[go: up one dir, main page]

KR20190016966A - 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체 - Google Patents

길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20190016966A
KR20190016966A KR1020187036235A KR20187036235A KR20190016966A KR 20190016966 A KR20190016966 A KR 20190016966A KR 1020187036235 A KR1020187036235 A KR 1020187036235A KR 20187036235 A KR20187036235 A KR 20187036235A KR 20190016966 A KR20190016966 A KR 20190016966A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
amino acid
antibody
antigen
cdr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020187036235A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102410778B1 (ko
Inventor
데니스 엘. 파우스트맨
Original Assignee
더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 filed Critical 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority to KR1020227020235A priority Critical patent/KR20220088515A/ko
Publication of KR20190016966A publication Critical patent/KR20190016966A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102410778B1 publication Critical patent/KR102410778B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001117—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR] or CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y02A50/486—
    • Y02A50/488—

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 항체 및 이의 항원-결합 단편, 그리고 조절 T 세포 (T-조절)의 증식을 저해하고 및/또는 T 작동자 세포 집단 또는 기능을 확대하기 위한 이러한 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 길항 TNFR2 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 종양 반응성 T-림프구의 T-조절-매개된 탈활성화를 억제하기 위해, 뿐만 아니라 널리 다양한 암 및 감염 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체
발명의 분야
본 발명은 종양 괴사 인자 수용체 2를 길항할 수 있는 폴리펩타이드, 가령, 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는, 가령, 세포 증식 장애 및 감염 질환들의 치료를 위한 면역요법 분야에서 조절 T 세포의 활성을 조절하기 위해, 뿐만 아니라 T 작동자 세포의 활성을 상향조절하기 위해 그리고 표면 종양유전자를 직접적으로 조절하기 위해 사용될 수 있다.
발명의 배경
자연-발생 및 유전자 조작된 T-림프구의 사용은 다양한 인간의 병리학을 개선시키기 위한 중요한 패러다임이다. 예를 들어, 암 치료를 위한 전형적인 치료 플랫폼은 종양 질량의 외과수술 제거, 방사능 요법, 및 화학요법제의 투여 (Shewach, Chem. Rev., 109:2859-2861, 2009)를 포함하고, 지난 십년간 암 치료 요법에 대한 입양 면역요법 적용의 재출현이 목격되었다. 키메라 항원 수용체 (CAR-T) 요법의 출현으로, 환자에게 자가유래 및 동종이계 종양-반응성 T 세포를 주입하기 위한 새로운 방법들이 부상하였다 (June, J. Clin. Invest., 117:1466-1476, 2007). CAR-T 요법은 적응 면역 반응의 자원을 이용하여 암 세포 세포독성을 촉진시키고 종양 물질을 박멸한다. 입양 면역요법에서의 공통 모티프는 뚜렷한 종양 항원을 보여주는 세포들에서 세포독성을 선택적으로 강화시키는 능력을 나타내는 T 세포의 사용이다. 이러한 기술의 예들에는 종양-침윤 림프구 (Dudley 외, J. Immunother., 26:332-342, 2003), 뿐만 아니라 종양-특이적 항원과 반응성을 나타내도록 유전자적으로 재-조작되어 있는 자가유래 또는 동종이계 T 세포 (Yee 외, PNAS., 99:16168-16173, 2002)의 투여가 포함된다.
T-림프구-계 암 면역요법의 장래성에도 불구하고, 이러한 치료 플랫폼의 개발은 자기 세포들에 대하여 축적되는 면역 공격을 억제하는 면역 시스템의 자연적인 성향에 의해 저해되어 왔다. 모든 유핵 인간 세포들과 유사하게 암 세포는 외부 세포들과 이러한 세포들을 구별하게 하는 제I형 주조직 적합성 복합체 (MHC) 단백질들을 발현시킨다. 세포 살해를 방지하기 위하여, "자기" MHC 항원들에 대한 반응성을 나타내는 T 세포의 활성을 억제하는 조절 T 세포 (T-조절 세포)가 발달되었다. T-조절 세포는 자신의 독특한 표면 단백질 제시에 기초하여 구별될 수 있는 이종의 T 세포 클래스를 나타낸다. 가장 잘-밝혀진 T-조절 세포의 집단은 CD4+, CD25+, FoxP3+ T-조절 세포 및 CD17+ T-조절 세포를 포함한다. 이들 세포들이 자가반응성 T 세포의 억제를 매개하는 정확한 메커니즘은 지금도 연구 중인 주제이지만, 특정 클래스의 T-조절 세포는 표적 T 세포에서 증식을 유도하는 사이토카인 IL-2의 생성을 억제하고 IL-2에 대한 CD25 (IL-2 수용체의 하위도메인)의 친화도로 인해 IL-2를 자가반응성 세포들로부터 추가적으로 격리할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Josefowicz 외, Ann. Rev. Immun., 30:531-564, 2012).
비록 T-조절 세포가 말초 관용을 유지함에 중요한 역할을 한다 하더라도, 자가반응성 T 세포 활성을 조절하는 이러한 세포들의 능력의 기저를 이루는 동일한 생화학적 특징들 또한 종양-반응성 T 림프구의 활성을 억제함으로써 입양 면역요법 및 자연 면역 반응을 약화시키는 기능을 한다. T-조절 세포 활성의 화학적 조절인자의 개발은 많은 약리학적 연구의 주제였는데, 이는 T-조절-매개된 T 세포 억제를 저해할 수 있는 제제에 대한 접근이 입양 암 면역요법의 범위 및 효능을 대단히 개선시킬 뿐만 아니라 감염 질환을 일으키는 병원성 유기체를 근절시키는 면역 시스템의 능력을 개선시킬 수 있기 때문이다.
종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 아형 1 및 2는 T-조절 세포표면에서 세포 사멸을 지시하는 신호 전달 분자들인 것으로 확인된 바 있다. TNFR1의 활성화는, 예를 들어, 카스파제 신호전달 연쇄반응을 증대시키고 T-조절 세포자멸을 종결시키는 반면, TNFR2의 활성화는 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 신호전달 경로를 통한 신호전달을 유도하며, 이러한 신호전달 경로는 세포자멸로부터의 이탈 및 세포 증식을 촉진시키는 유전자들의 TRAF2/3 및 NFκB-매개된 전사를 통한 신호전달을 조정한다. 세포 생존 및 성장을 유도하는 역할로 인해, TNFR2는 종양-반응성 T 림프구의 면역 검출을 방지하는 매력적인 표적이 된다. 이에 따라, 세포 증식 이상, 가령, 암, 그리고 광범위한 감염 질환을 표적으로 하는 치료에서 사용하기 위하여, T-조절 세포 생존 및 증식을 방해할 수 있는 치료요법이 현재 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 길항 종양 괴사 인자 수용체 2 (TNFR2) 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편를 제공한다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 KCRPG 서열 (서열 번호: 19)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 인간 TNFR2 내 에피토프 또는 비-인간 영장류 (예컨대, 본 출원에 기재된 들소 또는 소)의 TNFR2 내의 균등한 에피토프에 특이적으로 결합하며 인간 TNFR2내의 KCSPG 모티프 (서열 번호: 12)의 잔기들 또는 비-인간 영장류의 TNFR2 내 균등한 에피토프에는 특이적으로 결합하지 않는다. 본 출원에 기재된 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 암 및 감염 질환을 비롯한 다양한 질환들의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 T-조절 세포의 증식을 저해, 및/또는 이의 사멸을 촉진시키는 능력을 나타내기 때문에 이에 따라 기재된다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 TNFR2- 및 종양유전자를 발현시키는 암 세포들의 증식을 저해, 및/또는 이의 사멸을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 T 작동자 세포, 가령, 세포독성 CD8+ T 세포의 상호 확대를 가능하게 할 수 있다. 이는, 예를 들어, T-조절 세포증식 및 활성의 약화로 인해 발생할 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 직접적으로 확대시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 TNFR2 폴리펩타이드를 길항제로서 지정하는 것은 T-조절 및 TNFR2-발현 암 세포들의 증식 및 활성을 약화시키는 이들의 능력을 의미하며, 명확하게는, T 작동자 세포 반응의 길항작용을 나타내는 것이 아니다.
본 출원은 TNFR2 항체로부터 유래한 상보성 결정 영역-중쇄 1 (CDR-H1) 및 CDR-H2 및 아미노산 서열 JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5, JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2, JRJDGJSJY(J)2FDJ (서열 번호: 278), JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279), QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5 (서열 번호: 265), 또는 AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266)를 가지는 CDR-H3를 내포하는, 인간 TNFR2에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 개시하며, 이 때
각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
각 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산, 가령, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고;
각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산, 가령, 아스파트산 및 글루탐산이고;
각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산, 가령, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 및 글루타민이고;
각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산, 가령, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 및 메싸이오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 및 타이로신이다. 폴리펩타이드 화학식과 관련하여 본 출원에서 사용되는 아래 첨자의 숫자는 해당 화학식에 존재하는 선행하는 아미노산의 양을 표기하며, 위 첨자의 숫자는 해당 화학식에 존재하는 선행하는 아미노산의 유형을 표기한다.
첫 번째 양상에서, 본 발명은 인간 종양 괴사 인자 수용체 2 (TNFR2)에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 하며, 이 때 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 CDR-H3를 내포한다:
(a) JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279);
(b) AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266); 또는
(c) ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259) 또는 상기 서열들에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열;
이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
각 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산, 가령, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고;
각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산, 가령, 아스파트산 및 글루탐산이고;
각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산, 가령, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 및 글루타민이고;
각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산, 가령, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 및 메싸이오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 및 타이로신다.
일부 구체예들에서, 상기 CDR-H3의 존재하에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285) 또는 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 CDR-H3의 존재하에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 7의 아미노산 142-149 (KCRPGFGV) 또는 아미노산 161-169 (CKPCAPGTF) 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구체예들에서, CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)를 가진다. 일부 구체예들에서, CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)를 가진다.
일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 내포한다:
(a) 아미노산 서열 GJTF(J)2YJ (서열 번호: 277)을 가지는 CDR-H1;
(b) 아미노산 서열 (J)5GSJ을 가지는 CDR-H2;
(c) 아미노산 서열 (J)5Y를 가지는 CDR-L1;
(d) 아미노산 서열 (J)2S를 가지는 CDR-L2; 및
(e) 아미노산 서열 (J)3Y(J)4T를 가지는 CDR-L3.
이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이다.
일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 내포한다:
(a) 아미노산 서열 Z4YZ3Z5TDZ5X를 가지는 CDR-H1;
(b) 아미노산 서열 VDPEYZ4Z3T (서열 번호: 264)를 가지는 CDR-H2;
(c) 아미노산 서열 QNINKZ5 (서열 번호: 268)를 가지는 CDR-L1;
(d) 아미노산 서열 TYZ3 또는 YTZ3를 가지는 CDR-L2; 및
(e) 아미노산 서열 CLQZ5VNLXZ3 (서열 번호: 271)를 가지는 CDR-L3;
이 때 각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고;
각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 아미노산이고; 그리고
각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신이다.
일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 내포한다:
(a) 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H1;
(b) 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H2;
(c) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L1;
(d) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
(e) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L3;
이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신이다.
일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 내포한다:
(a) 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257)를 가지는 CDR-H1;
(b) 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258)를 가지는 CDR-H2;
(c) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260)를 가지는 CDR-L1;
(d) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
(e) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261)를 가지는 CDR-L3;
이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신이다.
일부 구체예들에서, CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274)를 가진다. 일부 구체예들에서, CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYI (서열 번호: 275)를 가진다.
일부 구체예들에서, CDR-L2는 아미노산 서열 TYS를 가진다. 일부 구체예들에서, CDR-L2는 아미노산 서열 YTS를 가진다.
일부 구체예들에서, CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLLT (서열 번호: 272)를 가진다. 일부 구체예들에서, CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273)를 가진다.
일부 구체예들에서, CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274)을 가지고 CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273)를 가진다.
일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 CDR-L2의 N-말단에 결합된 아미노산 서열 LLIR (서열 번호: 262)을 내포하는 프레임워크 영역을 내포한다. 일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 CDR-L2의 C-말단에 결합된 아미노산 서열 TLE를 내포하는 프레임워크 영역을 내포한다.
일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원-결합 단편은 다음과 같은 CDRs 중 하나 이상을 포함하지 않는다:
(a) 아미노산 서열 GFTFSSY (서열 번호: 23)를 가지는 CDR-H1;
(b) 아미노산 서열 SSGGSY (서열 번호: 24)를 가지는 CDR-H2;
(c) 아미노산 서열 SASSSVYYMY (서열 번호: 26)를 가지는 CDR-L1;
(d) 아미노산 서열 STSNLAS (서열 번호: 27)를 가지는 CDR-L2;
(e) 아미노산 서열 QQRRNYPYT (서열 번호: 28)를 가지는 CDR-L3;
(f) 아미노산 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 번호: 29)를 가지는 CDR-L1;
(g) 아미노산 서열 LASNLES (서열 번호: 30)를 가지는 CDR-L2; 및
(h) 아미노산 서열 QHSRELPRT (서열 번호: 31)를 가지는 CDR-L3.
일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-고유 불변 영역, 가령, 인간 불변 영역을 내포하거나, Fc 도메인의 전부 또는 일부가 없거나, 고유 Fc 도메인의 전부 또는 일부가 없거나, Fc 도메인 모두가 없다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 제 1 폴리펩타이드 도메인 및 제 2 폴리펩타이드 도메인을 내포하는 구조체를 제공하며, 이 구조체들 각각은 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드를 내포한다. 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 도메인들은 동일할 수 있다. 일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 도메인들은 상이할 수 있다. 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 도메인들은 링커, 가령, 아마이드 결합 또는 이황화물 다리를 내포하는 링커에 의해 결합될 수 있다. 구조체들은 쥐과 Fc 도메인이 없을 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 11, 19, 20, 및 34-117 중 어느 하나의 아미노산 서열을 내포하며 약 100 nM 미만의 KD 를 가지는 펩타이드에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 7의 아미노산 56-60 (KCSPG)을 내포하는 펩타이드에 결합하지 않을 수 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 7 (KCRPG)의 아미노산 142-146 중 하나 이상을 내포하는 펩타이드에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 7 (KCSPG)의 아미노산 56-60을 내포하는 펩타이드에 결합하지 않을 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 TNFR2 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 및 cIAP2/BIRC3로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 유전자들의 발현을 감소 또는 저해한다. 일부 구체예들에서, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 NF
Figure pct00001
B 활성화를 저해한다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 또는 cIAP2/BIRC3 중 하나 이상의 발현 또는 번역후 변형 (예컨대, 인산화)을, 본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편으로 처리되지 않은 샘플로부터 분리된 이들 분자들 중 하나 이상의 발현 또는 번역후 변형 (예컨대, 인산화)에 비해 예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 감소 또는 저해할 수 있다. 발현 수준 및 인산화 상태를 결정하기 위하여 사용될 수 있는 예시적인 분석법들이 해당 분야에 공지되어 있으며 단백질 함량을 결정하기 위한 웨스턴 블랏 분석법 및 mRNA 함량을 결정하기 위한 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 실험들을 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 우성 TNFR2 길항제이므로 TNFR2 작용제 (가령, TNFα) 또는 성장-촉진제, 가령, IL-2의 존재하에서도 TNFR2 활성화를 저해할 수 있다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 본 발명의 구조체)는 다음 성질들 중 하나 이상 또는 모두를 나타낼 수 있다:
a. 예를 들어, T-조절 세포표면 상에서 TNFR2를 결합 및 비활성화시킴에 의한, T-조절 세포증식의 억제;
b. 예를 들어, MDSC 표면 상에서 TNFR2를 결합 및 비활성화시킴에 의한, MDSC 증식의 억제;
c. T 작동자 세포, 가령, CD8+ T 세포의 확대 촉진; 및/또는
d. TNFR2-발현 암 세포, 가령, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 림프종 세포 및 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 및 신장 세포 암종 세포의 증식 억제.
예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 환자 (가령, 인간 환자)에서 또는 샘플 (예컨대, 환자, 가령, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환을 치료 중인 인간 환자로부터 분리된 샘플)에서 T-조절 또는 암 세포의 총 양을, 길항제로 치료되지 않은 환자 또는 샘플에 비해 감소시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 TNFR2, 예컨대, T-조절 세포 또는 암 세포 (가령, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포)에 의한 TNFR2의 발현, 및/또는 이들 세포에 의한 가용성 TNFR2의 분비를 감소시킨다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)은 환자 (예컨대, 인간 환자)에서 또는 샘플 (예컨대, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환의 치료중인 인간 환자로부터 분리된 샘플)에서 T-조절 세포의 증식을 저해하거나 총 양을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 TNFR2를 발현하는 T-조절 세포 및/또는 암 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있다. 예를 들어, 암 세포는 T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 및 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 및 신장 세포 암종 세포로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 암 세포 상에서 TNFR2의 결합은 암 세포의 증식을 저해 또는 감소시킬 수 있으며 또는 암 세포의 세포자멸을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 골수-유래 억제 세포 (MDSC; 예컨대, B7-1 (CD80), B7-H1 (PD-L1), CCR2, CD1d, CD1d1, CD2, CD31 (PECAM-1), CD43, CD44, 보체 성분 C5a R1, F4/80 (EMR1), Fcγ RIII (CD16), Fcγ RII (CD32), Fcγ RIIA (CD32a), Fcγ RIIB (CD32b), Fcγ RIIB/C (CD32b/c), Fcγ RIIC (CD32c), Fcγ RIIIA (CD16A), Fcγ RIIIB (CD16b), 갈렉틴-3, GP130, Gr-1 (Ly-6G), ICAM-1 (CD54), IL-1RI, IL-4Rα, IL-6Rα, 인테그린 α4 (CD49d), 인테그린 αL (CD11a), 인테그린 αM (CD11b), M-CSFR, MGL1 (CD301a), MGL1/2 (CD301a/b), MGL2 (CD301b), 산화 질소, PSGL-1 (CD162), L-셀렉틴 (CD62L), siglec-3 (CD33), 트랜스페린 수용체 (TfR), VEGFR1 (Flt-1), 및 VEGFR2 (KDR 또는 Flk-1)로 구성된 그룹에서 선택된 소분자들 및 단백질 모두 또는 이의 서브셋을 발현시키는 세포)의 표면 상에서 TNFR2에 결합할 수 있다. 특히, MDSC는 B7-2 (CD86), B7-H4, CD11c, CD14, CD21, CD23 (FcεRII), CD34, CD35, CD40 (TNFRSF5), CD117 (c-kit), HLA-DR, 및 Sca-1 (Ly6)으로 구성된 그룹에서 선택된 단백질을 발현시키지 않는다. MDSC 상에서 TNFR2의 결합은 MDSC의 증식을 저해 또는 감소시킬 수 있으며 또는 MDSC의 세포자멸을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 T-조절 세포, 암 세포 (예컨대, TNFR2-발현 암 세포), 및/또는 MDSCs의 증식을 감소 또는 저해함에 TNFα를 필요로 하지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암을 가지지 않은 대상체에 비해 암에 걸린 환자에서 보다 더 큰 효능으로 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위 또는 암이 없는 대상체에 비해 암의 미세환경에서 더 큰 효능으로 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해한다.
예를 들어, 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위에서 또는 암이 없는 대상체에서 보다 종양의 미세환경에서 더 큰 효능으로 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 종양 미세환경에서 T-조절 세포의 증식을 저해하는 IC50을 나타낼 수 있으며, 이는 암 세포가 없는 부위에서 T-조절 세포의 증식을 저해하는 폴리펩타이드의 IC50보다, 예를 들어, 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배, 1.8-배, 1.9-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10,000-배, 또는 그 이상 만큼 작다. 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포를 내포하는 종양 미세환경에서, 가령, 전술한 암들 중 하나 이상에 걸린 환자에서 이러한 암 세포가 없는 부위 또는 암이 없는 대상체에서 보다 더 큰 효능으로 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암을 가지지 않은 대상체에 비해 암에 걸린 환자에서 보다 더 큰 효능으로 MDSCs의 증식을 감소 또는 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위 또는 암이 없는 대상체에 비해 암의 미세환경에서 더 큰 효능으로 MDSCs의 증식을 감소 또는 저해한다.
예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위 또는 암이 없는 대상체에서 보다 종양 미세환경에서 더 큰 효능으로 종양 미세환경 내 존재하는 MDSC의 표면 상에서 TNFR2에 결합할 수 있으며, MDSC의 증식을 저해 또는 감소시킬 수 있거나 MDSC의 세포자멸을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 종양 미세환경에서 MDSCs의 증식을 저해하는 IC50을 나타낼 수 있으며, 이는 암 세포가 없는 부위에서 MDSCs의 증식을 저해하는 폴리펩타이드의 IC50보다, 예를 들어, 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배, 1.8-배, 1.9-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10,000-배, 또는 그 이상 만큼 작다. 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포를 내포하는 종양 미세환경에서, 가령, 전술한 암들 중 하나 이상에 걸린 환자에서 이러한 암 세포가 없는 부위 또는 암이 없는 대상체에서 보다 더 큰 효능으로 MDSCs의 증식을 감소 또는 저해할 수 있거나 MDSCs의 세포자멸을 촉진할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암을 가지지 않은 대상체에 비해 암에 걸린 환자에서 보다 더 큰 효능으로 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 확대시킨다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위 또는 암이 없는 대상체에 비해 암의 미세환경에서 더 큰 효능으로 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 확대시킨다.
예를 들어, 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위에서 또는 암이 없는 대상체에서 보다 종양의 미세환경에서 더 큰 효능으로 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 직접 확대시킨다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 암이 없는 대상체에서 T 작동자 세포를 확대시키는 폴리펩타이드의 EC50보다, 예를 들어, 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배, 1.8-배, 1.9-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10,000-배, 또는 그 이상 작은, 암 환자에서 T 작동자 세포를 확대시키는 EC50을 가질 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포를 내포하는 종양 미세환경에서, 가령, 전술한 암들 중 하나 이상에 걸린 환자에서 이러한 암 세포가 없는 부위 또는 암이 없는 대상체에서 보다 더 큰 효능으로 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 직접 확대시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, T 작동자 세포 (예컨대, CD8+ 세포독성 T 세포)는 하나 이상의 암 세포, 가령, 호지킨 림프종 세포, 피부 비-호지킨 림프종 세포, T 세포 림프종 세포, 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포 상에 존재하는 항원과 특이적으로 반응한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 다음과 같이 확인하는 방법을 특징으로 한다:
(a) 항체 또는 이의 단편들의 이종 혼합물을, 서열 번호: 285 또는 286의 아미노산 서열, 또는 상기 서열들에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드에 노출시키는 단계; 및
(b) 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편들을 유지시키고 펩타이드에 특이적으로 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편들을 제거함으로써, 최소한 하나의 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 내포하는 농후 항체 혼합물을 생성하는 단계. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 농후 항체 혼합물 내 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구체예들에서, 펩타이드는 표면에 결합된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바이러스 입자 또는 세포의 표면, 가령, 파지, 세균 세포, 또는 효모 세포의 표면에서 발현될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 리보솜에 비-공유 결합되거나 mRNA 또는 cDNA에 공유 결합된 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬들로서 발현될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 펩타이드는 탐지가능한 표지, 가령, 형광 분자 (예컨대, 녹색 형광 단백질, 청록 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 피코에리트린, 알로피코시아닌, 회흐스트, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 프로피듐 아이오다이드, 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 테트라메틸로다민, 및 사이아닌), 에피토프 태그 (예컨대, 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-전달효소, 폴리-히스티딘 태그, FLAG-태그, myc-태그, 인간 인플루엔자 적혈구응집소 (HA) 태그, 비오틴, 및 스트렙타비딘), 및 방사성표지로 구성된 그룹에서 선택된 탐지가능한 표지에 접합된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 1회 이상 순차적으로 반복된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 비-인간 포유동물을 서열 번호: 285 또는 286의 서열, 또는 상기 서열들에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 내포하는 펩타이드로 면역화하는 단계, 및 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 내포하는 혈청을 수집하는 단계에 의한 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법을 특징으로 한다. 상기 비-인간 포유동물은 토끼, 생쥐, 쥐, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 및 양으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 구체예들 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장 항체 또는 항체 단편들, 가령, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 다클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이원-가변 면역글로불린 도메인, 일가 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 Fv 분자 (scFv), 디아바디, 트리아바디, 나노바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 도메인 항체, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 분자, 및 탠덤 scFv (taFv)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예컨대, 아마이드 결합, 싸이오에터 결합, 탄소-탄소 결합, 또는 이황화물 다리에 의해, 또는 링커, 가령, 본 출원에 기재된 링커에 의해 서로에 공유 결합된 둘 이상의 CDRs를 내포한다. 일부 구체예들에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE로 구성된 그룹에서 선택된 아이소형을 가진다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 치료제, 가령, 본 출원에 기재된 세포독성제에 접합될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오타이드를 내포하는 벡터를 특징으로 한다. 상기 벡터는 발현 벡터, 가령, 진핵 발현 벡터, 또는 바이러스 벡터, 가령, 아데노바이러스 (Ad, 가령, 혈청형 5, 26, 35, 또는 48 아데노바이러스), 레트로바이러스 (가령, γ-레트로바이러스 또는 렌티바이러스), 폭스바이러스, 아데노-연관 바이러스, 배큘로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 또는 백시니아 바이러스 (가령, 변형된 백시니아 앙카라 (MVA)일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 내포하는 숙주 세포, 가령, 원핵 및 진핵 (예컨대, 포유류) 세포를 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포 (예컨대, TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 내포하는 제약학적 조성물을 특징으로 한다. 제약학적 조성물은, 예를 들어, 추가 치료제, 가령, 면역요법제를 내포할 수 있다. 일부 구체예들에서, 면역요법제는 항-CTLA-4 제제, 항-PD-1 제제, 항-PD-L1 제제, 항-PD-L2 제제, TNF-α 교차-결합 제제, a TRAIL 교차-결합 제제, 항-CD27 제제, 항-CD30 제제, 항-CD40 제제, 항-4-1BB 제제, 항-GITR 제제, 항-OX40 제제, 항-TRAILR1 제제, 항-TRAILR2 제제, 또는 항-TWEAKR 제제이다. 예를 들어, 면역요법제는 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-PD-L2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, TNF-α 교차-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편, TRAIL 교차-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-CD27 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-CD30 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-CD40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-4-1BB 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-GITR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-TRAILR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-TRAILR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-TWEAKR 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 면역요법제는 Mahoney 외의 문헌인, Cancer Immunotherapy, 14:561-584 (2015)의 표 1에 기재된, 하나 이상의 면역학적 표적들에 특이적으로 결합할 수 있으며, 이 문헌은 그 전문이 참고문헌으로 포함된다. 예를 들어, 면역요법제는 OX40L, TL1A, CD40L, LIGHT, BTLA, LAG3, TIM3, Singlecs, ICOS, B7-H3, B7-H4, VISTA, TMIGD2, BTNL2, CD48, KIR, LIR, LIR 항체, ILT, NKG2D, NKG2A, MICA, MICB, CD244, CSF1R, IDO, TGF
Figure pct00002
, CD39, CD73, CXCR4, CXCL12, SIRPA, CD47, VEGF, 또는 뉴로필린 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제, 가령, 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 특히, 제약학적 조성물은 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항-PD-1 또는 항-PDL1 항체를 내포한다. 일부 구체예들에서, 면역요법제는 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론 (예컨대, PEGASYS®), 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 가바펜틴, 림프계 세포 표면 수용체 및/또는 림포카인에 대한 항체, 표면 암 단백질에 대한 항체, 및/또는 보리노스타트와 같은 소분자 치료제이다.
일부 구체예들에서, 추가 치료제는 화학요법제, 가령, 본 출원에 기재된 화학요법제이다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포 (예컨대, TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 화학요법제와 혼합함으로써, 화학요법제와의 공-투여를 위해 제형화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포는 화학요법제와 별도로 투여하기 위해 제형화된다. 일부 구체예들에서, 화학요법제는, 예를 들어, 본 출원에 기재되거나 해당 분야에 공지된 결합-형성 기술을 사용하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포에 직접 접합된다.
본 발명은 또한 숙주 세포에서 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계 및 숙주 세포 배지로부터 상기 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계에 의한, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 항원-결합 단편)의 제조 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 추가적으로 조절 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응 저해 방법, 뿐만 아니라, 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 또는 제약학적 조성물 (예컨대, TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및, 선택적으로, 면역요법제, 가령, 항-PD-1 또는 항-PDL1 항체를 내포하는 제약학적 조성물)을 치료를 필요로 하는 인간에게 투여하는 것에 의한, 인간의 세포 증식 장애 치료 방법을 특징으로 한다. 추가적으로, 본 발명은 조절 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 저해하기 위한, 뿐만 아니라 인간의 세포 증식 장애를 치료하기 위한, 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 내포하는 조성물을 특징으로 한다.
일부 구체예들에서, 세포 증식 장애는 암, 가령, 백혈병, 림프종, 간암, 골암, 폐암, 뇌암, 방광암, 위장관암, 유방암, 심장암, 자궁경부암, 자궁암, 두경부암, 담낭암, 후두암, 구순 및 구강암, 안구암, 흑색종, 이자암, 전립선암, 결장직장암, 고환암, 또는 인두암일 수 있다. 특정 사례들에서, 세포 증식 장애는 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 부신피질 암종, AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 항문암, 충수암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 간외암, 유잉 육종군, 골육종 및 악성 섬유 조직구종, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 생식 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막세포종, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 원발성 림프종, 척삭종, 만성 골수증식성 신생물, 결장 암, 간외 담관암, 제자리 관상 암종 (DCIS), 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 나팔관암, 골의 섬유성 조직구종, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양 (GIST), 고환생식 세포 종양, 임신 영양막병, 교종, 소아기 뇌간 교종, 털 세포 백혈병, 간세포 암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 섬세포 종양, 이자 신경내분비 종양, 윌름스 종양 및 기타 소아기 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 소세포 폐암, 피부 T 세포 림프종, 안구내 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 정중선로(midline tract) 암종, 다발 내분비샘 종양 증후군, 다발 골수종/형질 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 비강 및 부비동암, 코인두 암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 상피성 난소암, 생식 세포 난소 암, 저위험 악성 난소 암, 이자 신경내분비 종양, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 원발성 복막암, 직장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 카포시 육종, 횡문근육종, 세자리 증후군, 소장암, 연조직 육종, 인두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 요도암, 자궁내막 자궁암, 자궁 육종, 질암, 음문암, 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증으로 구성된 그룹에서 선택된 암일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 환자 (예컨대, 포유동물 환자, 가령, 인간 환자)에게 투여함에 의한, T 세포 림프종 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암, 결장 암, 다발 골수종, 또는 신장 세포 암종의 치료 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 환자 (예컨대, 포유동물 환자, 가령, 인간 환자)에 투여함에 의한 난소암 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 추가적으로 환자 (예컨대, 인간 환자)의 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종, T 세포 림프종, 난소 암, 결장 암, 다발 골수종, 또는 신장 세포 암종을 치료하기 위한 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 내포하는 조성물을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 치료를 필요로 하는 인간에게 투여함에 의한, 환자 (예컨대, 인간 환자)의 감염성 질환 치료 방법, 뿐만 아니라 환자 (예컨대, 인간 환자)의 감염성 질환을 치료하기 위한 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 내포하는 조성물을 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 감염성 질환은 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충에 의해 유발된다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 바이러스 감염에는 C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 카담 바이러스, 키아사누르 삼림병 바이러스, 랑가트 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 포와산 바이러스, 로얄 팜 바이러스, 카르시 바이러스, 진드기 매개 뇌염바이러스, 뉴도에르플 바이러스, 소프진 바이러스, 도약병 (Louping ill) 바이러스, 네기시 바이러스, 메반 바이러스, 사우마레즈 리프 바이러스, 튤레니이 바이러스, 아로아 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 바이러스, 카시파코어 바이러스, 코우탕고 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 야오운데 바이러스, 코코베라 바이러스, 바가자 바이러스, 일레우스 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 바이러스, 템부수 바이러스, 지카 바이러스, 반지 바이러스, 보우보우이 바이러스, 엣지 힐 바이러스, 주그라 바이러스, 사보야 바이러스, 세픽 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 황열병 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 요코세 바이러스, 아포이 바이러스, 카우본 릿지 바이러스, 주티아파 바이러스, 모독 바이러스, 살 비에자 바이러스, 산 페를리타 바이러스, 부칼라사 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 바이러스, 다카르 박쥐 바이러스, 몬타나 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 박쥐 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 세포 융합 제제 바이러스, 이피 바이러스, 라싸 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 아마파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라티노 바이러스, 마추포 바이러스, 올리베로스 바이러스, 파라나 바이러스, 피친데 바이러스, 피리탈 바이러스, 사비아 바이러스, 타카리베 바이러스, 타미아미 바이러스, 화이트워터 아로요 바이러스, 차파레 바이러스, 루요 바이러스, 한탄 바이러스, 신 놈브레 바이러스, 두그베 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 라 크로세 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 크리미언-콩고 출혈열 (CCHF) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE), 신드비스 바이러스, 풍진 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바르마 삼림 바이러스, 오니옹니옹 바이러스, 및 치쿤구니아 바이러스, 천연두 바이러스, 원숭이마마 바이러스, 백시니아 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 수두대상포진 바이러스, 카포시 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV), 인플루엔자 바이러스, 중증 급성 호흡 증후군 (SARS) 바이러스, 광견병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 뉴캐슬병 바이러스, 헨드라바이러스, 니파바이러스, 홍역 바이러스, 린더페스트 바이러스, 개 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 (예컨대, 1, 2, 3, 및 4), 라이노바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 인간 엔테로바이러스 (A, B, C, 및 D), A형 간염 바이러스, 콕사키바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 아스트로바이러스, JC 바이러스, BK 바이러스, SV40 바이러스, 노웍 바이러스, 로타바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T-림프친화 바이러스 I 및 II형, 및 전염성 해면상 뇌염증, 가령, 만성 소모성 질환이 포함된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 세균 감염에는 살모넬라 (Salmonella), 스트렙토코쿠스 (streptococcus), 바실루스 (bacillus), 리스테리아 (listeria), 코리네박테리움 (corynebacterium), 노카르디아 (nocardia), 나이세리아 (neisseria), 악티노박터 (actinobacter), 모락셀라 (moraxella), 엔테로박테리아세아에 (entero세균cece) (예컨대, 대장균 (E. coli), 가령, O157:H7), 슈도모나스 (pseudomonas), 에스케리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (klebsiella), Ser쥐ia, 엔테로박터 (enterobacter), 프로테우스 (proteus), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (shigella), 예르시니아 (yersinia), 헤모필루스 (haemophilus), 보르다텔라 (bordatella), 레기오넬라 (legionella), 파스퇴렐라 (pasturella), 프란치셀라 (francisella), 브루셀라 (Brucella), 바르토넬라 (bartonella), 클로스트리디움 (clostridium), 비브리오 (vibrio), 캄필로박터 (campylobacter), 및 스타필로코쿠스 (staphylococcus)로 구성된 군에서 선택된 속에 속하는 박테리아에 의해 유발되는 감염이 포함된다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 기생충 감염에는 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba hystolytica), 지아디아 람블리아 (Giardia lamblia), 크립토스포리디움 무리스 (cryptosporidium muris), 트리파노소마티다 감비엔세 (trypanosomatida gambiense), 트리파노소마티다 로데시엔세 (trypanosomatida rhodesiense), 트리파노소마티다 크루시 (trypanosomatida crusi), 리슈마니아 멕시카나 (leishmania mexicana), 리슈마니아 브라질리엔시스 (leishmania braziliensis), 리슈마니아 트로피카 (leishmania tropica), 리슈마니아 도노바니 (leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디 (toxoplasma gondii), 플라스모디움 비박스 (plasmodium vivax), 플라스모디움 오발레 (plasmodium ovale), 플라스모디움 말라리아에 (plasmodium malariae), 플라스모디움 팔시파룸 (plasmodium falciparum), 질트리코모나스 (trichomonas vaginalis), 및 히스토모나스 멜리아그리디스 (histomonas meleagridis)에 의해 유발되는 감염이 포함된다. 예시적인 기생충제 (helminthic parasites)에는 트리추리스 트리츄라 (richuris trichiura), 아스카리스 룸브리코이데스 (ascaris lumbricoides), 엔테로바이러스 버미큘러리스 (enterobius vermicularis), 안사이클로스토마 두오데날레 (ancylostoma duodenale), 네카토르 아메리카누스 (necator americanus), 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (strongyloides stercoralis), 우체레리아 반크로프티 (wuchereria bancrofti), 및 드라쿤쿨루스 메디넨시스 (dracunculus medinensis), 쉬스토소마 만소니 (schistosoma mansoni), 쉬스토소마 해마토비움 (schistosoma haematobium), 쉬스토소마 자포니쿰 (schistosoma japonicum), 파시올라 헤파티카 (fasciola hepatica), 파시올라 기간티카 (fasciola gigantica), 헤테로파이에스 (heterophyes), 파라고니무스 웨스트마니 (paragonimus westermani), 태니아 솔리움 (taenia solium), 태니아 사기나타 (taenia saginata), 히메노렙시스 나나 (hymenolepis nana), 또는 에키노코쿠스 그라뉼로수스 (echinococcus granulosus)가 포함된다.
본 발명은 또한 키트, 가령, 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체, 또는 항원-결합 단편 (예컨대, 길항제 TNFR2 항체), 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포를 내포하는 키트를 특징으로 한다. 일부 사례들에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 숙주 세포에 본 발명의 벡터를 형질감염하기 위한 지시사항들을 내포할 수 있다. 선택적으로, 키트는 본 발명의 숙주 세포에서 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원-결합 단편을 발현시키기 위한 지시사항 (그리고 선택적으로, 이를 위해 사용될 수 있는 시약)을 내포할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 구조체, 항체 또는 항원-결합 단편, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포를 인간 환자에게 투여하기 위한 지시사항을 내포할 수 있다. 선택적으로 키트는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포를 제조 또는 사용하는 지시사항들을 내포할 수 있다.
정의
본 출원에서 사용되는, 용어 "약"은 기재된 값의 10% 이상 또는 이하의 값을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "약 5 nM"는 4.5 nM 내지 5.5 nM 범위를 나타낸다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항체" (Ab)는 특정 항원에 특이적으로 결합하거나, 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자를 지칭하고, 다클론, 단클론, 유전자 조작된 및 다른 방식으로 변형된 형태의 항체를 포함하며, 키메라 항체, 인간화 항체, 이종접합 항체 (예컨대, 이중- 삼중- 및 사중-특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디), 및, 예컨대, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG, 및 scFv 단편을 비롯한, 항체의 항원-결합 단편을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱이, 달리 언급이 없는 한, 용어 "단클론 항체" (mAb)는 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 무손상 분자, 뿐만 아니라, 항체 단편 (가령, 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편) 모두를 포함함을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 무손상 항체의 Fc 단편이 없으며, 동물의 순환으로부터 더욱 신속하게 제거되고, 무손상 항체 보다 더 적은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다 (Wahl 외, J. Nucl. Med. 24:316, 1983 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
본 출원에서 사용되는 용어 "항원-결합 단편"은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편들을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있다. 항체 단편들은 Fab, F(ab')2, scFv, SMIP, 디아바디, 트리아바디, 애피바디, 나노바디, 압타머, 또는 도메인 항체일 수 있다. 항체의 "항원-결합 단편" 용어에 포함되는 결합 단편들이 예들에는 다음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인들로 구성된 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 다리에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편들을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편, (v) VH 및 VL 도메인들을 포함하는 dAb; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward 외, Nature 341:544-546, 1989); (vii) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb; (viii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (ix) 합성 링커에 의해 선택적으로 결합될 수 있는 둘 이상의 단리된 CDR들의 조합. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인들, VL 및 VH는 별도의 유전자들에 대해 코딩되지만, 이 도메인들은 재조합 방법들을 사용하여 링커에 의해 결합될 수 있으며, 이 때 링커는 VL 및 VH 영역들을 짝을 이루게 하여 일가 분자들 (단쇄 Fv (scFv)로도 공지됨; 예컨대, Bird 외, Science 242:423-426, 1988, 및 Huston 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988 참고)을 형성하고 있는 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있게 한다. 이들 항체 단편들은 이들 단편들은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 전형적인 기법들을 사용하여 수득될 수 있으며, 무손상 항체들과 동일한 방식으로 용도에 따라 선별될 수 있다. 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기법, 무손상 면역글로불린들의 효소적 또는 화학적 절단에 의해, 또는, 일부 구체예들에서, 해당 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성 절차에 의해 제조될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항-종양 괴사 인자 수용체 2 항체", "TNFR2 항체", "항-TNFR2 항체 부분", 및/또는 "항-TNFR2 항체 단편" 등은 TNFR2에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자의 최소한 일부분, 가령, 경쇄 또는 중쇄의 최소한 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 일부 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩타이드-내포 분자를 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린 분자의 둘 이상의 부분들은, 예컨대, 아마이드 결합, 싸이오에터 결합, 탄소-탄소 결합, 이황화물 다리를 통해, 또는 링커, 가령, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 링커에 의해 서로 공유 결합될 수 있다. TNFR2 항체는 또한 항체-유사 단백질 스캐폴드, 가령, 항체 CDRs과 구조적으로 그리고 용매 접근성이 유사한 BC, DE, 및 FG 구조 루프들을 내포하는, 피브로넥틴의 10번째 유형 III 도메인 (10Fn3)을 포함한다. 10Fn3 도메인의 4차 구조는 IgG 중쇄의 가변 영역의 4차 구조와 닮아있어서, 해당 분야의 숙련된 기술자는, 예컨대, 10Fn3의 BC, DE, 및 FG 루프들의 잔기들을 TNFR2 단클론 항체의 CDR-H1, CDR-H2, 또는 CDR-H3 영역들의 잔기들로 대체함으로써, TNFR2 단클론 항체의 CDRs을 피브로넥틴 스캐폴드에 이식할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "길항제 TNFR2 항체" 및 "길항 TNFR2 항체"는 TNFR2의 활성화를 저해 또는 감소할 수 있고 및/또는 TNFR2에 의해 매개되는 하나 이상의 신호 전달 경로들을 약화시킬 수 있는 TNFR2 항체를 지칭한다. 예를 들어, 길항 TNFR2 항체는 조절 T 세포의 성장 및 증식을 저해 또는 감소시킬 수 있다. 길항 TNFR2 항체는 TNFR2가 TNFα를 결합시키는 것을 차단함으로써 TNFR2 활성화를 저해 또는 감소시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 길항 TNFR2 항체는 TNFα와의 상호작용에 의해 다른 방식으로 유도되는 TNFR2의 삼량체화를 차단할 수 있어, TNFR2 활성의 억제를 생성할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "이중특이적 항체"는 최소한 2개의 상이한 항원들에 대한 결합 특이성을 가지는 단클론, 종종 인간 또는 인간화 항체를 지칭한다. 본 발명에서, 결합 특이성들 중 하나는 TNFR2를 향해 지시될 수 있고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대해, 예컨대, 세포-표면 단백질, 수용체, 수용체 아단위, 조직-특이적 항원, 바이러스 유래 단백질, 바이러스 인코딩된 외피 단백질, 세균 유래 단백질, 또는 세균 표면 단백질, 등에 대해 지시될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 어구 "화학요법제"는 암, 가령, 본 출원에 기재된 암의 치료에 치료적 유용성을 가진 임의의 화학 제제를 지칭한다. 화학요법제는 화학적 및 생물학적 제제들 모두를 포함한다. 이들 제제들은 지속적인 생존을 위해 암 세포가 의존하는 세포 활성을 저해하기 위해 기능할 수 있다. 화학요법제들의 범주에는 알킬화/알칼로이드 제제, 항대사제, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 항신생물 약제가 포함된다. 본 출원에 기재된 조성물 및 방법들과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 화학요법제들에는, 제한 없이, include, 제한 없이, those set forth in Slapak 및 Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison' s Principles of 내부 medicine, 14th edition; Perry 외, Chemo치료, Chapter 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., 2000; Baltzer L. 및 Berkery R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemo치료, 2nd ed. St. Luois, mosby-Year Book, 1995; Fischer D. S., Knobf M. F., Durivage H.J. (eds): The Cancer Chemo치료 Handbook, 4th ed. St. Luois, Mosby-Year Handbook에 제시된 것들이 포함되며, 상기 문헌들 각각의 내용은 화학요법제와 관련되는 한 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "키메라" 항체는 하나의 출처 유기체, 가령, 쥐 또는 생쥐의 면역글로불린으로부터 유래한 가변 도메인 서열들 (예컨대, CDR 서열들), 및 상이한 유기체 (예컨대, 인간, 또 다른 영장류, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 고양이, 개, 기니아 피그, 소과 군의 구성원 (가령, 그 중에서도, 소, 들소, 버팔로, 엘크, 및 야크), 암소, 양, 말, 또는 들소)의 면역글로불린으로부터 유래한 불변 영역들을 가지는 항체를 지칭한다. 키메라 항체 제조 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 본 출원에 참고문헌으로 포함되는, 예컨대, Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi 외, 1986, Bio기술 4:214-221; Gillies 외, 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국 특허 제 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397을 참고하라.
본 출원에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" (CDR)은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들 모두에서 발견되는 초가변 영역을 지칭한다. 가변 도메인들 중 보다 많이 보존되는 부분들을 프레임워크 영역 (FRs)이라 한다. 해당 분야에서 이해되는 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 묘사하는 아미노산 위치들은, 해당 분야에 공지된 내용 및 다양한 정의들에 따라 달라질 수 있다. 가변 도메인 내 일부 위치들은, 이들 위치들이 한 세트의 범주 하에서는 초가변 영역 내 존재하는 것으로 인정될 수 있으나 다른 세트의 범주 하에서는 초가변 영역 밖에 존재하는 것으로 인정될 수 있다는 점에서, 하이브리드 초가변 위치들로 볼 수 있다. 이러한 위치들 중 하나 이상은 또한 연장된 초가변 영역들에서 발견될 수 있다. 본 발명은 이러한 하이브리드 초가변 위치들에서의 변형들을 포함하는 항체를 포함한다. 고유 중쇄 및 경쇄들의 가변 도메인들은 각각 일차적으로 3개의 CDR들에 의해 연결된 β 쉬트 구조를 취하는 4개의 프레임워크 영역들을 포함하며, 이들은 β쉬트 구조를 연결하여 일부 사례들에서 β쉬트 구조의 일부를 형성하는 루프들을 형성한다. 각 사슬에서 CDRs은 FR 영역들에 의해 다른 항체 사슬들로부터의 CDR들과 함께FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 근접하게 함께 고정되며, 항체의 표적 결합 부위의 형성에 기여한다 (본 출원에 참고문헌으로 포함된, Kabat 외, Sequences of Proteins of 면역학적 Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987 참고). 본 출원에서 사용되는 면역글로불린 아미노산 잔기들의 넘버링은, 달리 언급이 없는 한, Kabat 외의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따라 이루어진다.
본 출원에서 사용되는 용어 "보존적 돌연변이", "보존적 치환", 또는 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 물리화학적 성질, 가령, 극성, 정전지 전하, 및 입체 부피를 나타내는 하나 이상의 상이한 아미노산들에 대한 하나 이상의 아미노산들의 치환을 지칭한다. 이러한 성질들은 아래 표 1에 20개의 자연-발생 아미노산들 각각에 대해 요약되어 있다.
표 1. 자연-발생 아미노산들의 대표적인 물리화학적 성질
Figure pct00003
Figure pct00004
이 표로부터 보존적 아미노산 군들은, 예컨대, (i) G, A, V, L, I, P, 및 M; (ii) D 및 E; (iii) C, S 및 T; (iv) H, K 및 R; (v) N 및 Q; 및 (vi) F, Y 및 W를 포함함이 이해된다. 그러므로 보존적 돌연변이 또는 치환은 동일한 아미노산 군의 구성원을 하나의 아미노산으로 치환하는 것 (예컨대, Thr을 Ser로 또는 Arg을 Lys로 치환)이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "접합체"는 한 분자의 반응성 작용기와 또 다른 분자의 적절한 반응성 작용기의 화학적 결합에 의해 형성되는 화합물을 지칭한다.
TNFR2 길항제와 관련하여 본 출원에서 사용되는 용어 "구조체"는 제 2 폴리펩타이드 도메인에 결합된 제 1 폴리펩타이드 도메인을 내포하는 융합 단백질을 지칭한다. 폴리펩타이드 도메인들은 각각 독립적으로, 예를 들어, 본 출원에 기재된, 길항 TNFR2 단일 사슬 폴리펩타이드일 수 있다. 제 1 폴리펩타이드 도메인은, 예를 들어, 링커, 가령, 그 중에서도 펩타이드 링커 또는 이황화물 다리에 의해 제 2 폴리펩타이드 도메인에 공유 결합될 수 있다. 길항 TNFR2 구조체의 폴리펩타이드 도메인들을 결합시키기 위해 사용될 수 있는 예시적인 링커들에는, 제한 없이, Leriche 외, Bioorg. Med. Chem., 20:571-582 (2012)에 기재되어 있는 링커들이 포함되며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "유도체화 항체"는 단리된 항체에 고유하지 않은 잔기들을 절단하거나 화학적 모이어티를 추가하기 위하여 화학 반응에 의해 변형되는 항체를 지칭한다. 유도체화 항체는 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지의 화학적 보호/차단 그룹들의 추가에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 링키지에 의해 수득될 수 있다. 임의의 다양한 화학적 변형들은, 제한 없이, 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신에 의한 대사 합성 등을 비롯한 공지 기술에 의해 확립된 절차들을 사용하여 실시될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 예컨대, 엠버 억제 기술을 사용하여 하나 이상의 비-자연 아미노산들을 내포할 수 있다 (예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 6,964,859 참고).
본 출원에서 사용되는 용어 "디아바디"는 2개의 폴리펩타이드 사슬들을 포함하는 이가 항체를 지칭하며, 여기서 각각의 폴리펩타이드 사슬은, 너무 짧아서 동일한 펩타이드 사슬 상에서 VH 및 VL 도메인들의 분자내 결합을 할 수 없게 하는 링커 (예컨대, 5개 아미노산들로 이루어진 링커)에 의해 결합되는 VH 및 VL 도메인들을 포함한다. 이러한 구조는 각 도메인이 또 다른 폴리펩타이드 사슬 상의 상보적 도메인과 짝을 이루게 하여, 동종이량체 구조를 형성하게 한다. 따라서, 용어 "트리아바디"는 3개의 펩타이드 사슬들을 포함하는 삼가 항체를 지칭하며, 이들 각각은 지나치게 짧아서 동일한 펩타이드 사슬 내에서 VH 및 VL 도메인들의 분자내 결합을 할 수 없게 하는 링커 (예컨대, 1-2개 아미노산들로 이루어진 링커)에 의해 결합되는 하나의 VH 도메인 및 하나의 VL 도메인을 내포한다. 펩타이드들을 그 고유한 구조로 폴딩시키기 위하여, 이러한 방식으로 구성된 펩타이드들은, 이웃한 펩타이드 사슬들의 VH 및 VL 도메인들을 서로 공간적으로 근위에 배치시켜 적절한 폴딩을 가능하게 하기 위해 전형적으로 삼량체화된다(본 출원에 참고문헌으로 포함된 Holliger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993 참고).
본 출원에서 사용되는 TNFR2의 "우성 길항제"는 TNFR2 작용제, 가령, TNFα, 또는 IL-2의 존재하에서도 TNFR2 활성화를 저해할 수 있는 길항제 (예컨대, 길항 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)이다. 예를 들어, TNFR2 길항제는, TNFR2 작용제 (예컨대, TNFα) 또는 IL-2의 존재하에서 상기 길항제의 IC50가, TNFR2 작용제, 가령, TNFα, 또는 IL-2의 부재시 동일한 분석법으로 측정한 길항제의 IC50에 비해200% 미만 (예컨대, 200%, 100%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 미만, 또는 그 미만)만큼 증가하는 경우 우성 길항제이다. TNFR2 활성화의 저해는, 예를 들어, TNFR2+ 세포, 가령, T-조절 세포, TNFR2를 발현시키는 암 세포, 또는 골수-유래 억제 세포의 증식 저해를 측정함으로써, 뿐만 아니라 NF
Figure pct00005
B 신호전달 저해를 측정함으로써 (예컨대, 종래의 유전자 발현 분석법으로 CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 및 cIAP2/BIRC3로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 유전자들의 발현 감소를 모니터링함으로써) 평가될 수 있다. TNFR2 활성화를 모니터하기 위해 사용될 수 있는 세포 증식 분석법 및 유전자 발현 분석법은 본 출원에, 예를 들어, 각각 실시예 9 및 12에 기재되어 있다.
본 출원에서 사용되는, "이원 가변 도메인 면역글로불린" ("DVD-Ig")은 2개의 단클론 항체의 표적-결합 가변 도메인들을 링커들을 통해 조합시켜 사가의, 이원-표적화 단일 제제를 생성하는 항체를 지칭한다. (본 출원에 참고문헌으로 포함된 Gu 외, Meth. Enzymol., 502:25-41, 2012). 본 발명의 DVDs의 경쇄들에서 사용하기에 적합한 링커들에는 Gu 외의 문헌 30페이지 표 2.1에 제시된 다음과 같은 링커들이 포함된다: 짧은 K 사슬 링커들 ADAAP (서열 번호: 118) (쥐과) 및 TVAAP (서열 번호: 119) (인간); 긴
Figure pct00006
사슬 링커들 ADAAPTVSIFP (서열 번호: 120) (쥐과) 및 TVAAPSVFIFPP (서열 번호: 121) (인간); 짧은
Figure pct00007
사슬 링커 QPKAAP (서열 번호: 122) (인간); 긴
Figure pct00008
사슬 링커 QPKAAPSVTLFPP (서열 번호: 123) (인간); GS-짧은 링커 GGSGG (서열 번호: 124), GS-중간 링커 GGSGGGGSG (서열 번호: 125), 및 GS-긴 링커 GGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 126) (모든 GS 링커들은 쥐과 및 인간의 것이다). DVDs의 중쇄에 사용하기에 적합한 링커들에는 본 출원에 참고문헌으로 포함된, Gu & Ghayur, 2012의 문헌, Methods in Enzymology 502:25-41의 30페이지 표 2.1에 제시된 다음과 같은 링커들이 포함된다: 짧은 링커 AKTTAP (서열 번호: 127) (쥐과) 및 ASTKGP (서열 번호: 128) (인간); 긴 링커 AKTTAPSVYPLAP (서열 번호: 129) (쥐과) 및 ASTKGPSVFPLAP (서열 번호: 130) (인간); GS-짧은 링커 GGGGSG (서열 번호: 131), GS-중간 링커 GGGGSGGGGS (서열 번호: 132), 및 GS-긴 링커 GGGGSGGGGSGGGG (서열 번호: 133) (모든 GS 링커들은 쥐과 및 인간의 것이다).
본 출원에서 사용되는 "내인성"은 특정 유기체 (예컨대, 인간)에서 또는 유기체의 특정 위치 (예컨대, 기관, 조직, 또는 세포, 가령, 인간 세포)에서 자연적으로 발견되는 분자 (예컨대, 폴리펩타이드, 핵산, 또는 보조인자)를 설명한다.
본 출원에서 사용되는 "외인성"은 특정 유기체 (예컨대, 인간)에서 또는 유기체의 특정 위치 (예컨대, 기관, 조직, 또는 세포, 가령, 인간 세포)에서 자연적으로 발견되지 않는 분자 (예컨대, 폴리펩타이드, 핵산, 또는 보조인자)를 설명한다. 외인성 물질들은 외부 출처로부터 유기체에 또는 유기체로부터 추출된 배양된 물질에 제공되는 물질들을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FW 영역"은 CDRs에 인접한 아미노산 잔기들을 포함한다. FW 영역 잔기들은,그 중에서도, 예를 들어, 인간 항체, 설치류-유래 항체 (예컨대, 쥐과 항체), 인간화 항체, 영장류화 항체, 키메라 항체, 항체 단편 (예컨대, Fab 단편), 단쇄 항체 단편 (예컨대, scFv 단편), 항체 도메인, 및 이중특이적 항체에 존재할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "융합 단백질"은 또 다른 분자에 공유 결합을 통해 결합되는 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은, 예컨대, 하나의 단백질의 N-말단과 또 다른 단백질의 C-말단 사이의 아미드-결합 형성 반응에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 단백질에 공유 결합된 하나의 단백질을 내포하는 융합 단백질은, 예를 들어, 벡터의 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포의 게놈의 발현에 의해 세포 (예컨대, 진핵 세포 또는 원핵 세포)에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 융합 단백질은 링커에 공유 결합되고, 그 후 또 다른 분자에 공유 결합되는 하나의 단백질을 내포할 수 있다. 융합 단백질의 형성에 사용될 수 있는 링커들의 예들에는, 펩타이드-내포 링커들, 가령, 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산들을 내포하는 링커들이 포함된다. 일부 구체예들에서, D-아미노산 잔기들은 자연-발생 단백질에 존재하지 않으므로 링커에 D-아미노산들을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 그리하여 내인성 단백분해효소에 의한 분해에 더욱 내성을 띠게 된다. 링커들은 링커의 반응성 성분들에 따라 해당 분야에 널리 공지된 다양한 전략들을 사용하여 제조될 수 있고, 효소적 가수분해, 광분해, 산성 조건하에서 가수분해, 염기성 조건하에서 가수분해, 산화, 이황화물 환원, 친핵성 절단, 또는 유기금속 절단에 의해 절단될 수 있다 (Leriche 외, Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012).
본 출원에서 사용되는 용어 "이종특이적 항체"는 최소한 2개의 상이한 항원들에 대하여 결합 특이성을 가지는 단클론, 바람직하게는 인간 또는 인간화, 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이종특이적 항체의 재조합 제조는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 짝의 공동-발현에 기반한 것으로, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 가진다 (Milstein 외, Nature 305:537, 1983). 유사한 절차들이, 예컨대, WO 93/08829, 미국 특허 제 6,210,668; 6,193,967; 6,132,992; 6,106,833; 6,060,285; 6,037,453; 6,010,902; 5,989,530; 5,959,084; 5,959,083; 5,932,448; 5,833,985; 5,821,333; 5,807,706; 5,643,759, 5,601,819; 5,582,996, 5,496,549, 4,676,980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker 외, EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh 외, Methods in Enzymology 121:210 (1986)에 개시되어 있으며; 이들 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 이종특이적 항체는, 본 출원에 참고문헌으로 포함된 Klein 외, mAbs 4(6):653-663, 2012에 기재된 바와 같은, 다중특이적 항체에서 올바른 사슬 결합을 실시하게 하는 Fc 돌연변이들을 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는, 실질적으로 모든 단백질 부분 (예컨대, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인 (예컨대, CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH))이 실질적으로 인간에서 비-면역원성이며 단지 소수의 서열 변화 또는 변이만을 가지는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 인간 세포에서 (예컨대, 재조합 발현에 의해), 또는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 (예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자들을 발현시킬 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 제조될 수 있다. 또한, 인간 항체가 단쇄 항체일 때, 이는 고유한 인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는, 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결하는 링커 펩타이드, 가령, 2 내지 약 8개의 글라이신 또는 다른 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 이러한 링커 펩타이드들은 인간 기원인 것으로 간주된다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열들로부터 유래한 항체 라이브러리를 사용하여 파지 디스플레이법을 비롯한 해당 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 제조될 수 있다. 본 출원에 참고문헌으로 포함된, 미국 특허 제 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공개 특허 출원 WO 1998/46645; WO 1998/50433; WO 1998/24893; WO 1998/16654; WO 1996/34096; WO 1996/33735; 및 WO 1991/10741을 참고하라. 인간 항체는 기능적인 내인성 면역글로불린들을 발현시킬 수는 없으나, 인간 면역글로불린 유전자들을 발현시킬 수 있는 형질전환 생쥐를 사용하여 제조될 수도 있다. 본 출원에 참고문헌으로 포함된, 예컨대, PCT 공개 특허 출원 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제 5,413,923; 5,625, 126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598을 참고하라.
본 출원에서 사용되는 용어 "인간화" 항체는, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소한의 서열들을 내포하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편들 (가령, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 표적-결합 하위도메인들)인, 비-인간 (예컨대, 쥐과) 항체의 형태들을 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체는 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의, 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이며, 여기서 CDR 영역들 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린의 이들 영역들에 상응한다. 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역들은 또한 인간 면역글로불린 서열의 영역들일 수 있다. 상기 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 최소한 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린 공통 서열 부분을 또한 포함할 수 있다. 항체 인간화 방법은 해당 분야에 공지이다. 예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함된, Riechmann 외, Nature 332:323-7, 1988; 미국 특허 제: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370 to Queen 외; EP239400; PCT 공개 특허 출원 WO 91/09967; 미국 특허 제 5,225,539; EP592106; 및 EP519596을 참고하라.
본 출원에서 사용되는 용어 "소수성 측쇄"는, 예컨대, 측쇄 내부에 존재하는 화학적 모이어티들의 입체 또는 전기적 성질로 인해 물에 대한 낮은 용해도를 나타내는 아미노산 측쇄를 지칭한다. 소수성 측쇄들을 내포하는 아미노산들의 예들에는 불포화 지방족 탄화수소를 내포하는 아미노산들, 가령, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 및 메싸이오닌, 뿐만 아니라 생리학적 pH에서 정전기적으로 중성인 방향족 고리계를 내포하는 아미노산들, 가령, 트립토판, 페닐알라닌, 및 타이로신이 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "면역요법제"는 면역 관문 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하여 이러한 수용체 또는 리간드에 길항 효과를 발휘함으로써, 길항되지 않으면 면역 반응의 하향조절을 초래하게 되는 이러한 수용체 또는 리간드의 신호 전달을 감소 또는 저해하는, 본 출원에 기재된 화합물, 가령, 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체를 지칭한다. 면역요법제들에는, 조혈 세포, 가령, 림프구 (예컨대, T 세포)의 표면에서 발현되는 수용체들에 특이적으로 결합하여, 억제되지 않으면 내인성 ("자가") 항원, 가령, 종양-관련 항원에 대한 관용을 가져오게 되는, 이러한 수용체 또는 리간드에 의해 유도되는 신호전달을 억제할 수 있는 화합물들, 가령, 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체가 포함된다. 면역요법제는 상기 수용체 또는 리간드에 의해 유도되는 신호전달을, 면역요법제 부재시 나타나는 수용체 또는 리간드에 의해 유도되는 신호전달에 비해, 예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 만큼 감소시킬 수 있다. 수용체 또는 리간드 신호전달의 정도를 측정하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 분석법들에는, 그 중에서도, 예를 들어, 특정 신호 전달 경로와 관련된 단백질 발현 변형을 측정하기 위한 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 기술, 뿐만 아니라 중합효소 연쇄 반응 (PCR)-기반 기술, 가령, 정량적 PCR, 역전사 PCR, 및 특정 신호 전달 경로와 관련된 유전자 발현의 변화를 판정하는데 유용한 실시간 PCR 실험들이 포함된다. 제제가 "면역요법제"인지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 방법들에는 Mahoney 외, Cancer Immunotherapy, 14:561-584 (2015)에 기재된 분석법들이 포함되며, 이 문헌의 기재내용은 본 출원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다. 면역요법제들의 예들에는, 예컨대, OX40L, TL1A, CD40L, LIGHT, BTLA, LAG3, TIM3, Singlecs, ICOS, B7-H3, B7-H4, VISTA, TMIGD2, BTNL2, CD48, KIR, LIR, LIR 항체, ILT, NKG2D, NKG2A, MICA, MICB, CD244, CSF1R, IDO, TGF
Figure pct00009
, CD39, CD73, CXCR4, CXCL12, SIRPA, CD47, VEGF, 및 뉴로필린 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 포함된다. 추가적인 면역요법제들의 예에는, 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론 (예컨대, PEGASYS®), 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 가바펜틴, 림프계 세포 표면 수용체 및/또는 림포카인에 대한 항체, 표면 암 단백질에 대한 항체, 및/또는 보리노스타트와 같은 소분자 치료제가 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 비롯한 단일 클론으로부터 유도되는 항체를 지칭하며, 이러한 항체가 제조되는 방법은 아니다.
본 출원에서 사용되는 용어 "다중특이적 항체"는 하나 초과의 표적 항원에 대해 친화성을 나타내는 항체를 지칭한다. 다중특이적 항체는 전장 면역글로불린 분자와 유사한 구조를 가질 수 있으며 Fc 영역들, 예를 들어 IgG Fc 영역들을 포함할 수 있다. 이러한 구조에는, IgG-Fv, IgG-(scFv)2, DVD-Ig, (scFv)2-(scFv)2-Fc 및 (scFv)2-Fc-(scFv)2.가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IgG-(scFv)2의 경우, scFv는 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C- 말단 단부에 부착될 수 있다. Fc 영역들을 포함하고 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편들이 통합될 수 있는 예시적인 다중특이적 분자들은 Kontermann, 2012, mAbs 4(2):182-197, Yazaki 외, 2013, Protein Engineering, Design & 선택 26(3):187- 193, and Grote 외, 2012, in Proetzel & Ebersbach (eds.), Antibody Methods and 프로토콜, Methods in Molecular Biology vol. 901, chapter 16:247-263에 의해 보고되었으며; 이들은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 일부 구체예들에서, 항체 단편들은 IgG 또는 DVD 또는 scFv의 단편들에 기반한, Fc 영역들이 없는 다중특이적 분자들의 성분들이 될 수 있다. Fc 영역들이 없고 항체 또는 항체 단편들이 통합될 수 있는 예시적인 다중특이적 분자들에는 scFv 이량체 (디아바디), 삼량체 (트리아바디) 및 사량체 (테트라바디)가 포함되고, Fab 이량체 (접착 폴리펩타이드 또는 단백질 도메인들에 의한 접합체) 및 Fab 삼량체 (화학적으로 접합됨)는 본 출원에 참고문헌으로 포함된, Hudson 및 Souriau, 2003, Nature Medicine 9:129-134에 기재되어 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "골수-유래 억제 세포" 또는 "MDSC"는 그 중에서도, 다양한 작동자 세포 및 항원-제시 세포, 가령, T 세포, NK 세포, 수지상 세포, 및 마크로파지의 활성을 조절하는 면역계의 세포를 지칭한다. 골수 유래 억제 세포는 그 유전자 발현 프로파일에 의해 구별되며, B7-1 (CD80), B7-H1 (PD-L1), CCR2, CD1d, CD1d1, CD2, CD31 (PECAM-1), CD43, CD44, 보체 성분 C5a R1, F4/80 (EMR1), Fcγ RIII (CD16), Fcγ RII (CD32), Fcγ RIIA (CD32a), Fcγ RIIB (CD32b), Fcγ RIIB/C (CD32b/c), Fcγ RIIC (CD32c), Fcγ RIIIA (CD16A), Fcγ RIIIB (CD16b), 갈렉틴-3, GP130, Gr-1 (Ly-6G), ICAM-1 (CD54), IL-1RI, IL-4Rα, IL-6Rα, 인테그린 α4 (CD49d), 인테그린 αL (CD11a), 인테그린 αM (CD11b), M-CSFR, MGL1 (CD301a), MGL1/2 (CD301a/b), MGL2 (CD301b), 산화 질소, PSGL-1 (CD162), L-셀렉틴 (CD62L), siglec-3 (CD33), 트랜스페린 수용체 (TfR), VEGFR1 (Flt-1), 및 VEGFR2 (KDR 또는 Flk-1)로 구성된 그룹에서 선택된 단백질 및 소분자들 모두 또는 이의 서브셋을 발현시킨다. 특히, MDSC는 B7-2 (CD86), B7-H4, CD11c, CD14, CD21, CD23 (FcεRII), CD34, CD35, CD40 (TNFRSF5), CD117 (c-kit), HLA-DR, 및 Sca-1 (Ly6)으로 구성된 그룹에서 선택된 단백질을 발현시키지 않는다.
본 출원에서 사용되는 용어 "중성 TNFR2 폴리펩타이드" 및 "표현형-중성 TNFR2 폴리펩타이드"는 TNFR2에 결합하여 TNFR2 활성화에 길항 또는 작용 효과를 발휘하지 않는 폴리펩타이드 (가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편)를 지칭한다. 예를 들어, 해당 폴리펩타이드가 TNFR2에 결합하여, 예를 들어, TNFR2-발현 세포 (예컨대, T-조절 세포, TNFR2+ 암 세포, 및/또는 MDSCs)의 증식을 측정함으로써 및/또는 하나 이상의 NF
Figure pct00010
B 표적 유전자들, 가령, CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 및/또는 cIAP2/BIRC3의 발현을 측정함으로써 평가하였을 때, TNFR2 활성화를 강화시키지도 억제시키지도 않는 경우, TNFR2 폴리펩타이드는 중성 TNFR2 폴리펩타이드이다. 세포 증식 및 유전자 발현을 측정하기 위한 예시적인 분석법들은 예컨대, 각각 실시예 9와 12에 설명된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "비-고유 불변 영역"은 항체 가변 영역과 상이한 출처에서 유래하거나 또는 고유의 항체 불변 영역 서열과 상이한 아미노 서열을 가지는 인간-생성된 합성 폴리펩타이드인 항체 불변 영역을 지칭한다. 예를 들어, 비-고유 불변 영역을 내포하는 항체는 비-인간 출처 (예컨대, 생쥐, 쥐, 또는 토끼)로부터 유래한 가변 영역 및 인간 출처 (예컨대, 인간 항체 불변 영역)로부터 유래한 불변 영역, 또는 또 다른 영장류, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 고양이, 개, 기니아 피그, 소과 군의 구성원 (가령, 그 중에서도, 소, 들소, 버팔로, 엘크, 및 야크), 암소, 양, 말, 또는 들소에서 유래한 불변 영역을 가질 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은, 서열들을 정렬시키고, 필요에 따라 최대 서열 동일성 퍼센트를 얻기 위해 갭을 도입시킨 후 (예컨대, 갭은 최적 정렬을 위해 후보 및 기준 서열들 중 하나 또는 모두에 도입될 수 있고 및 비-상동성 서열들은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음) 기준 서열의 아미노산 (또는 핵산) 잔기들과 동일한 후보 서열의 아미노산 (또는 핵산) 잔기들의 백분율을 지칭한다. 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 해당 업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 구현될 수 있다. 숙련된 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 예를 들어, 후보 서열과 비교하기 위하여 정렬되는 기준 서열은 후보 서열이 후보 서열의 전체 길이 또는 후보 서열의 인접 아미노산 (또는 핵산) 잔기들 중 선택된 부분에 걸쳐 50% 내지 100% 서열 동일성을 나타냄을 보여줄 수 있다. 비교를 위해 정렬되는 후보 서열의 길이는, 예를 들어, 기준 서열 길이의 최소한 30%, (예컨대, 30%, 40, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%) 일 수 있다. 후보 서열에서의 위치가 기준 서열에서 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되면, 이 때 이 분자들은 그 위치에서 동일하다.
본 출원에서 사용되는 용어 "영장류화 항체"는 프레임워크 영역s from 영장류-유래 항체의 프레임워크 영역들 및 비-영장류 출처의 항체의 다른 영역들, 가령, CDRs 및/또는 불변 영역들을 포함하는 항체를 지칭한다. 영장류화 항체 제조 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,658,570; 5,681,722; 및 5,693,780을 참고하라. 예를 들어, 본 발명의 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-영장류 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR들을 영장류의 하나 이상의 프레임워크 영역들을 내포하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 삽입함으로써 제조될 수 있다.
본 출원에서 폴리뉴클레오타이드 단편과 관련하여 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 단편들이 이러한 2개의 폴리뉴클레오타이드 단편들에 의해 인코딩되는 아미노산 서열들이 프레임 안에 유지되도록 결합됨을 의미하고자 한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "약물동역학적 프로파일"은 환자에게 약물 투여 후 시간에 따른 약물의 흡수, 분포, 대사 및 제거율을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 TNFR2의 "열성 길항제"는 TNFR2 작용제, 가령, TNFα, 또는 IL-2의 부재시 측정할 때 동일한 길항제의 저해 정도와 비교하여 TNFR2 작용제, 가령, TNFα, 또는 IL-2의 존재하에서 TNFR2 활성화를 유의하게 더 덜한 정도로 저해하는 길항제 (예컨대, 길항 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)이다. 예를 들어, TNFR2 길항제는, TNFR2 작용제, 가령, TNFα, 또는 IL-2의 부재하에 동일한 분석법으로 측정한 상기 길항제의 IC50에 비해, TNFR2 작용제 (예컨대, TNFα) 또는 IL-2의 존재하에서 상기 길항제의 IC50이 예컨대, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 또는 그 이상 만큼 증가하는 경우 열성 길항제이다. TNFR2 활성화의 저해는, 예를 들어, TNFR2+ 세포, 가령, T-조절 세포, TNFR2를 발현시키는 암 세포, 또는 골수-유래 억제 세포의 증식 저해를 측정함으로써, 뿐만 아니라 NF
Figure pct00011
B 신호전달 저해를 측정함으로써 (예컨대, 종래의 유전자 발현 분석법으로 CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 및 cIAP2/BIRC3로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 유전자들의 발현 감소를 모니터링함으로써) 평가될 수 있다. TNFR2 활성화를 모니터하기 위해 사용될 수 있는 세포 증식 분석법 및 유전자 발현 분석법은 본 출원에, 예를 들어, 각각 실시예 9 및 12에 기재되어 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 그 외 다른 발현 제어 요소들 (예컨대, 폴리아데닐화 신호)을 포함한다. 이러한 조절 서열들은, 예를 들어, 본 출원에 참고문헌으로 포함되는 Goeddel, 유전자 Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)에 기재되어 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "scFv"는 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들이 결합되어 하나의 사슬을 형성하고 있는 단쇄 Fv 항체를 지칭한다. scFv 단편들은 링커에 의해 분리된 항체 경쇄 (VL)의 가변 영역 (예컨대, CDR-L1, CDR-L2, 및/또는 CDR-L3) 및 항체 중쇄 (VH)의 가변 영역 (예컨대, CDR-H1, CDR-H2, 및/또는 CDR-H3)을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 내포한다. scFv 단편의 VL 및 VH 영역을 결합시키는 링커는 단백질생성 아미노산들로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다. 다른 링커들이 scFv 단편의 단백질가수분해에 대한 내성을 증가시키기 위해 (예컨대, D-아미노산들을 내포하는 링커들), scFv 단편의 용해도를 향상시키기 위해 (예컨대, 친수성 링커, 가령, 폴리에틸렌 글리콜-내포 링커들 또는 반복되는 글라이신 및 세린 잔기들을 내포하는 폴리펩타이드), 분자의 생물물리학적 안정성을 개선하기 위해 (예컨대, 분자내 또는 분자간 이황화물 결합을 형성하는 시스테인 잔기들을 내포하는 링커), 또는 scFv 단편의 면역원성을 약화시키기 위해 (예컨대, 당화 부위들을 내포하는 링커들) 사용될 수 있다. scFv 분자들은 해당 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 미국 특허 5,892,019, Flo 외, (유전자 77:51, 1989); Bird 외, (Science 242:423, 1988); Pantoliano 외, (Biochemistry 30:10117, 1991); Milenic 외, (Cancer Research 51:6363, 1991); 및 Takkinen 외, (Protein Engineering 4:837, 1991)에 기재되어 있다. scFv 분자의 VL 및 VH 도메인들은 하나 이상의 항체 분자들로부터 유래할 수 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 본 발명의 scFv 분자들의 가변 영역들이 이들이 유래하는 항체 분자로부터의 아미노산 서열이 달라지도록 변형될 수 있음을 또한 이해할 것이다. 예를 들어, 한 구체예에서, 아미노산 잔기들에서의 보존적 치환 또는 변화를 가져오는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환들을 생성할 수 있다 (예컨대, CDR 및/또는 프레임워크 잔기들에서). 대안적으로 또는 추가적으로, 항원 결합을 최적화하기 위하여, 해당 분야에 알려진 기술을 사용하여 CDR 아미노산 잔기들에 돌연변이들이 생성된다. scFv 단편들은, 예를 들어, 참고문헌으로 본 출원에 포함되는 WO 2011/084714에 기재되어 있다.
본 출원에서 사용되는 어구 "특이적으로 결합하다"는, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 의해 특수하게 인식되는 단백질 및 다른 생물학적 분자들의 이종 집단에서 항원의 존재에 결정적인 결합 반응을 지칭한다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 nM 미만의 KD로 항원에 결합할 것이다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 최대 100 nM (예컨대, 1 pM 내지 100 nM)의 KD로 항원에 결합할 것이다. 특정 항원 또는 이의 에피토프에 특이적 결합을 나타내지 않는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특정 항원 또는 이의 에피토프에 대해 100 nM 초과 (예컨대, 500 nm, 1 μM, 100 μM, 500 μM, 또는 1 mM 초과)의 KD를 나타낼 것이다. 특정 단백질 또는 탄수화물과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선별하기 위해 다양한 면역분석 형식들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석법은 단백질 또는 탄수화물과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선별하기 위해 관례적으로 사용된다. 특이적 면역활성을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 면역분석 형식 및 조건들의 설명에 관하여, Harlow & Lane, Antibodies, A Labo쥐ory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988) 및 Harlow & Lane, Using Antibodies, A Labo쥐ory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)를 참고하라.
본 출원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 본 출원에 기재된 특정 질환 또는 병태 (가령, 암 또는 감염성 질환)에 대한 치료를 받는 유기체를 지칭한다. 대상체 및 환자들의 예들에는, 질환 또는 질환, 예를 들어, 세포 증식 이상, 가령, 암 또는 감염 질환에 대한 치료를 받는, 포유동물, 그 중에서도, 가령, 인간, 영장류, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 고양이, 개, 기니아 피그, 소과 군의 구성원들 (가령, 그 중에서도 소, 들소, 버팔로, 엘크, 및 야크), 암소, 양, 말, 및 들소가 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "형질감염"은 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 널리 다양한 임의의 기술들, 예컨대, 전기천공, 리포펙션, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE- 덱스트란 형질감염 등을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료를 지칭하며, 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애, 가령, 세포 증식 장애, 가령, 암, 또는 감염 질환의 진행을 예방 또는 지연시키는 것 (늦추는 것)이다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과들에는 증상들의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 저하, 질환 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도 (부분적이든 또는 전체적이든), 탐지가능한지 또는 탐지불가능한지 여부가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료를 필요로하는 사람들은 이미 병태 또는 장애를 가지고 있는 사람들, 뿐만 아니라 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 사람들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "종양 미세환경" 종양을 형성하는 암 세포 및 종양 내부에 있거나 암 세포와 경계를 이루거나 이를 둘러싸고 있는 비-암 세포, 분자, 및/또는 혈관들의 집단을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리", "TNFR 수퍼패밀리" 또는 "TNFRS"는 카르복시-말단 세포내 도메인 및 공통의 시스테인 풍부 도메인 (CRD)으로 특징되는 아미노-말단 세포외 도메인을 가지는 I형 막경유 단백질의 그룹을 지칭한다. TNFR 수퍼패밀리는 TNF 수퍼패밀리의 하나 이상의 리간드들에 대한 결합의 결과로 세포 신호전달을 매개하는 수용체들을 포함한다. TNFR 수퍼패밀리는 다음과 같은 2개의 하위그룹들로 나뉠 수 있다: 세포내 사멸 도메인을 내포하는 수용체들 및 이러한 도메인이 없는 수용체들. 사멸 도메인은 수용체 활성화 후 세포사멸 신호 전달 연쇄반응을 전파시키는 80개의 아미노산 모티프이다. 세포내 사멸 도메인을 내포하는 예시적인 TNFR 수퍼패밀리 구성원들에는 TNFR1은 포함되는 반면, TNFR2는 이러한 도메인을 내포하지 않는 TNFR 수퍼패밀리 단백질을 대표한다. TNFR 수퍼패밀리의 구성원들에는 TNFR1, TNFR2, RANK, CD30, CD40, 림포톡신 베타 수용체 (LT-
Figure pct00012
R), OX40, Fas 수용체, 디코이(Decoy) 수용체 3 (DCR3), CD27, 4-1BB, 사멸 수용체 4 (DR4), 사멸 수용체 5 (DR5), 디코이 수용체 1 (DCR1), 디코이 수용체 2 (DCR2), 오스테오프로테그린, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, 헤르페스바이러스 유입 매개인자, 신경 성장 인자 수용체, B 세포 성숙화 항원, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련, TROY, 사멸 수용체 6 (DR6), 사멸 수용체 3 (DR3), 및 엑토디스플라신 A2 수용체가 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "가변 영역 CDR"은 서열 또는 구조 기반 방법들을 사용하여 확인된 CDR 또는 상보성 결정 영역 내 아미노산들을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 영역들 내에서 발견되는 비인접 항원-결합 부위들을 지칭한다. 이러한 특정 영역들은 Kabat 외, J. Biol. Chem. 252:6609-6616, 1977 및 Kabat, 외, Sequences of Proteins of 면역학적 Interest, Fifth Edition, 미국 보건복지부, NIH 간행물 제 91 -3242, 1991에 의해; Chothia 외, (J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987)에 의해 설명된 바 있으며, MacCallum 외, (J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996)는 아미노산 잔기들을 서로 비교시 아미노산 잔기들의 중첩 또는 서브셋을 이러한 정의에 포함시킨다. 특정 구체예들에서, 용어 "CDR"은 서열 비교에 기반하여 Kabat에 의해 정의된 CDR이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "벡터"는 핵산 벡터, 예컨대, DNA 벡터, 가령, 플라스미드, RNA 벡터, 바이러스 또는 그 외 적합한 복제단위 (replicon) (예컨대, 바이러스 벡터)를 포함한다. 외인성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 원핵 또는 진핵 세포로 전달하기 위한 다양한 벡터들이 개발되었다. 이러한 발현 벡터들의 예들은, 예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함되는 WO 1994/11026에 개시되어 있다. 본 발명의 발현 벡터들은 폴리뉴클레오타이드 서열, 뿐만 아니라, 예컨대, 포유동물 세포의 게놈에 이들 폴리뉴클레오타이드 서열들을 통합 및/또는 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 추가 서열 요소들을 내포한다. 본 발명의 항체 및 항체 단편들을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 특정 벡터들에는 유전자 전사를 지시하는 조절 서열들, 가령, 프로모터 및 인핸서 영역들을 내포하는 플라스미드들이 포함된다. 항체 및 항체 단편들의 발현을 위한 그 외 다른 유용한 벡터들은 이들 유전자들의 번역 속도를 향상시키는 또는 유전자 전사로부터 생기는 mRNA의 안정성 또는 핵 방출을 개선시키는 폴리뉴클레오타이드 서열들을 내포한다. 이들 서열 요소들에는, 예컨대, 발현 벡터로 운반되는 유전자의 효율적인 전사를 지시하기 위한 5' 및 3' 비번역 영역들, 내부 리보솜 유입점 (IRES), 및 폴리아데닐화 신호 부위가 포함된다. 본 발명의 발현 벡터들은 또한 이러한 벡터를 내포하는 세포를 선별하기 위한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 내포할 수도 있다. 적합한 마커의 예들에는 항생제, 가령, 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 또는 노르세오트리신에 대한 내성을 인코딩하는 유전자들이 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "VH"는 Fv, scFv, 또는 Fab의 중쇄를 비롯한, 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL"은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 경쇄를 비롯한, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다. 항체 (Abs) 및 면역글로불린 (Igs)은 동일한 구조적 특성을 가지는 당단백질이다. 항체는 특정 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린들은 표적 특이성이 없는 항체 및 그 외 다른 항체-유사 분자들 모두를 포함한다. 고유 항체 및 면역글로불린들은 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 고유 항체의 각 중쇄는 아미노 말단에서 수많은 불변 도메인들을 수반하는 가변 도메인 (VH)을 가진다. 고유 항체의 각 경쇄는 아미노 말단에서 가변 도메인 (VL) 그리고 카르복시 말단에서 불변 도메인을 가진다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B는 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1의 중쇄 및 경쇄들의 DNA 및 아미노산 서열들을 보여준다. 도 1A는 TNFRAB1의 중쇄를 인코딩하는 DNA 서열 (상부) 및 이러한 중쇄의 아미노산 서열 (하부)을 보여준다. 3개의 상보성 결정 영역 (CDRs)의 아미노산 서열들은 볼드체로 나타낸다. 도 1B는 TNFRAB1의 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열 (상부) 및 이러한 경쇄의 아미노산 서열 (하부)을 보여준다. 3개의 CDRs의 아미노산 서열들은 볼드체로 나타낸다.
도 2A 및 2B는 인간 TNFR2의 아미노산 서열을 보여준다 (서열 번호: 7). 특히, 인간 TNFR2는 본 출원에서 위치 1에서 N-말단 메싸이오닌으로 시작하여 위치 461에서 C-말단 세린으로 끝나도록 넘버링된다 (서열 번호: 7). All 기준s to TNFR2 내부의 아미노산 위치들은 모두 도 2A 및 2B에 나타낸 TNFR2 넘버링 도식 내용을 참고하여 지칭된다. (도 2A) 음영표시된 잔기들 KCRPGFGV (서열 번호: 20)는 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프를 정의한다. 유의하게, 밑줄표시된 잔기들 KCSPG (서열 번호: 12)에 결합하지 않고 이러한 영역 내 잔기들에 선택적으로 결합하는 TNFRAB1의 능력은 TNFR2 신호전달의 길항작용을 촉진시킨다. 밑줄표시된 잔기들을 내포하는 에피토프에 대한 결합이 TNFR2 항체 중에서의 저해 활성 약화와 상관관계가 있었으므로, 밑줄표시된 잔기들의, 또는 근방의 영역 내에 있는 잔기들에 대한 본 발명의 항체의 열등한 친화성 (또는 친화성 없음)은 이들 항체의 길항 활성과 일치한다. TNFRAB1은 음영표시된 잔기들 CKPCAPGTF (서열 번호: 21)을 포함하는 에피토프에 추가로 결합한다. 이들 잔기들은 일차 서열에서 KCRPG 모티프와 연속이지는 않지만, 이들은 TNFR2의 3차원 3차 구조에서 공간적으로 근접하게 위치하기 쉽고 본 발명의 길항 TNFR2 항체와 상호작용하기에 적절하게 위치될 수 있다 (도 4 참고). (도 2B) 음영표시된 잔기들 CAPLRKRCR (서열 번호: 11)은 길항 TNFR2 항체 TNFRAB2에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프를 정의한다. TNFRAB2는 불연속 에피토프의 일부분 일 수 있는, 잔기들 DSTYTQL (서열 번호: 8), PECLSCGS (서열 번호: 9), 및 RICTCRPG (서열 번호: 10)를 포함하는 하나 이상의 영역들에 추가적으로 결합할 수 있다. 이들 잔기들은 일차 서열에서 연속이지는 않지만, 이들은 TNFR2의 3차원 3차 구조에서 공간적으로 근접하게 위치하기 쉽고 본 발명의 길항 TNFR2 항체와 상호작용하기에 적절하게 위치될 수 있다.
도 3A 및 3B는 TFNR2 내의 다양한 연속 및 불연속 에피토프에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 친화성을 결정하기 위하여 수행되었던 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 실험들로부터 얻은 원 데이터를 보여주는 표이다 (실시예 1 참고). 원 발광 값들을 표의 4번째 열 (오른쪽)에 나타낸다. 나타낸 펩타이드 서열들은 TNFRAB1 (도 3A) 또는 TNFRAB2 (도 3B)와 상호작용하는 TNFR2 내 입체형태 에피토프의 일부분을 내포하는 서열들을 나타낸다. 단일-숫자 코드 "2"가 있는 아미노산 잔기들은 펩타이드 합성 동안 아세트아미도메틸 (ACM) 모이어티로 싸이올 위치에서 화학적으로 보호되어 있었던 시스테인 잔기들을 표시한다. 이들 잔기들은 브로모메틸-내포 친전자체와 반응성이지 않으므로 고리화 및 이고리화 단계 동안 교차-결합하지 않았다. 표에서 3번째 열은 펩타이드 스캐폴드의 일반 구조를 나타낸다. "CYS.S"는 27-잔기 펩타이드를 나타내며 여기서 이러한 펩타이드의 위치 1-11 및 17-27은 UniProt 엔트리 P20333으로 이용가능한 정보에 기초하여 고유 단백질에서 이황화물 다리를 형성하는 시스테인 잔기들을 내포하는 TNFR2로부터 유래한 11-잔기 펩타이드를 나타낸다. 서열 Gly-Gly-Ser-Gly-Gly는 이 그룹의 펩타이드의 위치 12-16에 통합되었다. 이황화물 다리들을 형성하지 않는 고유 Cys 잔기들은 아세트아미도메틸 (ACM) 보호 그룹으로 보호되어 있으며 단일-숫자 코드 "2"로 표시된다.
도 4는 길항제 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1 및 TNFRAB2와 상호작용할 수 있는 TNFR2 내부의 입체형태 에피토프 , 뿐만 아니라 길항제 TNFR2 항체와 상호작용하지 않는 잔기들을 도시한 도식도이다. KCSPG 모티프는 상기 도면의 상부 왼쪽에 확대하여 나타내고; KCRPG 모티프는 상기 도면의 오른쪽에 확대하여 나타낸다. 단백질의 외부 표면은 TNFR2의 반 데르 발스 표면을 표시한다. 도 4는 TNFR2의 X-선 결정 구조로부터 분리된 TNFR2의 단량체를 제시한다 (PDB ID: 3ALQ, Mukai, 외, Sci. Signal., 3:ra83, 2010).
도 5는 TNFRAB1이 시험관내에서 배양된 T-조절 세포의 성장을 억제함을 보여주는 그래프이다. 값들은 특정 조건에 대해 세포 노출 후 배양물에 남아있는 생존성 T-조절 세포의 비처리된 대조 세포에 대한 분율을 나타낸다. 제일 왼쪽에 도시된 막대들은 200 U/ml의 IL-2 (대조), TNFα (20 ng/ml), TNFR2 작용제 (2.5 μg/ml), 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 (2.5 μg/ml), 또는 길항 TNFR2 항체 TNFRAB2 (2.5 μg/ml)로 처리된 T-조절 세포를 나타낸다. 왼쪽에서 2번째에 나타낸 막대들은 TNFRAB1으로 세포 처리시 T-조절 생존력의 용량-의존적 변이를 도시한다. 오른쪽에서 2번째 나타낸 막대들은 TNFα의 성장-촉진 활성을 저해하는 TNFRAB1의 능력을 보여준다. T-조절 세포들을 일정 농도의 TNFα (20 ng/ml) 및 변화하는 농도의 TNFRAB1 (from 0.0008 to 25 μg/ml)으로 처리하였다. TNFRAB1은 농도-의존 방식으로 TNFα유도 증식을 억제할 수 있었으며, 이는 TNFRAB1이 TNFR2를 길항함을 나타내는 것이다. 제일 오른쪽에 도시된 막대들은 T-조절 세포의 성장에 대한 TNFα의 효과를 나타낸다. 20 ng/ml TNFα로 T-조절 세포를 배양한 결과 비처리된 세포에 비해 대략 130% 증식을 가져왔다.
도 6A는 T-조절 세포증식을 용량-의존 방식으로 유도하는 TNFα의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 6B는 T-조절 세포증식을 용량-의존 방식으로 유도하는 IL-2의 능력을 보여주는 그래프이다. 최대 48 시간 동안 TNFα 및 IL-2 (200 U/ml)와 함께 갓 분리된 인간 CD4+ 세포의 배양은 용량-의존 방식으로 T-조절 세포 확대를 유도하며 IL-2의 존재는 T-조절 확대를 촉진함에 중요하다.
도 6C는 T-조절 세포증식에 대한 TNFα 및 우성 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다. x-축의 값들은 IL-2로 처리된 샘플에 대한 T-조절 세포 양의 퍼센트 변화를 나타낸다.
도 6D 및 6E는 T-조절 세포증식에 대한 TNFRAB2의 효과를 결정하기 위해 수행된 중복 실험들의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6F 및 6G는 T-조절 세포증식에 대한 TNFRAB1의 효과를 결정하기 위해 수행된 중복 실험들의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7A는 CD4+ T-조절 세포의 증식에 대한 TNFα의 효과를 보여주는 그래프이다. x-축 값들은 TNFα로 처리시 T-조절 세포 양의 퍼센트 변화를 IL-2 처리와 비교하여 나타낸다.
도 7B는 TNFα의 존재 및 부재시 T-조절 세포증식을 우성적으로 저해하는 TNFRAB1의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 7C는 TNFα의 존재 및 부재시 T-조절 세포증식을 저해하는 TNFRAB2의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 7D 및 7E는 TNFα의 존재 및 부재시 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFR2 우성 길항제의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8A는 T-조절 세포의 증식을 일반적으로 전반적으로 저해하는 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 8B는 T-조절 세포증식에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 효과를 IL-2 처리에 의해 유도되는 효과와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 8C는 총 T-조절 양에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8D는총 T-조절 양에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 효과를 IL-2 처리에 의해 유도되는 효과와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 8E는 고-친화성 상태의 CD25 (CD25고) 및 저-친화성 상태의 CD45RA (CD45RA저)를 발현시키는 활성화된 T-조절 세포 (aT-조절 세포)에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8F는 CD45RO고 및 CD25고.를 발현시키는 T-조절 세포 집단에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8G는 CD25고-발현 CD4+ T 세포에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8H는 CD25고i-발현 T-조절 세포에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다. 이들 데이터는 활성화된 (aT-조절) 및 휴지기 (rT-조절) 세포 모두는 TNFRAB1 또는 TNFRAB2 처리시 저해되는 반면, 길항 TNFR2 항체는 바람직하게는 T-조절 세포의 증식을 저해함을 나타낸다.
도 9A는 다양한 표현형들의 T-조절 세포 증식에 대한, T-조절 세포 (예컨대, TNFα, IL-2, 및 TNFR2 작용제) 뿐만 아니라 TNFR2 길항제, TNFRAB2의 성장을 지시하는 물질들의 효과를 나타내는 일련의 2-차원 유세포분석 플롯이다. TNFR2 길항제 항체 처리는 바람직하게는 CD25Hi-발현 T-조절 세포의 증식을 저해한다. IL-2 (200 U/ml) 단독, TNFα (20 ng/ml), 또는 TNFR2 길항제 항체 (12.5 μg/ml)와 함께 최대 48시간 배양 후 TNFR2를 발현시키는 CD4+, CD25고+ 세포의 비율을 나타낸다.
도 9B는 TNFR2의 분비에 대한 TNFRAB1의 효과를 보여주는 그래프이며, pg/ml 단위로 나타낸다.
도 9C is는 카르복시플루오레세인 (CFSE) 표지에 의하여 측정된 CD8+ T 세포 수에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 일련의 1-차원 유세포분석 플롯이다.
도 10A는 전장 TNFRAB1 (IgG) 뿐만 아니라 TNFRAB1의 F(ab')2 단편의 T-조절 세포 증식 저해능력을 보여주는 그래프이다.
도 10B는 도 10A는 전장 TNFRAB2 (IgG) 뿐만 아니라 TNFRAB2의 F(ab')2 단편의 T-조절 세포 증식 저해능력을 보여주는 그래프이다. 이들 데이터는 이들 길항 TNFR2 항체의 Fab 영역들의 TNFR2에 대한 특이적 결합은 이들 항체의 Fc 영역의 비-특이적 결합 보다는 T-조절 세포 성장을 조절하는 원인이 될 가능성이 있음을 나타낸다. IL-2 (200 U/ml)와 TNFRAB1 또는 TNFRAB2의 전 항체 또는 F(ab')2 단편과 함께 최대 48시간 동안 갓 분리된 CD4+ 세포의 배양은 TNFα (20 ng/ml)의 존재 또는 부재시 T-조절 세포의 유사한 용량-의존 저해를 생성한다.
도 10C는 용량-반응 분석 결과를 보여주는 그래프이며 여기서 T-조절 세포들은 항-IgG 항체의 존재하에 TNFRAB1로 처리되었다.
도 10D는 용량-반응 분석 결과를 보여주는 그래프이며 여기서 T-조절 세포들은 항-IgG 항체의 존재하에 TNFRAB2로 처리되었다. TNFR2 길항제 항체에 의해 유도된 T-조절 세포 성장의 용량-의존적 억제는 항-IgG 분자들의 존재에 의해 영향을 받지 않았으며, 이는 TNFRAB1 또는 TNFRAB2에 의해 매개된 비-특이적 교차-결합은 T-조절 세포증식에 대한 이들 항체의 저해 효과의 원인이 아님을 나타내는 것이다. TNFR2 길항제 항체 (0.02 - 25 μg/ml)와 교차 결합 항체 (2.5 μg/ml)의 공-배양은 T-조절 증식을 용량-의존 방식으로 저해하는 항체의 능력에 영향을 주지 않는다. 데이터를 하나의 대표예로 제시한다.
도 11A는 TNFRAB1 발현 후 수행된 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 폴리아크릴아마이드의 이미지이다.
도 11B는 TNFRAB2 발현 후 수행된 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 폴리아크릴아마이드의 이미지이다. 환원 및 비-환원 TNFR2 길항제 항체 (2.5 μg)의 분석을 보여준다.
도 11C는 TNFRAB1의 F(ab')2 단편들 발현 후 수행된 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 폴리아크릴아마이드의 이미지이다.
도 11D는 TNFRAB2의 F(ab')2 단편들 발현 후 수행된 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 폴리아크릴아마이드의 이미지이다. F(ab')2 단편 준비 전과 후의 TNFR2 길항제 항체 분석을 보여준다.
도 12A는 TNFα 및 림포톡신의 발현에 대한 TNFR2 길항제 항체의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 12B 는 FoxP3 및 CD25의 발현에 대한 TNFR2 길항제 항체의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 12C는 NF
Figure pct00013
B 활성화를 촉진시키는 다음 유전자들의 발현에 대한 TNFR2 길항제 항체의 효과를 보여주는 그래프이다: 보존성 헬릭스-루프-헬릭스 유비퀴토스 키나아제 (CHUK), B 세포 억제인자 엡실론에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자 인핸서의 핵인자 (NFKBIE), B 세포 얼제인자 알파에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자 인핸서의 핵인자 (NFKBIA), 미토겐-활성화 단백질 키나아제 11 (MAP3K11), TNFα 수용체-관련 인자 2 (TRAF2), TNFα 수용체-관련 인자 3 (TRAF3), 전사 인자 relB, 및 배큘로바이러스 IAP 반복 내포 3 단백질 (cIAP2/BIRC3). IL-2 (50 U/ml)를 TNFα (20 ng/ml) 또는 TNFR2 길항제 (2.5 μg/ml)와 함께 3 시간 동안 배양 후 새로운 CD4+ 세포로부터 분리된 RNA를 실시간 PCR 분석을 사용하여 탐지하였다.
도 12D는 세포-기반 ELISA 분석을 사용하여 측정된 NF
Figure pct00014
B 활성화를 억제하는 TNFRAB1의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 12E는 세포-기반 ELISA 분석을 사용하여 측정된 NF
Figure pct00015
B 활성화를 억제하는 TNFRAB2의 능력을 보여주는 그래프이다. 인산화 RelA/NF
Figure pct00016
B p65를 NF
Figure pct00017
B 활성의 마커로 사용하였다. 길항 TNFR2 항체로 T-조절 세포를 처리한 결과 TNFα로 처리한 것과 비교하여 NF
Figure pct00018
B 활성화를 약화시켰다. 새로운 CD4+ 세포를 IL-2 (200 U/ml) 및 다양한 농도의 TNFα (0.2 - 20 ng/ml) 또는 TNFR2 길항제 항체 (0.02 - 25 μg/ml)와 함께 10분 배양 후 세포-기반 ELISA를 사용하여 인산화 RelA/NFĸB p65를 측정하였다. RelA/NFĸB p65의 인산화는 용량-의존 방식으로 TNFα에 의해 유도되고 TNFR2 길항제 mAbs에 의해 저해된다.
도 13A는 TNFR2에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 결합의 동적 및 열역학적 매개변수를 보여주는 표이다. 결합 속도 상수는 M-1s-1 단위로 표시되고, 해리 속도 상수는 s-1 단위로 표시되고, 평형 상수는 M 단위로 표시된다.
도 13B는 인간 TNFR2 내 다양한 선형 펩타이드 서열들에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 친화성을 보여주는 표이다. 상대 친화성은 일련의 "+" 기호로 나타내고, 이 기호의 양이 많을 수록 친화성 값들이 상승함을 나타낸다. ELISA 결합 실험들로부터 유래한 원 데이터는 "판독" 컬럼에 제공된다.
도 13C는 인간 TNFR2 내 다양한 선형 펩타이드 서열들에 대한 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 친화성에 대한 TNFα의 효과를 보여주는 표이다. 상대 친화성은 일련의 "+" 기호로 나타내고, 이 기호의 양이 많을 수록 친화성 값들이 상승함을 나타낸다. ELISA 결합 실험들로부터 유래한 원 데이터는 "판독" 컬럼에 제공된다.
도 14A 및 14B는 TNFR2 활성을 부드럽게 저해하는 열성-TNFR2 길항제 항체 (열성-길항제 TNFR2 항체 A)의 T-조절 세포의 증식에 대한 효과를 결정하기 위해 수행된 중복 실험들의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14C 및 14D는 TNFR2 활성을 부드럽게 저해하는 제 2 열성-TNFR2 길항제 (열성-길항제 TNFR2 항체 B)의 T-조절 세포의 증식에 대한 효과를 결정하기 위해 수행된 중복 실험들의 결과를 보여주는 그래프이다. 이들 열성-길항제 항체들은 NF
Figure pct00019
B 활성화를 초래하는 TNFR2 삼량체화를 방지하기 위하여 TNFR2의 외부 영역에 대해 상승되었다.
도 15A는 인간 TNFR2의 역-평행 이량체 및 평행 이량체의 3차원 구조를 보여주는 구조 모델이다.
도 15B는 TNFα-TNFR2 복합체의 3차원 구조를 보여주는 구조 모델이다. 음영표시된 잔기들은 TNFRAB1에 의해 결합되는 인간 TNFR2 내부의 아미노산들을 나타낸다. 단백질들은 반 데르 발스 표면 아래 리본 형태로 묘사된다. 본 출원에 기재된 데이터는, TNFR2에 역-평행 입체형태로 결합하는 전 항체 또는 이의 F(ab')2 단편에 있어서, TNFR2 수용체는 표시된 아미노산 모티프들에서 상기 항체 또는 이의 단편에 결합하게 됨을 명확하게 보여준다. 평행 이량체의 결합 부위들은 서로 너무 가까우므로 항체 결합을 방해하게 될 것이다. 더욱이, 삼량체 TNFα-TNFR2 복합체는 길항 TNFR2 항체에 의해 결합되는 에피토프들을 차폐시키는데, 이는 이들 잔기들은 삼량체 구조의 내부 안에 위치하기 때문이다.
도 15C는 공지의 문헌에 기재된 TNFR2의 삼량체 구조 모델을 삼량체 TNF를 내포한 삼량체로서 보여주는 이미지이다. 이 구조에서 열성-길항제 TNFR2 항체 A 및 B에 의해 결합되는 인간 TNFR2 내 아미노산들을 나타내는 음영표시된 잔기들 또한 도시된다.
도 16A는 난소 암 환자로부터 분리된 T-조절 세포 (회색 음영) 및 난소 암이 아닌 대상체로부터 분리된 T-조절 세포 (검은색 음영)의 증식에 대한 TNFRAB1의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 16B는 난소 암 환자로부터 분리된 T-조절 세포 (회색 음영) 및 난소 암이 아닌 대상체로부터 분리된 T-조절 세포 (검은색 음영)의 증식에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17A는 난소 암이 아닌 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB1의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17B는 난소 암이 아닌 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17C는 난소 암 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB1의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17D는 난소 암 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17E는 난소 암이 아닌 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB1의 효과를 보여주는 그래프이다 (도 17A에 대한 중복 데이터 세트).
도 17F는 난소 암이 아닌 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다 (도 17B에 대한 중복 데이터 세트).
도 17G는 난소 암 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB1의 효과를 보여주는 그래프이다 (도 17C에 대한 중복 데이터 세트).
도 17H는 난소 암 대상체로부터 분리된 T-조절 세포의 증식에 대한 TNFRAB2의 효과를 보여주는 그래프이다 (도 17D에 대한 중복 데이터 세트).
도 18A는 12개 쥐과 항체의 TNFR2 결합 친화성을 결정하기 위한 ELISA-기반 결합 분석법으로부터 얻은 형광 값들을 보여주는 표이다. 12개 항체들을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 1 내지 12열에 배열하고 플레이트의 A 내지 F 행에 연속 희석시켰다.
도 18B는 N-말단에서 소 혈청 알부민 (BSA)에 결합되는 아미노산 서열 LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285)을 가지는 표적 펩타이드 1에 대한 12개 쥐과 항체의 친화성을 결정하기 위한 ELISA-기반 결합 분석법으로부터 얻은 형광 값들을 보여주는 표이다. 12개 항체들을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 1 내지 12열에 배열하고 플레이트의 A 내지 F 행에 연속 희석시켰다.
도 18C는 C-말단에서 BSA에 결합되는 아미노산 서열 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286)을 가지는 표적 펩타이드 2에 대한 12개 쥐과 항체의 결합 친화성을 결정하기 위한 ELISA-기반 결합 분석법으로부터 얻은 형광 값들을 보여주는 표이다. 12개 항체들을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 1 내지 12열에 배열하고 플레이트의 A 내지 F 행에 연속 희석시켰다.
도 19는 관련없는 TNFR2 에피토프에 대한 12개 쥐과 항체의 결합 친화성을 결정하기 위한 ELISA-기반 결합 분석법으로부터 얻은 형광 값들을 보여주는 표이다. 12개 항체들을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 1 내지 12열에 배열하고 플레이트의 A 내지 F 행에 연속 희석시켰다.
도 20은 TNFR2A3에 대한 표적 펩타이드 1 (LRKCRPGFGVA, 서열 번호: 285) 및 표적 펩타이드 2 (VVCKPCAPGTFSN, 서열 번호: 286)의 BSA 접합체들의 친화성을 결정하기 위한 ELISA-기반 결합 분석법으로부터 얻은 형광 값들을 보여주는 표이다.
도 21A는 IL-2, TNFα, TNFR2 작용제, 및 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB2와 배양 후 배양된 T-조절 세포 집단에서의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 21B는 IL-2, TNFα, TNFR2 작용제, 및 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1와 배양 후 배양된 T-조절 세포 집단에서의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 21C는 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2와 배양 후 배양된 T 작동자 세포 집단에서의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 21D 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1과 배양 후 배양된 OVCAR3 세포, TNFR2-발현 난소 세포 암 계통 집단에서의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 22A는 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1와 배양 후 난소 암을 앓고 있는 환자 또는 암이 없는 인간 대상체로부터 분리된 샘플에서 T-조절 세포 집단의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 22B는 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1와 배양 후 난소 암을 앓고 있는 환자 또는 암이 없는 인간 대상체로부터 분리된 샘플에서 T 작동자 세포 집단의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 23A는 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1와 배양 후 암이 없는 인간 대상체 또는 피부 T 세포 림프종을 앓고 있고 면역요법제로 치료중인 환자로부터 분리된 샘플에서 T 작동자 세포 집단에서의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 23B는 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1와 배양 후 암이 없는 인간 대상체 또는 피부 T 세포 림프종을 앓고 있고 면역요법제로 치료중인 환자로부터 분리된 샘플에서 T-조절 세포 집단에서의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
도 23C는 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1와 배양 후 암이 없는 인간 대상체 또는 피부 T 세포 림프종을 앓고 있고 면역요법제로 치료중인 환자로부터 분리된 샘플에서 CD26-의 TNFR2+ 세포 집단에서의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. X-축을 따라 나타낸 값값들은 μg/ml 단위이다.
상세한 설명
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편은 (예컨대, T-조절 세포, TNFR2를 발현시키는 암 세포, 또는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 외부 표면 상의) 이러한 수용체에 결합함으로써 TNFR2-발현 세포에서 TNFR2의 활성화를 저해하여 상기 단백질의 그 동족형 리간드, TNFα의 동원을 방지한다. TNFα는 TNFR2 단백질의 삼량체를 핵화(nucleating)시킴으로써 TNFR2 신호전달을 증강시킨다. 개개의 TNFR2 단백질을 근접하게 위치시키고 MAPK/NF
Figure pct00020
B/TRAF2/3 경로를 통한 신호 전달을 개시하는 것은 이러한 삼량체화 사건이며, 이는 궁극적으로 세포 성장을 초래하여 세포자멸하지 않게 한다. TNFR2 항체는 상기 수용체에 결합하여 TNFα가 이러한 구조적 변화를 촉발하는 것을 방지함으로써 이러한 상호작용을 길항할 수 있다. 예를 들어, 이것이 발생할 수 있는 하나의 메커니즘은 상기 수용체의 비활성 구조인 역-평행 TNFR2 이량체의 형성에 의한 것이다.
본 발명은 부분적으로 수용체 길항작용을 촉진시키는 TNFR2 내 에피토프들의 발견, 뿐만 아니라 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 특이성이 항체 또는 이의 단편의 CDR-H3 서열에 의해 주로 좌우된다는 결과에 기반한 것이다. TNFR2 내에서 서로 다른 잔기들, 가령, TNFR2 내 KCRPG 모티프 (서열 번호: 19), 뿐만 아니라 하류 아미노산들 (예를 들어, LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285) 및 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286) 에피토프)을 내포하는 잔기들의 결합은 수용체 길항작용을 촉진시킴을 발견하였다. 추가적으로, 중성 항-TNFR2 항체 (즉, 기능면에서 길항제도 작용제도 아닌 항체)의 CDR-H3 서열을 길항 TNFR2 항체의 CDR-H3로 대체하는 것은 표현형-중성 항체를 길항 TNFR2 항체, 가령, 우성 길항 TNFR2 항체로 전환시킴이 발견되었다. 종합적으로, 이들 발견들은 TNFR2-결합 폴리펩타이드 (예컨대, CDR-H3 영역을 내포하는, 선택적으로 하나 이상의 추가 CDRs에 결합되는 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편), 가령, TNFR2에 결합하여 수용체 활성화를 억제하는 우성 길항제 폴리펩타이드의 제조를 가능하게 한다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 구조체)는 다음 성질들 중 하나 이상 또는 모두를 나타낼 수 있다:
a. 예를 들어, T-조절 세포표면 상에서 TNFR2를 결합 및 비활성화시킴에 의한, T-조절 세포증식의 억제;
b. 예를 들어, MDSC 표면 상에서 TNFR2를 결합 및 비활성화시킴에 의한, MDSC 증식의 억제;
c. T 작동자 세포, 가령, CD8+ T 세포의 확대 촉진; 및/또는
d. TNFR2-발현 암 세포, 가령, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 및 신장 세포 암종 세포의 증식 억제.
일부 구체예들에서, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 구조체)는 상기 특성들 중 하나 이상 또는 모두를 발휘하며, 암 세포가 없는 부위에서 보다 종양 미세환경에서 보다 큰 효능을 가진다. 예를 들어, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 구조체)는 암이 없는 대상체 (가령, 포유동물 대상체, 예컨대, 인간)에 비해 바람직하게는 암을 앓고 있는 환자 (가령, 포유동물 환자, 예컨대, 인간)에서 (a), (b), 및 (c)의 성질들 중 하나 이상 또는 모두를 발휘할 수 있다.
하기 내용은 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 구조체들의 예시적인 특성, 및 치료 방법에서의 이의 용도에 대한 설명을 제공한다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드
TNFR2/MAPK/TRAF2/3 신호 전달 연쇄반응에 대한 효과
본 발명의 항-TFNR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 TNFR2와 상호작용하여 이의 활성을 저해할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드는 TNFR2 신호전달을 촉진시키는 것 보다는 TNFα-TNFR2 상호작용을 선택적으로 길항시킬 수 있다. 이는 치료적 응용, 가령, 암 면역요법에 특히 중요한데, 이는 TNFα와 결합시 TNFR2 활성화는 MAPK 및 TRAF2/3 신호 연쇄반응의 전파 및 T-조절 세포 성장에 관여하는 유전자들의 NF
Figure pct00021
B-매개된 전사 활성화를 초래하며 세포자멸로부터의 벗어나게 하기 때문이다 (Faustman, 외, Nat. Rev. Drug Disc., 9:482-493, 2010). 본 발명의 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는, TNFR2 신호전달을 개시하게 하는 TNFR2에 대한 TNFα 결합을 가능하게 하기 보다는, 높은 친화성으로 TNFR2에 결합할 수 있으며, 예컨대, TNFα 결합 부위들이 입체적으로 접근할 수 없게 되어 있는 역-평행 이량체 입체형태의 TNFR2에 결합함으로써 상기 수용체들을 TNFα로부터 입체적으로 격리시킬 수 있다. 이는, 순차적으로, TNFα가 TNFR2 신호 전달을 촉발시키는 TNFR2의 활성화 삼량체를 핵화시키는 것을 방지한다. 그러므로 본 발명의 항체는 T-조절 세포 성장 및 증식을 억제하기 위하여 사용될 수 있으며, 이로써, 예를 들어, 예컨대, 암 세포 또는 외부 병원체에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 T 작동자 세포의 증식을 가능해진다. 그러므로, 본 출원에 기재된 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 환자의 면역 반응 (예컨대, 암 세포 또는 병원성 유기체에 대한 면역 반응)의 유효성을 향상시키기 위해 포유동물 대상체, 가령, 세포 증식 장애 또는 감염 질환을 가진 인간 환자에게 투여될 수 있다.
T-조절 세포증식에 대한 효과
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 자기 세포에 대한 T 세포-매개된 세포독성을 전형적으로 수반하는 T-조절 세포의 활성 (예컨대, 증식), 가령, T-림프구에 의한 종양 세포의 공격을 약화시키기 위해 사용될 수 있다. 길항 TNFR2 항체는 적응 면역 반응, 가령, 암 세포 또는 병원성 유기체에 대한 반응 기간을 지속시키기 위하여 포유동물 대상체, 가령, 인간에게 (예컨대, 본 출원에 기재된 임의의 다양한 투여 경로에 의해) 투여될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 기존의 기술들과 상승작용하여 암 및 감염 질환에 대한 T-림프구-계 요법을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TNFR2 길항제는 T-조절 세포활성을 억제함으로써, 종양 반응성 T 세포의 세포독성 효과를 향상시키기 위해 투여될 수 있다. TNFR2 길항제는 또한 기존의 치료전략들과 상승작용하여 종양-반응성 T 세포 생존, 가령, 림프구고갈 및 성장 인자 요법을 촉진시키고, 순차적으로 생체내 항-종양 반응성 기간을 지속시킬 수 있다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에서 넓은 범위의 감염 질환을 치료하기 위해 사용될 수도 있는데, 이는 T-조절 증식의 저해가 병원성 유기체에 대한 공격을 증가시킬 수 있는 CD8+ T-림프구의 활성을 촉진시키기 때문이다. 추가적으로, 본 발명의 길항 TNFR2 항체 및 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 농업 가축 동물 (예컨대, 소과 포유동물, 돼지, 암소, 말, 양, 염소, 고양이, 개, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 또는 기타 비-인간 포유동물)에서 널리 다양한 감염 질환, 가령, 결핵균을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
TNFR2+ 암 세포에 대한 직접적인 효과
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 암 세포, 가령, TNFR2+ 종양 세포의 표면에서 TNFR2에 결합하여 비활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 길항 TNFR2 항체 및 이의 항원-결합 단편은 그 중에서도, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포의 표면에서 TNFR2에 결합할 수 있다. 암 세포 상에서 TNFR2에 직접 결합하는 본 발명의 길항 TNFR2 항체 및 이의 항원-결합 단편의 능력은 상기 분자들이 암 세포 생존 및 증식을 약화시킬 수 있는 또 다른 경로를 제공한다. 예를 들어, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열을 내포하는, 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 가령, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포의 세포자멸을 촉진시키거나 및/또는 세포를 증식시키는 세포의 능력을 억제하기 위하여 암 세포 (예컨대, 피부 T 세포 림프종 세포, 난소 암 세포, 결장 암 세포, 또는 다발 골수종 세포, 가령, 난소 암 세포)의 표면에서 직접 TNFR2에 결합할 수 있다.
TNFR2 길항제 폴리펩타이드는 활성을 위해 추가적인 TNFR2-결합제에 의존하지 않는다
중요한 것은, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR2에 결합하여 TNFR2-매개된 신호전달을 억제할 수 있으며 내인성 TNFR2-결합제, 가령, TNFα를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 TNFα가 T-조절 및/또는 암 세포 증식을 약화시키는 것을 필요로 하지 않는다. 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이들 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 TNFR2에 결합하여 이러한 수용체의 역-평행 이량체 입체형태를 안정화시키는 능력으로 인해 이러한 성질을 나타낼 수 있다. 이러한 구조적 배열은 NF
Figure pct00022
B 신호전달을 강화시킬 수 없다. TNFR2를 비활성 구조 상태로 유지시킴으로써, 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR2 작용제가 세포 성장을 회복하지 못하게 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 TNFα의 존재 또는 부재하에 TNFR2+ 세포, 가령, T-조절 세포, 암 세포, 또는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 표면에서 TNFR2에 결합하여 이러한 세포의 증식을 저해할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 상기 세포의 증식을, TNFR2 길항제 폴리펩타이드로 처리되지 않은 세포에 비해, 예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상 만큼 저해할 수 있다. 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 이러한 세포의 증식 분석법에서 TNFα의 존재 또는 부재에 의해 대부분 변화하지 않은 IC50 값을 나타낼 수 있다 (예컨대, TNFα 존재시 IC50 값은 TNFα 부재시 동일한 세포 증식 분석법에서 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)의 IC50 값에 비해 50%, 45%, 40%, 35%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 1% 미만 만큼 변화함). TNFR2 항체의 길항 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있는 세포 사멸 분석법들의 예들은 본 출원에, 예컨대, 하기 실시예 9에 기재되어 있다. 유사하게, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 및 cIAP2/BIRC3으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 유전자들의 발현을 측정함으로써 평가시, TNFR2 길항제 폴리펩타이드로 처리되지 않은 상기 세포에 비해 TNFR2 신호전달을, 예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상 만큼 저해할 수 있다. 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 이러한 유전자 발현 분석법에서 TNFα의 존재 또는 부재에 의해 대부분 변화하지 않은 IC50 값을 나타낼 수 있다 (예컨대, TNFα 존재시 IC50 값은 TNFα 부재시 동일한 유전자 발현 분석법에서 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)의 IC50 값에 비해 50%, 45%, 40%, 35%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 1% 미만 만큼 변화함). TNFR2 항체의 길항 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있는 유전자 발현 분석법들의 예들은 본 출원에, 예컨대, 하기 실시예 12에 기재되어 있다.
T-조절 세포, TNFR2+ 암 세포, 및 MDSCs의 직접 사멸
본 출원에 개시된 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, T-조절 세포, TNFR2+ 암 세포, 및/또는 MDSC 증식을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, (예컨대, 환자, 가령, 인간 환자 내) 샘플 내 T-조절 세포, TNFR2+ 암 세포, 및/또는 MDSCs의 사멸을 유도할 수도 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 길항제 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 처리된 샘플 (가령, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환을 치료 중인 인간 환자로부터 분리된 샘플)에서 T-조절 세포, 암 세포 (가령, 그 중에서도 피부 T 세포 림프종 세포, 난소 암 세포, 결장 암 세포, 신장 세포 암종 세포 또는 다발 골수종 세포), 및/또는 MDSCs의 총 양을, 길항제 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 처리되지 않은 샘플에 비해, 예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상 만큼 감소시킬 수 있다.
T-조절, MDSC, 및/또는 암 세포 성장을 약화시키는 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)의 능력은 부분적으로 샘플 (예컨대, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환의 치료중인 인간 환자로부터 분리된 샘플) 내 가용성 TNFR2의 양을 감소시키는 이들 항체 또는 항원-결합 단편의 능력으로 인한 것일 수 있다. 이러한 유익한 활성의 부재시, 가용성 TNFR2는, 예컨대, T-조절 세포에 의해 분비될 수 있으며, 그렇지 않은 경우 세포외 환경에서 이러한 길항제를 결합 및 격리시킴에 의해 T-조절 세포, TNFR2+ 암 세포, 또는 MDSC의 표면의 TNFR2로 국소화시키는 TNFR2 길항제의 능력에 지장을 줄 수 있다. TNFR2 분비를 감소시킴으로써, 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명의 조성물 및 방법들과 병용하여 사용될 수 있는 치료 분자들, 가령, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및/또는 추가 항-암 제제들에 대한 T-조절 세포, TNFR2+ 암 세포, 및/또는 MDSCs의 취약성을 증가시킬 수 있다.
활성 (CD25 고 및 CD45RA 저 ) T-조절 세포의 선택적 조절
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 샘플 (예컨대, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환의 치료중인 인간 환자로부터 분리된 샘플)에서 T-조절 세포의 증식을 저해하거나 이의 총 양을 감소시킬 수 있으며 활성적으로-분열된 상태의 T-조절 세포에 대해 선택적으로 작용할 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예컨대, CD25중 및 CD45RA고를 발현시키는 휴지기 T-조절 세포 보다, CD25고 및 CD45RA저를 발현시키는 활성 T-조절 세포를 선택적으로 표적할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD25고 및 CD45RA저를 발현시키는 T-조절 세포의 증식을, CD25고 및 CD45RA저 단백질을 발현시키지 않는 T-조절 세포, 가령, CD25중 및 CD45RA고 단백질을 발현시키는 T-조절 세포에 비해, 예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상 만큼 감소시킬 수 있다.
종양 미세환경에서 T-조절 세포, MDSCs, 및 T 작동자 세포의 조절
본 출원에 기재된 길항제 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암을 가지지 않는 대상체에 비해 암을 앓고 있는 환자에서 보다 큰 효능으로 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있다. 본 출원에 기재된 길항제 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위 또는 암이 없는 대상체에 비해 암의 미세환경에서 더 큰 효능으로 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해한다. 이러한 효과는 예를 들어, 본 출원에 기재된 세포 사멸 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 종양 미세환경에서 T-조절 세포의 증식 감소 또는 저해에 대해, 암 세포가 없는 부위의 T-조절 세포의 증식 감소 또는 저해에 관한 폴리펩타이드의 IC50 보다, 예를 들어, 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배, 1.8-배, 1.9-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10,000-배, 또는 그 이상 만큼 작은 IC50을 나타낼 수 있다. 항-TNFR2 폴리펩타이드의 길항 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있는 세포 사멸 분석법들의 예들은 본 출원에, 예컨대, 하기 실시예 9에 기재되어 있다. 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포를 내포하는 종양 미세환경에서, 가령, 전술한 암들 중 하나 이상에 걸린 환자에서 이러한 암 세포가 없는 부위 또는 암이 없는 대상체에서 보다 더 큰 효능으로 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 출원에 기재된 상기 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암을 가지지 않는 대상체에 비해 암을 앓고 있는 환자에서 보다 큰 효능으로 MDSC의 증식을 감소 또는 저해할 수 있다. 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위 또는 암이 없는 대상체에 비해 암의 미세환경에서 더 큰 효능으로 MDSCs의 증식을 감소 또는 저해한다. 이러한 효과는 예를 들어, 본 출원에 기재된 세포 사멸 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 종양 미세환경에서 MDSCs의 증식 감소 또는 저해에 대해, 암 세포가 없는 부위의 T-조절 세포의 증식 감소 또는 저해에 관한 폴리펩타이드의 IC50 보다, 예를 들어, 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배, 1.8-배, 1.9-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10,000-배, 또는 그 이상 만큼 작은 IC50을 가질 수 있다. 항-TNFR2 폴리펩타이드의 길항 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있는 세포 사멸 분석법들의 예들은 본 출원에, 예컨대, 하기 실시예 9에 기재되어 있다. 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 호지킨 림프종 세포, 피부 비-호지킨 림프종 세포, 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포를 내포하는 종양 미세환경에서, 가령, 전술한 암들 중 하나 이상에 걸린 환자에서 이러한 암 세포가 없는 부위 또는 암이 없는 대상체에서 보다 큰 효능으로 MDSCs의 증식을 감소 또는 저해할 수 있거나 MDSCs의 세포자멸을 촉진할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암을 가지지 않은 대상체에 비해 암에 걸린 환자에서 보다 더 큰 효능으로 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 확대시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 암 세포가 없는 부위, 가령, 암에 걸린 환자에서 종양으로부터 먼 부위 또는 암이 없는 대상체에 비해 암의 미세환경에서 더 큰 효능으로 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 확대시킨다. 이러한 효과는 예를 들어, 본 출원에 기재된 세포 증식 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, 종양 미세환경에서 T 작동자 세포의 확대에 대해, 암 세포가 없는 부위의 T 작동자 세포의 확대에 관한 폴리펩타이드의 EC50 보다, 예를 들어, 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배, 1.8-배, 1.9-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10,000-배, 또는 그 이상 만큼 작은 EC50을 가질 수 있다. T 작동자 세포에 대한 항-TNFR2 폴리펩타이드의 길항 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있는 세포 증식 분석법들의 예들은 본 출원에, 예컨대, 하기 실시예 18에 기재되어 있다. 본 출원에 기재된 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편은, T 세포 림프종 세포 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포를 내포하는 종양 미세환경에서, 가령, 전술한 암들 중 하나 이상에 걸린 환자에서 이러한 암 세포가 없는 부위 또는 암이 없는 대상체에서 보다 더 큰 효능으로 T 작동자 세포, 가령, CD8+ 세포독성 T 세포를 직접 확대시킬 수 있다. 예를 들어, T 작동자 세포 (예컨대, CD8+ 세포독성 T 세포)는 하나 이상의 암 세포, 가령, 호지킨 림프종 세포, 피부 비-호지킨 림프종 세포, T 세포 림프종 세포, 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 또는 신장 세포 암종 세포 상에 존재하는 항원과 특이적으로 반응할 수 있다.
전장 TNFR2 길항제 항체의 항원-결합 단편의 활성
본 발명의 길항 TNFR2 항체는 이러한 항체의 항원-결합 단편이 나타내는 것과 유사한 효능으로, 예컨대, T-조절, 암 세포, 및/또는 MDSC 성장을 저해하거나, T 작동자 세포 성장을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 항체의 Fc 영역의 제거는 샘플 (예컨대, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환의 치료중인 인간 환자로부터 분리된 샘플)에서 T-조절 세포, MDSCs, 및/또는 암 세포의 증식을 약화시키거나 이의 총 양을 감소시키는 상기 분자들의 능력을 변화시키지 않을 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체 및 이의 항원-결합 단편은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)과 구별되는 경로에 의해 기능할 수 있는데, 여기서 세포 사멸을 유도하기 위해 작동자 단백질을 동원함에 Fc 영역이 필요하다. 추가적으로, 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 교차-결합제의 존재하에 저해능의 소실에 취약하지 않을 수 있다. 그러므로 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 다양한 아이소형, 가령, IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE으로, 또는 다양한 형태로, 가령, 단쇄 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 예를 들어, 아마이드 결합, 싸이오에터 결합, 탄소-탄소 결합, 또는 이황화물 다리에 의해 서로에 공유 결합되는 하나 이상의 CDRs을 가지는 단쇄 폴리펩타이드), 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 다클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이원-가변 면역글로불린 도메인, 일가 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 Fv 분자 (scFv), 디아바디, 트리아바디, 나노바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 도메인 항체, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 분자, 및 탠덤 scFv (taFv) 치료 활성을 나타낼 수 있다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드의 특이적 결합 성질
본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편의, 인간 TNFR2에 대한 특이적 결합은 임의의 다양한 확립된 방법들에 의해 결정될 수 있다. 친화성은 시험관내 TNFα-TNFR2 상호작용의 절반-최대 저해 (IC50) 및 항체-TNFR2 복합체 해리의 평형 상수 (KD)를 구현하는데 필요한 항체의 농도를 비롯하여, 다양한 측정치들에 의해 정량적으로 제시될 수 있다. 본 발명의 항체와 TNFR2의 상호작용을 설명하는 평형 상수, KD는 TNFR2-항체 복합체의, 서로 상호작용하지 않는 용매-분리된 TNFR2 및 항체 분자들로의 해리 반응에 대한 화학적 평형 상수이다.
본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 100 nM 미만의 KD 값 (예컨대, 95 nM, 90 nM, 85 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 65 nM, 60 nM, 55 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM)으로 TNFR2에 특이적으로 결합하는 것들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)은 1 nM 미만의 KD 값 (예컨대, (예컨대, 990 pM, 980 pM, 970 pM, 960 pM, 950 pM, 940 pM, 930 pM, 920 pM, 910 pM, 900 pM, 890 pM, 880 pM, 870 pM, 860 pM, 850 pM, 840 pM, 830 pM, 820 pM, 810 pM, 800 pM, 790 pM, 780 pM, 770 pM, 760 pM, 750 pM, 740 pM, 730 pM, 720 pM, 710 pM, 700 pM, 690 pM, 680 pM, 670 pM, 660 pM, 650 pM, 640 pM, 630 pM, 620 pM, 610 pM, 600 pM, 590 pM, 580 pM, 570 pM, 560 pM, 550 pM, 540 pM, 530 pM, 520 pM, 510 pM, 500 pM, 490 pM, 480 pM, 470 pM, 460 pM, 450 pM, 440 pM, 430 pM, 420 pM, 410 pM, 400 pM, 390 pM, 380 pM, 370 pM, 360 pM, 350 pM, 340 pM, 330 pM, 320 pM, 310 pM, 300 pM, 290 pM, 280 pM, 270 pM, 260 pM, 250 pM, 240 pM, 230 pM, 220 pM, 210 pM, 200 pM, 190 pM, 180 pM, 170 pM, 160 pM, 150 pM, 140 pM, 130 pM, 120 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 또는 1 pM)으로 TNFR2에 특이저으로 결합하는 것들이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 다양한 시험관내 결합 분석법들로 특성화될 수 있다. 항-TNFR2 폴리펩타이드의 KD 또는 IC50를 결정함에 사용될 수 있는 실험들의 예들에는, 그 중에서도, 예컨대, 표면 플라스몬 공명, 등온 적정 열량측정법, 형광 이등방성, 및 ELISA-기반 분석법이 포함된다. ELISA는 항체 활성을 분석하는 특히 유용한 방법을 대표하며, 이러한 분석법은 전형적으로 최소 항체 농도를 필요로 한다. 전형적인 ELISA 분석법으로 분석되는 통상적인 신호는 발광이며, 이는 통상적으로 일차 항체 (예컨대, 본 발명의 TNFR2 항체)에 특이적으로 결합하는 이차 항체에 접합된 과산화물의 작용 결과이다. 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 TNFR2 및 이로부터 유래한 에피토프, 가령, 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 142-146 (KCRPG, 도 2A 및 2B에 도시됨)중 하나 이상을 내포하는 에피토프 , 뿐만 아니라 고유 단백질에서 이들 아미노산들의 입체형태를 시뮬레이트할 수 있는 방식으로 다양한 잔기들을 구조적으로 사전-구성하는, TNFR2로부터 유래한 분리된 펩타이드에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 서열 번호: 11, 19, 20, 34-117, 285, 또는 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 내포하는 펩타이드들, 또는 서열 번호: 7의 위치 80과 130 사이에 있는 약 10 내지 약 30개의 연속 또는 불연속 아미노산들을 내포하는 펩타이드에 결합할 수 있다. 직접 ELISA 실험에서, 이러한 결합은, 예컨대, HRP 기질 (예컨대, 2,2'-아자이노-디-3-에틸벤즈싸이아졸린 설포네이트)을 HRP-접합된 이차 항체에 결합된 항원-항체 복합체와 함께 배양시 발생하는 발광을 분석하?로써, 정량화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)은 HRP 기질의 존재하에서 표면-고정화 항원 및 HRP-접합된 이차 항체와 배양시 약 400 흡광 단위 또는 그 이상의 발광 반응을 유도할 수 있다 (예컨대, 실시예 3 참고). 일부 구체예들에서, 관찰된 발광은 약 400 내지 약 900 흡광 단위 (예컨대, 400-900 흡광 단위, 500-800 흡광 단위, 또는 600-700 흡광 단위)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 관찰된 발광은 약 600 내지 약 900 흡광 단위 (예컨대, 600-900 흡광 단위 또는 700-800 흡광 단위)일 수 있다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드의 동적 성질
TNFR2-폴리펩타이드 상호작용의 열역학적 매개변수 이외에도, TNFR2와 본 발명의 폴리펩타이드의 동적 결합 및 해리를 정량적으로 특성화하는 것이 가능하다. 이는, 예컨대, 확립된 절차에 따라 항체-항원 복합체 형성 속도를 모니터링함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항체-TNFR2 복합체의 형성 (k온) 및 해리 (k오프)에 대한 속도 상수들을 결정하기 위해 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용할 수 있다. 이들 데이터는 또한 항체-TNFR2 복합체 해리의 평형 상수 (KD) 계산을 가능하게 하는데, 이러한 단일분자 해리의 평형 상수는 k오프 내지 k온 값들의 비율로 표현될 수 있기 때문이다. SPR은 수용체-항체 상호작용들의 동적 및 열역학적 매개변수를 결정함에 특히 유리한 기술인데, 왜냐하면 해당 실험은 하나의 성분이 화학적 표지 부착에 의해 변형되는 것을 필요로 하지 않기 때문이다. 그 보다는, 상기 수용체는 통상적으로 증가하는 농도의 항체 용액들로 펄스 처리되는 고체 금속 표면 상에 고정화된다. 항체-수용체 결합은 금속 표면에서 입사광의 반사각 왜곡을 유도하고, 항체가 시스템으로 도입될 때 시간에 따른 굴절률의 이러한 변화는 항체-수용체 상호작용의 결합 및 해리 속도 상수를 계산하기 위해 확립된 회귀 모델로 적합될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 TNFR2와 상호작용시 높은 k온 및 낮은 k오프 값들을 나타낼 수 있으며, 이는 고-친화성 수용체 결합과 합치한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 TNFR2의 존재시 104 M-1s-1 보다 큰 k온 값들 (예컨대, 1.0 x 104 M-1s-1, 1.5 x 104 M-1s-1, 2.0 x 104 M-1s-1, 2.5 x 104 M-1s-1, 3.0 x 104 M-1s-1, 3.5 x 104 M-1s-1, 4.0 x 104 M-1s-1, 4.5 x 104 M-1s-1, 5.0 x 104 M-1s-1, 5.5 x 104 M-1s-1, 6.0 x 104 M-1s-1, 6.5 x 104 M-1s-1, 7.0 x 104 M-1s-1, 7.5 x 104 M-1s-1, 8.0 x 104 M-1s-1, 8.5 x 104 M-1s-1, 9.0 x 104 M-1s-1, 9.5 x 104 M-1s-1, 1.0 x 105 M-1s-1, 1.5 x 105 M-1s-1, 2.0 x 105 M-1s-1, 2.5 x 105 M-1s-1, 3.0 x 105 M-1s-1, 3.5 x 105 M-1s-1, 4.0 x 105 M-1s-1, 4.5 x 105 M-1s-1, 5.0 x 105 M-1s-1, 5.5 x 105 M-1s-1, 6.0 x 105 M-1s-1, 6.5 x 105 M-1s-1, 7.0 x 105 M-1s-1, 7.5 x 105 M-1s-1, 8.0 x 105 M-1s-1, 8.5 x 105 M-1s-1, 9.0 x 105 M-1s-1, 9.5 x 105 M-1s-1, 또는 1.0 x 106 M-1s-1)을 나타낼 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 TNFR2에 결합시 낮은 k오프 값들을 나타낼 수 있는데, 이는 이들 폴리펩타이드가 높은 친화성으로 다른 TNFR2 에피토프와 상호작용할 수 있기 때문이다. 이들 에피토프 내 잔기들은 TFNR2와 강한 분자간 접촉을 형성하고, 이러한 접촉은 항체-TNFR2 복합체의 해리를 늦추는 기능을 한다. 이러한 높은 수용체 친화성은 낮은 k오프 값들로 명시된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 TNFR2에 복합될 때 10-3 s-1 미만의 k오프 값들 (예컨대, 1.0 x 10-3 s-1, 9.5 x 10-4 s-1, 9.0 x 10-4 s-1, 8.5 x 10-4 s-1, 8.0 x 10 -4 s-1, 7.5 x 10-4 s-1, 7.0 x 10-4 s-1, 6.5 x 10-4 s-1, 6.0 x 10-4 s-1, 5.5 x 10-4 s-1, 5.0 x 10-4 s-1, 4.5 x 10-4 s-1, 4.0 x 10-4 s-1, 3.5 x 10-4 s-1, 3.0 x 10-4 s-1, 2.5 x 10-4 s-1, 2.0 x 10-4 s-1, 1.5 x 10-4 s-1, 1.0 x 10-4 s-1, 9.5 x 10-5 s-1, 9.0 x 10-5 s-1, 8.5 x 10-5 s-1, 8.0 x 10-5 s-1, 7.5 x 10-5 s-1, 7.0 x 10-5 s-1, 6.5 x 10-5 s-1, 6.0 x 10-5 s-1, 5.5 x 10-5 s-1, 5.0 x 10-5 s-1, 4.5 x 10-5 s-1, 4.0 x 10-5 s-1, 3.5 x 10-5 s-1, 3.0 x 10-5 s-1, 2.5 x 10-5 s-1, 2.0 x 10-5 s-1, 1.5 x 10-5 s-1, 또는 1.0 x 10-5 s-1)을 나타낼 수 있다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드에 의해 결합되는 TNFR2 내 에피토프
TNFR2를 길항할 수 있는 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)를 개발함에 있어서의 어려움들 중 하나는 신호 전달을 촉진시키는 에피토프 보다는 길항 복합체 형성에 참여하는 TNFR2 내 에피토프의 해명이었다. 본 발명은 결합시, 수용체 길항작용을 촉진하는, TNFR2 내 에피토프들의 발견에 일부분 기초한 것이다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)에 결합하여 수용체 길항작용을 촉진시키는 특히 중요한 에피토프들은 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 142-146에 위치한 KCRPG 모티프 (서열 번호: 19)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 것들이다. 이들 잔기들 중 하나 이상은 본 발명의 길항 TNFR2 항체와 상호작용 할 수 있는 보다 큰 에피토프들 (예컨대, 서열 번호: 7의 잔기들 142-149, 도 2A에 도시, 및 서열 번호: 7의 잔기들 137-144, 도 2B에 도시) 내부에 존재한다. 길항 TNFR2 항체에 선택적으로 결합하는 이러한 잔기들에 대한 정보는 라이브러리 선별 기술들, 예컨대, 본 출원에 기재되거나 해당 분야에 공지된 기술들을 사용하여 길항 TNFR2 항체 및 이의 항원-결합 단편을 식별하고 이의 광범위한 어레이를 설계하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, KCRPG 서열 내 잔기들을 하나 이상 내포하는 펩타이드들 (예컨대, 인간 TNFR2 내 LRKCRPGFGVA 모티프 (서열 번호: 285))은 높은 친화성 및 선택성으로 이들 에피토프에 결합하는 항체 및 항체-유사 스캐폴드를 선별 및 선택하기 위해 사용될 수 있다.
중요하게는, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 KCRPG 모티프 (서열 번호: 19)의 잔기들 중 하나 이상을 내포하는 TNFR2의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있으며 이와 달리 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 56-60 (KCSPG, 서열 번호: 12)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는다 . 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 142-146의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프 및 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 56-60을 내포하는 에피토프에 결합하는 능력을 나타내는 폴리펩타이드는 저해 (길항) 활성이 없는 것으로 나타났다. 이와 같이, TNFR2 폴리펩타이드가 이들 에피토프들을 구별하여 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 142-146 중 하나 이상을 포함하는 에피토프와 특이적으로 상호작용하고 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 56-60으로 구성된 에피토프와의 특이적 결합에 관여하지 않는 능력은 TNFR2 신호전달을 길항하는 본 발명의 항체의 특징이다.
서열 번호: 7의 아미노산 142-146의 하나 이상의 잔기들 이외에도, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 또한 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 130-149 (KQEGCRLCAPLRKCRPGFGV, 서열 번호: 17) 중 최소한 5개의 연속 또는 불연속 잔기들을 포함하는 보다 큰 에피토프, 또는 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 및 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프의 하나 이상의 잔기들에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 항체는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 142-149 (KCRPGFGV, 서열 번호: 20)을 내포하는 에피토프, 또는 (KCRPG 서열의 하나 이상의 잔기들이 상기 에피토프에 존재하는 한) 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 137-144 (CAPLRKCR, 서열 번호: 11)을 포함하는 에피토프, 또는 (KCRPG 서열의 하나 이상의 잔기들이 에피토프에 존재하는 한) 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
KCRPG 모티프 (서열 번호: 19) 이외에도, 수용체 길항작용을 촉진하는 인간 TNFR2 내 존재하는 또 다른 중요한 에피토프는 서열 번호: 7의 잔기들 159-171 (VVCKPCAPGTFSN, 서열 번호: 286)을 내포함이 발견되었다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)은, 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 150-190 (ARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI, 서열 번호: 22)의, 예를 들어, 최소한 5개의 연속 또는 불연속 잔기들을 내포하는, KCRPG 서열 (서열 번호: 19)의 하류 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 그리고 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환을 내포하는 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 161-169의 잔기들 (CKPCAPGTF, 서열 번호: 21)을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 그리고 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 140-150의 잔기들 (LRKCRPGFGVA, 서열 번호: 285)을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 그리고 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 159-171의 잔기들 (VVCKPCAPGTFSN, 서열 번호: 286)을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 그리고 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기-기재된 에피토프 이외에도, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 또한 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 75-128 (CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL, 서열 번호: 13)의 최소한 5개 연속 또는 불연속 잔기들을 포함하는 인간 TNFR2 내 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 및 이러한 서열에 대해 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드는 또한 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 75-91 (CDSCEDSTYTQLWNWVP, 서열 번호: 14)의 최소한 5개 연속 또는 불연속 잔기들을 포함하는 인간 TNFR2 내 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 대한 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 및 이러한 서열에 대해 보존적 아미노산 치환을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 80-86의 잔기들 (DSTYTQL, 서열 번호: 8)을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 및 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 또한 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 86-103 (LWNWVPECLSCGSRCSSD, 서열 번호: 15)의 최소한 5개 연속 또는 불연속 잔기들을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 대한 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 및 이러한 서열에 대해 보존적 아미노산 치환을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 사례들에서, 본 발명의 항체는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 91-98의 잔기들 (PECLSCGS, 서열 번호: 9)을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 및 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)은 또한 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 111-128 (TREQNRICTCRPGWYCAL, 서열 번호: 16)의 최소한 5개 연속 또는 불연속 잔기들을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 대한 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 및 이러한 서열에 대해 보존적 아미노산 치환을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 116-123의 잔기들 (RICTCRPG, 서열 번호: 10)을 포함하는 에피토프, 뿐만 아니라 이러한 서열에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 에피토프 그리고 이러한 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 116-123 (RICTCRPG, 서열 번호: 10) 및 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 137-144 (CAPLRKCR, 서열 번호: 11)을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 TNFR2 폴리펩타이드의 저해 활성을 예측하기 위해 사용될 수 있는 하나의 예시적 절차는, KCRPG 모티프를 내포하는 펩타이드 (예컨대, 서열 LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285) 또는 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286)을 가지는 선형 펩타이드)에 대한 항체 또는 항체 단편의 친화성을, KCSPG 서열을 내포하는 펩타이드 (예컨대, 서열 QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC, 서열 번호: 18을 가지는 선형 펩타이드)에 대한 동일한 항체 또는 항체 단편의 친화성과 비교하는 것이다. 예를 들어, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1은 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 48-67에 의해 정의되는 펩타이드 단편 (QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC, 서열 번호: 18) 보다 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 130-149에 의해 정의되는 펩타이드 단편 (KQEGCRLCAPLRKCRPGFGV, 서열 번호: 17)에 40-배 더 큰 친화성으로 특이적으로 결합한다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체 및 항원-결합 단편은, 예컨대, 인간 TNFR2의 KCSPG 서열을 내포하는 펩타이드 (서열 번호: 12)에 대한 동일한 항체 또는 항원-결합 단편의 친화성 보다 최소한 10-배 더 큰 친화성으로 KCRPG 서열 (서열 번호: 19)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)은 인간 TNFR2의 KCSPG 서열을 내포하는 펩타이드 (서열 번호: 12)에 대한 동일한 항체 또는 항원-결합 단편의 친화성 보다 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 200-배, 300-배, 400-배, 500-배, 600-배, 700-배, 800-배, 900-배, 1000-배, 또는 1000-배 이상 더 큰 친화성으로, 인간 TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 19)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 결합할 수 있다. KCRPG 서열 (인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프 및 KCSPG 모티프 (인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 56-60)를 내포하는 에피토프에 유사한 친화성 (예컨대, 10-배 미만의 친화성 차이)으로 결합하는 항체 또는 항체 단편들은 본 발명의 길항 TNFR2 항체로 간주되지 않는다.
비-인간 동물들의 TNFR2에 결합하는 길항 TNFR2 폴리펩타이드
KCRPG 모티프를 내포하는 인간 TFNR2 내 에피토프에 결합하는 것 이외에도, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 또한 비-인간 동물들 유래 TNFR2 내 균등한 모티프, 가령, 비-인간 포유동물들의 TNFR2 내 , 예컨대, 그 중에서도 암소, 들소, 생쥐, 또는 쥐에서 얻은 TNFR2 내 KCGPG 모티프 (서열 번호: 287)를 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것들을 포함한다. 예시적인 비-인간 포유동물들로부터 유래한 TNFR2 내 인간 KCRPG 모티프와 균등한 서열들의 위치를 아래 표 2에 나타낸다:
표 2. 비-인간 포유동물로부터의 TNFR2 내 KCRPG와 균등한 서열들의 위치
Figure pct00023
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)에 의해 결합될 수 있는, 상기 논의된 비-인간 포유동물들로부터 유래한 TNFR2 내 에피토프들을 하기 서열 정렬로 나타낸다. 이 서열 정렬은 인간, 소, 들소, 생쥐, 및 쥐 유래의 TNFR2의 부분 서열들, 뿐만 아니라 인간 KCRPG 모티프와 균등한 에피토프 (회색으로 강조)를 보여준다.
Figure pct00024
길항 TNFR2 항체 TNFRAB1
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 본 출원에서 TNFR2 길항제 1로도 지칭되며 TNFRα-TNFR2 상호작용을 길항하는 쥐과 항체인 TNFRAB1의 CDR-H3 서열을 내포할 수 있다. 예를 들어, TNFRAB1의 CDR-H3 및 이의 변이체 (예컨대, 이러한 CDR-H3 서열에 대한 보존적 아미노산 치환들을 나타내는 변이체)는 예를 들어, 본 출원에 기재되거나 해당 분야에 공지된 항체 인간화 방법들을 사용하여 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 TNFRAB1과 동일하거나 유사한 결합 성질을 나타낼 수 있다. 이러한 성질들은 다음과 같다: TNFR2의 존재하에서, TNFRAB1은 TNFR2와의 복합체에서 4.98 x 106 M-1s-1의 높은 k온 값, 뿐만 아니라 2.21 x 10-4 s-1 의 낮은 k오프값 및 약 44.4 pM의 KD를 나타낸다. KCRPGFGV 모티프 (서열 번호: 20), 및 특히, KCRPG 서열 (서열 번호: 19)은, 에피토프 맵핑 분석으로 결정시 TNFRAB1과 분자간 접촉을 생성하는 특히 중요한 기능적 에피토프 성분으로서 확인되었다 (도 2 및 3). 본 발명의 항-TNFR2 항체와 이들 잔기들의 상호작용은 선택적으로 길항 활성을 촉진시킨다. 현저하게, 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 잔기들 56-60 (KCSPG, 서열 번호: 12)을 포함하는 TNFR2 에피토프는 TNFRAB1에 의해 특이적으로 결합되는 본 발명의 입체 형태 에피토프 또는 길항 TNFR2 항체 또는 항체 단편들의 일부가 명백히 아닌데, 이는 이들 에피토프 모두에 대한 특이적 결합은 길항 활성의 소실 또는 길항 활성의 유의한 감소를 가져오는 것으로 나타났기 때문이다. 이에 따라, 이러한 두 에피토프 모두 (KCSPG 및 인간 TNFR2의 최소한 KCR 서열, 그리고 더욱 특이적으로, KCRPG 서열을 내포하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 본 발명의 길항 TNFR2 항체로 간주되지 않는다.
서열 KCRPGFGV (서열 번호: 20) 내 내포된 에피토프에 결합하는 것 이외에도, TNFRAB1은 또한 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 161-169에 의해 정의되는 서열 (CKPCAPGTF, 서열 번호: 21) 내 내포된 하류 에피토프에 결합한다. 본 발명의 TNFR2 항체 및 항체 단편들은 또한 이러한 에피토프 또는 이러한 에피토프를 내포하는 TNFR2 내 더 큰 영역 (예컨대, 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 150-190 (ARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI, 서열 번호: 22)으로부터의 최소한 5개 연속 또는 불연속 잔기들을 포함하는 서열)에 결합할 수 있다. TNFRAB1은 도 1A 및 1B에 도시된 바와 같이, 2개의 중쇄, 뿐만 아니라 2개의 경쇄를 내포한다. TNFRAB1의 중쇄들은 다음 아미노산 서열을 내포한다 (CDRs는 볼드체로 표시한다):
EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYVMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQRVDGYSSYWYFDVWGAGTAVTVSS (서열 번호: 2)
TNFRAB1 경쇄의 서열은 다음과 같다 (CDRs은 볼드체로 표시한다):
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRRNYPYTFGGGTKLEIKRA
(서열 번호: 4)
길항 TNFR2 항체 TNFRAB2
본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, 본 출원에서 TNFR2 길항제 2로도 지칭되고 이러한 수용체 내 다양한 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 TNFR2에 선택적으로 결합하여 이를 저해하는 항체인, TNFRAB2의 CDR-H3 서열을 내포할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)는 TNFRAB2와 동일하거나 유사한 결합 성질을 나타낼 수 있다. 이러한 성질들은 다음과 같다: TNFR2의 존재하에서, TNFRAB2는 TNFR2와의 복합체에서 3.6099 x 105 M-1s-1의 높은 k온 값, 뿐만 아니라 2.24 x 10-4 s-1 의 낮은 k오프값 및 약 621 pM의 KD를 나타낸다. 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 잔기들 137-144 (CAPLRKCR, 서열 번호: 11)를 내포하는 에피토프는 에피토프 맵핑 분석으로 결정시 TNFRAB2와 분자간 접촉을 생성하는 특히 중요한 기능적 에피토프 성분인 것으로 확인되었다 (예컨대, 실시예 1 및 도 2B 및 3B 참고). 본 발명에는 이러한 에피토프에 특이적으로 결합하는 TNFR2 항체 및 항체 단편들이 포함된다.
잔기들 CAPLRKCR (서열 번호: 11)을 내포하는 에피토프에 결합하는 것 이외에도, TNFRAB2는 또한 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 80-86 (DSTYTQL, 서열 번호: 8), 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 91-98 (PECLSCGS, 서열 번호: 9), 뿐만 아니라 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 위치 116-123 (RICTCRPG, 서열 번호: 10) 내 하나 이상의 잔기들을 포함하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 TNFR2 항체 및 항체 단편들은 또한 이들 에피토프의 하나 이상에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 단편들은 TNFRAB2에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프에 관한 정보를 사용하여 설계되고 확인될 수 있다. 예를 들어, 높은 친화성 및 선택성으로 이들 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 선별하기 위하여 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 다양한 시험관내 펩타이드 디스플레이 기술 또는 조합성 항체 라이브러리 선별을 사용할 수 있다.
TNFRAB2의 중쇄 및 경쇄 CDRs을 아래에 나타낸다:
TNFRAB2 CDR-H1: GYTFTDY(L/I) (서열 번호: 257)
TNFRAB2 CDR-H2: VDPEYGST (서열 번호: 258)
TNFRAB2 CDR-H3: ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)
TNFRAB2 CDR-L1: QNINKY (서열 번호: 260)
TNFRAB2 CDR-L2: TYS 또는 YTS
TNFRAB2 CDR-L3: CLQYVNL(L/I)T (서열 번호: 261)
상기와 같이, TNFRAB2의 CDR-H1 서열은 이러한 영역의 8번째 위치에서 류신 또는 아이소류신 잔기를 내포할 수 있다. 유사하게, TNFRAB2 CDR-L2는 TYS 또는 YTS 트라이펩타이드를 포함할 수 있고, TNFRAB2 CDR-L3는 이러한 영역의 8번째 위치에서 류신 또는 아이소류신 잔기를 내포할 수 있다. 특히, TNFRAB2의 CDR-L2는 N-말단 프레임워크 잔기들 LLIR (서열 번호: 262) 및 C-말단 프레임워크 잔기들 TLE에 의해 플랭크된다. 따라서, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 항원-결합 단편)은 TNFRAB2의 상기 CDRs 중 하나 이상, 뿐만 아니라 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR-L2 서열을 플랭크하는 N-말단 LLIR (서열 번호: 262) 및 C-말단 TLE 잔기들을 내포하는 것들을 포함한다.
길항 TNFR2 항체 TNFR2A3
본 발명의 대표적인 길항제 TNFR2 항체는 TNFR2A3으로, 이는 인간 TNFR2로 생쥐를 면역화 그리고 후속 CDR 돌연변이유발에 의해 발견된 쥐과 항체이다. TNFR2A3에 대한 전구물질 항체는 쥐과 면역화 실험들에서 TNFR2의 길항제도 작용제도 아니었던 TNFR2-결합 항체로서 확인되었다. 재조합 유전자 발현 기술들을 사용하여, 전구물질 쥐과 항체의 CDR-H3 서열을 CDR-H3 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)로 대체하여 TNFR2A3를 제조하였다. 전구물질 스캐폴드로 이러한 CDR-H3 서열의 삽입시 , 생성되는 TNFR2A3 항체는 TNFR2 표적에 대한 길한 효과를 나타낼 수 있었다. 추가적으로, TNFR2A3 항체는, 우성 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2에 의해 결합되는 항체들과 일관되게, 인간 TNFR2 내 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 실시예 15에 기재된 바에 따라, TNFR2A3은 인간 TNFR2 내 2개의 뚜렷한 에피토프에 결합한다. 제 1 에피토프는 인간 TNFR2의 잔기들 140-150 (LRKCRPGFGVA, 서열 번호: 285)에 이르며 KCRPG 모티프 (서열 번호: 19)를 내포한다. 제 2 에피토프는 인간 TNFR2의 잔기들 159-171을 내포하는 하류 서열 (VVCKPCAPGTFSN, 서열 번호: 286)이다. 예를 들어, 본 발명의 우성 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR2A3과 동일하거나 유사한 결합 성질을 나타낼 수 있다. 중요하게는, TNFR2 내 이들 에피토프에 대한 TNFR2A3의 결합은 부위-특이적인데, 왜냐하면 TNFR2A3 항체는 관련없는, 먼 아미노산 서열을 내포하는 인간 TNFR2-유래 펩타이드에 결합하지 않는다 (예컨대, 실시예 15). 종합하면, 이러한 관찰결과들은 TNFR2 길항작용에 관한 CDR-H3 서열의 다음과 같은 2가지 중요한 특징을 입증한다: (i) 길항 TNFR2 항체의 CDR-H3 서열은 시스템의 항원-결합 성질을 크게 좌우한다, 그리고 (ii) CDR-H3 모티프는 이러한 항체에 TNFR2 우성 길항 특징을 부여하기 위하여 길항 활성을 나타내지 않는 항-TNFR2 항체로 치환될 수 있는 모듈 도메인이다.
TNFR2 친화성 및 길항작용의 분자 결정인자
특히, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1, TNFRAB2, 및 TNFR2A3의 CDR-H3 영역들 사이에 뚜렷한 서열 유사성이 존재한다. 이들 항체의 CDR-H3 서열들에 공통인 잔기들의 분석은 TNFR2에 결합하여 길항 효과, 가령, 우성 길항 효과를 나타내는 항체의 분자적 특징들에 관한 통찰을 제공한다. 에피토프 맵핑 분석은 TNFRAB1, TNFRAB2, 및 TNFR2A3 모두는 서열 번호: 7의 잔기들 142-146을 내포하는 TNFR2 내 에피토프에 결합하며 서열 번호: 7의 잔기들 56-60을 내포하는 에피토프에는 결합하지 않음을 보여주었다. 상응하는 CDR-H3 영역들 사이의 구조적 유사성은 TNFR2 친화성 및 길항작용 (예컨대, 우성 길항작용)을 보존 또는 향상시킬 수 있는 잔기 치환들을 예측하기 위한 기초를 제공한다. 이들 항체의 CDR-H3 서열들에 관한 조사는 몇몇 잔기들 및 물리화학적 특성들은 이 영역 전반에 걸쳐 보존되는 반면, 이 CDR의 다른 위치들은 친화성 및 길항 기능의 소실 없이 유의하게 달라질 수 있음을 입증한다. TNFRAB1, TNFRAB2, 및 TNFR2A3의 CDR-H3 서열들을 하기에 나타낸다:
QRVDGYSSYWYFDV (TNFRAB1 CDR-H3, 서열 번호: 25)
ARDDG-S-YSPFDYWG (TNFRAB2 CDR-H3, 서열 번호: 259)
ARDDG-S-YSPFDYFG (TNFR2A3 CDR-H3, 서열 번호: 284)
-R-DG-S-Y--FD--- (공통 서열)
TNFRAB1, TNFRAB2, 및 TNFR2A3의 CDR-H3 서열들의 조사는 이 CDR 전반에 걸쳐 보존된 아르기닌, 아스파트산, 글라이신, 세린, 타이로신, 및 페닐알라닌 잔기들을 나타낸다. 특히, 입체 및 정전기적 성질들이 다른 잔기들이 나머지 위치들에서 관용된다. 예를 들어, CDR-H3 서열의 첫번째 위치는 크기 및 수소 결합-형성 경향이 대조적인 아미노산 잔기들을 관용하는데, 이는 TNFRAB1의 CDR-H3의 첫번째 위치가 수소 결합 공여자 및 수용자 모이어티와 함께 카르복스아마이드 측쇄를 내포하는 극성 글루타민 잔기를 특징으로 하는 반면, 작용기화되지 않은 메틸 측쇄를 보유한 알라닌 잔기는 TNFRAB2 및 TNFR2A3의 상응하는 위치에서 발견되기 때문이다. 추가적으로, 상기 CDR-H3 서열들의 세번째 위치는 TNFRAB1에서 소수성 발린 그리고 TNFRAB2의 상응하는 위치에서 음이온 아스파트산 모이어티를 특징으로 한다. 유사하게, TNFRAB1의 CDR-H3의 위치 10 및 11은 방향족 계통을 내포하는 반면, TNFRAB2 및 TNFR2A3의 상응하는 잔기들은 극성 및 고리형 지방족 치환기들을 내포한다.
종합하면, 상기 CDR-H3 서열들이 공유하는 구조적 특징들은 수용체 길항작용 (예컨대, 우성 수용체 길항작용)을 촉진시키는 TNFR2 내 잔기들을 선택적으로 결합시키는데 중요한 잔기들, 가령, 인간 TNFR2의 잔기들 140-150 (LRKCRPGFGVA, 서열 번호: 285) 및 인간 TNFR2의 잔기들 159-171 (VVCKPCAPGTFSN, 서열 번호: 286)에 관한 통찰을 제공하며 다른 아미노산들이 친화성과 우성 길항 활성을 보유하면서 변화될 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)은 식 JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5 또는 JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2으로 나타내어지는 CDR-H3을 내포할 수 있으며, 이 때 각각의 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고, 그리고 각각의 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이다.
유사하게, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 식 JRJDGJSJY(J)2FDJ (서열 번호: 278), JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279), QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5 (서열 번호: 265), 또는 AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266)으로 나타내어지는 CDR-H3를 내포할 수 있다. 예를 들어, CDR-H3는 TNFRAB1으로부터 유래할 수 있고 아미노산 서열 QRVDGYSSYWYFDV (서열 번호: 25)을 가질 수 있다. CDR-H3는 TNFRAB2로부터 유래할 수 있고 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, CDR-H3는 TNFR2A3로부터 유래하고 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)를 가진다.
상기 CDR-H3 서열들 이외에도, 다른 CDR 서열들이 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)에 포함될 수 있다. 우성 TNFR2 길항작용을 촉진시키는 추가적인 CDR 서열들은, 예를 들어, TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR 서열들의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-H1 서열들을 아래 나타낸다:
GFTFSSY (TNFRAB1 CDR-H1, 서열 번호: 23)
GYTFTDY(L/I) (TNFRAB2 CDR-H1, 서열 번호: 257)
G-TF―-Y- (공통 서열)
상기 서열들의 정렬로 공유 GXTFXXY 모티프가 나타나며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산을 표기한다. 이들 CDR-H1 서열들은 첫번째 위치에서 보존된 글라이신 잔기 및 세번째, 네번째, 및 일곱번째 위치에서 각각 보존된 트레오닌, 페닐알라닌, 및 타이로신 잔기들을 특징으로 한다. 이들 서열들의 조사는 CDR-H1 영역이 나머지 위치들에서의 치환을 관용함을 입증한다. 극성을 달리하는 측쇄들은 두번째 위치에서 관용되는데, 이는, 예를 들어, 치환되지 않은 소수성 페닐 모이어티를 내포하는 페닐알라닌, 그리고 양성자성 하이드록실 치환기를 내포하는 타이로신 모두가, TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-H1 영역의 이 위치에서 각각 발견되기 때문이다. 추가적으로, 다섯번째 및 여섯번째 위치들은 TNFRAB1의 CDR-H1에서 극성 세린 잔기들이 점유하지만, TNFRAB2에서 이들 위치들은 추가적인 소수성 메틸 치환기를 내포하는 트레오닌, 그리고 생리학적 pH에서 음이온인 아스파트산을 특징으로 한다. 이러한 다양성은 이들 위치들이 TNFR2 친화성 및 길항작용의 소실없이 다양한 정전기적 성질들을 가지는 아미노산들로 치환될 수 있음을 입증한다.
TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-H2 영역들의 서열 분석은 유사하게 이들 영역들 전반에 걸쳐 다음과 같은 다양한 위치들에서 보존된 아미노산들의 세트를 나타낸다:
SSG--GSY (TNFRAB1 CDR-H2, 서열 번호: 24)
VDPEYGST (TNFRAB2 CDR-H2, 서열 번호: 258)
-----GS- (공통 서열)
이러한 서열 정렬 분석은 CDR-H2 서열들이 CDR-H2 영역의 C-말단 단부에서 보존된 GS 모티프를 나타내고, 다양한 분자 크기, 극성, 및 정전기 전하의 측쇄들이 나머지 위치들에서 관용됨을 입증한다.
유사한 분석은 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-L 서열들에 공통된 분자 특징들을 나타낸다. 예를 들어, TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-L1 서열들을 아래 나타낸다:
SASSSVYYMY (TNFRAB1 CDR-L1, 서열 번호: 26)
Q-N--INK-Y (TNFRAB2 CDR-L1, 서열 번호: 260)
Y (공통 잔기)
이들 서열들의 조사는 하이드록실-내포 타이로신 잔기가 CDR-L1의 마지막 위치에서의 특징이며, 물리화학적 성질을 달리하는 잔기들이 나머지 위치들에서 관용됨을 나타낸다. 유사하게, TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-L2 영역들의 분석은 두 영역 모두에서 마지막 위치에 보존된 아미노산을 나타낸다:
STSNLAS (TNFRAB1 CDR-L2, 서열 번호: 27)
TY----S 또는 (TNFRAB2 CDR-L2)
YT----S
S (공통 잔기)
상기 서열 정렬의 분석은 세린 잔기들이 이들 CDR-L2 서열들의 세번째 위치의 특징이며, 나머지 잔기들에서 치환들이 널리 관용됨을 입증한다. 유사하게, TNRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-L3 서열들은 다음과 같다:
Q-QRRNYPY------T (TNFRAB1 CDR-L3, 서열 번호: 28)
CLQ---YVNL(L/I)T (TNFRAB2 CDR-L3, 서열 번호: 261)
------Y--------T (공통 서열)
TNFRAB1 및 TNFRAB2의 CDR-L3 서열들의 분석은 이들 영역들 내 별개의 위치들에서 타이로신 및 트레오닌 잔기들에 대한 선호도를 나타내는 반면, 양이온 측쇄 (Arg), 입체형태적으로 제한된 측쇄 (Pro), 및 다양한 극성의 측쇄들 (예컨대, Gln, Asn, Leu, 및 Val)을 가진 잔기들을 비롯한 넓은 범위의 물리화학적 특성을 가진 아미노산들이 다른 위치들에서 관용됨을 나타낸다. 종합하면, 상기 CDR-H 및 CDR-L 서열들이 공유하는 구조적 특징들은 역-평행 이량체 구조의 TNFR2의 KCRPG 에피토프 (서열 번호: 7의 위치 142-146, 서열 번호: 19로 나타냄) 중 하나 이상의 잔기들의 선택적 결합에 중요한 잔기들에 관한 통찰을 제공하며 특정 아미노산들은 친화성 및 우성 길항 활성을 보유하면서 달라질 수 있음을 입증한다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 그러므로 상기 공통 서열들을 내포하는 중쇄 및 경쇄 CDRs을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TNFR2 길항제는 아미노산 서열 Z4JZ3Z5(J)2Z5J을 가지는 CDR-H1; 아미노산 서열 (J)5Z4Z3J를 가지는 CDR-H2; 아미노산 서열 (J)5Z5를 가지는 CDR-L1; 아미노산 서열 (J)2Z3를 가지는 CDR-L2; 및/또는 아미노산 서열 (J)3Z5(J)4Z3를 가지는 CDR-L3를 가질 수 있으며; 여기서 각각의 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z2는 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고 각각의 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 아미노산 서열 GJTF(J)2YJ (서열 번호: 277)를 가지는 CDR-H1; 아미노산 서열 (J)5GSJ를 가지는 CDR-H2; 아미노산 서열 (J)5Y를 가지는 CDR-L1; 아미노산 서열 (J)2S를 가지는 CDR-L2; 및/또는 아미노산 서열 (J)3Y(J)4T를 가지는 CDR-L3를 가질 수 있으며; 이 때 각각의 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 아미노산 서열 Z4YZ3Z5TDZ5X를 가지는 CDR-H1; 아미노산 서열 VDPEYZ4Z3T (서열 번호: 264)를 가지는 CDR-H2; 아미노산 서열 QNINKZ5 (서열 번호: 268)를 가지는 CDR-L1; 아미노산 서열 TYZ3 또는 YTZ3를 가지는 CDR-L2; 및/또는 아미노산 서열 CLQZ5VNLXZ3 (서열 번호: 271)를 가지는 CDR-L3를 가질 수 있으며; 여기서 각각의 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 아미노산이고; 각각의 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 아미노산이고; 각각의 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z4 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 각각의 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 그리고 각각의 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신이다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257) 또는 이 서열에 대해 최대 2개의 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H1; 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258), 또는 이 서열에 대해 최대 2개의 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H2; 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260), 또는 이 서열에 대해 최대 2개의 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L1; 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 및/또는 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261), 또는 이 서열에 대해 최대 2개의 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L3를 가질 수 있다.
예를 들어, 일부 구체예들에서, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274), 또는 이 서열에 대해 최대 2개의 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H1; 및 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273), 또는 이 서열에 대해 최대 2개의 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L3를 가질 수 있다. 본 발명은 CDR-H1 및 CDR-L3 영역들의 이러한 특정한 조합이 활성화된 T-조절 세포의 선택적 사멸을 촉진시키고 증가된 T 작동자 세포 증식을 강화시킨다는 발견에 일부분 기초한 것이다. 본 출원에 기재된 바와 같이, 이러한 표현형들은 암 및 감염 질환의 치료에 유익한데, 이는 이러한 병을 앓고 있는 환자의 활성화된 T-조절 세포 집단들을 고갈시키는 능력이 세포독성 CD8+ T 세포의 약화를 감소시킬 수 있고, 이로써 작동자 세포가 암 및 감염 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있게 하기 때문이다 (예컨대, 실시예 17 참고).
인간화, 영장류화, 및 키메라 항체
본 발명의 항체는 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열, 또는 임의의 이들 CDR-H3 서열들 또는 이들 CDR-H3 서열들에 대해 보존적 돌연변이들을 내포하는 서열들에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 CDR-H3를 내포하는 인간, 인간화, 영장류화, 및 키메라 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3, 또는 임의의 이들 CDR-H3 서열들 또는 이들 CDR-H3 서열들에 대해 보존적 돌연변이들을 내포하는 서열들에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 CDR-H3를 내포하는 인간, 인간화, 영장류화, 및 키메라 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또한 보존적 아미노산 치환들을 제외하고 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3와 동일한 CDR-H3를 내포하는 인간, 인간화, 영장류화, 및 키메라 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체는 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3, 또는 임의의 이들 CDR-H3 서열들 또는 이들 CDR-H3 서열들에 대해 보존적 돌연변이들을 내포하는 서열들에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 CDR을 내포할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 항체는 상기 임의의 CDR-H3 서열들을 인간 항체의 프레임워크 영역들 (예컨대, FW1, FW2, FW3, 및 FW4)에 통합시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 CDRs의 하나 이상을 내포하는 인간화 항-TNFR2 항체 개발에 사용될 수 있는 예시적인 프레임워크 영역들에는, 제한 없이, 미국 특허 제 7,732,578, 미국 특허 제 8,093,068, 및 WO 2003/105782에 기재된 것들이 포함되며; 이들 문헌은 본 출원에 참고로 포함된다.
본 발명의 인간화 항체를 설계하기 위해 사용될 수 있는 하나의 전략은 길항 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열들을, 공통 인간 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 함께 정렬하는 것이다. 공통 인간 항체 중쇄 및 경쇄 서열들은 해당 분야에 공지이다 (예컨대, "VBASE" 인간 생식세포 서열 데이터베이스 참고; 또한 Kabat, 외, Sequences of Proteins of 면역학적 Interest, Fifth Edition, 미국 보건복지부, NIH Publication No. 91 -3242, 1991; Tomlinson 외, J. Mol. Biol. 227:776-98, 1992; 및 Cox 외, Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 이러한 방식으로, 가변 도메인 프레임워크 잔기들 및 CDRs은 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다 (상기 Kabat 문헌 참고). 인간화 TNFR2 길항제 항체를 제조하기 위하여, 예를 들어, 공통 인간 항체의 CDR-H3를 길항 TNFR2 항체의 CDR-H3, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3로 치환할 수 있다. 공통 인간 항체의 예시적인 가변 도메인은 다음 중쇄 가변 도메인:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVAVISENGSDTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGGAVSYFDVWGQGTLVTVSS (서열 번호: 32)
및 경쇄 가변 도메인을 포함하고:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSLPYTFGQGTKVEIKRT (서열 번호: 33)
이들은 미국 특허 제 6,054,297에서 확인되었으며; 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다 (CDRs은 Chothia, 외, J. Mol. Biol, 196:901-917, 1987의 방법에 따라 결정되었으며 볼드체로 나타낸다). 이러한 아미노산 치환들은, 예를 들어, 해당 분야에 공지된 또는 본 출원에 기재된 방법을 사용하여 숙주 세포에서 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들을 재조합 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
유사하게, 이러한 전략은 또한, 예를 들어, 영장류 항체 공통 서열의 CDR-H3를, 예를 들어, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3로 치환할 수 있기 때문에, 영장류화 항-TNFR2 항체를 제조하기 위하여 사용될 수도 있다. 공통 영장류 항체 서열들은 해당 분야에 공지이다 (예컨대, 미국 특허 제 5,658,570; 5,681,722; 및 5,693,780 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
일부 구체예들에서, TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR 서열들 이외에도 특정 프레임워크 잔기들을 인간 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인에 가져오는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,054,297은 생성된 인간화 항체에 특정 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터의 특정 프레임워크 잔기들을 보유하는 것이 유리할 수 있는 몇몇 예들을 제시한다. 일부 구체예들에서, 프레임워크 잔기들은 항원과의 비-공유적 상호작용에 관여하므로 표적 항원에 대한 항체의 친화성에 기여할 수 있다. 다른 사례에서, 개개의 프레임워크 잔기들은 CDR의 입체형태를 조절할 수 있으므로, 항원과 항체의 상호작용에 간접적으로 영향을 줄 수 있다. 대안적으로, 특정 프레임워크 잔기들은 VH와 VL 도메인들 사이의 경계를 형성할 수 있으므로, 전체 항체 구조에 기여할 수 있다. 다른 사례에서, 프레임워크 잔기들은 기능적 당화 부위들 (예컨대, Asn-X-Ser/Thr)을 구성할 수 있는데, 이는 탄수화물 모이어티에 부착시 항체 구조 및 항원 친화성을 좌우할 수 있다. 가령, 상기 사례들에서, TNFR2 길항제 항체 (예컨대, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3)의 특정 프레임워크 잔기들을 본 발명의 길항 항체 및 이의 항원-결합 단편, 가령, 인간화 항체에 유지시키는 것이 유익할 수 있는데, 이는 다양한 프레임워크 잔기들이 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 높은 에피토프 친화성 및 개선된 생화학적 활성을 촉진시킬 수 있기 때문이다.
본 발명의 항체는 또한 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 (예컨대, QRVDGYSSYWYFDV (서열 번호: 25), ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259), 또는 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)) 또는 임의의 이들 CDR-H3 서열들에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 CDR-H3을 내포하는, 항체 단편, Fab 도메인, F(ab') 분자, F(ab')2 분자, 단쇄 가변 단편 (scFvs), 탠덤 scFv 단편, 디아바디, 트리아바디, 이원 가변 도메인 면역글로불린, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 및 이종특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열들에 대해 1 내지 3개의 아미노산 치환들 (예컨대, 보존적 또는 비보존적 치환)을 가지는 CDR-H3 서열들을 또한 내포하는 것들을 포함한다. 이들 분자들은 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 기술들을 사용하여 이들 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들을 진핵 또는 원핵 세포에서 형질감염용 발현 벡터에 통합시킴으로써 재조합적으로 발현되거나, 또는, 예컨대, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 고체상 펩타이드 합성법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 추가적으로, 예를 들어, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열, 또는 임의의 이들 CDR-H3 서열들 또는 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TFNR2A3의 CDR-H3 서열들에 대해 1 내지 3개의 아미노산 치환들 (예컨대, 보존적 또는 비보존적 치환들)을 내포하는 서열들에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 나타내는 CDR-H3 서열을 내포하는 항체-유사 스캐폴드를 포함한다. 항체-유사 스캐폴드들의 예들에는, 기본 항체에 대한 BC, DE, 및 FG 구조 루프 유사체를 내포하는 피브로넥틴의 10번째 유형 III 도메인 (10Fn3)을 내포하는 단백질이 포함된다. 이러한 10Fn3 도메인의 3차 구조는 IgG 중쇄의 가변 영역과 닮아 있어, 해당 분야의 숙련된 기술자는, 예컨대, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3, 또는, 임의의 이들 CDR-H3 서열들 또는 이들 CDR-H3 서열들에 대해 보존된 아미노산 치환들을 내포하는 서열들에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 가지는 서열들을, 10Fn3의 BC, DE, and FG 루프들의 잔기들을 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3의 잔기들로 대체함으로써 피브로넥틴 스캐폴드에 이식할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 원핵 또는 진핵 세포에서 변형된 10Fn3 도메인의 재조합 발현 (예컨대, 본 출원에 기재된 벡터 및 기술들을 사용)에 의해 구현될 수 있다. BC, DE, 및 FG 구조 루프들에 항체의 CDRs를 이식하기 위한 항체-유사 스캐폴드로서 10Fn3 도메인을 사용하는 예들은 WO 2000/034784, WO 2009/142773, WO 2012/088006, 및 미국 특허 제 8,278,419에 보고되어 있으며; 이들은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드
본 발명의 TNFR2 길항제는 단쇄 폴리펩타이드의 형태, 가령, 본 출원에 기재된 CDR-H3 영역 (예컨대, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 영역)을, 선택적으로 표현형-중성 TNFR2 항체 (즉, TNFR2 활성화의 길항제도 작용제도 아닌 항체)로부터 유래한 CDR과 함께 내포하는 단쇄 폴리펩타이드일 수 있다. 단쇄 폴리펩타이드는 항체 단편, 예컨대, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 항체 단편, 가령, scFv 단편의 형태일 수 있다. 단쇄 폴리펩타이드는 대안적으로 해당 분야에 공지된 전형적인 결합-형성 기술들을 사용하여, 예를 들어, 아마이드 결합, 싸이오에터 결합, 탄소-탄소 결합에 의해, 또는 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 링커, 가령, 펩타이드 링커 또는 다가 친전자 (예컨대, 비스(브로모메틸) 아렌 유도체, 가령, 비스(브로모메틸)벤젠 또는 비스(브로모메틸)피리딘)에 의해, 서로에 공유 결합된 본 출원에 기재된 하나 이상의 CDRs를 내포할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드는 TNFR2 에피토프, 가령, KCRPG 모티프 (서열 번호: 19)에 대한 선택적 결합을 촉진시키고, TNFR2 길항작용을 유도하는 상기 공통 서열들 중 하나를 내포하는 CDR-H3 영역을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드는 아미노산 서열 JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5 또는 JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2을 가지는 CDR-H3를 가질 수 있으며, 이 때 각각의 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고 각각의 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드는 아미노산 서열 JRJDGJSJY(J)2FDJ (서열 번호: 278) 또는 JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279)를 가지는 CDR-H3를 가질 수 있으며, 이 때 각각의 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이다.
본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드는 아미노산 서열 QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5 (서열 번호: 265) 또는 AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266)을 가지는 CDR-H3를 가질 수 있으며, 이 때 각각의 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 아미노산이고; 각각의 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 아미노산이고; 각각의 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 각각의 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 각각의 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고; 그리고 각각의 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신이다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드는 아미노산 서열 QRVDGYSSYWYFDV (서열 번호: 25), ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259), 또는 이들 서열들에 대해 최대 2개의 아미노산 치환들 (예컨대, 1 또는 2개 아미노산 치환, 가령, 보존적 아미노산 치환)을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H3를 가질 수 있다.
단쇄 폴리펩타이드는 다양한 재조합 및 합성 기술들, 가령, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 재조합 유전자발현 또는 고체상 펩타이드 합성 절차에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 해당 분야의 숙련된 기술자는, 예컨대, 프레임에서 서로 작동적으로 연결된 둘 이상의 CDRs을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 설계하여, 이들 CDRs을 내포하는 연속, 단쇄 펩타이드를 제조할 수 있다. 선택적으로, CDRs은 스페이서에 의해, 가령, 프레임워크 영역 (예컨대, 본 출원에 기재된 프레임워크 서열 또는 인간 항체의 생식세포 공통 서열의 프레임워크 영역) 또는 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 가요성 링커, 가령, 폴리-글라이신 또는 글라이신/세린 링커에 의해 분리될 수 있다. 화학적 합성법으로 제조시, 고유의 화학적 결찰이 긴 펩타이드들 (예컨대, 50개 이상의 아미노산들)을 합성하기 위한 전략으로서 선택적으로 사용될 수 있다. 고유의 화학적 결찰 프로토콜은 해당 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함된 Dawson 외 (Science, 266:776-779, 1994)에 기재되어 있다. 단쇄 폴리펩타이드, 전장 항체, 및 항체 단편들의 제조를 위한 기술들에 관한 상세한 설명이 하기 부분에 제공된다.
핵산 및 발현 시스템
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 임의의 다양한 확립된 기술들에 의해 준비될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체를 재조합 발현시키기 위하여, 숙주 세포를 상기 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA 단편들을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터들로 형질감염시켜, 경쇄 및 중쇄들을 숙주 세포에서 발현시킬 수 있으며, 선택적으로, 숙주 세포가 배양되는 배지로 배출시키고, 이러한 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 가령, 본 출원에 참고문헌으로 포함된, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current 프로토콜 in Molecular Biology (Ausubel 외, eds., Greene Publishing Associates, 1989), 및 미국 특허 제 4,816,397에 기재된, 표준 재조합 DNA 방법들을 사용하여, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자들을 얻고, 이들 유전자들을 재조합 발현 벡터에 통합시키고, 벡터들을 숙주 세포들에 도입시킨다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드 발현용 벡터
바이러스 유전체는 외인성 유전자들을 세포 (예컨대, 진핵 또는 원핵 세포)의 유전체로 효율적으로 전달하기 위해 사용될 수 있는 벡터들의 풍부한 출처를 제공한다. 바이러스 유전체는 유전자 전달에 특히 유용한 벡터인데, 왜냐하면 이러한 유전체 내에 내포된 폴리뉴클레오타이드들은 통상적으로 일반화 또는 특수화 형질도입에 의해 표적 세포의 유전체로 통합되기 때문이다. 이러한 과정들은 자연적인 바이러스 복제 주기의 일부로 발생하며 유전자 통합을 유도하기 위해 추가되는 단백질 또는 시약들을 필요로 하지 않는다. 바이러스 벡터들의 예들에는, 레트로바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, Ad5, Ad26, Ad34, Ad35, 및 Ad48), 파르보바이러스 (예컨대, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA바이러스 가령, 오르토믹소바이러스 (예컨대, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스 (예컨대, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (예컨대 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA바이러스, 가령, 피코르나바이러스 및 알파바이러스, 및, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (예컨대, 단순 헤르페스 바이러스 1 및 2형, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스), 및 폭스바이러스 (예컨대, 백시니아, 변형된 백시니아 앙카라 (MVA), 계두 및 카나리폭스)를 비롯한 이중 가닥 DNA바이러스가 포함된다. 본 발명의 항체 경쇄 및 중쇄 또는 항체 단편들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들을 전달함에 유용한 다른 바이러스들에는, 예를 들어, 노웍 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스, 및 간염 바이러스가 포함된다. 레트로바이러스의 예들에는 다음이 포함된다: 조류 백혈병-육종, 포유동물 C-형, B-형 바이러스, D-형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스 (Coffin, J. M., Retro비리다에: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). 다른 예들에는 쥐과 백혈병 바이러스, 쥐과 육종 바이러스, 생쥐 젖 종양 바이러스, 소과 백혈병 바이러스, 고양이과 백혈병 바이러스, 고양이과 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 돼지 내인성 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스, 메이슨 화이저 원숭이 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 유인원 육종 바이러스, 라우스 육종 바이러스 및 렌티바이러스가 포함된다. 벡터의 다른 예들은, 예를 들어, 본 출원에 참고문헌으로 포함된 McVey 외, (미국 특허 제 5,801,030)에 기재되어 있다.
유전체 편집 기술
바이러스 벡터 이외에도, 유전자들, 예컨대, 그 중에서도, 항체 경쇄 및 중쇄들, 단쇄 폴리펩타이드, 단쇄 가변 단편 (scFvs), 탠덤 scFvs, Fab 도메인, F(ab')2 도메인, 디아바디, 및 트리아바디를 인코딩하는 유전자들을, 폴리펩타이드 발현을 위한 표적 세포의 유전체에 통합시키기 위한 또 다른 다양한 방법들이 개발되었다. 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 원핵 또는 진핵 세포에 통합시키기 위해 사용될 수 있는 이러한 한 방법은 트랜스포존을 포함한다. 트랜스포존은 유전자전위효소를 인코딩하고 5' 및 3' 위치에서 절제 부위들에 의해 플랭킹되는 관심 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 유전자를 내포하는 폴리뉴클레오타이드들이다. 트랜스포존이 세포 내부로 전달되었을 때, 유전자전위효소 유전자의 발현이 시작되고 트랜스포존으로부터 관심 유전자를 절단시키는 활성 효소가 생성된다. 이러한 활성은 유전자전위효소에 의한 트랜스포존 절제 부위들의 부위-특이적 인식에 의해 매개된다. 일부 구체예들에서, 이들 절제 부위들은 말단 반복부 또는 반전 말단 반복부일 수 있다. 트랜스포존으로부터 절제되면, 관심 유전자는 세포의 핵 유전체 내에 존재하는 유사한 절제 부위들의 유전자전위효소-촉매화된 절단에 의해 원핵 또는 진핵 세포의 유전체 내부에 통합될 수 있다. 이는 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편 또는 도메인을 인코딩하는 유전자가 절제 부위들에서 절단된 핵 DNA에 삽입될 수 있게 하며, 원핵 또는 진핵 세포 유전체의 DNA에 관심 유전자를 결합시키는 포스포다이에스터 결합들의 후속 결찰은 통합 과정을 완료시킨다. 일부 구체예들에서, 트랜스포존은 레트로트랜스포존일 수 있으며, 그리하여 항체를 인코딩하는 유전자는 먼저 RNA 산물로 전사된 다음 DNA로 역전사되고, 그 후 원핵 또는 진핵 세포 유전체에 통합된다. 예시적인 트랜스포존 시스템에는 피기백 (piggybac) 트랜스포존 (WO 2010/085699에 상세히 기재됨) 및 슬리핑 뷰티 (sleeping beauty) 트랜스포존 (US20050112764에 상세히 기재됨)이 포함되며; 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 인코딩하는 핵산 분자들을 원핵 또는 진핵 세포의 유전체에 통합시키는 또 다른 유용한 방법은 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas 시스템이며, 이는 바이러스에 의한 감염에 대해 세균 및 고세균에서 적응 방어 메커니즘으로 처음에 발달되는 시스템이다. CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드 DNA 내부의 회문구조 반복부 서열들 및 관련 Cas9 핵산분해효소로 구성된다. DNA 및 단백질의 이러한 앙상블은 먼저 외부 DNA를 CRISPR 좌위에 통합시킴으로써 표적 서열의 부위 특이적 DNA 절단을 지시한다. 이들 외부 서열들 및 CRISPR 좌위의 반복부-스페이서 요소들을 내포하는 폴리뉴클레오타이드는 결국 숙주 세포에서 전사되어 가이드 RNA를 생성하고, 이는 후속하여 표적 서열에 어닐링되고 Cas9 핵산분해효소를 이 부위에 국소화시킨다. 이러한 방식으로, 매우 부위-특이적인 cas9-매개된 DNA 절단이 외부 폴리뉴클레오타이드에 생성될 수 있는데, 이는 표적 DNA 분자의 근방에 cas9이 오게하는 상호작용이 RNA:DNA 혼성화에 의해 좌우되기 때문이다. 결과적으로, 임의의 관심 표적 DNA 분자를 절단하기 위한 CRISPR/Cas 시스템을 이론적으로 설계할 수 있다. 이러한 기술은 진핵 유전체를 편집하기 위해 이용되어 왔으며 (Hwang 외, Nat. Biotech., 31:227-229, 2013) 본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 통합 이전에 DNA를 절단하기 위해 진핵 또는 원핵 유전체를 부위-특이적으로 편집하는 효율적인 수단으로서 사용될 수 있다. 유전자 발현을 조절하기 위한 CRISPR/Cas의 사용은 미국 특허 제 8,697,359에 기재된 바 있으며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 TNFR2 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 통합시키기 전에 유전체 DNA를 부위-특이적으로 절단시키는 대안적인 방법들은 아연 핑거 핵산분해효소 및 전사 활성화제-유사 작동자 핵산분해효소 (TALENs)의 사용을 포함한다. CRISPR/Cas 시스템과 달리, 이들 효소들은 특정 표적 서열로 국소화시키기 위한 가이드 폴리뉴클레오타이드를 내포하지 않는다. 표적 특이성은 대신 이들 효소들 내부에 있는 DNA 결합 도메인들에 의해 제어된다. 유전체 편집 분야에 사용하기 위한 아연 핑거 핵산분해효소 및 TALENs는 Urnov 외 (Nat. Rev. Genet., 11:636-646, 2010); 및 in Joung 외, (Nat. Rev. Mol. 세포. Bio. 14:49-55, 2013)에 기재되어 있으며; 이들은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 원핵 또는 진핵 세포의 유전체에 통합시키기 위해 사용될 수 있는 추가적인 유전체 편집 기술은 ㅇ부위-특이적으로 유전체 DNA를 절단시키기 위해 합리적으로 설계될 수 있는 ARCUSTM 메가핵산분해효소의 사용을 포함한다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 원핵 또는 진핵 세포의 유전체에 통합시키기 위한 이들 효소들의 사용은 이러한 효소들에 대해 확립되어있었던 구조-활성 관계 면에서 특히 유리하다. 그러므로 단쇄 메가핵산분해효소들은 원하는 위치들에서 DNA를 선택적으로 절단하는 핵산분해효소들을 생성하기 위해 특정 아미노산 위치에서 변형될 수 있다. 이들 단쇄 핵산분해효소들은, 예컨대, 미국 특허 제 8,021,867 and 8,445,251에 자세히 설명되어 있으며; 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
폴리뉴클레오타이드 서열 요소들
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 발현시키기 위하여, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 본 출원에 기재된 CDR-H3 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를, 발현 벡터에 삽입하여, 상기 유전자들이 전사 및 번역 조절 서열들에 작동적으로 연결시킬 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열들은 사용되는 발현 숙주 세포와 양립가능하도록 선택된다. TNFR2 항체의 경쇄 유전자 및 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 확립된 기술들을 사용하여 별도의 벡터들에 삽입될 수 있고, 또는, 선택적으로,두 폴리뉴클레오타이드들 모두가 동일한 발현 벡터에 통합될 수 있다.
항체의 중쇄 및 경쇄들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (또는 단쇄 폴리펩타이드 또는 항체 단편, 가령, a scFv 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드) 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터들은 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자들의 발현을 조절하는 조절 서열들을 운반할 수 있다. 조절 서열들의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계는, 변형될 숙주 세포 또는 원하는 단백질의 발현 수준의 선택과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 포유동물 숙주 세포 발현에 적합한 조절 서열들은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소들, 가령, 거대세포바이러스 (CMV) (가령, CMV 프로모터/인핸서), 유인원 바이러스 40 (SV40) (가령, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예컨대, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래한 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소들, 및 이의 서열들에 관한 추가 설명은, 예컨대, 미국 특허 제 5, 168,062, 미국 특허 제 4,510,245, 및 미국 특허 제 4,968,615를 참고하라.
항체 사슬 유전자들 및 조절 서열들 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터들은 추가 서열들, 가령, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열들 (예컨대, 복제 원점) 및 선발가능한 마커 유전자들을 운반할 수 있다. 선발가능한 마커 유전자는 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예컨대, 미국 특허 제 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참고). 예를 들어, 전형적으로 선발가능한 마커 유전자는 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포에 세포독성 약물, 가령, G418, 퓨로마이신, 블라스티시딘, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 적합한 선발가능한 마커 유전자들에는 다이하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선발/증폭을 가진 DHFR" 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 네오 유전자 (G418 선발용)가 포함된다. TNFR2 항체 또는 TNFR2 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 발현시키기 위하여, 중쇄 및 경쇄들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들을 내포하는 발현 벡터(들)은 표준 기술들에 의해 숙주 세포로 형질감염될 수 있다.
변형된 길항 TNFR2 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열을 내포할 수 있으나, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3에서 상응하는 서열과 비교하여 나머지 CDRs 중 하나 이상의 서열의 차이를 특징으로 할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3를 내포할 수 있으나 하나 이상의 프레임워크 영역의 차이를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 하나 이상의 프레임워크 영역들은 인간 항체의 프레임워크 영역으로 치환될 수 있다. 예시적인 프레임워크 영역들에는, 예를 들어, US 7,829,086에 기재된 인간 프레임워크 영역, 및 EP 1945668에 기재된 영장류 프레임워크 영역이 포함되며; 상기 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 이러한 TNFR2 항체를 인코딩하는 핵산을 생성하기 위하여, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역들 중 최소한 하나, 또는 둘 모두를 인코딩하는 DNA 단편들이 화학적 합성에 의해 (예컨대, 고체상 폴리뉴클레오타이드 합성 기술에 의해), 시험관내 유전자 증폭 (예컨대, 중합효소 연쇄 반응 기술에 의해), 또는 숙주 유기체에서 폴리뉴클레오타이드의 복제에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-TNFR2 항체를 인코딩하는 핵산들은, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3를 공통 항체의 프레임워크 잔기들에 통합시키기 위해 경쇄 및 중쇄 가변 서열들을 인코딩하는 생식세포 DNA 또는 cDNA의 증폭 및 변형에 의해 수득될 수 있다. 일부 구체예들에서, 인간화 길항 TNFR2 항체는 TFNRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3, 또는, 임의의 이러한 CDR-H3 서열들 또는 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열들에 대해 1 내지 3개의 아미노산 치환들 (예컨대, 보존적 또는 비보존적 치환)을 내포하는 서열들에 최소한 85% 서열 동일성 (예컨대, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 가지는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어, 생식세포 DNA 또는 cDNA의 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하고 생성된 폴리뉴클레오타이드들을 확립된 절차에 따라 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 증폭시킴으로써 구현될 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자들에 대한 생식세포 DNA 서열들은 해당 분야에 공지이다 (예컨대, "VBASE" 인간 생식세포 서열 데이터베이스 참고; 또한 Kabat 외, Sequences of Proteins of 면역학적 Interest, Fifth Edition, 미국 보건복지부, NIH Publication No. 91 -3242, 1991; Tomlinson 외, J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992; 및 Cox 외, Eur. J. Immunol. 24:827- 836, 1994 참고; 상기 문헌들은 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3를 내포하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 인코딩하는 키메라 핵산 구조체들은, 예컨대, 해당 분야에 공지된 확립된 클로닝 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 추가적으로, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TFNR2A3의 CDR-H3를 내포하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 합성하고 관례적인 돌연변이유발 기술을 사용하여 본 출원에 기재된 변이체를 생성하기 위한 돌연변이유발용 주형으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 변이체를 인코딩하는 DNA 단편이 직접 합성될 수 있다 (예컨대, 확립된 고체상 핵산 화학 합성 절차에 의해).
일단 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3를 내포하는 VH 분절들을 인코딩하는 DNA 단편들이 수득되면, 이들 DNA 단편들은, 가변 영역 유전자들을 전장 항체 사슬 유전자들로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위하여, 예컨대, 표준 재조합 DNA 기술로 추가 조작될 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-인코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 가령, 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 인코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 항-TNFR2 항체의 VH 영역을 인코딩하는 분리된 DNA는, 예컨대, VH-인코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 도메인 (CH1, CH2, CH3, 및, 선택적으로, CH4)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합시킴으로써 전장 중쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 중쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자들의 서열들은 해당 분야에 공지이며 (예컨대, Kabat 외, Sequences of Proteins of 면역학적 Interest, Fifth Edition, 미국 보건복지부, NIH Publication No. 91 -3242, 1991 참고) 이들 영역들을 포함하는 DNA 단편들은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으며, 특정 구체예들에서는 IgG1 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자에 있어서, VH-인코딩 DNA는 중쇄 CH1 도메인 만을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다.
항-TNFR2 항체의 VL 영역을 인코딩하는 분리된 DNA는 VL-인코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자들의 서열들은 해당 분야에 공지이고 (예컨대, Kabat 외, Sequences of Proteins of 면역학적 Interest, Fifth Edition (미국 보건복지부, NIH Publication No. 91 -3242, 1991) 참고) 이들 영역들을 포함하는 DNA 단편들은, 예컨대, 이들 영역들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 원핵 또는 진핵 세포에서의 증폭에 의해, PCR 증폭에 의해, 또는 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 (
Figure pct00025
) 또는 람다 (
Figure pct00026
) 불변 영역일 수 있으나, 특정 구체예들에서 카파 불변 영역일 수 있다. scFv 유전자를 생성하기 위해, VH 및 VL-인코딩 DNA 단편들을 가요성 링커를 인코딩하는 또 다른 단편, 예컨대, 가요성, 친수성 아미노산 서열, 가령, 아미노산 서열 (Gly4Ser)3,을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결시켜, VH 및 VL 서열들이 인접 단쇄 단백질로서 발현될 수 있으며, VL 및 VH 영역들은 상기 링커에 의해 결합되어 있다 (예컨대, Bird 외, Science 242:423-426, 1988; Huston 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; McCafferty 외, Nature 348:552-554, 1990 참고).
TNFR2의 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄들 중 하나 또는 모두를 인코딩하는 DNA의 일부 또는 모두를 제거하기 위하여 재조합 DNA 기술 또한 사용될 수 있다. 이러한 절두된 DNA 분자들로부터 발현된 분자들 또한 본 발명이 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄는 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3로부터 유래한 CDR-H3 서열을 내포하고, 다른 하나의 중쇄 및/또는 경쇄들은 TNFR2 이외의 항원에 특이적인 이중기능성 항체가 제조될 수 있다. 이러한 항체는, 예컨대, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열을 내포하는 중쇄와 항-TNFR2 항체, 가령, 작용제도 길항제도 아닌 항-TNFR2 항체의 경쇄를, 표준적인 화학적 교차결합 방법들에 의해 (예컨대, 이황화물 결합 형성에 의해) 제 2 항체의 중쇄 및 경쇄에 교차결합 시킴으로써 생성될 수 있다. 이중기능성 항체는 또한 원핵 또는 진핵 세포에서 이중기능성 항체를 인코딩하기 위하여 조작된 핵산 분자를 발현시켜 제조될 수도 있다.
이원 특이적 항체, 즉, 동일한 결합 부위를 사용하여 TNFR2 및 상이한 항원에 결합하는 항체는, 경쇄 및/또는 중쇄 CDRs의 아미노산 잔기들을 돌연변이 시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 구체예들에서, 2개의 항원들, 가령, TNFR2 및 제 2 세포-표면 수용체에 결합하는 이원 특이적 항체는, 항원 결합 부위의 말초에 있는 아미노산 잔기들을 돌연변이시킴으로써 제조될 수 있다 (Bostrom 외, Science 323: 1610-1614, 2009). 이중 기능성 항체는 이원 특이적 항체를 인코딩하도록 조작된 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 변형된 길항 TNFR2 항체 및 항체 단편들은 또한 화학적 합성법에 의해 제조될 수도 있다 (예컨대, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, 111에 기재된 방법들에 의해; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 변이체 항체 또한 무-세포 합성 플랫폼을 사용하여 생성될 수 있다 (예컨대, Chu 외, Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
길항 TNFR2 폴리펩타이드 발현을 위한 숙주 세포
핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 발현시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)의 발현은, 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체의 최적 분비를 위해 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 숙주 세포에서 실시된다. 본 발명의 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현시키기 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포들에는 중국 햄스터 난소 (CHO 세포) (Urlaub 및 Chasin (1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)에 기재된 DHFR CHO 세포 포함, 예컨대, Kaufman 및 Sharp (1982, Mol. Biol. 159:601-621)에 기재된 DHFR 선발가능한 마커와 함께 사용됨), NSO 골수종 세포, COS 세포, 293 세포, 및 SP2/0 세포가 포함된다. 항체 및 이의 단편들의 발현에 유용할 수 있는 추가적인 세포 유형들에는 세균 세포, 가령, BL-21(DE3) 대장균 (E. coli) 세포가 포함되며, 이는 확립된 프로토콜에 따라 외부 DNA를 내포하는 벡터들로 형질전환될 수 있다. 항체의 발현에 유용할 수 있는 추가적인 진핵 세포들에는 효모 세포, 가령, S. 세레비시아에 (S. cerevisiae)의 영양요구 균주가 포함되며, 이는 해당 분야에 공지된 확립된 절차에 따라 형질전환되어 불완전 배지에서 선택적으로 성장될 수 있다. 항체 유전자들을 인코딩하는 재조합 발현 벡터들이 포유동물 숙주 세포들에 도입되는 경우, 이러한 항체들은 숙주 세포들에서 항체가 발현되기에 또는, 숙주 세포들이 성장되고 있는 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 시기동안 숙주 세포들을 배양함으로써 제조된다.
폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 표준 단백질 정제 방법들을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 숙주 세포는 또한 무손상 항체의 부분들, 가령, Fab 단편 또는 scFv 분자들을 제조하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명은 또한 상기 절차가 해당 분야에 공지된 확립된 프로토콜에 따라 변화되는 방법들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항-TNFR2 항체의 항원-결합 단편을 제조하기 위해 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄 (그러나 모두는 아님)를 인코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)가 재조합 발현에 의해 제조되었을 경우, 이는 해당 분야에 공지된 임의의 방법들에 의해, 가령, 면역글로불린 분자의 정제에 유용한 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피 (예컨대, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 또는 단백질 G 선택 후 TNFR2에 대한 친화성에 의한 이온 교환, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 또는 이의 단편들은 정제를 용이하게 하기 위해 또는 치료적 접합체들을 제조하기 위해 본 출원에 기재된 또는 달리 해당 분야에 공지된 이종 폴리펩타이드 서열들에 융합될 수 있다 (하기 "길항 TNFR2 폴리펩타이드 접합체" 참고).
분리되었으면, 항-TNFR2 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 필요에 따라, 예컨대, 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 (예컨대, Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980) 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨), 또는, 가령, SuperdexTM 75 컬럼 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, 스웨덴) 상에서의 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가 정제될 수 있다.
길항 항-TNFR2 폴리펩타이드를 생성 및 친화성-성숙하기 위한 플랫폼
수용체 길항작용을 촉진시키는 TNFR2의 맵핑 에피토프
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)의 라이브러리들을 수용체 활성화 보다는 수용체 길항작용을 선택적으로 촉진시키는 TNFR2 내 에피토프에 결합할 수 있는 기능적 분자들에 대해 선별함으로써 제조될 수 있다. 이러한 에피토프는 TNFR2 내 원하는 에피토프에 상응하는 잔기들을 내포하는 일련의 선형 또는 고리형 펩타이드들에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 선별함으로써 모델화될 수 있다.
한 예로서, 수용체 길항작용을 촉진하는 TNFR2로부터 분리된 개개 단편들을 내포하는 펩타이드들은 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 펩타이드 합성 기술에 의해 합성될 수 있다. 이들 펩타이드들은 고체 표면에 고정화되어 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편), 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3에 결합하는 분자들에 대해, 예컨대, 확립된 절차들을 사용하는 ELISA-기반 선별 플랫폼을 사용하여 선별될 수 있다. 이러한 분석법을 사용하여, 그리하여 높은 친화성으로 TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3에 특이적으로 결합하는 펩타이드들은 이들 항체에 우선적으로 결합하는 TNFR2의 에피토프 내 잔기들을 내포한다. 이러한 방식으로 확인된 펩타이드들 (예컨대, 서열 번호: 11, 19, 20, 34-117, 285, 및 286 중 어느 하나의 서열을 가지는 펩타이드들, 또는 서열 번호: 7의 위치 80 내지 130 사이의 약 10개 내지 약 30개의 연속 또는 불연속 아미노산들을 내포하는 펩타이드들)은 본 발명의 항-TNFR2 항체를 확인하기 위한 항체 및 이의 항원-결합 단편의 라이브러리들을 선별하기 위하여 사용될 수 있다. 더욱이, 이들 펩타이드들은 수용체 길항작용을 촉진시키는 TNFR2 내 에피토프에 대한 대용물로 기능하기 때문에, 이러한 선별 기술을 사용하여 생성된 항체들은 TNFR2에서 상응하는 에피토프에 결합할 수 있으며 수용체 활성의 길항제가 될 것으로 예상된다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드에 관한 라이브러리들의 선별
TNFR2 내 에피토프에 결합할 수 있는 분자들 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 가지는 펩타이드들)에 관한 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편) 라이브러리의 고 처리능 선별 방법들에는, 제한 없이, 파지 디스플레이, 세균 디스플레이, 효모 디스플레이, 포유동물 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이, 및 cDNA 디스플레이를 비롯한 디스플레이 기술이 포함된다. 생물학적 관련 분자들에 결합하는 리간드들을 분리하기 위한 파지 디스플레이의 사용은, 예컨대, Felici 외 (Biotechnol. Annual Rev. 1:149-183, 1995), Katz (Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45, 1997), 및 Hoogenboom 외 (Immunotechnology 4:1-20, 1998)에서 검토된 바 있다. 상이한 표적들, 예컨대, 세포 표면 수용체 또는 DNA에 결합하는 폴리펩타이드를 선택하기 위하여 몇몇 임의적으로 조합된 펩타이드 라이브러리들이 만들어진 바 있다 (Kay (Perspect. Drug Discovery Des. 2, 251-268, 1995), Kay 외, (Mol. Divers. 1:139-140, 1996)에 의해 검토). 단백질 및 다량체 단백질들은 기능적 분자들로서 성공적으로 파지-디스플레이 되었다 (EP 0349578A, EP 4527839A, EP 0589877A; Chiswell 및 McCafferty (Trends Biotechnol. 10, 80-84 1992) 참고). 또한, 기능적 항체 단편들 (예컨대 Fab, 단쇄 Fv [scFv])이 발현되었다 (McCafferty 외 (Nature 348: 552- 554, 1990), Barbas 외 (Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:7978-7982, 1991), Clackson 외 (Nature 352:624-628, 1991)). 이들 문헌들은 본 출원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
(i) 파지 디스플레이 기술
한 예로서, 수용체 길항작용을 촉진시키는 TNFR2 내 에피토프(예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 가지는 펩타이드)를 내포하는 고리형 또는 다중고리형 펩타이드들에 결합할 수 있는 기능적 분자들에 관한 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)의 라이브러리들을 선별하기 위해 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 무작위화된 초가변 영역을 내포하는 단쇄 항체 단편, 가령, scFv 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들의 라이브러리는 확립된 절차들 (예컨대, 고체상 폴리뉴클레오타이드 합성법 또는 오류-유발 PCR 기술, McCullum 외 (Meth. Mol. Biol., 634:103-109, 2010) 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨)을 사용하여 수득될 수 있다. 이들 무작위화된 폴리뉴클레오타이드들은 후속적으로 바이러스 유전체에 통합되고, 그리하여 이러한 유전자들에 의해 인코딩되는 무작위화된 항체 사슬들은 섬유상 파지 표면에서, 예컨대, 항체 사슬과 외피 단백질 (예컨대, M13 파지 표면 상의 pIII 외피 단백질) 사이의 공유 결합에 의하여 발현될 수 있다. 이는 항체 사슬의 유전자형 및 표현형 사이의 물리적 연결을 제공한다. 이러한 방식에서, 초가변 영역들에서 무작위 돌연변이들을 내포하는 다양한 항체 사슬들을 디스플레이하는 파지 라이브러리는, 확립된 절차들을 사용하여 표면에 고정화되는 TNFR2 에피토프 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 가지는 펩타이드)에 결합하는 외부 항체 사슬들의 능력에 대해 선별될 수 있다. 예를 들어, 이러한 펩타이드들은, 펩타이드와 에피토프 태그 (예컨대, 비오틴) 사이에 공유 결합을 형성하고, 높은 친화성으로 상기 펩타이드에 부착된 태그에 결합하는 상보적 태그 (예컨대, 아비딘)로 사전에 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 웰들에서 이들 펩타이드를 배양함으로써 마이크로타이터 플레이트의 표면에 물리적으로 결합될 수 있다. 적합한 에피토프 태그들에는, 제한 없이, 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-전달효소, 폴리-히스티딘 태그, FLAG-태그, myc-태그, 인간 인플루엔자 적혈구응집소 (HA) 태그, 비오틴, 스트렙타비딘이 포함된다. 이들 분자들에 의해 제공되는 에피토프들을 내포하는 펩타이드들은, 각각 말토스, 글루타티온, 니켈-내포 복합체, 항-FLAG 항체, 항-myc 항체, 항-HA 항체, 스트렙타비딘, 또는 비오틴과 상보적인 분자들을 내포하는 표면 상에서 고정화될 수 있다. 이러한 방식에서, 파지는 적절한 완충제 시스템 (예컨대, 생리학적 염 농도, 이온 강도를 내포하는 완충제 시스템, 그리고 완충제에 의해 생리학적 pH로 유지됨)의 존재하에서 그리고 구속된 펩타이드에 대한 항체의 결합을 가능하게 하기에 적합한 시간 동안 고정화된 TNFR2-유래 펩타이드를 내포하는 표면과 함께 배양될 수 있다. 그 후 특정 역치 값 보다 큰 친화성으로 TNFR2-유래 펩타이드들과 상호작용하는 항체 사슬들이 존재하지 않는 파지를 제거하기 위하여 상기 표면은 (예컨대, 0.1% Tween-20을 내포하는 인산염 완충제으로) 세척될 수 있다.
이러한 초기 패닝(panning) (즉, 선별) 단계 후 남아있는 폴리펩타이드의 친화성은 세척 단계의 조건들을 조절함으로써 (예컨대, 온화한 산성 또는 염기성 성분들을 포함시킴으로써, 또는 항원-결합 부위들에 고정화된 펩타이드와 경쟁하기위해 저 농도의 다른 TNFR2-유래 펩타이드들을 포함시킴으로써) 조절될 수 있다. 이러한 방식에서, 세척 단계 후 마이크로타이터 플레이트의 표면에 결합되어 남는 파지의 집단에는 수용체 길항작용을 촉진시키는 TNFR2-유래 펩타이드 에피토프에 결합하는 파지가 풍부해진다. 남아있는 파지들은 그 후 단백질-단백질 상호작용 강도를 감소시키기 위해 이들 펩타이드들을 내포하는 표면으로부터 이러한 파지를 용리시킴으로써 (예컨대, 주변 pH, 이온 강도, 또는 온도를 변화시킴으로써) 증폭될 수 있다. 이어서, 분리된 파지는, 예컨대, 세균 세포를 감염시킴으로써 증폭될 수 있으며, 생성된 파지는 선택적으로, 보다 높은-친화성의 항-TNFR2 폴리펩타이드가 존재하는 파지 집단이 더 풍부해지도록 하기 위하여 선별을 추가로 반복함으로써 패닝될 수 있다. 이러한 패닝 단계들 후, 고-친화성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 디스플레이하는 파지는 후속하여 분리될 수 있으며 인코딩되는 항체의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열들을 확인하기 위해 이들 파지의 유전체는 시퀀싱될 수 있다. 이와 같은 파지 디스플레이 기술은, 예컨대, TNFR2의 길항제로 사용될 수 있는 본 발명의 항체 사슬들, 가령, scFv 단편, 탠덤 scFv 단편, 및 다른 항원-결합 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 고 친화성으로 특정 항원에 결합하는 항체 사슬들 및 이의 항원-결합 단편을 확인하기 위한 예시적인 파지 디스플레이 프로토콜은 잘 확립되어 있으며, 예컨대, 미국 특허 제 7,846,892, WO 1997/002342, 미국 특허 제 8,846,867, 및 WO 2007/132917에 기재되어 있고; 이 문헌들은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 수용체 길항작용을 촉진하는 TNFR2 내 에피토프 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 가지는 펩타이드들에 의해 제시되는 에피토프)에 결합하는 본 발명의 항체-유사 스캐폴드 (예컨대, 10Fn3 도메인)를 생성하기 위하여 유사한 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다. 항체-유사 스캐폴드 단백질을 확인하기 위한 예시적인 파지 디스플레이 프로토콜은, 예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함되어 있는 WO 2009/086116에 기재되어 있다.
(i) 세포-기반 디스플레이 기술
용매-노출된 폴리펩타이드의 유전자형과 표현형 사이의 연관을 연구하는 다른 시험관내 디스플레이 기술은 효모 및 세균 디스플레이를 포함한다. 효모 디스플레이 기술은 해당 분야에 확립되어 있으며 많은 양의 항체 (종종 최대 30,000)가 개개의 효모 세포 표면에 제시될 수 있다는 점에서 종종 유리하다 (예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함된 Boder 외 (Nat Biotechno. 15:553, 1997) 참고). 섬유상 파지 보다 큰 크기의 효모 세포는 또 다른 선별 전략을 사용할 수 있는데, 효모의 라이브러리를 분석 및 분류하기 위해 유세포분석을 사용할 수 있다. 예를 들어, 확립된 절차들은 무작위화된 초가변 영역들을 내포하는 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)를 발현시키는 세균 세포 또는 효모 세포의 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제 7,749,501 및 US 2013/0085072 참고; 이들 문헌 각각의 내용은 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 예를 들어, 미감작 scFv 단편들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 효모 세포의 대형 라이브러리를 확립된 절차들을 사용하여 만들 수 있다 (de Bruin 외, Nat Biotechnol 17:397, 1999; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 이어서 패닝 단계 동안 이들 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 효모 세포들을 다음과 같은 2가지 상이한 형광 분자들과 함께 배양할 수 있다: 항체 내 보존된 잔기들에 결합하므로 디스플레이된 항체의 양을 반영하는 하나의 염료, 그리고 상이한 파장에서 형광을 방출하고 항원에 결합하므로 결합된 항원의 양을 표시하는 또 다른 염료. 예를 들어, 해당 분야의 숙련된 기술자는, 선택적으로 항체-항원 결합을 방해할 것으로 예상되지 않는 펩타이드의 N- 또는 C-말단에서 또는 잔기에서, 에피토프 태그 (예컨대, 비오틴)에 접합되어 있었던 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 내포하는 TNFR2-유래 펩타이드를 사용할 수 있다. 이는 상보적 태그 (예컨대, 아비딘)로 표지된 형광 염료가 항체-항원 복합체로 국소화될 수 있게 한다. 이는 선택의 진행에 대하여 상당한 유연성 그리고 즉각적인 피드백을 가져온다. 파지 디스플레이와 대조적으로, 항체 디스플레이 수준에 대해 정규화시킴으로써, 보다 큰 발현 수준 보다, 보다 높은 친화성을 가지는 항체가 용이하게 선택될 수 있다. 실제로, 단 2-배만큼 상이한 친화도의 항체를 구별하고 분류할 수 있다 (VanAntwerp 및 Wittrup (Biotechnol Prog 16:31, 2000)).
(ii) 뉴클레오타이드 디스플레이 기술
무작위화된 폴리뉴클레오타이드 라이브러리의 시험관내 번역을 이용하는 디스플레이 기술 또한 본 발명의 항-TNFR2 항체를 생성하기 위한 강력한 접근법을 제공한다. 예를 들어, 지정된 초가변 영역들 내 돌연변이들을 내포하는 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)를 인코딩하는 무작위화된 DNA 라이브러리를, 예컨대, 본 출원에 기재된 바와 같이 확립된 PCR-기반 돌연변이유발 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 이러한 라이브러리들의 폴리뉴클레오타이드는 전사 조절 서열들, 가령, 프로모터 및 전사 종결 서열들을 내포할 수 있으며, 생성된 mRNA 구조체의 번역 속도를 증가시키는 서열들 (예컨대, IRES 서열, 5' 및 3' UTRs, 폴리-아데닐화 트랙 등)을 추가적으로 인코드할 수 있다. 이들 폴리뉴클레오타이드 라이브러리는 DNA 서열들의 수용성 mRNA 분자들로의 전사를 가능하게 하기 위하여 RNA 중합효소 및 RNA 뉴클레오사이드 트라이포스페이트 (NTPs)를 내포하는 적절히 완충된 용액에서 배양될 수 있으며, 후속하여 용액에 존재하는 대형 및 소형 리보솜 아단위, 아미노아실 tRNA 분자, 및 번역 개시 및 연신 인자들에 의해 번역될 수 있다 (예컨대, PURExpress® 시험관내 단백질 합성 키트, New England Biolabs® 사용). 설계된 mRNA 변형들은 항체 생성물들이 퓨로마이신에 대한 화학적 결합에 의해 mRNA 주형에 공유 결합된 채 남아있게 할 수 있다 (예컨대, Keefe (Curr. Protoc. Mol. Biol., Chapter 24, Unit 24.5, 2001) 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 그러므로 이러한 유전자형-표현형 연계는, mRNA:항체 융합 구조체들을 표면에 고정화된 펩타이드와 함께 배양하고 파지 디스플레이 기술과 유사한 방식으로 패닝함으로써 TNFR2-유래 펩타이드 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 가지는 펩타이드)에 결합하는 항체를 선택하기 위하여 사용될 수 있다 (예컨대, WO 2006/072773 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
선택적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는, 항체 생성물이 퓨로마이신 링커에 의해 공유적으로 결합하기 보다는 리보솜-mRNA 복합체에 대해 비-공유적으로 결합될 수 있다는 것을 제외하고, 유사한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 리보솜 디스플레이로 공지된 이러한 플랫폼은, 예컨대, 미국 특허 제 7,074,557에 기재되어 있으며; 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 대안적으로, 항체는 mRNA가 아닌 cDNA가 퓨로마이신 링커에 의해 항체 생성물에 공유 결합된다는 점을 제외하고 mRNA 디스플레이와 유사한 기술인 cDNA 디스플레이를 사용하여 생성될 수 있다. cDNA 디스플레이 기술은 더욱더 엄격한 조건들하에서, 예컨대, 특히 TNFR2-유래 펩타이드에 대한 높은 친화성을 가지는 항체를 선별하기 위해 염 농도, 이온 강도, pH, 및/또는 주위환경의 온도가 조절되는 조건하에서 패닝 단계들을 실시할 수 있는 이점을 제공한다. 이는 단일-가닥 mRNA 보다 높은 이중-가닥 cDNA의 자연적인 안정성으로 인한 것이다. cDNA 디스플레이 선별 기술은, 예컨대, Ueno 외 (Methods Mol. Biol., 805:113-135, 2012)에 기재되어 있으며; 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)를 생성하는 것 이외에도, 시험관내 디스플레이 기술 (예컨대, 본 출원에 기재된 그리고 해당 분야에 공지된 기술들) 또한 본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드의 친화성 개선 방법을 제공한다. 예를 들어, 완전히 무작위화된 초가변 영역들을 내포하는 항체 및 이의 단편들의 라이브러리를 선별하는 것 보다는, 초가변 영역들 내 특정 부위들에서 표적된 돌연변이들을 특징으로 하는 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 보다 좁은 라이브러리를 선별할 수 있다. 이는, 예컨대, 초가변 영역들 내 특정 부위들에서만 무작위 돌연변이들을 인코딩하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들의 라이브러리를 어셈블리함으로써 구현될 수 있다. 다음으로 이들 폴리뉴클레오타이드들은, 예컨대, TNFR2 에피토프 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 내포하는 펩타이드)에 개선된 결합 친화성으로 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 선별하기 위한 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이, 또는 cDNA 디스플레이 기술을 사용하여, 예컨대, 섬유상 파지, 세균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 효모 디스플레이는, 친화성 성숙화에 아주 적합하며, 단쇄 항체의 친화성을 48 fM의 KD로 개선하기 위해 기존에 사용되어 왔다 (Boder 외 (Proc Natl Acad Sci USA 97:10701, 2000)).
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)의 생성 및 친화성 성숙화를 위해 사용될 수 있는 추가적인 시험관내 기술은 TNFR2-유래 펩타이드 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드)에 특이적으로 결합할 수 있는 기능적 분자들에 관해 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 조합 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다. 조합 항체 라이브러리는, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 무작위화된 초가변 영역들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 진핵 또는 원핵 세포에서 발현시킴으로써 수득될 수 있다. 이는, 예컨대, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 유전자 발현 기술을 사용하여 구현될 수 있다. 항체의 이종 혼합물은, 예컨대, 단백질 A 또는 단백질 G 선택, 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이에 의해, 및/또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 이렇게 수득된 조합 라이브러리의 라이브러리는, 예컨대, 이들 항체의 이종 혼합물을 표면에 고정화 되어있는 TNFR2 유래 펩타이드 (예컨대, 고체상 수지의 표면 또는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 고정화된 서열 번호: 285 또는 286의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드)와 함께 항체-항원 결합을 가능하게 하기에 충분한 시기 동안 배양함으로써 선별될 수 있다. 비-결합 항체 또는 이의 단편들은 적절한 완충제 (예컨대, 생리학적 pH (대략 7.4)로 완충시킨 그리고 생리학적 염 농도 및 이온 강도를 내포하는, 그리고 선택적으로 세척제, 가령, TWEEN-20을 내포하는 용액)으로 표면을 세척함으로써 제거될 수 있다. 결합된 채 남아있는 항체는 후속하여, 예컨대, ELISA-기반 탐지 프로토콜 (예컨대, 미국 특허 제 4,661,445 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨)을 사용하여 탐지될 수 있다.
폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)의 조합 라이브러리를 TNFR2-유래 펩타이드 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 아미노산 서열을 내포하는 펩타이드)에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 대해 선별하는 추가적인 기술에는 항체 단편들의 1-비드-1-화합물 라이브러리의 선별이 포함된다. 항체 단편들은 친수성의, 수-팽윤성 물질로 구성된 고체 비드 상에 (예컨대, 확립된 분할 혼합 (split-and-pool) 고체상 펩타이드 합성 프로토콜을 사용하여) 화학적으로 합성되어, 각각의 비드가 단일 항체 단편을 나타내도록 할 수 있다. 이어서 이종 비드 혼합물은, 탐지가능한 모이어티 (예컨대, 형광 염료)로 선택적으로 표지되거나 상보적 태그 (예컨대, 각각 아비딘, 비오틴, 항-FLAG 항체, 항-HA 항체)로 처리하여 추후 탐지될 수 있는 에피토프 태그 (예컨대, 비오틴, 아비딘, FLAG 태그, HA 태그)에 접합된, TNFR2-유래 펩타이드와 함께 배양될 수 있다. TNFR2-유래 펩타이드 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 아미노산 서열을 내포하는 펩타이드)에 특이적으로 결합하는 항체 단편들을 내포하는 비드들은 형광으로-표지된 항원 또는 상보적 태그와 함께 배양 후 비드들의 형광 성질을 분석함으로써 확인할 수 있었다 (예컨대, 공초점 형광 현미경검사법에 의해 또는 형광-활성화된 비드 분류에 의해; 예컨대, Muller 외 (J. Biol. Chem., 16500-16505, 1996) 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). TNFR2-유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 단편들을 내포하는 비드들은 고-친화성 항체 단편들을 내포하지 않는 비드들로부터 분리될 수 있다. TNFR2-유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 단편의 서열은, 그 중에서도 예컨대, 에드만 분해, 탠덤 질량 분광법, 매트릭스-보조 레이저-탈착 비행 시간형 질량 분광법 (MALDI-TOF MS), 핵 자기 공명 (NMR), 및 2D 겔 전기영동을 비롯하여 해당 분야에 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다 (예컨대, WO 2004/062553 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
폴리펩타이드의 음성 선별
수용체 길항작용을 촉진시키는, 인간 TNFR2 유래 에피토프에 특이적으로 결합하는 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편을 선별하는 상기 기재된 방법들 이외에도, KCSPG 서열을 내포하는 에피토프에도 또한 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편들을 제거하기 위하여 음성 선별을 추가로 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 임의의 선별 기술의 결과로서 분리된 항체 또는 항체 단편들의 혼합물은 KCSPG 모티프를 내포하는 인간 TNFR2로부터 유래한 펩타이드, 가령, 서열 번호: 7의 잔기들 48-67을 내포하는 펩타이드 (QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC, 서열 번호: 18)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편들에 대해 선별될 수 있다. 이는, 예컨대, 선별되는 항체 또는 항체 단편들이 KCRPG 서열 중 하나 이상의 잔기들 (예컨대, 최소한 KCR 서열)을 내포하는 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 사전에 확인되었던 단편들이 되도록 하는 상기 기재한 임의의 방법들 또는 이의 변형들을 사용하여 이루어질 수 있다. 음성 선별에 유용한 예시적인 기술에는 상기 기재된 또는 해당 분야에 공지된 기술들, , 가령, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 세균 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이, cDNA 디스플레이, 또는 표면-기반 조합 라이브러리 선별 (예컨대, ELISA 형식으로)이 포함된다. 이러한 선별 기술은 길항 TNFR2 항체 또는 항체 단편을 확인하기에 유용한 전략을 제시하는데, KCRPG 서열 중 하나 이상의 잔기들 그리고 KCSPG 서열을 내포하는 TNFR2 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편들은 길항 활성이 없거나 또는 유의하게 감소된 길항 활성을 가지는 것으로 나타났기 때문이다.
비-인간 포유동물의 면역화
본 발명의 길항 TNFR2 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위하여 사용될 수 있는 또 다른 전략은 비-인간 포유동물을 면역화시키는 것을 포함한다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체 및 이의 단편들을 제조하기 위해 면역화될 수 있는 비-인간 포유동물들의 예들에는 토끼, 생쥐, 쥐, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 및 양, 뿐만 아니라 비-인간 영장류가 포함된다. 예를 들어, 영장류를 면역화시키는 확립된 절차들은 해당 분야에 공지이다 (예컨대, WO 1986/6004782 참고; 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 면역화는 B 림프구의 항원 특이성을 연구함으로써 단클론 항체를 제조하는 강력한 방법을 제시한다. 예를 들어, 단클론 항체는 콜러-밀스타인 (Kohler-Millstein) 과정에 의해 제조될 수 있으며 (예컨대, EP 0110716에 기재됨; 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함됨), 이 때 비-인간 동물 (예컨대, 영장류)의 비장 세포를 수용체 길항작용을 촉진하는 TNFR2-유래 항원을 제시하는 펩타이드 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 아미노산 서열을 내포하는 펩타이드)로 면역화시켰다. 면역화에 의해 생성된 클론-확대된 B 림프구는 해당 동물의 혈청으로부터 분리되고 후속하여 하이브리도마를 형성하기 위해 골수종 세포와 융합될 수 있다. 이들 불멸화된 세포는 항원-특이적 항체의 지속적 공급을 제공할 수 있기 때문에 하이브리도마는 항체 제조에 특히 유용한 제제이다. 이러한 하이브리도마로부터 얻은 항체는 후속적으로, 해당 분야에 공지된 기술을 사용하여, 예컨대, 시약들, 가령, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지의 항체를 정제함으로써 분리될 수 있다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드 접합체
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)를 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에게 투여하기 전에, 상기 항체 또는 이의 단편을 제 2 분자에 접합시키는 것이, 예컨대, 생체내에서 항체의 활성을 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 길항 TNFR2 항체 및 이의 단편들은 해당 분야에 널리 공지되어 있는 다양한 확립된 접합 전략들 중 어느 하나를 사용하여 항체의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단의 다른 분자들에 접합될 수 있다. 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편을 또 다른 분자에 공유적으로 테더링시키기 위해 사용될 수 있는 반응성 작용 그룹들의 쌍들의 예들에는, 제한 없이, 싸이올 쌍, 카르복시산 및 아미노 그룹, 케톤 및 아미노 그룹, 알데하이드 및 아미노 그룹, 싸이올 및 알파, 베타-불포화 모이어티 (가령, 말레이미드 또는 디하이드로알라닌), 싸이올 및 알파-할로 아마이드, 카르복시산 및 하이드라지드, 알데하이드 및 하이드라지드, 그리고 케톤 및 하이드라지드가 포함된다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 설명한 바와 같은 화학적 접합에 의해 또 다른 분자에 직접 공유 결합될 수 있다. 대안적으로, 길항 TNFR2 항체 및 이의 단편을 내포하는 융합 단백질은 세포 (예컨대, 진핵 세포 또는 원핵 세포)로부터 재조합적으로 발현될 수 있다. 이는, 예를 들어, 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 세포의 핵 유전체에 (예컨대, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 기술들을 사용하여) 통합시킴으로써 구현될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 항체 및 이의 단편은 항체와 링커 사이에 공유 결합을 형성함으로써 제 2 분자에 결합될 수 있다. 그 후 이러한 링커는 후속적으로 또 다른 분자에 접합될 수 있으며, 또는 이러한 링커는 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편에 결찰되기 전 또 다른 분자에 접합될 수 있다. 접합체 형성에 사용될 수 있는 링커들의 예들에는 폴리펩타이드 링커, 가령, 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산들을 내포하는 것들이 포함된다. 일부 구체예들에서, D-아미노산 잔기들은 자연-발생 단백질에 존재하지 않으므로 링커에 D-아미노산들을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 그리하여 내인성 단백분해효소에 의한 분해에 더욱 내성을 띠게 된다. 폴리펩타이드 링커들을 내포하는 융합 단백질은 화학적 합성 기술, 가령, 본 출원에 기재된 기술들을 사용하여, 또는 세포 (예컨대, 원핵 또는 진핵 세포)에서 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 재조합 발현을 통해 제조될 수 있다. 링커들은 해당 분야에 널리 공지된 다양한 전략들을 사용하여 제조될 수 있으며, 링커의 반응성 성분들에 따라 효소적 가수분해, 광분해, 산성 조건하에서 가수분해, 염기성 조건하에서 가수분해, 산화, 이황화물 환원, 친핵성 절단, 또는 유기금속 절단에 의해 절단될 수 있다 (Leriche 외, Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012).
약물-폴리펩타이드 접합체
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 추가적으로 치료제, 가령, 세포독성 분자에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 또는 이와 별도로 투여될 수 있다. 본 발명의 접합체들은 이상 세포 증식과 관련된 질환, 가령, 본 출원에 기재된 암의 치료 또는 예방에 이용가능할 수 있다. 길항 TNFR2 폴리펩타이드에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 또는 이와 별도로 투여될 수 있는 예시적인 세포독성 제제들에는, 제한 없이, 항신생물제 가령,: 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 하이드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 아드리아마이신; 알데스류킨; 알트레타민;암보마이신; 아. 메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페를린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 바이칼루타마이드; 바이산트렌 하이드로클로라이드; 비스나파이드 다이메실레이트; 바이젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 소듐; 브로피리민; 부설판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 캄프토테신; 카라세마이드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 콤브레테스타틴 a-4; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파마이드; 사이타라빈; 다카르바진; 데카 (n- [2- (디메틸-아미노)에틸] 아크리딘-4-카르복스아마이드); 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 다우노마이신; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 다이아지쿠온; 도세탁셀; 돌라사틴스; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 사이트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 하이드로클로라이드; 엘립티신; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에티오다이즈드 오일 i 131; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 하이드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티나이드; 플록수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 5-fdump; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 젬시타빈; 젬시타빈 하이드로클로라이드; 골드 au 198; 호모캄프토테신; 하이드록시우레아; 이다루비신 하이드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-nl; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-i a; 인터페론 감마-i b; 이프로플라틴; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오타이드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤라이드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 소듐; 로무스틴; 로속산트론 하이드로클로라이드; 메소프로콜; 메이탄신; 메클로레타민 하이드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐 메토프린; 메투레데파; 미틴도마이드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스페르; 미토탄; 미톡산트론 하이드로클로라이드; 마이코페놀릭 애시드; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로이신 설페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 피록산트론 하이드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 하이드로클로라이드; 퓨로마이신; 퓨로마이신 하이드로클로라이드; 파이라조퓨린; 리족신; 리족신 d; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 소듐; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 하이드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 스트론튬 클로라이드 sr 89; 술로페누르; 탈리소마이신; 탁산; 탁소이드; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔록산트론 하이드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티미탁; 티아조퓨린; 티라파자민; 토무덱스; top53; 토포테칸 하이드로클로라이드; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트라이시리빈 포스페이트; 트라이메트렉세이트; 트라이메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 하이드로클로라이드; 우라실 머스터드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈류로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 하이드로클로라이드; 2-클로로데옥시아데노신; 2' 데옥시포르마이신; 9-아미노캄프토테신; 랄티트렉시드; N-프로파르길-5,8-디데아자폴릭 애시드; 2클로로-2'-아라비노-플루오로-2'-데옥시아데노신; 2-클로로-2'-데옥시아데노신; 아니소마이신; 트리코스타틴 A; hPRL-G129R; CEP-751; 리노마이드; 황 머스터드; 질소 머스터드 (메클로르 에타민); 사이클로포스파미드; 멜팔란; 클로람부실; 이포스파미드; 부설판; N-메틸-N니트로소우레아 (MNU); N, N'-비스 (2-클로로에틸)-N-니트로소우레아 (BCNU); N- (2-클로로에틸)-N' 사이클로헥실-N-니트로소우레아 (CCNU); N- (2-클로로에틸)-N'- (트랜스-4-메틸사이클로헥실-N-니트로소우레아 (MeCCNU); N- (2-클로로에틸)-N'- (다이에틸) 에틸포스포네이트-N-니트로소우레아 (포테무스틴); 스트렙토조토신; 다이아카르바진 (DTIC); 미토졸로마이드; 테모졸로마이드; 티오테파; 미토마이신 C; AZQ; 아도젤레신; 시스플라틴; 카르보플라틴; 오르마플라틴; 옥살리플라틴;C1-973; DWA 2114R; JM216; JM335; 비스 (플래티늄); 토무덱스; 아자시티딘; 시타라빈; 젬시타빈; 6-메르캅토퓨린; 6-티오구아닌; 하이포잔틴; 테니포시드 9-아미노 캄프토테신; 토포테칸; CPT-11; 독소루비신; 다우노마이신; 에피루비신; 다루비신; 미톡산트론; 로속산트론; 닥티노마이신 (악티노마이신 D); 암사크린; 파이라졸로아크리딘; 올-트랜스 레티놀; 14-하이드록시-레트로-레티놀; 올-트랜스 레티노익 애시드; N- (4-하이드록시페닐) 레티나마이드; 13-시스 레티노익 애시드; 3-메틸 TTNEB; 9-시스 레티노익 애시드; 플루다라빈 (2-F-아라-AMP); 또는 2-클로로데옥시아데노신 (2-Cda)이 포함된다.
이상 세포 증식과 연관된 질환의 치료, 예방 또는 진행을 연구하기 위해 본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 이와 별도로 투여될 수 있는 다른 치료 화합물들에는, 세포독성제, 가령, 20-pi-1,25 다이하이드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아실풀벤; 아데사이페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불리닉 애시드; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴라이드; 혈관신생 저해제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-등 형태형성 단백질-1; 전립선 암종 항안드로겐; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 아피디콜린 글리시네이트; 세포자멸 유전자 모듈레이터; 세포자멸 조절제; 아푸리닉 애시드; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자타이로신; 박카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴리닉 애시드; bFGF 저해제; 바이칼루타마이드; 비스안트렌; 비스아지리디닐스페르민; 비스나피드; 비스트라트렌 A; 비젤레신; 브레플레이트; 블레오마이신 A2; 블레오마이신 B2; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체 (예컨대, 10-하이드록시-캄프토테신); 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복스아미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래 저해제; 카르젤레신; 카세인 키나아제 저해제 (ICOS); 카스타노스페르민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린스; 클로로퀴녹살린 설폰아마이드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A ; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베스시딘 816 ; 크리스나톨; 크립토파이신 8; 크립토파이신 A 유도체; 쿠라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포용해 인자; 시토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데하이드로디뎀닌 B; 2'데옥시코포르마이신 (DCF); 데슬로렐린; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디뎀닌 B; 디독스; 다이에틸노르스페르민; 다이하이드로-5-아자시티딘; 다이하이드로탁솔, 9- ; 다이옥사마이신; 다이페닐 스피로무스틴; 디스코데르몰리드; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 듀오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에포틸론 (A, R = H; B, R = Me); 에피틸론; 에프리스테라이드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 작용제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 4'-포스페이트 (에토포포스); 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나제 저해제; 젬시타빈; 글루타티온 저해제; 헵설팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아마이드; 호모헤링토닌 (HHT); 하이페리신; 이반드로닉 애시드; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩타이드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 저해제; 인터페론 작용제; 인터페론; 인터루킨; 아이오벤구안; 아이오도독소루비신; 이포메아놀; 이리노테칸; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 야스플라키놀리드; 카할랄리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 저해 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤라이드 + 에스트로겐 + 프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친지성 이당류 펩타이드; 친지성 백금 화합물; 리스소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 세포용해성 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴리신 저해제; 매트릭스 메탈로프로테나제 저해제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 저해제; 이페프리스톤; 밀테포신; 미리노스팀; 미스매치형 이중 가닥 RNA; 미트라신; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유모세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 단클론 항체, 인간 코리오닉 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A + 미오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다약제 내성 유전자 저해제; 다중 종양 억제제 1-기반 요법; 머스터드 항암 제; 마이카퍼옥사이드 B; 마이코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환 벤즈아마이드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손 + 펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드로닉 애시드; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 산화 질소 모듈레이터; 니트록사이드 항산화제; 니트룰린; 06-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 사이토카인 유도제; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드로닉 애시드; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 소듐; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 퍼릴릴 알콜; 페나지노마이신; 페닐 아세테이트; 포스파타제 저해제; 피시바닐; 필로카르핀 하이드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화제 저해제; 백금 복합체; 백금 화합물; 백금-트리아민 복합체; 포도필로톡신; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아좀 저해제; 단백질 A-기반 면역 모듈레이터; 단백질 키나제 C 저해제; 단백질 키나제 C 저해제, 마이크로엘갈; 단백질 타이로신 포스파타제 저해제; 퓨린 뉴클레오사이드포스포릴라제 저해제; 푸르푸린스; 피라졸로아크리딘; 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 접합체; raf 길항제; 랄티트렉시드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 전달효소 저해제; ras 저해제; ras-GAP 저해제; 탈메틸화된 레텔립틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나마이드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B 1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코파이톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 모사체; 세무스틴; 노화 유래 저해제 1; 센스 올리고뉴클레오타이드; 신호 전달 저해제; 신호 전달 모듈레이터; 단쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소듐 보로캅테이트; 소듐 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포식 애시드; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기 세포 저해제; 줄기-세포 분열 저해제; 스티피아미드; 스트로멜리신 저해제; 설피노신; 과활성의 혈관활성 장 펩타이드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스완소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메트아이오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 저해제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 탈리도마이드; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모사체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 작용제; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 틴 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 다이클로라이드; 토포테칸; 토프센틴; 토레미펜; 전능성(totipotent) 줄기 세포 인자; 번역 저해제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 타이로신 키나제 저해제; 티르포스틴; UBC 저해제; 우베니멕스; 비뇨생식골-유래 성장 저해인자; 우로키나제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 벨라레졸; 베라민; 베르딘; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 및 지노스타틴 스티말라머가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
표지된 항-TNFR2 폴리펩타이드
일부 구체예들에서, 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 정제 또는 탐지를 위해 또 다른 분자 (예컨대, 에피토프 태그)에 접합될 수 있다. 단백질 정제에 유용한 이러한 분자들의 예들에는 제 2 분자에 의해 인식될 수 있는 구조적 에피토프를 제공하는 분자들이 포함된다. 이는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 이용되는 일반적인 전략으로, 이 때 분자는 고체 지지체 상에 고정되어 고정화된 화합물에 결합할 수 있는 분자에 접합된 표적 단백질을 내포하는 이종 혼합물에 노출된다. 분자 인식을 위해 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편들에 접합될 수 있는 에피토프 태그 분자들의 예들에는, 제한 없이, 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-전달효소, 폴리-히스티딘 태그, FLAG-태그, myc-태그, 인간 인플루엔자 적혈구응집소 (HA) 태그, 비오틴, 스트렙타비딘이 포함된다. 이들 분자들에 의해 제공되는 에피토프들을 내포하는 접합체들은, 각각 말토스, 글루타티온, 니켈-내포 복합체, 항-FLAG 항체, 항-myc 항체, 항-HA 항체, 스트렙타비딘, 또는 비오틴과 상보적인 분자들에 의해 인식될 수 있다. 예를 들어, 다른 단백질과 생체분자 (예컨대, DNA, RNA, 탄수화물, 인지질, 등)의 복합체 혼합물을, 길항 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편의 에피토프 태그를 선택적으로 인식하여 이에 결합할 수 있는 상보적 분자를 내포하는 고체상 수지로 처리함으로써, 상기 혼합물로부터 에피토프 태그에 접합되어 있는 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편을 정제할 수 있다. 고체상 수지들의 예들에는 아가로즈 비드가 포함되며, 이는 수용액에서 정제에 적합하다.
본 발명의 길항 TNFR2 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 형광 분자에 공유 부착되어, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 형광측정법에 의해 및/또는 형광 현미경검사법을 사용한 직접 가시화에 의해 탐지할 수도 있다. 본 발명의 항체에 접합될 수 있는 예시적인 형광 분자들에는 녹색 형광 단백질, 청록 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 피코에리트린, 알로피코시아닌, 회흐스트 (hoescht), 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 프로피듐 아이오다이드, 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 테트라메틸로다민, 및 사이아닌이 포함된다. 본 발명의 항체에 접합하기에 적합한 형광 분자들의 추가적인 예들은 해당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대, 미국 특허 제 7,417,131 및 7,413,874에 상세히 기재되어 있고, 이들 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
형광 분자를 내포하는 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 및 이의 단편들의 세포-표면 국소화 성질을 모니터링함에 특히 유용하다. 예를 들어, 배양된 포유동물 세포 (예컨대, T-조절 세포)를, 형광 분자에 공유적으로 접합되어 있는 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편들에 노출시킨 후, 해당 분야에 공지된 종래의 형광 현미경검사 기술을 사용하여 이들 세포를 분석할 수 있다. 공초점 형광 현미경검사법은 길항 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편들의 세포-표면 국소화를 결정하는 특히 강력한 방법인데, 왜냐하면, 예컨대, 수용체-매개된 세포내이입에 의해, 세포의 내부에 내재화되어 있는 항체 또는 이의 단편들을, 세포막의 외부면에 결합되어 있는 것들과 구별하기 위하여 개개 세포의 면(plane)들이 분석될 수 있기 때문이다. 추가적으로, 세포는 특정 파장의 가시광선을 방출하는 형광 분자 (예컨대, 플루오레세인, 약 535 nm에서 형광을 발광함) 및 T-조절 세포표면 상의 특정 부위로 국소화되는 것으로 공지되고 상이한 파장에서 형광을 발광하는 또 다른 형광 분자 (예컨대, 약 599 nm에서 형광을 발광하고 CD25에 국소화하는 분자)에 접합된 길항 TNFR2 항체로 처리될 수 있다. 생성된 방출 패턴들은 공초점 형광 현미경검사법으로 가시화될 수 있으며 이들 두 파장들로부터 얻은 이미지들은 T-조절 세포표면 상의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 다른 수용체들에 대한 국소화에 관한 정보를 나타내기 위해 합쳐질 수 있다.
생물발광 단백질 또한 길항 항-TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 단편의 탐지 및 가시화를 위해 융합 단백질에 통합될 수 있다. 생물발광 단백질, 가령, 루시페라제 및 에쿼린은 기질 (예컨대, 루시페린 및 코엘렌테라진)과의 화학적 반응의 일부로 빛을 방출한다. 진단 서열로 사용하기에 적합한 예시적인 생물발광 단백질 및 이의 사용 방법들이, 예컨대, 미국 특허 제 5,292,658, 5,670,356, 6,171,809, 및 7,183,092에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 생물발광 단백질로 표지된 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편들은 시험관내 분석 후 본 발명의 항체 참지를 위한 유용한 툴이다. 예를 들어, 또 다른 단백질들의 복합체 혼합물 중에서 생물발광 단백질에 접합되어 있는 길항 TNFR2 항체의 존재는 해당 분야에 공지된 겔 전기영동법 (예컨대, 고유 겔 분석)을 사용하여 상기 혼합물의 성분들을 분리한 후, 웨스턴 블롯을 실시하기 위해 상기 분리된 단백질을 막으로 이동시킴으로써 탐지될 수 있다. 다른 단백질의 혼합물 중에서 길항 TNFR2 항체는 적절한 루시페라제 기질로 막을 처리한 다음, 확립된 프로토콜을 사용하여 막(film) 상의 단백질 혼합물을 가시화함으로써 탐지될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 방사능 핵을 포함하는 분자에 접합될 수 있으므로, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 핵의 방사능 방출 패턴을 분석함으로써 탐지될 수 있다. 대안적으로, 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편은 단백질을 제조하는 중에 항체 내부에 방사능 핵을 통합시킴으로써 직접 변형될 수 있다. 메싸이오닌 (35S), 질소 (15N), 또는 탄소 (13C)의 방사성 동위원소는, 예컨대, 이들 동위원소를 내포하는 영양소들로 보충되어 있는 배지에서 세균을 배양함으로써, 본 발명의 항체 또는 이의 단편들에 통합될 수 있다. 선택적으로, 방사능 할로겐을 내포하는 타이로신 유도체들은 방사성표지된 타이로신으로 보충된 배지에서 세균 세포를 배양함으로써, 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편에 통합될 수 있다. 페놀계의 C2 위치에서 방사성 할로겐으로 작용기화된 타이로신은 생체내에서 내인성 번역 효소를 사용하여 연신하는 폴리펩타이드 사슬들에 신속하게 통합됨이 밝혀졌다 (미국 특허 제 4,925,651; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 할로겐에는 불소, 염소, 브롬, 요오드, 및 아스타틴이 포함된다. 추가적으로, 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편들은 세포 배양물로부터 분리 및 정제 후 본 발명의 항체 또는 이의 단편들을 방사성 동위원소로 작용기화함으로써 변형될 수 있다. 할로겐은, 예컨대, 이들 잔기들 중 하나 이상과 친전자성 할로겐 종들의 반응에 의한, 타이로신 또는 트립토판에서의 방향족 치환에 의해 정제된 단백질로 용이하게 통합될 수 있는 동위원소 군을 나타낸다. 방사능 할로겐 동위원소의 예들에는 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 또는 211At가 포함된다.
방사성 동위원소의 통합을 위한 또 다른 대안적인 전략은 길항 항-TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 단편에 킬레이트화 그룹을 공유 부착시키는 것이다. 킬레이트화 그룹은, 반응성 작용기, 가령, 싸이올, 아미노 그룹, 알콜, 또는 카르복시산에 대한 부착에 의해 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편에 공유적으로 부착될 수 있다. 그 후 킬레이트화 그룹은, 125I, 67Ga, 111In, 99Tc, 169Yb, 186Re, 123I, 124I, 125I, 131I, 99mTc, 111In, 64Cu, 67Cu, 186Re, 188Re, 177Lu, 90Y, 77As, 72As, 86Y, 89Zr, 211At, 212Bi, 213Bi, 또는 225Ac와 같은 방사성 핵종을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 임의의 다양한 금속 방사성동위원소를 내포하도록 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 단편)를, 무거운 성분들의 금속 이온 또는 희토류 이온들, 가령, Gd3+, Fe3+, Mn3+, 또는 Cr2+에 결합할 수 있는 킬레이트화 그룹과 공유 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 상자성 금속에 배위결합된 킬레이트화 그룹을 내포하는 이러한 접합체들은 MRI 영상 분야에서 유용하다. 상자성 금속에는, 크롬 (III), 망간 (II), 철 (II), 철 (III), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 프레세오디뮴(III), 네오디뮴 (III), 사마리움 (III), 가돌리늄 (III), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III), 에르븀 (III), 및 이테르븀(III)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방식에서, 길항 TNFR2 항체는 MRI 분광법에 의해 탐지될 수 있다. 예를 들어,투여 후 항체 분포를 모니터하기 위하여, 포유동물 대상체 (예컨대, 인간 환자)에게 상자성 이온들에 결합된 킬레이트화 그룹에 접합된 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편들을 투여할 수 있다. 이는 환자에게 본 출원에 기재된 임의의 투여 경로들, 가령, 정맥내로 항체를 투여한 후, 확립된 프로토콜에 따라 환자의 MRI를 기록함으로써 투여된 항체의 위치를 분석하여 이루어질 수 있다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 추가적으로 수용액에서 단백질의 용해도 및 안정성을 개선시키기 위하여 다른 분자들에 접합될 수 있다. 그 중에서도,이러한 분자들의 예들에는 PEG, PSA, 소 혈청 알부민 (BSA), 및 인간 혈청 알부민 (HSA)이 포함된다. 예를 들어, 치료 중인 환자의 면역계에 의해 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편이 탐지되지 않도록 하기 위하여 상기 항체 또는 이의 단편을 탄수화물 모이어티에 접합시킬 수 있다. 이러한 과당화 과정은 순환 중인 B 세포 수용체들과 치료 단백질의 상호작용을 입체적으로 저해함으로써 상기 단백질의 면역원성을 감소시킨다. 대안적으로, 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편들은 본 발명의 항체의 인간 혈청으로부터의 제거를 방해하고 약물동역학적 프로파일을 개선시키는 분자들에 접합될 수 있다. 이들 항체 및 단편들의 제거를 약화시키고 약물동역학적 프로파일을 개선시키기 위하여 본 발명의 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편들 내 접합되거나 삽입되는 예시적인 분자들에는 구제 수용체 결합 에피토프가 포함된다. 이들 에피토프는 IgG 면역글로불린의 Fc 영역 내에서 발견되며 Fc 수용체들에 결합하여 인간 혈청에서 항체 반감기를 지연시키는 것으로 밝혀졌다. 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편들로의 구제 수용체 결합 에피토프 삽입은, 예컨대, 미국 특허 제 5,739,277에 기재된 바와 같이 이루어질 수 있으며; 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
변형된 길항 TFNR2 폴리펩타이드
식별 또는 가시화를 위한 다른 치료제들에 대한 접합 및 표지 이외에도, 본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 또한 이의 약물동역학적 프로파일, 생물물리학적 안정성, 또는 저해능을 개선시키기 위해 변형될 수도 있다. 예를 들어, 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편의 적절한 입체형태를 유지시킴에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화 안정성을 개선하고 이상 교차결합을 막기 위하여 등입체성 또는 등전성 아미노산 (예컨대, 세린)으로 치환될 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)은 그 안정성 (특히, 항체가 항체 단편, 가령, Fv 단편인 경우)을 개선하기 위해 상기 항체 또는 이의 단편에 추가될 수 있다. 이는, 항체 3차 구조를 강화하기 위해 산화 조건하에서 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 추가적인 시스테인 잔기쌍들을 인코딩하기 위하여, 예컨대, 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 변화시킴으로써 구현될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제 7,422,899 참고; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)에 이루어질 수 있는 또 다른 유용한 변형들에는 이들 항체 및 이의 단편의 당화 프로파일을 변화시키는 것이 포함된다. 이는, 예컨대, 길항 TNFR2 항체에서 아미노산들을 치환, 삽입, 또는 결실시켜 당화 부위를 삽입 또는 제거함으로써 구현될 수 있다. 항체의 당화는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합 방식으로 발생한다. N-결합 당화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에서 항체에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 발생시키는 과정이다. N-결합 당화를 위한 공통 아미노산 서열들에는 트라이펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 (NXS) 및 아스파라긴-X-트레오닌 (NXT)이 포함되며, 이 때 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 폴리펩타이드 (예컨대, 항-TNFR2 항체)에 이러한 트라이펩타이드 서열들 중 어느 하나의 삽입은 가능한 당화 부위를 생성한다. O-결합 당화는 하이드록시아미노산, 거의 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신 또한 글리코시드 형성에 대한 수용 기질이다. 그러므로 항-TNFR2 항체에 대한 당화 부위들의 추가는 항체의 아미노산 서열을 변화시킴으로써 (예컨대, 본 출원에 기재된 재조합 발현 기술을 사용) 이루어질 수 있으며, 그 결과 상기 항체는 N-결합 당화를 촉진시키는 상기 트라이펩타이드 서열들 중 하나 이상을 내포하게 되거나, 또는 본래의 항체의 서열들에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기들은 O-결합 당화를 유발하게 된다 (예컨대, 미국 특허 제 7,422,899 참고; 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
다른 사례들에서, 예컨대, 항체의 항원-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 향상시키기 위해 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 작동자 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환들을 도입시킴으로써 구현될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기들은 (예컨대, 본 출원에 기재된 재조합 발현 기술에 의해) 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편의 Fc 영역에 도입되어, 이 영역에서 추가적인 사슬간 이황화물 결합 형성을 용이하게 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 증가된 입체형태적 제약을 가질 수 있으며, 이러한 제약은 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 조성할 수 있다. 향상된 항-종양 활성을 가지는 동종이량체 항체는 또한, 예를 들어, Wolff 외 (Canc. Res., 53:2560-2565, 1993)에 기재되어 있는 이종이작용기성 교차-결합제를 사용하여 제조될 수 있으며; 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 대안적으로, 항체는 조작되어 이원 Fc 영역들을 가질 수 있으며, 이로써 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 (Stevenson 외 (Anti-Canc. Drug Des., 3:219-230, 1989) 참고; 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)의 혈청 반감기는, 일부 구체예들에서, 하나 이상의 아미노산 변형들을 통합시킴으로써, 가령, 예컨대, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프들에서 발견되는, 구제 수용체 모티프를 도입시키기 위하여 Fab 도메인의 CH1 또는 CL 영역을 변화시킴으로써 개선될 수 있다. 이러한 변형들은, 예를 들어, 미국 특허 제 5,869,046 및 미국 특허 제 6,121,022에 기재되어 있으며; 이들은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 항체 또는 이의 단편의 면역원성을 감소시키기 위하여 또는 그 내부에 존재하는 T-세포 에피토프를 감소 또는 제거하기 위하여, 예를 들어 US2003/0153043에 기재된 바와 같은 추가적인 프레임워크 변형들 또한 이루어질 수 있으며; 상기 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
치료 방법
표현형-중성 TNFR2 항체로부터 유래한 CDR-H1 및 CDR-H2 그리고 식 JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5 또는 JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2로 나타내어지는 CDR-H3 (이 때 각각의 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고, 그리고 각각의 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산임)를 내포하는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)은 세포 증식 장애 (가령, 본 출원에 기재된 암), 감염 질환 (가령, 본 출원에 기재된 바이러스, 세균, 진균, 또는 기생충 감염), 또는 TNFR2 신호전달에 의해 매개되는 또 다른 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 표현형-중성 TNFR2 항체로부터 유래한 CDR-H1 및 CDR-H2 그리고, 식 JRJDGJSJY(J)2FDJ (서열 번호: 278), JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279), QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5 (서열 번호: 265), 또는 AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266)에 의해 나타내어지는 CDR-H3를 내포하는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 세포 증식 장애 (가령, 본 출원에 기재된 암), 감염 질환 (가령, 본 출원에 기재된 바이러스, 세균, 진균, 또는 기생충 감염), 또는 TNFR2 신호전달에 의해 매개되는 또 다른 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, CDR-H3는 TNFRAB1으로부터 유래하고 아미노산 서열 QRVDGYSSYWYFDV (서열 번호: 25)을 가진다. CDR-H3는 TNFRAB2로부터 유래할 수 있고 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, CDR-H3는 TNFR2A3로부터 유래하고 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)를 가진다.
세포 증식 이상의 치료 방법
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 광범위한 암 및 세포 증식 이상의 치료에 유용한 치료제이다. 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 세포 증식 장애, 가령, 암을 앓고 있는 포유동물 대상체, 가령, 인간에게, 예컨대, 표적 암 세포에 대한 적응 면역 반응의 유효성을 향상시키기 위하여 투여될 수 있다.
특히, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 T-조절 세포 성장 및 활성화를 감소 또는 저해하기 위하여, 포유동물 대상체, 가령, 인간에게 투여될 수 있으며, 이는 종양-침윤 T-림프구를 종양-관련 항원들을 제시하는 세포로 국소화시켜 세포독성을 촉진할 수 있게 한다. 또한, 이러한 전략의 유효성에 대한 제한들 중 하나가 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에 주입 후 종양-반응성 T 세포의 세포독성을 지속시키는 것의 어려움이었기 때문에, 본 발명의 폴리펩타이드는 기존의 입양 T 세포 요법 플랫폼과의 상승작용을 가져올 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한, 외부 MHC 단백질을 발현시킬 수 있고 숙주 면역계에 의한 불활성화에 점점더 취약해질 수 있는 동종이계 T-림프구의 활성을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 통상적으로 T 세포 주입을 수반하는 T-조절 세포의 성장 및 증식을 억제함으로써 T-조절-매개된 종양-반응성 T 세포의 고갈을 완화시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 T-조절 세포의 성장을 처리되지 않은 세포에 비해 약 50% 내지 약 200% 만큼 (예컨대, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200%) 감소시킬 수 있다. 세포 성장의 감소는 TNFα의 존재를 필요로 하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 TNFα 존재하에서 T-조절 세포의 성장을 처리되지 않은 세포에 비해 90% 내지 150%로 (예컨대, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 또는 150%) 제한할 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 또한 T-조절 세포의 증식을 처리되지 않은 T-조절 세포 집단의 증식의 70% 미만 (예컨대, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%)으로 제한할 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 또한 T-조절 세포의 생존을 처리되지 않은 T-조절 세포 집단에 비해 약 10% 만큼 (예컨대, 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 또는 그 이상) 감소시킬 수 있다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 암 세포 및 발암성 물질에 대한 면역 반응을 촉진시킴으로써 환자의 병태를 개선시키기 위하여 암을 앓고 있는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는, 예컨대, 본 출원에 기재된 임의의 투여 경로들을 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 부형제, 생물학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화될 수 있으며, 추가 치료제들, 가령, 항-암제에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 또는 이와 별도로 (예컨대, 순차적으로) 공동-투여될수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여에 의해 치료될 수 있는 암들에는, 암, 가령, 백혈병, 림프종, 간암, 골암, 폐암, 뇌암, 방광암, 위장관암, 유방암, 심장암, 자궁경부암, 자궁암, 두경부암, 담낭암, 후두암, 구순 및 구강암, 안구암, 흑색종, 이자암, 전립선암, 결장직장암, 고환암, 및 인두암이 포함된다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여에 의해 치료될 수 있는 특정 암들에는, 제한 없이, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 부신피질 암종, AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 항문암, 충수암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 간외암, 유잉 육종군, 골육종 및 악성 섬유 조직구종, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 생식 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막세포종, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 원발성 림프종, 척삭종, 만성 골수증식성 신생물, 결장 암, 간외 담관암, 제자리 관상 암종 (DCIS), 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 나팔관암, 골의 섬유성 조직구종, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양 (GIST), 고환생식 세포 종양, 임신 영양막병, 교종, 소아기 뇌간 교종, 털 세포 백혈병, 간세포 암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 섬세포 종양, 이자 신경내분비 종양, 윌름스 종양 및 기타 소아기 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 소세포 폐암, 피부 T 세포 림프종, 안구내 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 정중선로 암종, 다발 내분비샘 종양 증후군, 다발 골수종/형질 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 비강 및 부비동암, 코인두 암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 상피성 난소암, 생식 세포 난소 암, 저위험 악성 난소 암, 이자 신경내분비 종양, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 원발성 복막암, 직장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 카포시 육종, 횡문근육종, 세자리 증후군, 소장암, 연조직 육종, 인두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 요도 암, 자궁내막 자궁암, 자궁 육종, 질암, 음문암, 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증이 포함된다.
예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 T 세포 림프종 (예컨대, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포), 난소 암, 결장 암, 다발 골수종, 또는 신장 세포 암종을 치료하기 위하여 환자 (예컨대, 포유동물 환자, 가령, 인간 환자)에게 투여될 수 있다.
본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)는 또한 암 세포를 향한 반응성을 나타내는 치료 항체와 함께 공동-투여될 수 있다. 이러한 방식에서, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 이의 단편들)는, 예컨대, T-림프구 종양 반응성을 지속시킴에 의해 적응 면역 반응과 상승작용 할 뿐만 아니라 종양 세포 성장의 다른 저해제들과도 상승작용 할 수 있다. 암 및 다른 세포 증식 이상을 치료하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 치료 항체들의 예들에는 암 세포의 표면 상에서 과발현되는 종양 항원 또는 세포-표면 단백질과 반응성을 나타내는 상체들이 포함된다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체와 혼합, 공동-투여, 또는 순차 투여될 수 있는 예시적인 항체들에는, 제한 없이, 트라스투주맙 (HERCEPTIN®), 베바시주맙 (AVASTIN®), 세툭시맙 (ERBITUX®), 파니투무맙 (VECTIBIX®), 이필리무맙 (YERVOY®), 리툭시맙 (RITUXAN® 및 MABTHERA®), 알렘투주맙 (CAMPATH®), 오파투무맙 (ARZERRA®), 젬투주맙 오조가마이신 (MYLOTARG®), 브렌툭시맙 베도틴 (ADCETRIS®), 90Y-이브리투모맙 티욱세탄 (ZEVALIN®), 및 131I-토시투모맙 (BEXXAR®)이 포함되며, 이들은 Scott 외 (암 Immun., 12:14-21, 2012)에 상세히 기재되어 있고; 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
해당 분야의 통상의 지식을 가진 의사는 필요로 하는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에게 투여하기 위한길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편의 유효량을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 의사는 원하는 치료 효과를 구현하는데 필요한 것보다 낮은 수준으로 본 발명의 폴리펩타이드의 투약 용량을 시작하여 원하는 효과가 구현될 때까지 용량을 점진적으로 증가시키킬 수 있다. 대안적으로, 의사는 길항 TFNR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편을 고 용량으로 투여함으로써 치료 투약법을 시작하고 후속적으로 치료 효과 (예컨대, 하나 이상의 종양들의 부피 감소, T-조절 세포 집단의 감소, 또는 세포 증식 장애의 차도)가 구현될 때까지 점진적으로 더 낮은 용량을 투여할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 적합한 일일 용량은 치료 효과를 생성함에 유효한 최저 용량인 화합물의 양이 될 것이다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 주사에 의해, 예컨대, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 주사에 의해, 선택적으로 표적 조직 (예컨대, 종양) 부위와 근접하게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료 조성물의 일일 용량은 단회 투약으로 또는 1일, 1주, 1개월 또는 1년 전반에 걸쳐 적절한 간격으로 분리하여, 선택적으로 단위 투약 형태로, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 투약으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 단독으로 투여될 수 있으나, 이는 또한 부형제, 담체, 및 선택적으로, 추가 치료제들과 조합된 제약학적 제제로 투여될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 세포 증식 질환, 가령, 암의 진행을 약화시키는 그 능력에 대해, 해당 분야에 공지된 임의의 다양한 방법으로 모니터 될 수 있다. 예를 들어, 의사는 환자의 하나 이상의 종양들의 부피를 분석함으로써 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편을 이용한 치료에 대한 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)의 반응을 모니터 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 1% 내지 100% 만큼 (예컨대, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%) 종양 부피를 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 의사는 특정 대상체의 림프 내 T-조절 세포 집단을 분석함으로써, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한 치료에 대한 대상체 (예컨대, 인간)의 반응성을 모니터할 수 있다. 예를 들어, 의사는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)로부터 혈액 샘플을 채취하고 확립된 절차들, 가령, 형광 활성화된 세포 분류를 사용하여 T-조절 세포 (예컨대, CD4+ CD25+ FOXP3+ T-조절 세포 또는 CD17+ T-조절 세포)의 양 또는 밀도를 결정할 수 있다.
감염 질환의 치료 방법
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 또한 감염 질환, 가령, 하나 이상의 바이러스, 세균, 진균, 또는 기생충 (예컨대, 진핵 기생충)에 의해 유발되는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 감염 질환을 치료하기 위해, 뿐만 아니라 이러한 질환의 하나 이상의 증상들을 경감시키기 위해 감염 질환을 앓고 있는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 포유동물 대상체, 가령, 인간에서, 예컨대, 플라비비리다에 과의 구성원 (예컨대, 플라비바이러스, 페스티바이러스, 및 헤파시바이러스 속의 구성원) (이는 C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스; 진드기-매개 바이러스, 가령, 가제트 굴리 바이러스, 카담 바이러스, 키아사누르 삼림병 바이러스, 랑가트 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 포와산 바이러스, 로얄 팜 바이러스, 카르시 바이러스, 진드기 매개 뇌염바이러스, 뉴도에르플 바이러스, 소프진 바이러스, 도약병 바이러스 및 네기시 바이러스; 바다새 진드기-매개 바이러스, 가령, 메반 바이러스, 사우마레즈 리프 바이러스, 및 튤레니이 바이러스; 모기-매개 바이러스, 가령, 아로아 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 바이러스, 카시파코어 바이러스, 코우탕고 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 야오운데 바이러스, 코코베라 바이러스, 바가자 바이러스, 일레우스 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 바이러스, 템부수 바이러스, 지카 바이러스, 반지 바이러스, 보우보우이 바이러스, 엣지 힐 바이러스, 주그라 바이러스, 사보야 바이러스, 세픽 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 황열병 바이러스; 및 공지되지 않은 절지동물 벡터를 가진 바이러스, 가령, 엔테베 박쥐 바이러스, 요코세 바이러스, 아포이 바이러스, 카우본 릿지 바이러스, 주티아파 바이러스, 모독 바이러스, 살 비에자 바이러스, 산 페를리타 바이러스, 부칼라사 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 바이러스, 다카르 박쥐 바이러스, 몬타나 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 박쥐 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 및 세포 융합 제제 바이러스를 포함함); 아레나비리다에 과의 구성원 (이는 이피 바이러스, 라싸 바이러스 (예컨대, Josiah, LP, 또는 GA391 균주), 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 아마파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라티노 바이러스, 마추포 바이러스, 올리베로스 바이러스, 파라나 바이러스, 피친데 바이러스, 피리탈 바이러스, 사비아 바이러스, 타카리베 바이러스, 타미아미 바이러스, 화이트워터 아로요 바이러스, 차파레 바이러스, 및 루요 바이러스를 포함함); 분야비리다에 과의 구성원 (예컨대, 한타바이러스, 나이로바이러스, 오르토분야바이러스, 및 플레보바이러스 속의 구성원), (이는 한탄 바이러스, 신 놈브레 바이러스, 두그베 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 라 크로세 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 및 크리미언-콩고 출혈열 (CCHF) 바이러스를 포함함); 필로비리다에 과의 구성원 (이는 에볼라 바이러스 (예컨대, 자이레, 수단, 아이보리 코스트, 레스톤 및 우간다 균주) 및 마르부르그 바이러스 (예컨대, 앙골라, Ci67, 무소케, 폽프, 레이븐 및 레이크 빅토리아 균주)를 포함함); 토가비리다에 과의 구성원 (예컨대, 알파바이러스 속의 구성원) (이는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE), 신드비스 바이러스, 풍진 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바르마 삼림 바이러스, 오니옹니옹 바이러스, 및 치쿤구니아 바이러스를 포함함); 폭스비리다에 과의 구성원 (예컨대, 오르토폭스바이러스 속의 구성원) (이는 천연두 바이러스, 원숭이마마 바이러스, 및 백시니아 바이러스를 포함함); 헤르페스비리다에 과의 구성원, (이는 단순 헤르페스 바이러스 (HSV; 1, 2, 및 6형), 인간 헤르페스 바이러스 (예컨대, 7 및 8형), 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 수두대상포진 바이러스, 및 카포시 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV)를 포함함); 오르토믹소비리다에 과의 구성원 (이는 인플루엔자 바이러스 (A, B, 및 C), 가령, H5N1 조류 인플루엔자 바이러스 또는 H1N1 돼지 독감을 포함함); 코로나비리다에 과의 구성원 (이는 중증 급성 호흡 증후군 (SARS) 바이러스를 포함함); 랍도비리다에 과의 구성원 (이는 광견병 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV)를 포함함); 파라믹소비리다에 과의 구성원 (이는 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 뉴캐슬병 바이러스, 헨드라바이러스, 니파바이러스, 홍역 바이러스, 린더페스트 바이러스, 개 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 (예컨대, 1, 2, 3, 및 4), 라이노바이러스, 및 볼거리 바이러스를 포함함); 피코르나비리다에 과의 구성원 (이는 폴리오바이러스, 인간 엔테로바이러스 (A, B, C, 및 D), A형 간염 바이러스, 및 콕사키바이러스를 포함함); 헤파드나비리다에 과의 구성원 (이는 B형 간염 바이러스를 포함함); 파필로마비리다에 과의 구성원 (이는 인간 유두종 바이러스를 포함함); 파르보비리다에 과의 구성원 (이는 아데노-연관 바이러스를 포함함); 아스트로비리다에 과의 구성원 (이는 아스트로바이러스를 포함함); 폴리오마비리다에 과의 구성원 (이는JC 바이러스, BK 바이러스, 및 SV40 바이러스를 포함함); 칼시비리다에 과의 구성원 (이는 노웍 바이러스를 포함함); 레오비리다에 과의 구성원 (이는 로타바이러스를 포함함); 그리고 레트로비리다에 과의 구성원 (이는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV; 예컨대, 1 및 2형), 및 인간 T-림프친화 바이러스 I 및 II형 (각각 HTLV-1 및 HTLV-2); 프리엔드 백혈병 바이러스; 및 전염성 해면상 뇌염증, 가령, 만성 소모성 질환을 포함함)에 의해 유발되는 바이러스 감염의 하나 이상의 증상들을 치료 또는 경감시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법들은 HIV 감염을 치료하기 위하여 길항 TNFR2 항체 (예컨대, TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 TNFR2의 KCSPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 56-60)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열 또는 이의 변이체를 내포하는 TNFR2 항체)를 인간 (가령, AIDS를 앓고 있는 인간)에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 또한 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에서 세균 감염의 하나 이상의 증상들을 치료, 또는 경감시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편의 투여에 의해 치료될 수 있는 세균 감염의 예들에는, 제한 없이, 스트렙토코쿠스 (streptococcus), 바실루스 (bacillus), 리스테리아 (listeria), 코리네박테리움 (corynebacterium), 노카르디아 (nocardia), 나이세리아 (neisseria), 악티노박터 (actinobacter), 모락셀라 (moraxella), 엔테로박테리아세아에 (엔테로박터 (enterobacter)iacece) (예컨대, E. coli, 가령, O157:H7), 슈도모나스 (pseudomonas) (가령, 슈도모나스 아에루기노사), 에스케리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (klebsiella), 세라시아 (serratia), 엔테로박터 (enterobacter), 프로테우스 (proteus), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (shigella), 예르시니아 (yersinia), 헤모필루스 (haemophilus), 보르데텔라 (bordetella) (가령, 보르데텔라 퍼투시스), 레기오넬라 (legionella), 파스퇴렐라 (pasturella), 프란치셀라 (francisella), 브루셀라 (Brucella), 바르토넬라 (bartonella), 클로스트리디움 (clostridium), 비브리오 (vibrio), 캄필로박터 (campylobacter), 스타필로코쿠스 (staphylococcus), 마이코박테리움 (mycobacterium) (가령, 결핵균 및 마이코박테리움 아비움 파라투베르쿨로시스), 및 헬리코박터 (helicobacter) (가령, 헬리코박터 파일로리 및 헬리코박터 헤파티쿠스) 속에 속하는 세균에 의해 유발되는 감염들이 포함된다. 특히, 본 발명의 방법들은 결핵균 감염을 치료하기 위해 본 출원에 기재된 CDR-H3 영역을 내포하는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 (예컨대, TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 TNFR2의 KCSPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 56-60)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열을 내포하는 TNFR2 항체)을 인간 또는 비-인간 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 특히 본 발명의 방법들은 결핵균 감염을 치료하기 위하여 길항 TNFR2 폴리펩티드 (예컨대, TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 TNFR2의 KCSPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 56-60)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열 또는 이의 변이체를 내포하는 TNFR2 항체)를 소과 포유동물 또는 들소에게 투여하는 것을 포함한다. 추가적으로, 본 발명의 방법들은 마이코박테리움 아비움 파라투베르쿨로시스 감염을 치료하기 위하여 길항 TNFR2 폴리펩티드 (예컨대, TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 TNFR2의 KCSPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 56-60)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열 또는 이의 변이체를 내포하는 TNFR2 항체)를 인간 또는 비-인간 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 특히 본 발명의 방법들은 마이코박테리움 아비움 파라투베르쿨로시스 감염을 치료하기 위하여 길항 TNFR2 폴리펩티드 (예컨대, TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 TNFR2의 KCSPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 56-60)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열 또는 이의 변이체를 내포하는 TNFR2 항체)를 소과 포유동물 또는 들소에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 또한 원생동물 기생충 (예컨대, 장 원생동물, 조직 원생동물, 또는 혈액 원생동물) 또는 구충 기생충 (예컨대, 선충, 연충, 쌍기충, 쌍선충, 흡충, 흡충 (혈액 흡충, 간 흡충, 장 흡충, 및 폐 흡충), 또는 조충)에 의해 유발되는 기생충 감염의 하나 이상의 증상들을 치료, 또는 경감시키기 위해 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 예시적인 원생동물 기생충들에는, 제한 없이, 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba hystolytica), 지아디아 람블리아 (Giardia lamblia), 크립토스포리디움 무리스 (cryptosporidium muris), 트리파노소마티다 감비엔세 (trypanosomatida gambiense), 트리파노소마티다 로데시엔세 (trypanosomatida rhodesiense), 트리파노소마티다 크루시 (trypanosomatida crusi), 리슈마니아 멕시카나 (leishmania mexicana), 리슈마니아 브라질리엔시스 (leishmania braziliensis), 리슈마니아 트로피카 (leishmania tropica), 리슈마니아 도노바니 (leishmania donovani), 리슈마니아 메이저 (leishmania major), 톡소플라즈마 곤디 (toxoplasma gondii), 플라스모디움 비박스 (plasmodium vivax), 플라스모디움 오발레 (plasmodium ovale), 플라스모디움 말라리아에 (plasmodium malariae), 플라스모디움 팔시파룸 (plasmodium falciparum), 플라스모디움 요엘리 (plasmodium yoelli), 질트리코모나스 (trichomonas vaginalis), 및 히스토모나스 멜리아그리디스 (histomonas meleagridis)가 포함된다. 예시적인 기생충제 (helminthic parasites)에는 트리추리스 트리츄라 (richuris trichiura), 아스카리스 룸브리코이데스 (ascaris lumbricoides), 엔테로바이러스 버미큘러리스 (enterobius vermicularis), 안사이클로스토마 두오데날레 (ancylostoma duodenale), 네카토르 아메리카누스 (necator americanus), 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (strongyloides stercoralis), 우체레리아 반크로프티 (wuchereria bancrofti), 및 드라쿤쿨루스 메디넨시스 (dracunculus medinensis), 쉬스토소마 만소니 (schistosoma mansoni), 쉬스토소마 해마토비움 (schistosoma haematobium), 쉬스토소마 자포니쿰 (schistosoma japonicum), 파시올라 헤파티카 (fasciola hepatica), 파시올라 기간티카 (fasciola gigantica), 헤테로파이에스 (heterophyes), 파라고니무스 웨스트마니 (paragonimus westermani), 태니아 솔리움 (taenia solium), 태니아 사기나타 (taenia saginata), 히메노렙시스 나나 (hymenolepis nana), 및 에키노코쿠스 그라뉼로수스 (echinococcus granulosus)가 포함된다. 본 발명의 방법들에 따라 치료될 수 있는 추가적인 기생충 감염에는 온코세르카스 볼부루스 (onchocercas volvulus)가 포함된다.
길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)은 또한 진균 감염의 하나 이상의 증상들을 치료 또는 경감시키기 위하여 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에 투여될 수 있다. 본 발명의 방법들에 따라 치료될 수 있는 예시적인 진균 감염들에는, 제한 없이, 예컨대, 아스페르길루스 (Aspergillus), 칸디다 (candida), 말라세지아 (malassezia), 트리코스포론 (trichosporon), 푸사륨 (fusarium), 아크레모니움 (acremonium), 리조푸스 (rhizopus), 무코르 (mucor), 뉴모사이스티스 (pneumocystis), 및 압시디아 (absidia)에 의해 유발되는 감염들이 포함된다. 본 발명의 방법들에 따라 치료될 수 있는 예시적인 진균 감염들에는 또한 뉴모사이스티스 카리니 (pneumocystis carinii), 브라질 파라콕시디오이데스 (paracoccidioides brasiliensis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼 (histoplasma capsulatum)이 포함된다.
제약학적 조성물
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 내포하는 제약학적 조성물들은 해당 분야에 공지된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물들은 표현형-중성 TNFR2 항체로부터 유래한 CDR-H1 및 CDR-H2 그리고 식 JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5 또는 JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2 (이 때 각각의 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z1은 독립적으로 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산이고, 각각의 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고, 그리고 각각의 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 내포하는 자연 발생 아미노산임)으로 나타내어지는 CDR-H3를 내포하는 길항 TNFR2 항체, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)을 내포할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 제약학적 조성물들은 표현형-중성 TNFR2 항체로부터 유래한 CDR-H1 및 CDR-H2 그리고 식 JRJDGJSJY(J)2FDJ (서열 번호: 278), JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279), QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5 (서열 번호: 265), 또는 AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266)으로 나타내어지는 CDR-H3를 내포하는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 내포할 수 있다.
일부 구체예들에서, CDR-H3는 TNFRAB1으로부터 유래하고 아미노산 서열 QRVDGYSSYWYFDV (서열 번호: 25)을 가진다. CDR-H3는 TNFRAB2로부터 유래할 수 있고 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, CDR-H3는 TNFR2A3로부터 유래하고 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)를 가진다.
본 발명의 제약학적 조성물은, 예컨대, 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980); 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함됨)를 사용하여, 그리고 원하는 형태로, 예컨대, 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 상기 조성물은 또한 원하는 농도의 활성 제제 (예컨대, 길항 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편)를 내포하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약학적 조성물은 중량으로 (w/w) 최소한 10% (예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 100%)의 활성 제제를 내포할 수 있다.
추가적으로, 제약학적 제제에 통합될 수 있는 활성 제제 (예컨대, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 우성 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드)는 그 자체로 원하는 수준의 순도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드, 가령, a 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 세포 배양 배지로부터 항체를 분리한 후 또는 확립된 고체상 펩타이드 합성 방법들 또는 본 출원에 기재된 고유한 화학적 결찰에 의해, 예컨대, 단쇄 항체 단편 (예컨대, scFv)의 화학적 합성 후 특정한 순도로 특징될 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 제약학적 조성물에 항체를 통합시키기 전 최소한 10% 순도 (예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 100% 순도) 일 수 있다 .
본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드의 제약학적 조성물은, 보관을 위하여, 원하는 순도를 가지는 항체를 해당 분야에서 통상적으로 이용되는 선택적인 제약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제, 예컨대, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제, 및 다른 기타 첨가제와 혼합함으로써, 동결건조 제형 또는 수용액으로 제조될 수 있다. 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980; 본 출원에 참고문헌으로 포함됨)을 참고하라. 이러한 첨가제들은 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이어야 한다.
완충제
완충제는 생리학적 조건들에 거의 가까운 범위의 pH를 유지하는데 도움을 준다. 이들은 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)와 사용하기에 적합한 완충제에는, 유기 및 무기산 모두 및 이의 염, 가령, 시트레이트 완충제 {예컨대, 모노소듐 시트레이트-다이소듐 시트레이트 혼합물, 시트릭 애시드-트라이소듐 시트레이트 혼합물, 시트릭 애시드-모노소듐 시트레이트 혼합물, 등), 숙시네이트 완충제 {예컨대, 숙시닉 애시드-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙시닉 애시드-소듐 하이드록사이드 혼합물, 숙시닉 애시드- 다이소듐 숙시네이트 혼합물, 등), 타르트레이트 완충제 (예컨대, 타르타릭 애시드-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르타릭 애시드-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르타릭 애시드-소듐 하이드록사이드 혼합물, 등), 푸마레이트 완충제 {예컨대, 푸마릭 애시드-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마릭 애시드- 다이소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-다이소듐 푸마레이트 혼합물, 등), 글루코네이트 완충제 {예컨대, 글루코닉 애시드-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루코닉 애시드-소듐 하이드록사이드 혼합물, 글루코닉 애시드-포타슘 글루코네이트 혼합물, 등), 옥살레이트 완충제 {예컨대, 옥살릭 애시드-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살릭 애시드-소듐 하이드록사이드 혼합물, 옥살릭 애시드-포타슘 옥살레이트 혼합물, 등), 락테이트 완충제 {예컨대, 락틱 애시드-소듐 락테이트 혼합물, 락틱 애시드-소듐 하이드록사이드 혼합물, 락틱 애시드-포타슘 락테이트 혼합물, 등) 및 아세테이트 완충제 {예컨대, 아세틱 애시드-소듐 아세테이트 혼합물, 아세틱 애시드-소듐 하이드록사이드 혼합물, 등)이 포함된다. 추가적으로, 인산염 완충제, 히스티딘 완충제 및 트라이메틸아민 염, 가령, Tris가 사용될 수 있다.
보존제
보존제는 미생물 성장을 지체시키기 위하여 본 발명의 조성물에 추가될 수 있으며, 0.2%-1% (w/v) 범위의 양으로 추가될 수 있다. 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)와 함께 사용하기에 적합한 보존제에는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드 {예컨대, 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 가령, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥산올, 및 3-펜탄올이 포함된다. 등장화제는 종종 "안정화제"로도 공지되어 있으며 본 발명의 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위해 추가될 수 있고, 다가 당 알콜, 예를 들어 3가 또는 보다 고급의 당 알콜, 가령, 글리세린, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨이 포함된다. 안정화제는 넓은 범주의 부형제들을 지칭하는 것으로 그 범위가 기능면에서 벌크화제로부터 첨가제에 이를 수 있으며 치료제를 용해시키거나 또는 변질 및 용기 벽에 대한 부착을 막는데 도움을 준다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알콜 (상기 열거됨); 아미노산, 가령, 아르기닌, 라이신, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 등, 유기 당 또는 당 알콜, 가령, 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등, 사이클리톨, 가령, 이노시톨 포함; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 황 함유 환원제, 가령, 우레아, 글루타티온, 티옥틱 애시드, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, a-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트; 저 분자량 폴리펩타이드 (예컨대, 10개 잔기들 또는 그 보다 적은 잔기의 펩타이드); 단백질 가령, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 가령, 폴리비닐피롤리돈 단당류, 가령, 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류, 가령, 락토스, 말토스, 수크로스 및 삼당류, 가령, 라피노스; 및 다당류, 가령, 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질의 0.1 내지 10,000 중량부 범위로 존재할 수 있다.
세제
비-이온성 계면활성제 또는 세제 (또한 "습윤제"로도 공지됨)는 치료제를 용해화함에 도움을 주기 위해, 뿐만 아니라 교반-유도 응집에 대해 치료 단백질을 보호하기 위해 추가될 수 있으며, 이는 또한 단백질의 변성을 유발하지 않고 응력을 받는 전단 표면에 제제가 노출되게 할 수 있다. 적합한 비-이온성 계면활성제에는 폴리소르베이트 (20, 80, 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에터 (TWEEN®-20, TWEEN®-80, 등)가 포함된다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 예를 들어 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL 범위로 존재할 수 있다.
추가적인 기타 부형제들에는 벌크화제 (예컨대, 전분), 킬레이트제 (예컨대, EDTA), 항산화제 (예컨대, 아스코르브산, 메싸이오닌, 비타민 E), 및 보조용매가 포함된다.
다른 제약학적 담체
본 발명의 조성물에 통합될 수 있는 대안적인 제약학적으로 허용가능한 담체는 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아라비아 고무 (rubber arable), 포타슘 포스페이트, 아르기네이트 (arginate), 젤라틴, 포타슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체를 내포하는 조성물은 윤활제, 보습제, 감미제, 착향제, 유화제, 현탁제, 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 제약학적으로 허용가능한 담체 및 제제들에 대한 세부내용은 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에서 찾을 수 있으며, 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
병용 요법을 위한 조성물 및 방법들
본 발명의 제약학적 조성물들은 선택적으로 하나 이상의 활성화 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 또 다른 제약학적 활성 분자, 예컨대, 세포독성제, 항생제, 또는 T-림프구 (예컨대, CAR-T 요법에서 사용하기 위한 유전자-편집된 T-림프구)에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 또는 이와 별도로 투여되는 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 내포할 수 있다. 예를 들어, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 또는 이의 치료 접합체 (예컨대, 본 출원에 기재된 약물-항체 접합체)는 암 또는 또 다른 세포 증식 장애 (예컨대, 신생물)을 치료하기 위하여 사용될 수 있는 하나 이상의 추가적인 활성 제제들과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제약학적 조성물들은 암 또는 다른 세포 증식 이상을 치료하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 추가적인 활성 제제들과의 공동-투여 또는 순차 투여를 위해 제제화될 수 있다. 암 및 다른 세포 증식 이상을 치료하기 위해 사용될 수 있으며 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 이와 별도로 투여될 수 있는 추가적인 활성 제제들의 예들에는 세포독성제 (예컨대, 본 출원에 기재된 제제), 뿐만 아니라 암 세포의 표면에서 과발현되는 종양 항원 또는 세포-표면 단백질과 반응성을 나타내는 항체가 포함된다. 본 발명의 길항 TNFR2 항체에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 이와 별도로 투여될 수 있는 예시적인 항체들에는, 제한 없이, 트라스투주맙 (HERCEPTIN®), 베바시주맙 (AVASTIN®), 세툭시맙 (ERBITUX®), 파니투무맙 (VECTIBIX®), 이필리무맙 (YERVOY®), 리툭시맙 (RITUXAN® 및 MABTHERA®), 알렘투주맙 (CAMPATH®), 오파투무맙 (ARZERRA®), 젬투주맙 오조가마이신 (MYLOTARG®), 브렌툭시맙 베도틴 (ADCETRIS®), 90Y-이브리투모맙 티욱세탄 (ZEVALIN®), 및 131I-토시투모맙 (BEXXAR®)이 포함되며, 이들은 Scott 외 (암 Immun., 12:14-21, 2012)에 상세히 기재되어 있고; 이 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드와 접합되거나, 이와 혼합되거나 이와 별도로 투여될 수 있는 추가적인 제제들에는 특정 질병과 연관된 특이적 항원과 반응성을 나타내는 T-림프구가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 세포 증식 장애, 가령, 본 출원에 기재된 암을 치료하기 위하여 키메라 항원 수용체 (CAR-T)를 발현시키는 T 세포와 함께 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 T-조절 세포가 종양-반응성 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형되어 있는 T-림프구를 탈활성화 시키는 것을 방해함으로써 CAR-T 요법과 상승작용 할 수 있다. 이러한 방식에서, CAR-T 세포는 세포 증식 장애, 가령, 암을 앓고 있는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)을 치료하기 위해 길항 TNFR2 폴리펩타이드 이전에, 또는 이와 동시에, 또는 이를 투여한 후에 환자에게 투여될 수 있다.
CAR-T 요법은 종양-관련 항원에 특이적인 항원 수용체를 발현시키기 위해 T-림프구를 유전자 조작할 수 있는 능력을 고려할 때 암 세포를 표적화함에 특히 강력한 플랫폼이다. 예를 들어, 종양 및 다른 암 세포의 표면 상에서 과발현되는 항원들의 식별은 키메라 T 세포 수용체들의 설계 및 발견을 알려줄 수 있으며, 키메라 T 세포 수용체들은 종종 특정 항원 펩타이드에 특이적으로 결합하는 세포외 scFv 단편에 작동적으로 연결된 자연-발생 T 세포 수용체로부터 유래한 세포질 및 막경유 도메인으로 구성된다. T 세포는 특정 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현시키기 위하여 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 임의의 다양한 유전체 편집 기술에 의해 유전자 변형될 수 있다. 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 유전자를 통합하도록 T-세포 유전체를 변형시키기 위한 예시적인 기술에는 본 출원에 기재된 CRISPER/Cas, 아연 핑거 핵산분해효소, TALEN, ARCUSTM 플랫폼이 포함된다. CAR-T 림프구의 유전자 조작 방법들은, 예컨대, WO 2014/127261, WO 2014/039523, WO 2014/099671, 및 WO 20120790000에 기재되어 있으며; 이들 각 문헌의 내용은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법들에서 유용한 CAR-T 세포는 세포가 내인성 T 세포 수용체를 발현하지 않도록 유전자 변형되어 있는 세포들을 포함한다. 예를 들어, CAR-T 세포는, CAR-T 주입을 받는 환자에서 이식편-대-숙주 반응을 방지하기 위하여, 유전체-편집 기술, 가령, 본 출원에 기재된 기술들을 사용하여, 내인성 T 세포 수용체의 발현을 억제하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, CAR-T 세포는 하나 이상의 내인성 MHC 단백질의 발현을 감소시키도록 유전자 변형될 수 있다. 이는 외부 MHC 단백질의 인식은 동종이식 거부반응을 촉진시키는 하나의 메커니즘을 나타내기 때문에 동종이계 T-림프구의 주입에 특히 유용한 기술이다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 또한 면역 억제제 단백질, 가령, 예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 및 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4 (CTLA-4)의 발현을 억제하도록 T-림프구를 변형할 수 있다. 이들 단백질은 활성화 될 때, T 세포 활성화를 약화시키는 세포 표면 수용체들이다. 하나 이상의 면역억제제 단백질의 발현을 감소시키도록 유전자 변형되어있는 CAR-T 세포의 주입은 생체내에서 T-림프구-매개된 세포독성을 지연시키기 위해 사용될 수 있는 하나의 전략을 나타낸다.
특이적 유전자들의 결실 이외에도, 원하는 항원 특이성을 가지는 T 세포 수용체를 발현시키기 위하여 CAR-T 세포를 변형할 수 있다. 예를 들어, 주입된 T 세포를 암 세포에 대해 표적하기 위하여 종양-관련 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체를 발현시키기 위하여 T-림프구를 유전자 변형할 수 있다. CAR-T 세포에 의해 발현될 수 있는 예시적인 T-세포 수용체는 다양한 종양 세포 상에서 종종 과발현되는 세포 표면 단백질인 PD-L1에 결합하는 수용체이다. PD-L1은 T-림프구 표면 상의 PD-1을 활성화시키기 때문에, CAR-T 요법으로 이러한 종양 항원을 표적하는 것은 생체내에서 T-림프구에 의해 매개되는 면역 반응의 기간을 증가시키기 위하여 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 항체 단편들과 상승작용 할 수 있다. CAR-T 세포는 또한 하나 이상의 감염 질환과 관련된 항원, 가령, 바이러스 단백질, 세균 세포, 진균, 또는 다른 기생 유기체에서 유래한 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체를 발현시키도록 변형될 수 있다.
본 발명의 다른 제약학적 조성물들은 길항 TNFR2 항체 또는 항체 단편, 인터페론 알파, 및/또는 감염 질환을 앓고 있는 환자 (예컨대, 인간 환자)에 투여될 수 있는 하나 이상의 항생제를 내포하는 조성물들을 포함한다. 예를 들어, 길항 TNFR2 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 감염 질환을 치료함에 유용한 항생제, 가령, 그 중에서도, 아미카신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 토브라마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 겔다나마이신, 헤르비마이신, 리팍시민, 로라카르베프, 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴, 메로페넴, 세파드록실, 세파졸린, 세파즐렉신, 세파클로르, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 클린다마이신, 린코마이신, 답토마이신, 에리트로마이신, 리네졸리드, 토레졸리드, 아목시실린, 암피실린, 바시트라신, 시프로플록사신, 독시사이클린, 및 테트라사이클린에 접합되거나, 이와 혼합되거나, 또는 이와 별도로 투여될 수 있다.
면역요법제
본 출원에 기재된 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는, 예를 들어, 암 또는 감염 질환, 가령, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환의 치료를 위해, 면역요법제와 혼합되거나, 이에 접합되거나, 이와 함께 투여되거나 또는 이와 별도로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법들과 함께 유용한 예시적인 면역요법제들에는, 제한 없이, 항-CTLA-4 제제, 항-PD-1 제제, 항-PD-L1 제제, 항-PD-L2 제제, 항-TNF-α 교차-결합 제제, 항-TRAIL 교차-결합 제제, 항-CD27 제제, 항-CD30 제제, 항-CD40 제제, 항-4-1BB 제제, 항-GITR 제제, 항-OX40 제제, 항-TRAILR1 제제, 항-TRAILR2 제제, 및 항-TWEAKR 제제, 뿐만 아니라, 예를 들어, Mahoney 외, Cancer Immunotherapy, 14:561-584 (2015)의 표 1에 기재된 면역학적 표적들을 향해 지시되는 제제들이 포함되며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 예를 들어, 면역학적 표적 4-1BB 리간드는 항-4-1BB 리간드 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 OX40L은 항-OX40L 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 GITR은 항-GITR 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CD27은 항-CD27 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 TL1A는 항-TL1A 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CD40L은 항-CD40L 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 LIGHT는 항-LIGHT 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 BTLA는 항-BTLA 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 LAG3는 항-LAG3 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 TIM3는 항-TIM3 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 Singlecs는 항-Singlecs 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 ICOS 리간드는 항-ICOS 리간드 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 B7-H3는 항-B7-H3 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 B7-H4는 항-B7-H4 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 VISTA는 항-VISTA 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 TMIGD2는 항-TMIGD2 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 BTNL2는 항-BTNL2 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CD48은 항-CD48 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 KIR은 항-KIR 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 LIR은 항-LIR 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 ILT는 항-ILT 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 NKG2D는 항-NKG2D 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 NKG2A는 항-NKG2A 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 MICA는 항-MICA 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 MICB는 항-MICB 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CD244는 항-CD244 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CSF1R은 항-CSF1R 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 IDO는 항-IDO 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 TGF
Figure pct00027
는 항-TGF
Figure pct00028
항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CD39는 항-CD39 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CD73은 항-CD73 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CXCR4는 항-CXCR4 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CXCL12는 항-CXCL12 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 SIRPA는 항-SIRPA 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 CD47은 항-CD47 항체로 표적될 수 있고; 면역학적 표적 VEGF는 항-VEGF 항체로 표적될 수 있고; 그리고 면역학적 표적 뉴로필린은 항-뉴로필린 항체로 표적될 수 있다 (예컨대, Mahoney 외의 문헌 표 1 참고).
본 출원에 기재된 조성물 및 방법들과 함께 사용될 수 있는 추가적인 면역요법제들의 예에는 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론 (예컨대, PEGASYS®), 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 가바펜틴, 림프계 세포 표면 수용체 및/또는 림포카인에 대한 항체, 표면 암 단백질, 및/또는 보리노스타트와 같은 소분자 치료제에 대한 항체가 포함된다.
본 발명의 방법들을 사용하여, 본 출원에 기재된 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 면역요법제와 공동-투여 (예컨대, 혼합하여) 또는 이와 별도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 암 또는 감염 질환을 앓고 있는 환자, 가령, 인간 환자에게, 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 환자에게 면역요법제를 투여하기 전에 환자에게 투여된다. 대안적으로, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 면역요법제 이후에 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 면역요법 치료 실패 후 환자에게 투여될 수 있다. 해당 분야의 숙련된 의사는 면역요법이 치료될 질병 (가령, 암 또는 감염 질환, 예컨대, 본 출원에 기재된 암 또는 감염 질환)을 성공적으로 개선하였는지 여부를 결정하기 위해 본 출원에 기재된 그리고 해당 분야에 공지된 방법을 사용하여 면역요법 치료 효능을 모니터할 수 있다.
예를 들어, 해당 분야의 숙련된 의사는 환자, 가령, 인간 환자로부터 분리된 샘플 (예컨대, 혈액 샘플 또는 생검 샘플)의 암 세포 양을, 예를 들어, 유세포분석 또는 FACS 분석을 사용하여 모니터할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 해당 분야의 숙련된 의사는 예를 들어, 환자의 하나 이상의 종양들의 크기를, 예를 들어, CT 스캔, MRI, 또는 X-선 분석에 의해 모니터함으로써, 환자의 암 질환의 진행을 모니터할 수 있다. 해당 분야의 숙련된 의사는 환자의 종양 생물마커의 양 및/또는 농도, 가령, 세포 표면-결합된 종양 관련 항원들 또는 종양 존재의 지표로서 환자의 혈액에 존재하는 분비된 종양 항원들의 양 및/또는 농도를 평가함으로써, 암, 가령, 본 출원에 기재된 암의 진행을 모니터할 수 있다. 면역요법제를 투여한 후, 특정된 시기 (예컨대, 1일 내지 6개월, 가령, 1일, 2일, 3일, 4일, 5 일, 6 일, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월) 이내에 환자에 또는 환자로부터 분리된 샘플에 존재하는 암 세포의 양, 종양의 크기 및/또는 하나 이상의 종양 항원들의 양 또는 농도가 예를 들어, 통계적으로 유의한 양만큼 감소되지 않았다는 결과는 면역요법 치료가 암을 개선하지 못했음을 나타낼 수 있다. 이러한 표시를 근거로, 해당 분야의 숙련된 의사는 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체를 투여할 수 있다. 유사하게, 해당 분야의 숙련된 의사는 감염 질환, 가령, 본 출원에 기재된 감염 질환을 앓고 있는 환자로부터 분리된 샘플 내 세균, 진균, 또는 기생충 세포의 양, 또는 바이러스 입자들의 양을 모니터할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 해당 분야의 숙련된 의사는 이러한 질환을 앓고 있는 환자의 증상들을 평가함으로써 감염 질환의 진행을 모니터할 수 있다. 예를 들어, 의사는 면역요법제로 치료 후 감염성 질환의 하나 이상의 증상들의 빈도 및/또는 중증도가 안정화 (예컨대, 동일하게 유지) 또는 감소되었는지 여부를 결정함으로써 환자를 모니터할 수 있다. 면역요법제 투여 후 특정된 시기 이내 (예컨대, 1 일 내지 6 개월, 가령, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월)에 환자로부터 분리된 샘플 내 세균, 진균, 또는 기생충 세포 또는 바이러스 입자들의 양 및/또는 감염성 질환의 하나 이상의 증상들의 빈도 또는 중증도가 예를 들어, 통계적으로 유의한 양만큼 감소되지 않았다는 결과는 면역요법 치료가 감염성 질환을 개선하지 못했음을 나타낼 수 있다. 이러한 표시를 근거로, 해당 분야의 숙련된 의사는 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체를 투여할 수 있다.
화학요법제 및 방사선 요법
추가적으로 또는 대안적으로, 본 출원에 기재된 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 화학요법제, 예를 들어, 암, 가령, 본 출원에 기재된 암의 치료를 위한 화학요법제와 혼합되거나, 이에 접합되거나, 이와 함께 투여되거나 또는 이와 별도로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법들과 함께 사용가능한 예시적인 화학요법제에는, 제한없이, 아비라테론 아세테이트, ABITREXATE® (메토트렉세이트), ABRAXANE® (파클리탁셀 알부민), ADRIAMYCIN®, 블레오마이신, 빈블라스틴, 및 다카르바진 (ABVD), ADRIAMYCIN®, 블레오마이신, 빈크리스틴 설페이트, 및 에토포시드 포스페이트 (ABVE), ADRIAMYCIN®, 블레오마이신, 빈크리스틴 설페이트, 에토포시드 포스페이트, 프레드니손, 및 사이클로포스파미드 (ABVE-PC), 독소루비신 및 사이클로포스파미드 (AC), 독소루비신, 사이클로포스파미드, 및 파클리탁셀 또는 도세탁셀 (AC-T), ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴), 시타라빈, 다우노루비신, 및 에토포시드 (ADE), 아도-트라스투주맙 엠탄신, ADRIAMYCIN® (독소루비신 하이드로클로라이드), 아파티닙 다이말레이트, AFINITOR® (에베롤리무스), AKYNZEO® (네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드), ALDARA® (이미퀴모드), 알데스루킨, ALECENSA® (알렉티닙), 알렉티닙, 알렘투주맙, 주사용 ALKERAN® (멜팔란 하이드로클로라이드), ALKERAN® 정제 (멜팔란), ALIMTA® (페메트렉시드 다이소듐), ALOXI® (팔로노세트론 하이드로클로라이드), AMBOCHLORIN® (클로람부실), AMBOCLORIN® (클로람부실), 아미노레불리닉 애시드, 아나스트로졸, 아프레피탄트, AREDIA® (파미드로네이트 다이소듐), ARIMIDEX® (아나스트로졸), AROMASIN® (엑스메스탄), ARRANON® (넬라라빈), 아르세닉 트라이옥사이드, ARZERRA® (오파투무맙), 아스파라기나제 에르비니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi), AVASTIN® (베바시주맙), 악시티닙, 아자시티딘, BEACOPP 베세눔 (카르무스틴), BELEODAQ® (벨리노스타트), 벨리노스타트, 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 블레오마이신, 에토포시드, 및 시스플라틴 (BEP), 베바시주맙, 벡사로텐, BEXXAR® (토시투모맙 및 아이오딘 131I 토시투모맙), 바이칼루타미드, BiCNU (카르무스틴), 블레오마이신, 블리나투모맙, BLINCYTO® (블리나투모맙), 보르테조밉, BOSULIF® (보수티닙), 보수티닙, 브렌툭시맙 베도틴, 부설판, BUSULFEX® (부설판), 카바지탁셀, 카보잔티닙-S-말레이트, CAF, CAMPATH® (알렘투주맙), CAMPTOSAR® (이리노테칸 하이드로클로라이드), 카페시타빈, CAPOX, CARAC® (플루오로우라실), 카르보플라틴, 카르보플라틴-TAXOL®, 카르필조밉, CARMUBRIS® (카르무스틴), 카르무스틴, 카르무스틴 임플란트, CASODEX® (바이칼루타미드), CEENU (로무스틴), 시스플라틴, 에토포시드, 및 메토트렉세이트 (CEM), 세리티닙, CERUBIDINE® (다우노루비신 하이드로클로라이드), CERVARIX® (재조합 HPV 이가 백신), 세툭시맙, 클로람부실, 클로람부실-프레드니손, CHOP, 시스플라틴, CLAFEN® (사이클로포스파미드), 클로파라빈, CLOFAREX® (클로파라빈), CLOLAR® (클로파라빈), CMF, 코비메티닙, 코메트리크 (카보잔티닙-S-말레이트), COPDAC, COPP, COPP-ABV, COSMEGEN® (닥티노마이신), COTELLIC® (코비메티닙), 크리조티닙, CVP, 사이클로포스파미드, CYFOS® (이포스파미드), CYRAMZA® (라무시루맙), 시타라빈, 시타라빈 리포좀, CYTOSAR-U® (시타라빈), CYTOXAN® (사이클로포스파미드), 다브라페닙, 다카르바진, DACOGEN® (데시타빈), 닥티노마이신, 다라투무맙, DARZALEX® (다라투무맙), 다사티닙, 다우노루비신 하이드로클로라이드, 데시타빈, 데가렐릭스, 데닐루킨 디프티톡스, 데노수맙, DEPOCYT® (시타라빈 리포좀), 덱사메타손, 덱스라족산하이드로클로라이드, 디누툭시맙, 도세탁셀, DOXIL® (독소루비신 하이드로클로라이드), 독소루비신 하이드로클로라이드, DOX-SL® (독소루비신 하이드로클로라이드), DTIC-DOME® (다카르바진), EFUDEX (플루오로우라실), ELITEK® (라스부리카제), ELLENCE® (에피루비신 하이드로클로라이드), 엘로투주맙, ELOXATIN® (옥살리플라틴), 엘트롬보파그 올라민, EMEND® (아프레피탄트), EMPLICITI® (엘로투주맙), 엔잘루타미드, 에피루비신 하이드로클로라이드, EPOCH, ERBITUX® (세툭시맙), 에리불린 메실레이트, ERIVEDGE® (비스모데깁), 에를로티닙 하이드로클로라이드, ERWINAZE® (아스파라기나제 에르비니아 크리산테미), ETOPOPHOS® (에토포시드 포스페이트), 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, EVACET® (독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 에베롤리무스, EVISTA® (랄록시펜 하이드로클로라이드), EVOMELA® (멜팔란 하이드로클로라이드), 엑스메스탄, 5-FU (5-플루오로우라실), FARESTON® (토레미펜), FARYDAK® (파노비노스타트), FASLODEX® (풀베스트란트), FEC, FEMARA® (레트로졸), 필그라스팀, FLUDARA® (플루다라빈 포스페이트), 플루다라빈 포스페이트, FLUOROPLEX® (플루오로우라실), 플루오로우라실 주사, 플루타미드, FOLEX® (메토트렉세이트), FOLEX® PFS (메토트렉세이트), FOLFIRI, FOLFIRI-베바시주맙, FOLFIRI-세툭시맙, FOLFIRINOX, FOLFOX, FOLOTYN® (프랄라트렉세이트), FU-LV, 풀베스트란트, GARDASIL® (재조합 HPV 4가 백신), GARDASIL 9® (재조합 HPV 9가 백신), GAZYVA® (오비누투주맙), 게피티닙, 젬시타빈 하이드로클로라이드, 젬시타빈-시스플라틴, 젬시타빈-옥살리플라틴, 젬투주맙 오조가마이신, GEMZAR® (젬시타빈 하이드로클로라이드), GILOTRIF® (아파티닙 다이말레이트), GLEEVEC® (이마티닙 메실레이트), GLIADEL® (카르무스틴 임플란트), GLIADEL® 웨이퍼 (카르무스틴 임플란트), 글루카르피다제, 고세렐린 아세테이트, HALAVEN® (에리불린 메실레이트), HERCEPTIN® (트라스투주맙), HPV 이가 백신, HYCAMTIN® (토포테칸 하이드로클로라이드), 하이퍼-CVAD, IBRANCE (팔보시클립), 이브리투모맙® 티욱세탄, 이브루티닙, ICE, ICLUSIG® (포나티닙 하이드로클로라이드), IDAMYCIN® (이다루비신 하이드로클로라이드), 이다루비신 하이드로클로라이드, 이델라리십, IFEX® (이포스파미드), 이포스파미드, 이포스파미둠, IL-2 (알데스루킨), 이마티닙 메실레이트, IMBRUVICA® (이브루티닙), i이미퀴모드, IMLYGIC® (탈리모겐 라헤르파렙벡), INLYTA (악시티닙), 재조합 인터페론 알파-2b, 인트론 A, 토시투모맙, 가령, 131I 토시투모맙, 이필리무맙, IRESSA® (게피티닙), 이리노테칸 하이드로클로라이드, ISTODAX® (로미뎁신), 익사베필론, 익사조밉 시트레이트, IXEMPRA® (익사베필론), JAKAFI® (룩솔리티닙 포스페이트), JEVTANA® (카바지탁셀), KADCYLA® (아도-트라스투주맙 엠탄신), KEOXIFENE® (랄록시펜 하이드로클로라이드), KEPIVANCE® (팔리페르민), KEYTRUDA® (펨브롤리주맙), KYPROLIS® (카르필조밉), 란레오타이드 아세테이트, 라파티닙 다이토실레이트, 레날리도마이드, 렌바티닙 메실레이트, LENVIMA® (렌바티닙 메실레이트), 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류케란 (클로람부실), 류프롤라이드 아세테이트, 레불란 (아미노레불리닉 애시드), LINFOLIZIN® (클로람부실), LIPODOX® (독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 로무스틴, LONSURF® (트라이플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드), LUPRON® (류프롤라이드 아세테이트), LYNPARZA® (올라파립), MARQIBO® (빈크리스틴 설페이트 리포좀), MATULANE® (프로카르바진 하이드로클로라이드), 메클로레타민 하이드로클로라이드, 메게스트롤 아세테이트, MEKINIST® (트라메티닙), 멜팔란, 멜팔란 하이드로클로라이드, 메르캅토퓨린, MESNEX® (메스나), METHAZOLASTONE® (테모졸로마이드), 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 LPF, MEXATE® (메토트렉세이트), MEXATE-AQ® (메토트렉세이트), 미토마이신 C, 미톡산트론 하이드로클로라이드, MITOZYTREX® (미토마이신 C), MOPP, MOZOBIL® (플레릭사포르), MUSTARGEN® (메클로레타민 하이드로클로라이드), MUTAMYCIN® (미토마이신 C), MYLERAN® (부설판), MYLOSAR® (아자시티딘), MYLOTARG® (젬투주맙 오조가마이신), 나노입자 파클리탁셀, NAVELBINE® (비노렐빈 타르트레이트), 네시투무맙, 넬라라빈 , NEOSAR® (사이클로포스파미드), 네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드, NEUPOGEN® (필그라스팀), NEXAVAR® (소라페닙 토실레이트), 닐로티닙, NINLARO® (익사조밉 시트레이트), 니볼루맙, NOLVADEX® (타목시펜 시트레이트), NPLATE® (로미플로스팀), 오비누투주맙, ODOMZO® (소니데깁), OEPA, 오파투무맙, OFF, 올라파립, 오마세탁신 메페숙시네이트, ONCASPAR® (페가스파르가제), 온단세트론 하이드로클로라이드, ONIVYDE® (이리노테칸 하이드로클로라이드 리포좀), ONTAK® (데닐루킨 디프티톡스), OPDIVO® (니볼루맙), OPPA, 오시메르티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제제, PAD, 팔보시클립, 팔리페르민, 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 팔로노세트론 하이드로클로라이드 및 네투피탄트, 파미드로네이트 다이소듐, 파니투무맙, 파노비노스타트, PARAPLAT® (카르보플라틴), PARPLATIN® (카르보플라틴), 파조파닙 하이드로클로라이드, PCV, 페가스파르가제, 페그인터페론 알파-2b, PEG-인트론® (페그인터페론 알파-2b), 펨브롤리주맙, 페메트렉시드 다이소듐, PERJETA® (퍼투주맙), 퍼투주맙, PLATINOL® (시스플라틴), PLATINOL-AQ® (시스플라틴), 플레릭사포르, 포말리도마이드, POMALYST® (포말리도마이드), 포나티닙 하이드로클로라이드, PORTRAZZA® (네시투무맙), 프랄라트렉세이트, 프레드니손, 프로카르바진 하이드로클로라이드, PROLEUKIN® (알데스루킨), PROLIA® (데노수맙), PROMACTA (엘트롬보파그 올라민), PROVENGE® (시풀루셀-T), PURINETHOL® (메르캅토퓨린), PURIXAN® (메르캅토퓨린), 223Ra 다이클로라이드, 랄록시펜 하이드로클로라이드, 라무시루맙, 라스부리카제, R-CHOP, R-CVP, 재조합 인간 유두종바이러스 (HPV), 재조합 인터페론 알파-2b, 레고라페닙, R-EPOCH, REVLIMID® (레날리도마이드), RHEUMATREX® (메토트렉세이트), RITUXAN® (리툭시맙), 롤라피탄트 하이드로클로라이드, 로미뎁신, 로미플로스팀, 루비도마이신 (다우노루비신 하이드로클로라이드), 룩솔리티닙 포스페이트, SCLEROSOL® 가슴막내 에어로졸 (활석), 실툭시맙, 시풀루셀-T, 소마툴린 데포 (란레오타이드 아세테이트), 소니데깁, 소라페닙 토실레이트, SPRYCEL® (다사티닙), STANFORD V, 멸균 활석 분말 (활석), STERI활석® (활석), STIVARGA® (레고라페닙), 수니티닙 말레이트, SUTENT® (수니티닙 말레이트), SYLATRON® (페그인터페론 알파-2b), SYLVANT® (실툭시맙), SYNOVIR® (탈리도마이드), SYNRIBO® (오마세탁신 메페숙시네이트), 티오구아닌, TAC, TAFINLAR® (다브라페닙), TAGRISSO® (오시메르티닙), 탈리모겐 라헤르파렙벡, 타목시펜 시트레이트, 타라빈 PFS (시타라빈), TARCEVA (에를로티닙 하이드로클로라이드), TARGRETIN® (벡사로텐), TASIGNA® (닐로티닙), TAXOL® (파클리탁셀), TAXOTERE® (도세탁셀), TEMODAR® (테모졸로마이드), 템시롤리무스, 탈리도마이드, THALOMID® (탈리도마이드), 티오구아닌, 티오테파, TOLAK® (국소 플루오로우라실), 토포테칸 하이드로클로라이드, 토레미펜, TORISEL® (템시롤리무스), TOTECT® (덱스라족산하이드로클로라이드), TPF, 트라벡테딘, 트라메티닙, TRE및A® (벤다무스틴 하이드로클로라이드), 트라이플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드, TRISENOX® (아르세닉 트라이옥사이드), TYKERB® (라파티닙 다이토실레이트), UNITUXIN® (디누툭시맙), 우리딘 트라이아세테이트, VAC, 반데타닙, VAMP, VARUBI® (롤라피탄트 하이드로클로라이드), 벡티빅스 (파니투무맙), VelP, VELBAN® (빈블라스틴 설페이트), VELCADE® (보르테조밉), VELSAR (빈블라스틴 설페이트), 베무라페닙, VIADUR (류프롤라이드 아세테이트), VIDAZA (아자시티딘), 빈블라스틴 설페이트, VINCASAR® PFS (빈크리스틴 설페이트), 빈크리스틴 설페이트, 비노렐빈 타르트레이트, VIP, 비스모데깁, VISTOGARD® (우리딘 트라이아세테이트), VORAXAZE® (글루카르피다제), 보리노스타트, VOTRIENT® (파조파닙 하이드로클로라이드), WELLCOVORIN® (류코보린 칼슘), XALKORI® (크리조티닙), XELODA® (카페시타빈), XELIRI, XELOX, XGEVA® (데노수맙), XOFIGO® (223Ra 다이클로라이드), XT및I® (엔잘루타미드), YERVOY® (이필리무맙), YONDELIS® (트라벡테딘), ZALTRAP® (지브-아플리베르셉트), ZARXIO® (필그라스팀), ZELBORAF® (베무라페닙), ZEVALIN® (이브리투모맙 티욱세탄), ZINECARD® (덱스라족산하이드로클로라이드), 지브-아플리베르셉트, ZOFRAN® (온단세트론 하이드로클로라이드), ZOLADEX® (g고세렐린 아세테이트), 졸레드로닉 애시드, ZOLINZA® (보리노스타트), ZOMETA® (졸레드로닉 애시드), ZYDELIG® (이델라리십), ZYKADIA® (세리티닙), 및 ZYTIGA (아비라테론 아세테이트)가 포함된다.
본 발명의 방법들을 사용하여, 본 출원에 기재된 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 암을 치료하기 위한 화학요법제와 공동-투여 (예컨대, 혼합하여) 또는 이와 별도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 암을 앓고 있는 환자, 가령, 인간 환자에게, 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 환자에게 화학요법제를 투여하기 전에 환자에게 투여된다. 대안적으로, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 화학요법제 이후에 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 화학요법 치료 실패 후 환자에게 투여될 수 있다. 해당 분야의 숙련된 의사는 면역요법이 치료될 질병 (가령, 본 출원에 기재된 암 )을 성공적으로 개선하였는지 여부를 결정하기 위해 본 출원에 기재된 그리고 해당 분야에 공지된 방법을 사용하여 화학요법 치료 효능을 모니터할 수 있다.
예를 들어, 해당 분야의 숙련된 의사는 환자, 가령, 인간 환자로부터 분리된 샘플 (예컨대, 혈액 샘플 또는 생검 샘플)의 암 세포 양을, 예를 들어, 유세포분석 또는 FACS 분석을 사용하여 모니터할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 해당 분야의 숙련된 의사는 예를 들어, 환자의 하나 이상의 종양들의 크기를, 예를 들어, CT 스캔, MRI, 또는 X-선 분석에 의해 모니터함으로써, 환자의 암 질환의 진행을 모니터할 수 있다. 해당 분야의 숙련된 의사는 환자의 종양 생물마커의 양 및/또는 농도, 가령, 세포 표면-결합된 종양 관련 항원들 또는 종양 존재의 지표로서 환자의 혈액에 존재하는 분비된 종양 항원들의 양 및/또는 농도를 평가함으로써, 암, 가령, 본 출원에 기재된 암의 진행을 모니터할 수 있다. 화학요법제를 투여한 후, 특정된 시기 (예컨대, 1일 내지 6개월, 가령, 1일, 2일, 3일, 4일, 5 일, 6 일, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월) 이내에 환자에 또는 환자로부터 분리된 샘플에 존재하는 암 세포의 양, 종양의 크기 및/또는 하나 이상의 종양 항원들의 양 또는 농도가 예를 들어, 통계적으로 유의한 양만큼 감소되지 않았다는 결과는 화학요법 치료가 암을 개선하지 못했음을 나타낼 수 있다. 이러한 표시를 근거로, 해당 분야의 숙련된 의사는 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체를 투여할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 방법들을 사용하여, 본 출원에 기재된 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 방사선 치료와 동시에 투여되거나 또는 이와 별도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 해당 분야의 숙련된 의사는 본 출원에 기재된 암을 앓고 있는 환자, 가령, 인간 환자에게, 외부 및/또는 내부 전자기 방사선으로 환자를 치료함으로써, 방사선 요법을 투여할 수 있다. 전형적으로, X-선, 감마선, 및 유사한 형태의 저-파장 에너지의 형태인 이러한 방사선에 의해 전달되는 에너지는, 암 세포의 DNA에 산화적 손상을 유발함으로써, 예를 들어, 세포자멸에 의한, 세포 사멸을 가져올 수 있다. 외부 방사선 요법은 제어된 펄스의 전자기 방사선에 환자를 노출시키기 위하여 예를 들어, 기기, 가령, 방사선 빔을 사용하여 투여될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 환자는, 예를 들어, 방사능 치환체를 내포하는 치료제, 가령, 각각 고-에너지의 알파 및 베타 입자들을 방출하는 223Ra 또는 131I를 내포하는 물질을 환자에게 투여함으로써, 내부 방사선을 투여받을 수 있다. 방사성표지에 접합될 수 있는 예시적인 치료제들에는, 예를 들어, 그 중에서도, 소분자 화학요법제, 항체, 및 이의 항원-결합 단편이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 , 예를 들어, 해당 분야에 공지된 또는 본 출원에 기재된 결합-형성 기술을 사용하여 이러한 치환체를 결찰시키는 모이어티 또는 방사능 치환체에 접합될 수 있다. 이러한 접합체들은 방사선 요법 및 본 발명의 TNFR2 길항제의 치료 용량을 전달하기 위해 동시 투여로 대상체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 상기 "길항 TNFR2 폴리펩타이드 접합체" 참고).
일부 구체예들에서, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 방사선 치료 실패 후 환자에게 투여된다. 해당 분야의 숙련된 의사는 방사선요법이 치료될 질병 (가령, 본 출원에 기재된 암 )을 성공적으로 개선하였는지 여부를 결정하기 위해, 예컨대, 본 출원에 기재된 방법을 사용하여 방사선요법 치료 효능을 모니터할 수 있다. 예를 들어, 해당 분야의 숙련된 의사는 환자, 가령, 인간 환자로부터 분리된 샘플 (예컨대, 혈액 샘플 또는 생검 샘플)의 암 세포 양을, 예를 들어, 유세포분석 또는 FACS 분석을 사용하여 모니터할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 해당 분야의 숙련된 의사는 예를 들어, 환자의 하나 이상의 종양들의 크기를, 예를 들어, CT 스캔, MRI, 또는 X-선 분석에 의해 모니터함으로써, 환자의 암 질환의 진행을 모니터할 수 있다. 해당 분야의 숙련된 의사는 환자의 종양 생물마커의 양 및/또는 농도, 가령, 세포 표면-결합된 종양 관련 항원들 또는 종양 존재의 지표로서 환자의 혈액에 존재하는 분비된 종양 항원들의 양 및/또는 농도를 평가함으로써, 암, 가령, 본 출원에 기재된 암의 진행을 모니터할 수 있다. 방사선요법을 투여한 후, 특정된 시기 (예컨대, 1일 내지 6개월, 가령, 1일, 2일, 3일, 4일, 5 일, 6 일, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월) 이내에 환자에 또는 환자로부터 분리된 샘플에 존재하는 암 세포의 양, 종양의 크기 및/또는 하나 이상의 종양 항원들의 양 또는 농도가 예를 들어, 통계적으로 유의한 양만큼 감소되지 않았다는 결과는 방사선요법 치료가 암을 개선하지 못했음을 나타낼 수 있다. 이러한 표시를 근거로, 해당 분야의 숙련된 의사는 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체를 투여할 수 있다.
일부 구체예들에서, 해당 분야의 숙련된 의사는 암을 앓고 있는 환자에게 화학요법제, 방사선 요법, 및 본 발명의 TNFR2 길항제 (가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)를 투여할 수 있다. 본 발명의 TNFR2 길항제, 화학요법제, 및 방사선 요법은 상기 환자에게 동시에 (예를 들어, 단일 제약학적 조성물로 또는 동시에 환자에게 투여되는 다수의 조성물로) 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, TNFR2 길항제 (가령, 본 발명의 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체)가 환자에게 먼저 투여되고, 그 후 화학요법제 및 방사선 요법이 투여된다. 대안적으로, TNFR2 길항제 (가령, 본 발명의 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 화학요법 및 방사선 치료 후 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체)는 화학요법 및/또는 방사선 치료 실패 후 환자에게 투여될 수 있다.
해당 분야의 숙련된 의사는 화학요법 및 방사선요법이 치료될 질병 (가령, 본 출원에 기재된 암 )을 성공적으로 개선하였는지 여부를 결정하기 위해, 본 출원에 기재된 방법, 가령, 상기 기재된 방법을 사용하여 방사선요법 치료 효능을 모니터할 수 있다. 예를 들어, 해당 분야의 숙련된 의사는 환자, 가령, 인간 환자로부터 분리된 샘플 (예컨대, 혈액 샘플 또는 생검 샘플)의 암 세포 양을, 예를 들어, 유세포분석 또는 FACS 분석을 사용하여 모니터할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 해당 분야의 숙련된 의사는 예를 들어, 환자의 하나 이상의 종양들의 크기를, 예를 들어, CT 스캔, MRI, 또는 X-선 분석에 의해 모니터함으로써, 환자의 암 질환의 진행을 모니터할 수 있다. 해당 분야의 숙련된 의사는 환자의 종양 생물마커의 양 및/또는 농도, 가령, 세포 표면-결합된 종양 관련 항원들 또는 종양 존재의 지표로서 환자의 혈액에 존재하는 분비된 종양 항원들의 양 및/또는 농도를 평가함으로써, 암, 가령, 본 출원에 기재된 암의 진행을 모니터하고 혈청 가용성 TNFR2를 측정할 수도 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 활성화된 T-조절의 수를 감소시키고, T 작동자의 수를 증가시키고 암 세포의 총 수를 감소시킬 것으로 예상할 것이다. 이들 TNFR2 항체의 암에 대한 특이성으로 인해, 임상 모니터링 결과는 종양 미세환경에서 가장 강할 것으로 예상될 것이다. 화학요법제 및 방사선을 투여한 후, 특정된 시기 (예컨대, 1일 내지 6개월, 가령, 1일, 2일, 3일, 4일, 5 일, 6 일, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월) 이내에 환자에 또는 환자로부터 분리된 샘플에 존재하는 암 세포의 양, 종양의 크기 및/또는 하나 이상의 종양 항원들의 양 또는 농도가 예를 들어, 통계적으로 유의한 양만큼 감소되지 않았다는 결과는 화학요법 및 방사선치료가 암을 개선하지 못했음을 나타낼 수 있다. 이러한 표시를 근거로, 해당 분야의 숙련된 의사는 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 구조체를 투여할 수 있다.
혈액-뇌 장벽 투과
특정 구체예들에서, 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 생체내에서 적절한 분포를 확보하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 많은 고 친수성 화합물들을 배제시킨다. 본 발명의 치료 조성물이 BBB를 통과하는 것 (필요한 경우)을 보장하기 위하여, 이들은, 예를 들어, 리포좀 내에 제형화될 수 있다. 리포좀 제조 방법들은, 예컨대, 미국 특허 제 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331에 기재되어 있다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기로 선택적으로 전달됨으로써, 표적화된 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예컨대, V. V. Ranade (J. Clin. Pharmacol. 29:685, 1989) 참고). 예시적인 표적화 모이어티들에는, 예컨대, 엽산염 또는 비오틴 (예컨대, 미국 특허 제 5,416,016 참고); 만노사이드 (Umezawa 외 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038, 1988)); 항체 (P. G. Bloeman 외 (FEBS Lett. 357:140, 1995); M. Owais 외 (Antimicrob. Agents Chemother. 39:180, 1995)); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe 외 (Am. J. Physiol. 1233:134, 1995))가 포함되며; 상기 문헌들 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
투여 경로 및 용량
본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간) by 다양한 경로로, 가령, 경구, 경구, 경피, 피하, 비강내, 비강내, 근육내, 안구내, 종양내, 비경구, 국소, 척수강내 및 뇌실내 투여될 수 있다. 임의의 주어진 사례에서 투여에 가장 적합한 경로는 투여되는 특정 폴리펩타이드, 환자, 제약학적 제제화 방법, 투여 방법 (예컨대, 투여 시간 및 투여 경로), 환자의 연령, 체중, 성별, 치료되는 질병의 중증도, 환자의 식이, 및 환자의 배설물 비율 (excretion rate)에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 항-TNFR2 폴리펩타이드의 유효량은, 치료되는 병태, 투여 경로 그리고 대상체의 연령, 체중, 및 상태에 따라, 단회 (예컨대, 볼루스) 투여, 다회 투여 또는 연속 투여에 대해 체중 1kg 당 약 0.0001 내지 약 100 mg 범위, 또는 단회 (예컨대, 볼루스) 투여, 다회 투여 또는 연속 투여에 대해 0.0001-5000 μg/mL 혈청 농도, 또는 이 범위에 속하는 임의의 유효 범위 또는 값의 혈청 농도에 도달하기 위한 범위일 수 있다. 특정 구체예들에서, 예컨대, 암 치료와 관련하여, 각각의 용량은 체중 1kg 당 약 0.0001 mg 내지 약 500 mg 범위일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약학적 조성물은 0.001-100 mg/kg (체중) 범위의 일일 용량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 필요로 하는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에게 1일, 1주, 1개월 또는 1년에 1회 이상 (예컨대, 2-10 회) 투여될 수 있다.
치료 조성물은 해당 분야에 공지된 의학 장치들을 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 무바늘 분출 주사 장치, 가령, 미국 특허 제 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치들을 이용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈들의 예들에는 다음이 포함된다: 제어된 비율로 약제를 투약하기 위한 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시하는, 미국 특허 제 4,487,603; 피부를 통해 약제를 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는, 미국 특허 제 4,486,194; 정확한 주입 비율로 약제를 전달하기 위한 약제 주입 펌프를 개시하는, 미국 특허 제 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 이식가능한 가변 유동 주입 장비를 개시하는, 미국 특허 제 4,447,224; 다수의 챔버 구획들을 가지는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는, 미국 특허 제 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는, 미국 특허 제 4,475,196. 이들 특허문헌들은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 많은 다른 이식물, 전달 시스템 및 모듈들은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지이다.
길항 항-TNFR2 폴리펩타이드를 내포하는 키트
본 발명은 또한 길항 항-TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)를 내포하는 키트를 포함한다. 본 출원에서 제공되는 키트는 본 출원에 기재된 임의의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 이러한 항체를 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 내포하는 벡터, 또는 본 발명의 항체를 발현 및 분비하도록 조작된 세포 (예컨대, 원핵 또는 진핵 세포)를 내포할 수 있다. 본 발명의 키트는 본 발명의 조성물 (예컨대, 길항 항-TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 길항 항-TNFR2 폴리펩타이드를 내포하는 접합체, 길항 항-TNFR2 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 내포하는 벡터)을 제조하기 위해 사용될 수 있는 시약들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 세포 (예컨대, 포유동물 세포) 내에서 길항 TNFR2 폴리펩타이드 발현을 유도할 수 있는 시약들, 가령, 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 포함할 수 있다. 다른 사례들에서, 본 발명의 키트는 에피토프 태그 및 길항 TNFR2 항체를 내포하는 융합 단백질에 결합하여 이를 탐지할 수 있는 화합물을 내포할 수 있다. 예를 들어, 이러한 사례에서 본 발명의 키트는 말토스, 글루타티온, 니켈-내포 복합체, 항-FLAG 항체, 항-myc 항체, 항-HA 항체, 비오틴, 또는 스트렙타비딘을 내포할 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 또는 이의 단편)를 직접 탐지할 수 있는 시약들을 포함할 수도 있다. 이러한 시약들의 예들에는 본 발명의 항-TNFR2 항체의 Fc 영역 내의 특정한 구조적 특징들을 선택적으로 인식하여 결합하는 이차 항체가 포함된다. 본 발명의 키트는 길항 TNFR2 항체의 Fc 영역을 인식하고 형광 분자에 접합되는 이차 항체를 내포할 수 있다. 이들 항체-형광단 접합체들은 길항 항-TNFR2 항체, 예컨대, 특정 조직 또는 배양된 포유동물 세포에서 확립된 면역형광 기술을 사용하여 길항 항-TNFR2 항체의 국소화를 분석하기 위한 툴을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 키트는 공지된 준세포 국소화 패턴을 나타내는 추가적인 형광 화합물들을 포함할 수 있다. 이들 시약들은 다른 세포-표면 단백질에 대한 항-TNFR2 항체의 국소화를 분석하기 위하여 또 다른 항체-형광단 접합체, 예컨대, 세포 표면 상의 상이한 수용체를 특이적으로 인식하는 접합체와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드 (예컨대, 단쇄 폴리펩타이드, 항체, 및 이의 항원-결합 단편)의 투여에 의한 치료에 대해 환자의 반응을 분석하기 위해 사용될 수 있는 시약을 내포할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 길항 TNFR2 항체 그리고 본 발명의 항체로 치료 중인 대상체 (예컨대, 인간)으로부터 채취한 혈액 샘플 내 T-조절 세포의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 시약들을 포함할 수 있다. 이러한 키트는, 예컨대, T-조절 세포, 가령, CD4 및 CD25에 의해 제시되는 세포-표면 항원들에 선택적으로 결합하는 항체를 내포할 수 있다. 선택적으로, 이러한 항체들은 해당 분야에 공지된 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 방법들에 의한 T-조절 세포의 분석을 용이하게 하기 위하여 형광 염료, 가령, 플루오레세인 또는 테트라메틸로다민으로 표지될 수 있다. 본 발명의 키트는 복원 중인 종양-침윤 림프구 증식에 있어서 본 발명의 길항 TNFR2 항체의 유효도를 결정하기 위하여 종양-반응성 T-림프구를 정량하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 시약들을 선택적으로 내포할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 세포독성 T 세포, 가령, CD8 또는 CD3의 표면 상의 세포-표면 마커들에 선택적으로 결합하는 항체를 내포할 수 있다. 선택적으로, 이들 항체는 FACS 분석으로 정량할 수 있도록 형광 분자들로 표지될 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 TNFR2에서 유래한 하나 이상의 펩타이드 (예컨대, 서열 번호: 11, 19, 20, 34-117, 285, 또는 286 중 어느 하나의 서열을 내포하는 펩타이드)에 대한 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드의 친화성 및 선택성을 결정함에 유용한 하나 이상의 시약들을 내포할 수 있다. 예를 들어, 키트는 길항 TNFR2 폴리펩타이드 그리고, 고유 단백질에서의 에피토프와 유사한 입체형태의 TNFR2 에피토프를 제시하는 하나 이상의 펩타이드들에 대한 본 발명의 항체의 KD를 결정하기 위하여 ELISA 분석에서 사용될 수 있는 하나 이상의 시약들을 내포할 수 있다. 키트는, 예컨대, 아비딘에 이미 접합시킨 웰들을 내포하는 마이크로타이터 플레이트를 내포할 수 있으며, 각각이 비오틴 모이어티에 접합되어 있는 TNFR2-유래 펩타이드의 라이브러리를 내포할 수 있다. 이러한 키트는 선택적으로 본 발명의 길항 TNFR2 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 이차 항체를 내포할 수 있으며, 이차 항체는 발광 빛을 방출시키는 화학적 반응을 촉매화하는 효소 (예컨대, 홀스래디쉬 퍼옥시다제)에 접합될 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 그리고 이러한 항체에 접합될 수 있는, 기존 문헌에 기재된 시약들 (예컨대, 세포독성 제제, 형광 분자, 생물발광 분자, 방사성 동위원소를 내포하는 분자, 상자성 이온에 결합된 킬레이트 그룹을 내포하는 분자 등)을 포함한 시약들을 내포한다. 이들 키트들은 추가적으로 제 2 분자, 가령, 상기 기재된 분자들에 본 발명의 길항 TNFR2 항체를 어떻게 접합시킬 수 있는지에 관한 지시사항들을 내포할 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 길항 항-TNFR2 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 내포하는 벡터, 가령, 본 출원에 기재된 임의의 벡터를 내포할 수 있다. 대안적으로, 키트는 세포의 핵 유전체로부터 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편들을 발현 및 분비하도록 유전자 변형되어 있는 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포)를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한 폴리뉴클레오타이드로부터 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편의 발현이 어떻게 유도될 수 있는지를 설명하는 지시사항을 내포할 수 있으며, 이들 폴리뉴클레오타이드의 전사를 촉진하기 위해 사용될 수 있는 시약들 (가령, 예컨대, 독시사이클린 또는 테트라사이클린)을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 키트는 본 발명의 길항 TNFR2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제작에 유용할 수 있다.
본 발명의 다른 키트는 세포의 핵 유전체로부터 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드를 발현 및 분비하도록 원핵 또는 진핵 세포 (예컨대, CHO 세포 또는 BL21(DE3) 대장균 (E. coli) 세포)를 조작하기 위한 툴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 해당 분야에 공지된 방법에 따라 적절한 배지에서 보관되고 선택적으로 동결시킨 CHO 세포를 내포할 수 있다. 키트는 또한 핵산분해효소 (예컨대, 가령, 본 출원에 기재된 CRISPER/Cas, 아연 핑거 핵산분해효소, TALEN, ARCUSTM 핵산분해효소)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 세포에서 핵산분해효소를 발현시키기 위한 시약들을 내포하는 벡터를 제공할 수 있다. 키트는 관심 대상인 특정 표적 DNA 서열의 절단을 지시하기 위해 핵산분해효소의 DNA 서열을 변화시킬 수 있도록, 핵산분해효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시키기 위한 툴을 추가적으로 제공할 수 있다. 이러한 툴들의 예들에는 관심 핵산분해효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 증폭 및 부위-지시된 돌연변이유발을 위한 프라이머가 포함된다. 키트는 또한 벡터로부터 핵산분해효소-인코딩 폴리뉴클레오타이드를 선택적으로 절제하고 후속적으로 사용자가 유전자를 변형하였을 때 변형된 폴리뉴클레오타이드를 상기 벡터에 다시 재도입시키기 위해 사용될 수 있는 제한 효소들을 포함할 수도 있다. 이러한 키트는 또한 변형된 핵산분해효소-인코딩 폴리뉴클레오타이드와 표적 벡터 사이에 공유 포스포다이에스터 링키지의 형성을 촉매화하기 위해 사용될 수 있는 DNA 연결효소를 포함할 수도 있다. 본 발명의 키트는 또한 길항 항-TNFR2 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 뿐만 아니라 세포의 유전체에서 특정 DNA 서열을 선택적으로 절단하여 이 부위의 유전체에 길항 TNFR2 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 통합시키기 위해 사용할 수 있는 방법들을 설명하는 패키지 삽입물을 제공할 수도 있다. 선택적으로, 키트는, 길항 TNFR2 항체 또는 이의 단편과 추가적인 폴리펩타이드, 가령, 예컨대, 본 출원에 기재된 폴리펩타이드를 내포하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 출원에서 청구되는 조성물 및 방법들을 실시, 제조, 및 평가하는 방법에 관한 설명을 해당 분야의 통상의 기술자에게 제공하기 위하여 제시되며, 단순히 본 발명의 예시인 것으로 간주되고 발명자가 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1. TNFRAB1 및 TNFRAB2와 상호작용하는 TNFR2 내의 개개 에피토프 맵핑
TNFR2로부터 유래한 선형, 고리형 및 이고리형 펩타이드들의 라이브러리들을 TNFR2 항체 TNFRAB2에 대하여 고 친화성을 나타내는 단백질에 속하는 별개의 서열들에 대해 선별한다. TFNR2 내 입체형태 에피토프를 선별하기 위하여, 일차 단백질 서열의 별개 영역들로부터 얻은 펩타이드들을 서로 접합시켜 키메라 펩타이드들을 형성하였다. 이들 펩타이드는 그 일차 서열들 내 전략적 위치들에서 시스테인 잔기들을 내포하였다 (예컨대, 도 3, 서열 번호: 34-117 및 134-252 참고). 이는 개개의 펩타이드들을 넓은 범위의 3차원 입체형태들 중 하나로 제한하기 위해 사용되었던 분자내 교차-결합 전략을 용이하게 하였다. 시스테인 잔기들의 비보호된 싸이올들은, 각각 입체형태적으로 제한된 고리형 및 이고리형 펩타이드들 형성하도록, 이가 및 삼가 친전자체, 가령, 2,6-비스(브로모메틸)피리딘 및 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠과의 친핵성 치환 반응에 의해 교차결합되었다. 이러한 방식에서, TNFR2 일차 서열의 이질적 영역들로부터 얻은 아미노산들의 독특한 조합을 내포하는 펩타이드들은 고유 TNFR2 3차 구조에서 제시되는 것들과 유사할 수 있는 에피토프들을 구조적으로 사전-조직하도록 하였다. 이들 펩타이드들을 내포하는 라이브러리들은 펩타이드들을 별개의 고체 표면 영역들에 고정화시키고 그 후 이 표면을 과산화수소의 존재하에서 TNFRAB1 또는 TNFRAB2, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 이차 항체, 및 HRP 기질 (2,2'-아자이노-다이-3-에틸벤즈싸이아졸린 설포네이트)로 처리함으로써 선별되었다. 과량의 또는 비-특이적으로 결합된 물질들을 제거하기 위하여 연속적인 시약 처리 사이에 고체 표면을 세척하였다. 이어서 각 표면의 각 영역의 발광을 전하 결합 장치 (CCD) - 카메라 및 이미지 처리 시스템을 사용하여 분석하였다.
"표면 상에 제한된 펩타이드 라이브러리" (CLIPS) 플랫폼은 조합 매트릭스 설계를 사용하여 표적 단백질, 예컨대, TNFR2를, 최대 10,000개의 중첩된 펩타이드 구조체들의 라이브러리로 전환시키는 것으로 시작한다 (Timmerman 외, J. Mol. Recognit., 20: 283-29, 2007). 고체 담체 상에서, 선형 펩타이드의 매트릭스가 합성되고, 이는 후속하여 공간적으로 정의된 CLIPS 구조체들로 형상화된다. 정확한 입체형태로 다수의 불연속 에피토프 부분들을 제시하는 구조체들은 높은 친화성으로 항체에 결합하고, 이러한 항체가 탐지되고 정량화된다. 불완전한 에피토프를 제시하는 구조체들은 낮은 친화성으로 항체에 결합하는 반면, 에피토프를 내포하지 않는 구조체들은 전혀 결합하지 않는다. 친화성 정보는 에피토프의 서열 및 입체형태를 상세히 정의하기 위한 반복 선별에서 사용된다. 이들 ELISA 실험들로부터 얻은, TNFRAB1 및 TNFRAB2 각각에 대한 원 발광 데이터를 도 3A 및 3B에 기록한다. 이러한 결과들은 길항 TNFR2 항체에 결합하는 TNFR2의 표면에 존재하는 에피토프의 분석 결과를 알려주었다. 이러한 항체에 결합하는 에피토프를 도시하는 TNFR2의 구조적 모델을 도 4 및 15A-15C에 나타낸다.
펩타이드 합성
표적 분자의 에피토프를 재구성하기 위하여 펩타이드들의 라이브러리를 합성하였다. 다이사이클로헥실카르보다이이미드 (DCC)와 N-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하는 t-뷰틸옥시카르보닐-헥사메틸렌다이아민 (BocHMDA)과의 반응을 통해 전매 친수성 폴리머 제제를 이식한 후, 트라이플루오로아세틱 애시드 (TFA)를 사용하여 Boc-그룹을 절단시켜, 아미노 작용기화된 폴리프로필렌 지지체를 얻었다 . 주문 변형된 JANUS® 액체 핸들링 스테이션 (Perkin Elmer)에 의해 표준 Fmoc-펩타이드 합성을 사용하여 아미노-작용기화 고체 지지체 상에 펩타이드들을 합성하였다. CLIPS 기술은 상기 펩타이드들을 단일 루프, 이중-루프, 삼중 루프, 쉬트-형 폴드, 나선-형 폴드 및 이의 조합으로 구조화시킬 수 있다. CLIPS 주형들을 시스테인 잔기들에 결합시킨다. 펩타이드들의 다수의 시스테인들의 측쇄들을 1개 또는 2개의 CLIPS 주형들에 결합시킨다. 예를 들어, 0.5 mM의 CLIPS 주형 용액 (2,6- 비스(브로모메틸)피리딘)을 암모늄 바이카보네이트 (20 mM, pH 7.8)/아세토나이트릴 (1:3(v/v))에 용해시킨다. 이 용액을 표면-결합된 펩타이드 어레이에 추가한다. CLIPS 주형은 펩타이드-어레이들 (3 μl 웰의 455개 웰 플레이트)의 고체상 결합된 펩타이드들에 존재하는 2개 시스테인들의 측쇄들과 반응할 것이다. 이러한 펩타이드 어레이들을 용액으로 완전히 덮은 채 용액중에서 30 내지 60분 동안 부드럽게 진탕한다. 마지막으로, 펩타이드 어레이들을 과량의 H2O로 광범위하게 세척하고 PBS (pH 7.2) 중에 1 % SDS/0.1 % 베타-메르캅토에탄올을 내포하는 70℃의 디스럽트-완충액 (disrupt-buffer)에서 30분 동안 음파처리 한 후, 추가 45분 동안 H2O에서 음파처리한다.
표면 플라스몬 공명에 의한 길항 TNFR2 항체의 결합 친화성 분석
재조합 인간 TNFR2에 대한 길항 TNFR2 항체의 친화성을 BIACORETM 분석 서비스 (Precision Antibody사)를 사용하여 측정하였다. 요약하면, 항체를 PBS 중의 비오티닐-LC-LC-NOSE (Thermo-Fisher사)를 사용하여 5:1 화학양론 비율로 비오티닐화시켰다. 과량의 비오티닐화 시약을 원심분리 크로마토그래피로 제거하고 비오티닐화 항체를 3000 RU의 스트렙타비딘 표면에 100 RU 수준으로 포획하였다. 상기 항체 포획 수준을 가지는 TNFR2에 의한 이론적 최대 신호는 26 RU였으며 이 신호는 러닝 완충액에서의 500 nM TNFR2를 사용하는 예비 실험으로 도달되었다. 60 μL/분의 유동에서 2분 주입으로 항원 결합에 관한 동역학 분석을 실시하였다. 100 RU의 최종 포획이 될 때까지 1 mg/ml 농도의 항체들을 주사하였다. 사용된 기구는 BioCap 칩을 보유한 BIACORETM 3000이었다 (GE Healthcare 사). 이중 기준법을 분석에 사용하였다. 기준 채널은 동일한 수준의 스트렙타비딘을 내포하였다. 이러한 분석법을 사용하여 측정한, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 TNFR2에 대한 결합에 관한 열역학적 및 동적 매개변수를 도 13A에 나타낸다.
ELISA 선별
합성된 펩타이드들 각각에 대한 항체의 결합을 ELISA 형식으로 테스트하였다. 표면-고정화된 펩타이드 어레이들을 일차 항체 용액과 함께 배양하였다 (4℃에서 하룻밤). 세척 후, 펩타이드 어레이들을 적절한 항체 퍼옥시다제 접합체 (SBA)의 1/1000 희석액과 함께 한 시간 동안 25℃에서 배양하였다. 세척 후, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아자이노-다이-3-에틸벤즈싸이아졸린 설포네이트 (ABTS) 및 2 μl/ml의 3 퍼센트 H2O2를 추가하였다. 한 시간 후, 색 전개를 측정하였다. 색 전개를 전하 결합 장치 (CCD) - 카메라 및 이미지 처리 시스템으로 정량화하였다. CCD 카메라로부터 얻은 값들은 표준 96-웰 플레이트 ELISA-판독장치와 유사하게 0 내지 3000 mAU 범위이다. 상기 결과를 정량화하고 Peplab 데이터베이스에 저장하였다. 웰이 거짓-양성 값을 생성하는 기포를 포함하는 경우, 카드들을 수동으로 검사하여 기포에 의해 유발되는 값들을 0으로 계산한다.
합성된 펩타이드들의 질을 확인하기 위하여, 별도 세트의 양성 및 음성 대조 펩타이드들을 동시에 합성하였다. 이들을 TNFR2에 특이적으로 결합하지 않는 음성 대조인, 항체 57.9를 사용하여 선별하였다 (Posthumus 외 (J. Virology. 64:3304-3309, 1990)).
높은 친화성으로 TNFRAB1 및 TNFRAB2에 결합된 펩타이드들은 도 3A 및 3B에서 각각 강조되어 있다. 그러므로 이들 펩타이드들은 TNFRAB1 및 TNFRAB2에 의해 우선적으로 결합되는 에피토프들로 구조적으로 구성된, TNFR2 내 잔기들을 내포한다.
에피토프 맵핑
ELISA 또한 TNFR2의 세포외 표면 상에 존재하는 선형 에피토프를 결정하기 위해 사용되었다. TNFR2 일차 서열 내 다양한 영역들에 상응하는 선형 펩타이드들을 GenScript사 (Piscataway, NJ)로부터 구입하고, 코팅 완충액에 희석시키고 Immulon 4HBX 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 (Thermo Scientific사) 위에 1 μg/웰의 농도로 넣었다. 일차 TNFR2 길항 항체 (0.1 μg/웰)를 기질들과 함께 배양하였다. 일차 항체를 탐지하기 위하여 설치류 IgG에 대한 이차 상체를 사용하였다. SPECTRAMAX® 190 흡광도 플레이트 판독장치를 사용하여 흡광도를 측정하고 SoftMax Pro 6.3 (Molecular Devices사)로 분석하였다. 이들 ELISA-기반 분석법의 결과들을 도 13B 및 13C에 나타낸다.
실시예 2. 길항 TNFR2 항체는 T-조절 세포증식을 저해한다
재료 및 방법
· 인간 T-조절 FlowTM 키트 (BioLegend사, 카탈로그 번호 320401)
o 칵테일 항-인간 CD4 PE-Cy5/CD25 PE (BioLegend사, 부품 번호 78930)
o Alexa Fluor® 488 항-인간 FOXP3, 클론 259D (BioLegend사, 부품 번호 79467)
o Alexa Fluor® 488 생쥐 IgG1, k 아이소형 대조군 (ICFC), 클론 MOPC-21 (BioLegend사, 부품 번호 79486)
o FOXP3 Fix/Perm 완충액 (4X) (BioLegend사, 카탈로그 번호 421401)
o FOXP3 Perm 완충액 (10X) (BioLegend사, 카탈로그 번호 421402)
· PE 항-인간 CD25, 클론: BC96 (BioLegend사, 카탈로그 번호 302606)
· Alexa Fluor® 488 항-인간 FOXP3, 클론 259D (BioLegend사, 카탈로그 번호 320212)
· PBS pH 7.4 (1X) (Gibco사 카탈로그 번호 10010-023)
· HBSS (1X) (Gibco사 카탈로그 번호 14175-095)
· FBS (열 불활성화됨)
· 15 ml 시험관
· 스윙 버켓 로터를 구비한 15 ml 시험관용 실험대용 원심분리기 (설정 속도 1100 rpm 또는 200 g)
길항 TNFR2 항체 (TNFRAB1 및 TNFRAB2)를 T-조절 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 테스트하였다. 배양된 T-조절 세포들을 자극 성장 인자들 (예컨대, TNFα)의 존재 및 부재하에서 설정 시기 동안 다양한 농도의 길항 TNFR2 항체로 처리하였다. T-조절 세포들은 또한 TNFα 존재 및 부재하에서 0.0008-25 μg/ml 범위의 다양한 농도의 TNFRAB1 존재하에서 배양되었다. 높은 분율의 T-조절 세포 수 증가를 유도하는 TNFα 수준을 선택하기 위하여, 대조로서, T-조절 세포들을 0-40 ng/ml 범위 농도의 TNFα 만으로 배양하였다. 추가적으로, T-조절 세포들을 IL-2 단독의 존재하에서 그리고 TNFRAB2 단독의 존재하에서 배양하였다.
상기 조건 하에서 T-조절 세포를 배양 후, 세포 수를 유세포분석을 사용하여 결정하였다. 0.2-1 x 106개 세포/100 μl 밀도의 T-조절 세포들을 15-ml 원뿔관에 분배하고 세포들을 펠릿화시키기 위하여 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 100 μl의 세척 완충액 (1x 2% FBS를 내포하는 HBSS)에 재현탁시켰다. 5 μl의 PE 항-인간 CD25 형광단-항체 접합체들을 이 혼합물에 추가하고, 세포들을 후속적으로 볼텍싱하고 25분 동안 암실에서 배양하였다. 이후 세포들을 1 ml의 세척 완충액을 추가하여 세척한 후 5분 동안 원심분리하였다. 이어서 상청액을 버리고 1 ml의 FoxP3 고정/투과 완충액 (PBS에서의 4x FOXP3 Fix/Perm 완충액의 1:4 희석액)을 세포에 추가하였다. 이후 세포들을 볼텍싱하고 20분 동안 암실에서 배양하였다. 세포들을 후속적으로 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버렸다. 이후 세포들을 1 ml의 새로운 세척 완충액에 재현탁시키고, 볼텍싱하고, 5분 동안 원심분리하였다. 세포들을 후속적으로 1 ml의 1x FOXP3 Perm 완충액 (PBS에서의 10x FOXP3 Perm 완충액의 1:10 희석액)에 재현탁시키고, 볼텍싱하고, 15분 동안 암실에서 배양하였다. 배양 후, 세포들을 5분 동안 원심분리하고, 후속하여 상청액을 버렸다. 다음으로 세포 펠릿들을 100 μl의 1x FOXP3 Perm 완충액에 재현탁시켰다. 이 시점에서, 5 μl의 Alexa Fluor® 488 항-인간 FOXP3 또는 Alexa Fluor® 488 생쥐 IgG1, k 아이소형 대조 중 하나를 세포에 추가하였다. 그 후 세포들을 볼텍싱하고 35분 동안 암실에서 배양하였다. 배양 후, 1 ml의 새로운 세척 완충액을 세포에 추가함으로써 세포들을 세척하고, 세포를 볼텍싱하고, 5분 동안 원심분리하였다. 그 후 상청액을 버리고 세포 펠릿을 FBS가 없는 1x HBSS 0.2-0.5 ml에 재현탁시켰다. 이어서 세포수를 유세포분석으로 결정하였다.
도 5에서 보는 바와 같이, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1의 배양은 세포들이 20 ng/ml TNFα와 함께 공-배양되었을 경우에도 용량 의존 방식으로 T-조절 세포증식을 억제하였다. 놀랍게도, 이러한 농도의 TNFα는 TNFα 단독으로 처리된 T-조절 샘플들에서 분석되었던 TNFα 용량들 중에서 최대 분율의 T-조절 세포수 증가를 유도할 수 있었다. TNFRAB1이 활성화 수준의 TNFα의 존재하에서도 T-조절 세포증식을 감소시킬 수 있다는 것은 길항 TNFR2 항체가 수용체 결합에 있어서 TNFα와 경쟁할 수 있을 뿐만 아니라, T-조절 세포 성장 및 증식을 초래하는 하류 신호전달 연쇄반응들을 저해하는 능력을 보여줌을 나타낸다. 예를 들어, T-조절 세포들이 20 ng/ml의 TNFα 단독과 함께 배양되었을 때, 생성되는 T-조절 집단은 비처리된 대조군 세포의 130%까지 증가하였다. 그러나, 20 ng/ml의 TNFRAB1과 T-조절 세포의 공동-배양시, 세포 증식의 꾸준한 용량-의존성 억제가 0.004-1.25 μg/ml 범위 농도의 TNFRAB1에서 관찰된다.
실시예 3. 파지 디스플레이에 의한 길항 TNFR2 항체 생성
본 발명의 길항 TNFR2 항체의 시험관내 단백질 발달을 위한 예시적인 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있는 기술인 파지 디스플레이이다. 파지 디스플레이 라이브러리는 항체의 CDRs 또는 항체-유사 스캐폴드의 유사 영역들 (예컨대, 10Fn3 도메인들의 BC, CD, 및 DE 루프들)에 관한 코딩 서열 내에서의 변이들 또는 설계된 일련의 돌연변이를 만들어 생성될 수 있다. 이들 돌연변이가 도입되는 주형 항체-인코딩 서열들은, 예컨대, 본 출원에 기재된 미감작 인간 생식세포 서열일 수 있다. 이들 돌연변이는 해당 분야에 공지된 또는 본 출원에 기재된 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 그리하여 각각의 돌연변이 서열은 주형 서열에서 하나 이상의 아미노산 변이를 가지는 것을 제외하고 전체 구조가 주형에 상응하는 항체를 인코딩한다. 레트로바이러스 및 파지 디스플레이 벡터들은 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 표준 벡터 제작 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 양립가능한 단백질 발현 벡터들과 함께 P3 파지 디스플레이 벡터들은, 해당 분야에 널리 공지된 바와 같이, 본 출원에 기재된 바와 같은 항체 다양화를 위한 파지 디스플레이 벡터들을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
돌연변이된 DNA는 서열 다양성을 제공하며, 각각의 형질전환체 파지는 이러한 DNA에 의해 인코딩되는 초기 주형 아미노산 서열 중 하나의 변이체를 보여주며, 이는 상이하지만 구조적으로 관련된 수많은 아미노산 서열들을 보여주는 파지 집단 (라이브러리)을 초래한다. 항체 초가변 영역들의 잘-정의된 구조로 인해, 파지 디스플레이 선별에 도입된 아미노산 변이들은 결합 펩타이드 또는 도메인의 구조를 유의하게 변화시키지 않으면서 그 결합 성질을 변화시킬 것으로 예상된다.
통상적인 선별에서, 파지 라이브러리를 TNFR2-유래 펩타이드 (예컨대, 서열 번호: 285 또는 286의 서열을 가지는 펩타이드), 또는 이의 특정 하위성분과 접촉시켜 이에 결합하게 한다. 결합제 및 비-결합제의 분리를 용이하게 하기 위하여, 표적을 고체 지지체 상에 고정시키는 것이 편리하다. TNFR2-결합 모이어티를 보유하는 파지는 고체 지지체 상의 표적과 복합체를 형성할 수 있는 반면, 비-결합 파지는 용액 중에 남아있어서 과량의 완충액으로 세척될 수 있다. 그 후 결합된 파지는 완충액을 극단 pH (pH 2 또는 pH 10)로 변화시킴으로써, 완충액의 이온 강도를 변화시킴으로써, 변성제를 추가함으로써, 또는 다른 공지된 수단에 의해 표적으로부터 유리될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 나타내는 결합 파지를 분리하기 위하여, 단백질 용리를 실시한다.
그 후 회수된 파지는 세균 세포 감염을 통해 증폭될 수 있으며, 이제 비-결합 항체가 제거되고 표적 펩타이드에 결합한 항체가 풍부해진 새로운 풀(pool)을 사용하여 선별 과정을 반복할 수 있다. 몇 개의 결합 파지의 회수만으로도 후속적인 선별 반복을 위하여 파지를 증폭시키기에 충분하다. 수 회 주기의 선별 후, 결합 풀에서 선택된 파지 클론들로부터 유래한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자 서열들이 종래의 방법들에 의해 결정되고, 그리하여 표적에 파지의 결합 친화성을 제공하는 펩타이드 서열이 밝혀진다. 패닝 과정 동안, 상기 집단의 서열 다양성은 원하는 펩타이드-결합 항체가 남을 때까지 각 선별 주기를 거치면서 감소된다. 상기 서열들은 소수의 관련 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 전형적으로 각 라이브러리의 약 109 내지 1010 개의 최초 후보들 중에서 10-50개로 수렴할 수 있다. 각 주기의 선별시 회수되는 파지 수의 증가는 라이브러리의 수렴이 선별에서 발생하였다는 좋은 표시이다. 일련의 결합 폴리펩타이드가 식별된 후, 서열 정보는 원하는 추가적인 성질들을 가지는 구성원들에 대해 편향된, 다른 이차 파지 라이브러리를 설계하기 위해 사용될 수 있다 (WO 2014/152660 참고; 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함됨).
실시예 4. 길항 항-TNFR2 항체의 투여에 의한 인간 환자에서의 암 치료
본 발명의 길항 TNFR2 항체는 세포 증식 장애, 가령, 암을 치료하기 위해 인간 환자에 투여될 수 있다. 이들 항체의 투여는 T-조절 세포의 성장 및 증식을 억제한다. 본 발명의 항체는 또한 T-조절-매개된 면역 반응을 억제하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 암, 예컨대, 본 출원에 기재된 암을 앓고 있는 인간 환자는, 본 발명의 길항 TNFR2 항체를 적절한 경로로 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년에 걸쳐 (예컨대, 비강내) 특정 용량으로 (예컨대, 0.001 내지 100 mg/kg/일) 투여함으로써 치료될 수 있다. 필요에 따라, 항-TNFR2 항체는 면역 인식을 피하고 및/또는 항체의 약물동역학적 프로파일을 개선하도록, 예컨대, 과당화에 의해 또는 PEG와의 접합에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 길항 TNFR2 항체로 치료되는 암의 진행은 여러 확립된 방법들 중 어느 하나 이상에 의해 모니터될 수 있다. 의사는 환자가 나타내는 증상들이 치료에 반응하여 어떻게 변화하였는지를 평가하기 위해 직접 관찰에 의해 환자를 모니터 할 수 있다. 환자는 또한 종양이 전이되었는지 여부 또는 종양 크기가 변화하였는지, 예컨대, 본 발명의 항-TNFR2 항체 치료에 반응하여 감소되었는지 여부를 결정하기 위하여 MRI, CT 스캔, 또는 PET 분석 될 수 있다. 선택적으로, 세포는 환자로부터 추출될 수 있으며 다양한 성장 인자 수용체, 가령, 표피 성장 인자 수용체의 상대적 세포-표면 농도를 결정하기 위하여 정량적 생화학적 분석을 수행할 수 있다. 이들 분석 결과에 기초하여, 의사는 후속 치료 주기에서 보다 높은/보다 낮은 용량 또는 보다 많은/보다 적은 빈도의 길항 TNFR2 항체 투약을 처방할 수 있다.
실시예 5. scFv TNFR2 길항제 제조
본 발명의 항체 단편들은 scFv 단편들을 포함하며, 이들은 단일 펩타이드 사슬로 조합된 경쇄 및 중쇄들의 항체 가변 영역들로 구성된다. 표현형-중성 TNFR2 항체는 TNFR2 항체의 중쇄의 가변 영역에 작동적으로 연결된 이 항체의 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 재조합 발현시킴으로써 scFv 항체 단편을 개발하기 위한 프레임워크로 사용될 수 있다. 중쇄의 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3로부터 유래한, CDR-H3 서열을 내포할 수 있다. 이러한 가변 영역들을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 확립된 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다. 이후 이러한 폴리뉴클레오타이드가 세포 (예컨대, CHO 세포)에서 발현될 수 있고 scFv 단편은 후속하여 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다.
대안적으로, TNFR2 길항제에서 유래한 scFv 단편들은 화학적 합성 방법들에 의해 (예컨대, 본 출원에 기재된 Fmoc-기반 고체상 펩타이드 합성법에 의해) 제조될 수 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 항체의 중쇄의 가변 영역에 작동적으로 연결된 표현형-중성 TNFR2 항체의 경쇄의 가변 영역으로 구성된 펩타이드 사슬을 화학적으로 합성할 수 있으며, 그 결과 중쇄의 가변 영역은 길항 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열을 내포하게 된다. 고유의 화학적 결찰은 긴 펩타이드 (예컨대, 50개가 넘는 아미노산들)의 합성을 위한 전략으로 사용될 수 있다. 고유의 화학적 결찰 프로토콜은 해당 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 본 출원에 참고문헌으로 포함된 Dawson 외 (Science, 266:776-779, 1994)에 기재되어 있다.
실시예 6. 인간화 TNFR2 항체의 제조
본 발명의 인간화 TNFR2 항체를 제조하는 한 가지 방법은 TNFR2 항체의 CDRs을 인간 항체 공통 서열에 들여오는 것이다. 공통 인간 항체 중쇄 및 경쇄 서열들은 해당 분야에 공지이다 (예컨대, "VBASE" 인간 생식세포 서열 데이터베이스; Kabat 외 (서Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건복지부, NIH Publication No. 91 -3242, 1991); Tomlinson 외 (J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992); 및 Cox 외 (Eur. J. Immunol. 24:827- 836, 1994) 참고; 이 문헌들은 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 확립된 절차를 사용하여, 공통 항체 서열의 CDRs 및 가변 도메인 프레임워크 잔기들을 식별할 수 있다 (예컨대, 서열 정렬에 의해 (상기 Kabat의 문헌 참고)). 인간화, 길항 TNFR2를 제조하기 위하여, 예컨대, 항체의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 표현형-중성 항-TNFR2 항체의 상응하는 서열들로 치환할 수 있고, 뿐만 아니라 공통 인간 항체의 CDR-H3를 길항 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3로 치환할 수 있다. 상기 CDR 서열들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은, 예컨대, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 유전자 편집 기술을 사용하여, 합성하여 또는 재조합하여 제조될 수 있다. 공통 인간 항체의 가변 도메인의 한 예에는 미국 특허 제 6,054,297에서 확인한, 중쇄 가변 도메인 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVAVISENGSDTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGGAVSYFDVWGQGTLVTVSS (서열 번호: 32) 및 경쇄 가변 도메인 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSLPYTFGQGTKVEIKRT (서열 번호: 33)이 포함되며; 상기 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다 (CDRs은 볼드체로 나타냄).
인간화, 길항 TNFR2 항체를 제조하기 위하여, CDR-H1, CDR-H2, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열들이 표현형-중성, TNFR2-특이적 항체의 상응하는 CDR 서열들로 대체되어 있는 상기 공통 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 재조합 발현시킬 수 있다. 공통 인간 항체의 CDR-H3 서열은 길항 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 (즉, 각각 서열 번호: 25, 259, 또는 284)로 치환될 수 있다.
서로에 작동적으로 연ㄱ열된 상기 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터 (예컨대, 본 출원에 기재된 또는 해당 분야에 공지된 원핵 또는 진핵 세포에서 단백질 발현을 위해 최적화된 발현 벡터)로 통합될 수 있다. 그리하여 단쇄 항체 단편 (scFv)은 숙주 세포에서 발현된 후 후속하여 본 출원에 기재된 확립된 기술, 가령, 크기-배제 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 숙주 세포 배지로부터 정제될 수 있다.
실시예 7. 길항 항-TNFR2 항체의 투여에 의한 인간 환자의 HIV 치료
본 발명의 길항 TNFR2 항체는 바이러스 감염, 가령, HIV를 치료하기 위해 인간 환자에 투여될 수 있다. 이들 항체의 투여는, 감염된 세포에 공격을 가할 수 있는 세포독성 T-림프구의 성장 및 증식을 가능하게 함으로써 환자의 면역 반응을 향상시키는 T-조절 세포의 성장 및 증식을 억제한다. 예를 들어, HIV를 앓고 있는 인간 환자는 본 발명의 길항 TNFR2 항체 (예컨대, TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 TNFR2의 KCSPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 56-60)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열 또는 이의 변이체를 내포하는 TNFR2 항체))를 적절한 경로에 의해 (예컨대, 비강내) 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년에 걸쳐 특정 용량 (예컨대, 0.001 내지 100 mg/kg/일)으로 투여함으로써 치료될 수 있다. 필요에 따라, 항-TNFR2 항체는 면역 인식을 피하고 및/또는 항체의 약물동역학적 프로파일을 개선하도록, 예컨대, 과당화에 의해 또는 PEG와의 접합에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 길항 TNFR2 항체로 치료되는 HIV의 진행은 여러 확립된 방법들 중 어느 하나 이상에 의해 모니터될 수 있다. 의사는 환자가 나타내는 증상들이 치료에 반응하여 어떻게 변화하였는지를 평가하기 위해 직접 관찰에 의해 환자를 모니터 할 수 있다. 하나 이상의 백혈구 세포의 세포수를 분석하여 본 발명의 항-TNFR2 항체 치료에 반응하여 감염된 세포의 양이 변화하였는지 (예컨대, 감소하였는지) 여부를 결정하기 위하여 혈액 샘플을 또한 환자로부터 채취할 수 있다. 이들 분석 결과에 기초하여, 의사는 후속 치료 주기에서 보다 높은/보다 낮은 용량 또는 보다 많은/보다 적은 빈도의 길항 TNFR2 항체 투약을 처방할 수 있다.
실시예 8. 길항 항-TNFR2 항체의 투여에 의한 비-인간 포유동물의 결핵 치료
본 발명의 길항 TNFR2 항체는 세균 감염, 가령, 결핵을 치료하기 위하여 비-인간 포유동물 (예컨대, 소과 포유동물, 돼지, 들소, 말, 양, 염소, 암소, 고양이, 개, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 또는 다른 비-인간 포유동물)에 투여될 수 있다. 이들 항체의 투여는, 병원체에 공격을 가할 수 있는 세포독성 T-림프구의 성장 및 증식을 가능하게 함으로써 환자의 면역 반응을 향상시키는 T-조절 세포의 성장 및 증식을 억제한다. 예를 들어, 결핵을 앓고 있는 비-인간 포유동물은 본 발명의 길항 TNFR2 항체 (예컨대, TNFR2의 KCRPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 142-146)의 하나 이상의 잔기들을 내포하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 TNFR2의 KCSPG 서열 (서열 번호: 7의 잔기들 56-60)을 내포하는 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내지 않는 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1, TNFRAB2, 또는 TNFR2A3의 CDR-H3 서열 또는 이의 변이체를 내포하는 TNFR2 항체))를 적절한 경로에 의해 (예컨대, 비강내) 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년에 걸쳐 특정 용량 (예컨대, 0.001 내지 100 mg/kg/일)으로 투여함으로써 치료될 수 있다. 필요에 따라, 항-TNFR2 항체는 면역 인식을 피하고 및/또는 항체의 약물동역학적 프로파일을 개선하도록, 예컨대, 과당화에 의해 또는 PEG와의 접합에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 길항 TNFR2 항체로 치료되는 결핵균 감염의 진행은 여러 확립된 방법들 중 어느 하나 이상에 의해 모니터될 수 있다. 의사는 환자가 나타내는 증상들이 치료에 반응하여 어떻게 변화하였는지를 평가하기 위해 직접 관찰에 의해 환자를 모니터 할 수 있다. 하나 이상의 백혈구 세포의 세포수를 분석하여 본 발명의 항-TNFR2 항체 치료에 반응하여 면역 반응이 변화하였는지 (예컨대, 증가하였는지) 여부를 결정하기 위하여 혈액 샘플을 또한 환자로부터 채취할 수 있다. 이들 분석 결과에 기초하여, 의사는 후속 치료 주기에서 보다 높은/보다 낮은 용량 또는 보다 많은/보다 적은 빈도의 길항 TNFR2 항체 투약을 처방할 수 있다.
실시예 9. 길항 TNFR2 항체는 IL-2 및 TNF의 존재하에서 T-조절 세포증식을 저해한다
상승된 양의 T-조절 세포의 존재는 암 및 감염 질환을 방지하는 면역계의 능력을 방해할 수 있다. TNFR2는 T-조절 증식에서 중요한 체크포인트를 나타내므로 면역조절을 위한 이상적인 표적을 구성한다. 2개의 길항 TNFR2 단클론 항체 (mAbs), TNFRAB1 및 TNFRAB2의 기능적 활성을 특성화하기 위하여, 동질의 T-조절 확대를 위해 개발된 세포-기반 분석법이 이용되었다. 증가하는 농도의 TNFα와 함께 배양된 정상 인간 CD4+ 세포는 T-조절 세포의 용량-의존성 증가를 가져왔음이 처음으로 확인되었다 (도 6A 및 7A). 우리는 또한 IL-2의 존재가 T-조절 증식에 필요함을 확인하였다 (도 6B). 도 6B-6G에서 보는 바와 같이, IL-2 단독 처리에 비해, T-조절 증식에 대한 20 ng/ml TNF의 효과는 현저하며 (>20% 확대) TNFR2 작용제와의 공-배양에 의해 추가로 향상된다 (>60% 확대).
길항 TNFR2 항체는 이러한 분석을 사용하여 측정된 바와 같이 T-조절 증식에 반대의 효과를 유도한다. 두 TNFR2 길항 항체 모두는 정상 혈액 공여자들의 잔여 T-조절 세포의 백분율에 있어서 4-15% 감소를 가져오는 T-조절 증식에 대한 억제 효과를 유도하였다. 두드러지게, TNFR2 길항 효과는 우성이며 심지어 넉넉한 양의 TNFα (20mg/ml)의 존재시 보다 우수할 수 있다 (도 6C-6G). T-조절에 대한 TNFR2 길항 효과는 용량 의존성이었다 (도 6D-6G). 2가지 TNFR2 길항 항체를 TNFα의 존재하에서 연구하였을 때의 관찰 결과가 더욱 현저하였으며, 두 TNFR2 길항제 항체 모두는 용량 의존 방식으로 TNFα 작용성 (agonism) 보다 우수할 수 있었다. 두 길항 항체 모두 T-조절 확대를 약화시키고 TNFα 작용 곡선을 반전시킬 수 있었다 (도 6A 및 6C-6G). 고정된 양의 TNFR2 길항 항체와 함께 T-조절 세포를 배양하고 TNFα의 용량을 상승시켜 이러한 분석을 또한 실시하였다 (도 6D-6G). 역시 두 TNFR2 길항제 모두는 용량-의존 방식으로 TNFα 작용성을 역전시킬 수 있었다. 이러한 48시간 T-조절 확대 분석은 비-특이적 인간 CD4+ T 세포 사멸을 방지하기 위하여 배양물에서 IL-2, 작용제와 함께 실시됨을 유념하여야 한다. 이들 실험들로부터 얻은 데이터를 IL-2 단독의 존재시와 비교하여 길항 TNFR2 항체의 존재하에서 T-조절 증식의 상대적 변화를 결정하기 위해 처리할 때, 두 항체 모두의 길항 성질은 지속되었다 (도 7A-7E). 또한 이러한 결과들은 인간 CD4+ 세포에서 T-조절 증식을 억제하는 두 가지 TNFR2 길항제 항체의 기능성을 입증하는 것이며, 그 효과는 증등 용량에서 높은 용량의 TNFα에 의해 이루어지는 작용성 이상으로 두드러지게 우세하다.
상기 T-조절 억제 분석법을 수행하기 위하여, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs)를 반응자로 사용하였다. Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 밀도 구배를 사용하여 정맥천자일에 PBMCs를 분리하였으며 -80'C에서 동결보존시켰다. T-조절 세포와 혼합하기 하루 전에 세포들을 해동시키고 RPMI 1640 및 IL-2 (10 U/ml)에서 하룻밤 놓아두었다. 다음 날, 반응자 세포들을 1 μM 카르복시플루오레세인 다이아세테이트 숙신이미딜 에스터 (CFSE)로 염색하였다. 이후 반응자 세포 (5 x 104 개 세포)들을 확대된 T-조절 세포와 다양한 비율로 (0:1, 4:1, 2:1, 1:1) 혼합하고, 항-CD3 mAb (HIT3a, BD Biosciences) 및 IL-2 (50 U/ml)로 자극하였다. 세포들을 4일 후 수집하고 유세포분석으로 분석하였다.
인간 대상체
from over 100명 이상의 공여자들로부터 인간 혈액 샘플들을 메사추세츠 종합 병원 인간 연구 학회 (MGH-2001P001379)가 승인한 인간 연구 프로토콜에 따라 수집하였다. 모든 공여자들은 서면 동의서를 제공하였다. 혈액을 BD 진공 EDTA 채혈관 (BD Diagnostics사)에 채혈하고 정맥절개 2시간 이내에 처리하였다. 난소 암 환자들로부터 분리된 T-조절 샘플들은 방사선조사 전 그리고 화학요법 전 새로이 난소 암을 진단받은 여성들로부터 수득되었다. 이러한 인간 연구들은 메사추세츠 종합 병원 인간 연구 학회에 의해 승인되었다 (MGH-2015P002489; 하기 실시예 14 참고).
혈액 및 세포 배양
새로운 인간 혈액은 정맥천자 2시간 이내에 처리되었다. 혈액을 1x HBSS (Invitrogen사)와 2% FBS (Sigma-Aldrich사)로 2회 세척하고 CD4+ 세포들을 Dynabeads® CD4 양성 분리 키트 (Invitrogen사)를 사용하여 분리하였다. 분리된 CD4+ 세포들을 RPMI GlutaMAXTM (Life Technologies사)와 10% FBS (Sigma-Aldrich사) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies사)에 재현탁시켰다. 세포들을 96-둥근-바닥 웰 플레이트에 0.2 - 1 x 106 개 세포/웰의 농도로 접종하고, TNFR2 길항제 항체 또는 TNFR2 작용제 (각 실시예에 지시됨)로 처리한 다음, 37℃에서 5% CO2와 함께 최대 48 시간 동안 배양하였다. 분리되어 배양된 인간 T 세포는 세포 배양 배지에서 IL-2의 부재시에 사멸하기 때문에, 본 출원에 기재된 모든 세포-기반 실험들은 IL-2의 부재가 데이터에 영향을 미치지 않도록 하기 위해 배양 배지에 저 수준의 IL-2 (100U/ml)를 사용하였다. 멸균 난소 암 복수로부터 분리된 T-조절 세포들은 50-ml 원뿔관에서 세포들을 먼저 농축시킨 다음, 세포 펠릿들을 재현탁시켜 CD4+ 세포 분리물을 얻음으로써 수득되었다 (하기 실시예 14 참고).
시약 및 유세포분석
재조합 인간 TNF를 Sigma-Aldrich사로부터 구입하고 재조합 인간 IL-2를 Life Technologies로부터 구입하였다. TNFRAB1 및 TNFRAB2의 F(ab')2 단편들을 Pierce F(ab')2 준비 키트 (Life Technologies사)를 사용하여 준비하였다. 설치류 IgG에 대한 교차결합 항체 (ab9165 및 ab99670)들을 Abcam사 (Cambridge, MA)로부터 구입하였다. 제조업체 지시에 따라 인간 T-조절 FlowTM 키트 (BioLegend사)를 사용하여 유세포분석을 위한 세포들을 준비하였다. 유세포분석을 위해 사용되는 항체는 Alexa Fluor® 488 항-인간 FOXP3, FOXP3의 세포내 염색을 위한 클론 259D, 및 CD25의 세포 표면 염색을 위한 PE 항-인간 CD25 클론 BC96 (BioLegend사)을 포함하였다. 형광 염색된 세포들을 1x HBSS (Invitrogen사)에 재현탁시키고 BD FACS Calibur 유세포분석기 (Becton Dickinson사)를 사용하여 분석하였다. FACS 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (버전 10.0.8)를 사용하여 처리하였다.
통계적 분석
Excel (Microsoft사) 또는 GraphPad Prism-5 소프트웨어 (GraphPad Software사, La Jolla, CA)를 사용하여 대응표본 스튜던트 t 검정으로 데이터 분석을 실시하였다. 유의도는 0.05 미만의 양측 p-값으로 결정되었다.
실시예 10. 활성화된 T-조절 세포에 대한 TNFR2 길항제 항체에 의한 단기 배양 효과
TNFR2 분비를 조절하는 길항 TNFR2 항체의 능력을 조사하기 위하여, 세포 배양물 상청액의 가용성 인간 TNFR2를 Quantikine® ELISA (R&D Systems사)를 사용하여 측정하였다. CD4+ 세포를 IL-2 (200 U/ml) 단독과 함께 또는 TNF (20 ng/ml) 또는 길항 TNFR2 항체 (12.5 μg/ml)와 함께 24 - 42 시간 배양 후 상청액들을 수집하고 이들 중 어느 하나를 즉시 사용하거나 -20℃에서 동결시켰다. 제조업체의 지시에 따라 ELISA를 실시하였다. SpectraMax® 190 흡광도 플레이트 판독장치를 사용하여 흡광도를 측정하고 SoftMax Pro 6.3 (Molecular Devices사)로 분석하였다.
T-조절 세포는 두 가지 상태, 활성화 (aT-조절) 및 휴지기 (rT-조절)로 존재하며; 이러한 두 가지 상태들은 CD45RA 발현을 기준으로 구별될 수 있다. aT-조절 세포의 표현형은 CD25고CD45RA저인 반면, rT-조절 세포의 표현형은 CD25중CD45RA고 이다. aT-조절 세포가 보다 강력한 면역 기능 억제제이므로 면역요법의 이상적인 표적이다. aT-조절 세포의 저해 효능을 조사하기 위하여, CD4+ 세포가 TNFR2 길항제로 처리되었을 때 단순히 T-조절 세포의 비율이 아닌, T-조절 세포의 총 수가 감소되었음을 먼저 확인하였다 (도 8A-8H). 다음으로, 어느 분류의 T-조절이 TNFR2 길항제에 의해 저해되는지를 결정하기 위하여, 세포들을 CD45RA로 염색하였다. 두 분류의 T-조절 세포 모두가 저해되는 반면, aT-조절 세포들은 rT-조절 세포 보다 더 큰 정도로 억제되었음을 발견하였다. 이들 데이터는 TNFR2 길항제 항체가 aT-조절 세포의 증식을 선택적으로 저해함을 제시한다. 높은 TNFR2 발현은 억제성 T-조절 세포의 또 다른 특성이다. TNFR2 발현 수준을 측정하였으며 TNFR2 길항제 처리가 TNFR2고-발현 세포의 수를 감소시켰음을 발견하였다. 대조저긍로, TNFR2 발현의 평균 형광 강도 (MFI)는 모든 처리들 중에서 유사하게 유지되었다 (도 9A). 종합하면, 이들 데이터는, 길항 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1 및 TNFRAB2가 CD25고+, CD45RA저+ T-조절 세포의 증식을 선택적으로 약화시킬 수 있음을 제시한다.
면역 반응은 종종 높은 단백질 전환 세포로 인한 가용성 TNFR2의 증가로 특징된다. 그러므로 면역 활성에 대한 이들 분자들의 효과를 결정하기 위해 TNFR2-조절 제제들로 처리 후 배양 상청액에서 가용성 TNFR2의 수준을 측정하였다. TNF 및 TNFR2 작용제는 가용성 TNFR2의 양을 증가시켰던 반면, TNFR2 길항제는 가용성 TNFR2의 수준을 감소시켰음이 관찰되었다 (도 9B). 추가적으로, T-조절 억제제 분석으로 CD8+ 세포의 TNFR2 길항작용에 의한 강력한 억제가 확인되었다 (도 9A 및 9C). 이들 데이터는 인간 CD4+ 세포의 TNFR2 길항제 처리는 활성화되어 매우 억제성인 T-조절 세포의 수를 효과적으로 감소시키고 가용성 디코이 TNFR2 분비를 저해하는 추가적인 이점을 가졌음을 입증한다.
상기와 같이 T-조절 억제 분석법을 수행하기 위하여, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs)들을 반응자로 사용하였다. Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 밀도 구배를 사용하여 정맥천자일에 PBMCs를 분리하였으며 -80° C에서 동결보존시켰다. T-조절 세포와 혼합하기 전날에 PBMCs를 해동시키고 RPMI 1640 및 IL-2 (10 U/ml)에서 하룻밤 놓아두었다. 다음 날, 반응자 세포들을 1 μM 카르복시플루오레세인 다이아세테이트 숙신이미딜 에스터 (CFSE)로 염색하였다. 이후 반응자 세포 (5 x 104 개 세포)들을 확대된 T-조절 세포와 다양한 비율로 (0:1, 4:1, 2:1, 1:1) 혼합하고, 항-CD3 mAb (HIT3a, BD Biosciences) 및 IL-2 (50 U/ml)로 자극하였다. 세포들을 4일 후 수집하고 유세포분석으로 분석하였다.
상기와 같이 분비된 TNFR2의 농도를 측정하기 위하여, QUANTIKINE® ELISA 분석 키트를 사용하였다 (R&D Systems사). 요약하면, 요약하면, CD4+ 세포를 IL-2 (200 U/ml) 단독과 함께 또는 TNFα (20 ng/ml) 또는 TNFR2 길항제 항체 (12.5 μg/ml)와 함께 24 - 42 시간 배양 후 상청액들을 수집하고 이들 중 어느 하나를 즉시 사용하거나 -20℃에서 동결시켰다. 제조업체의 지시에 따라 ELISA 분석을 실시하였다. SPECTRAMAX® 190 흡광도 플레이트 판독장치를 사용하여 흡광도를 측정하고 SoftMax Pro 6.3 (Molecular Devices사)로 분석하였다.
실시예 11. TNFR2 길항제 활성은 비-특이적 Fc 영역 결합 또는 교차-결합과 무관하다
항체 Fc 영역들에 의한 비-특이적 결합은 임의의 기능적 활성을 생성할 수 있다. TNF와 함께 또는 TNF 없이, CD4+ 세포의 TNFR2 mAb F(ab')2 단편 처리는 T-조절 세포 양에 있어서 전 단클론 항체에서 관찰된 것과 유사한 용량 반응을 생성하였다 (도 10A-10D). 이는 TNFR2에 대하여, 길항 TNFR2 항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 비-특이적 결합보다는 F(ab')2 영역에 의한 특이적 결합이 억제 활성을 유발할 가능성이 있음을 확인시켜 준다. F(ab')2 단편들 및 전 항체의 순도를 SDS-PAGE 분석으로 평가하였다 (도 11A-11D).
교차결합은 또한 항체의 이상 기능 활성을 가져올 수도 있다. 비-특이적 교차결합이 관찰된 기능적 활성의 원인이었을 가능성을 밝혀내기 위하여, 용량 반응 분석을 실시하였으며, 여기서 TNFR2 길항제 항체는 항-IgG 항체와 함께 또는 없이 T-조절 세포와 함께 배양되었다. TNFR2 길항제 항체에 의한 T-조절 세포의 용량-의존적 억제는 항-IgG의 존재에 의해 영향을 받지 않았다 (도 10C 및 10D). 종합하면, 이들 데이터로부터 TNFR2 길항제 항체의 기능적 활성은 비-특이적 Fc 영역 활성 또는 교차결합과 무관함이 확인된다.
상기 기재된 SDS-PAGE 분석을 수행하기 위하여, 단백질 샘플들을 100V에서 1시간 동안 MOPS SDS 러닝 완충액 (Life Technologies사)의 NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔 상에서 PRECISION PLUSTM (BioRad사) 또는 PERFECT PROTEINTM (EMD Millipore사) 마커들과 함께 실험하였다. 겔들을 24시간 동안 SIMPLY BLUETM 안전 염색제 (Invitrogen사)로 염색하였다.
실시예 12. NFkB 활성화 및 유전자 발현은 길항 TNFR2 항체에 의해 저해된다
NFkB 신호전달은 TNF-매개된 세포 반응에 필요하며 암 요법을 위한 가능한 표적으로서 제시되어 왔다. TNFR2 길항제 항체로 처리 후 T-조절 세포증식의 감소를 관찰하였을 때, 그 기저를 이루는 신호전달 메커니즘이 NFkB 활성화의 감소를 포함할 것이라는 가설을 세웠다. TNFR2 길항작용에 대한 분자 반응을 조사하기 위하여, NFkB 활성화에 관한 8가지 프로모터의 발현을 실시간 PCR 분석으로 측정하였다. 이들 단백질은 다음을 포함하였다: CHUK, NFKBIE, KNKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, cIAP2/BIRCH. TNF 및 림포톡신, 뿐만 아니라 T-조절 세포의 두 가지 마커들인, FoxP3 및 CD25의 발현을 추가적으로 모니터하였다. 각 사례에서, TNFRAB2 처리는 TNF 처리와 비교하여 유전자 발현을 하향조절하였다 (도 12A 및 12B). 다음으로, 인산화된 RelA/NFkB p65를 마커로 사용하여, CD4+ 세포의 임의의 TNFR2 길항제 항체 처리는 NFkB 활성화를 감소시켰던 반면, TNF 처리는 NFkB 활성화를 증가시켰음을 입증하였다 (도 12C-12E). 이는 TNFR2 신호 전달에 대한 두 가지 TNFR2 길항제 항체의 효과가 매우 유사함을 제시한다. 추가적으로, 길항제 TNFR2 항체의 재조합 인간 TNFR2에 대한 결합의 동적 매개변수 분석 결과 결합 또는 해리 속도에 있어서 TNFRAB1과 TNFRAB2 사이에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다 (도 13A).
유전자 발현 분석을 수행하기 위하여, 분리된 CD4+ 세포들을 IL-2 (50 U/ml) 및 TNFα (20 ng/ml) 또는 TNFR2 길항제 항체 (2.5 μg/ml)의 존재하에서 3시간 동안 배양하였다. 세포들을 수집하고 RNAqueous-4PCR 키트 (Ambion사)를 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA를 고 용적 cDNA 역전사 키트 (Applied-Biosystems사)를 사용하여 역전사하였다. TaqMan® 유전자 발현 마스터 믹스를 보유한 TaqMan® 어레이 인간 NFkB 경로 96-웰 플레이트 및 ABI Prism 7000 서열 탐지 시스템 (Applied-Biosystems사)을 사용하여 실시간 PCR을 실시하였다.
세포-기반 인간 포스포-RelA/NFkB p65 면역분석기 (R&D Systems사)를 사용하여 NFkB 활성화를 측정하였다. 요약하면, 새로운 CD4+ 세포들을 96-웰 편평-바닥 플레이트 (0.2 x 106 세포/웰)에서 IL-2 (200 U/ml) 단독의 존재하에 또는 지시된 농도의 TNF 또는 TNFR2 길항제의 존재하에 10분 동안 37℃에서 배양하였다. 세포들을 원심분리 및 고정화에 의해 플레이트에 부착시킨 다음 제조업체의 지시에 따라 염색하였다. EnVision® 멀티라벨 플레이트 판독장치 (Perkin Elmer사)를 사용하여 형광을 판독하고 정규화된 상대 형광 단위 (RFU)를 계산하였다.
실시예 13. TNFR2에 대한 길항 TNFR2 항체의 결합은 중첩 영역들을 맵핑한다
TNFR2 길항제 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2의 특이적 결합 성질들을 추가로 조사하기 위하여, 에피토프 맵핑 분석을 실시하고 이들 항체에 결합하는 인간 TNFR2 내 에피토프들을 수용체 표면상의 개개 위치들과 상관시켰다. 두 가지 TNFR2 길항제의 선형 펩타이드 맵핑 결과 두 길항 항체들 모두 전장 표적 단백질에 대한 높은 친화성을 보여주는 반면, 이들 항체는 선형 펩타이드들에 대하여 상이한 친화성을 보이는 것으로 나타났다. 구체적으로, TNFRAB1은 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 112-139를 내포하는 에피토프에 대하여 중간 정도의 친화성을 보여주었으며, 서열 번호: 7의 아미노산 128-155를 내포하는 에피토프에 대하여 강력한 친화성을 보여주었다. TNFRAB2는 어떠한 선형 펩타이드 영역에도 결합하지 않았다 (도 13B). TNFR2에 대한 TNFRAB1의 친화성은 TNFa의 존재에 의해 방해받지 않았으며, 이는 TNFa가 TNFR2 결합에 있어서 이 항체와의 경쟁자가 아님을 나타낸다 (도 13C). 두 가지 길항제 항체들에 결합하는 입체형태 에피토프를 조사하기 위하여, 3차원 결합 분석을 수행하였다. TNFRAB1에 있어서, 3D 데이터는 선형 펩타이드 맵핑 분석 결과와 일치하였으며 이는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 142-149의 영역이 높은 친화성으로 TNFRAB1에 의해 결합되어 있음을 나타내었다. 추가적으로, 상기 3D 분석 결과는 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 161-169에서의 새로운 결합 영역을 보여주었다 (도 13A-13C 및 15A-15C). TNFRAB2에 있어서, 성공적인 선형 펩타이드 결합이 전혀 존재하지 않았으나, 4개의 결합 영역들이 3D 분석으로 맵핑되었다 (도 15A-15C). 흥미롭게도, 두 가지 TNFR2 길항제 항체들의 정확한 불연속 에피토프에 있어서 인간 TNFR2 내 서열 번호: 7의 아미노산 142-144에서 부분적인 중첩이 존재하였다.
이러한 후자의 데이터는 흥미로운 것이었는데, 왜냐하면 TNFa 유입을 막아 TNF 삼량체의 안정화를 막기 위하여 TNFR2 삼량체 신호전달 복합체의 TNFR2 결합 부위에 대해 및/또는 삼량체 결합 부위의 외부 영역에 대해 길항 TNFR2 항체를 상승시키기 위한 이전의 시도들은 성공적이지 않았기 때문이다. TNFa 및 TNFR2 복합체들의 용액 구조는 세 가지 TNFR2 수용체들 에 의해 둘러싸인 중심의 TNFa 동종삼량체를 정의하였다(Mukai 외 Science Signaling 3: ra83 (2010)). 이러한 배열은 또한 림포톡신과 TNFR1, TRAIL 리간드와 DR5, 및 Ox40L 과 Ox40 수용체를 비롯한 기존의 많은 TNF 수퍼패밀리 구성원들에서 관찰되었다 (Banner 외 Cell 73: 431-445 (1993); Cha 외 J. Biol. Chem. 275: 31171-31177 (2000); Compaan 외 Structure 14:1321-1330 (2006); Hymowitz 외 Mol. Cell 4:563-571 (1999); Mongkolsapaya 외 Nat. Struct. Biol. 6:1048-1053 (1999)).
TNFa 결합 및 TNFR2 삼량체를 막기 위해 이들 영역들에 대한 길항 항체를 제조하기 위한 이전의 시도들은 T-조절 증식 분석법에서 통상적으로 미량인 약한 TNFR2 저해 활성을 가진 열성-길항 항체를 산출하였다. 도 14A-14D에서 보는 바와 같이, 48시간 T-조절 분석에서 이들 열성-길항 항체는 TNFR2-자극 제제의 부재시 길항제로서 기능하였다. 실제로, 두 가지 열성-길항제 TNFR2 항체 A 및 B는 그 자체로 0-25 μg/ml의 용량 반응에 대한 용량 반응 T-조절 길항작용을 나타내었다 (도 14A 및 14C). 중요한 것은, TNFa (20 mg/ml)가 배양물에 추가되었을 때, 이들 TNFR2-지시된 열성-길항 항체 A 및 B는 TNFa와 열등하게 경쟁하였다는 것이다. 각 사례에서, TNFa 추진된 작용성은 이러한 형태의 길항작용 보다 더 우세하였으며, TNFa 또는 TNFR2 삼량체 형성을 막기 위한 항체에 최소한 부분적이고 약한 길항작용을 가진다 (도 15C). 이러한 거동은 본 출원에서 확인되고 기재된 TNFR2 내 특이적 에피토프, 가령, TNFR2의 KCRPG 모티프를 내포하는 에피토프 및 본 출원에서 제공된 TNFRAB1 및 TNFRAB2에 관한 기재 내용에서 확인된 다른 에피토프에 결합하는 우성 길항 TNFR2 항체, 가령, TNFRAB1 및 TNFRAB2의 능력과 대조적이다. 열성-길항 TNFR2 항체 A 및 B와 정 반대로, TNFR2 길항 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2는 TNFR2 작용제, 가령, TNFα 및 IL-2의 존재하에서 조차도 TNFR2 신호전달 및 T-조절 증식을 약화시키는 능력을 보여주었다. 중요한 것은, 본 출원에서 확인된 에피토프는 TNFR2 자극원의 존재하에서 지속되는 길항 효과를 보여주는 길항 TNFR2 항체를 상승시키기 위해 사용될 수 있다는 것이다.
선형 펩타이드 맵핑은 TNFRAB1 및 TNFRAB2가 왜 보다 우수한 길항제였는지에 관한 질문에 부분적으로만 답을 주었기 때문에, 우리는 다음으로 두 가지 TNFR2 길항제의 입체형태 에피토프를 확인하는 조사를 하였다. 우리는 Pepscan 기술 (Pepscan사, The Netherlands)을 사용하여 3차원 (3D) 결합 분석을 수행하였다. TNFRAB1 및 TNFRAB2 모두에 대해, 3D 데이터는 대략 aa138-aa150의 중첩 영역들을 보여주었다. 명백한 것은 이러한 결합 영역들이 삼량체 TNFa와 함께 고전적인 TNFR2 삼량체에 결합할 수 없는 것으로 보였다는 것인데, 그 이유는 상기 부위들이 이러한 삼량체의 내부 상에 존재할 것이기 때문이다 (도 15B). 다른 연구 그룹들이 평행 또는 역-평행 모델이었던 TNF 수퍼패밀리 구성원들의 TNF 독립 형태들에 대한 다른 형태들을 보고하였기 때문에, 우리는 이들 부위들에 대한 에피토프를 맵핑하였다 (Naismith 외 J. Biol. Chem. 270:13303-13307 (1995); Naismith 외 Structure 4:1251-1262 (1996)). 놀랍게도, 다음과 같은 오직 하나의 TNFR2 길항 결합 모델이 최적이었다: 역-평행 이량체 (도 15A)가 필수적으로 힌지된 TNFR2 길항제와 공간적으로 떨어져있는 두 개의 TNFR2 길항 항체 결합 영역들을 내포하고, 이들 항체의 또 다른 기능적 특징인 이러한 TNFa-독립적 복합체를 안정화시키는 것으로 보이는 모델. 추가 모델링에서, 우리의 기능 분석에서 관찰되었던 바와 같이, 역-평행 복합체는, 서로 멀리 떨어져 있는 세포내 영역들을 가지며 NFkB 신호전달을 저해함을 명백히 보여주었으나 평행 이량체 복합체는 그렇지 않았다. 수용체들의 TNF 수퍼패밀리의 모든 구성원들은 일반적으로 잘 연구되지 않은 이러한 역-평행 입체형태를 보여줄 수 있기 때문에, TNFR 수퍼패밀리의 임의의 수용체에 대한 길항 항체는 역-평행 TNFRS 구성원 단백질 내 표면-노출된 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 설계 또는 이를 선별함으로써 제조될 수 있다 (예컨대, 하기 실시예 15 참고). 이들 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이들 단백질의 역-평행 형태들을 안정화시켜, 신호전달, 뿐만 아니라 종종 가용성 동족형 리간드들에 또한 결합하는 이들 수용체들의 활성 삼량체 형태들의 형성을 막을 수 있다. 그 중에서도 역-평행 이량체 구조들을 나타내는 것으로 공지된 수용체들의 TNF 수퍼패밀리들의 공지된 구성원들은 다음을 포함한다: TNFR1, TNFR2, Fas, DCR3, DR3, TRAIL-R1(DR4). TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3, TRAIL-R4, DR6, EDAR, CD271, OPG, RANK, LT
Figure pct00029
R, TWEAK-R, HVEM, CD27, CD30, CD40, CD137, OX40, GITR, BCMA, TACI, BAFFR, EDAR2, TROY, 및 RELT.
실시예 14. 암 세포에 대한 TNFR2 길항제 활성
암을 앓고 있는 환자에 존재하는 T-조절 세포는 강력한 면역 억제자이다. 이는 암 환자 또는 대조 대상체들의 말초 혈액의 T-조절 세포와 비교하여 종양 부위들로부터 얻은 T-조절 세포에 있어서 특히 그러하다 . 난소 암 T-조절 세포에 대한 TNFR2 길항제 항체의 효능을 이해하기 위해, 새로운 난소 암 T-조절 세포들을 분리하고 이들의 증식을 실시예 2에 기재한 바와 같이 특성화하였다. 먼저 TNF에 대해, 그 후 TNFR2 작용제에 대해, 실제로 T-조절 세포에 상주하는 난소 암이 정상 공여자의 T-조절 세포 보다 훨씬 더 크게 확대되어, 과 활성화의 징후를 나타내었다 (도 16A-16B 및 17A-17H). 건강한 공여자들로부터 분리된 T-조절 세포의 증식 분석으로부터 얻은 엄격한 용량 반응 데이터와 비교시 TNFR2 길항 항체는 용량-의존 방식으로 그리고 보다 높은 변이성으로 T-조절 세포증식을 저해하였다. 추가적으로, 두 길항 항체 모두는 건강한 공여자들과 비교하여 보다 강력하게 난소 암 환자들로부터 분리된 T-조절 세포 증식을 저해하였다.
상기 기재한 실험들은 길항 TNFR2 항체가 정상 및 암-관련 T-조절 세포증식 모두를 저해할 수 있음을 입증한다. 이러한 항체는 배양물 내 T-조절 세포의 양 면에서 뿐만 아니라 T-조절 증식 면에서 모두 강력한 억제성 T-조절 세포를 제거 또는 불활성화 할 수 있다. 이들 항체들의 특성들은 NFkB 활성화에 앞서 세포내 조기 인산화 발생을 약화시키는 능력 및 이들 세포가 감소된 양의 활성화 마커, 가령, CD45RO를 발현시키도록 잔부 T-조절 세포의 표현형을 변화시키는 능력을 포함한다. 추가적으로, 길항 TNFR2 항체는 전염증성 단백질인 가용성 TNFR2의 분비를 감소시킬 수 있다. 놀랍게도, 세포 배양 배지에 추가되는 작용제 TNFα 또는 작용제 TNFR2 항체의 양이 넉넉히 존재하는 경우 조차도, 길항 TNFR2 항체는 여전히 우성 길항제로 작용한다.
TNFα 수용체들의 항체 또는 리간드 작용성을 항체 길항작용과 대조하여 보는 것이 의미가 있다. 자연 리간드들과 TNF 및 다른 TNF 수퍼패밀리 작용성에 관한 필요조건은 잘 연구되어 있으며 효율적인 신호 전달을 위해 응집 및 집락화를 필요로 한다 (Das 외 J. Mol. Endocrinol. 53:81-91 (2014); Siegel 외 J. Cell. Biol. 167:735-744 (2004); Takeda 외 Oncogene 26:3745-3757 (2007)). 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리는 대부분 통상적으로 리간드의 삼량체와 짝을 이룬 삼량체 수용체로 확인된다 (Gommerman 외 Nat. Rev. Immunol. 3:642-655 (2003); Loetscher 외 J. Biol. Chem. 266:18324-18329 (1991); Smith 외 Cell 76:959-962 (1994); Tartaglia J. Biol. Chem. 267:4304-4307 (1992); Ware Annu. Rev. Immunol. 23:787-819 (2005)). 작용제 항체는 동일한 원칙을 따르는 것으로 보이며 또한 세포외 격자를 안정화시키는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 메커니즘을 통해 관련 세포에 대한 이들의 수용체들의 Fc 부분들을 필요로 하는 것으로 보인다. TNFR2 작용성에 대해 관찰된 이러한 외부 수용체 올리고머화 및 집락화는 활발한 NFkB 신호전달을 위한 상호 TRAF 격자 네트워크의 내부 올리고머화를 가능하게 한다(Cabal-Hierro 외 Cell Signal. 26:2658-2666 (2014); Yin 외 Nat. Struct. Mol. Biol. 16:658-666 (2009); Zheng 외 Mol. Cell. 38:101-113 (2010)). 작용제의 안정화는 또한 수용체에 대한 추가 리간드의 통합에 의해 촉진된다. 이는 많은 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원들에 대한 치료 유효성에 중요한 것으로 보인다 (Graves 외 Cancer Cell 26:177-189 (2014)).
본 출원에서 연구된 두 가 지TNFR2 길항제 항체의 공유 수용체 결합 영역들은 안정하고 우성인 길항작용을 유발하는, TNFR2 수용체에 대한 매우 상이한 가능한 항체 결합 모델로 우리를 이끌었다. 통상적으로 연구된 TNFR2의 삼량체 형태는 새로이 확인된 항체 길항제가 이들의 아미노산 서열들에 결합하지 못하게 할 것이며 이러한 길항 항체들이 are 우성 over TNFα 또는 IL-2 보다 어떻게 우세한지를 설명할 것이다 (Mukai 외 Science Signal. 3:ra83 (2010)). 실제로, 삼량체 TNFR2 구조에서 TNFα 결합 영역에 대한 또는 이러한 삼량체의 TNFα 결합 영역의 외부 표면에 대한 TNFR2 항체를 생성하고자 한 수년간의 연구는 TNFR2 작용제의 존재하에서 수용체 신호전달의 우세한 저해를 지속시켰던 강력한 길항제를 생성하지 못했다. TNFα와 경쟁하도록 설계된 TNFR2 삼량체-지시된 항체는 우세하지 않았으나, TNFα 또는 IL-2의 염증 환경에 시험 감염시 중화 효과를 보여주었다.
TNFR2의 삼량체 형태는 이는 NFkB가 관여하는 세포 성장 신호들과 관련되어 있기 때문에 가장 일반적으로 연구된 TNFα 수용체의 형태이다. 기존의 연구들은 TNFR2 및 림포톡신 수용체와 같은 유사한 TNFα 수퍼패밀리 구성원들 또한 평행 및 역-평행 형태로 존재할 수 있음을 제시하였다. 이러한 형태들은 TNF 결합 부위가 없다 (Naismith 외 J. Biol. Chem. 270:13303-13307 (1995); Naismith 외 Structure 4:1251-1262 (1996)). 본 출원에 기재된 데이터는 길항작용을 증가시키기 위해 또는 길항작용을 작용성으로 전환시키기 위해 교차-결합 시약을 추가하는 것에 대한 어떠한 추가적인 이점도 보여주지 않는다. 삼량체 TNFR2에 대한 TNFα의 고-친화성 TNFα 결합이 항체에 의해 경쟁적으로 저해될 수 있다는 것은, 극히 높은 친화성의 경우에도 상상하기 어려울 것이다. TNFR2의 역-평행 이량체는 길항 항체 및 기능적 분석을 위한 평가가능한 결합 부위로 가장 적합하지만 이러한 관찰 결과를 뒷받침하는 또 다른 특징들이 존재한다 - 외부 경계면이 훨씬 더 넓어서 다른 데이터에 의해 뒷받침되는 바와 같이 이 또한 TNFR2의 세포내 꼬리가 더욱 멀리 떨어져 있도록 할 것이다(Naismith 외 Structure 4:1251-1262 (1996)). TNFR2 삼량체화를 통해 TNFR2의 세포내 신호전달 영역들이 서로 가깝게 끌어당겨지므로, 이들 TNF 수퍼패밀리 수용체들의 세포내 도메인들의 TRAF 직접 및 간접적 동원을 용이하게 한다 (Napetschnig 외 Annu. Rev. Biophys. 42:443-468 (2013); Yin 외 Nat. Struct. Mol. Biol. 16:658-666 (2009)). 이 작용제 신호는 kB (IkB) 키나아제 (IKK)의 억제제 및 궁극적으로 NFkB를 활성화시키는 MAP 키나아제를 활성화시키기 위해 다른 신호 전달 단백질과 결합한다. 수용체 신호 전달 경로가 TNFR2 길항 항체로 다양한 정도로 차단된다는 사실은 외부 TNFR2 구조의 지배적인 안정화에 의해 세포 내 TRAFs의 동원이 저해됨을 제시한다. TNFR1의 역평행 이합체가 저해 복합체 일 수 있고 TNF에 결합 할 수 없음이 다른 연구자들에 의해 기존에 제안되었다.(Naismith 외 Structure 4:1251-1262 (1996)). 역-평행 모델은 새로운 활성화 삼량체가 형성될 수 없었기 때문에 이러한 복합체의 길항 형성이 TNF 공동-배양 보다 우세함을 설명하는 방법을 보다 근접하게 입증한다.
다른 연구자에 의해 보고된 바와 같이, 암 환경의 T-조절 세포는 비-암 공여자의 T-조절 세포 또는 암 공여자의 말초 혈액으로부터 분리된 T-조절 세포와 비교하여 매우 강력함을 언급할 가치가 있다.(Govindaraj 외 Clin. Cancer Res. 20: 724-735 (2013)). 본 출원에 기재된 바와 같이, 길항 TNFR2 항체는 난소 암 환자들로부터 분리된 강력한 T-조절 세포의 증식을 저해할 수 있다. 난소 암 환자로부터 분리된 T-조절 세포의 두드러진 저해는 TNFR2 길항제 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2에 의해 구현됨이 또한 관찰되었다. 이러한 활성은 암 환자의 TNFR2 신호전달에 대한 향상된 효능을 제공하는 TNFR2 유전자 서열의 특징을 확인한 최근의 보고들을 고려할 때 유익하다. 피부 T 세포 림프종의 설정에서, 예를 들어, TNFR2에 대한 유전자는 유전자 중복이며 및/또는 항시 작용성을 부여하기 위하여 세포내 영역에서 돌연변이 될 수 있다. TNFR2 성장 신호를 지속적으로 유지시키기 위한 이러한 유전적 압력은 과도한 성장과 합치한다.
본 출원에 기재된 길항제 항체는 TNFα의 존재하에서 T-조절 저해 그리고 심지어 우세한 저해를 조절하는 TNFR2 수용체의 제한된 영역들에 결합한다. 이들 길항제는 T-조절 세포증식을 약하게 저해할 수 있는 본 출원에 기재된 열성 길항제와 매우 상이하지만, TNF 및 IL-2의 염증 환경에서 사용될 때, 작용성이 우세하다 (도 14A-14D). 종합하면, 상기 기재된 데이터는 암을 앓고 있는 환자들에서 T-조절 세포 성장을 조절할 수 있는 본 출원에 기재된 항체들 보다 우수한 추가적인 길항제 TNFR2 항체를 생성하기 위한 새로운 플랫폼을 제공하며, 여기서 암 세포는 상승된 양의 TNFR2 (예컨대, 난소 암)을 발현시키고 TNFR2 작용제의 존재하에서 조차도 길항 효과를 나타낼 수 있다. 특히, 이러한 길항 TNFR2 항체는 비-암 공여자의 T-조절 세포에서 보다 난소 암 환자들의 T-조절 세포에서 더욱 강력하다.
실시예 15. CDR-H3 서열 치환에 의한 길항 TNFR2 항체의 개발
항-TNFR2 항체를 생성하기 위하여, 생쥐들을 확립된 면역화 절차를 사용하여 전장 인간 TNFR2로 면역화시켰다. 이어서 면역화된 생쥐들로부터 혈청을 분리하고, 12개의 별개의 단클론 항체들이 정제되었다. 이러한 12개 항체들의 인간 TNFR2에 대한 친화성을 인간 TNFR2로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 ELISA로 확인하였다 (도 18A). 이들 실험들에서 사용된 마이크로타이터 플레이트의 웰들을 항원 at 5 μg/ml의 항원으로 코팅하였다. 후속하여 쥐과 항체를 마이크로타이터 플레이트의 A행부터 G행까지의 각 웰에 1:300, 1:900, 1:2700, 1:8100, 1:24300, 1:72900, 및 1:218799의 희석액으로 추가하였다. H행의 판독값들이 배경 형광에 해당한다. 특히, 양성 효능은 1:2700 희석에서 배경값을 2회 판독한 광학 밀도를 가질 것이다. 추가된 항체는 개발중인 항체, 가령, 형광 제제에 접합시켜 표지된 염소 항-생쥐 면역글로불린을 추가하여 탐지되었다. 후속하여 형광 플레이트 판독장치를 사용하여 마이크로타이터 플레이트를 분석하였다. 이후 ELISA 선별 원 데이터를 Excel을 사용하여 수치적으로 분석하였다. 양의 역치보다 큰 광학 밀도(OD) 값을 가지는 항원으로 코팅된 임의의 마이크로타이터 웰은 카운터 스크린-코팅된 플레이트 상에서 상응하는 웰이 음성 역치보다 작은 OD를 가지는 경우 "양성 결과"로 간주된다.
TNFR2에 대한 높은 친화성에 기초하여 (예컨대, 도 18A에서 3열 B행에 나타낸 형광 판독값으로 증명됨), 쥐과 클론 3을 CDR-H3 돌연변이유발을 위해 선택하였다. 길항 TNFR2 항체 TNFR2A3를 제조하기 위하여 클론 3의 CDR-H3 서열을 해당 분야에 공지된 재조합 유전자 발현 기술을 사용하여 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284) 로 치환하였다. 전구물질 클론 3은 TNFR2 표적을 길항할 수 없었으나, 재조합하여 제조한 TNFR2A3는 길항 특성을 나타내었다. 도 18B 및 18C의 3열, 뿐만 아니라 도 20의 2 및 3열에서 보는 바와 같이, TNFR2A3은 각각 아미노산 서열 LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285) 및 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286)을 가지는 두 가지 인간 TNFR2-유래 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 선택적 결합은 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에서 증가하는 농도의 TNFR2A3 내에서 형광이 용량-의존적으로 증가하는 것에 의해 증명되었다. TNFR2A3는 부위-특이적 방식으로 TNFR2에 결합하는데, 왜냐하면 이 항체가 인간 TNFR2 일차 구조의 원위 영역으로부터 분리된 관련없는 TNFR2-유래 펩타이드에 대하여 무시할 만한 수준의 결합 친화성을 나타냄이 밝혀졌기 때문이다 (예컨대, 도 19의 3열 참고). 종합하면, 이러한 관찰결과들은 TNFR2 길항작용과 관련하여 CDR-H3 서열의 두 가지 중요한 측면들을 입증한다. 먼저, 길항 TNFR2 항체의 CDR-H3 서열은 항체의 항원-결합 성질의 중요한 분자 결정인자이다. 다음으로, CDR-H3 모티프는 수용체 길항작용을 촉진시키는 TNFR2의 영역들에 결합하는 능력을 가진 항체를 제공하기 위해 길항 활성을 나타내지 않는 항-TNFR2 항체에 제공될 수 있는 모듈 도메인이다.
실시예 16. 길항 항-TNFR2 항체와 면역요법제의 병용 투여에 의한 인간 환자의 암 또는 감염 질환의 치료
본 발명의 길항 TNFR2 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체들은 세포 증식 장애, 가령, 암, 또는 감염 질환, 가령, 바이러스, 세균, 진균, 또는 기생충 감염을 치료하기 위하여 면역요법제와 병용하여 인간 환자에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 이와 혼합, 이와 공동-투여, 또는 이와 별도로 투여) . 이러한 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체의 투여는 TNFR2를 발현시키는 T-조절 세포 및/또는 암 세포의 성장 및 증식을 억제할 수 있다. 면역요법제, 가령, 항-CTLA-4 제제, 항-PD-1 제제, 항-PD-L1 제제, 항-PD-L2 제제, TNF-α 교차-결합 제제, TRAIL 교차-결합 제제, 항-CD27 제제, 항-CD30 제제, 항-CD40 제제, 항-4-1BB 제제, 항-GITR 제제, 항-OX40 제제, 항-TRAILR1 제제, 항-TRAILR2 제제, 및 항-TWEAKR 제제는 길항제 TNFR2 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체들과 동시에 기능할 수 있는데, 왜냐하면 면역요법제들은 세포독성 T 세포 반응의 하향조절 및 종양-관련 항원들에 대한 내성을 초래하게 되는 면역 관문 수용체s 및/또는 리간드들의 신호 전달을 하향조절할 수 있기 때문이다. 길항 TNFR2 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체와 병용하여 사용될 수 있는 면역요법제들의 추가적인 예들에는 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론 (예컨대, PEGASYS®), 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 가바펜틴, 림프계 세포 표면 수용체들 및/또는 림포카인에 대한 항체, 표면 암 단백질에 대한 항체, 및/또는 보리노스타트와 같은 소분자 치료제가 포함된다.
해당 분야의 숙련된 의사는, 예를 들어, 본 출원에 기재된 길항제와 같은, TNFR2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체를, 암 또는 감염 질환을 앓고 있는 인간 환자에게 면역요법제와 병용하여 투여할 수 있다. 이러한 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체 및 면역요법제는 적절한 투여 경로로 (예를 들어, 그 중에서도, 비강내, 근육내, 또는 피하) 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년에 걸쳐 특정 용량으로 (예를 들어, 기타 범위들 중에서도, 0.001 내지 100 mg/kg/일) 환자에게 투여될 수 있다. 필요에 따라, 항-TNFR2 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체는 면역 인식을 피하고 및/또는 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체의 약물동역학적 프로파일을 개선하도록, 예컨대, 과당화에 의해 또는 PEG와의 접합에 의해 변형될 수 있다.
이러한 방식으로 치료되는 암 또는 감염 질환의 진행은 여러 확립된 방법들 중 하나 이상에 의해 모니터 될 수 있다. 의사는 환자가 나타내는 증상들이 치료에 반응하여 어떻게 변화하였는지를 평가하기 위해 직접 관찰에 의해 환자를 모니터 할 수 있다. 환자는 또한 종양이 전이되었는지 여부 또는 종양 크기가 변화하였는지, 예컨대, 항-TNFR2 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체 및 면역요법제 치료에 반응하여 감소되었는지 여부를 결정하기 위하여 MRI, CT 스캔, 또는 PET 분석 될 수 있다. 선택적으로, 세포는 환자로부터 추출될 수 있으며 다양한 성장 인자 수용체, 가령, 표피 성장 인자 수용체의 상대적 세포-표면 농도를 결정하기 위하여 정량적 생화학적 분석을 수행할 수 있다. 이들 분석 결과에 기초하여, 의사는 후속 치료 주기에서 보다 높은/보다 낮은 용량 또는 보다 많은/보다 적은 빈도의 길항 TNFR2 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체 및 면역요법제 투약을 처방할 수 있다.
실시예 17. 활성화된 T-조절 세포의 사멸 및 T 작동자 세포의 증식에 대한 길항 TNFR2 폴리펩타이드의 CDR-H 및 CDR-L 영역들의 조합 효과 분석
최근 CDR-H 및 CDR-L 영역들의 특정 조합을 내포하는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체들이 특히 T-조절 세포사멸을 촉진하고 T 작동자 세포 (예컨대, CD8+ T 세포) 증식을 증가시킬 수 있음이 발견되었다. 항-TNFR2 폴리펩타이드의 길항 활성에 대한 CDR-H1 및 CDR-L3 영역들의 다양한 조합의 효과를 테스트하기 위하여, 다음과 같은 두 가지 CDR-H1 영역들의 가능한 4가지 조합을 모두 내포하는 일련의 단클론 항체를 개발하였다: GYTFTDYL (서열 번호: 274) 및 GYTFTDYI (서열 번호: 275) 그리고 2가지 CDR-L3 영역들: CLQYVNLLT (서열 번호: 272) 및 CLQYVNLIT (서열 번호: 273). 나머지 CDR 영역들은 TNFRAB2에 대해 기재한 것들과 동일하였다 (CDR-H2: VDPEYGST (서열 번호: 258), CDR-H3: ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259), CDR-L1: QNINKY (서열 번호: 260), CDR-L2: TYS 또는 YTS).
그 후 전술한 CDR-H1 및 CDR-L3 영역들의 4가지 가능한 조합들 각각을 내포하는 단클론 항체들을, T-조절 세포사멸을 유도하고 CD8+ 세포 증식을 촉진시키는 능력에 대해 using 가령, 상기 실시예 2에 기재된 절차와 같은 표준 CD4+CD25+ 및 CD8+ 세포 계수 절차를 사용하여 테스트하였다. T-조절 세포사멸을 유도하고 CD8+ T 세포 증식을 유도하는 각 단클론 항체들의 능력을 1 내지 5의 정성 척도로 순위를 매겼으며, 이 때 1은 측정가능한 생물학적 활성에 해당하고 5는 강력한 생물학적 활성에 해당한다. 이 실험들의 결과를 아래 표 3에 요약한다:
표 3. 길항 TNFR2 단클론 항체의 T-조절 억제 및 CD8+ T 세포 유도 성질에 대한 CDR-H1과 CDR-L3 조합의 효과
Figure pct00030
표 3에 보고된 결과는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274)을 가지는 CDR-H1 및 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273)를 가지는 CDR-L3을 내포하는, 본 출원에 기재된 항체, 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체들이 활성화된 T-조절 세포의 선택적 사멸의 촉진 및 증가된 T 작동자 세포 증식의 강화에 특히 효과적임을 입증한다. 본 출원에 기재된 바와 같이, 이러한 표현형들은 암 및 감염 질환의 치료에 유익한데, 이는 이러한 병을 앓고 있는 환자의 활성화된 T-조절 세포 집단들을 고갈시키는 능력이 세포독성 CD8+ T 세포의 약화를 감소시킬 수 있고, 이로써 작동자 세포가 암 및 감염 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 기능을 하게 하거나 또는 확대하도록 하기 때문이다.
실시예 18. 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 T-조절 세포, T 작동자 세포, 및 TNFR2+ 암 세포에 대한 효과를 나타낸다
길항 TFNR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체는 T-조절 세포 및 T 작동자 세포에 대하여 생물학적 활성을 발휘할 수 있다. 이러한 효과를 조사하기 위하여, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2를 항체 농도를 상승시키면서 배양된 T-조절 세포와 함께 배양하고, 배양물 내 T-조절 세포의 양의 백분율 변화를 후속하여 기록하였다. 이 실험들의 결과를 도 21A 및 21B에 나타내며, 이는 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2가 용량-의존 방식으로 배양물 내 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해함을 입증한다.
추가적으로, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2는 T 작동자 세포의 증식을 촉진한다. 이러한 활성을 조사하기 위하여, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2를 상승하는 농도의 항체에서 배양된 CD8+ T 세포와 함께 배양하고, 배양물 내 CD8+ T 세포의 양의 백분율 변화를 후속하여 기록하였다. 이 실험들의 결과를 도 21C에 나타내며, 이는 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2가 용량-의존 방식으로 T 작동자 세포의 증식을 증가시킴을 입증한다.
길항 TNFR2 항체 TNFRAB1 및 TNFRAB2는 또한 TNFR2-발현 암 세포를 직접 사멸시킨다. 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1을, TNFR2+ 난소 암 세포주인 배양된 OVCAR3 세포와 함께, 항체 농도를 상승시키면서 배양하고, 배양물 내 CD8+ T 세포의 양의 백분율 변화를 후속하여 기록하였다. 이 실험들의 결과를 도 21D에 나타내며, 이는 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1이 용량-의존 방식으로 TNFR2+ 암 세포의 증식을 억제함을 입증한다.
종합하면, 도 21A-21D에 도시된 데이터는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 항-TNFR2 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체가 몇 가지 별도의 메커니즘을 통해 치료 효과를 발휘할 수 있음을 입증한다. 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 T-조절 세포증식을 억제하고 T 작동자 세포의 증식을 증가시킬 수 있으며, 이어서 예를 들어, 암 세포 또는 감염 병원체의 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 추가적으로, 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 TNFR2를 발현시키는 암 세포를 직접 사멸할 수 있다. 이러한 메커니즘을 통해, 예를 들어, 가령, 본 출원에 기재된 것과 같은 길항 TNFR2 폴리펩타이드는, 다양한 암 및 감염 질환, 가령, 본 출원에 기재된 병태를 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 19. 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 종양 미세환경에서 T-조절 세포를 사멸하고 T 작동자 세포를 확대시킨다
길항 TFNR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체들은, 암 환자의 종양 미세환경에서 선호적으로 T-조절 세포의 증식을 감소시키고 T 작동자의 증식을 증가시킬 수 있다. 이러한 성질을 조사하기 위하여, 길항 TNFR2 항체인, TNFRAB1을, 암이 없는 인간 대상체로부터 얻은 새로운 인간 난소 암 복수 또는 혈액 샘플과 함께 배양하였다. TNFRAB1을 용량을 증가시키면서 이들 샘플들에 제공하고, 배양 기간 이후 각 샘플에 존재하는 T-조절 세포 및 T 작동자 세포의 양을 기록하였다. 이 실험들의 결과를 도 22A 및 22B에 기록한다. 상기 도면에서 보는 바와 같이, TNFRAB1은 용량-의존 방식으로 난소 암 복수 샘플 내 T-조절 세포의 증식을 사멸 또는 감소시켰다. TNFRAB1은 또한 암이 없는 인간으로부터 얻은 샘플에서 T-조절 세포의 증식을 사멸 또는 감소시켰으나, 그 정도가 더 적었다. 역으로, TNFRAB1은 암이 없는 인간으로부터 얻은 샘플에서 보다 더 큰 정도로 난소 암 복수 샘플 내 T 작동자 세포 증식을 증가시켰다. 종합하면, 이들 데이터는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 항-TNFR2 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체들이, 종양 미세환경에서, 가령, 본 출원에 기재된 암을 앓고 있는 환자에서의 T-조절 세포를, 암 세포가 없는 환경, 가령, 건강한 인간 대상체에서의 T-조절 세포와 비교하여 우선적으로 제거할 수 있음을 입증한다.
실시예 20. 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 T-조절 세포를 사멸시키고, T 작동자 세포를 확대시키고, TNFR2+ CD26- 세포를 제거한다
길항 TFNR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체는, 종양 미세환경에서 T-조절 세포를 사멸시키고, T 작동자 세포 증식을 증가시키고, TNFR2-발현 암 세포를 사멸시키는 능력을 보여준다. 이들 활성을 추가로 조사하기 위하여, 길항 TNFR2 항체 TNFRAB1을 건강한 인간 대상체 및 진행된 피부 T 세포 림프종을 앓고 있는 인간 환자들로부터 얻은 혈액 샘플들과 함께 배양하였다. 이들 환자들은 하나 이상의 면역요법제, 가령, 그 중에서도, 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론 (예컨대, PEGASYS®), 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 및 가바펜틴을 이용한 배경 치료를 받고 있었으며, 본 실험들이 수행되었던 때에 면역요법에 대한 반응이 없었다.
배양 기간 후, 작동자 T 세포, T-조절 세포, 및 TNFR2+ CD26- 세포의 양을 각각의 샘플에서 측정하였다. T 세포에 의한 CD26 발현의 부재는 T 세포 림프종의 지표가 된다. 그러므로, 이러한 세포들에 대해 발휘되는 효과는 T 세포 림프종 환자에서의 암 세포에 대한 효과를 나타낸다. 이 실험들의 결과를 도 23A-23C에 기록한다. 이들 데이터는 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, TNFRAB1이 암 환자의 T-조절, T 작동자, 및 TNFR2+ CD26- 세포 집단들을 동시에 조절할 수 있음을 입증한다. 본 출원에 기재된 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체들은, 암, 가령, T 세포 림프종 또는 본 출원에 기재된 또 다른 암을 앓고 있는 환자들에 대하여 치료 효과를 제공하는 이들 3가지 특성들 모두를 입증할 수 있다.
추가적으로, 도 23A-23C에 도시된 결과는, 길항 TNFR2 폴리펩타이드, 가령, 본 출원에 기재된 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 및 구조체가, 환자의 암 치료를 위한 면역요법제와 병용하여 사용될 수 있음을 입증한다. 전술한 실험들에서 연구되었던 T 세포 림프종 환자들은 면역요법 단독에 대하여는 반응하지 않았다. 이들 환자들로부터 얻은 분리된 혈액 샘플을 TNFRAB1로 처리시, 바람직한 시험관내 반응이 관찰되었는데, T-조절 세포 및 TNFR2+ CD26- 세포의 증식은 감소하였고 T 작동자 세포의 증식은 증가하였다. 이러한 결과는, 암 환자의 치료 효능을 개선하기 위하여, 길항 TNFR2 폴리펩타이드가 면역요법제, 가령, 본 출원에 기재된 면역요법제 (예를 들어, 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론 (예컨대, PEGASYS®), 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 및 가바펜틴)과 병용하여 사용될 수 있음을 보여준다.
더욱이, 상기 실험들의 결과는 본 발명의 길항 TNFR2 폴리펩타이드가 다양한 암 환자들에서 치료 효과를 나타냄을 입증한다. 본 출원에 기재된 바와 같이 길항 TNFR2 항체는 난소 암 세포 증식 (예컨대, 상기 실시예 14 참고) 및 T 세포 림프종 세포 증식을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 두 가지 암들 모두의 세포들은 TNFR2를 발현시키는 일반적인 성질을 나타낸다. 그러므로, 길항 TNFR2 폴리펩타이드는 넓은 범위의 유형의 암, 가령, TNFR2가 암 세포 표면에서 발현되는 유형의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구체예들
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고문헌으로 포함되도록 나타낸 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
본 발명을 이의 특정 구체예들과 관련하여 설명하였으나, 추가 변형이 가능하며 본 출원은, 일반적으로 본 발명의 원리를 따르는 그리고 본 발명으로부터 출발하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있거나 관례적으로 실시되는, 그리고 전술한 그리고 하기 청구범위에 기재되는 필수적인 특징들에 적용될 수 있는, 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 개조를 포함하고자 하는 것으로 이해하여야 한다.
다른 구체예들은 청구범위에 기재되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The General Hospital Corporation <120> ANTAGONISTIC ANTI-TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY ANTIBODIES <130> 00786-578WO3 <150> US 62/457,496 <151> 2017-02-10 <150> US 62/336,468 <151> 2016-05-13 <160> 287 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 523 <212> DNA <213> Murine <400> 1 gaccaggcat cccagggtca ccatggagtt agtttgggca gcagatccag gggccagtgg 60 atagacagat gggggtgtcg ttttggctga ggagacggtg accgcggtcc ctgcgcccca 120 gacatcgaag taccagtagc tggagtaacc atcaaccctc tgtcgtgcac agtaatacat 180 ggccgtgtcc tcagacctca gactgctcat ttgcaggtac agggtgttct tggcattgtc 240 tctggagatg gtgaatcgcc ccttcacact gtctggatag taggtgtaac taccaccact 300 actaatggtt gcgacccact ccagcctctt ctccggagtc tggcgaaccc aagacatgac 360 ataactactg aaagtgaatc cagaggctgc acaggagagt ttcagggacc ctccaggctt 420 cactaagcct ccccctgact cctgcagctg cacctccgga agcctgaatt ctgcagatat 480 ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca tctagaggcc cat 523 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Murine <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Arg Val Asp Gly Tyr Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 508 <212> DNA <213> Murine <400> 3 ctccgagcgg ccgccagtgt gatggatatc tgcagaattc agggggacat tgtgctgacc 60 cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccataac ctgcagtgcc 120 agctcaagtg tatattacat gtactggttc cagcagaagc caggcacttc tcccaaactc 180 tggatttata gcacatccaa cctggcttct ggagtccctg ttcgcttcag tggcagtggc 240 tctgggacct cttactctct cacaatcagc cgaatggagg ctgaagatgc tgccacttat 300 tactgccagc aaaggaggaa ttacccgtac acgttcggag gggggaccaa gttggaaata 360 aaacgggctg atgctccacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga gcagttacct 420 gaattccagc acactggcgg ccgttactag tggatccgag ctcggtacca agcttgatgc 480 atagcttgag tattctaacg cgtcacct 508 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Murine <400> 4 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 <210> 5 <211> 454 <212> DNA <213> Murine <400> 5 gagcggccgc cagtgtgatg gatatctgca gaattcaggg ggacattgtg ctgacccaga 60 ctcctgcttc cttagctgta tctctggggc agagggccac catctcatgc agggccagca 120 aaagtgtcag tacatctggc tatagttata tgcactggta ccaacagaaa ccaggacagc 180 cacccaaact cctcatctat cttgcatcca acctagaatc tggggtccct gccaggttca 240 gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaacatcca tcctgtggag gaggaggatg 300 ctgcaaccta ttactgtcag cacagtaggg agcttcctcg gacgttcggt ggaggcacca 360 agctggaaat caaacgggct gatgctccac caactgtatc cacccctgaa ttccagcaca 420 ctggcggccg ttactagtgg atccgagctc ggta 454 <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Murine <400> 6 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Ala <210> 7 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly 260 265 270 Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys 275 280 285 Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro 290 295 300 Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu 305 310 315 320 Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser 325 330 335 Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly 340 345 350 Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser 355 360 365 Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile 370 375 380 Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln 385 390 395 400 Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro 405 410 415 Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser 420 425 430 Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro 435 440 445 Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser 450 455 460 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Cys Ser Pro Gly 1 5 <210> 13 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val 1 5 10 15 Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu 20 25 30 Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 50 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val 1 5 10 15 Pro <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser 1 5 10 15 Ser Asp <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys 1 5 10 15 Ala Leu <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro 1 5 10 15 Gly Phe Gly Val 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala 1 5 10 15 Lys Val Phe Cys 20 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Cys Arg Pro Gly 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe 1 5 <210> 22 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala 1 5 10 15 Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro 20 25 30 His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile 35 40 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 23 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Murine <400> 24 Ser Ser Gly Gly Ser Tyr 1 5 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Murine <400> 25 Gln Arg Val Asp Gly Tyr Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Murine <400> 26 Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 27 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 28 Gln Gln Arg Arg Asn Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Murine <400> 29 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 30 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 31 Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Glu Asn Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Gly Ala Val Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 34 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 34 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 35 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 35 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 36 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 36 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 37 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 37 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 38 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 38 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 39 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 39 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 40 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 40 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 41 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 41 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 42 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 43 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 43 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 44 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 45 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 46 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 47 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 47 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 48 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 48 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 49 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 49 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 50 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 50 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 51 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 51 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 52 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 52 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 53 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 53 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 54 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 54 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 55 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 55 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 56 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 56 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 57 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 57 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 58 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 58 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 59 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 59 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 60 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 60 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 61 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 61 Trp Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 62 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 62 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 63 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 63 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 64 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 64 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 65 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 65 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 66 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 66 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 67 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 67 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 68 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 68 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 69 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 69 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 70 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 70 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 71 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 71 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 72 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 72 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 73 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 73 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 74 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 74 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 75 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 75 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 76 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 76 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 77 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 77 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 78 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 78 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 79 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 79 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 80 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 80 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 81 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 81 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 82 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 82 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 83 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 83 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 84 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 84 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 85 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 85 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 86 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 86 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 87 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 87 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 88 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 88 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 89 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 89 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 90 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 90 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 91 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 91 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 92 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 92 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 93 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 93 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 94 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 94 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 95 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 95 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 96 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 96 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 97 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 97 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 98 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 98 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 99 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 99 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 100 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 100 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 101 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 101 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 102 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 102 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 103 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 103 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 104 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 104 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 105 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 105 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 106 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 106 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 107 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 107 Trp Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 108 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 108 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 109 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 109 Trp Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 110 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 110 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 111 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 111 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 112 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 112 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 113 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 113 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 114 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 114 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 115 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 115 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 116 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 116 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 117 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 117 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 118 Ala Asp Ala Ala Pro 1 5 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Thr Val Ala Ala Pro 1 5 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Murine <400> 120 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 1 5 10 <210> 121 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Gln Pro Lys Ala Ala Pro 1 5 <210> 123 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 124 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 126 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 126 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> Murine <400> 127 Ala Lys Thr Thr Ala Pro 1 5 <210> 128 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 129 <211> 13 <212> PRT <213> Murine <400> 129 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 130 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 131 Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 132 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 133 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 133 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 134 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 134 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg 20 25 <210> 135 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 135 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg 20 25 <210> 136 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 136 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg 20 25 <210> 137 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 137 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 138 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 138 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 139 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 139 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 140 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 140 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 141 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 141 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 142 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 142 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 143 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 143 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 144 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 144 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 145 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 145 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 146 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 146 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 147 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 147 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro 20 25 <210> 148 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 148 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 149 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 149 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 150 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 150 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 151 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 151 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 152 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 152 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 153 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 153 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 154 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 154 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 155 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 155 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 156 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 156 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 157 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 157 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 158 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 158 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly 20 25 <210> 159 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 159 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 160 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 160 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 161 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 161 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 162 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 162 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 163 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 163 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 164 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 164 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 165 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 165 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 166 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 166 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 167 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 167 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 168 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 168 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 169 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 169 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp 20 25 <210> 170 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 170 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 171 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 171 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 172 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 172 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 173 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 173 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 174 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 174 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 175 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 175 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 176 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 176 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 177 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 177 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 178 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 178 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 179 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 179 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 180 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 180 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr 20 25 <210> 181 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 181 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 182 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 182 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 183 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 183 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 184 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 184 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 185 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 185 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 186 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 186 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 187 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 187 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 188 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 188 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 189 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 189 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 190 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 190 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 191 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 191 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa 20 25 <210> 192 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 192 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 193 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 193 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 194 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 194 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 195 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 195 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 196 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 196 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 197 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 197 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 198 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 198 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 199 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 199 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala 20 25 <210> 200 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 200 Val Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 201 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 201 Pro Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 202 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 202 Glu Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 203 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 203 Xaa Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 204 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 204 Leu Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 205 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 205 Ser Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 206 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 206 Xaa Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 207 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 207 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 208 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 208 Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 209 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 209 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 210 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 210 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Cys Thr Xaa Arg Pro Gly Trp Tyr Xaa Ala Leu 20 25 <210> 211 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 211 Xaa Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Xaa Thr Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln 20 25 <210> 212 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 212 Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Xaa Thr Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln 20 25 <210> 213 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 213 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Xaa Thr Cys Arg Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln 20 25 <210> 214 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 214 Glu Gln Asn Arg Ile Xaa Thr Cys Arg Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln 20 25 <210> 215 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 215 Gln Asn Arg Ile Xaa Thr Cys Arg Pro Gly Trp Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln 20 25 <210> 216 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 216 Asn Arg Ile Xaa Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln 20 25 <210> 217 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 217 Trp Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 218 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 218 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 219 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 219 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 220 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 220 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 221 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 221 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 222 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 222 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 223 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 223 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 224 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 224 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 225 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 225 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe 20 25 <210> 226 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 226 Trp Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 227 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 227 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 228 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 228 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 229 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 229 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 230 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 230 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 231 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 231 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 232 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 232 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 233 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 233 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 234 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 234 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly 20 25 <210> 235 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 235 Trp Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 236 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 236 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 237 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 237 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 238 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 238 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 239 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 239 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 240 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 240 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 241 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 241 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 242 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 242 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 243 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 243 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val 20 25 <210> 244 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 244 Trp Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 20 25 <210> 245 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 245 Tyr Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 246 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 246 Xaa Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 247 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 247 Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 248 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 248 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 249 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 249 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 250 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 250 Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 251 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 251 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 252 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys residue protected with ACM protecting group <400> 252 Glu Gly Cys Arg Leu Xaa Ala Pro Leu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 20 25 <210> 253 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala 1 5 10 15 Leu Ser Lys Gln 20 <210> 254 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro 20 <210> 255 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys 1 5 10 15 Arg Pro Gly Phe 20 <210> 256 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 1 5 10 15 Pro Gly Thr Glu 20 <210> 257 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Leu or Ile <400> 257 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Xaa 1 5 <210> 258 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <400> 258 Val Asp Pro Glu Tyr Gly Ser Thr 1 5 <210> 259 <211> 14 <212> PRT <213> Murine <400> 259 Ala Arg Asp Asp Gly Ser Tyr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 260 <211> 6 <212> PRT <213> Murine <400> 260 Gln Asn Ile Asn Lys Tyr 1 5 <210> 261 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Leu or Ile <400> 261 Cys Leu Gln Tyr Val Asn Leu Xaa Thr 1 5 <210> 262 <211> 4 <212> PRT <213> Murine <400> 262 Leu Leu Ile Arg 1 <210> 263 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asn, Gln, Ser, or Thr <400> 263 Ser Ser Gly Xaa Xaa Tyr 1 5 <210> 264 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Asn, Gln, Ser, or Thr <400> 264 Val Asp Pro Glu Tyr Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 265 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Arg, Lys, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Asn, Gln, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <400> 265 Gln Xaa Val Xaa Xaa Tyr Xaa Ser Xaa Trp Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 266 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Asn, Gln, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <400> 266 Ala Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Pro Xaa Xaa Xaa Trp Gly 1 5 10 <210> 267 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <400> 267 Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met Xaa 1 5 10 <210> 268 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <400> 268 Gln Asn Ile Asn Lys Xaa 1 5 <210> 269 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Asn, Gln, Ser, or Thr <400> 269 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Xaa 1 5 <210> 270 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Asn, Gln, Ser, or Thr <400> 270 Gln Gln Arg Arg Asn Xaa Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 271 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Trp, Phe, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Asn, Gln, Ser, or Thr <400> 271 Cys Leu Gln Xaa Val Asn Leu Xaa Xaa 1 5 <210> 272 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 272 Cys Leu Gln Tyr Val Asn Leu Leu Thr 1 5 <210> 273 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 273 Cys Leu Gln Tyr Val Asn Leu Ile Thr 1 5 <210> 274 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <400> 274 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Leu 1 5 <210> 275 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <400> 275 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 1 5 <210> 276 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid <400> 276 Gly Xaa Thr Phe Xaa Xaa Tyr 1 5 <210> 277 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <400> 277 Gly Xaa Thr Phe Xaa Xaa Tyr Xaa 1 5 <210> 278 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <400> 278 Xaa Arg Xaa Asp Gly Xaa Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 279 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <400> 279 Xaa Arg Xaa Asp Gly Ser Tyr Xaa Xaa Phe Asp Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 280 <211> 459 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 280 Met Ala Pro Thr Ala Phe Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Gln Phe 1 5 10 15 Trp Ala Ala Gly Arg Ala Val Pro Ala Gln Ala Val Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ile Pro Glu Pro Gly Ser Ser Cys Arg Gln Gln Glu Tyr Tyr Asn Gln 35 40 45 Lys Ile Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Pro Pro Gly Tyr Arg Val Gln 50 55 60 Ser Leu Cys Asn Met Thr Leu Asp Thr Ile Cys Ala Ser Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Leu Val Thr Ala Cys Phe Ser Cys 85 90 95 Asn Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Thr 100 105 110 Lys Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Lys Pro Gly Trp Tyr Cys Thr Leu 115 120 125 Gly Arg Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Val Ala Leu Arg Lys Cys Gly 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Lys Pro Gly Thr Ala Thr Thr Asn Val Ile 145 150 155 160 Cys Ala Pro Cys Gly Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser Tyr Thr 165 170 175 Asp Thr Cys Lys Pro His Arg Asn Cys Ser Ser Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Thr Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Thr Ser Val Leu Pro Thr Arg Lys 195 200 205 Val Ala Arg Gly Pro Ala Thr Thr Arg Ser Gln His Met Glu Pro Thr 210 215 220 Leu Gly Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Phe Phe Leu Leu Pro Lys Val 225 230 235 240 Pro Ser Pro Pro Ser Ser Pro Val Glu Gln Pro Asn Thr Gly Asn Ile 245 250 255 Ser Leu Pro Ile Glu Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu 260 265 270 Leu Ile Val Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Lys Lys Lys Lys 275 280 285 Pro Phe Cys Leu Gln Gly Asp Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asn 290 295 300 Lys Ala Gln Gly Ala Pro Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Thr Thr 305 310 315 320 Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Thr Ser Ser Thr 325 330 335 Asp Lys Arg Ala Pro Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ser Pro Gly Val Glu 340 345 350 Lys Ala Ser Thr Ser Gly Glu Ala Gln Thr Gly Cys Ser Ser Ser Glu 355 360 365 Ala Ser Ser Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val 370 375 380 Asn Val Cys Ser Gly Pro Asp His Ser Ser Gln Cys Pro Ser Gln Ala 385 390 395 400 Gly Ser Thr Arg Asp Thr Asp Ala Ser Thr Pro Asn Ser Pro Lys Glu 405 410 415 Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Arg Pro Phe Gln Ser Gln Pro 420 425 430 Gly Ala Pro Glu Thr Leu Leu Gln Gly Leu Glu Glu Lys Pro Leu Pro 435 440 445 Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser 450 455 <210> 281 <211> 458 <212> PRT <213> Bison bison <400> 281 Met Ala Pro Thr Ala Phe Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Gln Phe 1 5 10 15 Trp Ala Ala Gly Arg Ala Val Pro Ala Gln Ala Val Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ile Pro Glu Pro Gly Ser Ser Cys Arg Gln Gln Glu Tyr Tyr Asn His 35 40 45 Lys Ile Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Pro Pro Gly Tyr Arg Val Gln 50 55 60 Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asp Thr Ile Cys Ala Ser Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Leu Val Thr Ala Cys Phe Ser Cys 85 90 95 Asn Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Thr 100 105 110 Lys Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Lys Pro Gly Trp Tyr Cys Thr Leu 115 120 125 Gly Arg Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Val Ala Leu Arg Lys Cys Gly 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Lys Pro Gly Thr Ala Thr Thr Asn Val Ile 145 150 155 160 Cys Ala Pro Cys Gly Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser Tyr Thr 165 170 175 Asp Thr Cys Lys Pro His Arg Asn Cys Ser Ser Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Thr Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Thr Ser Val Leu Pro Thr Arg Lys 195 200 205 Val Ala Arg Gly Pro Ala Thr Thr Arg Ser Gln His Met Glu Pro Thr 210 215 220 Leu Gly Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Phe Phe Leu Leu Pro Lys Val 225 230 235 240 Pro Ser Pro Pro Ser Ser Pro Val Glu Gln Pro Asn Ala Gly Asn Ile 245 250 255 Ser Leu Pro Ile Glu Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu 260 265 270 Leu Ile Val Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Lys Lys Lys Lys 275 280 285 Pro Phe Cys Leu Gln Gly Asp Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asn 290 295 300 Lys Ala Gln Gly Ala Pro Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Thr Thr 305 310 315 320 Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Thr Ser Ser Thr 325 330 335 Asp Lys Arg Ala Pro Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ser Pro Gly Val Glu 340 345 350 Ala Asn Thr Ser Gly Glu Ala Gln Thr Gly Cys Ser Ser Ser Glu Ala 355 360 365 Ser Ser Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn 370 375 380 Val Cys Ser Gly Pro Asp His Ser Ser Gln Cys Pro Ser Gln Ala Gly 385 390 395 400 Ser Thr Arg Asp Thr Asp Ala Ser Thr Pro Asn Ser Pro Lys Glu Glu 405 410 415 Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Arg Pro Phe Gln Ser Gln Pro Gly 420 425 430 Ala Pro Glu Thr Leu Leu Gln Gly Leu Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu 435 440 445 Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser 450 455 <210> 282 <211> 474 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 282 Met Ala Pro Ala Ala Leu Trp Val Ala Leu Val Phe Glu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Trp Ala Thr Gly His Thr Val Pro Ala Gln Val Val Leu Thr Pro Tyr 20 25 30 Lys Pro Glu Pro Gly Tyr Glu Cys Gln Ile Ser Gln Glu Tyr Tyr Asp 35 40 45 Arg Lys Ala Gln Met Cys Cys Ala Lys Cys Pro Pro Gly Gln Tyr Val 50 55 60 Lys His Phe Cys Asn Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Ala Asp Cys Glu 65 70 75 80 Ala Ser Met Tyr Thr Gln Val Trp Asn Gln Phe Arg Thr Cys Leu Ser 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Cys Thr Thr Asp Gln Val Glu Ile Arg Ala Cys Thr 100 105 110 Lys Gln Gln Asn Arg Val Cys Ala Cys Glu Ala Gly Arg Tyr Cys Ala 115 120 125 Leu Lys Thr His Ser Gly Ser Cys Arg Gln Cys Met Arg Leu Ser Lys 130 135 140 Cys Gly Pro Gly Phe Gly Val Ala Ser Ser Arg Ala Pro Asn Gly Asn 145 150 155 160 Val Leu Cys Lys Ala Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser 165 170 175 Ser Thr Asp Val Cys Arg Pro His Arg Ile Cys Ser Ile Leu Ala Ile 180 185 190 Pro Gly Asn Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Ala Pro Glu Ser Pro Thr 195 200 205 Leu Ser Ala Ile Pro Arg Thr Leu Tyr Val Ser Gln Pro Glu Pro Thr 210 215 220 Arg Ser Gln Pro Leu Asp Gln Glu Pro Gly Pro Ser Gln Thr Pro Ser 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ile Ile Glu Gln Ser Thr Lys 245 250 255 Gly Gly Ile Ser Leu Pro Ile Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ser Leu 260 265 270 Gly Leu Leu Met Leu Gly Leu Val Asn Cys Ile Ile Leu Val Gln Arg 275 280 285 Lys Lys Lys Pro Ser Cys Leu Gln Arg Asp Ala Lys Val Pro His Val 290 295 300 Pro Asp Glu Lys Ser Gln Asp Ala Val Gly Leu Glu Gln Gln His Leu 305 310 315 320 Leu Thr Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala 325 330 335 Ser Ala Gly Asp Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly His Pro Gln Ala Arg 340 345 350 Val Met Ala Glu Ala Gln Gly Phe Gln Glu Ala Arg Ala Ser Ser Arg 355 360 365 Ile Ser Asp Ser Ser His Gly Ser His Gly Thr His Val Asn Val Thr 370 375 380 Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser 385 390 395 400 Ser Gln Ala Ser Ala Thr Val Gly Asp Pro Asp Ala Lys Pro Ser Ala 405 410 415 Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Gln Glu Glu Cys Pro Ser 420 425 430 Gln Ser Pro Cys Glu Thr Thr Glu Thr Leu Gln Ser His Glu Lys Pro 435 440 445 Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Met Gly Met Lys Pro Ser Gln Ala Gly 450 455 460 Trp Phe Asp Gln Ile Ala Val Lys Val Ala 465 470 <210> 283 <211> 474 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 283 Met Ala Pro Ala Ala Leu Trp Val Ala Leu Val Val Glu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Trp Ala Thr Gly His Thr Val Pro Ala Lys Val Val Leu Thr Pro Tyr 20 25 30 Lys Pro Glu Pro Gly Asn Gln Cys Gln Ile Ser Gln Glu Tyr Tyr Asp 35 40 45 Lys Lys Ala Gln Met Cys Cys Ala Lys Cys Pro Pro Gly Gln Tyr Ala 50 55 60 Lys His Phe Cys Asn Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Ala Asp Cys Ala 65 70 75 80 Ala Gly Met Phe Thr Gln Val Trp Asn His Leu His Thr Cys Leu Ser 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Cys Ser Asp Asp Gln Val Glu Thr His Asn Cys Thr 100 105 110 Lys Lys Gln Asn Arg Val Cys Ala Cys Asn Ala Asp Ser Tyr Cys Ala 115 120 125 Leu Lys Leu His Ser Gly Asn Cys Arg Gln Cys Met Lys Leu Ser Lys 130 135 140 Cys Gly Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Ser Arg Thr Ser Asn Gly Asn 145 150 155 160 Val Ile Cys Ser Ala Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser 165 170 175 Ser Thr Asp Val Cys Arg Pro His Arg Ile Cys Ser Ile Leu Ala Ile 180 185 190 Pro Gly Asn Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Ala Ser Glu Ser Pro Thr 195 200 205 Pro Ser Ala Val Pro Arg Thr Ile Tyr Val Ser Gln Pro Glu Pro Thr 210 215 220 Arg Ser Gln Pro Met Asp Gln Glu Pro Gly Pro Ser Gln Thr Pro His 225 230 235 240 Ile Pro Val Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ile Ile Glu Pro Ser Ile Thr 245 250 255 Gly Gly Ile Ser Leu Pro Ile Gly Leu Ile Val Gly Leu Thr Thr Leu 260 265 270 Gly Leu Leu Met Leu Gly Leu Ala Asn Cys Phe Ile Leu Val Gln Arg 275 280 285 Lys Lys Lys Pro Ser Cys Leu Gln Arg Glu Thr Met Val Pro His Leu 290 295 300 Pro Asp Asp Lys Ser Gln Asp Ala Ile Gly Leu Glu Gln Gln His Leu 305 310 315 320 Leu Thr Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala 325 330 335 Ser Ala Gly Asp Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly His Pro Gln Ala Arg 340 345 350 Val Thr Ala Glu Ala Gln Gly Ser Gln Glu Ala Cys Ala Gly Ser Arg 355 360 365 Ser Ser Asp Ser Ser His Gly Ser His Gly Thr His Val Asn Val Thr 370 375 380 Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser 385 390 395 400 Ser Gln Ala Ser Thr Thr Val Gly Asp Pro Asp Ala Asn Pro Ser Gly 405 410 415 Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Gln Glu Glu Cys Pro Ser 420 425 430 Gln Ser Gln Trp Glu Thr Thr Glu Thr Leu Gln Asn His Asp Lys Pro 435 440 445 Phe Pro Leu Gly Val Pro Asp Val Gly Met Lys Pro Asn Gln Pro Gly 450 455 460 Trp Tyr Asp Gln Ile Ala Val Lys Val Pro 465 470 <210> 284 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 284 Ala Arg Asp Asp Gly Ser Tyr Ser Pro Phe Asp Tyr Phe Gly 1 5 10 <210> 285 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 285 Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 1 5 10 <210> 286 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 286 Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn 1 5 10 <210> 287 <211> 5 <212> PRT <213> Bison bison <400> 287 Lys Cys Gly Pro Gly 1 5

Claims (193)

  1. 결합 인간 종양 괴사 인자 수용체 2 (TNFR2)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이 때 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 상보성 결정 영역-중쇄 3 (CDR-H3)을 포함하고:
    (a) JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279);
    (b) AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266); 또는
    (c) ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259) 또는 상기 서열들에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산임.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 CDR-H3의 존재하에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285) 또는 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있음을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 CDR-H3의 존재하에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 7의 아미노산 142-149 (KCRPGFGV) 또는 아미노산 161-169 (CKPCAPGTF) 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)을 가짐을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)을 가짐을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 청구항 1-5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GJTF(J)2YJ (서열 번호: 277)을 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 (J)5GSJ을 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 (J)5Y를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 (J)2S를 가지는 CDR-L2; 및
    (e) 아미노산 서열 (J)3Y(J)4T를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산임.
  7. 청구항 1-5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 Z4YZ3Z5TDZ5X를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 VDPEYZ4Z3T (서열 번호: 264)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 QNINKZ5 (서열 번호: 268)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 TYZ3 또는 YTZ3를 가지는 CDR-L2; 및
    (e) 아미노산 서열 CLQZ5VNLXZ3 (서열 번호: 271)를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고;
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 아미노산이고; 그리고
    각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신이다.
  8. 청구항 1-5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
    (e) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  9. 청구항 6-8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257)를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
    (e) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261)를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYI (서열 번호: 275)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 9-11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 TYS를 가짐을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 청구항 9-11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 YTS를 가짐을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 청구항 9-13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLLT (서열 번호: 272)을 가짐을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 청구항 9-13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273)을 가짐을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 청구항 9-15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 CDR-L2의 N-말단에 결합된 아미노산 서열 LLIR (서열 번호: 262)을 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 청구항 9-16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 CDR-L2의 C-말단에 결합된 아미노산 서열 TLE를 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 청구항 1-17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상을 포함하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GFTFSSY (서열 번호: 23)를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 SSGGSY (서열 번호: 24)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 SASSSVYYMY (서열 번호: 26)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 STSNLAS (서열 번호: 27)를 가지는 CDR-L2;
    (e) 아미노산 서열 QQRRNYPYT (서열 번호: 28)를 가지는 CDR-L3;
    (f) 아미노산 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 번호: 29)를 포함하는 CDR-L1;
    (g) 아미노산 서열 LASNLES (서열 번호: 30)를 포함하는 CDR-L2; 및
    (h) 아미노산 서열 QHSRELPRT (서열 번호: 31)를 포함하는 CDR-L3.
  19. 청구항 1-18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-고유 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 비-고유 불변 영역은 인간 불변 영역임을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 청구항 1-18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 도메인 모두 또는 일부가 없거나, 고유 Fc 도메인 모두 또는 일부가 없거나, 또는 Fc 도메인이 모두 없음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 청구항 1-21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 11, 19, 20, 및 34-117 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 약 100 nM 미만의 KD로 특이적으로 결합하며 서열 번호: 7의 아미노산 56-60 (KCSPG)을 포함하는 펩타이드에 결합하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 청구항 1-22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 7의 아미노산 142-146 (KCRPG) 중 하나 이상을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하며 서열 번호: 7의 아미노산 56-60 (KCSPG)을 포함하는 펩타이드에 결합하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 청구항 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR2 신호전달을 저해함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 청구항 1-24 중 어느 한 항에 있어서 ,상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 및 cIAP2/BIRC3으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 유전자들의 발현을 저해함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 청구항 1-25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 NFkB 활성화를 저해함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  27. 청구항 1-26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  28. 청구항 1-27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR2를 발현시키는 암 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 암 세포는 T 세포 림프종 세포, 가령, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포, 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 및 신장 세포 암종 세포로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  30. 청구항 1-29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 골수-유래 억제 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  31. 청구항 1-30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해하기 위하여 TNFα를 필요로 하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 청구항 1-31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 작동자 세포의 증식을 촉진시킴을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. 다음 단계를 포함하는 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 식별 방법:
    (a) 항체 또는 이의 단편들의 이종 혼합물을, 서열 번호: 285 또는 286의 아미노산 서열, 또는 상기 서열들에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드에 노출시키는 단계; 및
    (b) 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편들을 유지시키고 펩타이드에 특이적으로 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편들을 제거함으로써, 최소한 하나의 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 농후 항체 혼합물을 생성하는 단계.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 방법은 상기 농후 항체 혼합물 내 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 33 또는 34에 있어서, 상기 펩타이드는 표면에 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 33-35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 파지, 세균 세포, 또는 효모 세포의 표면에서 발현됨을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 33-35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 리보솜에 비-공유 결합되거나 mRNA 또는 cDNA에 공유 결합된 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬들로서 발현됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 청구항 33-37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 탐지가능한 표지에 접합됨을 특징으로 하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 탐지가능한 표지는 형광 분자, 에피토프 태그, 및 방사성표지로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 형광 분자는 녹색 형광 단백질, 청록 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 피코에리트린, 알로피코시아닌, 회흐스트, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 프로피듐 아이오다이드, 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 테트라메틸로다민, 및 사이아닌으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 상기 에피토프 태그는 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-전달효소, 폴리-히스티딘 태그, FLAG-태그, myc-태그, 인간 인플루엔자 적혈구응집소 (HA) 태그, 비오틴, 및 스트렙타비딘으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 33-41 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)는 순차적으로 1회 이상 반복됨을 특징으로 하는 방법.
  43. 비-인간 포유동물을 서열 번호: 285 또는 286의 서열, 또는 상기 서열들에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 내포하는 펩타이드로 면역화하는 단계, 및 TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 내포하는 혈청을 수집하는 단계를 포함하는, TNFR2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 비-인간 포유동물은 토끼, 생쥐, 쥐, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 및 양으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  45. 청구항 33-44 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  46. 청구항 1-32, 및 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 다클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이원-가변 면역글로불린 도메인, 일가 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 Fv 분자 (scFv), 디아바디, 트리아바디, 나노바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 도메인 항체, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 분자, 및 탠덤 scFv (taFv)로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 F(ab')2 분자임을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  48. 청구항 1-32, 45, 및 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE로 구성된 그룹에서 선택된 아이소형을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  49. 청구항 1-32 및 45-48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 치료제에 접합됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제임을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  51. 인간 TNFR2에 특이적으로 결합할 수 있는 단쇄 폴리펩타이드, 이 때 이러한 단쇄 폴리펩타이드는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3를 포함하고, CDR-H3는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함하며:
    (a) JRJDGSY(J)2FD(J)3 (서열 번호: 279);
    (b) AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG (서열 번호: 266); 또는
    (c) ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259) 또는 상기 서열들에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산임.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 CDR-H1 및 CDR-H2는 서열 번호: 7의 아미노산 70-180 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항-TNFR2 항체의 것임을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 CDR-H1 및 CDR-H2는 서열 번호: 7의 아미노산 142-149 (KCRPGFGV) 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항-TNFR2 항체의 것임을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  54. 청구항 52에 있어서, 상기 CDR-H1 및 CDR-H2는 서열 번호: 7의 아미노산 137-144 (CAPLRKCR) 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항-TNFR2 항체의 것임을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  55. 청구항 52에 있어서, 상기 CDR-H1 및 CDR-H2는 서열 번호: 7의 아미노산 161-169 (CKPCAPGTF) 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항-TNFR2 항체의 것임을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  56. 청구항 52에 있어서, 상기 CDR-H1 및 CDR-H2는 서열 번호: 7의 아미노산 80-86 (DSTYTQL), 91-98 (PECLSCGS), 및 116-123 (RICTCRPG) 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항-TNFR2 항체의 것임을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  57. 청구항 51-56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3의 존재하에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285) 또는 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있음을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  58. 청구항 51-57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  59. 청구항 51-57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  60. 청구항 51-59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H1은 다음 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) GJTF(J)2YJ (서열 번호: 277);
    (b) Z4YZ3Z5TDZ5X; 또는
    (c) GYTFTDYX (서열 번호: 257) 또는 상기 서열들에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이며; 그리고
    각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  62. 청구항 61에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  63. 청구항 61에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYI (서열 번호: 275)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  64. 청구항 51-63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H2은 다음 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) (J)5GSJ;
    (b) VDPEYZ4Z3T (서열 번호: 264); 또는
    (c) VDPEYGST (서열 번호: 258) 또는 상기 서열들에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산임.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 CDR-H2은 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  66. 청구항 51-65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 (J)5Y를 가지는 CDR-L1;
    (b) 아미노산 서열 (J)2S를 가지는 CDR-L2; 및
    (c) 아미노산 서열 (J)3Y(J)4T를 가지는 CDR-L3.
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산임.
  67. 청구항 51-65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 QNINKZ5 (서열 번호: 268)를 가지는 CDR-L1;
    (b) 아미노산 서열 TYZ3 또는 YTZ3를 가지는 CDR-L2; 및
    (c) 아미노산 서열 CLQZ5VNLXZ3 (서열 번호: 271)를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고;
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 아미노산이고; 그리고
    각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  68. 청구항 51-65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L1;
    (b) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
    (c) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  69. 청구항 66-68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 TYS을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  70. 청구항 66-68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 YTS을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  71. 청구항 66-70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLLT (서열 번호: 272)을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  72. 청구항 66-70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273)을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  73. 청구항 66-72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 상기 CDR-L2의 N-말단에 결합되는 아미노산 서열 LLIR (서열 번호: 262)을 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  74. 청구항 66-72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 상기 CDR-L2의 C-말단에 결합되는 아미노산 서열 TLE를 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  75. 청구항 51-74 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상을 포함하지 않음을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 GFTFSSY (서열 번호: 23)를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 SSGGSY (서열 번호: 24)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 SASSSVYYMY (서열 번호: 26)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 STSNLAS (서열 번호: 27)를 가지는 CDR-L2;
    (e) 아미노산 서열 QQRRNYPYT (서열 번호: 28)를 가지는 CDR-L3;
    (f) 아미노산 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 번호: 29)를 가지는 CDR-L1;
    (g) 아미노산 서열 LASNLES (서열 번호: 30)를 가지는 CDR-L2; 및
    (h) 아미노산 서열 QHSRELPRT (서열 번호: 31)를 가지는 CDR-L3.
  76. 제 1 폴리펩타이드 도메인 및 제 2 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 구조체로서, 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인 및 상기 제 2 폴리펩타이드 도메인은 각각 독립적으로 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드를 포함하는, 구조체.
  77. 청구항 76에 있어서, 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인 및 상기 제 2 폴리펩타이드 도메인은 공유 링커에 의해 결합됨을 특징으로 하는 구조체.
  78. 청구항 77에 있어서, 상기 공유 링커는 아마이드 결합을 포함함을 특징으로 하는 구조체.
  79. 청구항 77에 있어서, 상기 공유 링커는 이황화물 결합을 포함함을 특징으로 하는 구조체.
  80. 청구항 1-32 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  81. 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  82. 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  83. 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  84. 청구항 83에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 발현 벡터는 진핵 발현 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  86. 청구항 83에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 (Ad), 레트로바이러스, 폭스바이러스, 아데노-연관 바이러스, 배큘로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 및 백시니아 바이러스로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 벡터.
  88. 청구항 87에 있어서, 상기 아데노바이러스는 혈청형 5, 26, 35, 또는 48 아데노바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
  89. 청구항 87에 있어서, 상기 레트로바이러스는 γ-레트로바이러스 또는 렌티바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
  90. 청구항 87에 있어서, 상기 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA)임을 특징으로 하는 벡터.
  91. 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
  92. 청구항 91에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  93. 청구항 91에 있어서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  94. 청구항 93에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포을 특징으로 하는 숙주 세포.
  95. 청구항 94에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  96. 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 또는 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  97. 청구항 96에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 추가 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  98. 청구항 97에 있어서, 상기 추가 치료제는 면역요법제임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  99. 청구항 98에 있어서, 상기 면역요법제는 항-CTLA-4 제제, 항-PD-1 제제, 항-PD-L1 제제, 항-PD-L2 제제, TNF-α 교차-결합 제제, TRAIL 교차-결합 제제, 항-CD27 제제, 항-CD30 제제, 항-CD40 제제, 항-4-1BB 제제, 항-GITR 제제, 항-OX40 제제, 항-TRAILR1 제제, 항-TRAILR2 제제, 항-TWEAKR 제제, 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론, 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 및/또는 가바펜틴으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  100. 청구항 1-32 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계 및 숙주 세포 배지로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  101. 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 단쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계 및 숙주 세포 배지로부터 단쇄 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  102. 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계 및 숙주 세포 배지로부터 구조체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  103. 인간에서 조절 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응의 억제 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체, 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 91 및 93-95 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  104. 인간의 세포 증식 장애 치료 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체, 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 91 및 93-95 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  105. 청구항 104에 있어서, 상기 세포 증식 장애는 백혈병, 림프종, 간암, 골암, 폐암, 뇌암, 방광암, 위장관암, 유방암, 심장암, 자궁경부암, 자궁암, 두경부암, 담낭암, 후두암, 구순 및 구강암, 안구암, 흑색종, 이자암, 전립선암, 결장직장암, 고환암, 및 인두암으로 구성된 그룹에서 선택된 암임을 특징으로 하는 방법.
  106. 청구항 104에 있어서, 상기 세포 증식 장애는 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 부신피질 암종, AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 항문암, 충수암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 간외암, 유잉 육종군, 골육종 및 악성 섬유 조직구종, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 생식 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막세포종, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 원발성 림프종, 척삭종, 만성 골수증식성 신생물, 결장 암, 간외 담관암, 제자리 관상 암종 (DCIS), 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 나팔관암, 골의 섬유성 조직구종, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양 (GIST), 고환생식 세포 종양, 임신 영양막병, 교종, 소아기 뇌간 교종, 털 세포 백혈병, 간세포 암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 섬세포 종양, 이자 신경내분비 종양, 윌름스 종양 및 기타 소아기 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 소세포 폐암, 피부 T 세포 림프종, 안구내 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 정중선로(midline tract) 암종, 다발 내분비샘 종양 증후군, 다발 골수종/형질 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 비강 및 부비동암, 코인두 암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 상피성 난소암, 생식 세포 난소 암, 저위험 악성 난소 암, 이자 신경내분비 종양, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 원발성 복막암, 직장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 카포시 육종, 횡문근육종, 세자리 증후군, 소장암, 연조직 육종, 인두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 요도암, 자궁내막 자궁암, 자궁 육종, 질암, 음문암, 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증으로 구성된 그룹에서 선택된 암임을 특징으로 하는 방법.
  107. 인간의 감염 질환 치료 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체, 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 91 및 93-95 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  108. 청구항 107에 있어서, 상기 감염 질환은 바이러스, 세균, 진균, 또는 기생충으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  109. 청구항 108에 있어서, 상기 감염 질환은 C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 카담 바이러스, 키아사누르 삼림병 바이러스, 랑가트 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 포와산 바이러스, 로얄 팜 바이러스, 카르시 바이러스, 진드기 매개 뇌염바이러스, 뉴도에르플 바이러스, 소프진 바이러스, 도약병 (Louping ill) 바이러스, 네기시 바이러스, 메반 바이러스, 사우마레즈 리프 바이러스, 튤레니이 바이러스, 아로아 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 바이러스, 카시파코어 바이러스, 코우탕고 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 야오운데 바이러스, 코코베라 바이러스, 바가자 바이러스, 일레우스 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 바이러스, 템부수 바이러스, 지카 바이러스, 반지 바이러스, 보우보우이 바이러스, 엣지 힐 바이러스, 주그라 바이러스, 사보야 바이러스, 세픽 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 황열병 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 요코세 바이러스, 아포이 바이러스, 카우본 릿지 바이러스, 주티아파 바이러스, 모독 바이러스, 살 비에자 바이러스, 산 페를리타 바이러스, 부칼라사 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 바이러스, 다카르 박쥐 바이러스, 몬타나 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 박쥐 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 세포 융합 제제 바이러스, 이피 바이러스, 라싸 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 아마파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라티노 바이러스, 마추포 바이러스, 올리베로스 바이러스, 파라나 바이러스, 피친데 바이러스, 피리탈 바이러스, 사비아 바이러스, 타카리베 바이러스, 타미아미 바이러스, 화이트워터 아로요 바이러스, 차파레 바이러스, 루요 바이러스, 한탄 바이러스, 신 놈브레 바이러스, 두그베 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 라 크로세 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 크리미언-콩고 출혈열 (CCHF) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE), 신드비스 바이러스, 풍진 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바르마 삼림 바이러스, 오니옹니옹 바이러스, 및 치쿤구니아 바이러스, 천연두 바이러스, 원숭이마마 바이러스, 백시니아 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 수두대상포진 바이러스, 카포시 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV), 인플루엔자 바이러스, 중증 급성 호흡 증후군 (SARS) 바이러스, 광견병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 뉴캐슬병 바이러스, 헨드라바이러스, 니파바이러스, 홍역 바이러스, 린더페스트 바이러스, 개 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 (예컨대, 1, 2, 3, 및 4), 라이노바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 인간 엔테로바이러스 (A, B, C, 및 D), A형 간염 바이러스, 콕사키바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 아스트로바이러스, JC 바이러스, BK 바이러스, SV40 바이러스, 노웍 바이러스, 로타바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T-림프친화 바이러스 I 및 II형, 및 전염성 해면상 뇌염증, 가령, 만성 소모성 질환으로 구성된 그룹에서 선택된 바이러스에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  110. 청구항 108에 있어서, 상기 감염 질환은 살모넬라 (Salmonella), 스트렙토코쿠스 (streptococcus), 바실루스 (bacillus), 리스테리아 (listeria), 코리네박테리움 (corynebacterium), 노카르디아 (nocardia), 나이세리아 (neisseria), 악티노박터 (actinobacter), 모락셀라 (moraxella), 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriacece), 슈도모나스 (pseudomonas), 에스케리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (klebsiella), 세라시아 (Serratia), 엔테로박터 (enterobacter), 프로테우스 (proteus), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (shigella), 예르시니아 (yersinia), 헤모필루스 (haemophilus), 보르다텔라 (bordatella), 레기오넬라 (legionella), 파스퇴렐라 (pasturella), 프란치셀라 (francisella), 브루셀라 (Brucella), 바르토넬라 (bartonella), 클로스트리디움 (clostridium), 비브리오 (vibrio), 캄필로박터 (campylobacter), 및 스타필로코쿠스 (staphylococcus)로 구성된 그룹에서 선택된 속에 속하는 세균에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  111. 청구항 108에 있어서, 상기 감염 질환은 아스페르길루스 (aspergillus), 칸디다 (candida), 말라세지아 (malassezia), 트리코스포론 (trichosporon), 푸사륨 (fusarium), 아크레모니움 (acremonium), 리조푸스 (rhizopus), 무코르 (mucor), 뉴모사이스티스 (pneumocystis), 및 압시디아 (absidia)로 구성된 그룹에서 선택된 진균에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  112. 청구항 108에 있어서, 상기 감염 질환은 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba hystolytica), 지아디아 람블리아 (Giardia lamblia), 크립토스포리디움 무리스 (cryptosporidium muris), 트리파노소마티다 감비엔세 (trypanosomatida gambiense), 트리파노소마티다 로데시엔세 (trypanosomatida rhodesiense), 트리파노소마티다 크루시 (trypanosomatida crusi), 리슈마니아 멕시카나 (leishmania mexicana), 리슈마니아 브라질리엔시스 (leishmania braziliensis), 리슈마니아 트로피카 (leishmania tropica), 리슈마니아 도노바니 (leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디 (toxoplasma gondii), 플라스모디움 비박스 (plasmodium vivax), 플라스모디움 오발레 (plasmodium ovale), 플라스모디움 말라리아에 (plasmodium malariae), 플라스모디움 팔시파룸 (plasmodium falciparum), 질트리코모나스 (trichomonas vaginalis), 및 히스토모나스 멜리아그리디스 (histomonas meleagridis)로 구성된 그룹에서 선택된 기생충에 의해 유발되며, 예시적인 기생충제에는 트리추리스 트리츄라 (richuris trichiura), 아스카리스 룸브리코이데스 (ascaris lumbricoides), 엔테로바이러스 버미큘러리스 (enterobius vermicularis), 안사이클로스토마 두오데날레 (ancylostoma duodenale), 네카토르 아메리카누스 (necator americanus), 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (strongyloides stercoralis), 우체레리아 반크로프티 (wuchereria bancrofti), and 드라쿤쿨루스 메디넨시스 (dracunculus medinensis), 쉬스토소마 만소니 (schistosoma mansoni), 쉬스토소마 해마토비움 (schistosoma haematobium), 쉬스토소마 자포니쿰 (schistosoma japonicum), 파시올라 헤파티카 (fasciola hepatica), 파시올라 기간티카 (fasciola gigantica), 헤테로파이에스 (heterophyes), 파라고니무스 웨스트마니 (paragonimus westermani), 태니아 솔리움 (taenia solium), 태니아 사기나타 (taenia saginata), 히메노렙시스 나나 (hymenolepis nana), 및 에키노코쿠스 그라뉼로수스 (echinococcus granulosus)이 포함됨을 특징으로 하는 방법.
  113. 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체, 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 91 및 93-95 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포함하는, 인간에서 조절 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 저해하기 위한 조성물.
  114. 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체, 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 91 및 93-95 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포함하는, 인간의 세포 증식 장애를 치료하기 위한 조성물.
  115. 청구항 114에 있어서, 상기 세포 증식 장애는 백혈병, 림프종, 간암, 골암, 폐암, 뇌암, 방광암, 위장관암, 유방암, 심장암, 자궁경부암, 자궁암, 두경부암, 담낭암, 후두암, 구순 및 구강암, 안구암, 흑색종, 이자암, 전립선암, 결장직장암, 고환암, 및 인두암으로 구성된 그룹에서 선택된 암임을 특징으로 하는 조성물.
  116. 청구항 114에 있어서, 상기 세포 증식 장애는 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 부신피질 암종, AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 항문암, 충수암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 간외암, 유잉 육종군, 골육종 및 악성 섬유 조직구종, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 생식 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막세포종, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 원발성 림프종, 척삭종, 만성 골수증식성 신생물, 결장 암, 간외 담관암, 제자리 관상 암종 (DCIS), 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 나팔관암, 골의 섬유성 조직구종, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양 (GIST), 고환생식 세포 종양, 임신 영양막병, 교종, 소아기 뇌간 교종, 털 세포 백혈병, 간세포 암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 섬세포 종양, 이자 신경내분비 종양, 윌름스 종양 및 기타 소아기 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 소세포 폐암, 피부 T 세포 림프종, 안구내 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 정중선로(midline tract) 암종, 다발 내분비샘 종양 증후군, 다발 골수종/형질 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 비강 및 부비동암, 코인두 암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 상피성 난소암, 생식 세포 난소 암, 저위험 악성 난소 암, 이자 신경내분비 종양, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 원발성 복막암, 직장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 카포시 육종, 횡문근육종, 세자리 증후군, 소장암, 연조직 육종, 인두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 요도암, 자궁내막 자궁암, 자궁 육종, 질암, 음문암, 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증으로 구성된 그룹에서 선택된 암임을 특징으로 하는 조성물.
  117. 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체, 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 91 및 93-95 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포함하는, 인간의 감염 질환을 치료하기 위한 조성물.
  118. 청구항 117에 있어서, 상기 감염 질환은 바이러스, 세균, 진균, 또는 기생충으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질에 의해 유발됨을 특징으로 하는 조성물.
  119. 청구항 118에 있어서, 상기 감염 질환은 C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 카담 바이러스, 키아사누르 삼림병 바이러스, 랑가트 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 포와산 바이러스, 로얄 팜 바이러스, 카르시 바이러스, 진드기 매개 뇌염바이러스, 뉴도에르플 바이러스, 소프진 바이러스, 도약병 (Louping ill) 바이러스, 네기시 바이러스, 메반 바이러스, 사우마레즈 리프 바이러스, 튤레니이 바이러스, 아로아 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 바이러스, 카시파코어 바이러스, 코우탕고 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 야오운데 바이러스, 코코베라 바이러스, 바가자 바이러스, 일레우스 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 바이러스, 템부수 바이러스, 지카 바이러스, 반지 바이러스, 보우보우이 바이러스, 엣지 힐 바이러스, 주그라 바이러스, 사보야 바이러스, 세픽 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 황열병 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 요코세 바이러스, 아포이 바이러스, 카우본 릿지 바이러스, 주티아파 바이러스, 모독 바이러스, 살 비에자 바이러스, 산 페를리타 바이러스, 부칼라사 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 바이러스, 다카르 박쥐 바이러스, 몬타나 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 박쥐 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 세포 융합 제제 바이러스, 이피 바이러스, 라싸 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 아마파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라티노 바이러스, 마추포 바이러스, 올리베로스 바이러스, 파라나 바이러스, 피친데 바이러스, 피리탈 바이러스, 사비아 바이러스, 타카리베 바이러스, 타미아미 바이러스, 화이트워터 아로요 바이러스, 차파레 바이러스, 루요 바이러스, 한탄 바이러스, 신 놈브레 바이러스, 두그베 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 라 크로세 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 크리미언-콩고 출혈열 (CCHF) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE), 신드비스 바이러스, 풍진 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바르마 삼림 바이러스, 오니옹니옹 바이러스, 및 치쿤구니아 바이러스, 천연두 바이러스, 원숭이마마 바이러스, 백시니아 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 수두대상포진 바이러스, 카포시 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV), 인플루엔자 바이러스, 중증 급성 호흡 증후군 (SARS) 바이러스, 광견병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 뉴캐슬병 바이러스, 헨드라바이러스, 니파바이러스, 홍역 바이러스, 린더페스트 바이러스, 개 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 (예컨대, 1, 2, 3, 및 4), 라이노바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 인간 엔테로바이러스 (A, B, C, 및 D), A형 간염 바이러스, 콕사키바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 아스트로바이러스, JC 바이러스, BK 바이러스, SV40 바이러스, 노웍 바이러스, 로타바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T-림프친화 바이러스 I 및 II형, 및 전염성 해면상 뇌염증, 가령, 만성 소모성 질환으로 구성된 그룹에서 선택된 바이러스에 의해 유발됨을 특징으로 하는 조성물.
  120. 청구항 118에 있어서, 상기 감염 질환은 살모넬라 (Salmonella), 스트렙토코쿠스 (streptococcus), 바실루스 (bacillus), 리스테리아 (listeria), 코리네박테리움 (corynebacterium), 노카르디아 (nocardia), 나이세리아 (neisseria), 악티노박터 (actinobacter), 모락셀라 (moraxella), 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriacece), 슈도모나스 (pseudomonas), 에스케리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (klebsiella), 세라시아 (Serratia), 엔테로박터 (enterobacter), 프로테우스 (proteus), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (shigella), 예르시니아 (yersinia), 헤모필루스 (haemophilus), 보르다텔라 (bordatella), 레기오넬라 (legionella), 파스퇴렐라 (pasturella), 프란치셀라 (francisella), 브루셀라 (Brucella), 바르토넬라 (bartonella), 클로스트리디움 (clostridium), 비브리오 (vibrio), 캄필로박터 (campylobacter), 및 스타필로코쿠스 (staphylococcus)로 구성된 그룹에서 선택된 속에 속하는 세균에 의해 유발됨을 특징으로 하는 조성물.
  121. 청구항 118에 있어서, 상기 감염 질환은 아스페르길루스 (aspergillus), 칸디다 (candida), 말라세지아 (malassezia), 트리코스포론 (trichosporon), 푸사륨 (fusarium), 아크레모니움 (acremonium), 리조푸스 (rhizopus), 무코르 (mucor), 뉴모사이스티스 (pneumocystis), 및 압시디아 (absidia)로 구성된 그룹에서 선택된 진균에 의해 유발됨을 특징으로 하는 조성물.
  122. 청구항 118에 있어서, 상기 감염 질환은 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba hystolytica), 지아디아 람블리아 (Giardia lamblia), 크립토스포리디움 무리스 (cryptosporidium muris), 트리파노소마티다 감비엔세 (trypanosomatida gambiense), 트리파노소마티다 로데시엔세 (trypanosomatida rhodesiense), 트리파노소마티다 크루시 (trypanosomatida crusi), 리슈마니아 멕시카나 (leishmania mexicana), 리슈마니아 브라질리엔시스 (leishmania braziliensis), 리슈마니아 트로피카 (leishmania tropica), 리슈마니아 도노바니 (leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디 (toxoplasma gondii), 플라스모디움 비박스 (plasmodium vivax), 플라스모디움 오발레 (plasmodium ovale), 플라스모디움 말라리아에 (plasmodium malariae), 플라스모디움 팔시파룸 (plasmodium falciparum), 질트리코모나스 (trichomonas vaginalis), 및 히스토모나스 멜리아그리디스 (histomonas meleagridis)로 구성된 그룹에서 선택된 기생충에 의해 유발되며, 예시적인 기생충제에는 트리추리스 트리츄라 (richuris trichiura), 아스카리스 룸브리코이데스 (ascaris lumbricoides), 엔테로바이러스 버미큘러리스 (enterobius vermicularis), 안사이클로스토마 두오데날레 (ancylostoma duodenale), 네카토르 아메리카누스 (necator americanus), 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (strongyloides stercoralis), 우체레리아 반크로프티 (wuchereria bancrofti), and 드라쿤쿨루스 메디넨시스 (dracunculus medinensis), 쉬스토소마 만소니 (schistosoma mansoni), 쉬스토소마 해마토비움 (schistosoma haematobium), 쉬스토소마 자포니쿰 (schistosoma japonicum), 파시올라 헤파티카 (fasciola hepatica), 파시올라 기간티카 (fasciola gigantica), 헤테로파이에스 (heterophyes), 파라고니무스 웨스트마니 (paragonimus westermani), 태니아 솔리움 (taenia solium), 태니아 사기나타 (taenia saginata), 히메노렙시스 나나 (hymenolepis nana), 및 에키노코쿠스 그라뉼로수스 (echinococcus granulosus)이 포함됨을 특징으로 하는 조성물.
  123. 청구항 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드, 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체, 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 91 및 93-95 중 어느 한 항의 숙주 세포, 및 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물로 구성된 그룹에서 선택된 제제를 포함하는 키트.
  124. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 1-32 및 45-50 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  125. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 청구항 51-75 중 어느 한 항의 단쇄 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  126. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 청구항 76-79 중 어느 한 항의 구조체를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  127. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 청구항 80-82 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  128. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 청구항 83-90 중 어느 한 항의 벡터를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  129. 청구항 128에 있어서, 상기 키트는 상기 벡터를 숙주 세포에 형질감염시키기 위한 지시사항을 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.
  130. 청구항 129에 있어서, 상기 키트는 상기 숙주 세포에서 상기 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체를 발현시키기 위한 지시사항을 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.
  131. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 청구항 91-95 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  132. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 청구항 96-99 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  133. 청구항 123에 있어서, 상기 키트는 상기 숙주 세포에서 상기 항체, 이의 항원-결합 단편, 단쇄 폴리펩타이드, 또는 구조체를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 시약을 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.
  134. 청구항 123에 있어서, 인간 환자에게 상기 제제를 투여하기 위한 지시사항을 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.
  135. 청구항 123에 있어서, 상기 제제를 제조 또는 사용하기 위한 지시사항을 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.
  136. 청구항 1에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  137. 청구항 1에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  138. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GJTF(J)2YJ (서열 번호: 277)을 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 (J)5GSJ을 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 (J)5Y를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 (J)2S를 가지는 CDR-L2; 및
    (e) 아미노산 서열 (J)3Y(J)4T를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산임.
  139. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 Z4YZ3Z5TDZ5X를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 VDPEYZ4Z3T (서열 번호: 264)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 QNINKZ5 (서열 번호: 268)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 TYZ3 또는 YTZ3를 가지는 CDR-L2; 및
    (e) 아미노산 서열 CLQZ5VNLXZ3 (서열 번호: 271)를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고;
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 아미노산이고; 그리고
    각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  140. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
    (e) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  141. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상 또는 모두를 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257)를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
    (e) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261)를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  142. 청구항 141에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  143. 청구항 141에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYI (서열 번호: 275)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  144. 청구항 141에 있어서, 상기 CDR-L2은 아미노산 서열 TYS을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  145. 청구항 141에 있어서, 상기 CDR-L2은 아미노산 서열 YTS을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  146. 청구항 141에 있어서, 상기 CDR-L3은 아미노산 서열 CLQYVNLLT (서열 번호: 272)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  147. 청구항 141에 있어서, 상기 CDR-L3은 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273)을 가짐을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  148. 청구항 141에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 CDR-L2의 N-말단에 결합된 아미노산 서열 LLIR (서열 번호: 262)을 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  149. 청구항 141에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 CDR-L2의 C-말단에 결합된 아미노산 서열 TLE를 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  150. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 영역들 (CDRs) 중 하나 이상을 포함하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 아미노산 서열 GFTFSSY (서열 번호: 23)를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 SSGGSY (서열 번호: 24)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 SASSSVYYMY (서열 번호: 26)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 STSNLAS (서열 번호: 27)를 가지는 CDR-L2;
    (e) 아미노산 서열 QQRRNYPYT (서열 번호: 28)를 가지는 CDR-L3;
    (f) 아미노산 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 번호: 29)를 포함하는 CDR-L1;
    (g) 아미노산 서열 LASNLES (서열 번호: 30)를 포함하는 CDR-L2; 및
    (h) 아미노산 서열 QHSRELPRT (서열 번호: 31)를 포함하는 CDR-L3.
  151. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-고유 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  152. 청구항 151에 있어서, 상기 비-고유 불변 영역은 인간 불변 영역임을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  153. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 도메인 모두 또는 일부가 없거나, 고유 Fc 도메인 모두 또는 일부가 없거나, 또는 Fc 도메인이 모두 없음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  154. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 11, 19, 20, 및 34-117 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 약 100 nM 미만의 KD로 특이적으로 결합하며 서열 번호: 7의 아미노산 56-60 (KCSPG)을 포함하는 펩타이드에 결합하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  155. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 7의 아미노산 142-146 (KCRPG) 중 하나 이상을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하며 서열 번호: 7의 아미노산 56-60 (KCSPG)을 포함하는 펩타이드에 결합하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  156. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR2 신호전달을 저해함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  157. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CHUK, NFKBIE, NFKBIA, MAP3K11, TRAF2, TRAF3, relB, 및 cIAP2/BIRC3으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 유전자들의 발현을 저해함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  158. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 NFkB 활성화를 저해함을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  159. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  160. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TNFR2를 발현시키는 암 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  161. 청구항 160에 있어서, 상기 암 세포는 T 세포 림프종 세포, 가령, 호지킨 또는 피부 비-호지킨 림프종 세포, 난소 암 세포, 결장 암 세포, 다발 골수종 세포, 및 신장 세포 암종 세포로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  162. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 골수-유래 억제 세포의 증식을 감소 또는 저해할 수 있음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  163. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T-조절 세포의 증식을 감소 또는 저해하기 위하여 TNFα를 필요로 하지 않음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  164. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 작동자 세포를 직접 확대시킬 수 있음을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  165. 청구항 51-56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3의 존재하에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 LRKCRPGFGVA (서열 번호: 285) 또는 VVCKPCAPGTFSN (서열 번호: 286)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있음을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  166. 청구항 51에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYWG (서열 번호: 259)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  167. 청구항 51에 있어서, 상기 CDR-H3는 아미노산 서열 ARDDGSYSPFDYFG (서열 번호: 284)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  168. 청구항 51에 있어서, 상기 CDR-H1은 다음 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) GJTF(J)2YJ (서열 번호: 277);
    (b) Z4YZ3Z5TDZ5X; 또는
    (c) GYTFTDYX (서열 번호: 257) 또는 상기 서열들에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이며; 그리고
    각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  169. 청구항 168에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYX (서열 번호: 257)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  170. 청구항 169에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYL (서열 번호: 274)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  171. 청구항 169에 있어서, 상기 CDR-H1은 아미노산 서열 GYTFTDYI (서열 번호: 275)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  172. 청구항 51에 있어서, 상기 CDR-H2는 다음 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) (J)5GSJ;
    (b) VDPEYZ4Z3T (서열 번호: 264); 또는
    (c) VDPEYGST (서열 번호: 258) 또는 상기 서열들에 대해 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열;
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고; 그리고
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 자연 발생 아미노산임.
  173. 청구항 172에 있어서, 상기 CDR-H2은 아미노산 서열 VDPEYGST (서열 번호: 258)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  174. 청구항 51에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 (J)5Y를 가지는 CDR-L1;
    (b) 아미노산 서열 (J)2S를 가지는 CDR-L2; 및
    (c) 아미노산 서열 (J)3Y(J)4T를 가지는 CDR-L3.
    이 때 각 J는 독립적으로 자연 발생 아미노산임.
  175. 청구항 51에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 QNINKZ5 (서열 번호: 268)를 가지는 CDR-L1;
    (b) 아미노산 서열 TYZ3 또는 YTZ3를 가지는 CDR-L2; 및
    (c) 아미노산 서열 CLQZ5VNLXZ3 (서열 번호: 271)를 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 Z1은 생리학적 pH에서 양이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z2는 독립적으로 생리학적 pH에서 음이온 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z3는 독립적으로 생리학적 pH에서 극성의, 하전되지 않은 측쇄를 포함하는 아미노산이고;
    각 Z4는 독립적으로 글라이신 또는 알라닌이고;
    각 Z5는 독립적으로 소수성 측쇄를 포함하는 아미노산이고; 그리고
    각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  176. 청구항 51에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 QNINKY (서열 번호: 260) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L1;
    (b) 아미노산 서열 TYS 또는 YTS를 가지는 CDR-L2; 그리고
    (c) 아미노산 서열 CLQYVNLXT (서열 번호: 261) 또는 상기 서열에 대한 최대 2개 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가지는 CDR-L3;
    이 때 각 X는 독립적으로 류신 또는 아이소류신임.
  177. 청구항 174에 있어서, 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 TYS을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  178. 청구항 174에 있어서, 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 YTS을 가짐을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  179. 청구항 174에 있어서, 상기 CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLLT (서열 번호: 272)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  180. 청구항 174에 있어서, 상기 CDR-L3는 아미노산 서열 CLQYVNLIT (서열 번호: 273)를 가짐을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드.
  181. 청구항 174에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 상기 CDR-L2의 N-말단에 결합되는 아미노산 서열 LLIR (서열 번호: 262)을 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  182. 청구항 174에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 상기 CDR-L2의 C-말단에 결합되는 아미노산 서열 TLE를 포함하는 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는, 단쇄 폴리펩타이드.
  183. 청구항 51에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩타이드는 다음 CDRs 중 하나 이상을 포함하지 않음을 특징으로 하는 단쇄 폴리펩타이드:
    (a) 아미노산 서열 GFTFSSY (서열 번호: 23)를 가지는 CDR-H1;
    (b) 아미노산 서열 SSGGSY (서열 번호: 24)를 가지는 CDR-H2;
    (c) 아미노산 서열 SASSSVYYMY (서열 번호: 26)를 가지는 CDR-L1;
    (d) 아미노산 서열 STSNLAS (서열 번호: 27)를 가지는 CDR-L2;
    (e) 아미노산 서열 QQRRNYPYT (서열 번호: 28)를 가지는 CDR-L3;
    (f) 아미노산 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 번호: 29)를 가지는 CDR-L1;
    (g) 아미노산 서열 LASNLES (서열 번호: 30)를 가지는 CDR-L2; 및
    (h) 아미노산 서열 QHSRELPRT (서열 번호: 31)를 가지는 CDR-L3.
  184. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 조절 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응의 억제 방법.
  185. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 세포 증식 장애 치료 방법.
  186. 청구항 185에 있어서, 상기 세포 증식 장애는 백혈병, 림프종, 간암, 골암, 폐암, 뇌암, 방광암, 위장관암, 유방암, 심장암, 자궁경부암, 자궁암, 두경부암, 담낭암, 후두암, 구순 및 구강암, 안구암, 흑색종, 이자암, 전립선암, 결장직장암, 고환암, 및 인두암으로 구성된 그룹에서 선택된 암임을 특징으로 하는 방법.
  187. 청구항 185에 있어서, 상기 세포 증식 장애는 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 부신피질 암종, AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 항문암, 충수암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 간외암, 유잉 육종군, 골육종 및 악성 섬유 조직구종, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 생식 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막세포종, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 원발성 림프종, 척삭종, 만성 골수증식성 신생물, 결장 암, 간외 담관암, 제자리 관상 암종 (DCIS), 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 나팔관암, 골의 섬유성 조직구종, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양 (GIST), 고환생식 세포 종양, 임신 영양막병, 교종, 소아기 뇌간 교종, 털 세포 백혈병, 간세포 암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 섬세포 종양, 이자 신경내분비 종양, 윌름스 종양 및 기타 소아기 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 소세포 폐암, 피부 T 세포 림프종, 안구내 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 정중선로(midline tract) 암종, 다발 내분비샘 종양 증후군, 다발 골수종/형질 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 비강 및 부비동암, 코인두 암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 상피성 난소암, 생식 세포 난소 암, 저위험 악성 난소 암, 이자 신경내분비 종양, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 원발성 복막암, 직장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 카포시 육종, 횡문근육종, 세자리 증후군, 소장암, 연조직 육종, 인두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 요도암, 자궁내막 자궁암, 자궁 육종, 질암, 음문암, 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증으로 구성된 그룹에서 선택된 암임을 특징으로 하는 방법.
  188. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 감염 질환 치료 방법.
  189. 청구항 188에 있어서, 상기 감염 질환은 바이러스, 세균, 진균, 또는 기생충으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  190. 청구항 189에 있어서, 상기 감염 질환은 C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 카담 바이러스, 키아사누르 삼림병 바이러스, 랑가트 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 포와산 바이러스, 로얄 팜 바이러스, 카르시 바이러스, 진드기 매개 뇌염바이러스, 뉴도에르플 바이러스, 소프진 바이러스, 도약병 (Louping ill) 바이러스, 네기시 바이러스, 메반 바이러스, 사우마레즈 리프 바이러스, 튤레니이 바이러스, 아로아 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 바이러스, 카시파코어 바이러스, 코우탕고 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 야오운데 바이러스, 코코베라 바이러스, 바가자 바이러스, 일레우스 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 바이러스, 템부수 바이러스, 지카 바이러스, 반지 바이러스, 보우보우이 바이러스, 엣지 힐 바이러스, 주그라 바이러스, 사보야 바이러스, 세픽 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 황열병 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 요코세 바이러스, 아포이 바이러스, 카우본 릿지 바이러스, 주티아파 바이러스, 모독 바이러스, 살 비에자 바이러스, 산 페를리타 바이러스, 부칼라사 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 바이러스, 다카르 박쥐 바이러스, 몬타나 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 박쥐 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 세포 융합 제제 바이러스, 이피 바이러스, 라싸 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 아마파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라티노 바이러스, 마추포 바이러스, 올리베로스 바이러스, 파라나 바이러스, 피친데 바이러스, 피리탈 바이러스, 사비아 바이러스, 타카리베 바이러스, 타미아미 바이러스, 화이트워터 아로요 바이러스, 차파레 바이러스, 루요 바이러스, 한탄 바이러스, 신 놈브레 바이러스, 두그베 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 라 크로세 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 크리미언-콩고 출혈열 (CCHF) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE), 신드비스 바이러스, 풍진 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바르마 삼림 바이러스, 오니옹니옹 바이러스, 및 치쿤구니아 바이러스, 천연두 바이러스, 원숭이마마 바이러스, 백시니아 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 수두대상포진 바이러스, 카포시 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV), 인플루엔자 바이러스, 중증 급성 호흡 증후군 (SARS) 바이러스, 광견병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 뉴캐슬병 바이러스, 헨드라바이러스, 니파바이러스, 홍역 바이러스, 린더페스트 바이러스, 개 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 (예컨대, 1, 2, 3, 및 4), 라이노바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 인간 엔테로바이러스 (A, B, C, 및 D), A형 간염 바이러스, 콕사키바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 아스트로바이러스, JC 바이러스, BK 바이러스, SV40 바이러스, 노웍 바이러스, 로타바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T-림프친화 바이러스 I 및 II형, 및 전염성 해면상 뇌염증, 가령, 만성 소모성 질환으로 구성된 그룹에서 선택된 바이러스에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  191. 청구항 189에 있어서, 상기 감염 질환은 살모넬라 (Salmonella), 스트렙토코쿠스 (streptococcus), 바실루스 (bacillus), 리스테리아 (listeria), 코리네박테리움 (corynebacterium), 노카르디아 (nocardia), 나이세리아 (neisseria), 악티노박터 (actinobacter), 모락셀라 (moraxella), 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriacece), 슈도모나스 (pseudomonas), 에스케리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (klebsiella), 세라시아 (Serratia), 엔테로박터 (enterobacter), 프로테우스 (proteus), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (shigella), 예르시니아 (yersinia), 헤모필루스 (haemophilus), 보르다텔라 (bordatella), 레기오넬라 (legionella), 파스퇴렐라 (pasturella), 프란치셀라 (francisella), 브루셀라 (Brucella), 바르토넬라 (bartonella), 클로스트리디움 (clostridium), 비브리오 (vibrio), 캄필로박터 (campylobacter), 및 스타필로코쿠스 (staphylococcus)로 구성된 그룹에서 선택된 속에 속하는 세균에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  192. 청구항 189에 있어서, 상기 감염 질환은 아스페르길루스 (aspergillus), 칸디다 (candida), 말라세지아 (malassezia), 트리코스포론 (trichosporon), 푸사륨 (fusarium), 아크레모니움 (acremonium), 리조푸스 (rhizopus), 무코르 (mucor), 뉴모사이스티스 (pneumocystis), 및 압시디아 (absidia)로 구성된 그룹에서 선택된 진균에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
  193. 청구항 189에 있어서, 상기 감염 질환은 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba hystolytica), 지아디아 람블리아 (Giardia lamblia), 크립토스포리디움 무리스 (cryptosporidium muris), 트리파노소마티다 감비엔세 (trypanosomatida gambiense), 트리파노소마티다 로데시엔세 (trypanosomatida rhodesiense), 트리파노소마티다 크루시 (trypanosomatida crusi), 리슈마니아 멕시카나 (leishmania mexicana), 리슈마니아 브라질리엔시스 (leishmania braziliensis), 리슈마니아 트로피카 (leishmania tropica), 리슈마니아 도노바니 (leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디 (toxoplasma gondii), 플라스모디움 비박스 (plasmodium vivax), 플라스모디움 오발레 (plasmodium ovale), 플라스모디움 말라리아에 (plasmodium malariae), 플라스모디움 팔시파룸 (plasmodium falciparum), 질트리코모나스 (trichomonas vaginalis), 및 히스토모나스 멜리아그리디스 (histomonas meleagridis)로 구성된 그룹에서 선택된 기생충에 의해 유발되며, 예시적인 기생충제에는 트리추리스 트리츄라 (richuris trichiura), 아스카리스 룸브리코이데스 (ascaris lumbricoides), 엔테로바이러스 버미큘러리스 (enterobius vermicularis), 안사이클로스토마 두오데날레 (ancylostoma duodenale), 네카토르 아메리카누스 (necator americanus), 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (strongyloides stercoralis), 우체레리아 반크로프티 (wuchereria bancrofti), and 드라쿤쿨루스 메디넨시스 (dracunculus medinensis), 쉬스토소마 만소니 (schistosoma mansoni), 쉬스토소마 해마토비움 (schistosoma haematobium), 쉬스토소마 자포니쿰 (schistosoma japonicum), 파시올라 헤파티카 (fasciola hepatica), 파시올라 기간티카 (fasciola gigantica), 헤테로파이에스 (heterophyes), 파라고니무스 웨스트마니 (paragonimus westermani), 태니아 솔리움 (taenia solium), 태니아 사기나타 (taenia saginata), 히메노렙시스 나나 (hymenolepis nana), 및 에키노코쿠스 그라뉼로수스 (echinococcus granulosus)이 포함됨을 특징으로 하는 방법.
KR1020187036235A 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체 Active KR102410778B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020227020235A KR20220088515A (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662336468P 2016-05-13 2016-05-13
US62/336,468 2016-05-13
US201762457496P 2017-02-10 2017-02-10
US62/457,496 2017-02-10
PCT/US2017/032513 WO2017197331A2 (en) 2016-05-13 2017-05-12 Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227020235A Division KR20220088515A (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190016966A true KR20190016966A (ko) 2019-02-19
KR102410778B1 KR102410778B1 (ko) 2022-06-21

Family

ID=60266830

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187036235A Active KR102410778B1 (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체
KR1020227020235A Ceased KR20220088515A (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체
KR1020247041916A Pending KR20250007678A (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체
KR1020247019918A Active KR102745778B1 (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227020235A Ceased KR20220088515A (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체
KR1020247041916A Pending KR20250007678A (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체
KR1020247019918A Active KR102745778B1 (ko) 2016-05-13 2017-05-12 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11859002B2 (ko)
EP (1) EP3455262A4 (ko)
KR (4) KR102410778B1 (ko)
CN (3) CN116715767A (ko)
AU (2) AU2017263833B2 (ko)
CA (1) CA3023930A1 (ko)
WO (1) WO2017197331A2 (ko)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2953634T3 (pl) 2013-02-07 2021-11-22 The General Hospital Corporation Sposoby namnażania lub zubożania limfocytów t-regulatorowych
CN115043943A (zh) 2015-05-15 2022-09-13 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
CN116715767A (zh) 2016-05-13 2023-09-08 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
WO2018013611A1 (en) * 2016-07-11 2018-01-18 Corvus Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd73 antibodies
CN108484773B (zh) * 2018-03-12 2021-07-06 安徽合创健康生物技术有限公司 一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途
EP3840782A4 (en) * 2018-08-20 2022-06-08 The General Hospital Corporation TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY ANTAGONIST POLYPEPTIDES
JP2022502076A (ja) * 2018-09-18 2022-01-11 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 抗ｔｎｆｒ２抗体およびその使用
CA3117864A1 (en) * 2018-11-01 2020-05-07 Bioinvent International Ab Novel antagonistic anti tnfr2 antibody molecules
WO2020089473A2 (en) * 2018-11-01 2020-05-07 Bioinvent International Ab Novel agonistic antibody molecules
JP7652690B2 (ja) * 2018-11-15 2025-03-27 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション アゴニスト性腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーポリペプチド
AU2020324183B2 (en) * 2019-08-02 2024-11-21 Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-TNFR2 antibody and use thereof
KR20220071214A (ko) * 2019-09-17 2022-05-31 아펙시젠, 인코포레이티드 항-tnfr2 항체 및 사용 방법
GB201917630D0 (en) * 2019-12-03 2020-01-15 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for determination of aggregates
WO2022003693A1 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 Biolojic Design Ltd. Anti-tumor necrosis factor receptor (tnfr2) antibodies and uses thereof
IL300930A (en) 2020-08-27 2023-04-01 Enosi Therapeutics Corp Methods and compositions for the treatment of autoimmune diseases and cancer
CN114605367B (zh) * 2020-12-03 2023-06-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 含香豆素的连接子及含该连接子的抗体偶联药物
WO2022161425A1 (zh) * 2021-01-29 2022-08-04 江苏先声药业有限公司 抗tnfr2人源化抗体及其用途
CN115925929A (zh) 2021-09-22 2023-04-07 上海康岱生物医药技术股份有限公司 抗tnfr2单克隆抗体及其应用
CN118369346A (zh) * 2021-12-14 2024-07-19 山东先声生物制药有限公司 一种用于检测血清中sTNFR2的抗体及试剂盒
TW202333788A (zh) * 2021-12-28 2023-09-01 大陸商江蘇先聲藥業有限公司 一種抗ｔｎｆｒ２抗體藥物組合物
CN116514913B (zh) * 2023-06-07 2025-03-21 澳门大学 具有抗肿瘤活性的tnfr2靶向肽及其应用
WO2025049818A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Enosi Therapeutics Corporation Tnfr1 antagonists lacking agonist activity and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150366909A1 (en) * 2013-02-07 2015-12-24 The General Hospital Corporation Methods for expansion or depletion of t-regulatory cells

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4309418A (en) 1980-03-25 1982-01-05 Sloan-Kettering Research Institute For Cancer Anti-tumor agent from human serum and process
FR2513124B1 (fr) 1981-07-21 1989-11-17 Hayashibara Biochem Lab Production et applications du facteur de lyse des cellules-cibles
US4457916A (en) 1982-08-31 1984-07-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for stabilizing Tumor Necrosis Factor and a stable aqueous solution or powder containing the same
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5288852A (en) 1984-03-06 1994-02-22 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Human tumor necrosis factor polypeptides
US4879226A (en) 1984-04-06 1989-11-07 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel human physiologically active polypeptide
DE3423234A1 (de) 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4677064A (en) 1984-11-09 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
DE3585690D1 (de) 1984-12-21 1992-04-23 Biogen Inc Reinigung, herstellung und verwendung von tumor-nekrosisfaktoren.
US4681760A (en) 1985-04-17 1987-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of conferring immunotolerance to a specific antigen
US5059530A (en) 1985-09-30 1991-10-22 Suntory Ltd. Expression vector for human TNF
US5002876A (en) 1986-09-22 1991-03-26 Phillips Petroleum Company Yeast production of human tumor necrosis factor
US4985241A (en) 1986-11-21 1991-01-15 Cetus Corporation Therapeutic combination of free-radical scavenger and tumor necrosis factor
US4963354A (en) 1987-01-21 1990-10-16 Genentech, Inc. Use of tumor necrosis factor (TNF) as an adjuvant
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5215743A (en) 1988-04-13 1993-06-01 Maninder Singh Tumor necrosis factor formulations
US5370870A (en) 1989-10-06 1994-12-06 Genentech, Inc. Method for protection against reactive oxygen species
US5283058A (en) 1990-08-30 1994-02-01 The General Hospital Corporation Methods for inhibiting rejection of transplanted tissue
US5593698A (en) 1990-10-31 1997-01-14 Autoimmune, Inc. Suppression of proliferative response and induction of tolerance with polymorphic class II MHC allopeptides
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
DE69232798T2 (de) 1991-08-02 2003-07-24 Denise L Faustman Diagnose und behandlung von autoimmunkrankheiten
US6984380B1 (en) 1991-08-02 2006-01-10 Denise L. Faustman Treatment of diseases involving faulty MHC class I antigen complex presentation
US5139481A (en) 1991-08-07 1992-08-18 The General Hospital Corporation Treatment for type II diabetes
US5843425A (en) 1992-02-19 1998-12-01 The General Hospital Corporation Transplantation and graft-versus-host-disease
RU2180850C2 (ru) 1992-04-23 2002-03-27 Слоан-Кеттеринг Институт фор Кансер Рисерч Фармацевтическая композиция, содержащая c-kit-лиганд и гемопоэтический фактор, способ повышения уровней стволовых клеток в периферической крови, антагонист c-kit-лиганда, антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты, способ увеличения уровней клеток периферической крови ex-vivo
US5939532A (en) 1993-09-07 1999-08-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Humanized antibodies to ganglioside GM2
WO1994009137A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Genentech, Inc. Antibodies against type 2 tumor necrosis factor receptor
US5843452A (en) 1992-11-09 1998-12-01 Pharmagenesis, Inc. Immunotherapy composition and method
DE69423806T2 (de) 1993-01-22 2000-08-17 Kanegafuchi Chemical Ind Therapeutisches Agens für NIDDM
US5728385A (en) 1993-08-12 1998-03-17 Classen Immunotherapies, Inc. Method and composition for an early vaccine to protect against both common infectious diseases and chronic immune mediated disorders or their sequelae
US5693617A (en) 1994-03-15 1997-12-02 Proscript, Inc. Inhibitors of the 26s proteolytic complex and the 20s proteasome contained therein
US6660268B1 (en) 1994-03-18 2003-12-09 The President And Fellows Of Harvard College Proteasome regulation of NF-KB activity
US5874301A (en) 1994-11-21 1999-02-23 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
WO1997008328A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Selective elimination of t cells that recognize specific preselected targets
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
US5874306A (en) 1996-12-12 1999-02-23 The Regents Of The University Of California Culturing human pancreatic endocrine cells in medium containing extracellular matrix from human bladder carcinoma cells
AU6241698A (en) 1997-01-21 1998-08-07 Human Genome Sciences, Inc. Tace-like and matrilysin-like polypeptides
US6177076B1 (en) 1997-12-09 2001-01-23 Thomas Jefferson University Method of treating bladder cancer with wild type vaccinia virus
US6617171B2 (en) 1998-02-27 2003-09-09 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing and treating autoimmune disease
US6165737A (en) 1998-04-16 2000-12-26 The University Of Texas System Board Of Regents DNA fragmentation factor involved in apoptosis
US6284879B1 (en) 1998-04-16 2001-09-04 The General Hospital Corporation Transport associated protein splice variants
AU768656B2 (en) 1998-04-17 2003-12-18 University Of Vermont And State Agricultural College, The Methods and products related to metabolic interactions in disease
CA2328509A1 (en) 1998-05-18 1999-11-25 Applied Research Systems Ars Holding N.V Methods and use of compositions comprising tnf-rii(p75) agonists for treating asthma and other allergic conditions
US7485293B1 (en) 1999-02-18 2009-02-03 Faustman Denise L Method for inhibiting transplant rejection
US6599710B1 (en) 1999-03-10 2003-07-29 The General Hospital Corporation Treatment of autoimmune disease
US7015037B1 (en) 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
JP3589912B2 (ja) 1999-09-03 2004-11-17 泰久 福井 ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識するモノクローナル抗体
CA2392615A1 (en) 1999-12-06 2001-06-07 The General Hospital Corporation Pancreatic stem cells and their use in transplantation
CA2394536A1 (en) 1999-12-16 2001-06-21 Amgen Inc. Tnfr/opg-like molecules and uses thereof
US6414218B1 (en) 2000-01-18 2002-07-02 The General Hospital Corporation Mouse model for rheumatoid arthritis
WO2001091793A1 (en) 2000-05-26 2001-12-06 Smithkline Beecham Corporation Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders
WO2002026819A2 (en) 2000-09-26 2002-04-04 Roger Williams Hospital Recombinant bcg vaccines for the prevention and treatment of cancer
US20040031066A9 (en) 2001-01-18 2004-02-12 Faustman Denise L. Mouse model for rheumatoid arthritis
US7582313B2 (en) 2002-06-27 2009-09-01 The General Hospital Corporation Methods of organ regeneration using Hox 11-expressing pluripotent cells
US7628988B2 (en) 2002-06-27 2009-12-08 The General Hospital Corporation Methods and compositions for treating type 1 diabetes
US20040229785A1 (en) 2002-11-15 2004-11-18 Denise Faustman Screening methods to identify treatments for autoimmune disease
WO2005030040A2 (en) 2003-09-26 2005-04-07 The Regents Of The University Of Michigan Hematopoietic stem cell identification and isolation
JPWO2005035578A1 (ja) 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する抗体組成物
US8563308B2 (en) 2004-03-10 2013-10-22 The Rockefeller University Culture-expanded T suppressor cells and methods of use thereof
CA2568344C (en) 2004-05-27 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
CN101084014A (zh) 2004-10-08 2007-12-05 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
US20080102054A1 (en) 2005-01-18 2008-05-01 Faustman Denise L Compositions Containing Agm Cells And Methods Of Use Thereof
CA2605253C (en) 2005-04-11 2017-06-13 Yale University Selective modulation of tumour necrosis factor receptors in therapy
EP2107115A1 (en) 2007-01-24 2009-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2
US20090136470A1 (en) 2007-06-13 2009-05-28 Hilde Cheroutre Regulatory t cells and methods of making and using same
WO2009012488A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Duke University Assay for human anti-egrf variant iii antibodies
US8314213B2 (en) 2008-04-18 2012-11-20 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
EP2419121B1 (en) 2009-04-17 2018-07-18 New York University Peptides targeting tnf family receptors and antagonizing tnf action, compositions, methods and uses thereof
WO2010124262A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Allostera Pharma Inc. Methods of identification of allosteramers and uses thereof
WO2010126967A1 (en) 2009-04-28 2010-11-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Ex-vivo treatment of immunological disorders with pkc-theta inhibitors
EP2431463A4 (en) * 2009-05-13 2012-12-26 Shionogi & Co TESTS FOR VISCERAL ADIPOSITAS AND ITS USE
US8653242B2 (en) 2010-03-01 2014-02-18 Lostam Pharmaceuticals Ltd. Therapeutic antibodies against flagellated Pseudomonas aeruginosa
PL2542590T5 (pl) 2010-03-05 2020-08-10 The Johns Hopkins University Kompozycje i sposoby dla ukierunkowanych immunomodulatorowych przeciwciał i białek fuzyjnych
US20130064831A1 (en) 2010-05-17 2013-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Immunotherapeutic dosing regimens and combinations thereof
PL2616489T3 (pl) 2010-09-16 2017-07-31 Baliopharm Ag Przeciwciało anty-huTNFR1
US20140121123A1 (en) 2010-10-29 2014-05-01 Kevin Caili Wang Methods for diversifying antibodies, antibodies derived therefrom and uses thereof
EP2468764A1 (en) 2010-12-24 2012-06-27 Rijksuniversiteit te Groningen TNF family ligand variants
US9403891B2 (en) 2011-03-10 2016-08-02 New York University Methods and compositions for modulating TNF/TNFR signaling
GB201115280D0 (en) 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
WO2013165982A2 (en) * 2012-04-30 2013-11-07 Cell Signaling Technology, Inc. Anti-human cytomegalvirus antibodies and use thereof
US9531457B2 (en) 2012-07-18 2016-12-27 Kyocera Corporation Interference management of device-to-device communication in a cellular communication system
CN113912723A (zh) 2014-03-24 2022-01-11 癌症研究技术有限公司 含有修饰IgG2结构域的引起激动或拮抗特性的修饰抗体及其用途
CN114099671A (zh) * 2014-08-12 2022-03-01 鳄鱼生物科学公司 利用抗cd40抗体的组合疗法
US9172855B1 (en) 2014-08-28 2015-10-27 Avigilon Corporation Pendant housing for a camera
CN115043943A (zh) * 2015-05-15 2022-09-13 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
EP3340999A4 (en) 2015-08-28 2019-06-12 The General Hospital Corporation AGONISTIC ANTI-TUMOR NECROSIS RECEPTOR 2 ANTIBODIES
CA3004830A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Opi Vi- Ip Holdco Llc Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
CN116715767A (zh) 2016-05-13 2023-09-08 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
MA45941A (fr) 2016-08-12 2019-06-19 Janssen Biotech Inc Anticorps de membres de la superfamille anti-tnfr modifiés par fc ayant une activité agoniste améliorée et leurs procédés d'utilisation
IL265692B2 (en) 2016-09-29 2024-03-01 Amgen Inc Low viscosity antigen binding proteins and methods for their preparation
JP7054209B2 (ja) 2016-11-21 2022-04-13 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 エピトープ均質化抗体パネル、ならびにその作製方法および利用
JP2020504105A (ja) 2016-12-19 2020-02-06 グレンマーク・ファーマシューティカルズ・エスエー 新規なｔｎｆｒアゴニストおよびその使用
US20200270355A1 (en) 2017-11-09 2020-08-27 The General Hospital Corporation Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily polypeptides
EP3840782A4 (en) 2018-08-20 2022-06-08 The General Hospital Corporation TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY ANTAGONIST POLYPEPTIDES

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150366909A1 (en) * 2013-02-07 2015-12-24 The General Hospital Corporation Methods for expansion or depletion of t-regulatory cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sci. Rep., Vol. 3, 3153 (2013.11.06.) *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3023930A1 (en) 2017-11-16
AU2023258320A1 (en) 2023-11-16
CN116715767A (zh) 2023-09-08
US20190144556A1 (en) 2019-05-16
AU2017263833A1 (en) 2018-11-29
KR102745778B1 (ko) 2024-12-24
KR20250007678A (ko) 2025-01-14
KR102410778B1 (ko) 2022-06-21
AU2017263833B2 (en) 2023-08-03
US20240270860A1 (en) 2024-08-15
EP3455262A2 (en) 2019-03-20
WO2017197331A2 (en) 2017-11-16
CN109476745A (zh) 2019-03-15
US11859002B2 (en) 2024-01-02
CN117903308A (zh) 2024-04-19
WO2017197331A3 (en) 2017-12-28
EP3455262A4 (en) 2020-04-08
CN109476745B (zh) 2023-11-24
KR20240095471A (ko) 2024-06-25
KR20220088515A (ko) 2022-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240270860A1 (en) Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies
US12152082B2 (en) Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies
US20250066494A1 (en) Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily polypeptides
US20230295326A1 (en) Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily polypeptides
TWI785009B (zh) Ｃｄ７０結合分子及使用彼之方法

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20181213

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
AMND Amendment
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20200511

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20210722

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20211129

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20210722

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20211129

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20210917

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20200511

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20220314

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20220222

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20211129

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20210917

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20200511

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20220615

PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20220615

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20220616

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration