KR20190054111A

KR20190054111A - 실란트 제형 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190054111A
Application number: KR1020197010506A
Authority: KR
Inventors: 로넨 이브리; 아마치아 간츠; 로니 민츠; 이스라엘 누르; 다미안 비스노베즈키
Original assignee: 옴릭스 바이오파머슈티컬스 리미티드
Priority date: 2016-09-14
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2019-05-21
Also published as: MA46243A; CN109715223A; AU2017328479A1; WO2018051324A1; AU2017328479B2; EP3512571A1; IL247821A0; IL265251B2; IL265251B1; US20180071429A1; JP2019526645A; CA3036771A1; IL265251A

Abstract

본 발명은 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형에 관한 것이다.

Description

실란트 제형 및 이의 용도

본 발명은 피브리노겐계 실란트 또는 피브린 실란트 제형에 관한 것이다.

현재 개시된 주제에 대해 배경 기술로서 관련이 있는 것으로 고려되는 참고문헌들이 하기에 열거된다:

상기 참고문헌들을 본 명세서 내에서 인정한다는 것은 이들이 어떠한 방식으로든 현재 개시된 주제의 특허성과 관련된 것임을 의미하는 것으로 추론되어서는 안 된다.

- 미국 특허 제5,985,315호

- 국제특허 공개 WO 93/05822호

- 미국 특허 제5,792,835호

- 미국 특허 제5,985,315호

- 미국 특허 제6,916,911호

- 미국 특허 제8,962,033호

- 유럽 특허 제1 351 705호.

배경

생물학적 글루(glue)/실란트가 본 기술 분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 2-성분 글루가 미국 특허 제5,985,315호에 개시되어 있다. 구체적으로, 미국 특허 제5,985,315호에는 피브리노겐 및 하나 이상의 응고 인자를 포함하는 혈장 유래 생물학적 글루를 제조하는 방법이 기재되어 있으며, 이 응집 인자는 수용액에서 자발적으로 응고되지 않으며 칼슘 이온을 함유하는 성분을 첨가함으로써 응고될 수 있다.

또한, 국제특허 공개 WO 93/05822호에는 전혈 동결침전물 및 단백질 분해 효소를 포함하는 조직 글루가 기재되어 있다.

미국 특허 제5,792,835호에는 피브리노겐, 인자 II, 및 소량의 플라스미노겐을 포함하는 혈장으로부터 국소 피브리노겐 복합체를 제조하는 방법이 기재되어 있다.

미국 특허 제6,916,911호에는 6개 이상의 피브리노겐 단위를 갖는 피브리노겐 다량체를 포함하는 피브린 실란트의 제조 방법이 기재되어 있다.

미국 특허 제8,962,033호에는 피브린 매트릭스의 제조, 및 구체적으로 피브린 매트릭스를 누출 조직 상에 도포하는 방법이 기재되어 있으며, 이 방법은 소정 양의 고체 피브린 실란트 블렌드(blend)를 조직 상에 도포하는 단계와 이어서 고체 피브린 실란트 상에 소정 양의 액체 피브린 실란트를 도포하는 단계를 포함하며, 이 고체 블렌드는 피브리노겐과 반응할 때 피브린을 형성할 수 있는 단백질 분해 효소를 포함한다. 고체 피브린 및 액체 피브린 실란트의 조합은 조직 상에 피브린 매트릭스를 형성한다.

마지막으로, 유럽 특허 제1 351 705호에는 재조합 인자 VIIa와 피브리노겐의 조합물이 조합물의 정맥내 투여 후 출혈의 치료에 효과적인 것으로서 기재되어 있다.

본 발명은 피브리노겐, 칼슘 이온 및 인자 XIa(본 명세서에서 약어 FXIa로 또한 지칭됨)를 포함하는 하나/단일 성분 실란트(글루) 제형의 개발에 기초한다. 놀랍게도, 단일 성분 실란트로서의 이들 성분의 조합은 저장 안정성이지만, 혈액과 접촉 시에 자발적으로 응고되는 것으로 밝혀졌다.

이러한 발견에 따라, 본 발명은, 그의 태양들 중 제1 태양에 따르면, 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 제공하며, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하다.

제2 태양에 따르면, (i) 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 실란트 제형을 수용하는 용기로서, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한, 상기 용기; 및 (ii) 실란트 제형의 전달을 위한 재밀봉 가능한 개구를 포함하는, 어플리케이터가 본 발명에 의해 제공된다.

또한 제3 태양에 따르면, 실란트 제형을 수용하는 지지 매트릭스를 포함하는 상처 드레싱이 본 발명에 의해 제공되며, 실란트 제형은 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하고, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하다.

또한, 제4 태양에 따르면, 피브린 혈전의 형성을 촉진하는 방법이 제공되며, 이 방법은 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 실란트 제형과 혈액을 접촉시키는 단계를 포함하고, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하다.

더욱이, 제5 태양에 따르면, 본 발명은 상처 치료를 필요로 하는 대상에서 상처를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 상처의 적어도 일부분 상에 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 소정 양의 실란트 제형을 도포하는 단계를 포함하고, 이 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하고, 상기 실란트 제형의 양은 상기 상처와 접촉할 때 상기 상처에서 응고를 촉진하기에 효과적이다.

본 발명은, 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 실란트 제형 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 용기를 포함하는 키트를 제공하며, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하다.

본 발명은, 하기 단계들을 포함하는, 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형의 제조 방법을 제공하며, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하다:

a) 혈액 유래 피브리노겐 농축물 성분을 제공하는 단계;

b) 인자 XIa 성분을 제공하는 단계;

c) 2가 양이온 성분을 제공하는 단계; 및

d) 모든 성분들을 혼합하여 제형을 얻는 단계.

용어 "혼합"은 성분들을 임의의 순서, 임의의 조합 및/또는 하위-조합으로 혼합하는 것을 의미한다.

저장-안정성 수성 실란트 제형에 대해 본 명세서에서 상기 및 하기에 기재된 모든 실시 형태 및 정의는 또한 본 발명에 따른 어플리케이터, 상처 드레싱, 방법 및/또는 키트에 관한 것이다.

본 명세서에 개시된 주제를 더 잘 이해하고 그것이 실제로 어떻게 수행될 수 있는지를 예시하기 위하여, 첨부 도면을 참조하여, 단지 비제한적인 예로서, 실시 형태들을 이제 기재할 것이다.
도 1은 Ca²⁺의 첨가 후 혈전 형성 및 (바이알 내의) 시험된 제형을 나타내는 이미지이다(바이알 1 내지 바이알 8, 및 대조군 바이알 9 및 대조군 바이알 10).
도 2는 응고 시간에 대한 CaCl₂ 농도 및 상이한 FXIa 농도의 영향을 나타내는 그래프이다.

본 발명은, 그의 제1 태양에 따르면, 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 제공하며, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하다.

본 발명과 관련하여, 용어 "실란트 제형"은 단일/하나의 성분의 접착제/글루/지혈제로서 이해되어야 하며, 이 제형은 조직 및/또는 예를 들어 조직과 근접해 있는 혈액과 접촉 시에 반응하여 후속적으로 혈전을 형성하는 성분들을 가지며, 조직 접착제로서 작용하여, 출혈을 멈추게 하고/하거나, 구조체들을 결합하고/하거나, 예를 들어 뇌척수액(CSF), 림프액, 담즙, 위장(GI) 내용물, 폐로부터의 공기 누출 등의 생리학적 누출을 밀봉한다. 일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 또한 치료제를 포함하여, 체내에서 형성된 혈전의 자연적 분해 시에 치료제가 방출되도록 한다. 치료제는 항생제, 진통제, 항염증 약물, 항암 약물 등과 같은 약물, 예를 들어, 인간 또는 다른 기원의 임의의 유형의 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기 세포, 만능 줄기 세포(iPSC) 등을 포함하는 세포일 수 있지만, 이로 한정되지 않는다.

때때로, 실란트 제형은 "피브리노겐계 실란트"로 지칭되며, 본 명세서에 개시된 맥락에서, 이는 피브린 글루, 피브린 실란트, 피브린 접착제, 피브린 필름, 피브린 네트워크, 피브린 격자, 피브린 메시, 피브린 그리드(greed) 및 피브린 겔을 형성하거나 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

실란트 제형은 적어도 피브리노겐, 2가 양이온 및 인자 XIa의 블렌드를 포함한다. "블렌드"를 언급할 때, 이는 임의의 형태의 혼합물, 즉 3가지 이상의 성분의 균질 혼합물 및 불균질 혼합물로서 이해되어야 한다. 블렌드는 하기에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이 다른 성분들을 포함할 수 있다.

놀랍게도, 수성 제형 중의 2가 양이온의 존재에도 불구하고, 실란트 제형은 불활성이며, 즉 선택된 저장 조건 하에서 충분한 시간 동안 자발적으로 응고되지 않는 것으로 밝혀졌다. 실란트 제형이 혈장 또는 혈액과 접촉함에 따라, 인자 XIa는 응고 메커니즘의 하류의 고유 성분들을 활성화시키며, 이는 결국 제형 내의 피브리노겐의 존재 하에서 글루의 형성을 야기한다.

실란트 제형은 수성 제형이다. "수성 제형"을 언급할 때, 이는 물 분자를 함유하는, 액체 또는 고체 형태의, 성분들의 블렌드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시 형태에서, 수성 제형은 액체 형태이다. 액체 형태인 경우, 일부 실시 형태에 따르면, 액체 담체는 본질적으로 중성인 pH, 예를 들어 pH 7.0±0.5를 갖는 완충제이다.

일부 다른 실시 형태에서, 제형은 고체 형태이다. 일부 실시 형태에서, 제형은 동결된다. 사용 전에, 제형은 해동될 수 있다.

또 일부 다른 실시 형태에서, 제형은 분말, 예를 들어 동결건조된 분말의 형태이며, 사용 전에 또는 표적 부위(예를 들어, 조직) 상으로의 도포 동안 분말은 저장에 적합한 수성 용액으로 또는 혈액으로 습윤화된다.

실란트 제형은 저장 안정성이다. 용어 "저장 안정성" 또는 "안정한"은 사전-선택된 저장 온도, 제형의 사전-선택된 물리적 상태(예를 들어, 유체/액체, 고체 등)를 포함하는 사전-선택된 저장 조건(이하 참조) 하에서 안정한 제형을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 안정성은 사전-선택된 저장 조건 하에서, 예를 들어 제형이 액체 형태일 때 제형 내의 가시적 응집 및/또는 피브린 혈전의 부재를 시험함으로써 결정될 수 있다. 안정성은 사전-선택된 저장 조건 하에서 제형의 저장 후 제형 내의 피브리노겐 함량을, 예를 들어, 응고 분석 및/또는 웨스턴 블롯(western blot) 및/또는 면역분석에 의해 측정함으로써 또한 결정될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 안정한 실란트 제형을 언급할 때, 이는 사용 시에 제형의 저장 조건과 무관하게 효과적인 응고 시간을 가지며, 예를 들어, 실란트 제형은 실온에서 저장되었든 더 낮은 온도에서 저장되었든 관계없이 본질적으로 동일한 기간에 응고되는 것으로 이해되어야 한다.

추가적으로 또는 대안적으로, 그리고 본 발명에 따르면, 안정한 실란트 제형을 언급할 때, 이는 사전-선택된 저장 조건 하에서의 저장 후에 그리고 사용 시에, 37℃로 설정된 다이아그노스티카 스타고 스타트(Diagnostica Stago START™) 응고 기계를 사용하여, 예를 들어 60초 동안 샘플을 인큐베이션한 후 유니캘리브레이터(Unicalibrator)를 첨가하고 이어서 37℃에서 응고 시간을 측정할 때, 제형이 500초 이하의 응고 시간을 갖는 것으로 이해되어야 한다.

500초 이하, 예를 들어 100 내지 500초의 범위의 응고 시간이 (혈액 또는 혈장 성분들의 존재 하에서), 예를 들어 조직들(예를 들어, 피판(skin flap)들)을 결합하는 데 유익할 수 있다.

일 실시 형태에서, 1-성분 실란트는 생리학적 혈액 응고 성분에 기초하기 때문에 출혈의 재발생을 방지하는 데 사용된다.

다른 실시 형태에서, 1-성분 실란트는 200초 이하 이내에, 예를 들어, 100 내지 200초의 시간 범위 이내에 출혈 재발을 중단시키거나 방지하는 데 사용된다.

일부 실시 형태에서, 사전-선택된 저장 조건은 실온(즉, 20℃ 내지 25℃)에서의 저장을 포함하고, 실란트 제형은 5분 이상 동안, 때때로 15분 이상 동안, 또는 심지어 1시간 이상 동안 안정하다.

또 일부 실시 형태에서, 저장 조건은 2℃ 내지 8℃의 저장을 포함하고, 실란트 제형은 1일 이상, 2, 3, 4, 5, 6 또는 심지어 7일 이상 동안 안정하다.

일부 실시 형태에서, 사전-선택된 저장 조건은 -30℃ 이하의 저장을 포함하고, 실란트 제형은 1개월 이상 동안, 때때로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 심지어 15개월 이상 동안 안정하다.

단일 성분 실란트 제형은 적어도 하기 성분들을 포함한다:

- 혈액 유래 피브리노겐 농축물;

- 2가 양이온; 및

- 인자 XIa.

"혈액 유래 피브리노겐 농축물"을 언급할 때, 이는 피브리노겐뿐만 아니라 다른 혈액 유래 단백질을 포함하는 조성물로서 이해되어야 하며, 적어도 피브리노겐의 농도는 전혈 중에서의 농도보다 높다. 일부 실시 형태에서, 피브리노겐 농축물은 총 건조 물질 중 50% w/w 이상의 피브리노겐을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 피브리노겐 농축물은 순수한 피브리노겐 이외의 것이다. 이는, 순수한 피브리노겐을 사용할 때 제형이 자발적으로 응고한다는 본 명세서에 제공된 발견에 의해 지지된다. 다시 말하면, 본 명세서에 개시된 발견에 기초하고 이론에 의해 구애됨이 없이, 혈액 유래 피브리노겐 농축물에 존재하는 성분들이 제형의 안정성에 필요하다고 결론지었다.

따라서, 일부 실시 형태에 따르면, 피브리노겐에 더하여, 피브리노겐 농축물은 피브로넥틴, 알부민, 및 면역글로불린, 플라스민(플라스미노겐), vWF, 인자 VIII, 항트롬빈 III 및 세르핀 단백질로부터 선택되는 잔류 단백질(총 농축물 조성으로부터 총 1% w/v까지의 잔류 단백질) 중 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상의 조합을 함유한다.

놀랍게도, (하기 실시예에 나타낸 바와 같이) 순수한 피브리노겐에 기초한 제형은 칼슘의 존재 하에 자발적으로 응고되기 때문에 안정하지 않은 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 피브리노겐 농축물, 즉 (동결-고갈(cryo-depletion) 공정을 사용하여 생성된) BAC2에 기초한 제형은 칼슘의 존재 하에서 안정하였다. 이론에 의해 구애됨이 없이, 이는 피브리노겐을 안정화시키는 데 도움을 주는 추가적인 성분들의 존재로 인한 것일 수 있다. 따라서, 비-순수 피브리노겐(예를 들어, 혈장 또는 혈액으로부터 유래된 것)이 적합한 단일 성분 실란트 제형을 얻는 데 필수적이라고 추가로 결론지었다.

일부 실시 형태에서, 피브리노겐 농축물은 40 g/L(4%) 이상의 응고성(clottable) 단백질, 즉, 주로 피브리노겐을 포함하며 인자 XIII - 2 내지 9 IU/mL; 피브로넥틴 - 0.5 내지 6 mg/mL; 및 알부민 - 9 내지 30 mg/mL과 같은 추가적인 단백질을 포함하는 단백질을 함유한다.

일부 실시 형태에서, 혈액 유래 피브리노겐 농축물은 동결침전된 피브리노겐을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 혈액 유래 피브리노겐 농축물은 동결침전된 피브리노겐이다. 본 발명과 관련하여, 용어 "동결침전된 피브리노겐"은 냉동 혈장으로부터 얻어지는 피브리노겐을 지칭하며, 냉동 혈장은 전혈로부터 제조된다. 동결침전물은 냉동 혈장이 저온에서, 전형적으로 0 내지 4℃의 온도에서 해동되어, 주로 상기 피브리노겐을 함유하는 침전물을 형성할 때 얻어질 수 있다. 침전물은, 예를 들어, 원심분리에 의해 수집되고 적합한 완충제, 예를 들어 120 mM 염화나트륨, 10 mM 시트르산삼나트륨, 120 mM 글라이신, 95 mM 아르기닌 염산염을 함유하는 완충제에 용해될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 피브리노겐 용액은 인자 XIII, 인자 VIII, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자(vWF), 비트로넥틴 등 중 어느 하나 또는 이들의 조합과 같은 추가적인 인자를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 동결침전된 피브리노겐은 혈장의 생물학적 활성 성분(BAC)으로 간주된다.

몇몇 유형의 BAC가 존재하며, 이들 모두는 바람직하게는 바이러스 불활성화(viral inactivated)된다.

일부 실시 형태에서, BAC는 항피브린용해제(antifibrinolytic agent)로서 트라넥삼산을 함유하는 생물학적 활성 성분이다. 트라넥삼산을 함유하는 BAC는 때때로 제품명 퀵실(Quixil)(이스라엘 소재의 옴릭스(Omrix))로 알려져 있다.

일부 다른 실시 형태에서, BAC는 트라넥삼산을 함유하지 않는 생물학적 활성 성분이다. 이는 제2 세대 BAC로 간주되며 당업계에서 BAC2로 지칭된다. BAC2 제조 동안, 플라스미노겐(피브리노겐 및 피브린을 분해하는 플라스민의 효소 전구체)이 제거된다.

BAC는, 그 내용이 참고로 포함된, 미국 특허 제6,121,232호 및/또는 국제특허 공개 WO98/033533호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. BAC의 조성물은 항피브린용해제(예를 들어, 트라넥삼산) 및 아르기닌 염산염을 포함할 수 있다. BAC 중의 트라넥삼산과 같은 항피브린용해제의 양은 약 80 내지 약 110 mg/ml일 수 있다.

BAC2는 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 유럽 특허 EP 534 178호의 개시 내용에 따라 성분 A로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 성분 A는 농축된 동결침전물로부터 제조되며, 용매 세제 처리 및 저온살균(pasteurization)에 의한 바이러스 불활성화를 겪는다.

일부 실시 형태에서, 혈액 유래 피브리노겐 농축물은 BAC2, 즉 주로 피브리노겐을 포함하는 농축된 바이러스 불활성화된 동결침전물이며, 플라스미노겐-고갈된다(플라스미노겐의 제거는 유럽 특허 EP 1 390 485호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다). BAC2는 트라넥삼산을 갖지 않는다.

일부 실시 형태에서, 혈액 유래 피브리노겐 농축물은 인자 VIII의 제조 공정의 부산물이며, 산-침전물, 냉각-침전물, 수산화알루미늄 침전물(예를 들어, 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,455,300호 참조), 글라이신 침전물(예를 들어, 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,297,344호 참조), 에탄올 침전물, 및 헤파린 침전된 페이스트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 인자 VIII의 제조 공정의 부산물로서의 혈액 유래 피브리노겐 농축물은 또한 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제9,328,338호에 기재되어 있다.

일부 실시 형태에서, 동결침전된 피브리노겐은 총 단백질 - 30 내지 60 mg/mL; TVC ≤ 1000 CFU/mL; 인자 XIII - 2 내지 9 IU/mL; 피브로넥틴 - 0.5 내지 6 mg/mL; 및 응고성 피브리노겐 - 18 내지 39 mg/mL을 함유하는 원심분리 후의 신선한 동결 혈장 침전물을 나타내지만 이로 한정되지 않는다.

또 다른 일부 실시 형태에서, 혈액 유래 피브리노겐 농축물은, 때때로 페이스트 I로도 지칭되는, 현탁되거나 침전된 콘 분획(Cohn Fraction) I이거나 그를 포함한다.

콘 분획화(Cohn fractionation)는 다양한 혈장 단백질의 등전 특성의 차이를 활용하는 공정이며, pH, 에탄올 농도 및 온도를 변경하여 침전을 통해 단백질을 5개의 "분획"(I 내지 V)으로 분리하는 것을 수반하는 일련의 정제 단계를 포함한다. 콘 공정은 또한 차가운 에탄올 침전으로서 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제2,390,074호에 그리고 콘 등(문헌[J. Am. Chem. Soc. 68:459, 1945) 및 문헌[J. Am. Chem. Soc. 72:465-474, 1950])에 의해 기재된다.

특히, 본 발명과 관련하여, "현탁되거나 침전된 콘 분획 I"을 언급할 때, 이는 본 명세서에서 상기에 언급된 콘 공정뿐만 아니라, 적어도 피브리노겐이 침전되는 에탄올 분획화의 임의의 생성물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

일반적으로, 현탁되거나 침전된 콘 분획 I을 얻기 위하여, 혈장은 에탄올 농도에 노출된다. 구체적으로, 콘 I 침전물(분획 I)은 해동된 혼주(pooled) 혈장으로부터 8 내지 10% 에탄올 농도에서 -3℃ 내지 -5℃ 및 중성 pH에서의 침전에 의해 얻어진다. 원심분리에 의해 회수된 페이스트는 때때로 동결침전물과 대략 동일한 단백질을 함유하지만, 90% 초과의 피브리노겐 수율을 포함하는 것으로 간주된다(문헌[Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use; Bertolini, Goss and Curling 2013, page 141]).

순수한 피브리노겐이 아니기만 하면, 임의의 다른 혈액 유래 피브리노겐 농축물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

피브리노겐 농축물은 또한 상업적으로 입수될 수 있다. 피브리노겐의 예에는 에비셀(EVICEL)(즉, BAC2)의 피브리노겐 성분, (아프로티닌, 항피브린용해제를 함유하는) 티셀(Tisseel)의 피브리노겐 성분이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

혈장 유래 피브리노겐 농축물은 그 안에 응고성 단백질의 양에 의해 정의될 수 있다.

본 발명과 관련하여, "응고성 단백질"을 언급할 때, 이는 응고 캐스케이드(cascade)에 참여하는 혈장 단백질 중 임의의 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 당업계에서 허용가능한 바와 같이, 응고성 단백질은 주로 피브리노겐뿐만 아니라, 약간 양의 추가적인 단백질, 예를 들어 인자 XIII, 피브로넥틴, 및 알부민도 포함한다.

"응고성 단백질"의 %는, 예를 들어, 응고성 단백질 및 총 단백질 결정으로부터 계산될 수 있다. "총 단백질"은 0.2 mol/l의 수산화나트륨 및 7 mol/l의 우레아를 함유하는 가용화 완충제 중에 샘플을 희석시키고, 280 nm에서의 샘플의 흡광도를 세계 보건 기구 국제 표준물(World Health Organization International Standard)(피브리노겐 인간 농축물 98/614)에 대해 보정된 유사하게 처리된 사내 표준물(house standard)의 흡광도와 비교함으로써 결정될 수 있다. "응고성 단백질"은 희석된 샘플을 트롬빈(4 IU/ml)으로 응고시키고, 혈전을 인산염-완충 염수(1:2 PBS:식염수)로 세척하고, 이를 여과지 상에서 건조시킴으로써 결정될 수 있다. 이어서, 건조 혈전을 가용화 완충제에 용해시키고, 280 nm에서의 흡광도를 전술된 세계 보건 기구 국제 표준물에 대해 보정된 유사하게 처리된 사내 표준물의 흡광도와 비교함으로써 % 응고성 단백질을 결정할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 혈장 유래 피브리노겐 농축물은 혈장 유래 피브리노겐 농축물 내의 단백질의 총량 중 79.8%(총 단백질 100 mg/ml 중 79.8 mg/ml) 이하의 응고성 단백질을 포함한다.

일 실시 형태에서, 혈장 유래 피브리노겐 농축물은 65% 내지 78%, 때때로, 68% 내지 78%, 추가로 때때로, 68% 내지 72% 및 또한 더욱이 때때로 약 70%의 응고성 단백질을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 농축된 피브리노겐은 약 96 내지 약 125 mg/ml의 범위의 총 단백질 및 약 72 내지 약 110 mg/ml의 범위의 응고성 단백질을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 농축된 피브리노겐은 약 80 내지 약 120 mg/ml의 범위의 총 단백질 및 약 50 내지 약 90 mg/ml의 범위의 응고성 단백질을 포함한다. 일부 추가적인 또는 대안적인 실시 형태에서, 혈장 유래 피브리노겐 농축물은 피브로넥틴 상대 농도, 즉 피브로넥틴 대 피브리노겐 몰비로서 정의되는 피브리노겐에 대한 피브로넥틴의 비율에 의해 특징지어진다.

일부 실시 형태에서, 피브로넥틴 대 피브리노겐 비는 0.016 이상, 또는 0.065 이상이다.

일부 실시 형태에서, 피브로넥틴 대 피브리노겐 비는 약 0.068 이상(즉, 비가 0.068 초과임), 때때로 약 0.078 이상(즉, 비가 0.078 초과임)이고, 때때로, 비는 0.1 이상, 0.5 이상, 1.0 이상, 1.5 이상이다.

일부 실시 형태에서, 피브로넥틴 대 피브리노겐 몰 비는 2 이하(즉, 비가 2 미만임), 때때로 1.5 미만, 때때로, 1.0 미만, 때때로 0.5 미만, 또는 때때로 0.1 미만이다.

일부 실시 형태에서, 피브로넥틴 대 피브리노겐 몰비는 0.1 내지 2.0이다.

또 다른 실시 형태에서, 피브로넥틴 대 피브리노겐 몰비는 0.1 내지 0.2이다.

혈장 유래 피브리노겐 농축물은 또한 피브리노겐 절대 농도에 의해 특징지어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 피브리노겐 농도는 13 내지 85 mg/ml, 예를 들어 13 내지 29 mg/ml, 때때로 13 내지 21 mg/ml(40 내지 63 μM과 등가임), 때때로 13 내지 17 mg/ml, 또는 14 내지 18 mg/ml, 또는 15 내지 19 mg/ml, 또는 16 내지 20 mg/ml, 또는 17 내지 21 mg/ml이다.

본 발명과 관련하여, 2가 양이온은 Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 2가 양이온은 칼슘 양이온이다. 일부 실시 형태에서, 칼슘 양이온은 염화칼슘으로부터 유래하며, 즉 제형은 염화칼슘으로 제조된다.

일부 실시 형태에서, CaCl₂의 농도는 0.15 내지 0.5 mg/ml(3.70 내지 12.50 mM과 등가임), 때때로 0.15 내지 0.25 mg/ml(3.70 내지 6.25 mM과 등가임), 때때로 0.25 내지 0.5 mg/ml(1.85 내지 12.50 mM과 등가임)이다.

일부 실시 형태에서, 바람직하게는 2가 양이온이 Ca²⁺인 경우, 농도는 약 3.75 내지 7.50 mM의 범위이다.

인자 XIa에 대해서, 이는 지혈 동안 기질 인자 IX를 활성화시킬 수 있는 천연, 혈액 유래 효소, 재조합 인자 XIa 또는 이들의 임의의 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

일부 실시 형태에서, XIa는 0.01 내지 110 ㎍/ml, 0.11 내지 110 ㎍/ml의 양, 예를 들어, 0.11 ㎍/ml 초과 110 ㎍/ml 이하의 양이다.

실란트 제형은 상기 3가지 언급된 성분 이외의 추가 성분을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 인자 XIII, 항피브린용해제(예를 들어, 아미노카프로산(ε-아미노카프로산), 아프로티닌 및 트라넥삼산), 항생제, 안정제, 예를 들어, 아르기닌, 라이신, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자; RGD 펩티드; 성장 인자, 연골 유도 인자(cartilage inducing factor), 골 유도 인자(osteoid inducing factor), 골 성장 인자, 콜라겐 성장 인자; 시토킨; 인터페론; 호르몬; 치료제, 예를 들어, 항미생물제, 항염제; 항암 약물; 화학요법제; 진통제; 인터류킨; 미네랄; 세포 이동, 부착 및/또는 증식을 자극하는 분자; 효소; 신경영양 인자, 예를 들어, 신경 성장 인자(NGF); 섬모 신경영양 인자(CNTF), 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 혼합물 등으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 실란트 첨가제는 실란트 제형 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이 선택된다. 가능한 실란트 추가 성분의 목록은, 특히 발명의 명칭이 "지혈 조성물, 장치 및 방법"(Hemostatic Compositions, Devices and Methods)인 제트-메디카(Z-Medica)의 미국 특허 제8,858,969호; 및 발명의 명칭이 "지혈을 위한 젤라틴 및 알기네이트계 제형"(Gelatin and Alginate-Based Formulations for Hemostasis)인 오르토비타(Orthovita)의 미국 특허 출원 공개 제2014/0271610 호에서 찾아 볼 수 있으며; 이들의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

실란트 첨가제는 인간 또는 포유류의 혈장으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합형일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 비타민 K-의존성 응고 자이모겐(zymogen)이 고갈되고/되거나 부재한다. 일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 인자 IX 자이모겐이 고갈된다. 용어 "고갈된"을 사용함으로써, 이는 상기 자이모겐이 결여된 것으로, 또는 활성화되는 경우, 실란트 제형의 응고를 야기하기에 비효과적인 양을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

일부 실시 형태에서, 비타민 K-의존성 응고 자이모겐은 FII, FVII, FIX 및 FX 자이모겐으로부터 선택된다. 그뢰버 우(

U)에 의해 기재된 바와 같이, 비타민 K는 다수의 비타민 K-의존성 단백질에서 특정 글루탐산(Glu) 잔기의 g-카르복실화에 필수적이다. 생성된 g-카르복시글루탐산(Gla) 화합물은 칼슘 이온의 착물 결합을 초래하여, 그의 생리학적 기능에 대한 전제 조건인 단백질 구조 변화를 야기할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 번역 후 변형에 의해, 응고 인자 II(프로트롬빈), VII, IX 및 X가 전구체로부터 발현된다. (참고문헌[

U, Reichrath J, Holick MF, Kisters K. Vitamin K: an old vitamin in a new perspective. Dermatoendocrinol. 2015 Jan 21;6(1)]).

일부 실시 형태에서, 비타민 K-의존성 응고 자이모겐은 프로트롬빈(FII)이다.

일부 실시 형태에서, 실란트 제형에는 트롬빈 또는 트롬빈의 기능적 유사체가 부재한다. 본 발명과 관련하여, "트롬빈이 부재하는"(또는 이의 기능적 유사체가 부재하는)은, 제형이 잔류 트롬빈을 함유할 수 있지만, 실란트 제형의 응고를 야기하기에 비효과적인/불충분한 양으로 함유할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈이 부재하는(또는 이의 기능적 유사체가 부재하는)은 1 IU/ml 이하의 트롬빈의 양을 포함한다. 또 다른 일부 실시 형태에서, 트롬빈(또는 이의 기능적 유사체)이 부재하는 것은 외부에서 첨가된 트롬빈(또는 이의 기능적 유사체)의 결여, 즉, 피브리노겐 농축물로부터 유래하지 않은 트롬빈(또는 이의 기능적 유사체)의 결여를 지칭한다.

본 발명과 관련하여, "트롬빈 기능적 유사체"를 지칭할 때, 이는 적어도 피브리노겐을 절단하여 피브린을 형성할 수 있는 실체(entity)를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

트롬빈의 양은 트롬빈 항체를 사용하여 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 트롬빈은 응고 기계를 사용하여 트롬빈 활성 시험에 의해 결정될 수 있다.

실란트 제형은, 상기에 논의된 바와 같이, 출혈 상처를 치료하기 위한 것, 예를 들어 뇌척수액, 림프액, 담즙, 위장(GI) 내용물, 폐로부터의 공기 누출의 생리학적 누출을 밀봉하기 위한 것, 조직 또는 재료를 조직에 접착하기 위한 것, 또는 예를 들어, 혈전의 자연적인 분해 시에 약물 또는 세포가 방출되는 경우에 약물 또는 세포를 위한 전달 장치 물질로서의 것과 같은 다양한 응용을 가질 수 있다.

실란트 제형을 도포하기 위해, 실란트 제형은 의료 장치/어플리케이터 내에 수용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 태양에 따르면, 어플리케이터는 (i) 본 명세서에 개시된 실란트 제형을 수용하는 용기, 및 (ii) 실란트 제형의 전달을 위한 밀봉 가능한 개구를 포함하는 어플리케이터가 제공된다.

일부 실시 형태에서, 어플리케이터는 주사기의 형태이다.

일부 실시 형태에서, 어플리케이터는 액체 제형을 (예를 들어, 밀봉이 필요한 표적 조직 상으로 제형을 분무 또는 적하시킴으로써) 미세 액적(fine droplet)으로서 도포하는 네뷸라이저(nebulizer) 또는 디스펜서(dispenser)의 형태이다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어 큰 표면적이 출혈로부터 밀봉될 필요가 있다면, 분무가 일반적으로 사용될 것이며; 예를 들어, 생검 후에, 한정된 영역으로부터 출혈이 발생하는 경우, 적하가 일반적으로 사용될 것이다. 대안적으로, 분무 및 적하가 동일한 처치에 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 어플리케이터의 개구는 재밀봉 가능하다.

배럴 내의 실란트 제형은 액체 또는 고체(냉동) 형태일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 어플리케이터는 액체 형태의 실란트 제형을 수용하는 주사기 형태이다.

어플리케이터는 1회 사용을 위한 것일 수 있는데, 즉 실란트 제형의 전부 또는 일부가 용기로부터 배출되거나; 또는 어플리케이터의 개구가 사용들 사이에 재밀봉되도록 다수회 사용을 위해 설계될 수 있다.

일부 다른 실시 형태에서, 어플리케이터는 실란트 제형을 수용하는 지지 매트릭스를 포함하는 상처 드레싱의 형태이다.

지지 매트릭스는 상처 상에 적용된 붕대, 폼 패드 등의 형태일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지지 매트릭스는, 제형이 흡수되거나 함침되거나 팽윤되는 등의 습윤 와이프(wet wipe)에 사용되는 것과 같은 부직포이거나 이를 포함한다.

실란트 제형을 갖는 지지 매트릭스는 용기 내에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 사용 전에 각각 개방되는 사셰(sachet)에서와 같이 입체적으로 밀봉될 수 있다.

실란트 제형의 전달 방식은 다양한 고려 사항, 예를 들어, 필요한 밀봉의 유형/정도, (밀봉을 필요로 하는) 개구의 유형/치수 및 의사에 의해 인식되는 다른 고려 사항에 기초하여 결정될 수 있다.

실란트 제형은 생물학적 글루를 필요로 하는 다양한 의학적 방법에 적용가능하다.

일 태양에 따르면, 원위치 피브린 혈전/매트릭스 형성을 촉진하는 방법이 제공되는데, 본 방법은 본 명세서에 개시된 실란트 제형을 표적 조직에 도포하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 상처 치료를 필요로 하는 대상에서 상처를 치료하는 방법이며, 본 방법은 상기 상처의 적어도 일부분 상에 본 명세서에 개시된 소정 양의 실란트 제형을 도포하는 단계를 포함하며, 상기 실란트 제형의 양은 상기 상처와 접촉한 후에 상기 상처에서 피브린 혈전 형성을 촉진하기에 효과적이다.

이론에 의해 구애됨이 없이, 제형의 성분들을 사용하여 응집 캐스케이드를 개시하는 것은 (예를 들어, 상처 부위에 존재하는) 혈액과 실란트 제형의 원위치 접촉이다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상처, 바람직하게는 혈액 함유 상처를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상처는 출혈 상처이다.

일단 혈장 대체물과 블렌딩되면, 수 초, 약 200초 이내(시험에서 열거된 농도에 따라 변화됨)에 응고가 일어나는 것으로 밝혀졌다.

마지막으로, 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 바와 같은 실란트 제형, 및 선택적으로 어플리케이터를 포함하는 키트가 본 발명에서 제공된다. 일부 실시 형태에서, 키트는 또한 상처에서의 응고를 촉진하기 위한 실란트 제형의 사용을 위한 설명서를 포함한다. 설명서는 상처에 도포하기 전에 실란트 제형을 제조하는 단계들, 및/또는 상처의 적어도 일부분 상에 실란트 제형을 도포하는 단계들을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키트는 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 용기를 포함하며, 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정하다. 일부 실시 형태에서, 용기는 어플리케이터의 형태이다. 일부 실시 형태에서, 어플리케이터는 상처의 적어도 일부분 상에 실란트 제형을 도포하는 것을 용이하게 하도록 구성된다. 일부 실시 형태에서, 어플리케이터는 주사기이다. 일부 실시 형태에서, 키트는 어플리케이터를 추가로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 건조 또는 고체 형태이고, 설명서는 제형을 습윤화하는 것을 포함한다. 이러한 관점에서, 키트는 때때로 습윤제, 예를 들어 염수를 포함할 수 있다.

일부 추가의 실시 형태에서, 실란트 제형은 건조 형태이며, 설명서는 상처에 제형을 건조 형태로 도포함으로써, 상처 또는 혈액 그 자체로부터의 분비물에 의해 습윤화되게 하는 것, 또는 상처에 도포하기 전에 건조 제형을 습윤화하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 키트는 어플리케이터 내에 즉시 사용가능한(ready-to-use) 실란트 제형을 구비하며; 일부 다른 실시 형태에서, 실란트 제형은 카트리지 또는 다른 수용 유닛/캐리어 내에 공급되고 사용 전에 어플리케이터 내로 도입된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 부정 관사 및 정관사("a," "an," 및 "the")는 문맥이 명백히 다르게 지시하지 않는 한 단수형뿐만 아니라 복수형 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 " 2가 양이온" 은 응고 캐스케이드에 참여할 수 있는 하나 이상의 그러한 양이온을 포함한다.

또한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 포함하는 "은 제형이 언급된 성분들, 즉, 피브리노겐, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하지만, 다른 추가 성분을 배제하지 않음을 의미하고자 한다. 용어 " ~로 본질적으로 이루어지는 "은 언급된 성분들을 포함하지만 응고 캐스케이드에 대한 유의성을 가질 수 있는 다른 요소를 배제하는 제형을 정의하는 데 사용된다. 따라서 " ~로 이루어지는 "은 다른 요소들 중 미량을 초과하는 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 연결 용어의 각각에 의해 한정되는 실시 형태는 본 발명의 범주 내에 있다.

또한, 모든 수치 값은, 예를 들어 제형을 구성하는 성분들의 양 또는 범위를 지칭할 때, 언급된 값으로부터 (+) 또는 (-)로 20% 이하만큼, 때때로 10% 이하만큼 변동되는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되지 않더라도, 모든 수치 표기에는 용어 " 약 "이 선행하는 것으로 이해되어야 한다.

이제, 본 발명에 따라 수행된 실험의 하기 설명에서 본 발명을 예시할 것이다. 이들 실시예는 사실상 제한이 아니라 예시가 되고자 함이 이해되어야 한다. 명백하게는, 이들 실시예의 많은 수정 및 변형이 상기 교시를 고려하여 가능하다. 따라서, 본 발명이, 첨부된 청구범위의 범주 내에서, 이하에 구체적으로 기재되는 것과 달리 많은 가능한 방식으로 실시될 수 있음이 이해되어야 한다.

비제한적인 실시예

하기 비제한적인 실시예에서, 하기 재료를 사용하였다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 재료는 2 내지 8℃에서 저장하였다.

사이판/스타고(Saifan/Stago)(로트# 10789)로부터 입수하고 2 내지 8℃에서 저장한 CaCl ₂ (0.025M).

탈레크리스(Talecris)(로트# 110081)로부터 입수한 인간 알부민 25% 분취물(RD221014-02).

인간 혈장: STA(등록상표) 유니캘리브레이터(표준 혈장 대체물, 스타고, 카탈로그 번호 00625), 이는 프로트롬빈 시간, 피브리노겐, 인자 II, V, VII, VIII, IX, X, XI 및 XII, 단백질 C 및 단백질 S, 항트롬빈(AT), 플라스미노겐 및 항플라스민을 비롯하여 이 시약에 적합한 STA(등록상표) 라인의 분석기에서의 응고 파라미터의 기능적 분석을 위한 보정 혈장으로서 사용하기 위해 의도됨. TSB 완충제 - 1 L PuW, pH 7.4 중에서 6.05 g의 트리스-염기, 9 g의 NaCl 및 0.2 g의 소듐 아지드로부터 제조됨("NAPTT"의 경우, 활성화되지 않은 부분적 트롬보플라스틴 시간은 모든 관련 응고 인자를 용액에 첨가한 후에 혈전을 형성하기까지의 시간이다. 이 분석은 혈장 및 혈장 분획에서 활성화된 응집 인자의 존재를 평가한다. 잔류물인지 의도된 응집 인자인지의 여부

타롬(Tarom)/HTI(로트# CC0709)로부터 입수하고 -65℃ 미만에서 저장한 인자 XIa(1/5000) 분취물(RD171113-01).

BAC2는 인간 혈장의 농축된 바이러스-불활성화된 동결침전물(동결침전물은 전형적으로 유럽 특허 EP 534,178호에 기재된 바와 같이 제조됨)이며, 이는 주로 피브리노겐(대략 85%)으로 이루어지고 플라스미노겐-고갈되며(플라스미노겐의 제거는 전형적으로 유럽 특허 EP 1,390,485호에 기재된 바와 같이 수행됨), 항피브린용해제가 첨가되어 있지 않다.

실시예 1: 최소 안정성 기간의 결정

이 연구의 목적은 2가지였다:

"저장 안정성" - 72시간 동안 이들 성분을 인큐베이션하고 혈전이 형성되는지 여부를 검사함으로써 FXIA 및 피브리노겐을 함유하는 용액의 저장 안정성을 결정하기 위한 것.

"활성" - 72시간의 저장 기간 후에, (생리학적 환경을 모의하기 위해) 유니캘리브레이터 및 인지질을 첨가하여 측정되는 바와 같은 혈전을 형성하는 용액의 능력을 결정하기 위한 것.

FXIa+BAC2(옴릭스-에티콘 피브린 실란트의 피브리노겐 성분)를 실온 또는 4℃에서 72시간 동안 평가하였다.

안정성

표 1은 시험된 제형들을 요약한다. BAC2와 인자 XIa 사이의 비는 1:1 내지 10:1에서 변하였다.

[표 1]

제형을 바이알 내로 도입하고, 상기 표 1에 따라 4℃ 또는 RT에 72시간의 기간 동안 두었다. 이러한 단기간 저장 후, 안정성 및 활성을 결정하였다.

FXIa 및 BAC2 비 및 저장 온도에 관계없이 바이알들 중 어떠한 것에서도 혈전이 형성되지 않았다.

활성

활성 시험을 위해, 표 1의 동일한 제형을 사용하였으며, 이들을 출혈 부위에서의 생리학적 상태를 모의하는 응고 반응 완충제와 혼합하였다.

구체적으로, 응고 반응 완충제는 400 μl의 알부민을 2.1 ml의 TSB 완충제('재료'에 기재됨)에 첨가함으로써 제조하였다.

표 1의 각각의 바이알에, 30 μl의 TSB 완충제(알부민 및 인지질을 가짐)를 모든 다른 성분들과 함께 첨가한 후에, 30 μl의 유니캘리브레이터를 첨가하였다.

이어서, 바이알을 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이션 후에 혈전이 형성되지 않았다.

이어서, 각각의 바이알에, 30 μl의 Ca²⁺ 0.025M을 첨가하고, 바이알을 RT에 2.5시간 동안 두었다.도 1은 각각의 바이알을 보여주며, FXIa + BAC2 바이알 혼합물(바이알 1 내지 바이알 8)에서는 침전물이 형성되었고, 대조군 바이알(바이알 10) 및 사전 인큐베이션이 없는 BAC2 + 완충제 + Ca²⁺를 함유하는 바이알(맨 오른쪽 바이알)에서는 침전물이 형성되지 않았음을 보여준다. 바이알 9의 하부의 백색 침강물은 Ca²⁺의 침강으로 인한 것이었음에 유의한다.

따라서, 단일 성분 제형으로서 모든 성분들을 저장하는 것이 저장 안정하며, 이 저장이 성분들의 활성에 영향을 미치지 않아, 일단 생리학적 조건을 모의하는 완충제 및 Ca²⁺와 접촉하게 되면 피브린 혈전이 효과적으로 형성되는 것으로 결론지었다.

실시예 2: 필수 반응 성분의 결정

이 연구의 목적은 Ca²⁺ 및 세팔린(cephalin)(혈소판 인지질을 대체함)이 시험관내 반응에 필수적인지 여부를 결정하기 위하여 상이한 제형들을 스크리닝하는 것이었다.

필수 반응 성분의 결정을 위해, 하기 표 2에 또한 상세히 설명되는 바와 같이, Ca²⁺(0.025 M) 및 세팔린(응고 캐스케이드에 참여하는 혈소판 인지질에 대한 생리학적 대체물을 제공함, 약 27.4 ㎍/ml의 스트로크 용액 농도)을 사용하거나 사용하지 않고, BAC2(약 64 mg/ml의 스톡 농도)와 FXIa(0.65 ㎍/ml "FXIa-0.65" 또는 0.44 ㎍/ml "FXIa-0.44"의 스톡 농도)의 조합을 시험하였다. 반응을 개시하기 위하여, TSB 완충제 및 알부민을 포함하는 응고 반응 완충제(실시예 1 에 기재된 바와 같음)를 첨가하였다("TSB-알부민").

[표 2]

제조된 혼합물을 4℃ 또는 RT에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 유니캘리브레이터를 바이알에 첨가하고, 이어서 바이알을 37℃에서 인큐베이션하여 응고 시간을 시험하였다.

인큐베이션 후에, 바이알을 1초 동안 와동(vortex)시키고, 10분 동안 롤링(roll)하고, 표 3(각각의 행은 단일 바이알을 나타냄) 및 표 4(각각의 행은 3벌을 나타냄)에 기재된 바와 같이 추가로 인큐베이션하였다

RT에서 하룻밤 저장된 세팔린 및 Ca²⁺를 함유하는 바이알은 자발적인 혈전을 형성하였음이 이미 지적되었다.

하룻밤 인큐베이션 후에, 50 μl의 유니캘리브레이터를 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이 샘플 중 일부에 첨가하였다.

모든 바이알을 37℃에서 인큐베이션하고, 하기 시점에 검사하였다: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60분(표 3에 요약된 결과), 및 표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 60분. 특히, 상이한 성분들에 대해 표 4에 나타나 있는 수준은 상응하는 국제 표준물에 대해 각각 계산된다. 모든 성분이 응고 캐스케이드에 참여한다.

[표 3]

[표 4]

표 3 및 표 4에 제시된 결과는 Ca²⁺를 사용하지 않은 경우 중합 반응이 없음을, 즉 혈전이 형성되지 않음을 나타낸다.

오직 Ca²⁺ 만 존재할 때, 즉 인간 혈장 없으면, 제형은 액체로 유지된다. 액체 제형에 유니캘리브레이터를 첨가하면, 중합이 일어났다.

따라서, Ca²⁺가 혈전 형성에 필수적이며, 세팔린은 자발적인 응고를 유발하기 때문에 제형에 첨가해서는 안 된다고 결론지었다. 구체적으로, 이들 결과에 따르면, 바람직한 제형은 최소한 BAC2, FXIa, 및 Ca²⁺를 함유해야 한다.

실시예 3: 제형에 대한 Ca2 + 및 FXIa 농도의 영향의 결정

이 연구의 목적은 Ca²⁺ 성분 및 FXIa 성분의 상이한 농도의 영향을 결정하는 것이었다. 이를 위해, 둘 모두의 성분에 대해 계열 희석(serial dilution)을 수행하고, 유니캘리브레이터의 첨가 후 응고 시간을 측정하였다. BAC2, Ca² ⁺ 및 유니캘리브레이터(FXIa를 첨가하지 않음)를 함유하는 제형의 응고 시간을 기준선(대조군)으로서 사용하였다.

반응 혼합물을 하기와 같이 제조하였다:

기준선 결정을 위해: 150 μl의 완충제 A(FXIa를 희석하기 위해 사용되며, 400 ml의 정제수 중에 2.4 g의 HEPES, 4.38 g의 NaCl 및 0.5 g의 소 혈청 알부민을 포함하고, pH가 7.4로 조정되었음), 150 μl의 BAC2, 및 150 μl의 CaCl₂를 혼합하였다.

FXIa 및 Ca ²⁺ 농도의 결정을 위해: 10 μl의 스톡 FXIa를 990 μl의 완충제 A로 희석하고(1/10 희석), 10분 동안 롤링하였다(40 RPM). 이어서, 0.5 ml의 이러한 제제를 4.5 ml의 완충제 A(최종 부피 5 ml)와 혼합하고, 5분 동안 롤링하였다. 0.5 ml(이전 희석) + 4.5 ml의 완충제 A의 계열 1:10 희석을 반복하여 모든 희석을 달성하였다. 다양한 FXIa 희석이 표 5에 요약되어 있다.

[표 5]

시험 샘플을 하기 표 6에 따라 제조하였다. 각각의 바이알은 하기를 함유하였다:

1) 210 μl BAC2(총 단백질 농도 80 내지 120 mg/ml; 응고성(피브리노겐 농도 55 내지 85 mg/ml);

2) 210 μl FXIa(농도는 표 6에 따라 첨가됨);

3) 210 μl CaCl₂(농도는 표 6에 따라 첨가됨).

BAC2로부터의 단백질의 얻어진 최종 농도는 26.7 내지 40 mg/ml이었고, 응고성 피브리노겐의 최종 농도는 18.33 내지 28.33 mg/ml이었다.

일단 모든 성분들이 첨가되었으면, 바이알을 5분 동안 롤링하였다. 각각의 샘플로부터, 150 μl의 부피를 각각의 지정된 응고 기계 큐벳(다이아그노스티카 스타고 스타트) 내에 첨가하였다. 각각의 샘플에 대해 4개의 복제물을 사용하였다.

응고 시간은 응고 기계(다이아그노스티카 스타고 스타트)를 사용하여 측정하였다. 50 μl의 유니캘리브레이터(37℃로 예열됨)의 첨가로 시작하여 반응 시간을 측정한다. (혈전이 960초 미만에 형성되는 경우) 혈전을 형성하기까지의 시간(단위: 초)으로서, 또는 이 시간까지 혈전이 형성되지 않은 경우에는 >960초로서 측정치를 기록하였다.

상이한 FXIa 및 Ca²⁺ 농도에 따른 혈전 형성 시간(단위: 초)이 하기 표 7에 제시되어 있다. 시간 측정은 유니캘리브레이터의 첨가로 시작되었음에 유의한다. 기준선(대조군 - FXIa이 없는 시험)은 중합에 대해 768.1±15.1초였다.

[표 6]

[표 7]

상기 표 7의 결과가 또한 도 2에 제시되어 있으며, 상이한 FXIa 농도에서 CaCl₂ 농도에 따른 경화(혈전 형성) 속도를 보여준다. 수평선은 기준선(FXIa가 없는 시험 결과)을 나타내고, 디스플레이 목적상 >960초의 결과는 이러한 도 2에서 1000으로 표시하였다.

최고 FXIa 농도의 오직 하나의 샘플을 사용하였고(110 ㎍/ml의 최종 희석물), 이는 가장 빠른 응고 시간으로 지칭된다. 다시 말하면, (최고 농도 이외의) FXIa의 모든 희석물에 대해서는 CaCl₂ 농도들의 매트릭스를 시험하였고, FXIa의 최고 농도에 대해서는 오직 하나의 농도의 CaCl₂를 적용하였다. 이러한 점을 가장 빠른 응고 시간에 대한 기준으로서 사용하였다. FXIa 희석물 1:100 및 1:1000(따라서 11 ㎍/ml 및 1.1 ㎍/ml) 둘 모두의 응고는 유사하였고, 12.5 내지 5.0 mM(최종)의 범위 사이의 Ca²⁺ 농도의 변화는 응고 시간에 영향을 미치지 않았다.

Ca²⁺ 농도와 혈전 형성까지의 시간 사이의 상관관계는 반응에서의 Ca²⁺ 농도의 감소로서 관찰되었으며, 이는 더 느린 혈전 형성을 야기하였다.

FXIa를 1:10000(110 ng/ml의 최종 농도)으로 희석시키는 것은 더 높은 FXIa 농도에 비하여 더 느린 혈전 형성을 야기하였다. 이러한 더 낮은 FXIa 농도에 대해, Ca²⁺ 농도가 감소될 때 더 강한 영향이 관찰된다. 추가로, 12.5 mM의 Ca²⁺ 농도는 경화 속도에 대해 다소 더 낮은 영향을 나타내었다.

희석된 FXIa 1:100000(11 ng/ml)은 훨씬 더 느린 경화 속도를 나타내었고, Ca²⁺ 농도의 영향은 110 ng/ml 희석에서와 동일한 추세를 나타낸다.

상기 결과에 기초하여, 작용 가능성을 갖는 FXIa 희석물은 1/100(11 ㎍/ml), 1/1000(1.1 ㎍/ml), 1/10000(110 ng/ml)인 것으로 결론지었다. 바람직한 작용 Ca²⁺ 농도는 6.25 mM(최종 농도, 0.025 M의 Ca²⁺ 스톡 사용)이다.

기존의 지혈 제품(문헌[Topical hemostatic agents. Seyednejad et al 2008])의 사용을 통해 현재의 문헌으로부터 추론되는 바와 같은 추정된 시간 값인 960초 미만의 임상적으로 관련된 혈전 형성 속도를 달성하기 위해, 하기 제형들을 사용하여야 한다(FXIa 범위 0.01 내지 110 ug/ml 및 Ca²⁺ 범위 3.75 내지 12.5 mM).

실시예 4: 제형의 단기간 안정성 및 장기간 안정성의 결정

이 연구의 목적은 최대 1년의 기간 동안 3가지 상이한 온도에서 제형의 안정성을 결정하는 것이었다. 단일 성분 제형의 단기간 안정성 및 장기간 안정성을 결정하기 위하여, 3가지 상이한 FXIa 농도를 3가지 상이한 온도(RT, 2 내지 8℃ 및 -30℃)에서 인큐베이션하였다. 선택된 온도에서의 인큐베이션 기간 후에, 각각의 바이알을 37℃로 가열한 후, 유니캘리브레이터를 첨가하였다. 이어서, 응고 기계를 사용하여 응고까지의 시간을 기록하였다.

구체적으로, 36개의 샘플을 하기와 같이 제조하였다:

- 2 내지 8℃에서 인큐베이션된 12개의 샘플.

- 실온에서 인큐베이션된 12개의 샘플.

- -30℃에서 인큐베이션된 12개의 샘플.

각각의 인큐베이션 온도에 대해, 하기 7가지 인큐베이션 기간에 대해 2벌(2개의 바이알)을 표시하였다:

1일(1d), 1주(1w), 2주(2w), 1개월(1m), 2개월(2m), 6개월(6m), 및 15개월(15m).

사용한 부피:

BAC2 - 120 μl * 3(처리) * 36(샘플) = 12.96 ml

CaCl₂ - 120 μl * 3(처리) * 36(샘플) = 12.96 ml

FXIa - 120 μl * 1(희석) * 36(샘플) = 4.32 ml (각각의 희석물에 대해)

1:10 희석 스톡(440 ㎍/ml의 스톡 농도)으로부터 FXIa에 대한 희석물을 제조하였다:

1/100: 275 μl(1/10) + 2.475 ml(완충제 A)

2.75 ml(1/100) + 2.5 ml(1/100, 이전 희석)

1/1000: 400 μl(1/100) + 3.6 ml(완충제 A)

4.0 ml(1/1000) + 850 μl(1/1000, 이전 희석)

1/10,000: 400 μl(1/1000) + 3.6 ml(완충제 A)

4.0 ml(1/10,000) + 850 μl(1/10,000, 이전 희석)

각각의 바이알을 (정의된 시험에 따라) 200 μl의 BAC2, 200 μl의 CaCl₂(혼합 전 0.025M 스톡 농도), 200 μl의 FXIa로 보충하였다. 이어서, 바이알을 1초 동안 와동시키고, 10분 동안 롤링한 후에, 선택된 처리에 따라 인큐베이션하였다. 각각의 처리의 2개의 바이알(독립적인 2벌)을 제조하였다. 얻어진 응고 시간(단위: 초)이 표 8A 내지 표 8C에 제시되어 있다.

[표 8A]

[표 8B]

[표 8C]

표 8C에 제시된 결과는, 0.11 ug/ml의 농도에서 FXIa가 -30℃에서 15개월 이상 동안 저장 시에 안정하고 2 내지 8℃에서 1일 이상 동안 저장 시에 안정함을 나타낸다.

표 8B에 제시된 결과는, 1.1 ug/ml의 농도에서 FXIa가 -30℃에서 15개월 이상 동안 저장 시에 안정하고 2 내지 8℃에서 2주 이상 동안 저장 시에 안정하고 RT에서 1일 이상 동안 저장할 때 안정함을 나타낸다.

표 8A에 제시된 결과는, 11.1 ug/ml의 농도에서 FXIa가 -30℃에서 15개월 이상 동안 저장 시에 안정하고 2 내지 8℃에서 최대 2개월 동안 저장 시에 안정하며 RT에서 최대 1개월 동안 저장 시에 안정함을 나타낸다.

실시예 5: 순수한 피브리노겐을 사용하는 제형의 단기간 안정성 및 장기간 안정성의 결정

이 연구의 목적은 칼슘을 사용하거나 사용하지 않은 제형의 단기간 안정성 또는 장기간 안정성에 대한 순수한 피브리노겐(플라스미노겐 고갈된 인간 피브리노겐(타롬 어플라이드 테크놀로지스(Tarom Applied technologies), 100.00% 응고성)의 영향을 결정하는 것이었다. 이를 위해, 2가지 상이한 FXIa 농도를 2가지 상이한 온도(RT, 및 2 내지 8℃)에서 인큐베이션하였다. 선택된 온도에서의 인큐베이션 기간 후에, 각각의 바이알을 37℃로 가열한 후, 유니캘리브레이터를 첨가하였다. 이어서, 응고 기계를 사용하여 응고까지의 시간(단위: 초)을 기록하였다.

구체적으로, 동결건조 피브리노겐을 37℃로 예열된 15 ml의 DDW를 사용하여 재구성하고, 완전히 용해될 때까지 37℃에서 혼합하였다.

FXIa 11 ㎍/ml:900 μl (1/10) + 8.1 ml (완충제 A)

FXIa 1.1 ㎍/ml:900 μl (1/100) + 8.1 ml (완충제 A)

시험은 11 ㎍/ml, 1.1 ㎍/ml의 FXIa 농도를 포함하였다. 각각의 시험의 총 33개의 샘플을 하기와 같이 제조하였다:

즉시 시험을 위한 3개의 샘플.

각각의 처리 중 인큐베이션: 15개의 샘플은 2 내지 8℃에서 하룻밤.

15개의 샘플은 RT에서 하룻밤.

각각의 바이알을 (시험에 따라) 지정된 바이알에 대해 140 μl의 피브리노겐, 140 μl의 FXIa, 및 140 μl의 CaCl₂(0.025M)로 보충하였다. 이어서, 바이알을 1초 동안 와동시키고, 10분 동안 롤링한 후에, 선택된 처리에 따라 인큐베이션하였다. 각각의 처리의 3개의 바이알(독립적인 2벌)을 제조하였다.

안정성 시험 파라미터는 다음과 같았다:

피브리노겐 농도: 약 22 mg/ml(안정성 기간 동안) 및 응고 시간 시험 동안 약 16.7 mg/ml

CaCl ₂ 농도: 약 8 mM (안정성 기간 동안) 및 응고 시간 시험 동안 6.25 mM

FXIa 희석 (및 응고 시간 시험 동안의 농도): 1:100(11 ㎍/ml) 및 1:1000(1.1 ㎍/ml).

온도: RT, 2 내지 8℃.

시점: 1일, 1주, 2주, 1개월, 및 2개월.

응고 시간이 표 9A 내지 표 9C에 요약되어 있다.

[표 9A]

[표 9B]

표 9A에 제시된 결과는, 칼슘을 사용하거나 사용하지 않은 1.1 ug/ml 및 11 ug/ml FXIa의 농도 둘 모두에서, 실란트가 1주 미만 동안 RT에서 저장될 때 안정함을 나타낸다. 1주 이내에, 샘플은 칼슘의 존재 또는 부재 하에 자발적으로 응고되었다.

표 9B에 제시된 결과는 1.1 ㎍/ml 및 11 ㎍/ml FXIa의 농도 둘 모두에서, 실란트는 칼슘을 사용할 때 1주 미만 동안 안정하였음을 나타낸다. 1주 후에는, 오직 칼슘의 존재 하에서만, 실란트가 자발적으로 응고되었다.

저장하거나 저장하지 않은 경우의 표 8 및 표 9의 결과들 사이의 비교는, BAC2 성분을 포함하는 실란트 조성물이 순수한 피브리노겐을 포함하는 조성물에 비하여 더 활성임을 나타낸다.

Claims

저장-안정성 수성 실란트 제형으로서, 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하며, 상기 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항에 있어서, 상기 혈액 유래 피브리노겐 농축물은 동결침전된 피브리노겐을 포함하는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항에 있어서, 상기 혈액 유래 피브리노겐 농축물은 현탁되거나 침전된 콘 분획(Cohn Fraction) I을 포함하는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 양이온은 칼슘 양이온인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제4항에 있어서, 상기 칼슘 양이온은 염화칼슘에 의해 제공되는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 0.078 초과의 피브로넥틴:피브리노겐의 상대 농도로 피브로넥틴을 포함하는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제6항에 있어서, 0.1 내지 0.2의 피브로넥틴:피브리노겐의 상대 농도로 피브로넥틴을 포함하는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형 내의 단백질들의 총량 중 79.8% 미만인 양으로 응고성(clottable) 단백질을 포함하며, 상기 총량은 상기 인자 XIa를 제외한 것인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 형태인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 냉동 형태인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브리노겐의 양은 13 내지 85 mg/ml, 예를 들어 13 내지 29 mg/ml인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제5항에 있어서, 상기 염화칼슘의 양은 0.15 내지 0.5 mg/ml인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 XIa의 양은 0.01 내지 110 ㎍/ml, 예를 들어 0.11 내지 110 ㎍/ml, 그리고 예를 들어 0.11 ㎍/ml 초과 110 ㎍/ml 이하인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈이 부재하는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브리노겐 농축물은 인자 VIII의 제조 공정의 부산물인, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2주 이상 동안 안정한, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, -30℃의 온도에서 15개월 이상 동안 안정한, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민 K 의존성 응고 자이모겐(zymogen)이 부재하는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
제18항에 있어서, FII, FVII, FIX 및 FX 자이모겐이 부재하는, 저장-안정성 수성 실란트 제형.
(i) 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 실란트 제형을 수용하는 용기로서, 상기 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한, 상기 용기; 및 (ii) 상기 실란트 제형의 전달을 위한 재밀봉 가능한 개구를 포함하는, 어플리케이터.
제20항에 있어서, 상기 실란트 제형은 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 어플리케이터.
제20항 또는 제21항에 있어서, 액체 형태의 상기 실란트 제형을 수용하는 주사기의 형태인, 어플리케이터.
실란트 제형을 수용하는 지지 매트릭스를 포함하는 상처 드레싱으로서, 상기 실란트 제형은 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하며, 상기 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한, 상처 드레싱.
제24항에 있어서, 상기 실란트 제형은 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 상처 드레싱.
피브린 혈전의 형성을 촉진하는 방법으로서, 상기 방법은 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 실란트 제형과 혈액을 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한, 방법.
제25항에 있어서, 상기 실란트 제형은 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 방법.
상처 치료를 필요로 하는 대상에서 상처를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 상처의 적어도 일부분 상에, 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하며 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한 소정 양의 실란트 제형을 도포하는 단계를 포함하며, 상기 실란트 제형의 상기 양은 상기 상처와 접촉할 때 상기 상처에서 응고를 촉진하기에 효과적인, 방법.
제27항에 있어서, 상기 실란트 제형은 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 방법.
키트로서, 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하는 저장-안정성 수성 실란트 제형을 포함하는 용기를 포함하며, 상기 실란트 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한, 키트.
제29항에 있어서, 상기 용기는 어플리케이터의 형태인, 키트.
제30항에 있어서, 상기 어플리케이터는 상처의 적어도 일부분 상에 상기 실란트 제형을 도포하는 것을 용이하게 하도록 구성되는, 키트.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 어플리케이터는 주사기인, 키트.
제29항에 있어서, 어플리케이터를 추가로 포함하는, 키트.
상처 치료를 필요로 하는 대상에서 상처를 치료하기 위한 저장-안정성 수성 실란트 제형의 용도로서, 상기 제형은 혈액 유래 피브리노겐 농축물, 2가 양이온 및 인자 XIa를 포함하며, 상기 제형은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 이상 동안 안정한, 용도.