KR20190071453A - 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 풀루란을 이용한 하이드로젤에 염화칼슘과 트롬빈을 포함하여 우수한 혈액응고능을 가짐과 동시에 주입형 하이드로젤 형태로 제조되어 다루기 쉽고 유동성 있는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 풀루란을 이용한 하이드로젤에 염화칼슘과 트롬빈을 포함하여 우수한 혈액응고능을 가짐과 동시에 주입형 하이드로젤 형태로 제조되어 다루기 쉽고 유동성 있는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
지혈이란 혈관에 상처가 나서 혈액이 외부의 이물질과 접촉하면 혈소판이나 혈장에 존재하는 여러 혈액 응고인자가 복잡한 경로를 거쳐 혈전을 야기하여 상처부위의 출혈을 멎게 하는 것을 의미한다.
혈관이 외상이나 질환에 의하여 손상을 받아 출혈이 발생하게 되면 출혈을 멈추기 위해 먼저 혈관수축이 이루어지고, 이어서 1차 지혈과정인 혈소판의 부착 및 응집에 의한 혈소판 마개가 형성되며, 2차 지혈과정인 응고인자들의 활성화를 통하여 섬유소가 만들어지고 지혈 마개가 형성되어 출혈 부위의 완전한 지혈이 이루어지게 된다.
2차 지혈과정에 관여하는 혈액응고인자들의 대표적인 작용기전을 설명하면 먼저, 출혈 시에 파괴된 혈소판에서 트롬보플라스틴이 혈장 중으로 방출되어, 혈장 속에 존재하는 비활성상태인 프로트롬빈에 작용하게 되고, 프로트롬빈을 활성상태의 트롬빈으로 전환하는 작용을 한다. 이어서, 활성상태의 트롬빈이 혈액 속의 가용성 피브리노겐을 가수분해하여 불용성인 피브린으로 전환하는 반응을 촉매하고, 이 피브린이 서로 엉겨서 혈소판 마개를 더욱 단단히 고정함으로써, 출혈이 멎는 지혈과정이 이루어지게 된다.
하지만, 이러한 체내 지혈과정의 경우 가벼운 상처로 인한 경증출혈에는 충분히 지혈효과를 발휘할 수 있지만, 외과수술 시나 응급상황에서 발생하는 과다출혈의 경우 그 출혈을 충분히 멎게 하는데 한계가 있으므로 다른 효과적인 지혈방법의 사용이 추가적으로 요구되는 경우가 다반사이다.
이러한, 지혈방법으로는 크게 기계적 방법, 냉온에 의한 방법 및 화학적 방법 등이 존재하는데, 이중 화학적 방법으로는 혈액응고제 등을 출혈부위에 처치하여 출혈을 멎게 하는 것이 대표적이다.
현재 화학적 방법을 적용한 의료용 제제인 지혈제의 상용화된 제품을 살펴보면, 대표적으로 Surgicel®, Gelfoam®, Floseal® 및 Avitene® 등이 있다.
Surgicel®은 산화재생셀룰로오스로 만들어진 흡수성 니트로써, 산도가 높아 지혈과 동시에 향균 작용을 하며 7-14일 후 흡수된다. 그러나, 동맥 출혈에는 효과가 낮고, 체액의 피막 형성 및 이물질에 대한 거부반응, 비과적(rhinological)인 용도에서는, 낮은 pH로 인한 진통, 재채기 및 신경독성이 발생한다는 보고가 있다.
Gelfoam®은 정제 젤라틴에 포름알데히드를 열 중합 발포 공정을 통해 스펀지 상으로 만든 다공성 폼 형태의 지혈제이다. 비용이 적게 들어 수술 및 외상 시 흡수성 지혈제로 사용되고, 사용 후 4-6주 내에 조직에서 완전히 흡수된다. 하지만, 동맥출혈이나 출혈이 계속되고 있는 경우에는 압력 때문에 안전하게 붙어있지 못하여 출혈이 계속될 가능성이 있고, 이물반응으로 피막형성 및 혈종을 생성할 수 있다는 단점이 있다.
Floseal®은 Bovine 젤라틴과 트롬빈의 혼합물로 이루어진 높은 점도의 겔이다. 불규칙하고 축축한 표면인 점막 및 혈소판 기능 이상이 있을 때 사용 가능하다. 하지만 가격이 비싸고 유착을 일으킬 수 있으며, 이물 반응, 점막과 유합 및 염증반응을 일으킨다는 부작용이 있다.
Avitene®은 bovine corium collagen으로부터 partial hydrochloric acid salt로 제조된다. 이것은 혈소판을 공격해서 섬유 종괴를 형성하는 응고인자를 유리시킨다. 수술 중에 모세혈관 출혈을 조절하거나 결찰 등의 일반적인 방법이 비효과적이거나 불가능할 때 쓰인다. 하지만, 쉽게 부스러질 수 있으며, 겸자에 붙어 쉽게 떨어지지 않아 조작이 쉽지 않고, 흡착력이 낮아 지혈효과가 높지 않다.
이와 같이, 현재 상용되고 있는 흡수성 패킹은 고가로 판매되고 있음에도 그 지혈효과가 충분하지 못하거나, 점막의 재생효과가 미미한 경우가 많다. 따라서, 비용이 저렴하고, 지혈효과, 생체적합성 및 점막의 재생을 도와 재출혈을 방지할 수 있는 새로운 지혈제를 개발할 필요성이 계속적으로 요구되고 있다.
한편, 1960년대 Wichterle에 의해 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트) (PHEMA)로 이루어진 하이드로젤이 개발된 이후로 이것이 가지는 친수성과 생체적합성으로 인하여 생체재료분야에서의 응용이 증가되어 왔다. 하이드로젤은 특성상 다량의 수분 혹은 생물학적 체액을 함유할 수 있는 삼차원의 친수성 고분자 망상구조를 가지고 있는 구조를 말한다. 이러한 하이드로젤의 네트워크 망상구조는 화학 결합 또는 물리적 응집 등 여러 요인에 의해 형성되어 수용액상에서 팽윤된 후에 열역학적으로 안정하게 존재하게 된다. 하이드로젤은 유연한 강도 및 높은 함수율을 가지므로 살아있는 조직과 유사하여 의학 혹은 약학분야에 널리 이용되고 있다.
특히 하이드로젤을 이용한 주입형 시스템은 간단한 혼합만으로도 원하는 부위에 고효율의 전달 시스템을 설계하는 것이 가능하다. 또한 그 유동성은 결손된 부위를 채우는데 사용하기에도 적합한 물성을 가지고 있어 다양한 분야에서의 응용이 기대되는 방법이다.
하이드로젤을 주입형 재료로써 활용하기 위해서는 체외에서는 유체와 같이 유동성을 가지고 있으며 주입 후에는 물리적 혹은 화학적 자극에 의해 젤화되는 것을 필요로 한다. 분자의 얽힘에 의하거나 이온결합, 수소결합, 소수성 상호작용을 포함한 이차결합에 의해 하이드로젤을 형성하는 경우 가역적 혹은 물리적 하이드로젤이라고 부른다. 물리적 하이드로젤은 일반적으로 균일하지 못하며, 사슬의 중간부 혹은 말단이 일시적으로 결합하는 형태이다. 이러한 물리적 하이드로젤을 유지하는 상호작용은 가역적이며 물리적 조건 (온도, pH, 농도, 첨가물, 이온강도 등)이 변하면 붕괴될 수 있다.
그러나 주입 시 젤화되는 모델에서의 가장 큰 제약이라고 할 수 있는 것은 다양한 종류의 젤 전구체와 가교제의 농도에 큰 영향을 받는다는 것이다. 이는 가교제에 의해서 생체의학적인 제약이 생길 수도 있으며 가교제나 전구체에 의한 개질과 같은 효과를 나타내면서 강도등의 변화와 원하지 않는 기계적인 물성의 변화를 초래하기도 한다.
그리하여 이러한 약점을 극복하고자 최근에는 화학적 가교제의 선택에 있어서 천연물질에서 추출한 물질을 사용하는 등의 여러 가지 방면으로의 연구가 진행되어 오고 있으며 특히, 고추냉이에서 추출한 효소인 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)는 많은 주목을 받는 물질 중에 한 가지이다.
서양고추냉이 과산화효소(HRP)는 티라민(tyramine)과 과산화수소수(H2O2)와 함께 반응하여 가교제로서 역할을 수행하며, 생분해성과 생체적합성이 우수한 가교제로 알려져 있다. 크게 2가지 단계로 반응이 진행되는데 첫 번째 단계로 HRP가 과산화수소수에 의해서 산화되고, 두 번째 단계로 산화된 HRP는 티라민에 있는 페놀 그룹을 산화시켜서 중간체를 형성한다. 이렇게 생성된 물질로 인해서 가교점이 생성되어서 네트워크 구조를 형성하게 되는 것이다. 이때의 중요한 요소로는 H2O2와 HRP의 농도에 의해서 기계적 강도와 하이드로젤 형성 시간을 쉽게 조절할 수 있다는 점이다.
이러한 하이드로젤을 지혈제에 적용하여 다루기 쉽고 유동성 있는 형태를 갖고 지혈인자를 통해 우수한 혈액응고능을 나타내는 지혈제에 대한 필요가 존재한다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 외과수술 혹은 창상 시 과다출혈이 일어나는 출혈부위에 적용되어 신속한 혈액응고인자의 방출에 기인한 우수한 혈액응고능을 가지며, 주입형 하이드로젤 형태로 다루기 쉽고 유동성 있는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 본 발명의 목적을 달성하고, 후술하는 본 발명의 특징적인 효과를 실현하기 위한, 본 발명의 특징적인 구성은 하기와 같다.
본 발명에 따른 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법은 (a) 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시, 자유 라디칼 (TEMPO), 소듐 브로마이드 (NaBr) 및 소듐 하이포클로라이드 용액을 사용하여 풀루란에 카르복실기를 도입하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 카르복실기가 도입된 풀루란에 티라민, N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카르보다이이미드(EDC)를 이용하여 티라민을 도입하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 얻어진 티라민 치환된 풀루란에 서양고추냉이 과산화효소(HRP), 과산화수소수(H202), 트롬빈 및 염화칼슘(CaCl2)을 넣고 반응시켜 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a)단계에서 상기 풀루란은 중량평균분자량이 50,000 내지 250,000 g/mol이고, 하이드로젤 지혈제의 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 50 중량부로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (b)단계에서 티라민의 치환율은 1 내지 15%인 것을 특징으로 한다.
상기 (c)단계에서 상기 HRP의 농도는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량부로 포함하고, 상기 과산화수소수(H202)의 농도는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 30 중량부로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (c)단계는 티라민 치환된 풀루란, HRP, 트롬빈 및 염화칼슘을 실온에서 20분 내지 1시간 동안 pH6 내지 8의 PBS에 용해시켜 1차 용액을 제조하는 단계; 및
상기 1차 용액에 풀루란의 농도가 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 50 중량부로 포함하는 용액에 30% 과산화수소수(H202)인 2차 용액을 첨가하여 5초 내지 2분 동안 반응시켜서 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 트롬빈은 PBS 1 mL 당 100 내지 500 μg으로 포함하고, 상기 염화칼슘은 PBS 1 mL 당 3 내지 15 mM로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (c)단계에서 젤라틴, 키토산, 히알루론산, 알지네이트 및 셀룰로오스 유도체 중에서 선택된 1종 이상의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (c)단계에서 지혈물질로 피브리노겐, 비타민 C, 비타민 K, 콜라겐, 젤라틴 및 미세젤폼(gelfoam) 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 풀루란을 이용한 하이드로젤은 실온에서 점도가 10,000 내지 25,000 cP이고, 접착 강도가 10 내지 30 kPa인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제는 주입형 하이드로젤 형태로 제조되어 다루기 쉽고 유동성 있는 효과가 있으며, 동시에 지혈을 촉진하는 혈액응고인자를 도입하고, 이들이 효과를 나타내는 최적의 농도를 설정하여 지혈제의 혈액응고능을 증대시키는 효과가 있다.
또한, 생체 유래 천연고분자인 플루란을 사용하여 생체 내에서의 조직면역반응을 일으키지 않아 우수한 생체친화성 및 생분해성을 나타내는 효과가 있다.
또한, 조직 형태에 적합성이 있고 젤의 특성상 상처의 도포가 용이하며, 젤이 형성되었을 때 어느 정도의 기계적 강도를 가짐으로 인해 생체 내에서 일정시간 형태를 유지하면서 지혈 효과를 나타내는 효과가 있다.
또한, 젤레이션(gelation) 단계에 포함되는 서양고추냉이 과산화효소(HRP)와 과산화수소의 적절한 배합비를 제공함으로써 겔 형성능과 겔 형성시간을 최적화시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 풀루란에 카르복실기를 도입하기 위한 TEMPO 반응의 공정을 나타내는 도면이다.
도 2는 카르복실기가 도입된 풀루란에 티라민을 도입하기 위한 EDC 반응 공정을 나타내는 도면이다.
도 3은 하이드로젤의 제조 과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 풀루란 및 개질 풀루란의 ATR-FTIR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 5는 풀루란 및 개질 풀루란의 13C-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 6은 개질된 풀루란의 1H-NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 7은 풀루란 및 개질 풀루란의 GPC 데이터를 보여준다.
도 8은 풀루란 농도에 따른 젤화시간을 나타내는 도면이다.
도 9는 풀루란 농도에 따른 하이드로젤의 유변학적 특성을 레오미터를 통해 나타낸 도면이다.
도 10은 풀루란 농도에 따른 swelling ratio를 통해 crosslinking density 정도를 나타내는 도면이다.
도 11은 풀루란의 농도에 따른 in vitro 생분해성 평가를 나타내는 도면이다.
도 12는 풀루란 하이드로젤을 이용한 적혈구 용혈 실험을 나타내는 도면이다.
도 13은 SD rat을 이용한 지혈동물실험을 나타내는 도면이다.
도 14는 SD rat을 이용한 지혈동물실험의 풀루란 농도별 결과를 나타내는 사진이다.
도 15은 SD rat을 이용한 풀루란 농도별 결과에서 출혈양을 그래프로 나타낸 사진이다.
도 16는 SD rat을 이용한 풀루란 농도별 결과에서 출혈시간을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 17는 풀루란 하이드로젤로 처리된 간의 지혈부위를 H&E staining을 통해 조직학적 관찰한 결과이다.
도 18는 풀루란 하이드로젤로 처리된 간의 지혈부위를 carstairs staining을 통해 조직학적 관찰한 결과이다.
도 2는 카르복실기가 도입된 풀루란에 티라민을 도입하기 위한 EDC 반응 공정을 나타내는 도면이다.
도 3은 하이드로젤의 제조 과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 풀루란 및 개질 풀루란의 ATR-FTIR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 5는 풀루란 및 개질 풀루란의 13C-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 6은 개질된 풀루란의 1H-NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 7은 풀루란 및 개질 풀루란의 GPC 데이터를 보여준다.
도 8은 풀루란 농도에 따른 젤화시간을 나타내는 도면이다.
도 9는 풀루란 농도에 따른 하이드로젤의 유변학적 특성을 레오미터를 통해 나타낸 도면이다.
도 10은 풀루란 농도에 따른 swelling ratio를 통해 crosslinking density 정도를 나타내는 도면이다.
도 11은 풀루란의 농도에 따른 in vitro 생분해성 평가를 나타내는 도면이다.
도 12는 풀루란 하이드로젤을 이용한 적혈구 용혈 실험을 나타내는 도면이다.
도 13은 SD rat을 이용한 지혈동물실험을 나타내는 도면이다.
도 14는 SD rat을 이용한 지혈동물실험의 풀루란 농도별 결과를 나타내는 사진이다.
도 15은 SD rat을 이용한 풀루란 농도별 결과에서 출혈양을 그래프로 나타낸 사진이다.
도 16는 SD rat을 이용한 풀루란 농도별 결과에서 출혈시간을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 17는 풀루란 하이드로젤로 처리된 간의 지혈부위를 H&E staining을 통해 조직학적 관찰한 결과이다.
도 18는 풀루란 하이드로젤로 처리된 간의 지혈부위를 carstairs staining을 통해 조직학적 관찰한 결과이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제는 생분해성, 비독성 및 생체친화성을 갖는 풀루란을 주요 성분으로 하며, 티라민 및 과산화수소수 (H2O2)와 함께 반응하여 가교제로서 역할을 수행하며 생분해성과 생체적합성이 우수한 가교제로 알려져 있는 서양고추냉이 과산화효소 (HRP)를 이용하여 제조된다.
풀루란(pullulan)은 아우레오바시둠 풀루란스(Aureobasidum pullulans)가 세포외(extracellular)로 생산하는 물질로서, 주로 3개의 글루코오스가 α-1, 3 결합된 말토트리오스가 α-1, 6 결합으로 반복 결합된 직쇄상의 글루칸으로 형성되어 있다. 상세한 구조 연구에 의해 풀루란은 말토트리오스 단위만의 반복 구조만으로 형성된 것이 아니라 말토테르라오스가 수 % 함유되어 있으며, 분자의 말단은 글루코오스이고 덱스트란과는 다른 구조로 이루어져 있다고 밝혀져 있다. 이런 구조를 가진 플루란은 무미무취하고 부정형의 백색분말로 각종 독성, 변이원성 시험 결과에 대해 아무 문제가 없어 국내외에서 식품 첨가물로 인가되어 있다. 또한 다른 다당류에 비해 물에 녹기 쉽고 저점성이지만 부착성과 실같이 늘어나는 성질이 강하며 안정한 중성용액으로 여러 가지 응용이 용이한 다당류 물질이다. 그리고 수용액의 점성은 온도 의존성이 비교적 낮고 각종 염류 및 pH의 영향을 적게 받는 특성을 가지고 있다. 한 예로서 각종 금속 이온이 공존하는 풀루란 수용액의 (1% 수용액, 25℃, 30 rpm) 점도가 250 ~ 300 cp로 풀루란 분자 중의 -OH기와 킬레이트를 형성한다고 생각되는 티탄, 붕소 이온의 경우를 제외하면 어느 경우도 점도의 증가나 젤이 형성되지 않는다. 그리고 접착성이 우수한 특성과 함께 구조상 많은 미생물에 의해서 완전히 자화 되어 최종적으로는 탄화가스와 물로 변환되는 생분해성적인 특성을 가진 고분자 물질이다.
풀루란을 원료로 하고 HRP를 가교제로 이용한 하이드로젤 제조방법은 i) TEMPO 반응을 통해 풀루란에 카르복실기를 도입하는 단계, ii) 풀루란에 티라민을 도입하기 위한 EDC 반응 단계, 및 iii) 개질된 풀루란과 서양고추냉이 과산화효소 및 과산화수소수를 반응시켜 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함한다.
도 1은 본 발명에 따라 풀루란에 카르복실기를 도입하기 위한 TEMPO 반응의 공정을 나타내는 도면이고, 도 2는 카르복실기가 도입된 풀루란에 티라민을 도입하기 위한 EDC 반응 공정을 나타내는 도면이며, 도 3은 하이드로젤의 제조 과정을 나타내는 도면이다.
도 1 내지 3을 참조하면, 본 발명에 따른 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법은 (a) 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시, 자유 라디칼 (TEMPO), 소듐 브로마이드 (NaBr) 및 15% 소듐 하이포클로라이드 용액을 사용하여 풀루란에 카르복실기를 도입하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 카르복실기가 도입된 풀루란에 티라민, N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카르보다이이미드(EDC)를 이용하여 티라민을 도입하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 얻어진 티라민 치환된 풀루란에 서양고추냉이 과산화효소(232 unit/mg, HRP), 30% 과산화수소수(H202), 트롬빈 및 염화칼슘(CaCl2)을 넣고 반응시켜 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a)단계에서 상기 풀루란은 중량평균분자량이 50,000 내지 250,000 g/mol이고, 바람직하게는 100,000 내지 200,000 g/mol일 수 있다. 또한, 하이드로젤 지혈제의 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 50 중량부로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 50 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위보다 높은 범위를 갖게 되는 경우 생체 내에서 하이드로젤의 점도가 너무 높아져 젤화에 시간이 오래 걸리게 되어 지혈시간을 지연시키게 되고 상기 범위보다 낮은 범위를 갖게 되는 경우 하이드로젤의 조직접착성이 떨어질 수 있다.
HRP가 가교제로서 작용하기 위해서는 티라민기를 필요로 하지만 풀루란에는 티라민기가 존재하지 않으므로 풀루란을 이용하기 위해서는 풀루란에 티라민기의 도입이 필요하다. 이러한 풀루란의 개질에 있어서, 하이드로젤의 기계적 강도와 젤 형성 시간을 고려할 때, 상기 (b)단계에서 티라민의 치환율은 약 1 내지 15%, 바람직하게는 약 4 내지 10%가 적절하며, 보다 바람직하게는 6.4%의 치환율이 적절하다.
하이드로젤을 제조하기 위한 상기 (c)단계에서 상기 HRP의 농도는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량부로 포함하고, 상기 과산화수소수(H202)의 농도는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 30 중량부로 포함할 수 있다.
또한, 상기 (c)단계는 두 단계로 나누어 진행될 수 있는데 티라민 치환된 풀루란, HRP, 트롬빈(92.6 units/mg) 및 염화칼슘을 실온에서 20분 내지 1시간, 바람직하게는 30분 동안 pH 6 내지 8, 바람직하게는 pH 7의 PBS에 용해시켜 1차 용액을 제조하는 단계; 및 상기 1차 용액에 티라민 치환된 풀루란 및 30% 과산화수소수(H202)를 실온에서 pH 6 내지 8, 바람직하게는 pH 7의 PBS에 용해시켜 만든 2차 용액을 첨가하여 5초 내지 2분 동안 반응시켜서 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
과산화수소수에 의해 산화된 HRP는 풀루란에 도입된 티라민기에 있는 페놀기를 산화시켜 중간체를 형성하며 이로 인해 가교점이 생성되어 네트워크 구조를 형성함으로써 주입형 하이드로젤이 형성되게 된다.
상기 트롬빈은 PBS 1 mL 당 100 내지 500 μg으로 포함하고, 상기 염화칼슘은 PBS 1 mL 당 3 내지 15 mM으로 포함할 수 있다. 이 수치범위보다 낮은 경우 지혈 효과가 떨어지고, 높은 경우 경제적 손실을 초래할 수 있다.
상기 (c)단계에서 풀루란 외에도 젤라틴, 키토산, 히알루론산, 알지네이트 및 셀룰로오스 유도체 중에서 선택된 1종 이상의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (c)단계에서 지혈물질로 트롬빈 및 염화칼슘 외에도 피브리노겐, 비타민 C, 비타민 K, 콜라겐, 젤라틴 및 미세젤폼(gelfoam) 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 풀루란을 이용한 하이드로젤은 실온에서 점도가 10,000 내지 25,000 cP일 수 있다. 또한, 접착 강도가 10 내지 30 kPa인 것을 특징으로 한다. 상기 범위를 만족하는 경우 하이드로젤 지혈제가 지혈 부위로부터 이탈되거나 유실되는 현상을 방지할 수 있다. 상기 점도 범위보다 높은 범위를 갖는 경우 수술 시 조작용이성에 대한 문제가 생기게 되며, 반대로 상기 범위 보다 낮은 범위를 갖게 되는 경우 조직 부착성 및 저장성에 문제가 발생하게 된다.
또한 본 발명의 하이드로젤 지혈제는 주사형, 스프레이형, 겔형, 액형 및 에어로졸 형태 등으로 이용될 수 있기 때문에 상기 점도 및 접착 강도 범위를 갖는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 풀루란에 카르복실기를 도입하는 단계
풀루란의 개질을 위하여, 먼저 풀루란에 카르복실기를 도입하고자 알드리치(Aldrich)사에서 구입한 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시, 자유 라디칼(TEMPO)과 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사에서 구입한 소듐 브로마이드(NaBr)와 소듐 하이포클로라이드 용액을 이용하였다. 풀루란을 TEMPO 그리고 NaBr과 함께 3차 증류수에 넣고 1℃에서 충분히 교반시켜 준다. 이후 15% NaOCl 용액을 첨가 하면서 용액의 pH를 4 M HCl를 서서히 첨가하여 9.5로 유지하면서 0.5 M NaOH 용액을 넣어 주면서 약 120분 정도 교반하여 준다. 그 후에 반응을 종결시키기 위하여 메탄올을 첨가하여 준 후에 4 M HCl을 이용하여 중성화하여 준다. 그 다음 용액을 아세톤으로 침전 시킨 후 미반응 물질을 제거하기 위하여 침전 과정을 2 ~ 3회 정도 반복 한 후 용액을 감압 건조하여 카르복실기가 도입된 풀루란을 제조하였다(도 1).
2. 풀루란에 티라민를 도입하는 단계
앞서 제조된 카르복실기가 도입된 풀루란에 티라민기를 도입하고자 플루카(Fluka)사에서 구입한 티라민, 와코(Wako)사에서 구입한 N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 TCI사에서 구입한 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카르보다이이미드(EDC)를 이용하여 반응을 진행하였다.
우선 개질된 풀루란을 3차 증류수에 넣고 약 3 ~ 5시간 충분히 교반하여 준 후 만들어진 용액에 티라민과 EDC 그리고 NHS를 함께 용액에 넣고 pH를 4.7로 유지하여 주면서 약 12시간 교반한다. 그 후에 만들어진 용액을 4 M HCl을 이용하여 중화한 뒤 반투석막에 넣어 100 mM NaCl 용액, 25% 에탄올 그리고 증류수에서 각각 약 2일, 1일, 1일씩 4일간 투석하여 준다. 투석을 마친 용액을 동결 건조하여 티라민이 도입된 샘플을 제조하였다(도 2).
3. 하이드로젤 지혈제의 제조
앞서 제조된 티라민 치환된 풀루란에 암레스코(Amresco)사에서 구입한 서양고추냉이 과산화효소(232 unit/mg, HRP), 대정(Daejung)사에서 구입한 과산화수소(H202), 트롬빈(92.6 units/mg) 및 염화칼슘을 첨가하여 실온에서 30분 동안 pH 7에서 용해시킨 다음에, 30% 과산화수소와 티라민 치환된 풀루란을 용해한 용액을 첨가하여 60 초 이내로 반응시켜 최종적으로 하이드로젤 지혈제를 제조하였다(도 3).
< 실험예 >
실험예 1
Attenuated total reflection FT-IR을 통한 풀루란 개질 확인
도 4는 풀루란 및 개질 풀루란의 ATR-FTIR 스펙트럼을 보여주는 도면이다. 도 4를 참조하면, 본 발명에 따른 TEMPO 반응과 EDC 반응 후의 풀루란 개질 유무를 확인하기 위해 attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR, IRAffinity-1S, Shimadzu)가 사용되었다. TEMPO 반응 후 1600 cm-1 에서 피크를 나타냄을 통해 -OH기가 O-C=O기로 산화하였음을 확인할 수 있었다(carboxylated pullulan). 반면 EDC-NHS 반응 후에는 피크의 변화가 없었는데 이는 이는 티라민의 도입량이 적기 때문인 것으로 나타났다. 티라민의 도입 여부는 NMR을 통하여 확인하였다.
실험예 2
NMR을 통한 풀루란 개질 확인
1) 13C-NMR 스펙트럼 분석
도 5는 풀루란 및 개질 풀루란의 13C-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다. 도 5를 참조하면, TEMPO 반응 후의 개질 여부 확인을 위해 13C-NMR이 사용되었다(BRUKER BIOSPIN/AVANCE 400, 400MHz FT-NMR, Bruker, Germany). 175 ppm에서 카르복실산과 카르복실릭 염 형태의 특성피크를 보이는데 이를 통해 TEMPO 반응에 의해 1차 알코올이 산화하여 카르복실기로 존재함을 확인하였다.
2) 1H-NMR 스펙트럼 분석
도 6은 개질된 풀루란의 1H-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다. 도 6을 참조하면, EDC-NHS 반응 후의 티라민 도입 여부 확인을 위해 1H-NMR을 사용하였다(BRUKER BIOSPIN/AVANCE 400, 400MHz FT-NMR, Bruker, Germany). 7 ppm 부근에서 티라민의 벤젠 특성 피크를 보이는데 이를 통해 EDC-NHS 반응에 의해 티라민이 도입됨을 확인하였다. 또한, C2, C3에서 나타나는 수소의 적분비와 비교하여 티라민의 치환율을 확인하였다.
실험예 3
겔투과 크로마토그래피를 통한 분자량 분석
도 7은 풀루란 및 개질 풀루란의 GPC 데이터로서, 풀루란의 개질 단계별 분자량 변화를 살펴보기위해 수용성 젤투과 크로마토그래프 시스템(GPC) (Breeze System, USA)를 사용하였다. 도 7을 참조하면, 초기 180,000 Mw의 풀루란이 TEMPO 반응 후 97,667 Mw으로, EDC-NHS 반응 후 22,355 Mw로 분자량이 감소함을 확인할 수 있다.
실험예 4
하이드로젤화 시간 분석
도 8은 풀루란과 HRP 농도에 따른 젤화시간을 나타내는 도면이다. 풀루란의 농도가 0.15 g/ml 일 때, HRP의 농도가 3 mg/ml 이상일 경우 젤화가 5초 이내 이루어짐을 확인하였다. 또한, HRP의 농도가 3 mg/ml 일 때, 풀루란의 농도가 0.15 이상일 경우 젤화가 5초 이내 이루어짐을 확인하였다.
실험예 5
유변학적 특성 분석
도 9는 풀루란 농도에 따른 하이드로젤의 유변학적 특성을 레오미터를 통해 나타낸 도면이다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 하이드로젤의 유변학적 특성을 파악하고자 Thermo Scientific HAAKE MARS II Rheometer (Thermo Scientific HAAKE MARS II Rheometer, Thermo, Germany)를 사용하였다. 사용된 레오미터(Rheometer)는 고분자 물질뿐만 아니라 용액, 에멀젼, 서스펜션, 열경화성 재료의 유변학적 물성(물질의 점도, 탄성률, 응력, 전단속도 등)을 측정하는 기기로서 미지의 재료에 대한 물질정보를 유동과 변형을 부과하여 물리적인 방법으로 물질의 구조 및 특성을 파악 할 수 있다.
HRP의 농도가 3.0 mg/ml로 같을 경우, 풀루란의 농도(0.3 g/ml, 0.4 g/ml, 0.5 g/ml)가 높아짐에 따라 저장탄성률이 높아지는 것을 보아 풀루란의 농도를 조절함으로써, 원하는 저장탄성률을 가지는 하이드로젤을 만들 수 있음을 확인하였다.
실험예 6
풀루란 농도에 따른 swelling ratio 분석
도 10은 풀루란 농도에 따른 swelling ratio를 통해 crosslinking density 정도를 나타내는 도면이다. 지름 1 cm, 높이 0.5 cm의 알루미늄 팬에 하이드로젤을 주사하여 일정 크기의 하이드로젤을 만든 뒤, 50 ml PBS 용액 (pH 7.2, 37℃)에 넣어 1, 3, 5, 10, 15 분이 지난 뒤 무게를 측정하였다. Swelling ratio는 다음과 같은 식으로 계산을 하였다.
Ws: swelling된 하이드로젤의 무게이다.
Wd: 동결건조된 하이드로젤의 무게이다.
풀루란 농도가 0.3 g/ml 이고, HRP 농도가 3 mg/ml일때 시간에 따른 swelling ratio가 가장 높게 나타났다.
실험예 7
풀루란 하이드로젤의
in vitro
생분해성 평가
제조한 하이드로젤 지혈제의 생분해거동을 알아보기 위한 in vitro 생분해 거동을 확인하여 도 11과 같이 나타내었다. 샘플을 50 mL cornical tube에 넣은 후 25 mL phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) 용액을 넣고 shaking bath (90 rpm, 37℃)에 넣어 시간경과 (0, 5, 12, 24 h)에 따른 하이드로젤의 생분해 거동을 관찰하였다. 시간에 따라 회수한 시편은 새로운 10 mL cornical tube에 넣고 동결건조 한 뒤 무게를 측정하였다. 풀루란의 농도(0.3, 0.4, 0.5 g/mL)가 높아짐에 따라 5시간 후 in vitro 환경에서의 생분해 거동을 관찰하였을 때, 각각 30.4%, 24.4%, 17.1%의 무게 감소율을 보였고, 12시간 후에는 각각 72.7%, 70.5%, 62.9% 임을 확인하였다. 24시간 후에는 모든 샘플이 분해되었음을 관찰할 수 있었다.
실험예 8
트롬빈 및 염화칼슘 농도에 따른 PRT 실험
본 발명에 따른 하이드로젤 제조 시 트롬빈 및 염화칼슘을 포함하여 농도별 혈액응고능 실험을 시행하였다. 각 농도의 지혈제를 37%로 맞춘 항온수조 위 시계접시에 300μL 첨가 후, 혈액을 3000 rpm 이상으로 원심분리하여 얻은 PPP(Platelet-poor-plasma) 300μL 를 시계접시 위 용액에 첨가하였다. 이후 혈전이 생성되는 시간을 측정하였다.
[표 1] [표 2]
표 1과 같이 트롬빈의 경우 67 μg/300μL 에서 6s의 결과가 나온 것을 보아 효율적인 농도로 보이며, 표 2와 같이 CaCl2의 경우 농도가 너무 높거나 낮을경우 지혈 효과가 떨어지는데 0.009375 M 일때 96s로 가장 효율적임을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따라 상기 (c)단계에서 하이드로젤 제조 시, 트롬빈은 PBS 1 mL 당 100 내지 500 μg으로 포함하고, 상기 염화칼슘은 PBS 1 mL 당 3 내지 15 mM로 포함할 수 있다. 이 수치범위를 벗어난 경우 지혈 효과가 떨어져 지혈되는데 시간이 너무 오래 걸릴 수 있다.
실험예 9
제조된 하이드로젤 지혈제의
적혈구 용혈 실험
혈액 응고 후의 잔여 적혈구 양을 측정하기 위해 적혈구 용혈 실험을 실시하여, 용혈된 적혈구에서 나온 헤모글로빈의 흡광도를 통해 혈액 응고능을 확인하였다. 대조군은 하이드로젤 샘플을 도입하지 않은 채로 혈액응고 반응을 진행한 경우이다. 일정 시간 후 샘플 위에 5 mL의 증류수를 첨가하여 혈액응고반응을 정지시킨 후 얻은 상등액을 96 well plate에 분주하여 헤모글로빈의 흡광도를 측정한다. 혈액응고가 많이 진행되면 잔여 적혈구의 양이 적기 때문에 용혈을 통해 방출된 헤모글로빈의 양도 적으므로, 헤모글로빈의 흡광도 세기를 통해 지혈능을 관찰할 수 있다.
도 12와 같이, 측정 결과 대조군에 비해 지혈제를 담지한 하이드로젤을 사용한 경우 흡광도가 낮게 나타났으며 풀루란의 농도가 낮은 하이드로젤 일수록 흡광도가 낮다는 것을 관찰하였다.
실험예 10
제조된 하이드로젤 지혈제의
i
n vivo
지혈 실험
도 13은 SD rat을 이용한 지혈동물실험을 나타내는 사진이다. SD rat에 Zoletil® 50과 Rompun®을 4:1 비율로 섞은 동물용 마취제를 투여하여 마취한 후 SD rat이 마취되면 복부 부위의 털을 제모하여 수술대에 45°로 기울여 고정하였다. 포비돈 요오드 용액으로 복부 제모 부위를 소독한 후 중앙에 10번 블레이드를 이용하여 약 20 내지 30 mm 절개하고 피부 및 복막을 박리하여 양측방으로 거상시켜 간을 노출시켰다. 미리 무게를 재둔 필터페이퍼를 간 밑에 배치한 후, 마개 위로 3 mm 노출된 10번 블레이드를 이용하여 깊이 3 mm의 상처를 간 좌엽에 내고, 출혈이 시작되면 하이드로젤 0.5 ml를 도입하여 지혈이 되는 시간을 측정하였다. 지혈이 되면 혈액을 흡수한 필터페이퍼와 하이드로젤 무게를 재어, 출혈량을 계산하였다.
도 14는 SD rat을 이용한 지혈동물실험의 풀루란 농도별 결과를 나타내는 사진이다. 하기 표 3과 같이 풀루란 농도를 0.3 g/ml, 0.4 g/ml, 0.5 g/ml로 달리 제조한 하이드로젤 지혈제를 사용하였다.
[표 3]
도 15는 SD rat을 이용한 풀루란 농도별 결과에서 출혈양을 그래프로 나타낸 도면이다. 출혈량의 경우 대조군이 1,149.9 mg, 풀루란 0.3, 0.4, 0.5 g/ml의 경우 각각 651.2, 334.3, 273.3 mg 의 출혈이 나타났음을 확인하였고, 0.5 g/ml의 경우 지혈 효과가 가장 큼을 확인할 수 있었다.
도 16은 SD rat을 이용한 풀루란 농도별 결과에서 출혈시간을 그래프로 나타낸 도면이다. 지혈시간은 대조군의 경우 약 130 초, 풀루란 0.3, 0.4, 0.5 g/ml의 경우 각각 61.5, 50.1, 10.5 초 이내로 지혈이 이루어짐을 확인하였고, 0.5 g/ml의 경우 지혈 효과가 가장 큼을 확인할 수 있었다. 이는 풀루란의 농도가 낮을수록 45°의 각도에 의해 흐르게 되어 초기 지혈이 이루어지지 않은 것으로 보이며, 농도가 높을 경우 흐르지 않아 초기 지혈이 이루어졌기 때문에 지혈능이 효과적인 것으로 사료된다
도 17은 풀루란 하이드로젤로 처리된 간의 지혈부위를 H&E staining을 통해 조직학적으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 세포의 핵은 파랗게, 세포질은 붉게 염색되는데 상처 부위가 붉은 것을 보아 상처부위에 적혈구가 잘 얽혀있음을 확인할 수 있었다. 도 18은 풀루란 하이드로젤로 처리된 간의 지혈부위를 carstairs staining을 통해 조직학적으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 이 염색법은 피브린을 붉게, 혈소판은 푸르게 염색시키는데, 상처부위가 붉은 것을 보아 피브린이 잘 형성되어 있음을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
Claims (12)
- (a) 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시, 자유 라디칼 (TEMPO), 소듐 브로마이드 (NaBr) 및 소듐 하이포클로라이드 용액을 사용하여 풀루란에 카르복실기를 도입하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 얻어진 카르복실기가 도입된 풀루란에 티라민, N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카르보다이이미드(EDC)를 이용하여 티라민을 도입하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 얻어진 티라민 치환된 풀루란에 서양고추냉이 과산화효소(HRP), 과산화수소수(H202), 트롬빈 및 염화칼슘(CaCl2)을 넣고 반응시켜 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a)단계에서 상기 풀루란은 중량평균분자량이 50,000 내지 250,000 g/mol이고, 하이드로젤 지혈제의 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 50 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b)단계에서 티라민의 치환율은 1 내지 15%인 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서 상기 HRP의 농도는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서 상기 과산화수소수(H202)의 농도는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 30 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계는 티라민 치환된 풀루란, HRP, 트롬빈 및 염화칼슘을 실온에서 20분 내지 1시간 동안 pH6 내지 8의 PBS에 용해시켜 1차 용액을 제조하는 단계; 및
상기 1차 용액에 30% 과산화수소수(H202)인 2차 용액을 첨가하여 5초 내지 2분 동안 반응시켜서 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 트롬빈은 PBS 1 mL 당 100 내지 500 μg으로 포함하고, 상기 염화칼슘은 PBS 1 mL 당 3 내지 15 mM로 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서 젤라틴, 키토산, 히알루론산, 알지네이트 및 셀룰로오스 유도체 중에서 선택된 1종 이상의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서 지혈물질로 피브리노겐, 비타민 C, 비타민 K, 콜라겐, 젤라틴 및 미세젤폼(gelfoam) 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제의 제조방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 제조된 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제.
- 제10항에 있어서,
상기 하이드로젤 지혈제는 실온에서 점도가 10,000 내지 25,000 cP인 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제.
- 제10항에 있어서,
상기 하이드로젤 지혈제는 접착 강도가 10 내지 30 kPa인 것을 특징으로 하는 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제.
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