KR20190098689A - 융합 폴리펩타이드를 이용하여 글루카곤 유사 펩타이드-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법 - Google Patents
융합 폴리펩타이드를 이용하여 글루카곤 유사 펩타이드-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190098689A KR20190098689A KR1020190007168A KR20190007168A KR20190098689A KR 20190098689 A KR20190098689 A KR 20190098689A KR 1020190007168 A KR1020190007168 A KR 1020190007168A KR 20190007168 A KR20190007168 A KR 20190007168A KR 20190098689 A KR20190098689 A KR 20190098689A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- arg
- val
- gly
- ala
- glu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 401
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 160
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 151
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 146
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 title claims abstract description 77
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 title claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 20
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 95
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 86
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 84
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 80
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 67
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 43
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 35
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 34
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 34
- 239000010426 asphalt Substances 0.000 claims description 34
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 33
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 33
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 33
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 29
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 24
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 23
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 22
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 22
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 21
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 21
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 21
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 21
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 21
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 21
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 21
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 21
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 21
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 21
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 21
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 21
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 21
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 21
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 18
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 18
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 18
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 18
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 18
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000005918 Ubiquitin Thiolesterase Human genes 0.000 claims 1
- 108010005656 Ubiquitin Thiolesterase Proteins 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 441
- SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 198
- DJQIUOKSNRBTSV-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N DJQIUOKSNRBTSV-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 198
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 197
- QXEVZBXTDTVPCP-GMOBBJLQSA-N Met-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N QXEVZBXTDTVPCP-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 187
- LYSMQLXUCAKELQ-DCAQKATOSA-N His-Asp-Arg Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N LYSMQLXUCAKELQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 162
- HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 162
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 162
- 108010005652 splenotritin Proteins 0.000 description 162
- DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N Ile-Arg-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 145
- NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N Arg-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 133
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 117
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 117
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 117
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 117
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 117
- IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N 0.000 description 93
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 72
- IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 72
- 108010029384 tryptophyl-histidine Proteins 0.000 description 68
- CTNODEMQIKCZGQ-JYJNAYRXSA-N Phe-Gln-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CTNODEMQIKCZGQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 67
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 67
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 66
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 65
- WRNAXCVRSBBKGS-BQBZGAKWSA-N Glu-Gly-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WRNAXCVRSBBKGS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 65
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 65
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 52
- TZFQICWZWFNIKU-KKUMJFAQSA-N Asn-Leu-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TZFQICWZWFNIKU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 48
- KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 48
- YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N Ala-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 47
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 47
- SWSRFJZZMNLMLY-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SWSRFJZZMNLMLY-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 47
- CQZDZKRHFWJXDF-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CN CQZDZKRHFWJXDF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 46
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 44
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 44
- QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 44
- JZJGEKDPWVJOLD-QEWYBTABSA-N Glu-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JZJGEKDPWVJOLD-QEWYBTABSA-N 0.000 description 44
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N Phe-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N 0.000 description 44
- GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N Phe-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 44
- PLQWGQUNUPMNOD-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PLQWGQUNUPMNOD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 44
- MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N Thr-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 44
- WMBFONUKQXGLMU-WDSOQIARSA-N Trp-Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N WMBFONUKQXGLMU-WDSOQIARSA-N 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 30
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 description 29
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- FDKDGFGTHGJKNV-FHWLQOOXSA-N Tyr-Phe-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N FDKDGFGTHGJKNV-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 29
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 29
- AFPFGFUGETYOSY-HGNGGELXSA-N His-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AFPFGFUGETYOSY-HGNGGELXSA-N 0.000 description 28
- DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 28
- FHVCMIMUGUFIOJ-IHPCNDPISA-N Trp-His-His Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)N[C@@H](CC4=CN=CN4)C(=O)O)N FHVCMIMUGUFIOJ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 28
- VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 27
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 27
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 27
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- CTGZVVQVIBSOBB-AVGNSLFASA-N His-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CTGZVVQVIBSOBB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 25
- WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N Ile-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 25
- IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 25
- COYSIHFOCOMGCF-WPRPVWTQSA-N Val-Arg-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 25
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 25
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 25
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 24
- RJTUIDFUUHPJMP-FHWLQOOXSA-N Pro-Trp-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CC4=CN=CN4)C(=O)O RJTUIDFUUHPJMP-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 24
- OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 24
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 23
- ISSDODCYBOWWIP-GJZGRUSLSA-N Gly-Pro-Trp Chemical compound [H]NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ISSDODCYBOWWIP-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 23
- RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 23
- IWAVRIPRTCJAQO-HSHDSVGOSA-N Thr-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O IWAVRIPRTCJAQO-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 23
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 23
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 23
- BVELAHPZLYLZDJ-HGNGGELXSA-N Gln-His-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVELAHPZLYLZDJ-HGNGGELXSA-N 0.000 description 22
- HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N Glu-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 22
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 22
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 20
- AVQNTYBAFBKMDL-WDSOQIARSA-N His-Pro-Trp Chemical compound N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O AVQNTYBAFBKMDL-WDSOQIARSA-N 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 16
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 13
- ZEDVFJPQNNBMST-CYDGBPFRSA-N Met-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZEDVFJPQNNBMST-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 12
- XMMWDTUFTZMQFD-GMOBBJLQSA-N Met-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC XMMWDTUFTZMQFD-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 12
- MVMNUCOHQGYYKB-PEDHHIEDSA-N Met-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N MVMNUCOHQGYYKB-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 12
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 12
- BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N Arg-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 11
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 11
- OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N Arg-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 11
- WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 11
- WKPXXXUSUHAXDE-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O WKPXXXUSUHAXDE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 11
- HNJNAMGZQZPSRE-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HNJNAMGZQZPSRE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 11
- OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 11
- UULLJGQFCDXVTQ-CYDGBPFRSA-N Arg-Pro-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O UULLJGQFCDXVTQ-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 11
- BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N Asn-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 11
- YFGUZQQCSDZRBN-DCAQKATOSA-N Asp-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YFGUZQQCSDZRBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 11
- IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N Ile-Pro-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 11
- SBSIKVMCCJUCBZ-GUBZILKMSA-N Met-Asn-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N SBSIKVMCCJUCBZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 11
- FRWZTWWOORIIBA-FXQIFTODSA-N Met-Asn-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N FRWZTWWOORIIBA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 11
- IVCPHARVJUYDPA-FXQIFTODSA-N Met-Asn-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N IVCPHARVJUYDPA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N Arg-Asp-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 9
- FMYQECOAIFGQGU-CYDGBPFRSA-N Arg-Val-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FMYQECOAIFGQGU-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 9
- WVCJSDCHTUTONA-FXQIFTODSA-N Asn-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WVCJSDCHTUTONA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 9
- JGDBHIVECJGXJA-FXQIFTODSA-N Asp-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JGDBHIVECJGXJA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- UMYZBHKAVTXWIW-GMOBBJLQSA-N Ile-Asp-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N UMYZBHKAVTXWIW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 9
- GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 9
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 description 6
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 5
- YJIUYQKQBBQYHZ-ACZMJKKPSA-N Gln-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YJIUYQKQBBQYHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 5
- STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N His-His-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 4
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 4
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 4
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 3
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QVVDVENEPNODSI-BTNSXGMBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylidene Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QVVDVENEPNODSI-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- 102100024341 10 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010059013 Chaperonin 10 Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N Met-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000008880 Peptidase C12, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108050000823 Peptidase C12, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 108010091617 pentalysine Proteins 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102220195310 rs1057517867 Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N Arg-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QHVRVUNEAIFTEK-SZMVWBNQSA-N Arg-Pro-Trp Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O QHVRVUNEAIFTEK-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- YWFLXGZHZXXINF-BPUTZDHNSA-N Asn-Pro-Trp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 YWFLXGZHZXXINF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- SXLCDCZHNCLFGZ-BPUTZDHNSA-N Asp-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O SXLCDCZHNCLFGZ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- DMHGKBGOUAJRHU-RVMXOQNASA-N Ile-Arg-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DMHGKBGOUAJRHU-RVMXOQNASA-N 0.000 description 1
- MTFVYKQRLXYAQN-LAEOZQHASA-N Ile-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O MTFVYKQRLXYAQN-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- AKQFLPNANHNTLP-VKOGCVSHSA-N Ile-Pro-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N AKQFLPNANHNTLP-VKOGCVSHSA-N 0.000 description 1
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WGNOPSQMIQERPK-UHFFFAOYSA-N Leu-Asn-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(=O)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O WGNOPSQMIQERPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N Met-Asn Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- KLAONOISLHWJEE-QWRGUYRKSA-N Phe-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KLAONOISLHWJEE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- FYPGHGXAOZTOBO-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 FYPGHGXAOZTOBO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040576 Shock hypoglycaemic Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000030135 gastric motility Effects 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000008062 guanidine hydrochloride buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 101150084046 pep gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- -1 thiorredoxin Proteins 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 N-말단 융합 파트너와 글루카곤 유사 펩타이드-1 또는 이의 유사체를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 이용하여 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 유전자 재조합 기술로 GLP-1 또는 이의 유사체 생산시 수율을 향상시킬 수 있으며, 숙주세포의 단백질 분해효소로부터 분해를 최소화하여 안정적으로 GLP-1 또는 이의 유사체를 발현시킬 수 있다.
Description
본 발명은 N-말단 융합 파트너와 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 또는 이의 유사체를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 이용하여 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린 분비의 결함, 인슐린 작용의 결함 또는 두 가지 모두의 결함으로 인하여 혈당이 높아지는 대사질환이다. 당뇨병은 크게 두 가지 유형으로 분류되며, 인슐린 의존형 제1형 당뇨병과 인슐린 비의존형(인슐린 저항성) 제2형 당뇨병으로 나뉜다.
현재 제2형 당뇨병은 전체 당뇨병의 90% 내지 95%를 차지한다. 제2형 당뇨병은 그 기전이 명확하게 밝혀지지 않은 복합 질환으로 사춘기 때 나타날 수도 있지만 대개 성인에서 발생한다. 제2형 당뇨병을 가진 환자들은 관상동맥질환, 뇌졸증, 말초혈관 질환, 고혈압, 신장병, 신경장애 및 망막증을 포함하는, 거대혈관 및 미세혈관의 합병증을 나타낸다. 이와 관련하여, 당뇨병 치료법의 발전에도 불구하고, 최적의 혈당 조절을 달성하는 데에 있어서 저혈당 쇼크가 종종 제한 요인이 된다.
한편, 당뇨병의 치료 및 예방을 위해 체내 활성 물질 중 하나로서 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)이 사용되고 있다. GLP-1은 포도당 의존성 인슐린 분비를 자극하는 반면 글루카곤 분비는 억제하는 것을 유도하는 호르몬이다. 현재 제2형 당뇨병의 치료제로서 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산하기 위한 여러가지 방법이 제시되고 있다. 최근에는 유전자 재조합 기술을 이용하여 GLP-1을 대량 생산하려는 시도도 이루어지고 있다
유전자 재조합 기술은 여러 중요한 단백질들의 핵산을 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고, 이를 적당한 숙주세포에 형질도입시켜 배양함으로써 타겟 단백질을 생산하는 방법이다. 다만, 숙주세포에 내재된 분해 효소에 의해 타겟 단백질이 분해되어 수율이 낮아지거나, 융합 파트너를 사용할 경우 펩타이드의 크기가 제조하고자 하는 타겟 단백질의 크기에 비해 너무 커서 수율이 현저히 떨어지는 문제가 있다.
따라서, 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 GLP-1 또는 이의 유사체를 대량 생산하고자 하는 경우, 해당 폴리펩타이드를 안정적으로 발현시키면서도 생산 수율을 향상시킬 수 있는 융합 파트너를 개발하는 것이 중요하다.
이에 본 발명자들은 GLP-1 또는 이의 유사체를 안정적으로 발현시키면서 생산 수율을 향상시킬 수 있는 융합 파트너를 개발하기 위해 연구한 결과, 본 발명에 따른 N-말단 융합 파트너와 GLP-1 또는 이의 유사체를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 이용하여 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산할 경우, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산 수율이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, (a) 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합 파트너; 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon like peptide-1; GLP-1) 또는 이의 유사체; 및 상기 N-말단 융합 파트너와, 상기 GLP-1 또는 이의 유사체 사이에 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계; (c) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; (d) 상기 숙주세포에서 발현된 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계; 및 (e) 상기 정제된 융합 폴리펩타이드를 절단 효소와 배양하여 GLP-1 또는 이의 유사체를 회수하는 단계를 포함하는 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법을 제공한다:
[일반식 1]
Met-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Z)n
상기 일반식 1에서,
Xaa1 내지 Xaa6은, 서로 독립적으로, 이소루신(Ile, I), 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 프롤린(Pro, P), 발린(Val, V), 루신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 트립토판(Trp, W), 아스파라긴(Asn, N), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 아르기닌(Arg, R), 리신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 아스팔트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 기존에 알려진 융합 파트너 대비 작은 분자량을 갖는 신규한 융합 파트너를 포함한다. 이러한, 분자량이 작은 융합 파트너를 이용함으로써, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산 수율을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 숙주세포 내에서 내포체 형태로 발현을 유도함으로써 숙주세포의 단백질 분해효소로부터 분해를 방지하여 안정적으로 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 종래의 융합 파트너를 사용한 경우보다 안정성 및 수율이 향상된 GLP-1 또는 이의 유사체의 생산 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 재조합 대장균에서 생산된 총 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 1: H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG005), 레인 2: PG07-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG006), 레인 3: PG15-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG007), 레인 4: PG22-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG008), 레인 5: PG29-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG009), 레인 6: PG36-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG010), 레인 7: PG43-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG011)).
도 2는 재조합 대장균의 총세포 분획을 가용성 및 불용성 분획으로 분리한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 T: 총 분획, 레인 S: 가용성 분획, 레인 I: 불용성 분획, 레인 1: H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG005), 레인 2: PG07-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG006), 레인 3: PG15-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG007), 레인 4: PG22-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG008)).
도 3은 재조합 대장균의 총세포 분획을 가용성 및 불용성 분획으로 분리한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 T: 총 분획, 레인 S: 가용성 분획, 레인 I: 불용성 분획, 레인 5: PG29-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG009), 레인 6: PG36-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG010), 레인 7: PG43-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG011)).
도 4는 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 2번째 또는 3번째 아미노산 잔기를 이소루신(I), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 아스팔트산(D)으로 치환한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체를 SDS-PAGE로 분석한 후 결과이다.
도 5는 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 4번째 또는 5번째 아미노산 잔기를 이소루신(I), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 아스팔트산(D)으로 치환한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체를 SDS-PAGE로 분석한 후 결과이다.
도 6은 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 6번째 또는 7번째 아미노산 잔기를 이소루신(I), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 아스팔트산(D)으로 치환한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체를 SDS-PAGE로 분석한 후 결과이다.
도 7은 크로마토그래피를 통해 불용성 분획 내의 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 정제한 결과이다(크로마토그램에서 청색, 녹색 선들은 각각 280 nm 파장에서의 흡광도, 용출 완충액의 비율을 나타냄).
도 8은 크로마토그래피를 통해 정제한 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 S: 정제 전 시료, FT: 통과액 분획, 레인 E: 용출액 분획). 화살표는 PG43-H6TEV-GLP-1 K28R 융합 폴리펩타이드를 나타낸다.
도 9는 TEV 프로테아제를 이용한 정제된 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 절단 후 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 C: TEV 프로테아제를 처리하지 않은 시료, 레인 T: TEV 프로테아제를 처리한 시료).
도 10은 본 발명에 따라 정제된 GLP-1K28R의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 대장균의 총세포 분획을 가용성 및 불용성 분획으로 분리한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 T: 총 분획, 레인 S: 가용성 분획, 레인 I: 불용성 분획, 레인 1: H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG005), 레인 2: PG07-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG006), 레인 3: PG15-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG007), 레인 4: PG22-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG008)).
도 3은 재조합 대장균의 총세포 분획을 가용성 및 불용성 분획으로 분리한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 T: 총 분획, 레인 S: 가용성 분획, 레인 I: 불용성 분획, 레인 5: PG29-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG009), 레인 6: PG36-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG010), 레인 7: PG43-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG011)).
도 4는 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 2번째 또는 3번째 아미노산 잔기를 이소루신(I), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 아스팔트산(D)으로 치환한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체를 SDS-PAGE로 분석한 후 결과이다.
도 5는 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 4번째 또는 5번째 아미노산 잔기를 이소루신(I), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 아스팔트산(D)으로 치환한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체를 SDS-PAGE로 분석한 후 결과이다.
도 6은 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 6번째 또는 7번째 아미노산 잔기를 이소루신(I), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 아스팔트산(D)으로 치환한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체를 SDS-PAGE로 분석한 후 결과이다.
도 7은 크로마토그래피를 통해 불용성 분획 내의 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 정제한 결과이다(크로마토그램에서 청색, 녹색 선들은 각각 280 nm 파장에서의 흡광도, 용출 완충액의 비율을 나타냄).
도 8은 크로마토그래피를 통해 정제한 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 S: 정제 전 시료, FT: 통과액 분획, 레인 E: 용출액 분획). 화살표는 PG43-H6TEV-GLP-1 K28R 융합 폴리펩타이드를 나타낸다.
도 9는 TEV 프로테아제를 이용한 정제된 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 절단 후 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 C: TEV 프로테아제를 처리하지 않은 시료, 레인 T: TEV 프로테아제를 처리한 시료).
도 10은 본 발명에 따라 정제된 GLP-1K28R의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, (a) 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합 파트너; 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon like peptide-1; GLP-1) 또는 이의 유사체; 및 상기 N-말단 융합 파트너와, 상기 GLP-1 또는 이의 유사체 사이에 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계; (c) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; (d) 상기 숙주세포에서 발현된 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계; 및 (e) 상기 정제된 융합 폴리펩타이드를 절단 효소와 배양하여 GLP-1 또는 이의 유사체를 회수하는 단계를 포함하는 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법을 제공한다:
[일반식 1]
Met-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Z)n
상기 일반식 1에서,
Xaa1 내지 Xaa6은, 서로 독립적으로, 이소루신(Ile, I), 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 프롤린(Pro, P), 발린(Val, V), 루신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 트립토판(Trp, W), 아스파라긴(Asn, N), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 아르기닌(Arg, R), 리신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 아스팔트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
먼저, 상기 (a) 단계에서는, 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합 파트너; 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon like peptide-1; GLP-1) 또는 이의 유사체; 및 상기 N-말단 융합 파트너와, 상기 GLP-1 또는 이의 유사체 사이에 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제조한다.
상기 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)는 31개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드이다. 상기 GLP-1은 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 저해, 위 운동성 또는 장 운동성 저해, 및 체중 감량 유도와 같은 기능이 있는 호르몬이다. 구체적으로, 상기 GLP-1은 서열번호 151의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 GLP-1은 서열번호 293으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
또한, GLP-1의 유사체는 상기 GLP-1과 유사한 기능을 갖는 펩타이드이다. 예를 들어, 그 활성이 유지되거나 향상되는 범위 내에서, 천연 GLP-1와 비교하여 아미노산의 치환, 첨가 및/또는 결실에 따른 변이를 갖는 펩타이드일 수 있다.
일례로, 리라글루타이드는 GLP-1의 유사체로서 GLP-1의 28번째 라이신이 아르기닌으로 치환(K28R)되어 있으며, 20번째 라이신 잔기의 아미노 그룹에 팔미트산과 글루탐산으로 구성된 N-Palmitoyl-L-glutamic acid가 결합되어 있는 형태를 갖는다. 상기 리라글루타이드는 제2형 당뇨병 또는 비만을 치료제로 사용될 수 있으며, 일반적으로 리라글루타이드는 N-Palmitoyl-L-glutamic acid가 결합되어 있지 않은 리라글루타이드 전구체 펩타이드(GLP-1K28R)를 생산하고, 이의 20번째 라이신 잔기에 N-Palmitoyl-L-glutamic acid를 결합시키는 공정으로 생산할 수 있다(Dunweber, Jensen et al. 2007). 구체적으로, 상기 GLP-1K28R은 서열번호 152의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 GLP-1K28R는 서열번호 294로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
재조합 미생물 시스템을 이용하여 목적 폴리펩타이드를 생산하는 경우, 그 타겟 물질의 물성에 따라 숙주세포 내 효소에 의해 분해될 수 있다. 또한, 목적 폴리펩타이드가 낮은 수준으로 발현될 수 있을 뿐만 아니라 부적절한 단백질 폴딩 등으로 인해 목적 단백질의 수율이 저하될 우려가 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 융합 파트너를 이용하고 있으나 아직도 개선되어야 할 문제점이 존재한다. 예를 들어, 종래 융합 파트너로 활용되는 MBP (maltose binding protein), 글루타티온 S-전달효소(glutathione-S-transferase), 티오레독신(thioredoxin), SUMO, 유비퀴틴 등은 각각 397, 216, 106, 101, 76 개의 아미노산을 갖는데, 비교적 저분자량의 목적 폴리펩타이드 등을 생산시 수율이 좋지 못한 문제가 있었다.
이에 반해, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개 내지 43개의 아미노산으로 이루어진 분자량이 작은 펩타이드이다. 이를 적용하여 GLP-1 또는 이의 유사체를 생산하는 경우 기존의 융합 파트너들을 활용한 경우보다 향상된 수율로 GLP-1 또는 이의 유사체를 수득할 수 있다. 예를 들어, 재조합 융합 폴리펩타이드에서 GLP-1의 유사체로서 GLP-1K28R의 비율을 아래 표 1에 나타내었다.
| 융합 파트너 | 아미노산 개수 | 분자량 (kDa) | GLP-1K28R 비율 (%)* |
| MBP(Maltose binding protein) | 397 | 44.2 | 7 |
| 글루타티온 S-전달효소 | 216 | 23.8 | 12 |
| 티오레독신 | 106 | 11.7 | 21 |
| SUMO | 101 | 11.1 | 22 |
| 유비퀴틴 | 76 | 8.4 | 27 |
| 서열번호 9, 31, 53, 75, 97 또는 119의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 N-말단 융합 파트너 | 7 - 43 | 0.8 - 4.7 | 60 - 35 |
*링커 부분을 포함하여 계산
표 1에 나타난 바와 같이, 종래의 융합 파트너들은 융합 폴리펩타이드에서 GLP-1K28R의 비율이 7% 내지 27%에 그치는 반면, 본 발명에 따른 융합 파트너가 융합된 융합 폴리펩타이드에서의 GLP-1K28R의 비율은 35% 내지 60%로 확인된다. 따라서, 동일한 농도의 융합 폴리펩타이드로부터 얻을 수 있는 GLP-1K28R의 양이 종래 융합 파트너 대비 더 높으므로 최종 생산 수율이 향상될 수 있다.
또한, 상기 융합 파트너는 융합 폴리펩타이드의 불용성 발현을 유도하여 융합 폴리펩타이드가 불용성 내포체로서 숙주세포 내로 고농도로 축적되게 할 수 있다. 따라서, 대장균(Escherichia coli) 등의 숙주세포 내에서 프로테아제 및 펩티다제에 의해 전부 혹은 일부가 분해 혹은 절단될 우려가 있는 GLP-1 또는 이의 유사체를 고수율로 수득하기 용이한 장점이 있다.
상기 N-말단 융합 파트너에 있어서, 상기 Xaa1 내지 Xaa6은, 서로 독립적으로, 이소루신(Ile, I), 프롤린(Pro, P), 루신(Leu, L), 아스파라긴(Asn, N), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H) 및 아스팔트산(Asp, D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 N-말단 융합 파트너에 있어서, 상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 N-말단 융합파트너는 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[일반식 2]
Met-Xaa1-Ile-Arg-Pro-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 2에서,
Xaa1은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
또한, 상기 Xaa1은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 Xaa1은 이소루신(Ile, I), 아스파라긴(Asn, N), 아르기닌(Arg, R) 및 아스팔트산(Asp, D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다.
일 구체예로, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 8, 30, 52, 74, 96 또는 118의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 161, 183, 205, 227, 249 또는 271의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa1은 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 9, 31, 53, 75, 97 또는 119의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 162, 184, 206, 228, 250 또는 272의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa1은 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 10, 32, 54, 76, 98 또는 120의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 163, 185, 207, 229, 251 또는 273의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa1은 아스팔트산 또는 글루탐산일 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 11, 33, 55, 77, 99 또는 121의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 164, 186, 208, 230, 252 또는 274의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 N-말단 융합파트너는 하기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[일반식 3]
Met-Asn-Xaa2-Arg-Pro-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 3에서,
Xaa2는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
구체적으로, 상기 Xaa2는 이소루신(Ile, I), 아스파라긴(Asn, N), 아르기닌(Arg, R) 및 아스팔트산(Asp, D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다.
또한, 상기 Xaa2는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구체예로, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 9, 31, 53, 75, 97 또는 119의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 162, 184, 206, 228, 250 또는 272의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa2는 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 12, 34, 56, 78, 100 또는 122의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 165, 187, 209, 231, 253 또는 275의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa2는 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 13, 35, 57, 79, 101 또는 123의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 166, 188, 210, 232, 254 또는 276의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa2는 아스팔트산 또는 글루탐산일 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 14, 36, 58, 80, 102 또는 124의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 167, 189, 211, 233, 255 또는 277의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 N-말단 융합파트너는 하기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[일반식 4]
Met-Asn-Ile-Xaa3-Pro-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 4에서,
Xaa3은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
또한, 상기 Xaa3은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 Xaa3은 이소루신(Ile, I), 아스파라긴(Asn, N), 아르기닌(Arg, R) 및 아스팔트산(Asp, D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다.
일 구체예로, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 15, 37, 59, 81, 103 또는 125의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 168, 190, 212, 234, 256 또는 278의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa3은 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 16, 38, 60, 82, 104 또는 126의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 169, 191, 213, 235, 257 또는 279의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa3은 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 9, 31, 53, 75, 97 또는 119의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 162, 184, 206, 228, 250 또는 272의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa3은 아스팔트산 또는 글루탐산일 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 17, 39, 61, 83, 105 또는 127의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 170, 192, 213, 236, 258 또는 280의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 N-말단 융합파트너가 하기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[일반식 5]
Met-Asn-Ile-Arg-Xaa4-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 5에서,
Xaa4는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
또한, 상기 Xaa4는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 Xaa4는 이소루신(Ile, I), 아스파라긴(Asn, N), 아르기닌(Arg, R) 및 아스팔트산(Asp, D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다.
일 구체예로, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 8, 40, 62, 84, 106 또는 128의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 171, 193, 215, 237, 259 또는 281의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa4는 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 19, 41, 63, 85, 107 또는 129의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 172, 194, 216, 238, 260 또는 282의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa4는 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 20, 42, 64, 86, 108 또는 130의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 173, 195, 217, 239, 261 또는 283의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa4는 아스팔트산 또는 글루탐산일 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 21, 43, 65, 87, 190 또는 131의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 174, 196, 218, 240, 262 또는 284의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 N-말단 융합파트너는 하기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[일반식 6]
Met-Asn-Ile-Arg-Pro-Xaa5-His-(Z)n
상기 일반식 6에서,
Xaa5는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
또한, 상기 Xaa5는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 Xaa5는 이소루신(Ile, I), 아스파라긴(Asn, N), 아르기닌(Arg, R) 및 아스팔트산(Asp, D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다.
일 구체예로, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 22, 44, 66, 88, 110 또는 132의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 175, 197, 219, 241, 263 또는 285의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa5는 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 23, 45, 67, 89, 111 또는 135의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 176, 198, 220, 242, 264 또는 286의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa5는 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 24, 46, 68, 90, 112 또는 134의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 177, 199, 221, 243, 265 또는 287의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa5는 아스팔트산 또는 글루탐산일 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 25, 47, 69, 91, 113 또는 135의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 178, 200, 222, 244, 266 또는 288의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 N-말단 융합파트너는 하기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[일반식 7]
Met-Asn-Ile-Arg-Pro-Leu-Xaa6-(Z)n
상기 일반식 7에서,
Xaa6은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다.
또한, 상기 Xaa6은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 Xaa6은 이소루신(Ile, I), 아스파라긴(Asn, N), 아르기닌(Arg, R) 및 아스팔트산(Asp, D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다.
일 구체예로, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 26, 48, 70, 92, 114 또는 136의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 179, 201, 223, 245, 267 또는 289의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa6은 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 27, 49, 71, 93, 115 또는 137의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 180, 202, 224, 246, 268 또는 290의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa6은 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 28, 50, 72, 94, 116 또는 138의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 181, 203, 225, 247, 269 또는 291의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 Xaa6은 아스팔트산 또는 글루탐산일 수 있다. 일 구체예로, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합파트너는 서열번호 29, 51, 73, 95, 117 또는 139의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 서열번호 182, 204, 226, 248, 270 또는 292의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 일반식 1 내지 7에 있어서, 상기 n이 O의 정수인 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 본 발명에서 7개의 아미노산으로 이루어진 N-말단 융합 파트너를 "PG07"로 명명하였다. 또한, 상기 n이 1의 정수인 경우, 상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 8개, 15개, 22개, 29개 또는 36개의 아미노산일 수 있다. 이 경우, 상기 N-말단 융합 파트너는 15개, 22개, 29개, 36개 또는 43개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 본 발명에서 15개, 22개, 29개, 36개 또는 43개의 아미노산으로 이루어진 N-말단 융합 파트너를 각각 순서대로"PG15", "PG22", "PG29", "PG36", "PG43"으로 명명하였다.
상기 N-말단 융합 파트너는 샤페로닌 10(chaperonin 10, GroES proteon)의 N-말단 유도체일 수 있다. 또한, 상기 N-말단 융합 파트너는 7개 내지 43개의 아미노산을 갖는 펩타이드로서, 서열번호 119의 N-말단에서 C-말단으로 7개 내지 43개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 N-말단 융합 파트너는 서열번호 8 내지 139 중 어느 하나의 아미노산 서열으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 융합 파트너의 아미노산 갯수는 목적 폴리펩타이드의 특성에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 7개, 8개, 9개, 10개, 13개, 15개, 17개, 22개, 25개, 27개, 29개, 30개, 33개, 38개, 40개, 43개 등일 수 있다. 일 구체예로서, 상기 N-말단 융합 파트너는 서열번호 9, 31, 53, 75, 97 또는 119로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 융합 폴리펩타이드는 융합 파트너와 GLP-1 또는 이의 유사체 사이에 링커를 포함할 수 있으며, 상기 링커는 친화성 태그를 포함할 수 있다.
본원에서 용어 "친화성 태그"는 재조합 융합 폴리펩타타이드 또는 이를 코딩하는 핵산에 도입될 수 있는 펩타이드 또는 핵산 서열로서 다양한 목적으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 GLP-1 또는 이의 유사체의 정제 효율을 높이기 위한 것일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 친화성 태그는 당 업계에 공지된 임의의 적합한 물질을 원하는 바에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그(H6 또는 H10; 서열번호 140 또는 141), 폴리라이신 태그(K6 또는 K10; 서열번호 142 또는 143), 또는 폴리아르기닌 태그(R6 또는 R10; 서열번호 144 또는 145)일 수 있다.
또한, 상기 링커는 프로테아제 인식서열을 포함할 수 있다. 프로테아제란, 특정 아미노산 서열을 인식하여, 인식한 서열 내의 펩타이드 결합이나 그 서열의 마지막 아미노산과 융합된 폴리펩타이드의 첫번째 아미노산과의 펩타이드 결합을 절단하는 단백질 분해효소이다. 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 프로테아제 인식서열을 갖는 링커를 포함함으로써, 최종 단계에서 GLP-1 또는 이의 유사체 정제시 절단효소 인식서열이 포함된 아미노 말단(친화성 태그를 사용한 경우에는 친화성 태그도 포함)과 GLP-1 또는 이의 유사체의 N-말단을 분리시켜 GLP-1 또는 이의 유사체를 회수할 수 있다.
구체적으로, 상기 프로테아제 인식서열은 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식서열, 엔테로키나아제 인식서열, 유비퀴틴 가수분해효소 인식서열, 인자 Xa 인식서열, 퓨린 인식서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
구체적으로, 상기 프로테아제 인식서열은 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식서열, 엔테로키나아제 인식서열, 유비퀴틴 가수분해효소 인식서열, 인자 Xa 인식서열, 퓨린 인식서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
구체적으로, 상기 프로테아제 인식서열은 담배 식각 바이러스 프로테아제, 엔테로키나아제, 유비퀴틴 가수분해효소, 인자 Xa, 퓨린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인식서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 프로테아제 인식서열은 서열번호 146 내지 150의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 융합 파트너, 링커 및 GLP-1 또는 이의 유사체를 포함하는 신규한 융합 폴리펩타이드는 서열번호 161 내지 292의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 전술한 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공할 수 있고, 예를 들어, 서열번호 161 내지 292의 아미노산 서열 중 어느 하나를 코딩할 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 296 또는 서열번호 301 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 (b) 단계에서는, (a) 단계에서 제조한 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질도입 시킨다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주세포에 도입되어 숙주세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는, 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 수단을 의미한다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "숙주세포"는 재조합 발현벡터가 도입될 수 있는 원핵세포 또는 진핵세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 용어, "형질도입"은, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는, 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드가 포함되도록 형질전환되어, GLP-1 또는 이의 유사체의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 숙주세포는 대장균 세포, 불사의 하이브리도마 세포, NS/0 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, 인간 양수 유래 세포(CapT cell) 또는 COS 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 융합 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용된 숙주 균주는 대장균 BL21(DE3)이며, 상기 유전자 및 이들의 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다.
상기 (c) 단계에서는, 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 갖는 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 배양한다.
이때, 상기 숙주세포는 임의의 발효 방식으로 배양될 수 있다, 예를 들어, 회분식, 유가식, 반연속식 및 연속식 발효 방식이 이용될 수 있다. 실시예에서, 발효 배지는 복합 배지 혹은 제한 배지로부터 선택될 수 있다. 특정 실시예에서, 제한 배지가 선택된다. 제한 배지는 낮은 수준의 아미노산, 티아민과 같은 비타민 또는 다른 성분들로 보충될 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 배양 절차 및 무기염 배지의 상세한 설명은 문헌(Riesenberg, Schulz et al. 1991)에 기재되어 있다.
예를 들어, 융합 폴리펩타이드의 생산은 발효기 배양에서 달성될 수 있다. 예를 들어, 2 L의 제한 배지를 함유하는 발효기에서 37℃의 온도에서 배양하고, 염산이나 암모니아 첨가를 통해 pH 6.8로 유지할 수 있다. 용존 산소는 교반 속도 및 발효기 내로 공기 유속(air flow rate) 증가, 또는 필요에 따라 순수산소 주입을 통해 과량으로 유지할 수 있다. 발효기 내의 세포를 고농도로 배양하기 위해 세포 배양 동안 포도당 혹은 글리세롤이 포함된 주입 용액(feeding solution)을 배양액에 전달할 수 있다.
또한, 상기 조건을 유지하다가, 유도를 위한 목표 배양액의 광학 밀도(optical density), 예를 들어, 600 nm 파장에서 특정 값의 광학 밀도(A600)에 도달하면, IPTG를 첨가하여 융합 폴리펩타이드의 발현이 개시될 수 있다. 유도 시 세포의 광학 밀도, IPTG 농도, pH, 온도, 용존 산소 수준, 각각을 변화시켜 최적의 발현 조건을 결정할 수 있다. 또한, 유도 시 세포의 광학 밀도는 A600 30 내지 300의 범위에서 변화시킬 수 있다. IPTG 농도는 0.01 mM 내지 1.0 mM 범위로, pH는 5.5 내지 7.5 범위로, 온도는 15℃ 내지 37℃ 범위로, 그리고 공기 유속은 1 vvm(분당 배지 리터당 공기 리터) 내지 5 vvm 범위로 변화시킬 수 있다. 유도 후 4시간 내지 48시간 후에, 발효기로부터의 배양액을 원심분리하여 세포를 수거하고, 세포 펠렛은 -80℃ 온도에서 냉동할 수 있다. 배양액 시료는 재조합 융합 폴리펩타이드 발현 정도 분석을 위해 SDS-PAGE 등의 방법으로 분석할 수 있다.
한편, 숙주세포 배양은 15℃ 내지 40℃의 온도 및 약 5.5 내지 약 7.5의 pH 조건에서 행해질 수 있다. Lac 계열 프로모터를 가진 발현 구조물이 사용될 때, 발현은 IPTG를 약 0.01 mM 내지 약 1.0 mM의 최종 농도로 배양물에 첨가하여 유도할 수 있다.
유도제를 첨가한 후, 배양액은 일정 기간, 예를 들어, 약 12시간 동안 배양할 수 있는데, 이 기간에 재조합 단백질이 발현된다. 유도제를 첨가한 후, 배양액은 약 4시간 내지 48시간 동안 배양할 수 있다
세포 배양액은 원심분리하여 세포가 존재하지 않는 배지(상등액)를 제거하고 세포를 회수할 수 있다. 예를 들어, 세포배양액은 12,000 rpm 조건에서 30분간(4℃) 원심분리하고 상등액을 제거하여 불용성 분획을 얻을 수 있다. 원심분리에 의해 얻은 불용성 분획에 불용성 내포체 형태로 존재하는 재조합 융합 폴리펩타이드의 가용화를 위해 불용성 분획을 요소나 염산구아니딘과 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)가 포함된 완충액으로 재현탁할 수 있다. 실시예에서, 세포는 고압 기계적 세포 파쇄 장치(예를 들어, 마이크로플루다이저(Microfluidizer))를 사용하여 파괴한다. 재현탁된 세포는 예를 들어, 초음파 처리를 사용하여 파괴할 수 있다.
당업계에 공지된, 세포를 용해시키는데 적합한 임의의 방법을 이용하여 세포 내 축적된 내포체들을 회수할 수 있다. 예를 들어, 실시양태에서, 화학적 및/또는 효소적 세포 용해 시약, 예를 들어, 세포벽 용해 효소(lysozyme) 및 EDTA가 사용될 수 있다.
상기 (d) 단계에서는, 상기 (c)단계에서 배양한 숙주세포에서 발현된 융합 폴리펩타이드를 정제한다.
이때, 불용성 분획에는 불용성 내포체 형태로 발현된 융합 폴리펩타이드가 주로 존재한다. 불용성 분획에 존재하는 내포체의 가용화는 카오트로픽제가 포함된 변성 조건하에서 수행할 수 있다. 내포체 가용화 조건은, 카오트로픽제가 포함된 완충액의 사용을 포함할 수 있고, 내포체 가용화 완충액은 카오트로픽제로 요소 또는 염산구아니딘, 인산나트륨 또는 트리스 완충액 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 또한, 친화성 크로마토그래피를 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 수행하는 경우, 내포체 가용화 완충액은 이미다졸을 포함할 수 있다. 실시예에서, 내포체 가용화 완충액은 4 M 내지 10 M의 요소 또는 3 M 내지 8 M의 염산구아니딘을 포함할 수 있다. 또한, 내포체 가용화 완충액은 5 mM 내지 100 mM 인산나트륨 또는 트리스(pH 7 내지 9)를 포함할 수 있다. 내포체 가용화 완충액은 0 M 내지 1 M 염화나트륨을 포함할 수 있다. 또한, IMAC을 위한 내포체 가용화 완충액은 0 mM 내지 50 mM의 이미다졸을 포함할 수 있다. 이때, 내포체 가용화 완충액은, 8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 50 mM 이미다졸, pH 7.4를 포함하고, 용해된 세포의 원심분리로 얻어진 불용성 분획을 재현탁하여 불용성 분획의 융합 폴리펩타이드의 내포체를 가용화할 수 있다.
예를 들어, 내포체 가용화 완충액으로 불용성 분획의 내포체를 가용화 시키는 경우, 2℃ 내지 8℃ 온도에서 약 1시간 내지 6시간 동안 진탕 배양한 후 12,000 rpm (12,000Хg) 조건에서 30분간(4℃) 원심분리하여 불용성 분획에 존재하는 파쇄된 세포 잔해를 제거하고 가용화된 융합 폴리펩타이드가 포함되어 있는 상등액을 얻는다. 상등액은 적층형 필터(depth filter) 및 막 필터로 여과하여 불용성 및 고형 성분을 제거하여 정제용 컬럼에 주입될 수 있도록 한다.
또한, 불용성 내포체 형태로 발현된 후 가용화된 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 목적 폴리펩타이드는 크기 배제, 음이온 또는 양이온 교환, 소수성 상호작용, 또는 친화성 크로마토그래피 방법에 의해 다른 단백질 및 세포 잔해로부터 분리하거나 정제할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 폴리히스티딘 태그(6-histidine tag)가 포함되어 있으므로 Ni-sepharose FF가 충진되어 있는 HisTrap FF 5 mL 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 정제할 수 있다. 가용화된 재조합 융합 폴리펩타이드는 AKTA pure 25 크로마토그래피 시스템에 장착된 S9 시료 펌프를 이용하여 내포체 가용화 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 50 mM 이미다졸, pH 7.4)으로 평형화된 HisTrap FF 5 mL 컬럼 내로 주입되도록 하고, 내포체 가용화 완충액으로 세척 후 용출 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4)의 비율을 100%로 단계적 증가시켜 컬럼에 결합된 융합 폴리펩타이드를 용출시키고 분획을 수집할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는, 융합 파트너와 목적 폴리펩타이드인 GLP-1 또는 이의 유사체 등이 서로 상이한 등전점을 가짐으로써 목적 폴리펩타이드를 고순도로 용이하게 정제될 수 있다. 단백질의 등전점(isoelectric point, pI)은 단백질이 순 전하를 띠지 않는 pH로, 단백질은 이의 등전점에 따라 분리될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 서열번호 9, 31, 53, 75, 97 또는 119의 아미노산 서열 아미노산 서열로 이루어진 융합 파트너의 pI 값은 각각 9.52, 11.72, 10.27, 10.27, 10.43, 10.42일 수 있다. 또한, 상기 각각의 N-말단 융합 파트너 C-말단에 정제용 태그(서열번호 140) 및 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식서열(서열번호 146)이 융합된 서열번호 154 내지 159의 아미노산 서열을 갖는 융합 파트너의 pI 값은 각각 7.06, 10.27, 9.52, 9.52, 9.82, 9.30이며, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 pI 값은 5.53이다. 즉, GLP-1 또는 이의 유사체의 pI 값과 N-말단 융합 파트너 및 이를 포함하는 융합 파트너들의 pI 값은 실질적으로 상이하다. 따라서, 이온 교환 크로마토그래피, 등전점 침전법 등의 방법을 이용하여 융합 파트너로부터 목적 GLP-1 또는 이의 유사체의 정제를 이온 교환 크로마토그래피, 등전점 침전법 등의 방법을 이용하여 용이하게 할 수 있다.
상기 (e) 단계에서는, 전술한 방법으로 정제된 융합 폴리펩타이드를 절단 효소와 배양하여 GLP-1 또는 이의 유사체(GLP-1K28R)를 회수한다.
이때, 융합 폴리펩타이드는 절단효소에 의해 적합하게 절단될 수 있어, GLP-1 또는 GLP-1K28R를 적합한 형태로 유리시킬 수 있다. 정제된 융합 폴리펩타이드 분획에는 8 M의 요소가 첨가되어 있으므로 절단효소의 변성을 막기 위해 희석 완충액(20 mM 트리스, pH 7.4)를 이용하여 요소 농도가 1 M이 되도록 희석하는 것이 바람직하다. 융합 폴리펩타이드는 정제 후 요소 농도가 1 M이 되도록 희석되어 20 mM 트리스, pH 7.4, 1 M 요소, 62.5 mM 염화나트륨, 62.5 mM 이미다졸을 함유하는 완충액에 존재할 수 있다. 재조합 융합 폴리펩타이드는 절단효소와 반응하여 친화성 태그 및 절단효소 인식 서열이 포함된 아미노 말단 융합 파트너와 GLP-1 또는 GLP-1K28R로 절단된다. 프로테아제 절단 방법은 당업계에 공지되고 제조사의 지시서를 포함한 문헌에 기재된 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 정제 후 요소 농도가 1 M이 되도록 희석된 융합 폴리펩타이드에 TEV 프로테아제를 최종 농도가 500 nM이 되도록 첨가하고 실온에서 6시간 이상 절단 반응이 진행될 수 있도록 한다. 예를 들어, TEV 프로테아제에 의해 재조합 융합 폴리펩타이드는 약 60% 내지 약 100%가 절단된다.
재조합 융합 폴리펩타이드, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 수율은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis) 또는 웨스턴 블롯(Western blot) 분석에 의해 결정할 수 있다. SDS-PAGE로 전기영동된 겔(gel)은 염색(staining), 탈색(destaining), 디지털 영상화 과정을 거쳐 재조합 융합 폴리펩타이드, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 대략적인 정량 및 정성 분석이 가능하다.
또한, 정제된 융합 폴리펩타이드, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 농도는 당업계에 공지되고 문헌에 기재된 방법에 의한 흡광도 분광법으로 결정될 수 있다.
정제된 융합 폴리펩타이드, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 수율 또는 순도를 결정하기 위한 웨스턴 블롯 분석은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고, GLP-1 또는 GLP-1K28R에 특이적인 항체를 이용하는 당업계에 공지된 적합한 방법에 따라 수행될 수 있다. 실시예에서, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 순도를 측정하기 위한 방법 중 하나로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)방법을 이용할 수 있다.
정제된 융합 폴리펩타이드, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 수율은 배양액의 부피당 정제된 융합 폴리펩타이드 또는 목적 폴리펩타이드의 양(예를 들어, g 또는 mg의 단백질/리터의 배양액 부피), 융합 폴리펩타이드의 백분율(예를 들어, 재조합 융합 폴리펩타이드의 양/전체 세포 단백질(total cell protein)의 양), 및 건조 균체량(dry cell weight)에 대한 백분율 또는 비율을 포함한다. 본원에 기재된 폴리펩타이드의 수율의 척도는 완전한 형태로 발현된 해당 폴리펩타이드의 양을 기준으로 한다.
수율이 배양액 부피에 대한 정제된 융합 폴리펩타이드, GLP-1 또는 GLP-1K28R의 양으로 표현되는 경우, 배양된 세포 밀도 혹은 세포 농도가 수율을 결정하는데 고려될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 일 구체예는 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 이용하여 GLP-1 또는 GLP-1K28R를 수득한다. 이를 통해, GLP-1 또는 GLP-1K28R가 세포 내에서 효소에 의해 분해되거나, 부적절한 폴딩이 발생하는 등의 문제점을 최소화하여 고수율 특성을 갖는 대량 생산 방법을 제공할 수 있다. 구체적인 생산 방법의 일 예시는 실시예를 통해 설명하기로 한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 리라글루타이드 전구체 펩타이드(GLP-1K28R) 융합 폴리펩타이드 제조 및 생산
실시예 1.1. GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드의 제작
GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자는 overlap extension polymerase chain reaction (OE-PCR) 방법을 이용하여 합성하였다. 이때, 상기 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드는 아미노 말단 융합 파트너로서 PG07(서열번호 9), PG15(서열번호 31), PG22(서열번호 53), PG29(서열번호 75), PG36(서열번호 97) 및 PG43(서열번호 119) 중 하나와 6 히스티딘 태그(서열번호 140), TEV 프로테아제 인식서열(서열번호 146) 및 GLP-1K28R 의 아미노산 서열(서열번호 151)이 포함되어 있다.
대조군으로서 사용된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드(H6TEV-GLP-1K28R)는 아미노 말단 융합 파트너가 포함되어 있지 않고, 6 히스티딘 태그(서열번호 140), TEV 프로테아제 인식서열(서열번호 146) 및 GLP-1K28R의 아미노산 서열(서열번호 152)이 포함되어 있다. 각 융합 폴리펩타이드의 유전자는 제한 효소 NdeI, NcoI 및 XhoI의 인식서열과 1개의 종결 코돈을 포함한다. 상기 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 296 내지 301에 해당하며, 대조군은 서열번호 295에 해당한다.
아래 표 2에 기재한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드 pSGK530, pSGK495, pSGK496, pSGK500, pSGK501, pSGK502 및 pSGK497을 제작하기 위해서, OE-PCR로 합성된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드 유전자 단편을 NdeI 및 XhoI 제한 효소를 이용하여 절단하고, T7 프로모터, lac 작동자 및 LacI 유전자를 포함하여 IPTG에 의한 발현 조절이 가능한 발현벡터 pET26b에 클로닝하였다.
| 균주 | 숙주세포 | 플라스미드 | 재조합 융합 폴리펩타이드 |
| PG005 | E. coli BL21(DE3) | pSGK530 | H6TEV-GLP-1K28R |
| PG006 | E. coli BL21(DE3) | pSGK495 | PG07-H6TEV-GLP-1K28R |
| PG007 | E. coli BL21(DE3) | pSGK496 | PG15-H6TEV-GLP-1K28R |
| PG008 | E. coli BL21(DE3) | pSGK500 | PG22-H6TEV-GLP-1K28R |
| PG009 | E. coli BL21(DE3) | pSGK501 | PG29-H6TEV-GLP-1K28R |
| PG010 | E. coli BL21(DE3) | pSGK502 | PG36-H6TEV-GLP-1K28R |
| PG011 | E. coli BL21(DE3) | pSGK497 | PG43-H6TEV-GLP-1K28R |
제작된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드들은 DNA 염기서열 확인을 통해 정확한 클로닝 여부를 확인하였다. 제작된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드들은 염화칼슘을 이용한 화학적인 방법으로 대장균 BL21(DE3) 세포를 형질전환하였다. GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현 플라스미드들이 형질도입된 대장균들은 카나마이신(kanamycin)이 50 ㎍/㎖의 농도로 포함된 LB 고체배지에서 콜로니를 형성하였다. 형질전환된 대장균들은 각각 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지에 배양한 후, 50% 글리세롤을 배양액과 동일한 부피로 첨가하여 세포 농축액(cell stock)을 만들고, 이를 -80℃ 온도의 냉동고에 보관하였다.
실시예 1.2. 형질전환된 세포의 배양 및 GLP-1K28R의 발현
-80℃ 온도에서 보관된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현 플라스미드들이 형질전환된 대장균의 세포 농축액을 실온에서 녹인 후 50 ㎕를 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지 5 ㎖이 포함된 시험관에 첨가하여 37℃ 온도의 진탕배양기에서 12시간 동안 종균 배양하였다. 종균 배양된 대장균 2 ㎖을 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지 200 ㎖이 포함된 플라스크에 첨가하여 37℃ 온도의 진탕배양기에서 배양하였다. 배양 약 3시간 후 세포의 광학밀도(OD600)가 약 1.0이 되었을 때 IPTG를 최종 농도 0.1 mM이 되도록 첨가하여 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현을 유도하였다. 발현 유도 4시간 후에 광학 밀도를 측정하여 세포의 광학 밀도를 측정하였다.
실시예 1.3. 발현 수준 비교 분석을 위한 시료의 제조
발현 유도가 된 세포의 광학밀도가 10.0이 되도록 세포를 농축하고 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액으로 재현탁시킨 후 초음파 세포 파쇄기(ultrasonic processor, Cole-Parmer)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포는 총 세포 분획으로 표지하였다. 세포 파쇄액은 12,000×g, 4℃ 온도에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 회수하고 가용성 분획으로 표지하였다. 불용성 분획은 500 ㎕의 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액으로 초음파 세포 파쇄기를 이용하여 재현탁하고 불용성 분획으로 표지하였다.
실시예 1.4. SDS-PAGE 분석을 통한 생산된 GLP-1K28R의 확인
50 ㎕의 총 세포, 가용성 및 불용성 분획을 각각 50 ㎕의 2배 농축된 SDS 시료 완충액(SDS sample buffer 2× concentrate, Sigma)에 혼합한 후, 95℃ 온도에서 5분간 가열하여 각 시료의 단백질이 변성될 수 있도록 하였다. 시료 내 변성된 단백질들은 16% SDS-PAGE 겔(gel) 및 TANK 완충액을 이용하여 분자량 크기에 따라 겔 내에서 분리될 수 있도록 하였다. SDS-PAGE 후 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue) R-250이 포함된 염색 완충액으로 염색한 후, 탈색 완충액으로 탈색하여 염색된 단백질만 보일 수 있도록 하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 대조군인 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 융합 파트너가 포함되지 않은 H6TEV-GLP-1K28R(5.1 kDa의 분자량)의 밴드는 SDS-PAGE 젤에서 검출되지 않아 발현 후 세포내 단백질 분해효소에 의해 분해된 것으로 보인다. SDS-PAGE 젤에서 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현은 분자량이 가장 작은 아미노 말단 융합 파트너인 PG07이 융합된 PG07-H6TEV-GLP-1K28R(6.1 kDa의 분자량)부터 확인되었다.
아미노 말단 융합 파트너인 PG15가 융합된 PG15-H6TEV-GLP-1K28R(7.1 kDa의 분자량)의 발현 수준은 PG07-H6TEV-GLP-1K28R 대비 증가하였다. 아미노 말단 융합 파트너인 PG15, PG22, PG29, PG36 및 PG43이 융합된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드인 PG15-H6TEV-GLP-1K28R(7.1 kDa의 분자량), PG22-H6TEV-GLP-1K28R(7.9 kDa의 분자량), PG29-H6TEV-GLP-1K28R(8.4 kDa의 분자량), PG36-H6TEV-GLP-1K28R(9.1 kDa의 분자량) 및 PG43-H6TEV-GLP-1K28R(11.7 kDa의 분자량)의 발현 수준은 대조군(H6TEV-GLP-1K28R) 대비 매우 향상된 것이 확인되었다.
덴시토미터 분석을 통해 PG07, PG15, PG22, PG29, PG36 및 PG43 중 PG22, PG29, PG36 및 PG43이 융합된 융합 폴리펩타이드들의 발현 수준은 유사하였고 PG07, PG15이 융합된 융합 폴리펩타이드 보다 월등히 높은 것으로 확인되었다(도 2 및 도 3).
또한, 도 2를 참조하면, 대조군을 포함한 모든 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드는 가용성 분획에서는 관찰되지 않고 모두 불용성 분획에서 나타나는 것을 알 수 있다(레인 1: H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG005) 및 레인 2: PG07-H6TEV-GLP-1K28R(균주 번호 PG006)의 경우 목적 펩타이드가 발현되지 않거나 발현 수준이 낮아 가용성 테스트를 수행하지 않았음).
참고로, 실시예에서 사용한 폴리펩타이드의 분자량, 등전점, 평균소수성 및 몰 흡광 계수를 아래 표 3에 나타내었다. 몰 흡광 계수는 Expasy의 ProtParam Tool(http://web.expasy.org/protparam/)로 계산되었다.
| 폴리펩타이드 단백질 명칭 | 분자량 (Da) | 등전점 (pI) | 평균소수성 (GRAVY) |
몰흡광계수 |
| PG07 | 880.08 | 9.52 | -0.371 | - |
| PG15 | 1875.31 | 11.72 | -0.667 | - |
| PG22 | 2620.11 | 10.27 | -0.745 | - |
| PG29 | 3217.82 | 10.27 | -0.200 | - |
| PG36 | 3834.50 | 10.43 | -0.183 | - |
| PG43 | 4559.35 | 10.42 | -0.023 | - |
| H6 | 840.86 | 7.21 | -3.200 | - |
| H10 | 1389.43 | 7.35 | -3.200 | - |
| K6 | 787.06 | 10.70 | -3.900 | - |
| K10 | 1299.76 | 10.95 | -3.900 | - |
| R6 | 955.14 | 12.70 | -4.500 | - |
| R10 | 1579.89 | 12.95 | -4.500 | - |
| Tobacco etch virus (TEV) protease | 812.88 | 4.00 | -0.867 | 1490 |
| Enterokinase | 606.54 | 3.77 | -3.580 | - |
| Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase | 557.65 | 12.00 | -1.200 | - |
| Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) | 3355.71 | 5.53 | -0.235 | 6990 |
| Liraglutide 전구체 펩타이드 | 3383.72 | 5.53 | -0.255 | 6990 |
| H6TEV | 1766.92 | 6.56 | -1.731 | 1490 |
| PG07-H6TEV | 2781.11 | 7.06 | -1.405 | 6990 |
| PG15-H6TEV | 3776.35 | 10.27 | -1.272 | 6990 |
| PG22-H6TEV | 4521.15 | 9.52 | -1.203 | 6990 |
| PG29-H6TEV | 5118.86 | 9.52 | -0.760 | 6990 |
| PG36-H6TEV | 5735.53 | 9.82 | -0.670 | 6990 |
| PG43-H6TEV | 8361.43 | 9.30 | -0.772 | 13980 |
| H6TEV-GLP-1K28R | 5132.63 | 6.34 | -0.691 | 8480 |
| PG07-H6TEV-GLP-1K28R | 6146.82 | 6.69 | -0.719 | 13980 |
| PG15-H6TEV-GLP-1K28R | 7142.06 | 9.40 | -0.747 | 13980 |
| PG22-H6TEV-GLP-1K28R | 7886.86 | 8.23 | -0.764 | 13980 |
| PG29-H6TEV-GLP-1K28R | 8484.57 | 8.23 | -0.549 | 13980 |
| PG36-H6TEV-GLP-1K28R | 9101.24 | 9.22 | -0.511 | 13980 |
| PG43-H6TEV-GLP-1K28R | 11727.14 | 8.23 | -0.615 | 20970 |
실시예 1.5. N-말단 융합 파트너의 아미노산 치환에 의한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현 수준 변화
PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 2번부터 7번까지 6개의 아미노산 잔기의 변화가 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현 수준에 미치는 영향을 알아보기 위해 각각의 아미노산 잔기를 이소루신, 아스파라긴, 아르기닌, 아스팔트산으로 치환한 총 22개의 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체를 제작하여 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 와의 세포 내 발현수준을 비교하였다.
GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체 발현을 위한 플라스미드 DNA는 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)방법을 이용하여 제작하였다. 위치 지정 돌연변이를 위한 주형(template)은 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 발현 플라스미드인 pSGK497을 사용하였다. 프라이머는 각각의 변이체의 아미노산 치환부위의 염기서열이 변경된 정방향(forward) 및 역방향(reverse)의 단일가닥 DNA 올리고머 를 이용하였다. 실험에 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.
| No. | PG43 mutants | Oligomer sequence | 서열번호 | |
| 1 | PG43-N2I | F-primer | GGAGATATACATATGATTATTCGTCCATTGCAT | 서열번호 303 |
| R-primer | ATGCAATGGACGAATAATCATATGTATATCTCC | 서열번호 304 | ||
| 2 | PG43-N2N | F-primer | - | |
| R-primer | - | |||
| 3 | PG43-N2R | F-primer | GGAGATATACATATGCGCATTCGTCCATTGCAT | 서열번호 305 |
| R-primer | ATGCAATGGACGAATGCGCATATGTATATCTCC | 서열번호 306 | ||
| 4 | PG43-N2D | F-primer | GGAGATATACATATGGATATTCGTCCATTGCAT | 서열번호 307 |
| R-primer | ATGCAATGGACGAATATCCATATGTATATCTCC | 서열번호 308 | ||
| 5 | PG43-I3I | F-primer | - | |
| R-primer | - | |||
| 6 | PG43-I3N | F-primer | GATATACATATGAATAACCGTCCATTGCATGAT | 서열번호 309 |
| R-primer | ATCATGCAATGGACGGTTATTCATATGTATATC | 서열번호 310 | ||
| 7 | PG43-I3R | F-primer | GATATACATATGAATCGCCGTCCATTGCATGAT | 서열번호 311 |
| R-primer | ATCATGCAATGGACGGCGATTCATATGTATATC | 서열번호 312 | ||
| 8 | PG43-I3D | F-primer | GATATACATATGAATGATCGTCCATTGCATGAT | 서열번호 313 |
| R-primer | ATCATGCAATGGACGATCATTCATATGTATATC | 서열번호 314 | ||
| 9 | PG43-R4I | F-primer | ATACATATGAATATTATTCCATTGCATGATCGC | 서열번호 315 |
| R-primer | GCGATCATGCAATGGAATAATATTCATATGTAT | 서열번호 316 | ||
| 10 | PG43-R4N | F-primer | ATACATATGAATATTAACCCATTGCATGATCGC | 서열번호 317 |
| R-primer | GCGATCATGCAATGGGTTAATATTCATATGTAT | 서열번호 318 | ||
| 11 | PG43-R4R | F-primer | - | |
| R-primer | - | |||
| 12 | PG43-R4D | F-primer | ATACATATGAATATTGATCCATTGCATGATCGC | 서열번호 319 |
| R-primer | GCGATCATGCAATGGATCAATATTCATATGTAT | 서열번호 320 | ||
| 13 | PG43-P5I | F-primer | CATATGAATATTCGTATTTTGCATGATCGCGTG | 서열번호 321 |
| R-primer | CACGCGATCATGCAAAATACGAATATTCATATG | 서열번호 322 | ||
| 14 | PG43-P5N | F-primer | CATATGAATATTCGTAACTTGCATGATCGCGTG | 서열번호 323 |
| R-primer | CACGCGATCATGCAAGTTACGAATATTCATATG | 서열번호 324 | ||
| 15 | PG43-P5R | F-primer | CATATGAATATTCGTCGCTTGCATGATCGCGTG | 서열번호 325 |
| R-primer | CACGCGATCATGCAAGCGACGAATATTCATATG | 서열번호 326 | ||
| 16 | PG43-P5D | F-primer | CATATGAATATTCGTGATTTGCATGATCGCGTG | 서열번호 327 |
| R-primer | CACGCGATCATGCAAATCACGAATATTCATATG | 서열번호 328 | ||
| 17 | PG43-L6I | F-primer | ATGAATATTCGTCCAATTCATGATCGCGTGATC | 서열번호 329 |
| R-primer | GATCACGCGATCATGAATTGGACGAATATTCAT | 서열번호 330 | ||
| 18 | PG43-L6N | F-primer | ATGAATATTCGTCCAAACCATGATCGCGTGATC | 서열번호 331 |
| R-primer | GATCACGCGATCATGGTTTGGACGAATATTCAT | 서열번호 332 | ||
| 19 | PG43-L6R | F-primer | ATGAATATTCGTCCACGCCATGATCGCGTGATC | 서열번호 333 |
| R-primer | GATCACGCGATCATGGCGTGGACGAATATTCAT | 서열번호 334 | ||
| 20 | PG43-L6D | F-primer | ATGAATATTCGTCCAGATCATGATCGCGTGATC | 서열번호 335 |
| R-primer | GATCACGCGATCATGATCTGGACGAATATTCAT | 서열번호 336 | ||
| 21 | PG43-H7I | F-primer | AATATTCGTCCATTGATTGATCGCGTGATCGTC | 서열번호 337 |
| R-primer | GACGATCACGCGATCAATCAATGGACGAATATT | 서열번호 338 | ||
| 22 | PG43-H7N | F-primer | AATATTCGTCCATTGAACGATCGCGTGATCGTC | 서열번호 339 |
| R-primer | GACGATCACGCGATCGTTCAATGGACGAATATT | 서열번호 340 | ||
| 23 | PG43-H7R | F-primer | AATATTCGTCCATTGCGCGATCGCGTGATCGTC | 서열번호 341 |
| R-primer | GACGATCACGCGATCGCGCAATGGACGAATATT | 서열번호 342 | ||
| 24 | PG43-H7D | F-primer | AATATTCGTCCATTGGATGATCGCGTGATCGTC | 서열번호 343 |
| R-primer | GACGATCACGCGATCATCCAATGGACGAATATT | 서열번호 344 | ||
각각의 변이체에 대한 위치 지정 돌연변이 후 얻어진 발현 플라스미드들은 DNA 염기서열 확인을 통해 정확한 클로닝 여부를 확인하였다.
제작된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 변이체 발현 플라스미드들을 이용하여 염화칼슘을 이용한 화학적인 방법으로 대장균 BL21(DE3) 세포를 형질전환하였다. GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현 플라스미드들이 형질전환된 대장균들은 카나마이신(kanamycin)이 50 ㎍/㎖의 농도로 포함된 LB 고체배지에서 콜로니를 형성하였다. 형질전환된 대장균들을 각각 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지에 배양한 후, 50% 글리세롤을 배양액과 동일한 부피로 첨가하여 세포 농축액을 만들어, 이를 -80℃ 온도의 냉동고에 보관하였다.
-80℃ 온도에서 보관된 GLP-1K28R융합 폴리펩타이드의 변이체 발현 플라스미드들이 형질전환된 대장균의 세포 농축액을 실온에서 녹인 후 50 ㎕를 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지 5 ㎖이 포함된 시험관에 첨가하여 37℃ 온도의 진탕배양기에서 12시간 동안 종균 배양하였다. 종균 배양된 대장균 2 ㎖은 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지 200 ㎖이 포함된 플라스크에 첨가하여 37℃ 온도의 진탕배양기에서 배양하였다. 배양 약 3시간 후 세포의 광학밀도(OD600)가 약 1.0이 되었을 때, IPTG의 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하여 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 발현을 유도하였다. 발현 유도 4시간 후에 광학 밀도를 측정하여 세포의 광학 밀도를 측정하였다.
발현 유도가 된 세포의 광학밀도가 10.0이 되도록 세포를 농축하고 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액으로 재현탁시킨 후 초음파 세포 파쇄기(ultrasonic processor, Cole-Parmer)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포는 총 세포 분획으로 표지하였다. 세포 파쇄액은 12,000×g, 4℃ 온도에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 회수하고 가용성 분획으로 표지하였다. 불용성 분획은 500 ㎕의 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액으로 초음파 세포 파쇄기를 이용하여 재현탁하고 불용성 분획으로 표지하였다.
50 ㎕의 총 세포, 가용성 및 불용성 분획을 각각 50 ㎕의 2배 농축된 SDS 시료 완충액(SDS sample buffer 2× concentrate, Sigma)에 혼합한 후, 95℃ 온도에서 5분간 가열하여 각 시료의 단백질이 변성될 수 있도록 하였다. 시료 내 변성된 단백질들은 16% SDS-PAGE 겔 및 TANK 완충액을 이용하여 분자량 크기에 따라 겔 내에서 분리될 수 있도록 하였다. SDS-PAGE 후 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue) R-250이 포함된 염색 완충액으로 염색한 후, 탈색 완충액으로 탈색하여 염색된 단백질만 보일 수 있도록 하였다.
도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군인 PG43-H6TEV-GLP-1K28R의 발현 수준과 비교하여 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 PG43의 2번부터 7번까지 6개의 아미노산 잔기의 변화에 의해 발현 수준이 향상된 변이체와 감소된 변이체들을 확인하였다. 특히, 덴시토미터 분석을 통해 2번째 잔기가 아스팔트산으로 치환된 변이주와 7번째 잔기가 아이소루신, 아스파라긴, 아르기닌, 아스팔트산으로 치환된 변이주들은 대조군 대비 2 내지 3배 이상 발현 수준이 향상되는 것으로 확인되었다.
실시예 2. GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 회수 및 정제
실시예 2.1. 세포 파쇄 및 불용성 내포체 회수
플라스크 규모에서 발현된 세포의 냉동된 세포 펠렛을 50 ㎖의 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액을 첨가하여 해동하였다. 재현탁된 세포는 초음파 세포 파쇄기(ultrasonic processor, Cole-Parmer)를 이용하여 파쇄하였다. 용해된 세포는 12,000 rpm (12,000Хg)에서 30분간 원심분리하고 상등액을 제거하여 재조합 융합 폴리펩타이드가 포함된 불용성 내포체 분획을 회수하였다.
실시예 2.2. 불용성 내포체 가용화
회수된 불용성 내포체 분획에 20 ㎖의 내포체 가용화 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 50 mM 이미다졸, pH 7.4)을 첨가하고 25℃ 온도에서 4시간 동안 진탕배양하여 불용성 분획 내 내포체 형태의 재조합 융합 폴리펩타이드가 가용화될 수 있도록 하였다. 가용화된 불용성 분획 시료는 12,000Хg에서 30분간 원심분리하고 상등액을 (0.45/0.2 ㎛) 막필터를 통해 여과하였다.
실시예 2.3. GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드 정제
7개 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드 중 가장 발현 수준이 높은 PG43-H6TEV-GLP-1K28R를 정제하였다. 먼저, 가용화된 불용성 분획 내의 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 정제를 위하여 S9 시료 펌프(Sample pump S9) 및 F9-C 분획 수집기(Fraction collector F9-C)이 장착된 AKTA pure 25 크로마토그라피 시스템(GE Healthcare)을 이용하였다. 가용화된 불용성 분획 시료는 내포체 가용화 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 50 mM 이미다졸, pH 7.4)으로 미리 평형화된 HisTrap FF 1 ㎖ 컬럼(GE Healthcare)에 주입하였다.
주입이 완료된 후 컬럼은 5배 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척하고, 5배 컬럼 부피의 용출 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4)을 단계적으로 100%가 되도록 증가시켜 컬럼의 수지에 결합되어 있는 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드를 용출하였다. 용출 후 얻어진 분획의 결과를 각각 도면에 나타내었다(도 7 및 도 8). 컬럼에 주입된 가용화된 불용성 분획 시료 내의 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드는 대부분 컬럼 내 수지에 결합 후 용출되어 95% 이상의 순도를 보였다.
실시예 3. 프로테아제 처리를 통한 링커 서열 절단
약 5 ㎖의 정제된 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드의 분획을 합친 후 140 ㎖의 희석 완충액(20 mM 트리스, pH 7.4)을 첨가하여 요소 농도가 1 M이 되도록 희석하였다. 희석된 재조합 융합 폴리펩타이드에 TEV 프로테아제를 최종 농도가 500 nM이 되도록 첨가하고 실온에서 12시간 동안 절단 반응이 진행될 수 있도록 하였다.
TEV 프로테아제에 의한 절단 여부를 확인하기 위해, 절단 후 SDS-PAGE 분석을 수행하여 그 결과를 도면에 나타내었다(도 9). TEV 프로테아제에 의한 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드(PG43-H6TEV-GLP-1K28R)의 절단 전, 후를 SDS-PAGE로 분석해 본 결과, 7.9 kDa의 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드는 거의 100%의 수율로 아미노 말단 융합 파트너와 6 히스티딘 태그 및 TEV 프로테아제 인식서열 융합체인 PG43-H6TEV와 목적 폴리펩타이드인 GLP-1K28R로 절단되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 절단 후의 GLP-1K28R 의 분자량 분석
완전한 형태의 GLP-1K28R 융합 폴리펩타이드(PG43-H6TEV-GLP-1K28R)의 발현 유무, TEV 프로테아제에 의한 정확한 절단 및 절단 후 얻어진 GLP-1K28R의 변형(modification) 유무를 확인하기 위해 MALTI-TOF MS를 이용한 분자량 분석을 실시하였다. 본 발명에 따라 수득된 GLP-1K28R의 분자량을 측정한 결과를 도면에 나타내었다.
도면 10을 참고하면, PG43-H6TEV-GLP-1K28R로부터 수득된 GLP-1K28R의 분자량은 3382.59 Da으로 측정되어 이론적인 분자량인 3383.72 Da과 오차범위 이내에서 일치하였으므로 대장균 내에서 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)에 의한 아미노 혹은 카르복시 말단의 부분적인 절단이나 분해 없이 완전한 형태로 발현된 것을 확인할 수 있었다.
따라서 TEV 프로테아제는 PG43-H6TEV-GLP-1K28R 내 인식서열인 ENLFQ 서열을 인식하고 마지막 아미노산인 Q(글루타민)와 GLP-1K28R의 첫번째 아미노산인 H(히스티딘) 사이의 펩타이드 결합을 정확하게 절단하는 것으로 판단된다.
<110> PEPGENE INC.
<120> METHOD OF PREPARING GLUCAGON LIKE PEPTIDE-1 OR ANALOGUES USING
FUSION POLYPEPTIDE
<130> FPD201809-0085
<150> KR 10-2018-0018255
<151> 2018-02-14
<160> 345
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner
<400> 1
Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner
<400> 2
Met Xaa Ile Arg Pro Leu His
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner
<400> 3
Met Asn Xaa Arg Pro Leu His
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner
<400> 4
Met Asn Ile Xaa Pro Leu His
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner
<400> 5
Met Asn Ile Arg Xaa Leu His
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner
<400> 6
Met Asn Ile Arg Pro Xaa His
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner
<400> 7
Met Asn Ile Arg Pro Leu Xaa
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 8
Met Ile Ile Arg Pro Leu His
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 9
Met Asn Ile Arg Pro Leu His
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 10
Met Arg Ile Arg Pro Leu His
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 11
Met Asp Ile Arg Pro Leu His
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 12
Met Asn Asn Arg Pro Leu His
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 13
Met Asn Arg Arg Pro Leu His
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 14
Met Asn Asp Arg Pro Leu His
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 15
Met Asn Ile Ile Pro Leu His
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 16
Met Asn Ile Asn Pro Leu His
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 17
Met Asn Ile Asp Pro Leu His
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 18
Met Asn Ile Arg Ile Leu His
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 19
Met Asn Ile Arg Asn Leu His
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 20
Met Asn Ile Arg Arg Leu His
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 21
Met Asn Ile Arg Asp Leu His
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 22
Met Asn Ile Arg Pro Ile His
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 23
Met Asn Ile Arg Pro Asn His
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 24
Met Asn Ile Arg Pro Arg His
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 25
Met Asn Ile Arg Pro Asp His
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 26
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 27
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 28
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG07)
<400> 29
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp
1 5
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 30
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 31
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 32
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 33
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 34
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 35
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 36
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 37
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 38
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 39
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 40
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 41
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 42
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 43
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 44
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 45
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 46
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 47
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 48
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 49
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 50
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG15)
<400> 51
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 52
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 52
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 53
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 53
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 54
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 54
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 55
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 55
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 56
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 56
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 57
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 57
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 58
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 58
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 59
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 59
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 60
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 60
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 61
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 61
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 62
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 62
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 63
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 63
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 64
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 64
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 65
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 65
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 66
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 66
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 67
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 67
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 68
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 68
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 69
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 69
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 70
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 70
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 71
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 71
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 72
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 72
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 73
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG22)
<400> 73
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala
20
<210> 74
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 74
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 75
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 75
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 76
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 77
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 77
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 78
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 78
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 79
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 79
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 80
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 80
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 81
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 81
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 82
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 82
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 83
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 83
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 84
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 84
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 85
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 85
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 86
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 86
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 87
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 87
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 88
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 88
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 89
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 89
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 90
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 90
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 91
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 91
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 92
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 92
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 93
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 93
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 94
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 94
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 95
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG29)
<400> 95
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly
20 25
<210> 96
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 96
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 97
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 97
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 98
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 98
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 99
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 99
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 100
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 100
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 101
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 101
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 102
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 102
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 103
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 103
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 104
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 104
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 105
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 105
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 106
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 106
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 107
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 107
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 108
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 108
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 109
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 109
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 110
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 110
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 111
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 111
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 112
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 112
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 113
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 113
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 114
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 114
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 115
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 115
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 116
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 116
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 117
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG36)
<400> 117
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr
35
<210> 118
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 118
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 119
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 119
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 120
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 120
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 121
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 121
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 122
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 122
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 123
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 123
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 124
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 124
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 125
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 125
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 126
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 126
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 127
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 127
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 128
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 128
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 129
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 129
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 130
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 130
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 131
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 131
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 132
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 132
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 133
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 133
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 134
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 134
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 135
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 135
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 136
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 136
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 137
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 137
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 138
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 138
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 139
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner (PG43)
<400> 139
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val
35 40
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for H6
<400> 140
His His His His His His
1 5
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for H10
<400> 141
His His His His His His His His His His
1 5 10
<210> 142
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for K6
<400> 142
Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for K10
<400> 143
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 144
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for R6
<400> 144
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for R10
<400> 145
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 146
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for Tobacco etch virus (TEV) protease
<400> 146
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5
<210> 147
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for Enterokinase
<400> 147
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase
<400> 148
Arg Leu Arg Gly Gly
1 5
<210> 149
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for Factor Xa
<400> 149
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 150
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for Furin
<400> 150
Arg Lys Arg Arg
1
<210> 151
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for GLP-1
<400> 151
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 152
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for GLP-1K28R
<400> 152
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 153
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for H6TEV
<400> 153
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10
<210> 154
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV
<400> 154
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln
20
<210> 155
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV
<400> 155
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
20 25
<210> 156
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV
<400> 156
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln
35
<210> 157
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV
<400> 157
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
35 40
<210> 158
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV
<400> 158
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln
50
<210> 159
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV
<400> 159
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
50 55
<210> 160
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for H6TEV-GLP-1K28R
<400> 160
Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
1 5 10 15
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
20 25 30
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
35 40
<210> 161
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 161
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 162
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 162
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 163
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 163
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 164
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 164
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 165
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 165
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 166
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 166
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 167
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 167
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 168
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 168
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 169
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 169
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 170
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 170
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 171
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 171
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 172
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 172
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 173
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 173
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 174
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 174
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 175
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 175
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 176
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 176
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 177
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 177
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 178
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 178
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 179
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 179
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 180
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 180
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 181
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 181
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 182
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 182
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Pro Trp His His His His His His Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Arg Gly
50
<210> 183
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 183
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 184
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 184
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 185
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 185
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 186
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 186
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 187
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 187
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 188
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 188
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 189
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 189
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 190
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 190
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 191
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 191
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 192
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 192
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 193
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 193
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 194
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 194
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 195
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 195
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 196
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 196
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 197
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 197
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 198
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 198
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 199
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 199
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 200
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 200
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 201
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 201
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 202
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 202
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 203
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 203
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 204
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 204
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Pro
1 5 10 15
Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu
20 25 30
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
50 55 60
<210> 205
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 205
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 206
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 206
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 207
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 207
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 208
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 208
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 209
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 209
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 210
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 210
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 211
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 211
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 212
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 212
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 213
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 213
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 214
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 214
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 215
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 215
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 216
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 216
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 217
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 217
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 218
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 218
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 219
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 219
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 220
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 220
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 221
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 221
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 222
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 222
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 223
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 223
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 224
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 224
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 225
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 225
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 226
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 226
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Pro Trp His His His His His His Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
50 55 60
Gly Arg Gly
65
<210> 227
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 227
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 228
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 228
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 229
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 229
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 230
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 230
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 231
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 231
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 232
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 232
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 233
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 233
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 234
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 234
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 235
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 235
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 236
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 236
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 237
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 237
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 238
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 238
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 239
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 239
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 240
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 240
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 241
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 241
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 242
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 242
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 243
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 243
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 244
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 244
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 245
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 245
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 246
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 246
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 247
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 247
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 248
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 248
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Pro Trp His
20 25 30
His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
50 55 60
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
65 70
<210> 249
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 249
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 250
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 250
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 251
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 251
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 252
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 252
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 253
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 253
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 254
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 254
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 255
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 255
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 256
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 256
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 257
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 257
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 258
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 258
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 259
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 259
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 260
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 260
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 261
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 261
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 262
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 262
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 263
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 263
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 264
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 264
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 265
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 265
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 266
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 266
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 267
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 267
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 268
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 268
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 269
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 269
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 270
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 270
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Pro Trp His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 271
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 271
Met Ile Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 272
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 272
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 273
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 273
Met Arg Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 274
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 274
Met Asp Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 275
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 275
Met Asn Asn Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 276
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 276
Met Asn Arg Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 277
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 277
Met Asn Asp Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 278
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 278
Met Asn Ile Ile Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 279
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 279
Met Asn Ile Asn Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 280
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 280
Met Asn Ile Asp Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 281
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 281
Met Asn Ile Arg Ile Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 282
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 282
Met Asn Ile Arg Asn Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 283
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 283
Met Asn Ile Arg Arg Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 284
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 284
Met Asn Ile Arg Asp Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 285
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 285
Met Asn Ile Arg Pro Ile His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 286
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 286
Met Asn Ile Arg Pro Asn His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 287
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 287
Met Asn Ile Arg Pro Arg His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 288
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 288
Met Asn Ile Arg Pro Asp His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 289
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 289
Met Asn Ile Arg Pro Leu Ile Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 290
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 290
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asn Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 291
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 291
Met Asn Ile Arg Pro Leu Arg Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 292
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 292
Met Asn Ile Arg Pro Leu Asp Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Pro Trp His His His
35 40 45
His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
50 55 60
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
85
<210> 293
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for GLP-1
<400> 293
catgcggaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa 60
gaatttattg cgtggctggt gaaaggccgc ggctaa 96
<210> 294
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for GLP-1K28R
<400> 294
catgcggaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa 60
gaatttattg cgtggctggt gcgtggccgc ggctaa 96
<210> 295
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for H6TEV-GLP-1K28R
<400> 295
atgcatcatc atcaccacca cgaaaacctg tatttccagc atgcggaagg cacctttacc 60
agcgatgtga gcagctatct ggaaggccag gcggcgaaag aatttattgc gtggctggtg 120
cgtggccgcg gctaa 135
<210> 296
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for PG07-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 296
atgaatattc gtccattgca tccatggcat catcatcacc accacgaaaa cctgtatttc 63
cagcatgcgg aaggcacctt taccagcgat gtgagcagct atctggaagg ccaggcggcg 123
aaagaattta ttgcgtggct ggtgcgtggc cgcggctaa 162
<210> 297
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for PG15-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 297
atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaaccatg gcatcatcat 60
caccaccacg aaaacctgta tttccagcat gcggaaggca cctttaccag cgatgtgagc 120
agctatctgg aaggccaggc ggcgaaagaa tttattgcgt ggctggtgcg tggccgcggc 180
taa 183
<210> 298
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for PG22-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 298
atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60
tctgctccat ggcatcatca tcaccaccac gaaaacctgt atttccagca tgcggaaggc 120
acctttacca gcgatgtgag cagctatctg gaaggccagg cggcgaaaga atttattgcg 180
tggctggtgc gtggccgcgg ctaa 204
<210> 299
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for PG29-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 299
atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60
tctgctggcg gcatcgttct gaccggccca tggcatcatc atcaccacca cgaaaacctg 120
tatttccagc atgcggaagg cacctttacc agcgatgtga gcagctatct ggaaggccag 180
gcggcgaaag aatttattgc gtggctggtg cgtggccgcg gctaa 225
<210> 300
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for PG36-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 300
atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 63
tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccc atggcatcat 123
catcaccacc acgaaaacct gtatttccag catgcggaag gcacctttac cagcgatgtg 183
agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa gaatttattg cgtggctggt gcgtggccgc 243
ggctaa 249
<210> 301
<211> 267
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for PG43-H6TEV-GLP-1K28R
<400> 301
atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60
tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120
ctggctgtcc catggcatca tcatcaccac cacgaaaacc tgtatttcca gcatgcggaa 180
ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc aggcggcgaa agaatttatt 240
gcgtggctgg tgcgtggccg cggctaa 267
<210> 302
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for N-terminal fusion partner PG15(2-7)
<400> 302
Met Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys
1 5
<210> 303
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for PG43-N2I
<400> 303
ggagatatac atatgattat tcgtccattg cat 33
<210> 304
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for PG43-N2I
<400> 304
atgcaatgga cgaataatca tatgtatatc tcc 33
<210> 305
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-N2R
<400> 305
ggagatatac atatgcgcat tcgtccattg cat 33
<210> 306
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-N2R
<400> 306
atgcaatgga cgaatgcgca tatgtatatc tcc 33
<210> 307
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-N2D
<400> 307
ggagatatac atatggatat tcgtccattg cat 33
<210> 308
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-N2D
<400> 308
atgcaatgga cgaatatcca tatgtatatc tcc 33
<210> 309
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-I3N
<400> 309
gatatacata tgaataaccg tccattgcat gat 33
<210> 310
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-I3N
<400> 310
atcatgcaat ggacggttat tcatatgtat atc 33
<210> 311
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-I3R
<400> 311
gatatacata tgaatcgccg tccattgcat gat 33
<210> 312
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-I3R
<400> 312
atcatgcaat ggacggcgat tcatatgtat atc 33
<210> 313
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-I3D
<400> 313
gatatacata tgaatgatcg tccattgcat gat 33
<210> 314
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-I3D
<400> 314
atcatgcaat ggacgatcat tcatatgtat atc 33
<210> 315
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-R4I
<400> 315
atacatatga atattattcc attgcatgat cgc 33
<210> 316
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-R4I
<400> 316
gcgatcatgc aatggaataa tattcatatg tat 33
<210> 317
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-R4N
<400> 317
atacatatga atattaaccc attgcatgat cgc 33
<210> 318
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-R4N
<400> 318
gcgatcatgc aatgggttaa tattcatatg tat 33
<210> 319
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-R4D
<400> 319
atacatatga atattgatcc attgcatgat cgc 33
<210> 320
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-R4D
<400> 320
gcgatcatgc aatggatcaa tattcatatg tat 33
<210> 321
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-P5I
<400> 321
catatgaata ttcgtatttt gcatgatcgc gtg 33
<210> 322
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-P5I
<400> 322
cacgcgatca tgcaaaatac gaatattcat atg 33
<210> 323
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-P5N
<400> 323
catatgaata ttcgtaactt gcatgatcgc gtg 33
<210> 324
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-P5N
<400> 324
cacgcgatca tgcaagttac gaatattcat atg 33
<210> 325
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-P5R
<400> 325
catatgaata ttcgtcgctt gcatgatcgc gtg 33
<210> 326
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-P5R
<400> 326
cacgcgatca tgcaagcgac gaatattcat atg 33
<210> 327
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-P5D
<400> 327
catatgaata ttcgtgattt gcatgatcgc gtg 33
<210> 328
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-P5D
<400> 328
cacgcgatca tgcaaatcac gaatattcat atg 33
<210> 329
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-L6I
<400> 329
atgaatattc gtccaattca tgatcgcgtg atc 33
<210> 330
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-L6I
<400> 330
gatcacgcga tcatgaattg gacgaatatt cat 33
<210> 331
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-L6N
<400> 331
atgaatattc gtccaaacca tgatcgcgtg atc 33
<210> 332
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-L6N
<400> 332
gatcacgcga tcatggtttg gacgaatatt cat 33
<210> 333
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-L6R
<400> 333
atgaatattc gtccacgcca tgatcgcgtg atc 33
<210> 334
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-L6R
<400> 334
gatcacgcga tcatggcgtg gacgaatatt cat 33
<210> 335
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-L6D
<400> 335
atgaatattc gtccagatca tgatcgcgtg atc 33
<210> 336
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-L6D
<400> 336
gatcacgcga tcatgatctg gacgaatatt cat 33
<210> 337
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-H7I
<400> 337
aatattcgtc cattgattga tcgcgtgatc gtc 33
<210> 338
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-H7I
<400> 338
gacgatcacg cgatcaatca atggacgaat att 33
<210> 339
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-H7N
<400> 339
aatattcgtc cattgaacga tcgcgtgatc gtc 33
<210> 340
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-H7N
<400> 340
gacgatcacg cgatcgttca atggacgaat att 33
<210> 341
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-H7R
<400> 341
aatattcgtc cattgcgcga tcgcgtgatc gtc 33
<210> 342
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-H7R
<400> 342
gacgatcacg cgatcgcgca atggacgaat att 33
<210> 343
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PG43-H7D
<400> 343
aatattcgtc cattggatga tcgcgtgatc gtc 33
<210> 344
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PG43-H7D
<400> 344
gacgatcacg cgatcatcca atggacgaat att 33
<210> 345
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence for 8-43 aa fragment of N-terminal fusion
partner (PG43)
<400> 345
Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu
20 25 30
Val Leu Ala Val
35
Claims (14)
- (a) 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 N-말단 융합 파트너;
글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon like peptide-1; GLP-1) 또는 이의 유사체; 및
상기 N-말단 융합 파트너와, 상기 GLP-1 또는 이의 유사체 사이에 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계;
(c) 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
(d) 상기 숙주세포에서 발현된 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계; 및
(e) 상기 정제된 융합 폴리펩타이드를 절단 효소와 배양하여 GLP-1 또는 이의 유사체를 회수하는 단계를 포함하는, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법:
[일반식 1]
Met-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Z)n
상기 일반식 1에서,
Xaa1 내지 Xaa6은, 서로 독립적으로, 이소루신(Ile, I), 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 프롤린(Pro, P), 발린(Val, V), 루신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 트립토판(Trp, W), 아스파라긴(Asn, N), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 아르기닌(Arg, R), 리신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 아스팔트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다. - 제 1항에 있어서,
상기 N-말단 융합파트너가 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법:
[일반식 2]
Met-Xaa1-Ile-Arg-Pro-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 2에서,
Xaa1은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다. - 제 1항에 있어서,
상기 N-말단 융합파트너가 하기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법:
[일반식 3]
Met-Asn-Xaa2-Arg-Pro-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 3에서,
Xaa2는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다. - 제 1항에 있어서,
상기 N-말단 융합파트너가 하기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법:
[일반식 4]
Met-Asn-Ile-Xaa3-Pro-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 4에서,
Xaa3은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다. - 제 1항에 있어서,
상기 N-말단 융합파트너가 하기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법:
[일반식 5]
Met-Asn-Ile-Arg-Xaa4-Leu-His-(Z)n
상기 일반식 5에서,
Xaa4는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다. - 제 1항에 있어서,
상기 N-말단 융합파트너가 하기 일반식 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법:
[일반식 6]
Met-Asn-Ile-Arg-Pro-Xaa5-His-(Z)n
상기 일반식 6에서,
Xaa5는 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다. - 제 1항에 있어서,
상기 N-말단 융합파트너가 하기 일반식 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법:
[일반식 7]
Met-Asn-Ile-Arg-Pro-Leu-Xaa6-(Z)n
상기 일반식 7에서,
Xaa6은 이소루신, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스팔트산 또는 글루탐산이며,
상기 Z는 서열번호 345로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산에서부터 시작하는 1개 내지 36개의 아미노산이고,
상기 n은 0 또는 1의 정수이다. - 제 1항에 있어서,
상기 N-말단 융합 파트너는 서열번호 8 내지 139 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법. - 제 1항에 있어서,
상기 링커는 친화성 태그를 포함하는 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법. - 제 1항에 있어서,
상기 링커는 프로테아제 인식서열을 포함하는 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법. - 제 10항에 있어서,
상기 프로테아제 인식서열은 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식서열, 엔테로키나아제 인식서열, 유비퀴틴 카르복시 말단 가수분해효소 인식서열, 인자 Xa 인식서열, 퓨린 인식서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법. - 제 1항에 있어서,
상기 GLP-1은 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법. - 제 1항에 있어서,
상기 GLP-1의 유사체는 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법. - 제 1항에 있어서,
상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 161 내지 292의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인, GLP-1 또는 이의 유사체의 생산방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180018255 | 2018-02-14 | ||
| KR20180018255 | 2018-02-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190098689A true KR20190098689A (ko) | 2019-08-22 |
| KR102017540B1 KR102017540B1 (ko) | 2019-09-03 |
Family
ID=67766887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190007168A Active KR102017540B1 (ko) | 2018-02-14 | 2019-01-18 | 융합 폴리펩타이드를 이용하여 글루카곤 유사 펩타이드-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102017540B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4217503A4 (en) * | 2020-09-23 | 2024-12-11 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | PROCESS FOR THE PREPARATION OF SEMAGLUTIDE AND SEMAPEPTIDE |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017536835A (ja) * | 2014-12-01 | 2017-12-14 | フェネックス インク． | ペプチド産生のための融合パートナー |
-
2019
- 2019-01-18 KR KR1020190007168A patent/KR102017540B1/ko active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017536835A (ja) * | 2014-12-01 | 2017-12-14 | フェネックス インク． | ペプチド産生のための融合パートナー |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JACS. Vol.138:11775-11782 (2016)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102017540B1 (ko) | 2019-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102040982B1 (ko) | 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술 | |
| KR102106773B1 (ko) | 목적 단백질의 수용성 및 발현량 증가를 위한 융합 태그 및 이의 용도 | |
| GB2602733A (en) | Recombinant interleukin-15 analog | |
| CN109486800B (zh) | 一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法 | |
| US11267863B2 (en) | N-terminal fusion partner for producing recombinant polypeptide, and method for producing recombinant polypeptide using same | |
| KR102345011B1 (ko) | GroES 융합을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드-1 또는 이의 유사체의 생산방법 | |
| KR102017540B1 (ko) | 융합 폴리펩타이드를 이용하여 글루카곤 유사 펩타이드-1 또는 이의 유사체를 생산하는 방법 | |
| Canals et al. | Production of engineered human pancreatic ribonucleases, solving expression and purification problems, and enhancing thermostability | |
| US7771970B2 (en) | Process for preparation of polypeptides of interest from fusion polypeptides | |
| KR102064810B1 (ko) | 재조합 폴리펩타이드 생산용 n-말단 융합 파트너 및 이를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법 | |
| US20210230659A1 (en) | Leader Sequence for Higher Expression of Recombinant Proteins | |
| KR102017542B1 (ko) | 융합 폴리펩타이드를 이용하여 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 생산하는 방법 | |
| CN109136209B (zh) | 肠激酶轻链突变体及其应用 | |
| KR100368073B1 (ko) | 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| KR102009709B1 (ko) | 융합 폴리펩타이드를 이용하여 인간 부갑상선 호르몬 1-84를 생산하는 방법 | |
| KR102011291B1 (ko) | 신규한 융합 폴리펩타이드 및 이를 이용하여 인간 부갑상선 호르몬 1-34를 생산하는 방법 | |
| JP2637392B2 (ja) | 遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法 | |
| KR102345013B1 (ko) | GroES 융합을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 생산방법 | |
| KR102345012B1 (ko) | GroES 융합을 이용한 인간부갑상선호르몬 1-34의 생산방법 | |
| CN114921444B (zh) | 一种v8蛋白酶的制备方法 | |
| KR100407792B1 (ko) | 인간 글루카곤 유사펩타이드를 융합파트너로 이용한재조합 단백질의 제조방법 | |
| KR100988600B1 (ko) | 예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제 유전자의 신호서열을 이용한 단백질 생산방법, 및 이를 위한 재조합발현벡터 | |
| JP2007514423A (ja) | ペプチドおよびタンパク質のプロセシング | |
| KR100486070B1 (ko) | 인간 적혈구 형성 자극인자(ｅｐｏ) 발현 벡터 및 이를이용한 ｅｐｏ의 대량 생산방법 | |
| KR20030010536A (ko) | 융합단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20190118 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PA0302 | Request for accelerated examination |
Patent event date: 20190327 Patent event code: PA03022R01D Comment text: Request for Accelerated Examination Patent event date: 20190118 Patent event code: PA03021R01I Comment text: Patent Application |
|
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20190520 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20190823 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20190828 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20190829 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20220804 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20230724 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20250225 Start annual number: 6 End annual number: 6 |