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KR20200025246A - 세포의 이온채널 활성화 방법, 세포의 이온채널 활성화용 구조체 및 그의 제조방법 - Google Patents

세포의 이온채널 활성화 방법, 세포의 이온채널 활성화용 구조체 및 그의 제조방법 Download PDF

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KR20200025246A
KR20200025246A KR1020180102310A KR20180102310A KR20200025246A KR 20200025246 A KR20200025246 A KR 20200025246A KR 1020180102310 A KR1020180102310 A KR 1020180102310A KR 20180102310 A KR20180102310 A KR 20180102310A KR 20200025246 A KR20200025246 A KR 20200025246A
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KR
South Korea
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cells
cell
ion channel
pillar
seeding
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Withdrawn
Application number
KR1020180102310A
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English (en)
Inventor
이정오
채수상
이건희
김성환
김은혜
김기석
이향애
김은미
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 한국화학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to KR1020180102310A priority Critical patent/KR20200025246A/ko
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Abstract

본 발명은 세포의 이온채널 활성화용 구조체 및 세포의 이온채널 활성화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 상기 기둥 형태의 구조물은 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 가짐으로써, 세포의 이온채널을 활성화시킬 수 있는 구조체, 그의 제조방법 및 세포의 이온채널 활성화 방법에 관한 것이다.

Description

세포의 이온채널 활성화 방법, 세포의 이온채널 활성화용 구조체 및 그의 제조방법{Method of activating ion channel of cell, Structure for ion channel activation of cell and Manufacturing method thereof}
본 발명은 시딩된 세포의 이온채널을 활성화시키는 방법, 세포의 이온채널을 활성화시킬 수 있는 구조체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
암은 유전학(genetics)적인 측면에서, 발암물질(carcinogen), 식이요법 및 육체적 활동, 자외선 노출 및 가능한 감염에 이르는 범위의 많은 가능한 원인을 갖는 복합적 질환인 데, 세포수준에서의 암체계 연구는 암동역학(cancer dynamics)에서 보다 나은 이해를 제공할 것으로 기대되고 있다. 최근에는 가능한 발암물질에 대한 세포반응을 활발히 추구하고 있다(pursued). 화학적 간섭(chemical interferences)(발암물질) 뿐만 아니라 물리적 환경이 세포 운명을 결정할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 세포의 형질을 의도적으로 조절하는 기술은 신약개발에서 조직공학, 재생의료에 이르기까지 널리 사용되는 핵심기술이다. 암세포를 의도적으로 공격성이 강해지도록 하여 전이를 막는 신약을 개발하는 신약 스크리닝에서 형질전환을 통한 특정 조직/장기의 개발, 그리고 치료제 목적의 세포를 양산하는 기술이 현재 가장 많이 연구되고 이용되는 기술에 해당한다. 세포의 형질전환을 위해서는 일반적으로 유기저분자 형태의 약물을 이용하여 세포의 형질을 전환시키나 최근에는 물리적 자극 (압력, 온도, 환경 기타)을 가하거나 ECM(extracellular matrix)을 제어하여 세포의 형질전환을 유도하는 연구도 많이 진행되고 있다.
물리적 자극을 이용한 형질 전환은 유기저분자 약물에 의한 자극보다 상대적으로 세포에 한정적 영향을 미치며 이는 약물형태의 자극에서 오는 부작용을 상대적으로 줄일 수 있는 장점을 제공한다. 최근 나노/마이크로 패터닝 기술의 발전으로 세포를 다양한 나노/마이크로구조에 접목시켜 형질전환을 유도하는 연구가 활발하게 진행 중에 있다.
그러나 이들 대부분의 연구는 실험실 수준의 연구로, 나노/마이크로구조 자극에 의한 일부의 특성 변화만을 보고하고 있다. 특히 마이크로/나노구조의 필라형태 구조물에 다양한 세포의 성장이 보고되고 있는데, 이들 구조물의 기하학적 구조/크기와 세포의 형질전환의 상관관계가 일부 수준에서만 밝혀지고 있다.
이에 따라, 세포의 형질전환, 특히 이온채널의 활성화를 원하는 형태로 유도해낼 수 있으며 그에 따른 세포생리학적 변화를 정확하게 프로파일링한 구조물의 개발이 필요하다.
한국공개특허 제2014-0050514호
본 발명은 시딩된 세포의 이온채널의 활성화를 유도하는 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 시딩된 세포의 이온채널을 활성화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 시딩된 세포의 이온채널의 활성화를 유도하는 구조체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 상기 기둥 형태의 구조물은, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
2. 위 1에 있어서, 상기 기둥 형태의 구조물은 세포가 시딩 직후 10시간 이하까지 2 내지 3개의 기둥 형태의 구조물과 접촉되는 간격을 갖는, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
3. 위 1에 있어서, 상기 기둥 형태의 구조물의 높이는 시딩되는 세포의 수직 단면의 최장 높이보다 큰, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
4. 위 1에 있어서, 상기 기둥 형태의 구조물은 종횡비(aspect ratio)가 5 이상인, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
5. 위 1에 있어서, 상기 세포는 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나인, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
6. 세포를 준비하는 단계; 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 상기 기둥 형태의 구조물은, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태 구조물에 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는, 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 상기 세포를 시딩하는 단계;를 포함하는 세포의 이온채널 활성화 방법.
7. 위 6에 있어서, 상기 세포는 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나인, 세포의 이온채널 활성화 방법.
8. 위 7에 있어서, A549 세포는 상기 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 시딩된 후 이동성이 증가하는 기간을 갖는, 세포의 이온채널 활성화 방법.
9. 위 7에 있어서, 심근 세포는 상기 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 시딩된 후 박동수가 증가되는, 세포의 이온채널 활성화 방법.
10. 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며, 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는 기둥 형태의 구조물이 음각으로 패턴화된 탄성고분자를 포함하는 중간체 주형을 준비하는 제1단계; 상기 중간체 주형을 광경화성 수지 상에 각인시키고 30초 내지 5분 동안 빛을 조사하는 제2단계; 및 상기 광경화된 수지로부터 중간체 주형을 제거하는 제3단계;를 포함하는 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법.
11. 위 10에 있어서, 상기 제1단계는 그 이전에 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는 기둥 형태의 구조물을 실리콘웨이퍼 상에 형성하여 실리콘 마스터 주형을 준비하는 단계;를 더 포함하는 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법.
12. 위 10에 있어서, 상기 세포는 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나인, 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법.
본 발명의 마이크로미터 크기의 기둥 형태의 구조물이 규칙적으로 배열된 구조체는 세포의 형질을 전환시킬 수 있으며, 특히 이온채널을 활성화시킬 수 있다.
보다 구체적으로는 A549 세포의 경우 chemotaxis를 유발하여 세포의 이동속도를 증가시키며, 심근세포의 경우 심장박동속도를 빠르게 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 기둥 형태의 구조물을 포함하는 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 세포가 시딩되어 있는 상태의 일 예시를 나타낸 사시도이다(100: 바닥면, 200: 기둥 형태의 구조물).
도 2는 본 발명에 따른 세포의 이온채널 활성화용 구조체 상의 기둥 형태의 구조물과 관련된 치수의 정의를 나타낸 도이다.
도 3은 세포와 기둥 형태의 구조물의 간격과의 상관관계를 나타낸 것으로, (a)는 비교예 3, (b)는 본 발명의 실시예 1, (c)는 비교예 2, (d)는 비교예 1을 나타낸다.
도 4는 기둥 형태의 구조물의 높이(H)는 세포의 단면 중 최장 직경(CH)보다 크거나 거의 같은 상태일 때 최대의 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 도이다.
도 5는 A549 세포가 시딩된 후 10시간 이내(초기 상태)에 세포가 2개 내지 3개의 기둥 형태의 구조물과만 접촉하는 이온채널 활성화용 구조체에서 최대의 이동성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 기둥 형태의 구조물의 높이와 A549 세포의 이동속도와의 상관관계를 나타낸 것으로, 비교예 1, 비교예 2, 실시예 1의 구조체를 비교하여 (a)에서는 배양 시간에 따른 A549 세포의 이동속도를 측정, (b)는 배양 시간에 따른 상처 넓이를 측정, (c)는 배양 시간에 따른 상처 치유율을 측정한 것이다.
도 7은 (a)는 Control(6-Well plate, Falcon), (b)는 비교예 1(flat, 기둥 형태의 구조물이 없는 구조체), (c)는 실시예 1(기둥 형태의 구조물의 직경 = 2 μm, 기둥 형태의 구조물의 중심간 거리 = 16 μm인 구조체)의 세포의 이온채널 활성화용 구조체에서 배양된 심근세포(cardiomyocytes)의 사진으로서, 일반 transmission 타입의 광학현미경 사진이다.
도 8은 비교예 1과 Control(6-Well plate, Falcon), 실시예 1을 비교하여 세포의 이온채널 활성화용 구조체에서 배양된 심근세포의 박동속도가 증가하는 것을 보여주는 그래프이다(** p<0.01, Tukey's test).
도 9는 심근 세포에서의 이온채널이 활성화되는 지를 단백질 발현을 통해 확인한 도이다. (a)는 cardiac marker인 cTnT(cardiac Troponin T)의 발현, (b)는 이온채널과 관련된 Automated beating의 marker인 HCN4(Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated channel 4), (c)는 이온채널과 관련된 Automated beating의 marker인 NCX1(Na+/Ca2+ Exchange 1)의 발현을 확인한 것이다. 비교예 1과 실시예 1을 배양 시간을 1주 및 2주로 나누어 비교 분석한 것이다.
도 10도 심근세포에서의 이온채널이 활성화되는 지를 단백질 발현을 통해 확인한 도이다. (a)는 심장의 이온채널에서의 탈분극과 관련된 marker들인 Nav1.5(Sodium channel, voltage-dependent) 및 Cav1.2(Calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1C subunit)의 발현량을 실시예 1과 비교예 1을 배양 시간을 1주 및 2주로 나누어 비교 분석한 것이며, (b)는 재분극과 관련된 marker들인 hERG(human　Ether-
Figure pat00001
-go-go-Related　Gene), Kv4.3(Potassium voltage-gated channel subfamily D member 3), Kv7.1(Potassium voltage-gated channel), Kir2.1(inward-rectifier potassium ion channel) 및 Kir2.2(inward-rectifier potassium ion channel)를 비교예 1과 실시예 1을 배양 시간을 1주 및 2주로 나누어 비교 분석한 것이다.
본 발명의 일 실시예는 기둥 형태의 구조물을 포함한 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 대한 것으로 세포의 이온채널의 활성화를 최대화할 수 있는 기하학적 구조 및 크기를 가짐으로써, 세포의 이온채널을 활성화시킬 수 있는 세포의 이온채널 활성화용 구조체를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "이온채널"(ion channel)이란, 세포 내부와 외부의 이온이 순환하기 위해 필요한 막 단백질을 의미한다. 이온채널은 세포 내부에 필요한 이온 농도를 유지시키며, 이온의 이동을 조절하여 세포의 크기를 유지한다. 신경계를 이루는 세포인 뉴런에서는 신호전달을 준비하는 상태인 휴지막전위(resting membrane potential)를 유지하는 데 필요하며, 세포의 활성 상태 즉 세포 내 신경전달인 신경활성(action potential)에 역할을 한다. 기본적으로 모든 세포는 이온채널을 갖고 있으며 크게 2종류로 나뉘는데 이온성 단백질(ionophoric protein)과 이온 수송체이다.
본 명세서에서, 용어 "기둥 형태의 구조물 사이의 간격"은 인접한 서로 다른 기둥 형태의 구조물의 수평 단면의 중심 사이의 거리를 의미한다. 도 2에 "기둥 형태의 구조물 사이의 간격"의 정의가 개략적으로 도시되어 있다.
이하 도면을 참고하여, 본 발명의 실시예를 보다 구체적으로 설명하도록 한다. 다만, 본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니된다.
도 1에는 본 발명의 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 일 실시예가 개략적으로 도시되어 있다.
도 1을 참고하면, 본 발명에 따른 구조체의 일 실시예는 바닥면(100) 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물(200)을 포함한다.
기둥 형태의 구조물(200)은 시딩된 세포를 지지하고 자극하여 세포의 형질 전환을 유도하는 기능을 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 기둥 형태의 구조물(200)은 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 가질 수 있다. 기둥 형태의 구조물(200)이 상기 간격과 높이를 가지면 시딩된 세포의 이온 채널이 활성화될 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 구조체의 일 실시예에 시딩된 세포는 기둥 형태의 구조물(200)에 의해 지지되지 않는 세포 하부가 큰 압축 응력을 받게 되는데, 이 경우 세포의 이온 채널이 활성화되는 것으로 생각된다. 다만 이는 예측일 뿐 이에 한정되어 해석되어서는 안된다.
도 2는 시딩된 세포가 구조체와 접촉하는 다양한 예시를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2를 참고하면, (b)는 본 발명의 일 실시예에 대응되는 경우인 반면, (a)는 3개 초과의 다수 기둥 형태 구조물에 의해 지지되는 경우이고, (c)는 바닥면(100)에 세포가 닿는 경우이며, (d)는 기둥 형태의 구조물이 없는 비교예 1의 경우이다. 전술한 바와 같이 (b)의 경우에만 이온채널이 활성화될 수 있다.
도 3에는 기둥 형태의 구조물(200)의 간격, 수평 단면 직경 및 높이의 측정방법이 개략적으로 도시되어 있다.
기둥 형태의 구조물(200) 간의 간격은 시딩된 직후 세포가 2개 내지 3개의 기둥 형태의 구조물(200)과 접촉되도록 제어되며, 상기 간격은 세포의 종류 또는 크기에 따라 조절될 수 있다. 예를 들면, A549 세포 또는 심근세포의 경우에는, 기둥 형태의 구조물(200)의 간격은 12 μm 내지 20 μm일 수 있으며, 바람직하게는 14 μm 내지 18 μm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 기둥 형태의 구조물(200)은 세포가 시딩 직후 10시간 이하까지 2 내지 3개의 기둥 형태의 구조물과 접촉되는 간격을 가질 수 있다. 기둥 형태의 구조물(200)이 상기 간격을 갖는 경우 시딩된 세포의 이온채널 활성화 정도가 더욱 극대화될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 기둥 형태의 구조물(200)의 수평 단면 직경은 해당 구조물이 세포의 무게로 인해 견고하게 유지되지 못하고 휘어지거나 세포를 침투하지 않을 정도로 작아서는 아니되며, 시딩된 세포가 해당 구조물의 측면에 닿지 않으면서 상부에만 위치할 정도의 크기는 되지 않는 직경일 수 있다.
따라서 상기 수평 단면 직경은 구체적인 세포의 종류에 따라 다를 수 있으나, 예를 들면, 1 μm 내지 3 μm일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1.5 μm 내지 2.5 μm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 1 μm 미만의 직경에서는 기둥 형태의 구조물이 세포막을 침투하거나 해당 구조물이 세포의 무게로 인해 견고하게 유지되지 못하고 쉽게 휘어질 수 있다.
또한, 3 μm 초과의 직경에서는 실질적인 인접한 기둥 사이의 공간이 좁아져서 세포와 바닥면 간의 상호작용을 나타내기 어려울 수 있으며, 기둥 상부에 넓은 편평한 공간을 가지므로 세포가 복수의 기둥 구조물에 걸쳐 부착되지 않고 하나의 구조물에만 부착될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 기둥 형태의 구조물(200)의 높이는 바닥면(100)에 시딩된 세포가 닿지 않는 높이일 수 있다. 예를 들면, 시딩되는 세포의 수직 단면 중 최장 높이보다 큰 높이일 수 있다. 기둥 형태의 구조물(200)이 시딩된 세포가 바닥면(100)에 닿지 않는 높이를 가져야 세포의 이온채널을 활성화시킬 수 있다.
기둥 형태의 구조물(200)의 높이의 구체적인 값은 시딩되는 세포의 종류에 따라 조절될 수 있다. 예를 들면, A549세포 또는 심근세포의 경우에 있어서, 상기 높이는 10 내지 16 μm일 수 있으며, 바람직하게는 12 내지 14 μm일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다. 도 4에는 세포의 수직 단면의 최장 높이와 기둥 형태의 구조물(200)의 높이의 관계가 개략적으로 도시되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 기둥 형태의 구조물(200)은 종횡비(aspect ratio)가 5 이상일 수 있다.
여기서 종횡비(Aspect ratio)란, 기둥 형태의 구조물(200)의 직경과 높이의 비율을 의미한다. 예를 들어, 종횡비가 5인 구조체의 경우, 기둥 형태의 구조물의 직경과 높이의 비율이 5라는 의미로 직경이 2 μm이면, 높이는 10 μm일 수 있다.
기둥 형태의 구조물(200)이 상기 종횡비를 갖는 경우 시딩된 세포의 이온채널 활성화 정도가 더욱 극대화될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 기둥 형태의 구조물(200)의 소재는 유기물, 무기물 등에 제한되지 않으며, 세포독성이 없으며, 세포를 시딩했을 때 그 강도가 세포에 의해 휘어지지 않는 소재일 수 있다.
또한, 상기 소재는 세포의 관측과 배양이 용이하도록 투명하고 배양액을 담지할 수 있는 형태로 가공이 용이한 것이 유리할 수 있다.
예를 들면, 투명한 광경화성 수지 조성물의 경화물, 경도가 조정된 PDMS, 실리카 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바닥면(100)은 기둥 형태의 구조물(200)을 지지하며, 기둥 형태의 구조물(200)과 동일한 소재로 형성된 것일 수 있으며, 기둥 형태의 구조물(200)과 일체화된 것일 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 세포는 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
전술한 본 발명의 구조체에 세포를 시딩한 후 배양하면, 세포의 이온채널이 활성화될 수 있다. 세포의 이온채널이 활성화되면, 심근 세포의 경우 심박수가 증가할 수 있고, A549 세포의 경우 chemotaxis를 유발하여 세포의 이동성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 세포의 이온채널 활성화 방법을 제공한다.
본 발명의 세포의 이온채널 활성화 방법에 따른 일 실시예는, 세포를 준비하는 단계; 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 상기 기둥 형태의 구조물은, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는, 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 상기 세포를 시딩하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 세포의 이온채널 활성화 방법에 따른 일 실시예는 준비된 세포를 전술한 본 발명의 구조체에 시딩하고 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 이온채널 활성화 방법의 일 실시예에 적용될 수 있는 세포는 특별한 제한은 없으나, 예를 들면 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
전술한 바와 같이, 세포의 이온채널이 활성화되면, 심근세포의 경우 심박수가 증가할 수 있고, A549세포의 경우 chemotaxis를 유발하여 세포의 이동성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법의 일 실시예는,
바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며, 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는 기둥 형태의 구조물이 음각으로 패턴화된 탄성고분자를 포함하는 중간체 주형을 준비하는 제1단계; 상기 중간체 주형을 광경화성 수지 상에 각인시키고 30초 내지 5분 동안 빛을 조사하는 제2단계; 광경화된 수지로부터 중간체 주형을 제거하는 제3단계;를 포함할 수 있다.
상기 중간체 주형은 액체인 원료에 열 또는 빛 등의 자극을 가하여 고형화할 수 있으며, 생성된 주형은 실온에서 고체로 존재하는 물질로 제조할 수 있다. 액체인 원료를 사용하면 마스트 몰드의 형태를 간직하여 고형화할 수 있다. 또한 상기 주형은 탄성고분자를 포함하는 소재로 제조하여 고형화된 구조물이 탄성을 가져 제3단계인 최종 기둥형태의 구조물로부터 중간체 주형을 제거하는 단계를 용이하게 할 수 있을 뿐만 아니라, 이들 소재로 제조된 중간체 주형은 탈착 후 주형의 잔여물이 거의 남지 않으며, 분리된 중간체 주형도 원형을 유지하므로 계속 반복하여 사용할 수 있다. 상기 탄성고분자의 예는 PDMS(polydimethylsiloxane), 폴리스티렌계 고분자, 폴리올레핀계 고분자, 폴리염화비닐계 고분자, 폴리우레탄계 고분자, 폴리에스테르계 고분자, 폴리아미드계 고분자, 콜라겐, 하이드로겔, 고형화 가능한 탄소 및 실리콘러버 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 제1단계는 그 이전에 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는 기둥 형태의 구조물을 실리콘웨이퍼 상에 형성하여 실리콘 마스터 주형을 준비하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 실리콘 마스터 주형의 형성은 당업계에 공지된 미세 패턴기술을 제한없이 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대, 포토리소그래피 및 심도반응성 이온식각(deep reactive ion etching; deep RIE) 또는 용액 에칭 공정(wet etching)에 의해 형성할 수 있다. 또한, 상기 실리콘 마스터 주형의 표면에 소수성을 부여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 소수성의 부여는 표면을 소수성화할 수 있는 옥타데실실란(octadecylsilane; OTS) 또는 트리클로로퍼플루 오로옥틸실란(trichloro(1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane) 등으로 처리하여 이에 의해 형성되는 자기조립단층(self-assembled monolayer; SAM)으로 기능화(functionalize)함으로써 달성될 수 있다. 상기 소수성 처리를 함으로써, 추후 제1단계를 통해 마스터 주형으로부터 형성되는 PDMS 중간체 주형의 분리를 용이하게 할 수 있다.
바람직하게, 제1단계로부터 준비한 중간체 주형을 반복하여 사용할 수 있는 것이 특징이다. 본 발명의 PDMS 중간체 주형은 최종 고분자 구조물의 분리가 용이할 뿐만 아니라, 10회 이상 반복하여 사용하여도 물리적 및/또는 화학적 성질의 변화를 나타내지 않으므로, 본 발명에 따른 세포 배양 기재의 대량생산의 유용하게 사용할 수 있다. 특히, 고가의 실리콘 마스터 주형으로부터 1회 제조하여 여러 번 반복하여 사용할 수 있으므로, 경제적인 이점도 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1
규칙적으로 배열된 기둥을 포함하는 세포배양 시스템에서 기둥의 크기 및 간격이 상기 시스템 상에서 배양되는 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 기둥의 규모(dimension)를 계획적으로 변화시켜 제작하였다.
먼저, 8인치 실리콘웨이퍼 상에 포토리소그래피 및 용액 식각 공정으로 패턴화(patterning)하여 마스터 주형(master mold)을 제조하였다. 상기 마스터 기둥 구조물의 제조는 한국의 National Nanofab Center에서 실시하였다. 표면 소수성을 부여하기 위하여 상기 제조된 실리콘 기둥 어레이를 트리클로로퍼플루오로옥틸실란 (trichloro(1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)의 기조립단층(self-assembled monolayers; SAM)으로 기능화(functionalize)하였다. 폴리디메틸실록산 중간체 주형(polydimethylsiloxane(PDMS) intermediate mold)의 용이한 분리를 위하여 소수성 SAM 처리가 요구된다. 이후, 10:1 경화제(curing agent)와 혼합한 PDMS를 SAM-기능화된 Si 마스터 주형 상에 붓고, 80℃에서 4시간 동안 경화시켜, 중간체 PDMS 주형을 제조하였다. 최종 고분자 구조물의 편리한 분리(convenient release)를 위해 중간체 PDMS 마스터 주형을 도입하였으며, PDMS 중간체 주형은 여러 번 반복하여 사용할 수 있으므로(심한 성능 저하 없이(without too much of degrading) 10회 이상 사용할 수 있다), Si 마스터를 직접 사용하는 것보다 경제적으로 이점이 있다.
마지막으로, 표적 기재(targetsubstrates; PET) 상에 UV-경화성 수지(NOA 63 from Norland Products)를 도포하여 수지층을 형성하였다. 형성된 수지층을 상기 제조된 PDMS 중간체 주형으로 가압하여 주형에 형성된 기둥 구조물 형태를 수지층으로 전사하였다. 다음으로 UV 램프를 1분 동안 조사하여 상기 UV-경화성 수지를 경화시켰다. 이후, PDMS 중간체 주형을 시료로부터 떼내어 PET 상에 UV-경화성 수지로 형성된 최종 기둥 구조물을 포함하는 구조체를 얻었다. 얻어진 기둥 형태 구조물의 수평 단면의 직경은 2 μm, 기둥 형태 구조물간의 간격은 16 μm, 높이는 13 μm이었다.
PET 기재(substrate) 상에 형성한 기둥 구조물을 포함하는 구조체는 상용화된 6-웰 플레이트(Falcon)의 각 웰에 삽입할 수 있는 크기로 절단하여 6-웰 플레이트에 삽입하였다.
비교예 1
UV-경화성 수지층에 기둥 형태의 구조물(200)을 형성하지 않고 그대로 경화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 구조체를 제작하였다.
비교예 2
기둥 형태의 구조물의 높이가 2 μm 인 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 구조체를 제작하였다.
비교예 3
기둥 형태의 구조물의 간격이 5 μm 인 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 구조체를 제작하였다.
실험예
1. 세포의 이온채널 활성화용 구조체에서 성장된 A549 세포의 기둥의 높이에 따른 세포의 이동성 평가
(1) 실험 방법
A549 세포(초기 상태)를 실시예 1 및 비교예들의 구조체에 시딩하고 배양하였다. 실시예 1의 경우 A549 세포가 2 내지 3개의 기둥 형태의 구조물에 의해 지지되는 것을 확인하였다(도 5). 이후 배양시간에 따른 세포의 이동성, 세포가 자란 표면에 상처를 내어 세포를 제거한 후, 세포가 움직여서 그 빈 자리를 채우는데 걸리는 시간을 측정하는 방법으로서, 세포의 이동속도를 측정하는 표준 방법인 wound healing 법에 따라 상처 넓이 및 상처 치유율을 평가하였다.
(2) 실험 결과
A549 세포가 시딩된 후 10시간 이내(초기 상태)에 세포가 2 내지 3개의 기둥 형태의 구조물과만 접촉하는 이온채널 활성화용 구조체에서 이동성이 최대로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
또한, 배양 시간에 따른 세포의 이동성을 비교예 1, 2 및 실시예 1의 구조체를 비교하였을 때, 배양시간 30시간까지는 실시예 1의 구조체에서 배양된 세포가 가장 높은 이동성을 보임을 확인할 수 있었다(도 6a).
상처 넓이의 경우 실시예1, 비교예 1, 비교예 2의 순서로 가장 빠르게 작아짐을 알 수 있었고(도 6b), 상처 치유율의 경우 실시예 1, 비교예 2, 비교예 1 순으로 높아지는 것을 확인할 수 있었다(도 6c).
이를 종합하여 볼 때, 실시예 1에서 시딩된 A549 세포는 이온채널이 활성화됨을 알 수 있었다.
2. 세포의 이온채널 활성화용 구조체에서 성장된 cardiomyocyte 세포의 심박수 증가 평가
(1) 실험 방법
심근세포를 실시예 1 및 비교예들의 구조체에 시딩하였다. 실시예 1의 경우 심근 세포가 2 내지 3개의 기둥형태의 구조물에 의해 지지되는 것을 확인하였으며, 비교예 1과 비교하기 위해 현미경 사진을 촬영했다(도 7).
실시예 1 및 비교예 1에의 시딩 후 심근 세포의 분당 심박수를 측정하여, 그 결과를 도 8에 그래프로 나타내었다.
또한, 비교예 1 및 실시예 1에 시딩 후 이온채널이 활성화되었음을 알 수 있는 marker들의 유전자 발현 정도를 측정하여, 도 9, 도 10에 그래프로 나타내었다.
상기 마커들은 cardiac marker인 cTnT(cardiac Troponin T), 는 이온채널과 관련된 Automated beating의 marker인 HCN4(Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated channel 4), NCX1(Na+/Ca2 + Exchange 1), 심장의 이온채널에서의 탈분극과 관련된 marker들인 Nav1.5(Sodium channel, voltage-dependent) 및 Cav1.2(Calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1C subunit), 재분극과 관련된 marker들인 hERG(human　Ether-
Figure pat00002
-go-go-Related　Gene), Kv4.3(Potassium voltage-gated channel subfamily D member 3), Kv7.1(Potassium voltage-gated channel), Kir2.1(inward-rectifier potassium ion channel) 및 Kir2.2(inward-rectifier potassium ion channel)이다.
(2) 실험결과
도 8을 참고하면, 비교예 1에 시딩된 심근 세포의 분당 심박수보다 실시예 1에 시딩된 심근 세포의 분당 심박수가 높음을 알 수 있었다.
도 9를 참고하면, cTnT, HCN4는 비교예 1에서보다 실시예 1에서 시딩된 세포가 더 적게 발현됨을 알 수 있었고, NCX1은 비교예 1에서보다 실시예 1에서 시딩된 세포가 더 많이 발현됨을 알 수 있었다.
도 10을 참고하면, Nav1.5는 1w에서는 실시예 1에서 시딩된 세포에서 발현량이 더 많았으나, 2w에서는 비교예 1에서 시딩된 세포에서 발현량이 더 많았다.
또, Cav1.2, Kir2.2는 실시예 1에서보다 비교예 1에서 시딩된 세포에서 발현량이 더 많았다.
hERG의 경우, 1w에서는 비교예 1에서 시딩된 세포에서 발현량이 더 많았으나, 2w에서는 실시예 1에서 시딩된 세포에서 발현량이 더 많았다.
또한, Kv4.3, Kv7.1, Kir2.1의 경우 실시예 1의 경우가 발현량이 더 많았다.
이를 종합하여 볼 때, 실시예 1에서 시딩된 심근 세포의 경우 NCX, hERG, Kir2.1와 같이 심근세포의 성숙화와 관련된 이온채널이 보다 더 활성화된다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 상기 기둥 형태의 구조물은 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥 형태의 구조물은 세포가 시딩 직후 10시간 이하까지 2 내지 3개의 기둥 형태의 구조물과 접촉되는 간격을 갖는, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥 형태의 구조물의 높이는 시딩되는 세포의 수직 단면의 최장 높이보다 큰, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥 형태의 구조물은 종횡비(aspect ratio)가 5 이상인, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나인, 세포의 이온채널 활성화용 구조체.
  6. 세포를 준비하는 단계;
    바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 상기 기둥 형태의 구조물은, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태 구조물에 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는, 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 상기 세포를 시딩하는 단계;
    를 포함하는 세포의 이온채널 활성화 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 세포는 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나인, 세포의 이온채널 활성화 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, A549 세포는 상기 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 시딩된 후 이동성이 증가하는 기간을 갖는, 세포의 이온채널 활성화 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 심근 세포는 상기 세포의 이온채널 활성화용 구조체에 시딩된 후 박동수가 증가되는, 세포의 이온채널 활성화 방법.
  10. 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며, 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는 기둥 형태의 구조물이 음각으로 패턴화된 탄성고분자를 포함하는 중간체 주형을 준비하는 제1단계;
    상기 중간체 주형을 광경화성 수지 상에 각인시키고 30초 내지 5분 동안 빛을 조사하는 제2단계; 및
    상기 광경화된 수지로부터 중간체 주형을 제거하는 제3단계;를 포함하는 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 제1단계는 그 이전에 바닥면 및 상기 바닥면 상에 배치된 기둥 형태의 구조물을 포함하고, 세포의 시딩(seeding) 직후에 세포가 2 내지 3개의 상기 기둥 형태의 구조물의 접촉하는 간격으로 배열되며 상기 바닥면에 세포가 닿지 않는 높이를 갖는 기둥 형태의 구조물을 실리콘웨이퍼 상에 형성하여 실리콘 마스터 주형을 준비하는 단계;를 더 포함하는 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 세포는 심근 세포 또는 A549 세포 중에서 선택되는 적어도 하나인, 세포의 이온채널 활성화용 구조체의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20140050514A (ko) 2012-10-19 2014-04-29 소마아루 가부시끼가이샤 세포 배양 기재, 및 그것을 사용한 세포 배양 방법 및 만능 줄기 세포의 분화 유도 방법

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