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KR20190049483A - Scf 및 갈렉틴-1을 표적으로 하는 이중표적항체 및 그 용도 - Google Patents

Scf 및 갈렉틴-1을 표적으로 하는 이중표적항체 및 그 용도 Download PDF

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KR20190049483A
KR20190049483A KR1020180127615A KR20180127615A KR20190049483A KR 20190049483 A KR20190049483 A KR 20190049483A KR 1020180127615 A KR1020180127615 A KR 1020180127615A KR 20180127615 A KR20180127615 A KR 20180127615A KR 20190049483 A KR20190049483 A KR 20190049483A
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Abstract

본 발명은 SCF(Stem Cell Factor) 및 갈렉틴-1(Galectin-1)을 표적으로 하는 이중표적항체 및 이를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 신생혈관형성에 관여하는 SCF 및 갈렉틴-1을 동시에 중화시킴으로써 신생혈관 생성을 효과적으로 저해할 수 있는 인간 단일클론항체 유래 이중표적항체와 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 이중표적항체는 신생혈관형성에 관여하는 두 가지 표적을 동시에 중화시킴으로써, 비정상적 혈관신생으로 혈관이 변화되어 투과성이 증가됨으로써 출혈을 일으키는 혈관신생 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

SCF 및 갈렉틴-1을 표적으로 하는 이중표적항체 및 그 용도{BISPECIFIC ANTIBODY TARGETING SCF AND GALECTIN-1, AND USE THEREOF}
본 발명은 SCF(Stem Cell Factor) 및 갈렉틴-1(Galectin-1)을 표적으로 하는 이중표적항체 및 이를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
SCF(stem cell factor)는 혈액세포, 정자, 멜라닌세포의 분화에 깊이 관여하는 인자로 알려져 있다. 주로 섬유아세포(fibroblast)와 내피세포(endothelial cell)에서 생산되며, 저산소증(hypoxia) 상태에서 발현 및 분비가 증가함으로써 혈관신생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 갈렉틴-1(Galectin-1)은 저산소증(hypoxia) 상황에서 분비되어 혈관형성을 조절하는 대표적인 단백질인 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 혈관내피세포성장인자) 수용체에 결합하여 혈관형성을 유도하는 인자로, VEGF를 억제하더라도 새로운 리간드인 갈렉틴-1에 의해 혈관이 유도되는 것으로 알려져 있다.
혈관신생(angiogenesis)은 체내의 혈관생성인자에 의해 이미 존재하는 기존 혈관으로부터 새로운 미세혈관이 생성되는 것을 의미한다. 세포가 어느 정도 성장을 하면 혈관 생성을 자극하는 물질을 분비하고, 역으로 너무 많이 분비되면 그것을 억제하는 물질을 분비한다. 피드백을 이용하여 혈관생성의 밸런스를 유지하게 된다.
성인 대부분의 혈관은 거의 분열하지 않으며, 정상적인 혈관신생은 극히 드물게 일어난다. 비정상적 혈관신생은 혈관이 변화되어 투과성이 증가됨으로써 출혈을 일으키는 질병을 불러일으킨다. 그 예로 노인성 황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 녹내장성 망막색소변성(glaucoma retinitis igmentosa), 미숙아 망막증(retinopathy od prematurity), 녹내장(glaucoma), 각막 이영양증(corneal dystrophy), 망막층간분리(retinoschises), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis), 종양 전이(metastasis), 만성 상처(delayed wound healing) 등의 질환이 발생한다.
특히, 상기 질병들 중 각막에서의 신생혈관 생성은 안구의 투명성을 저해하여 시력의 손실을 가져오게 하며, 망막에서의 신생혈관 생성은 비정상적인 혈관이 생성됨으로써 혈액의 삼출현상이 일어나 망막세포의 변성을 통한 실명을 유도한다. 따라서, 눈에서의 신생혈관 생성은 바람직한 현상이 아니고 최대한 억제되는 것이 바람직하며, 이와 같이 비정상적 혈관신생에 기인한 질병들은 신생혈관을 억제해야만 해당 질환의 치료효과를 높일 수 있다.
이러한 이유로 혈관신생 억제제를 이용하여 혈관신생관련 질병의 치료에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 혈관내피세포의 성장, 이동, 분화, 모세혈관 형성 등과 같은 혈관형성과정에 관여하는 많은 혈관신생 촉진인자와 혈관신생 억제인자들이 발견되었다. 혈관신생 억제인자들은 혈관신생 시 필요한 혈관신생 촉진인자들의 활성에 반대하여 활성화된다. 체내에 자연적으로 존재하는 혈관신생 억제제들은 독성이 적어 병리적인 혈관신생 억제에 사용될 수 있으므로 이와 관련된 많은 약물들이 개발 중에 있다.
본 발명자들은 혈관신생 관련 질환의 치료 물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, SCF(stem cell factor) 및 갈렉틴-1이 혈관 신생을 촉진하는 반면, SCF 및 갈렉틴-1의 발현을 억제할 경우 신생혈관 발현이 저해됨을 확인하고, SCF 및 갈렉틴-1을 동시에 중화시킬 수 있는 이중표적항체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SCF(Stem Cell Factor) 및 갈렉틴-1(Galectin-1)에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 코딩하는 DNA를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 SCF 및 갈렉틴-1의 동시 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 SCF(Stem Cell Factor) 및 갈렉틴-1(Galectin-1)에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3을 각각 코딩하는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3을 각각 코딩하는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 코딩하는 DNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 SCF 및 갈렉틴-1의 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 신생혈관형성에 관여하는 SCF 및 갈렉틴-1을 동시에 중화시킴으로써 신생혈관 생성을 효과적으로 저해할 수 있는 인간 단일클론항체 유래 이중표적항체와 상기 항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 이중표적항체는 신생혈관형성에 관여하는 두 가지 표적을 동시에 중화시킴으로써, 비정상적 혈관신생으로 혈관이 변화되어 투과성이 증가됨으로써 출혈을 일으키는 혈관신생 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 효소면역 측정법을 통해 선택된 총 9종의 단일클론 항체 3C6, 3A2, 3C3, 3A4, 3E7, 3C8, 3C4, 3F7 및 3F3을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 총 9종의 단일클론 항체를 HUVEC(혈관내피세포)에 처리하여 각 항체의 혈관내피세포의 튜브 형성 억제능을 확인한 도이다.
도 3은 PCR에 의해 증폭된 3C4 항체 가변부위 중 경쇄 도메인의 DNA를 1% 아가로즈 젤에서 전기영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 PCR에 의해 증폭된 3C4 항체 가변부위 중 중쇄 도메인의 DNA를 1% 아가로즈 젤에서 전기영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 3C4 항체 경쇄부위의 염기서열, 아미노산 서열 및 이의 CDR 영역을 나타낸 도이다.
도 6은 3C4 항체 중쇄부위의 염기서열, 아미노산 서열 및 이의 CDR 영역을 나타낸 도이다.
도 7은 동물 세포주에서 발현된 인간 3C4 항체를 분리 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 인간 3C4 항체의 SCF 결합능을 확인하기 위하여 SPR(표면 플라즈몬 공명)을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 인간 3C4 항체의 혈관내피세포(HUVEC)의 튜브 형성 억제능을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 인간 3C4 항체의 c-kit 인산화 억제 효능 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 인간 3C4 항체를 이용한 단백질 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 인간 galectin-1 유전자를 대장균에서 과발현시킨 후 분리정제한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 인간 3C4 항체의 galectin-1 결합능을 확인하기 위하여 SPR(표면 플라즈몬 공명)을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명에 따른 인간 3C4 항체의 혈관내피세포의 튜브 형성 억제능을 확인한 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 인간 3C4 항체의 SCF 및 galectin-1에 의한 세포 증식 억제능을 확인한 도이다.
도 16은 본 발명에 따른 인간 3C4 항체와 시판 중인 SCF 항체의 중화능을 비교하기 위하여 각 항체의 혈관내피세포의 튜브 형성 억제능을 확인한 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명자들은 혈관신생 관련 질환에 있어서 신생혈관 생성을 저해하여 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 이중표적항체를 최초로 생산하였다.
상기 이중표적항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리하는 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서 이중표적항체는 '다클론' 또는 '단클론' 항체일 수 있으나, 단클론 항체가 보다 바람직하다. 단클론 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 더욱이, 상이한 에피토프에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체와는 반대로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 유도된다. 단클론은 임의의 특정한 방법으로 항체를 생성하는 것을 필요로 한다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에서 유용한 단클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조하거나, 재조합 DNA 방법 [미국특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. 또한, 단클론 항체는 예를 들면 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
일 양태로서, 본 발명은 SCF(Stem Cell Factor) 및 갈렉틴-1(Galectin-1)에 특이적으로 결합하는 이중표적항체로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각이며, 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 카파형이다.
본 명세서에서, 용어 “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어 “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄 및 경쇄에는 각각 3개의 CDR(중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3))이 포함되어 있다. CDR은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서, 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공하여 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정되는 중요한 부위이다.
본 발명에서, 용어 "프레임 워크 영역(framework region, FR)"이란, 항체의 가변영역을 구성하는 구성요소로서, 상기 CDR의 사이에 위치하여 CDR의 고리구조를 지지하는 역할을 수행하는 부위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "SCF 및 갈렉틴-1(Galectin-1)에 특이적으로 결합하는 이중표적항체"는 “항-SCF 항체” 또는 “이중표적항체”와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 이중표적항체 또는 그의 항원 결합 단편은, SCF 및 갈렉틴-1을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 가진다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있으며, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
또한, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
또한, 본 발명에 있어서, 본 발명의 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체는 인간 IgG1 유래 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기한 경쇄 가변부위 및 중쇄 가변부위에 추가로 인간 IgG1 유래 불변 영역을 포함하는 이중표적항체인 3C4 항체를 제공한다.
본 발명의 이중표적항체는 “인간화 항체”인 것이 바람직하다. 인간화 항체란, 비인간 상보성 결정 영역(CDR)을 보유하는 항체의 서열을 변경시킴으로써 일부 또는 전체가 인간 항체 배선(germline)으로부터 유도된 아미노산 서열로 구성된 항체를 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 “인간 항체”일 수 있다. 본 발명에서, 용어 "인간항체(human antibody)"란, 광범위하게는 인간의 면역글로불린으로부터 유래된 가변영역(CDR 및 FR)을 포함하는 항체를 의미하고, 보다 좁은 범위로는 인간의 면역글로불린으로부터 유래된 가변영역 및 불변영역(constant region)을 포함하는 항체를 의미한다. 상기 인간항체는 전체 항체(whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 인간 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 인간항체는 모든 구성요소가 인간으로부터 유래되었기 때문에, 기존의 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비해서 면역화 반응이 일어날 확률이 적어서 인간에게 투여하였을 경우 원하지 않는 면역반응이 일어나지 않는 장점이 있으므로, 인간을 대상으로 하는 치료용 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 인간항체는 발명의 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체로서 간주될 수 있고, 상기 인간항체는 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하여 SCF 및 갈렉틴-1에 의해 유도되는 신생혈관 발현을 현저하게 저해시키는 기능을 수행하는 것으로 간주될 수도 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
아울러, 상기 인간항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 투여된 생체 내에서의 체류시간을 증진시키기 위하여, 당화(glycosylation) 및/또는 페길화(PEGylation)될 수 있다.
본 발명의 용어 "당화(glycosylation)"는 글리코실기를 단백질에 전위시키는 가공방법을 의미한다. 상기 당화는 글리코실 전달효소에 의해 글리코실기가 표적 단백질의 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 히드록실리신 잔기에 결합되어 수행되는데, 상기 당화된 단백질은 생체조직의 구성물질로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 세포표면에서 세포인식에도 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 본 발명에서는 인간항체의 당화 또는 상기 당화의 패턴을 변화시켜서 인간항체의 효과를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "페길화(PEGlation)"는 상기 인간항체에 폴리에틸렌글리콜을 도입함으로써, 상기 인간항체의 혈중 체류시간을 향상시키는 가공방법을 의미한다(Anna M. Wu, et al., Nature Biotechnology, 23(9): 1137-1146, 2005; David Schrama, et al., Drug Discovery, 5:147-159, 2006; Alain Beck, et al., Immunology, 10:345-352, 2010). 구체적으로, 폴리에틸렌글리콜로 고분자 나노 입자를 페길화하는 것에 의해, 나노 입자의 표면의 친수성이 증가되며 병원균, 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시키는 인체 내의 탐식세포(macrophage) 등을 포함하는 면역 기능으로부터의 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과(stealth effect)를 통한 신체 내에서의 빠른 분해가 방지될 수 있다. 따라서, 상기 페길화에 의하여 인간항체의 혈중 체류 시간이 향상될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 페길화는 히알루론산의 카르복실 그룹과 폴리에틸렌 글리콜의 아민 그룹의 결합에 의해 아미드 그룹을 형성하는 방법으로 형성될 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 아니하며 다양한 방법으로 페길화를 수행할 수 있다. 이때, 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 100-1,000사이의 분자량을 갖고, 선형 또는 가지형의 구조를 가지는 것을 사용함이 바람직하다.
상기 당화 및/또는 페길화는 본 발명의 항체의 기능을 유지하는 한 당업계의 공지된 방법에 의해 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형될 수 있고, 본 발명의 인간항체는 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형된 변이 인간항체를 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3을 각각 코딩하는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3을 각각 코딩하는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 코딩하는 DNA를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는 서열번호 16으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는 서열번호 17로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 이중표적항체를 코딩하는 DNA는 서열번호 18로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 정렬(alignment) 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미이며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)를 포함한다. 본 발명의 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 이중표적항체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 벡터에서 이중표적항체를 코딩하는 DNA는 프로모터와 작동 가능하게 결합된(operatively linked) 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “작동 가능하게 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있고, 상기 항생제 내성 유전자는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 세포는 박테리아 또는 동물세포일 수 있다.
상기 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포로, 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵 세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포일 수 있고, 바람직하게는 CHO 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 본 발명의 이중표적항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 혈관의 생성으로부터 야기되는 질환을 의미한다. 본 발명의 혈관신생 관련 질환은 안혈관 관련 질환, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis), 종양(cancer), 종양 전이(metastasis), 만성 상처(delayed wound healing), 만성 염증(chronic inflammation), 동맥경화증(atherosclerosis), 협착증(stenosis), 혈관 기형(vascular malformation), 혈액투석과 관련된 혈관 통로 협착(Vascular Access Dysfunction in Patients with Hemodialys), 이식 후 동맥병증(transplant arteriopathy), 혈관염(vasculitis), 디 죠지 증후군(DiGeorge syndrome), 유전성 출혈성 모세혈관확장증(hereditary hemorrhagic telangiectasia), 해면상 혈관종(Cavernous Malformation), 켈로이드성 반흔(keloid scar), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 수포질환(blister), 카포시 육종(kaposi's sarcoma), 증식성 유리체 망막증(Proliferative Vitreoretinopathy), 원발성 폐고혈압증(Primary Pulmonary Hypertension), 천식(asthma), 비폴립(nasal polyps), 염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Disease), 치주 질환(periodontal disease), 복수(ascites), 복막 유착(Peritoneal adhesion), 자궁내막증(endometriosis), 자궁출혈(uterine bleeding), 난소낭종(ovarian cyst), 난소과자극증후군(Ovarian Hyperstimulation Syndrome), 윤활막염(synovitis), 골수염(osteomyelitis), 골증식(osteophyma), 패혈증(sepsis), 감염성 질환(Infectious disease) 및 자가면역질환(autoimmune disease) 등을 포함하고, 바람직하게는 안혈관 관련 질환일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 안혈관 관련 질환은 황반변성(macular degeneration), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 녹내장성 망막색소변성(glaucoma retinitis igmentosa), 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity), 녹내장(glaucoma), 각막 이영양증(corneal dystrophy) 및 망막층간분리(retinoschises)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 노인성 황반변성 또는 당뇨성 망막병증일 수 있다.
하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 이중표적항체는 혈관내피세포의 신생혈관 형성을 저해할 수 있어, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적이다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “약학적 유효량”은 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 VEGF를 타겟하는 다른 치료제와 병행 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 이에 따라 비정상적인 신생혈관형성의 보다 효과적인 억제와 같은 상승작용이 존재할 수 있다. 상기 VEGF를 타겟하는 치료제는 바람직하게는 아일리아(eylea, Aafibercept) 또는 루센티스(lucentis, Ranibizumab)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 SCF 및 갈렉틴-1의 동시 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 검출용 조성물 및 키트는 상술한 본 발명의 이중표적항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 바 이의 동시 검출이 가능하다.
본 발명의 검출용 조성물 및 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 검출용 조성물 및 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SCF 및 Galectin -1을 표적하는 이중 표적 항체 생성 세포주 제작
1-1. 마우스의 면역화
R&D systems로부터 구매한 재조합 SCF(Stem Cell Factor) 단백질 (cat# 7466-SC) 50ug을 동일한 부피의 완전 프라운트 아주반트(Freund's Adjuvant)(sigma, USA)와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다(마우스 1마리 기준). 에멀젼을 7주령 암컷 human CD34+ 세포 주사로 제작된 인간화 NSG 마우스 4마리의 복강 내에 주입하였다. 이후, 항원 50㎍을 총부피 500㎕로 각각의 마우스에게 주입하여 항체 생성을 유도하였다. 그로부터 1주 및 2주 경과 후, 각각 불완전 프라운트 아주반트(Sigma, USA)와 항원을 혼합한 에멀젼을 마우스의 복강 내에 추가로 주입하였다.
1-2. 항체-생성세포의 확인 및 선별
상기 방법을 통해 면역화된 마우스의 안구에서 혈액을 채취하고 1.5 ml 미세원심분리 튜브에 넣고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 혈청을 분리하고 항체생성을 확인하는 실험을 실시할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 항원 단백질을 이용한 효소면역 측정법을 실시하여 항체 생성 여부를 확인한 후, 세포 융합 3일전에 한번 더 불완전 프라운트 아주반트 (Sigma, USA)와 항원을 혼합한 에멀젼을 마우스의 복강 내에 주입하였다.
1-3. 하이브리도마의 제조
항체 생성을 확인한 후 마우스를 희생시켜 비장세포를 분리하고 골수종 세포 P3X63Ag8.653(ATCC CRL-1580)와 융합시켜 하이브리도마를 제조하였다.
먼저, 10% 소태아 혈정을 보충한 RPMI1640배지를 사용하여 배양 플레이트 내에서 마우스의 P3X63Ag8.653 세포를 배양하였다. 세포융합을 실시하기 위해 P3X63Ag8.653 세포를 무혈청 RPMI1640 배지(Hyclone, USA)로 2회 세척하고 1 X 107 세포농도가 되도록 조정하였다. 마우스를 경추탈구에 의해 희생시키고 비장을 채취한 후, 메시 용기(Sigma, USA)에 넣고 세포를 분리하였다. 비장세포의 현탁액을 제조한 후, 현탁액을 원심분리를 이용하여 세척하였다. 비장세포 용액을 트리스-NH4Cl(트리스 20.6g/L, NH4Cl 8.3g/L)에 노출시켜 적혈구 세포를 용해하였다. 완전히 분리된 항체 생성세포를 400 x g로 5분간 원심분리한 후, 무혈청 배지에서 2회 세척하고 10ml 배지에서 재현탁시켰다. 혈구계를 이용하여 림프세포를 계수하고 림프구 1 x 108을 무혈청 배지 내에서 P3X63Ag 8.653 세포 1 x 10 (10:1)와 혼합하였다. 원심분리는 400 x g로 5분간 실시하였다. 이후 37℃에서 데워진 50% (M/V) 폴리에틸렌글리콜 1500(sigma, USA)) 용액 1ml를 1분간 천천히 첨가하여 혼합하였다.
상기에서 제조한 융합 혼합용액을 무혈청 RPMI1640으로 희석하고 400 x g로 3분간 원심분리 하였다. 세포를 20% 소태아 혈청 및 HAT (100 uM 하이포잔틴, 0.4uM 아미노프테린, 16 uM 티미딘)을 보충한 RPMI 1640 선택 배지 35ml에서 현탁하였다. 현탁액 100ul를 1일전 피더세포(RPMI1640을 사용한 복강으로부터 분리된 대식세포)를 코팅한 96-웰 플레이트에 로딩하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 5일 후, HAT 배지는 2-3일 간격으로 교체하고 세포를 14일간 배양하였다. 14일 후, 20% 소태아혈청 및 HT(HAT로부터 0.4 uM 아미노프테린을 제거한 배지) 보충한 RPMI1640 배지를 교체하여 2차 배양하였다. 이렇게 SCF를 면역주사한 림프절에서 분리한 림프구를 골수종세포와 융합하여 얻은 하이브리도마 콜로니의 상층액을 사용하여 이후 실험에 사용하였다.
1-4. 항체 생성 융합세포의 선택 및 분리
실시예 1-3에서 제조한 하이브리도마 콜로니의 상층액을 수집하고 효소면역 측정법을 실시하여, 상기 제조된 항원에 특이적인 항체의 제조를 확인하였다. 음성대조군에 비해 4배 이상의 적정 농도를 나타낸 융합세포의 배양액을 선택하고 24-웰 배양 플레이트로 옮겨 배양하였다. 추가로 96-웰 플레이트에 웰당 1개의 세포가 들어가도록 희석하여(limiting dilution) 배양한 후 배양액을 회수하였다. 이후, 96-웰 플레이트에 항원으로 사용한 SCF 단백질을 웰당 0.1ug으로 코팅한 후, 효소면역 측정법을 실시하였다. 그 결과, 450nm 파장에서 흡광도(optical density, OD value)를 측정하여 최종적으로 9개의 단클론 항체(3C6, 3A2, 3C3, 3A4, 3E7, 3C8, 3C4, 3F7 및 3F3)를 생산하는 융합세포를 선택하였다. 이를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 이중표적항체의 SCF 중화능 결정
매트리겔(Matriegel)(Corning, USA) 300ul를 12-웰 플레이트에 분주한 후 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)을 SCF(50ng/ml) 또는 SCF(50ng/ml) + 항-SCF 항체(10ug/ml)를 섞어준 후 매트리겔에 분주하여 in vitro에서 HUVEC의 튜브(tube) 형성을 관찰하였다(n=10). 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 9개의 단클론 항체 중 3C3 및 3C4 항체가 효과적으로 SCF에 의해 유도되는 HUVEC의 튜브 형성을 억제함을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명의 3C3 및 3C4 항체는 신생혈관 생성을 억제하여 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. IgG 가변영역(variable region)의 염기 서열 분석
3-1. 융합세포로부터 cDNA 합성
실시예 1 및 2에서 얻은 융합세포 3C4 클론 5 X 105 개로부터 전체 RNA를 분리하고, 그로부터 Random primer(bioneer, Korea)와 역전사효소를 이용하여 역전사반응을 실시하였다.
3-2. 마우스 IgG 가변 도메인의 PCR 증폭
역전사반응으로 얻게 된 cDNA에 대해 가변영역 특이 프라이머들을 사용하여 항체의 경쇄 및 중쇄의 해당부위를 증폭하였다. 사용한 프라이머들을 하기 표 1에 나타내었다.
종류 서열 (5’-3') 서열번호
경쇄 CAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGG (정방향) 19
CAGTTGCTAACTGTTCCGTGGATG (역방향) 20
중쇄 ATGGARTTGGGGCTGWGCTGGGTTTT (정방향) 21
ACTTTTGAGAGCAGTTCCAGGAGC (역방향) 22
먼저, 서열번호 1, 2로 표시되는 프라이머를 이용하여 cDNA로부터 카파 경쇄 도메인을 증폭하였다. 증폭된 DNA는 아가로즈 젤 전기영동으로 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, 서열번호 3, 4로 표시되는 프라이머를 이용하여 cDNA로부터 IgG1 중쇄 도메인을 증폭하였다. 마찬가지로, 증폭된 DNA는 아가로즈 젤 전기영동으로 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 카파경쇄 도메인(414 bp)과 중쇄 도메인(483 bp) 사이에서 밴드가 발견되어 예상된 크기의 PCR 산물이 생성됨을 확인하였다. 음성대조군으로 이용한 다른 PCR에서는 PCR 산물이 나타나지 않았다.
이후, 상기 PCR 산물을 아가로즈 젤에 전개하여 밴드를 절단하고 아가로즈 젤을 60℃에 녹인 후, 스핀 컬럼(Qiagen)을 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 TOPO-TA 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여, 대장균 DH5a에 형질전환(transformation)시켜 콜로니를 얻은 후, 콜로니를 배양하여 플라스미드를 추출 후 다시 PCR을 실시한 결과 4개의 플라스미드를 얻은 후 3C4 항체의 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석을 통해 동정된 서열을 표 2에 나타내었다. 한편, 서열분석 결과 3C3 클론은 3C4 클론과 같은 염기서열을 보유하는 것으로 확인되었다. 3C4 항체의 염기 서열, 아미노산 서열 및 이의 CDR 영역을 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 3C4의 경쇄는 파란색 글씨의 순서대로 경쇄의 CDR1(서열번호 1), CDR2(서열번호 2) 및 CDR3(서열번호 3)을 포함하고, 도 6에 나타낸 바와 같이, 3C4의 중쇄는 파란색 글씨의 순서대로 중쇄의 CDR1(서열번호 4), CDR2(서열번호 5) 및 CDR3(서열번호 6)을 포함한다.
또한, 3C4의 경쇄 아미노산 서열을 서열번호 7에, 중쇄 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타내었고, 3C4의 전체 아미노산 서열을 서열번호 9에 나타내었다. 3C4의 경쇄(서열번호 16) 및 중쇄(서열번호 17) 염기서열을 표 2에 나타내었고, 3C4의 전체 염기서열을 서열번호 18에 나타내었다.
종류 서열 (5'-3') 서열번호
경쇄 GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCC GTC ACC CTT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT CAA AGC CTC GTA TAC AGT GAT GGA AAC ACC TAC TTG AAT TGG TTT CAG CAG AGG CCA GGC CAA TCT CCA AGG CGC CTA ATT TAT AAG GTT TCT AAC CGG GAC TCT GGG GTC CCA CAG AGA TTC AGC GGC AGT GGG TCA GGC ACT GAT TTC ACA CTG AAA ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TAC TGC ATG CAA GGT ACA CAC TGG CCT CTT TCG GCG GAG GGA CCA AGG TGG AGA TCA AAC 16
중쇄 CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GTA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAC TGG GTG GCA GTT ATA TGG TAT GAT GGA AGT AAT AAC GAC TAT GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACA CTG TAT CTA CAA ATC AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTA TAT TAC TGT GCG AGA GGG CAA AAT TAC TAT GGT TTG GGG AGT TAT TTC TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC 17
-볼드 및 밑줄 부분은 CDR(Complementarity determining region, 상보적 결정부위) 서열이며, 순서대로 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 나타낸다.
실시예 4. 인간 항체 클로닝
실시예 3에서 얻어진 항-SCF 항체 3C4(이하, 3C4)의 가변 도메인을 인간 Fc 아미노산 서열에 grafting하고 pCHO vector(lifetechnology)내에 클로닝 하였다.
경쇄가변 도메인은 인간 카파 불변영역에 대한 프레임 내에 융합시키고, 중쇄 가변 도메인은 인간 IgG1 불변 영역에 대한 프레임 내에 융합시켰다. 전장 IgG1 항체의 배지내 분비를 위한 리더 펩타이드 서열을 두 유전자에 첨가하여 유전자를 합성 후 서열분석을 통해 다시 한 번 검증하였다. CHO 세포 내에서 발현 시험을 위해 3개의 클론을 선택하였다. 3개의 클론에 대한 글리세롤 스톡을 제조하고 엔도톡신이 없는 플라스미드 DNA를 CHO 세포 내에서 발현시험하기 위해 제조하였다.
실시예 5. CHO 세포에 형질 감염 후 항체의 분리 정제
실시예 4에서 얻은 플라스미드 DNA를 CHO-S 세포 내에 형질감염시켰다. 형질감염 1주일 전 CHO-S(Invitrogen, 10743-029)을 DMEM 보충 혈청 내 단층 배양물 내로 옮겼다. 형질감염 1일 전 세포를 분주 한 다음, 형질 감염 시료에 대하여 DNA-리포펙타민 복합체를 준비하였다. 밤새 인큐베이터에서 5% CO2, 37℃에서 세포를 인큐베이션 한 후, 배지를 2-3일에 한번씩 첨가해 주면서 일주일 간 배양한 후, 배양액을 회수하여 Protein A/G agarose(회사)에 결합시킨 후 PBS로 세척하였다. 이후, 0.1 M 글리신(pH 2.8)으로 용출(elution)한 후, 1M Tris-HCl(pH 8.0)으로 중화시켰다. 다시 PBS로 투석(dialysis)한 후, -70℃에서 보관하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 결과 50 kDa 정도의 중쇄와 25 kDa 정도의 경쇄 밴드가 관찰되었으며, 이를 통해 항체가 정확하게 합성되어 생산되고 있음을 확인하였다.
실시예 6. 3C4 항체의 친화력 검증
본 발명의 3C4 항체가 SCF에 결합하는 능력을 수치화를 통해 정확하게 확인하기 위하여 SPR(Surface Plasmon Resonance, 표면 플라즈몬 공명)을 실시하였다. SR7500DC(Reichert, USA)를 이용하여, 항체 제작을 위해 사용된 인간 항원 SCF 단백질 20ug을 PEG(Reichert, USA) 칩에 고정한 후 본 발명의 항-SCF 항체를 농도 별로(0, 7.8125nM, 15.625nM, 31.25nM, 62.5nM, 125nM, 250nM, 500nM, 1uM 및 2uM) 흘려주었다. SCF에 대한 친화도인 KD 값을 Scrubber2 프로그램을 이용하여 분석한 결과를 도 8에 나타내었다. KD 값은 kd 값을 ka 값으로 나눈 값으로 낮을수록 해당 물질에 대한 결합능이 크다.
도 8에 나타낸 바와 같이, KD 값은 약 18.8 ± 2 X 10-9 M로 나타나 본 발명의 3C4 항체는 SCF에 대하여 강한 친화도를 나타냄을 확인하였다.
실시예 7. 3C4 항체의 SCF에 의한 혈관형성 유도 억제능 재검증
매트리겔(Corning, USA) 300ul를 12-웰 플레이트에 분주한 후 HUVEC을 SCF(50ng/ml) 또는 SCF(50ng/ml) + 3C4 항체(10ug/ml)를 섞어준 후 매트리겔 위에 분주하였다. 이후, HUVEC의 튜브 형성을 관찰하고(n=10), 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3C4 항체는 SCF에 의해 유도되는 HUVEC의 튜브 형성을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명의 3C4 항체는 신생혈관 생성을 억제하여 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 3C4 항체의 SCF에 의한 c-kit 인산화 억제 효능 분석
세포 6 X 104 개를 12시간 동안 배양 후, 4시간 동안 혈청 고갈시키고, 본 발명의 3C4 항체를 15분간 전처리하고, SCF를 처리한 후 세포를 수확하였다. 웨스턴 블랏을 통한 c-Kit 발현을 통해 3C4 항체가 SCF에 의한 신호전달을 효과적으로 억제하는지 여부를 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3C4 항체는 효과적으로 SCF를 중화함으로써 SCF에 의한 c-kit 인산화를 억제할 뿐만 아니라, 하위(down-stream) 신호전달경로에도 영향을 미쳐 AKT 및 ERK의 인산화를 억제시키는 것을 확인하였다.
실시예 9. 단백질 마이크로어레이 분석을 통한 SCF 및 Galectin -1에 대한 결합능 확인
HuProtTMv3.1 human proteome microarray(CDI laboratories) 단백질 칩을 이용하여 단백질 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 먼저 단백질 칩에 2% BSA, 0.1% Tween 20이 포함된 PBST(pH 7.4)로 상온에서 2시간 블로킹하였다. 비오티닐화(biotinylation)된 3C4 항체 2ug를 2% BSA, 0.1% Tween 20이 포함된 PBST(pH 7.4)에 녹여 4℃에서 8시간 동안 결합을 유도한 다음, PBST로 3회 세척하였다. Streptavidin-fluorescence(Alexa-Fluor 532 nm) 1ug(18.9 pmol)을 단백질 칩에 뿌리고 4℃에서 1시간 동안 결합을 유도한 다음, 다시 PBST로 3회 세척하였다. 남은 버퍼액을 완전히 제거한 다음 단백질 칩을 -20℃에 얼리고 GenePix4100A microarray laser scanner(Molecular Devices)로 스캔하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3C4 항체는 SCF 외에 Galectin-1(LGALS1)에 대하여도 높은 결합력을 보임을 확인하였다.
실시예 10. 3C4 항체의 Galectin -1에 대한 친화력 검증
본 발명의 3C4 항체가 galectin-1에 결합하는 능력을 수치화를 통해 정확하게 확인하기 위하여 SPR(Surface Plasmon Resonance, 표면 플라즈몬 공명)을 실시하였다. 먼저, 인간 galectin-1(NP_002296.1)유전자를 pET-3a의 NdeI/BamHI에 클로닝하여 대장균에서 과발현 시킨 후 이온-교환 크로마토그래피로 분리정제한 후 PBS로 투석(dialysis)하여 -70℃에서 보관하였다. 정제된 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 통해 단백질이 galectin-1이 맞는지 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
그 다음으로, SR7500DC (Reichert, USA)를 이용하여, 인간 항원 galectin-1 단백질 20ug을 PEG(Reichert, USA) 칩에 고정한 후 본 발명의 3C4 항체를 농도 별로(0, 23.4375nM, 46.875nM, 93.75nM, 187.5nM, 375nM, 750nM, 1.5uM, 3uM, 및 6uM) 흘려주었다. Galectin-1에 대한 친화도인 KD 값을 Scrubber2 프로그램을 이용하여 분석한 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, KD 값은 약 46.9 ± 9 X 10-9 M로 나타나 본 발명의 3C4 항체는 SCF 뿐만 아니라 galectin-1에 대하여도 강한 친화도를 나타냄을 확인하였다.
실시예 11. Galectin -1에 의한 혈관형성 유도 억제능 검증
매트리겔(Corning, USA) 300ul를 12-웰 플레이트에 분주한 후 HUVEC을 galectin-1(5ug/ml) 또는 galectin-1(5ug/ml) + 3C4 항체(5ug/ml 또는 10ug/ml)를 섞어준 후 매트리겔 위에 분주하였다. 이후, HUVEC의 튜브 형성을 관찰하고(n=10), 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3C4 항체는 galectin-1에 의해 유도되는 HUVEC의 튜브 형성을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명의 3C4 항체는 이중표적항체로써 SCF뿐만 아니라 galectin-1에 의해 유도되는 신생혈관 생성을 억제하여 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 12. SCF 및 galectin -1에 의한 세포 증식 억제능 검증
5 X 103개의 HUVEC 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고 EGM2 배지를 이용하여 12시간 동안 배양하였다. 이후, 본 발명의 3C4 항체를 처리하여 SCF 및 galectin-1에 의한 세포 증식 억제 효과를 Celigo Imaging cytometer(Nexcelom Bioscience)를 이용하여 스캔하고 훼히스트(Hoechst) 염색을 통해 세포 수를 확인하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 3C4 항체 처리시 SCF 및 galectin-1에 의해 유도되는 HUVEC의 증식이 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 3C4 항체는 SCF뿐만 아니라 galectin-1에 의해 유도되는 신생혈관 생성을 효과적으로 억제함을 다시 한 번 확인하였다.
비교예 1. 본 발명의 3C4 항체와 R&D systems의 polyclonal 항체의 중화능 비교
시판 중인 SCF 항체와 본 발명의 3C4 항체의 중화능을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 매트리겔(Corning, USA) 300ul를 12-웰 플레이트에 분주한 후 5분간 방치하여 굳도록 하였다. HUVEC을 SCF(50ng/ml), SCF(50ng/ml) + 3C4 항체 또는 R&D systems의 항-SCF polyclonal 항체(cat#, AF-255-NA)와 농도 별로 섞어준 후 매트리겔 위에 분주하였다. 이후, HUVEC의 튜브 형성을 관찰하고(n=7), 그 결과를 도 16에 나타내었다(*p<0.05).
도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3C4 항체는 모든 농도에 있어서 R&D systems의 항-SCF polyclonal 항체에 비하여 SCF에 의해 유도되는 HUVEC의 튜브 형성 억제능이 유의적으로 높음을 확인하였다. 상기 비교예를 통하여, 시판 중인 SCF 항체보다, 본 발명의 3C4 항체를 사용하는 경우 신생혈관 발현이 현저하게 저해되어, 혈관신생 관련 질환을 보다 효율적으로 치료할 수 있음을 다시 한 번 확인하였다.
안혈관질환의 경우 주된 치료제가 VEGF를 타겟으로 하는 약물이 주를 이루고 있지만, 환자의 약 20%는 VEGF 무반응군으로 새로운 치료제 개발이 필요한 실정이다. 상기 실시예 및 비교예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 이중표적항체는 SCF(Stem Cell Factor) 및 갈렉틴-1(Galectin-1)에 특이적으로 결합하여 SCF 및 갈렉틴-1에 의해 유도되는 혈관형성을 각각 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 기존 치료제에 대한 무반응군 환자에 대해서도 효과적인 치료가 가능하고, VEGF를 타겟하는 기존 약물과 함께 병용투여하여 비정상적인 신생혈관형성을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 예상된다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
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<220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region of 3C4 <400> 6 Ala Arg Gly Gln Asn Tyr Tyr Gly Leu Gly Ser Tyr Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of 3C4 <400> 7 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Leu Ser Ala Glu Gly Pro Arg Trp Arg Ser Asn 100 105 110 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of 3C4 <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gln Asn Tyr Tyr Gly Leu Gly Ser Tyr Phe Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 120 <210> 9 <211> 671 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3C4 <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Leu Ser Ala Glu Gly Pro Arg Trp Arg Ser Asn Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Val Glu 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys 225 230 235 240 Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg 245 250 255 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp 260 265 270 Gly Ser Asn Asn Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 275 280 285 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 290 295 300 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gln Asn Tyr 305 310 315 320 Tyr Gly Leu Gly Ser Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 325 330 335 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 340 345 350 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 355 360 365 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 370 375 380 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 385 390 395 400 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 405 410 415 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 420 425 430 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 435 440 445 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 450 455 460 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 465 470 475 480 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 485 490 495 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 500 505 510 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 515 520 525 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 530 535 540 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 545 550 555 560 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 565 570 575 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 580 585 590 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 595 600 605 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 610 615 620 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 625 630 635 640 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 645 650 655 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 660 665 670 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding CDR1 of a light chain variable region of 3C4 <400> 10 caaagcctcg tatacagtga tggaaacacc tac 33 <210> 11 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding CDR2 of a light chain variable region of 3C4 <400> 11 aaggtttct 9 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding CDR3 of a light chain variable region of 3C4 <400> 12 atgcaaggta cacactggcc tctt 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding CDR1 of a heavy chain variable region of 3C4 <400> 13 ggattcacct tcagtagcta tggc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding CDR2 of a heavy chain variable region of 3C4 <400> 14 atatggtatg atggaagtaa taac 24 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding CDR3 of a heavy chain variable region of 3C4 <400> 15 gcgagagggc aaaattacta tggtttgggg agttatttct ttgactac 48 <210> 16 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding a light chain variable region of 3C4 <400> 16 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300 ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aac 333 <210> 17 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding a heavy chain variable region of 3C4 <400> 17 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggactg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taacgactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240 ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gagagggcaa 300 aattactatg gtttggggag ttatttcttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 360 <210> 18 <211> 2019 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding 3C4 <400> 18 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300 ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aaccgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttgacag 660 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 720 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 780 ggcaaggggc tggactgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa cgactatgca 840 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac actgtatcta 900 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtatatt actgtgcgag agggcaaaat 960 tactatggtt tggggagtta tttctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 1020 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 1080 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 1140 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 1200 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 1260 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 1320 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 1380 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1440 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1500 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1560 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1620 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtcagcaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1680 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1740 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1800 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1860 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1920 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1980 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 2019 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cagctcctgg ggctgctaat gctctgg 27 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cagttgctaa ctgttccgtg gatg 24 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 atggarttgg ggctgwgctg ggtttt 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 acttttgaga gcagttccag gagc 24

Claims (16)

  1. SCF(Stem Cell Factor) 및 갈렉틴-1(Galectin-1)에 특이적으로 결합하는 이중표적항체로,
    서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중표적항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중표적항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG1 유래 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중표적항체.
  5. 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3을 각각 코딩하는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3을 각각 코딩하는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 코딩하는 DNA.
  6. 제5항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는 서열번호 16으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중표적항체를 코딩하는 DNA.
  7. 제5항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는 서열번호 17로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중표적항체를 코딩하는 DNA.
  8. 제5항에 있어서, 상기 이중표적항체를 코딩하는 DNA는 서열번호 18로 표시되는 것을 특징으로 하는, 이중표적항체를 코딩하는 DNA.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 벡터.
  10. 제9항의 벡터로 형질전환된 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 또는 동물세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  12. 제1항의 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 안혈관 관련 질환, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis), 종양(cancer), 종양 전이(metastasis), 만성 상처(delayed wound healing), 만성 염증(chronic inflammation), 동맥경화증(atherosclerosis), 협착증(stenosis), 혈관 기형(vascular malformation), 혈액투석과 관련된 혈관 통로 협착(Vascular Access Dysfunction in Patients with Hemodialys), 이식 후 동맥병증(transplant arteriopathy), 혈관염(vasculitis), 디 죠지 증후군(DiGeorge syndrome), 유전성 출혈성 모세혈관확장증(hereditary hemorrhagic telangiectasia), 해면상 혈관종(Cavernous Malformation), 켈로이드성 반흔(keloid scar), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 수포질환(blister), 카포시 육종(kaposi's sarcoma), 증식성 유리체 망막증(Proliferative Vitreoretinopathy), 원발성 폐고혈압증(Primary Pulmonary Hypertension), 천식(asthma), 비폴립(nasal polyps), 염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Disease), 치주 질환(periodontal disease), 복수(ascites), 복막 유착(Peritoneal adhesion), 자궁내막증(endometriosis), 자궁출혈(uterine bleeding), 난소낭종(ovarian cyst), 난소과자극증후군(Ovarian Hyperstimulation Syndrome), 윤활막염(synovitis), 골수염(osteomyelitis), 골증식(osteophyma), 패혈증(sepsis), 감염성 질환(Infectious disease) 및 자가면역질환(autoimmune disease)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 안혈관 관련 질환은 황반변성(macular degeneration), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 녹내장성 망막색소변성(glaucoma retinitis igmentosa), 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity), 녹내장(glaucoma), 각막 이영양증(corneal dystrophy) 및 망막층간분리(retinoschises)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상임을 특징으로 하는, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 이중표적항체는 신생혈관 생성을 저해하는 것인, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제1항에 따른 SCF 및 갈렉틴-1에 특이적으로 결합하는 이중표적항체를 포함하는 SCF 및 갈렉틴-1의 동시 검출용 조성물.
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