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KR20180129726A - 세포와 세포간의 결합 증진을 위한 고분자 지지체 및 이를 이용한 세포 배양 방법 - Google Patents

세포와 세포간의 결합 증진을 위한 고분자 지지체 및 이를 이용한 세포 배양 방법 Download PDF

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KR20180129726A
KR20180129726A KR1020180148726A KR20180148726A KR20180129726A KR 20180129726 A KR20180129726 A KR 20180129726A KR 1020180148726 A KR1020180148726 A KR 1020180148726A KR 20180148726 A KR20180148726 A KR 20180148726A KR 20180129726 A KR20180129726 A KR 20180129726A
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cells
peptide
present
stem cells
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Ceased
Application number
KR1020180148726A
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English (en)
Inventor
이근용
이재원
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
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Publication date
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Abstract

본 발명은 세포 간의 결합을 유도하는 고분자 세포 지지체에 관한 것이다. 본 발명의 고분자 세포 지지체를 사용함으로써, 배양 세포-세포 접합을 유도할 수 있고, 이를 통해 세포 분화 유도용 조성물 또는 세포 이식용 조성물 등을 제공할 수 있다.

Description

세포와 세포간의 결합 증진을 위한 고분자 지지체 및 이를 이용한 세포 배양 방법{Polymer Scaffolds for Promoting the Cell-cell Adhesion and Method for Cell Culture Using the Same}
본 발명은 세포 간의 결합을 유도하는 고분자 세포 지지체에 관한 것이다.
일반적으로 조직공학 및 재생 의학에서 세포를 이용한 치료는 손상된 조직과 재생을 복원하는데 많이 사용되어지고 있다. 현재는 줄기세포를 이용한 다양한 치료법이 시행되고 있으나, 세포의 단순 주입의 경우 낮은 생착률 및 분화조절의 어려움을 가지고 있으며, 이러한 효과를 극대화하는데 많은 연구가 진행되어지고 있다. 또한 줄기세포를 치료제로 사용함에 있어서 세포의 생착률 및 분화조정능을 생체 내에서 극대화시키기 위해서 다양한 방법이 개발되어지고 있다. 효과적인 세포의 전달 및 조직재생을 위하여 지지체를 이용하는 것이 필수적이며, 최근 고분자를 이용한 세포결합 지지체가 개발되어 지고 있다. 대부분의 고분자 지지체가 세포결합력을 증가시키기 위하여 세포결합물질을 고정하거나, 세포의 분화를 유도하기 위하여 성장인자 및 성장인자 유래 펩타이드를 고정하여 사용하고 있으나, 아직까지 만족스러운 수준에 이르지 못하고 있다.
이러한 종래의 고분자 지지체는 세포와 세포외 기질(Extra cellular matrix)간의 결합력을 증진시키는데 초점을 맞추어 진행하고 있다. 하지만 생체내 어느 세포도 세포외 기질간의 결합만으로 존재하는 경우는 없으며, 다양한 여러 세포와 결합하는 환경 속에 존재하고 있다. 따라서 세포를 In vitro 및 In vivo에서 배양하는데 있어서 세포와 세포간의 결합을 제공할 수 있는 지지체의 개발이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 세포-세포 간의 결합을 제공하는 고분자 세포 지지체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 카드헤린(cadherin) 부착성 올리고펩타이드가 결합된 고분자 지지체를 이용하는 경우, 세포-지지체 간의 결합을 형성하는 것 뿐만 아니라, 세포-세포 간의 결합도 유도되어 세포 배양, 줄기세포 분화 등에 유용하게 이용할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 군집 형성을 위한 고분자 세포 지지체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포 군집형성 배양 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골세포로의 분화를 위한 줄기세포 배양 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 체내 이식용 세포 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 세포 군집 형성을 위한 고분자 세포 지지체를 제공한다:
(a) 생체 적합성 고분자 백본;
(b) 상기 고분자 백본에 결합된 카드헤린(cadherin) 부착성 올리고펩타이드.
본 발명자들은 세포-세포 간의 결합을 제공하는 고분자 세포 지지체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 카드헤린(cadherin) 부착성 올리고펩타이드가 결합된 고분자 지지체를 이용하는 경우, 세포-지지체 간의 결합을 형성하는 것 뿐만 아니라, 세포-세포 간의 결합도 유도되어 세포 배양, 줄기세포 분화 등에 유용하게 이용할 수 있음을 규명하였다.
종래의 세포 배양용 고분자 지지체들은 세포와 지지체 간의 결합을 제공하기는 하지만, 세포와 세포간의 결합을 유도하는 효과를 제공하지는 못하였다. 그러나 본 발명의 고분자 세포 지지체는 카드헤린 부착성 올리고펩타이드를 포함함으로써, 배양 세포 표면의 카드헤린(cadherin) 단백질과 결합을 형성하고, 세포-세포 간의 결합을 유도함으로써, 배양 세포의 군집 형성을 가능케 하는 특징이 있다. "카드헤린 단백질"은 타입-1 막통과 단백질의 일종으로서, 세포 간 접착(adhesion)을 형성하는데 중요한 역할을 수행하는 단백질이다.
본 명세서 상의 용어 "생체 적합성 고분자 백본"은 세포와 접촉시 친화성을 가지며 거부반응을 나타내지 않는 생체친화성 고분자로 이루어진 구조체를 의미하고, 종래 세포 배양을 위한 스캐폴드(scaffold)와 같은 구조체의 소재로 이용되는 것으로 알려진 다양한 소재를 제한없이 이용가능하다. 다만 카드헤린 부착성 펩타이드를 결합시키기 위한 기능기를 포함하거나, 그러한 기능기를 포함하도록 표면 개질되는 것이 필요하다. 고분자 백본은 다양한 방법에 의해 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 고분자 백본은, 예를 들면 미립구 형태로 제조될 수 있고, 이를 위해 유중수형 에멀젼(Water-in-oil emulsion) 방법을 이용할 수 있다. 구체적인 방법은 본 명세서 상의 실시예를 참조할 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "카드헤린(cadherin) 부착성 올리고펩타이드"는 배양 세포의 카드헤린 단백질과 결합을 형성할 수 있는 올리고펩타이드 서열을 의미하고, 상기 올리고펩타이드 서열이 세포 상의 카드헤린 단백질과 결합을 형성하기만 하면, 본 발명의 효과가 유의하게 발휘되는 것으로 자명하게 이해된다. 카드헤린 단백질과 결합을 형성하는 올리고펩타이드의 동정은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법을 통해 실시될 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J. Biol . Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, 카드헤린 단백질을 베이트(bait) 단백질로 이용하여 카드헤린 단백질에 결합하는 올리고펩타이드를 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드 시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, 카드헤린-인코딩 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL-4)의 DNA 결합 도메인-인코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 올리고펩타이드("프레이" 또는 "시험물질")를 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 인 비보에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, 루시퍼라제)의 전사를 촉발하게 된다. 그 결과 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 프레이가 카드헤린 단백질과 결합할 수 있음을 나타내는 것이며, 상기 프레이는 본 발명의 카드헤린 부착성 올리고펩타이드로 이용될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 고분자 백본과 카드헤린 부착성 올리고펩타이드의 결합은 상술한 생체 적합성 고분자 백본과 상술한 카드헤린 부착성 올리고펩타이드 사이에 형성된 아마이드 결합이다. 카드헤린 부착성 올리고펩타이드는 N-말단 또는 C-말단의 아미노기 또는 카복실기를 이용하여 고분자 백본과 결합될 수 있다. 이때 본발명의 고분자 백본은 카드헤린 부착성 올리고펩타이드와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 기능기를 포함하는 것이 요구된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 생체 적합성 고분자 백본은 상기 아마이드 결합을 형성하기 위한, 카복실기, 히드록실기 또는 아미노기를 포함한다. 구체적으로 본 발명의 고분자 백본은 카드헤린 부착성 올리고펩타이드의 아미노기와 결합할 수 있는 카복실기 또는 히드록실기, 또는 카드헤린 부착성 올리고펩타이드의 카복실기와 결합할 수 있는 아미노기를 포함하는 것 뿐만아니라, 카복실기, 히드록실기, 또는 아미노기를 포함하도록 표면 개질된 것을 포함하는 것으로 이해된다. 카복실기와 아미노기 사이의 아마이드 결합 형성이 보다 일반적으로 알려져 있지만, 히드록실기와 아미노기 간의 아마이드 결합 형성도 유기금속촉매를 이용하는 방법 등이 종래 알려져 있고(김기철 등, 알코올과 아민으로부터 유기금속촉매를 이용한 아마이드 결합 형성 반응 개발, 화학세계, 2013. 3), 종래 알려진 다양한 방법을 통해 본 발명의 고분자 백본에 카드헤린 부착성 올리고펩타이드를 도입할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 일 실시예에서 이용된 EDC/NHS 반응을 이용할 수 있다. 한편 본 발명의 고분자 백본과 카드헤린 부착성 올리고펩타이드 사이의 결합은 펩타이드 링커를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 고분자 백본은 카복실기 또는 히드록실기를 포함하거나, 카복실기 또는 히드록실기를 포함하도록 표면개질된 것을 이용할 수 있다. 본 구체예에서 본 발명의 고분자 백본은 카드헤린 부착성 올리고펩타이드의 N-말단의 아미노기와 아마이드 결합을 형성하거나, 링커를 통해 카드헤린 부착성 올리고펩타이드의 C-말단의 카복실기와 결합을 형성하는 것도 가능하다. 본 발명에서의 카복실기 간의 결합을 형성할 수 있는 링커는 구체적으로 예를 들면, 다이아민, 다이비닐설폰, 1,4-뷰테인다이올, 다이글리시딜 에테르(BDDE) 및 글루타르알데히드, 카보다이이미드, 하이드록시석신이미드, 이미도에스터, 말레이미드, 할로아세틸, 다이설파이드, 하이드로아자이드, 또는 알콕시아민을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 고분자 백본은 알긴산 중합체, 키토산 중합체 및 히알루론산 중합체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이다. 본 발명의 "알긴산 중합체"는 화학식 1로 표시되는 고분자 중합체로서, 카복실기를 포함하여 본 발명의 카드헤린 부착성 올리고펩타이드와 결합을 형성하는데 적합한 고분자이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
또한 본 발명의 "키토산 중합체"는 화학식 2로 표시되는 고분자 중합체로서, 히드록실기 및 아미노기를 포함하고 본 발명의 카드헤린 부착성 올리고펩타이드와 결합을 형성하는데 적합한 고분자이다.
[화학식 2]
Figure pat00002
또한 본 발명의 "히알루론산 중합체"는 화학식 3로 표시되는 고분자 중합체로서, 히드록실기와 카복실기를 포함하고 본 발명의 카드헤린 부착성 올리고펩타이드와 결합을 형성하는데 적합한 고분자이다.
[화학식 3]
Figure pat00003
이 밖에도 카복실기, 히드록실기 또는 아미노기를 포함하도록 표면 개질된 고분자 중합체를 적합하게 이용 가능하다. 표면 개질의 방법에 대하여는 종래 기술된 방법을 제한없이 이용가능하며, 구체적으로 예를 들면, 아크릴 산(acrylic acid, AAc)을 이용한 그라프트(graft)에 의해 고분자 중합체의 표면에 카복실기를 도입하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 카드헤린 부착성 올리고펩타이드는 서열목록 제1서열로 이루어진 LRP5 펩타이드 또는 서열목록 제2서열로 이루어진 HAV 펩타이드이다. 본 발명의 "LRP5 펩타이드"는 LRP5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5)의 아미노산 서열 중 카드헤린 단백질에 효과적으로 결합하는 일부 서열로서 서열목록 제1서열로 이루어진다. 본 발명의 "HAV 펩타이드"는 세포의 밀착연접(tight junction)에 직접적으로 참여하는 카드헤린 단백질의 특정 부위의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로서 서열목록 제2서열로 이루어진다. 본 발명자들은 본 발명의 효과는 서열 특이성과 상관없이 카드헤린 부착능에 의해 발생하는 것으로 예상하였으며, 서로 연관성이 없는 두 서열의 카드헤린 부착 펩타이드를 이용하여 이를 입증하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 LRP5 펩타이드 또는 HAV 펩타이드는 세포의 카드헤린 단백질과 결합을 형성한다. 카드헤린 단백질은 상술한 바와 같이 세포 간 접착(adhesion)에 직접적으로 참여하는 중요한 역할을 수행하는 단백질로서, 본 발명자들은 카드헤린 단백질을 타겟팅하여 결합을 형성하는 카드헤린 부착성 올리고펩타이드, 구체적으로 예를 들어 LRP5 펩타이드 및/또는 HAV 펩타이드를 이용하여, 세포 군집을 형성시킬 수 있는 고분자 세포 지지체를 제조하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 세포 지지체는 (c) 상술한 고분자 백본에 결합된 인테그린(integrin) 부착성 올리고펩타이드를 추가적으로 더 포함한다. 본 발명의 "인테그린(integrin)"은 세포-세포 및 세포-세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 상호작용의 가교(bridge) 역할을 하는 막관통 수용체(transmembrane receptor)이다. 본 명세서 상의 용어 "인테그린 부착성 올리고펩타이드"는 상술한 인테그린과 결합을 형성하는 대략 2-20 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 가닥을 의미한다. 본 발명의 생체 적합성 고분자 백본에 상술한 카드헤린(cadherin) 부착성 올리고펩타이드 외에 추가적으로 인테그린 부착성 올리고펩타이드를 함께 포함하는 세포 지지체를 이용하여 세포를 배양하는 경우, 보다 더 밀집된 구형 형태로 세포 군집이 형성되는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 인테그린 부착성 올리고펩타이드는 RGD, PSHRN, FHRRIKA, YIGSR, KGD, RHD, NGR, SDGR, KQAGDV, LDV, DGEA, YGYYGDALR, FYFDLR, DALR, DLR, RLD, KRLDGS, IDA, IDAPS 및 REDV로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상술한 PSHRN(Benoit and Anseth, 2005), FHRRIKA(Rezania and Healy, 1999), YIGSR(Massia and Hubbell, 1990), KGD(Plow et al, 1985; Scarborough et al 1993), RHD(Ghiso et al 1992, Saporito-Irwin & van Nostrand 1995), NGR, SDGR(Yamada & Kennedy 1987), KQAGDV(Kloczewiak et al, 1984; Lam et al 1987), LDV(Guan & Hynes 1990, Mould et al 1990), DGEA(Staatz et al 1991), YGYYGDALR, FYFDLR(Underwood et al 1995), DALR, DLR, RLD(Altieri et al, 1993; Koivunen et al, 1995), KRLDGS(Alfieri et al 1993), LDV, IDA, IDAPS 및 REDV(Mould et al, 1990; Mould & Humphries, 1991)는 RGD 펩타이드와 같이 인테그린에 결합하는 올리고펩타이드이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 세포 지지체와 세포를 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는 세포 군집형성 배양 방법을 제공한다.
종래 세포 배양을 위하여는 세포 부착을 위한 피더 세포 층(feeder cell layer)을 이용하는 것이 일반적이다. 그러나, 본 발명의 고분자 세포 지지체를 이용하는 경우, 피더 세포 층과 같은 역할을 하여, 단지 세포-지지체 간의 결합을 형성하는데 그치는 것이 아니라, 세포-세포 간의 결합을 유도하여 세포 군집이 형성된 상태에서 세포를 배양할 수 있게 된다. 본 발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 세포에는 특별한 제한이 없다.
본 발명의 세포 배양은 종래 이용되는 세포 배양 배지 내에서 이루어질 수 있다. 세포 배양 배지는 배양 세포의 종류 및 배양 목적에 따라 적절하게 선정하여 사용할 수 있다. 본 발명의 배지를 이루는 기본배지는 당업계의 통상적인 배지, 예컨대 DMEM[Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., virology 8: 396(1959)], Eagle's MEM[Eagle's minimum essensial medium, Eagle, H. Science 130:142(1959)], α-MEM[Stanner, C.P. et al., NAT . New Biol . 230: 52(1971)], Iscove's MEM[Iscove, N. et al., J. Exp . Med . 147:923(1978)], 199 medium[Morgan et al., Proc . Soc . Exp . BioMed ., 73: 1(1950)], CMRL 1066, RPMI 1640[Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199: 519(1967)], F12[Ham, Pro . Natl . Acad . Sci. USA 53: 288(1965)], F10[Ham, R.G . Exp . Cell Res . 29: 515(1963)], DMEM 및 F12의 혼합물[Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102: 225(1980)], Way-mouth's MB752/1[Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)], 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium), 이스코브 변형 피셔 배지 또는 이스코브 변형 이글 배지, McCoy's 5A [McCoy, T. A., et al, Pro . soc . Exp . Bio . Med . 100: 115(1959)], MCDB의 시리즈[Ham, R.G et al., In Vitro 14: 11(1978)], AIM-V 배지 및 이의 변형배지를 포함한다. 배지의 상세한 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에서 알 수 있으며, 상기 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한, 본 발명의 배지는 항생제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 네오마이신, 폴리믹신 또는 암포테리신 B를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 세포 지지체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 "줄기세포"는 특별한 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 세포는 모두 본 발명에 적용될 수 있는 세포이다. 본 발명이 적용되는 줄기세포는 크게 배아줄기세포(ES) 및 배아생식세포(EG)를 포함하는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell)로 구분된다. 배아줄기세포는 배반포의 내부세포괴(ICM)로부터 유래되고, 배아생식세포는 5-10 주령의 생식융기(gonadal ridge)의 원시생식세포로부터 유래된다. 한편, 다능성 줄기세포는 배아 조직, 태아조직 및 성체 조직에서 발견되며, 이는 성체줄기세포를 포함한다. 전능성 줄기세포는 인 비트로에서 무한정 증식되며, 3종류의 모든 배아층(외배엽, 중배엽과 내배엽)으로부터 유래되는 다양한 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는다. 한편, 다능성 줄기세포는 그가 유래된 특정 조직으로 분화될 수 있는 능력을 가지며, 자가재생산 능력은 전형적으로 유기체의 라이프타임으로 제한된다. 다능성 줄기세포의 소스는 모든 조직 종류이고, 특히 골수, 혈액, 간, 피부, 장, 췌장, 뇌, 골격근 및 치수로부터 주로 분리된다.
본 발명은 상술한 세포 지지체를 이용하여 배양 세포의 농도와 상관없이 군집 형성을 유도하고, 이 때 형성된 세포-세포 간 결합에 의해 세포 분화를 촉진하는 데 특징이 있는 것으로서, 다른 배양 조건들은 크게 제한되지 않고, 배양 세포, 배양 목적에 따라 적절히 선택 및 조절 가능하다. 본 발명의 조성물은 종래 알려진 줄기세포 분화 조건 배지를 포함할 수 있고, 분화 조건 배지는 분화의 결과로 얻고자 하는 세포의 종류에 따라 종래 공지된 배지를 적절히 선택하여 이용 가능하다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 줄기세포 분화 유도용 조성물과 줄기세포를 접촉시켜 연골세포 분화 조건 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 연골세포로의 분화를 위한 줄기세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "연골세포 분화 조건 배지"란 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 조건의 배지를 의미하고, 대표적인 예로서, 성장인자가 보충된 인슐린, 트랜스페린, 셀레니우스 액시드, 우혈청 알부민, 리놀레산, 파이루베이트, 아스코베이트 및/또는 덱사메타손을 포함하는 혈청-결여 배지(Johnstone et al., 1998)를 들 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서 사용한 DMEM/F12, 덱사메타손, L-아스코르브산, 인슐린 및/또는 TGF-β1을 포함하는 배지를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 연골세포로의 분화를 위한 줄기세포 배양 방법에 있어서, 특히 카드헤린 부착성 올리고펩타이드 뿐만아니라, 인테그린 부착성 올리고펩타이드를 추가적으로 더 포함하는 세포 지지체를 이용하는 경우, 카드헤린 부착성 또은 인테그린 부착성 올리고텝타이드를 단독으로 포함하는 세포 지지체를 이용하는 경우에 비하여, 연골세포 분화인자의 유전자 발현이 유의하게 상승하였다. 따라서 바람직하게는 카드헤린 부착성 올리고펩타이드 및 인테그린 부착성 올리고펩타이드 모두를 포함하는 세포 지지체를 이용하여 줄기세포를 배양하고, 더욱 효과적으로 연골세포로 분화 시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본발명은 (a) 상술한 세포 지지체, (b) 상기 세포 지지체에 결합된 체내 이식을 위한 세포를 포함하는 체내 세포 이식용 조성물을 제공한다.
본 발명의 이식을 위한 세포는 구체적으로 예를 들면 연골세포(chondrocytes), 근아세포(myoblasts), 간세포(hepatocytes), 골아세포(osteoblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈모세포, 간줄기세포, 심장줄기세포, 췌장줄기세포, 내피전구세포(endothelial progenitors), 성장내피세포(outgrowth endothelial cells), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells), 인간신경줄기세포(neural stem cells), 위성세포(satellite cells), 장 상피세포, 평활근세포 및 섬유아세포가 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 체내 이식용 세포 조성물은 예를 들어 주사 또는 외과적 수술방법을 이용하여 원하는 위치에 주입할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 체내 이식을 위한 세포는 줄기세포이다. 줄기세포에 대하여는 본 명세서 상에서 상술한 바와 같으며, 줄기세포를 체내 도입하여 질병을 치료하는 줄기세포치료를 위해 종래 알려진 사용 양태로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 체내 이식을 위한 세포는 줄기세포로부터 분화된 연골세포이다.
본 발명의 조성물은 추가적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 본 발명의 치료제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 치료제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 국소 주입(local injection)이 가장 바람직한 투여방법이다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 조성물의 투여량은 바람직하게는 1회 1 x 105- 5 x 108 세포/ml이고 그 양은 필요에 의해 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 이식되는 세포의 기능을 충분히 발휘할 수 있도록 세포간 네트워킹을 탁월하게 형성케 하여 실제적으로 질환 동물에서 개선된 치료 효능을 나타낸다.
본 발명의 체내 이식용 세포 조성물은 연골-손상 질환의 치료를 위해 이용될 수 있고, 구체적으로 예를 들면, 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 늑연골염(Costochondritis), 다연골염(Relapsing polychondritis), 및 연골육종(Chondrosarcoma)의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 세포 군집 형성을 위한 고분자 세포 지지체를 제공한다.
(b) 본 발명은 세포 군집형성 배양 방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
(d) 본 발명은 연골세포로의 분화를 위한 줄기세포 배양 방법을 제공한다.
(e) 본 발명은 체내 이식용 세포 조성물을 제공한다.
(f) 본 발명의 고분자 세포 지지체를 이용하면 세포 배양시 적은 농도의 세포를 이용하는 경우에도 세포-세포 접합을 유도하여 세포 군집을 형성시킬 수 있다.
(g) 본 발명의 줄기세포 분화 유도용 조성물, 줄기세포 배양 방법을 이용하면, 효과적으로 줄기세포를 원하는 세포로 분화 시키는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 고정화된 지지체를 이용하여 세포의 부착과정을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 고분자 지지체의 고분자 구조에 결합하는 과정 및 예측되는 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체의 IR분석 결과로 고분자 지지체에 세포부착성 펩타이드가 결합되어 있는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체의 물성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에 다양한 세포를 부착시켜 각각의 세포의 표현형을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에 부착한 세포의 세포간의 결합력을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 줄기세포의 표현형에 미치는 영향을 확인하고, 세포와 세포간의 특이적 결합력에 의해 부착되어지는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에 낮은 농도의 세포수를 이용하여 줄기세포를 연골세포로 분화시켰을 때의 줄기세포의 표현형 및 세포간의 결합력을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체를 이용하여 낮은 농도의 줄기세포를 연골세포로 분화시켰을 때의 분화력을 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체를 이용하여 높은 농도의 줄기세포를 연골세포로 분화시켰을 때의 줄기세포의 표현형 및 세포간으이 결합력을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 결합된 고분자 지지체를 이용하여 높은 농도의 줄기세포를 연골세포로 분화시켰을 때의 분화력을 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 고분자 미립구의 형성 방법 및 고분자 미립구에 세포부착성 펩타이드를 결합하는 과정을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 고분자 미립구와 줄기세포를 이용하여 응집체를 형성하는 과정을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 고분자 미립구와 줄기세포로 형성한 응집체의 물성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 고분자 미립구와 줄기세포로 형성한 응집체 안에서 줄기세포의 표현형을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 고분자 미립구와 줄기세포로 형성한 응집체 안에서 줄기세포의 생존율을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 17은 본 발명의 고분자 미립구와 줄기세포로 형성한 응집체 안에서 줄기세포를 연골세포로의 분화능을 분석하기 위하여 조직학적 평가(알시안 블루, 시리어스 레드)를 한 결과를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 고분자 미립구와 줄기세포로 형성한 응집체 안에서 줄기세포를 연골세포로 분화시켰을 때의 분화력을 분석한 결과를 나타낸다.
도 19는 본 발명의 카드헤린 펩타이드의 농도에 따른 줄기세포의 생장능을 분석한 결과를 나타낸다.
도 20는 본 발명의 카드헤린 펩타이드의 농도에 따른 줄기세포의 표현형 및 부착능을 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 １: 카드헤린 부착성 올리고펩타이드가 결합된 고분자 지지체의 제조 및 세포 부착능 평가
1.1 고분자 지지체의 제조
1.1.1 펩타이드의 선정
생체내 존재하는 세포와 세포간의 결합력을 제공할 수 있는 고분자 지지체를 개발하기 위하여 고분자 지지체에 세포의 카드헤린(cadherin) 단백질과 특이적으로 결합하는 LRP5 펩타이드(DSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS)를 도입한 지지체를 개발하고자 하였다(참조: 도 1).
1.1.2 펩타이드의 결합
천연 고분자인 알긴산을 이용하여 합성을 진행하였으며, 알긴산의 카르복실기와 세포부착성 펩타이드의 아민기를 결합시키기 위하여 EDC/NHS 반응을 사용하였다. 알긴산을 pH 6.5의 MES 완충액에 용해시키고, EDC와 NHS를 이용하여 펩타이드를 결합시킨 후, 펩타이드가 결합된 알긴산 수용액을 증류수와 NaCl을 이용하여 3일간 투석시켰다. 투석을 완료한 알긴산 수용액에 활성탄을 넣어 30분간 불순물을 제거한뒤 0.22 μl 필터로 여과시키고 동결건조시켰다(참조: 도 2).
1.1.3 고분자 표면 분석(아미노산 분석)
상기 실시예에 따라 LRP5 펩타이드를 부착한 고분자 지지체에 대하여, 아미노산 분석을 실시하여 효율적으로 아미노산이 결합되었는지 확인하였다(참조: 표 1).
[표 1]
Figure pat00004
펩타이드를 부착하지 않은 고분자 지지체에서는 어떤 아미노산도 관찰되지 않았으며, 세포부착성 LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서는 펩타이드에 포함된 아미노산이 관찰되는 것을 확인할 수 있다.
1.1.4 고분자 표면 분석(IR분석)
상기 실시예에 따라 LRP5 펩타이드를 부착한 고분자 지지체의 IR분석을 통하여, 펩타이드가 결합되지 않은 고분자 지지체와 펩타이드가 결합된 고분자 지지체를 확인한 결과, 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서 아마이드 결합(1450 cm- 1)이 관찰되는 것을 확인할 수 있다(참조: 도 3).
1.1.5 고분자 지지체의 물성
상기 실시예에 따라 LRP5 펩타이드가 부착된 고분자 지지체의 복소 탄성률을 측정한 결과 펩타이드가 결합되지 않은 고분자 지지체가 펩타이드가 부착된 고분자 지지체에 비해 약간 높은 복소 탄성률을 가지고 있는 것이 관찰되었다. 이는 알긴산 고분자의 구조에서 펩타이드가 결합되는 부위가 알긴산 하이드로겔을 형성하는 결합 부위와 일치하므로, 펩타이드의 결합에 따라 발생하는 복소 탄성률의 저하로 예상된다(참조: 도 4).
1.2 다양한 세포의 부착능 평가
1.2.1 고분자 지지체를 이용한 다양한 세포의 부착능 평가 및 세포 표현형 관찰
세포와 세포간의 결합을 제공하는 고분자 지지체의 세포 부착능 및 표현형을 관찰하기 위하여, 일반적으로 세포와 지지체간의 결합을 제공하는 RGD 펩타이드가 단독으로 결합된 고분자 지지체를 비교군으로 사용하여 실험을 진행하였으며, 혈액모세포(HSC), 골모세포(MC3T3), 성체줄기세포(D1 stem cell) 및 섬유아세포(NIH3T3)를 사용하여 다양한 세포에서의 부착능을 평가하였다.
RGD 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서의 세포 부착능 및 세포 표현형을 관찰한 결과 혈액모세포(HSC), 골모세포(MC3T3), 성체줄기세포(D1 stem cell) 및 섬유아세포(NIH3T3)에 결합되는 것을 확인할 수 있었으며, 단일 세포로 골고루 결합하고 있는 것을 관찰할 수 있었다(참조: 도 5a).
상기 결과와 비교하여 세포간 결합을 제공하는 LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서는 각각의 세포가 결합되어 세포군집을 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었다(참조: 도 5b)
1.2.2 카드헤린 부착성 올리고펩타이드가 결합된 고분자 지지체의 세포간 결합 유도능 평가
카드헤린 부착성 LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체의 표면에 혈액모세포(HSC), 골모세포(MC3T3), 성체줄기세포(D1 stem cell) 및 섬유아세포(NIH3T3)를 부착하여 세포간 결합을 유도한 결과, 각각의 세포가 세포군집을 형성하여 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 세포간 결합 단백질인 n-카드헤린(cadherin)을 면역염색법을 통하여 관찰한 결과 세포간의 결합에 관여하고 있는 것을 관찰할 수 있었다(참조: 도 6).
실시예 2: 세포- 세포간 결합을 제공하는 고분자 지지체를 이용한 줄기세포의 연골세포 분화능 평가
2.1 줄기세포의 부착능 평가
세포와 세포간의 결합을 제공하는 고분자 지지체를 이용하여 성체줄기세포(D1 stem cell)(D1 stem cell, CRL-12424, ATCC)의 결합력을 평가하고 세포의 표현형 및 세포-세포 간의 결합을 확인하기 위하여 세포와 지지체간의 결합을 제공하는 RGD 펩타이드가 단독으로 결합된 고분자 지지체를 비교군으로 사용하여 실험을 진행하였다. 사용되어진 성체줄기세포(D1 stem cell, CRL-12424, ATCC)는 마우스 골수 유래 성체줄기세포로서, 뼈, 연골, 지방 세포로의 분화연구에 매우 적합한 성체줄기세포이다.
LRP5 또는 RGD 펩타이드 어느 것도 결합되지 않은 고분자 지지체에서 줄기세포의 부착력이 낮아 상대적으로 적은 양의 세포가 부착된 것을 확인할 수 있으며, 세포-세포간의 결합력을 확인시켜주는 카테닌(catenin) 단백질의 발현도 나타나지 않는 것을 확인 할 수 있었다(참조: 도 7). 이와 대조적으로 RGD 펩타이드와 LRP5 펩타이드가 각각 결합된 고분자 지지체에서는 많은 수의 세포가 부착된 것을 관찰 할 수 있었으며, LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서는 세포와 세포가 결합하는 형태를 나타내며 세포군집을 형성하는 모습을 관찰 할 수 있었다.
LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체가 카드헤린 단백질을 이용한 세포-세포간의 결합을 제공한다는 것을 확인하기 위하여, EGTA 용액을 처리하여 세포-세포간의 결합을 억제 한 뒤 지지체와 결합시킨 결과 펩타이드가 결합되지 않은 고분자 지지체와 비슷한 세포 부착능을 관찰할 수 있었다(참조: 도 7). 이는 본 발명의 카드헤린 부착성 올리고펩타이드가 도입된 고분자 지지체가 세포-세포간의 결합을 제공하는 것을 보여주는 결과이다.
2.2 줄기세포의 연골세포 분화능 평가
2.2.1 낮은 농도의 세포를 이용한 고분자 지지체에서의 연골분화능 평가
세포와 지지체간의 결합을 제공하는 RGD 펩타이드 만 도입된 고분자 지지체와 세포와 세포간의 결합을 제공하는 LRP5 펩타이드가 도입된 고분자 지지체를 이용하여 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 평가하기 위하여 고분자 지지체 안에 세포를 캡슐화 하여 2주간 연골세포 분화 배지 조건(DMEM/F12, 10 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid, 5 μl/ml Insulin, 10 ng/ml TGF-beta1)하에서 배양하였다. 이때 사용되어진 줄기세포의 농도는 일반적인 3차원적 세포 배양법에 사용되어지는 세포 농도보다 10분의 1의 낮은 농도의 세포 수(1.0 x 106 세포/ml)로 배양하였다.
2주간 배양한 후 세포의 표현형을 관찰한 결과 RGD 펩타이드가 도입된 고분자 지지체에서는 줄기세포가 단일 세포로 존재하며 세포간의 결합을 확인할 수 있는 단백질인 beta-카테닌을 면역염색하여 확인한 결과 세포-세포간의 결합이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었으나, 이와 대조적으로 LRP5 펩타이드가 도입된 고분자 지지체에서는 줄기세포가 군집을 이루고 있는 것을 확인할 수 있었으며 beta-카테닌 단백질의 발현 역시 눈에 띄게 증가하여 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(참조: 도 8).
줄기세포의 연골세포 분화능을 평가하기 위하여 연골세포 분화인자인 콜라겐 타입2(collagen type2)와 sox-9의 유전자 발현양을 측정하여 비교한 결과, LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서 RGD 펩타이드가 결합된 고분자 지지체와 비교하여 많은 양의 유전자가 발현된 것을 확인할 수 있었다(참조: 도 9). 또한 이는 일반적인 3차원적 세포 배양에 사용되어지는 농도보다 10분의 1의 낮은 농도의 세포 수에서 배양한 조건으로 낮은 농도에서의 세포 배양 및 세포 분화는 잘 이루어지지 않는다는 결과에 반대되는 결과이다. 즉, 세포와 세포간의 결합을 제공하는 고분자 지지체를 이용한 세포 배양은 낮은 농도의 세포 배양에서도 세포간의 결합을 제공해주는 지지체의 역할을 하여 세포의 배양이 보다 효과적인 것을 확인할 수 있었으며, 줄기세포의 분화에도 큰 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
2.2.2 높은 농도의 세포를 이용한 고분자 지지체에서의 연골분화능 평가
줄기세포의 3차원적 배양에 이용한 연골세포 분화능을 평가하기 위하여, 일반적으로 사용하는 세포 농도인 1.0 x 107 세포/ml에서 실험을 진행하였으며, 위의 실험과 비교 분석하기 위하여 RGD 펩타이드가 결합된 고분자 지지체와 LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체를 이용하여 실험을 진행하였다.
2주간 연골세포 분화 배지(DMEM/F12, 10 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid, 5 μl/ml Insulin, 10 ng/ml TGF-beta1)에 배양하여 줄기세포(D1 stem cell, CRL-12424, ATCC)의 연골세포의 분화를 유도한 결과, 세포와 지지체간의 결합을 제공하는 RGD 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서 역시 세포 군집을 형성하고 있는 것을 관찰 할 수 있었으며, 세포와 세포간의 결합을 제공하는 LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서는 보다 많은 세포가 군집을 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었다(참조: 도 10).
연골세포 분화인자인 콜라겐 타입2 와 sox-9의 유전자 발현양을 측정한 결과, LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서 유전자가 발현량이 약간 상승한 것을 확인할 수 있었으나, 그 차이가 낮은 농도의 세포를 이용한 실험과 비교하여 크지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이는 세포의 농도가 높아짐에 따라서 세포와 세포간의 결합을 제공하지 않는 RGD 펩타이드가 결합된 고분자 지지체에서도 세포와 세포간의 결합이 존재하여 세포의 군집을 형성하는 것을 보여주고, 이에 따라 줄기세포의 연골분화능 역시 세포의 농도의 증가에 따라 LRP5 펩타이드가 결합된 고분자 지지체와 큰 차이가 나지 않는 것으로 보여진다.
실시예 3: 세포- 세포간 결합을 제공하는 고분자 미립구(microsphere)를 이용한 줄기세포의 연골세포 분화능 평가
3.1 고분자 미립구의 제조 및 세포와의 응집체 형성
3.1.1 펩타이드의 선정
세포와 세포간의 결합력을 제공할 수 있는 고분자 미립구를 개발하기 위하여 고분자 지지체에 세포 밀착연접(tight junction)에 직접적으로 참여하는 카드헤린자체의 특정부위 펩타이드(GGGGSHAVSS)(HAV 펩타이드)를 선정하여 단독 또는 RGD 펩타이드와 함께 고분자 지지체에 결합시킴으로써, 배양 세포의 세포막에 존재하는 카드헤린 단백질과 직접적인 결합을 할 수 있는 고분자 미립구를 제작하였다.
3.1.2 펩타이드의 결합
천연 고분자인 알긴산을 이용하여 미립구를 제작하였으며, 알긴산 미립구를 제조하기 위하여 유중수형 에멀젼(Water-in-oil emulsion)을 이용하였다. 알긴산 고분자를 이소옥탄(Isooctane), SPAN 80, Tween 80이 포함된 유기용매에 녹인후 20 wt%의 CaCl2 수용액에서 한시간동안 반응시켜 미립구를 제조하였다. 이후 알긴산 미립구의 카르복실기와 카드헤린 부착성 올리고펩타이드(HAV 펩타이드)의 아민기와의 결합을 위하여 EDC/NHS 반응을 사용하였다. 알긴산 미립구를 pH 6.5의 MES 완충액에 용해하고, EDC와 NHS를 이용하여 펩타이드를 결합시킨 후, 펩타이드가 결합된 알긴산 수용액을 증류수와 NaCl을 이용하여 3일간 투석시켰다. 투석을 완료한 알긴산 수용액을 활성탄을 넣어 30분간 불순물을 제거한뒤 0.22 μm 필터로 여과시킨 후 동결건조 시켜주었다(참조: 도 12).
3.1.3 카드헤린 부착성 펩타이드 농도에 따른 줄기세포 성장능 평가
카드헤린 부착성 펩타이드의 농도에 따른 줄기세포 성장능을 평가하기 위하여, 다양한 농도 (7, 14, 28, 70 μg/mg)의 펩타이드를 알긴산에 도입시켜 하이드로젤을 제조하였으며, 각각의 하이드로젤에 줄기세포의 농도를 2.0 x 106 세포/ml로 부착시켜 총 5일간 실험을 진행하였다. 하이드로젤에 부착된 세포의 수를 측정하기 위하여, EDTA가 포함된 용액으로 하이드로젤을 제거하였으며, 고분자 지지체가 제거된 후 세포의 수를 Hemocytometer로 측정하여 5일간의 줄기세포의 성장능을 평가하였다. 카드헤린 부착성 펩타이드가 도입된 알긴산에 줄기세포를 부착시켜 생장능을 평가한 결과, 펩타이드가 도입되지 않은 알긴산과 비교하여 생장능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 펩타이드 농도가 높아짐에 따라서 비례하여 증가하였으나, 14 μg/mg 농도 이상으로 결합시키는 경우 효율이 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(참고: 도 19). 또한 줄기세포를 부착시켜 세포를 관찰한 결과, 펩타이드의 농도가 높아짐에 따라 세포의 부착이 보다 활발하게 이루어진 것을 확인할 수 있었으며, 각각의 세포가 결합되어 세포군집을 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었다(참조: 도 20).
3.1.4 줄기세포와 고분자 미립구의 응집체 형성
세포와 결합력을 가지고 있는 고분자 미립구와 줄기세포를 혼합하여 줄기세포와 고분자 미립구로 이루어진 응집체를 제조하였으며, 고분자 미립구는 10 wt%로 1.0 x 108/ml의 농도로 사용하였으며, 세포는 1.0 x 107/ml의 농도를 사용하여 응집체를 형성하였다. 또한 이렇게 형성된 응집체는 바닥이 둥근 웰 플레이트를 사용하여 배양하였다(참조: 도 13).
3.1.5 줄기세포와 고분자 미립구로 형성된 응집체의 물성
상기 실시예에 따라 HAV 펩타이드가 부착된 고분자 미립구와 줄기세포로 형성된 응집체의 형성 유무를 확인하기 위하여, 각각의 응집체를 유동계를 사용하여 전단탄성율을 측정하였다. 그 결과 펩타이드가 결합되지 않은 고분자 미립구를 이용한 응집체와 비교하여 RGD 펩타이드와 HAV 펩타이드가 부착된 고분자 미립구를 이용한 응집체의 탄성율(G')이 더 높은 것으로 관찰되었다. 이는 고분자에 결합된 펩타이드와 세포간의 결합력이 존재하며 이러한 결합력으로 인하여 미립구와 세포의 응집체를 형성하는 것을 알 수 있었다(참조: 도 14). 도 14에서 "RGD-alg"는 RGD 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내고, "Cadherin-alg"는 HAV 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내며, "Alginate"는 펩타이드가 도입되지 않은 고분자 미립구 대조군을 나타내고, 실선은 탄성율(G'), 점선은 손실 탄성율(G")을 나타낸다.
3.2 줄기세포와 고분자 미립구로 형성한 응집체의 세포 분화능 평가
3.2.1 줄기세포의 부착능 평가 및 세포 표현형 관찰
세포와 세포간의 결합을 제공하는 고분자 미립구를 이용하여 줄기세포의 결합력을 평가하고 세포의 표현형 및 세포-세포 간의 결합을 확인하기 위하여 세포와 지지체간의 결합을 제공하는 RGD 펩타이드가 단독으로 결합된 고분자 지지체를 비교군으로 사용하여 실험을 진행하였다.
RGD 펩타이드 및/또는 HAV 펩타이드가 결합되지 않은 고분자 미립구와 줄기세포를 함께 배양한 경우 줄기세포의 부착력이 낮아 상대적으로 적은 양의 세포가 부착되어 생장하는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 대조적으로 RGD 펩타이드 및/또는 HAV 펩타이드가 결합된 고분자 미립구에서는 많은 수의 세포가 생장하고 있는 것을 관찰 할 수 있었다. HAV 펩타이드가 단독으로 결합된 고분자 미립구에서는 세포와 세포가 결합하는 형태를 나타내며 세포군집을 형성하는 모습을 관찰 할 수 있었으며, RGD 펩타이드와 HAV 펩타이드가 동시에 결합된 고분자 미립구에서 역시 세포군집을 형성하는 모습을 관찰할 수 있었다. 대조적으로 RGD 펩타이드가 단독으로 결합된 고분자 미립구에서는 세포가 미립구 표면을 뻗어서 생장하고 있는 모습을 관찰 할 수 있었다(참조: 도 15). 도 15에서 "RGD-alginate"는 RGD 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내고, "CAD-alginate"는 HAV 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내며, "R/C-alginate"는 RGD 펩타이드와 HAV 펩타이드가 동시에 결합된 고분자 미립구를 나타내고, "alginate"는 펩타이드가 도입되지 않은 고분자 미립구 대조군을 나타낸다.
3.2.2 줄기세포와 고분자 미립구 응집체의 세포 생존율 평가
고분자 미립구와 줄기세포로 형성된 응집체에서의 줄기세포의 생존율을 평가하였다. RGD 펩타이드 및/또는 HAV 펩타이드가 결합되지 않은 고분자 미립구를 이용한 응집체는 세포와 미립구간의 결합력이 존재하지 않아 응집체를 형성하지 못한 것을 관찰할 수 있으며, 세포의 생존율도 다른 그룹에 비하여 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이와 대조적으로 RGD 펩타이드 또는 HAV 펩타이드가 각각 결합된 고분자 미립구를 이용한 각각의 응집체에서는 세포와 미립구간의 결합력에 의하여 특정 부피의 응집체를 형성하고 있는 것을 확인할 수 있으며, 세포의 생존율도 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, RGD펩타이드와 HAV 펩타이드가 동시에 결합된 고분자 미립구를 이용한 응집체에서는 높은 결합력으로 구형에 가까운 응집체를 형성하고 있었으며, 응집체 내부에 세포의 생존율도 높은 것을 확인할 수 있었다(참조: 도 16). 도 16에서 "RGD-alginate"는 RGD 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내고, "Cadherin-alginate"는 HAV 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내며, "R/C-alginate"는 RGD 펩타이드와 HAV 펩타이드가 동시에 결합된 고분자 미립구를 나타내고, "alginate"는 펩타이드가 도입되지 않은 고분자 미립구 대조군을 나타낸다.
3.2.3 줄기세포와 고분자 미립구 응집체의 연골세포 분화능 평가
세포와 지지체간의 결합을 제공하는 RGD 펩타이드가 단독으로 도입된 고분자 미립구와 세포와 세포간의 결합을 제공하는 HAV 펩타이드가 도입된 고분자 미립구를 이용하여 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 평가하기 위하여 고분자 미립구와 줄기세포를 혼합하여 응집체를 형성하였고, 2주간 연골세포 분화 배지 조건하에 배양하였다(DMEM/F12, 10 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid, 5 μl/ml Insulin, 10 ng/ml TGF-beta1). 2주간 배양한 후 조직학적으로 관찰한 결과 펩타이드가 도입되지 않은 알긴산 미립구의 경우 응집체의 형성이 되지 않은 것을 확인할 수 있었으며, RGD 펩타이드가 단독으로 도입된 고분자 미립구보다 HAV 펩타이드가 도입된 고분자 미립구를 이용한 응집체에서 연골조직의 분화능을 평가하는 알시안블루(alcian blue)와 시리어스 레드(sirius red)에서 연골조직으로 분화가 보다 활발히 이루어진 것을 관찰할 수 있다(참조: 도 17). 도 17에서 "RGD-Alginate"는 RGD 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내고, "Cadherin-Alginate"는 HAV 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내며, "Alginate"는 펩타이드가 도입되지 않은 고분자 미립구 대조군을 나타낸다.
줄기세포의 연골세포 분화능을 평가하기 위하여 연골세포 분화인자인 콜라겐 타입2와 아그레칸(aggrecan)의 유전자 발현양을 측정하여 비교한 결과, HAV 펩타이드가 결합된 고분자 미립구를 이용한 응집체에서 RGD 펩타이드가 단독으로 결합된 고분자 미립구를 이용한 응집체와 비교하여 많은 양의 유전자가 발현된 것을 확인할 수 있었다. 또한 RGD 펩타이드와 HAV 펩타이드를 동시에 결합시킨 고분자 미립구를 이용한 응집체는 다른 그룹과 비교할 때 연골세포 분화인자의 유전자 발현이 보다 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 세포와 세포간의 결합을 제공하는 고분자 미립구를 이용한 줄기세포 배양이, 세포와 지지체간의 결합만을 제공하는 고분자 미립구를 이용한 경우와 비교하여, 연골세포의 배양에 보다 효과적인 것을 확인할 수 있었다(참조: 도 18). 도 18에서 "RGD"는 RGD 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내고, "CAD"는 HAV 펩타이드 도입 고분자 미립구를 나타내며, "R/C"는 RGD펩타이드와 HAV 펩타이드가 동시에 결합된 고분자 미립구를 나타내고, "Alg"는 펩타이드가 도입되지 않은 고분자 미립구 대조군을 나타낸다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Polymer Scaffolds for Promoting the Cell-cell Adhesion and Method for Cell Culture Using the Same <130> P18U10C1679 <150> KR 10-2015-0050380 <151> 2015-04-09 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP5 peptide <400> 1 Asp Ser Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser Tyr Phe His Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Pro Pro Ser Pro Cys Thr Asp Ser Ser 20 25 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HAV peptide <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser His Ala Val Ser Ser 1 5 10

Claims (13)

  1. 다음을 포함하는 세포 군집 형성을 위한 고분자 세포 지지체:
    (a) 알긴산 중합체, 키토산 중합체 및 히알루론산 중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어진 생체 적합성 고분자 백본; 및
    (b) 상기 고분자 백본에 아마이드 결합된, 카드헤린 부착성 올리고펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생체 적합성 고분자 백본은 상기 아마이드 결합을 형성하기 위한, 카복실기, 히드록실기 또는 아미노기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 지지체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 고분자 백본은 카복실기 또는 히드록실기를 포함하거나, 카복실기 또는 히드록실기를 포함하도록 표면개질된 것을 특징으로 하는, 세포 지지체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 카드헤린 부착성 올리고펩타이드는 서열목록 제1서열로 이루어진 LRP5 펩타이드 또는 서열목록 제2서열로 이루어진 HAV 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 세포 지지체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 LRP5 펩타이드 또는 상기 HAV 펩타이드는 상기 세포의 카드헤린 단백질과 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 세포 지지체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 지지체는 (c) 상기 고분자 백본에 결합된 인테그린(integrin) 부착성 올리고펩타이드를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 지지체.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 인테그린 부착성 올리고펩타이드는 RGD, PSHRN, FHRRIKA, YIGSR, KGD, RHD, NGR, SDGR, KQAGDV, LDV, DGEA, YGYYGDALR, FYFDLR, DALR, DLR, RLD, KRLDGS, IDA, IDAPS 및 REDV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포 지지체.
  8. 제 1 항의 세포 지지체와 세포를 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는 세포 군집형성 배양 방법.
  9. 제 1 항에 따른 세포 지지체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
  10. 제 9 항에 따른 줄기세포 분화 유도용 조성물과 줄기세포를 접촉시켜 연골세포 분화 조건 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 연골세포로의 분화를 위한 줄기세포 배양 방법.
  11. (a) 제 1 항에 따른 세포 지지체, 및 (b) 상기 세포 지지체에 결합된 체내 이식을 위한 세포를 포함하는 체내 세포 이식용 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 체내 이식을 위한 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 체내 이식을 위한 세포는 줄기세포로부터 분화된 연골세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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Patent event date: 20181219

Patent event code: PE09021S01D

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PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20190305

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Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20181219

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Patent event code: PE06011S01I