4주 및 12주에서, 각각 Sellers 스케일에 근거하여, 이하의 결과가 기록되었다: 대조그룹(4주: 26.2±1.6; 12주: 27.8±1.5), 비Muse 그룹(4주: 27.2±1.2; 12주: 25±0.6), 및 Muse 그룹(4주: 17.4±0.6; 12주: 11.8±2.0). 비Muse 그룹은, 처치 후의 12주에서, 대조그룹보다 유의하게 양호한 결과를 나타내었다. 더욱이, Muse 그룹의 스코어는, 처치 후의 4주와 12주 양쪽에서 다른 그룹보다 유의하게 양호하였다(도 4). 각각의 파라미터의 Sellers 스코어를 표 5에 나타내었다. 또한, 12주에서의 H&E 염색은, 다른 그룹과 비교하여, Muse 그룹의 수복조직의 세포밀도가 높다는 것을 나타내었다(도 3의 (B), (C)).

표 5. Sellers 스코어

[표 5-1]

[표 5-2]

[표 5-3]

[표 5-4]

[표 5-5]

[표 5-6]

[표 5-7]

[표 5-8]

* 대조와 비교하여 유의하게 양호함(p<0.05)

Muse 세포의 관절내 주사는, 골연골 손상, 특히 섬유조직에 의하여 덮여진 연골하골을 수복하는 유망한 방법이다.

참고문헌

[1] A. Mobasheri, C. Csaki, A.L. Clutterbuck, M. Rahmanzadeh, and M. Shakibaei, Mesenchymal stem cells in connective tissue engineering and regenerative medicine: applications in cartilage repair and osteoarthritis therapy. Histol Histopathol, vol. 24, no. 3, pp. 347-366, 2009.

[2] M. Brittberg, A. Lindahl, A. Nilsson, C. Ohlsson, O. Isaksson, and L. Peterson, Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med, vol. 331, no. 14, pp. 889-895, 1994.

[3] M. Ochi, Y. Uchio, K. Kawasaki, S. Wakitani, and J. Iwasa, Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering in the treatment of cartilage defects of the knee. J Bone Joint Surg Br, vol. 84, no. 4, pp. 571-578, 2002.

[4] K. Tamai, T. Yamazaki, T. Chino, et al., PDGFRalpha-positive cells in bone marrow are mobilized by high mobility group box 1 (HMGB1) to regenerate injured epithelia. Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 108, no. 16, pp. 6609-6614, 2011.

[5] Y. Kuroda, S. Wakao, M. Kitada, T. Murakami, M. Nojima, and M. Dezawa, Isolation, culture and evaluation of multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells. Nat Protoc, vol. 8, no. 7, pp. 1391-1415, 2013.

[6] J.S. Wayne, C.L. McDowell, K.J. Shields, and R.S. Tuan, In vivo response of polylactic acid-alginate scaffolds and bone marrow-derived cells for cartilage tissue engineering. Tissue Eng, vol. 11, no. 5-6, pp. 953-963, 2005.

[7] W. Cui, Q. Wang, G. Chen, et al., Repair of articular cartilage defects with tissue-engineered osteochondral composites in pigs. J Biosci Bioeng, vol. 111, no. 4, pp. 493-500, 2011.

[8] R.S. Sellers, D. Peluso, and E.A. Morris, The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) on the healing of full-thickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am, vol. 79, no. 10, pp. 1452-1463, 1997.

Claims

생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 골연골 손상을 치료 또는 수복하기 위한 세포제제.
제 1 항에 있어서,
외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분을 포함하는, 세포제제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, CD105 양성인, 세포제제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, CD117 음성 및 CD146 음성인, 세포제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인, 세포제제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인, 세포제제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, 이하의 성질 모두를 가지는 다능성 간세포인, 세포제제:
(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, 골연골 손상부위에 축적하는 능력을 가지는, 세포제제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, 연골세포로 분화하는 능력을 가지는, 세포제제.