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KR20200056396A - 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 삼중-경쇄 항체 분리 - Google Patents

양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 삼중-경쇄 항체 분리 Download PDF

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KR20200056396A
KR20200056396A KR1020207009516A KR20207009516A KR20200056396A KR 20200056396 A KR20200056396 A KR 20200056396A KR 1020207009516 A KR1020207009516 A KR 1020207009516A KR 20207009516 A KR20207009516 A KR 20207009516A KR 20200056396 A KR20200056396 A KR 20200056396A
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KR
South Korea
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antibody
composition
antigen
binding fragments
cation exchange
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Application number
KR1020207009516A
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English (en)
Inventor
팡 류
신팡 리
Original Assignee
이뮤노젠 아이엔씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이뮤노젠 아이엔씨 filed Critical 이뮤노젠 아이엔씨
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Abstract

H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 이중-경쇄 (H2L2) 항체 (가령, 항-CD123 H2L2) 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 조성물로부터 삼중-경쇄 (H2L3) 항체 (가령, 항-CD123 H2L3 항체) 또는 이의 항원-결합 단편들을 분리하는 방법이 제공된다.

Description

양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 삼중-경쇄 항체 분리
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2017년 9월 22일자로 제출된 미국 가출원 번호 62/562,188을 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급
전자 제출된 서열 목록의 내용(이름: S2921_097PC01_ST25; 크기: 15.736 바이트; 및 생성 날짜: 2018년 9월 21일)에 전자 제출된 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원의 참고자료에 편입된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 이중-경쇄 (H2L2) 항체 (가령, 항-CD123 H2L2) 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 조성물로부터 삼중-경쇄 (H2L3) 항체 (가령, 항-CD123 H2L3 항체) 또는 이의 항원-결합 단편들을 분리하는 방법에 일반적으로 관계한다.
배경
반응성 시스테인 잔기들로 공작된 재조합 항체, 가령, "시스테인-공작된(engineered) 항체"를 관심대상 약물에 공유적으로 접합시켜 표적이 되는 치료제를 만들 수 있다. 연구에 따르면 이러한 시스테인 공작된 항체를 발현시키기 위해, 안정적으로 형질감염된 포유동물 세포는 삼중 경쇄 (H2L3) 항체로 알려진 고-분자량 종을 분비하는 것으로 나타났다(Gomez 외, Biotechnol Bioeng. 105(4): 748-60 (2010)). H2L3 시스테인-변형된(modified) 항체는 H2L2 시스테인-변형된 항체에서 공작된 시스테인 잔기들중 하나와 여분의 경쇄 사이에 이황화결합 형성으로 인한 산물이다. 세포 배양물에서 H2L3 시스테인-변형된 항체의 수준은 세포계통과 배양 조건과 관련된다. 상기 세포 배양물 조건을 변형시켜 H2L3 형성을 최소화시킬 수 있지만 (가령, 세포 배양 동안 온도 변위(shifts)를 이용함으로써), 영향은 대개 세포계통 의존적이다 (Gomez 외, Biotechnol Prof. 26(5): 1438-45 (2010)).
단량체 종과의 유사성으로 인해, H2L3 항체의 분리는 모노클로 날 H2L2 시스테인-변형된 항체의 다운스트림(downstream) 정제 동안 문제를 발생시킨다. 하나의 특정 연구에서, 소수성 상호작용 크로마토 그래피 (HIC)는 비-시스테인 공작된 모노클로날 항체의 정제에서 H2L3 수준을 약 3 %에서 0.5 %로 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Wollacott 외, mAbs 5(6): 925-935 (2013)). 동일 연구에서, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 H2L3 항체를 제거하려는 시도가 있었다. 그러나, 심지어 변형된 조건 하에서도, 이 공정은 시험된 모든 세포 계통에서 H2L3의 백분율을 1 % 미만으로 낮추기에는 충분하지 않았다. 저자들은 양이온 교환 크로마토그래피에서의 정전기 효과(electrostatic effects)가 H2L3 항체를 제거하기에 충분히 강하지 않다는 결론을 내렸다. 따라서, 가장 일관된 항체 산물 (가령, 치료요법적 항체 및 이러한 항체를 함유하는 면역접합체(immunoconjugates)용)을 취득하기 위하여, 항체 정제 동안 H2L3 종들을 더욱 효과적으로 분리할 필요가 있다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 이중 경쇄 (H2L2) 항체로부터 삼중 경쇄 (H2L3) 항체를 분리하는 효과적인 정제 전략 개별에 관계한다. 상기 방법은 양이온 교환 수지가 주로 전하에 기초하여 단백질을 분리한다는 사실을 이용한다. 본원에서 제공된 바와 같이, 수지의 pH가 관심대상 항체의 것보다 더 낮다면, 가령, 3.8 내지 6.5), H2L3 및 H2L2를 모두 함유하는 모든 항체 종들은 양이온 교환 수지에 결합한다. 상기 항체가 양이온 교환 수지로부터 높은 pH 및/또는 낮은 염 농도를 갖는 용출(elution) 조성물을 이용하여 용리될 때, H2L3 종은 H2L2 종의 주요 피크의 용출 후, 후기 분획(fractions) 뿐만 아니라 원하는 H2L2 종을 함유하는 초기 분획에서도 용리된다. 그러나, 본원에서 실증된 바와 같이, 더 낮은 pH 및 더 높은 염 농도의 사용을 통한 양이온 교환 수지의 최적화(optimization)로 H2L2 종의 주요 피크 용출 후 후기 분획에 H2L3 종의 대부분 또는 모두가 용리될 수 있다. 최적화된 POROSTM XS 강력한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여, 항체 조성물에서 H2L3 항체의 양은 11%에서 1% 미만으로 감소시킬 수 있고, 이러한 수준의 감소는 다양한 세포계통에서 재생가능하다.
일부 구체예들에서, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 조성물로부터 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 분리시키는 방법은 (i) 상기 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 넣고, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 수지에 결합되고; (ii) 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 갖는 용출 조성물을 이 양이온 교환 수지에 넣고; 그리고 (iii) 이 수지로부터 H2L2 조성물을 수거하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 조성물로부터 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 분리시키는 방법은 (i) 상기 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 넣고, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 수지에 결합되고; (ii) 약 300 mM 내지 약 600 mM의 염 농도를 갖는 용출 조성물을 이 양이온 교환 수지에 넣고; 그리고 (iii) 이 수지로부터 H2L2 조성물을 수거하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항-CD123 항체 조성물로부터 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 분리시키는 방법은 (i) 상기 항-CD123 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 넣고, 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 수지에 결합되고; (ii) 약 3.8 내지 약 5.5의 pH를 갖는 용출 조성물을 이 양이온 교환 수지에 넣고; 그리고 (iii) 이 수지로부터 항-CD123 H2L2 조성물을 수거하는 것을 포함하고, 이때 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 그리고 차례로 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항-CD123 항체 조성물로부터 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들를 분리시키는 방법은 (i) 항-CD123 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 넣고, 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 이 수지에 결합되고; (ii) 약 300 mM 내지 약 600 mM의 염 농도를 갖는 용출 조성물을 이 양이온 교환 수지에 넣고; (iii) 그리고 이 수지로부터 용리된 항-CD123 H2L2 조성물을 수집하고, 이때 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 그리고 차례로 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들중 단지 2%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다. 일부 구체예들에서, H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들중 단지 1%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다. 일부 구체예들에서, H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들중 단지 0.5%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다.
일부 구체예들에서, H2L2 조성물에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 최소한 99.5%는 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다. 일부 구체예들에서, 상기 H2L2 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에서 단지 25%, 단지 20%, 단지 15%, 단지 10%, 또는 단지 5%만의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 하나 또는 그 이상의 용리된 컬럼 용적을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-4를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 양이온 교환 수지는 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 양이온 교환 수지의 입자 크기는 약 50 μm이다. 일부 구체예들에서, 상기 양이온 교환 수지는 양봉성(bimodal) 포어 크기 분포를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 양봉성 포어 크기 분포는 포어 직경이 약 500 nM인 포어와 직경이 약 22 nM인 포어를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 양이온 교환 수지는 POROSTM 강력한 양이온 교환 수지 XS이다.
일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물은 염을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물 안의 염은 염화물 염이다. 일부 구체예들에서, 상기 염화물 염은 염화나트륨염, 염화칼륨염, 염화칼슘염, 또는 염화마그네슘염이다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 100 mM 내지 약 600 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM이다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM이다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 400 mM이다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 항체 조성물을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키기 전, 상기 양이온 교환 수지에 평형(equilibration) 조성물을 적용시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물은 아세테이트 나트륨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물 안의 아세테이트 나트륨 농도는 약 10 mM 내지 150 mM이다. 일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물 안의 아세테이트 나트륨 농도는 약 50 mM이다. 일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 약 10 내지 약 100 g/L 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 약 30 g/L 내지 약 50 g/L 또는 약 35 g/L 내지 약 45 g/L 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 약 40 g/L 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 1% 내지 약 20%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 1% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 3% 내지 약 12%, 또는 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다. 일부 구체예들에서, 상기 H2L2 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에서 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 또는 최소한 55%의 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 EU/OU 번호매김에 따른 위치 442에 공작된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 항체의 항원-결합 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 이황화물 연계된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGΔCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트리아바디(triabody), 디아바디(diabody), 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 CHO 세포계통에서 생산된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 H2L2 조성물 안의 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 세포독소(cytotoxin)에 접합시켜, 면역접합체 조성물을 만드는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역접합체 조성물은 본원에서 기술된 방법들에 따라 만들어진다. 일부 구체예들에서, 상기 면역접합체 조성물은 단지 2%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역접합체 조성물은 단지 1%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역접합체 조성물은 단지 0.5%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.
일부 구체예들에서, H2L2 조성물은 본원에서 기술된 방법들에 따라 만들어진다. 청구항 46의 H2L2 조성물은 단지 2%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 H2L2 조성물은 단지 1%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 H2L2 조성물은 단지 0.5%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.
일부 구체예들에서, (i) 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성, 약 50 μm의 입자 크기, 그리고 직경이 약 500 nM의 포어와 직경이 약 22 nM인 포어를 포함하는 양봉성 포어 크기 분포를 포함하고; (ii) 상기 용출 조성물은 약 300 내지 600 mM의 염화물 염을 포함하고 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 갖고; (iii) 상기 항체 조성물은 약 10 내지 약 100 g/L 단백질을 포함하고, 그리고 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며; (iv) 상기 H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 용리된 컬럼 용적을 포함하고; 그리고 (v) 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 2%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다.
일부 구체예들에서, (i) 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성, 약 50 μm의 입자 크기, 그리고 직경이 약 500 nM의 포어와 직경이 약 22 nM인 포어를 포함하는 양봉성 포어 크기 분포를 포함하고; (ii) 상기 용출 조성물은 약 400 mM NaCl을 포함하고, 약 4.2의 pH를 갖고; (iii) 상기 항체 조성물은 약 30 내지 약 50 g/L 단백질을 포함하고, 그리고 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며; (iv) 상기 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-4를 포함하고; 그리고 (v) 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 1%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다.
일부 구체예들에서, 조성물은 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하고, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 1% 미만은 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며, 그리고 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 그리고 차례로 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체는 서열 번호:1의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:2의 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 시스테인-공작된다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체는 서열 번호:3의 중쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체는 서열 번호:4의 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 0.5% 미만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다.
일부 구체예들에서, 조성물은 항-CD123 면역접합체를 포함하고, 이때 상기 면역접합체는 DGN549-C에 연계된 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하고, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 1% 미만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이고, 그리고 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 그리고 차례로 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체는 서열 번호:1의 가변 중쇄 서열을 포함한다.일부 구체예들에서, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:2의 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 시스테인-공작된다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체는 서열 번호:3의 중쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항-CD123 항체는 서열 번호:4의 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역접합체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure pct00001
일부 구체예들에서, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 0.5% 미만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다.
도 1은 단백질 A 정제 후, 시스테인 공작된 모노클로날 항체 (CysmAb) 조성물의 크기-압출 초-고성능 액체크로마토그래피 (SEC-UPLC) 크로마토그램을 나타낸다. 표시된 피크는 CysmAb 단량체, 응집체, 삼중 경쇄 항체 (H2L3) 및 저분자량 (LMW) 종을 나타낸다. 크로마토그램의 y-축은 흡광도의 척도(AU 또는 흡광도 단위)이다. x-축은 시간 (분) 단위이며, 각 피크의 머무름 시간을 결정하는 데 사용된다.
도 2는 상이한 바이오리엑터 생산 배취(batches)(A, B, C, D, E, F, G, 그리고 H)에서 응집체 (진회색 막대) 및 H2L3 (연회색 막대) 항체의 백분율을 나타낸다. 배취 A 및 B에서 응집체 및 H2L3 항체는 세포계통 A에서 생성되었다. 배취 C 및 D에서 응집체 및 H2L3 항체는 세포계통 B에서 생성되었다. 배취 E, F, G, 및 H에서 응집체 및 H2L3 항체는 세포계통 C에서 생성되었다.
도 3은 염 농도의 가변화 상태에서 (100mM, 95mM, 90mM, 또는 85mM의 인산칼륨염 완충액) 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT) 정제 후 용출액에서 H2L3 항체의 백분율을 나타낸다. 로드 H2L3% (진회색 막대), 용출액 H2L3% (연회색 막대).
도 4는 응집체 및 H2L3 종의 용출 프로파일상에 덧씌운 시스테인 공작된 mAb 종의 용출 프로파을 보여준다. 분획 수율% (검정선), 응집체% (연회색 막대), 그리고 H2L3% (진회색 막대)는 각 분획 1-10 (F1-F10) (x-축)에 대해 측정되었다.
도 5는 상이한 용출 pH에서 용출 푸울(pool) 안에 H2L3의 백분율을 보여준다. 더 높은 pH (실선, 검정 원), 중간 pH (파선, 개방 원), 더 낮은 pH (파선, 검정 원), 출발 H2L3 (곧은 검정선).
도 6은 NaCl 농도 (420 mM, 410mM, 400mM, 390mM, 그리고 380mM) 및 수집 용적 (CV1-3, CV1-4, CV1-5, 그리고 7CV 미만의/대등한) 가변시 용출액에서 H2L3의 백분율을 나타낸다. 출발 H2L3 (곧은 검정선).
도 7은 CysmAb의 정제를 위한 통계학적 타당성 분석에 근거하여 POROSTM XS 양이온 교환 크로마토그래피의 확정된 용출 조건을 나타낸다.
도 8a는 IMGN632의 화학적 구조를 나타낸다. IMGN632는 아황산수소나트륨에서 세포독성 페이로드 DGN549-C에 연계된 항-CD123 G4723 항체 함유하는 면역접합체를 포함하는 조성물이다. 상기 조성물에서 면역접합체의 대부분은 도 8a에 나타낸 술폰화된 형태로 존재한다.
도 8b는 세포독성 페이로드 DGN549-C에 연계된 항-CD123 G4723 항체를 함유하는 면역접합체의 술폰화안된 형태 (모노-이민 구조)를 나타내며, 이는 또한 IMGN632 조성물에도 존재할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 (가령, 항-CD123 항체) 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 조성물로부터 H2L3 항체 (가령, 항-CD123 H2L3 항체) 또는 이의 항원-결합 단편들을 분리시키는 방법을 제공한다.
I. 정의
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어 및 구문이 아래에 정의되어 있다.
"양이온 교환 수지"는 음전하를 띠고, 고체 상(phase)을 통과하거나 통과하는 수용액에서 양이온과의 교환을 위한 자유 양이온을 갖는 고체 상을 지칭한다. 양이온 교환 수지를 형성하기에 적합한 고체 상에 부착된 임의의 음으로 전하 리간드, 예를 들어 카르복실레이트, 설포 네이트 및 기타 다른 것등이 사용될 수 있다. 시판되는 이용가능한 양이온 교환 수지에는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 예를 들면, 술폰산염 기반의 그룹을 갖는 것들; 술포에틸 기반의 그룹; 술포프로필 기반의 그룹; 술포이소부틸 기반의; 술폭시에틸 기반의 그룹, 카르복시메틸 기반의 그룹; 술폰 및 카르복실산 기반의 그룹; 카르복실산 기반의 그룹; 술폰산 기반의 그룹; 그리고 오르소포스페이트 기반의 그룹. 본원에서 제공된 바와 같이, 단백질 (가령, 항체 또는 이의 항원-결합 단편들)은 양이온 교환 수지에서 음으로 하전된 그룹들과 단백질 (가령, 항체 또는 이의 항원-결합 단편들) 상에 양으로 하전된 그룹 간에 상호작용에 근거하여 분리될 수 있다.
용어 "용출하다(elute)" 및 이의 문법적 변이형은 수지 (가령, 크로마토그래피 물질)로부터 적절한 조건을 이용하여 분자, 가령, 관심 대상의 폴리펩티드를 제거하는 것을 말하는데, 가령, 수지 (가령, 크로마토그래피 물질) 주변의 완충액의 이온 강도 또는 pH 변경시킴으로써, 상기 분자의 소수성을 변경시킴으로써, 또는 상리 리간드의 화학적 성질 (가령, 전하)을 변화시켜, 상기 관심대상 단백질이 이 수지에 결합할 수 없고, 따라서 이 수지 (가령, 크로마토그래피 컬럼)로부터 용리된다. 용어 "용출액(eluate)"이란 상기 용출을 컬럼에 적용시킬 때, 관심 대상의 폴리펩티드가 함유된 수지(가령, 컬럼)으로부터 떨어져 나온 유출액을 지칭한다. 상기 관심 대상의 폴리펩티드가 용출된 후, 해당 수지 (가령, 컬럼)는 필요에 따라 재생되고, 소독되고, 보관될 수 있다.
용어 "항체"는 면역 글로불린 분자의 가변 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 항원 인지 부위를 통하여, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 전술한 것들의 조합과 같은 표적을 인지하고, 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 이용된, 용어 "항체"는 무손상(intact) 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질, 그리고 항체의 원하는 생물학적 활성을 나타낸다는 전제하에 임의의 기타 변형된 면역 글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 5 가지 주요 부류의 면역글로불린중 하나일 수 있다: 알파, 델타, 입실론, 감마, 그리고 뮤로 차례로 언급되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 정체성(identity)에 근거하여, IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM, 또는 이의 하위부류(동소형)(가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고, 잘 알려진 하위단위(subunit) 구조 및 3-차원 구성을 갖는다. 항체는 네이키드(naked)이거나, 독소, 방사성동위원소 등과 같은 다른 분자에 접합될 수 있다.
용어 "항체 단편"이란 양이온 교환 수지에 결합할 수 있는 충분한 양 전하를 갖는 무손상 항체의 일부분을 지칭한다. "항원-결합 단편"이란 항원에 결합하고, 양이온 교환 수지에 결합할 수 있는 충분한 양 전하를 갖는 무손상 항체의 일부분을 지칭한다. 항원-결합 단편은 무손상 항체의 항원 결정성 가변 영역을 함유할 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편들, 선형(linear) 항체, 그리고 단일 쇄 항체들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "삼중-경쇄" 또는 "H2L3" 항체 또는 항원-결합 단편이란 2개의 중쇄 또는 이의 단편들과 3개의 경쇄 또는 이의 단편들을 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "이중-경쇄" 또는 "H2L2" 항체 또는 항원-결합 단편이란 2개의 중쇄 또는 이의 단편들과 2개의 경쇄 또는 이의 단편들을 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "항체 조성물"이란 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 조성물을 지칭한다. 항체 조성물은 세포 배양물에서 만들어지고 (가령, CHO 세포로부터), 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제되고, 그리고 음이온 교환 컬럼을 이용하여 임의선택적으로 추가 정제된 항체 및 기타 성분들을 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편들에 추가하여, 항체 조성물은 예를 들면, Tris 아세트산을 함유할 수 있다. 항체 조성물은 또한 응집체를 함유할 수 있다.
"H2L2" 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물보다 더 많은 비율의 H2L2를 함유하는, 양이온 교환 수지로부터 용리된 조성물을 지칭한다.
"H2L3" 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물보다 더 많은 비율의 H2L3을 함유하는, 양이온 교환 수지로부터 용리된 조성물을 지칭한다.
용어 "시스테인 공작된" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 경쇄 또는 중쇄의 주어진 잔기에 정상적으로 존재하지 않은 최소한 하나의 시스테인 ("Cys")을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 Cys은 또한, "공작된 Cys"이라고 불릴 수도 있는데, 임의의 통상적인 분자 생물학 또는 재조합 기술 (가령, 표적 잔기에서 비-Cys 잔기에 대한 코딩 서열을 Cys에 대한 코딩 서열로 대체함으로써)을 이용하여 공작될 수 있다. 예를 들면, 상기 원래 잔기가 5'-UCU-3'의 코딩 서열을 갖는 Ser이라면, 상기 코딩 서열은 (가령, 부위-지향된 돌연변이생성에 의해)로 5'-UGU-3'로 돌연변이될 수 있고, 이것은 Cys를 인코드한다. 특정 구체예들에서, 상기 Cys 공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄에 공작된 Cys를 보유한다. 특정 구체예들에서, 상기 공작된 Cys는 중쇄의 CH3 도메인에 또는 이 부근에 존재한다. 특정 구체예들에서, 상기 공작된 Cys은 중쇄의 잔기 442에 있다 (EU/OU 번호매김; EU 색인, Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, NIH publication No. 91-3242, 1991, 이의 전문은 본원의 참고자료에 통합된다). 특정 구체예들에서, Fc 영역은 EU 색인에 의해 번호매김될 때, 위치 239, 282, 289, 297, 312, 324, 330, 335, 337, 339, 356, 359, 361, 383, 384, 398, 400, 440, 422, 그리고 442중 하나 또는 그 이상에서 시스테인을 포함한다. 특정 구체예들에서, 다음의 잔기들중 임의의 하나 또는 그 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 번호매김); 중쇄의 A118 (EU 번호매김); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 번호매김). 특정 구체예들에서, 가령, scFv의 가변 경쇄 도메인은 Kabat 위치 100에서 시스테인을 갖는다. 특정 구체예들에서, 가령 scFv의 가변 중쇄 도메인은 Kabat 위치 44에서 시스테인을 갖는다. 시스테인 공작된 항체은 가령, U.S. 특허 번호 7,521,541, U.S. 특허 번호 7,855,275, U.S. 공개된 출원 번호. 20110033378 및 WO 2011/005481에서 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
"모노클로날" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 항원 결정 인자, 또는 에피토프를 매우 특이적으로 인지하고, 결합에 관여하는 동질성(homogeneous) 항체 또는 항원 결합 단편 집단을 지칭한다. 이는 상이한 항원 결정기를 지향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체와 대조된다. 용어 "모노클로날" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 무손상 및 전장 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 일부분을 포함하는 융합 단백질, 그리고 항원 인지 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 더욱이, "모노클로날" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하이브리도마, 파아지 선별, 재조합 발현 및 이식유전자를 가진 동물을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 임의의 여러 방식으로 만들어진 항체 및 이의 항원 결합 단편을 지칭한다.
용어 "인간화된" 항체 또는 이의 항원-결합 단편이란 특이적 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린 또는 작은 비-인간(가령, 뮤린) 서열을 함유하는 이의 단편인 비-인간(가령, 뮤린) 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이의 상보성 결정 영역 (CDR)이 비-인간 종(가령, 마우스, 렛, 토끼, 헴스터)의 CDR의 잔기로 대체되고, 원하는 특이성, 친화력, 그리고 능력 ("CDR 접합된")을 갖는 인간 면역글로블린이다(Jones 외, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 외, Nature 332:323-327(1988); Verhoeyen 외, Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 경우들에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기들은 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 또는 단편에서 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fv 프레임워크 영역 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형되어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특이성, 친화력, 및/또는 능력을 개선하고, 최적화시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역을 함유하는 최소한 1개, 전형적으로 2개 또는 3개의 가변 도메인을 포함하지만, FR 모든 영역 또는 실질적으로 모든 영역은 인간 면역글로불린 공통(consensus) 서열의 영역이다. 상기 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로블린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 최소한 일부분, 전형적으로 인간 면역글로블린의 것을 또한 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 만드는데 이용되는 방법의 예로는 U.S. 특허 5,225,539; Roguska 외, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 91(3):969-973 (1994), 그리고 Roguska 외, Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)에 기술된다. 일부 구체예들에서, "인간화된 항체"는 재포장된(resurfaced) 항체다.
항체의 "가변 영역"이란 단독으로 또는 조합에 의해 이 항체 경쇄의 가변 영역 또는 이 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변(hypervariable) 영역으로도 알려진 3 개의 상보성 결정 영역 (CDRs)에 의해 연결된 4 개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다. 각 쇄의 CDRs은 FRs에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDRs과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDRs을 결정하는 데는 최소한 두 가지 기술이 있다: (1) 종-간(cross-species) 서열 변이에 기초한 접근법(가령, Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.), "Kabat"); 그리고 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근법(Al-lazikani 외, J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)). 또한, 때때로 CDRs을 결정하기 위해 당업계에서 이들 두 접근법의 조합이 사용된다.
Kabat 번호매김 시스템은 상기 가변 도메인에서 잔기를 언급할 때 일반적으로 이용된다(경쇄의 대략적으로 잔기 1-107과 중쇄의 잔기 1-113) (가령, Kabat 외, Sequences of Immunological Interest. (5th Ed, 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) ("Kabat").
Kabat, 외에서와 같은 아미노산 위치 번호매김은 Kabat 외의 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 번호매 시스템을 지칭한다(Sequences of Immunological Interest. (5th Ed, 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), "Kabat"). 이 번호매김 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR에 상응하는 몇 개의 또는 추가 아미노산, 또는 이보다 짧은 삽입체를 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입 (Kabat에 따라, 잔기 52a)과 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (가령, Kabat에 따라, 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 번호매김은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 번호가 매겨진 서열의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. Chothia는 대신 구조 루프(structural loops)의 위치를 나타낸다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kabat 번호매김 규칙을 사용하여, 번호 매겨진 Chothia CDR-H1 루프의 단부는 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다 (이것은 Kabat 번호매김 체계가 H35A와 H35B에 삽입을 배치하기 때문이고; 35A 또는 35B가 존재하지 않는다면, 이 루프는32에서 끝나고; 오직 35A만 존재한다면, 이 루프는 33에서 끝나고; 35A와 35B가 모두 존재한다면, 이 루프는 34에서 끝난다). AbM 초 가변 영역은 Kabat CDRs와 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어가 이용된다.
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용어 "인간" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항체 또는, 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 만들어진 인간에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 의미한다. 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 정의에는 무손상 또는 전장 항체 및 이의 단편들을 포함한다.
용어 "키메라(chimeric)" 항체 또는 이의 항원 결합 단편이란 아미노산 서열이 2 종 이상의 종으로부터 유래된 경우의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 한 종의 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 렛, 토끼 등)로부터 유래된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 영역에 상응하고,한편 불변 영역은 다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열과 상동성이어서 그 종에서 면역 반응을 유발하지 않도록 한다.
용어 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정인자(antigenic determinant)"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 특정 항체에 의해 인지되고, 특이적으로 결합될 수 있는 항원 부분을 지칭한다. 상기 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 단백질의 3 차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산과 비-연속 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 유지되지만, 3 차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 형태에서 최소한 3 개, 보다 일반적으로는 최소한 5 개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
"결합 친화력"이란 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예를 들면, 항체)와 이의 결합 짝 (예를 들면, 항체) 사이에 비공유 상호작용의 총 강도를 말한다 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "결합 친화력"이란 결합 쌍의 구성요소들간 (예를 들면, 항체와 항원)에 1:1 상호작용을 반영한 고유한 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화력은 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본 명세서에서 설명된 것이 포함된 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 낮은-친화력 항체는 일반적으로 항원을 천천히 결합 시키며 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은 친화력 항체는 일반적으로 항원을 더 빨리 결합시키고 더 오랫동안 결합하는 경향이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적인 실시예들이 다음에 설명된다.
또는 결합 친화력을 지칭하기 위해 본원에서 사용될 때 "또는 더 나은(or better)"이란 분자와 이의 결합 파트너 사이의 더 강한 결합을 의미한다. 본원에서 사용될 때, "또는 더 나은"이란 더 작은 수치적 Kd 값으로 표시되는 더 강한 결합을 지칭한다. 예를 들어, "0.6 nM 또는 그 이상"의 항원에 대한 친화력을 갖는 항체, 항원에 대한 항체의 친화도는 <0.6 nM, 즉 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM 등, 또는 0.6 nM 미만의 임의의 값이다.
"특이적으로 결합한다"는 것은 일반적으로 항체가 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 그것이 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때 임의의 관련되지 않은 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 에피토프에 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합"한다라고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대 친화도를 확인하기 위해 사용된다. 예를 들면, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련 에피토프 "D"에 대한 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 언급될 수 있다.
"선호적으로 결합한다"라는 것은 항체가 관련된, 유사하거나, 상동성이거나 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 에피토프에 더 쉽게 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "선호적으로 결합하는" 항체는 관련 에피토프보다 그 에피토프에 결합할 가능성이 높지만, 이러한 항체는 관련 에피토프와 교차-반응할 수 있다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 것으로, 본 명세서에서 호환된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하고; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 컨쥬게이션과 같은 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산을 포괄한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함) 및 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 이 정의 안에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체 기반이기 때문에, 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 단일 쇄, 또는 연합된 쇄로 발생될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용 된 용어 "면역접합체"또는 "접합체"는 세포 결합제 (즉, 항-CD123 항체 또는 이의 단편)에 연계된 화합물 또는 이의 유도체를 나타내며, 다음의 일반식으로 정의된다: C-A, 이때 C = 세포독소 (가령, 메이탄신노이드, 피롤벤조디아제핀 (PBD) 및 테트라사이클 벤조디아제핀을 포함하는 벤조디아제핀, 이를 테면, 인돌리노벤조디아제핀) 그리고 A = 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 가령, 항-CD123 항체 또는 항체 단편. 면역접합체는 임의선택적으로 링커를 함유할 수 있고, 다음의 식으로 정의될 수 있다: C-L-A, 이때 C = 세포독소, L = 링커, 그리고 A = 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 가령, 항-CD123 항체 또는 항체 단편. 면역 접합체는 또한 상기 일반식의 역순으로 정의될 수 있다: C-A 또는 A-L-C. 면역접합체는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (A)마다 다중 세포독소 (C) 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (A)마다 다수의 세포독소 (C)와 링커 (L)를 또한 함유할 수 있다.
"링커"는 화합물, 보통 약물 (이를 테면, 피롤벤조디아제핀(PBD) 및 테트라사이클 벤조디아제핀을 비롯한 메이탄신노이드, 가령, 인돌리노벤조디아제핀)을 세포-결합제 (이를 테면 항-CD123 항체 또는 이의 단편)에 안정적 공유적인 방법으로 연결시킬 수 있는 임의의 화학적 모이어티다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성을 유지하는 조건 하에서, 예를 들어 이황화 결합 절단에 영향을 받거나, 또는 실질적으로 저항 일 수 있다. 적합한 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 디설파이드기와 티오에테르기을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 문구는 물질 또는 조성물이 제제를 포함하는 다른 성분 및/또는 이런 것들로 처리되는 포유 동물과 화학적으로 및/또는 독성학적으로 양립가능해야 함을 나타낸다.
"약제학적 제형(formulation)"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없는 독성을 갖는 추가 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다. 이러한 제형은 멸균될 수 있다.
용어 "(인간) IL-3Rα", "인터루킨-3 수용체 알파", 또는 "CD123"은 본원에서 호환되며, 다른 언급이 없는 한, 임의의 고유의 (인간) IL-3Rα 또는 CD123을 지칭한다. CD123 단백질은 이종이량체 사이토킨 수용체 (IL-3 수용체, 또는 IL-3R)의 인터루킨 3-특이적 하위단위다. 이 용어들은 "전장", 프로세스안된 CD123 폴리펩티드 뿐만 아니라 상기 세포로부터 프로세싱에 의해 결과된 임의의 형태의 CD123 폴리펩티드를 포괄한다. 이 용어는 자연 발생적 CD123 변이체들, 가령, 스플라이스 변이체 및 대립 유전자 변이체에 의해 인코딩된 것들을 또한 포함한다. 본원에서 기술된 CD123 폴리펩티드는 다양한 원천, 이를 테면, 인간 조직 유형 또는 또다른 원천으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 준비될 수 있다. 특이적으로 표시될 때, "CD123"은 CD123 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 지칭하는데 이용될 수 있다. 인간 CD123 서열은 공지되어 있으며, 예를 들면, NCBI 참조 번호 NP_002174 & NM_002183 (인간 CD123 변이체 1의 단백질 및 핵산 서열, 그리고 NP_001254642 & NM_001267713 (인간 CD123 변이체 2의 단백질 및 핵산 서열)과 연합된 것들을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인간 CD123"은 서열 번호:11 또는 서열 번호:12의 서열을 포함하는 CD123을 지칭한다.
1 MVLLWLTLLL IALPCLLQTK EDPNPPITNL RMKAKAQQLT WDLNRNVTDI ECVKDADYSM
61 PAVNNSYCQF GAISLCEVTN YTVRVANPPF STWILFPENS GKPWAGAENL TCWIHDVDFL
121 SCSWAVGPGA PADVQYDLYL NVANRRQQYE CLHYKTDAQG TRIGCRFDDI SRLSSGSQSS
181 HILVRGRSAA FGIPCTDKFV VFSQIEILTP PNMTAKCNKT HSFMHWKMRS HFNRKFRYEL
241 QIQKRMQPVI TEQVRDRTSF QLLNPGTYTV QIRARERVYE FLSAWSTPQR FECDQEEGAN
301 TRAWRTSLLI ALGTLLALVC VFVICRRYLV MQRLFPRIPH MKDPIGDSFQ NDKLVVWEAG
361 KAGLEECLVT EVQVVQKT (서열 번호:11)
1 MVLLWLTLLL IALPCLLQTK EGGKPWAGAE NLTCWIHDVD FLSCSWAVGP GAPADVQYDL
61 YLNVANRRQQ YECLHYKTDA QGTRIGCRFD DISRLSSGSQ SSHILVRGRS AAFGIPCTDK
121 FVVFSQIEIL TPPNMTAKCN KTHSFMHWKM RSHFNRKFRY ELQIQKRMQP VITEQVRDRT
181 SFQLLNPGTY TVQIRARERV YEFLSAWSTP QRFECDQEEG ANTRAWRTSL LIALGTLLAL
241 VCVFVICRRY LVMQRLFPRI PHMKDPIGDS FQNDKLVVWE AGKAGLEECL VTEVQVVQKT
(서열 번호:12)
용어 "항-CD123 항체" 또는 "CD123에 결합하는 항체"란 일반적으로 충분한 친화력으로 CD123에 결합하는 항체로써, 이 항체(가령, huMov19 (M9346A) 항체)는 CD123을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 무관한, 비-CD123 단백질에 대한 항-CD123 항체의 결합 정도는 예를 들어, 방사선면역분석법 (RIA)에 의해 측정될 때, CD123에 대한 이 항체의 결합에 대해 약 10% 미만일 수 있다.
용어 "IMGN632"는 도 8에 나타낸 면역접합체 조성물을 지칭한다. 상기 면역접합체 조성물은 술폰화된 형태로 huCD123-6Gv4.7 ("G4723A") 항체마다 평균 1.5 내지 2.1개의 DGN549-C 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 포함한다 (도 8a). 상기 면역접합체 조성물는 술폰화안된 면역접합체 (도 8b에 나타낸 모노-이민 구조)를 또한 포함할 수 있다.
본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수("a", "an" 및 "the")형은 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다는 것으로 주지되어야 한다.
본 명세서에서 "포함하는"이라는 언어는 구체예들이 기술되는 경우, 그렇지 않으면 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 관점에서 설명된 유사한 구체예들이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
따라서, 구절에서 사용된 용어 "및/또는", 이를 테면 "A 및/또는 B"는 "A와 B", "A 또는 B", "A", 및 "B"를 포함한다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 다음 각 구체예를 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
II. 양이온 교환 수지
본원에서 제공된 방법에 따르면, 양이온 교환 수지를 이용하여 H2L3과 이중-경쇄 (H2L2) 항체 및 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 조성물로부터 삼중-경쇄 (H2L3) 항체 및 이의 항원-결합 단편들을 분리할 수 있다.
본원에서 제공된 방법에서 유용한 하나의 예시적인 양이온 교환 수지는 최적화된 POROSTM 강력한 양이온 교환 수지 XS (Thermos Fisher, 예전에는 Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA; 10,000 mL = Cat. # 440334; 5,000 mL = Cat. #4404335; 1,000 mL = Cat. # 4404336; 250 mL = Cat. # 4404337; 10 mL = Cat. # 82071, 그리고 50 mL = Cat. # 82072)이다.
상기 양이온 교환 수지는 예를 들면, 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠)을 포함할 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성을 갖는다. 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠)을 포함하고, 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성을 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 양이온 교환 수지는 Fractogel SE HiCap (EMD Millipore) 컬럼은 아니다. 일부 구체예들에서, 상기 양이온 교환 수지는 메타크릴레이트 기반의 수지는 아니다.
상기 양이온 교환 수지는 약 50 μm의 입자 크기를 가질 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 양봉성(biomodal) 포어 크기 분포, 가령, 약 500 nM 직경의 포어와 약 22 nM 직경의 포어를 가질 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 약 50 μm의 입자 크기와 직경이 500 nM인 포어 및 직경이 약 22 nM인 포어를 갖는 양봉성 포어 분포를 가질 수 있다.
상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠)을 포함하고, 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성을 갖고, 약 50 μm의 입자 크기와 직경이 500 nM인 포어 및 직경이 약 22 nM인 포어를 갖는 양봉성 포어 분포를 가질 수 있다.
상기 양이온 교환 수지는 특정 크기일 수 있다. 예를 들면, 상기 양이온 교환 수지는 약 10 내지 약 15,000 ml일 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 약 20 내지 약 25 mL일 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 약 100 내지 약 150 mL일 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 약 10,000 내지 약 15,000 mL일 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 약 13,800 mL일 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 32 L 또는 그 이상일 수 있다.
상기 양이온 교환 수지는 컬럼일 수 있다.
III. 항체 및 이의 항원-결합 단편들
항체 및 이의 항원-결합 단편들 (가령, 치료요법적으로 유용한 항체 및 이의 항원-결합 단편들)은 2개의 중쇄 또는 이의 단편들과 2개의 경쇄 또는 이의 단편들을 일반적으로 함유한다. 그러나, 2개의 중쇄 또는 이의 단편들 및 3개의 경쇄 또는 이의 단편들을 함유하는 삼중-경쇄 (H2L3) 종이 또한 관찰되었다. 이러한 H2L3 종은 예를 들면, 상기 H2L3 종이 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 상에서 여분의 경쇄와 상기 공작된 시스테인중 하나 사이에 이황화결합 형성의 결과라면, 시스테인 공작된 항체 및 이의 항원-결합 단편들은 더 높은 비율로 발생될 수 있다. 따라서, 본원에서 이용된 바와 같이, 항체 조성물은 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함할 수 있다. 유사하게, H2L2 또는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 시스테인-공작된 H2L2 또는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 상기 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, EU/OU 번호매김 위치 442에서 공작된 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이다. 일부 구체예들에서, 상기 인간화된 항체 또는 단편은 재포장된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 온전한(fully) 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
예를 들어, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명에 이용될 수 있다. 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1-3에 나타낸 huCD123-6Gv4.7 항체의 서열을 함유할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 차례로 서열 번호: 5, 6, 그리고 7의 가변 중쇄 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3 서열, 그리고 서열 번호: 8, 9, 그리고 10의 가변 경쇄 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:1에서 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:2에서 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:1에서 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인과 서열 번호:2에서 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:3에서 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:4에서 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:3에서 제시된 서열을 포함하는 중쇄와 서열 번호:4에서 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
한 가지 실시예에서, 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1에서 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인과 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다. 또다른 실시예에서, 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 2에서 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 여전히 또다른 실시예에서, 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 3에서 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 CD123의 아미노산 205 내지 346 안의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (가령, 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 재조합에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 이용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (가령, 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 포유동물 세포계통, 가령, CHO 세포에서 만들어질 수 있다.
IV. 항체 조성물
본원에서 제공된 방법에 따르면, 삼중-경쇄 (H2L3) 항체 및 이의 항원-결합 단편들 및 이중-경쇄 (H2L2) 항체 및 이의 항원-결합 단편들을 모두 포함하는 항체 조성물을 양이온 교환 컬럼에 적용시켜 상기 H2L3 및 H2L2 종을 분리시킬 수 있다.
본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항체 조성물은 이 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 1% 내지 약 20%가 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인 조성물일 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항체 조성물은 당해 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 1% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 3% 내지 약 12%, 또는 약 10% 내지 약 15%가 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인 조성물이다.
본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 항체 조성물은 특정 로딩 밀도가 상기 양이온 교환 수지에 적용되도록 특정 단백질 농도를 포함할 수 있다. 상기 단백질 농도 (로딩 밀도)는 예를 들면, 약 10 g/L 내지 약 100 g/L일 수 있다. 상기 단백질 농도 (로딩 밀도)는 약 30 g/L 내지 약 50 g/L일 수 있다. 상기 단백질 농도 (로딩 밀도)는 약 30 g/L 내지 약 45 g/L일 수 있다. 상기 단백질 농도 (로딩 밀도)는 약 30 g/L 내지 약 40 g/L일 수 있다. 상기 단백질 농도 (로딩 밀도)는 약 40 g/L일 수 있다.
H2L2 및 H2L3 종에 추가하여, 항체 조성물은 응집체를 함유할 수 있다. 예를 들면, 항체 조성물은 약 1 내지 약 10%의 응집체를 함유할 수 있다. 항체 조성물은 약 1 내지 약 5%의 응집체를 함유할 수 있다. 항체 조성물은 약 2 내지 약 5%의 응집체를 함유할 수 있다.
상기 항체 조성물은 특정 pH, 가령, 약 3.8 내지 약 6.5를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 5.5의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 4.7의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 4.4의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 4.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 4.0 내지 약 5.0의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 4.0 내지 약 4.7의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 4.0 내지 약 4.4의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 4.0 내지 약 4.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 항체 조성물은 약 4.2의 pH를 가질 수 있다.
상기 항체 조성물의 pH는 예를 들면, 상기 항체 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 적용되기 전, 상기 양이온 교관 수지에 적용되는 평형 조성물 (결합 조성물)의 pH와 동일할 수 있는데, 하기에서 더 상세하게 기술된다. 상기 항체 조성물의 pH은 예를 들면, 용출 조성물의 pH와 동일할 수 있는데, 이 용출 조성물은 하기에서 더 상세하게 기술되는 바와 같이, H2L2 조성물을 용출시키기 위하여, 상기 항체 조성물 다음으로 양이온 교환 수지에 적용될 수 있다. 상기 항체 조성물의 pH는 상기 평형 조성물 (결합 조성물) 및 상기 용출 조성물의 pH와 동일할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 pH 6.0을 가지지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 조성물은 6.0 미만의 pH를 갖는다.
항체 조성물은 단백질 A-정제된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함할 수 있다. 상기 항체 조성물은 단백질-A 정제되고, 음이온 교환 컬럼에서 정제된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 항체 조성물은 가용성 H2L2 및 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들에 추가하여, 이를 테면 완충액 (가령, Tris 아세트산) 및/또는 항체 응집체와 같은 성분들을 함유할 수 있다.
V. H2L2 및 H2L3 조성물을 만들기 위한 용출 용액 및 방법
본원에서 제공된 방법에 따르면, 삼중-경쇄 (H2L3) 항체 및 항원-결합 그리고 이중-경쇄 (H2L2) 항체 및 이의 항원-결합 단편들은 양이온 교환 컬럼으로부터 분리 용출될 수 있다.
구체적으로, 용출 조성물을 양이온 교환 수지 (가령, 컬럼)에 적용시켜, 선호적으로 H2L2 종을 용출시키고, 그 다음 H2L2 조성물은 당해 수지로부터 수집될 수 있다. 이러한 방법에 사용을 위한 용출 조성물이 본원에서 제공된다.
본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 용출 조성물은 염을 포함할 수 있다. 상기 염은 염화물 염, 예를 들면 염화나트륨염, 염화칼륨염, 염화칼슘염, 또는 염화마그네슘염일 수 있다. 한 가지 예로써, 상기 염은 염화나트륨염이다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 예를 들면, 약 100 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 200 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 300 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 400 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 200 mM 내지 약 500 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 300 mM 내지 약 500 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 400 mM 내지 약 500 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 380 mM 내지 약 420 mM일 수 있다. 상기 용출 조성물에서 상기 염 (가령, 염화나트륨염)의 농도는 약 400 mM일 수 있다.
일부 구체예들에서, 용출 조성물은 100 mM의 염 농도를 가지지 않는다. 일부 구체예들에서, 용출 조성물은 100 mM 이상의 염 농도를 갖는다.
본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 용출 조성물은 특정 pH를 가질 수 있다. pH는 예를 들면, 약 3.8 내지 약 6.5일 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 5.5의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 4.7의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 4.4의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 4.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 4.0 내지 약 5.0의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 4.0 내지 약 4.7의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 4.0 내지 약 4.4의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 4.0 내지 약 4.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 용출 조성물은 약 4.2의 pH를 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 용출 조성물은 6.0의 pH를 가지지 않는다. 일부 구체예들에서, 용출 조성물은 6.0 미만의 pH를 갖는다.
본원에서 제공된 방법에 사용을 위한 용출 조성물은 특정 염 농도와 특정 pH의 조합을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 염 (가령, 염화나트륨염) 농도는 약 300 mM 내지 약 600 mM이고, pH는 약 3.8 내지 약 5.5일 수 있다. 예를 들면, 상기 염 (가령, 염화나트륨염) 농도는 약 300 mM 내지 약 500 mM이고, pH는 약 3.8 내지 약 5.0일 수 있다. 예를 들면, 상기 염 (가령, 염화나트륨염) 농도는 약 380 mM 내지 약 420 mM이고, pH는 약 4.0 내지 약 4.4일 수 있다. 상기 염 (가령, 염화나트륨염) 농도는 약 400 mM이며, pH는 약 4.2일 수 있다.
일부 구체예들에서, 용출 조성물은 pH 6.0에서 100 mM의 염화나트륨염을 갖지 않는다.
본원에서 실증된 바와 같이, 본원에서 제공된 용출 조성물 (가령, 낮은 pH 및 높은 염 농도를 갖는)을 본원에서 제공된 H2L2 및 H2L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편들을 갖는 항체 조성물을 함유하는 양이온 교환 수지에 제공하면, H2L3 오염은 거의 없거나 또는 없이, H2L2 조성물을 용출시킬 수 있다. 이것은 본원에서 제공된 방법은 H2L3 종이 초기(H2L2 용출 피크와 함께) 뿐만 아니라 후기 (H2L2 용출 피크 다음) 모두에서 용출되도록 하는 것 대신, 지속적으로 후기 (H2L2 용출 피크 다음)에 용출되도록 할 수 있기 때문이다.
따라서, 본원에서 제공된 H2L2 조성물은 하나 또는 그 이상의 용리된 컬럼 용적을 포함할 수 있다. 예를 들면, H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 단일 용리된 컬럼 용적을 포함할 수 있다. H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 2개의 용리된 컬럼 용적 (가령, 컬럼 용적 1과 2 또는 컬럼 용적 3과 4)을 포함할 수 있다. H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9의 용리된 컬럼 용적을 포함할 수 있다. H2L2 조성물은 또한 용리된 컬럼 용적 1-9 (가령, 처음 9개의 컬럼 용적 푸울)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-8 (가령, 처음 4개의 컬럼 용적 푸울)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-7 (가령, 처음 4개의 컬럼 용적 푸울)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-6 (가령, 처음 4개의 컬럼 용적 푸울)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-5 (가령, 처음 4개의 컬럼 용적 푸울)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-4 (가령, 처음 4개의 컬럼 용적 푸울)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-3 (가령, 처음 4개의 컬럼 용적 푸울)을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 방법을 이용하여, H2L3 종은 항체 조성물에서 H2L2로부터 효과적으로 분리될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 이용된 방법으로 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에 존재하는 H2L3 종의 단지 25%, 단지 20%, 단지 15%, 단지 10%, 또는 단지 5% 만을 포함하는 H2L2 조성물이 생성되게 할 수 있다. 다른 한편, 본원에서 이용된 방법으로 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에 존재하는 H2L3 종의 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 또는 최소한 95%를 포함하는 H2L3 조성물이 생성되게 할 수 있다.
본원에서 이용된 방법을 이용함으로써, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 단지 2%, 단지 1%, 또는 단지 0.5%만이 H2L3 종인, H2L2 조성물이 획득될 수 있다. 본원에서 이용된 방법을 이용함으로써, 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 최소한 99.5%는 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인 H2L2 조성물이 획득될 수 있다.
본원에서 이용된 방법을 이용함으로써, 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물보다 적은 응집체를 함유하는 H2L2 조성물이 또한 수득될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 이용된 방법을 이용하면, 단지 1% 응집체 또는 단지 0.5%의 응집체를 포함하는 H2L2 조성물이 획득될 수 있다. 본원에서 이용된 방법을 이용하면, 약 0.3% 응집체, 약 0.2% 응집체, 또는 약 0.1%의 응집체를 포함하는 H2L2 조성물이 획득될 수 있다.
유익하게는, 본원에서 제공된 방법은 높은 수율을 또한 제공한다. 예를 들면, 본원에서 이용된 방법을 이용하면 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물 안에 상기 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 또는 최소한 55%를 함유하는 H2L2 조성물이 획득될 수 있다.
상기 양이온 교환 수지를 평형화시키고, 당해 수지에 H2L2 및 H2L3 항체 결합을 촉진시키기 위하여, 평형 조성물 (또는 결합 조성물)은 상기 항체 조성물이 당해 수지에 적용되기 전, 당해 수지에 적용될 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)을 이용하여 당해 수준의 pH 및/또는 전도율을 유지시킬 수 있다. 본 과정에 이용될 수 있는 적합한 완충액은 당분야에 공지되어 있고, 그리고 상기 H2L3 및 H2L2 종을 분리시키기 위하여 크로마토그래피 단계에 이용된 선택된 수지와 양립가능한 pH의 임의의 완충액을 포함한다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 충분히 높은 pH, 그러나, 항체 조성물 안의 항체 및 이의 항원-결합 단편들이 상기 양이온 교환 수지에 결합되는 것을 방해하기에는 너무 높지 않은 pH를 유지하는 농도의 아세테이트 나트륨을 함유할 수 있다.
상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 예를 들면, 10 mM 내지 150 mM의 아세테이트 나트륨을 포함할 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 예를 들면, 25 mM 내지 150 mM의 아세테이트 나트륨을 포함할 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 50 mM의 아세테이트 나트륨을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 20 mM의 아세테이트 나트륨을 함유하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 20 mM 이상의 아세테이트 나트륨을 함유한다.
상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 특정 pH, 가령, 약 3.8 내지 약 6.5를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 3.8 내지 약 5.5의 pH 를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 3.8 내지 약 4.7의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 3.8 내지 약 4.4의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 3.8 내지 약 4.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 4.0 내지 약 5.0의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 4.0 내지 약 4.7의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 4.0 내지 약 4.4의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 4.0 내지 약 4.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 약 4.2의 pH를 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 6.0을 가지지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 평형 조성물 (결합 조성물)은 6.0 미만의 pH를 갖는다.
본원에서 실증된 바와 같이, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 조성물로부터 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 분리시키는 방법은 (i) 상기 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 넣고, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 수지에 결합되고; (ii) 용출 조성물을 이 양이온 교환 수지에 넣고; 그리고 (iii) 이 수지로부터 H2L2 조성물을 수거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 항체 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 적용되기 전, 평형 조성물 (결합 조성물)을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키는 것을 임의선택적으로 포함할 수 있다. 본원에서 실증된 바와 같이, 양이온 교환 수지의 선택 뿐만아니라 상기 용출 조성물의 pH 및 염 농도의 선택은 모든 H2L3 종이 H2L2의 피크 용출 다음에 용출되도록 하고, H2L3 종이 거의 없거나(가령, 1% 미만) 또는 없는, H2L2 조성물의 수집을 유익하게 허용할 수 있다.
VI. H2L2 조성물의 용도
본원에서 제공된 방법에 따르면 삼중-경쇄 (H2L3) 항체 및 이의 항원-결합 단편들은 이중-경쇄 (H2L2) 항체 및 이의 항원-결합 단편들로부터 분리되어, H2L2 조성물을 만들 수 있다. 이러한 H2L2 조성물은 예를 들면, 치료요법적 목적에 유용하다. 예를 들면, H2L2 조성물을 이용하여 상당히 순수한 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 약제학적 조성물, 가령, 단지, 1% 또는 0.5%만의 H2L3 종을 포함하는 조성물을 제형화할 수 있다.
본원에서 제공된 방법에 따라 만들어진 H2L2 조성물을 또한 이용하여 면역접합체를 만들 수 있다. 유익하게는, 본원에서 제공된 상기 H2L2 조성물로부터 만들어진 면역접합체에는 H2L3 종이 거의 없거나 또는 없다. 이러한 면역접합체는 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 약물 또는 프로그럭을 연계시키기 위한 연결기(linking group)를 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 연결기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 디설파이드기, 티오에테르기, 산-불안정기, 광-불안정기, 펩티다제-불안정기 및 에스테라제-불안정기를 포함한다. 개별 면역접합체은 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 하나당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 약물 또는 프로드럭을 함유할 수 있다. 이러한 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 당 평균 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1.5 내지 약 2.1개의 약물 또는 프로드럭을 가질 수 있다.
본원에서 제공된 방법에 따라 만들어진 면역접합체 조성물은 단지 2%, 단지 1%, 또는 단지 0.5%의 H2L3 종을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 방법에 따라 만들어진 면역접합체 조성물은 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 최소한 99.5%의 H2L2 종을 포함할 수 있다.
예를 들어, H2L2 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 H2L2 조성물 (가령, huCD123-6Gv4.7; G4723A)은 세포독성제에 접합되어, 면역접합체를 형성할 수 있다. 상기 세포독성제는 예를 들면, 인돌리노-벤조디아제핀 암-사멸제, 이를 테면 DGN549-C일 수 있다. 이러한 면역접합체를 만드는 방법은 예를 들면, WO 2017/004025 및 WO 2017/004026에 제공되며; 이의 내용은 본원에 참고자료에 전체로 편입된다.
일부 구체예들에서, H2L2 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 (가령, huCD123-6Gv4.7; G4723A)을 포함하는 H2L2 조성물이 DGN549-C에 접합될 수 있다. 생성 조성물의 면역접합체는 항체(huCD123-6Gv4.7; G4723A)당 평균 약 1.5 내지 약 2.1개의 세포독소 (DGN549-C)를 함유할 수 있다. 상기 면역접합체 조성물은 중황산나트륨에서 제형화되어, 도 8a (및 8b)에 나타낸 것과 같이, IMGN632를 만들 수 있다.
실시예들
본 명세서에 기술된 실시예 및 구체예들은 단지 예시적인 목적이며, 그에 대한 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 이들은 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1: H2L3 수준의 평가
이러한 시스테인 공작된 항체를 발현시키기 위해, 안정적으로 형질감염된 포유동물 세포는 삼중 경쇄 (H2L3) 항체로 알려진 고-분자량 종을 분비하는 것으로 나타났다는 것이 이미 보고되었다(Gomez 외, Biotechnol Bioeng. 2010 Mar 1;105(4):748-60). 이들 항체는 당해 항체의 공작된 시스테인과 연합된 여분의 (제3의) 경쇄를 함유한다. 이러한 새로운 고 분자량 (HMW) 종의 분리는 단량체 종과의 유사성으로 인해, 시스테인 공작된 모노클로날 항체 (CysmAb)의 다운스트림 정제 동안 문제(challenge)를 일으킨다. H2L3 종을 제거하기 위한 강력하고, 효과적인 정제 전략을 개발하기 위해, 예시적인 항체에서 H2L3 함량을 평가하고, H2L3을 제거하기 위한 다양한 방법을 평가하였다.
연구된 예시적인 모노클로날 항체는 상기 시스테인 공작된 huCD123-6Gv4.7 (G4723A) 항체 (WO 2017/004025 및 WO 2017/004026 참고, 이의 내용은 본원의 참고자료에 전적으로 편입된다; 또한 상기 표 1-3 참고)였다. 상기 항체는 CHO 세포에서 발현되었고, 그 다음 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 맑은 세포 배양물 상청액으로부터 정제되었다. 상기 단백질 A 크로마토그래피 후, 상기 항체의 순도(단량체, 응집체, H2L3, 그리고 저분자량 종 포함)는 크기-압출 초-고성능 액체크로마토그래피 (SEC-UPLC)를 이용하여 평가되었다. SEC-UPLC 분석에서 H2L3 종을 나타낸다 (도 1). SEC-UPLC 크로마토그램에서 CysmAb 조성물 종의 각 피크에 대한 정체 시간을 나타낸다: 단량체 (17.686 분), 응집체 (15.336 분), H2L3 (16.638 분), 그리고 저분자량 종 (19.008 및 22.445 분) (도 1).
동일한 항체 (A, B, C, D, E, F, G, 그리고 H)의 8개 상이한 바이오리엑터 생산 배취를 이용한 실험들이 분석되었다. 세포계통 및 배양 조건 모두에 따라 H2L3의 양이 영향을 받았고, 2-11%에서 가변적이었다 (도 2).
실시예 2: 세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 H2L3 분리에 비효과적이다.
세라믹 히드록시아파타이트 (CHT) 크로마토그래피를 이용하여 상기 H2L3 종을 효과적으로 분리하지 못하였다. (도 3.) 이들 실험에서, CHT 컬럼은 20 mM 인산칼륨염, pH 6.7을 함유하는 완충액으로 평형화되었다. 4.7%의 H2L3 종을 갖는 CysmAb는 CHT™ 수지 (BioRad Laboratories, Hercules, CA)상에 로딩되었고, 100 mM, 95 mM, 90 mM, 또는 85 mM의 인산칼륨염 완충액, pH 6.7을 이용한 용출 단계에 의해 용리되었다. 1CV 분획에서 50 mAU 이상으로 용출 피크가 수집되었다. 상기 항체 단계 수율 및 각 분획의 H2L3%가 분석되었고, 6 컬럼 용적 (CV) 가성 푸울에서 단계 수율 및 H2L3%의 산출 및 비교에 이용되었다. 고분자량 종 (가령, 응집체 및 H2L3)은 이들의 큰 크기로 인하여 CHT 수지 상에 더 강력하게 결합하고, 따라서 나중 분획에 용리될 것으로 간주되었다. 더욱이, 더 낮은 포스페이트 농도를 갖는 용출은 더 넓은 용출 피크와, 가상 푸울의 더 낮은 단계 수율을 초래하고, 분리는 개선되는 것으로 간주되었다. 그러나, 도 3에서 시험된 포스페이트 범위에서 H2L3 종의 제거는 개선되지 않았고, 2.5%의 높은 수준으로 유지되었음을 볼 수 있다. 상기 염 농도를 변화시키는 추가 실험에서 또한 H2L3 종을 효과적으로 분리하지 못하였고, CHT 컬럼에서 pH를 변화시킬 여지가 거의 없다. 따라서, CHT 크로마토그래피는 H2L3을 효과적으로 분리시킬 능력이 없었다.
실시예 3: 최적화된 양이온 교환 크로마토그래피는 H2L3을 효과적으로 분리시킨다.
POROSTM XS 강력한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 H2L3 종의 분리가 테스트되었다. POROSTM 강력한 양이온 교환 수지 XS (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA)는 50 mM 아세테이트 나트륨, pH 5.5를 함유하는 완충액으로 평형화되었다. 3% 응집체 및 4% H2L3 종을 가지는 CysmAb 조성물은 POROSTM XS 컬럼에 로딩되었고, 20CV에 걸쳐 0-200mM NaCl를 이용한 구배(gradient) 용출에 의해 용리되었다. 0.5 CV 분획에서 50 mAU 이상으로 용출 피크가 수집되었다. 각 분획에서 항체 단계 수율, 응집체 %, 그리고 H2L3%가 분석되었고, 분획 번호에 대해 플롯되었다. 도 4에서 응집체 종들이 후기 분획 (F8-F10)에서 용출되었고, 용리된 항체의 주요 피크로부터 효과적으로 분리되었음을 볼 수 있다. 상기 H2L3 종은 용리된 항체의 주요 피크와는 상이한 분획에서 또한 용리되었다. 후기 분획에서 용리된 상기 H2L3 종의 상당한 부분은 상기 H2L2 항체의 주요 피크로부터 효과적으로 분리되었다 (도 4). 그러나, 일부 H2L3 종은 상기 항체 피크의 초기 분획과 함께 공동-용리되었다 (도 4). 초기-용리된 H2L3 종은 글루타티온으로 캡핑된 H2L3 항체에서 유리 시스테인으로 인한 것으로 보인다. 상기 글루타티온-캡핑된 종은 산성이 더 크고 (더 낮은 PI), 따라서 초기 분획에서 용출된다. 후기-용출된 H2L3 종은 시스테인으로 캡핑된 H2L3 항체의 유리 시스테인으로 인한 것으로 간주된다. 상기 시스테인-캡핑된 종은 산성이 약하고(더 높은 PI), 따라서 후기 분획으로부터 용출된다.
이들 결과로 볼 때, POROSTM XS 컬럼 결합 및 용출 조건의 추가 최적화로 인하여 초기-용출 H2L3 종이 후기 분획에 용출되도록 기획되었고, 상기 H2L2 종의 주요 피크로부터 더욱 효과적으로 분리될 수 있을 것이다. Poros XS 크로마토그래피의 결합 및 용출 pH를 낮추면 H2L3 종의 제거가 상당히 개선되었음을 알았다 (도 5).
NaCl 구배 용출은 pH 5.0, 4.7, 그리고 4.4 (20CV에 걸쳐 pH 5.0, 150-300mM NaCl; 25CV에 걸쳐 pH 4.7 및 4.4, 0-500mM NaCl)에서 POROSTM XS 크로마토그래피를 이용하여 실행되었다. POROSTM XS 수지 로딩 물질 (항체 조성물)은 대략적으로 8.4%의 H2L3 종을 갖는다. 0.5 CV 분획에서 100 mAU 이상으로 용출 피크가 수집되었다. 각 분획의 항체 단계 수율 및 H2L3%가 분석되었다. 상이한 수집 용적의 가상 푸울에서 H2L3%는 각 가상 푸울의 수율에 대하여 플롯되었다. 상기 항체 피크의 초기 분획에서 공동-용리된 H2L3 종은 pH 감소에 따라 감소되었다. 도 5에서 POROSTM XS 컬럼의 결합 및 용출 pH를 감소시키면 상기 H2L3 종의 제거를 상당히 개선시켰고, 더 낮은 pH를 이용한 용출은 더 낮은 H2L3 종을 갖는 산물을 생성시킴을 보여준다. pH 4.4에서 상기 H2L3은 상기 항체로부터 효과적으로 분리되었고, 오직 후기 분획에서만 용출되었다. 더 낮은 pH를 이용한 용출은 더 낮은 H2L3 종을 갖는 산물 (H2L2 조성물)을 생성시켰다.
용출 피크의 염 농도 및 수집 용적은 또한 H2L3 제거에 영향을 주는 것으로 나타났다 (도 6). 이들 실험에서, 대략적으로 4.1% H2L3 종을 갖는 출발 물질 (항체 조성물)은 50 mM 아세테이트 나트륨, pH 4.2로 평형화된 POROSTM XS 컬럼 상에 로딩되었다. 결합된 항체는 50mM 아세테이트 나트륨 완충액, pH 4.2 에서 380 mM 내지 420 mM NaCl로 용리되었다. 1 CV 분획에서 100 mAU 이상으로 용출 피크가 수집되었다. 상이한 NaCl 농도에서 용리되고, 상이한 수집 용적을 갖는 가상 푸울의 H2L3%을 비교하였다. 도 6에서는 NaCl 농도 및 수집 용적이 낮고 적을 수록 상기 용출 푸울 안에 H2L3%는 더 낮게 획득된 것을 보여준다. 시험된 NaCl 농도 범위에 걸쳐 가상 푸울의 H2L3%는 4.1%에서 <1%로 모두 감소되었다.
도 6의 실험 결과는 JMP® 예측 프로파일링 도구를 이용하여 분석되었다. 상이한 염 농도 및 수집 용적 하에서 수율, 응집체%, H2L3%, 그리고 전체 고분자량 (HMW)%을 예측하기 위한 수학적 모델이 구축되었다. 도 7에서는 염 농도가 모든 반응에 상당히 영향을 주는 반면, 수집 용적은 단지 단계 수율에만 유의적으로 영향을 주었다는 것을 볼 수 있다. 각 응답의 바람직함성은 제품 품질 요구 사항과 실제 고려 사항에 따라 설정되었다. 최종 공정 조건에 대해 전체 농도가 가장 높은 염 농도 및 수집 부피의 조합을 고려하였다.
pH, 염 농도, 로딩 밀도, 그리고 수집 용적을 비롯한 결합 및 용출 조건의 최적화에 의해, 상기 H2L3 수준은 최종 산물에서 일관되게 <1%로 감소되었다(표 4; 실험들은 상기에서 기술된 바와 동일한 POROS 조건에서, pH 4.2, 400mM NaCl을 이용하고, 4CV (가령, 컬럼 용적 1-4)에서 수집되었다).
Figure pct00006
상기에서 기술된 실험들에 근거하여, pH, 염, 로딩 밀도, 그리고 수집 용적에 대한 이상적인 범위는 다음과 같이 결정되었다: pH 약 3.8 내지 6.5, 염 농도 약 100 mM 내지 60 0mM, 로딩 밀도 약 10-100 g/L, 그리고 수집 용적 약 1-9 CV.
* * *
요약 및 요약 섹션이 아니라, 상세한 설명 섹션이 청구항을 해석하기 위해 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 요약 및 요약 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려 된 바와 같이 본 발명의 하나 이상의 예시적인 실시예들을 제시하지만, 그리고 따라서, 본 발명 및 첨부된 청구 범위를 임의의 방식으로 제한하려는 것이 아니다.
본 발명은 특정 기능 및 그 관계의 구현을 나타내는 기능적 빌딩 블록을 이용하여 설명되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본 명세서에서 임의로 정의되었다. 특정 기능 및 그 관계가 적절히 수행되는 한, 대체 경계가 정의될 수 있다.
특정 실시예들에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 본질을 충분히 밝힐 것이며, 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않으면서, 과도한 실험없이 이러한 특정 실시예와 같은 다양한 응용예를 당업계 기술 범위내에 지식을 적용함으로써 다른 이들도 용이하게 수정 및/또는 적응시킬 수 있다. 따라서, 이러한 적응 및 수정은 본 명세서에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 실시예의 등가의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본 명세서의 문구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아니며, 본 명세서의 용어 또는 문구는 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 전술한 예시적인 구체예 중 어느 것에 의해 제한되지 않아야 하며, 다음의 청구범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ImmunoGen, Inc. LIU, Fang LI, Xinfang <120> Separation of Triple-Light Chain Antibodies Using Cation Exchange Chromatography <130> 2921.097PC01/EKS/CLD/BMB <150> 62/562,188 <151> 2017-09-22 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huCD123-6Gv7 Heavy Chain Variable Region <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> huCD123-6Gv4 Light Chain Variable Region <400> 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Claims (130)

  1. H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 조성물로부터 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 단리시키는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    (i) 상기 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 적용시켜, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이 당해 수지에 결합되게 하고;
    (ii) 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 갖는 용출 조성물을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키고; 그리고
    (iii) 상기 수지로부터 용리된 H2L2 조성물을 수집한다.
  2. H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 조성물로부터 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 단리시키는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    (i) 상기 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 적용시켜, H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이 당해 수지에 결합되게 하고;
    (ii) 약 300 mM 내지 약 600 mM의 염 농도를 갖는 용출 조성물을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키고; 그리고
    (iii) 상기 수지로부터 용리된 H2L2 조성물을 수집한다.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 2%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 1%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 0.5%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  6. 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 최소한 99.5%는 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  7. 청구항 1-6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에서 단지 25%, 단지 20%, 단지 15%, 단지 10%, 또는 단지 5%의 상기 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  8. 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 하나 또는 그 이상의 용리된 컬럼 용적을 포함하는, 방법.
  9. 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-4를 포함하는, 방법.
  10. 청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠)을 포함하는, 방법.
  11. 청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성을 포함하는, 방법.
  12. 청구항 1-11중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지의 입자 크기는 약 50 μm인, 방법.
  13. 청구항 1-12중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 양봉성 포어 크기 분포를 갖는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 이때 상기 양봉성 포어 크기 분포는 500 nM 직경의 포어와 약 22 nM 직경의 포어를 포함하는, 방법.
  15. 청구항 1-14중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 POROSTM 강력한 양이온 교환 수지 XS인, 방법.
  16. 청구항 1 또는 3-15중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 염을 포함하는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염은 염화물 염인, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 염화물 염은 염화나트륨염, 염화칼륨염, 염화칼슘염, 또는 염화마그네슘염인, 방법.
  19. 청구항 16-18중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 100 mM 내지 약 600 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM인, 방법.
  20. 청구항 2-15중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM인, 방법.
  21. 청구항 19 또는 20에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 400 mM인, 방법.
  22. 청구항 2-21중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는, 방법.
  23. 청구항 1-22중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 갖는, 방법.
  24. 청구항 22 또는 23에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는, 방법.
  25. 청구항 1-24중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 상기 항체 조성물을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키기 전, 상기 양이온 교환 수지에 평형 조성물을 적용시키는 것을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 평형 조성물은 아세테이트 나트륨을 포함하는, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 평형 조성물 안의 아세테이트 나트륨 농도는 약 10 mM 내지 150 mM인, 방법.
  28. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 평형 조성물 안의 아세테이트 나트륨 농도는 약 50 mM인, 방법.
  29. 청구항 25-28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 평형 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 이때 상기 평형 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는, 방법.
  31. 청구항 1-30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 10 내지 약 100 g/L 단백질을 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 30 g/L 내지 약 50 g/L 또는 약 35 g/L 내지 약 45 g/L 단백질을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 40 g/L 단백질을 포함하는, 방법.
  34. 청구항 1-33중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는, 방법.
  36. 청구항 1-35중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 1% 내지 약 20%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 이때 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 1% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 3% 내지 약 12%, 또는 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  38. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에서 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 또는 최소한 55%의 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  39. 청구항 1-38중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 이때 상기 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 EU/OU 번호매김에 따른 위치 442에 공작된 시스테인 잔기를 포함하는, 방법.
  41. 청구항 1-40중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 항체를 포함하는, 방법.
  42. 청구항 1-40중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 항체의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  43. 청구항 1-40중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv or scFv, 이황화물 연계된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함하는, 방법.
  44. 청구항 1-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 CHO 세포계통에서 생산된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  45. 청구항 1-44중 임의의 한 항에 있어서, 상기 H2L2 조성물 안의 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 세포독소에 접합시켜, 면역접합체 조성물을 만드는 것을 더 포함하는, 방법.
  46. 청구항 1-45중 임의의 한 항에 따라 만들어진 H2L2 조성물.
  47. 청구항 46에 있어서, 단지 2%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, H2L2 조성물.
  48. 청구항 47에 있어서, 단지 1%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, H2L2 조성물.
  49. 청구항 48에 있어서, 단지 0.5%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, H2L2 조성물.
  50. 청구항 45에 따라 만들어진 면역접합체 조성물.
  51. 청구항 50에 있어서, 단지 2%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들만을 포함하는 면역접합체 조성물.
  52. 청구항 51에 있어서, 단지 1%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들만을 포함하는 면역접합체 조성물.
  53. 청구항 52에 있어서, 단지 0.5%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들만을 포함하는 면역접합체 조성물.
  54. 청구항 1에 있어서, 이때
    (i) 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성, 약 50 μm의 입자 크기, 그리고 직경이 약 500 nM의 포어와 직경이 약 22 nM인 포어를 포함하는 양봉성 포어 크기 분포를 포함하고;
    (ii) 상기 용출 조성물은 약 300 내지 600 mM의 염화물 염과 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 포함하고;
    (iii) 상기 항체 조성물은 상기 항체 조성물에서 약 10 내지 약 100 g/L 단백질을 포함하고, 그리고 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며;
    (iv) 상기 H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 하나 또는 그 이상의 용리된 컬럼 용적을 포함하고; 그리고
    (v) 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 2%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  55. 청구항 1에 있어서, 이때
    (i) 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성, 약 50 μm의 입자 크기, 그리고 직경이 약 500 nM의 포어와 직경이 약 22 nM인 포어를 포함하는 양봉성 포어 크기 분포를 포함하고;
    (ii) 상기 용출 조성물은 약 400 mM NaCl 및 약 4.2의 pH를 포함하고;
    (iii) 상기 항체 조성물은 약 30 내지 약 50 g/L 단백질을 포함하고, 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며;
    (iv) 상기 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-4를 포함하고; 그리고
    (v) 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 1%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  56. 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 그리고 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항-CD123 항체 조성물로부터 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 단리시키는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    (i) 상기 항-CD123 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 적용시켜, 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이 당해 수지에 결합되게 하고;
    (ii) 약 3.8 내지 약 5.5의 pH를 갖는 용출 조성물을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키고;
    (iii) 그리고 상기 수지로부터 용리된 항-CD123 H2L2 조성물을 수집하고,
    이때 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  57. 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 그리고 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 항-CD123 항체 조성물로부터 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 단리시키는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    (i) 상기 항-CD123 항체 조성물을 양이온 교환 수지에 적용시켜, 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이 당해 수지에 결합되게 하고;
    (ii) 약 300 mM 내지 약 600 mM의 염 농도를 갖는 용출 조성물을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키고;
    (iii) 그리고 상기 수지로부터 용리된 항-CD123 H2L2 조성물을 수집하고,
    이때 항-CD123 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 및 항-CD123 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  58. 청구항 56 또는 57에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:1의 가변 중쇄 서열을 포함하는, 방법.
  59. 청구항 56-58중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:2의 가변 경쇄 서열을 포함하는, 방법.
  60. 청구항 56-59중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 시스테인-공작된, 방법.
  61. 청구항 56-60중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:3의 중쇄 서열을 포함하는, 방법.
  62. 청구항 56-61중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:4의 경쇄 서열을 포함하는, 방법.
  63. 청구항 56-62중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 2%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 1%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 0.5%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  66. 청구항 56-65중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 최소한 99.5%는 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  67. 청구항 56-66중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에서 단지 25%, 단지 20%, 단지 15%, 단지 10%, 또는 단지 5%의 상기 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  68. 청구항 56-67중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 하나 또는 그 이상의 용리된 컬럼 용적을 포함하는, 방법.
  69. 청구항 56-68중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-4를 포함하는, 방법.
  70. 청구항 56-69중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠)을 포함하는, 방법.
  71. 청구항 56-70중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성을 포함하는, 방법.
  72. 청구항 57-72중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지의 입자 크기는 약 50 μm인, 방법.
  73. 청구항 56-72중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 양봉성 포어 크기 분포를 갖는, 방법.
  74. 청구항 73에 있어서, 이때 상기 양봉성 포어 크기 분포는 500 nM 직경의 포어와 약 22 nM 직경의 포어를 포함하는, 방법.
  75. 청구항 56-74중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 양이온 교환 수지는 POROSTM 강력한 양이온 교환 수지 XS인, 방법.
  76. 청구항 56 또는 58-75중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 염을 포함하는, 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염은 염화물 염인, 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 이때 상기 염화물 염은 염화나트륨염, 염화칼륨염, 염화칼슘염, 또는 염화마그네슘염인, 방법.
  79. 청구항 76-78중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 100 mM 내지 약 600 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM인, 방법.
  80. 청구항 57-78중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM인, 방법.
  81. 청구항 79 또는 80에 있어서, 이때 상기 용출 조성물 안의 염 농도는 약 400 mM인, 방법.
  82. 청구항 57-81중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는, 방법.
  83. 청구항 56-82중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 갖는, 방법.
  84. 청구항 82 또는 83에 있어서, 이때 상기 용출 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는, 방법.
  85. 청구항 56-84중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 상기 항체 조성물을 상기 양이온 교환 수지에 적용시키기 전, 상기 양이온 교환 수지에 평형 조성물을 적용시키는 것을 포함하는, 방법.
  86. 청구항 85에 있어서, 이때 상기 평형 조성물은 아세테이트 나트륨을 포함하는, 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 이때 상기 평형 조성물 안의 아세테이트 나트륨 농도는 약 10 mM 내지 150 mM인, 방법.
  88. 청구항 86에 있어서, 이때 상기 평형 조성물 안의 아세테이트 나트륨 농도는 약 50 mM인, 방법.
  89. 청구항 85-88중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 평형 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는, 방법.
  90. 청구항 89에 있어서, 이때 상기 평형 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는, 방법.
  91. 청구항 56-90중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 10 내지 약 100 g/L 단백질을 포함하는, 방법.
  92. 청구항 91에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 30 g/L 내지 약 50 g/L 또는 약 35 g/L 내지 약 45 g/L 단백질을 포함하는, 방법.
  93. 청구항 92에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 40 g/L 단백질을 포함하는, 방법.
  94. 청구항 56-93중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 3.8 내지 약 6.5의 pH를 갖는, 방법.
  95. 청구항 94에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 약 4.2의 pH를 갖는, 방법.
  96. 청구항 56-95중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 1% 내지 약 20%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  97. 청구항 96에 있어서, 이때 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 1% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 3% 내지 약 12%, 또는 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  98. 청구항 56-97중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 H2L2 조성물은 상기 양이온 교환 수지에 제공되는 항체 조성물에서 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 또는 최소한 55%의 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  99. 청구항 56-97중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  100. 청구항 99에 있어서, 이때 상기 시스테인-공작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 EU/OU 번호매김에 따른 위치 442에 공작된 시스테인 잔기를 포함하는, 방법.
  101. 청구항 56-100중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 항체를 포함하는, 방법.
  102. 청구항 56-100중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 항체의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  103. 청구항 56-100중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv or scFv, 이황화물 연계된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함하는, 방법.
  104. 청구항 56-103중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 조성물은 CHO 세포계통에서 생산된 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, 방법.
  105. 청구항 56-104중 임의의 한 항에 있어서, 상기 H2L2 조성물 안의 H2L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 세포독소에 접합시켜, 면역접합체 조성물을 만드는 것을 더 포함하는, 방법.
  106. 청구항 56-105중 임의의 한 항에 따라 만들어진 H2L2 조성물.
  107. 청구항 106에 있어서, 단지 2%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, H2L2 조성물.
  108. 청구항 107에 있어서, 단지 1%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, H2L2 조성물.
  109. 청구항 108에 있어서, 단지 0.5%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는, H2L2 조성물.
  110. 청구항 105에 따라 만들어진 면역접합체 조성물.
  111. 청구항 110에 있어서, 단지 2%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들만을 포함하는 면역접합체 조성물.
  112. 청구항 111에 있어서, 단지 1%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들만을 포함하는 면역접합체 조성물.
  113. 청구항 112에 있어서, 단지 0.5%의 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들만을 포함하는 면역접합체 조성물.
  114. 청구항 56에 있어서, 이때
    (i) 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성, 약 50 μm의 입자 크기, 그리고 직경이 약 500 nM의 포어와 직경이 약 22 nM인 포어를 포함하는 양봉성 포어 크기 분포를 포함하고;
    (ii) 상기 용출 조성물은 약 300 내지 600 mM의 염화물 염과 약 3.8 내지 약 5.0의 pH를 포함하고;
    (iii) 상기 항체 조성물은 상기 항체 조성물에서 약 10 내지 약 100 g/L 단백질을 포함하고, 그리고 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며;
    (iv) 상기 H2L2 조성물은 컬럼 용적 1-9에서 선택된 하나 또는 그 이상의 용리된 컬럼 용적을 포함하고; 그리고
    (v) 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 2%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  115. 청구항 57에 있어서, 이때
    (i) 상기 양이온 교환 수지는 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 술포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-) 표면 기능성, 약 50 μm의 입자 크기, 그리고 직경이 약 500 nM의 포어와 직경이 약 22 nM인 포어를 포함하는 양봉성 포어 크기 분포를 포함하고;
    (ii) 상기 용출 조성물은 약 400 mM NaCl 및 약 4.2의 pH를 포함하고;
    (iii) 상기 항체 조성물은 약 30 내지 약 50 g/L 단백질을 포함하고, 상기 항체 조성물에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 약 10% 내지 약 15%는 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며;
    (iv) 상기 H2L2 조성물은 용리된 컬럼 용적 1-4를 포함하고; 그리고
    (v) 상기 H2L2 조성물에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편들의 단지 1%만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 방법.
  116. 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 조성물에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 1% 미만은 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이며, 그리고 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 그리고 차례로 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 조성물.
  117. 청구항 116에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:1의 가변 중쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  118. 청구항 116 또는 117에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:2의 가변 경쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  119. 청구항 116-118중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 시스테인-공작된, 조성물.
  120. 청구항 116-119중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:3의 중쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  121. 청구항 116-120중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:4의 경쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  122. 청구항 116-121중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 0.5% 미만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 조성물.
  123. 항-CD123 면역접합체를 포함하는 조성물에 있어서, 이때 상기 면역접합체는 DGN549-C에 연계된 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하고, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 1% 미만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이고, 그리고 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들 차례로 서열 번호: 5-7의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 그리고 차례로 서열 번호: 8-10의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 조성물.
  124. 청구항 123에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:1의 가변 중쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  125. 청구항 123 또는 124에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:2의 가변 경쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  126. 청구항 123-125중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 시스테인-공작된, 조성물.
  127. 청구항 123-126중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:3의 중쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  128. 청구항 123-127중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체는 서열 번호:4의 경쇄 서열을 포함하는, 조성물.
  129. 청구항 1-128중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 면역접합체는 다음의 구조를 갖는 조성물:
    Figure pct00007
  130. 청구항 1-129중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편들의 0.5% 미만이 H2L3 항체 또는 이의 항원-결합 단편들인, 조성물.
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