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KR20200016873A - 세포 면역 요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

세포 면역 요법을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20200016873A
KR20200016873A KR1020197037744A KR20197037744A KR20200016873A KR 20200016873 A KR20200016873 A KR 20200016873A KR 1020197037744 A KR1020197037744 A KR 1020197037744A KR 20197037744 A KR20197037744 A KR 20197037744A KR 20200016873 A KR20200016873 A KR 20200016873A
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cell
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binding unit
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종하이 리
펭 왕
후아 지앙
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칼스젠 테라퓨틱스 씨오., 엘티디.
상하이 캔서 인스티튜트
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Abstract

윌름스 종양 단백질 1(WT1)을 발현하는 세포가 나타나는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법은 전형적으로 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체 면역 반응성 세포를, 필요로 하는 대상체에게 사용하여 종양 세포의 사멸을 초래한다.

Description

세포 면역 요법을 위한 조성물 및 방법
(상호 참조)
본 출원은 2017년 5월 31일자로 출원된 PCT 국제출원번호 PCT/CN2017/086606의 이익을 주장하며, 이 출원은 본원에 참조로 포함된다.
암은 전세계 사회에 큰 영향을 미친다. 2016년에 미국에서만 1,685,210건의 새로운 케이스의 암이 진단될 것이며, 595,690명이 질병으로 사망할 것으로 추정된다. Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)에 따르면, 2020년까지 약 19명 중 1명인 1,820만명의 미국인이 암 환자 또는 암 생존자가 될 것이며, 2005년의 1,170만명(26명 중 1명)보다 늘어난 것이다. 암은 전세계 사회에 큰 영향을 미친다. 2016년에 미국에서만 1,685,210건의 새로운 케이스의 암이 진단될 것이며 595,690명이 질병으로 사망할 것으로 추정된다. Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)에 따르면, 2020년까지 약 19명 중 1명인 1,820만명의 미국인이 암 환자 또는 암 생존자가 될 것이며, 2005년의 1,170만명(26명 중 1명)보다 늘어난 것이다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 단일 분자 내에서 T 세포 및 그 밖의 면역 세포의 특이성과 기능을 재설정하는, 항원에 대한 재조합 수용체이다. 암 면역 요법에 이들을 사용함으로써 종양-표적화된 T 세포가 신속하게 생성되어 능동 면역화의 장애를 회피할 수 있다. 일단 세포에서 발현되면, CAR-변형 세포는 대상체에서 즉각적이고 장기간적인 효과를 발휘할 수 있다.
종양을 인식하도록 암 환자의 T 세포를 편집하는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 혈액암을 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 최근 임상 시험에서, CAR T 세포 치료제는 달리 치료할 수 없는 형태의 백혈병 및 림프종에 걸린 혈액암 환자들의 치료 효과를 극적으로 개선시켰다. 대조적으로, CAR T 세포들은 고형 종양과 관련해서는 일련의 고유한 과제에 직면해 있다. 이러한 과제들 중에는 발현이 정상 조직으로부터 종양을 명확히 구분하는 항원의 식별 및 종양 내 종양 세포의 효과적인 사멸에 의한 종양 크기의 감소를 포함한다.
광범위한 고형 종양에 대한 대안적이고 효과적인 치료법이 시급히 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하고 관련 이점도 제공한다.
따라서, 본 발명은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛을 개시하고, 여기서 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 유의한 결합을 나타내지 않고, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 덜 나타내며, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 경우에 있어서, HLA는 HLA-A2를 포함한다. 일부 경우에 있어서, HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대한 결합 수준은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 대한 결합 수준의 10% 이하일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 결합 특이성은 FACS에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 결합 특이성은 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛은 1.5nM 미만의 KD를 나타낼 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛은 50pM 미만의 KD를 나타낼 수 있다. 일부 경우에 있어서, 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있고; 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함할 수 있고; 여기서 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 가지며; 여기서 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 경우에 있어서, 경쇄 CDR은 하기 LCDR 서열의 조합: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13; 및 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 13 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 중쇄 CDR은 하기 HCDR 서열의 조합: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 10; 및 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, 및 SEQ ID NO: 10 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛은 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 키메라 항원 수용체일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛은 sFc, Fv, Fab, 또는 (Fab)2일 수 있다.
경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하며, 여기서 상기 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에 있어서, 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있고; 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 가지며; 여기서 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 경우에 있어서, 상기 경쇄 CDR은 LCDR 서열의 하기 조합: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13; 및 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 13 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 중쇄 CDR은 HCDR 서열의 하기 조합: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 10; 및 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, 및 SEQ ID NO: 10 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛은 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 키메라 항원 수용체일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛은 scFv, Fv, Fab, 또는 (Fab)2일 수 있다.
세포외 항원 결합 유닛, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 본원에 개시되어 있으며, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 유의한 결합을 나타내지 않고, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 세포외 항원 결합 유닛, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 본원에 개시되어 있으며, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 덜 나타내고, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함할 수 있고, 여기서 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고; 여기서 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖고; 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10, 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 경우에 있어서, 상기 경쇄 CDR은 LCDR 서열의 하기 조합: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13; 및 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 13 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 중쇄 CDR은 HCDR 서열의 하기 조합: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 10; 및 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, 및 SEQ ID NO: 10 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, 또는 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키메라 항원 수용체는 WT1 또는 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는 세포의 세포 독성을 유도할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 표적 세포에 대한 키메라 항원 수용체의 비가 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2.5:1, 1:1, 또는 1:3일 때, 세포 독성의 수준은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%일 수 있다.
본원에 개시된 항원 결합 유닛 또는 본원에 개시된 키메라 항원 수용체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 항원 결합 유닛 또는 본원에 개시된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 항원 결합 유닛 또는 본원에 개시된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 본원에 개시된 항원 결합 유닛 또는 본원에 개시된 키메라 항원 수용체를 발현하는 숙주 세포가 본원에 개시된다. 본원에 개시된 항원 결합 유닛 또는 본원에 개시된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 개시된다. 항원 결합 유닛을 발현하기에 적합한 조건 하에서 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의해 발현된 상기 항원 결합 유닛을 단리하는 단계를 포함하는 항원 결합 유닛의 생성 방법이 본원에 개시된다. 키메라 항원 수용체를 발현하기에 적합한 조건 하에서 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의해 발현된 상기 키메라 항원 수용체를 단리하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체의 제조 방법이 본원에 개시된다.
HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 방법이 본원에 개시되고, 상기 방법은 상기 세포를 본원에 개시된 키메라 항원 수용체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 세포는 생체내(in vivo)에서 키메라 항원 수용체와 접촉될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 시험관내(in vitro)에서 키메라 항원 수용체와 접촉될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 암 세포일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 혈액암 세포 또는 고형 종양 세포일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 신아세포종 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 난소암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포, 또는 장암 세포일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 중피종암 세포일 수 있다.
표적 세포의 사멸을 유도하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 복수의 숙주 세포를 표적 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 표적 세포에 복수의 숙주 세포를 투여하는 단계는 상기 항원 결합 유닛, 키메라 항원 수용체, 또는 이를 인코딩하는 핵산이 결핍되어 있는 숙주 세포의 유사량을 투여하는 것에 비해 더 많은 표적 세포 사멸을 유도한다. 일부 경우에 있어서, 복수의 숙주 세포는 생체내에서 표적 세포에 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 복수의 숙주 세포는 시험관내에서 표적 세포에 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 표적 세포는 암 세포일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 암 세포는 혈액암 세포 또는 고형 종양 세포일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 신아세포종 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 난소암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포 또는 장암 세포일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 중피종암 세포일 수 있다.
필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되고, 상기 방법은 본원에 개시된 키메라 항원 수용체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 키메라 항원 수용체는 암 세포의 사멸을 유도한다. 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되고, 상기 방법은 본원에 개시된 항원 결합 유닛 또는 본원에 기재된 키메라 항원 수용체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되고, 상기 방법은 본원에 개시된 유효량의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 암은 혈액암 또는 고형 종양일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 암은 중피종일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 암은 신아세포종, 결장암, 직장암, 난소암, 만성 골수성 백혈병, 또는 장암일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체 및 IL-12를 포함하는 면역 반응성 세포가 본원에 개시된다. 일부 경우에 있어서, IL-12는 면역 반응성 세포의 표면 상에서 발현된다. 다른 경우에 있어서, IL-12는 면역 반응성 세포내에서 발현된다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체, 및 IL-12를 포함하는 면역 반응성 세포는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%의 세포 독성을 갖는다. 일부 경우에 있어서, 면역 반응성 세포는 효과기:표적(E:T)비가 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 또는 그것의 조합일 때, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60%의 세포 독성을 갖는다. 본원에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체 및 IL-12를 포함하는 면역 반응성 세포는 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 표적 세포는 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함한다. 또한, 필요로 하는 대상체에서 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 방법이 본원에 개시되고, 상기 방법은 본원에 기재된 키메라 항원 수용체 및 IL-12를 포함하는 면역 반응성 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
(참조에 의한 포함)
본원의 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허출원이 참조에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 기재된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 포함된다. 본원의 용어와, 참조에 의해 포함된 용어가 상충하는 경우는 본원의 용어로 제한한다.
본 개시의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 개시의 원리가 활용될 수 있는 예시적인 실시형태, 및 그것의 첨부 도면을 설명하는 하기의 상세한 설명을 참조하여 본 개시의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해가 얻어질 것이다.
도 1은 융합 HLA.A0201-BSP 유전자의 그림 이미지를 도시한다.
도 2a 및 도 2B는 단리된 폴리펩티드의 크로마토그램 및 아가로오스겔 정제의 일례를 각각 도시한다.
도 3은 예시적인 ELISA 분석법으로부터의 데이터를 도시한다.
도 4는 예시적인 결합 분석법으로부터의 데이터를 도시한다.
도 5는 예시적인 ELISA 분석법으로부터의 데이터를 도시한다.
도 6은 선택된 항원 결합 유닛으로부터의 서열 정렬을 도시한다.
도 7은 예시적인 KD 실험으로부터의 데이터를 도시한다.
도 8은 예시적인 결합 분석법으로부터의 데이터를 도시한다.
도 9는 예시적인 폴리펩티드 정제 결과를 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 예시적인 세포 독성 실험으로부터의 데이터를 도시한다.
도 11은 IL-12를 발현하는 CAR-T 세포에 대한 예시적인 유전자 구성을 도시한다.
도 12a, 도 12b. 도 12c는 IL-12를 발현하는 CAR T 세포를 사용한 예시적인 세포 독성 실험으로부터의 데이터를 도시한다.
다음의 설명 및 실시예들은 본 개시의 실시형태를 상세히 설명한다. 본 개시는 본원에 설명된 특정 실시형태들에 한정되지 않으며 변형될 수 있음이 이해되어야 한다. 당업자는 본 개시 내용이 다양하게 변형 및 수정될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것이 인식될 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 임의의 실시형태는 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 일부 실시형태에 있어서 수치 범위가 고려된다. 본 발명의 다양한 양태는 범위 형식으로 제공될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의성 및 간편성을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 변경할 수 없게 한정하여 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 명시적으로 기재된 것처럼 그 범위 내의 개별 수치뿐만 아니라, 가능한 모든 하위 범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1~6과 같은 범위에 대한 설명은 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5 및 6과 같은 그 범위 내의 개별 수치뿐만 아니라 1~3, 1~4, 1~5, 2~4, 2~6, 3~6과 같은 하위 범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계 없이 적용한다. 범위가 존재할 경우, 그 범위에는 범위의 종점이 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 관사 "a"는 달리 명시적으로 제공되지 않으면 하나 이상을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "함유하다", "함유하는", "포함하다", "포함하는" 등과 같은 용어는 "포함하는"을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "활성화" 및 그것의 문법적 동의어는 세포가 휴지 상태로부터 활성 상태로 변화되는 과정을 지칭할 수 있다. 이 과정은 항원에 대한 반응, 이동, 및/또는 기능적 활성 상태로의 표현형 또는 유전적 변화를 포함할 수 있다. 예를 들면, 용어 "활성화"는 T 세포 활성화의 단계적 과정을 지칭할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 완전히 활성화되기 위해 적어도 2가지 시그널을 필요로 할 수 있다. 제 1 시그널은 항원-MHC 복합체에 의한 TCR의 결합 후에 일어날 수 있고, 제 2 시그널은 공동 자극 분자의 결합에 의해 일어날 수 있다(표 4). 항-CD3은 제 1 시그널을 모방할 수 있고, 항-CD28은 시험관내에서 제 2 시그널을 모방할 수 있다. 예를 들면, 조작된 T 세포는 발현된 CAR에 의해 활성화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "T 세포 활성화" 또는 T 세포 촉발화(T cell triggering)는 검출가능한 세포 증식, 사이토카인 생성 및/또는 검출가능한 효과기 기능을 유도하기 위해 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 유닛"은 면역 글로불린 분자 및 면역 글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는("항원과 면역 반응하는") 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 또한, 용어 "항원 결합 유닛" 내에는 무척추 동물 및 척추 동물을 포함하는 다양한 기원의 면역 글로불린 분자가 포함된다.구조적으로, 가장 간단한 자연 발생 항체(예를 들면, IgG)는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩티드쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 면역 글로불린은 IgD, IgG, IgA, IgM 및 IgE와 같은 몇 가지 유형의 분자를 포함하는 분자들의 대규모 패밀리를 나타낸다. 용어 "면역 글로불린 분자"는 예를 들면, 하이브리드 항체 또는 변형된 항체, 및 그것의 단편을 포함한다. 항체의 항원 결합 기능은 자연 발생 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 이들 단편을 통칭하여 "항원 결합 유닛"이라고 한다. 용어 "항원 결합 유닛" 내에는 에피토프에 들어맞아 에피토프를 인식하는 특정 형태를 갖는 임의의 폴리펩티드쇄-함유 분자 구조이고, 여기서 하나 이상의 비공유 결합 상호작용은 분자 구조와 에피토프 사이에서 복합체를 안정화시킨다.
항원 결합 유닛은 그것이 폴리펩티드 또는 그 밖의 물질을 포함하는 다른 참조 항원에 결합하는 것보다 더 큰 친화도 또는 친밀도로 결합하는 경우, 항원에 "특이적으로 결합"하거나 항원과 "면역 반응성"인 것이다.
본원에 사용된 "항원"은 항원 결합 유닛에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 물질을 의미한다. 항원은 펩티드, 단백질, 당단백질, 다당류, 및 리피드; 그것의 부분 및 그것의 조합을 포함한다. 항원의 비제한적인 예시에는 인간, 뮤린, 및 그것의 다른 상동체로부터의 윌름스 종양 단백질 1(WT1)이 포함되었다. 또한, "항원"은 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭할 수 있다. 이 면역 반응은 항체 생성, 또는 특이적으로 면역학적-항체 반응을 일으키는 세포(immunologically-competent cell)의 활성화, 또는 둘 모두와 관련될 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 매크로 분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "면역 글로불린" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질의 클래스를 지칭할 수 있다. B 세포에 의해 발현된 항체는 키메라 항원 수용체 또는 항원 수용체라고 지칭되는 경우가 있다. 이들 클래스의 단백질에 포함된 5개의 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD, 및 IgE이며, 그 중 IgG가 가장 흔한 순환 항체이다. 그것은 응집, 보체 결합, 및 그 밖의 항체 반응에서 가장 효율적인 면역 글로불린이며, 박테리아와 바이러스에 대한 방어에 있어서 중요하다. 예를 들면, 종양 세포 항원은 CAR에 의해 인식될 수 있다.
용어 "항-WT1 항체"는 항체가 세포에 의해 발현된 다른 항원으로부터 WT1 또는 WT1 펩티드를 구별하는 데 유용하도록, 충분한 친화도로 WT1 또는 WT1 펩티드와 결합할 수 있는 항체 또는 항체 결합 부위를 지칭할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 무관한 비-WT1 단백질에 대한 항-WT1 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사 면역 분석법(RIA)에 의해 측정될 때, WT1 또는 WT1 펩티드에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에 있어서, WT1에 결합하는 항체는 <1μM, <100nM, <10nM, <5nM , <4nM, <3nM, <2nM, <1nM, <0.1nM, <0.01nM, 또는 <0.001nM(예를 들면, 10-8M 이하, 예를 들면, 10-8M~10-13M, 예를 들면, 10-9M~10-13M)의 해리상수(Kd)를 가질 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 항-WT1 항체는 상이한 종으로부터의 WT1 중에 보존되는 WT1의 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "자가" 및 그것의 문법적 동의어는 동일한 것으로부터 유래한다는 것으로 지칭될 수 있다. 예를 들면, 샘플(예를 들면, 세포)은 제거되고, 처리되고, 나중에 동일한 대상체(예를 들면, 환자)에게 되돌려질 수 있다. 자가 과정은 공여자와 수용자가 상이한 대상체인 동종(allogenic) 과정과는 구별된다.
본원에 사용된 "이종 이식" 및 그것의 문법적 동의어는 세포, 조직 또는 장기를 수용자에게 이식, 삽입 또는 주입하는 것을 포함하는 임의의 절차를 포함할 수 있으며, 수용자와 공여자는 상이한 종이다. 본원에 기재된 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식은 인간에게의 이종 이식에 사용될 수 있다. 이종 이식은 혈관화 이종 이식, 부분 혈관화 이종 이식, 비혈관화 이종 이식, 이종 이식, 이종 드레싱, 이종 밴디지 및 이종 구조를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 "동종 이식" 및 그것의 문법적 동의어(예를 들면, 동종 이식)은 세포, 조직, 또는 장기를 수용자에게 이식, 삽입, 또는 주입하는 것을 포함하는 임의의 절차를 포함할 수 있으며, 여기서 수용자와 공여자는 동일한 종이지만 상이한 개체이다. 본원에 기재된 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식은 인간에게의 동종 이식에 사용될 수 있다. 동종 이식에는 혈관화 동종 이식, 부분 혈관화 동종 이식, 비혈관화 동종 이식, 동종 드레싱, 동종 밴디지 및 동종 구조물이 포함될 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 "자가 이식" 및 그것의 문법적 동의어(예를 들면, 자가 이식)은 세포, 조직, 또는 장기를 수용자에게 이식, 삽입 또는 주입하는 것을 포함하는 임의의 절차를 포함할 수 있으며, 여기서 수용자와 공여자는 동일한 개체이다. 본원에 기재된 세포, 장기, 및/또는 조직의 이식은 인간에게의 자가 이식에 사용될 수 있다. 자가 이식에는 혈관화 자가 이식, 부분 혈관화 자가 이식, 비혈관 자가 이식, 자가 드레싱, 자가 밴디지, 및 자가 구조물이 포함지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 비제한적인 예로서 T 세포를 포함하는 면역 세포에 의해 발현될 수 있는 조작된 분자를 지칭한다. T 세포에서 발현된 경우의 CAR은 인공 수용자에 의해 지시되는 특이성을 가지고 표적 세포의 사멸을 유도하도록 T 세포를 재설정할 수 있다. CAR의 세포외 결합 도메인은 뮤린, 인간화, 또는 완전 인간 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. "항-WT1-CAR"은 WT1 또는 WT1 펩티드에 결합할 수 있는 CAR이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프" 및 그것의 문법적 동의어는 항체, B 세포, T 세포 또는 조작된 세포에 의해 인식될 수 있는 항원의 일부분을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 에피토프는 TCR에 의해 인식되는 암 에피토프일 수 있다. 또한, 항원 내의 다수의 에피토프가 인식될 수 있다. 또한, 에피토프는 돌연변이될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조작된" 및 그것의 문법적 동의어는 핵산, 예를 들면 유기체의 게놈 내의 핵산 중 하나 이상의 변경을 지칭할 수 있다. 용어 "조작된"은 유전자의 변경, 부가 및/또는 결실을 지칭할 수 있다. 조작된 세포는 부가, 결실 및/또는 변경된 유전자를 갖는 세포를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포" 또는 "조작된 세포" 및 그것의 문법적 동의어는 인간 또는 비인간 동물 기원의 세포를 지칭할 수 있다. 또한, 조작된 세포는 CAR-발현 세포를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "우수 제조 관리 기준"(GMP) 및 그것의 문법적 동의어는 FDA에 따라 안전하고, 유효하고, 또는 순수한 제품을 지칭할 수 있다. 또한, GMP는 "cGMP"라고 하는 경우가 한다. "c"는 "현재"를 나타낸다. 제품의 제조자는 GMP 제품의 규정을 준수하기 위해 최신 기술과 시스템을 채용할 수 있다. GMP를 만족하는 제품은 연구 환경이 아니라 임상 환경에서 일반적으로 활용된다.
"숙주 세포"는 대상 벡터의 수용자일 수 있거나 수용자인 개별 세포 또는 세포 배양을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함한다. 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래의 모세포와 (전체 DNA 보체의 형태 또는 게놈에 있어서) 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 벡터를 이용하여 생체내에서 형질 감염된 세포를 포함한다. "숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 폴리뉴클레오티드의 수용자로서 사용될 수 있거나 사용된 단세포 개체로서 배양된 원핵 세포, 진핵 세포, 또는 세포주를 지칭할 수 있고, 형질 감염된 원세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 전체 DNA 보체의 형태 또는 게놈이 원래의 모체와 반드시 완전히 동일하지 않을 것임을 이해한다.
"세포주" 또는 "세포 배양"은 시험관내에서 성장되고 유지되는 박테리아, 식물, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 의미한다. 세포의 자손은 모세포와 (형태 학적으로, 유전자형으로 또는 표현형으로) 완전히 동일하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질 감염"은 외래 핵산을 진핵 세포내로 도입하는 것을 지칭한다. 형질 감염은 인산칼슘-DNA 공동 침전, DEAE 덱스트란-매개 형질 감염, 폴리브렌-매개 형질 감염, 전기 천공, 미세 주입, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 유전자총법을 포함하는 공지된 다양한 기술 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "안정한 형질 감염" 또는 "안정적으로 형질 감염된"은 외래 핵산, DNA 또는 RNA를 형질 감염된 세포의 게놈 내로 도입하고 통합하는 것을 지칭한다. 용어 "안정한 형질 감염제"는 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합된 외래 DNA를 갖는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자 인코딩", "DNA 서열 인코딩" 및 "DNA 인코딩"은 데옥시리보핵산의 가닥을 따르는 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드(단백질)쇄를 따르는 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리머는 선형, 환상, 또는 분기상일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 또한, 상기 용어는 예를 들면, 황산화, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 요오드화, 메틸화, 산화, 단백 분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노실화, 단백질에의 아미노산의 전사-RNA 매개된 아미노산의 추가, 예를 들면 아르기닐화, 유비퀴틴화 또는 라벨링 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작을 통해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체(peptidomimetics)를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다. 지정된 단백질로부터 "유래된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 기원을 지칭한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 서열, 또는 그것의 부분에서 인코딩된 폴리펩티드의 서열과 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 여기서 상기 부분은 적어도 10~20개의 아미노산, 또는 적어도 20~30개의 아미노산, 또는 적어도 30~50개의 아미노산으로 이루어지거나, 또는 서열에서 인코딩된 폴리펩티드와 면역학적으로 식별가능하다. 또한, 이 용어들은 지정된 핵산 서열로부터 발현된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 동물, 예를 들면 포유동물 또는 유대류를 지칭한다. 본 발명의 대상체는 인간, 비인간 영장류(예를 들면, 붉은터원숭이 또는 다른 유형의 마카크), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트 및 임의의 가금류를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "수용자" 및 그것의 문법적 동의어는 요법 또는 치료를받는 인간 또는 비인간 동물을 지칭할 수 있다.
"치료", "치료하는", "치료하다" 등의 용어는 일반적으로 소망의 약리학적 및/또는 생리 학적 효과를 얻는 것을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 그 효과는 질병 또는 그것의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고 및/또는 질병에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 질병의 치유 및/또는 질병으로 인한 부작용의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 인간 및 다른 유인원, 특히 인간을 포함하는 포유동물, 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 영장류에서의 질병의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질병이나 증상에 취약할 수 있지만 아직 질병이나 증상을 가지고 있다고 진단되지 않은 대상체에서 질병이나 증상이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 병증을 억제하는 것; (c) 질병의 진전을 억제하는 것; (d) 병증을 완화하는 것; (e) 질병이나 증상의 퇴행을 유발하는 것; 또는 그것의 조합을 포함한다. .
용어 "암", "신생물", "종양" 및 "암종"은 비교적 자율적인 증식을 보이는 세포를 지칭하기 위해 본원에 상호교환적으로 사용되고, 세포 증식의 상당한 제어 손실로 특징지어지는 비정상적 성장 표현형을 나타낸다. 일반적으로, 본 출원에 있어서 검출 또는 치료를 목적으로 하는 세포는 전암성(예를 들면, 양성), 악성, 전이 전, 전이성 및 비전이성 세포를 포함한다. "정상 세포"와 관련하여 사용된 용어 "정상"은 형질 전환되지 않은 표현형 세포를 지칭하거나 또는 검사 중인 조직 유형의 형질 전환되지 않은 세포의 형태를 나타내는 것을 의미한다. "암성 표현형(cancerous phenotype)"은 일반적으로 암성 세포의 특징인 임의의 다양한 생물학적 현상을 지칭하고, 이러한 현상은 암의 유형에 따라 달라질 수 있다. 암성 표현형은 일반적으로, 예를 들면 세포 성장 또는 증식(예를 들면, 제어되지 않은 성장 또는 증식), 세포 주기의 조절, 세포 이동성, 세포-세포 상호작용 또는 전이 등)의 이상에 의해 식별된다.
본원에서 사용되는 용어 "말초 혈액 림프구"(PBL) 및 그것의 문법적 동의어는 혈액 내에서 순환하는 림프구(예를 들면, 말초 혈액)를 지칭할 수 있다. 말초 혈액 림프구는 장기로 국소화되지 않은 림프구를 지칭할 수 있다. 말초 혈액 림프구는 T 세포, NK 세포, B 세포, 또는 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "면역 반응성 세포"는 T 세포, B 세포, 및 NKT 세포, 이들 각각의 전구체 세포 및 그것의 자손을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 세포를 지칭할 수 있다. 또한, 면역 반응성 세포는 림프구 또는 골수구 계통의 세포를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "T 세포" 및 그것의 문법적 동의어는 임의의 기원의 T 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 1차 T 세포, 예를 들면 자가 T 세포, 세포주 등일 수 있다. 또한, T 세포는 인간 또는 비인간일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "T 세포 활성화" 또는 "T 세포 촉발화" 및 그의 문법적 동의어는 검출가능한 세포 증식, 사이토카인 생성 및/또는 검출가능한 효과기 기능을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭할 수 있다. 일부 경우에 있어서, "완전한 T 세포 활성화"는 T 세포의 세포 독성을 촉발하는 것과 유사할 수 있다. T 세포 활성화는 당업계에 공지된 다양한 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 분석법은 사이토카인 분비를 측정하기 위한 ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 발현을 측정하기 위한 유동 세포 분석법(CD107), 증식을 측정하기 위한 유동 세포 분석법, 및 표적 세포 제거를 결정하기 위한 세포 독성 분석법(51Cr 방출 분석)일 수 있다. 상기 분석법은 전형적으로 조작된 세포(CAR T)와의 비교를 위해 대조군(조작되지 않은 세포)을 사용하여, 대조군에 대한 조작 세포의 상대적인 활성화를 결정한다. 또한, 상기 분석법은 표적 항원을 발현하지 않는 표적 세포와 함께 인큐베이팅되거나 접촉되는 조작 세포와 비교할 수 있다. 예를 들면, 상기 비교는 CD19를 발현하지 않는 표적 세포와 함께 인큐베이팅된 CD19-CAR T 세포일 수 있다.
뉴클레오티드 서열을 지칭하는 데 사용되는 용어 "서열" 및 그것의 문법적 동의어는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고; 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 서열은 돌연변이될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 길이, 예를 들면 2~1,000,000개 이상의 뉴클레오티드 길이(또는 그 사이 또는 그 사이의 임의의 정수값), 예를 들면 약 100~약 10,000개의 뉴클레오티드, 또는 약 200~약 500개의 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 구성성분, 세포 및 다른 것으로부터 분리된것을 의미하며, 여기서 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그것의 단편은 통상적으로 자연 상태와 관련된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 비자연발생적 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그것의 단편은 그것의 자연발생적 대응물과 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다. 또한, "농축된", "분리된" 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그것의 단편은 체적당 분자의 농도 또는 수가 그것의 자연발생적 대응물의 "농축된" 것보다 크거나 "분리된" 것보다 적다는 점에서 그것의 자연발생적 대응물과 분리될 수 있다. 풍부화는 용액의 체적당 중량과 같이 절대적인 기준으로 측정될 수 있거나, 또는 소스 혼합물에 존재하는 제 2 잠재적 방해 물질과 관련하여 측정될 수 있다. 본 발명의 실시형태의 풍부화는 점점 더 선호되고 있다. 따라서, 예를 들면 2배 풍부화가 바람직하고, 10배 풍부화가 보다 바람직하고, 100배 풍부화가 보다 더욱 바람직하며, 1000배 풍부화가 훨씬 더욱 바람직하다. 또한, 물질은 화학적 합성 또는 재조합 발현과 같은 인공 조립의 공정에 의해 단리된 상태로 제공될 수 있다.
"연결된" 및 "융합된" 또는 "융합"은 본원에 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 어떠한 수단에 의해서든 2개 이상의 화학적 요소 또는 구성요소를 결합하는 것을 지칭한다. "인-프레임 융합(in-frame fusion)"은 원래의 ORF의 올바른 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 연속적이고 더 긴 ORF를 형성하기 위한 2개 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 결합하는 것을 지칭한다. 따라서, 결과로 얻어진 재조합 융합 단백질은 원래의 ORF에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 세그먼트를 함유하는 단일 단백질이다(이 세그먼트는 보통 자연에서는 그렇게 결합되지 않는다). 따라서, 리딩 프레임은 융합된 세그먼트 전반에 걸쳐 연속적이지만, 세그먼트는 예를 들면, 인-프레임 링커 서열(예를 들면, "플렉손(flexon)")에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 적용된 "재조합"은 폴리뉴클레오티드가 클로닝, 제한, 및/또는 리게이션 단계의 다양한 조합, 및 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드와는 별개의 구조체를 발생시키는 다른 과정의 생성물이라는 것을 의미한다.
용어 "유전자" 또는 "유전자 단편"은 본원에 상호교환적으로 사용된다. 그들은 전사되고 번역된 후 특정 단백질을 인코딩할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 유전자 또는 유전자 단편은 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 한, 게놈, cDNA, 또는 합성된 것일 수 있고, 이것은 전체 코딩 영역 또는 그것의 세그먼트를 커버할 수 있다.
"작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 기술된 구성요소들이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터 서열은 프로모터 서열이 코딩 서열의 전사를 촉진하면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA("전사물"이라고도 불림)가 계속하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 상기 전사물 및 인코딩된 폴리펩티드는 통칭하여 유전자 생성물이라고 불린다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되면, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA 스플라이싱을 포함할 수 있다.
조성물 - 항원 결합 유닛
일실시형태에 있어서, 본 개시는 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛을 제공하고, 여기서 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 유의한 결합을 나타내지 않고, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시형태에 있어서, 본 개시는 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛을 제공하고, 여기서 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 덜 나타내고, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시는 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛을 제공하고, 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하고, 여기서 상기 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR을 포함한다. 경쇄 CDR은 항원 결합 유닛의 경쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 경쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속적인 서열, 또는 프레임워크 영역과 같은 비상보성 결정 영역에 의해 분리되고 선택적으로는 플랭킹된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에 있어서, 경쇄 CDR은 2개 이상의 경쇄 CDR을 포함하고, 이것은 경쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있다. 유리한 예에 있어서, 경쇄 CDR은 각각 경쇄 CDR-1, 경쇄 CDR-2, 및 경쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 예에 있어서, 공통 경쇄 상에 존재하는 CDR의 그룹은은 통칭하여 경쇄 CDR로 지칭될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 중쇄 CDR을 포함한다. 중쇄 CDR은 항원 결합 유닛의 중쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 중쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속적인 서열, 또는 프레임 워크 영역과 같은 비상보성 결정 영역에 의해 분리되고 선택적으로는 플랭킹된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에 있어서, 중쇄 CDR은 2개 이상의 중쇄 CDR을 포함하고, 이것는 중쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있다. 유리한 예에 있어서, 중쇄 CDR은 3개의 중쇄 CDR을 포함하며, 이것은 각각 중쇄 CDR-1, 중쇄 CDR-2 및 중쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있다. 일부 예에 있어서, 공통 중쇄 상에 존재하는 CDR의 그룹은 통칭하여 중쇄 CDR로 지칭될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 WT1 또는 WT1 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 예에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합한다. 또한, 본원에 사용된 WT1은 오솔로그, 호몰로그, 코돈-최적화된 형태, 절단된 형태, 단편화된 형태, 돌연변이된 형태, 또는 공지된 WT1 서열의 임의의 그 밖의 유도체 형태를 지칭할 수 있다. 예를 들면, WT1은 인간 WT1일 수 있으며, 이것은 GenBank 접근 번호 [P19544]로 나타내어지고 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함한다. 또한, WT1은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 58, 및 SEQ ID NO: 59 중 어느 하나와 적어도 50%의 동일성을 공유하는 서열을 포함할 수 있다. WT1은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 58, 및 SEQ ID NO: 59 중 어느 하나와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 99% 초과의 동일성을 공유하는 서열을 포함할 수 있다
결합 특이성은 상보성 결정 영역, 또는 경쇄 CDR 또는 중쇄 CDR과 같은 CDR에 의해 결정될 수 있다. 많은 경우에, 결합 특이성은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR에 의해 결정된다. 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 소정 조합은 다른 참조 항원 또는 참조 펩티드와 비교하여 HAL와 복합체화된 WT1 또는 WT1 펩티드에 대해 더 큰 친화도 및/또는 특이성을 부여하는 소정의 결합 포켓을 제공한다.
HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 대한 항원 결합 유닛의 결합은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 특징화되거나 나타내어질 수 있다. 예를 들면, 결합은 항원 결합 유닛과 항원 사이의 상호작용의 강도인 결합 친화도에 의해 특징지어질 수 있다. 결합 친화도는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 시험관내 결합 분석법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 항원 결합 유닛의 결합 친화도는 WT1 및 HLA를 발현하는 세포를 활용하는 시험관내 결합 분석법으로 분석될 때 결정될 수 있다. 대상 항원 결합 유닛의 결합 친화도는 항체와 그것의 각각의 항원 사이의 평형 해리 상수인 Kd로 표현될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 본원에 개시된 항원 결합 유닛은 약 10μM~약 1fM의 범위 내의 Kd로 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합한다. 예를 들면, 항원 결합 유닛은 약 10μM, 1μM, 0.1μM, 10nM, 1nM, 01nM, 10pM, 1pM, 0.1pM, 10fM, 1fM, 0.1fM, 또는 0.1fM 미만의 Kd로 CD47에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 예에 있어서, Kd는 1.5nM 미만이다. 일부 예에 있어서, Kd는 50pM 미만이다.
일부 양태에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 유의한 결합을 나타내지 않는다. 일부 예에 있어서, HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대한 대상 항원 결합 유닛의 결합 수준은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 대한 상기 항원 결합 유닛의 결합 수준의 10% 이하이다. 예를 들면, 결합 수준은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 대한 상기 항원 결합 유닛의 결합 수준의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 1% 미만일 수 있다. 일부 예에 있어서, 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양태에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 덜 나타낸다. 일부 예에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 덜 나타낸다. 일부 예에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대한 비특이적인 결합이 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 초과로 덜 나타난다. 일부 예에 있어서, 참조 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 예에 있어서, 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함한다. 대상 항원 결합 유닛은 표 1에 열거된 임의의 LCDR 또는 HCDR을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 대상 항원 결합 유닛은 표 1에 열거된 임의의 LCDR 또는 HCDR과 적어도 60%의 동일성을 갖는 LCDR 또는 HCDR을 포함할 수 있다. 일부 양태에 있어서, 대상 LCDR 또는 HCDR은 표 1에 열거된 서열번호(SEQ ID NO)들과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
[표 1]
Figure pct00001
일부 경우에 있어서, 경쇄(LC) CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 중쇄(HC) CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다. 일부 예에 있어서, 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 예에 있어서, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 예에 있어서, 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖고, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10, 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR을 포함하고, 여기서 상기 경쇄(LC) CDR은 3개의 LCDR, 즉 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 조합을 포함한다. 3개의 LCDR의 조합은 표 2에 열거된 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[표 2]
Figure pct00002
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 상기 중쇄(HC) CDR은 3개의 HCDR, 즉 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 조합을 포함한다. 3개의 HCDR의 조합은 표 3에 열거된 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[표 3]
Figure pct00003
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 상기 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 표 2에 열거된 LCDR의 임의의 조합 및 표 3에 열겨된 HCDR의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 LCDR 및 HCDR을 각각 포함한다.
일부 양태에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 모노클로날 항원 결합 유닛, 폴리클로날 항원 결합 유닛, 인간화 항원 결합 유닛, 키메라 항원 결합 유닛, 1가 항원 결합 유닛, 다가 항원 결합 유닛, 이중특이적 항원 결합 유닛, 또는 그들의 임의의 조합이다. 항원 결합 유닛은 sFC, Fv, ccFv, Fab', F(ab')2 및 Fd를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 다양한 포맷을 취할 수 있다. 이러한 항체 결합 유닛은 전체 면역 글로불린으로부터 리신, 펩신, 파파인, 또는 다른 프로테아제 분열에 의해 생성될 수 있다. 또한, 대상 항원 결합 유닛은 키메라 항원 수용체(CAR) 내에 포함될 수 있다. 이러한 예에 있어서, 항원 결합 유닛은 세포외 항원 결합 유닛인 경우가 있다.
또한, 항원 결합 유닛은 재조합 면역 글로불린 기술을 활용하여 설계될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 사용하기 위한 "Fv" 면역 글로불린은 펩티드 링커를 통해 가변 경쇄 영역을 가변 중쇄 영역에 연결시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 링커는 폴리-글리신 또는 α나선 또는 β시트 모티프를 형성하지 않는 다른 서열일 수 있다. 전문이 본원에 참조로 포함된 미국특허 제6,147,203호에서 기술된 바와 같이 VH 및 VL 영역 사이에서 이황화 결합을 안정화시키는 단계를 포함하는 Fv가 또한 형성될 수 있다. 이들 항원 결합 유닛 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 2개의 중쇄와 쌍을 이루는 2 개의 경쇄를 갖는 전체 면역 글로불린일 수 있다.
항원-결합 유닛은 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 헤테로멀티머일 수 있다. 항원 결합 유닛의 예는 (i) 그 전문이 본원에 포함된 미국특허 제6,833,441호에 개시된 헤테로다이머화 서열에 의해 안정화된 ccFv 단편; (ii) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 ccFv 단편을 포함하는 임의의 다른 1가 및 다가 분자; (iii) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (vi) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; 및 (vii) 디아바디(diabody)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
폴리클로날 항체는 표준 프로토콜에 의해 생산 동물에게 항원성 조성물을 주입함으로써 생길 수 있다. 예를 들면, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988을 참조한다. 전체 단백질, 또는 더 큰 단백질의 부분을 활용할 때, 항체는 생산 동물을 단백질 및 적합한 아쥬반트(예를 들면, 프로인트, 완전 프로인트, 수중유형 에멀전 등)로 면역화함으로써 생성될 수 있다. 더 작은 펩티드를 활용할 때, 면역 자극 접합체를 제조하기 위해 상기 펩티드를 더 큰 분자와 접합하는 것이 유리하다. 이러한 사용에 상업적으로 이용가능한, 흔히 활용되는 접합 단백질은 소혈청 알부민(BSA) 및 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 포함한다. 특정 에피토프에 대해 항체를 생성시키기 위해서, 전체 서열로부터 유래된 펩티드가 활용될 수 있다. 대안적으로, 단백질 표적의 상대적으로 짧은 펩티드 부분에 대해 항체를 생성시키기 위해서, 오브알부민, BSA 또는 KLH와 같은 캐리어 단백질에 폴리펩티드가 결합되면 양호한 면역 반응이 유도될 수 있다.
폴리클로날 또는 모노클로날 항원 결합 유닛 또는 항체는 인간 면역 글로불린을 생성하도록 유전자 변형된 동물로부터 생성될 수 있다. 전이 유전자 동물은 처음에 동물의 천연 항체를 생성하지 않는 "넉 아웃(knock-out)" 동물을 생성하고, 동물을 인간 항체 유전자좌에 의해(예를 들면, 인간 인공 염색체의 사용에 의해) 안정적으로 형질 전환시킴으로써 생산될 수 있다. 이러한 경우에, 단지 인간 항체만이 동물에 의해 형성된다. 이러한 동물을 생성하고 그것으로부터 항체를 유도하는 기술은 전문이 본원에 참조로 포함된 미국특허 제6,162,963호 및 제6,150,584호에 기재되어 있다. 이러한 항체는 인간 이종성 항체로 지칭될 수 있다.
대안적으로, 항원 결합 유닛은 인간 가변 영역을 함유하는 파지 라이브러리로부터 생성될 수 있다. 전문이 본원에 참조로 포함된 미국특허 제6,174,708호를 참조한다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 하이브리도마에 의해 생성된다. 예를 들면, 본원에 개시된 항원 결합 유닛은 표 1에 열거된 항원 결합 유닛 중 하나를 발현하는 하이브리도마로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.
모노클로날 항원 결합 유닛 또는 모노클로날 항체의 경우, 접종된 동물의 비장으로부터의 것과 같은 자극된 면역 세포를 단리시킴으로써 하이브리도마가 형성될 수 있다. 이어서, 이들 세포는 세포 배양 시에 무한정 복제되며, 이것에 의해 불멸의 면역 글로불린-분비 세포주를 생성할 수 있는 불멸화 세포, 예를 들면 골수종 세포 또는 형질 전환된 세포에 융합될 수 있다. 활용된 불멸화 세포주는 특정 영양소의 활용에 필요한 효소가 결핍되도록 선택될 수 있다. 다수의 이러한 세포주(예를 들면, 골수종)는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면: 티미딘 키나아제(TK) 또는 하이폭산틴-구아닌 포스포리복실 트랜스퍼라아제(HGPRT)를 포함한다. 이들 결핍은 예를 들면, 하이폭산틴 아미노프테린티미딘 배지(HAT)에서 성장할 수 있는 능력에 따라 융합된 세포에 대한 선택을 허용한다.
또한, 대상 항원 결합 유닛은 유전자 조작에 의해 생성될 수 있다. 인간에게 투여될 때에 면역 반응이 덜 발생하는 인간화, 키메라, 또는 이종성 인간 항원 결합 유닛이 본 발명에서 사용된다.
본원에 개시된 항원 결합 유닛은 인간에게서 원치 않은 면역 반응, 예를 들면 아나필락시스 쇼크를 유발하는 경향이 감소되고, 또한 면역 반응을 프라이밍하는 경향이 감소될 수 있으며, 이것은 항체 치료제 또는 이미징제(예를 들면, 인간-항-뮤린-항체 "HAMA" 반응)의 반복된 투여를 방지할 것이다. 이러한 항원 결합 유닛은 인간화, 키메라, 또는 이종성 인간 항원 결합 유닛을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
유전자 조작을 채용함으로써, 항원 결합 유닛은 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛이 그것의 표적(예를 들면, HLA와 복합체화된 WT1 펩티드)에 대한 친화도가 더욱 높아지도록 선택될 수 있게 항원 결합 유닛은 돌연변이될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 그것의 표적에 대한 항원 결합 유닛의 친화도는 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현될 수 있는 표적에 대해 최적화될 수 있다. 이 최적화는 잠재적 독성을 최소화하기 위해 수행될 수 있다. 다른 경우에 있어서, 표적의 막 결합 형태에 대해 더욱 높은 친화도를 갖는 항원 결합 유닛의 클로닝은 그것의 가용가능한 형태의 대응물보다 바람직할 수 있다. 일부 표적이 상이한 수준으로 가용가능한 형태로 검출될 수 있고 그들의 표적화가 의도하지 않은 독성을 일으킬 수 있기 때문에 이러한 변형이 수행될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상 항원 결합 유닛은 뮤린, 인간화, 또는 완전 인간일 수 있다. 항원 결합 유닛은 약 1%~약 100% 인간일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항원 결합 유닛은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 최대 약 100% 인간일 수 있다.
키메라 항원 결합 유닛 또는 키메라 항체는 대부분 인간 도메인을 갖는 항체를 생성하기 위해, 예를 들면, 재조합 수단에 의해 뮤린(또는 다른 동물 유래의) 하이브리도마 클론으로부터 얻어진 뮤린의 가변 경쇄 및 중쇄 영역(VK 및 VH)을 인간 불변 경쇄 및 중쇄 영역과 조합함으로써 생성될 수 있다. 이러한 키메라 항체의 생성은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 표준 수단에 의해 달성될 수 있다(예를 들면, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국특허 제5,624,659호에 기술된 바와 같음).
비인간(예를 들면, 설치류 또는 영장류) 항체에 적용되는 용어 "인간화"는 비인간 면역 글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 하이브리드 면역 글로불린, 면역 글로불린쇄 또는 그것의 단편이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가, 소망의 특이성, 친화도 및 능력을 가진 마우스, 래트, 토끼, 또는 영장류와 같은 비인간종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역 글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에 있어서, 인간 면역 글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체뿐만 아니라 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인체에 도입될 때에 항체 성능을 더욱 개선하고 최적화하고 면역원성을 최소화하도록 이들 변형이 이루어진다. 일부 예에 있어서, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 면역 글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역 글로불린의 적어도 일부분을 포함할 수 있다.
인간화 항체는 인간-유사 면역 글로불린 도메인을 함유하고, 동물-유래 항체의 상보성 결정 영역만을 포함하도록 조작될 수 있다. 이것은 모노클로날 항원 결합 유닛 또는 모노클로날 항체의 가변 영역의 초가변 루프의 서열을 주의 깊게 조사하고 인간 항원 결합 유닛 또는 인간 항체 사슬의 구조에 적합화시킴으로써 달성 될 수 있다. 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국특허 제6,187,287를 참조한다.
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. "인간화" 항체는 인간 면역글로불린과 더 유사해지도록 서열의 적어도 일부가 그것의 초기 형태로부터 변형된 항체이다. 일부 버전에 있어서, 중쇄(H) 및 경쇄(L) 불변(C) 영역이 인간 서열로 대체된다. 이것은 가변(V) 영역 및 이종성 면역글로불린 C 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 일부 버전에 있어서, 상보성 결정 영역(CDR)이 비인간 항체 서열을 포함하는 반면, V 프레임워크 영역은 또한 인간 서열로 전환되었다. 예를 들면, EP 0329400을 참조한다. 일부 버전에 있어서, V 영역이 인간 및 마우스 V 영역의 공통 서열을 설계하고, 공통 서열 사이의 상이한 CDR 외부의 잔기를 전환함으로써 인간화된다.
원칙적으로, 인간화 항체로부터의 프레임워크 서열은 CDR 그래프팅을 위한 주형(template)의 역할을 할 수 있지만; 이러한 프레임워크로의 직선형CDR을 대체하는 항원에 대한 결합 친화도의 상당한 손실을 초래할 수 있음이 입증되었다. Glaser et al.(1992) J. Immunol. 149:2606; Tempest et al.(1992) Biotechnology 9:266; 및 Shalaby et al.(1992) J. Exp .Med.　17:217. 인간 항체(HuAb)가 원래의 뮤린 항체(muAb)에 대해 더 상동성일수록, 인간 프레임워크는 친화도를 감소시킬 수 있는 뮤린 CDR에 왜곡을 도입할 가능성이 적다. 항체 서열 데이터베이스에 대한 서열 상동성 검색에 기초하여, HuAb IC4는 muM4TS.22에 대해 양호한 프레임워크 상동성을 제공하지만, 그 밖의 고도로 상동성인 HuAb, 특히 인간 서브그룹 I로부터의 카파 L쇄 또는 인간 서브그룹 III로부터의 H쇄도 적합할 것이다. Kabat et al.(1987). ENCAD (Levitt et al.(1983) J. Mol. Biol. 168:595)와 같은 다양한 컴퓨터 프로그램이 V 영역에 대해 이상적인 서열을 예측하는 데 이용가능하다. 따라서, 본 발명은 상이한 가변(V) 영역을 갖는 HuAbs를 포함한다. 적합한 V 영역 서열을 결정하고 이들 서열을 최적화하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 또한, 면역원성이 감소된 항체를 수득하는 방법은 미국특허 제5,270,202호 및 EP 699,755에 기술되어 있다.
인간화 항체는 모체 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역 글로불린 모델은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이에 대한 검토는 후보 면역 글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역 글로불린이 그것의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로 FR 잔기는 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화도와 같은 소망의 항체 특성이 달성되도록 공통 서열 및 유입 서열로부터 선택되고 조합된다.
대상 항원 결합 유닛의 인간화 과정은 다음과 같을 수 있다. 가장 적합한 생식계열 수용체 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 그래프팅을 위한 인간 항체 생식계열의 상동성, 기본 구조 및 물리적 특성에 기초하여 선택된다. 그래프팅된 hVH/VL에 대한 mVH/VL의 컴퓨터 모델링이 수행되고, 프로토타입의 인간화 항체 서열이 생성된다. 모델링이 프레임워크 역-돌연변이의 필요성을 나타내는 경우, 나타내어진 FW 변화를 갖는 제 2 변이체가 생성된다. 선택된 생식계열 프레임워크 및 뮤린 CDR을 인코딩하는 DNA 단편이 합성된다. 합성된 DNA 단편은 IgG 발현 벡터로 서브클로닝되고, 서열은 DNA 서열화에 의해 확인된다. 인간화 항체는 293F와 같은 세포에서 발현되고, 단백질은 예를 들면, MDM 식균 작용 분석 및 항원 결합 분석에서 시험된다. 인간화 항원 결합 유닛은 예를 들면, 표적 항원을 발현하는 세포 상의 FACS에 의해 항원 결합 친화도의 점에서 모체 항원 결합 유닛과 비교된다. 상기 친화도가 모체 항원 결합 유닛보다 2배 미만 크면, 상술한 바와 같이 2차 인간화 변이체가 상술한 바와 같이 생성되고 시험될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 항원 결합 유닛은 "1가" 또는 "다가"일 수 있다. 전자는 항원-결합 유닛당 하나의 결합 부위를 갖는 반면, 후자는 동일하거나 상이한 종류의 둘 이상의 항원에 결합할 수 있는 다수의 결합 부위를 포함한다. 결합 부위의 수에 따라, 항원 결합 유닛은 2가(2개의 항원-결합 부위를 가짐), 3가(3개의 항원-결합 부위를 가짐), 4가(4개의 항원-결합 부위를 가짐) 등일 수 있다.
다가 항원 결합 유닛은 그들의 결합 특이성에 기초하여 더 분류될 수 있다. "단일특이적" 항원 결합 유닛은 동일한 종류의 하나 이상의 항원에 결합할 수 있는 분자이다. "다중특이적" 항원 결합 유닛은 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 분자이다. 이러한 분자는 일반적으로 2개의 별개의 항원(즉, 이중특이적 항원 결합 유닛)에만 결합할 것이지만, 본원에 사용되는 경우, 삼중특이적 항체와 같은 추가적인 특이성을 갖는 항체가 이 표현에 포함된다. 본 개시는 다중특이적 항원 결합 유닛을 더 제공한다. 다중특이적 항원 결합 유닛은 적어도 2개의 별개의 항원에 결합할 수 있는 다가 분자이다. 바람직한 다중특이적 항원 결합 유닛은 각각 2개 및 3개의 별개의 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 이중특이적 및 삼중특이적 분자이다.
본원에 개시된 일실시형태의 일부 양태에 있어서, 항원 결합 유닛은 이중특이적 항원 결합 유닛이며, 여기서 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드 및 제 2 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 예에 있어서, 제 2 항원은 WT1이 아니다. 일부 예에 있어서, 제 2 항원은 CD3이다. 일부 예에 있어서, 제 2 항원은 PD1 또는 PD-L1이다. 일부 예에 있어서, 제 2 항원은 CTLA-4, OX40, OX40L, 4-1BB(CD137), CD40, CD40L, ICOS, CD70, CD27, GITR, GITRL, TL1A, TNFRSF25, VISTA, TIM-3, LAG-3, TIGIT, CD112, CD112R, CD226, CD96, B7-H3, B7-H4, CD48, CD244, CD200R, CD200, HVEM, BTLA, CD160, LIGHT, HHLA2, TMIGD2, BTNL2, CD39, CD73, NKG2A, NKG2D, MICA/B, KIR2DL-1, KIR2DL-2, KIR2DL-3, 및 KIR3DL2를 포함하는 다른 면역 체크포인트 분자이다. 일부 예에 있어서, 제 2 항원은 EGFR이다. 일부 예에 있어서, 제 2 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, CD79b, CD96, CD97, CD99, CD123, CD138, CD155, CD171, PTHR2, HAVCR2, 또는 그 밖의 공지된 암 세포 마커이다. 적합한 제 2 항원의 추가적인 예는 FcγRI, CD15, p185 HER2, HER3, FcγRIII (CD16), CD3, 악성 B-세포(1D10), p97, 클라우딘18.2, OVCAR-3, 글리피칸-3, 메소텔린, L-D1(결장암종), Trop2, 멜라닌 세포 자극 호르몬 유사체, ErbB2, CAMA1, MoV18, CAIX(카르복시-안히드라아제-IX), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 엽산 결합 단백질(FBP), GD2, GD3, EpCAM, EGP-40, VEGFR2, MUC-1, MUC-16, STEAP1(전립선의 6개의 막 관통 상피 항원), PSMA, PSCA (전립선 줄기 세포 항원), GPC-3, LMP-1, DNAM-1(DNAX 보조 분자-1), 팬(pan) 암종 관련 항원(AMOC-31), 사포린, Id-1, CD7, CD38, CD30, CD44v7/8, CEA, 리신 A쇄, 인터페론-α(IFN-α), 하이브리도마 이디 오타입, 빈카알칼로이드, 알칼리성 포스파타아제, 피브린, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 유로키나아제제 플라스미노겐 활성화제(uPA), 저밀도 리포단백질(LDL), Fc 수용체(예를 들면, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII), 단순 포진 바이러스(HSV), T 세포 수용체, 인플루엔자, FcγR, HIV, EOTUBE, DPTA, 합텐, 토끼 IgG, 페리틴, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP), 호르몬, 소마토스타틴, 물질 P, FITC, 및 β-갈락토시다아제를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 그 외 적합한 제 2 항원은 종양 세포 항원, 세포 독성 촉발 분자, 독소 섬유소 분해제, 세포 표면 수용체, 감염성 질환 표적, 백신 아쥬반트, 진단제, 검출 분자, 및 리포터 분자를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
조성물 - 키메라 항원 수용체
일실시형태에 있어서, 본 개시는 세포외 항원 결합 유닛, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하며, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 유의한 결합을 나타내지 않고, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다
일실시형태에 있어서, 본 개시는 세포외 항원 결합 유닛, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하며, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 여기서 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 세포외 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 덜 나타내고, 여기서 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는다.
대상 항-WT1 키메라 항원 수용체(CAR)는 전형적으로 세포외 항원 결합 유닛, 막 관통 도메인, 및 면역 반응성 세포 활성화를 제어하는 세포내 시그널링 영역을 포함한다. 일부 경우에 있어서, 항-WT1 CAR은 힌지 또는 스페이서를 더 포함한다. 일부 경우에 있어서, 항-WT1 CAR은 하나 이상의 공동 자극 도메인을 더 포함한다
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일양태에 있어서, 대상 키메라 항원 수용체는 본원에 개시된 임의의 대상 항원 결합 유닛을 포함한다. 일부 예에 있어서, 대항 항원 결합 유닛은 세포외 항원 결합 유닛을 포함하고, 대상 항원 결합 유닛이거나 대상 항원 결합 유닛을 포함한다.
키메라 항원 수용체는 전형적으로 세포외 항원 결합 유닛을 포함한다. 일실시형태에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 완전한 인간일 수 있다. 다른 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 인간화될 수 있다. 다른 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 뮤린일 수 있거나, 또는 세포외 항원 결합 유닛에 있어서의 키메라는 적어도 2개의 상이한 동물종으로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 비인간일 수 있다. HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 표적화하도록 다양한 항원 결합 유닛을 설계할 수 있다. 비제한적인 예로는 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv's), 라이브러리로부터 선택된 단편 항원 결합 유닛(Fab), 단일 도메인 단편, 또는 그들의 인지체 수용체와 결합하는 천연 리간드가 포함된다. 세포외 항원 결합 유닛은 scFv, Fab, 또는 천연 리간드뿐만 아니라 그들의 유도체를 포함할 수 있다. 세포외 항원 결합 유닛은 온전한 항체의 일부를 포함할 수 있고 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합할 수 있는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭할 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
세포외 항원 결합 유닛, 예를 들면 scFv, Fab, 또는 천연 리간드는 항원 특이성을 결정하는 CAR의 일부일 수 있다. 세포외 항원 결합 유닛은 임의의 상보성 표적에 결합할 수 있다. 세포외 항원 결합 유닛은 가변 영역의 서열이 알려진 항체로부터 유래될 수 있다. 세포외 항원 결합 유닛은 이용가능한 마우스 하이브리도마로부터 얻어진 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 세포외 항원 결합 유닛은 종양 세포 또는 1차 세포, 예를 들면 종양 침윤 림프구(TIL)의 전체-엑솜 서열화로부터 얻어질 수 있다.
일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛의 결합 특이성은 상보성 결정 영역, 또는 경쇄 CDR 또는 중쇄 CDR과 같은 CDR에 의해 결정될 수 있다. 많은 경우에, 결합 특이성은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR에 의해 결정될 수 있다. 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 소정의 조합은 다른 참조 항원 또는 HLA와 복합체화된 참조 펩티드과 비교하여 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드와 같은 항원에 대해 더 큰 친화도 및/또는 특이성을 부여할 수 있는 소정의 결합 포켓을 제공할 수 있다. 예를 들면, HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 표적화하는 CAR이 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 발현하는 종양 세포에 대해 면역 반응성 세포를 표적화할 수 있도록, HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적인 CDR이 CAR의 세포외 결합 영역에서 발현될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, scFv와 같은 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 대해 특이적인 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 경쇄 CDR은 CAR의 scFv와 같은 항원 결합 유닛의 경쇄의 상보성 결정 영역 일 수 있다. 경쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속적인 서열, 또는 프레임워크 영역과 같은 비상보성 결정 영역에 의해 분리되고 선택적으로는 플랭킹된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 경쇄 CDR은 2개 이상의 경쇄 CDR을 포함할 수 있으며, 이는 경쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 경쇄 CDR은 3개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있으며, 이는 각각 경쇄 CDR-1, 경쇄 CDR-2, 및 경쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있다. 일부 예에 있어서, 공통 경쇄 상에 존재하는 CDR 그룹은 통칭하여 경쇄 CDR로 지칭될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, scFv와 같은 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 대해 특이적인 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 중쇄 CDR은 scFv와 같은 항원 결합 유닛의 중쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 중쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속적인 서열, 또는 프레임워크 영역과 같은 비상보성 결정 영역에 의해 분리되고 선택적으로는 플랭킹된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 중쇄 CDR은 2개 이상의 중쇄 CDR을 포함할 수 있으며, 이는 중쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 중쇄 CDR은 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있으며, 이는 각각 중쇄 CDR-1, 중쇄 CDR-2, 및 중쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 공통 중쇄 상에 존재하는 CDR 그룹은 통칭하여 중쇄 CDR로 지칭될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 특이적으로 인식한다. 일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 N-말단 펩티드, C-말단 펩티드, 또는 WT1의 임의의 펩티드를 표적화할 수 있다. 일부 경우에 있어서, WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 경우에 있어서, HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 표적화하는 세포외 항원 결합 유닛은 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포에 의해 발현될 수 있다. 일부 경우에 있어서, HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 결합하는 CDR, 경쇄 및/또는 중쇄는 CAR T 세포와 같은 CAR 면역 반응성 세포의 세포외 항원 결합 유닛 내에 포함될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 변형된 항-WT1 CDR은 CAR 면역 반응성 세포의 세포외 항원 결합 유닛 상에서 발현될 수 있고, 원래의 항-WT1 CDR과 약 50%의 상동성~약 100%의 상동성을 갖는다. 일부 경우에 있어서, 변형된 항-WT1 CDR은 변형되지 않은 항-WT1 CDR과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100%의 상동성을 포함할 수 있다.
유전자 조작을 채용함으로써, 세포외 항원 결합 유닛은 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛이 그것의 표적에 대해 높은 친화도를 갖도록 선택될 수 있게 세포외 항원 결합 유닛은 돌연변이가 될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 그것의 표적에 대한 세포외 항원 결합 유닛의 친화도는 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현될 수 있는 표적에 대해 최적화될 수 있다. 이 최적화는 잠재적 독성을 최소화하기 위해 수행될 수 있다. 다른 경우에 있어서, 표적의 막 결합 형태에 대해 더 높은 친화도를 갖는 세포외 항원 결합 유닛의 클로닝은 그것의 가용 형태 대응물보다 바람직할 수 있다. 일부 표적이 상이한 수준에서 가용가능한 형태로도 검출될 수 있고 그들의 표적화가 의도하지 않은 독성을 유발할 수 있기 때문에 이러한 변형이 수행될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 뮤린, 인간화, 또는 완전한 인간일 수 있다. 세포외 항원 결합 유닛은 약 1%~약 100%가 인간일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 최대 약 100%가 인간일 수 있다. 일부 예에 있어서, 대상 키메라 항원 수용체는 경쇄(LC) CDR 및 중쇄(HC) CDR을 포함하는 세포외 항원 결합 유닛을 포함할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상 세포외 항원 결합 유닛은 표 1에 열거된 임의의 LCDR 또는 HCDR을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포외 항원 결합 유닛은 표 1에 열거된 임의의 LCDR 또는 HCDR와 적어도 60%의 동일성을 갖는 LCDR 또는 HCDR을 포함할 수 있다. 일부 양태에 있어서, 대상 LCDR 또는 HCDR은 표 1에 열거된 임의의 서열번호들과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
일부 경우에 있어서, 경쇄(LC) CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 중쇄(HC) CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다. 일부 예에 있어서, 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 예에 있어서, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 예에 있어서, 상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖고, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR을 포함하고, 여기서 상기 경쇄(LC) CDR은 3개의 LCDR, 즉 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 조합을 포함한다. 3개의 LCDR의 조합은 표 2에 열거된 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 상기 중쇄(HC) CDR은 3개의 HCDR, 즉 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 조합을 포함한다. 3개의 HCDR의 조합은 표 3에 열거된 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 일부 양태에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 상기 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 각각 표 2에 열거된 LCDR의 임의의 조합 및 표 3에 열거된 HCDR의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 LCDR 및 HCDR을 포함한다.
일부 경우에 있어서, 세포외 항원 결합 유닛은 힌지 또는 스페이서를 포함한다. 용어 힌지와 스페이서는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 힌지는 세포외 항원 결합 유닛에 유연성을 제공하기 위해 사용된 CAR의 일부로 간주될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 특히 세포외 항원 결합 유닛을 검출하기 위한 항체가 기능적이지 않거나 이용가능하지 않을 때, 힌지는 세포의 세포 표면 상에서 CAR을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역 글로불린으로부터 유래된 힌지의 길이는 세포외 항원 결합 유닛이 표적화하는 표적 상의 에피토프의 위치에 따라 최적화될 필요가 있을 수 있다.
일부 경우에 있어서, 힌지는 면역 글로불린에 속하지 않지만, 그 대신 CD8α 분자의 천연 힌지와 같은 다른 분자에 속할 수 있다. CD8α 힌지는 CD8 공수용체와 MHC 분자의 상호작용에 역할을 하는 것으로 알려진 시스테인 및 프롤린 잔기를 함유할 수 있다. 상기 시스테인 및 프롤린 잔기는 상기 CAR의 성능에 영향을 줄 수 있다. 일부 예에 있어서, CD8α 힌지는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함한다.
CAR 힌지는 크기 조정이 가능할 수 있고, CAR 면역 반응성 세포와 표적 세포 사이의 직교 시냅스 거리를 정규화함에 있어서 어느 정도 보상할 수 있다. 또한, 면역 반응성 세포와 표적 세포 사이의 면역학적 시냅스의 이러한 위상은 짧은 힌지 CAR로도 시냅스 거리가 시그널링을 위한 근사치가 될 수 없는 세포-표적 표적 분자 상의 막-원위 에피토프로 인해 CAR에 의해 기능적으로 가교될 수 없는 거리를 규정한다. 마찬가지로, 막-근위 CAR 표적 항원 에피토프는 긴 힌지 CAR에 관해서만 시그널링 출력이 관찰되는 것으로 설명되었다. 힌지는 사용되는 세포외 항원 결합 유닛에 따라 조정될 수 있다. 힌지는 임의의 길이일 수 있다.
막 관통 도메인은 CAR을 세포의 원형질막에 고정시킬 수 있다. CD28의 천연 막 관통 부분이 CAR에 사용될 수 있다. 다른 경우에 있어서, 또한 CD8α의 천연 막 관통 부분이 CAR에 사용될 수 있다. "CD8"이란, NCBI 참조 번호: NP_001759와 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는 단백질 또는 자극 활성을 갖는 그것의 단편을 의미할 수 있다. "CD8 핵산 분자"란, CD8 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 막 관통 영역은 CD28의 천연 막 관통 부분일 수 있다. "CD28"이란, NCBI 참조 번호: NP_006130과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는 단백질 또는 자극 활성을 갖는 그것의 단편을 의미할 수 있다. "CD28 핵산 분자"란, CD28 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 막 관통 부분은 CD8α 영역을 포함할 수 있다.
CAR의 세포내 시그널링 영역은 CAR이 위치된 면역 반응성 세포의 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당할 수 있다. CAR은 예를 들면, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있는 T 세포의 효과기 기능을 유도할 수 있다. 따라서, 용어 세포내 시그널링 영역은 효과기 기능 시그널을 전달하고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포내 시그널링 영역이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 시그널링 도메인의 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 일부 경우에 있어서, 세포내 시그널링 영역의 절단된 부분이 사용된다. 일부 경우에 있어서, 용어 세포내 시그널링 영역은 효과기 기능 시그널을 전달하기에 충분한 세포내 시그널링 영역의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
CAR에 사용하기 위한 시그널링 도메인의 바람직한 예로는 표적-수용체 결합 후 시그널 전달을 개시하기 위해 협업하는 T 세포 수용체(TCR) 및 공수용체의 세포질 서열뿐만 아니라 및 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열이 포함될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 상기 세포내 시그널링 영역은 면역 수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM)라고 알려진 시그널링 모티프를 함유할 수 있다. 세포질 시그널링 서열을 포함하는 ITAM의 예로는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들이 포함된다. 그러나, 바람직한 일실시형태에 있어서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3ζ쇄로부터 유래된다.
하나 이상의 ITAM 모티프를 함유하는 T 세포 시그널링 도메인의 예로는 T 세포 수용체 T3ζ쇄 또는 CD247로도 알려진 CD3ζ 도메인이다. 이 도메인은 T 세포 수용체-CD3 복합체의 부분이며, T 세포의 주요 효과기 활성화로 항원 인식을 여러 세포내 시그널 전달 경로와 결합시키는 데 중요한 역할을 한다. 본원에 사용된 바와 같이, CD3ζ는 실질적으로 동일한 서열을 갖는 단백질을 포함한 Swissprot 엔트리 P20963으로부터 알려진 인간 CD3ζ 및 그것의 이소형을 주로 지향한다. 키메라 항원 수용체의 부분으로서, 완전한 T 세포 수용체 T3ζ쇄를 다시 필요로 하지 않으며, T 세포 수용체 T3ζ쇄의 시그널링 도메인을 포함하는 그것의 임의의 유도체가 적합하며, 그것의 임의의 기능적 등가물을 포함한다.
세포내 시그널링 도메인은 표 4의 도메인 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 참조 도메인 중 어느 하나에 대한 상동성이 약 50%~약 100%가 되도록 도메인이 변형 될 수 있다. 표 4의 도메인 중 어느 하나는 변형된 버전이 약 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 최대 약 100%의 상동성을 갖도록 변형될 수 있다.
CAR의 세포내 시그널링 영역은 하나 이상의 공동 자극 도메인을 더 포함할 수 있다. 세포내 시그널링 영역은 단일 공동 자극 도메인, 예를 들면 ζ-쇄(1세대 CAR), 또는 CD28 또는 4-1BB(2세대 CAR)를 포함할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포내 시그널링 영역은 2개의 공동 자극 도메인, 예를 들면 CD28/OX40 또는 CD28/4-1BB(3세대)를 포함할 수 있다.
CD8과 같은 세포내 시그널링 도메인과 함께, 이들 공동 자극 도메인은 유전자 전사 및 기능적 세포 반응을 지원하는 키나아제 경로의 다운스트림 활성화를 일으킬 수 있다. CAR의 공동 자극 도메인은 CD28(포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나아제) 또는 4-1BB/OX40(TNF-수용체-관련 인자 어댑터 단백질) 경로, 및 MAPK 및 Akt 활성화와 관련된 근위 시그널링 단백질을 활성화시킬 수 있다.
일부 경우에 있어서, CAR을 통해 발생된 시그널은 2차 또는 공동 자극 시그널과 복합화될 수 있다. 공동 자극 시그널링 도메인과 관련하여, 키메라 항원 수용체 유사 복합체는 여러 가능한 공동 자극 시그널링 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 미접촉 T 세포에 있어서 T 세포 수용체의 단순한 결합은 T 세포의 세포 독성 T 세포로의 완전한 활성화를 유도하기에 충분하지 않다. 완전하고 생산적인 T 세포 활성화에는 제 2 공동 자극 신호가 필요하다. T 세포 활성화를 위한 공동 자극을 제공하는 것으로 보고된 몇몇 수용체는 CD28, OX40, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), 4-1BBL, MyD88 및 4-1BB를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 공동 자극 분자에 의해 활용된 시그널링 경로는 1차 T 세포 수용체 활성화 시그널과 상승적으로 작용하는 공통의 특성을 공유한다. 이들 공동 자극 시그널링 영역은 하나 이상의 ITAM 모티프, 예를 들면 CD3ζ 시그널링 도메인으로부터 기원하는 주요 효과기 활성화 시그널과 상승작용할 수 있는 시그널을 제공하고, T 세포의 활성화에 대한 요건을 만족할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 키메라 항원 수용체 유사 복합체에 공동 자극 도메인을 추가함으로써, 조작된 세포의 효능 및 내구성을 향상시킬 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, T 세포 시그널링 도메인 및 공동 자극 도메인은 서로 융합하여 시그널링 영역을 구성한다.
[표 4] 공동 자극 도메인
Figure pct00004
일부 경우에 있어서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 및 SEQ ID NO: 66 중 어느 하나에 대해 약 50%~약 100%의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 그것의 부분을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 61~SEQ ID NO: 62 및 SEQ ID NO: 66 중 어느 하나에 대해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 67~SEQ ID NO: 75 중 어느 하나에 대해 약 50%~약 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다(표 5). 일부 경우에 있어서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 67~SEQ ID NO: 75 중 어느 하나에 대해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
[표 5] 예시적인 항-WT1 CAR들
Figure pct00005
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터
일부 실시형태에 있어서, 본 개시는 본원에 개시된 임의의 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시는 본원에 개시된 임의의 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 항원 결합 유닛 또는 세포외 항원 결합 유닛의 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
대상 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체는 재조합 DNA 기술, 합성 화학 기술, 또는 그것의 조합에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들면, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체의 소망의 성분을 인코딩하는 서열은 전형적으로 당업계에 공지된 표준 분자 기술을 사용하여 발현 벡터로 클로닝된다. 이들 서열은 소망의 단백질 서열을 인코딩하는 다른 벡터로부터, 각각의 주형 핵산을 사용하는 PCR-생성 단편으로부터, 또는 소망의 서열을 인코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드의 조립체에 의해 조립될 수 있다. 발현 시스템은 적합한 세포를 목적하는 항원 결합 유닛을 포함하는 발현 벡터로 형질 감염시킴으로써 생성될 수 있다.
기존 항체의 경쇄 또는 중쇄의 다양한 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 하이브리다이제이션, PCR, 및 DNA 서열화를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 통상적인 기술을 사용하여 용이하게 수득되고 서열화될 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포는 항체 뉴클레오티드 서열의 바람직한 소스의 역할을 한다. 다수의 모노클로날 항체를 생성하는 방대한 수의 하이브리도마 세포는 공공 또는 개인 저장소부터 수득될 수 있다. 가장 큰 기탁 기관은 American Type Culture Collection(atcc.org)이며, 이는 잘 특성화된 하이브리도마 세포주의 다양한 집단을 제공한다. 대안적으로, 항체 뉴클레오티드는 면역화된 또는 비면역화된 설치류 또는 인간으로부터 수득될 수 있으며, 비장 및 말초 혈액 림프구와 같은 장기를 형성할 수 있다. 항체 뉴클레오티드를 추출하고 합성하는 데 적용가능한 구체적인 기술은 Orlandi et al.(1989)　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A　86: 3833-3837; Larrick et al.(1989)　Biochem. Biophys. Res. Commun.　160:1250-1255; Sastry et al.(1989)　Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.　86: 5728-5732; 및 미국특허 제5,969,108호에 기술되어 있다.
또한, 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 상동성 비인간 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 코딩 서열로 치환함으로써 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 원래의 항원 결합 유닛의 결합 특이성을 보유하는 키메라 항체가 만들어진다.
또한, 본 발명에서 구현된 폴리뉴클레오티드는 예시된 폴리펩티드의 기능적 등가물 및 그것의 단편을 코딩하는 것을 포함하는 것으로 이해된다. 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 인코딩된 폴리펩티드의 특성을 향상시키고, 감소시키거나 또는 그 특성에 크게 영향을 미치지 않는 것을 포함한다. 기능적 등가물은 보존적 아미노산 치환, 융합을 포함하는 유사체, 및 돌연변이를 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
유전자 코드의 퇴화로 인해, 항원 결합 유닛 코딩 서열의 뉴클레오티드뿐만 아니라 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터의 구축에 적합한 서열에 상당한 변화가 있을 수 있다. 서열 변이체는 변형된 DNA 또는 아미노산 서열, 하나 이상의 치환, 결실, 또는 추가를 가질 수 있으며, 그것의 순 효과는 소망의 항원-결합 활성화를 보유하는 것이다. 예를 들면, 인코딩된 아미노산을 변경하지 않거나 보존적 변화를 초래하는 코딩 영역에서 다양한 치환이 이루어질 수 있다. 이들 치환은 본 발명에 의해 포함된다. 보존적 아미노산 치환은 하기 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 보존적 치환은 생성될 폴리펩티드에 함유된 하나 이상의 아미노산 잔기를 효과적으로 변화시키는 반면, 치환은 생성될 결과물인 항원 결합 유닛의 항원-결합 활성화를 방해하지 않을 것으로 기대된다. 인코딩된 아미노산 잔기를 변경하지 않는 뉴클레오티드 치환은 상이한 시스템에서 유전자 발현을 최적화하는 데 유용하다. 적합한 치환은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 발현 시스템에서의 바람직한 코돈 사용을 반영하기 위해서 수행된다. 예시적인 보존적 치환이 하기 표에 예시되어 있다.
[표 6]
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소망하는 경우, 본 개시의 재조합 폴리뉴클레오티드는 유전자 생성물의 발현 검출 및 정제를 용이하게 하는 비상동성 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 당업계에 공지되어 있으며, β-갈락토시다아제, β-락타마아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시페라아제, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 그들의 유도체와 같은 리포터 단백질을 인코딩하는 것을 포함한다. 정제를 용이하게 하는 그 밖의 이종 서열은 Myc, HA(인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌으로부터 유래됨), His-6, FLAG, 또는 면역 글로불린의 Fc 부분, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST) 및 말토오스-결합 단백질(MBP)과 같은 에피토프를 코딩할 수 있다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 다양한 화학적 기능성 모이어티에 접합될 수 있다. 흔히 채용된 모이어티는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있는 라벨, 시그널 펩티드, 면역학적 반응성을 향상시키는 작용제, 고체 지지체에 대한 결합을 촉진시키는 작용제, 백신 담체, 생물 반응성 개질제, 상자성 라벨 및 약물을 포함한다. 상기 모이어티는 재조합에 의해 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 폴리뉴클레오티드와 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 동일한 전사 유닛 내의 추가 인코딩 서열, 제어 요소, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 폴리아데닐화 부위, 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하에 있는 추가 전사 유닛, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 및 형질 전환을 허용하는 서열, 및 본 발명의 실시형태를 제공하는 데 바람직할 수 있는 임의의 이러한 구조를 포함할 수 있다.
본 발명에서 구현된 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 클로닝 방법, PCR 또는 그들의 임의의 조합을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에서 상세히 기술될 필요는 없다. 당업자는 본원에 제공된 서열 데이터를 사용하여 DNA 합성기를 채용하거나 상업적 서비스로부터 주문함으로써 소망의 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다.
소망의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 복제 및 증폭에 적합한 숙주 세포로 차례로 도입될 수 있는 적합한 벡터에 삽입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다양한 벡터를 포함한다. 본원에 개시된 항원 결합 유닛을 인코딩하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 발현 벡터의 선택가능한 라이브러리가 또한 제공된다.
본 발명의 벡터는 일반적으로 항원 결합 유닛을 발현하는 데 필요한 전사 또는 번역 제어 서열을 포함한다. 적합한 전사 또는 번역 제어 서열은 복제 원점, 프로모터, 인핸서, 리프레서 결합 영역, 전사 개시 부위, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 전사 및 번역에 대한 종결 부위를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
프로모터의 선택은 벡터가 도입된 숙주 세포에 따라 크게 달라질 것이다. 소망의 경쇄 또는 중쇄 유전자와 통상적으로 관련된 프로모터를 활용하는 것도 가능하며, 단 그러한 제어 서열은 숙주 세포 시스템과 양립할 수 있다. 또한, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 광범위한 조직 특이적 프로모터가 당업자에 이해 기술되고 채용되었다. 선택적인 동물 세포에서 작동하는 예시적인 프로모터는 간세포-특이적 프로모터 및 심근 특이적 프로모터를 포함한다. 수용자 세포 유형의 선택에 따라, 당업자는 본 발명의 발현 벡터의 구축에 적용가능한 그 밖의 적합한 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터를 알고 있을 것이다.
공지된 분자 클로닝 또는 유전자 조작 기술을 사용하여, 적절한 전사 제어 서열, 인핸서, 종결 인자, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 유전적 요소는 본 발명에 따라 발현될 온전한 선택가능한 융합 유전자와 작동 관계에 선택적으로 추가 통합될 수 있다. 상술한 요소 이외에도, 벡터는 선택가능한 마커(예를 들면, 벡터로 형질 전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 인코딩하는 유전자)를 함유할 수 있지만, 이러한 마커 유전자는 숙주 세포에 함께 도입된 다른 폴리뉴클레오티드 서열 상에 운반될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 몇몇 특정 용도를 갖는다. 그들은 예를 들면, 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체의 생성을 위한 발현 시스템에 있어서 유용하다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 소망의 폴리뉴클레오티드의 증폭에 영향을 주는 프라이머로서 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 백신, 진단, 및 약물을 포함하는 약학적 조성물에 있어서 유용하다.
본 발명의 숙주 세포는 그 중에서도 대상 폴리뉴클레오티드, 벡터의 저장소로서, 또는 그들의 항원 결합 특이성에 기초하여 소망의 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 생성하고 스크리닝하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 소망의 항원과 면역 반응성인 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 식별하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: (a) 항원 결합 유닛의 유전적으로 다양한 라이브러리를 준비하는 단계로서, 여기서 라이브러리는 적어도 하나의 대상 항원 결합 유닛을 포함하는, 단계; (b) 항원 결합 유닛의 라이브러리를 소망의 항원과 접촉시키는 단계; (c) 항원 결합 유닛과 항원 사이의 특이적 결합을 검출함으로써 소망의 항원과 면역 반응성인 항원 결합 유닛을 식별하는 단계.
소망의 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체의 능력은 당업계에 잘 확립된 다양한 절차에 의해 시험될 수 있다. Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Gherardi et al.(1990) J. Immunol. Meth. 126:61-68을 참조한다. 전형적으로, 소망의 결합 특이성을 나타내는 항원 결합 유닛은 면역 분석에 의해, 예를 들면 라벨링된 항원 결합 유닛을 고체 지지체 또는 기질에 고정된 항원과 반응시킴으로써 직접 검출될 수 있다. 일반적으로, 항원이 부착된 기질은 면역 분석 동안에 낮은 수준의 비특이적인 결합을 나타내는 재료로 제조된다. 고체 지지체의 예는 플라스틱 폴리머, 유리, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 반도체 재료, 및 금속 중 하나 이상의 재료로 제조된다. 일부 예에 있어서, 기질은 페트리 접시, 크로마토그래피 비드, 자성 비드 등이다.
이러한 고상 분석의 경우, 미반응 항원 결합 유닛은 세척에 의해 제거된다. 그러나, 액상 분석의 경우, 미반응 항원 결합 유닛은 여과 또는 크로마토그래피와 같은 일부 다른 분리 기술에 의해 제거된다. 라벨링된 항원 결합 유닛에 항원을 결합시킨 후, 결합된 라벨의 양을 결정한다. 이 기술의 변형은 항원이 원래의 결합 분자와의 포화 상태로 결합되는 경쟁 분석이다. 대상 항원 결합 유닛의 집단이 복합체에 도입될 때, 더 높은 결합 친화도를 나타내는 것들만이 경쟁할 수 있고, 따라서 항원에 결합된 채로 유지될 것이다.
대안적으로, 소정의 항원에 대한 특이적 결합은 세포 분류에 의해 평가될 수 있으며, 이것은 분류될 세포 상에 소망의 항원을 제시한 후, 검출가능한 작용제에 결합된 항원 결합 유닛으로 표적 세포를 라벨링하고, 이어서 세포 분류기에서 라벨링되지 않은 것들로부터 라벨링된 세포를 분리하는 것을 포함한다. 정교한 세포 분리 방법은 형광-활성화 세포 분류기(FACS)이다. 미세한 흐름으로 한 줄로 이동하는 세포는 레이저 빔을 통과하고, 형광 라벨링된 항원 결합 유닛에 의해 결합된 각각의 세포의 형광성이 측정된다.
용리된 항원 결합 유닛의 후속 분석은 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명하기 위한 단백질 서열화를 포함할 수 있다. 추론된 아미노산 서열에 기초하여, 항체 폴리펩티드를 인코딩하는 cDNA는 PCR, 라이브러리 스크리닝, 기존 핵산 데이터베이스에서의 상동성 검색, 또는 그들의 조합을 포함하는 재조합 클로닝 방법에 의해 수득될 수 있다. 흔히 채용되는 데이터베이스에는 GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, SWISS-PROT, EST, STS, GSS, 및 HTGS가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
항원 결합 유닛의 라이브러리가 파지 또는 박테리아 입자 상에 나타날 때, 친화성 크로마토그래피를 사용하여 선택하는 것이 바람직하다. 상기 방법은 전형적으로 파지 항원 결합 유닛의 라이브러리를 항원 코팅된 플레이트, 컬럼 매트릭스, 세포, 또는 비오티닐화된 항원과 용액 중에서 결합시킨 후 포획하는 것으로 진행된다. 고체상에 결합된 파지 또는 박테리아는 세척된 후 가용성 합텐, 산 또는 알칼리에 의해 용리된다. 대안적으로, 항원 농도의 증가는 친화성 매트릭스로부터 항원 결합 유닛을 해리시키는 데 사용될 수 있다. 항원에 대해 매우 높은 친화도 또는 결합성을 갖는 특정 항원 결합 유닛의 경우, 효율적인 용리에는 WO92/01047에 기재된 바와 같이 높은 pH 또는 약한 환원 용액을 필요로 할 수 있다.
선택의 효율은 세척 동안의 해리 동역학, 및 단일 파지 또는 박테리아 상의 다양한 항원 결합 유닛이 고체 지지체 상의 항원에 동시에 결합할 수 있는지의 여부를 포함한 여러 인자들의 조합에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 빠른 해리 동역학(및 약한 결합 친화도)을 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 디스플레이 및 고체 지지체에서의 높은 코팅 밀도의 항원을 사용함으로써 보유될 수 있다. 반대로, 느린 해리 동역학(및 양호한 결합 친화도)을 갖는 항원 결합 유닛의 선택은 긴 세척, 1가 파지, 및 낮은 코팅 밀도의 항원을 사용함으로써 선호될 수 있다.
소망하는 경우, 항원 결합 유닛의 라이브러리는 원치 않는 항원 결합 유닛을 대항-선택하기 위해 무관한 항원에 대하여 사전 선택될 수 있다. 라이브러리는 예를 들면, 항-이디오타입 항원 결합 유닛을 단리하기 위해 관련 항원에 대해 미리 선택될 수 있다.
본 발명의 숙주 세포
일부 실시형태에 있어서, 본 개시는 본원에 개시된 항원 결합 유닛 중 어느 하나를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 대상 숙주 세포는 전형적으로 본원에 개시된 항원 결합 유닛 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 벡터의 라이브러리로 형질 감염된 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 전기 천공법, 미세 투사물 충격(microprojectile bombardment); 리포펙션, 감염(벡터가 감염원에 결합된 경우), 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 그 밖의 물질을 채용하는 형질 감염을 포함한 다수의 적절한 수단 중 어느 하나에 의해 적합한 원핵 세포 또는 진핵 세포내로 도입될 수 있다. 벡터를 도입하는 수단의 선택은 숙주 세포의 특징에 따라 달라지는 경우가 있을 것이다.
대부분의 동물 세포의 경우, 상기 언급된 방법 중 임의의 것이 벡터 전달에 적합하다. 바람직한 동물 세포는 외인성으로 도입된 유전자 생성물을 대량으로, 예를 들면 밀리그램 수준으로 발현할 수 있는 척추동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포이다. 바람직한 세포의 비제한적인 예는 NIH3T3 세포, COS, HeLa 및 CHO 세포이다.
일단 적합한 숙주 세포내로 도입되면, 항원 결합 유닛의 발현은 당업계에 공지된 임의의 핵산 또는 단백질 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 경쇄 CDR 또는 중쇄 CDR의 전사된 mRNA의 존재, 또는 항원 결합 유닛은 통상적인 하이브리다이제이션 분석(예를 들면, 노던 블롯 분석), 증폭 절차(예를 들면, RT-PCR), SAGE(미국특허 제5,695,937호), 및 항원 결합 유닛 폴리뉴클레오티드의 임의의 영역에 상보적인 프로브를 사용하는 어레이 기반의 기술(예를 들면, 미국특허 제5,405,783호, 제5,412,087호 및 제5,445,934호 참조)에 의해 검출 및/또는 정량화될 수 있다.
또한, 벡터의 발현은 발현된 항원 결합 유닛을 검사함으로써 결정될 수 있다. 단백질 분석을 위한 다양한 기술이 당업계에 이용가능하다. 여기에는 방사선 면역 분석, ELISA(효소 결합 방사 면역 분석), "샌드위치" 면역 분석, 방사 면역 분석, 인시투 면역 분석(예를 들면, 콜로이드질 금, 효소 또는 방사성 동위 원소 라벨을 사용함), 웨스턴 블롯 분석, 면역 침강 분석, 면역 형광 분석이 포함된다.
항원 결합 유닛의 제조
일부 실시형태에 있어서, 본 개시는 본원에 개시된 임의의 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체의 제조 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원을 발현하기에 적합한 조건 하에서 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 발현된 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 단리시키는 단계를 포함한다.
발현된 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체는 당업계에 공지된 다양한 단백질 정제 기술을 이용하여 단리될 수 있다. 일반적으로, 항원 결합 유닛은 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 단리되지만, 시그널 펩티드 없이 직접 생성될 때는 숙주 세포 용해물 또는 박테리아 주변 세포질로부터 회수될 수 있다. 항원 결합 유닛이 막-결합된 경우, 당업자에 의해 일반적으로 채용되는 적합한 세척 용액에 의해 용해될 수 있다. 회수된 항원 결합 유닛은 염 침전(예를 들면, 황산암모늄에 의해), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 중성 pH에서 실행되고, 이온 강도가 증가하는 단계 구배로 용리되는 양이온성 또는 음이온성 교환 컬럼 상에서), 겔 여과 크로마토그래피(겔 여과 HPLC를 포함함), 태그-친화도 컬럼 상이나 단백질 A, 단백질 G, 히드록시아파타이트 및 항-면역 글로불린과 같은 친화성 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해 더 정제될 수 있다.
또한, 화학적 링커, 형광 염료와 같은 검출가능한 모이어티, 효소, 기질, 화학 발광 모이어티, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 비오틴과 같은 특이적 결합 모이어티, 또는 약물 접합체가 추가된, 유도체화된 면역 글로불린이 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
화학적 기능성 모이어티에 접합된 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체가 본원에 추가로 개시된다. 전형적으로, 상기 모이어티는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있는 라벨이다. 이들 접합된 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체는 예를 들면, 종양 크기의 정량화, 전이성 병소의 이미지화 및 종양 이미지화와 같은 검출 시스템에 있어서 유용하다. 이러한 라벨은 당업계에 공지되어 있으며, 방사성 동위 원소, 효소, 형광 화합물, 화학 발광 화합물, 생물 발광 화합물 기질 보조 인자 및 억제제가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 라벨의 사용을 교시하는 특허의 예에 대해서는 미국특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 참조한다. 상기 모이어티는 2차 시약, 예를 들면 제 2 항체, 단백질 A, 또는 비오틴-아비딘 복합체를 통해 항원 결합 유닛에 공유 결합되고, 항원 결합 유닛에 재조합적으로 결합되거나 접합될 수 있다.
다른 기능적 모이어티에는 시그널 펩티드, 면역학적 반응성을 향상시키는 작용제, 고체 지지체에 대한 결합을 촉진시키는 작용제, 백신 담체, 생물 반응성 개질제, 상자성 라벨 및 약물이 포함된다. 시그널 펩티드는 신호 펩티드는 세포막, 보통 진핵 세포의 소포체, 및 박테리아의 내막 또는 내막과 외막 모두를 통과하는 새롭게 합성된 단백질을 안내하는 짧은 아미노산 서열이다. 시그널 펩티드는 폴리펩티드의 N-말단 부분 또는 폴리펩티드의 C-말단 부분에 있을 수 있고, 세포로부터 폴리펩티드의 생합성과 분비 사이에서 효소적으로 제거될 수 있다. 이러한 펩티드는 합성된 분자의 분비를 허용하기 위해 항원 결합 유닛에 통합될 수 있다.
면역 반응성을 향상시키는 작용제에는 박테리아 슈퍼항원이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 고체 지지체와의 커플링을 촉진하는 작용제에는 비오틴 또는 아비딘이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 면역원 담체는 임의의 생리학적으로 허용가능한 완충제를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 생물 반응성 개질제는 사이토카인, 특히 종양 괴사 인자(TNF), 인터류킨-2, 인터류킨-4, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 및 γ-인터페론을 포함한다.
적합한 약물 모이어티는 항종양제를 포함한다. 비제한적인 예로는 방사성 동위 원소, 빈카알칼로이드, 예를 들면 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신 술페이트, 아드리아마이신, 블레오마이신 술페이트, 카보플라틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신 히드로클로라이드, 독소루비딘 히드로클로라이드, 에토포시드, 플루오로우라실, 로무스틴, 메클로레타민 히드로클로라이드, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토테인, 펜토스타틴, 피포브로만, 프로카르바제 히드로클로라이드, 스트렙토조토신, 탁솔, 티오구아닌, 및 우라실 머스타드가 포함된다.
항원 결합 유닛을 포함하는 면역 독소는 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. 다양한 면역 독소의 생성은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 상기 방법은 예를 들면, "Monoclonal Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet," Thorpe et al.(1982)　Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190; Vitatta(1987)　Science　238:1098-1104; 및 Winter and Milstein(1991)　Nature　349:293-299에서 찾을 수 있다. 적합한 독소는 리신, 방사성 핵종, 포키위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소, 리신 A쇄, 균류 독소, 예를 들면 레스트릭토신 및 포스포리파아제 효소를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로 "Chimeric Toxins," Olsnes and Pihl,　Pharmac. Ther.　15:355-381(1981); 및 "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy," eds. Baldwin and Byers, pp. 159-179, 224-266, Academic Press(1985)를 참조한다.
화학적으로 기능적인 모이어티는 예를 들면, 항원 결합 유닛 및 기능적 모이어티를 인코딩하는 융합 유전자를 생성함으로써 재조합적으로 만들어질 수 있다. 대안적으로, 항원 결합 유닛은 잘 확립된 다양한 화학적 절차 중 어느 것에 의해서도 모이어티에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들면, 모이어티가 단백질인 경우, 연결은 헤테로이작용성(heterobifunctional) 가교제, 예를 들면 SPDP, 카르보디이 미드글루타르알데히드 등에 의해 이루어질 수 있다. 상기 모이어티는 2차 시약, 예를 들면 2차 항체, 단백질 A 또는 비오틴-아비딘 복합체를 통해 공유 결합되거나 접합될 수 있다. 상자성 모이어티 및 그것의 항체와의 접합은 당업계에 널리 공지되어있다. 예를 들면, Miltenyi et al.(1990) Cytometry　11:231-238을 참조한다.
사용 방법
일실시형태에 있어서, 본 발명은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는 세포의 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 대상 키메라 항원 수용체와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 예에 있어서, 세포는 생체내에서 키메라 항원 수용체와 접촉된다. 다른 예에 있어서, 세포는 시험관내 또는 생체외(ex vivo)에서 키메라 항원 수용체와 접촉된다.
일부 예에 있어서, 세포는 암 세포이다. 예를 들면, 암 세포는 혈액암 세포, 고형 종양 암 세포, 중피종암 세포, 결장암 세포, 또는 장암 세포일 수 있다.
일실시형태에 있어서, 본 발명은 표적 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 복수의 숙주 세포를 표적 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 복수의 숙주 세포를 표적에 투여하는 단계는 상기 항원 결합 유닛 또는 키메라 항원 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산이 결핍되어 있는 숙주 세포의 유사량을 투여하는 것에 비해 더 많은 표적 세포 사멸을 유도한다.
일실시형태에 있어서, 복수의 숙주 세포는 생체내에서 표적 세포에 투여된다. 일부 예에 있어서, 복수의 숙주 세포는 시험관내 또는 생체외에서 표적 세포에 투여된다.
일부 예에 있어서, 표적 세포는 암 세포이다. 예를 들면, 암 세포는 혈액암 세포, 고형 종양 암 세포, 중피종암 세포, 결장암 세포 또는 장암 세포일 수 있다.
일실시형태에 있어서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 대상 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 숙주 세포를 투여하는 대상체에게 단계를 포함하며, 여기서 키메라 항원 수용체는 암 세포의 사멸을 유도한다. 일부 예에 있어서, 암은 혈액암, 고형 종양 암, 중피종암, 결장암 또는 장암이다.
일실시형태에 있어서, 본 개시는 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 대상 항원 결합 유닛, 또는 이를 포함하는 숙주 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 예에 있어서, 암은 혈액암, 고형 종양 암, 중피종암, 결장암 또는 장암이다.
일실시형태에 있어서, 본 개시는 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상 약학적 부형제 및 대상 항원 결합 유닛 또는 대상 키메라 항원 수용제를 포함하는 유효량의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 예에 있어서, 암은 혈액암, 고형 종양 암, 중피종암, 결장암 또는 장암이다.
본원에 개시된 방법에 의해 치료된 대상체에게 암 또는 고형 종양이 나타날 수 있다. 암 세포 또는 고형 종양 세포는 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 경우가 있다. 전형적으로, 종양 항원은 WT1 또는 WT1 펩티드, 예를 들면 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 WT1 펩티드이다. HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 발현하는 암 또는 고형 종양이 나타나는 대상체는 WT1-양성 암이 나타난다고 할 수 있다.
HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 발현하는 암은 간암, 위암, 식도암, 폐암, 유방암, 두경부암, 난소암, 신장암, 방광암, 자궁경부암, 췌장암, 지방 육종, 고환 비분화성 생식세포암, 흑색종, 선종, 부신암, 신경초종, 악성, 섬유성 조직구종, 중피종, 결장, 장 또는 그 임의의 조합을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 대상 방법은 위장관(GI tract)의 편평 세포암종 또는 선암, 신경 내분비암종의 치료에 적용가능하다. 추가로, 항-WT1-CAR-T 세포와 같은 본원에 개시된 면역 반응성 세포는 난소암종, 담도암종, 중피종, 유방암, 폐의 편평 세포암종, 자궁경부 상피내 종양, 자궁 경관의 편평 세포암종, 간내 및 간외암, 담낭암종, 침윤성 유관암종, 투명 세포암종, 호산성 과립세포종, 유두암종, 선암종, 유두암종, 및 유방의 소엽성 및 수질암종을 표적화하는 데 활용될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 암 또는 종양 세포는 유동 세포 분석법 또는 면역조직화학에 의해 WT1 발현을 평가할 수 있다. 암 또는 종양 세포에서 WT1의 수준은 낮음, 중간 또는 높음으로 분류될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 암 또는 종양 세포는 세포 표면 상에서 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 발현할 수 있다. HLA와 복합체화된 WT1 펩티드의 세포 표면 상에서의 발현은 예를 들면, 면역조직화학 또는 유동 세포 분석법과 같은 방법으로 WT1에 대한 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, WT1 mRNA 발현은 세포 표면 상에서의 WT1 발현과 상관관계가 있는 것으로 간주될 수 있고, 인시투 하이브리다이제이션 및 RT-PCR로부터 선택된 방법에 의해 결정될 수 있다.
대상 항-WT1 CAR을 인코딩하는 전이 유전자가 세포에 도입될 수 있다. 예를 들면, 전이 유전자는 T 세포와 같은 면역 반응성 세포에 도입될 수 있다. 세포내로 삽입될 때, 전이 유전자는 메신저 RNA(mRNA)의 복제인 상보적 DNA(cDNA) 세그먼트일 수 있거나, 게놈 DNA의 원래의 영역(인트론의 유무에 관계 없이)에 존재하는 유전자 자체일 수 있다.
전이 유전자 서열을 인코딩하는 핵산, 예를 들면 DNA는 세포의 염색체에 무작위로 삽입될 수 있다. 무작위 통합은 핵산, 예를 들면 DNA를 세포내로 도입하는 임의의 방법으로부터 발생할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법에는 전기 천공, 소노포레이션, 유전자총의 사용, 리포트랜스펙션, 인산칼슘 형질 감염, 덴드리머의 사용, 미세 주입, 및 아데노바이러스, AAV 및 레트로바이러스 벡터, 및/또는 II족 리보자임를 포함하는 바이러스 벡터의 사용이 있을 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
전이 유전자를 인코딩하는 DNA는 전기 천공법을 통해 세포내로 도입될 수 있다. 또한, DNA는 리포펙션, 감염, 또는 형질 전환을 통해 세포내로 도입될 수 있다. 1차 세포를 형질 감염시키기 위해 전기 천공 및/또는 리포펙션이 사용될 수 있다. 1차 조혈 세포를 형질 감염시키기 위해 전기 천공 및/또는 리포펙션이 사용될 수 있다. 또한, DNA는 상동성 재조합을 사용하지 않고도 세포 게놈에 도입될 수 있다. 일부 경우에 있어서, DNA은 게놈 내 표적화된 이중가닥 파괴 영역과 상보적인 조작된 부위들에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 경우에 있어서, DNA는 상동성 재조합 없이 이중가닥 파괴 영역에서 삽입될 수 있도록 다중 핵산으로부터 절단될 수 있다.
삽입될 전이 유전자는 게놈 내 표적화된 이중 가닥 파괴 부위와 유사한 조작된 부위들에 의해 플랭킹되어, 이중 가닥 파괴 영역에서 삽입될 수 있도록 다중 핵산으로부터 전이 유전자를 절단할 수 있다.
또한, 전이 유전자를 인코딩하는 DNA는 전이 유전자 또는 그것의 발현 생성물이 리포터 유전자의 활성화를 통해 검출될 수 있게 리포터 유전자를 포함하도록 설계될 수 있다. 상기 개시된 것들과 같은 임의의 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 리포터 유전자가 활성화된 세포를 세포 배양 시에 선택함으로써 전이 유전자를 함유하는 세포를 선택할 수 있다.
대상 항-WT1 CAR의 발현은 발현 분석, 예를 들면 qPCR에 의해 또는 RNA의 수준을 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 발현 수준은 복제본 수를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 발현 수준이 매우 높은 경우, 이는 2개 이상의 CAR의 복제본이 게놈에 통합되었음을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 높은 발현은 고도로 전사된 영역, 예를 들면 고도로 발현된 프로모터 근방에서 전이 유전자가 통합되었음을 나타낼 수 있다. 웨스턴 블롯팅과 같은 단백질 수준의 측정에 의해서도 발현을 확인할 수 있다.
대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 하나 이상의 전이 유전자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 전이 유전자는 항원 상의 하나 이상의 에피토프(예를 들면, HLA와 복합체화된 WT1 펩티드)를 인식하고 결합하는 CAR 단백질을 발현하거나, 항원 상의 돌연변이된 에피토프에 결합할 수 있다. CAR은 기능적 CAR일 수 있다. 또한, 본 발명의 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 하나 이상의 CAR을 포함할 수 있거나, 또는 단일 CAR 및 2차 조작된 수용체를 포함할 수 있다.
전이 유전자는 자살 유전자를 인코딩할 수 있다. 암 환자의 많은 효과적인 치료에서 입증된 바와 같이, CAR 면역 반응성 세포에 반응하는 객관적인 종양 퇴행은 독성이 동반될 수 있다. 일부 경우에 있어서, CAR 면역 반응성 세포는 표적화된 항원이 그들 사이에 공유될 때 종양 조직과 정상 조직을 구별하지 못할 수 있다("온-타깃/오프-종양(on-target/off-tumor)" 독성). 다른 경우에는, 사이토카인 방출 증후군(CRS)이라고 알려진 면역계의 전신성 교란이 발생할 수 있다. 상기 CRS는 전신성 염증 반응 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 포함할 수 있으며, 이는 CAR 면역 반응성 세포의 생체내 급속한 확장의 결과일 수 있다. CRS는 열과 저혈압을 특징으로하는 증상이며, 심한 경우에는 복합 장기 부전으로 이어질 수 있다. 대부분의 경우, 상기 독성은 주입된 CAR 면역 반응성 세포의 생체내 확장과 관련이 있으며, 이는 면역계의 일반적인 교란 및 TNFα 및 IL-6과 같은 높은 수준의 전 염증성 사이토카인의 방출을 유발할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 정상 조직과 공유되는 항원을 표적화하는 CAR 면역 반응성 세포는 예를 들면, 수용체를 인코딩하는 mRNA의 전기 천공 후에 CAR을 일시적으로 발현하도록 생성될 수 있다. 또한, 심각한 온-타깃 독성이 있는 경우에 CAR 면역 반응성 세포의 극적인 제거를 허용할 수 있는 안전 스위치를 포함시킴으로써 CAR 면역 반응성 세포를 추가 조작하려는 상당한 노력이 존재한다. CAR을 인코딩하는 벡터는 유도성 카스파아제-9 유전자(이량체화의 화학적 유도제에 의해 활성화됨) 또는 EGF 수용체 R의 절단된 형태(모노클로날 항체 세툭시맙에 의해 활성화됨) 또는 RQR8과 같은 안전 스위치와 조합될 수 있다.
대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 자살 유전자 전이 유전자를 인코딩할 수 있다. 또한 상기 전이 유전자는 CAR 수용체 또는 다른 유사한 수용체를 포함할 수 있다. 자살 유전자는 CAR 면역 반응성 세포의 제거를 유도할 수 있다. 자살 유전자는 상기 CAR 면역 반응성 세포에서 아포토시스를 유도하는 임의의 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 항-WT1 CAR과 함께 바이러스 벡터 내에서 인코딩될 수 있다.
하나 이상의 전이 유전자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 전이 유전자는 인간 유전자, 마우스 유전자, 래트 유전자, 돼지 유전자, 소 유전자, 개 유전자, 고양이 유전자, 원숭이 유전자, 침팬지 유전자, 또는 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 전이 유전자는 인간 유전자 서열을 갖는 인간 유래일 수 있다. 하나 이상의 전이 유전자는 인간 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 하나 이상의 전이 유전자는 아데노바이러스 유전자가 아니다.
전이 유전자는 상기 기재된 바와 같이 무작위 또는 부위-특이적 방식으로 면역 반응성 세포의 게놈 내에 삽입될 수 있다. 예를 들면, 전이 유전자는 면역 반응성 세포의 게놈 내 무작위 유전자좌에 삽입될 수 있다. 이들 전이 유전자는 기능적이고, 예를 들면 게놈 내 어느 부위든지 삽입될 경우에 완전히 기능적일 수 있다. 예를 들면, 전이 유전자는 그 자신의 프로모터를 인코딩할 수 있거나 또는 내인성 프로모터의 제어 하에 있는 위치에 삽입될 수 있다. 대안적으로, 전이 유전자는 유전자의 인트론 또는 유전자의 엑손, 프로모터 또는 비코딩 영역과 같은 유전자에 삽입될 수 있다. 전이 유전자는 상기 삽입이 유전자, 예를 들면 내인성 면역 체크포인트를 파괴하도록 삽입될 수 있다.
전이 유전자의 2개 이상의 본제본이 게놈 내 무작위 유전자좌보다 많이 삽입될 수 있다. 예를 들면, 게놈 내 무작위 유전자좌에 여러 복제본이 삽입될 수 있다. 이것은 전이 유전자가 무작위로 한번 삽입된 경우보다 전반적인 발현이 증가할 수 있다. 대안적으로, 전이 유전자의 복제본이 유전자에 삽입될 수 있고, 전이 유전자의 또 다른 본제본이 상이한 유전자에 삽입될 수 있다. 전이 유전자는 면역 반응성 세포의 게놈 내 특정 유전자좌에 삽입될 수 있도록 표적화될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상 항-WT1 CAR을 인코딩하는 서열을 포함하는 다중 핵산은 플라스미드 벡터의 형태를 취할 수 있다. 플라스미드 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는 프로모터가 구성적일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 프로모터는 유도적일 수 있다. 프로모터는 CMV, U6, MND, 또는 EF1a일 수 있거나 이들로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 프로모터는 CAR 서열에 인접할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 플라스미드 벡터는 스플라이싱 억셉터를 더 포함한다. 일부 경우에 있어서, 스플라이싱 억셉터는 본 발명의 CAR 서열에 인접할 수 있다. 프로모터 서열은 PKG 또는 MND 프로모터일 수 있다. MND 프로모터는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역 골수증식성 육종 바이러스 인핸서를 함유하는 합성 프로모터일 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상 항-WT1 CAR을 인코딩하는 다중 핵산은 비바이러스 기술에 의해 세포로 전달되도록 설계될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 다중 핵산은 우수 제조 관리 기준(GMP)을 만족하는 시약일 수 있다.
대상 항-WT1 CAR을 인코딩하는 다중 핵산의 발현은 하나 이상의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 프로모터는 편재적(ubiquitous), 구성적(관련 유전자의 지속적인 전사를 허용하는 비조절된 프로모터), 조직-특이적 프로모터 또는 유도적 프로모터일 수 있다. 프로모터에 인접하여 또는 프로모터 근방에 삽입되는 전이 유전자의 발현은 조절될 수 있다. 예를 들면, 전이 유전자는 편재적 프로모터 근방 또는 옆에 삽입될 수 있다. 일부 편재적 프로모터는 CAGGS 프로모터, hCMV 프로모터, PGK 프로모터, SV40 프로모터, 또는 ROSA26 프로모터일 수 있다.
프로모터는 내인성 또는 외인성일 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 전이 유전자는 내인성 또는 외인성 ROSA26 프로모터에 인접하여 또는 그 근방에 삽입될 수 있다. 또한, 프로모터는 면역 반응성 세포에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 전이 유전자가 돼지의 ROSA26 프로모터에 인접하여 또는 그 근방에 삽입될 수 있다.
조직 특이적 프로모터 또는 세포-특이적 프로모터는 발현 위치를 제어하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 전이 유전자는 조직-특이적 프로모터에 인접하여 또는 그 근방에 삽입될 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 FABP 프로모터, Lck 프로모터, CamKII 프로모터, CD19 프로모터, 케라틴 프로모터, 알부민 프로모터, aP2 프로모터, 인슐린 프로모터, MCK 프로모터, MyHC 프로모터, WAP 프로모터, 또는 Col2A 프로모터일 수 있다.
조직 특이적 프로모터 또는 세포-특이적 프로모터는 발현 위치를 제어하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 전이 유전자는 조직-특이적 프로모터에 인접하여 또는 그 근방에 삽입될 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 FABP 프로모터, Lck 프로모터, CamKII 프로모터, CD19 프로모터, 케라틴 프로모터, 알부민 프로모터, aP2 프로모터, 인슐린 프로모터, MCK 프로모터, MyHC 프로모터, WAP 프로모터, 또는 Col2A 프로모터일 수 있다.
유도적 프로모터도 사용될 수 있다. 이들 유도적 프로모터는 필요에 따라 유도제를 첨가하거나 제거함으로써 작동되거나 작동되지 않을 수 있다. 유도적 프로모터에는 Lac, tac, trc, trp, araBAD, phoA, recA, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, PL, cspA, T7, VHB, Mx, 및/또는 Trex가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아님을 고려한다.
또한, 발현에 필요한 것은 아니지만, 전이 유전자 서열에는 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 유입 부위, 2A 펩티드 및/또는 폴리아데닐화 시그널을 인코딩하는 서열이 포함될 수도 있다.
일부 경우에 있어서, 전이 유전자는 대상 항-WT1 CAR을 인코딩하고, 여기서 전이 유전자는 항-WT1 CAR이 발현되도록 세이프 하버(safe harbor) 내로 삽입된다. 일부 경우에 있어서, 전이 유전자는 PD1 및/또는 CTLA-4 유전자좌 내로 삽입된다. 다른 경우에 있어서, 전이 유전자는 무작위 삽입을 위해 렌티바이러스 내의 세포로 전달되는 반면, PD1- 또는 CTLA-4 특이적 뉴클레아제는 mRNA로서 공급될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 전이 유전자는 레트로바이러스, AAV 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터 시스템을 통해 세이프 하버(예를 들면, AAVS1, CCR5, 알부민 또는 HPRT)에 대해 특이적인 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA와 함께 전달된다. 또한, 세포는 PD1 및/또는 CTLA-4 특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA로 처리될 수 있다. 일부 경우에 있어서, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 전달 시스템을 통해 HPRT 특이적 뉴클레아제 및 PD 1- 또는 CTLA-4 특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA와 함께 공급된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 CAR에는 1세대, 2세대 및 3세대 설계를 포함한 모든 유형의 이들 키메라 단백질이 포함된다. CCR2 또는 siRNA와 같은 그 외의 작용제는 PD-1 발현을 감소시키기 위해 적용될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 전이 유전자를 면역 반응성 세포내로 도입시키기 위해 레트로바이러스 벡터(γ-레트로바이러스 또는 렌티바이러스)가 채용될 수 있다. 예를 들면, CAR(예를 들면, 항-WT1 CAR), 또는 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 결합하는 임의의 수용체는 레트로바이러스 벡터에 클로닝될 수 있고, 그것의 내인성 프로모터로부터, 레트로바이러스 긴 말단 반복순서로부터, 또는 목적하는 표적 세포 유형에 대해 특이적인 프로모터로부터 발현될 수 있다. 비바이러스 벡터도 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜이나 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 들 수 있다.
포유동물 세포로 유전자를 전달하기 위해 다수의 바이러스 기반의 시스템이 개발되었다. 예를 들면, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 간편한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 알려진 기술을 이용하여 벡터 내로 삽입되고 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 전이 유전자의 장기간의 안정된 통합 및 딸 세포에서의 그것의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간의 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비증식성 세포를 형질 도입할 수 있다는 점에서 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 온코-레트로바이러스로부터 유래된 벡터보다 더 많은 이점을 갖는다. 또한, 이들은 낮은 면역원성을 갖는다는 추가적인 이점이 있다. 아데노바이러스 벡터는 표적 세포의 게놈 내로 통합되지 않기 때문에 부정적인 통합-관련 이벤트를 회피한다는 이점을 갖는다.
세포는 대상 CAR을 인코딩하는 전이 유전자로 형질 감염될 수 있다. 전이 유전자 농도는 약 100피코그램~약 50마이크로그램일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포내로 도입될 수 있는 핵산(예를 들면, ssDNA, dsDNA, RNA)의 양은 형질 감염 효율 및/또는 세포 생존능을 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 예를 들면, 전기 천공을 위해 각각의 세포 샘플에 1마이크로그램의 dsDNA가 첨가될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 최적의 형질 감염 효율 및/또는 세포 생존능에 필요한 핵산(예를 들면, dsDNA)의 양은 세포 종류에 대해 특이적일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 각각의 샘플에 사용되는 핵산(예를 들면, dsDNA)의 양은 형질 감염 효율 및/또는 세포 생존능에 직접 대응될 수 있다. 예를 들면, 형질 감염의 농도 범위. 벡터에 의해 인코딩된 전이 유전자는 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 벡터에 의해 인코딩된 전이 유전자의 통합은 순방향으로 일어난다. 다른 경우에 있어서, 벡터에 의해 인코딩된 전이 유전자의 통합은 역방향으로 일어난다.
일부 경우에 있어서, 대상 CAR의 바이러스 전달 등의 세포 변형을 위한 개시 세포 밀도는 형질 감염 효율 및/또는 세포 생존능을 최적화하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 바이러스 벡터에 의한 세포의 형질 감염 또는 형질 도입을 위한 개시 세포 밀도는 약 1×105 세포 미만일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 바이러스 벡터에 의한 세포 변형을 위한 개시 세포 밀도는 적어도 약 1×105 세포~적어도 약 5×107 세포일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 형질 감염 효율 및/또는 세포 생존능에 대해 최적인 개시 세포 밀도는 세포 종류에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들면, 1.5×106 세포의 개시 세포 밀도는 매크로파지 세포에 대해 최적일 수 있다(예를 들면, 가장 높은 생존능 및/또는 형질 감염 효율을 제공함). 다른 예에 있어서, 5×106 세포의 개시 세포 밀도는 인간 세포에 대해 최적일 수 있다(예를 들면, 가장 높은 생존능 및/또는 형질 감염 효율을 제공함). 일부 경우에 있어서, 다양한 개시 세포 밀도가 소정의 세포 유형에 대해 최적일 수 있다. 예를 들면, 5.6×106~5×107 세포의 개시 세포 밀도는 T 세포와 같은 인간 세포에 대해 최적일 수 있다(예를 들면, 최대 생존능 및/또는 형질 감염 효율을 제공함).
예를 들면 바이러스 시스템을 이용하여 대상 CAR을 인코딩하는 핵산 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 효율은 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.9% 초과일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 조작된 세포의 세포막 상에서의 대상 CAR의 검출은 유동 세포 분석법으로 측정했을 때, 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.9% 초과일 수 있다.
일부 경우에 있어서, 면역 반응성 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L+(L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및/또는 IL-7Rα+로 구성된 줄기 기억 TSCM 세포일 수 있고, 또한, 상기 줄기 기억 세포는 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및/또는 LFA-1을 발현할 수 있으며, 상기 줄기 기억 세포에 특징적인 많은 기능적 속성이 나타난다. 대안적으로, 또한 면역 반응성 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 포함하는 중심 기억 TCM 세포일 수 있으며, 여기서 중심 기억 세포는 예를 들면, IL-2를 분비할 수 있지만 IFNγ 또는 IL-4는 분비할 수 없다. 또한, 면역 반응성 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 포함하는 효과기 기억 TEM 세포일 수도 있으며, 예를 들면 IFNγ 및 IL-4와 같은 효과기 사이토카인을 생성한다.
벡터는 후술하는 바와 같이 전신 투여(예를 들면, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 개별 환자에게 생체내 투여될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 개별 환자로부터 체외 이식된 세포와 같은 생체외 세포로 전달된 다음(예를 들면, 림프구, T 세포, 골수 흡입물, 조직생검), 보통은 벡터가 통합된 세포를 선택한 후에 상기 세포를 환자에게 재이식한다. 선택 전 또는 선택 후에 상기 세포는 확장될 수 있다.
항-WT1 CAR을 발현하는 적절한 면역 반응성 세포는 필요로 하는 대상체에 대해 자가 또는 비자가 세포일 수 있다.
적절한 면역 반응성 세포의 소스는 대상체로부터 수득될 수 있다. 일부 경우에 있어서, T 세포가 수득될 수 있다. 상기 T 세포는 PBMC, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 및 감염 부위, 복수, 흉수, 비장 조직, 및 종양으로부터의 조직을 포함한 여러 소르로부터 수득될 수 있다. 특정 경우에, T 세포는 FicollTM 분리와 같은 당업자에게 공지된 많은 기술을 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 유닛으로부터 수득될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 개체의 순환하는 혈액으로부터의 새포는 성분 채집술에 의해 수득된다. 성분 채집의 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 그 밖의 핵화 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한 림프구를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 성분 채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 완충제 또는 매질에 배치하기 위해 세척될 수 있다.
대안적으로, 세포는 건강한 공여자로부터, 암으로 진단된 환자로부터, 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 세포는 상이한 표현형 특성을 나타내는 세포의 혼합된 세포 집단의 부분일 수 있다. 또한, 세포주는 상술한 방법에 따라 형질 전환된 T 세포로부터 수득될 수 있다. 또한, 세포는 세포 치료 은행으로부터 수득될 수 있다. 면역 억제 치료에 내성인 변형된 세포는 본원에 설명된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 소망의 세포 집단은 변형 전에 선택될 수 있다. 또한, 조작된 세포 집단은 변형 후에 선택될 수 있다. 조작된 세포는 자가 이식에 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 동종 이식에 사용될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 암-관련 표적 서열을 식별하기 위해 샘플이 사용된 동일한 환자에게 투여된다. 다른 경우에 있어서, 세포는 암-관련 표적 서열을 식별하기 위해 샘플이 사용된 환자와는 다른 환자에게 투여된다.
일부 경우에 있어서, 면역 반응 세포는 1차 T 세포, 줄기 세포, 또는 전구 세포를 포함한 1차 세포일 수 있다. 전구 세포는 조혈 전구 세포일 수 있다. 본 발명의 세포는 인간 세포일 수 있다. 적합한 세포는 생체외 확장이 가능하다. 또한, 적합한 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+), IL-7Rα(+), 또는 그들의 조합일 수 있다.
일부 경우에 있어서, 적절한 1차 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 말초 혈액 림프구(PBL), 및 그 밖의 혈액 세포 서브세트들, 예를 들면 T 세포, 내추럴 킬러 세포, 단핵구, 내추럴 킬러 T 세포, 단핵구-전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 비만능 줄기 세포를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 일부 경우에 있어서, 세포는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 임의의 다른 유형의 T 세포와 같은 종양 침윤 세포(TIL) 등의 임의의 T 세포를 포함한 임의의 면역 세포일 수 있다. 또한, T 세포는 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 또는 효과기 T 세포를 포함할 수 있다. 또한, T 세포는 벌크 집단으로부터 선택될 수 있고, 예를 들면 전혈로부터 T 세포를 선택할 수 있다. 또한, T 세포는 벌크 집단으로부터 확장될 수 있다. 또한, T 세포는 특정 집단 및 표현형으로 왜곡될 수 있다. 예를 들면, T 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) 및/또는 IL-7Rα(+)를 표현형적으로 포함하도록 왜곡될 수 있다. CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) 및/또는 IL-7Rα(+)를 포함하는 목록으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 적합한 세포를 선택할 수 있다. 또한, 적합한 세포는 줄기 세포를 포함할 수 있으며, 이것의 예로는 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포가 포함된다. 적합한 세포는 인간 세포, 비인간 세포, 및/또는 마우스 세포와 같은 다수의 1차 세포를 포함할 수 있다. 적합한 세포는 전구 세포일 수 있다. 적합한 세포는 치료될 대상체(예를 들면: 환자)로부터 유래될 수 있다. 적합한 세포는 인간 공여자로부터 유래될 수 있다. 적합한 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L+(L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+로 구성된 줄기 기억 TSCM 세포일 수 있고, 또한 상기 줄기 기억 세포는 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1를 발현할 수 있으며, 상기 줄기 기억 세포에 특징적인 여러 기능적 속성이 나타난다. 적합한 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 포함하는 중심 기억 TCM 세포일 수 있으며, 상기 중심 기억 세포는 예를 들면, IL-2를 분비할 수 있지만 IFNγ 또는 IL-4는 분비할 수 없다. 또한, 적합한 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7를 포함하는 효과기 기억 TEM 세포일 수 있으며, 예를 들면 IFNγ 및 IL-4와 같은 효과기 사이토카인을 생성할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 방법은 세포의 급속한 확장에 앞서, CD8+ T 세포의 배양된 T 세포를 풍부화하는 것을 포함할 수 있다. IL-2에서 T 세포의 배양 후, 상기 T 세포는 예를 들면, CD8 마이크로비드 분리(예를 들면, CliniMACSplus CD8 마이크로비드 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용)를 사용하여 CD4+ 세포를 고갈시키고 CD8+ 세포를 풍부화할 수 있다. 특정 이론에 얽매이는 일 없이 CD4+, CD25+ 조절 T 세포가 항-종양 반응을 방해할 수 있다고 여겨질 수 있다. 따라서, CD8+ T 세포의 배양된 T 세포를 풍부화하고 CD4+ 세포를 감소시키거나 제거함으로써 입양 전달된(adoptively transferred) 항-종양 CD8+ 세포의 영향을 개선하고, 환자의 반응 속도를 향상시키며 및/또는 CD4+ 세포에 의한 사이토카인 생성에 의해 나타내어지는 독성을 감소시킬 수 있다고 여겨질 수 있다. 또한, 강화된 CD8+ "젊은" T 세포는 임상적 규모의 급속한 확장에 있어서 벌크 T 세포보다 더 신뢰성 있고 더 예측가능하게 거동한다고 여겨질 수 있다.
세포는 우수 제조 관리 기준(GMP)을 만족하는 시약일 수 있다. 세포는 암, 감염, 자가 면역 질환, 또는 이식편 대 숙주병(GVHD)을 치료하기 위한 병용 요법의 부분일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 본 발명의 세포는 단일 요법으로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상 CAR을 발현하는 세포에는 혼성 T 세포 집단이 포함된다. 일부 경우에 있어서, 사용된 세포는 크게 CD4와 CD8T 세포의 혼성 비율로 구성될 수 있다. 상기 CD4 및 CD8 세포는 순환하는 효과기 T 세포의 표현형 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 CD4 및 CD8 세포는 효과기-기억 세포의 표현형 특징을 가질 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 세포는 중심-기억 세포일 수 있다.
공여자로부터 단리될 수 있는 적합한 세포는 태아, 신생아, 청소년 및 성인을 포합하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 예를 들면, 공여자 면역 반응성 세포는 성인 인간으로부터 단리될 수 있다. 공여자 인간 면역 반응성 세포는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1세 미만일 수 있다. 예를 들면, 면역 반응성 세포는 6세 미만의 인간으로부터 단리될 수 있다. 또한, 면역 반응성 세포는 3세 미만의 인간에게서 단리될 수 있다. 공여자 연령은 10세보다 많을 수 있다.
적합한 세포를 얻는 방법은 소정의 마커에 기초하여 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 마커는 GFP, 저항성 유전자, 세포 표면 마커, 또는 내인성 태그를 포함할 수 있다. 세포는 내인성 마커를 사용하여 선택될 수 있다. 적용가능한 세포 선택 기술에는 유동 세포 분석법 및/또는 자성 컬럼이 포함된다. 선택된 세포는 그 후에 대상체에게 주입될 수 있다. 또한, 선택된 세포는 많은 수로 확장될 수 있다. 선택된 세포는 주입 전에 확장될 수 있다.
환자에서 치료학적으로 효과적이게 되는 데 필요한 세포의 양은 세포의 생존능, 및 세포가 유전적으로 변형된 효율(예를 들면, 전이 유전자가 하나 이상의 세포로 통합되는 효율, 또는 전이 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현 수준)에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우에 있어서, 유전적 변형 후 세포의 생존능(예를 들면, 증식) 및 전이 유전자의 통합 효율의 산물은 대상체에게 투여하는 데 이용가능한 세포의 치료학적 분취량에 상응할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 유전자 변형 후 세포의 생존능의 증가는 환자에게 치료학적으로 효과적이기 위한 투여에 필요한 세포의 양의 감소에 상응할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 전이 유전자가 하나 이상의 세포로 통합되는 효율의 증가는 환자에게 치료학적으로 효과적이기 위한 투여에 필요한 세포의 양의 감소에 상응할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 치료적으로 효과적이게 되는 데 필요한 세포의 양을 결정하는 것은 시간 경과에 따른 세포의 생존능의 변화에 대응하는 기능을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 치료적으로 효과적이게 되는 데 필요한 세포의 양을 결정하는 것은 시간 의존성 변수(예를 들면, 세포 배양 시간, 전기 천공 시간, 세포 자극 시간)와 관련하여 전이 유전자가 하나 이상의 세포로 통합되는 효율의 변화에 대응하는 기능을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 치료학적으로 효과적인 세포는 세포 표면 상의 항-WT1 CAR을 약 30%~약 100% 발현하는 세포의 집단일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 치료학적으로 효과적인 세포는 유동 세포 분석법으로 측정했을 때, 세포 표면 상의 항-WT1 CAR을 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.9% 초과까지 발현할 수 있다.
상술한 바와 같이 대상 CAR을 발현하는 데 다양한 세포들이 사용될 수 있다. 항-WT1 CAR은 포유동물 세포와 같은 진핵 세포의 원형질막에 존재할 수 있으며, 여기서 적절한 포유동물 세포의 예로는 세포 독성 세포, T 림프구, 줄기 세포, 줄기 세포의 자손, 전구 세포, 전구 세포의 자손, 및 NK 세포가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
진핵 세포의 원형질막에 존재하는 경우, 대상 CAR은 그것의 결합 표적의 존재 하에 활성화될 수 있다. 예를 들면, 항-WT1 CAR은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드의 존재 하에 활성화될 수 있다. WT1 펩티드와 같은 표적은 막 상에서 발현될 수 있다. 또한, 표적은 가용성(예를 들면, 세포에 결합하지 않음)일 수 있다. 표적은 표적 세포와 같은 세포의 표면에 존재할 수 있다. 표적은 지질 이중층 등과 같은 고체 표면 상에 존재할 수 있다. 표적은 가용성 항원과 같이 가용성일 수 있다. 표적은 항원일 수 있다. 항원은 표적 세포와 같은 세포 표면 상에 존재할 수 있다. 항원은 지질 이중층 등과 같은 고형 표면 상에 존재할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 표적은 항원의 에피토프일 수 있다. 본원에 개시된 방법에 있어서, 항원은 전형적으로 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드이고, 표적 세포를 발현하는 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드는 암 또는 종양 세포이다.
일부 경우에 있어서, 세포의 원형질막에 존재하는 경우 및 그것의 표적 결합에 의해 활성화되는 경우의 대상 CAR은 CAR의 결합 도메인이 결합하는 항원을 그것의 세포 표면 상에서 발현하는 표적에 대해 세포에 의한 세포 독성 활성이 일어날 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에 있어서 세포는 세포 독성 세포(예를 들면, NK 세포 또는 세포 독성 T 림프구)일 수 있으며, 세포의 원형질막에 존재하는 경우 및 그것의 표적 결합에 의해 활성화되는 경우의 본 개시의 CAR은 CAR의 결합 도메인이 결합하는 항원을 그것의 세포 표면 상에서 발현하는 표적 세포에 대해 세포 독성 세포의 세포 독성 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에 세포는 NK 세포 또는 T 림프구일 수 있으며, 세포의 원형질막에 존재하는 경우 및 그것의 표적 결합에 의해 활성화되는 경우의 본 개시의 CAR은 결합 표적이 없을 때의 세포의 세포 독성 활성에 비해 세포의 세포 독성 활성이 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 10배 이상 증가될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 그것의 표적 결합에 의해 활성화되는 경우의 대상 CAR은 증식 및 확장(증가된 세포 분열 또는 항-세포 자멸 반응으로 인한)과 같은 다른 CAR 활성 관련 이벤트를 일으킬 수 있다. 세포 확장은 현미경으로 볼 때 세포 클럼핑이 관찰됨으로써 시각적으로 측정될 수 있다. 세포 확장은 혈구 계수기 측정에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에 있어서, CAR-T 세포는 비교가능한 T 세포, 비-CAR T 세포에 비해 증가된 세포 증식 및 확장을 가질 수 있다. 증가된 세포 확장은 비교가능한 세포의 약 1배~약 20배일 수 있다. 증가된 세포 확장은 비교가능한 세포의 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 최대 20배일 수 있다. 세포 확장은 일정 시간의 기간 동안 측정될 수 있다. 예를 들면, 세포 확장은 세포 취득으로부터 대상체에게의 주입 시간에 걸쳐 일어날 수 있다. 다른 경우에 있어서, 세포 확장은 취득 후 약 1일~최대 약 30일 사이에 일어날 수 있다. 세포 확장은 취득 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 최대 30일 사이에 일어날 수 있다. 일부 경우에 있어서, 대상체에게 주입하기 전에 세포를 확장시키기 위해서 급속한 확장 프로토콜(REP)이 활용될 수 있다. 일부 경우에 있어서, REP는 약 14일에 걸쳐 일어날 수 있다.
일부 경우에 있어서, 그것의 표적 결합에 의해 활성화되는 경우의 CAR은 세포 시그널링 변조, 세포 분화, 또는 세포 사멸과 같은 다른 CAR 활성 관련 이벤트를 일으킬 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포 상에서의 CAR 발현은 세포의 세포내 시그널링을 변경할 수 있다. 다른 경우에 있어서, CAR의 발현은 세포 분화를 변경시킬 수 있다.
하나 이상의 사이토카인은 대상 CAR 또는 그것을 포함하는 숙주 세포와 함께 도입될 수 있다. 사이토카인은 전달된 세포(입양 전달된 종양-특이적 세포 포함)를 종양 미세환경 내에서 확장시키도록 부스팅하는 데 활용될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 세포들의 확장을 용이하게 하기 위해 IL-2가 사용될 수 있다. 또한, IL-15와 같은 사이토카인이 채용될 수 있다. IL-2, IL-7, IL-12, 및 L-21, 또는 그들의 임의의 조합과 같은 그 밖의 적절한 사이토카인들이 면역 치료의 분야에 활용될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 재조합 사이토카인이 사용된다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 대상 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)의 기능은 면역 반응성 세포를 IL-12에 노출시킴으로써 향상될 수 있다. 일부 경우에 있어서, IL-12는 면역 조절 활성을 가질 수 있으며 효과기 T 세포, 활성화된 NK 세포, 또는 양방의 기능을 향상시킬 수있다.
일부 실시형태에 있어서, 대상 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포는 IL-12를 포함하고, 이것에 의해 면역 반응성 세포를 IL-12에 노출시킨다. 일부 경우에 있어서, IL-12는 면역 반응성 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 경우에 있어서, IL-12는 면역 반응성 세포내에서 발현된다. 예를 들면, 도 11은 대상 CAR 및 IL-12를 포함하는 예시적인 유전자 구조를 도시한다.
일부 실시형태에 있ㅅ어서, 면역 반응성 세포는 IL-12를 분비하는 세포와 동시-투여된다. IL-12를 분비하는 세포의 예로는 수지상 세포 및 매크로파지가 포함된다.
다른 경우에 있어서, IL-12는 본원에 기재된 바와 같은 대상 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포와 함께 투여될 수있다. 일부 경우에 있어서, IL-12는 대상 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포의 투여 전, 투여 시, 투여 후, 또는 이들의 조합에 의해 투여된다. 일부 경우에 있어서, IL-12는 임의의 순서로 다른 사이토카인과 함께 동시에 또는 연속하여 동일한 경로 또는 다른 경로로 투여될 수있다. 일부 실시형태에 있어서, 면역 반응성 세포를 IL-12에 노출시킴으로써 면역 반응성 세포의 세포 독성 효과기 기능을 향상시킨다. 일부 경우에 있어서, IL-12에 노출된 면역 반응성 세포의 세포 독성은 IL-12에 노출되지 않은 면역 반응성 세포의 세포 독성보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상 클 수 있다.
일부 경우에 있어서, 본원에 기술된 대상체 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포는 IL-12에 노출될 수 있고, 시험관내 세포 독성 분석에서 표적에 대한 효과기(E:T)비가 5:1일 때, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 90%의 세포 독성을 가질 수 있다.
일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 대상 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포는 IL-12에 노출될 수 있고, 시험관내 세포 독성 분석에서 표적에 대한 효과기(E:T)비가 10:1일 때, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 90%의 세포 독성을 가질 수 있다.
일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 대상 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포는 IL-12에 노출될 수 있고, 시험관내 세포 독성 분석에서 표적에 대한 효과기(E:T)비가 15:1일 때, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 90%의 세포 독성을 가질 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 대상 CAR을 포함하는 면역 반응성 세포는 IL-12에 노출될 수 있고, 시험관내 세포 독성 분석에서 표적에 대한 효과기(E:T)비가 20:1일 때, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 90%의 세포 독성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 면역 반응성 세포를 IL-12에 노출시킴으로써 면역 반응성 세포의 사이토카인-생성 및/또는 분비 능력을 향상시킨다. 일부 경우에 있어서, 생성 및/또는 분비되는 사이토카인은 인터페론-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 또는 IL-2이다. 다른 경우에 있어서, 면역 반응성 세포를 IL-12에 노출시킴으로써 IFN-γ의 IL-4 매개 억제가 감소된다.
일부 경우에 있어서, T 세포 성장 인자는 대상 CAR 또는 그것을 포함하는 숙주 세포와 함께 투여될 수 있다. 성장 인자는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 둘 이상의 T 세포 성장 인자가 투여되는 경우, 임의의 순서로 동일한 경로 또는 다른 경로에 의해 동시에 또는 연속하여 투여될 수 있다. 알데스류킨(IL-2)과 같은 T 세포 성장 인자는 볼러스 주사와 같이 정맥내 투여될 수 있다. IL-2와 같은 T 세포 성장 인자의 투여량은 당업자에 의해 높다고 여겨지는 정도이다. 바람직하게는, 약 720,000IU/kg의 IL-2의 투여량이 허용량까지 매일 3회 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, IL-2는 약 5~약 15회 투여되고, 평균 약 9회 투여된다. T 세포 성장 인자는 약 0~약 20회 투여될 수 있다. T 세포 성장 인자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 최대 약 20회 투여될 수 있다.
IL-2는 정맥내 볼러스로서 720,000IU/kg(전체 체중에 기초하여)의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, IL-2는 15분에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, IL-2는 20분에 걸쳐 투여될 수 있다. IL-2는 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, IL-2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 또는 최대 6시간에 걸쳐 투여될 수 있다.
일부 경우에 있어서, IL-2는 세포 주입으로부터 24시간 이내에 시작하여 최대 약 4일(최대 12회 투여) 동안 지속하여 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, IL-2는 초기 투여 후 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40일 동안 투여될 수 있다.
IL-2의 투여량은 8시간마다 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, IL-2는 초기 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간마다 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 독성이 검출되면 IL-2 투여를 중단할 수 있다. 일부 경우에 있어서 환자가 설사, 메스꺼움, 구토, 저혈압, 피부 변화, 식욕 부진, 점막염, 연하곤란, 또는 전신 증상 및 실험실 변화와 같은 알데스류킨에 공통적인 가역적인 3등급 독성을 제외하고 3등급 또는 4등급의 독성을 나타내면 투여를 지연시키거나 중단시킬 수 있다. 일부 경우에 있어서, 이들 독성이 지지 요법 수단에 의해 24시간 이내에 쉽게 역전될 수 있다면 추가적인 투여가 제공될 수 있다. 또한, 치료 주치의의 재량에 따라 투여를 실시하거나 중단할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 항-WT1 CAR을 발현하는 면역 반응성 세포는 항-WT1 CAR을 발현하지 않는 비교가능한 면역 반응성 세포에 비해 증가된 항-종양 효능을 가질 수 있다.
일부 경우에 있어서, 항-종양 효능은 세포 독성 활성을 지칭할 수 있다. 다른 경우에 있어서, 항-종양 효능은 지속성을 지칭할 수 있다. 또한, 항-종양 효능은 종양을 표적화하는 세포의 능력을 지칭할 수 있다. 항-종양 효능은 다양한 시험관내 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 세포 독성 능력은 인터류킨-2(IL-2) 또는 인터페론-γ(IFNγ)의 방출을 측정하는 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 세포 독성 활성은 크롬-51 방출 분석 또는 공생-배양 분석과 같은 사멸 분석에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 비교가능한 세포와 비교했을 때, 증가된 항-종양 효능 및 능력을 나타낼 수 있다.
항-WT1 CAR 치료 효능은 여러 양상을 이용하여 평가될 수 있다. 효능은 WT1-양성 종양과 같은 종양이 제어, 감소, 또는 제거되는 정도인 항-종양 효능을 지칭할 수 있다. 또한, 치료 효능은 CAR 면역 반응tjd 세포 확장, 지속성, 종양-표적화, 및 그들의 임의의 조합을 지칭할 수 있다.
항-WT1 CAR T 세포 요법과 같은 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포 요법이 실시될 수 있는 대상체는 주입 동안에, 주입 직후에, 또는 주입하고 나서 최대 수년까지 평가될 수 있다. 예를 들면, 치료된 대상체는 대상체의 수명 기간까지 약 1일 동안 평가를 위해 병원으로 되돌아갈 수 있다. 치료된 대상체는 대상 CAR 면역 반응성 세포의 초기 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 또는 최대 90년까지 평가될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 평가 스케쥴은 일일 모니터링, 주간 모니터링, 월간 모니터링 또는 연간 모니터링을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 임상적으로 지시된 대로 대상체를 보다 자주 보게 될 수 있다. 평가에는 신체 검사, 화학 평가, 전체 혈구 검사, 갑상선 패널, 독성 평가, 신체 부위의 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔, 성분 채집술, 및 그들의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 성분 채집술은 대상 CAR 면역 반응성 세포 주입의 투여 전 및 투여하고 약 1~약 10주 후에 수행될 수 있다. 다른 시점에 있어서, 대상체의 말초 혈액 림프구(PBL)는 Ficoll 구배에서 원심분리를 이용하여 정제함으로써 전혈로부터 수득될 수 있다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분취량은 세포 기능의 면역학적 모니터링을 위해 저온 보존될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 다양한 테스트는 특이적 용균 및 사이토카인 방출의 평가, 대사체학 연구 및 바이오에너지 연구(해마를 이용한), 사이토카인 생성의 세포내 FACS, ELISA-스폿 분석의 평가를 포함할 수 있고, 림프구 서브세트 분석은 대상 CAR 면역 반응성 세포 치료의 면역학적 상관관계를 평가하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이들 분석에서 약 2~약 3배의 차이가 진정한 생물학적 차이를 나타낼 수 있다. 일부 경우에 있어서, 시험관내 분석에서 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포 치료 후 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 최대 약 5배까지의 차이가 치료 효능을 나타낼 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상 CAR 면역 반응성 세포 요법은 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔 또는 MRI로 측정했을 때, 종양 크기를 감소시킬 수 있다. 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포 요법은 종양 크기를 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 약 100%까지 감소시킬 수 있다. CAR-T 요법은 CT 스캔으로 측정했을 때, 종양을 제거할 수 있다. 일부 경우에 있어서, CAR 면역 반응성 세포 요법은 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔에 의해 측정되는 종양 병변의 직경의 기준 측정값의 변화가 10% 미만으로 측정될 때, 종양 크기를 안정화시킬 수 있다. 예를 들면, 종양은 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포의 투여 후 크기가 확장되지 않을 수 있다. 일부 경우에 있어서, 치료 전 측정값과 비교하여 종양 크기가 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 변화되었을 때 안정화로 여겨질 수 있다.
일부 경우에 있어서, 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포 효능은 대상체 생존 기간 관점에서 고려될 수 있다. 예를 들면, 항-WT1 CAR T 세포와 같은 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 항-WT1 CAR T 세포로 치료된 대상체는 치료되지 않은 대상체 또는 다른 치료법으로 치료된 대상체보다 더 오래 생존할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 2차 치료의 추가에 의해 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포 효능이 향상될 수 있다. 2차 치료는 항- WT1 CAR 면역 반응성 세포 치료와 상승작용을 일으킬 수 있다. 일부 경우에 있어서, 2차 치료는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포 요법의 부가적인 효과를 가져올 수 있다. 2차 치료는 림프구 감소, 세포 요법의 부가적인 형태, 항체 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 외과 수술, 항-혈관 신생 요법, 및 그들의 임의의 조합일 수 있다.
치료 반응은 개정된 고체 종양 효과 판정 기준(RECIST) 가이드라인(버전 1.1)에 의해 제안된 국제기준을 이용하여 평가될 수 있다. 악성 림프절의 경우에 종양 병변의 최대 직경(1차원 측정)과 최단 직경의 변화가 RECIST 기준 내에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 측정가능한 병변은 흉부 X선 촬영으로 >20mm, CT 스캔으로 >10mm, 또는 임상 시험에 의한 캘리퍼스로 >10mm 이상일 때, 적어도 1차원(기록될 최장 직경)으로 정확히 측정될 수 있는 것으로 규정된다. 병리학적으로 커지고 측정가능한 것으로 간주되기 위해서는 CT 스캔에 의해 평가했을 때 림프절의 단축이 >15mm일 수 있다. 작은 병변(최대 직경이 <10mm이거나 병리학적 림프절의 단축이 ≥10 내지 <15mm임)을 포함한 모든 다른 병변(또는 질병 부위)은 측정 불가능한 질병으로 간주될 수 있다. 뼈 병변, 연수막 질병, 복수, 흉수/심낭삼출, 림프관염/폐렴, 염증성 유방 질환은 측정 불가능한 것으로 간주될 수 있다.
모든 관련 장기를 대표하는 장기당 최대 2병변 및 총 5병변까지의 모든 측정가능한 병변을 표적 병변으로 식별하고, 베이스라인에서 기록되고 측정될 수 있다. 표적 병변은 그것의 크기(최장 직경의 병변)를 기준으로 선택될 수 있으며, 모든 관련 장기를 대표할 수 있지만, 또한 재현가능한 반복 측정에 적합해야 한다. 최장 병변이 재현가능한 측정에 적합하지 않은 경우가 있을 수 있으며, 이 상황에 있어서 재현가능하게 측정될 수 있는 다음으로 가장 긴 병변이 선택되어야 한다. 모든 표적 병변의 직경의 합(비결절성 병변의 경우는 최장, 결절성 병변의 경우는 단축)을 계산하여 베이스라인 합계 직경으로서 보고될 수 있다. 림프절을 합계에 포함시키려면, 단축만 합계에 추가할 수 있다. 베이스라인 합계 직경은 질병의 측정가능한 차원에서 임의의 객관적인 종양 퇴행을 더 특성화하기 위해 참조로서 사용될 것이다.
일부 경우에 있어서, 임상 병변은 표면에 드러나 있고(예를 들면, 피부 결절 및 촉진가능한 림프절), 캘리퍼스(예를 들면, 피부 결절)를 사용하여 평가한 직경이 약 10mm일 때 측정가능한 것으로 간주될 수있다. 병변을 측정하는 데 캘리퍼스가 사용될 수 없는 경우, CT 스캔 또는 MRI를 사용할 수도 있다. 일부 경우에는 CT 스캔으로 약 5mm 이하의 조직의 박편을 얻을 수 있다. CT 스캔은 일부 경우에 있어서 5mm, 4mm, 3mm, 2mm, 1mm 또는 0.5mm의 스캔 두께를 가질 수 있다. CT 스캔의 박편 두께가 5mm보다 크면, 측정가능한 병변의 최소 크기는 박편 두께의 2배가 될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 또한, 대상체를 평가하는 데 MRI가 수행될 수도 있다. 이상적으로는, 동일한 유형의 스캐너가 사용되어야 하며, 치료의 효능을 판단할 때 가능한 한 이전 스캔과 밀접하게 이미지 취득 프로토콜에 따를 필요가 있다. 신체 스캔은 가능하다면 호흡 중지 스캐닝 기술을 이용하여 수행되어야 한다. 일부 경우에 있어서, 치료 효능을 측정하는 데 플루오로데옥시글루코오스(FDG)-양전자 방출 단층 촬영(PET)이 사용될 수 있다.
일단 대상체가 평가되면, 표적 병변은 안정 질병(SD), 진행 병변(PD), 부분 관해(PR) 및/또는 완전 관해(CR)로 분류될 수 있다. SD는 직경의 최소 합계를 기준으로 PR이 되기에는 충분히 감쇠된 것이 아니고 PD가 되기에는 충분히 증가된 것도 아니라고 간주될 수 있다. PD는 최소 합계(최소가 되는 경우는 베이스라인 합계를 포함시킬 수 있음)를 기준으로 표적 병변의 직경의 합계가 적어도 20% 증가한 것으로 간주될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 약 20%의 상대적인 증가 이외에도 합계는 적어도 약 5mm의 절대적인 증가를 입증해야 한다. 직경의 베이스라인 합계를 기준으로 PR은 표적 병변의 직경의 합계가 적어도 약 30% 감소될 수 있다. CR은 표적 병변의 제거일 수 있다.
대상 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 약학적 약물로 제제화되고, 예를 들면 암으로 진단된, 치료를 필요로 하는 인간이나 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이들 약학적 약물은 하나 이상의 화학 요법제 또는 화학 요법 화합물과 함께 인간이나 포유동물에게 동시-투여될 수 있다.
CAR T 세포와 같은 대상 CAR 면역 반응성 세포의 집단은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 대상체에게 투여되도록 제제화할 수 있다. CAR 면역 반응성 세포의 집단을 포함하는 제제는 약학적으로 허용가능한 부형제(들)을 포함할 수 있다. 제제에 포함되는 부형제는 예를 들면, 사용된 T 세포의 서브집단 및 투여 방식에 따라 상이한 목적을 가질 것이다. 일반적으로 사용된 부형제의 예로는 식염수, 완충염수, 덱스트로오스, 주사용 증류수, 글리세롤, 에탄올, 및 그들의 조합, 안정화제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 보존제, 등장화제, 증량제, 및 윤활제가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. CAR 면역 반응성 세포의 집단을 포함하는 제제는 전형적으로 동물 혈청과 같은 임의의 비인간 성분이 없는 상태에서 제조되고 배양될 것이다. 제제는 CAR 면역 반응성 세포의 1개의 집단, 또는 1개보다 많은, 예를 들면 CAR 면역 반응성 세포의 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제제는 CAR T 세포의 1개의 집단, 또는 1개보다 많은, 예를 들면 CAR T 세포의 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 집단을 포함할 수 있다.
항-WT1 CAR 면역 반응성 세포의 집단(들)을 포함하는 제제는 당업자에게 공지된 방식 및 기술을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 방식의 예로는 정맥내 주사가 포함되지만 이것에 한정되는 것은 아니다. 다른 방식에는 종양내, 피내, 피하(S.C., s.q., sub-Q, Hypo), 근육내(i.m.), 복강내(i.p.), 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내(관절), 활액내(관절액 영역), 두개내, 척수내, 및 척추강내(척수액)가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 제제 주입의 비경구 주사에 유용한 임의의 공지된 장치가 이러한 투여를 수행하는 데 사용될 수 있다.
대상체에게 투여된 대상 CAR 면역 반응성 세포의 집단을 포함하는 제제는 특정 증상 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 효과적인 다수의 CAR 면역 반응성 세포를 포함한다. 따라서, 치료적으로 효과적인 CAR 면역 반응성 세포의 집단이 대상체에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 약 1×104~약 1×1010의 CAR 면역 반응성 세포를 포함하는 제제가 투여된다. 대부분의 경우, 제제는 약 1×105~약 1×109의 CAR 면역 반응성 세포, 또는 약 5×105~약 5×108의 CAR 면역 반응성 세포, 또는 약 1×106~약 1×107의 CAR 면역 반응성 세포를 포함할 것이다. 그러나, 대상체에게 투여된 CAR 면역 반응성 세포의 수는 암의 위치, 발생원, 식별, 정도 및 심각도, 치료받을 개체의 연령과 상태 등에 따라 광범위한 범위 내에서 달라질 것이다. 사용될 적절한 투여량은 의사가 최종적으로 결정한다.
종양-표적화 분자들는 CAR 면역 반응성 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 종양-표적화 분자는 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원과 연관시켜 대상체의 표적 세포에 결합시킬 수 있다. 종양-표적화 분자는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 대상체에게 투여되도록 제제화될 수 있다. 종양-표적화 분자의 제제는 약학적으로 허용가능한 부형제(들)을 포함할 수 있다. 일반적으로 사용된 부형제의 예로는 식염수, 완충염수, 덱스트로오스, 주사용 증류수, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합, 안정화제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 보존제, 등장화제, 증량제, 및 윤활제가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
종양-표적화 분자는 당업자에게 공지된 방식 및 기술을 이용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 방식의 예로는 정맥내, 복강내, 및 종양내 주사가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 디른 방식에는 피내, 피하(S.C., s.q., sub-Q, Hypo), 근육내(i.m.), 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내(관절), 활액내(관절액 영역), 두개내, 척수내, 및 척수강내(척수액)가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 일부 경우에 있어서, CAR-T는 간 병변과 같은 종양 병변에 국소적으로 투여될 수 있다. 제제의 비경구 주사 또는 주입에 유용한 임의의 공지된 장치가 이러한 투여를 수행하는 데 사용될 수 있다.
종양-표적화 분자를 포함하는 제제는 특정 증상 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 일반적으로, 적어도 약 0.1mg/kg~약 100mg/kg body weight의 종양-표적화 분자가 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대부분의 경우, 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 약 1mg/kg~약 100mg/kg body weight의 태그된 단백질이 매일 투여된다. 사용될 적절한 투여량은 의사가 결정할 것이다.
일실시형태에 있어서, 면역 반응성 세포-매개 면역 반응을 자극하는 데 키메라 항원 수용체가 사용된다. 예를 들면, T 세포-매개 면역 반응은 T 세포의 활성화와 관련된 면역 반응이다. 활성화된 항원-특이적 세포 독성 T 세포는 예를 들면, 종양 항원이 나타나는 암 세포와 같이 그것의 표면에 외래 항원의 에피토프가 나타나는 표적 세포에 아포토시스를 유도할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 키메라 항원 수용체는 포유동물에게 있어서 항-종양 면역을 제공하는 데 사용된다. T 세포-매개 면역 반응으로 인해, 대상체는 항-종양 면역을 갖게 될 것이다.
특정 경우에 있어서, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 종양-표적화 분자의 하나 이상의 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 이들 분자는 암 세포와 결합하고, 또한 대상 CAR 면역 반응성 세포의 치료학적으로 효과적인 하나 이상의 집단을 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 CAR 면역 반응성 세포는 종양-표적화와 결합하여 암 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 다른 실시형태는 치료를 필요로 하는 대상체에게 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포의 치료학적으로 효과적인 하나 이상의 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 CAR 면역 반응성 세포는 암 세포와 결합함으로써 암 세포의 사멸을 유도한다.
항-WT1 CAR 면역 반응성 세포 및 종양-표적화 분자와 조합한 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 포함하는 두 제제의 투여 빈도는 치료하고자 하는 질병, CAR 면역 반응성 세포와 종양 표적화 분자를 포함하는 요소, 및 투여 방식을 포함한 요인들에 따라 달라질 것이다. 각각의 제제는 일일 4회, 3회, 2회, 또는 1회, 격일로, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 일주일에 한번, 8일마다 , 9일마다, 10일마다, 격주로, 한달에 한번, 및 격월로 독립적으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "화학 요법제" 또는 "화학 요법 화합물" 및 그것의 문법적 동의어는 암 치료에 유용한 화학적 화합물일 수 있다. 개시된 CAR 면역 반응성 세포와 조합하여 사용될 수 있는 암 화학 요법제의 예로는 유사 분열 억제제(빈카알칼로이드)가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들에는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 NavelbineTM(비노렐빈, 5'-노르안하이드로블라스틴)이 포함된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 암 화학 요법제에는 캄토테신 화합물과 같은 토포이소머라아제 I 억제제가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "캄토테신 화합물"에는 CamptosarTM(이리노테칸 HCL), HycamtinTM(토포테칸 HCL) 및 캄토테신으로부터 유래된 그 밖의 화합물 및 그것의 유사체가 포함된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 암 화학 요법제의 다른 카테고리는 에토포시드, 테니포시드 및 미토포도지드와 같은 포도필로톡신 유도체이다. 본 개시는 종양 세포내의 유전자 물질을 알킬화하는 알킬화제로서 알려진 그 밖의 암 화학 요법제를 더 포함한다. 이들에는 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부설판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 개시는 화학 요법제로서 대사 길항 물질을 포괄한다. 이들 제제의 유형의 예로는 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 아자티오프림, 및 프로카바진이 포함된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 암 화학 요법제의 추가 카테고리에는 항생제가 포함된다.　예로는 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신이 포함된다. 이들 화합물에 대해 상업적으로 이용가능한 많은 리포솜 제제가 존재한다. 본 개시에는 항-종양 항체, 다카바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, 이포스파미드 및 미톡산트론을 포함한 그 밖의 암 화학 요법제가 더 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 세포 독성제/항신생물제 및 항-혈관 신생제를 포함한 그 밖의 항종양제와 조합하여 투여될 수 있다. 세포 독성제/항신생물제는 암 세포를 공격하고 사멸시키는 제제로서 정의될 수 있다. 일부 세포 독성제/항신생물제는 예를 들면, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부설판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진과 같은 종양 세포내의 유전자 물질을 알킬화하는 알킬화제일 수 있다. 그 밖의 세포 독성제/항신생물제는 항생제일 수 있으며, 예를 들면 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신일 수 있다. 이들 화합물에 대해 상업적으로 이용가능한 많은 리포솜 제제가 존재한다. 또 다른 세포 독성제/항신생물제는 유사 분열 억제제(빈카알칼로이드)일 수 있다. 이들에는 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 에토포시드가 포함된다. 다양한 세포 독성제/항신생물제로는 탁솔 및 그것의 유도체, L-아스파라기나아제, 항-종양 항체, 다카바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, VM-26, 이포스파미드, 미톡산트론, 및 빈데신이 포함된다.
또한, 항-혈관 신생제가 사용될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 적절한 항-혈관 신생제로는 인간화 항체와 키메라 항체를 포함한 항-VEGF 항체, 항-VEGF 압타머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 그 밖의 혈관 신생 억제제로는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터류킨 1(α 및 β 포함), 인터류킨 12, 레티노산, 및 메탈로프로테이나아제-1 및 -2의 조직 억제제(TIMP-1 및 -2)가 포함된다. 항-혈관 신생 활성을 갖는 토포이소머라아제 II와 같은 토포이소머라아제를 포함한 소형 분자들도 사용될 수 있다.
대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포와 조합하여 사용될 수 있는 그 밖의 항암제로는 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 히드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나아제; 아스펄린; 아바스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비스안트렌 히드로클로라이드; 비스나파이드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 소듐; 브로피리민; 부설판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세마이드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 히드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핑골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 히드로클로라이드; 데시타빈; 덱소마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 히드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트, 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로니틴 히드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 히드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 히드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 히드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 젬시타빈; 젬시타빈 히드로클로라이드; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 인터류킨 II(재조합 인터류킨 II, 또는 rIL2 포함), 인터페론α-2a; 인터페론α-2b; 인터페론α-n1; 인터페론α-n3; 인터페론β-I; 인터페론γ-I b; 이프로플라틴; 이리노테칸 히드로클로라이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 히드로클로라이드; 로메트렉솔 소듐; 로무스틴; 로속산트론 히드로클로라이드; 마소프로콜; 메이탄신; 메클로레타민 히드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 히드로클로라이드; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가아제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 설페이트; 퍼포스파미드; 피로브로만; 피포설판; 피록산트론 히드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르미로마이신; 프레드니무스틴; 프로카바진 히드로클로라이드; 퓨로마이신; 퓨로마이신 히드로클로라이드; 피라조퓨린; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 사핀골 히드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 소듐; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 히드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔록산트론 히드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조퓨린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트리프토렐린; 투불로졸 히드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈류로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 히드로클로라이드가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 그 밖의 항암 약물로는 20-epi-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 안타고니스트; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관 신생 억제제; 안타고니스트 D; 안타고니스트 G; 안타렐릭스; 항-도설라이징 모르포제네틱 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아포토시스 유전자 변형제; 아포토시스 조절제; 아푸린산; ara-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 데아미나아제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; CAR/ABL 안타고니스트; 벤조클로린스; 벤조일스타우로스포린; β락탐 유도체; β-알레틴; β클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 비칼루타미드; 비산트렌; 비스아지리디닐스페르민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복사미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래 억제제; 카르젤레신; 카제인 키나아제 억제제(ICOS); 카스타노스페르민; 세크로핀 B;, 세트로렐릭스; 클로린스; 클로로퀴녹살린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레스타틴 A4; 콤브레스타틴 유사체; 코나제닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜타안트라퀴논; 시클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포 용해 인자; 시토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데히드로디데민 B; 데스로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디데민 B; 디독스; 디에틸노르스페르민; 디히드로-5-아자시티딘; 디히드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 아고니스트; 에스트로겐 안타고니스트; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루비신 히드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나아제 억제제; 젬시타빈; 글루타티온 억제제; 헵설팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 하이퍼리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역 자극 펩티드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 아고니스트; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 아이오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키놀리드; 카할랄리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 α인터페론; 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 디사카리드 펩티드; 친유성 백금 화합물; 리소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 류토테칸; 류테튬 텍사피린; 리소필린; 용해성 펩티드; 메이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트리리신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제; 모노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나아제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매치된 이중가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파르로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체, 인간 융모성 성선 자극호르몬; 모노포스포릴 리피드 A+미오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제제 1-기반 요법; 머스타드 항암제; 미카퍼옥시드 B; 미코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록센+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다아제; 닐루타미드; 니사마이신; 산화질소 조절제; 니트록사이드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 사이토카인 인듀서; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가아제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 소듐; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타아제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 히드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화 억제제; 백금 복합체; 백금 화합물; 백금-트리아민 복합체; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아좀 억제제; 단백질 A-기반 면역 조절제; 단백질 키나아제 C 억제제; 단백질 키나아제 C 억제제, 미크로알갈; 단백질 티로신 포스파타아제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 접합체; raf 안타고니스트; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라아제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 레텔립틴 데메틸화; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르디드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 미메틱스; 세무스틴; 세네센스 유래 억제제 1; 센스올리고뉴클레오티드; 시그널 전달 억제제; 시그널 전달 조절제; 단일쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소듐 보로캅테이트; 소듐 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기 세포 억제제; 줄기 세포 분열 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 설피노신; 슈퍼액티브 혈관 작동성 장 펩티드 안타고니스트; 수라디스타; 수라민; 스웨인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오디드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라아제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 미메틱; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 아고니스트; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 틴 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 비클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 토티포펜트 줄기 세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테리드; 티로신 키나아제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 비뇨생식동-유래 성장 억제 인자; 유로키나아제 수용체 안타고니스트; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템; 적혈구 유전자 요법; 벨라레솔; 베라민; 베르딘스; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈잘틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 및 지노스타틴 스티말라머가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 일실시형태에 있어서, 항암 약물은 5-플루오로우라실, 탁솔, 또는 류코보린이다.
일부 경우에 있어서, 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 주사, 카테터 등에 의해 주입될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 면역 자극제로는 예를 들면, IL-2, IL-3, IL-6, 및 IL-11뿐만 아니라 그 밖의 인터류킨와 같은 인터류킨, G-, M- 및 GM-CSF와 같은 콜로니 자극 인자, 인터페론, 예를 들면 γ-인터페론 및 에리스로포이에틴이 포함될 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 일부 경우에 있어서, 대상체는 CAR-T, 면역 고갈제 및 면역 자극제에 의해 치료될 수 있다. CAR-T 세포 생성물의 성능을 높이기 위해 대상체는 IL-2로 치료될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 면역 자극제는 재조합 단백질일 수 있다. 또한, 면역 자극제는 단백질의 활성 부분을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 면역 자극제는 단백질의 일부분만을 포함할 수 있다. 단백질의 일부분은 단백질의 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 최대 약 100%일 수 있다.
CAR T 세포와 같은 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 포함하는 조성물은 멸균 액상 제제, 예를 들면 등장성 수용액, 현탁액, 에멀전, 분산제, 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있으며, 이는 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액상 제제는 보통 겔, 그 밖의 점성 조성물, 및 고형 조성물보다 제조하기 쉽다. 또한, 액상 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 더 오랜 접촉을 제공하도록 적절한 점성 범위 내에서 제제화될 수 있다. 액상 또는 점성 조성물은 담체를 포함할 수 있고, 이는 예를 들면 물, 염류 용액, 인산 완충식염수, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그것의 적절한 혼합물을 함유하는 용제 또는 분산 매체일 수 있다. 멸균 주사 용액은 본 발명을 실시하는 데 활용되는 유전자 변형된 CAR 면역 반응성 세포를 필요량의 적절한 용제에 필요에 따라서는 다양한 양의 다른 성분들과 함께 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 적절한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예를 들면 멸균수, 생리식염수, 글루코오스, 덱스트로오스 등과 혼합될 수 있다. 또한, 조성물은 동결 진공 건조될 수도 있다. 또한, 조성물은 투여 경로 및 소망의 제법에 따라 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들면, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화제 또는 점성 강화 첨가제, 보존제, 향료, 색소 등과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 본원에 참조로 포함된 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 제17판, 1985와 같은 표준 문헌은 과도한 실험 없이 적절한 제제를 만들기 위해 참조될 수 있다. 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키기 위한 항균성 보존제, 항산화제, 킬레이트제, 및 완충제를 포함한 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 미생물의 작용이 방지될 수 있다. 주사가능한 약물 형태의 흡수를 연장시키는 것은 흡수 지연제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면 사용된 임의의 비히클, 희석제, 또는 첨가제는 유전자 변형된 CAR 면역 반응성 세포 또는 그것의 전구체와 양립가능해야 한다.
일부 경우에 있어서, 조성물은 등장성일 수 있으며, 즉 조성물은 혈액 및 누액과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 본 발명의 조성물의 소망의 등장성은 염화나트륨, 또는 덱스트로오스, 붕산, 타르타르산 나트륨, 프로필렌 글리콜 또는 그 밖의 무기 또는 유기 용질과 같은 그 밖의 약학적으로 허용가능한 제제를 사용함으로써 달성될 수 있다. 염화나트륨은 나트륨 이온을 함유하는 완충제로서 특히 바람직하다. 조성물의 점도는 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 농후제를 이용하여 선택된 수준으로 유지될 수 있다. 경제적으로 손쉽게 입수가능하고 작업이 용이한 점에서 메틸셀룰로오스가 바람직하다. 그 밖의 적합한 농후제로는 예를 들면, 크산탄검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카보머 등이 포함된다. 농후제의 바람직한 농도는 선택된 제제에 따라 달라질 것이다. 중요한 점은 선택된 점성을 달성할 수 있는 양을 사용해야 한다는 것이다. 분명한 것은 정확한 투여 경로 및 투여 형태의 특성, 예를 들면 액체 투여 형태에 따라 적합한 담체 및 그 밖의 첨가제의 선택이 달라질 것이다(예를 들면, 조성물이 용액, 현탁액, 겔 또는 지속적으로 방출하는 형태 또는 액체가 충전된 형태와 같은 다른 액상 형태로 제제화되는지의 여부).
일부 경우, 예를 들면 암을 치료하기 위한 조성물, 제제 및 방법에 있어서 투여되는 조성물 또는 제제의 단위 투여량은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100mg일 수 있다.　일부 경우에 있어서, 투여되는 조성물 또는 제제의 총량은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100g일 수 있다.
일부 경우에 있어서, CAR T 세포와 같은 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 포함하는 약학적 조성물은 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 임의의 경로에 의해 투여될 수 있고 이러한 투여는 단회 투여 또는 다회 투여로 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 핸드 캔디, 분말, 스프레이, 수성 현탁액, 주사액, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 다양한 약학적으로 허용가능한 불활성 담체와 조합될 수 있다. 이러한 담체로는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매체 및 다양한 비독성 유기용제 등이 포함된다. 또한, 이러한 경구용 약학적 제제는 이러한 목적으로 흔히 채용되는 다양한 형태의 제제에 의해 적절하게 감미되고 및/또는 풍미가 입혀질 수 있다.
예를 들면, 항바이러스 요법, 시도포비어 및 인터류킨-2, 또는 시타라빈(ARA-C라고도 알려져 있음)과 같은 제제를 이용한 치료를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 많은 관련 치료 양상과 함께(예를 들면, 이전, 동시, 또는 이후) 환자에게 세포가 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 조작된 세포는 화학 요법, 방사전 치료, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506과 같은 면역 억제제, 항체, 또는 CAMPATH와 같은 면역 제거제, 항-CD3 항체 또는 그 밖의 항체 요법, 시톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코플리에놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 방사선 치료와 함께 같은 사용될 수 있다. 또한, 조작된 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈, 외부 방사선 치료 요법(XRT), 사이클로포스파미드와 같은 화학 요법제, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용한 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들면 이전, 동시 또는 이후) 환자에게 투여될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 조작된 세포 조성물은 CD20과 반응하는 제제, 예를 들면 리툭산과 같은 B-세포 제거 요법 후 투여될 수 있다. 예를 들면, 대상체는 고선량 화학 요법 후 말초 혈액 줄기 세포를 이식하는 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 이식 후에 대상체는 조작된 세포, 예를 들면 확장된 조작 세포를 주입받을 수 있다. 또한, 확장된 조작 세포는 수술 전이나 수술 후에 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법 중 하나에 의해 얻은 조작된 세포는 숙주 대 이식편(HvG) 거부와 이식편 대 숙주병(GvHD)에 대항하여 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 비활성화된 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자를 포함하는 유효량의 조작 세포를 상기 환자에게 투여함으로써 숙주 대 이식편(HvG) 거부와 이식편 대 숙주병(GvHD)에 대항하여 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 고려될 수 있다.
키트
조성물을 포함하는 키트가 본원에 개시된다. 또한, 암, 병원체 감염, 면역 질환 또는 동종 이식의 치료 또는 예방을 위한 키트가 본원에 개시된다. 일실시형태에 있어서, 키트는 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR을 단위 투여량 형태로 하나 이상 포함하는 유효량의 세포를 함유하는 치료 또는 예방용 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 치료 또는 예방용 백신을 함유할 수 있는 멸균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 박스, 앰플, 보틀, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터 팩, 또는 당업계에 알려진 그 밖의 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층 종이, 금속박, 또는 약품을 보관하기에 적합한 그 밖의 재질로 만들어질 수 있다. 일부 경우에 있어서, CAR T 세포와 같은 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 암, 병원체 감염, 면역 질환 또는 동종 이식을 갖거나 발생할 위험에 처한 대상체에게 CAR 면역 반응성 세포를 투여하기 위한 설명서가 함께 제공할 수 있다. 이러한 설명서는 일반적으로 암, 병원체 감염, 면역 질환 또는 동종 이식의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 관한 정보를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 키트는 약 1×104 세포~약 1×1012 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트는 적어도 약 1×105 세포, 적어도 약 1×106 세포, 적어도 약 1×107 세포, 적어도 약 4×107 세포, 적어도 약 5×107 세포, 적어도 약 6×107 세포, 적어도 약 6×107 세포, 적어도 약 8×107 세포, 적어도 약 9×107 세포, 적어도 약 1×108 세포, 적어도 약 2×108 세포, 적어도 약 3×108 세포, 적어도 약 4×108 세포, 적어도 약 5×108 세포, 적어도 약 6×108 세포, 적어도 약 6×108 세포, 적어도 약 8×108 세포, 적어도 약 9×108 세포, 적어도 약 1×109 세포, 적어도 약 2×109 세포, 적어도 약 3×109 세포, 적어도 약 4×109 세포, 적어도 약 5×109 세포, 적어도 약 6×109 세포, 적어도 약 6×109 세포, 적어도 약 8×109 세포, 적어도 약 9×109 세포, 적어도 약 1×1010 세포, 적어도 약 2×1010 세포, 적어도 약 3×1010 세포, 적어도 약 4×1010 세포, 적어도 약 5×1010 세포, 적어도 약 6×1010 세포, 적어도 약 6×1010 세포, 적어도 약 8×1010 세포, 적어도 약 9×1010 세포, 적어도 약 1×1011 세포, 적어도 약 2×1011 세포, 적어도 약 3×1011 세포, 적어도 약 4×1011 세포, 적어도 약 5×1011 세포, 적어도 약 6×1011 세포, 적어도 약 6×1011 세포, 적어도 약 8×1011 세포, 적어도 약 9×1011 세포, 또는 적어도 약 1×1012 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 약 5×1010 세포가 키트에 포함될 수 있다. 다른 예에 있어서, 키트는 3×106 세포를 포함할 수 있으며; 세포는 약 5×1010 세포까지 확장되어 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 키트는 동종 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트는 유전자 변형을 포함할 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트는 "기성품(off-the-shelf)" 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트는 임상 용도로 확장될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트는 연구 목적을 위한 내용물들을 포함할 수 있다.
일부 경우에 있어서, 상기 설명서는 치료제에 대한 설명; 종양 형성, 병원체 감염, 면역 질환이나 동종 이식 또는 그것의 증상을 치료하거나 예방하기 위한 투여 스케쥴 및 투여; 주의사항, 경고, 지침서; 대응 지침서; 과다복용 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 레퍼런스 중 적어도 하나를 포함한다. 설명서는 용기(존재할 경우) 상에 직접 인쇄될 수 있고, 또는 용기에 적용되는 라벨로서 또는 용기 안이나 용기와 함께 제공되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로서 제공될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 설명서는 화학 요법제를 투여한 후에 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 CAR 세포와 같은 항-WT1 CAR T 세포와 같은 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 투여하기 위한 절차를 제공한다. 일부 경우에 있어서, 설명서는 화학 요법제를 투여하기 전에 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 투여하기 위한 절차를 제공한다. 일부 경우에 있어서, 설명서는 화학 요법제 투여와 동시에 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 투여하기 위한 절차를 제공한다. 일부 경우에 있어서, 설명서는 화학 요법제를 투여하고 적어도 12시간 후에 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 투여하기 위한 절차를 제공한다. 일부 경우에 있어서, 설명서는 화학 요법제를 투여하고 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30시간, 또는 최대 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후에 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 투여하기 위한 절차를 제공한다. 일부 경우에 있어서, 설명서는 화학 요법제를 투여하고 적어도 24시간 후에 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 투여하기 위한 절차를 제공한다. 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 정맥내 주사를 위해 제제화될 수 있다. 항-WT1 항원 결합 유닛 또는 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포는 고형 종양을 포함할 수 있는 대상체의 간에의 동맥내 주사를 위해 제제화될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 키트에는 필요로 하는 대상체에게 각각 약 60mg/kg~약 80mg/kg 및 약 25mg/㎡~약 35mg/㎡의 양으로 투여하도록 제제화된 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈이 포함될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트에는 소아 용량의 제품이 포함될 수 있다.
재조합 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 달리 명시되지 않은 한, 본 발명의 실시는 당기술분야에 속해 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 면역학의 통상적인 기술을 채용하고 있다. 이러한 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제2판(Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis"(Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture"(Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology"(Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology"(Wei & Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller & Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction"(Mullis et al., eds., 1994); 및 "Current Protocols in Immunology"(Coligan et al., eds., 1991) 등의 문헌에 충분히 설명되어 있다. 이들 기술은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 적용가능하며, 본 발명을 고안하고 실시함에 있어서 고려될 수 있다. 특히 유용한 기술은 다음의 섹션에서 논의된다.
본원에 개시된 방법은 이식을 포함할 수 있다. 이식은 세포 생성물의 입양 이식을 지칭할 수 있다. 이식은 자가 이식, 동종 이식, 이종 이식, 또는 임의의 다른 이식일 수 있다. 예를 들면 이식은 이종이식일 수 있다. 또한, 이식은 동종 이식일 수 있다.
일부 경우에 있어서, 대상체에게 약 5×1010의 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포가 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 약 5×1010 세포는 대상체에게 투여되는 세포의 중간량을 나타낸다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체의 치료적 반응에 영향을 미치는 데 약 5×1010 세포가 필요하다. 일부 실시형태에 있어서, 적어도 약 적어도 약 1×107 세포, 적어도 약 2×107 세포, 적어도 약 3×107 세포, 적어도 약 4×107 세포, 적어도 약 5×107 세포, 적어도 약 6×107 세포, 적어도 약 6×107 세포, 적어도 약 8×107 세포, 적어도 약 9×107 세포, 적어도 약 1×108 세포, 적어도 약 2×108 세포, 적어도 약 3×108 세포, 적어도 약 4×108 세포, 적어도 약 5×108 세포, 적어도 약 6×108 세포, 적어도 약 6×108 세포, 적어도 약 8×108 세포, 적어도 약 9×108 세포, 적어도 약 1×109 세포, 적어도 약 2×109 세포, 적어도 약 3×109 세포, 적어도 약 4×109 세포, 적어도 약 5×109 세포, 적어도 약 6×109 세포, 적어도 약 6×109 세포, 적어도 약 8×109 세포, 적어도 약 9×109 세포, 적어도 약 1×1010 세포, 적어도 약 2×1010 세포, 적어도 약 3×1010 세포, 적어도 약 4×1010 세포, 적어도 약 5×1010 세포, 적어도 약 6×1010 세포, 적어도 약 6×1010 세포, 적어도 약 8×1010 세포, 적어도 약 9×1010 세포, 적어도 약 1×1011 세포, 적어도 약 2×1011 세포, 적어도 약 3×1011 세포, 적어도 약 4×1011 세포, 적어도 약 5×1011 세포, 적어도 약 6×1011 세포, 적어도 약 6×1011 세포, 적어도 약 8×1011 세포, 적어도 약 9×1011 세포, 또는 적어도 약 1×1012 세포이다. 예를 들면, 약 5×1010 세포가 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 예에 있어서, 3×106 세포로 시작하여 세포를 약 5×1010 세포로 확장시켜 대상체에게 투여할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 세포는 치료에 충분한 수로 확장된다. 예를 들면, 5×107 세포는 치료 용도로 충분한 수를 생성하기 위해 급속한 환장을 겪을 수 있다. 일부 경우에 있어서, 치료 용도로 충분한 개수는 5×1010일 수 있다. 임의의 수의 세포가 치료 용도로 주입될 수 있다. 예를 들면, 대상체에게 1×106~5×1012 세포가 주입될 수 있다. 환자에게는 그들을 위해 생성될 수 있는 만큼의 세포가 주입될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 환자에게 주입되는 세포는 모두 조작되는 것은 아니다. 예를 들면, 환자에게 주입되는 세포의 적어도 90%가 조작될 수 있다. 다른 경우, 환자에게 주입되는 세포의 적어도 40%가 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 방법은 대상체의 치료적 반응에 영향을 미치는 데 필요한 조작된 세포의 양을 계산하고 및/또는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 치료적 반응에 영향을 미치는 데 필요한 조작된 세포의 양을 계산하는 것은 세포의 생존능 및/또는 항-WT1 CAR 전이 유전자가 세포의 게놈 내로 통합되는 효능을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체의 치료적 반응에 영향을 미치기 위해서, 대상체에게 투여되는 세포는 살아있는 세포일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체의 치료적 반응에 영향을 미치기 위해서, 세포의 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%는 살아있는 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체의 치료적 반응에 영향을 미치기 위해서, 대상체에게 투여되는 세포는 그 세포의 게놈 내로 성공적으로 통합된 하나 이상의 전이 유전자를 갖는 세포일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체의 치료적 반응에 영향을 미치기 위해서, 세포의 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%가 그 세포의 게놈 내로 성공적으로 통합된 하나 이상의 CAR 전이 유전자를 갖는다.
일부 경우에 있어서, 대상체는 대상 항-WT1 CAR 면역 반응성 세포를 투여받을 수 있으며, 여기서 투여될 수 있는 CAR 면역 반응성 세포는 약 1~약 35일된 것일 수 있다. 예를 들면, 투여된 세포들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 최대 약 40일된 것일 수 있다. CAR 면역 반응성 세포의 나이는 자극 시점으로부터 고려될 수 있다. CAR 면역 반응성 세포의 나이는 성분 채집 시점으로부터 고려될 수 있다. CAR 면역 반응성 세포의 나이는 형질 도입 시점으로부터 고려될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체에게 투여될 수 있는 CAR 면역 반응성 세포는 약 10~약 14일 또는 약 20일된 것일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, CAR 면역 반응성 세포의 "나이"는 텔로미어의 길이에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, "젊은" CAR 면역 반응성 세포는 "소모된" 또는 "늙은" CAR 면역 반응성 세포에 비해 텔로미어 길이가 더 길 수 있다. 특정 이론에 얽매이는 일 없이, 면역 반응성 세포는 배양 시 1주일에 약 0.8kb의 텔로미어 길이가 소실되는 것으로 추정되며, 젊은 CAR 면역 반응성 세포 배양체는 44일된 면역 반응성 세포에 비해 약 1.4kb 더 긴 텔로미어 길이를 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 특정 이론에 얽매이는 일 없이, 텔로미어 길이가 더 길다는 것은 환자에게 있어서 긍정적이고 객관적인 임상 반응 및 생체내에서의 세포 지속성과 관련이 있을 수 있다고 여겨진다.
일부 경우에 있어서, 세포는 대상 유기체로부터 단리되고, 핵산(예를 들면, 유전자 또는 cDNA)에 의해 형질 감염되고, 대상 유기체(예를 들면, 환자)에게 다시 재주입된다.
이식 전, 후 및/또는 이식 중의 세포(예를 들면, 조작된 세포 또는 조작된 1차 T 세포)는 기능적일 수 있다. 예를 들면, 이식된 세포는 이식 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 이식 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 이식 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30년 동안 기능적일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 이식된 세포는 수용자의 수명 기간 동안 기능적일 수 있다.
또한, 이식된 세포는 그들의 통상적인 의도된 기능의 100%로 기능할 수 있다. 또한, 이식된 세포는 그들의 통상적인 의도된 기능의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 최대 약 100%로 기능할 수 있다.
또한, 이식된 세포는 그들의 통상적인 의도된 기능의 100%를 초과하여 기능할 수 있다. 예를 들면, 이식된 세포는 그들의 통상적인 의도된 기능의 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 최대 약 5000%로 기능할 수 있다.
또한, 이식은 임의의 형태의 이식일 수 있다. 부위는 간 피막하 공간, 비장 피막하 공간, 신장 피막하 공간, 장막, 위 또는 장 점막하층, 소장의 혈관 분절, 정맥낭, 고환, 뇌, 비장 또는 각막을 포함할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 이식은 피막하 이식일 수 있다. 또한, 이식은 근육내 이식일 수 있다. 이식은 문맥내(intraportal) 이식일 수 있다.
치료(예를 들면, 본원에 개시된 임의의 치료) 후, 이식 거부 반응은 하나 이상의 야생형 세포가 수용자에게 이식된 경우와 비교하여 개선될 수 있다. 예를 들면, 이식 거부 반응은 초급성 거부 반응일 수 있다. 또한, 이식 거부 반응은 급성 거부 반응일 수 있다. 거부의 그 밖의 유형에는 만성 거부 반응이 포함된다. 또한, 이식 거부 반응은 세포-매개 거부 반응 또는 T 세포 매개 거부 반응일 수 있다. 또한, 이식 거부 반응은 내추럴 킬러 세포-매개 거부 반응일 수 있다.
이식 개선은 바람직하지 않은 효과 또는 증상의 감소, 완화 또는 약화를 포함할 수 있는 초급성 거부 반응의 완화를 의미할 수 있다. 이식은 세포 생성물의 입양 이식을 지칭할 수 있다.
성공적인 이식의 다른 징후는 수용자가 면역 억제 요법을 필요로 하지 않는 날의 수일 수 있다. 예를 들면, 본원에 제공된 치료(예를 들면, 이식) 후, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안 필요로 하지 않을 수 있다. 이것은 이식이 성공적이었음을 가리킬 수 있다. 또한, 이것은 이식된 세포, 조직 및/또는 장기의 거부 반응이 없음을 가리킬 수 있다.
일부 경우에 있어서, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 1일 동안 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 7일 동안 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 14일 동안 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 21일 동안 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 28일 동안 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 60일 동안 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 수용자는 면역 억제 요법을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 동안 필요로 하지 않을 수 있다.
성공적인 이식의 다른 징후는 수용자가 약화된 면역 억제 요법을 필요로 하는 날의 수일 수 있다. 예를 들면, 본원에 제공된 상기 치료 후, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안 필요로 할 수 있다. 이것은 이식이 성공적이었음을 가리킬 수 있다. 또한, 이것은 이식된 세포, 조직 및/또는 장기의 거부 반응이 없거나 최소임을 가리킬 수 있다.
예를 들면, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 1일 동안 필요로 할 수 있다. 또한, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 7일 동안 필요로 할 수 있다. 또한, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 14일 동안 필요로 할 수 있다. 또한, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 21일 동안 필요로 할 수 있다. 또한, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 28일 동안 필요로 할 수 있다. 또한, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 60일 동안 필요로 할 수 있다. 또한, 수용자는 약화된 면역 억제 요법을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 동안 필요로 할 수 있다.
약화된 면역 억제 요법은 하나 이상의 야생형 세포가 수용자에게 이식될 때 필요한 면역 억제 요법에 비해 면역 억제 요법이 약화된 것을 가리킬 수 있다.
면역 억제 요법은 면역계를 억제하는 임의의 치료를 포함할 수 있다. 면역 억제 요법은 수용자의 이식 거부 반응을 완화, 최소화 또는 제거하는 것을 도울 수 있다. 예를 들면, 면역 억제 요법은 면역-억제 약물을 포함할 수 있다. 이식 전, 이식 중 및/또는 이식 후에 사용될 수 있는 면역 억제 약물의 예로는 MMF(미코페놀레이트 모페틸(Cellcept), ATG(항-흉선 세포 글로불린), 항-CD154(CD4OL), 항-CD40(2C10, ASKP1240, CCFZ533X2201), 알렘투주맙(Campath), 항-CD20(리툭시맙), 항-IL-6R 항체(토실리주맙, Actemra), 항-IL-6 항체(사릴루맙, 올로키주맙), CTLA4-Ig(Abatacept/Orencia), 벨라타셉트(LEA29Y), 시롤리무스(Rapimune), 에베로리무스, 타크로리무스(Prograf), 다클리주맙(Ze-napax), 바실릭시맙(Simulect), 인플릭시맙(Remicade), 사이클로스포린, 데옥시스퍼구알린, 가용성 보체 수용체 1, 코브라독 인자, 콤스타틴, 항-C5 항체(에쿨리주맙/Soliris), 메틸프레드니솔론, FTY720, 에베로리무스, 레플루노마이드, 항-IL-2R-Ab, 라파마이신, 항-CXCR3 항체, 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 및 항-CD122 항체가 포함될 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하나 이상의 면역 억제제/약물이 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 하나 이상의 면역 억제제/약물은 유도 요법 또는 유지 요법에 사용될 수 있다. 유도 또는 유지 단계에서 동일하거나 또는 상이한 약물이 사용될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 유도 요법에 다클리주맙(Zenapax)이 사용될 수 있고, 유지 요법에 타크로리무스(Prograf) 및 시롤리무스(Rapimune)가 사용될 수 있다. 또한, 유도 요법에 다클리주맙(Zenapax)이 사용될 수 있고, 유지 요법에 저용량의 타크로리무스(Prograf) 및 저용량의 시롤리무스(Rapimune)가 사용될 수 있다. 또한, 전신 방사선 조사, 흉선 방사선 조사 및 전체 및/또는 부분 비장 절제술을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 비-약물 요법을 사용하여 면역 억제가 달성될 수 있다. 또한, 이들 기술은 하나 이상의 면역-억제 약물과 함께 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실험예를 참조하여 더욱 상세히 설명된다. 이들 예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 명시하지 않는 한, 한정되는 것으로 의도한 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: HLA-펩티드 복합체의 제조
HLA.A0201-BSP 유전자는 시험관내에서 합성되었다(SEQ ID NO: 32). 도 1에 나타내어진 바와 같이, 융합 유전자는 N 말단으로부터 C 말단까지 시그널링 펩티드가 없는 HLA.A0201 분자(SEQ ID NO: 34)의 세포외 영역을 인코딩하기 위한 섹션, 짧은 "GS" 링커 및 비오틴 단백질 리가아제 BirA 기질 펩티드(BSP)를 포함한다. pET22b-HLA.A0201-BSP는 NdeI/Bam H I 분해된 융합 유전자를 pET-22b 발현 벡터에 삽입함으로써 구축되었다.
인간 β2m 유전자(SEQ ID NO: 33)를 시험관내에서 합성하고, pET-22b 발현 플라스미드에 NdeI/Bam H I 분해된 유전자를 삽입함으로써 인간 β2m 발현 벡터 (pET22b-β2m)가 마찬가지로 구축되었다.
그 후, pET22b-HLA.A0201-BSP 및 pET22b-β2m은 BL21로 형질 전환되었고, 높은 발현 수준의 pET22b-HLA 및 pET22b-β2m을 갖는 균주를 진탕기로 37℃에서 2YT 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 2일째, 하룻밤 배양물을 최종 농도 50㎍/㎖로 2YT 배지에서 시딩하고, 진탕기로 3시간 동안 37℃에서 250rpm으로 성장시켰다. OD600이 약 0.8이 되면 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 1mM의 최종 농도가 되도록 첨가했다. 상기 혼합물을 37℃에서 220rpm으로 4시간 동안 펩티드에 배양했다. 세포를 4℃에서 원심분리(8,000rpm)에 의해 수집하고, 40㎖ 완충제/400㎖ 세포에서 완충액(50mM 트리스, 25% 수크로오스, 10mM DTT, 1mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 및 1mM PMSF, pH 8.0)에 재현탁시켰다. 이어서, 현탁액을 초음파(3초 간격으로 99*3초, 400W)로 총 3회 균질화시켰다. 13,000rpm(15분)으로 원심분리하여 상청액을 수집했다.
세포는 각각 200㎕의 대조군 배양물과 발현 배양물로부터 수확하고 4℃에서 원심분리(8,000rpm)했다. 이어서, 세포를 30㎕ 로딩 완충액에 재현탁시키고, 10분 동안 끓인 후, 13,000rpm으로 2분간 원심분리했다. 6㎕의 상청액을 전기 영동에 사용하여 발현을 확인했다.
균질화된 세포(6㎕)는 각각 상청액(가용성, S) 및 침전물(불용성, I) 모두에 대해 전기 영동시켰다. SDS-PAGE는 봉입체에 있어서 HLA 및 β2m 모두의 발현이 확인되었다.
균질화로 생긴 침전물을 완충액(50mM 트리스, 1mM DTT, 1mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100 및 0.1M NaCl; pH 8.0)에 재현탁시키고, 4℃에서 2시간 동안 진탕시킨 후 13,000rpm으로 15분간 원심분리하여 침전물을 수집했다. 상기 봉입체가 하얗게 될 때까지 상기 침전물을 5회 세척했다.
이어서, 세척한 봉입체를 pH 8.0에서 30㎖의 10mM 트리스 및 8M 우레아에 재현탁시켰다. 상청액은 진탕 및 원심분리 후 1.5㎖ Q 컬럼에 로딩되었다. 상기 컬럼을 5 컬럼 체적(CV)에 대한 완충액(10mM 트리스 및 8M 우레아; pH 8.0)으로 평형화시켰다. Q 컬럼을 통해 30㎖의 샘플을 용리시키고, 통과액을 수집했다. E1은 전도도가 3인 또 다른 15㎖의 완충액을 컬럼을 통해 흐르게 함으로써 수집되었고; E2는 전도도가 5인 또 다른 15㎖의 완충액(10mM 트리스 및 8M 우레아; pH 8.0)을 컬럼을 통해 흐르게 함으로써 수집되었고; E3은 전도도가 7인 또 다른 15㎖의 완충액에 의해 수집되었다(10mM Tris 및 8M 우레아; pH 8.0).
HLA 분획은 E1과 E2를 조합함으로써 얻어졌으며, β2m 분획은 통과액과 E2를 조합함으로써 얻어졌다. 2mM DTT 및 1mM EDTA가 상기 분획에 첨가되었고, 단백질은 실온에서 2시간 동안 리폴딩되었다. HLA 및 β2m은 초미세 여과로 각각 약 10mg/㎖의 최종 농도로 농축시키고 -80℃로 유지시켰다.
GL Biochem(Shanghai) Ltd.로부터 구입한 표 7의 펩티드를 사용하여 상이한 HLA-펩티드 복합체를 제조했다. RMF는 WT1의 126-134 단편이다. 무관한 펩티드 YLL은 LMP-1로부터 유래된다. 이들 복합체들은 본원에 개시된 항체의 특이성을 확인하기 위해 사용되었다.
[표 7]
Figure pct00007
표 6의 펩티드는 리폴딩 완충액(0.1M 트리스, 2mM EDTA, 5mM GSH, 0.5mM SSG 및 0.2mM PMSF; pH 8.0)으로 리폴딩되었고, 5% 글리세롤로 보충된 PBS 완충액에 대해 투석되었다. 이어서, 상기 펩티드는 초미세 여과에 의해 농축되어 각각 약 1.8㎖의 최종 부피에 도달되었다. 상기 농축된 펩티드를 Superdex75 크로마토그래피로 정제 했다. 결과는 도 2에 나타내어진다. 피크 1은 복합체화되지 않은 HLA 폴리펩티드에 대응하고, 피크 2는 HLA-WT1 펩티드 복합체에 대응한다. 피크 3은 복합체화되지 않은 β2m에 대응한다.
이어서, 상기 복합체들은 비오티닐화 키트(Bir A, 용액 A, 용액 B, d-비오틴; 미국 콜로라도 Avidity)에 의해 라벨링되었다.
실시예 2: 완전 인간 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한, RMF/HLA 복합체에 특이적으로 결합하는 scFv의 스크리닝
HLA와 복합체화된 WT1 펩티드(RMF)(SEQ ID NO: 1)를 나타내는 파지 라이브러리는 복합체에 특이적으로 결합하는 scFv를 생성하고 스크리닝하는 데 사용되었다. VH 및 VL 단편을 연결하는 링커(SEQ ID NO: 53)를 갖는 다수의 scFv가 단리되었다.
실시예 3: ABU1 및 ABU2의 결합 친화도 분석
항원 결합 유닛 1(ABU1) 및 ABU2로 명명된 선별된 scFv는 ELISA 분석(도 3) 및 FACS 분석(도 4)을 수행함으로써 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드(RMF)에 대한 결합 친화도가 평가되었다.
도 3은 예시적인 ELISA 분석으로부터의 결과를 도시한다. 도 3에 나타내어진 바와 같이, ABU1 및 ABU2 모두는 RMF/HLA.A0201 복합체에 매우 특이적인 것으로 입증되었다.
도 4는 예시적인 결합 친화도 분석으로부터의 FACS 결과를 도시한다. 참조(REF) scFv(SEQ ID NO: 60)와 함께 ABU1 및 ABU2가 이 실시예에서 평가되었다. 본질적으로 WT1 음성 및 HLA 양성인 T2 세포주가 사용되었다. 이어서, T2는 WT1 펩티드(T2/RMF), YLL 음성 대조군(T2/YLL), 참조 펩티드 RMFS1(T2/RMFS1) 또는 참조 펩티드 RMFS2(T2/RMFS2)를 발현하도록 조작되었다. ABU1 및 ABU2 모두는 HLA(T2/RMF)와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합한다. 참조 항원 결합 유닛(REF)은 ABU2보다 RMFS1 및 RMFS2에 대해 비특이적인 결합이 더 높다.
실시예 4: 친화도 성숙
친화도 성숙이 실시되었고, 그 결과 ABU3, ABU4 및 ABU5가 생성되었다. ABU2와 함께 ABU3-5는 WT1 펩티드(RMF/HLA 복합체)에 대한 그들의 결합 친화도가 평가되었다. 2.5㎍/㎖ RMF, 0.5㎍/㎖ RMF, 0.2㎍/㎖ RMF 또는 2.5㎍/㎖ YLL을 사용한 예시적인 ELISA 실험으로부터의 데이터는 도 5에 도시되어 있다. 도 5에 나타내어진 바와 같이, 시험된 모든 항원 결합 유닛에서 특이성이 유지되었다.
ABU2, ABU3, ABU4 및 ABU5가 서열화되었고, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역의 예시적인 정렬이 도 6에 도시되어 있다. 이들 영역은 중쇄 CDR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3뿐만 아니라 경쇄 CDR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다.
실시예 5: 표면 플라즈몬 공명을 사용한 친화도 분석
친화도 성숙된 ABU3의 결합 친화도는 표면 플라즈몬 공명(Biacore® T200, BIAcore, Inc)에 의해 추가로 평가되었고 모체 ABU2와 비교되었다. BIA 평가 3.2, 및 1:1 랭뮤어 모델에 의해 피팅된 운동 곡선으로 분석된 예시적 실험으로부터의 데이터가 도 7에 도시되어있다.
실시예 6: 정면 친화성 크로마토그래피(FACs)를 사용한, 상이한 세포주에 대한 항체의 결합 분석
친화도 성숙 ABU3, ABU4 및 ABU5의 결합 친화도 및 모체 ABU2는 다양한 세포주를 사용하여 추가로 평가되었고, 예시적인 실험 결과는 도 8에 도시되어 있다.
H2452는 WT1 양성 및 HLA 양성인 중피종 세포주이다.
SW480은 WT1 양성 및 HLA 양성인 결장암 세포주이다.
SKOV3는 WT1 양성 및 HLA 양성인 난소암 세포주이다.
BV173은 WT1 양성 및 HLA 양성인 필라델피아 염색체(Ph1)-양성 급성 백혈병 세포주이다.
K562는 WT1 양성 및 HLA 음성인 적백혈병 세포주이다.
T2는 WT1 음성 및 HLA 양성인 체세포 하이브리드 세포주이다.
도 8에 나타내어진 바와 같이, REF는 WT1 양성 및 HLA 양성 세포주뿐만 아니라 WT1 양성 및 HLA 음성 세포주에도 결합한다. 반면에, ABU2-5는 WT1 양성 및 HLA 양성 세포주에 현저히 결합하지만 WT1 음성 또는 HLA 음성 세포주에는 결합하지 않는다.
실시예 7: ADCC 분석
항체-의존성 세포-매개 세포 독성은 CytoTox 96(Promega, Madison, USA)을 사용하여 젖산 탈수소 효소(LDH) 방출 분석에 의해 결정되었다. CD16a로 안정적으로 형질 감염된 NK96 세포가 효과기 세포로서 사용되었고, WT1 및 HLA-A0201 모두를 발현하는 H2452 및 SW480이 표적 세포로서 사용되었다. Fc-scFv 형태의 ABU3-5의 ADCC 활성을 시험하고, 다음과 같이 계산되었다(식 중, spon.release는 자발적 방출을 나타냄):
Figure pct00008
실시예 8: WT1 CAR-T 세포의 구축
pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-28Z, pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-BBZ, pRRLSIN-cPPT.EF-1α1A4-28BBZ, pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-28Z-F2A-EGFP, pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-BBZ-F2A-EGFP, 및 pRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A4-28BBZ-F2A-EGFP를 포함하는 pRRLSIN-cPPT.EF-1α를 사용하여, 다양한 ABU3-기반 키메라 항원 수용체를 발현하는 렌티바이러스 플라스미드를 클로닝했다. ABU3-28Z의 핵산 서열은 CD8α 시그널링 도메인(SEQ ID NO: 35), ABU3 scFv(SEQ ID NO: 37), 및 CD8 힌지(SEQ ID NO: 39), CD28 막 관통 도메인(SEQ ID NO: 41), CD28 세포내 시그널링 도메인(SEQ ID NO: 43) 및 CD3Z(SEQ ID NO: 45)를 인코딩하는 빌딩 블록을 갖도록 구축되었다. ABU3-28BBZ의 핵산 서열은 CD8α 시그널링 도메인(SEQ ID NO: 35), ABU3 scFv(SEQ ID NO: 37), 및 CD8 힌지(SEQ ID NO: 39), CD28 막 관통 도메인(SEQ ID NO: 41), CD28 세포내 시그널링 도메인(SEQ ID NO: 43), CD137 세포내 시그널링 도메인(SEQ ID NO: 49), 및 CD3Z(SEQ ID NO: 45)를 인코딩하는 빌딩 블록을 갖도록 구축되었다. pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP는 대조군으로 사용되었다.
이어서, ABU3 CAR을 발현하는 렌티바이러스 플라스미드는 pRSV-REV, pMDLg-RRE 및 VSV-G(Addgene, Cambridge, MA, USA)를 사용하여 패키징되었고, 293T 세포(ATCC:CRL-11268)로 형질 감염되었다. 형질 감염된 세포를 37℃에서 72시간 동안 성장시켰고, 상청액을 수집하여 바이러스를 농축시켰다. 렌티바이러스 역가를 결정하기 위해 적정이 수행되었다. 이어서, 농축된 렌티바이러스를 MOI=15(32℃, 1,800rpm)에서 활성화 T 세포로 형질 도입시켰다. 유동 세포 분석법에 의한 EGFP를 통해 ABU3-CAR의 발현을 측정했다. 대조군 및 ABU3 CAR(ABU3-28Z, ABU3-BBZ 및 ABU3-28BBZ)에 대한 형질 도입 효율은 68.41%, 58.3%, 70.7%, 및 32.6%로 측정되었다.
항-WT1 CAR T 세포 ABU3-28Z 및 ABU3-BBZ에 대해 세포 독성이 평가되었고 음성 대조군(UTD)과 비교했다. 예시적인 실험의 결과는 도 10a 및 도 10b에 도시되어 있다. H2452는 WT1 양성 및 HLA 양성인 중피종 세포주이다. SW480은 WT1 양성 및 HLA 양성인 결장암 세포주이다. 도 10a 및 10b에 나타내어진 바와 같이, CAR T 세포는 SW480 및 NCI-H2452 모두에 대해 세포 독성이 있는 것으로 확인되었다.
추가의 CAR T 세포는 ABU2, ABU4, 및 ABU5에 대해 구축되었고, SW480 및 NCI-H2452에 대해 세포 독성이 있는 것으로 확인되었다.
실시예 9: 이작용성 항체
CD3뿐만 아니라 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 이작용성 항체를 생성했다(ABU6). 구체적으로, 예시적인 실험에 있어서 항-WT1 scFv(ABU3)의 단편 1은 순방향 프라이머 ABU3-PF(SEQ ID NO: 54) 및 역방향 프라이머 ABU3-PR(SEQ ID NO: 55)에 의해 주형(V152-ABU3-huFC 플라스미드)으로부터 증폭되었다. 항-CD3 scFv의 단편 2는 프라이머 PCMV(SEQ ID NO: 56) 및 PH-R(SEQ ID NO: 57)에 의해 PIH-hu9F2-CD3 플라스미드(CN201610626384.7)로부터 증폭되었다. 단편 1 및 단편 2는 PCMV 및 ABU3-PR에 의해 결찰되고 증폭되었다. 생성된 scFv를 BamHI/NheI로 분해하고 분해된 PIH-hu9F2-CD3를 플라스미드에 삽입함으로써 이작용성 scFv가 얻어졌다(SEQ ID NO: 63). 6개의 연속적인 H는 C 말단에 있고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 그 후, 이작용성 scFv는 293F 세포로 형질 감염되었고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. SDS PAGE 결과는 도 9에 도시되었고, WT1/CD3 이작용성 scFv는 약 55kDa에서 밴드로서 도시되었다.
실시예 10: IL-12를 발현하는 WT CAR-T 세포
도 11에 나타내어진 ABU3-28Z-IL12 CAR 벡터는 실시예 8~9와 마찬가지의 방법으로 구축되었다. ABU3-28Z-GFP 단편을 제공하기 위해, ABU3(SEQ ID NO: 37), CD28 막 관통 도메인(SEQ ID NO: 41) 및 세포내 도메인(SEQ ID NO: 43), CD3Z(SEQ ID NO: 35), 및 EGFP(SEQ ID NO: 78)의 PCR 증폭이 수행되었고, 이는 ABU3-28Z-GFP CAR 벡터를 제공하기 위해 효소 절단을 통해 pRRLSIN 벡터에 삽입되었다. IL2-IL12 서열을 제공하기 위해, IL-2 프로모터 서열(SEQ ID NO: 77) 및 IL-12 유전자 서열(SEQ ID NO: 76)이 PCT를 통해 증폭되었고, 이는 ABU3-28Z-IL12 CAR 벡터를 제공하기 위해 pRRLSIN 벡터에 삽입되었다. VRRLSIN-ABU3-28Z-IL12 렌티바이러스는 패키징되었다. ABU3-28Z-IL12 CAR T 세포를 제공하기 위해, T 세포는 렌티바이러스에 의해 활성화되고 형질 도입되었다.
ABU3-28Z-IL12 CAR T 세포의 시험관내 세포 사멸 효과를 측정하기 위해 인간 결장암 세포주 SW480, 인간 중피종 세포주 H2452 및 난소암 세포주 OVCAR3이 표적 세포로서 사용되었다. CAR T 세포는 각각 20:1, 10:1 및 5:1의 효과기:표적(E:T)비로 첨가되었고, 시험관내에서 18시간 동안 배양했다. CytoTox 96® 비방사능성 세포 독성 분석 키트가 사용되었고, 결과는 도 12a~12c에 나타내어진다. 시험된 각각의 E:T비에 대해, ABU3-28Z-IL-12 CAR-T 세포는 ABU3-28Z CAR-T 세포 및 UTD 세포보다 더 큰 세포 독성을 갖는다.
[표 8]
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
SEQUENCE LISTING <110> CARSGEN THERAPEUTICS CO., LTD. SHANGHAI CANCER INSTITUTE <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF CELLULAR IMMUNOTHERAPY <130> 52022-703.602 <140> PCT/CN2018/089061 <141> 2018-05-30 <150> PCT/CN2017/086606 <151> 2017-05-31 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Arg Ala Ser Gln Ile Val Met Ser Asn Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gly Ala Ser Arg Arg Val Thr 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Glu Leu Ser Met His 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr 1 5 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Gly Ser Asp Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Asp Thr Ser Asn Lys His Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Leu Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val 1 5 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Gly Ser Asp Ser Gly Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Asp Thr Ser Arg Lys His Ser 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Leu Val Val Pro Asp Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggaggt 300 agcagtggct ggtacaactg gttcgacccc tggggcagag gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180 gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300 gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgtacctg ccgacggtga aacaatttac 180 gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300 gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Val Pro Asp Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggacta gttgttcctg atgatggtga aacaatatac 180 gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300 gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Met Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Val Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ile Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 27 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 gaaattgtga tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagggccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gattgttatg agcaacttct tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ggagggtcac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcagtc tcatcatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caatatggta gctcaccgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgt 324 <210> 28 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly 20 25 30 His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Tyr Ser Gly 85 90 95 Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 29 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 caggctgtgg tgactcagga gccctcagtg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60 acctgtggct ccgacactgg agctgtcacc agtggtcatt atccctactg gttccagcag 120 aagcctggcc aagcccccag gacactgatt tatgatacaa gcaacaaaca ctcctggaca 180 cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240 cagcctgacg atgaggctga ctattactgc ttgctctcct atagtggtga atgggtgttc 300 ggcggaggga ccaaagtcac cgtccta 327 <210> 30 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly Pro Val Thr Arg Gly 20 25 30 His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Tyr Ser Gly 85 90 95 Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 31 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 caggctgtgg tgactcagga gccctcagtg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60 acctgtggct ccgactctgg accggtcacc cgagggcatt acccctactg gttccagcag 120 aagcctggcc aagcccccag gacactgatt gatgatacaa gccgcaaaca ctcctggaca 180 cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240 cagcctgacg atgaggctga ctattactgc ttgctctcct atagtggcga atgggtgttc 300 ggcggaggga ccaaagtcac cgtccta 327 <210> 32 <211> 901 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 atacatatgg gtagccatag catgcgctat tttttcacca gcgttagccg tccgggtcgt 60 ggtgaaccgc gttttattgc agttggttat gttgatgata cccagtttgt gcgctttgat 120 agtgatgcag caagccagcg tatggaaccg cgtgcaccgt ggattgaaca agaaggtccg 180 gaatattggg atggtgaaac ccgtaaagtt aaagcacata gccagaccca tcgtgttgat 240 ctgggcaccc tgcgtggcta ttataaccag agcgaagcag gttcacatac cgttcagcgt 300 atgtatggtt gtgatgttgg tagcgattgg cgttttctgc gtggttatca tcagtatgcc 360 tatgatggca aagattatat cgccctgaaa gaagatctgc gtagctggac cgcagcagat 420 atggcagcac agaccaccaa acataaatgg gaagcagcac atgttgcaga acagctgcgt 480 gcatatctgg aaggcacctg tgttgaatgg ctgcgtcgtt atctggaaaa tggtaaagaa 540 accctgcagc gtaccgatgc accgaaaacc cacatgaccc atcatgcagt tagcgatcat 600 gaagcaaccc tgcgttgttg ggcactgagc ttttatccgg cagaaatcac cctgacctgg 660 cagcgtgatg gtgaagatca gacccaggat accgaactgg ttgaaacacg tcctgccggt 720 gatggcacct ttcagaaatg ggcagcagtt gttgttccga gcggtcaaga acagcgttat 780 acctgtcatg ttcagcatga aggtctgccg aaaccgctga ccctgcgctg ggaaggtagc 840 ggtctgaatg atatttttga agcccagaaa atcgaatggc acgagtaata aggatccgcg 900 c 901 <210> 33 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 atatccatat gattcagcgt accccgaaaa ttcaggttta tagccgtcat ccggcagaaa 60 atggtaaaag caattttctg aattgctacg tgagcggttt tcatccgagc gatattgaag 120 ttgatctgct gaaaaatggc gaacgcattg aaaaagttga acatagcgat ctgagcttta 180 gcaaagattg gagcttttat ctgctgtact ataccgaatt taccccgacc gaaaaagatg 240 aatatgcctg tcgtgttaat catgttaccc tgagccagcc gaaaattgtt aaatgggatc 300 gtgatatgta ataaggatcc agtcg 325 <210> 34 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 55 60 Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gln Tyr Ala 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 37 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 ggggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180 gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tacagaccta 300 gcagctggta ctaatgacta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360 ggcggttcag gcggaggtgg ttctggcggt ggcggatcgc aggctgtggt gactcaggag 420 ccctcagtga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtggctc cgactctgga 480 ccggtcaccc gagggcatta cccctactgg ttccagcaga agcctggcca agcccccagg 540 acactgattg atgatacaag ccgcaaacac tcctggacac ctgcccggtt ctcaggctcc 600 ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgacga tgaggctgac 660 tattactgct tgctctccta tagtggcgaa tgggtgttcg gcggagggac caaagtcacc 720 gtccta 726 <210> 38 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr 130 135 140 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp 180 185 190 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr 225 230 235 240 Val Leu <210> 39 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 40 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 41 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60 gcctttatta ttttctgggt g 81 <210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 43 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 44 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 45 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 45 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 46 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 46 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 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Sequence: Synthetic primer <400> 54 gctttggttt ccaggtgcaa gatgtggggt gcagctggtg gagt 44 <210> 55 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 gatatcggat ccaccacctc ctaggacggt gactttggtc c 41 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 ggctaactag agaacccact gc 22 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 acatcttgca cctggaaacc aaagc 25 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mediator complex subunit 13-like (MED13L) sequence <400> 58 Arg Met Phe Pro Thr Pro Pro Ser Leu 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class Q (PIGQ) sequence <400> 59 Arg Met Phe Pro Gly Glu Val Ala Leu 1 5 <210> 60 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Asp Pro Trp Gly Gln Glu Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 130 135 140 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 165 170 175 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 180 185 190 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr 130 135 140 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp 180 185 190 Thr Pro Ala Arg Phe Ser 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ccatgacctg cagagccagt tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag 1260 cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg atttatgaca catccaaagt ggcttctgga 1320 gtcccttatc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctcat actctctcac aatcagcagc 1380 atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg 1440 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa catcatcacc atcatcat 1488 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Latent membrane protein-1 (LMP-1) sequence <400> 65 Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu 1 5 <210> 66 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 50 55 60 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 65 70 75 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr 130 135 140 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp 180 185 190 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly 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ccactgtgct 420 ggttttatct tttgtgatat cttcatgatc aatctcttca gaagtgcaag ggtaaaattc 480 tagagtttgt ctggccttct ggagcatgtt gctgacggcc ctcagcaggt tttgggagtg 540 gtgaaggcat gggaacattc ctgggtctgg agtggccacg gggaggtttc tagatccgcc 600 gccacccgac ccaccaccgc ccgagccacc gccaccactg cagggcacag atgcccattc 660 gctccaagat gagctatagt agcggtcctg ggcccgcacg ctaatgctgg catttttgcg 720 gcagatgacc gtggctgagg tcttgtccgt gaagactcta tctttctttt ctctcttgct 780 cttgccctgg acctgaacgc agaatgtcag ggagaagtag gaatgtggag tactccaggt 840 gtcagggtac tcccagctga cctccacctg ccgagaattc tttaatggct tcagctgcaa 900 gttcttgggt gggtcaggtt tgatgatgtc cctgatgaag aagctgctgg tgtagttttc 960 atacttgagc ttgtgaacgg catccaccat gacctcaatg ggcagactct cctcagcagc 1020 tgggcaggca ctgtcctcct ggcactccac tgagtactca tactccttgt tgtcccctct 1080 gactctctct gcagagagtg tagcagctcc gcacgtcacc ccttgggggt cagaagagcc 1140 tctgctgctt ttgacactga atgtcaaatc agtactgatt gtcgtcagcc accagcaggt 1200 gaaacgtcca gaataattct tggcctcgca tcttagaaag gtcttatttt tgggttcttt 1260 ctggtccttt aaaatatcag tggaccaaat tccatcttcc tttttgtgaa gcagcaggag 1320 cgaatggctt agaacctcgc ctcctttgtg acaggtgtac tggccagcat ctccaaactc 1380 tttgacttgg atggtcaggg ttttgccaga gcctaagacc tcactgctct ggtccaaggt 1440 ccaggtgata ccatcttctt caggggtgtc acaggtgagg accaccattt ctccaggggc 1500 atccggatac caatccaatt ctacgacata aacatctttc ttcagttccc atatggccac 1560 gaggggagat gccagaaaaa ccagggaaaa ccaagagatg accaactgct ggtgacacat 1620 <210> 77 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 caggagttga ggttactgtg agtagtgatt aaagagagtg atagggaact cttgaacaag 60 agatgcaatt tatactgtta attctggaaa aatattatgg gggtgtcaaa atgtcccggg 120 acaattgacg ccttctgtat gaaacagttt ttcctccacg ccttctgtat gaaacagttt 180 ttcctccacg ccttctgtat gaaacagttt ttcctccgtc gaggacaatt gacgccttct 240 gtatgaaaca gtttttcctc cacgccttct gtatgaaaca gtttttcctc cacgccttct 300 gtatgaaaca gtttttcctc c 321 <210> 78 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 78 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 79 His His His His His His 1 5 <210> 80 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr 130 135 140 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly 145 150 155 160 Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp 180 185 190 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr 225 230 235 240 Val Leu Thr <210> 81 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr 130 135 140 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Ser Gly 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Asp Asp Thr Ser Arg Lys His Ser Trp 180 185 190 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr 225 230 235 240 Val Leu Thr <210> 82 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr 130 135 140 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly 145 150 155 160 Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp 180 185 190 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr 225 230 235 240 Val Leu Thr <210> 83 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Val Pro Asp Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr 130 135 140 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Asp Thr Gly 145 150 155 160 Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp 180 185 190 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Tyr Ser Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr 225 230 235 240 Val Leu Thr

Claims (62)

  1. 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛으로서,
    상기 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 상기 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 유의한 결합을 나타내지 않고, 상기 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는, 항원 결합 유닛.
  2. 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛으로서,
    상기 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 상기 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는 참조 항원 결합 유닛과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 덜 나타내고, 상기 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는, 항원 결합 유닛.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 HLA는 HLA-A2를 포함하는, 항원 결합 유닛.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대한 결합 수준은 상기 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 대한 결합 수준의 10% 이하인, 항원 결합 유닛.
  5. 제 4 항에 있어서,
    결합 특이성은 FACS에 의해 결정되는, 항원 결합 유닛.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 결합 특이성은 ELISA에 의해 결정되는, 항원 결합 유닛.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항원 결합 유닛은 1.5nM 미만의 KD를 나타내는, 항원 결합 유닛.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항원 결합 유닛은 50pM 미만의 KD를 나타내는, 항원 결합 유닛.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 상기 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하며;
    상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 가지며;
    상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10, 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 항원 결합 유닛.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 경쇄 CDR은 LCDR 서열의 하기 조합 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 유닛.
    a. SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7;
    b. SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13; 및
    c. SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 13
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 중쇄 CDR은 HCDR 서열의 하기 조합 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 유닛.
    a. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4;
    b. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10;
    c. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 10; 및
    d. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, 및 SEQ ID NO: 10
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항원 결합 유닛은 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다가 항체, 또는 키메라 항원 수용체인, 항원 결합 유닛.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항원 결합 유닛은 sFc, Fv, Fab, 또는 (Fab)2인, 항원 결합 유닛.
  14. 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 유닛으로서,
    상기 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 상기 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고,
    상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하고,
    상기 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10, 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 항원 결합 유닛.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 상기 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하며;
    상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 가지며;
    상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 항원 결합 유닛.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 경쇄 CDR은 LCDR 서열의 하기 조합 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 유닛.
    a. SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7;
    b. SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13; 및
    c. SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 13
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 중쇄 CDR은 HCDR 서열의 하기 조합 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 유닛.
    a. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4;
    b. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10;
    c. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 10; 및
    d. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, 및 SEQ ID NO: 10
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 항원 결합 유닛은 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 키메라 항원 수용체인, 항원 결합 유닛.
  19. 제 14 항에 있어서,
    상기 항원 결합 유닛은 sFc, Fv, Fab, 또는 (Fab)2인, 항원 결합 유닛.
  20. 세포외 항원 결합 유닛, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체로서,
    상기 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 상기 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 세포외 항원 결합 유닛은 상기 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 유의한 결합을 나타내지 않고, 상기 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  21. 세포외 항원 결합 유닛, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체로서,
    상기 세포외 항원 결합 유닛은 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드에 특이적으로 결합하고, 상기 WT1 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 세포외 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는 참조 항원 결합 유닛의 것과 비교하여 HLA와 복합체화된 참조 펩티드에 대해 비특이적인 결합을 덜 나타내고, 상기 참조 펩티드는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 세포외 항원 결합 유닛은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하고,
    상기 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; 상기 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하며;
    상기 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 5~7 및 11~15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 가지며;
    상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 SEQ ID NO: 2~4, 8~10 및 16~17로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 경쇄 CDR은 LCDR 서열의 하기 조합 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
    a. SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7;
    b. SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13; 및
    c. SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 13
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 중쇄 CDR은 HCDR 서열의 하기 조합 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
    a. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4;
    b. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10;
    c. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 10; 및
    d. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, 및 SEQ ID NO: 10
  25. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, 또는 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  26. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 WT1, 또는 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는 세포의 세포 독성을 유도하는, 키메라 항원 수용체.
  27. 제 26 항에 있어서,
    표적 세포에 대한 키메라 항원 수용체의 비가 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2.5:1, 1:1, 또는 1:3일 때, 상기 세포 독성의 수준은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%인, 키메라 항원 수용체.
  28. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 유닛 또는 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  29. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 유닛 또는 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는, 단리 된 핵산.
  30. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 유닛 또는 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  31. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 유닛 또는 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체를 발현하는, 숙주 세포.
  32. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 유닛 또는 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 포함하는, 숙주 세포.
  33. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 유닛을 생성하는 방법으로서,
    상기 항원 결합 유닛을 발현하기에 적합한 조건 하에서 제 31 항 또는 제 32 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의해 발현된 상기 항원 결합 유닛을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체를 생성하는 방법으로서,
    상기 키메라 항원 수용체를 발현하기에 적합한 조건 하에서 제 31 항 또는 제 32 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의해 발현된 상기 키메라 항원 수용체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 세포를 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 세포는 생체내에서 상기 키메라 항원 수용체와 접촉되는, 방법.
  37. 제 35 항에 있어서,
    상기 세포는 시험관내에서 상기 키메라 항원 수용체와 접촉되는, 방법.
  38. 제 35 항에 있어서,
    상기 세포는 암 세포인, 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 세포는 혈액암 세포 또는 고형 종양 세포인, 방법.
  40. 제 38 항에 있어서,
    상기 세포는 신아세포종 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 난소암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포, 또는 장암 세포인, 방법.
  41. 제 38 항에 있어서,
    상기 세포는 중피종암 세포인, 방법.
  42. 표적 세포의 사멸을 유도하는 방법으로서,
    상기 방법은 제 31 항 또는 제 32 항에 기재된 복수의 숙주 세포를 상기 표적 세포에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 복수의 숙주 세포를 상기 표적 세포에 투여하는 단계는 상기 항원 결합 유닛, 키메라 항원 수용체, 또는 이를 인코딩하는 핵산이 결핍되어 있는 숙주 세포의 유사량을 투여하는 것에 비해 더 많은 표적 세포의 사멸을 유도하는, 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 복수의 숙주 세포는 생체내에서 상기 표적 세포에 투여되는, 방법.
  44. 제 42 항에 있어서,
    상기 복수의 숙주 세포는 시험관내에서 상기 표적 세포에 투여되는, 방법.
  45. 제 42 항에 있어서,
    상기 표적 세포는 암 세포인, 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    상기 암 세포는 혈액암 세포 또는 고형 종양 세포인, 방법.
  47. 제 45 항에 있어서,
    상기 세포는 신아세포종 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 난소암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포, 또는 장암 세포인, 방법.
  48. 제 45 항에 있어서,
    상기 세포는 중피종암 세포인, 방법.
  49. 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체는 암 세포의 사멸을 유도하는, 방법.
  50. 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 유닛 또는 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 제 28 항에 기재된 약학적 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 혈액암 또는 고형 종양인, 방법.
  53. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 중피종인, 방법.
  54. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 신아세포종, 결장암, 직장암, 난소암, 만성 골수성 백혈병, 또는 장암인, 방법.
  55. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체, 및 IL-12를 포함하는, 면역 반응성 세포.
  56. 제 55 항에 있어서,
    상기 IL-12는 상기 면역 반응성 세포의 표면 상에서 발현되는, 면역 반응성 세포.
  57. 제 55 항에 있어서,
    상기 IL-12는 상기 면역 반응성 세포내에서 발현되는, 면역 반응성 세포.
  58. 제 55 항에 있어서,
    상기 면역 반응성 세포는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%의 세포 독성을 갖는, 면역 반응성 세포.
  59. 제 58 항에 있어서,
    상기 면역 반응성 세포는 효과기:표적(E:T)비가 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 또는 그것의 조합일 때, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%의 세포 독성을 갖는, 면역 반응성 세포.
  60. 제 55 항에 있어서,
    상기 면역 반응성 세포는 표적 세포의 사멸을 유도하는, 면역 반응성 세포.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 표적 세포는 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는, 면역 반응성 세포.
  62. 필요로 하는 대상체에서 HLA와 복합체화된 WT1 펩티드를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 방법으로서,
    상기 방법은 제 55 항에 기재된 면역 반응성 세포의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

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