KR20200005669A - 만난아제 변이체 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 만난아제의 변이체, 상기 변이체를 포함하는 조성물, 그의 생산 방법, 및 만난 함유 물질을 분해 및 변형하는데 상기 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

만난아제 변이체

본 발명은 만난아제 (mannanase) 효소의 변이체에 관한 것이다. 상기 변이체는 세탁 및 세정 분야에서, 사료, 식품, 펄프 및 제지 및 석유 산업에서와 같이, 만난 (mannan)의 분해 또는 변형이 요구되는 산업 분야에서의 응용에 유용하다. 본 발명은 또한 유용한 만난아제 효소, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 효소 조성물 및 이의 생산 및 사용 방법을 제공한다.

만난은 다양한 식물에서 발견되는 만노스 함유 폴리사카라이드이다. 만난은 수성 환경에서 잘 녹지 않으며, 이의 물리화학적 특성으로 인해 점성의 분산액을 생성한다. 또한, 만난은 높은 물 결합 능력 (water binding capacity)을 가지고 있다. 이러한 모든 특성은 양조, 제빵, 동물 영양, 및 세탁 및 세정 분야를 포함하는 여러 산업에서 문제를 야기한다.

식물 기반의 식이요법에서 다양한 β-만난이 존재하며, 그의 양과 특성에 따라 영양소 소화, 미생물 군집화 및 성장 성능을 손상시킬 수 있다. 만난의 효소적 분해는 고 수용성 만난의 소화물 점도를 감소시키고, 콩과 (leguminoseae)에 존재하는 수불용성 선형 만난을 형성할 수 있는 만노-올리고사카라이드의 생성을 초래한다. 만난아제는 모든 단위 동물 (monogastric animals)에서 평균 일일 증체량, 사료 효율, 체중 균일성 및 생존성을 증가시킨다.

곡류 식이요법을 포함하는 단위 동물용 사료와 같은 동물 사료 분야에 있어서, 만난은 장 내용물의 점도에 기여하는 요인이므로, 사료 소화율과 동물 성장 속도에 악영향을 미친다. 반추동물 (ruminant)의 경우, 만난은 섬유질 섭취의 실질적인 성분을 나타내며, 만난의 보다 완전한 소화는 보다 높은 사료 전환 효율을 촉진할 수 있다.

세탁 및 세정 분야에서, 만난아제를 포함하는 효소 조성물은 만난을 분해하는데 사용될 수 있다. 그러나, 우수한 만난 분해 활성을 나타내면서 다양한 저장 및 사용 조건에서 안정한 만난아제를 제공하는 것은 어렵다.

산업용 효소의 안정성은 효소의 자연 환경과는 매우 다른 조건에서 효소가 종종 사용되기 때문에 중요한 특성이다. 초기 시험에서 우수한 성능을 나타내는 야생형 효소는 산업적 규모의 생산에서는 적당하지 않거나, 또는 전형적인 적용 또는 저장 조건에서 안정하지 않다.

단백질의 N-연결된 글리코실화는 글리칸으로 알려져 있는 당 분자 올리고사카라이드가 단백질의 아스파라긴 (Asn, N) 잔기의 아미드 질소기에 부착되는 번역후 변형의 유형이다. 이러한 유형의 연결은 효소 및 다른 단백질의 구조와 기능 모두에서 중요하다.

본 발명의 목적은 상이한 산업 공정에 적용될 때, 만난아제 활성을 나타내고 개선된 안정성을 갖는 만난아제의 변이체뿐만 아니라 만난 분해 또는 변형을 위한 효소 조성물을 제공하는데 있다.

제1 양상에 따르면, 위치 123, 158, 180, 272, 307 또는 316에 상응하는 위치에서 아미노산의 적어도 하나의 치환을 포함하는 만난아제의 변이체를 제공하며, 상기 변이체는 만난아제 활성을 가지며, 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되고:

1) 서열번호: 2의 잔기 27-331에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;

2) 높은 엄격도 조건 (high stringency conditions) 하에 하기와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 변이체:

a) 서열번호: 1 (man7)의 뉴클레오티드 79 - 993 또는

b) a)의 전장 보체; 및

3) 서열번호: 1에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 게놈 DNA 서열에 의해 코딩되는 변이체;

상기 아미노산 넘버링 (numbering)은 신호 서열을 함유하는 서열번호: 2 (Man7) 전장 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 상응한다.

본 발명의 만난아제의 변이체는 양호한 안정성 및 만난아제 활성을 갖는데 유리하다. 상기 변이체는 세제에서, 구체적으로 고온에서 개선된 안정성을 갖는다. 그러므로, 본 발명의 만난아제의 변이체는 생산 시에 향상된 수율 및 사용 시에 우수한 성능을 제공할 수 있다. 상기 변이체의 안정성은 세제에서 및 세탁 세제와 같이, 만난 분해가 사용되는 응용 분야에서 전형적으로 사용되는 온도에서 특히 우수하다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 적어도 2개의 치환을 갖는다. 이는 고온에서 사용 시에 세제에서 안정성이 추가적으로 개선되는 이점이 있다. 대안으로서, 2개의 치환은 안정성 이외에, 상기 변이체의 다른 특성이 개선되도록 선택될 수 있다.

본 발명의 제2 양상에 따르면, 상기 제1 양상의 만난아제의 변이체 및 하기를 포함하는 효소 조성물을 제공한다:

a. 예를 들어 유기산, 시트르산, 아스코르브산, 벤조산 및 그의 염 및 유도체, 소듐 벤조에이트, 벤조에이트, 히드록시벤조에이트 및 유도체, 소르브산, 소듐 소르베이트, 소르베이트, 염, 예컨대 소듐 클로리드 또는 포타슘 클로리드, 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온 (BIT) 또는 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 보존제;

b. 선택적으로 폴리올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 글리세롤, 당, 당 알콜, 폴리사카라이드, 락트산, 붕산, 붕산 유도체, 방향족 보레이트 에스테르, 4-포르밀페닐 보론산, 페닐 보론산 유도체, 펩티드, 계면활성제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 안정화제;

c. 선택적으로 매개체 (mediator)를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제 (xylanases), 만난아제, 쿠티나제 (cutinases), 에스테라제, 피타제 (phytases), DNAses, 펙티나제 (pectinases), 펙틴분해 효소 (pectinolytic enzymes), 펙테이트 리아제 (pectate lyases), 카르보히드라제 (carbohydrases), 아라비나제 (arabinases), 갈락타나제 (galactanases), 잔타나제 (xanthanases), 자일로글루카나제 (xyloglucanases), 락카제 (laccases), 퍼옥시다제 및 옥시다제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및

d. 선택적으로 말토덱스트린, 곡물가루 (flour), 소듐 클로리드, 술페이트, 소듐 술페이트, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.

실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 효소 조성물에 포함되는 변이체는 재조합 숙주 세포에서 생산을 가능하게 하고 산업적 적용을 위한 효소 조성물에서 유용하게 하는 구조 및 특성을 갖는다. 상기 효소 조성물은 만난아제의 변이체가 세탁 및 세척 용도에서 만난을 분해하기 위해 사용될 때 양호한 안정성, 세척 성능 및 특이적 활성을 갖기 때문에 세제 제제에서 특히 바람직하다.

제3 양상에 따르면, 제1 양상의 만난아제의 변이체 또는 제2 양상의 효소 조성물을 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

본 발명의 세제 조성물은 만난 함유 얼룩을 제거하는데 안정적이고, 효율적이며, 경제적이라는 점에서 유리하다.

다른 양상에 따르면, 세제에서 본 발명의 효소 조성물 또는 본 발명의 만난아제의 변이체의 용도 및 사용 방법을 제공한다.

제4 양상에 따르면, 제1 양상의 만난아제의 변이체를 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 하는 유전자 요소 (genetic elements)를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.

제5 양상에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 만난아제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다:

a. 상기 제4 양상의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서,

상기 유전자 요소는 상기 재조합 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드의 생산을 조절하는 적어도 하나의 조절 서열을 포함하고;

상기 유전자 요소는 선택적으로 상기 숙주 세포 밖으로 상기 재조합 폴리펩티드를 운반하는 신호 서열을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하며;

상기 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 하는 조건하에 배양을 수행하는 것인 단계; 및

b. 상기 재조합 폴리펩티드를 회수하는 단계.

상기 방법은 만난아제의 변이체를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 생산하는 효율적인 방법을 제공한다. 상기 만난아제의 변이체가 재조합 숙주 세포에서 생성되기 때문에, 원하는 방식으로 최적화되고, 맞춤화되며, 제어될 수 있는 생산 시스템이 제공된다. 상기 방법에 의해 생산된 만난아제의 변이체는 천연 만난아제와는 구조 및 기능적 수준에서 상이할 수 있다.

다른 양상에 따르면, 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 수득할 수 있고, 만난아제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 효소 제제를 제공한다.

상기 효소 제제 또는 효소 조성물은 매개체를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제, 만난아제, 쿠티나제, 에스테라제, 피타제, DNAses, 펙티나제, 펙테이트 리아제, 펙틴분해 효소, 카르보히드라제, 아라비나제, 갈락타나제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 옥시다제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 다른 효소(들)뿐만 아니라, 안정화제, 버퍼 (buffers), 계면활성제, 표백제 (bleaching agents), 매개체, 부식방지제 (anti-corrosion agents), 빌더 (builders), 재침착 방지제 (anti-redeposition agents), 형광 증백제 (optical brighteners), 염료 (dyes), 안료 (pigments), 향료 (perfumes), 부식제 (caustics), 연마제 (abrasives) 및 보존제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적절한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

제6 양상에 따르면, 만난 함유 물질을 유효한 양의 본 발명의 효소 조성물 또는 본 발명의 만난아제의 변이체로 처리하는 단계를 포함하는, 만난 함유 물질을 분해 또는 변형시키는 방법을 제공한다.

제7 양상에 따르면, 본 발명의 효소 조성물 또는 본 발명의 만난아제의 변이체, 및 식물 기원의 적어도 하나의 단백질 공급원 또는 만난 함유 산물 또는 부산물, 및 하기를 포함하는 동물 사료를 제공한다:

a. 선택적으로 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제 (endoglucanase), 베타-글루카나제 (beta-glucanase) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및

b. 선택적으로 말토덱스트린, 곡물가루, 염, 소듐 클로리드, 술페이트, 소듐 술페이트, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.

제8 양상에 따르면, 본 발명의 효소 조성물 또는 본 발명의 만난아제의 변이체; 및 하기를 포함하는 사료 보충제를 제공한다:

a. 선택적으로 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제, 베타-글루카나제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및

b. 선택적으로 말토덱스트린, 곡물가루, 염, 소듐 클로리드, 술페이트, 소듐 술페이트, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.

상기 사료 및 사료 보충제는 상기 변이체가 없는 사료와 비교하여 사료의 영양적 가치를 향상시킨다. 본 발명의 효소 조성물은 상기 만난아제의 변이체를 포함하며, 이는 개선된 안정성을 갖는다. 본 발명의 효소 조성물 및 본 발명의 변이체는 사료 중에 존재하는 만난을 분해하여, 이를 동물이 보다 쉽게 소화할 수 있도록 한다. 특히, 대두 밀 (soybean meal) 함유 사료에 있어서, 효소 소화로부터 생성된 결과인 만난-올리고사카라이드는 장내 미생물에 대해 유익한 영향을 주어 결과적으로 동물의 수행에 유익하다. 옥수수 대두 기반 식이요법에 존재하는 아라비녹실란 (arabinoxylan)을 소화하기 위해 자일라나제를 포함시킴으로써 만난아제 변이체의 효과를 증진시킬 수 있다. 본 발명의 변이체는 또한 습식 사료의 유동학적 특성을 변형시키기 위해 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 사료는 동물 단백질, 예컨대 미트 밀 (meat meal) 또는 골 밀 (bone meal)을 포함할 수 있다.

다른 양상에 따르면, 하기에 있어서, 본 발명의 동물 사료 또는 본 발명의 사료 보충제의 용도 및 사용 방법을 제공한다:

a. 동물에게의 급여;

b. 동물 체중 증량 개선.

일 구체예에서, 상기 동물은 단위 동물 또는 반추동물이다. 다른 구체예에서, 상기 동물은 육계 (broiler chicken), 산란계 (egg-laying chicken), 돼지 (swine), 칠면조 (turkey), 또는 수경 생물체 (aquaculture organism) 예컨대 어류이다. 다른 구체예에서, 상기 동물은 반추동물이다.

제9 양상에 따르면, 오일 시추 (oil drilling) 또는 수압-파쇄법 (hydro-fracturing)에 있어서, 본 발명의 변이체 또는 본 발명의 효소 조성물의 용도 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 효소 조성물 및 본 발명의 변이체는 오일 시추 유체 (oil drilling fluids) 및 수압-파쇄 유체 (hydro-fracturing fluids)의 유동학적 특성을 개질시켜서, 오일 회수를 향상시키는데 유리하다.

제10 양상에 따르면, 커피 추출물, 과일 주스, 파인애플 주스 또는 두유 가공에 있어서, 본 발명의 변이체 또는 본 발명의 효소 조성물의 용도 및 사용 방법을 제공한다.

커피 추출물을 가공하는데 본 발명의 변이체 및 본 발명의 효소 조성물을 사용하면 상기 커피 추출물의 점도를 감소시키기 때문에 유리하다.

과일 주스를 가공 및 제조하는데 본 발명의 변이체 및 본 발명의 효소 조성물을 사용하면 상기 과일 주스의 점도를 낮추고, 여과 속도 및 안정성을 개선시키며, 과일 성분 추출을 돕기 때문에 유리하다.

두유를 가공 및 제조하는데 본 발명의 변이체 및 본 발명의 효소 조성물을 사용하면 상기 두유의 수율, 색상, 단백질 함량 및 맛을 향상시키기 때문에 유리하다.

다른 양상에서, 본 발명의 만난아제의 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명의 만난아제의 변이체의 기능적 단편, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명의 만난아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 본원에 개시된 서열 정보는 다른 동종의 만난아제를 동정하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)이 다양한 생물학적 출처로부터 다른 동종의 만난아제를 코딩하는 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 또한, 게놈 채굴 접근법 (genome mining approaches)은 게놈 데이터베이스로부터 다른 동종의 만난아제를 코딩하는 서열을 동정하는데 사용될 수 있다.

도 1은 바실루스 (Bacillus)에서 복제를 위한 벡터 pEV1의 개략도를 나타낸다.
도 2는 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei)의 형질전환에 사용되는 발현 카세트를 도식적으로 나타낸다.
도 3a-b는 40℃, 16˚dH, 60분, pH 대략 8.3에서 4.4 g/l의 시판 중질 (heavy duty) 액체 세제 A 및 세척액당 활성 단위 (MNU)로 투여되는 효소의 존재하에, 밝기 (lightness)의 증가 (3개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 및 야생형 Man7 (트리코더마에서 생산)의 얼룩 제거 성능 (stain removal performance)을 나타낸다.
도 3a는 변이체 TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 및 야생형을 나타낸다.
도 3b는 변이체 TBH6, TBH10, TBH11 및 야생형을 나타낸다.
도 4a-b는 40℃, 16˚dH, 60분, pH 대략 10에서 3.8 g/l의 시판 색상 세제 분말 (color detergent powder) 및 세척액당 활성 단위 (MNU)로 투여되는 효소의 존재하에, 밝기의 증가 (3개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 및 야생형 Man7 (트리 코더마에서 생산) 의 얼룩 제거 성능을 나타낸다.
도 4a는 변이체 TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 및 야생형을 나타낸다.
도 4b는 변이체 TBH6, TBH10, TBH11 및 야생형을 나타낸다.
도 5는 40℃, 16˚dH, 60분, pH 대략 9.5에서 3.8 g/l의 시판 표백 세제 분말 및 세척액당 활성 단위 (MNU)로 투여되는 효소의 존재하에, 밝기의 증가 (3개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 및 야생형 Man7 (트리코더마에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸다.
도 6은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 대략 8.3에서 4.4 g/l의 시판 중질 액체 세제 A 및 세척액당 활성 단위 (MNU)로 투여되는 효소의 존재하에, 밝기의 증가 (3개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 BH18, BH21, BH23, BH24, BH25 및 야생형 Man7 (바실루스에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸다.
도 7은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 대략 10에서 3.8 g/l의 시판 색상 세제 분말 및 세척액당 활성 단위 (MNU)로 투여되는 효소의 존재하에, 밝기의 증가 (3개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 BH18, BH21, BH23, BH24, BH25 및 야생형 Man7 (바실루 스에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸다.
도 8은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 대략 9.5에서 3.8 g/l의 시판 표백 세제 분말 및 세척액당 활성 단위 (MNU)로 투여되는 효소의 존재하에, 밝기의 증가 (3개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 BH18, BH21, BH23, BH24, BH25 및 야생형 Man7 (바실 루스에서 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸다.
도 9는 37℃에서 시판 중질 액체 세제 중에 트리코더마에서 생산되는 야생형 효소와 비교하여 변이체 TBH6의 안정성을 나타낸다.
도 10은 37℃에서 시판 중질 액체 세제 중에 바실루스에서 생산되는 야생형 효소와 비교하여 변이체 BH25의 안정성을 나타낸다.
도 11a-b는 50℃ 및 7일에서 시판 중질 액체 세제 중에 트리코더마에서 생산되는 변이체 및 야생형의 안정성을 나타낸다.
도 11a는 변이체 TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 및 야생형을 나타낸다.
도 11b는 변이체 TBH6, TBH10, TBH11 및 야생형을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 만난아제 변이체의 사용을 포함하는 인스턴트 커피 제조의 흐름도를 나타낸다.
도 13은 50℃에서 및 7일 동안 시판 중질 액체 세제 중에 변이체 TBH5 및 TBH6과 비교하여 조합 변이체 TBH14 (TBH5와 TBH6의 조합)의 안정성을 나타낸다.
기탁 사항
특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 하기 균주 기탁이 이루어졌다:
플라스미드 pALK4434를 포함하는 이.콜리 (E. coli) 균주 RF12379는 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32425가 부여되었다.
플라스미드 pALK4435를 포함하는 이.콜리 균주 RF12380은 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32426이 부여되었다.
플라스미드 pALK4436을 포함하는 이.콜리 균주 RF12381은 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32427이 부여되었다.
플라스미드 pALK4437을 포함하는 이.콜리 균주 RF12382는 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32428이 부여되었다.
플라스미드 pALK4438을 포함하는 이.콜리 균주 RF12383은 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32429가 부여되었다.
플라스미드 pALK4439를 포함하는 이.콜리 균주 RF12384는 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32430이 부여되었다.
플라스미드 pALK4440을 포함하는 이.콜리 균주 RF12385는 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32431이 부여되었다.
플라스미드 pALK4441을 포함하는 이.콜리 균주 RF12386은 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32432가 부여되었다.
플라스미드 pALK4442를 포함하는 이.콜리 균주 RF12387은 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 3월 2일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32433이 부여되었다.
플라스미드 pALK4432를 포함하는 이.콜리 균주 RF12456은 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 5월 18일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32518이 부여되었다.
플라스미드 pALK4433을 포함하는 이.콜리 균주 RF12457은 독일 D-38124 Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 b의 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2017년 5월 18일자로 기탁되었고, 수탁번호 DSM 32519가 부여되었다.
서열 목록
서열번호: 1 man7의 DNA 서열
서열번호: 2 Man7의 전장 아미노산 서열
서열번호: 3 Man7의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 4 CMB가 없는, Man7의 코어 아미노산 서열
서열번호: 5 변이체 tbh1의 합성 유전자 서열
서열번호: 6 변이체 TBH1의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 7 변이체 tbh2의 합성 유전자 서열
서열번호: 8 변이체 TBH2의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 9 변이체 tbh3의 합성 유전자 서열
서열번호: 10 변이체 TBH3의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 11 변이체 tbh4의 합성 유전자 서열
서열번호: 12 변이체 TBH4의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 13 변이체 tbh5의 합성 유전자 서열
서열번호: 14 변이체 TBH5의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 15 변이체 tbh6의 합성 유전자 서열
서열번호: 16 변이체 TBH6의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 17 변이체 tbh7의 합성 유전자 서열
서열번호: 18 변이체 TBH7의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 19 변이체 tbh8의 합성 유전자 서열
서열번호: 20 변이체 TBH8의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 21 변이체 tbh9의 합성 유전자 서열
서열번호: 22 변이체 TBH9의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 23 변이체 tbh10의 합성 유전자 서열
서열번호: 24 변이체 TBH10의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 25 변이체 tbh11의 합성 유전자 서열
서열번호: 26 변이체 TBH11의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 27 변이체 bh18의 DNA 서열
서열번호: 28 변이체 BH18의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 29 변이체 bh21의 DNA 서열
서열번호: 30 변이체 BH21의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 31 변이체 bh23의 DNA 서열
서열번호: 32 변이체 BH23의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 33 변이체 bh24의 DNA 서열
서열번호: 34 변이체 BH24의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 35 변이체 bh25의 DNA 서열
서열번호: 36 변이체 BH25의 추정된 아미노산 서열 (성숙)
서열번호: 37 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var1의 서열
서열번호: 38 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var2의 서열
서열번호: 39 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var3의 서열
서열번호: 40 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var4의 서열
서열번호: 41 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var5의 서열
서열번호: 42 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var6의 서열
서열번호: 43 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var7의 서열
서열번호: 44 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var8의 서열
서열번호: 45 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var9의 서열
서열번호: 46 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var10의 서열
서열번호: 47 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var11의 서열
서열번호: 48 올리고뉴클레오티드 프라이머 Man7_Var12의 서열

만난은 α-1,6-연결에 의해 백본에 부착된 갈락토스 곁사슬과 β-1,4-연결에 의해 함께 연결된 만노스 백본으로 구성된 폴리사카라이드를 나타낸다. 만난은 구아 검 (guar gum) 및 로커스트빈 검(locust bean gum)과 같은 식물-기반 물질을 포함한다. 글루코만난은 다소 규칙적으로 교대하는 β-1,4 연결된 만노스 및 글루코스의 백본을 갖는 폴리사카라이드이며, 갈락토만난 및 갈락토글루코만난은 알파-1,6-연결된 갈락토스 곁가지를 갖는 만난 및 글루코만난이다.

용어 "기능적 단편 (functional fragment)" 또는 "유효한 단편 (effective fragment)"은 대략 동일한 효소적 기능 또는 효과를 보유하는 서열번호: 2 변이체의 단편 또는 일부를 의미한다.

용어 "만난아제 변이체" 및 "만난아제의 변이체"는 부위-지정 또는 무작위 돌연변이화, 삽입, 치환, 결실, 재조합 및/또는 임의의 다른 단백질 공학 방법 (protein engineering method)에 의해서 수득되어, 야생형 만난아제와 같은 모체 만난아제와 그의 아미노산 서열에서 차이가 있는 만난아제를 유도하는, 임의의 만난아제 분자를 의미한다. 본 개시내용에 따른 용어 "야생형 만난아제", "야생형 효소", "야생형" 또는 "wt"는 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 만난아제 효소를 나타낸다.

용어 "촉매 활성" 또는 "활성"은 정의된 반응 조건하에 주어진 기질의 전환을 정량적으로 나타낸다. 용어 "잔류 활성"은 상이한 조건 세트 하에 촉매 활성에 대한 소정의 조건 세트하에 효소의 촉매 활성의 비율로 정의된다. 그러므로, 상기 잔류 활성 (a_i)은 a_i=v_i/v₀로 제공되며, 여기서 v는 촉매 활성의 임의의 측정치를 나타내고, a_i * 100은 퍼센트로 상대 활성이다. 용어 "특이적 활성"은 정의된 반응 조건하에 효소의 양에 대한 촉매 활성을 정량적으로 나타낸다.

용어 "단백질분해 안정성"은 단백질분해 활성이 측정될 수 있는 조건에서 활성을 잃지 않으면서, 프로테아제가 활성인 조건하에 프로테아제에 대한 제한된 노출을 견딜 수 있는 단백질의 특성을 나타낸다.

본원에서 사용되는, 용어 "만난아제" 또는 "갈락토만난아제"는 만난 엔도-1,4-베타-만노시다제로서 당분야에 알려져 있는 것에 따라 정의되고, 대체명으로서 베타-만난아제 및 엔도-1,4-만난아제로도 명명되며, 만난, 갈락토만난, 글루코만난 및 갈락토글루코만난에서 1,4-베타-D-만노시딕 연결의 가수분해를 촉매하는 만난아제 효소를 나타낸다. 만난아제는 효소 명명법에 따라 EC 3.2.1.78로 분류된다.

본원에서 사용되는, "단리된 (isolated)"은 자연에서 발생되지 않는 형태 또는 환경의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비제한적인 예로는 (1) 임의의 비자연적으로 발생하는 물질, (2) 자연에서 관련된 자연적으로 발생하는 구성성분의 하나 이상 또는 전부로부터 적어도 부분적으로 유래되는 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 보조인자를 포함하는 임의의 물질; (3) 변이체와 같이, 자연에서 발견된 물질에 대해 사람의 손에 의해 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연적으로 관련된 다른 구성성분에 대해 물질의 양을 늘리거나 줄여서 변형시킨 임의의 물질 (예: 숙주 세포에서의 재조합 생산; 물질을 코딩하는 유전자의 단일 또는 다중 카피; 및 물질을 코딩하는 유전자와 자연적으로 관련된 프로모터에 대한 대체 프로모터의 사용). 일 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 효소, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포 또는 조성물이 단리된다.

본원에서 사용되는, 용어 "포함하는 (comprising)"은 "구성된 (consisting of)" 및 "로만 구성된 (consisting only of)"의 협의적 표현뿐만 아니라 "포함하는 (including)", "함유하는 (containing)" 및 "포괄하는 (comprehending)"의 광의적 의미를 포함한다.

본원에서 사용되는, "변이체"는 하나 이상의 뉴클레오티드/아미노산이 삽입, 치환 또는 결실되거나, 또는 화학적으로 변형된 서열 (뉴클레오티드 또는 아미노산) 또는 이의 단편을 의미한다. 일 구체예에서, 용어 변이체는 또한 재조합 만난아제 효소를 포함한다.

본원에서 사용되는, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 일 구체예에서, 본 설명에서 보존적 아미노산은 하기 그룹의 아미노산을 나타낸다: 소수성 (F W Y H K M I L V A G C); 방향족 (F W Y H); 지방족 (I L V); 극성 (W Y H K R E D C S T N Q); 대전 (H K R E D); 양전하로 대전 (H K R); 음전하로 대전 (E D); 소 (small) (V C A G S P T N D); 극소 (Tiny) (A G S). 그러므로, 보존적 치환은 아미노산이 동일한 그룹의 아미노산으로 치환되는 경우 발생한다.

일 구체예에서, 상기 치환은 적어도 하나의 아미노산 잔기, 예컨대 1개의 아미노산, 2개의 아미노산 또는 3개의 아미노산에 의한 치환이다. 부가의 구체예에서, 상기 적어도 하나의 아미노산은 Ala이다.

본원에서 사용되는, "비-보존적 아미노산 치환"은 아미노산이 상기에 정의된 바와 같은 다른 그룹의 아미노산으로 치환되는 것이다. 상기 비-보존적 치환은 아미노산을 전하, 소수성 및/또는 크기와 같이 상이한 생화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 변화시킬 수 있다. 일 구체예에서, 상기 비-보존적 치환은 안정성, 글리코실화 패턴, 폴딩 (folding), 구조, 활성 또는 친화도와 같이, 변이체의 적어도 하나의 특성을 변화시킨다.

N-연결된 글리코실화 과정은 진핵생물에서 일어나며, 박테리아에서는 거의 일어나지 않는다. 글리칸 잔기의 단백질로의 부착은 공통 서열 (consensus sequence)의 인식을 필요로 한다. N-연결된 글리칸은 Asn-X-Ser/Thr 공통 서열의 일부로 존재하는 아스파라긴 (Asn) 곁사슬에 거의 항상 부착되며, 상기 X는 프롤린 (Pro)을 제외한 임의의 아미노산이다. 본 발명자는 또한 만난 분해 성능이 우수한 변이체를 수득하기 위해서 만난아제의 활성 부위에 구조적으로 근접한 비-글리코실화된 Asn 곁사슬이 중요하다는 것을 발견하였다. 임의의 이론에 국한되지 않고, 글리칸 당 (glycan sugars)은 극성 분자이고, Asn에 부착되는 경우, 이들은 단백질 표면에 위치하여 글리코실화된 Asn 및 그 부근에서 구조적 변화를 야기한다. 상기 Asn-Xaa-Thr(Ser) 공통 서열에서 Asn 또는 Ser/Thr 잔기의 부위 지정 돌연변이화는 본 발명의 제1 양상의 변이체에서 원하는 N-연결된 글리코실화 부위의 글리코실화를 방지하는데 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 N-연결된 글리코실화가 가능한 숙주 세포에서 발현될 때 잔기 283의 N-연결된 글리코실화를 방지하는 잔기에 의해 치환된 아미노산을 갖는다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체는 적어도 하나의 Asn-X-Ser/Thr 공통 서열을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체는 적어도 하나의 Asn-X-Ser/Thr 공통 서열의 위치 X에서 Pro 잔기를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환이다.

본원에서 사용되는, "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 복수의 연속 중합화된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. 본 발명의 목적을 위해, 펩티드는 20개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 분자이고, 폴리펩티드는 20개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 변형된 아미노산 잔기, 코돈으로 코딩되지 않는 자연에서 발생하는 아미노산 잔기, 및 자연에서 발생되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는, "단백질"은 임의 크기의 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 단백질은 효소, 단백질, 항체, 막 단백질, 펩티드 호르몬, 조절인자 (regulator) 또는 임의의 다른 단백질일 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일가닥 또는 이중가닥 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 자원으로부터 단리되거나, 인 비트로로 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는, 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 "변형", "변형된" 및 유사한 용어는 폴리뉴클레오티드의 코딩 또는 비-코딩 영역, 예컨대 조절 서열, 5' 비번역된 영역, 3' 비번역된 영역, 상향-조절 (up-regulating) 유전자 요소, 하향-조절 (down-regulating) 유전자 요소, 인핸서 (enhancer), 억제인자 (suppressor), 프로모터, 엑손 (exon) 또는 인트론 (intron) 영역에서의 변형을 나타낸다. 일부 구체예에서, 상기 변형은 폴리뉴클레오티드의 생물학적 효과, 작용 또는 기능에 영향을 주지 않는 오직 구조적인 변형일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 변형은 구조적 변형으로, 이는 폴리뉴클레오티드의 생물학적 효과, 작용 또는 기능의 변화를 제공한다. 이러한 변형은 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능을 증진, 억제 또는 변화시킬 수 있다.

본원에서 사용되는, "동일성 (identity)"은 두 서열에 존재하는 잔기의 위치의 수에 대해, 2개의 정렬된 서열 사이에 정확하게 일치하는 아미노산 잔기의 퍼센트를 의미한다. 하나의 서열이 다른 서열에서 상응하는 잔기가 없는 경우, 정렬 프로그램은 정렬 시에 갭 (gap)을 허용하고, 그 위치는 동일성 산출의 분모에서 계수되지 않는다. 동일성은 EMBL-EBI 웹사이트 (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)의 Pairwise Sequence Alignment tool EMBOSS Needle로 결정된 값이다.

본원에서 사용되는, 본원에서 사용되는, 낮은 엄격도 조건 (low stringency conditions)은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블로팅 (Southern blotting) 절차에 따라, 5Х SSC, 0.1% N-라우로일사르코신, 0.02% SDS, 1% 차단 시약 (Roche 11　096　176　001)에서 55 ℃로 사전혼성화 및 혼성화에서 혼성화에 해당하는 조건을 의미한다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 55℃에서 2X SSC, 0.1% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척된다.

본원에서 사용되는, 높은 엄격도 조건 (high stringency conditions)은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블로팅 절차에 따라, 5Х SSC, 0.1% N-라우로일사르코신, 0.02% SDS, 1% 차단 시약 (Roche 11　096　176　001)에서 65 ℃로 사전혼성화 및 혼성화에서 혼성화에 해당하는 조건을 의미한다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척된다.

본원에서 사용되는, "숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 핵산 구조물과의 형질전환, 형질감염, 형질도입, 교배 (mating), 교차 (crossing) 또는 이와 유사한 것에 대해 영향을 받기 쉬운 임의의 세포 타입을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 중에 발생하는 돌연변이로 인해 동일하지 않은 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 비제한적인 예로는, 진균 세포 (fungal cells), 사상 진균 세포 (filamentous fungal cells) 아스코마이코타 문 (Division Ascomycota), 페지조마이코티나 아문 (Subdivision Pezizomycotina); 바람직하게는 소르다리오마이세트 강 (Class Sordariomycetes), 하이포크레오마이세티다 아강 (Subclass Hypocreomycetidae), 하이포크레알레스 (Hypocreales) 및 마이크로아스 칼레스 (Microascales) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 목, 크리소스포리움 (Chrysosporium), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora) 및 휴미콜라 (Humicola)의 구성원으로 구성된 그룹; 더욱 바람직하게는 히포크레아세 (Hypocreacea), 넥트리아세에 (Nectriaceae), 클라비시피타세에 (Clavicipitaceae), 마이크로아스카세에 (Microascaceae) 과, 및 트리코더마 (Trichoderma) (히포크레아 (Hypocrea)의 무성생식형 (anamorph)), 푸사리움 (Fusarium), 지베렐라 (Gibberella), 넥트리아 (Nectria), 스타키보트리스 (Stachybotrys), 클라비셉스 (Claviceps), 메타리지움 (Metarhizium), 빌로시클라바 (Villosiclava), 오피오코르다이셉스 (Ophiocordyceps), 세팔로스포리움 (Cephalosporium), 및 세도스포리움 (Scedosporium) 속으로 구성된 그룹; 더욱 바람직하게는 트리코더마 리세이 (히포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina)), T. 시트리노비리데 (T. citrinoviridae), T. 롱지브라키아툼 (T. longibrachiatum), T. 바이렌스 (T. virens), T. 하지아눔 (T. harzianum), T. 아스페렐룸 (T. asperellum), T. 아트 로비리데 (T. atroviridae), T. 파라리세이 (T. parareesei), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), F. 그라미네아눔 (F. gramineanum), F. 슈도그라미네아룸 (F. pseudograminearum), F. 베네나툼 (F. venenatum), 지베렐라 후지쿠로이 (Gibberella fujikuroi), G. 모닐리포르미스 (G. moniliformis), G. 제아에 (G. zeaea), 넥트리아 (Nectria) (헤마토넥트리아 (Haematonectria)) 헤마토코카 (haematococca), 스타키보트리스 차르타룸 (Stachybotrys chartarum), S. 클로로할로나타 (S. chlorohalonata), 클라비셉스 푸르푸레아 (Claviceps purpurea), 메타리지움 아크리둠 (Metarhizium acridum), M. 아니소플리에 (M. anisopliae), 빌로시클라바 바이렌스 (Villosiclava virens), 오피오코르다이셉스 시넨시스 (Ophiocordyceps sinensis), 아크레모니움 (Acremonium) (세팔로스포리움 (Cephalosporium)) 크리소게눔 (chrysogenum), 및 세도스포리움 아피오스퍼뭄 (Scedosporium apiospermum), 및 아스페르길루스 나이저 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 룩노웬세 (Chrysosporium lucknowense), 마 이셀리오프토라 서모필라 (Myceliophthora thermophila), 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 및 휴미콜라 그리세아 (Humicola grisea)로 구성된 그룹, 가장 바람직하게는 트리코더마 리세이이다. 숙주 세포의 비제한적인 예로는 박테리아 세포, 바람직하게는 그람 양성 바실리 (gram positive Bacilli) (예: 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 아밀로리퀘파 시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 푸밀 루스 (B. pumilus)), 그람 음성 박테리아 (gram negative bacteria) (예: 에스케리 치아 콜리 (Escherichia coli)), 악티노마이세탈레스 (actinomycetales) (예: 스트 렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.)) 및 효모 (yeasts) (예: 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica))이다.

일 구체예에서, 숙주 세포는 진균 세포, 바람직하게는 사상 진균 세포, 예컨대 트리코더마 또는 트리코더마 리세이이다. 일 구체예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 바람직하게는 그람 양성 바실루스 세포, 예컨대 B. 서브틸리스, B. 리체 니포르미스, B. 메가테리움, B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 푸밀루스이다.

일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 N-연결된 글리코실화가 가능하다.

"재조합 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 상기 세포 또는 숙주 세포에 고유하지 않은 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변형 또는 변경된 세포 또는 숙주 세포를 지칭한다. 상기 유전자 변형은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈에 통합시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 외인성일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다.

본원에서 사용되는, "발현"은 전사, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하나 이에 제한되지 않는, 숙주 세포에서 폴리펩티드의 생산에 관련된 임의의 단계를 포함한다. 발현 후에는 숙주 세포 또는 발현 산물을 수확, 즉 회수할 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 그의 전사를 제공하는 추가 세그먼트에 작동가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 세그먼트를 포함하는 선형 또는 원형의 DNA 분자를 나타낸다. 이러한 추가 세그먼트는 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 기원, 하나 이상의 선택가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 운반체 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 둘 모두의 요소를 함유할 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 일반적으로 적용되는 임의의 발현 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 주로 벡터가 도입될 숙주 세포에 의존적일 것이다. 따라서, 상기 벡터는 자율 복제 벡터, 즉, 염색체외 실재물 (extrachromosomal entity)로 존재하는 벡터, 예컨대 플라스미드일 수 있으며, 이의 복제는 염색체 복제와 무관하다. 대안으로서, 상기 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 통합된 염색체와 함께 복제될 수 있는 것이다. 일 구체예에서, 본 발명의 벡터는 발현 벡터이다.

폴리펩티드 또는 단백질의 생산과 관련하여 본원에서 사용되는, 용어 "재조합 생산된" 또는 "재조합적으로 생산된"은 당 분야의 일반적인 정의에 따라 정의된다.

특정 미생물 출처과 관련하여 본원에서 사용되는, 용어 "~로부터 수득된" 및 "수득 가능한"은 폴리뉴클레오티드가 특정 출처 (동종 발현)에 의해 또는 출처로부터 유래된 유전자가 삽입된 세포 (이종 발현)에 의해 발현되는 것을 의미한다.

용어 "효소 조성물"은 다수의 상이한 효소 활성 또는 단일성분 효소의 혼합물, 바람직하게는 박테리아 또는 진균 종으로부터 일반적인 재조합 기술을 사용하여 유래되는 효소로서, 상기 효소는 발효되고, 개별적으로 단리 및 정제 가능한 것인 효소를 포함하는 단일 종의 미생물로부터 단리 및 정제 가능하고, 또한 상이한 종, 바람직하게는 진균 또는 박테리아 종으로부터 유래될 수 있는 통상적인 효소 발효 산물 또는 재조합 만난아제의 생산을 위해 숙주 세포로서 작용하면서도 동시에 다른 효소를 생산하는 미생물의 발효 산물을 의미한다.

DNA 세그먼트를 언급하는 경우, 용어 "작동가능하게 연결된"은 세그먼트가 의도된 목적을 위해 함께 기능하도록 배열되는 것을 의미하며, 예를 들어 전사는 프로모터에서 개시되고 코딩 세그먼트를 통해 종결인자로 진행된다.

용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열 함유 유전자의 일부를 의미한다. 프로모터 서열은 일반적으로 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견되지만, 항상 그런 것은 아니다.

용어 "분비 신호 서열" 또는 "신호 서열"은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 생산되는 숙주 세포의 분비 경로를 통해 보다 큰 폴리펩티드를 지시하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드")를 코딩하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 분비 신호 서열은 고유한 것일 수 있고, 또는 다른 출처 유래의 분비 신호 서열 또는 운반체 서열로 대체될 수 있다. 숙주 세포에 따라, 보다 큰 펩티드는 분비 경로를 통해 통과하는 동안 분비 펩티드를 제거하기 위해 절단될 수 있다.

용어 "코어 영역 (core region)" 또는 "촉매적 도메인 (catalytic domain)"은 변형 또는 변경되거나 되지 않을 수 있지만, 그의 본래 활성의 적어도 일부를 보유하는 효소의 도메인을 나타낸다. 본 발명에 따른 만난아제의 코어 영역은 서열번호 2의 Man7의 아미노산 27-331과 정렬된 아미노산에 상응한다.

용어 "링커" 또는 "스페이서"는 예를 들어, 효소 코어 및 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module: CBM)과 같은 결합 도메인을 포함하는 효소 또는 임의의 다른 효소 하이브리드와 같은 다중도메인 단백질의 도메인 사이 또는 2개의 코어 효소를 포함하는 융합 단백질과 같은 융합 폴리펩티드로서 생산된 2개의 단백질 또는 폴리펩티드 사이에 존재할 수 있는 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 효소 코어를 코딩하는 DNA 서열, 링커를 코딩하는 DNA 서열 및 CBM을 코딩하는 DNA 서열을 순차적으로 오픈 리딩 프레임에 융합하고 이 구조물을 발현시킴으로써 CBM과 효소 코어의 융합 단백질이 제공된다.

유효한 양은 선택된 적용에서 만노스를 분해하기에 충분한 양을 의미한다.

아미노산에 대해 하기 약어가 사용된다:

A Ala 알라닌

C Cys 시스테인

D Asp 아스파르트산

E Glu 글루탐산

F Phe 페닐알라닌

G Gly 글리신

H His 히스티딘

I Ile 이소류신

K Lys 리신

L Leu 류신

M Met 메티오닌

N Asn 아스파라긴

P Pro 프롤린

Q Gln 글루타민

R Arg 아르기닌

S Ser 세린

T Thr 트레오닌

V Val 발린

W Trp 트립토판

Y Tyr 티로신

하기 명명법을 사용하여 치환을 설명한다: 단백질 스캐폴드 (scaffold)의 아미노산 잔기; 위치; 치환된 아미노산 잔기(들). 상기 명명법에 따라, 예를 들어 위치 20에서 세린 잔기의 글리신 잔기로의 치환은 Ser20Gly 또는 S20G로 나타낸다.

용어 "세제 조성물" 및 "세제"는 달리 명시하지 않는 한, 고체, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 중질 세척제, 특히 세정 세제; 액체, 겔 또는 페이스트 형태의 다목적 세척제, 특히 중질 액상형 (heavy-duty liquid (HDL) types); 액체 미세-직물 세제 (liquid fine-fabric detergents); 핸드 식기세척제 또는 경질 (light duty) 식기세척제, 특히 고-발포형의 식기세척제; 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼-보조제 형태를 포함하는 가정용 및 산업용 기계 식기세척제; 액체 세정 및 소독제, 차 또는 카펫 샴푸, 욕실 클리너; 금속 클리너; 뿐만 아니라, 표백 첨가제 및 "얼룩-스틱" 또는 전처리 타입과 같은 세척 보조제를 포함한다. 용어 "세제", "세제 조성물" 및 "세제 제제"는 오염된 물체의 세척을 위해 세척 매질에 사용하기 위한 혼합물과 관련하여 사용된다. 일부 구체예에서, 상기 용어는 직물 및/또는 의류를 세탁하는 것과 관련하여 사용된다 (예: "세탁 세제"). 대안의 구체예에서, 상기 용어는 식기, 식기류 등을 세척하는데 사용되는 것과 같은 다른 세제를 의미한다 (예: "식기세척 세제"). 본 발명은 임의의 특정한 세제 제제 또는 조성물로 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 만난아제 외에도, 상기 용어는 예를 들어, 계면활성제, 빌더, 킬레이터, 또는 킬레이트제, 표백 시스템 또는 표백 구성성분, 폴리머, 직물 컨디셔너, 폼 부스터 (foam boosters), 비누 거품 억제제 (suds suppressors), 염료, 향료, 탈지 억제제, 형광 증백제, 살박테리아제 (bactericides), 살진균제 (fungicides), 소일 서스펜딩제 (soil suspending agents), 부식방지제 (anticorrosion agents), 향수성 물질 (hydrotropes), 직물 발색제 (fabric hueing agents), 분산제, 이염 억제제 (dye transfer inhibiting agents), 형광 표백제 (fluorescent whitening agents), 소일 릴리즈 폴리머 (soil release polymers), 재침착 방지제, 수축 방지제 (anti-shrink agents), 주름 방지제 (anti-wrinkling agents), 살박테리아제, 결합제, 운반체, 염료, 효소 안정화제 (enzyme stabilizers), 섬유 유연제 (fabric softeners), 충전제, 거품 조절제 (foam regulators), 향료, 안료, 소드 억제제 (sod suppressors), 용매, 및 액체 세제용 구조결정제, 구조 탄성화제 (structure elasticizing agents), 효소 억제제 또는 안정화제, 효소 활성화제, 트란스퍼라제(들), 가수분해 효소, 산화 환원효소, 청분작용제 (bluing agents) 및 형광 염료, 산화방지제 및 가용화제를 함유할 수 있는 세제를 포함하는 것을 의미한다.

용어 "섬유 (textile)"는 실 (yarns), 실 중간체 (yarn intermediates), 화이버 (fibers), 부직포 물질 (non-woven materials), 천연 물질 (natural materials), 합성 물질 (synthetic materials) 및 임의의 다른 섬유 물질, 이들 물질로 만들어진 직물 및 섬유로 만들어진 제품 (예: 의류, 린넨 및 기타 물품)을 의미한다. 상기 섬유 및 직물은 편직물, 직포, 데님, 부직포, 펠트, 실 및 타월 형태일 수 있다. 상기 섬유는 면, 아마/린넨 (flax/linen), 황마 (jute), 모시 (ramie), 사이잘 (sisal) 또는 코이어 (coir)를 포함하는 천연 셀룰로오스 화합물 또는 비스코스/레이온 (viscose/rayon), 모시 (ramie), 셀룰로오스 아세테이트 섬유 (cellulose acetate fibers (tricell)), 라이오셀 (lyocell) 또는 이의 블렌드와 같은 인조 셀룰로오스 화합물 (예: 나무 펄프 유래)과 같은 셀룰로오스계일 수 있다. 또한, 상기 섬유 또는 직물은 울, 카멜, 캐시미어, 모헤어, 토끼 및 비단을 포함하는 천연 폴리아미드 또는 나일론, 아라미드, 폴리에스테르, 아크릴릭, 폴리프로필렌 및 스판덱스/엘라스탄과 같은 합성 폴리머, 또는 이의 블렌드와 같은 비셀룰로오스계일 뿐만 아니라, 셀룰로오스계 및 비셀룰로오스계의 화이버의 블렌드일 수 있다. 블렌드의 예로는 면 및/또는 레이온/비스코스와 울, 합성 화이버 (예: 폴리아미드 화이버, 아크릴 화이버, 폴리에스테르 화이버, 폴리비닐 알콜 화이버, 폴리비닐 클로리드 화이버, 폴리우레탄 화이버, 폴리우레아 화이버, 아라미드 화이버) 및 셀룰로오스-함유 화이버 (예: 레이온/비스코스, 모시, 아마/린넨, 황마, 셀룰로오스 아세테이트 섬유, 라이오셀)와 같은 하나 이상의 동반 물질의 블렌드이다. 직물은 통상적인 세척가능한 세탁물, 예를 들어, 염색된 가정용 세탁물일 수 있다. 용어 직물 또는 의류가 사용되는 경우, 더욱 광범위한 용어인 섬유를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "안정성"은 저장 안정성 및 사용 중 안정성, 예컨대 세척 과정 중 안정성 (세척 안정성)을 포함하며, 시간의 함수로서 본 발명에 따른 만난아제의 안정성을 반영한다. 예를 들어, 만난아제를 용액, 특히 세제 용액에 보관했을 때 얼마나 많은 활성이 유지되는지를 의미한다. 상기 안정성은 예를 들어, pH, 온도, 세제 조성물 예컨대 프로테아제, 안정화제, 빌더, 계면활성제 등의 많은 요인에 의해 영향을 받는다. 상기 만난아제 안정성은 실시예에 기재된 바와 같이 '활성 분석'을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 "만난아제 활성"은 폴리펩티드의 만난 분해 활성을 나타낸다. 본원에서 사용된 분해 또는 변형은 만노스 단위가 만난아제에 의해 만난 폴리사카라이드로부터 가수분해되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 만난 분해 활성은 당분야에 알려져 있는 표준 시험 절차에 따라 시험될 수 있다. 실시예 5는 만난아제 활성을 결정하기 위한 표준 방법의 예를 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체는 위치 123, 158, 180, 272, 285 또는 307에서 적어도 하나의 치환 또는 이들의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체는 위치 M123, A158, F180, G272, T285 또는 T307에서 적어도 하나의 치환 또는 이들의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체는 위치 M123, A158, F180, G272, T307 또는 L316에서 적어도 하나의 추가 치환 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 1개의 추가 치환, 2개의 추가 치환, 3개의 추가 치환 또는 4개의 추가 치환을 포함한다.

일 구체예에서, 위치 316은 치환되지 않는다. 이는 위치 316 주변 부위에 근접한 잔기의 폴딩 (folding) 및 상호작용 (interaction)을 유지하는데 유리하다. 또한, 도 8은 시판 세제에서 316에 대해 치환되거나 또는 비치환된 변이체를 사용할 때 보다 적은 양의 효소로 유사한 성능이 수득될 수 있음을 보여준다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 표 1에 열거된 치환 세트를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 치환은 상기 위치에서 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로부터 선택된 아미노산으로의 치환을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 상기 위치(들)에서 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트 또는 이들의 조합을 포함한다:

단일 치환 M123, A158, F180, G272; T307, 또는 L316; 또는

M123 및 G272; 또는

A158 및 T307; 또는

L316; 또는

T307; 또는

M123, A158 및 T307; 또는

M123 및 L316;

A158, T307, 및 L316;

F180 및 L316; 또는

M123, A158, G272; T307, 및 L316.

일 구체예에서, 상기 치환은 변이체의 안정성을 향상시키는 치환이다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 치환을 포함한다:

N283의 글리코실화를 방지하는 치환;

283 또는 285의 치환; 또는

N283, T285 또는 S285의 치환; 또는

T285 또는 S285의 T 또는 S 이외의 잔기로의 치환;

T285 또는 S285의 잔기 A로의 치환.

일 구체예에서, 상기 추가 치환으로 N-연결된 글리코실화가 가능한 숙주 세포에서 생산될 때 변이체의 변경된 글리코실화를 초래한다. 일 구체예에서, 상기 변경된 글리코실화는 변이체의 글리코실화도를 감소시킨다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 만난아제 활성을 가지며, 위치 123, 158, 180, 272, 307 또는 316에 상응하는 위치에서 아미노산의 적어도 하나의 추가 치환을 포함하고, 상기 변이체는 만난아제 활성을 가지며, 1) 서열번호: 2의 잔기 27-331에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 변이체; 2) 높은 엄격도 조건하에 a) 서열번호: 1 (man7)의 뉴클레오티드 79 - 993 b) a)의 전장 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 변이체; 및 3) 서열번호: 1에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 게놈 DNA 서열에 의해 코딩된 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 상기 아미노산 넘버링은 서열번호: 2 (Man7)의 아미노산 넘버링에 상응한다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 위치 284 및/또는 286에서 P 잔기를 포함한다. 상기 위치들 중 어느 하나 또는 모두에서 P 잔기로의 치환으로 변이체에서 구조적 변화를 야기할 수 있고, 이는 N-연결된 글리코실화를 방지한다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체에서 위치 T285 또는 S285는 T 또는 S 이외의 잔기로 치환된다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체에서 위치 T285 또는 S285는 알라닌으로 치환된다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 N-연결된 글리코실화가 가능한 숙주 세포에서 생산될 때 위치 283에서 비-글리코실화된 Asn 잔기 및 서열번호: 2의 잔기 27-331에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.

일 구체예에서, 본 발명의 변이체는 적어도 하나의 추가의 글리코실화된 N 부위를 포함하며, 상기 N283에 상응하는 위치는 글리코실화되지 않는다. 이러한 변이체는 N-글리코실화가 가능한 숙주 세포에서 변이체를 생산하여, 다른 N-글리코실화 부위의 적어도 일부는 글리코실화하지만, 상기 N283의 N-글리코실화는 저해시킴으로써 수득될 수 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명의 변이체는 임의의 글리코실화된 N 부위를 포함하지 않는다. 이러한 변이체는 N-글리코실화가 가능한 숙주 세포에서 변이체를 생산하여, 상기 변이체의 글리코실화 저해를 초래함으로써 수득될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 신호 서열을 포함하지 않고, 50000 내지 51000, 바람직하게는 50800 내지 50970의 예측된 분자량을 갖는다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 4.5 내지 4.8, 바람직하게는 4.6 내지 4.75의 예측된 pI를 갖는다.

변이체의 pI 또는 분자량의 예측은 표 3에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

본 발명의 추가 구체예에서, 상기 변이체는 만난아제 활성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 N-연결된 글리코실화가 가능한 숙주 세포에서 생산될 때 위치 283에서 비-글리코실화된 Asn 잔기를 가지며, 진핵생물 숙주 세포에서 생산될 때 야생형 만난아제와 비교하여 특이적 활성이 증가하였다.

본 발명의 효소 조성물의 일 구체예에서, 상기 효소 조성물은 프로테아제, 리파제, 쿠티나제, 아밀라제, 카르보히드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 펙테이트리아제, 펙틴분해 효소, 에스테라제, 피타제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 잔타나제, 자일로글루카나제, DNAse, 락카제, 및/또는 퍼옥시다제로 구성된 그룹, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제 및 리파제로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가 효소를 추가적으로 포함한다.

만난아제 및 추가 효소를 포함하는 본 발명의 효소 조성물은 상승 효과를 제공하는데 유리하다. 이러한 추가 효소는 만난아제를 포함하는 본 발명의 효소 조성물이 세제에서 사용되는 경우, 예컨대 얼룩을 세척하는 경우 바람직하다. 세제에서 만난아제와 작용하는 특히 유익한 상승작용하는 효소로는 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제, 또는 이들의 조합, 예컨대 만난아제, 아밀라제 및 프로테아제를 포함하는 조성물이다.

일 구체예에서, 본 발명의 효소 조성물은 액체 조성물 또는 고체 조성물의 형태, 예컨대 용액, 분산제, 페이스트, 분말, 과립, 입자체 (granulate), 코팅된 입자체, 정제, 케이크, 결정, 결정 슬러리, 겔 또는 펠렛 (pellet)으로 제공된다.

일 구체예에서, 본 발명의 세제 조성물은 액체 세제 또는 고체 세제의 형태, 바람직하게는 바 (bar), 균질 정제 (homogenous tablet), 2개 이상의 층을 갖는 정제, 하나 이상의 구획을 갖는 파우치, 일반 또는 콤팩트 분말, 과립, 입자체, 페이스트, 겔, 또는 일반, 콤팩트 또는 농축 액체의 형태이다.

일 구체예에서, 본 발명의 세제 조성물은 프로테아제, 리파제, 쿠티나제, 아밀라제, 카르보히드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 펙테이트리아제, 펙틴분해 효소, 에스테라제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, DNAse 및/또는 퍼옥시다제로 구성된 그룹, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제 및 리파제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 효소를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 효소 조성물은 또한 세정제 또는 부스터 (boosters) 중에, 예를 들어 액체, 겔, 분말, 과립 또는 정제 형태로, 세척 중에 또는 전에 세제 위에 부가하여 사용할 수 있다. 효소 조성물 및 세제 구성성분은 또한 섬유와 같은 운반체에 침지될 수 있다.

본 발명은 또한 만난을 분해하기 위한, 본원에 개시된 바와 같은 효소 조성물 또는 세제 조성물의 용도 및 사용 방법에 관한 것이다.

추가 구체예에서, 본 발명은 세탁 과정에 있어서, 본원에 개시된 바와 같은 효소 조성물 또는 세제 조성물의 용도 및 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 효소 조성물 또는 세제 조성물을 표면과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면으로부터 얼룩을 제거하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 효소 조성물 또는 세제 조성물을 만난에 적용하는 단계를 포함하는 만난을 분해하는 방법에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 만난은 섬유 표면에, 또는 섬유에 적어도 부분적으로 매립되어 있다.

일반적으로, 선택된 효소(들)의 특성은 선택된 세제와 적합해야 하며 (즉, pH-최적, 다른 효소 및 비-효소 성분과의 적합성, 등), 상기 효소(들)는 유효한 양으로 존재해야 한다.

고체 세탁 세제에서 사용하기 위한 조성물은 상기 조성물의 중량 기준으로, 예를 들어 0.000001% - 5%, 예컨대 0.000005-2%, 예컨대 0.00001%-1%, 예컨대 0.00001%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.

세탁 액체에서 사용하기 위한 조성물은 상기 조성물의 중량 기준으로, 예를 들어 0.000001%-3%, 예컨대 0.000005%-1%, 예컨대 0.00001%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.

자동 식기세척기에서 사용하기 위한 조성물은 상기 조성물의 중량 기준으로, 예를 들어 0.000001%-5%, 예컨대 0.000005%-2%, 예컨대 0.00001%-1%, 예컨대 0.00001%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 제2 양상의 추가 성분 a-d는 본 발명의 효소 조성물에 향상된 특성을 제공한다. 상기 효소 조성물은 추가 구성성분과 적합하고, 다양한 용도에서 효소 조성물의 적용가능성을 개선하였다.

염, 예컨대 소듐 클로리드 및 소듐 술페이트는 건조 보조제 (drying aids)로 기능한다.

본 발명은 또한 예컨대 만난을 분해하기 위한 및 세탁 과정에서 사용하기 위한, 본 발명의 효소 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 코어 영역을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 CBM을 포함한다.

주위 온도 이상의 온도에서 활성을 유지하는 만난아제를 제공하는 것은 그러한 조건에서 만난 분해가 요구되는 응용분야에서 유리하다. 또한, 본 발명에 따른 만난아제는 알칼리성 조건에서 우수한 안정성 및 활성을 가질 수 있고, 이는 세제 사용 및 바이오매스 (biomass) 가공에서 유리하다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 서열번호: 2에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

일 구체예에서, 상기 만난아제 효소는 서열번호: 2 [Man7]에 대해 100% 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는다.

제3 양상의 일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다:

진균 세포,

사상 진균 세포 아스코마이코타 문, 페지조마이코티나 아문; 바람직하게는 소르다리오마이세트 강, 하이포크레오마이세티다 아강, 하이포크레알레스 및 마이크로아스칼레스 및 아스페르길루스 목, 크리소스포리움, 마이셀리오프토라 및 휴미콜라의 구성원으로 구성된 그룹;

더욱 바람직하게는 히포크레아세, 넥트리아세에, 클라비시피타세에, 마이크 로아스카세에 과, 및 트리코더마 (히포크레아의 무성생식형), 푸사리움, 지베렐라, 넥트리아, 스타키보트리스, 클라비셉스, 메타리지움, 빌로시클라바, 오피오코르다이셉스, 세팔로스포리움 및 세도스포리움 속으로 구성된 그룹;

더욱 바람직하게는 트리코더마 리세이 (히포크레아 제코리나), T. 시트리노비 리데, T. 롱지브라키아툼, T. 바이렌스, T. 하지아눔, T. 아스페렐룸, T. 아트로비리 데, T. 파라리세이, 푸사리움 옥시스포룸, F. 그라미네아눔, F. 슈도그라미네아룸, F. 베네나툼, 지베렐라 후지쿠로이, G. 모닐리포르미스, G. 제아에, 넥트리아 (헤마토넥트리아) 헤마토코카, 스타키보트리스 차르타룸, S. 클로로할로나타, 클라비 셉스 푸르푸레아, 메타리지움 아크리둠, M. 아니소플리에, 빌로시클라바 바이렌스, 오피오코르다이셉스 시넨시스, 아크레모니움 (세팔로스포리움) 크리소게눔, 및 세도스포리움 아피오스퍼뭄, 및 아스페르길루스 나이저, 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 오리제, 크리소스포리움 룩노웬세, 마이셀리오프토라 서모필라, 휴미콜라 인솔렌스, 및 휴미콜라 그리세아로 구성된 그룹,

박테리아 세포, 바람직하게는 그람 양성 바실리 예컨대 B. 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 메가테리움, B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 푸밀루스, 그람 음성 박테리아 예컨대 에스케리치아 콜리, 악티노마이세탈레스 예컨대 스트렙토마이세스 종 및

효모 예컨대 사카로마이세스 세레비지에, 피치아 파스토리스, 야로위아 리폴리티카,

가장 바람직하게는 트리코더마 리세이 또는 바실루스.

일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 N-연결된 글리코실화가 가능한 진핵생물 숙주 세포이다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 트리코더마 리세이이다.

상기 재조합 숙주 세포는 만난아제의 변이체를 생산하고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는데 사용될 수 있다. 상기 재조합 숙주 세포는 또한 상이한 특성을 갖는 만난아제의 변이체를 제조하는데 유용하다. 예를 들어, 안정성 또는 활성에 유익한 번역후 변형을 제공하거나, 또는 상기 숙주 세포에서 생산되는 만난아제의 변이체의 후-처리 및 제제화를 용이하게 하는 숙주 세포가 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 효소 조성물은 제2 양상의 재조합 숙주 세포를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 만난아제의 변이체는 융합 단백질인 재조합 폴리펩티드이다.

일 구체예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 융합 단백질이다:

분비 신호 서열을 제공하는 아미노산 서열;

정제를 용이하게 하는 아미노산 서열, 예컨대 친화성 태그, His-태그;

생산을 증진시키는 아미노산 서열, 예컨대 CBM과 같은 운반체인 아미노산 서열;

효소 활성을 갖는 아미노산 서열; 및

결합 친화도를 갖는 융합 단백질을 제공하는 아미노산 서열, 예컨대 탄수화물 결합 모이어티.

운반체로서 탄수화물 결합 모이어티 (CBM)는 예컨대 트리코더마 생산에서 유리하다.

일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 비-병원성 (non-pathogenic)이다. 이는 사료, 및 세제 용도 예컨대 가정용 세탁 세제에서 숙주 세포를 사용하는데 특히 유리하다.

제5 양상의 일 구체예에서, 만난 함유 물질은 식물 기반 물질, 섬유, 폐수, 하수, 오일 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.

일 구체예에서, 상기 만난 함유 물질은 섬유 물질 또는 직물이다.

다른 구체예에서, 상기 만난 함유 물질은 재활용 폐지; 기계적 펄프, 화학적 펄프, 반화학적 펄프, 크래프트 (Kraft) 또는 다른 제지 펄프; 침수 가공 (retting process) 처리된 화이버; 또는 구아검 또는 로커스트빈 검 함유 물질이다.

다른 구체예에서, 분해 또는 변형은 만난아제가 활성을 보이는 수성 환경에서 수행된다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 방법에서 분해되거나 변형되는 만난 함유 물질은 선택적으로 만난 얼룩을 갖는 섬유 또는 직물 상에 있다. 섬유 또는 직물에 부착된 만난을 분해하여, 만난에 결합된 먼지 또는 소일 (soil)을 방출시키고, 만난 또는 만난 얼룩에 다시 결합할 수 없다. 섬유 또는 직물은 예를 들어 면, 아마/린넨, 황마, 모시, 사이잘 또는 코이어 또는 비스코스/레이온, 모달, 셀룰로오스 아세테이트 섬유 (tricell), 라이오셀, 큐프로 또는 이의 블렌드를 포함하는 인조 셀룰로오스 화합물 (예: 목재 펄프로부터 유래)과 같은 임의의 물질일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 사료는 옥수수 및 대두 밀을 포함하거나 이로 구성된다.

일 구체예에서, 식물 기원의 단백질 공급원은 콩, 보리, 밀, 호밀, 귀리와 같은 곡류 또는 옥수수를 포함하거나 이로 구성된다.

일 구체예에서, 상기 만난 함유 산물 또는 부산물은 팜 커넬 (palm kernel), 구아 밀 (guar meal) 또는 코프라 밀 (copra meal)을 포함하거나 이로 구성된다.

일 구체예에서, 본 발명의 동물 사료 또는 본 발명의 사료 보충제는 습식 조성물 또는 건식 조성물의 형태로 제제화된다.

일 구체예에서, 적어도 하나의 만난아제 효소의 변이체를 포함하는 조성물은 펄프 및 제지 산업, 바이오표백 (biobleaching), 화이버 개질, 배수 개선 및 오일 산업, 즉 오일 시추 또는 수압-파쇄 또는 시추액의 점도를 조절하는 오일-서비스 산업에서 사용된다.

일 구체예에서, 적어도 하나의 만난아제의 변이체를 포함하는 조성물은 섬유 및 세제 산업, 바이오매스 가공 및 바이오매스 가수분해, 바람직하게는 바이오연료, 전분, 펄프 및 제지, 식품, 제빵, 사료 및 음료 산업에서 사용된다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 엔도-베타-1,4-만노시딕 연결을 무작위로 가수분해한다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체 또는 상응하는 야생형 만난아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 박테리아 출처로부터 수득되거나 유래될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 적어도 하나의 추가의 폴리펩티드와 융합하여, 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드 또는 추가의 폴리펩티드는 만난아제의 촉매 또는 결합 활성 이외의 다른 촉매 또는 결합 활성을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 추가의 폴리펩티드는 탄수화물 결합 모듈을 포함하거나 이로 구성되며, 이는 선택적으로 상기 만난아제와 동일하거나 상이한 생물체로부터 유래된 다른 단백질 또는 효소의 단편이다.

일 구체예에서, 상기 만난아제의 변이체는 링커로 추가의 폴리펩티드에 연결된다.

일 구체예에서, 기계 세척 공정의 세척 사이클 중에 제1 양상의 만난아제의 변이체 또는 제2 양상의 효소 조성물 함유 세척 용액으로 직물을 처리하는 단계를 포함하는 직물을 기계 처리하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 직물 세정 및/또는 직물 얼룩 제거를 위한 세정 조성물에 있어서, 매개체를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제, 만난아제, 쿠티나제, 에스테라제, 피타제, DNAse, 펙티나제, 펙틴분해 효소, 펙테이트 리아제, 카르보히드라제, 아라비나제, 갈락타나제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 옥시다제로부터 선택된 효소와 함께, 제2 양상의 효소 조성물 또는 제1 양상의 만난아제의 변이체의 용도를 제공한다.

일 구체예에서, 바닥, 벽, 욕실 타일 및 유사물과 같은 단단한 표면을 세정하기 위한 세정 조성물에 있어서, 매개체를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제, 만난아제, 쿠티나제, 에스테라제, 피타제, DNAse, 펙티나제, 펙틴분해 효소, 펙테이트 리아제, 카르보히드라제, 아라비나제, 갈락타나제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 옥시다제로부터 선택된 효소와 함께, 제1 양상의 만난아제의 변이체 또는 제2 양상의 효소 조성물의 용도를 제공한다.

일 구체예에서, 수동 또는 기계 식기세척을 위한 세정 조성물에 있어서, 매개체를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제, 만난아제, 쿠티나제, 에스테라제, 피타제, DNAse, 펙티나제, 펙틴분해 효소, 펙테이트 리아제, 카르보히드라제, 아라비나제, 갈락타나제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 옥시다제로부터 선택된 효소와 함께, 제1 양상의 만난아제의 변이체 또는 제2 양상의 효소 조성물의 용도를 제공한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 양상을 예시하기 위해 제공된다. 이는 본 발명을 한정하려는 것은 아니며, 이는 수반된 청구범위에 의해 한정된다.

실시예 1. 변이체 디자인

야생형 Man7 만난아제의 안정성 및 특이적 활성을 향상시키기 위해서, 변이체 세트를 야생형 효소의 구조적 분석에 기반하여 디자인하였다. 상기 Man7의 구조적 모델은 바실루스 종의 엔도-베타-D-1,4-만난아제 (1WKY)로부터의 좌표로 Bioluminate 소프트웨어 (Schrodinger LCC)를 사용하여 형성되었다. 상기 디자인은 변이체당 2개 이상의 특정 돌연변이를 포함한다. 표 1은 변이체의 목록을 나타낸다. 상기 아미노산 넘버링은 신호 서열을 함유하는 서열번호: 2 (Man7) 전장의 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 상응한다.

실시예 2. 합성 만난아제 변이체 유전자의 클로닝

이. 콜리 (E. coli) 형질전환, 시퀀싱 등에서 DNA의 단리 및 효소 처리 (예: 플라스미드 DNA의 단리, DNA 단편을 생성하기 위한 DNA의 소화)에서 표준 분자 생물학 방법이 사용되었다. 사용된 기본 방법은 효소, 시약 또는 키트 제조자가 설명한 바와 같다.

변이체 tbh1 - tbh11을 트리코더마 리세이에 대해 코돈 최적화하고 그 자신의 신호 펩티드 코딩 서열을 갖지 않는 합성 구조물로서 GenScript로부터 주문하였다. 유전자 tbh1 - tbh11을 포함하는 GenScript로부터 입수된 플라스미드 DNA를 멸균수 중에 재현탁하고, 제조자의 지침에 따라 NruI 및 BamHI 제한 효소 (Thermo Fisher Scientific)로 소화하고, NruI 및 BamHI로 절단된 발현 벡터로 클로닝하였다. 결찰 혼합물을 에스케리치아 콜리 XL1-Blue 또는 XL10-Gold 세포 (AH Diagnostics)로 형질전환시키고, 50-100 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB (Luria-Bertani) 플레이트에 플레이팅하였다. 여러 이. 콜리 콜로니를 상기 플레이트로부터 수집하고, DNA를 GenJet Plasmid Miniprep 키트 (Thermo Fisher Scientific)로 단리하였다. 제한 소화를 사용하여 포지티브 클론을 스크리닝하고, 예상된 크기의 삽입물을 함유하는 것으로 나타났다. tbh1 - tbh11 만난아제 유전자의 발현 플라스미드로의 융합 부위를 시퀀싱하고, 플라스미드를 각각 pALK4415 - pALK4423, pALK4430 및 pALK4431이라고 명명하였다 (세부 사항은 실시예 4 참조). GenScript에 의해 전달된 thb 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 또한 XL10-Gold 이. 콜리 세포 (Agilent)로 형질전환하고, DSMZ strain collection에 기탁하였다. 상기 유전자 및 추정된 아미노산 서열 (서열번호: 5-36)에 대한 관련 정보는 각각 표 2 및 표 3에 요약하였다. 각 플라스미드 pALK4434 - pALK4442, pALK4432 및 pALK4433을 포함하는 이. 콜리 균주 RF12379 - RF12387, RF12456 및 RF12457은 DSMZ collection에 각각 수탁번호 DSM 32425, DSM 32426, DSM 32427, DSM 32428, DSM 32429, DSM 32430, DSM 32431, DSM 32432, DSM 32433, DSM 32518 및 DSM 32519로 기탁되었다.

유전자 서열을 코딩하는 만난아제 변이체로부터 추정된 아미노산 서열의 요약.

Man 단백질	aas (b 의 번호	ss (a 의 길이	CBM	코어 (aa-aa)	예측된 ( Da ), ss는 포함되지 않음 (b	예측된 pI , ss 는 포함되지 않음 (b	서열번호
TBH1	464	26	예	27-331	50886	4.62	6
TBH2	464	26	예	27-331	50904	4.67	8
TBH3	464	26	예	27-331	50848	4.67	10
TBH4	464	26	예	27-331	50957	4.67	12
TBH5	464	26	예	27-331	50901	4.67	14
TBH6	464	26	예	27-331	50919	4.72	16
TBH7	464	26	예	27-331	50814	4.67	18
TBH8	464	26	예	27-331	50833	4.62	20
TBH9	464	26	예	27-331	50800	4.62	22
TBH10	464	26	예	27-331	50949	4.72	24
TBH11	464	26	예	27-331	50935	4.72	26

^(a 신호 서열에 대한 예측은 프로그램 SignalP v3.0, NN/HMM (Nielsen et al., 1997; Nielsen & Krogh, 1998; Bendtsen et al., 2004)을 사용하여 수행되었다.

^(b 예측된 신호 서열은 포함되지 않았다. 상기 예측은 Windows용 Clone Manager Professional version 9, Sci-Ed 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

실시예 3. man7 유전자의 부위 지정 돌연변이화

달리 언급하지 않는 한, DNA 조작 및 형질전환을 포함하는 표준 분자 생물학 방법을 사용하였다. Kunkel 1985에 기재된 바와 같은 부위 지정 돌연변이화에 의해 돌연변이를 도입하였다. 생성된 돌연변이를 표 4에 열거하였다. 아미노산 넘버링은 서열번호: 2 (Man7)의 아미노산 넘버링에 상응한다.

부위 지정 돌연변이화에 의해 Man7에 도입된 돌연변이의 목록

변이체 Nr .	돌연변이	서열번호 (nt)	서열번호 (aa)
BH18	M123I, G272Q	27	28
BH21	A158S, T307R	29	30
BH23	M123I, A158S, G272Q, T307R	31	32
BH24	M123I, G272Q, L316K	33	34
BH25	A158S, T307R, L316K	25	36

증폭을 위해 Pfx Accu Prime 폴리머라제 (Invitrogen)를 사용하였다. PCR을 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 발현 플라스미드 제작을 위해 하기 PCR 조건을 사용하였다: 94 ℃에서 120 초의 초기 변성, 그 다음에 94 ℃에서 15초, 하기 50/55 ℃ 중 하나에서 30초 어닐링, 68 ℃에서 110/290초 연장의 35회 사이클, 및 68 ℃에서 10분 동안 최종 연장. pEV1 man7을 PCR용 주형으로 사용하였다. 클로닝을 위해 사용된 프라이머의 순서는 표 5에 기재되어 있다. 혼성화를 위한 돌출부를 밑줄로 표시하였다.

클로닝 목적을 위해, NEBuilder®Hifi DNA Assembly Master Mix (NEB, Frankfurt)를 키트 제조자의 지침에 따라 사용하였다. 생성된 발현 플라스미드 (도 1)를 Zhang & Zhang 2011에 기재된 바와 같이 바실루스 서브틸리스 SCK6에서 유도된 능력에 의해 형질전환하였다. 상기 형질전환된 세포를 10 mg/l 카나마이신이 보충된 LB (Luria-Bertani) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 성장하는 콜로니를 채취하고, QiaPrep MiniPrep Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 플라스미드를 단리하였다. 그람 양성 플라스미드 제조에 대한 제조자의 권장사항에 따라 단리 절차를 수행하였다. 삽입물을 Sanger 시퀀싱 (GATC, Germany)을 통해 서열화하고, 변이체 1 내지 5의 성숙한 부분에 상응하는 DNA 서열을 밝혀냈다. 서열 비교는 ClustalW sequence alignment를 사용하여 수행하였다 (Thompson et al 1994). 마지막으로, 발현 플라스미드를 전기영동법을 통해 바실루스 생산 균주에서 형질전환하였다. 바실루스 생산 균주를 20 g/l 트립톤, 10g/l 효모 추출물, 10 g NaCl 및 2 M 수크로스를 함유하는 전기영동 배지에서 성장시키고, 0.4의 OD(600nm)에서 10 ml를 수확하였다. 0.272 M 수크로스, 1 mM MgCl₂ 및 7 mM KH₂PO4를 함유하는 전기영동 버퍼로 세포를 세척하고, 마지막으로 250 μl의 전기영동 버퍼에 재현탁하였다. 하기 조건을 사용하여 전기영동을 수행하였다: 1.2 kV, 150 Ω, 50 μF. 1ml의 전기영동 배지를 이후에 부가하고, 세포를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 20 mg/l 카나마이신이 보충된 LB 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 클론을 상기에 기재된 바와 같이 검증하고, 분석 시험을 위한 물질 생성에 사용하였다. 그러므로, 균주를 단백질 유도 조건하에 표준 발현으로 접종하고, 37℃에서 30시간 동안 인큐베이션하였다. 상등액을 수거하고, 분석 및 적용 시험에 사용하였다.

실시예 4. 트리코더마 리세이 에서 재조합 만난아제 변이체 단백질의 생성

트리코더마 리세이에서 재조합 만난아제 TBH1 - TBH11 (서열번호: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26) 단백질의 생성을 위해 발현 플라스미드를 제작하였다. 상기 제작된 발현 플라스미드를 표 6에 열거하였다. 그 자신의 신호 서열을 갖지 않는 재조합 만난아제 유전자를, T. 리세이 cel6A/cbh2 CBM 운반체 및 링커로 T. 리세이 cel7A / cbh1 프로모터 그 다음에 Kex2 프로테아제 인식 부위에 융합시켰다. 전사 종결은 T. 리세이 cel7A / cbh1 종결인자에 의해 보장되고, Paloheimo et al. (2003)에 기재된 바와 같이 형질전환체의 선택을 위해 A. 니둘란스 amdS 마커 유전자를 사용하였다. 선형 발현 카세트 (도 2)를 NotI 소화 후에 벡터 백본으로부터 단리하고, T. 리세이 원형질체 (protoplasts)로 형질전환하였다. 사용된 숙주 균주는 4개의 주요 T. 리세이 셀룰라제 (CBHI, CBHII, EGI, EGII) 중 어느 것도 생산하지 않았다. Karhunen et al. (1993)에 기재된 변형을 갖는 형질전환을 Penttila et al. (1987)에 기재된 바와 같이 수행하고, 단독 질소원으로서 아세트아미다제를 선택하였다 (amdS 마커 유전자). 형질전환체를 PD 상에 포자형성 (sporulating)하기 전에 단일 분생자 (conidia)를 통해 선택 플레이트에서 정제하였다.

트리코더마 리세이 에서 재조합 단백질인 TBH1 - TBH11 (서열번호: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26)을 생성하도록 제작된 발현 카세트. 발현 카세 트의 전체 구조는 도 2에 도시된 바와 같다.

만난아제 단백질	발현 플라스미드	발현 카세트 (a
TBH1	pALK4415	7.5 kb NotI
TBH2	pALK4416	7.5 kb NotI
TBH3	pALK4417	7.5 kb NotI
TBH4	pALK4418	7.5 kb NotI
TBH5	pALK4419	7.5 kb NotI
TBH6	pALK4420	7.5 kb NotI
TBH7	pALK4421	7.5 kb NotI
TBH8	pALK4422	7.5 kb NotI
TBH9	pALK4423	7.5 kb NotI
TBH10	pALK4430	7.5 kb NotI
TBH11	pALK4431	7.5 kb NotI
TBH14	pALK4668	7.5 kb NotI

^(a T. 리세이 형질전환을 위한 발현 카세트는 NotI 소화를 사용하여 벡터 백본으로부터 단리되었다.

상기 형질전환체의 만난아제 생성은 진탕 플라스크 배양의 배양 상등액으로부터 분석되었다. PD 슬랜트 (slants)로부터의 형질전환체를 5% KH₂PO₄로 완충된 50 ml의 복합 락토스-기반 셀룰라제 유도 배지 (Joutsjoki at al. 1993)를 함유하는 진탕 플라스크로 접종하였다. 상기 형질전환체의 만난아제 단백질 생성은 30 ℃, 250 rpm에서 7일 동안 이들을 성장시킨 후에 배양 상등액으로부터 분석하였다. 재조합 단백질의 이종 생산은 후속하는 쿠마시 (Coomassie) 염색과 함께 SDS-PAGE로 분석하였다. 적용 시험을 위해 원심분리로 상등액을 또한 회수하였다.

실험실 규모의 생물반응기에서 배양되는 최고 생산 형질전환체를 선택하였다. 상기 형질전환체는 전형적인 중온성 진균 배양 온도 및 약간 산성 조건에서 단백질 유도 조건하에 회분식 또는 과정의 추가 공급 타입으로 생물반응기에서 배양하였다. 배지 중에 당이 고갈될 때까지 또는 적절한 수율에 도달할 때까지 배양을 계속하였다. 적용 시험을 위해 원심분리 또는 여과로 상등액을 회수하였다.

실시예 5. DNS-방법에 의한 갈락토만난아제 활성의 분석

만난아제 활성 (MNU)은 5분 내에 50℃ 및 pH 7.0에서 갈락토만난 (0.3 w/w-%)으로부터 환원당의 방출로서 측정하였다. 방출된 환원 탄수화물의 양은 디니트로살리실산을 사용하여 분광광도계로 결정하였다.

분석에 사용된 기질 (0.3 w/w-%)을 하기와 같이 제조하였다: 가열 자기 교반기를 사용하여 약 80 ℃에서 50 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 7 (또는 시트레이트 포스페이트 버퍼 pH 7) 중에 0.6 g의 로커스트빈 검 (Sigma G-0753)을 넣고, 끓는점까지 가열하였다. 상기 용액을 냉각시키고, 밤새 차가운 방 (2 - 8 ℃)에서 교반을 지속하면서 용해시키고, 불용성 잔류물은 원심분리로 제거하였다. 그 후에 상기 용액을 버퍼로 200 ml까지 채웠다. 기질을 동결 상태로 저장하고, 약 80 ℃까지 끓인 수조 중에서 가열로 용융하고, 실온으로 냉각하고, 사용 전에 조심스럽게 혼합하였다.

상기 분석에 사용된 DNS 시약은, 약 4 리터의 물에 50 g의 3.5-디니트로살리실산 (Sigma D-550)을 용해시켜서 제조하였다. 연속 자기 교반하면서, 80.0 g의 NaOH를 서서히 부가하고 용해시켰다. 1500 g 양의 Rochelle 염 (K-Na-타르트레이트, Merck 8087)을 연속 교반하면서 소량씩 부가하였다. 45 ℃의 최대 온도까지 조심스럽게 가온시킨 용액을 실온으로 냉각하고, 5000 ml까지 채웠다. 그 후에 이를 Whatman 1 여과지를 통해 여과하고, 실온에서 짙은 병에 저장하였다.

2개의 시험 튜브 각각에 1.8 ml의 기질 용액을 부가하여 반응을 개시하고, 50 ℃에서 5분 동안 평형화시킨 후에, 200 μl의 적절하게 희석된 효소 용액을 상기 튜브 중 하나에 부가하고, 볼텍스 믹서로 잘 혼합하고, 50 ℃에서 정확하게 5분 동안 인큐베이션하였다. 효소 블랭크는 평형화 또는 인큐베이션할 필요가 없다. 3.0 ml의 DNS 시약을 튜브 모두에 부가하고 혼합하여 반응을 중지시켰다. 200 μl의 시료 용액을 효소 블랭크 튜브에 부가하였다. 튜브 모두를 끓는 수조에 넣었다. 정확하게 5분 동안 끓인 후에, 상기 튜브를 냉각 수조에 넣고 이를 실온으로 냉각시켰다. 540 nm에서 효소 블랭크에 대해 시료의 흡광도를 측정하고, 검정 곡선으로부터 활성을 판독하고, 희석 요인 (dilution factor)을 곱하였다. 적절하게 희석된 시료는 0.15 - 0.4의 흡광도 차이를 산출하였다.

360 mg의 만노스 (SigmaM-6020, 건조제 중에 저장)를 분석 버퍼 중에 용해시켜서 만노스 스톡 용액으로부터 20 mM의 표준 곡선을 제조하고, 3, 6, 10 및 14 μmol/ml의 만노스를 함유하는 용액으로 희석하였다. 표준은 50℃에서 인큐베이션하는 것을 제외하고 상기 시료와 같이 취급하였다. 540 nm에서 시약 블랭크 (만노스의 표준 희석물 대신에 버퍼를 함유)에 대해 흡광도를 측정하였다. 검정 곡선을 모든 분석 시리즈에 대해 제작하였다.

1 만난아제 유닛 (MNU)은 분석 조건 하에 1초 내에 갈락토만난으로부터 만노스의 1 nmol에 상응하는 환원력 (reductive power)을 갖는 환원성 탄수화물을 생산하는 효소의 양으로 정의되었다 (1 MNU = 1nkat).

실시예 6. 시판 세제와 트리코더마 에서 생산된 만난아제 변이체의 얼룩 제거 성능

트리코더마에서 생산된 TBH1 -TBH11 변이체의 배양 시료 (실시예 4에 기재된 바와 같음)를 시판 세제와 40 ℃ 및 16°dH의 수경도 (water hardness)에서 만난아제 민감성 표준 얼룩을 제거하는 역량을 시험하고, 야생형 효소와 비교하였다. Center for testmaterial B.V. (네덜란드)로부터 하기와 같이 인위적으로 오염시킨 시험 천을 사용하였다: 면에 민감한 초콜렛 푸딩 만난아제 (E-165), 면에 안료가 있는 로커스트빈 검 (C-S-73) 및 면에 카본 블랙을 갖는 구아검 (C-S-43). 상기 직물을 6 cm x 6 cm의 견본으로 자르고, 각 2 조각을 시험에 사용하였다.

만난아제를 제외한 모든 다른 효소를 함유하는 시판 중질 액체 세제 A를 세척액 1 리터당 4.4 g의 농도로 사용하고, 효소가 없는 시판 색상 세제 분말을 3.8 g/l로 사용하고, 효소가 없는 시판 표백 세제 분말을 4.2 g/l로 사용하였다. 세제 함유 세척액을 경도 16 °dH의 합성 수돗물에서 준비하였다. 프로테아제 Savinase® 16 L (0.5 w/w %) 및 아밀라제 Stainzyme® 12 L (0.4 w/w %)를 시판 색상 및 표백 세제 분말과 사용된 경수로 부가하고, 상기 액체 세제는 이미 아밀라제 및 프로테아제를 함유하였다. 상기 액체 세제의 세척액의 pH는 대략 8.3이고, 색상 세제 분말은 대략 10이며, 표백 세제는 대략 9.5이다.

만난아제를 세척액 1ml 당 0.025 및/또는 0.05 MNU 활성으로 투여하였다. 활성은 실시예 5에 기재된 바와 같이 측정하였다. 대조군 시료는 만난아제가 없는 세제 용액을 함유하였다.

16˚dH의 경도를 갖는 합성 수돗물의 경우, 하기의 스톡 용액을 탈이온수 (Milli-Q 또는 동등물)에서 준비하였다:

1000˚d 칼슘-경도를 갖는 스톡 용액: CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, Germany) 26.22 g/l

200˚d 마그네슘-경도를 갖는 스톡 용액: MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, Germany) 8.79 g/l H2O

NaHCO3 스톡 용액: NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, Germany) 29.6 g/l

13.3 ml의 CaCl2 용액, 13.3 ml의 MgSO4 용액 및 10.0 ml의 새로 제조된 NaHCO3 용액을 주어진 순서로 부피 플라스크에 부가하고, 탈이온수로 1L까지 만들어 혼합하였다. 물의 경도는 착물형성 적정 (complexometric titration)에 의해 측정하고, 정확한 것을 확인하였다.

얼룩 제거 처리는 다음과 같이 Atlas LP-2 Launder-Ometer에서 수행하였다. Launder-Ometer는 우선 40℃로 예열하였다. 그 다음에, 세제, 경도 16 °dH의 250 ml 합성 수돗물 및 희석된 효소 (<1.0 ml)를 1.2 리터 용기에 부가하였다. 얼룩을 부가하고, Launder-Ometer를 회전 속도 42 rpm으로 40 ℃에서 60 분 동안 작동시켰다. 그 후, 상기 견본을 흐르는 물로 조심스럽게 헹구고, 일광으로부터 보호되는 그리드에서 밤새 실내 공기에서 건조시켰다.

얼룩 제거 효과는 L*a*b*색 공간 좌표 (illuminant D65/10°, 420nm cut)를 사용하여 Konica Minolta CM-3610A 분광광도계로 반사율 값으로 색을 측정하여 평가하였다. 만난아제 성능 (얼룩 제거 효율)을 나타내는 얼룩의 퇴색은 ΔL^* (delta L^*)로 산출하고, 이는 효소 처리된 직물의 명도값 L^* - 만난아제 없는 세척액으로 처리된 직물의 명도값 L^* (대조군)을 의미한다. 최종 결과 (전체 얼룩 제거 효과)는 각 3개의 얼룩의 ΔL^*의 합으로 나타내었다. 각 얼룩의 색상 값은 2개의 견본의 평균이다.

시판 액체 세제로 얻은 결과는 도 3에 도시되어 있고, 시판 색상 세제 분말로 얻은 결과는 도 4에 도시되어 있으며, 시판 표백 세제로 얻은 결과는 도 5에 도시되어 있다. 모든 변이체 (TBH1-TBH11)는 다른 타입의 시판 세제와 탁월한 얼룩 제거 성능을 보였다. 변이체의 성능은 야생형과 유사했다.

실시예 7. 시판 세제와 바실루스 에서 생산된 만난아제 변이체의 얼룩 제거 성능

바실루스에서 생산된 변이체 BH18, BH21, BH23, BH24 및 BH25의 배양 상등액 (실시예 3에 기재된 바와 같음)을 시판 세제와 40 ℃ 및 16°dH의 수경도에서 만난아제 민감성 표준 얼룩을 제거하는 역량을 시험하고, 야생형 효소와 비교하였다. 실시예 6에 기재된 것과 유사한 시험 시스템을 사용하였다.

시판 액체 세제로 얻은 결과는 도 6에 도시되어 있고, 시판 색상 세제 분말로 얻은 결과는 도 7에 도시되어 있으며, 시판 표백 세제로 얻은 결과는 도 8에 도시되어 있다. 모든 변이체 (BH18, BH21, BH23, BH24, BH25)는 다른 타입의 시판 세제와 탁월한 얼룩 제거 성능을 보였다. 변이체의 성능은 야생형과 유사했다.

실시예 8. 37℃에서 시판 액체 세제 중에 만난아제 변이체의 안정성

트리코더마 (실시예 4에 기재된 바와 같음) 또는 바실루스 (실시예 3에 기재된 바와 같음)에서 생산된 몇몇 만난아제 변이체의 배양 상등액의 안정성은 만난아제를 제외한 프로테아제 및 모든 다른 효소를 함유하는 시판 액체 중질 세제 A에서 시험하고, 야생형 효소와 비교하였다. 만난아제 제제는 세제 중에 4 w/w-%로 부가하고, 시료를 캡 (caps)이 있는 플라스틱 튜브에서 37℃로 약 16주 또는 24주 동안 인큐베이션하였다. 활성은 30분의 인큐베이션 시간을 사용하는 것을 제외하고 실시예 5에 기재된 활성 분석에 의해 소정의 간격으로 측정하였다. 결과는 잔류 활성 (%)으로 산출하고, 이는 소정의 시점에서 얻어진 시료의 활성을 시료의 초기 활성으로 나누어 얻어진다.

변이체 TBH2, TBH3, TBH4, TBH5 및 특히 TBH6의 안정성은 37℃와 같이 높은 온도에서 24주 동안 저장될 때, 트리코더마에서 생산된 Man7의 야생형 효소와 비교하여 향상되었다. 야생형과 비교하여 TBH6에 의한 안정성 시험의 결과는 도 9에 도시되어 있다.

변이체 BH21, BH23, BH24 및 특히 BH25의 안정성은 37℃와 같이 높은 온도에서 수주 동안 저장될 때, 바실루스에서 생산된 Man7의 야생형 효소와 비교하여 향상되었다. 야생형과 비교하여 BH25에 의한 안정성 시험의 결과는 도 10에 도시되어 있다.

실시예 9. 50℃에서 시판 액체 세제 중에 만난아제 변이체의 안정성

트리코더마 (실시예 4에 기재된 바와 같음)에서 생산된 TBH1 - TBH11 변이체의 배양 상등액의 안정성을 프로테아제를 함유하지만 만난아제는 함유하지 않는 시판 액체 중질 세제 A에서 시험하고, 극한 조건에서 야생형 효소와 비교하였다. 만난아제 제제는 세제 중에 4 w/w-%로 부가하고, 시료를 캡이 있는 플라스틱 튜브에서 50℃로 7일 동안 인큐베이션하였다. 활성은 30분의 인큐베이션 시간을 사용하는 것을 제외하고 실시예 X에 기재된 활성 분석에 의해 측정하였다. 결과는 잔류 활성 (%)으로 산출하고, 이는 소정의 시점에서 얻어진 시료의 활성을 시료의 초기 활성으로 나누어 얻어진다.

도 11에 도시된 결과에 기반하여, 모든 변이체 효소의 안정성은 50℃에서 7일 동안 야생형과 비교하여 우수했다. 극한 조건에서의 안정성은 야생형 효소와 비교하여 TBH1, TBH2, TBH4, TBH5, TBH6, TBH10 및 TBH11에 의해 특히 상당하게 향상되었다.

최고의 생산 변이체 중 일부를 실험실 규모의 생물반응기에서 배양하고, 만난아제 제제의 양이 세제 중에 1 w/w-%인 것을 제외하고 상기에 기재된 바와 유사한 시험 시스템을 사용하여 안정성을 다시 시험하였다. 만난아제 변이체 TBH5 및 TBH6의 안정성은 실험실 규모의 배양 물질이 사용될 때 야생형보다 상당히 우수했다 (데이터는 개시되지 않음).

상기 결과로부터 만난아제 변이체는 특히 높은 온도에서 야생형 효소와 비교하여 우수한 얼룩 제거 성능 및 상당히 향상된 안정성을 갖는 것을 보여주었다. 또한, 이들의 높은 특이적 활성 및 생산 수율로 인해 보다 경제적으로 이들이 생산될 수 있다 (데이터는 개시되지 않음).

실시예 10. 변이체 TBH5 및 TBH6의 조합

만난아제 특성을 추가로 개선시키기 위해, TBH5 및 TBH6 변이체에서의 돌연변이를 조합하였다 (M123I, A158S, S229A, G272Q, T285A, T307R 및 L316K). 조합 변이체 TBH14를, 실시예 2 및 4에 기재된 바와 같이 합성 구조물로서 제조하고, 발현 벡터로 클로닝하고, 트리코더마 리세이에서 생산하였다. 상기 조합 변이체 TBH14의 안정성은 실시예 9에 기재된 바와 같이 50℃에서 7일 동안 시험하였다. 변이체 TBH6 및 TBH5는 비교를 위해 사용하였다. 결과는 도 13에 도시되어 있다. 상기 조합 변이체 TBH14의 안정성은 변이체 TBH6 또는 TBH5의 안정성보다 적어도 양호하거나 또는 우수했고, 이는 실시예 9에서 야생형과 비교하여 향상된 안정성을 보였으며, 즉 TBH14의 안정성은 50℃와 같은 높은 온도에서 몇 일 동안 저장될 때 트리코더마에서 생산된 야생형 효소와 비교하여 향상되었다. 상기 조합 변이체 TBH14는 또한 시판 세제와 우수한 얼룩 제거 성능을 보였다 (야생형과 유사함).

실시예 10b. 육계에서 만난아제 단독 및 비-전분 폴리사카라이드 ( NSP ) 분해 효소와의 조합에 의한 효율 연구

본 발명의 재조합 만난아제 변이체의 효과를 육계 (broilers)의 성장에 대해 연구하였다. 재조합 만난아제를 포함하는 발효액 (fermentation broth)의 한외여과물 (ultrafiltrate)을 건조시키고, 표적 수준을 펠렛화된 육계의 식단에 단독 또는 시판 자일라나제 기반 제품과 함께 적용하였다.

옥수수 및 탈피 용매 추출된 대두 밀을 기반으로 하는 대조군 식단을 효소 없이 공급하거나 또는 본 발명의 재조합 만난아제의 다양한 수준을 단독으로 또는 표준 용량의 시판 자일라나제와 조합하여 부가되었다.

상기 육계의 초기 중량은 30g 내지 50g이다. 실험은 3주 내지 5주 지속하였다. 각각의 처리는 각각 10마리의 육계로 최소 6개의 복제물로 구성된다. 각 사례에서, 상기 식단은 수분, 조단백질, 조섬유, 지방, 회분 및 효소 단백질에 대해 분석하였다.

5개의 식단을 준비하였다:

1) 비보충된 대조군 (BD)

2) BD + 만난아제 1 - 500 mg/kg

3) BD + 만난아제 1 - 1000 mg/kg

4) BD + 만난아제 1 - 500 mg/kg + 자일라나제 1 내지 10 mg/kg

5) BD + 자일라나제 1 - 10 mg/kg

상기 동물의 건강 상태 및 사망률을 육안으로 매일 점검하였다. 0, 14 및 35일에, 체중 증가 (BW), 사료 섭취 (FI) 및 사료 전환율 (FCR)을 측정하였다. FCR은 총 사료 소비량을 동일한 기간 동안의 체중 증가로 나눈 값으로 산출된다. 재조합 만난아제 변이체의 효과 결정은 동일한 식단 또는 동일한 식단에 자일라나제를 부가한 동물 사료와의 비교에 기반한다.

실시예 11. 인스턴트 커피 제조

순수한 만난은 커피 배젖의 주요 저장 폴리사카라이드 구성성분이고, 높은 점도의 원인이 되며, 이는 인스턴트 커피의 기술적 가공에 부정적인 영향을 미치고 건조 중에 에너지 소비를 증가시켰다. 만난에 기인한 이러한 효과는 단단하고 불용성의 결정 구조를 형성한다. β-만난아제는 종종 펙티나제 및 셀룰라제와 같은 다른 효소와 함께, 인스턴트 커피 제조의 농축 단계 중에 커피 추출물의 점도를 감소시키기 위해 부가된다. 또한, 만난아제는 인스턴트 커피의 동결 건조 중에 겔 형성을 억제하기 위해 액체 커피 추출물에 존재하는 갈락토만난을 가수분해하기 위해 사용된다. 또한, 효소 처리의 사용으로 인해, 커피 콩 추출물은 증발과 같은 저렴한 절차에 의해 농축될 수 있다.

상기 시험은 10℃의 온도 및 0.15% d.s의 효소 용량으로 도 12의 흐름도에 따라 수행하였다.

본 발명의 만난아제 변이체를 펙티나제 및 셀룰라제와 같은 상이한 효소로 구성된 혼합물에서 시험하였다.

상기 커피 추출물의 점도는 표준 가공 조건하에 경시적으로 유의하게 증가하였다. 그러나, 본 발명의 만난아제 변이체를 함유하는 효소 혼합물을 사용하여 점도를 유의하게 감소시켜, 분무- 또는 동결 건조와 같은 다운스트림 가공을 개선하였다.

실시예 12. 파인애플 가공

파인애플은 글루코만난과 갈락토만난을 포함하는 많은 분획의 만난을 함유하기 때문에, 파인애플 분쇄 주스 (pineapple mill juice) 추출 및 정화에 특히 만난아제가 유용하다.

만난아제는 유용한 과일 구성성분의 추출을 개선하고, 농축 전 과일 주스의 점도를 낮추며, 최종 제품의 여과 속도와 안정성을 증가시킨다.

파인애플을 고기 분쇄기에서 분쇄하고, 1000 ml 비커에 500 g의 매쉬 (mash)를 채웠다. 상기 효소를 21℃에서 60분의 반응 시간으로 적용하였다. 그 다음에 프레스 프로토콜에 따라 작은 Hafico 프레스로 상기 매쉬를 압착하였다: 0 bar 2 분 - 50 bar 2 분 - 100 bar 2 분 - 150 bar 2 분 - 200 bar 1 분 - 300 bar 1 분 - 400 bar 1분. 그 다음에 수득된 주스를 4500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 탁도 (turbidity) 및 점도를 분석하였다.

본 발명의 만난아제 변이체는 효소 혼합물 A, B 및 C에서 시험하였다 (표 7).

파인애플 매쉬에 부가하기 전에 효소를 먼저 수돗물로 희석하였다.

효소 혼합물

	효소 활성	투여량 [ ppm ]	5 ml [ % 효소 용액]
블랭크			5 ml H2O
혼합물 A	펙티나제	50	0.50%
혼합물 B	펙티나제 + 아라바나제	50	0.50%
혼합물 C	펙티나제 + 만난아제	50	0.50%

본 발명의 만난아제 변이체를 적용하면 파인애플 가공에서 주스의 수율이 증가하고 탁도가 낮아진다.

실시예 13. 두유 제조를 위한 대두의 만난아제 처리

두유를 얻기 위한 대두 (soya beans)의 효소 처리를 위해, "가열 공정"이 일반적으로 사용된다. 가열 두유 공정 (hot soya milk process)을 위해, 건조된 대두를 1:7 (침지된 대두: 물) 비율로 끓인 수돗물과 믹서에서 혼합하고 분쇄하였다. 전체 대두 슬러리를 효소 부가 전에 50-55℃로 냉각시켰다. 상기 대두 슬러리의 pH 수준은 약 pH 6.5이어야 하며, NaHCO₃으로 조정할 수 있다. 상기 만난아제 효소는 1kg/t의 건조 대두의 용량으로 슬러리에 부가하고, 30분 동안 교반하였다. 상기 반응 시간 완료 후에, 실험실 프레스를 사용하여 상기 슬러리를 압착하여 최종 산물인 두유를 수득하였다. 동일한 프레스 프로파일을 보장하기 위해, 압력 및 이에 상응하는 압착 시간을 표 8에 나타낸 바와 같이 명시하였다. 효소 반응을 위한 시료 외에도, 임의의 효소가 없는 대조군 시료를 준비하였고, 여기서 효소 용액은 물로 대체하였다.

프레스 계획

압력 [bar]	0	50	100	300
시간 [분]	2	2	2	1

압착 후에, 상기 두유를 끓을 때까지 전자레인지에서 가열하여 효소 반응을 정지시켰다. 두유의 분석:

그램/시간의 수율

두유 중 당의 양과 직접적인 상관관계를 나타내고, 굴절률측정기 (refractometer)로 결정되는 °Brix

상기 주스의 탁도는 NTU-광도계로 측정하고, nephelometric 탁도를 측정하였다.

밝기는 LAB-측정법으로 측정할 것이다.

단백질 함량은 CN-분석기 (연소 방법)로 결정하였다.

향미

본 발명의 만난아제 변이체로 처리된 두유는 증가된 수율, 더 밝은 색상, 증가된 °Brix, 더 낮은 탁도, 더 높은 단백질 함량 및 더 우수한 맛 (향기 제거)을 나타낸다.

특허 청구범위 및 이의 해석을 제한하지 않고, 본원에 개시된 하나 이상의 양상 또는 구체예의 특정한 기술적 효과를 하기에 열거하였다: 기술적 효과는 만난의 분해 및 변형이다. 다른 기술적 효과는 우수한 저장 안정성을 갖는 만난아제의 제공이다.

상기 설명은 본 발명의 특정한 구현 및 구체예의 비제한적인 예를 통해 본 발명을 실시하기 위한 본 발명자들에 의해 현재 고려되는 최상에 모드에 대한 완전하고 유익한 설명을 제공한다. 그러나, 본 발명은 상기 제시된 구체예의 세부 사항에 제한되지 않으며, 본 발명의 특성을 벗어나지 않는 한 동등한 수단을 사용하여 다른 구체예로 구현될 수 있다는 것이 당업자에게는 명백하다.

또한, 본 발명의 전술한 양상 및 구체예의 특징 중 일부는 다른 특징의 상응하는 사용 없이도 유익하게 사용될 수 있다. 이와 같이, 상기 발명의 설명은 단지 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 간주되어야 하며, 이를 제한하는 것은 아니다. 그러므로, 본 발명의 범위는 첨부된 특허 청구범위에 의해서만 제한된다.

일 구체예에서, 본 발명의 조성물의 적어도 하나의 구성성분은 적어도 하나의 구성성분이 유래된 상응하는 천연 성분과 비교하여 상이한 화학적, 구조적 또는 물리적 특성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 특성은 균일한 크기, 균질 분산, 상이한 이소형태, 상이한 코돈 축퇴성, 상이한 번역후 변형, 상이한 메틸화, 상이한 3차 또는 4차 구조, 상이한 효소 활성, 상이한 친화도, 상이한 결합 활성 및 상이한 면역원성 중 적어도 하나이다.

the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32425 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32426 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32427 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32428 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32429 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32430 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32431 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32432 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32433 20170302 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32518 20170518 the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM32519 20170518

SEQUENCE LISTING <110> AB Enzymes Oy <120> Mannanase variants, S <130> 31604EP-1f_ALLMAN-S <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1395 <212> DNA <213> Bacillus hemicellulosilyticus <400> 1 cagacccact cgggcttcta catcgagggc tcgacgctct acgacgctaa cggcgagcct 60 tttgtcatgc gcggcatcaa ccacggccac gcctggtaca agcacgactc caacgtcgct 120 atccctgcta tcgctaacca gggcgctaac accatccgca tcgtcctcag cgacggtggc 180 cagtgggcca aggacgacat caacacgctg aaccaggtcc tcgacctggc cgaggagcac 240 gagatgatcg ctgtcgtcga ggtccacgac gctaccggct ccaacagcat ggccgacctc 300 aaccgcgccg tcgactactg gatcgagatg aaggacgccc tgatcggcaa ggaagaccgc 360 gtcatcatca acatcgctaa cgagtggtac ggcgcttggg acggccaggg ctgggccaac 420 ggctacaagg aagtcatccc tcgcctgcgc aacgctggct tcacccacac cctcatggtc 480 gacgctgccg gctggggcca gtaccctcag agcatccacg actacggcca agaggtcttc 540 aacgccgacc ctctggccaa caccatgttc tccatccaca tgtacgagta cgctggcggc 600 aacgcctcca tggtccagag caacatcgac ggcgtcgtcg accagggcct cgctctggtc 660 atcggcgagt tcggccacat 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tggtagatgc agctggttgg ggacaatacc ctcaatcgat tcatgattat 540 ggtcaagagg tatttaatgc tgatccttta gcaaatacga tgttttccat ccatatgtat 600 gaatatgctg gcggaaatgc ttcaatggta caatctaata tcgatggtgt cgtcgatcaa 660 gggttagctc ttgtaatagg agaatttggg catatgcata cggacggaga tgttgatgaa 720 gcaacgatat tgagctactc gcaacaaaga ggagtcggtt ggctagcttg gtcttggaaa 780 ggcaatggga ctcaatggga atatctagat ttatcttatg attggcaagg aacaaactta 840 acttcttggg gaaatagaat tgtccacggg cctaatggat tactcgaaac atccattcca 900 agctcgattt tccataccgc tccaaacaat ggagatcccc ctcctcataa cggtaatgaa 960 acgatcttat atgatttcga acatggcact caaggctggt caggttcttc acttcttgga 1020 ggaccttgga cgacgaatga atggagtaca aatggtaacc attcattaaa ggccgatatt 1080 ttcttatcag ctaactccaa acatgaatta gcaaaagttg aaaatcgaaa tttatcaggc 1140 tactctactt tacaagccac tgtccgccat gcacattggg gaaatgttgg taatttaacg 1200 gcgagaatgt atgtaaaaac gggctcaaac tatagctggt ttaatggtga tcctatccca 1260 gtaaactcag caaatggtac gactgtcact ttgcctcttt catctattcc aaacctaaat 1320 gacgtaaaag aaattggcgt tgaatttatt ggagcttcaa atagcaatgg acaaaccgcc 1380 atttatttag atcatgtaac aatccaataa 1410 <210> 30 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 30 Ser Asp Gly His Ser Gln Thr His Ser Gly Phe Tyr Ile Glu Gly Ser 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Asp Ala Asn Gly Glu Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn 20 25 30 His Gly His Ala Trp Tyr Lys His Asp Ser Asn Val Ala Ile Pro Ala 35 40 45 Ile Ala Asn Gln Gly Ala Asn Thr Ile Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly 50 55 60 Gly Gln Trp Ala Lys Asp Asp Ile Asn Thr Leu Asn Gln Val Leu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Glu Glu His Glu Met Ile Ala Val Val Glu Val His Asp Ala 85 90 95 Thr Gly Ser Asn Ser Met Ala Asp Leu Asn Arg Ala Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Ile Glu Met Lys Asp Ala Leu Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Ile 115 120 125 Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Ser Trp Asp Gly Gln Gly Trp Ala 130 135 140 Asn Gly Tyr Lys Glu Val Ile Pro Arg Leu Arg Asn Ala Gly Phe Thr 145 150 155 160 His Thr Leu Met Val Asp Ala Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser 165 170 175 Ile His Asp Tyr Gly Gln Glu Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Ala Asn 180 185 190 Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Ser 195 200 205 Met Val Gln Ser Asn Ile Asp Gly Val Val Asp Gln Gly Leu Ala Leu 210 215 220 Val Ile Gly Glu Phe Gly His Met His Thr Asp Gly Asp Val Asp Glu 225 230 235 240 Ala Thr Ile Leu Ser Tyr Ser Gln Gln Arg Gly Val Gly Trp Leu Ala 245 250 255 Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly Thr Gln Trp Glu Tyr Leu Asp Leu Ser 260 265 270 Tyr Asp Trp Gln Gly Thr Asn Leu Thr Ser Trp Gly Asn Arg Ile Val 275 280 285 His Gly Pro Asn Gly Leu Leu Glu Thr Ser Ile Pro Ser Ser Ile Phe 290 295 300 His Thr Ala Pro Asn Asn Gly Asp Pro Pro Pro His Asn Gly Asn Glu 305 310 315 320 Thr Ile Leu Tyr Asp Phe Glu His Gly Thr Gln Gly Trp Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Leu Leu Gly Gly Pro Trp Thr Thr Asn Glu Trp Ser Thr Asn Gly 340 345 350 Asn His Ser Leu Lys Ala Asp Ile Phe Leu Ser Ala Asn Ser Lys His 355 360 365 Glu Leu Ala Lys Val Glu Asn Arg Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Thr Leu 370 375 380 Gln Ala 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taaggaggtt attccacgtt tacgaaatgc tggcttcact 480 catacattaa tggtagatgc agctggttgg ggacaatacc ctcaatcgat tcatgattat 540 ggtcaagagg tatttaatgc tgatccttta gcaaatacga tgttttccat ccatatgtat 600 gaatatgctg gcggaaatgc ttcaatggta caatctaata tcgatggtgt cgtcgatcaa 660 gggttagctc ttgtaatagg agaatttggg catatgcata cggacggaga tgttgatgaa 720 gcaacgatat tgagctactc gcaacaaaga caagtcggtt ggctagcttg gtcttggaaa 780 ggcaatggga ctcaatggga atatctagat ttatcttatg attggcaagg aacaaactta 840 acttcttggg gaaatagaat tgtccacggg cctaatggat tactcgaaac atccattcca 900 agctcgattt tccataccgc tccaaacaat ggagatcccc ctcctcataa cggtaatgaa 960 acgatcttat atgatttcga acatggcact caaggctggt caggttcttc acttcttgga 1020 ggaccttgga cgacgaatga atggagtaca aatggtaacc attcattaaa ggccgatatt 1080 ttcttatcag ctaactccaa acatgaatta gcaaaagttg aaaatcgaaa tttatcaggc 1140 tactctactt tacaagccac tgtccgccat gcacattggg gaaatgttgg taatttaacg 1200 gcgagaatgt atgtaaaaac gggctcaaac tatagctggt ttaatggtga tcctatccca 1260 gtaaactcag caaatggtac gactgtcact ttgcctcttt catctattcc aaacctaaat 1320 gacgtaaaag aaattggcgt tgaatttatt ggagcttcaa atagcaatgg acaaaccgcc 1380 atttatttag atcatgtaac aatccaataa 1410 <210> 32 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 32 Ser Asp Gly His Ser Gln Thr His Ser Gly Phe Tyr Ile Glu Gly Ser 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Asp Ala Asn Gly Glu Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn 20 25 30 His Gly His Ala Trp Tyr Lys His Asp Ser Asn Val Ala Ile Pro Ala 35 40 45 Ile Ala Asn Gln Gly Ala Asn Thr Ile Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly 50 55 60 Gly Gln Trp Ala Lys Asp Asp Ile Asn Thr Leu Asn Gln Val Leu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Glu Glu His Glu Met Ile Ala Val Val Glu Val His Asp Ala 85 90 95 Thr Gly Ser Asn Ser Ile Ala Asp Leu Asn Arg Ala Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Ile Glu Met Lys Asp Ala Leu Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Ile 115 120 125 Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Ser Trp Asp Gly Gln Gly Trp Ala 130 135 140 Asn Gly Tyr Lys Glu Val Ile Pro Arg Leu Arg Asn Ala Gly Phe Thr 145 150 155 160 His Thr Leu Met Val Asp Ala Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser 165 170 175 Ile His Asp Tyr Gly Gln Glu Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Ala Asn 180 185 190 Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Ser 195 200 205 Met Val Gln Ser Asn Ile Asp Gly Val Val Asp Gln Gly Leu Ala Leu 210 215 220 Val Ile Gly Glu Phe Gly His Met His Thr Asp Gly Asp Val Asp Glu 225 230 235 240 Ala Thr Ile Leu Ser Tyr Ser Gln Gln Arg Gln Val Gly Trp Leu Ala 245 250 255 Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly Thr Gln Trp Glu Tyr Leu Asp Leu Ser 260 265 270 Tyr Asp Trp Gln Gly Thr Asn Leu Thr Ser Trp Gly Asn Arg Ile Val 275 280 285 His Gly Pro Asn Gly Leu Leu Glu Thr Ser Ile Pro Ser Ser Ile Phe 290 295 300 His Thr Ala Pro Asn Asn Gly Asp Pro Pro Pro His Asn Gly Asn Glu 305 310 315 320 Thr Ile Leu Tyr Asp Phe Glu His Gly Thr Gln Gly Trp Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Leu Leu Gly Gly Pro Trp Thr Thr Asn Glu Trp Ser Thr Asn Gly 340 345 350 Asn His Ser Leu Lys Ala Asp Ile Phe Leu Ser Ala Asn Ser Lys His 355 360 365 Glu Leu Ala Lys Val Glu 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gccaatgaat ggtatggagc atgggacgga 420 caaggctggg caaatggcta taaggaggtt attccacgtt tacgaaatgc tggcttcact 480 catacattaa tggtagatgc agctggttgg ggacaatacc ctcaatcgat tcatgattat 540 ggtcaagagg tatttaatgc tgatccttta gcaaatacga tgttttccat ccatatgtat 600 gaatatgctg gcggaaatgc ttcaatggta caatctaata tcgatggtgt cgtcgatcaa 660 gggttagctc ttgtaatagg agaatttggg catatgcata cggacggaga tgttgatgaa 720 gcaacgatat tgagctactc gcaacaaaga caagtcggtt ggctagcttg gtcttggaaa 780 ggcaatggga ctcaatggga atatctagat ttatcttatg attggcaagg aacaaactta 840 acttcttggg gaaataccat tgtccacggg cctaatggat taaaagaaac atccattcca 900 agctcgattt tccataccgc tccaaacaat ggagatcccc ctcctcataa cggtaatgaa 960 acgatcttat atgatttcga acatggcact caaggctggt caggttcttc acttcttgga 1020 ggaccttgga cgacgaatga atggagtaca aatggtaacc attcattaaa ggccgatatt 1080 ttcttatcag ctaactccaa acatgaatta gcaaaagttg aaaatcgaaa tttatcaggc 1140 tactctactt tacaagccac tgtccgccat gcacattggg gaaatgttgg taatttaacg 1200 gcgagaatgt atgtaaaaac gggctcaaac tatagctggt ttaatggtga tcctatccca 1260 gtaaactcag caaatggtac gactgtcact ttgcctcttt catctattcc aaacctaaat 1320 gacgtaaaag aaattggcgt tgaatttatt ggagcttcaa atagcaatgg acaaaccgcc 1380 atttatttag atcatgtaac aatccaataa 1410 <210> 34 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 34 Ser Asp Gly His Ser Gln Thr His Ser Gly Phe Tyr Ile Glu Gly Ser 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Asp Ala Asn Gly Glu Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn 20 25 30 His Gly His Ala Trp Tyr Lys His Asp Ser Asn Val Ala Ile Pro Ala 35 40 45 Ile Ala Asn Gln Gly Ala Asn Thr Ile Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly 50 55 60 Gly Gln Trp Ala Lys Asp Asp Ile Asn Thr Leu Asn Gln Val Leu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Glu Glu His Glu Met Ile Ala Val Val Glu Val His Asp Ala 85 90 95 Thr Gly Ser Asn Ser Ile Ala Asp Leu Asn Arg Ala Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Ile Glu Met Lys Asp Ala Leu Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Ile 115 120 125 Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Ala Trp Asp Gly Gln Gly Trp Ala 130 135 140 Asn Gly Tyr Lys Glu Val Ile Pro Arg Leu Arg Asn Ala Gly Phe Thr 145 150 155 160 His Thr Leu Met Val Asp Ala Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser 165 170 175 Ile His Asp Tyr Gly Gln Glu Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Ala Asn 180 185 190 Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Ser 195 200 205 Met Val Gln Ser Asn Ile Asp Gly Val Val Asp Gln Gly Leu Ala Leu 210 215 220 Val Ile Gly Glu Phe Gly His Met His Thr Asp Gly Asp Val Asp Glu 225 230 235 240 Ala Thr Ile Leu Ser Tyr Ser Gln Gln Arg Gln Val Gly Trp Leu Ala 245 250 255 Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly Thr Gln Trp Glu Tyr Leu Asp Leu Ser 260 265 270 Tyr Asp Trp Gln Gly Thr Asn Leu Thr Ser Trp Gly Asn Thr Ile Val 275 280 285 His Gly Pro Asn Gly Leu Lys Glu Thr Ser Ile Pro Ser Ser Ile Phe 290 295 300 His Thr Ala Pro Asn Asn Gly Asp Pro Pro Pro His Asn Gly Asn Glu 305 310 315 320 Thr Ile Leu Tyr Asp Phe Glu His Gly Thr Gln Gly Trp Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Leu Leu Gly Gly Pro Trp Thr Thr Asn Glu Trp Ser Thr Asn Gly 340 345 350 Asn His Ser Leu Lys Ala Asp Ile Phe Leu Ser Ala Asn Ser Lys His 355 360 365 Glu Leu Ala Lys Val Glu Asn Arg Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Thr Leu 370 375 380 Gln Ala Thr Val Arg His Ala His Trp Gly Asn Val Gly Asn Leu Thr 385 390 395 400 Ala Arg Met Tyr Val Lys Thr Gly Ser Asn Tyr Ser Trp Phe Asn Gly 405 410 415 Asp Pro Ile Pro Val Asn Ser Ala Asn Gly Thr Thr Val Thr Leu Pro 420 425 430 Leu Ser Ser Ile Pro Asn Leu Asn Asp Val Lys Glu Ile Gly Val Glu 435 440 445 Phe Ile Gly Ala Ser Asn Ser Asn Gly Gln Thr Ala Ile Tyr Leu Asp 450 455 460 His Val Thr Ile Gln 465 <210> 35 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 35 tctgatggtc atagccaaac acattctggt ttttatatcg aaggttcaac cctttatgac 60 gccaacggag agccctttgt aatgagaggt atcaatcatg gacatgcctg gtataaacat 120 gattctaacg tcgctatacc agctattgct aatcaaggag caaatacaat tcgtattgtt 180 ctgtcagatg gtggtcaatg ggcaaaagat gatataaaca cattaaatca agtgctcgat 240 ttagcagagg aacatgagat gattgctgtt gttgaggttc acgatgcaac aggatctaat 300 tctatggctg acttaaatcg tgctgtcgat tattggattg aaatgaaaga cgctttaatt 360 ggaaaagaag atcgcgtcat aattaacatt gccaatgaat ggtatggatc atgggacgga 420 caaggctggg caaatggcta taaggaggtt attccacgtt tacgaaatgc tggcttcact 480 catacattaa tggtagatgc agctggttgg ggacaatacc ctcaatcgat tcatgattat 540 ggtcaagagg tatttaatgc tgatccttta gcaaatacga tgttttccat ccatatgtat 600 gaatatgctg gcggaaatgc ttcaatggta caatctaata tcgatggtgt cgtcgatcaa 660 gggttagctc ttgtaatagg agaatttggg catatgcata cggacggaga tgttgatgaa 720 gcaacgatat tgagctactc gcaacaaaga ggagtcggtt ggctagcttg gtcttggaaa 780 ggcaatggga ctcaatggga atatctagat ttatcttatg attggcaagg aacaaactta 840 acttcttggg gaaatagaat tgtccacggg cctaatggat taaaagaaac atccattcca 900 agctcgattt tccataccgc tccaaacaat ggagatcccc ctcctcataa cggtaatgaa 960 acgatcttat atgatttcga acatggcact caaggctggt caggttcttc acttcttgga 1020 ggaccttgga cgacgaatga atggagtaca aatggtaacc attcattaaa ggccgatatt 1080 ttcttatcag ctaactccaa acatgaatta gcaaaagttg aaaatcgaaa tttatcaggc 1140 tactctactt tacaagccac tgtccgccat gcacattggg gaaatgttgg taatttaacg 1200 gcgagaatgt atgtaaaaac gggctcaaac tatagctggt ttaatggtga tcctatccca 1260 gtaaactcag caaatggtac gactgtcact ttgcctcttt catctattcc aaacctaaat 1320 gacgtaaaag aaattggcgt tgaatttatt ggagcttcaa atagcaatgg acaaaccgcc 1380 atttatttag atcatgtaac aatccaataa 1410 <210> 36 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 36 Ser Asp Gly His Ser Gln Thr His Ser Gly Phe Tyr Ile Glu Gly Ser 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Asp Ala Asn Gly Glu Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn 20 25 30 His Gly His Ala Trp Tyr Lys His Asp Ser Asn Val Ala Ile Pro Ala 35 40 45 Ile Ala Asn Gln Gly Ala Asn Thr Ile Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly 50 55 60 Gly Gln Trp Ala Lys Asp Asp Ile Asn Thr Leu Asn Gln Val Leu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Glu Glu His Glu Met Ile Ala Val Val Glu Val His Asp Ala 85 90 95 Thr Gly Ser Asn Ser Met Ala Asp Leu Asn Arg Ala Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Ile Glu Met Lys Asp Ala Leu Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Ile 115 120 125 Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Ser Trp Asp Gly Gln Gly Trp Ala 130 135 140 Asn Gly Tyr Lys Glu Val Ile Pro Arg Leu Arg Asn Ala Gly Phe Thr 145 150 155 160 His Thr Leu Met Val Asp Ala Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser 165 170 175 Ile His Asp Tyr Gly Gln Glu Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Ala Asn 180 185 190 Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Ser 195 200 205 Met Val Gln Ser Asn Ile Asp Gly Val Val Asp Gln Gly Leu Ala Leu 210 215 220 Val Ile Gly Glu Phe Gly His Met His Thr Asp Gly Asp Val Asp Glu 225 230 235 240 Ala Thr Ile Leu Ser Tyr Ser Gln Gln Arg Gly Val Gly Trp Leu Ala 245 250 255 Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly Thr Gln Trp Glu Tyr Leu Asp Leu Ser 260 265 270 Tyr Asp Trp Gln Gly Thr Asn Leu Thr Ser Trp Gly Asn Arg Ile Val 275 280 285 His Gly Pro Asn Gly Leu Lys Glu Thr Ser Ile Pro Ser Ser Ile Phe 290 295 300 His Thr Ala Pro Asn Asn Gly Asp Pro Pro Pro His Asn Gly Asn Glu 305 310 315 320 Thr Ile Leu Tyr Asp Phe Glu His Gly Thr Gln Gly Trp Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Leu Leu Gly Gly Pro Trp Thr Thr Asn Glu Trp Ser Thr 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primer <400> 40 gtcggttggc tagcttggtc 20 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 atgaatggta tggatcatgg gacgg 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ggcccgtgga caattctatt tcccc 25 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tccataccat tcattggcaa tg 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 attgtccacg ggcctaatgg 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gaaacatcca ttccaagctc g 21 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 aatggatgtt tcttttaatc cattaggccc g 31 <210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cggtatatct ctgtcttatt ggattgttac atgatc 36 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gacagagata taccgacagt g 21

Claims (21)

1. 위치 123, 158, 180, 272, 307 또는 316에 상응하는 위치에서 아미노산의 적어도 하나의 치환을 포함하는 만난아제 (mannanase)의 변이체로서, 상기 변이체는 만난아제 활성을 가지며, 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되고:
   1) 서열번호: 2의 잔기 27-331에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
   2) 높은 엄격도 조건 (high stringency conditions) 하에 하기와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 변이체:
   a) 서열번호: 1 (man7)의 뉴클레오티드 79 - 993 또는
   b) a)의 전장 보체; 및
   3) 서열번호: 1에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 게놈 DNA 서열에 의해 코딩되는 변이체;
   상기 아미노산 넘버링 (numbering)은 신호 서열을 함유하는 서열번호: 2 (Man7) 전장 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 상응하는 것인 만난아제의 변이체.
2. 청구항 1에 있어서, 위치 M123, A158, F180, G272, T307 또는 L316에서 적어도 하나의 추가 치환, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 변이체.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 하기 위치(들)에서 적어도 하나의 치환 세트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 변이체:
   M123 및 G272; 또는
   A158 및 T307; 또는
   L316; 또는
   T307; 또는
   M123, A158 및 T307; 또는
   M123 및 L316;
   A158, T307 및 L316;
   F180 및 L316; 또는
   M123, A158, G272; T307 및 L316.
4. 청구항 1 내지 3에 있어서, 상기 치환은 상기 변이체의 안정성을 향상시키는 것인 변이체.
5. 청구항 1 내지 4에 있어서, 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 치환을 포함하는 것인 변이체:
   N283의 글리코실화를 방지하는 치환;
   283 또는 285의 치환; 또는
   N283, T285 또는 S285의 치환; 또는
   T285 또는 S285의 T 또는 S 이외의 잔기로의 치환
   T285 또는 S285의 잔기 A로의 치환.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 추가 치환은 N-연결된 글리코실화가 가능한 숙주 세포에서 생산될 때 변이체의 변경된 글리코실화를 초래하는 것인 변이체.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 변이체 및 하기를 포함하는 효소 조성물:
   a. 예를 들어 유기산, 시트르산, 아스코르브산, 벤조산 및 그의 염 및 유도체, 소듐 벤조에이트, 벤조에이트, 히드록시벤조에이트 및 유도체, 소르브산 (sorbic acid), 소듐 소르베이트, 소르베이트, 염, 예컨대 소듐 클로리드 또는 포타슘 클로리드, 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온 (BIT) 또는 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 보존제;
   b. 선택적으로 폴리올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 글리세롤, 당, 당 알콜, 폴리사카라이드, 락트산, 붕산, 붕산 유도체, 방향족 보레이트 에스테르, 4-포르밀페닐 보론산, 페닐 보론산 유도체, 펩티드, 계면활성제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 안정화제;
   c. 선택적으로 매개체 (mediator)를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제 (xylanases), 만난아제, 쿠티나제 (cutinases), 에스테라제, 피타제 (phytases), DNAses, 펙티나제 (pectinases), 펙틴분해 효소 (pectinolytic enzymes), 펙테이트 리아제 (pectate lyases), 카르보히드라제 (carbohydrases), 아라비나제 (arabinases), 갈락타나제 (galactanases), 잔타나제 (xanthanases), 자일로글루카나제 (xyloglucanases), 락카제 (laccases), 퍼옥시다제 및 옥시다제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
   d. 선택적으로 말토덱스트린, 곡물가루 (flour), 소듐 클로리드, 술페이트, 소듐 술페이트 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.
8. 청구항 7에 있어서, 용액, 분산제, 페이스트, 분말, 과립, 입자체 (granulate), 코팅된 입자체, 정제, 케이크, 결정, 결정 슬러리, 겔 또는 펠렛 (pellet)과 같은 액체 조성물 또는 고체 조성물의 형태인 것인 효소 조성물.
9. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 만난아제의 변이체 또는 청구항 7 또는 8의 효소 조성물을 포함하는 세제 조성물.
10. 청구항 9에 있어서, 액체 세제 또는 고체 세제의 형태, 바람직하게는 바 (bar), 균질 정제 (homogenous tablet), 2개 이상의 층을 갖는 정제, 하나 이상의 구획 (compartments)을 갖는 파우치, 일반 또는 콤팩트 분말, 과립, 입자체, 페이스트, 겔, 또는 일반, 콤팩트 또는 농축 액체의 형태인 것은 세제 조성물.
11. 청구항 9 또는 10에 있어서, 프로테아제, 리파제, 쿠티나제, 아밀라제, 카르보히드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 펙테이트리아제, 펙틴분해 효소, 에스테라제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, DNAse 및/또는 퍼옥시다제로 구성된 그룹, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제 및 리파제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 효소를 추가적으로 포함하는 것인 세제 조성물.
12. 청구항 1 내지 6의 변이체를 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리펩티드를 생성하도록 하는 유전자 요소를 포함하는 재조합 숙주 세포.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 숙주 세포는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 숙주 세포:
    진균 세포 (fungal cells),
    사상 진균 세포 (filamentous fungal cells) 아스코마이코타 문 (Division Ascomycota), 페지조마이코티나 아문 (Subdivision Pezizomycotina); 바람직하게는 소르다리오마이세트 강 (Class Sordariomycetes), 하이포크레오마이세티다 아강 (Subclass Hypocreomycetidae), 하이포크레알레스 (Hypocreales) 및 마이크로아스 칼레스 (Microascales) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 목, 크리소스포리움 (Chrysosporium), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora) 및 휴미콜라 (Humicola)의 구성원으로 구성된 그룹;
    더욱 바람직하게는 히포크레아세 (Hypocreacea), 넥트리아세에 (Nectriaceae), 클라비시피타세에 (Clavicipitaceae), 마이크로아스카세에 (Microascaceae) 과, 및 트리코더마 (Trichoderma) (히포크레아 (Hypocrea)의 무성생식형 (anamorph)), 푸사리움 (Fusarium), 지베렐라 (Gibberella), 넥트리아 (Nectria), 스타키보트리스 (Stachybotrys), 클라비셉스 (Claviceps), 메타리지움 (Metarhizium), 빌로시클라바 (Villosiclava), 오피오코르다이셉스 (Ophiocordyceps), 세팔로스포리움 (Cephalosporium), 및 세도스포리움 (Scedosporium) 속으로 구성된 그룹;
    더욱 바람직하게는 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei) (히포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina)), T. 시트리노비리데 (T. citrinoviridae), T. 롱지브라키아툼 (T. longibrachiatum), T. 바이렌스 (T. virens), T. 하지아눔 (T. harzianum), T. 아스페렐룸 (T. asperellum), T. 아트로비리데 (T. atroviridae), T. 파라리세이 (T. parareesei), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), F. 그라미네아눔 (F. gramineanum), F. 슈도그라미네아룸 (F. pseudograminearum), F. 베네나툼 (F. venenatum), 지베렐라 후지쿠로이 (Gibberella fujikuroi), G. 모닐 리포르미스 (G. moniliformis), G. 제아에 (G. zeaea), 넥트리아 (Nectria) (헤마토넥트리아 (Haematonectria)) 헤마토코카 (haematococca), 스타키보트리스 차르타 룸 (Stachybotrys chartarum), S. 클로로할로나타 (S. chlorohalonata), 클라비셉 스 푸르푸레아 (Claviceps purpurea), 메타리지움 아크리둠 (Metarhizium acridum), M. 아니소플리에 (M. anisopliae), 빌로시클라바 바이렌스 (Villosiclava virens), 오피오코르다이셉스 시넨시스 (Ophiocordyceps sinensis), 아크레모니움 (Acremonium) (세팔로스포리움 (Cephalosporium)) 크리소게눔 (chrysogenum), 및 세도스포리움 아피오스퍼뭄 (Scedosporium apiospermum), 및 아스페르길루스 나이저 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 룩노웬세 (Chrysosporium lucknowense), 마이셀리오프토라 서모필라 (Myceliophthora thermophila), 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 및 휴미콜라 그리세아 (Humicola grisea)로 구성된 그룹,
    박테리아 세포, 바람직하게는 그람 양성 바실리 (gram positive Bacilli) 예컨대 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 메 가테리움 (B. megaterium), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 푸 밀루스 (B. pumilus), 그람 음성 박테리아 (gram negative bacteria) 예컨대 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli), 악티노마이세탈레스 (actinomycetales) 예컨대 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.) 및
    효모 (yeasts) 예컨대 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica),
    가장 바람직하게는 트리코더마 리세이 또는 바실루스.
14. 청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 만난아제 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것 이외에, 하기 중 적어도 하나를 포함하는 융합 단백질인 것인 재조합 숙주 세포:
    분비 신호 서열을 제공하는 아미노산 서열;
    정제를 용이하게 하는 아미노산 서열, 예컨대 친화도 태그 또는 His-태그;
    생산을 증진시키는 아미노산 서열, 예컨대 CBM과 같은 운반체인 아미노산 서열;
    효소 활성을 갖는 아미노산 서열; 및
    결합 친화도를 갖는 융합 단백질을 제공하는 아미노산 서열, 예컨대 탄수화물 결합 모이어티.
15. 하기 단계를 포함하는, 만난아제의 변이체를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법:
    a. 청구항 12 내지 14의 재조합 숙주 세포을 배양하는 단계로서,
    상기 유전자 요소는 상기 재조합 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드의 생산을 조절하는 적어도 하나의 조절 서열을 포함하며;
    상기 유전자 요소는 선택적으로 숙주 세포 밖으로 재조합 폴리펩티드를 운반하는 신호 서열을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하고;
    상기 재조합 폴리펩티드를 생성하도록 하는 조건하에 배양을 수행하는 것인 단계; 및
    b. 상기 재조합 폴리펩티드를 회수하는 단계.
16. 만난 (mannan) 함유 물질을 유효한 양의 청구항 7 또는 8의 효소 조성물 또는 청구항 1 내지 6의 변이체로 처리하는 단계를 포함하는, 만난 함유 물질을 분해 또는 변형시키는 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 만난 함유 물질은 식물 기반 물질, 섬유, 폐수, 하수, 오일 또는 이들의 조합인 것인 방법.
18. 청구항 7 또는 8의 효소 조성물 또는 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 만난아제의 변이체, 및 식물 기원의 적어도 하나의 단백질 공급원 또는 만난 함유 산물 또는 부산물, 및 하기를 포함하는 동물 사료:
    a. 선택적으로 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제, 베타-글루카나제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
    b. 선택적으로 말토덱스트린, 곡물가루, 염, 소듐 클로리드, 술페이트, 소듐 술페이트 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.
19. 청구항 7 또는 8의 효소 조성물 또는 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 만난아제의 변이체; 및 하기를 포함하는 사료 보충제:
    a. 선택적으로 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제, 베타-글루카나제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
    b. 선택적으로 말토덱스트린, 곡물가루, 염, 소듐 클로리드, 술페이트, 소듐 술페이트 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.
20. 오일 시추 (oil drilling) 또는 수압-파쇄 (hydro-fracturing)에 있어서, 청구항 1 내지 6의 변이체 또는 청구항 7 또는 8의 효소 조성물의 용도.
21. 커피 추출물, 과일 주스, 파인애플 주스 또는 두유 가공에 있어서, 청구항 1 내지 6의 변이체 또는 청구항 7 또는 8의 효소 조성물의 용도.

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