KR20190039102A

KR20190039102A - 다능성 간세포에 따른 만성폐질환의 개선 및 치료

Info

Publication number: KR20190039102A
Application number: KR1020197002929A
Authority: KR
Inventors: 요시아키 사토; 토시히코 스즈키; 시노부 시미즈; 마사아키 미즈노; 마사히로 하야카와; 마리 데자와
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 나고야 다이가쿠; 도호쿠 다이가쿠; 가부시키가이샤 세이메이카가쿠 인스티튜트
Priority date: 2016-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2019-04-10
Anticipated expiration: 2037-08-03
Also published as: SG11201900983TA; EP3494978A1; US12083149B2; JPWO2018025973A1; AU2017305064B2; EP3494978A4; AU2017305064A1; CA3032917A1; WO2018025973A1; JP7165352B2; KR102503101B1; CN109789168A; US20190240262A1

Abstract

본 발명은, 재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 신생아의 만성폐질환을 개선 및 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물을 제공한다. 본 발명의 세포제제는, 상기 질환을 가지는 대상에 대하여, Muse 세포를 투여함으로써, 폐조직에 생착시켜서, 상기 질환을 개선 및 치료하는 기구에 근거하는 것이다.

Description

다능성 간세포에 따른 만성폐질환의 개선 및 치료

본 발명은, 재생의료에 있어서의 세포제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 다능성 간세포(幹細胞)를 함유하는 만성폐질환의 치료에 유효한 세포제제 및 신규 치료방법에 관한 것이다.

만성폐질환(chronic lung disease; CLD), 특히 신생아의 만성폐질환은, 신생아 의료의 중대하고 빈도가 높은 합병증으로, 호흡궁박증후군 등의 호흡장애를 위하여 인공환기요법을 받은 조산아의 한 그룹에서 인정되는 만성적인 폐의 병변이다. 이번 신생아 의료의 진보에 따라, 최근 20여년 동안 선진국에 있어서의 출생체중 1500g 미만의 영아의 생존률은, 70% 미만에서 80% 이상으로 상승하고 있는데, CLD의 이환율은 태내 28주 미만의 영아에서 53.2%, 출생체중 1000g 미만의 영아에서 40%로 여전히 높다.

신생아 만성폐질환에 관하여, 2001년에 국제적으로 제창된 정의에서는, '태내 32주 미만의 조산아에서는, 수정 36주 또는 퇴원 전까지 21%를 넘는 산소요법을 28일 이상 필요로 한 영아'라고 되어 있고, 그 산소의존도에 따라 중증도가 분류되어 있다. 만성폐질환은 퇴원 후에도 재택산소요법을 필요로 하는 경우도 있으며, 더욱이 유아기에 있어서의 호흡기 감염증의 입원 등, 의료경제를 고려하는 데에 있어서 중요한 질환이다. 또한, 만성폐질환은, 신생아 및 유아뿐만 아니라, 청년기까지 이르는 호흡기능의 저하도 큰 문제로 되어 있다.

지금까지 신생아 만성폐질환은, 폐미숙성이나 서팩턴트 결핍 상태에, 감염, 동맥관개존증, 산소독성, 인공환기 등의 손상이 더해져, 폐조직의 이형성에 기인하여, 기종화, 섬유화에 이른다고 생각되고 있었는데, 최근 신생아 만성폐질환은 단순한 폐의 상해뿐만 아니라, 발달 도중의 미숙폐가 태외에 나와 성장해 가는 과정에서 다양한 손상이 가해져, 폐포나 혈관계의 발달이 정지된 상태로 생각되고 있다.

이러한 질환의 치료법은, 대증요법으로서 투여하는 산소농도의 제한, 수분의 제한, 이뇨제에 의한 폐순환으로의 수분부하경감, 기관지확장제나 호흡자극제의 투여, 항염증작용이나 항부종작용을 목적으로 하는 스테로이드 투여 등이 이루어지고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1에서는, 호흡궁박증후군 환자가 신생아 만성폐질환에 빠질 리스크를 저감하기 위하여, 스테로이드제 및 폐서팩턴트를 조합한 기관내투여에 적용되는 의약조성물이 제안되어 있다. 하지만, 스테로이드에 대하여는, 성장기의 중추신경계로의 부작용이 우려되므로, 중증례에 대하여만 응급구조적으로 단기 소량 투여하고 있는 것이 현상이다. 이와 같이 만성폐질환에 대하여는, 대증요법적으로 치료가 이루어지고, 그 질환의 완치를 목적으로 하는 치료약 및 치료법에 대하여 보고되어 있지 않다.

최근 재생의료분야에 있어서, 간세포를 이용한 세포요법이 다양한 질환에 대하여 연구가 이루어지고, 임상으로의 응용도 행하여지고 있는 가운데, 만성폐질환, 예를 들어 기관지폐이형성증(BPD)의 개선이나 치료에 간세포의 적용이 기대되고 있다(비특허문헌 1~3). 예를 들어, 골수간엽계세포획분(MSC)은, 성체로부터 단리되어, 뼈, 연골, 지방세포, 신경세포, 골격근 등으로 분화하는 능력을 가지는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4 및 5). 하지만, MSC는 다양한 세포를 포함하는 세포군으로, 그 분화능의 실체를 알 수 없으며, 치료효과에 편차가 크다. 또한, 성체 유래의 다능성 간세포로서 iPS 세포(특허문헌 2)가 보고되어 있는데, iPS 세포의 수립에는, 간엽계세포인 피부섬유아세포획분에 특정 유전자나 특정 화합물을 체세포에 도입한다는 매우 복잡한 조작을 필요로 하는 것과 더불어, iPS 세포가 높은 종양형성능력을 가지는 것으로부터, 임상응용으로의 매우 높은 장애물이 존재하고 있다.

본 발명자들 중 한 사람인 데자와의 연구에 의하여, 간엽계세포획분에 존재하고, 유도조작 없이 얻어지는 SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면항원으로서 발현하고 있는 다능성 간세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse 세포)가 간엽계세포획분이 가지는 다능성을 담당하고 있어, 조직재생을 목표로 한 질환치료에 응용할 수 있을 가능성이 있다는 것이 명확해졌다. 또한, Muse 세포는, 간엽계세포획분을 다양한 스트레스로 자극함으로써 농축할 수 있다는 것도 알 수 있었다(특허문헌 3; 비특허문헌 6). 하지만, 만성폐질환의 개선 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여, 기대되는 치료효과가 얻어지는 것을 명확하게 한 예는 없다.

특허문헌 1: 일본공개특허공보 제2007-262064호 특허문헌 2: 일본특허공보 제4183742호 특허문헌 3: 국제공개공보 제2011/007900호

비특허문헌 1: Chou, H.C., et al., Am.J.Transl.Res., Vol.8, p.342-353(2016) 비특허문헌 2: Kim, Y.E., et al., Pediatric Res., 2016, doi:10.1038/pr.2016.88 비특허문헌 3: Luan, Y., et al., Mol.Med.Rep., Vol.11, p.1945-1950(2015) 비특허문헌 4: Dezawa, M., et al., J.Clin.Invest., Vol.113, p.1701-1710(2004) 비특허문헌 5: Dezawa, M., et al., Science, Vol.309, p.314-317(2005) 비특허문헌 6: Wakao, S, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.108, p.9875-9880(2011)

본 발명은, 재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, Muse 세포를 포함하는 만성폐질환(CLD)의 치료에 유효한 세포제제 및 의약조성물, 그리고 신규 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 고산소부하에 따른 만성폐질환 모델 래트를 제작하고, 정맥주사에 의하여 Muse 세포를 투여함으로써, 만성폐질환이 개선되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하와 같다.

[1] 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는 만성폐질환을 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제.

[2] 상기 [1]에 있어서, 외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분을 포함하는, 세포제제.

[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD105 양성인 세포제제.

[4] 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 세포제제.

[5] 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 세포제제.

[6] 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 세포제제.

[7] 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 이하의 성질을 모두 가지는 다능성 간세포인 세포제제:

(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐.

[8] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 있어서, 만성폐질환이 기관지폐이형성증(BPD), 윌슨·미키티 증후군(WMS), 신생아천연(遷延)성폐고혈압증(PPHN), 및 신생아고혈압증으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 세포제제.

[9] 상기 [1]~[8] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 폐조직에 생착하는 능력을 가지는 세포제제.

[10] 상기 [1]~[9] 중 어느 하나에 있어서, 사람신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서 약 1×10⁴세포/개체~약 3×10⁸세포/개체로 투여하는 세포제제.

[11] 상기 [1]~[10] 중 어느 하나에 있어서, 사람신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서, 그 대상 1개체당 약 3×10⁴세포/kg~약 3×10⁷세포/kg을 체중 환산한 세포량을 투여하는 세포제제.

본 발명은, 만성폐질환을 앓고 있는 대상(주로 신생아)에 대하여, Muse 세포를 정맥 등으로부터 투여함으로써, 항염증작용 및 조직수복작용을 발휘시키고, 정상적인 폐조직을 구축시킬 수 있다.

도 1은, GFP 표식된 Muse 세포가, 생후 15일의 만성폐질환 모델 래트의 폐조직에 있어서 생착한 것을 나타낸다.
도 2는, Muse 세포 투여 그룹('Muse'), 세포현탁액(HAN's BALANCED SALT SOLUTION: HBSS)만을 첨가한 그룹('비히클'), 및 샴 오퍼레이션 그룹('샴')의 만성폐질환 모델 래트의 폐조직을 평가한 결과를 나타낸다. 단기그룹은 생후 15일의 래트를 피험대상으로 하고, 장기그룹은 생후 29일의 래트를 피험대상으로 하였다. 세로축은, 조직의 비율을 나타낸다.
도 3은, Muse 세포 투여 그룹('Muse'), 비Muse 세포 투여 그룹('비Muse'), 세포현탁액(HBSS)만을 첨가한 그룹('비히클'), 및 샴 오퍼레이션 그룹('샴')의 만성폐질환 모델 래트의 폐조직을 평가한 결과를 나타낸다. 단기그룹은 생후 15일의 래트를 피험대상으로 하고, 장기그룹은 생후 29일의 래트를 피험대상으로 하였다. 세로축은, 조직의 비율을 나타낸다.
도 4는, 생후 29일의 래트의 폐조직에 있어서의 폐포벽의 비율을 평가한 결과를 나타낸다. 폐포벽 비율이 높을수록 폐포벽이 긴밀하게 형성되어 폐조직이 수복되어 있는 것을 나타낸다.
도 5는, 생후 15일의 만성폐질환 모델 래트의 폐조직에 있어서 발현한 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸다. 세로축은, 샴 오퍼레이션 그룹을 1로 한 상대적인 발현량을 나타낸다.
도 6은, Muse 세포 투여 그룹('Muse 그룹'), 세포현탁액(HBSS)만을 첨가한 그룹('비히클 그룹'), 및 샴 오퍼레이션 그룹('샴 그룹')의 만성폐질환 모델 래트의 심장평가를 행한 결과를 나타낸다. 세로축은, 우실벽의 중량을 좌실벽과 중격(中隔)의 중량으로 나눈 것을 나타낸다.
도 7은, Muse 세포 투여 그룹('Muse 그룹'), 비Muse 세포 투여 그룹('비Muse 세포'), 세포현탁액(HBSS)만을 첨가한 그룹('비히클 그룹'), 및 샴 오퍼레이션 그룹('샴 그룹')의 만성폐질환 모델 래트의 심장평가를 행한 결과를 나타낸다. 세로축은, 우실벽의 중량을 좌실벽과 중격의 중량으로 나눈 것을 나타낸다.
도 8은, 폐동맥혈관의 내벽률의 변화를 지표로 하여, 각종 투여 그룹에 있어서의 폐동맥혈관벽의 비후의 경감을 검토한 결과를 나타낸다. 도 8의 (a)는, 폐동맥혈관을 단면으로 한 조직을 항α-SMA 항체를 이용하여 염색한 도면이다. 도 8의 (b)는, 단기그룹 및 장기그룹에 있어서의 폐동맥세포의 내벽률을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는, 만성폐질환에 따라 항진되는 폐동맥세포의 신생의 억제를 각종 투여 그룹에 있어서 검토한 결과를 나타낸다. 도 9의 (a)는, 조직학적으로 염색한 결과를 나타내고, 증식 중인 폐동맥세포의 핵을 항Ki-67 항체로 염색(녹색)하며, α-평활근 악틴을 항α-SMA 항체로 염색(적색)하고, 폐동맥세포의 핵을 DAPI로 염색(청색)하였다. 도 9의 (b)는, 항 Ki-67 항체에 의한 양성률을 나타낸다.
도 10은, 폐포세정액 중의 염증성 세포의 수를 검토한 결과를 나타낸다.

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 만성폐질환을 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물, 그리고 신규 치료방법에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.

1. 적용질환과 그 진단

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 세포제제 또는 의약조성물을 이용하여, 만성폐질환의 개선 및 치료를 목표로 한다. 일본에서는 1996년에 후생노동성 연구반에 의하여, 신생아의 '만성폐장애'를 '선천기형을 제외하는 폐의 이상에 의하여, 산소투여를 필요로 하는 것과 같은 호흡궁박증상이 신생아기에 시작되어, 생후 28일을 넘어 계속되는 것'으로 정의하고, 더욱이 폐장애 중 대부분을 차지하는 저출생체중아의 만성폐장애를 질환으로서 특징짓기 위하여, '만성폐질환'을 '흉부X선 사진에서 미만성 불투양상, 포말상 음영 등 명확한 이상소견을 수반하는 만성폐장애가 있는 경우'로 정하고, 배경인자 및 흉부X선 소견으로부터 이하의 표 1에 나타내는 바와 같이 I-VI의 병형으로 분류된다.

표 1. 신생아 만성폐질환의 질환분류기준

Ⅰ. 신생아의 호흡궁박증후군(RDS)이 선행되는 신생아 만성폐장애로, 생후 28일을 넘어 흉부X선 상 미만성 포말상 음영 혹은 불규칙 로프상 기종상 음영을 나타내는 것

Ⅱ. RDS가 선행되는 신생아 만성폐장애로, 생후 28일을 넘어 흉부X선상 미만성 불투양상을 나타내는 것, 포말상 음영 혹은 불규칙 로프상 기종상 음영에는 이르지 않은 것

Ⅲ. RDS가 선행되지 않은 신생아 만성폐장애로, 제대혈의 IgM 고가(高價), 융모막양막염, 제대염 등 출생 전 감염의 의심이 농후하며, 또한 생후 28일을 넘어 흉부X선상 미만성 포말상 음영 혹은 불규칙 로프상 기종상 음영을 나타내는 것

Ⅳ. RDS가 선행되지 않은 신생아 만성폐장애로, 출생 전 감염에 관하여는 불분명하나, 생후 28일을 넘어 흉부X선 상 미만성 포말상 음영 혹은 불규칙 로프상 기종상 음영을 나타내는 것

Ⅲ'. RDS가 선행되지 않은 신생아 만성폐장애로, 제대혈의 IgM 고가, 융모막양막염, 제대염 등 출생 전 감염의 의심이 농후하며, 또한 생후 28일을 넘어 흉부X선상 미만성 불투양상을 나타내는 것, 포말상 음영 혹은 불규칙 로프상 기종상 음영에는 이르지 않은 것

Ⅴ. RDS가 선행되지 않은 신생아 만성폐장애로, 생후 28일을 넘어 흉부X선상 미만성 불투양상을 나타내는 것, 포말상 음영 혹은 불규칙 로프상 기종상 음영에는 이르지 않은 것

Ⅵ. 상기 Ⅰ~Ⅴ 중 어느 것으로도 분류되지 않는 것

만성폐질환의 진단은, 상기 기준에 기재되는 것과 같이, 호흡궁박증후군에 있어서의 다호흡을 주로 한 증상과 흉부X선에 의하여 진단되는데, 다른 호흡기질환의 가능성을 부정한 후의 제외진단이 기본이 된다.

일반적으로, 신생아 만성폐질환은, 폐의 미숙성, 산소독성, 인공환기, 염증, 감염, 동맥관개존증 등이 위험인자로 알려져 있고, 폐포나 혈관계의 발달이 억제된 상태에서 기인한 질환으로 파악할 수 있는데, 본 발명의 적용질환으로서의 만성폐질환에는, 한정되지 않지만, 기관지폐이형성증(BPD), 윌슨·미키티 증후군(WMS), 신생아천연성폐고혈압증(PPHN), 신생아고혈압증 등도 포함시킬 수 있다. 한편, 기관지폐이형성증(BPD)은, 1967년에 Northway 등이 최초로 보고한 것으로, 일반적으로 구미에서는 만성폐질환의 별명으로 되어 있다.

신생아만성폐질환은, 조산아에 많은 질환으로, 생후 28일 또는 수정 36주를 넘어도 산소를 필요로 하는 호흡장애가 지속되는 질환이다. 만성폐질환의 병인으로서는, 상기에 기재된 바와 같지만, 특히 고산소요법(장기 고농도흡수산소, 고압의 인공호흡기관리 등)이나 염증을 기인으로 하는 것이 크다. 염증(감염)과의 연관에서는, 융모양막염, 제대염 등의 출생전 감염에 의하여 만성폐질환의 병인이 되고, 이들 또한 본 발명의 적용대상이 될 수 있다. 융모양막염은, 태아를 포함하는 양막에 염증이 파급되어, 태반염증이 일어난 감염증의 하나이다. 융모양막염이 일어나면, 태내에서 염증성물질이 높은 값이 되어, 그 때문에 기관지나 패포상피의 박리, 폐포구조의 재생에 필요한 물질의 저하를 초래하고, 만성폐장애를 발병한다고 생각되고 있다.

본 발명에 따르면, 상기 적용질환을 치료하기 위하여, 후술하는 세포제제 및 의약조성물을 대상으로 투여(이하, 총칭하여 '이식'으로 기술하는 경우가 있음)하고, 적용질환의 개선 및/또는 치료를 가능하게 한다. 여기에서, '개선'이란, 만성폐질환에 수반하는 각종 증상의 완화 및 진행의 억제를 의미하고, 바람직하게는 일상생활에 지장이 없을 정도로까지 증상을 완화하는 것을 의미한다. 또한, '치료'란, 만성폐질환에 수반되는 각종 증상을 억제하는 것 또는 완전히 소실시키는 것을 말한다.

2. 세포제제 및 의약조성물

(1) 다능성 간세포

본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 다능성 간세포는, 전형적으로는, 본 발명자들 중 한 사람인 데자와가 사람생체 내에 그 존재를 발견하고, 'Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring)세포'라고 명명한 세포이다. Muse 세포는, 골수액, 지방조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(published on Jan 17, 2014))이나 진피결합조직 등의 피부조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합조직에도 산재한다. 또한, 이러한 세포는, 다능성 간세포와 간엽계간세포의 양쪽의 성질을 가지는 세포이고, 예를 들어 각각의 세포표면마커인 'SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)'과 'CD105'의 더블양성으로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 이들의 항원마커를 지표로서 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 또한, Muse 세포는 스트레스 내성으로, 간엽계조직 또는 배양간엽계조직으로부터 다양한 스트레스 자극에 의하여 농축할 수 있다. 본 발명의 세포제제에는, 스트레스 자극에 의하여 Muse 세포가 농축된 세포획분을 이용할 수도 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법, 및 특징 등의 상세는, 국제공고공보 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Wakao 등(2011, 상술)에 의하여 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계게포를 배양하고, 그것을 Muse 세포의 모집단으로서 이용하는 경우, SSEA-3 양성 세포의 모두가 CD105 양성세포인 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 세포제제 및 의약조성물에 있어서, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계간세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우는, 단순히 SSEA-3을 항원마커로서 Muse 세포를 정제하여, 사용할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서는, 만성폐질환을 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물에 있어서 사용될 수 있는 SSEA-3을 항원마커로서, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계조직으로부터 분리된 다능성 간세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 단순히 'SSEA-3 양성세포'로 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, '비Muse 세포'란, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계조직에 포함되는 세포로서, 'SSEA-3 양성세포' 이외의 세포를 가리킨다.

간단하게는, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 세포표면마커인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하고, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체를 모두 이용하며, 생체조직(예를 들어, 간엽계조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기에서, '생체'란, 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는, 수정란이나 포배기보다 발생단계가 앞인 배아는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생단계의 배아는 포함된다. 포유동물에는, 한정되지 않지만, 사람, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 생체의 조직으로부터 직접 마커를 이용하여 분리되는 점에서, 배성간세포(ES세포)나 iPS 세포로 명확하게 구별된다. 또한, '간엽계조직'이란, 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수, 제대, 제대혈 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는, 골수나 피부, 지방조직으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리수단을 이용하여, 섬유아세포나 골수간엽계간세포 등의 배양간엽계세포로부터 Muse 세포를 분리하여도 좋다. 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는, 리시피엔트에 대하여 자가여도 좋고, 또는 타가여도 좋다.

상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 SSEA-3 양성, 및 SSEA-3과 CD105의 이중양성을 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있는데, 사람 성인 피부에는, 다양한 타입의 간세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 하지만, Muse 세포는, 이들 세포와 같지 않다. 이와 같은 간세포 및 전구세포에는 피부유래 전구세포(SKP), 신경제간세포(NCSC), 멜라노블라스트(MB), 혈관주위세포(PC), 내피전구세포(EP), 지방유래간세포(ADSC)를 들 수 있다. 이러한 세포에 고유 마커의 '비발현'을 지표로 하여, Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는, CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF인자(폰빌레브란트 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커), 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있으며, 더욱이 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 더욱이 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 이하:

(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐

으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성질을 가져도 좋다. 본 발명의 일 국면은, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 상기 성질을 모두 갖는다. 여기에서, 상기 (i)에 대하여, '텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음'이란, 예를 들어 TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 이용하여 텔로머레이스 활성을 검출한 경우에, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머레이스 활성이 '낮다'란, 예를 들어 체세포인 사람섬유아세포와 같은 정도의 텔로머레이스 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela세포에 비하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머레이스 활성을 가지고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 대하여, Muse 세포는, in vitro 및 in vivo에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계, 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지고, 예를 들어 in vitro에서 유도배양함으로써, 간세포, 신경세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, in vivo에서 정소로 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 더욱이, 정맥주사에 의하여 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주(遊走) 및 생착하여, 조직에 따른 세포로 분화하는 능력을 가진다. 상기 (iii)에 대하여, Muse 세포는, 부유배양에서는 증식속도 약 1.3일로 증식하는데, 부유배양에서는 1세포로부터 증식하고, 배양체양세포 덩어리를 만들어 14일간 정도에서 증식이 멈춘다,라고 하는 성질을 가지는데, 이들 배양체양세포 덩어리를 접착배양으로 가지고 가면, 다시 세포증식이 개시되어, 세포 덩어리로부터 증식한 세포가 확산되어 간다. 더욱이, 정소로 이식한 경우, 적어도 반년 동안은 암화하지 않는다는 성질을 가진다. 또한, 상기 (iv)에 대하여, Muse 세포는, 셀프리뉴얼(자기복제)능을 가진다. 여기에서, '셀프리뉴얼'이란, 1개의 Muse 세포로부터 부유배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체양세포 덩어리에 포함되는 세포로부터 3배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있는 동시에, 배양체양세포 덩어리의 세포를 다시 1세포로 부유배양으로 가지고 감으로써, 다음 세대의 배양체양세포 덩어리를 형성시키고, 거기에서 다시 3배엽성의 분화와 부유배양에서의 배양체양세포 덩어리를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 좋다.

또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포획분은, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계세포에 외적 스트레스 자극을 주고, 그 외적 스트레스에 내성인 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 이하의 성질의 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 가지는 SSEA-3 양성 및 CD105 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분이어도 좋다.

(i) SSEA-3 양성;

(ii) CD105 양성;

(iii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;

(iv) 삼배엽으로 분화하는 능력을 가짐;

(v) 종양성증식을 나타내지 않음; 및

(vi) 셀프리뉴얼능을 가짐.

상기 외적 스트레는, 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건 하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크로의 폭로 하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결처리, 유해물질 존재 하에서의 배양, 활성산소 존재 하에서의 배양, 기계적 자극 하에서의 배양, 진동처리 하에서의 배양, 압력처리 하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 것 또는 복수의 조합이어도 좋다. 예를 들어, 상기 프로테아제에 의한 처리시간은, 세포에 외적 스트레스를 주기 위하여 합계 0.5~36시간 행하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는, 배양용기에 접착한 세포를 벗길 때, 세포 덩어리를 단일세로포 각각으로 할 때, 또는 조직으로부터 단일세포를 회수할 때에 이용되는 농도라면 좋다. 프로테아제는, 세린프로테아제, 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루타민산 프로테아제 또는 N말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 더욱이, 상기 프로테아제가 트리프신, 콜라게나아제 또는 디스파아제인 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명의 세포제제에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 정맥투여 등에 의하여 생체에 투여 후, 만성폐질환의 폐조직에 생착하고, 그 후에 Muse 세포는, 그 조직을 구성하는 세포로 분화하며, 만성폐질환을 개선 및/또는 치료하는 것으로 생각된다.

(2) 세포제제 및 의약조성물의 조제 및 사용

본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 한정되지 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 생리식염수나 적절한 완충액(예를 들어, 인산완충생리식염수, HBSS)에 현탁시킴으로써 얻어진다. 이러한 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리한 Muse 세포수가 적은 경우에는, 투여 전에 세포를 배양하고, 소정의 세포농도가 얻어질 때까지 증식시켜도 좋다. 한편, 이미 보고되어 있는 바와 같이(국제공개공보 WO2011/007900호 팸플릿), Muse 세포는, 종양화하지 않으므로, 생체조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 상태로 포함되어 있어도 암화의 가능성이 낮아 안전하다. 또한, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상의 증식배지(예를 들어, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α-최소필수배지(α-MEM))에 있어서 행할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 국제공개공보 WO2011/007900호를 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물(예를 들어, 항생물질, 혈청) 등을 선택하고, 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 사람 대상으로 본 발명의 세포제제 또는 의약조성물을 투여하는 경우에는, 사람의 장골로부터 수 mL 정도의 골수액을 채취하고, 예를 들어 골수액으로부터의 접착세포로서 골수간엽계간세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포를 분리할 수 있는 세포량에 도달할 때까지 증가시킨 후, Muse 세포를 SSEA-3의 항원마커를 지표로서 분리하여서, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다. 또는, 예를 들어 Muse 세포를 SSEA-3의 항원마커를 지표로서 분리한 후, 유효한 치료량에 도달할 때까지 세포를 배양하여 증가시킨 후, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다.

또한, Muse 세포의 세포제제 및 의약조성물로의 사용에 있어서는, 그 세포를 보호하기 위하여 디메틸술폭시드(DMSO)나 혈청알부민 등을, 세균의 혼입 및 증식을 방지하기 위하여 항생물질 등을 세포제제 및 의약조성물에 함유시켜도 좋다. 더욱이, 제제 상 허용되는 다른 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)이나 간엽계간세포에 포함되는 Muse 세포 이외의 세포 또는 성분을 세포제제 및 의약조성물에 함유시켜도 좋다. 당업자는 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포제제 및 의약조성물에 첨가할 수 있다.

상기에서 조제되는 세포제제 및 의약조성물 내에 함유하는 Muse 세포수는, 만성폐질환의 개선 및/또는 치료에 있어서 원하는 효과(예를 들어, 사망률 저하, 인공호흡 관리일수 단축, 산소투여일수 단축)가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 사용하는 세포의 상태 등을 고려하여, 적절히 조정할 수 있다. 후술하는 실시예 2~7에 있어서, 고산소 부하에 따른 만성폐질환 모델 래트를 이용하여, Muse 세포 이식에 따른 각종 효과를 검토하였는데, 체중 약 5~15g의 모델 래트에 대하여는, SSEA-3 양성 세포를 1×10⁴세포/마리(1개체당)로 투여하는 것에 의하여, 매우 뛰어난 효과가 얻어졌다. 이러한 결과로부터 사람 신생아(생후 28일 이내), 영아(생후 1년 미만), 또는 유아(생후 1~6년)의 1개체당 약 3×10⁴세포/kg~약 3×10⁷세포/kg을 체중환산한 세포량을 투여함으로써 뛰어난 효과가 얻어지는 것이 기대된다. 예를 들어, 신생아 및 영아의 체중을 약 400~10,000g으로 한 경우, 투여량으로는 개략으로 약 1×10⁴세포/개체~약 3×10⁸세포/개체가 유효하다고 생각된다. 한편으로, 혈관으로의 세포투여에 따른 폐색을 방지하기 위하여, 1회 투여분량으로서, 예를 들어 SSEA-3 양성 세포를 3×10⁷세포/kg 이하로 세포제제에 함유시키면 좋다. 여기에서 개체는 래트, 사람을 포함하는데 이것으로 한정되지 않는다. 그리고, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 원하는 치료효과가 얻어질때까지 복수회(예를 들어, 2~10회), 적절히 간격(예를 들어, 1일 2회, 1일 1회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회)을 두고 투여되어도 좋다. 따라서, 대상의 상태에도 따르지만, 치료상 유효량으로서는, 예를 들어 1개체당 약 1×10⁴세포~약 3×10⁸세포로 1~10회 투여량이 바람직하다. 1개체에 있어서의 투여총량으로서는, 한정되지 않지만, 1×10⁴세포~3×10⁹세포, 1×10⁴세포~1×10⁹세포, 1×10⁴세포~5×10⁸세포, 1×10⁴세포~3×10⁸세포, 1×10⁴세포~1×10⁸세포, 1×10⁴세포~5×10⁷세포, 1×10⁴세포~3×10⁷세포, 1×10⁴세포~1×10⁷세포, 1×10⁴세포~5×10⁶세포, 1×10⁴세포~3×10⁶세포, 1×10⁴세포~1×10⁶세포, 1×10⁴세포~5×10⁵세포, 1×10⁴세포~3×10⁵세포, 1×10⁴세포~1×10⁵세포, 1×10⁵세포~3×10⁹세포, 1×10⁵세포~1×10⁹세포, 1×10⁵세포~5×10⁸세포, 1×10⁵세포~3×10⁸세포, 1×10⁵세포~1×10⁸세포, 1×10⁵세포~5×10⁷세포, 1×10⁵세포~3×10⁷세포, 1×10⁵세포~1×10⁷세포, 1×10⁵세포~5×10⁶세포, 1×10⁵세포~3×10⁶세포, 1×10⁵세포~1×10⁶세포, 1×10⁶세포~3×10⁹세포, 1×10⁶세포~1×10⁹세포, 1×10⁶세포~5×10⁸세포, 1×10⁶세포~3×10⁸세포, 1×10⁶세포~1×10⁸세포, 1×10⁶세포~5×10⁷세포, 1×10⁶세포~3×10⁷세포, 1×10⁶세포~1×10⁷세포, 1×10⁷세포~3×10⁹세포, 1×10⁷세포~1×10⁹세포, 1×10⁷세포~5×10⁸세포, 1×10⁷세포~3×10⁸세포, 1×10⁷세포~1×10⁸세포, 1×10⁵세포~3×10⁸세포, 1×10⁵세포~1×10⁸세포, 1×10⁵세포~5×10⁷세포, 1×10⁵세포~3×10⁷세포, 1×10⁵세포~1×10⁷세포, 1×10⁵세포~5×10⁶세포, 1×10⁵세포~3×10⁶세포, 1×10⁵세포~1×10⁶세포, 5×10⁵세포~3×10⁸세포, 5×10⁵세포~1×10⁸세포, 5×10⁵세포~5×10⁷세포, 5×10⁵세포~3×10⁷세포, 5×10⁵세포~1×10⁷세포, 5×10⁵세포~5×10⁶세포, 5×10⁵세포~1×10⁶세포, 1×10⁶세포~1×10⁸세포, 1×10⁶세포~5×10⁷세포, 1×10⁶세포~1×10⁷세포, 1×10⁶세포~5×10⁶세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 만성폐질환을 개선 및 치료대상으로 하는데, 투여기간으로는, 출생 후의 소아과적인 소견, 흉부뢴트겐 사진이나 CT 등에 의하여 만성폐질환으로 진단된 후로, 진단 직후에서 수개월 이내여도 좋다. 또는, 생후 조기여도 호흡상태가 나쁘고, 만성폐질환이 될 가능성이 높다고 판단되었을 때(예를 들어, 생후 1주째)여도 좋다. 한편, 본 발명에 따르면, 그 세포제제 등은, 상처를 입은 직후에 투여되는 것이 바람직한데, 상처를 입은 후의 늦은 시기, 예를 들어 상처를 입고나서 1주간 후, 1개월 후, 3개월 후, 6개월 후, 12개월 후여도 본 발명의 세포제제 등의 효과를 기대할 수 있다. 또한, 사용되는 Muse 세포는, 타가 유래의 경우라도 면역응답을 야기하지 않는 것이 본 발명자들의 실험으로 확인되어 있으므로, 만성폐질환의 개선 및 치료에 있어서 원하는 효과가 얻어질 때까지 적절히 투여하면 된다. 한편, 후술하는 실시예 2~7에 있어서 나타나는 바와 같이, 만성폐질환 모델 래트를 이용한 Muse 세포에 의한 그 질환의 개선에 대하여 폐조직평가 및 심장평가를 하면, 단기(생후 15일) 치료효과보다 장기(생후 29일) 치료효과가 현저한 경향이 있다.

3. 만성폐질환 모델 래트의 제작

본 명세서에 있어서는, 본 발명의 세포제제에 의한 만성폐질환의 개선 및 치료효과를 검토하기 위하여 만성폐질환 모델 래트를 구축하고, 사용할 수 있다. 그 모델로서 사용되는 래트에는, 한정되지 않지만, 일반적으로 Wistar/ST계 래트, Spraugue Dawley(SD)계 래트를 들 수 있다. 만성폐질환 모델 래트를 제작하는 방법은 공지이며, 예를 들어 Lu,A.등(Pediatr. Res., 77, 784-792(2015))의 방법에 따라서 만성폐질환 모델 래트를 제작할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의하여 제작된 모델 래트가, 만성폐질환을 가지는지 아닌지를 폐조직의 평가에 의하여 확인할 수 있다.

본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 질환부위에 집적하는 성질을 가진다. 따라서, 세포제제 또는 의약조성물의 투여에 있어서, 그들의 투여부위(예를 들어, 복강내, 근내, 질환부위), 투여되는 혈관의 종류(정맥 및 동맥) 등은 한정되지 않는다. 또한, 투여되는 Muse 세포가 질환부위에 도달하여, 생착한 것을 확인하는 방법으로는, 예를 들어 미리 형광단백질(예를 들어, 녹색형광단백질(GFP))을 발현하도록 유전자 도입된 Muse 세포를 제작하고, 생체에 투여 후, 형광을 검출할 수 있는 방법(예를 들어, 면역조직염색)에 의하여 관찰하여, Muse 세포의 동태를 확인할 수 있다. 한편, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는 사람 유래이므로, 래트와는 이종(異種)의 관계에 있다. 모델 동물에 있어서 이종의 세포 등이 투여되는 실험에서는, 이종세포의 생체 내에서 거절반응을 억제하기 위하여, 이종세포의 투여 전 또는 동시에 면역억제제(시클로스포린 등)가 투여되어도 좋다.

4. 만성폐질환 모델 래트에 있어서의 Muse 세포에 의한 개선 및 치료효과

본 발명의 실시형태에서는, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 사람을 포함하는 포유동물에 있어서의 만성폐질환 및 그에 따르는 각종 증상을 개선 및/또는 치료할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기에서 제작한 만성폐질환 모델 래트를 이용하여, 실험적으로 만성폐질환의 래트에 있어서의 Muse 세포에 의한 증상의 개선 등을 검토하고, 그 Muse 세포의 효과를 평가할 수 있다. 평가방법으로서는, 래트를 이용한 폐기능을 평가하는 일반적인 측정계를 이용하여 할 수 있으며, 예를 들어 FinePointe(상표)-호흡·폐기능 평가 시스템 Noninvasive Airway Mechanics(NAM) 등의 래트의 호흡 및 폐기능 평가 시스템을 이용할 수 있다. 또한, 모델 래트로부터 취출한 폐조직에 대하여, 예를 들어 폐포벽의 측정(폐포간강의 확대), 염증성 사이토카인 등의 mRNA 발현량의 측정, 또는 만성폐질환과 관련지어지는 우실심근평가, 폐혈관평가를 행함으로써 평가할 수 있다.

(1) 폐조직의 평가

본 발명에 따르면, 폐조직의 평가의 하나로서, 조직체적밀도(Tissue Volume Density)를 측정함으로써, 만성폐질환의 치료개선효과를 평가할 수 있다. 간단하게는, 피험대상으로부터 취출한 폐조직을 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀 블록 절편을 작성한 후, 헤마톡실린·에오신으로 염색한다. 현미경 하에서 소정 수의 그리드 중 폐조직의 비율을 카운트하고, 폐조직의 병변을 평가할 수 있다(후술하는 실시예 4를 참조). 폐조직에 손상이 있으면, 폐포강률이 높아진다.

다른 실시형태에서는, 폐조직에 있어서 발현한 염증성 사이토카인의 발현량을 측정함으로써, 만성폐질환에 대한 본 발명의 세포제제 또는 의약조성물의 유효성을 평가할 수 있다. 일반적으로, 염증성 사이토카인에는, IL-1α, IL-1β, IL-6, CCL2(MCP-1), TNF-α, TGF-β, VEGF 등이 예시된다. 조직 내에 발현한 염증성 사이토카인의 발현량을 통상법에 의하여, 예를 들어 RT-PCR을 이용하여 측정할 수 있다. 후술하는 실시예 5에 기재되는 바와 같이, Muse 세포를 투여한 그룹에서는, 비히클을 투여한 대조 그룹과 비교하여, 염증성 사이토카인의 발현량을 현저하게 저하시킬 수 있어, Muse 세포는 만성폐질환의 치료에 기대될 수 있다.

(2) 심장평가(폐고혈압평가)

고산소부하에 기인한 만성폐질환에서는, 적용되는 고산소농도에 의하여, 폐혈관의 비후가 발생하여, 이에 따라 심장의 비후가 확인된다. 신생아의 만성폐질환에서는, (중증이 될 정도) 2차적인 폐고혈압증을 합병한다. 이러한 2차적인 폐고혈압증도 생명 예후를 결정하는 중요한 요인이다. 지속적인 폐고혈압은, 우심부하에 따른 우심실벽 비후로 이어지므로, 심장(심근)의 평가를 이용하여 폐고혈압을 평가할 수 있다. 후술하는 실시예 6에 나타나는 바와 같이, 만성폐질환 모델 래트에 있어서도 우심부하에 따르는 것으로 생각되는 우실벽 비후가 관찰되며, 이러한 비후를 Muse 세포의 투여에 의하여 저감시킬 수 있다.

(3) 폐포세정액 내의 염증성 세포수의 측정

만성폐질환에 있어서는, 염증성 세포수의 증가가 관찰되는데, 각종 처치에 의한 만성폐질환의 치료효과를 폐포로부터의 세정액 내의 염증성 세포수를 측정함으로써 평가할 수 있다. 후술하는 실시예 7에 나타나는 바와 같이, Muse 세포는, 만성폐질환 모델 래트에 있어서의 염증성 세포수를 유의하게 감소시킬 수 있다.

이하의 실시예에 의하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것이 전혀 아니다.

실시예

실시예 1: Muse 세포 의 조제

사람 Muse 세포의 분리 및 동정에 관한 국제공개공보 WO2011/007900호에 기재된 방법에 준거하여 Muse 세포를 얻었다.

실시예 2: 만성폐질환 모델 래트의 제작과 Muse 세포 의 투여

본 연구에 사용된 실험동물에 관한 프로토콜은, 나고야대학 의약부 동물실험 위원회에 의하여 승인된 것이다. 임신 SD 래트를 일본에스엘씨 주식회사(일본, 시즈오카현)로부터 입수하였다. 출생 후 바로(24시간 이내)부터 어미 래트와 새끼 래트는 실험기간 중에 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하고, 고산소 부하가 걸리는 케이지(산소 컨트롤러와 센서 어댑터를 구비한 애니멀 챔버) 내에서, 12시간 명암 사이클 하에서 사육되었다. 동물실과 케이지 내를 항상 23℃로 유지하였다. 어미 래트 또한 고산소화에서 상처를 받기 때문에, 대리모 래트를 2일마다 교체하였다.

생후 5일에서 상기 만성폐질환 모델 래트에 이소푸루란 흡입에 의하여 마취를 실시하고, 처치 그룹에 대하여는, Muse 세포(1×10⁴세포/개체)를 우외경정맥으로부터 투여하였다(처치 그룹). 대조 그룹에서는, Muse 세포 대신에, 같은 체적의 HBSS만이 투여되었다. Muse 세포 및 HBSS가 모두 제공되지 않고, 또한 고산소부하가 없는 래트를 샴그룹으로 하였다. 이하의 실험에서는, 생후 15일과 생후 29일의 래트를 각각 단기그룹 및 장기그룹으로 하고, 각종 평가에 이용하였다. 한편, 단기평가를 행하는 생후 15일까지, 래트는 고산소농도(80%)에 폭로되고, 그 후에 장기평가를 행하는 생후 29일까지 통상의 산소농도(21%)에 폭로되었다.

실시예 3: 폐조직에 있어서의 Muse 세포 의 생착 확인

이식에 사용된 Muse 세포가, 폐조직에 생착한 것을 확인하는 실험을 행하였다. 우선, 녹색형광 단백질(GFP)을 발현하고, Muse 세포가 이에 의하여 표식되도록, 미리 렌티바이러스-GFP 유전자를 Muse 세포에 도입하였다. GFP로 표식된 Muse 세포를 GFP와 SSEA-3의 이중 양성세포로 하여 FACS로 분리하였다. 그 후, 실시예 2에 기재된 바와 같이, Muse 세포를 투여하였다.

다음으로, Muse 세포가 투여된 생후 15일의 래트(고산소부하 후 14일)의 폐에 있어서, 이하와 같이 Muse 세포가 폐조직에 생착한 것을 확인하였다. 래트를 안락사시킨 후, 폐를 절제하여 통상법에 따라서 폐조직의 절편을 제작하였다. 동결절편을 제작하고, HistoVT one(나카라이테스크 주식회사)으로 항원부활을 행하였다. 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 당나귀 혈청으로 블로킹한 후, 항GFP 항체로 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 이어서, 적절한 2차 항체로 더욱 인큐베이션하였다. 그후, DNA를 염색하는 DAPI를 포함한 밀봉제로 밀봉하였다. 이러한 결과로부터 래트의 우외경정맥으로부터 이식된 Muse 세포는, 폐장애를 받은 폐조직에 생착한 것이 나타났다(도 1).

실시예 4: 폐조직평가

만성폐질환 모델 래트의 폐조직의 평가를 이하와 같이 행하였다. 상기 단기그룹과 장기그룹의 모델 래트를 안락사시키고, 우심실로부터 생리식염수를 주입하여 폐혈관을 관류한 후, 기관카테터를 통하여 4% 파라포름알데히드 수용액으로 폐를 팽창시켰다(20cm H₂O, 20분간). 폐를 적출하고, 4% 파라포름알데히드 용액 내에서 18~24시간(4℃) 고정한 후, 각 폐엽으로 잘라 나누었다. 나뉘어진 폐엽을 에탄올 수용액, 크실렌으로 탈수하고, 파라핀 포리(包理) 후, 폐엽을 두께 5㎛의 절편으로 하고, 헤마톡실린-에오신 염색(HE염색)하여 표본을 제작하였다. 도립현미경(올림푸스사 제품, 품번 IX83)을 사용하고, 현미경 소프트웨어(Stereo Investigator) 상에서 100의 그리드(×3곳×6절편)를 두고, 각각의 그리드 밑이 공간 또는 폐조직 중 어느 것인지를 평가하였다. 100(합계 1,800)의 그리드 중 몇%가 폐조직인지를 평가하였다. 통상적으로, 정상적인 폐조직에서는 40% 정도를 차지하고, 폐조직의 손상에 따라서 폐포강이 커진다. 도 2에 나타나는 바와 같이, 단기그룹(생후 15일) 래트에 있어서, Muse 세포가 투여된 처치 그룹(Muse 그룹) 및 HBSS가 투여된 처치 그룹(비히클 그룹)은, 정상상태의 샴그룹과 비교하여 같은 정도였는데, 장기그룹(생후 29일)의 래트에서는, 비히클 그룹과 비교하여 Muse 그룹에서는 유의한 효과를 나타내고, 정상상태에 가깝게 나아진 것이 나타났다.

상기와 마찬가지로, 새롭게 Muse 세포를 투여한 그룹, 비히클 그룹, 샴 그룹 이외에, 비Muse 세포를 투여한 그룹을 더하여, 단기그룹 및 장기그룹의 래트에 있어서 폐조직을 재평가하였다(도 3). 단기그룹에 있어서, 비Muse 세포가 투여된 처치 그룹(비Muse 그룹)은, 비히클 그룹과 같은 정도로 폐조직의 손상의 경감효과는 관찰되지 않았는데, Muse 세포가 투여된 그룹(Muse 그룹)에서는, 이전 결과(도 2)와 마찬가지로, Muse 세포에 따른 폐조직의 손상의 현저한 경감효과가 관찰되었다. 한편, 장기그룹에 있어서는, 비Muse 그룹에서는, 비히클 그룹과 비교하여, 폐조직의 손상의 경감효과는 관찰되었는데, 그 효과는, Muse 그룹과 비교할 때 작았다. Muse 세포가 투여된 래트에서는, 폐조직의 손상이 이전 결과와 마찬가지로 정상상태에 가깝게 나아진 것이 나타났다.

더욱이, 생후 29일의 래트에 있어서, 폐포벽 비율을 계측함으로써 폐조직을 평가하였다. 제작한 표본을 현미경용 디지털 카메라(올림푸스사 제품, 품번 DP73)로 촬영하였다. 촬영화상 이미징 소프트웨어(올림푸스사 제품, 상품명 cellSens)를 이용하여 해석하였다. 표본절편 전체의 면적으로부터 기관, 혈관 및 장애부위의 면적을 제외하고 폐포의 면적으로 하여서, 그 중 폐포벽이 차지하는 면적의 비율(폐포벽비율)을 하기 식에 의하여 산출하였다.

폐포벽비율(%)=폐포벽면적÷{폐표본 전체면적-(기관부위면적+혈관부위면적+장애부위면적)}×100

이러한 폐포벽 비율이 높을수록 폐포벽이 기밀하게 형성되어 폐조직이 수복되어 있는 것을 나타낸다. 결과를 도 4에 나타낸다. 샴 그룹에서는, 폐포벽 비율은 약 22~23%이고, 만성폐질환 모델 래트에 Muse 세포를 투여한 그룹에서는, 파괴된 폐포벽이 21% 전후까지 회복되었다. 또한, 비Muse 세포 그룹에 있어서도 회복 효과가 보였는데, Muse 세포 그룹 정도까지는 이르지 않았다. 이와 같이, 상기 폐조직평가로부터 폐 Muse 세포 그룹에서는 유의한 효과를 나타내고, 정상상태에 가깝게 나아지는 것이 나타났다.

실시예 5: 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 측정

만성폐질환에서는, 폐조직에 있어서 각종 염증성 사이토카인의 발현이 증대되는데, Muse 세포의 이식에 의하여 이들의 발현량을 저감시킬 수 있는지를 검토하였다. 생후 15일의 래트로부터 폐조직을 채취하고, 통상법에 따라서 총RNA를 추출한 후, 염증성 사이토카인인 CCL2 및 VEGF의 mRNA 발현량을 처치 그룹과 비히클 그룹에서 비교하였다. 구체적인 수법으로는, 폐조직을 빠르게 취출한 용기에 TRI 시약을 첨가하고, Dounce 호모지나이저, 21G 바늘 장착 실린더로 호모지나이징하였다. 클로로포름을 첨가한 후, 원심분리하여, RNA를 포함하는 수분층을 얻었다. 이소프로판올로 RNA를 침전시키고, 지적농도로 용해시킨 RNA를 SuperScript(등록상표) VILO(상표) cDNA Synthesis Kit로 cDNA를 합성하였다. 그 후, SYBR Green을 이용하여, 실시간 정량 RT-PCR을 행하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. 세로축은 샴 그룹의 발현량을 1로 하였을 때의 각 사이토카인의 mRNA의 상대적인 발현량을 나타낸다. Muse 세포를 투여한 처치 그룹(Muse 그룹)은, HBSS가 투여된 처치 그룹(비히클 그룹)과 비교하여, 어떤 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량을 유의하게 저하시킬 수 있었다.

실시예 6 : 심장평가(폐고혈압평가)

Muse 세포에 의한 만성폐질환의 치료효과로서, 래트의 심장을 이용한 평가를 행하였다. 상기 단기그룹 및 장기그룹의 모델 래트로부터 심장을 취출하고, 우실벽(RV)과 중격+좌실벽(IVS+LV)의 2가지로 분리한 후, 충분(60℃, 48시간)하게 건조기에서 건조시키고, 각각의 중량을 측정하였다. 지속적인 폐고혈압이 있으면 우실벽이 비후(=무거워짐)된다. 도 6의 샴 그룹은 정상값인데, 만성폐질환(비히클 그룹)이 되면, 0.4 정도까지 상승하였다. 이것은, 우실이 비후한 것을 나타낸다. 이에 대하여, Muse 세포를 투여한 그룹(Muse 그룹)에서는, 거의 정상화하는 것을 알 수 있었다.

상기와 마찬가지로, 새롭게 Muse 세포를 투여한 그룹, 비히클 그룹, 샴 그룹 이외에, 비Muse 세포를 투여한 그룹을 더하여, 단기그룹 및 장기그룹의 래트에 있어서 폐고혈압의 개선효과에 대하여 재평가하였다(도 7). 단기그룹 및 장기그룹의 양쪽에 있어서, 비Muse 세포가 투여된 처치 그룹(비Muse 그룹)은, 비히클 그룹과 같은 정도로 폐고혈압의 경감효과는 관찰되지 않았다. 한편, Muse 세포가 투여된 그룹(Muse그룹)에서는, 이전 결과(도 6)와 마찬가지로, Muse 세포에 의한 폐고혈압의 현저한 경감효과가 관찰되었다.

이어서, 고산소부하에 의하여 손상된 폐조직의 수복에 대하여, 조직학적으로 평가를 행하였다. 최초로, 폐동맥의 혈관벽을 항α-SMA(α-평활근 악틴)항체에 의하여 조직학적으로 염색하고, 각종 투여그룹에 대하여 폐동맥혈관벽의 비후의 경감효과를 내벽률의 변화를 지표로 하여 평가하였다. 동시에, 만성폐질환에 따라서 항진되는 폐동맥세포의 신생이, Muse 세포의 투여에 의하여 억제되는지 아닌지에 대하여, 세포주기 관련 핵단백질인 Ki-67을 세포증식 마커로서 검토하였다. 상기 실시예와 마찬가지로 파라핀 절편을 제작하고, 그 후, 구연산 버퍼로 항원부활을 행하였다. 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 당나귀 혈청으로 블로킹한 후, 항α-SMA항체, 및 항Ki-67항체로 4℃에서 하룻밤 인큐베이션을 하였다. 적절한 2차 항체로 더욱 인큐베이션한 후, DNA를 염색하는 DAPI를 포함한 밀봉제로 밀봉하였다.

폐동맥혈관의 단면에 있어서의 조직염색의 결과를 도 8의 (a)에 나타낸다. 이들 화상에 근거하여, 각 그룹의 내벽률을 이하의 식:

내벽률(%)={(혈관외경-혈관내경)/혈관외경}×100

에 따라서 산출하고, 결과를 도 8의 (b)에 나타낸다. 이러한 도면에 나타나는 바와 같이, 단기그룹 및 장기그룹은 모두 유사한 결과이고, Muse 세포 그룹에서는, 폐고혈압에 기인하는 폐동맥혈관벽의 비후를 현저하게 억제할 수 있었다. 또한, 비Muse 세포 그룹에 있어서도 억제효과는 관찰되었는데, Muse 세포 그룹과 비교하여 그 결과는 작았다.

증식 중인 폐동맥세포의 핵을 항Ki-67항체에 의하여 조직학적으로 염색하고, 폐동맥세포의 신생률에 대하여 평가하였다. 도 9의 (a)에서는, 항α-SMA항체, 항Ki-67항체, 및 DAPI에 의한 삼중염색을 행한 결과를 나타낸다. 도면에 나타난 폐동맥 표본은, 비Muse 세포를 투여한 그룹의 것이고, 항Ki-67항체에 의하여 염색된 증식 중인 폐동맥세포가 관찰되었다.

다음으로, 이와 같은 삼중염색을 각 그룹에 대하여 행하고, DAPI에 의하여 핵염색된 폐동맥세포 중 Ki-67 양성인 세포의 비율을 산출하였다(도 9의 (b)). 단기그룹에서는, Muse 세포 그룹에 있어서 폐동맥세포의 신생은, 비히클 그룹 및 비Muse 그룹과 비교하여, Ki-67 양성세포의 비율이 감소되어 있었다. 또한, 장기그룹에서는, Muse 세포 그룹은, 샴 그룹과 같은 정도까지 Ki-67 양성 세포의 비율이 감소하고, 단기그룹보다 그 효과는 현저하였다. 이상의 폐고혈압평가로부터 Muse 세포는 만성폐질환의 치료에 있어서 유의한 효과를 나타내는 것이 나타났다.

실시예 7: 폐포세정액 내의 염증성 세포수의 측정

만성폐질환에 있어서는, 염증성 세포수의 증가가 관찰되는데, Muse 세포의 투여에 의하여, 이들 세포수가 감소하는지 아닌지를 검토하였다. 단기그룹의 래트를 안락사시킨 후, 폐동맥으로부터 혈관을 생리식염수로 관류하고, 삽관되어 있는 기관카눌라로부터 생리식염수 0.4ml(0.2ml×2회)를 주입하고, 폐포세정(BAL)을 행하여, BAL액(BALF)을 회수하였다. BALF 내의 백혈구, 대식세포(macrophage), 호중구, 및 림프구의 수를 이하의 수법에 의하여 계측하였다. 구체적으로는, 기관지폐포세정액 10μL에 Turk용액 20μL를 첨가하여 염색하고, Burker-Turk 혈구계산반을 이용하여 총세포수를 측정하였다. 이어서, Cytospin4(등록상표)를 사용하여, 기관지폐포세정액 100μL의 도말표본을 제작하고, 제작한 도말표본을 May-Giemsa 염색으로 염색하였다. 현미경 하에, 1표본당 적어도 200개의 세포를 카운트하여 백혈구 획분을 측정하고, 대식세포수, 호중구수, 및 림프구수를 산출하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. 만성폐질환에 따라서 증가한 각종 염증성세포의 수가, Muse 세포의 투여에 의하여 경감되었다. 이러한 결과로부터, Muse 세포는, 만성폐질환의 치료에 있어서 유의한 결과를 나타내는 것이 나타났다.

본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 신생아 만성폐질환의 개선 및 치료에 응용할 수 있다.

본 명세서에 인용하는 모든 간행물 및 특허문헌은, 참조에 의하여 전체적으로 본 명세서 내에 원용된다. 한편, 예시를 목적으로 하여, 본 발명의 특정 실시형태를 본 명세서에서 설명하였는데, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 변경 가능한 것은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.

Claims

생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는 만성폐질환을 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제.
제 1 항에 있어서,
외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분을 포함하는 세포제제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD105 양성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성 및 CD271 음성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 세포제제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가, 이하의 성질을 모두 가지는 다능성 간세포인 세포제제:
(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
만성폐질환이 기관지폐이형성증(BPD), 윌슨·미키티 증후군(WMS), 신생아천연(遷延)성폐고혈압증(PPHN), 및 신생아고혈압증으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 세포제제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 폐조직에 생착하는 능력을 가지는 세포제제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
사람신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서 약 1×10⁴세포/개체~약 3×10⁸세포/개체로 투여하는 세포제제.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
사람신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서, 그 대상 1개체당 약 3×10⁴세포/kg~약 3×10⁷세포/kg을 체중 환산한 세포량을 투여하는 세포제제.