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KR20190117550A - T 세포 전구체(progenitor)의 생성 방법 - Google Patents

T 세포 전구체(progenitor)의 생성 방법 Download PDF

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KR20190117550A
KR20190117550A KR1020197024529A KR20197024529A KR20190117550A KR 20190117550 A KR20190117550 A KR 20190117550A KR 1020197024529 A KR1020197024529 A KR 1020197024529A KR 20197024529 A KR20197024529 A KR 20197024529A KR 20190117550 A KR20190117550 A KR 20190117550A
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Abstract

본 발명은 TNF-알파 및/또는 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 스템레게닌 1 (SR1)을 포함하는 배지 내 및 노치 (Notch) 리간드 및 선택적으로는 피브로넥틴 단편의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계를 포함하는, T 세포 전구체를 생성하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.

Description

T 세포 전구체(progenitor)의 생성 방법
본 발명은 세포 치료, 특히 형질전환되거나 되지 않은 조혈모세포 이식, 특히 더, 이러한 이식 이후의 면역 재구성의 세포 치료 분야에 관한 것이다.
전구체 및 조혈모/전구 세포 (HSPC)의 이식은 가장 중증의 선천성 면역 결핍 (hereditary immune deficiency), 많은 악성 혈액질환 (hemopathy), 및 다수의 고형 종양 (solid tumor)에 대한 가장 좋은 치료 방법으로 생각된다.
현재, 부분적 HLA 부적합성을 나타내는 동종 이식 환경에서, 미리 조절된 수혜자에 대한, 증가된 용량의 분류된 CD34+ HSPC의 주입은 이식편대숙주질환 (graft-versus-host disease, GVH)을 효과적으로 예방하며 공여체 이식을 가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 주입된 CD34+ 세포로부터의 새로운 T 림프구의 분화에는 최소 4개월의 기간이 필요하며, 이러한 T 림프구는 나타난지 단지 몇 개월 후에 감염에 대한 예방 역할을 하기에 충분한 수를 갖는다.
이러한 면역 재구성의 둔화는 수많은 감염 질환, 특히 바이러스성 감염 질환으로 이어지나 역시 재발로 이어지고, 이는 이식된 환자의 장기 예후에 영향을 미친다.
나아가, 다른 치료 프로토콜은 유전자 치료 접근법, 즉, 형질도입된 HSPC의 자가 이식법을 사용하는데, 이는 특정 선천성 면역 결핍의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. HSPC CD34+ 동종 이식 대비 상기 전략의 이점은 HLA-적합 공여체가 없을 때 생존 및 이환율의 측면에서 논란의 여지가 없다. 그럼에도 불구하고, 임상 경험에 따르면 일부 중증 환자의 경우, T 림프구 구획의 재구성이 느리고 순환하는 T 림프구가 정상 수준에 도달하지 않는 것으로 나타난다. 상기 특정 상황에 관련된 이환율 및 사망률은 중요하다.
이러한 유형의 이식과 관련된 높은 이환율 및 사망률로 인해, 이식 후 면역결핍 기간을 감소시키기 위한 새로운 치료법을 개발하는 것에는 충분한 이유가 있다.
특히, 이미 T 림프구 분화 경로 (T 세포 전구체)에 관여한 전구체의 투여에 의해 T 림프구의 생성을 가속화하는 것이 중요하다.
이러한 T 세포 전구체는 CD34+ HSPC 분화로부터 수득되며 특히 CD7+ 마커를 갖는데, 이는 T-세포 경로 내 분화 마커이다. 이들은 또한 다른 마커를 가질 수 있다. Awong et al (Blood 2009; 114: 972-982)은 하기 T 림프구의 전구체에 대해 기술하였다: 마커 (CD34+ / CD45RA+ / CD7+)를 갖는 초기 흉선 전구체 (ETP), proT1 단계의 전구 세포 (CD7++ / CD5-), proT2 단계의 전구 세포(CD7++ / CD5+), 및 preT 단계의 세포 (CD7++ / CD5+ CD1a+). HSPC는 T 세포 발생 (development) 경로를 통해 하나의 단계에서 다른 단계로 넘어갈 때 이러한 마커를 연속적으로 획득한다. 나아가 인간에서 CD1a 항원은 매우 미성숙한 흉선 전구체로부터 T-경로에 명백하게 관여하는 전구체까지의 경로를 구별하는 것으로 알려져 있다 (Cavazzana-Calvo et al, MEDECINE/SCIENCES 2006; 22: 151-9).
HSPC 이식에 수반하여, T-세포 전구체 이식은 면역 체계의 완전한 재구성 전에 환자가 일부 면역력의 혜택을 받을 수 있도록 함으로써, 성숙하고 기능적인 T 림프구 구획의 신속한 생산을 가능하게 하며, 따라서 중증 감염의 위험을 방지하도록 한다.
나아가, 제대혈 세포에 비해 성체 세포를 얻는 것이 더 쉽고 저렴하기 때문에, 그리고 성체 세포가 동종 이식에서 보다 일반적으로 사용되기 때문에, 제대혈 세포 대신 성체 세포를 사용할 수 있는 것은 중요하다.
그러나, 인간 및 마우스에서 얻은, 문헌에 발표된 데이터는 태아 조혈 세포 (제대혈 포함) 및 성체 세포 간의 본질적인 차이를 보여준다. 이러한 차이는 생존, DNA 손상을 복구하는 능력, 증식 능력 및 분화 가능성과 관련이 있으며 (예를 들어, 하기 참조: Yuan et al., (2012 Mar 9; 335 (6073): 1195-200), 이는 성체 골수 세포가 태아 세포에 비해 다양한 세포 유형을 생성할 가능성에 있어 덜 효과적임을 나타낸다: Lansdorp et al (J Exp Med 1993 Sep 1; 178 (3): 787-91); Szilvassy et al (Blood, 2001 Oct. 1, 98 (7): 2108-15), Frassoni et al (Blood, 2003 Aug. 1, 102 (3): 1138-41), Liang et al. 106 (4): 1479-87), Six et al (J Exp Med 2007 Dec 24, 204 (13): 3085-93).
WO 2016/055396은 CD34+ 세포를 고정된 노치(Notch)의 리간드 (특히 IgG 단백질의 Fc 영역에 융합된, 델타 (Delta)-유사-리간드의 가용성 도메인)의 존재 하, 그리고 헤파린-결합 도메인 (특히 레트로넥틴 (Retronectin®)의 존재 하)뿐만 아니라 RGDS (서열번호 3, Arginine - Glycine - Aspartate - Serine) 및 CS-1 도메인을 포함하는 피브로넥틴 단편의 존재 하에서 배양함으로써 T-세포 전구체를 생성하는 것이 가능함을 기술한다. 사용된 Notch 리간드는 DL4/Fc로 나타낼 수 있다.
상기 문헌이 고정된 Notch의 리간드, 및 피브로넥틴이 둘다 존재하는 것이 T 림프구 전구체 (CD7+ 세포)의 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 기술한다는 점에 주목하여야 하는데, 이는 이미 종래 기술에서 개선된 것이나 WO 2016/055396의 도 3에 나타난 것과 같이 CD7+CD34- 세포의 비율은 상당히 낮게 유지된다. 그러나 이를 필요로 하는 환자에게 보다 높은 양의 전구체를 투여할 수 있도록 하기 위해, 상기 비율을 높이는 것이 흥미롭고 특히 중요하다. 한편, 적절한 면역성을 제공할 수 있도록 세포가 초기 분화 단계에 머무르는 것 또한 중요하다.
Notch 단백질은 다수의 주위 환경 신호에 반응하는 세포 반응을 조절하는 막투과성 수용체이다. 포유류에서, 4개의 Notch (Notch 1-4) 수용체 및 5개의 리간드 (Delta-유사-1, 3, 및 4, Jagged1, Jagged2)가 문헌에 개시되었다 (Weinmaster Curr Opin Genet Dev 2000: 10: 363-369).
델타 (Delta)-유사-리간드 4 (Delta-like ligand 4)는 하기와 같이 표시될 수 있다:
(ii) Delta-유사-리간드 4 (DLL4 유전자의 이름에 해당함)
(iii) Delta-유사-4 또는 Delta 리간드 4 (약칭 DL-4).
본 출원에서, Notch Delta-유사-1 및 Delta-유사-4 리간드는 각각 DL1 및 DL4 또는 DL-1 및 DL-4로 표시될 수 있다. 리간드 DL-1 및 DL-4의 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 명시된다.
Ohishi et al (BLOOD,vol. 98, no. 5, 2001, pp 1402-1407)은 대식세포 및 수지상 세포로의 단핵세포 (monocyte) 분화에 대한 Notch 신호전달의 효과에 관한 것이다. 상기 문헌에 기술된 실험에서 사용된 단핵세포는 음성 선택에 의해 정제된 말초 혈액 단핵세포, 또는 CD34+ 줄기 세포의 시험관내 분화 이후 수득한 단핵세포이다. 상기 문헌에서 사용된 세포는 따라서 단핵세포/대식세포/수지상 세포 분화 경로에 진입하며, CD34 마커 (이는 조혈모세포 마커임)를 잃고 CD14 마커를 제시한다. 이들 세포는 Delta-1 및 GM-CSF, TNF-알파 (이는 CD34+ 세포-유래된 CD1a-CD14+ 세포를 수지상 세포로 분화 유도하기 위하여 사용됨)의 세포외 영역의 존재 하에서 배양된다. 상기 문헌은 Notch 리간드의 존재 하에서 그리고 TNF-알파의 존재 하에서 CD34+ 세포를 사용하지 않으며 T-세포 전구체 (CD7+ T 림프구 전구체)의 생성과 관련이 없다.
SHUKLA et al (NATURE METHODS, vol. 14, no. 5, 2017, 531-538) 및 WO 2017/173551은 줄기세포 및/또는 전구체 세포를 Notch 리간드 Delta-유사-4 (DL4) 및 혈관 부착 분자 1 (vascular adhesion molecule 1) (VCAM-1)에 노출시키는 단계를 포함하는, 전구체 T 세포를 줄기세포 및/또는 전구체 세포로부터 생성하는 방법을 개시한다.
본 출원에서 기술된 방법은 세포 기질을 사용하지 않고 (이는 임상 상황에서 쉽게 구상될 수 없음), CD34+ 줄기세포로부터 CD7+ T 림프구 전구체(precursor)의 생성 및 그 수를 증가(증식)시키도록 한다. 또한, 상기 방법은 성체 공여체(adult donor)로부터 나온 CD34+ 세포를 이용하여 수행할 때 특히 적합하다.
또한, 본 명세서에서 개시된 것과 같은 공정을 통해 수득한 세포는 Bcl11b 마커를 보유하는데, 이는 T-세포 실행 이후 독특하게 켜지는 중요한 전사 인자이다 (Kueh et al, 2016, Nat Immunol. 2016 Aug;17(8):956-65. doi: 10.1038/ni.3514).
본 발명자들은 또한 본 명세서에서 개시된 공정을 통해 수득된 전구체에서 T 세포 수용체의 유전자좌 (TCRbeta, TCRgamma 또는 TCRdelta)의 재배열이 없음을 보였다.
나아가, 본 명세서에서 수득된 전구체의 경우, WO 2016/055396에 개시된 공정과 대비할 때 세포사멸 마커의 감소가 나타났다.
요약하면, 본 명세서에서 기술되는 공정은 줄기세포를 이식받는 성체에 효율적으로 사용하기에 충분히 많은 수의 T 세포 전구체를 얻을 수 있도록 한다.
본 방법은 관심있는 유전자를 포함하는 벡터가 본 명세서에 개시된 공정 동안 어느 시점에서 사용될 때, 유전자 치료를 위하여 형질전환된 (형질도입된) T 세포 전구체를 수득하기 위해 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 공정에 의해 수득된 세포는 성체 CD34+ 세포에 대해 수득될 수 있으며, 제대혈 세포가 그러한 이식편에 사용되는 경우에도, 동종 이식편 또는 자가 이식편에 사용될 수 있다.
상기 방법은 성체 CD34+ 세포에 매우 효율적이나, 제대혈 CD34+ 세포에도 사용될 수 있음을 주목하여야 한다.
구체적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 Notch 리간드, Delta-4, 레트로넥틴 (Retronectin®) 및 사이토카인의 조합으로부터 유래된 고정된 융합 단백질을 조합하여, 시험관내 (in vitro) 배양 시스템에서 HSPC로부터 생산된 T-세포 전구체의 주입 이후 생체내 (in vivo) T-세포 생성을 촉진한다.
본 시스템은 7일 내에, 인간 흉선 T-세포 전구체와 표현형 및 분자적으로 유사한 T-세포 전구체가 생성되도록 한다. 또한, 이들 T-세포 전구체는 HSPC에 비해 더 빠른 동역학을 나타내며 NSG 마우스에서 인간 성숙하고 다양한 T-세포를 발생시킬 수 있다.
본 명세서에서 보고된 결과는 제대혈 (CB) 및 성체 (성체 공여체로부터의 가동화 말초 혈액, mPB) HSPC 둘다로부터 얻었다.
본 발명자들은 상기 CD34+ 세포를 Notch 리간드에 노출시킴으로써, 그리고 가용성 TNF-알파의 존재 하에서 T 세포 전구체의 양이 CD34+ 세포로부터 개선될 수 있음을 보였다 (Tumor Necrosis Factor Alpha, Uniprot P01375, RefSeq NP_000585, 서열번호 8). 상기 노출은 전구체 T 세포의 생성에 적합한 조건 하에서 이루어진다. 선택적으로 세포는 또한, RDGS 모티브, 및/또는 CS-1 모티브 및 선택적으로는 헤파린 결합 도메인을 포함하는 피브로넥틴 단편에 노출된다. 바람직하게, 상기 피브로넥틴 단편은 RDGS 모티브, CS-1 모티브 및 헤파린 결합 도메인을 포함한다.
TNF는 안정된 동종삼량체로 배열된, 233-아미노산-길이 타입 II 막투과 단백질으로 주로 생산된다. 분비된 형태의 인간 TNF-알파는 삼각형 피라미드 형상을 나타내며 무게는 약 17-kDa이다.
WO 2016/055396에 개시된 것과 같이, 피브로넥틴 단편 대신에 RGDS 펩티드 및/또는 CS-1 펩티드를 이용하여 본 명세서에 개시된 방법을 수행하는 것이 가능하다. RGDS 및 CS-1 펩티드를 조합하여, 특히 동일한 단백질 내에 융합시켜 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, RGDS 및/또는 CS-1 펩티드는 배양 배지 내에 또는 배양 배지 내 폴리펩티드 또는 단백질 내와 같은 곳에 존재할 수 있다. 배양 배지가 이와 같이 RGDS 및/또는 CS-1 펩티드만을 포함하는 경우, 상기 펩티드가 배양 용기의 내부 표면 상에 고정되어 있지 않다면, 이들을 배양 배지에서 “유리” 펩티드(들)과 관련시킬 수 있다. 실제로, 상기 펩티드(들)은 용액 상에 있거나 CD34+ 세포가 고정된 Notch 리간드에 노출된 용기 내부 표면에 고정될 수 있다.
그러나, 상기 설명한 것과 같이, 헤파린-결합 도메인뿐만 아니라 RGDS 및 CS-1 패턴을 포함하는 피브로넥틴의 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 피브로넥틴 단편은 용액 상에 유리되거나 배양 용기의 내부 표면 상에 고정될 수 있다.
상기 공정은 세포 배양 접시 (페트리 접시, 24 웰 어레이 등)와 같은, 바람직하게는 내부 표면 상에 Notch 리간드가 고정된 용기 내에서 시험관내 (in vitro) 수행된다. 그러나 Notch 리간드는 배양 배지 내에 존재하는, 비드 (특히 마이크로비드) 표면과 같은 임의의 지지체에 고정될 수 있다. Notch 리간드의 고정은 본질적으로 리간드를 안정화하여 CD34+ 세포의 Notch 수용체의 활성화를 허용하기 위해 의도된다.
"T 세포 전구체"에 의해, CD34+ HSPC로부터 T 림프구 경로로의 분화 경로에 관여하는 임의의 세포를 지정하고자 한다. 따라서 상기 세포는 CD7 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는데, 상기 마커는 T 세포의 림프 구성 중 가장 초기 마커 중 하나로 알려져 있다. T 림프 경로에서 분화 상태에 따라, 이는 CD34 마커를 발현하거나 하지 않을 수 있다 (분화 동안의 CD34의 손실). 이러한 T 세포 전구체는 또한 CD5 마커를 발현하거나 하지 않을 수 있다.
"T-세포 전구체" 중에는 출생 후 흉선에서 발견될 수 있는 세포, 즉, 초기 흉선 전구체 (ETP) (CD34+/CD45RA+/CD7+), proT1 세포 (CD34+CD45RA+CD7++CD5-CD1a-), proT2 세포 (CD34+CD45RA+CD7++CD5+CD1a-) 및 preT 세포 (CD34-CD7++/CD5+CD1a+)가 있다. T-세포 수용체 (TCR) 유전자좌는 고도로 정렬된 방식으로 재배열된다 (TCRδ-TCRγ-TCRβ-TCRα). 참고로, 제1 기능성 TCR 재배열은 CD34-CD7++/CD5+CD1a+ preT 세포 단계에서 일어난다 (Dik et al. J Exp Med 2005;201:1715-1723). T-세포 전구체는 당업계에 잘 알려져 있다. 이들은 특히 Reimann et al (STEM CELLS 2012;30:1771-1780.) 및 Awong et al (2009, op.cit.)에 의해 인용된다.
상기 용어 “RGDS 펩티드”는 인테그린 VLA-5에 결합할 수 있도록 RGDS 패턴을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 펩티드 또는 단백질은 당업계에 알려지고 보고된 방법에 의해 VLA-5 인테그린에 결합할 수 있는 능력에 대해 시험될 수 있다. RGDS 펩티드는 인테그린 VLA-5 (Very Late Antigen-5)에 결합하는데, 이는 CD49e (alpha5) 및 CD29 (beta1)로 구성된 이량체이다.
헤파린-결합 도메인은 당업계에 공지되어 있으며 헤파린에 결합하는 수많은 단백질에 존재한다. 이들 서열은 일반적으로 XBBXBX 또는 XBBBXXBX (B = 염기성 아미노산; X = 친수성 아미노산; Cardin and Weintraub, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1989;9:21-32, 서열번호 4 및 서열번호 5)이다.
이러한 헤파린-결합 도메인의 존재는 CD34+ 세포가 이들을 유도하고 전이유전자를 발현하는 T 세포 전구체를 수득하기 위하여 바이러스 (특히 레트로바이러스) 벡터에 노출될 때에 특히 적합하다.
CS-1 펩티드 또는 CS-1 패턴은 Wayner et al, 1989 (J. Cell Biol. 109: 1321)에 기술된 25개의 아미노산 펩티드 (DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST, 서열번호 6)이다. 상기 CS-1 패턴은 VLA-4 (Very Late Antigen-4) 수용체에 결합한다. 상기 항원은 CD49d (alpha 4) 및 CD29 (beta 1)로 구성된 인테그린 이량체이다.
구체적인 실시양태에서, 피브로넥틴 단편은 배양 배지에 존재하거나 용기 내벽 (특히 바닥) 상에 고정된다. 피브로넥틴은 단백질로, 천연 형태가 100 nm 길이 및 460 kDa인 v-형상의 거대 이량체이다. 상기 2개의 단량체는 각 C-말단의 2개의 이황화결합에 의해 연결된다. 상기 용어 "피브로넥틴" 또는 “피브로넥틴 단편”은 천연 피브로넥틴 단백질 (즉, 선택적 스플라이싱에 의해 생산되는 임의의 동형), 또한 상기 단백질의 단량체, 또는 상기 단백질의 단편 (다만 펩티드 RGDS, 뿐만 아니라 CS-1 펩티드 및 헤파린 결합 부위를 포함함)을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 기술된 공정을 수행하기에 특히 적합한 피브로넥틴은 레트로넥틴 (Retronectin®)이다. 상기 단백질은 인간 피브로넥틴의 단편 (CH-296 단편, Kimizuka et al., J Biochem., 1991 Aug. 110 (2):284-91, Chono et al., J Biochem 2001 Sep 130 (3):331-4) 에 대응되며 상기 방법의 구현에 적합한 3개의 기능적 도메인 (RGDS 펩티드, 헤파린-결합 도메인 및 CS-1 서열을 포함하는 세포-결합 C 도메인)을 포함한다. 상기 단백질은 특히 Takara Bio Inc. (Shiga, Japan) 회사에 의해 판매된다.
구체적인 실시양태에서, 피브로넥틴 단편은 고정된다 (즉, 고체 지지체에 결합되며 용액 상에 유리되어 존재하지 않음 (그러나 용액 내에 특정 성분이 발견될 수 있음)). 상기 고체 지지체는 바람직하게는 공정이 수행되는 용기의 바닥 벽이다. 그러나, 피브로넥틴 단편을 중합체 또는 자성 비드 (일반적으로 1 내지 5 μm의 직경을 가짐)와 같은 비드에 결합시키는 것도 구상할 수 있다. 이들 비드에 대한 단백질 또는 펩티드의 결합은 공유이거나 공유가 아닐 수 있다. 단백질 또는 펩티드를 비드에 부착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 피브로넥틴 단편을 한천 또는 겔과 같은 반고체 배지에 도입하는 것 또한 가능하다.
피브로넥틴 단편이 지지체 (특히 공정이 수행되는 용기의 바닥 벽) 상에 고정될 때, 상기 고정화는 또한 공유이거나 공유가 아닐 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 고정화는 용기의 바닥 벽을 구성하는 유리 또는 플라스틱 상에 피브로넥틴 단편이 흡수되도록 함으로써 비-공유적으로 수행된다.
구체적인 실시양태에서, 상기 나타난 것과 같이, CD34+ 세포의 T-세포 전구체로의 분화는, 이들 세포에 관심있는 유전자 (또는 유전자 편집을 위한 시스템)를 도입하기 위하여, 벡터 (바이러스 벡터, 또는 플라스미드 또는 플라스미드 RNA 또는 DNA 서열과 같은 핵산 단편)에 의한 CD34+ 세포의 형질도입 (transduction) 또는 형질감염 (transfection) (Lonza에 의해 개발된 특정 전기 천공법 시스템인 뉴클레오펙틴 (nucleofectionTM)을 포함함)과 함께 이루어진다. 이는 TNF-알파와 함께 Notch 리간드 및 피브로넥틴 단편에 노출된 세포가, TNF-알파와 함께 Notch 리간드 및 피브로넥틴 단편에 노출된 적어도 일부 시간 동안 바이러스 상등액에 또한 노출됨을 의미한다.
세포 형질도입을 수행하기 위한 작동 조건과 관련된 WO 2016/055396의 교시는 본 발명의 방법에 명시적으로 적용될 수 있으며, 따라서 본 출원에 명시적으로 열거된 것으로 간주된다.
특히 하기를 언급할 수 있다:
(iv) 일정 시간 (바람직하게는 4시간 초과, 더욱 바람직하게는 6시간 초과, 또는 8시간 또는 10시간 초과, 다만 36시간 미만, 더욱 바람직하게는 30시간 미만 또는 24시간 미만) 동안, 당업계에 공지되고 WO 2016/055396에 개시된 적절한 사이토카인과 함께 Notch 리간드, 피브로넥틴 단편 및 TNF-알파에 대한 세포의 노출, 및 적절한 시간 (바람직하게는 4시간 초과, 더욱 바람직하게는 6시간, 8시간 또는 10시간 초과, 바람직하게는 30시간 미만, 더욱 바람직하게는 24시간 미만, 더욱 바람직하게는 약 16시간) 동안 바이러스 상등액의 첨가.
(v) WO 2016/055396에 교시된 것과 같이 필요한 경우 제2 형질도입
(vi) 전이유전자가 환자에서 없거나 부족한 단백질을 첨가하여 치료적 이점을 가져오기 위한, 유전자 치료 프로토콜에서 자가조직의 조혈모세포 이식을 위한 상기 프로토콜의 사용.
(vii) 사용 가능한 전이유전자: 유전자 교정 면역결핍 (특히 SCID (severe combined immunodeficiencies)이거나 아님, CID), HIV, X-연관 부신백색질형성장애 (adrenoleukodystrophy), 이상혈색소증 (hemoglobinopathy), 특히 β-지중해빈혈 (thalassemy) 또는 겸상 세포 질환 (sickle cell disease). 또한 전이유전자로서, 키메릭 항원 수용체 (CAR), 즉, 조작된 CAR-T 세포를 통해 암세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 암세포에 의해 특이적으로 발현되는 세포 표면 단백질을 인식하는 세포 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 사용할 수 있다
(viii) 특히 당업계에 알려지고 기술된 렌티바이러스를 사용하여, 전이유전자가 세포 게놈 내에 삽입되도록 하는 바이러스 상등액의 바람직한 사용.
(ix) 4 내지 36시간, 바람직하게는 6 내지 24시간의 CD34+ 세포의 사전-활성화 이후 세포 배양 배지 내 바이러스 벡터의 도입
(x) 세포의 바이러스 벡터에 대한 4 내지 30시간, 바람직하게는 12 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 약 16시간의 노출, 및 바이러스 벡터의 제거 (세포를 회수 및 세척하고, Notch 리간드, 피브로넥틴 단편 및 TNF-알파의 존재 하에 세포를 재현탁함).
상기 설명한 것과 같이, 다른 실시양태에서, CD34+ 세포는 유전자 편집의 수행을 가능하도록 하는 시스템에 노출된다. 이러한 시스템은 현재 당업계에 널리 공지되고 기술되어 있으며, 본질적으로 핵산 이중-손상 복구에 기초한다. 이러한 게놈 편집 시스템은 메가뉴클레아제, 징크 핑거 (zinc finger) 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터-기반 뉴클레아제 (TALEN), 및 CRISPR-Cas 뉴클레아제로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 상기 언급된 성분에 노출되어 TNF-알파의 존재 하에 있는 동안 CD34+ 세포가 증식한다는 사실은 세포 증식을 요구하는 이러한 유전자 편집 시스템을 사용할 수 있도록 한다.
구체적인 실시양태에서, Notch 리간드는 Delta-유사-1 단백질 (서열번호 1) 또는 그의 단편 (가용성 도메인)이다.
다른 바람직한 실시양태에서, Notch 리간드는 Delta-유사-4 단백질 (서열번호 2)이다.
구체적인 실시양태에서, 상기 Notch 리간드는 IgG 단백질의 Fc 영역에 융합된 천연 Notch 리간드의 가용성 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 당업계에 알려진 것과 같이, Notch 리간드의 가용성 도메인은 상기 리간드의 세포외 부분을 나타낸다. Varnum-Finney et al (J Cell Sci., 2000 Dec; 113 Pt 23:4313-8)은 DL-1의 가용성 부분과 IGg1의 Fc 부분의 융합 단백질을 기술한다. Reimann et al (op cit)은 DL-4 (아미노산 1-526)의 가용성 부분과 IgG2b 면역글로불린의 Fc 단편의 융합 단백질을 기술한다. 따라서 IgG 단백질이 IgG2인 경우가 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용된 Notch 리간드의 서열은 서열번호 7이다. 인간 lgG 1의 Fc 영역의 C-말단에 융합되는 인간 DLL4 (전장 DLL4 수탁 번호 (accession number) NP_061947.1)의 세포외 도메인 (Met 1-Pro 524)을 포함하는 상업적으로 이용가능한 제품 (Sino Biologicals)은 DL4 단백질이 본 명세서에서 사용하기에 적합하다.
본 명세서에서 기술된 방법의 맥락에서 사용된 배양 배지는 CD34+ 세포 및 T 세포의 배양에 적합한 임의의 배지이다. 특히 α-MEM, DMEM, RPMI 1640, IMDM, BME, McCoy's 5A, StemSpanTM, 특히 SFII (StemCell Technologies) 배지 또는 피셔 배지 (Fischer's medium)를 언급할 수 있다. StemSpanTM SFII 배지는, 특히, Iscove's MDM, 소 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린 (철-포화된), 2-메르캅토에탄올을 포함한다.
본 명세서에 개시된 공정을 수행하기에 적합하고 바람직한 배양 배지는 X-VIVOTM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)이다. 상기 배지는 특히 Jonuleit et al (Eur J Immunol, 1997, 27, 12, 3135-42) 및 Luft et al (J Immunol, 1998, 161, 4, 1947-53)에 의해 사용되었다.
바람직하게, 기본 배지 (즉, 보충제를 첨가할 필요 없이 세포가 성장하도록 하는 배지)가 사용되나, 바람직하게는 혈청, 및/또는 성장 인자 및 사이토카인을 첨가한다.
따라서, 소태아혈청 (FBS) 또는 소태아혈청 (FCS), 자가 인간 혈청 또는 인간 AB 혈청은 바람직하게는 기본 배양 배지에 첨가된다. 바람직하게, 상기 배지는 적어도 15%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%의 태아 혈청으로 보충된다. FBS는 본 공정을 구현하기에 특히 적합하다. 특히, 정제된 FBS를 사용하는 것이 바람직하다. 정제된 FBS는 바이러스 입자의 존재를 피하기 위해 분석되고 여과된 고품질 혈청이다. 이는 많은 공급 업체에서 판매된다 (예: Thermo Scientific™의 HyClone™Defined Fetal Bovine Serum(FBS)).
TNF-알파에 더하여, 배양 배지는 또한 바람직하게는 사이토카인 및 성장 인자로 보충된다. 상기 사이토카인 및 성장 인자는 특히 SCF (줄기세포 인자(Stem Cell Factor)), 트롬보포이에틴 (TPO, 또한 MGDF (거핵구 성장 발달 인자(megakaryocyte growth and development factor))라고도 함), Flt3-리간드 (이는 조혈성 성장 인자임), 인터루킨 3 (IL-3), 인터루킨 7 (IL-7) 및 SCF (stem cell factor)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 구체적인 실시양태에서, 배양 배지는 TNF-알파에 더하여 상기 사이토카인 또는 성장 인자를 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 특히 바이러스 벡터로 형질도입되지 않은 T 세포 전구체의 생성을 위하여, 적어도 또는 정확히 3개의 사이토카인이 첨가된다. 바람직하게, 상기 3개의 사이토카인은 인터루킨-7 (IL-7), SCF (줄기세포 인자) 및 Flt-3 리간드 (조혈 성장 인자)이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 4개의 사이토카인, 즉, 상기 언급된 3개의 사이토카인과 TPO (트롬보포이에틴)가 첨가된다.
다른 구체적인 실시양태에서, 특히 바이러스 벡터로 형질도입된 T 세포 전구체의 생성을 위하여, 천연 사이토카인 및 성장 인자는 본 방법의 구현에서 다양할 수 있다.
따라서, 바이러스 벡터를 첨가하기 전에 세포를 사전-활성화하는 단계에서 IL-3, IL-7, SCF, TPO, 및 Flt3-L은 배지 내에서 사용될 수 있으며, 이후 벡터가 제거된 후에 배지를 IL-7, SCF, TPO, 및 Flt3-L로만 보충할 수 있다..
상기 언급된 사이토카인 및 성장 인자 혼합물은 CD34+ 세포를 T-세포 전구체로 분화 유도하기에 충분하며, 일반적으로 배양 배지는 실시예에서 기술된 것과 같이, T 세포 전구체의 수를 증가시킬 수 있는 TNF-알파를 제외한 다른 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 예상되는 공정 상에서, Notch 리간드, RGDS 모티브를 발현하는 단백질 또는 펩티드 및 TNF-알파의 존재 하 CD34+ 세포의 총 노출 기간은 바람직하게는 3일 초과 10일 미만의 시간 동안 일반적으로 수행된다.
상기 노출은 세포의 형질도입 여부에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 3일 간의 노출은 형질도입되지 않은 성체 줄기세포에는 충분할 수 있으나, 영아 줄기세포 (약 7일) 또는 형질도입이 수행된 경우에는 일반적으로 더 길어질 것이다.
CD34+ 세포는 제대혈 또는 성체 공여체의 말초 혈액으로부터 골수 천자법으로 수득되는데, 특히 G-CSF 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 가동화제를 이용하여 가동화된다. CD34+ 세포를 분류하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 특히, CD34를 인식하는 항체를 그 표면에 갖는 자성 비드를 본 목적을 위해 사용할 수 있다.
바람직하게, 세포 배양 용기는 CD34+ 세포에 노출시키기 전에 Notch 리간드 및 피브로넥틴 단편을 내부 (바람직하게는 하부) 표면에 고정하여 제조한다. Retronectin®또는 다른 피브로넥틴은 자연적으로 세포 배양 박스의 플라스틱 (페트리 접시 또는 24-웰 박스, 또는 기타)에 부착한다. 유사하게, 리간드가 면역글로불린의 Fc 단편과의 융합 단백질로 사용되는 경우, 상기 Fc 단편은 또한 플라스틱에 부착한다. 따라서, 적절한 코팅을 얻기 위해서는 용기를 이들 화합물의 존재 하에 몇 시간 동안 두는 것으로 충분하다. 이러한 배양 용기를 Notch 리간드 및 피브로넥틴 단편으로 코팅하는 방법은 WO 2016/055396에 상세하게 개시되어 있으며 본 명세서에 개시된 것과 같은 방법을 구현하기 위해 적용될 수 있다.
WO 2016/055396에 따르면, 5 μg/ml이 사용되는 경우 약 75%의 DL-4가 용기 표면에 부착될 것이며, 최적의 용량은 1.25 μg/ml 이상, 바람직하게는 2.5 내지 5 μg/ml이다.
피브로넥틴 단편과 관련하여, 다른 농도 (보다 높거나 낮은)를 사용할 수 있음에도 불구하고 25 μg/ml의 농도는 특히 조정된다 (특히 Retronectin®이 사용되는 경우).
본 명세서에서 기술된 공정의 구현에서, CD34+ 세포는 배양 용기 내 106 내지 107 세포/ml, 특히 약 2x106 CD34+ 세포/ml의 농도로 첨가된다.
세포가 형질도입되는지 CD34+ 세포인지에 따라, 2 내지 10 cm2 (즉, 24 내지 6 웰의 플레이트)의 플레이트를 사용할 수 있다. 24 웰 플레이트를 이용하는 경우, 각 웰에 104 내지 106 CD34+ 세포, 바람직하게는 웰 당 2x104 내지 4x105 CD34+ 세포를 첨가한다. 6 웰 플레이트가 사용되는 경우 웰 당 8x104 내지 2x106 세포를 첨가한다.
첨가되는 세포의 양은 사용된 용기에 따라 당업자에 의해 조정된다.
세포는 상기 설명한 것과 같이, TNF-알파로 보충되고 우선적으로 성장 인자 및 사이토카인으로 보충된 웰에, 선택된 기본 배지에 위치한다.
사이토카인 또는 성장 인자의 농도는 2 내지 300 ng/ml이다. 바람직하게, 상기 농도는 40 ng/l 초과 300 ng/ml 또는 200 ng/l 미만, 더욱 바람직하게는 약 100 ng/ml이다.
그러나, 형질도입된 T 세포 전구체를 생성하고자 하는 경우, 그리고 세포가 바이러스 벡터에 노출되기 전에 미리 활성화된 경우에는, 보다 높은 농도 (약 300-400 ng/ml)를 사용할 수 있다. 본 실시양태에서, SCF 및 Flt3-L은 300ng/ml 범위의 농도, TPO 및 IL-7은 100ng/ml 범위의 농도, 그리고 IL-3은 약 40ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.
TNF-알파는 바람직하게는 5 ng/ml 이상의 농도로 사용된다. 실제로, 실시예에서 입증된 것과 같이, 이러한 낮은 농도는 분화 경로를 변경시키지 않고도 T 세포 전구체의 증식을 얻기에 충분하다.
그러나, 보다 높은 농도가 또한 사용될 수 있다. 특히, TNF-알파 농도는 300 ng/ml 또는 200 ng/ml만큼 높을 수 있다. 적절한 농도는 약 100 ng/ml이다. 그러나, 10 ng/ml, 20 ng/ml 또는 50 ng/ml와 같은 다른 농도 또한 적합하다.
본 발명은 따라서 상술한 것과 같이, TNF-알파를 포함하는 적합한 배지에서 그리고 고정된 Notch 리간드, 및 선택적으로는 피브로넥틴 단편의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계를 포함하는 T 세포 전구체의 생성을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명은 따라서 상술한 것과 같이, TNF-알파를 포함하는 적합한 배지에서 그리고 고정된 Notch 리간드, 및 선택적으로는 피브로넥틴 단편의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계를 포함하는 T 세포 전구체를 확장하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
T 세포 전구체를 확장하는 것은 TNF-알파가 사용되지 않았을 때보다 T 세포 전구체가 더 많은 것, 그리고/또는 용기 내 도입된 CD34+ 세포의 수보다 T 세포 전구체가 더 많은 것을 의미하도록 의도된다.
특히, 상기 방법에 의해 수득된 T 세포 전구체는 CD34- / CD7+ / CD5- 전구체이다.
일반적으로, 세포는 CD1a 마커를 가지고 있지 않다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법에 의해 수득된 T 세포 전구체는 CD34- / CD7+ / CD1a- 전구체이다.
이는, 유세포 분석법에 의해 분석되는 것과 같이, 본 명세서의 방법에 의해 수득된 T 세포 전구체 집단(population)이 CD7 마커를 발현한다는 것과 상기 마커를 발현하는 80% 이상의 세포가 상기 표현형을 갖는다 (하기 표현형은 발현하지 않음
- CD34 및 CD1a, 또는
- CD34 및 CD5, 또는
- CD34 및 CD1a 및 CD5)는 것을 의미한다. 상기 표현형은 일반적으로 배양 7일 후에 얻어진다.
명시된 것과 같이, CD34+ 세포는 바람직하게는 제대혈 세포가 아니다. 그러나, 상기 방법은 또한 제대혈 CD34+ 세포를 이용하여 사용될 수 있으며 제대혈 CD34+ 세포에 적용될 수 있고, 이는 개선된 결과를 유도할 수 있다.
상기 방법은 성체 환자로부터 단리된 CD34+ 세포로 구현될 때 특히 흥미롭다. 상기 환자는 건강한 공여체, 또는 질병을 가진 공여체일 수 있으며, 특히 세포는 바이러스성 형질도입에 의해 교정될 수 있다.
세포는 배양 기간이 더 길어질 수 있으나, 3일을 초과하여, 바람직하게는 적어도 5일 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 또는 정확히 6일 동안, 가장 바람직하게는 적어도 또는 정확히 7일 동안 배양될 수 있다.
본 명세서에서 개시된 방법에서, TNF-알파는 바람직하게는 배양 배지에 0일차에 (즉, CD34+ 세포 배양 시작 시에) 첨가되며 적어도 3일 동안, 바람직하게는 세포가 배양되는 동안 항상 (즉, 바람직하게는 약 7일) 배양 배지 내에 존재하여야 한다.
본 명세서에서 기술된 방법을 수행할 때, TNF-알파를 이미 포함하는 배양 배지에 스템레게닌 1 (StemRegenin 1) (SR1, 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀, CAS 1227633-49-10)을 추가하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 T 세포 전구체 (T 세포 전구세포)를 수득하는 방법에 관한 것이다:
a. 상기 방법을 수행하는 단계 및
b. 상기 생성된 T 세포 전구체를 정제하여 수득하는 단계.
정제는 세포를 세척하고 기본 배지와 같은 곳에 재현탁함으로써 수행될 수 있다.
상기 방법은 또한 환자에게 주입하기 위한 파우치(pouch) 내에 T 세포 전구체를 컨디셔닝 (conditioning)하는 단계를 포함할 수 있다.
이 경우, 상기 세포는 albunormTM 5% 50 g/L (Octopharma, Lingolsheim, France)과 같은 5% HAS를 포함하는 식염수 내에 재컨디셔닝되는 것이 선호된다.
이러한 세포는 또한 종래 알려진 방법에 따라 냉동될 수 있다.
본 발명은 또한 T 세포 전구체 집단 (상술한 방법에 의해 수득하기 쉽거나 수득되는)을 포함하는, 정맥 주사용 파우치에 관한 것으로, 상기 집단 내 CD7+ 세포의 비율은 80% 초과, 더욱 바람직하게는 85% 초과이다.
본 발명은 또한 CD7+ T 세포 전구체 집단 (상술한 방법에 의해 수득하기 쉽거나 수득되는)을 포함하는, 정맥 주사용 파우치에 관한 것으로, 상기 집단 내 CD34- 및 CD5- 세포 (CD7+이며 CD34- 및 CD5-인 세포)의 비율은 80% 초과, 더욱 바람직하게는 85% 초과이다.
본 발명은 또한 CD7+ T 세포 전구체 집단(상술한 방법에 의해 수득하기 쉽거나 수득되는)을 포함하는, 정맥 주사용 파우치에 관한 것으로, 상기 집단 내 CD34- 세포 (CD7+ 및 CD34-인 세포)의 비율은 50% 초과, 더욱 바람직하게는 60% 초과이다. 또한, 집단 내 적어도 80%, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 85%의 세포가 CD1a- 세포이다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 형질전환된 T-세포 전구체를 수득하기 위한 시험관내 (in vitro) 방법에 관한 것이다:
a. TNF-알파를 포함하는 적합한 배지 내에서 및 고정된 노치 (Notch) 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계,
b. 상기 세포를 CD34+ 세포의 형질감염 또는 형질도입을 의도하는 벡터에 노출시키는 단계.
상술한 것과 같이, 그리고 세척 및 상기 세포를 다시 배양하는 단계 이후에, 형질전환된 T-세포 전구체 (이들 게놈 내에 통합되어 전이유전자를 발현함)가 수득된다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 변형된 T-세포 전구체를 수득하기 위한 시험관내 (in vitro) 방법에 관한 것이다:
a. TNF-알파를 포함하는 배지 내에서 및 고정된 노치 (Notch) 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계,
b. 세포 배양 중 적어도 일부 시간 동안 상기 세포를 유전자 편집에 적합한 성분을 포함하는 벡터 또는 핵산 서열에 노출시키는 단계.
그렇게 함으로써 세척 및 배양의 잠재적 단계 이후, 유전자 편집에 의해 변형된 T 세포 전구체가 얻어진다.
본 발명은 또한 일부 개월 (적어도 2개월, 바람직하게는 적어도 6개월) 동안, 특히 면역억제된 환자에서 면역 재구성을 허용하기 위하여 그리고/또는 상기 환자에서의 감염에 대한 면역 보호를 얻기 위하여, 면역억제된 환자에게 사용하기 위한 T 세포 전구체, 특히 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 수득한 T 세포 전구체에 관한 것이다.
구체적인 실시양태에서, 환자는 면역억제된 환자이다. 결핍의 원인은 다양할 수 있다: 선천성 면역 결핍, 백혈병 (leukemia)에 대한 화학요법, 컨디셔닝, 줄기세포만을 포함하는 이식, GVH (이식편대숙주병(graft-versus-host disease)) 예방을 위한 이식후 치료, 환자의 연령, 및 감염 등의 합병증.
특히, 환자는 조혈모세포 이식 전의 치료 후 면역 세포 고갈로 인해 면역억제될 수 있다. 본 실시양태에서, 이식편은 동종 이식편 (이 경우, T 세포 전구체는 바람직하게는 일부 HLA-적합한 공여체로부터 유래됨), 또는 자가 이식편 (이 경우, T 세포 전구체는 상기 환자의 유전적 결함을 교정할 수 있도록 하는 유전자 및/또는 단백질을 발현하기 위하여 벡터에 의해 우선적으로 형질전환됨)일 수 있다.
T 세포 전구체는 바람직하게는 CD7+ 세포군이다 (즉, 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 집단 내 세포가 CD7 마커를 발현하는 집단). 상기 집단 또한 본 발명의 일부이다. 특히, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득되는 것이 가능하다. 구체적인 실시양태에서, 이는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득된다.
보다 구체적으로, T 세포 전구체는 바람직하게는 CD7+ 세포군으로 (즉, 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 집단 내 세포가 CD7 마커를 발현하는 집단) 집단 내 CD34- 및 CD5- 세포 (CD7+이며 CD34- 및 CD5-인 세포)의 비율이 80%를 초과하며, 더욱 바람직하게는 85%를 초과한다. 상기 집단 또한 본 발명의 일부이다. 특히, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득되는 것이 가능하다. 구체적인 실시양태에서, 이는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득된다.
다른 실시양태에서, T 세포 전구체는 바람직하게는 CD7+ 세포군이다 (즉, 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 집단 내 세포가 CD7 마커를 발현하는 집단). 상기 집단에서, 50% 초과, 더욱 바람직하게는 60%를 초과하는 세포는 CD34 마커를 발현하지 않는다. 상기 집단에서 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%의 세포는 CD1a 마커를 발현하지 않는다. 상기 집단에서 CD7+ CD1a- 세포의 비율은 바람직하게는 적어도 80%이다. 상기 집단 또한 본 발명의 일부이다. 특히, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득되는 것이 가능하다. 구체적인 실시양태에서, 이는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득된다.
세포가 표면 마커 (CD7, CD34, CD5 또는 CD1a)에 양성인지 아닌지를 결정하기 위해서는, 세포가 표면 항원에 대한 형광 항체로 표시된 후 종래 알려진 임의의 방법, 그리고 특히 유세포 분석법을 사용하여야 한다. 원칙은, 주어진 강도로 집단의 각 세포에 대하여 신호가 방출되며, 그 신호가 임의의 한계점보다 높다면 그 세포는 항원에 대해 양성으로 간주된다는 것이다.
CD34의 경우: HPSC 집단 (제대혈 또는 가동화 말초 혈액으로부터 단리된 것들)으로 이루어지는 대조 집단은 적절한 한계점을 결정하는데 사용된다. 상기 세포군에서, 세포들은 CD34+ CD7- CD5-, 또는 CD34+ CD7- CD1a-이다. 상기 대조군을 사용하여, 다른 집단의 세포가 이들 항원에 대하여 양성인지 아닌지 결정하는데 사용될, 각 항원에 대한 한계점을 결정하는 것이 가능하다.
대조 집단은 90%의 CD34+ CD7- CD5-, 또는 90%의 CD34+ CD7- CD1a- 조혈모세포를 일반적으로 포함한다. 한계점은 그 집단의 세포가 90/10 비율로 분류될 수 있는 신호 강도 수준이다.
CD7 (각각 CD5 또는 CD1a)의 경우: 종래 알려진 기술, 특히, Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences)와 같은 밀도 기울기법에 의한 말초 혈액 단핵 세포 (Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)의 단리에 의해 수득된 대조 집단이 사용된다. CD7 (각각 CD5 또는 CD1a) 양성 세포는, 항-CD7 (각각 항-CD5 또는 항-CD1a) 항체를 지닌 자성 입자를 이용하는 MACS®기법 (Magnetic Cell Isolation and Cell Separation, Miltenyi Biotec)과 같은 종래 알려진 기술을 이용하여 단리된다. 상기 집단에서, 세포는 본질적으로 CD7+ (각각 CD5+ 또는 CD1a+)이며, 그 비율은 약 90/10일 것으로 생각된다.
세포가 표면 항원에 대해 양성인지 평가하기 위한 한계점은 상기 항원에 대한 대조 집단을 이용하여 결정되며, 이는 대조 집단에서 90%를 초과하는 세포가 그보다 높은 신호 강도를 나타내는 강도이다
따라서, 세포는 해당 항원에 대한 강도 신호가 상기 결정된 것과 같은 한계점보다 높으면 항원에 대해 양성인 것으로, 해당 항원에 대한 강도 신호가 상기 결정된 것과 같은 한계점보다 낮으면 항원에 대해 음성인 것으로 간주된다.
CD1a 마커를 발현하는 세포는 흉선에 도달하기에 매우 효율적이지 않을 수 있으며 따라서 생체내 재증식을 위한 CD1a- 세포만큼 효과적일 수 있기 때문에, 집단 내 대다수의 T 세포 전구체가 CD1a 마커를 발현하지 않는다는 사실은 유리한 것으로 드러날 수 있다. CD1a+ 세포의 재구성 가능성은 불확실하기 때문에, 집단 내 이러한 세포의 양을 줄이는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상술한 것과 같이, 면역억제된 환자에게 T-세포 전구체를 투여하는 단계를 포함하는, 특히 적어도 일시적으로, 면역억제된 환자에서 면역 재구성을 허용하기 위한 목적으로, 면역억제된 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 상술한 것과 같은 조건 하에서, CD34+ 세포를 TNF-알파 (상술한 것과 같음)의 존재 하에 Notch 리간드에, 바람직하게는 RGDS 모티브 및/또는 CS1 모티브를 갖는 단백질 또는 펩티드, 특히 상술한 것과 같은 피브로넥틴 단편에 노출시킴으로써 이러한 전구체를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
특히, 치료적으로 유효한 양, 즉, kg 당 1 내지 5 × 106의 전구체가 투여되는데, 이는 적어도 수개월 (약 6개월 정도)동안 환자에게 감염에 대한 보호 역할을 하도록 하는 세포를 제공할 수 있도록 한다.
바람직하게는, T 세포 전구체의 이러한 투여는 상기 환자에 대한 조혈모세포 이식 직전, 직후 또는 동시에 진행된다. 상기 나타난 것과 같이, 주입된 세포는 상기 환자에서 유전적 결함을 교정하도록 의도된 벡터에 의해 형질전환될 수 있다.
다른 실시양태에서, T 세포 전구체는 조혈모세포 이식이 필요하지 않는 환자에게 주입된다. 실제로, 면역계를 고갈시키는 화학요법을 수행할 필요 없이, 형질전환 또는 형질도입된 T 세포 전구체를, 오직 T 세포만이 영향을 받는 일부 면역결핍, HIV 또는 암 환자 치료에 사용하는 것이 가능하다 (CAR-T 세포를 유도하도록 변형된 전구체를 사용함).
TNF-알파에 대해 개시된 것과 같은 본 발명의 교시는 또한 퓨린 유도체 스템레게닌 1 (SR1, Boitano et al (Science. 2010 Sep 10;329(5997):1345-8)에 개시됨)에도 적용될 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 따라서 SR1은 분화의 시작, 및 세포의 확장 (세포 수의 증가)과 함께 T 세포 전구체를 CD34+ 세포로부터 수득하기 위해 TNF-알파를 대체할 수 있다 (즉, TNF-알파 대신에 사용됨). SR1의 농도는 바람직하게는 750nM (30 ng/ml)의 범위, 또한 1500 nM 또는 2500 nM (100 ng/ml)와 같은 더 높은 농도, 또는 심지어 5000nM (200 ng/ml) 또는 500 nM (20 ng/ml)와 같은 그 이하의 농도도 예상할 수 있다. 단독으로 사용될 때, 또는 특히 TNF-알파와 조합하여 사용되는 경우, 3 ng/ml, 또는 10 ng/ml만큼 더 낮은 농도가 사용될 수 있다. 적합한 농도는 또한 30 ng/ml 또는 100 ng/ml를 포함한다. 따라서, 3 ng/ml보다 높거나, 10 ng/ml보다 높은 임의의 농도가 T-세포 전구체에 대한 CD34+ 세포의 분화를 증가시키는데 적합하다.
SR1은 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체 (AhR)의 리간드 (길항제 (antagonist))이다. 다른 AhR 길항제가 단독 또는 TNF-알파와 함께 T-세포 전구체 계통으로의 CD34+ 세포의 분화를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다. 레스베라트롤, 오메프라졸, 루테올린, 알파-나프토플라본, 멕실레틴, 트라닐라스트, 6,2',4'-트리메톡시플라본, CH 223191 (1-메틸-N-[2-메틸-4-[2-(2-메틸페닐)디아제닐]페닐-1H-피라졸-5-카복사미드, CAS 301326-22-7)이 언급될 수 있다. AhR 길항제의 양은 길항제의 IC50 (SR1은 IC50이 127 nM인 반면, CH 223191은 IC50이 30 nM임)과, 일부 산물이 고농도이거나 (알파-나프토플라본 등) 세포 상황에 의존적일 때 (오메프라졸 등) AhR에 대한 작용제 활성을 가질 수 있다는 사실을 고려하여, 당업자에 의해 사례 별로 결정된다. SR1과 CH 223191 간의 IC50 차이를 고려할 때, CH 223191의 유효 농도는 본 명세서에 개시된 SR1의 유효 농도보다 훨씬 낮을 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은 또한 하기에 관한 것이다:
(i) 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 스템레게닌 1 (SR1)을 포함하는 배지 내에서 및 고정된 노치 (Notch) 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계를 포함하는, T 세포 전구체 생성을 위한 시험관내 (in vitro) 방법.
(ii) 상기 방법에서, 배양 배지는 TNF-알파를 추가로 포함하는 시험관내 방법.
(iii) 상기 방법에서, 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 스템레게닌 1 (SR1)은 배양 0일차부터 배양 배지 내에 존재하는 시험관내 방법.
(iv) 상기 방법에서, CD34+ 세포는 성체 공여체, 또는 제대혈로부터 단리되는 시험관내 방법.
(v) 상기 방법에서, 세포는 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 스템레게닌 1 (SR1)의 존재 하에서, 최대 10일 동안 배양되는 시험관내 방법.
(vi) 상기 방법에서, 세포는 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 스템레게닌 1 (SR1)의 존재 하에서, 3일 내지 7일 동안 배양되는 시험관내 방법.
(vii) 상기 방법에서, 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 스템레게닌 1 (SR1)은 1 ng/ml 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 1 ng/ml 이상, 또는 3 ng/ml 이상, 또는 10 ng/ml 이상, 바람직하게는 200 ng/ml 미만, 또는 150 ng/ml 미만, 일반적으로는 3 ng/ml 내지 100 ng/ml의 농도로 배양 배지에 첨가되는 시험관내 방법.
(viii) 상기 방법에서, Notch 리간드는 IgG 단백질, 바람직하게는 IgG2 단백질의 Fc 영역에 융합된 Delta-유사-4 리간드의 가용성 도메인인 시험관내 방법.
(ix) 상기 방법에서, 세포는 또한 피브로넥틴 단편에 노출되며, 상기 단편은 RGDS 및 CS-1 패턴 및 또한 바람직하게는 배양 용기의 내부 표면에 고정된 헤파린-결합 도메인을 포함하는 시험관내 방법.
(x) 상기 방법에서, 피브로넥틴 단편은 상술한 것과 같이 레트로넥틴 (Retronectin®)인, 시험관내 방법.
(xi) 상기 방법에서, 배양 배지는, CD34+ 세포가 Notch 리간드에 노출되는 적어도 일부의 시간 동안, CD34+ 세포의 형질감염 또는 형질도입을 의도하는 벡터를 또한 포함하는 시험관내 방법.
(xii) 상기 방법에서, 배양 배지는 인터루킨 7 (IL-7), SCF (줄기세포 인자), 트롬보포이에틴 (TPO), 및 Flt3 리간드 (FLT3L)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 시험관내 방법.
(xiii) 하기 단계를 포함하는 T 세포 전구체를 수득하는 (시험관내) 방법:
a. 상기 임의의 방법을 수행하는 단계 및
b. 상기 생성된 T 세포 전구체를 정제하는 단계,
c. 선택적으로는 환자에게 주입하기 위한 파우치 내에 T 세포 전구체를 컨디셔닝 (conditioning)하는 단계.
(xiv) 하기 단계를 포함하는 형질전환된 T-세포 전구체를 수득하기 위한 시험관내 (in vitro) 방법:
a. 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 SR1를 포함하는 배지 내에서 및 고정된 Notch 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계,
b. 상기 세포를 CD34+ 세포의 형질감염 또는 형질도입을 의도하는 벡터에 노출시키는 단계.
(xv) 하기 단계를 포함하는 변형된 T-세포 전구체를 수득하기 위한 시험관내 (in vitro) 방법:
a. 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 SR1를 포함하는 배지 내에서 및 고정된 노치 (Notch) 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계,
b. 상기 세포를 유전자 편집에 적합한 성분을 포함하는 벡터 또는 핵산 서열에 노출시키는 단계.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 상기 설명한 것과 같은 방법을 수행하기 위한 키트(kit)에 관한 것이다:
(i) Notch의 리간드 (특히 IgG 단백질, 특히 IgG2 단백질의 Fc 영역에 융합된 Delta-유사-리간드의 가용성 도메인), 및 선택적으로는 피브로넥틴 단편을 포함하는 코팅 배지,
(ii) α-MEM, DMEM, RPMI 1640, IMDM, BME, McCoy's 5A, StemSpanTM SFII (StemCell Technologies) 배지, X-VIVOTM 배지 또는 피셔 배지 (Fischer's medium)와 같은, CD34+ 세포 및 T 세포의 배양 (및/또는 확장)을 위해 조정된 배지,
(iii) TNF-알파 및 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7에서 특히 선택되는 바람직하게는 3개의 사이토카인을 포함하는 전구체 확장 배지. 전구체 확장 배지는 TNF-알파 및 4개의 사이토카인 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7을 모두 포함하는 경우가 바람직하다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 설명한 것과 같이 동일한 성분 (i) 및 (ii), 그리고 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 SR1, 및, 특히 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7로부터 선택되는 바람직하게는 3개의 사이토카인을 포함하는 전구체 확장 배지 (iii)를 포함하는 키트에 관한 것이다. 전구체 확장 배지는 SR1 및 4개의 사이토카인 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7을 모두 포함하는 경우가 바람직하다.
다른 실시양태에서, 전구체 확장 배지 (iii)은 TNF-알파 및 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 SR1, 및 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7에서 선택되는 바람직하게는 3개의 사이토카인을 포함한다. 전구체 확장 배지는 TNF-알파, SR1 및 4개의 사이토카인 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7을 모두 포함하는 경우가 바람직하다.
이러한 키트는 특히 본 명세서에 개시된 방법의 수행을 위하여 조절 및 설계된다.
코팅 배지 (i)는 먼저 배양 용기의 벽을 코팅하는데 사용된다.
배지 (ii)는 이후 CD34+ 세포 (제대혈 또는 특히 성체의 가동화 말초 혈액로부터 수득됨)를 배양하는데 사용된다. 이러한 배지는 일반적으로 그리고 바람직하게는 1x 농도로 (즉, 희석하지 않고 사용할 수 있음) 사용된다.
배지 (iii)는 일반적으로 10x 희석으로 나타낸다 (즉, 배지 (ii)에 희석되어 사용되어야 함). 배지 (ii) 및 (iii)으로부터 재구성된 배지는 이후 상술한 것과 같이 T-세포 계통 내에서 CD34+ 세포가 T-세포 전구체로 분화되는 것을 촉진하기 위하여 사용된다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체(subject) 내에서 T 세포의 수를 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 수득된 전구체 T 세포를 개체에 유효한 수로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 증가된 수의 T 세포를 필요로 하는 개체의 치료 용도를 위한, 본 명세서에 개시된 임의의 방법에 의해 수득된 전구체 T 세포에 관한 것이다.
특히, 상기 개체는 인간이다.
특히, 투여된 전구체 T 세포는 자기 유래의 것이다. 다른 실시양태에서, 투여된 전구체 T 세포는 동종이계이다.
특히, 증가된 수의 T 세포를 필요로 하는 개체는 림프구감소증 (lymphopenia), 특히 암 (cancer), HIV 감염, 부분 흉선절제술 (partial thymectomy), 자가면역 질환 (autoimmune disease), 및/또는 장기 이식 (organ transplant)을 일으키거나 초래하는 의학적 질환을 가진다.
도 1 : 20000 CD34+ 세포를 이용하여 시작하여 제대혈 (CB, 도 1.A) 또는 가동화 말초 혈액 (mPB, 도 1.B)으로부터 배양 3일 후 (검정 막대) 및 7일 후 (누적 검정 및 회색 막대)에 수득된 총 유핵 세포의 수. NC: 보충되지 않음; SR1: 스템레게닌 1 (750nM)이 첨가됨; TNF-알파: TNF-알파 (100ng/ml)가 첨가됨; + (a), (b), (c): 배양 0-3일차부터 (a), 배양 0-7일차부터 (b) 또는 배양 4-7일차부터 (c) 보충물이 첨가될 때 관찰된 세포의 수.
도 2 : 20000 CD34+ 세포를 이용하여 시작하여 제대혈 (CB, 도 2.A) 또는 가동화 말초 혈액 (mPB, 도 2.B)으로부터 7일차에 수득된 CD7+ T-세포 전구체의 수. 검정 막대: CD34+CD7+ 세포; 회색 막대: CD34-CD7+ 세포. (a), (b), (c): 배양 0-3일차부터 (a), 배양 0-7일차부터 (b) 또는 배양 4-7일차부터 (c) 보충물이 첨가될 때 관찰된 세포의 수.
도 3 : TNF-알파의 존재 하에서 (회색 막대) 또는 부재 하에서 (검정 막대) 배양된 제대혈 (CB) 또는 가동화 말초 혈액 (mPB)으로부터, CD34+ 세포를 이용하여 시작하여 수득된 배양 7일 후 생존 세포 상의 Bcl11b의 발현이 분석되었다.
도 4 : CD34+ 제대혈 세포 (CB, 검정 막대, 좌측) 또는 가동화 말초 혈액 (mPB, 회색 막대, 우측)으로부터 시작하여 7일차에 수득된 CD7+ 세포의 수에 대한, TNF-알파 및 Notch 리간드 DL4의 조합 효과. (+/-는 DL4 또는 TNF-알파의 존재 또는 부재를 의미함).
도 5 : TNF-알파의 존재 (회색 막대) 하 또는 부재 (검정 막대) 하에서, 제대혈 (CB) 또는 가동화 말초 혈액 (mPB)으로부터의 CD34+ 세포로부터 시작하여 수득된 7일차의 골수 세포의 빈도 (평균 ± 표준오차).
도 6 : 제대혈 (CB, 도 6.A) 또는 가동화 말초 혈액 (mPB, 도 6.B)으로부터의 CD34+ 세포를 이용하여 시작하여, TNF-알파의 용량 반응 어세이에서 3일차부터 7일차까지 수득된 총 CD7+ 세포의 수.
도 7 : 제대혈 (CB, 도 7.A) 또는 가동화 말초 혈액 (mPB, 도 7.B)으로부터의 CD34+ 세포를 이용하여 시작한, TNF-알파의 용량 반응 어세이에서 CD34-CD7+ 세포 (회색 막대) 대 CD34+CD7+ 세포 (검정 막대)의 비율.
도 8 : 세포 주기의 상이한 단계의 세포의 비율. A. CB: 제대혈로부터 분화된 세포; B. 가동화 말초 혈액 세포로부터 분화된 세포. NC: 보충되지 않음; TNF-알파: TNF-알파 (20 ng/ml)의 존재 하에 배양됨; SR1: SR1 (30ng/ml)의 존재 하에 배양됨
도 9 : 배양 7일 후에, 다양한 농도의 TNF-알파 및/또는 SR1의 존재 하에 제대혈로부터의 CD34+ 세포를 이용하여 시작하여 배양된 CD5+CD7+ 세포의 백분율 (A) 및 총 수 (B).
실시예
실시예 1 - 재료 및 방법
인간 세포
은행 보관에 적합하지 않은 제대혈 샘플을 연구 목적으로 사용하였으며 아이 부모의 사전 동의 조항에 따랐다. G-CSF 가동화 이후 건강한 공여체로부터 가동화 말초 혈액 (mPB) 샘플을 수집하였다. 샘플은 바로 CD34+ 세포에 대해 농축되었다. 사전 동의는 각 공여체 (Biotherapy Department, Necker Hospital, Paris)로부터 얻었다.
CD34+ 전구체 세포의 Notch 리간드 DL-4에 대한 노출
인간 CB 또는 가동화 말초 혈액 샘플로부터의 CD34+ 세포를 재조합 인간 피브로넥틴 (RetroNectin®, Clontech/Takara) 및 DL-4 (5 μg/ml, PX'Therapeutics, Grenoble, France)로 코팅된 24-웰 플레이트 또는 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 코팅은 2시간 동안 37℃에서 수행하였고, DL-4 코팅된 웰은 인산-완충 생리식염수 (PBS)에서 30분 동안 37℃로 소 혈청 알부민 2% (BSA)로 블로킹하고 PBS로 세척하였다. 배양물은 TNF-α (R&D Systems, US)의 존재 또는 부재 하에서, NaHCO3 (7,5%) (Gibco, life Technology) 및 20% 정의된 소 태아 혈청 (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France) 및 재조합 인간 사이토카인 인터루킨-7 (IL-7), Flt3-리간드 (Flt-3), 줄기세포 인자 (SCF) 및 트롬보포이에틴 (TPO) (모두 100 ng/ml 농도이며 모두 PeproTech Inc (Rocky Hill, NJ)에서 구입함)으로 보충된 α-MEM 배지 (Gibco, life Technology) 내에서 2 x104 세포/웰 또는 1x105 세포/웰 (24-웰 및 6-웰 플레이트 각각)의 농도로 시작하였다. 배양 3일 후, 세포는 신선한 배지를 반 교체하였다. 배양된 세포를 DL-4 상의 배양 3일 그리고 7일 후에 각각 형광-활성화 세포 선택 (FACS)에 의해 분석하고 후속 분석을 위해 CD34-/CD7- 골수 세포를 제외하였다.
OP9/DL1 세포에 대한 시험관내 (In vitro) T 세포 분화 어세이
앞서 기술된 방법 (Six et al, Blood Cells Mol Dis. 2011 Jun 15;47(1):72-8 및 Six J Exp Med. 2007 Dec 24;204(13):3085-93)으로, 자연 상태의 CD34+ CB 세포 및 DL-4에 대한 노출에 의해 생성된 TNF-α 유도된 T 세포 전구체의 T-림프구로의 가능성을 OP9/DL-1 공-배양물에서 평가하였다
RT2 프로파일러 어세이 (Profiler array)를 이용한 정량, 실시간 중합효소 연쇄 반응
배양 7일 후 CD7+ 세포를 AriaII 상에 분류하였다. 3일차부터 7일차까지 분류된 세포 분획의 총 RNA를 Rneasy 마이크로 키트 (Qiagen, Courtaboeuf, France)로 단리하였다. RT2 Profiler PCR 어레이를 RT2 Profiler PCR 어레이 핸드북 (SA Biosciences, Frederick MD)에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다.
유세포 분석법 및 세포 분류
인간 CD34 (AC136), CD3 (BW264/56), CD45 (5B1)에 대한 단클론성 항체를 Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Germany)에서 구입하였고 CD4 (SK4), CD7 (M-T701), CD25 (M-A251), 7-아미노악티노마이신 D (7AAD)는 BD Biosciences (San Jose, CA)에서 구입하였다. 항-인간 CD8 (RPAT8)은 Sony Biotechnology (San Jose, USA)로부터 구입하였다. 항-인간 Ctip2 (Bcl11b) 항체는 Abcam (Cambridge, UK)로부터 구입하였다.
인간 세포는 Gallios 분석기 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany)를 이용하여 염색 및 분석하였다. 이종의 수혜자로부터의 세포를 MACSQuant® 장치 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) 상에서 분석하였다. 데이터는 살아있는, 7AAD-음성 세포 상에서 게이팅 한 후 FlowJo 소프트웨어 (Treestar, Ashland, OR)를 이용하여 분석하였다. 세포 서브세트는 ARIA II 시스템 상에서 분류하였다.
세포 증식 어세이
세포 증식 어세이를 위하여, CB 및 mPB로부터의 CD34+ 세포를, DL-4 및 TNF-알파 (Life Technologies)를 이용하여 배양하기 전에 CellTraceTM CFSE 키트 (Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 표지하였다. 세포의 염색 강도를 3일차부터 7일차까지 각 날에 배양하기 전에 측정하였다. CFSE-양성 세포를 Gallios cytometer (Beckman Coulter) 상에서 분석하였다.
세포 주기 어세이
세포 주기 분석을 위하여, 세포를 실온에서 15분 간 PerFix-nc 키트 (Beckman Coulter)의 고정 시약으로 고정한 후 Hoechst33342 (Life technology) 및 Ki67-PC5 (BD Bioscience)로 염색하고, 투과성 시약을 가하였다. 데이터는 살아있는, 7AAD-음성 세포 상에서 게이팅 한 후 FlowJo 소프트웨어 (version 10.2, Treestar, Ashland, OR)를 이용하여 분석하였다.
성체 HSPC로부터 유래된 시험관내-생성된 T-세포 전구체의 NSG 신생아로의 입양전달 (Adoptive transfer)
동물에 대한 모든 실험 및 절차는 동물 실험에 대한 프랑스 농무부 (French Ministry of Agriculture)의 규정에 따라 수행하였다. NSG 마우스에 대한 시험관내 생성된 인간 T-세포 전구체의 주입은 고등 교육 및 연구부 (the Ministry of Higher Education and Research)로부터 승인되었다 (APAFIS 2101-2015090411495178v4).
NSG (NOD-Scid(IL2Rgnull)) 마우스 (Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, http://www.jax.org)로부터 수득함)는 무-병원체 시설에 보관되었다. TNF α (3x105 또는 1x106)의 존재 또는 부재 하 7일 동안의 DL-4 배양에서 mPB CD34+ HSPC로부터 유래된 자손 세포를 NSG 신생아 (0-4일령)에 간내 주사하였다. 대조군 마우스에는 3x105 비-배양된 mPB CD34+ 세포 또는 100ul PBS를 주사하였다.
이식 후 4 내지 12주 동안 NSG 마우스의 평균 이식 수준을 측정하였다. 대퇴골, 흉선, 말초 혈액 및 비장으로부터 수집된 신선한 세포 상에서 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 1x 적혈구 용해 완충액(Biolegend, US)으로 처리하고 항체 염색 전에 세척하였다.
T 세포 수용체 다양성 분석
TCR 유전자 재배열 분석을 중복하여 2개의 독립적으로 정제된 서브세트에 대하여 수행하였다 (평균을 표시함).
TCR-δ 정량 (D δ2-D δ3, D δ2-J δ1, 및 D δ3-J δ1)을 나열된 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 수행하였다
하기를 D δ2-D δ3 재배열에 사용하였다:
D δ2, 5'-CAAGGAAAGGGAAAAAGGAAGAA-3' (서열번호 9);
D δ3, 5'-TTGCCCCTGCAGTTTTTGTAC-3' (서열번호 10);
및 D'3 프로브, 5'-ATACGCACAGTGCTACAAAACCTACAGAGACCT-3' (서열번호 11).
하기 프라이머 및 프로브를 D δ2-J δ1 에 사용하였다:
D δ2, 5'-AGCGGGTGGTGATGGCAAAGT-3' (서열번호 12);
J δ1, 5'-TTAGATGGAGGATGCCTTAACCTTA-3' (서열번호 13);
및 J δ1 프로브, 5'-CCCGTGTGACTGTGGAACCAAGTAAGTAACTC-3' (서열번호 14)
하기를 D δ3-J δ1 재배열에 사용하였다:
D δ3, 5'-GACTTGGAGAAAACATCTGGTTCTG-3' (서열번호 15);
J δ1 프라이머 및 J δ1 프로브.
다중 형광 PCR에 의한 TCR 재배열 분석을 모세관 서열분석 중합체 (capillary sequencing polymer) 내 형광색소-표지된 단일 가닥 PCR 산물의 분리에 의해 수행하고, 자동화된 레이저 스캐닝을 통해 감지하였다.
세포 사멸 어세이
세포를 차가운 PBS로 세척하고 결합 완충액 (binding buffer)에 1백만 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 5ul 아넥신 (Annexin) V-PE (BD Bioscience) 및 2ul 7AAD를 첨가한 후, 세포를 어두운 곳, 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이어, 세포를 500ul 결합 완충액으로 세척하고 1시간 내에 분석할 수 있도록 100ul 결합 완충액에 재현탁하였다.
실시예 2: T-세포 전구체의 확장 및 분화의 개선
CD34+ 세포를 DL-4를 이용하여 배양할 때, 그리고 제대혈 (도 1.A) 또는 PB (도 1.B)로부터 나온 CD34+ 세포를 이용하여 시작할 때, 도 1은 TNF-알파없이 배양한 경우와 대비할 때 TNF-알파를 세포 배양 배지에 첨가하는 것이 7일차에 회수된 총 세포 수를 10배나 크게 증가시킬 수 있음을 보여준다.
도 2는 제대혈 (도 2.A) 또는 PB (도 2.B)로부터 나온 CD34+ 세포를 이용하여 시작할 때, TNF-알파를 세포 배양 배지에 첨가하는 것이 CD7+ 세포 수를 20 내지 40배나 크게 증가시킬 수 있음을 보여준다. 이러한 개선은 특히 CD34-CD7+ 세포군에서 높다.
실시예 3: T 세포 전구체의 표면 마커 분석
배양 7일 후 수득된 세포 표면에 존재하는 표면 마커를 유세포 분석법에 의해 결정하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
상기 표들은 TNF-알파가 CD5+ 세포 비율의 큰 증가 없이 CD7+ 세포 비율이 증가하도록 함을 보여준다.
배양 7일 후, HSPC는 CD34-CD7+CD5- T-세포 전구체로 분화하였다.
배양 10일 후 수득된 세포 표면에 존재하는 표면 마커를 유세포 분석법에 의해 결정하였다.
CD1a의 발현이 나타나지 않았다 (데이터 미도시).
표면 마커 수정의 동역학을 연구한 결과 배양 배지 내 TNF-알파의 존재가 4일차에서 7일차 동안 CD7+의 비율을 증가시키는 것으로 나타났다 (데이터 미도시).
실시예 4: T 세포 수용체의 재배열
배양 7일 후에 DL-4 T-세포 전구체는 TNF-알파 또는 SR1의 존재 또는 부재 하에서 TCR 재배열의 어느 신호도 나타내지 않았다 (데이터 미도시).
재배열의 구체적인 분석을 수행하였다:
TCRdelta 재배열 결과
CB-NC 및 CB-SR1에서 Dδ2-Dδ3 재배열이 감지되었다. 다른 TCRdelta 재배열은 감지되지 않았다. 결과는 RQ-PCR 정량에 부합하였다.
TCRgamma 재배열 결과
TCRgamma 재배열이 감지되지 않았다.
TCRbeta 재배열 결과
TCRbeta 재배열이 감지되지 않았다.
실시예 5: TNFα 유도된 T-세포 전구체의 T-실행 (commitment)
Bcl11b는 T-세포 실행 이후 독특하게 켜지며 T-세포 분화에 절대적으로 요구되는 중요한 전사 인자이다.
TNF-알파를 이용하여 배양된 T-세포 전구체에 대한 세포내 염색은 제대혈, 및 mPB로부터 나온 CD34+ 세포 모두가 Bcl11b를 양성 발현함을 보여주었다. 도 3은 TNF-알파가 Bcl11b 전사 인자를 발현하는 총 세포 비율을 증가시킴을 보여준다. TNF-알파를 이용하여 배양할 때, Bcl11b 발현 세포의 비율은 증가하였다.
실시예 6: 다른 계통에서의 분화
다른 계통에 특이적인 다른 세포 표면 마커 (CD14 및 CD33)의 존재를 평가하였다.
도 5는 TNF-알파 존재 하의 배양이 이러한 세포를 검출할 수 없도록 하는 반면, CD34+ 세포가 TNF-알파 없이 배양되는 경우 그 비율이 22% 미만임을 보여준다.
실시예 7: TNF-알파가 세포의 세포사멸을 감소시킨다
세포 사멸 마커 (7AAD 및 Annexin5)를 연구하였다.
Figure pct00003
상기 표는 TNF-알파 존재 하의 배양이 세포사멸 마커의 존재를 감소시킴을 보여준다. 이는 특히 mPB에서 뚜렷하다.
실시예 8: TNF-알파의 용량 반응 어세이 (Dose response assay)
TNF-알파의 다양한 용량을 사용하였다.
도 6은 CB 세포 (도 6.A) 또는 mPB 세포 (도 6.B)에 대하여 농도가 10 ng/ml를 초과할 때 TNFa가 배양 중 CD7+ 세포 수를 증가시킬 수 있음을 보여준다
용량 반응의 동역학은 TNF-알파가 DL-4 내 배양 단지 4일 후에 T-세포 분화를 증가시킴을 보여주었다. 농도 10, 50 및 100 ng/ml (미도시) 사이에 차이는 없었다.
효과적인 농도의 한계점을 결정하기 위하여, 보다 낮은 농도 (0.01-10 ng/ml)의 분석이 이루어졌다.
CB 및 mPB 상의 TNF-알파의 T-세포 분화에 대한 영향 (CD34- CD7+ 세포의 비율)은 낮은 농도에서 농도-의존적인 것으로 나타났다 (도 7). CD7+ T-세포 전구체의 총 수는 5ng/ml와 100ng/ml에서 상이하지 않았다.
실시예 9: 배양 중 증식 분석
TNF-알파 부재의 배양 조건과 비교할 때 TNF-알파는 CD34+CD7+ T-세포 전구체의 증식을 DL-4 내 배양 3일차부터 증가시키는 것으로 나타났다 (데이터 미도시).
실시예 10: TNF-알파 및 Notch 리간드 간의 시너지 효과
도 4는 DL4 없이는 CB 및 mPB 모두 CD7+ T-세포 전구체로 분화하지 못하였음을 보여준다. TNF-알파로 배지를 보충하는 경우에도 이는 변하지 않았다.
TNF-알파 및 Notch 리간드가 모두 존재하는 경우, 관찰된 효과는 매우 컸다. 따라서 두 화합물 사이에는 시너지 효과가 있는 것으로 보이며, T-세포 분화에 대한 TNF-알파의 효과는 Notch 의존성인 것으로 보인다.
실시예 11: TNF-알파의 첨가는 CD7+ 전구체의 증식을 증가시킨다
TNF-알파의 존재 하의 배양 7일 후, CD34+CD7-, CD34+CD7+ 및 CD34-CD7+ 서브세트는 분류되어 CFSE (카복시플루오레세인 석시니미딜 에스테르(Carboxyfluorescein succinimidyl ester))로 염색되었고, 이어 CFSE (세포 증식의 대리 마커)의 희석이 8일차부터 10일차까지 진행되었다.
TNF-알파와 배양될 때 오직 CD34+CD7+ 및 CD34-CD7+ 세포만이 증가된 증식을 보여준다. (데이터 미도시)
실시예 12: 세포 주기 분석
세포 주기의 분석을 수행하였다. CB 및 mPB 유래 CD7+ 전구체에서 TNF-알파의 존재 하에서 보다 많은 세포가 G0 단계로부터 방출되는 것으로 관찰되었다 (도 8).
실시예 13: SR1 및 TNFa의 조합
SR1은 7일차에 CD5+ CD7+ 세포의 존재에 의해 나타나는 것과 같이 T-세포 분화를 가속화한다. CD5+CD7+ 세포의 수는 TNF-알파 및 SR1 모두의 존재에 의해 증가한다 (도 9).
실시예 14: 생체내 (in vivo) 데이터
TNF-알파의 존재 하에서 유도된 T-세포 전구체는 생체내 T-계통의 재구성을 주로 촉진시킬 수 있다.
실제로, 이식 후 4주에, TNF-알파의 존재 하에 생산된 mPB T-세포 전구체를 주입한 수혜자 마우스는 TNF-알파의 부재 하에 생산된 mPB T-세포 전구체를 주입한 마우스에 비해 보다 큰 흉선을 갖는다. TNF-알파의 존재 하에 유도된 T-세포 전구체는 생체내에서 4주 내에 활성화된 TCRαβT 세포로 분화할 수 있다. (데이터 미도시)
요약하면, 0일차부터 DL-4 배양 시스템 내 TNF-알파의 첨가는 7일차에 mPB HSPC에 대해서는 40배, CB HSPC에 대해서는 20배의 T-세포 전구체 (CD7의 표면 발현에 의해 정의됨)의 증가를 유도한다.
CB 그리고 mPB로부터 생성된 CD7+ T-세포 전구체는 주로 CD34-이며 CD1a 음성이다. 세포는 또한 주로 CD5 음성이다.
이들은 Bcl11b를 발현하였는데, 이는 T-실행 및 나아가 T-세포 분화에 대한 중요한 미세-조정 분자이다.
이들은 T-세포 수용체 재배열의 어떤 신호도 보이지 않았다.
이들의 표현형 및 분자 특성은 TNF-알파 부재 하에 수득된 CD34-CD7+ T-세포 전구체 중 하나와 유사하였다.
TNF-알파 작용에 관여하는 메커니즘과 관련하여, TNF-알파는 배양 동안 세포사멸 마커의 발현을 감소시키며 세포 증식을 증가시킨다. 이는 또한 골수 세포 생산을 억제한다.
DL4 배양 시스템에서 TNF-알파의 사용은 인간 성체 및 제대혈 HSPC로부터 생산된 T-세포 전구체의 양을 상당히 증가시킨다. 따라서 성체 HSPC로부터 다량의 T-세포 전구체를 얻는 어려움을 극복할 수 있다. 또한 향후 임상 시험에 필요한 HSPC의 시작 횟수와 GMP 등급 및 기타 필요한 시약의 양을 감소시킬 수 있어, T-세포 전구체의 생산 비용을 감소시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ASSISTANCE PUBLIQUE-HOPITAUX DE PARIS FONDATION IMAGINE - INSTITUT DES MALADIES GENETIQUES UNIVERSITE PARIS DESCARTES INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) <120> METHOD FOR GENERATING T CELLS PROGENITORS <130> IPA191033-FR <150> EP 17305161.6 <151> 2017-02-13 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 723 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Delta -1 (soluble fraction: 1-536) G502 may be R <400> 1 Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe 20 25 30 Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe 100 105 110 Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His 115 120 125 Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser 145 150 155 160 Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg 165 170 175 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 180 185 190 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 195 200 205 Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro 210 215 220 Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro 225 230 235 240 Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu 245 250 255 Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp 260 265 270 Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp 275 280 285 Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys 290 295 300 Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro 325 330 335 Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys 340 345 350 Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met 355 360 365 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser 370 375 380 Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe 385 390 395 400 Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn 405 410 415 Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln 420 425 430 Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala 435 440 445 Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp 450 455 460 Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala 465 470 475 480 Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys 485 490 495 His Glu Arg Gly His Gly Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly 500 505 510 Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala 515 520 525 Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro 530 535 540 Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu 545 550 555 560 Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His 565 570 575 Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn 580 585 590 Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly 595 600 605 Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp 610 615 620 His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp 625 630 635 640 Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp 645 650 655 Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly 660 665 670 Glu Glu Lys Gly Thr Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu 675 680 685 Arg Lys Arg Pro Asp Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr 690 695 700 Gln Ser Val Tyr Val Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala 705 710 715 720 Thr Glu Val <210> 2 <211> 724 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human delta-4 protein (soluble fraction 1-526) <400> 2 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val Thr Pro Arg 675 680 685 Leu Asp Leu Pro Ser Ala Leu Phe Thr Leu His Pro Gly Trp Asp Val 690 695 700 Phe His Met Gln Arg Ala Ala Leu Arg Arg Arg Arg Glu Trp Gln Glu 705 710 715 720 Pro Asp Arg Leu <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGDS pattern <400> 3 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heparin binding domain XBBXBX; B = basic amino acid; X = hydropathic amino acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Xaa Asx Asx Xaa Asx Xaa 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heparin binding domain XBBBXXBX; B = basic amino acid; X = hydropathic amino acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Xaa Asx Asx Asx Xaa Xaa Asx Xaa 1 5 <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CS-1 pattern <400> 6 Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly 1 5 10 15 Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr 20 25 <210> 7 <211> 754 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein human delta 4 - Fc receptor <400> 7 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Thr Met 515 520 525 Val Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 530 535 540 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 545 550 555 560 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu Val His 580 585 590 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 595 600 605 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 610 615 620 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 625 630 635 640 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 645 650 655 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 660 665 670 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 675 680 685 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 690 695 700 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 705 710 715 720 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 725 730 735 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 740 745 750 Gly Lys <210> 8 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human soluble TNF-alpha <400> 8 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting TCR rearrangement <400> 9 caaggaaagg gaaaaaggaa gaa 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting TCR rearrangement <400> 10 ttgcccctgc agtttttgta c 21 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting TCR rearrangement <400> 11 atacgcacag tgctacaaaa cctacagaga cct 33 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting TCR rearrangement <400> 12 agcgggtggt gatggcaaag t 21 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting TCR rearrangement <400> 13 ttagatggag gatgccttaa cctta 25 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting TCR rearrangement <400> 14 cccgtgtgac tgtggaacca agtaagtaac tc 32 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting TCR rearrangement <400> 15 gacttggaga aaacatctgg ttctg 25

Claims (20)

  1. TNF-알파를 포함하는 배지 내에서 및 고정된 노치 (Notch) 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계를 포함하는, T 세포 전구체(precursor) 생성을 위한 시험관내 (in vitro) 방법.
  2. 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제, 특히 스템레게닌(StemRegenin) 1 (SR1)을 포함하는 배지 내에서 및 고정된 Notch 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계를 포함하는, T 세포 전구체 생성을 위한 시험관내 (in vitro) 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 배양 배지는 TNF-알파, 및 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제 둘 모두를 포함하는, 시험관내 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TNF-알파 및/또는 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제는 배양 배지 내에, 배양 0일차부터 존재하는, 시험관내 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD34+ 세포는 성체 공여체(adult donor)로부터 단리된, 시험관내 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 TNF-알파 및/또는 SR1의 존재 하에서 최대 10일 동안 배양되는, 시험관내 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 TNF-알파 및/또는 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제의 존재 하에서 3일 내지 7일 동안 배양되는, 시험관내 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TNF-알파 및/또는 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제는 3 ng/ml 또는 그 이상의 농도로 배양 배지에 첨가되는, 시험관내 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Notch 리간드는 IgG 단백질, 바람직하게는 IgG2 단백질의 Fc 영역에 융합된 델타 (Delta)-유사-4 리간드의 가용성 도메인인, 시험관내 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 또한 피브로넥틴 단편에 노출되며, 상기 단편은 RGDS 및 CS-1 패턴 및 또한 바람직하게는 배양 용기의 내부 표면에 고정된 헤파린-결합 도메인을 포함하는 시험관내 방법.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 피브로넥틴 단편은 레트로넥틴 (Retronectin®)인, 시험관내 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지는, CD34+ 세포가 Notch 리간드에 노출되는 적어도 일부의 시간 동안, CD34+ 세포의 형질감염 또는 형질도입을 의도하는 벡터를 또한 포함하는, 시험관내 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 인터루킨 7 (IL-7), SCF (Stem Cell Factor), 트롬보포이에틴 (TPO), 및 Flt3 리간드 (FLT3L)로 이루어지는 군에서 선택되는 사이토카인 또는 성장 인자를 적어도 3개, 바람직하게는 4개 모두 포함하는, 시험관내 방법.
  14. a. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계 및
    b. 상기 생성된 T 세포 전구체(progenitor)를 정제하는 단계,
    c. 선택적으로는 환자에게 주입하기 위한 파우치(pouch) 내에 T 세포 전구체를 컨디셔닝 (conditioning)하는 단계를 포함하는, T 세포 전구체를 수득하는 방법.
  15. 집단(population) 중 CD34- 및 CD1a- 인 세포의 비율이 50% 보다 높은, CD7+ T 세포 전구체 집단.
  16. 제15항에 따른 T 세포 전구체 집단을 포함하는, 정맥 주사용 파우치.
  17. a. TNF-알파를 포함하는 배지 내에서 및 고정된 노치 (Notch) 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계,
    b. 상기 세포를 CD34+ 세포의 형질감염 또는 형질도입을 의도하는 벡터에 노출시키는 단계를 포함하는, 형질전환된 T-세포 전구체를 수득하기 위한 시험관내 (in vitro) 방법.
  18. a. TNF-알파를 포함하는 배지 내에서 및 고정된 노치 (Notch) 리간드의 존재 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 단계,
    b. 상기 세포를 유전자 편집에 적합한 성분을 포함하는 벡터 또는 핵산 서열에 노출시키는 단계를 포함하는, 변형된 T-세포 전구체를 수득하기 위한 시험관내 (in vitro) 방법.
  19. (i) 노치 (Notch)의 리간드, 및 선택적으로는 피브로넥틴 단편을 포함하는 코팅 배지,
    (ii) CD34+ 세포 및 T 세포의 배양을 위해 조정된 배지,
    (iii) TNF-알파 및 바람직하게는 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7로 이루어지는 군에서 선택되는 3개 또는 4개의 사이토카인을 포함하는 전구체 확장 배지를 포함하는, 제1항 내지 제14항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트(kit).
  20. (i) 노치 (Notch)의 리간드, 및 선택적으로는 피브로넥틴 단편을 포함하는 코팅 배지,
    (ii) CD34+ 세포 및 T 세포의 배양을 위해 조정된 배지,
    (iii) 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체의 길항제 및 바람직하게는 SCF, TPO, Flt3L, 및 IL-7로 이루어지는 군에서 선택되는 3개 또는 4개의 사이토카인을 포함하는 전구체 확장 배지를 포함하는, 제1항 내지 제14항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트.
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