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KR20180105733A - 양자 세포 치료제를 제조하는 개선된 방법 - Google Patents

양자 세포 치료제를 제조하는 개선된 방법 Download PDF

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KR20180105733A
KR20180105733A KR1020187026618A KR20187026618A KR20180105733A KR 20180105733 A KR20180105733 A KR 20180105733A KR 1020187026618 A KR1020187026618 A KR 1020187026618A KR 20187026618 A KR20187026618 A KR 20187026618A KR 20180105733 A KR20180105733 A KR 20180105733A
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KR
South Korea
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cells
cell
cell population
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hours
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리처드 모건
케빈 프리드먼
던 마이어
Original Assignee
블루버드 바이오, 인코포레이티드.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 양자 세포 치료제를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 모집단을 수거하고, PBMC를 단리하여 활성화시키고, T 세포를 확장시키고, T 세포 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다.

Description

양자 세포 치료제를 제조하는 개선된 방법{IMPROVED METHODS FOR MANUFACTURING ADOPTIVE CELL THERAPIES}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은, 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는, 2014년 4월 25일자로 출원된 미국 가출원 제61/984,558호의 35 U.S.C. §119(e)하에서의 이익을 주장한다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 카피 대신에 텍스트 포맷으로 제공되며, 본 명세서에 참조로서 도입된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 화일의 명칭은 BLBD_028_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 화일은 3KB이고, 2015년 4월 24일에 작성되었으며, 명세서의 제출과 동시에 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
기술 분야
본 발명은 면역 작동 세포를 제조하기 위한 개선된 플랫폼 및 관련된 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 T 세포를 포함하는 치료학적 면역 작동 세포 조성물을 제조하기 위한 대규모, 유연성, 신뢰성 및 재현성 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
양자 면역 요법 또는 양자 세포 요법(ACT)은 질환의 치료를 위해 유전자 변형된 T 림프구를 대상체에게 이입하는 것이다. 양자 면역요법은, 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증 질환 및 면역결핍증을 포함하는 광범위한 질환을 치료하는 이의 잠재성을 아직 실현하지 못한다. 그러나, 전부는 아니지만, 대부분의 양자 면역요법 전략은 T 세포의 임상적으로 효과적인 치료 용량을 생성하기 위해 T 세포 활성화 및 확장을 필요로 한다. 생존 세포 배양 및 환자간의 가변성의 본질적인 복잡성 때문에, 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 치료 용량을 생성하는 현재의 기술은 번거로운 T 세포 제조 프로세스에 의해 제한된 상태이다. 기존의 T 세포 제조 프로세스는 용이하게 대규모, 반복적, 신뢰성 또는 효율적이지 않고, 작동 면역 세포 기능의 고갈 및 상실의 가능성이 있는 하위 T 세포 생성물을 생성한다.
현재까지, 조작된 T 세포 양자 면역요법은 제한된 성공만을 이루었고, 통상 다양한 임상적 활성을 나타낸다. 따라서, 이러한 요법은 광범위한 임상 용도에 적합하지 않다.
간단한 개요
본 발명은 일반적으로 양자 세포 요법을 위한 방법을 제공한다.
다양한 실시형태에서, a) T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 세포 모집단을 수득하는 단계; b) i) 하나 이상의 사이토킨, ii) 항-CD3 항체 또는 이의 CD3-결합 단편 및 (iii) 항-CD28 항체 또는 이의 CD28-결합 단편, B7-1 또는 이의 CD28-결합 단편, 또는 B7-2 또는 이의 CD28-결합 단편을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포 모집단을 배양하는 단계로서, 여기서 상기 배양은 T 세포를 활성화시키고 자극시키는 단계; c) 활성화된 세포의 모집단을 바이러스 벡터로 형질도입시키는 단계; 및 d) 세포 성장 배지에서 세포 모집단을 배양하여 형질도입된 T 세포를 확장시킴으로써 T 세포 치료제를 제조하는 단계를 포함하는,
T 세포 치료제를 제조하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, 세포 모집단은 말초혈, 말초혈 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 이슈(thymus issue), 감염 부위 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 또는 종양으로부터 수득된다.
추가의 실시형태에서, T 세포는 말초혈, 말초혈 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 이슈, 감염 부위 조직, 복수, 흉수, 비장 조직, 종양 또는 T 세포주로부터 수득된다.
추가의 실시형태에서, APC는 말초혈, 말초혈 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 이슈, 감염 부위 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 또는 종양으로부터 수득된다.
일부 실시형태에서, 세포 모집단은 말초혈 단핵구 세포(PBMC)를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단을 수거 또는 수득하는 것은 백혈구분리반출을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 모집단을 단리하는 것은 침강을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 침강은 FICOLLTM 또는 PERCOLL™ 구배를 포함한다.
특정 실시형태에서, 침강은 반자동 플로우쓰로우(flowthrough) 원심분리를 사용하여 수행된다.
추가의 실시형태에서, 반자동 플로우쓰로우 원심분리는 코베(Cobe) 2991 세포 프로세서, 세포 세이버(Cell Saver) 5+ 또는 엘루트라(Elutra)이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 세포 모집단을 완충제 또는 세포 배양 배지에서 세척하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 모집단은, 하나 이상의 사이토킨을 함유하는 T 세포 성장 배지(TCGM)에서 세척된다.
일부 실시형태에서, TCGM 중의 상기 하나 이상의 사이토킨은 IL-2, IL7, IL-15, IL-9 및 IL-21로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 사이토킨은 IL-2이다.
특정 실시형태에서, IL-2의 농도는 약 250IU/mL이다.
특정 실시형태에서, IL-2의 농도는 약 100IU/mL 내지 약 300IU/mL이다.
일부 실시형태에서, 단리된 세포 모집단은 PBMC를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 조절된 속도의 냉동기에서 동결보존된다.
추가의 실시형태에서, 동결보존된 세포 모집단은 해동된다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 단계(b)에서 배양하기 위해 약 1×108 세포/mL의 밀도로 TCGM에 씨딩된다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 단계(b)에서 배양하기 위해 약 1×107 세포/mL의 밀도로 TCGM에 씨딩된다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 단계(b)에서 배양하기 위해 약 1×106 세포/mL의 밀도로 TCGM에 씨딩된다.
추가의 실시형태에서, 약 1×108 세포는 단계(b)에서 배양하기 위해 약 1×106 세포/mL의 밀도로 TCGM에 씨딩된다.
특정 실시형태에서, 세포 모집단은 세포 배양 백 또는 생물반응기에서 배양된다.
특정 실시형태에서, TCGM은 IL-2, IL7, IL-15, IL-9 및 IL-21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 사이토킨을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 하나 이상의 사이토킨은 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에서, 하나 이상의 사이토킨은 IL-2를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 하나 이상의 사이토킨의 농도는 약 250IU/mL이다.
추가의 실시형태에서, 하나 이상의 사이토킨의 농도는 25IU/mL 내지 약 500IU/mL이다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 가용성 항-CD3 항체 및 가용성 항-CD28 항체와 함께 배양된다.
특정 실시형태에서, 항-CD3 항체의 농도는 약 50ng/mL이다.
특정 실시형태에서, 항-CD28 항체의 농도는 약 50ng/mL이다.
특정 실시형태에서, 단계 b)의 상기 세포 모집단은 형질도입 전에 약 12시간 내지 약 48시간 동안 배양된다.
추가의 실시형태에서, 단계 b)의 상기 세포 모집단은 형질도입 전에 약 16시간 내지 약 32시간 동안 배양된다.
추가의 실시형태에서, 단계 b)의 상기 세포 모집단은 형질도입 전에 적어도 18시간 동안 배양된다.
추가의 실시형태에서, 단계 b)의 상기 세포 모집단은 형질도입 전에 적어도 24시간 동안 배양된다.
특정 실시형태에서, 단계 d)의 상기 세포 모집단은 레트로바이러스 벡터로 형질도입된다.
특정 실시형태에서, 단계 d)의 세포 모집단은 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다.
추가의 실시형태에서, 약 1×109 TU 내지 약 2×109 TU의 바이러스 벡터는 1×108 개의 씨딩되는 세포를 형질도입시키기 위해 사용된다.
추가의 실시형태에서, 약 1×109 TU 내지 약 4×109 TU의 바이러스 벡터는 1×108 개의 씨딩되는 세포를 형질도입시키기 위해 사용된다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 전체 배양 용적의 20% v/v로 희석된다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 전체 배양 용적의 약 20% 내지 약 40% v/v로 희석된다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 약 18 내지 약 48시간 동안 형질도입된다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 약 18 내지 약 36시간 동안 형질도입된다.
추가의 실시형태에서, 세포 모집단은 약 24시간 동안 형질도입된다.
추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은,
알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y(Lewis-Y), Kappa, 메소텔린(Mesothelin), Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈(Survivin), TAG72, TEM 및 VEGFR2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 결합하는 세포외 도메인;
CD8α; CD4, CD28, CD45, PD1 및 CD152로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드로부터 유래되는 막관통 도메인;
CD28, CD54(ICAM), CD134(OX40), CD137(41BB), CD152(CTLA4), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1) 및 CD278(ICOS)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 공-자극 시그날전달 도메인; 및
CD3ζ 시그날전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 항원에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 공-자극 시그날전달 도메인은 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에서, 힌지 영역 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
추가의 실시형태에서, 힌지 영역 폴리펩티드는 IgG1 또는 CD8α의 힌지 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 시그날 펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 시그날 펩티드는 IgG1 중쇄 시그날 폴리펩티드, CD8α 시그날 폴리펩티드 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 시그날 폴리펩티드를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단은 확장을 위해 약 5 내지 약 8일 동안 배양된다.
특정 실시형태에서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단은 확장을 위해 세포 배양 백에서 약 5일 내지 약 8일 동안 배양된다.
추가의 실시형태에서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단이 확장을 위해 세포 배양 백에서 약 5일 동안 배양되고, 이어서 생물반응기에서 약 3일 동안 배양된다.
추가의 실시형태에서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단은 확장을 위해 생물반응기에서 약 5일 내지 약 8일 동안 배양된다.
추가의 실시형태에서, 생물반응기는 WAVE 생물반응기 또는 GREX 생물반응기이다.
특정 실시형태에서, T 세포의 수는 단계 d)의 배양 동안 적어도 50배 확장된다.
특정 실시형태에서, T 세포의 수는 단계 d)의 배양 동안 적어도 100배 확장된다.
특정 실시형태에서, T 세포의 수는 단계 d)의 배양 동안 적어도 200배 확장된다.
추가의 실시형태에서, T 세포의 수는 단계 d)의 배양 동안 적어도 300배 확장된다.
추가의 실시형태에서, T 세포의 수는 단계 d)의 배양 동안 적어도 400배 확장된다.
추가의 실시형태에서, T 세포의 수는 단계 d)의 배양 동안 적어도 500배 확장된다.
추가의 실시형태에서, T 세포의 수는 단계 d)의 배양 동안 적어도 600배 확장된다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 제조된 T 세포 치료제를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, T 세포 치료제를 회수하는 것은 단계 d)에서 확장된 세포를 농축 및 세척하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, T 세포 치료제는 반자동 플로우쓰로우 원심분리를 사용하여 농축 및 세척된다.
추가의 실시형태에서, 반자동 플로우쓰로우 원심분리는 세포 세이버 5+ 또는 LOVO이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 T 세포 치료제를 동결보존하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 실시형태에서, 동결보존된 T 세포는 양자 세포 요법의 방법에서 사용하기 위해 해동된다.
다양한 실시형태에서, 상기 및 본원의 다른 개소에 기재된 선행 실시형태 중의 어느 하나의 제조된 T 세포 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
다양한 기타 실시형태에서, 상기 및 본원의 다른 개소에 기재된 선행 실시형태 중의 어느 하나의 T 세포 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 악성종양을 치료하는 방법이 제공된다.
도 1은 T 세포 제조 프로세스 동안 상이한 시간에서 형질도입된 형질도입 세포의 형질도입 효율 및 VCN을 나타낸다. 세포를 D0, D1 및 D2에 1-2×108 TU/106 PBMC에서 렌티바이러스를 발현하는 GFP로 형질도입시켰다. CD3, CD8 또는 CD4를 발혀하는 GFP 발현 세포의 FACS 분석은 형질도입 효율 및 VCN이 활성화 20 내지 24시간(D1) 후에 형질도입된 세포에서 최고인 것으로 측정되었다.
도 2는 상이한 방법을 사용하여 활성화시킨 세포의 형질도입 효율을 나타낸다. PBMC는 (i) 플레이트 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체; (ii) 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체; 및 (iii) 비드 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시켰다. 활성화된 세포는 1-2×108 TU/106 PBMC에서 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입 효율 및 VCN는, 다른 방법과 비교하여 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시킨 T 세포 마커 CD3, CD8 또는 CD4를 발현하는 GFP에서 가장 높았다.
도 3은 세포 배양 백에서의 활성화 및 형질도입이 플라스크에서의 형질도입에 필적함을 나타낸다. PBMC는 50ng/mL의 농도로 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 D0에서 활성화시켰다. 활성화된 세포는 D1의 3×108 TU/106 PBMC에서 캅파LC 발현 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입 효율은, 세포를 활성화시키고 세포 배양 백 또는 플라스크에서 형질도입시킨 경우에 필적했다. VCN은 세포 배양 백에서 활성화 및 형질도입시킨 세포에서 약간 더 높았다.
도 4는 상이한 방법으로 활성화시킨 PBMC 중에서 T 세포 확장이 동등함을 나타낸다. PBMC는 (i) 플레이트 결합된 항-CD3 항 항-CD28 항체; 및 (ii) 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시키거나; 정제된 림프구를 (iii) 비드 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시켰다. PBMC 및 림프구는 동일한 공급원으 것이었다. 활성화된 세포는 1-2×108 TU/106 PBMC에서 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 3개 방법에 의해 활성화시킨 PBMC 중에서 세포 확장은 10일 확장 배양 기간 전체에 걸쳐 동등했다.
도 5는 복수의 공여체로부터의 PBMC가 동등한 및 견고한 확장을 나타냈음을 나타낸다. PBMC를 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시켰다. 활성화된 세포는 1-2×108 TU/106 PBMC에서 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 10일 동안 배양한 복수의 공여체로부터 활성화 및 형질도입된 세포는 서로 및 형질도입되지 않은 대조군(UTD) 사이에서 동등한 성장율을 나타냈다. 각각의 확장된 배양에서 10일에 존재하는 림프구의 수가 또한 제시되어 있다.
도 6은, 약 61% 마킹의 평균 및 29% 내지 80%(n=5)의 범위를 사용하여, 상이한 환자로부터 생서된 세포 생성물 사이에서 항-CD19 CAR 발현이 동등함을 나타내는 대표적 FACS 분석이다. qPCR은 또한 세포 생생물 중의 VCN이 상이한 환자로부터 생성된 세포 생성물 사이에서 동등함을 증명했다.
도 7은 가용성 항체를 사용하여 활성화시킨 T 세포에 의한 항원 특이적 종양 클리어런스가 다른 방법을 사용하여 활성화시킨 T 세포보다 양호하거나 보다 우수한 것을 나타낸다. PBMC는 (i) 플레이트 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체; (ii) 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체; 및 (iii) 비드 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시켰다. 활성화된 세포는 1-2×108 TU/106 PBMC에서 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 확장된 항-CD19 CAR T 세포를 CD19 발현 바우디(Baudi) 세포 또는 비-CD19 발현 K562 세포와 함께 공-배양했다. 가영성 항체를 사용하여 활성화시킨 항-CD19 CAR T 세포는 항원 특이적 방식으로 다우디 세포를 사멸시켰지만, 다른 방법에 의해 활성화시킨 항-CD19 CAR T 세포는 양호하게 또는 보다 우수하게 K562 세포를 사멸시키지는 않았다.
도 8은 본원에서 의도된 방법을 사용하여 제조한 CAR T 세포에 의한 항원 특이적 종양 클리어런스의 대표적 실험을 나타낸다. PBMC는 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시키고, 1-2×108 TU/106 PBMC에서 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 항-CD19 CAR T 세포는 CD19 발현 다우디 Daudi 세포를 사멸시켰지만, 비-CD19 발현 K562 세포를 사멸시키지는 않았다.
도 9는 소규모 연구 T 세포 제조 플랫폼 및 대규모 임상 cGMP 약물 제조 플랫폼의 플로우차트 비교를 나타낸다. 소규모 프로세스는 데이터가 대규모 cGMP 제조 플랫폼에 필적할 수 있다는 보증과 함께 CART 작제물의 보다 높은 산출량 평가를 가능하게 했다.
도 10은 신선한 PBMC, 세포 배양 백 및 임의로 WAVE 생물반응기를 사용한 T 세포 제조 플랫폼의 플로우차트를 나타낸다.
도 11은 동결된 PBMC, 세포 배양 백 및 임의로 WAVE 생물반응기를 사용한 T 세포 제조 플랫폼의 플로우차트를 나타낸다.
도 12는 시선한 PBMC 및 GREX 생물반응기를 사용한 T 세포 제조 플랫폼의 플로우차트를 나타낸다.
도 13는 소규모 및 대규모 제ㅗ 방법으로부터 최종 제조된 CAR T 세포 생성물의 표현형을 비교하는 대표적 실험을 나타낸다. CD4, CD8, CAR T 작제물, CD56 및 CD62L 세포 표면 마커의 발현에 대한 FACS 분석은 플랫폼 사이에 최종 CAR T 생성물의 표현형의 어떠한 유의한 차이도 동정하지 않았다. 2개 플랫폼 사이에서 모든 표면 마커에 대한 p≥0.20. (n=3).
도 14는 세포 세이버(Cell Saver®) 5+ 자가 혈액 회수 시스템(Haemonetics)에 대해 수행된 FICOLL™ 단리 및 세척을 사용하여 18개 공여체로부터의 PBMC의 세포 조성물을 나타낸다. 수득되는 세포 모집단은 CD45+ 세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 및 수지상 세포에 대한 FACS를 특징으로 한다. 18개 공여체 가운데 세포 프로파일이 일치하였다.
도 15는 상이한 방법을 사용하여 제조하는 CAR T 세포가 최종 세포 생성물과 비교하여 생성되었음을 나타낸다. CAR T 세포는 소규모(T25 플라스크) 및 대규모(GREX100, 정적 세포 배양 백 및 WAVE 생물반응기) 장치를 사용하여 제조했다. 10일 배양 기간에 걸쳐 세포 성장률 및 확장된 세포 수는 방법 사이에서 동등했다. (A). FACS 분석은 CD3+ 세포의 양이 제조 방법 사이에서 일치했음을 나타냈다. (B). qPCR은 CD3+ 세포의 VCN이 시험된 다양한 제조 방법 사이에서 동등했음을 나타냈다.
도 16은 복수의 렌티바이러스 CAR 작제물의 카툰 맵을 나타낸다. 작제물은 프로모터, scFV, +/- 링커, 힌지, 막관통 영역 및 시그날전달 도메인이 상이했다.
도 17은 다양한 CAR T 세포 생성물이 (A) 동등한 성장률; (B) VCN; 및 (C) 상이한 CAR 작제물의 세포 표면 발현을 나타냈음을 나타낸다.
도 18은 CAR T 세포의 발현을 사용하는 항원 특이적 종양 클리어런스를 나타낸다. (A). 항-BCMA 발현 CAR T 세포는 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지된 BCMA 발현 종양 세포를 사멸시켰고; 형광은 FACS에 의해 측정했다. (B). 항-BCMA 발현 CAR T 세포는 BCMA를 발현하도록 유전적으로 변형된 K562 세포 및 K562 세포와 공-배양했고, 상청액은 24시간 후에 수집했고, ELISA에 의해 IFN-γ 방출에 대해 분석했다.(n=3).
상세한 설명
A. 개요
양자 세포 치료제를 제조하는 기존의 방법은 번잡하고 고가이며, 진료소에서 광범위한 치료로서 ACT의 사용에 대한 거대한 장벽을 제시하고 있다. 조성물 및 방법은 세포-기반 치료제의 제조와 관련된 이들 및 기타 문제에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명은 일반적으로 T 세포 치료제를 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 바라지 않지만, 본원에서 의도된 본 발명의 방법은, 종래 기술의 기존 T 세포 조성물과 비교하여, 재현성 있고 신뢰성 있으며 강력한 ACT 제조 플랫폼을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 양자 세포 치료제를 제조하는 방법, 면역 작동 세포 조성물 또는 치료제, 면역 작동 세포를 확장시키는 방법, 및 면역 작동 세포 제조 플랫폼이 제공된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 조작된 TCR 또는 CAR 면역 작동 세포 조성물은 본원에서 의도된 방법에 의해 제조되고, 이는 면역 작동 세포 양자 세포 요법의 효력을 추가로 증가시킬 수 있다. 본원에서 의도된 제조된 세포 조성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증 질환 및 면역결핍증을 포함하는 다수의 상태의 치료 또는 예방에 유용하다.
다양한 실시형태에서, 면역 작동 세포를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법은 면역 작동 세포를 포함하는 세포 모집단을 수득하고, 세포 모집단을 활성화시키고, 세포 모집단을 배양하여 면역 작동 세포를 확장시키는 것을 수반한다. 특정 실시형태에서, 면역 작동 세포는 T 세포, 및 임의로 NK 세포 및/또는 NKT 세포를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 면역 작동 세포는 세포 배양 백 및/또는 생물반응기에서 제조된다.
기타 다양한 실시형태에서, 면역 작동 세포는 생물반응기에서 제조된다.
한 가지 실시형태에서, T 세포를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법은 대상체로부터 세포를 수거하고, 밀폐계 프로세서를 사용하여 세포 모집단을 단리하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 임의의 적합한 신한 또는 동결된 공급원으로부터 단리할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단리된 세포 모집단은 말초혈 단핵구 세포(PBMC)를 포함한다. 단리된 세포 모집단은 배양을 개시하기 위해 씨딩되고, T 세포는 세포를 일차 및 공자극 리간드와 접촉시킴으로써 활성화되고 자극된다. 특정 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 포함하는 세포 모집단은 형질도입된 세포를 특정 표적 항원으로 재지시하도록 바이러스 벡터로 형질도입된다. 특정 실시형태에서, 세포는 CAR 또는 조작된 TCR을 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 이어서, 형질도입된 세포 또는 비-형질도입된 세포는 성장 배지에서 배양하여 면역 작동 세포, 예를 들면, T 세포를 확장시킬 수 있다. 이어서, 제조된 면역 작동 세포 조성물은 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있거나, 차후의 사용을 위해 동결될 수 있다.
본원에서 의도된 방법을 사용하여 제조된 양자 세포 치료제는 재현가능한 수준의 확장, 세포 프로파일, VCN을 갖는 세포 약물 생성물을 생성하는데 효과적이고, 항원-특이적 종양 클리어런스를 매개하는데 효과적이다. 상기 방법은 양자 세포 치료제를 생성하는데 있어서 환자간 변동성을 감소시키고, 재현가능하고 신뢰성이 있으며 확장성이 있고 cGMP 제조 프로세스로 이행가능하다. 따라서, 본원에서 의도된 방법 및 조성물은 기존의 양자 세포 면역요법과 비교하여 양자적 개선을 나타낸다.
본 발명의 실시는, 반대로 명확하게 지시하지 않는 한, 당해 기술분야의 숙련가의 범위 내에 있는 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학 및 세포 생물학의 통상의 방법을 사용할 것이고, 이들 중 다수는 예시의 목적을 위해 하기에 기재되어 있다[참조: Sambrook, et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(3rd Edition, 2001); Sambrook, et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); Maniatis et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(1982); Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning : A Practical Approach, vol. I & II(IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; as well as monographs in journals such as Advances in Immunology].
본원에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허원은 이의 전체가 참조로서 본원에 도입된다.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 숙련가에 의해 통상 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있고, 조성물, 방법 및 재료의 바람직한 실시형태는 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 이하에 정의된다.
관사 "a", "an" 및 "the"는 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 만큼 상이한 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은, 수치를 선행하는 경우, 당해 값 ± 15%, 10%, 5% 또는 1% 범위를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상인 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, "실질적으로 동일한"은, 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 대략 동일한 효과, 예를 들면, 생리학적 효과를 생성하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 당해 문맥이 별도로 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하지만, 어떤 다른 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "~로 이루어진"은 문구 "~로 이루어진"에 후속하는 것이 모든 것을 포함하며, 이들로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "~로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 필수적인 것이고, 존재할 수 있는 다른 요소가 없음을 나타낸다. "본질적으로 ~로 이루어진"은 문구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소의 개시에 명시된 활성 또는 작용을 저해하지 않거나 명시된 활성 또는 작용에 기여하는 기타 요소들로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "본질적으로 ~로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 필수적이지만, 임의적이고 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 아닌지의 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 기타 요소가 없음을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "하나의 실시형태" 또는 "실시형태", "특정한 실시형태", "관련 실시형태", "특정 실시형태", "추가의 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정한 양상, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 위치에서 상기 문구의 출현은 반드시 모두가 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 특정한 특색, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 모든 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포 제조" 또는 "T 세포의 제조 방법" 또는 동등한 용어는 T 세포의 치료 조성물을 생성하는 방법을 지칭하고, 제조 방법은 T 세포 또는 정제된 T 세포 모집을 포함하는 세포 모집단에 대해 1회 또는 복수회 수행된 하기 단계 중의 하나 이상 또는 전부를 포함할 수 있다: 수거, 단리, 세척, 자극, 활성화, 변형, 확장, 동결보존 및 해동, 또는 이의 임의 적합한 조합.
용어 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 당해 기술분야에서 인식되고, 흉선세포, 천연 T 림프구, 미성숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지 T 림프구 또는 활성화된 T 림프구를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적 T 세포 모집단은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포), 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포, 또는 T 세포의 임의의 다른 서브세트를 포함한다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 T 세포의 기타 예시적 모집단은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하기 마커 중의 하나 이상을 발현하는 T 세포를 포함하고: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD197 및 HLA-DR, 필요한 경우, 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리할 수 있다.
말초혈 단핵구(PBMC)는 원형 핵을 갖는 임의의 혈액 세포(예: 림프구, 단핵구 또는 마크로파지)로서 정의된다. 이들 혈액 세포는 감염과 싸우고 침입자에 적응하기 위한 면역계에서 중요한 성분이다. 림프구 모집단은 CD4+와 CD8+ T 세포, B 세포와 천연 킬러 세포, CD14+ 단핵구, 및 염기구/호중구/호산구/수지상세포로 이루어진다. 이들 세포는 종종 FICOLL™, 혈액의 층을 분리하는 친수성 다당류를 사용하여 전혈 또는 백혈구로부터 분리되고, 단핵구 및 림프구는 혈장의 층하에 연막을 형성한다. 한 가지 실시형태에서, "PBMC"는 적어도 T 세포, 및 임의로 NK 세포 및 항원 제시 세포를 포함하는 세포 모집단을 지칭한다.
"항원-제시 세포"는 항원을 T 세포로 프로세싱 및 제시함으로써 세포 면역 반응을 매개하는 면역성 세포의 이종성 그룹을 지칭한다. 항원-제시 세포는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 마크로파지, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, B-림프구, 혈소판 및 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 포함한다.
aAPC는 다양한 공자극 분자 및 사이토킨의 안정한 발현 및 분비를 지시하기 위해 K562, U937, 721.221, T2 및 C1R 세포를 조작함으로써 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, K32 또는 U32 aAPC는 AAPC 세포 모집단 상에 하나 이상의 항체-기반 자극 분자의 표시를 지시하기 위해 사용된다. T 세포 모집단은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L) 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하는 다양한 공자극 분자를 발현하는 aAPC에 의해 확장할 수 있다. 마지막으로, aAPC는 유전적으로 변형된 T 세포를 확자하고 CD8 T 세포 상에서 CD28 발현을 유지하기 위한 효율적인 플랫폼을 제공한다. 국제공개공보 제WO 03/057171호 및 제US2003/0147869호에 제공된 aAPC는 이의 전체가 참조로서 본원에 도입된다.
본원에 사용된 바와 같이, "증식"은 세포 분열, 세포의 대칭적 또는 비대칭적 분열의 증가를 지칭한다. 특정 실시형태에서, "증식"은 T 세포의 대칭적 또는 비대칭적 분열을 지칭한다. "증가된 증식"은, 무처리 샘플 중의 세포와 비교하여 처리된 샘플에서 세포 수가 증가하는 경우에 발생한다.
"면역 작동 세포"는 하나 이상의 작동 기능(예: 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토킨의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포이다. 본원에서 의도된 예시적 면역 작동 세포는 림프구, 특히 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포) 및 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포)이다. 당해 기술분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 세포도 또한 본원에 기재된 CAR을 갖는 면역 작동 세포로서 사용될 수 있다. 특히, 면역 작동 세포는 또한 NK 세포, NKT 세포, 호중구 및 마크로파지를 포함한다. 특정 실시형태에서, T 세포 및 하나 이상의 기타 세포 유형, 예를 들면, NK 세포, NKT 세포, 호중구 및/또는 마크로파지는 본원에서 의도된 제조 방법을 사용하여 유전적으로 변형 및 확장된다.
"변형된 T 세포"는 본원에서 의도된 조작된 TCR 또는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 변형된 T 세포를 지칭한다. 변형된 T 세포는 유전적 및 비-유전적 변형(예:에피좀 또는 염색체외) 둘 다를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전적으로 조작된" 또는 "유전적으로 변형된"은 세포 중의 전체 유전 물질에 DNA 또는 RNA의 형태로 추가 외부 물질의 부가를 지칭한다.
용어 "유전적으로 변형된 세포", "변형된 세포" 및 "재지시된 세포"는 상호 교대로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 요법"은, 유전자의 발현을 회복, 수정 또는 변형시키거나 치료 폴리펩티드, 예를 들면, TCR 또는 CAR 및/또는 하나 이상의 사이토킨을 발현시킬 목적으로 세포 중의 전체 유전 물질에 DNA 또는 RNA의 형태로 추가 유전 물질의 도입을 지칭한다. 특정 실시형태에서, T 세포는, 예를 들면, TCR 또는 CAR을 발현하는 에피좀 벡터를 세포에 도입함으로써 세포의 게놈을 변형시키지 않고서 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하도록 조작된다.
용어 "생체외"는 일반적으로 생물체 외부에서 발생하는 활성, 예를 들면, 바람직하게는 천연 조건의 최소 변형과 함께, 생물체 외부의 인공 환경에서 살아있는 조직에서 또는 살아있는 조직에 대해 수행된 실험 또는 측정을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체외" 절차는 생물체로부터 채취하고 실험 장치에서 통상 멸균 조건하에, 환경에 따라, 통상 수시간 또는 최대 약 24시간, 그러나 최대 48시간 또는 72시간 동안 배양 또는 조절한 생세포 또는 조직을 수반한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집하고 동결시킬 수 있고, 차후에 생체외 처리를 위해 해동시킬 수 있다. 살아있는 세포 또는 조직을 사용하여 수일 이상 지속하는 조직 배양 실험 또는 절차는 통상 "시험관내"인 것으로 간주되며, 특정 실시형태에서, 이러한 용어는 생체외와 상호 교대로 사용될 수 있다.
용어 "생체내"는 일반적으로 생물체 내부에서 발생하는 활성, 예를 들면, 세포 자가-복제 및 세포의 확장을 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, 용어 "생체내 확장"은 생체내에서 수를 증가시키는 세포 모집단의 능력을 지칭한다.
용어 "자극"은, 이의 동족 리간드와 자극 분자를 결합(예: TCR/CD3 복합체)시켜, 이로써 한정되는 것은 아니지만, TCR/CD3 복합체를 통해 시그날 형질도입을 포함하는 시그날 형질도입 사상을 매개함으로써 유도된 일차 반응을 지칭한다.
"자극 분자"는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 지칭한다.
"자극 리간드"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 제시 세포(예: aAPC, 수지사 세포, B-세포 등) 상에 존재하는 경우, T 세포 상에서 동족 결합 파트너(본원에서 "자극 분자"로서 지칭됨)와 특이적으로 결합하여, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하는 T 세포에 의한 일차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 지칭한다. 자극 분자는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, CD3 리간드 또는 결합제, 예를 들면, 항-CD3 항체 및 CD2 리간드 또는 결합제, 예를 들면, 항-CD2 항체를 포함한다.
용어 "활성화"는 검출가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 활성화는 또한 유도된 사이토킨 생성 및 검출가능한 작동 기능과 연관될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는, 그 중에서도, 증식하고 있는 T 세포를 지칭한다. TCR 단독에 의해 생성된 시그날은 T 세포의 충분한 활성화에 불충분하고, 하나 이상의 이차 또는 공자극 시그날이 또한 요구된다. 따라서, T 세포 활성화는 TCR/CD3 복합체 및 하나 이상의 이차 공자극 시그날을 통한 일차 자극 시그날을 포함한다. 공자극은 일차 활성화 시그날, 예를 들면, CD3/TCR 복합체 또는 CD2를 통한 자극을 제공받은 T 세포에 의한 증식 및/또는 사이토킨 생성에 의해 입증될 수 있다.
"공자극 시그날"은, 일차 시그날과 조합, 예를 들면, TCR/CD3 연결과 조합하여, T 세포 증식, 사이토킨 생성, 및/또는 특정 분자의 상향조절 또는 하향 조절을 유도하는 시그날을 지칭한다.
"공자극 리간드"는 공자극 분자에 결합하는 분자를 지칭한다. 공자극 리간드는 가용성일 수 있거나, 표면 상에 제공될 수 있다. 공-자극 리간드는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작동제 또는 항체 및 B7-H3에 결합하는 리간드를 포함한다. 공-자극 리간드는 또한, 특히, T 세포 상에 존재하는 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림라구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
"공자극 분자"는 T 세포 상의 동족 결합 파트너, 예를 들면, 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 증식을 포함하는, T 세포에 의한 공-자극 반응을 매개하는 CD28을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "자기"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "동종"은 비교하는 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "동계"는 비교하는 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "이종"은 비교하는 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "개체" 및 "대상체"는 종종 상호 교대로 사용되며, 본원의 다른 개소에 기재된 유전자 치료 벡터, 세포 기반 치료제 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암, 감염성 질환, 면역결핍 질환 또는 자가-면역 질환의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 적합한 대상체(예: 환자)는 실험실 동물(예: 마우스, 랫트, 래빗 또는 기니아 피그), 농장 동물 및 가축 또는 애완동물(예: 고양이 또는 개)을 포함한다. 비-인간 영장류 및, 바람직하게는, 인간 환자가 포함된다. 전형적인 대상체는, 암, 감염성 질환, 면역결핍증, 염증 질환 또는 자가-면역 질환을 갖거나, 암, 감염성 질환, 면역결핍증, 염증 질환 또는 자가-면역 질환으로 진단되거나, 암, 감염성 질환, 면역결핍증, 염증 질환 또는 자가-면역 질환을 가질 위험에 있는 인간을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 본원의 다른 개소에 개시된 유전자 치료 벡터, 세포-기반 치료제 및 방법으로 치료될 수 있는 특정 징후로 진단된 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리학적 상태의 증상 또는 병리학에 대한 모든 유익하거나 바람직한 효과를 포함하며, 치료될 질환 또는 상태(예: 암)의 하나 이상의 측정가능한 마커의 최소 감소도 포함할 수 있다. 치료는 임의로, 질환 또는 상태의 증상의 감소 또는 개선, 또는 질환 또는 상태의 진행의 지연을 포함할 수 있다. "치료"는 질환 또는 상태, 또는 이의 연관된 증상을 반드시 완전히 근절하거나 치유하는 것을 나타내는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방하다", 및 "예방된", "예방하는" 등의 유사한 단어들은 질환 또는 상태(예: 암)의 출현 또는 재발의 가능성을 방지, 억제 또는 감소시키는 접근법을 나타낸다. 또한, 이는 질환 또는 상태의 발현 또는 재발을 지연시키거나, 질환 또는 상태의 증상의 출현 또는 재발을 지연시키는 것을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어들은 또한 질환 또는 상태의 발현 또는 재발 전에 질환 또는 상태의 강도, 영향, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "양"은 임상 결과를 포함하여 유리한 또는 목적하는 예방적 또는 치료적 결과를 달성하기 위한 유전적으로 치료 세포(예: T 세포)의 "효과적 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방적 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하기에 효과적인 유전적으로 변형된 치료 세포의 양을 지칭한다. 전형적으로, 그러나 반드시 필요한 것은 아니지만, 예방적 용량은 질환의 초기 단계 전에 또는 초기 단계에 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적다.
유전적으로 변형된 치료 세포의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유발하는 T 세포의 능력 등의 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입된 치료 세포의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료학적으로 유리한 효과가 상회하는 것이다. 용어 "치료학적 유효량"은 대상체(예: 환자)를 "치료"하는데 효과적인 양을 포함한다. 치료적 유효량이 지시되는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 대사 정도 및 상태를 고려하여 주치의에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 일반적으로 비정상 세포가 조절 없이 분열하고 부근 조직으로 침입할 수 있는 질환 또는 상태의 부류에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "악성"은 종양 세포의 그룹이 하나 이상의 비조절된 성장(즉, 정상 한계를 초과하는 분열), 침윤(즉, 인접 조직으로의 침입 및 파괴) 및 전이(즉, 림프 또는 혈액을 통해 신체 중의 다른 장소로의 확산)를 나타내는 암이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전이"는 신체의 한 부분으로부터 다른 부분으로의 암의 확산을 지칭한다. 확산된 세포에 의해 형성된 종양은 "전이성 종양" 또는 "전이"라 불리운다. 전이성 종양은 본래(원발) 종양의 것과 유사한 세포를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "양성" 또는 "비-악성"은 보다 크게 성장할 수 있지만 신체의 한 부분으로부터 다른 부분으로 확산하지 않는 종양을 지칭한다. 양성 종양은 자체-제한되고, 전형적으로 침입 또는 전이하지 않는다.
"암 세포" 또는 "종양 세포"는 암 성장의 개개 세포 또는 조직을 지칭한다. 종양은 일반적으로 세포의 비정상 성장에 의해 형성된 팽윤 또는 병변을 지칭하고, 이는 양성, 프리-악성 또는 악성일 수 있다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 일부, 예를 들면, 백혈병은 반드시 종양을 형성하는 것은 아니다. 종양을 형성하는 이들 암의 경우, 용어 암(세포) 및 종양(세포)는 상호 교대로 사용된다. 개체에서 종양의 양은 종양의 수, 용적 또는 중량으로 측정될 수 있는 "종양 양"이다.
"감염성 질환"은 인간에서 인간으로 또는 생물체에서 생물체로 전달될 수 있고 미생물제(예: 감기)에 의해 유발되는 질환을 지칭한다. 감염성 질환은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 간염, 성 전달 질환(예: 클라미디아, 임질), 결핵, HIV/AIDS, 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라 및 인플루엔자를 포함한다.
"자가면역 질환"은 신체가 이의 자신의 조직의 일부 구성분에 대한 면역원성(즉, 면역계) 반응을 생성하는 질환을 지칭한다. 달리 말하면, 면역계는 신체 내의 일부 조직 또는 시스템을 "자가"로서 인식하는 이의 능력을 상실하고, 이것이 외래인 것과 같이 이를 표적화하고 공격한다. 자가면역 질환은 주로 하나의 기관이 발병(예: 용혈성 빈혈 및 항-면역 갑상선염)되는 것들, 및 자가면역 질환 프로세스가 다수의 조직(예: 전신성 루프스 에리트네마토수스)을 통해 확산되는 것들로 분류할 수 있다. 예를 들면, 다발서 경화증은 뇌 및 척수의 신경 섬유를 둘러싸는 시스(sheath)에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 이는 조정, 약한 및 시력 장애의 상실을 제공한다. 자가면역 질환은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 용혈성 비혈, 항-면역 갑상선염, 전신성 루프 에리테마토수스, 셀리아 질환, 크론병, 대장염, 당뇨병, 강피증, 건선 등을 포함한다.
"면역결핍증"은 면역계가 질환 또는 화학물질의 투여에 의해 절충되는 환자의 상태를 의미하다. 이 상태는 당해 시스템을 외래 물질에 대해 방어하는데 필요한 혈액 세포의 수 및 유형에서 부족하게 한다. 면역결핍 상태 또는 질환은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, AIDS(후천성 면역결핍 증후군), SCID(중증 복합 면역결핍 질환), 선택적 IgA 결핍증, 공통의 가변 면역결핍, X-연쇄 무감마글로불린혈증, 만성 육아종 질환, 고-IgM 증후군 및 당뇨병을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "염증 질환"은 급성 또는 만성 염증 상태를 지칭하고, 이는 감염성 또는 비-감염성 원으로부터 발생할 수 있다. 다양한 감염성 원인은 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 결핵, 피부염, 및 성인 호흡 강박 증후군을 포함한다. 비-감염성 원인은 외상(화상, 절상, 타박상, 압궤 손상), 자가면역 질환 및 기관 거부 에피소드를 포함한다.
"증강" 또는 "촉진" 또는 "증가" 또는 "확장"이란 일반적으로, 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응과 비교하여, 보다 많은 생리학적 반응(즉, 하류 효과를 생성, 유도 또는 유발하는 본원에서 의도된 조성물의 능력을 지칭한다. 측정가능한 생리학적 반응은, 당해 기술분야에서의 이해 및 본원의 기재로부터 명백한 것들 중에서, T 세포 확장, 활성화, 증식의 증가 및/또는 암 세포 사멸 능력에서의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "증강된" 양은 통상 "통계학적으로 유의한" 양이고, 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 형성된 반응과 비교하여 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예: 500, 1000배)(1 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들면, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등을 포함함)인 증가를 포함할 수 있다.
"감소" 또는 "저하" 또는 "저감" 또는 "경감" 또는 "완화"란, 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응과 비교하여 보다 적은 생리학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성, 유도 또는 유발하는 본원에서 의도된 조성물의 능력을 일반적으로 지칭한다. "저하" 또는 "감소된" 양은 통상 "통계학적으로 유의한" 양이고, 비히클, 대조군 조성물 또는 특정 세포 계통에서의 반응에 의해 생성된 반응과 비교하여 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예: 500, 1000배)(1 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들면, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등을 포함함)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화 없는" 또는 "실질적 변화 없는" 또는 "실질적 감소 없는"이란 비히클, 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응 또는 특정 세포 계통에서의 반응과 비교하여 세포에서 보다 적은 생리학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성, 유도 또는 유발하는 본원에서 의도된 조성물의 능력을 일반적으로 지칭한다. 필적하는 반응은 기준 반응으로부터 유의적 차이 또는 측정가능한 차이가 없는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "특이적 결합 친화성" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 표적화하는"은 배경 결합보다 큰 결합 친화성으로 또 다른 분자에 대한 한 분자의 결합을 기재한다. 결합 도메인(또는 결합 도메인을 포함하는 CAR 또는 결합 도메인을 함유하는 융합 단백질)은, 예를 들면, 약 105 M-1 이상의 친화성 또는 Ka(즉, 1/M의 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수)로 표적 분자에 결합하거나 이와 연합하는 경우, 표적 분자에 대해 "특이적으로 결합한다". 특정 실시형태에서, 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)은 약 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 또는 1013 M-1 이상의 Ka로 표적에 결합한다. "고도 친화성" 결합 도메인(또는 이의 일본쇄 융합 단백질)은 적어도 107 M1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1 또는 그 이상의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다.
또는, 친화성은 M의 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)(예: 10-5 M 내지 10-13 M 또는 그 이하)로서 정의될 수 있다. 본 개시에 따른 결합 도메인 폴리펩티드 및 CAR 단백질의 친화성은 통상의 기술, 예를 들면, 경쟁 ELISA(효소-결합된 면역흡착 검정)에 의해, 또는 표지된 리간드를 사용하거나 바이아코어(Biacore) T100(이는 뉴저지주 피스카타웨이 바이아코어 인코포레이티드로부터 이용가능함) 등의 표면-플라스몬 공명 장치 또는 각각 코닝(Corning) 및 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 이용가능한 EPIC 시스템 또는 EnSpire 등의 광학 바이오센서 기술을 사용하는 결합 회합 또는 치환 분석에 의해 용이하게 측정할 수 있다[참조: Scatchard et al .(1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; 및 미국 특허 제5,283,173호; 제5,468,614호, 또는 그 등가물].
한 가지 실시형태에서, 특이적 결합의 친화성은 배경 결합보다 약 2배 크거나, 배경 결합보다 약 5배 크거나, 배경 결합보다 약 10배 크거나, 배경 결합보다 약 20배 크거나, 배경 결합보다 약 50배 크거나, 배경 결합보다 약 100배 크거나, 배경 결합보다 약 1000배 크다.
"항원(Ag)"은, 동물 내로 주입되거나 흡수되는 조성물(예: 종양-특이적 단백질을 포함하는 것)을 포함하는, 동물에서 항체 또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 지칭한다. 항원은, 개시된 항원 등의 이종성 항원에 의해 유도된 것들을 포함하여 특정의 체액성 또는 세포 면역성의 생성물과 반응한다. "표적 항원" 또는 "목적하는 표적 항원"은, 본원에서 의도되는 CAR 또는 조작된 TCR의 결합 도메인이 결합하도록 설계되어 있는 항원이다.
"에피토프" 또는 "항원성 결정기"는 결합제가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다.
"단리된 펩티드" 또는 "단리된 폴리펩티드" 등은, 본원에서 사용된 바와 같이, 세포 환경으로부터 및 세포의 다른 성분과의 회합으로부터 펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 시험관내 단리, 합성 및/또는 정제를 지칭하고, 즉 이는 생체내 물질과 현저하게 회합하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된 폴리뉴클레오티드"는, 재조합, 합성 또는 비천연 발생 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 천연에 존재하지 않고 인간의 손으로 제조되는 단리된 상보성 DNA(cDNA) 또는 기타 폴리뉴클레오티드의 시험관내 단리, 합성 및/또는 정제를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 천연-발생 상태에서 이에 인접하는 서열로부터 정제된 재조합, 합성 또는 비천연 발생 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 통상 단편에 인접하는 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다.
바람직하게는, 본원에서 의도된 방법을 사용하여 제조된 세포 치료제는 내독소 비함이고, cGMP 관행에 따라 제조된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "내독소 비함유"는 최소 미량(즉, 대상체에 대해 어떠한 생리학적 부작용을 갖지 않는 양)의 내독소 및 바람직하게는 검출불가능한 양의 내독소를 함유하는 용기 및/또는 조성물을 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, 용어 "내독소 비함유"는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 내독소 비함유의 조성물의 지칭한다. 내독소는, 내독소가 그람-양성 세균, 예를 들면, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에서 발견될 수도 있지만, 특정 세균, 통상 그람-음성 세균과 연관되는 독소이다. 가장 보급된 내독소는 다양한 그람-음성 세균의 외부 막에서 발견되는 리포다당(LPS) 또는 리포올리고당(LOS)이고, 이는 질환을 유발하는 이들 세균의 능력에서 중심적 병원성 특징을 나타낸다. 인간에서 소량의 내독소는, 다른 생리학적 부작용 중에서, 고열, 혈압의 저하 및 염증 및 응고의 활성화를 생성할 수 있다. 따라서, 소량이어도 인간에서 부작용을 유발할 수 있기 때문에 약물 생성물 용기로부터 최대 또는 모든 미량의 내독소를 제거하는 것이 종종 바람직하다. 내독소는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 용기로부터 제거될 수 있고, 예를 들면, 용기는 내독소-비함유 물로 HEPA 여과된 세척 장치에서 세정하고, 250℃에서 탈발열시키고, 클라스 100/10 청정 룸 내부에 배치된 HEPA 여과된 워크스테이션에서 청정-패키징할 수 있다(예를 들면, 클라스 100 청정 룸은 공기의 입방 피트에 1/2마이크론 이하 크기의 100개 미만의 입자를 함유한다).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "현재 우수한 제조 관행(cGMP)"는 식품, 약제 생성물 및 의료용 장치의 제조의 조절 및 관리, 및 품질 관리 시험을 지칭한다. cGMP는 샘플링에 반드시 의존하는 것은 아니며, 대신에 약물 및 의료용 장치 제조에 수반되는 프로세스, 활성 및 작동의 모든 측면의 문서화에 의존한다. 생성물이 어떻게 제조되고 시험(이는 추적을 가능하게 하고, 장래 문제가 발생하는 경우에 시장으로부터 회수를 가능하게 한다)되는지를 나타내는 문서화가 정확하지 않거나 순차로 되어 있지 않으면, 생성물은 요구된 명세를 만족하지 않고 오염된 것으로 간주된다(US에서 불순물). 추가로, cGMP는 통상적으로 모든 제조 및 시험 장비가 사용에 적합한 것으로 인정되고 약물 제조 프로세스에 이용된 모든 작동 방법 및 절차(예: 제조, 세정 및 분석 시험)가, 이들이 소위 말하는 기능(들)을 수행할 수 있는 것을 입증하기 위해 소정 명세에 따라 검증된 것을 필요로 한다. 미국에서, 문구 "현재 우수한 제조 관행"은 1938 식품, 의약품 및 화장품 법률(21 U.S.C. § 351)의 501(B)에서 나타난다.
C. T 세포 제조 방법
현재, 기존의 T 세포 제조 방법은 CAR T 세포의 단리, 활성화, 형질도입 및 확장을 위한 다양한 복잡한 단계를 포함한다. 대조적으로, 본 발명자들은 소규모 연구 모델을 사용하여, 조작된 CAR T 세포를 위한 대규모 임상 cGMP 제조 프로세스로 전이되는 단순한, 강력한, 충분히 특성 부여된, 유연한, 폐쇄계 T 세포 제조 플랫폼을 개발했다.
다양한 실시형태에서, 세포는 밀폐계 처리를 사용하거나 밀폐계 세포 처리와 조합하여 제조한다. 밀폐계 세포 처리는 "밀폐된" 또는 재밀봉가능한 용기에서 처리, 원심분리, 배양, 배지 첨가, 세포 선별, 세포 세척 및 최종 충전 및 가공을 자동화한다. 밀폐계 세포 처리는 프로세스를 통합하고 자동화하며, 일정한 및 작동자-독립적 품질을 제공하기 위해 다수의 정량적으로 조절된 수작업을 복제한다.
자동화된 밀폐계 세포 처리와 연관된 이점은 치료제 비용(전형적으로 2590%) 및 요구된 작동자의 수(전형적으로 > 70%)의 현저한 감소; 숙련된 노동자의 낮은 의존성; 보다 우수한 시설(전형적으로 3050%)을 통한 자본 투자의 현저한 절약; 개선된 품질 및 보다 적은 품질 사례; 및 시장 수요에 적합하게 하도록 보다 용이하게 확장 및 축소하는 능력을 포함할 것이다.
다양한 실시형태에서, 치료 T 세포 조성물을 제조하는 방법은 밀폐계 프로세스를 사용하여 면역 작동 세포 및 항원 제시 세포를 포함하는 세포 모집단을 수득하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 단리된 세포 모집단은 배양을 개시하기 위해 특정 밀도로 씨딩되고, T 세포는 세포를 일차 및 공자극 리간드와 접촉시킴으로써 활성화 및 자극된다. 특정 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 포함하는 세포 모집단은 CAR 또는 조작된 TCR을 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입되고, T 세포를 확장하기 위해 배양된다. 이어서, 치료 T 세포를 포함하는 제조된 면역 작동 세포 조성물을 사용하여 이를 필요로 하는 대상체를 치료하거나 장래 사용을 위해 동결시킬 수 있다.
1. T 세포 공급원
특정 실시형태에서, T 세포는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 말초혈, 말초혈 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 이슈, 감염 부위의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, T 세포는 또한 배양된 T 세포주, 예를 들면, Jurkat, SupT1 등으로부터 수득할 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포를 포함하는 세포 모집단, 예를 들면, PBMC는 본원에서 의도된 제조 방법에 사용된다. 다른 실시형태에서, 단리되거나 정제된 T 세포 모집단은 본원에서 의도된 제조 방법에 사용된다.
한 가지 실시형태에서, T 세포의 공급원은 또한 상업적으로, 예를 들면, 상귄 바이오사이언스(Sanguine Biosciences)에서 수득할 수 있다.
2. 세포 수거
본 발명은 개선된 T 세포 조성물의 제조를 의도한다. 세포는 자기/자가("자기") 또는 비-자기("비-자기", 예를 들면, 동종이계, 동계 또는 이종)일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 세포는 포유동물 대상체로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 영장류 대상체로부터 수득된다. 특정 실시형태에서, 세포는 인간 대상체로부터 수득된다.
다양한 실시형태에서, T 세포를 포함하는 세포 모집단은 개체로부터 수득되고, 본원에서 의도된 제조 방법에 제공된다. 한 가지 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법(apheresis), 예를 들면, 백혈구분리반출에 의해 수득된다. 분리반출법 생성물은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 핵화 백혈구 세포, 적혈구 세포 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유할 수 있으며 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 핵화 백혈구 세포를 포함하는 림프구를 포함하는 백혈구분리반출 생성물일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포는 세척하여 혈장 분획을 제거하고 후속 처리를 위해 적적한 완충제 또는 매질에 세포를 위치시킬 수 있다. 세포는 PBS, 또는 칼슘, 마그네슘 및 대부분(그러나 전부는 아님) 이가 양이온을 결여하는 또 다른 적합한 용액으로 세척할 수 있다.
T 세포를 포함하는 세포 모집단이 수득되면, 세포 모집단 내의 세포 계수 및 세포 생존률을 측정하고, 모집단 또는 이의 일부를 장래 사용 또는 분석을 위해 동결보존할 수 있고, 모집단 중의 세포, 예를 들면, PBMC는 다수의 세포 마커 패널, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD28, CD45RA, CD45RO, CD61, CD62L, CD66b, CD127 및 HLA-DR을 사용하여 특성화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 제조 방법에 사용된 분리반출된 세포의 용적은 약 50mL 내지 약 500mL, 약 50mL 내지 약 250mL, 약 50mL 내지 약 200mL, 약 100mL 내지 약 500mL, 약 100mL 내지 약 250mL, 또는 약 100mL 내지 약 200mL, 또는 이의 임의의 개재 범위이다.
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 제조 방법에 사용된 분리반출된 세포의 용적은 약 25mL, 약 50mL, 약 75mL, 약 100mL, 약 125mL, 약 150mL, 약 175mL, 약 200mL, 약 225mL, 약 250mL, 약 275mL, 약 300mL, 약 325mL, 약 350mL, 약 375mL, 약 400mL, 약 425mL, 약 450mL, 약 475mL 또는 약 500mL, 또는 이의 임의의 개재 용적이다.
3. PBMC 단리
특정 실시형태에서, PBMC의 모집단은 본원에서 의도된 T 세포 제조 방법에서 사용된다. 특정 실시형태에서, T 세포를 포함하는 PBMC는, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 다수의 임의의 기술, 예를 들면, 원심분리 및 침강, 예를 들면, FICOLLTM 분리, PERCOLL™ 분리 등을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위 또는 분리반출된 분획으로부터 수득된다.
특정 실시형태에서, 분리반출에 의해 수집된 PBMC는 반자동 플로우쓰로우 원심분리, 예를 들면, 코베(Cobe) 2991 세포 프로세스, 세포 세이버(Cell Saver) 5 등을 사용하여 FICOLLTM 또는 PERCOLL™ 구배로 단리된다. 일부 실시형태에서, 분리반출에 의해 수집된 PBMC는 계수-플로우쓰로우 원심분리 용출 장치, 예를 들면, 테루모(Terumo) BCT ELUTRA® 등을 사용하여 FICOLLTM 또는 PERCOLL™ 구배의 사용 없이 단리된다. 세포 세이버 5의 사용은 하나의 장치 상에서 제조된 T 세포 조성물의 최종 농도 및 세척 뿐만 아니라 피콜(Ficoll)을 통한 PBMC 출발 물질의 밀폐계 처리를 가능하게 한다. 밀폐계의 사용은 cGMP 처리에 필요한 장비를 최소화함으로써 제조를 단순화하고, 일정하고 재현가능하게 순수한 PBMC 또는 최종 T 세포 조성물을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, PBMC는 ELUTRA® 계수-플로우쓰로우 원심분리 용출 장치를 사용하여 단리하고, 세포 세이버 5+ 또는 LOVO에서 세척한다.
일부 실시형태에서, PBMC의 단리 후, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구는, 밀폐계 장치 및 cGMP 시약, 예를 들면, CliniMACS를 사용하여, 활성화, 확장 및/또는 유전자 변형 전후에 천연, 기억 및 작동 T 세포로 분류할 수 있다.
단리 후, PBMC 세포 계수 및 생존률을 측정하고, PBMC 또는 이의 일부를 장래의 사용 또는 분석을 위해 동결보존할 수 있고, PBMC는 다수의 세포 마터 패널, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD45RA, CD45RO, CD61 및 CD66b를 사용하여 특성화할 수 있다.
특정 실시형태에서, PBMC를 단리한 후, 이들은, 예를 들면, 피콜(Ficoll)을 제거하기 위해 하나 이상의 세척 단계로 처리한다. 특정 실시형태에서, 세포는, 본원에서 의도된 임의의 수의 제조 단계 전에, 동안 또는 후에 1회 이상 세척할 수 있다. 세척은 임의의 적합한 완충제 또는 배양 매질, 예를 들면, HABS 또는 HSA가 보충된 CliniMACS 완충제, PlasmaLyte,TCGM, PBS, 링거액, 생리학적 식염수, 0.9% NaCl, 또는 칼슘, 마그네슘 및 대부분(그러나 전부는 아님) 이가 양이온을 결여하는 또 다른 적합한 용액에서 수행할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, PBMC를 단리한 후, 이들은 반자동 플로우쓰로우 원심분리, 예를 들면, 코베(Cobe) 2991 세포 프로세서, 세포 세이버 5, 박스터 사이토메이트(Baxter CytoMate), LOVO 등에서 세척한다. 또 다른 실시형태에서, PBMC를 단리한 후, 이들은 또 다른 멸균 용기, 예를 들면, 전달 또는 배양 용기로 전달된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용기"는 일반적으로 본원에서 기재되고 의도된 다양한 목적을 위해 세포 및 이의 부산물을 생체외 또는 시험관내 등에서 배양, 취급, 조작, 저장, 분석, 배양, 투여 및 달리는 확립, 지지, 성장, 수거, 처리 및 사용하기 위한 목적으로 사용될 수 있는 임의의 용기에 관한 것이다.
"전달 용기"는 일반적으로 기체-투과성이 없는 용기를 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, 세척은 전달 용기에서 수행하고, 후속적으로 세포 조작은 하나 이상의 유형의 세포 배양 용기에서 수행한다.
세포 배양 용기의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 세포 배양 백, 생물반응기(예: 기체-투과성 급속 확장 플라스크(G-Rex), 생물반응기, 윌슨-볼프 제조; 및 WAVE 생물반응기, GE Healthcare Life Sciences), 세포 또는 조직 배양 장치, 파우치, 캡슐, 배양 바이알, 장치, 세포 공장, 용기, 배양 튜브(예를 들면, 미세원심분리 튜브, EPPENDORF TUBES®, FALCON® 원뿔 튜브 등), 배양 접시(예: 페트리 접시), 배양 플라스크, 스피너 플라스크, 롤러 병, 다중-웰 플레이트(예: 2-웰, 4-웰, 6-웰, 12-웰, 24-웰, 48-웰, 96-웰 및 384-웰 플레이트), 마이크로-인큐베이터, 마이크로-캐리어, 마이크로플레이트, 마이크로슬라이드 및 챔버 슬라이드를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, PBMC는 반자동 플로우쓰로우 원심분리로 1회 이상 세척할 수 있고, 전달하고, 적합한 용기에서 1회 이상 세척할 수 있다.
세포 배양 백의 예시적 실시형태는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, MACS® GMP 세포 확장 백, MACS® GMP 세포 분화 백, EXP-Pak™ 세포 확장 생물-용기, VueLife™ 백, KryoSure™ 백, KryoVue™ 백, Lifecell® 백, PermaLife™ 백, X-Fold™ 백, Si-Culture™ 백, 오리겐 생물의약 동결백 및 VectraCell™ 백을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 백은 하기 특징 중의 하나 이상을 포함한다: 기체 투과성(재료는 산소, 이산화탄소 및 질소에 대해 적합한 기체 전달 속도를 갖는다); 무시가능한 물 소실율(재료는 물에 실질적으로 불투과성이다); 화학적 및 생물학적 불활성(재료는 용기 내용물과 반응하지 않는다), 및 다양한 조건에서 유연성 및 강도의 유지(재료는 마이크로파 조사하거나, UV 조사로 처리하거나, 원심분리하거나, 광범위한 온도 범위, 예를 들면, -100℃ 내지 +100℃ 내에서 사용한다).
본원에서 의도된 세포 배양 용기의 예시적 용적은, 제한 없이다, 약 10mL, 약 25mL, 약 50mL, 약 75mL, 약 100mL, 약 150mL, 약 250mL, 약 500mL, 약 750mL, 약 1000mL, 약 1250mL, 약 1500mL, 약 1750mL, 약 2000mL, 또는 그 이상의 용적(임의의 개재 용적 포함)을 포함한다. 예를 들면, 10mL과 25mL 사이의 개재 용적은 11mL, 12mL, 13mL, 14mL, 15mL, 16mL, 17mL, 18mL, 19mL, 20mL, 21mL, 22mL, 23mL 및 24mL를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 세포 배양 백의 용적은 약 100mL 내지 약 10L이다.
세척에 이어서, 단리된 세포, 세척후 세척 계수 및 생존률을 측정하고, 장래 사용 또는 분석을 위해 동결보존할 수 있고/있거나, 다수의 세포 마커, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD197, CD279 및 HLA-DR를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류(FAC) 분석을 사용하여 특성화할 수 있다.
4. 동결보존
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 T 세포 제조 방법은 T 세포를 포함하는 새롭게 단리된 세포 모집단을 사용하여 실시한다. 다른 특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 방법은 T 세포를 포함하는 동결보존된 세포 모집단을 사용하여 실시한다. 세포는 PBMC의 수거 또는 단리 후, 배양 개시 및 활성화 후, 형질도입 후, 또는 확장 후 또는 임의의 프로세스 단계 후에 동결보존할 수 있다. 제조된 T 세포는 또한 T 세포 제조 프로세스 후에 동결보존할 수 있다. 동결-해동 사이클은 비-T 세포 모집단을 제거함으로써 보다 균일한 T 세포 조성물을 제공할 수 있다.
세포 모집단은 PBMC 단리 및 본원의 다른 개소하에 본원에서 의도된 적합한 세포 배양 용기(상기 참조)에서 동결보존할 수 있다. 세포 모집단은 적합한 세포 배양 배지 및/또는 동결 배지, 예를 들면, 50% 플라스말라이트 및 50% 크리오스터 10; 50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO); 크리오스터 10; 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로즈, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스말라이트-A, 31.25% 덱스트로즈 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로즈, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는, 예를 들면, 헤스판 및 플라스말라이트 A를 함유하는 기타 적합한 세포 동결 배지에서 동결시킬 수 있다. 이어서, 세포는 조절된 속도의 냉동기에서 1분당 1℃의 속도로 약 -80℃ 내지 약 -135℃의 온도로 동결하고, 액체 질소 저장 탱크의 증기상에서 저장한다. 조절된 동결의 다른 예시적 방법, -20℃ 또는 액체 질소에서 비조절된 즉시 동결도 또한 사용할 수 있다.
동결보존 후, 세포는 37℃ 수욕에서 해동시키고, 적합한 세포 배양 배지 또는 완충제, 예를 들면, TCGM에서 세척한다. 해동된 세포는, 본원에서 의도된 제조 방법을 위해 또는 대상체에게 투여하기 위해 후속적으로 사용할 수 있다. 세척 단계는 본원의 다른 개소에서 의도된 바와 같이 수행할 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포를 포함하는 세포 모집단은 개체로부터 단리하고, 생체외 또는 시험관내에서 추가의 조작 없이 시험관내에서 증식시키기 위해 활성화 및 자극시킨다. 이어서, 이러한 세포는 개체에 직접 재-투여할 수 있다. 추가의 실시형태에서, T 세포를 포함하는 세포 모집단을 단리한 후, 세포는 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형되기 전에 시험관내에서 증식시키기 위해 먼저 활성화 및 자극시킨다. 이와 관련하여, T 세포는 유전적으로 변형되기 전 및/또는 후에 배양할 수 있다(즉, 본원에서 의도된 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하도록 형질도입 또는 형질감염됨).
5. 배양 개시 및 활성화
T 세포 조성물의 충분한 치료 용량을 달성하기 위해, T 세포를 제조하는 기존의 방법은 종종 1회 이상의 자극, 활성화 및/또는 확장으로 종종 처리함으로써, 보다 많은 오염 기회를 도입하고 제조 프로세스의 비용 및 시간을 증가시키고 일반적으로 열등한 세포 치료 생성물을 제공한다.
T 세포 제조 방법은 우수한 치료 생성물인 수득된 T 세포 조성물에 기여하는 단순하고 강력한 배양 개시 및 활성화 단계를 본원에서 의도했다. 한 가지 실시형태에서, 배양 개시 및 활성화는 세포 모집단을 세포 배양 용기, 예를 들면, 세포 배양 백, GREX 생물반응기, WAVE 생물반응기 등에 씨딩하고, 일차 및 공-자극 T 세포 시그날전달 경로를 통해 T 세포를 활성화시키는 것을 포함한다. 세포 조성물은 하나 이상의 추가 성장 인자 또는 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15, 또는 이의 임의의 적합한 조합의 존재하에 추가로 배양할 수 있다.
특정 실시형태에서, 배양 개시는 T 세포를 포함하는 세포 모집단, 예를 들면, PBMC를 세포 배양 용기에서 목적하는 밀도, 예를 들면, 하나 이상의 사이토킨, 일차 자극 리간드 및 공-자극 리간드를 함유하는 적합한 세포 배양 배지에서 1-5×106 세포/mL로 씨딩하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토킨, 자극 및 공-자극 리간드는 세포 배양 배지 중의 PBMC에 후속적으로 첨가할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 세포 배양 용기는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원의 다른 개소에서 의도된 바와 같이, MACS® GMP 세포 확장 백, MACS® GMP 세포 분화 백, EXP-Pak™ 세포 확장 바이오-용기, VueLife™ 백, KryoSure™ 백, KryoVue™ 백, Lifecell® 백, PermaLife™ 백, X-Fold™ 백, Si-Culture™ 백, 및 VectraCell™ 백을 포함하는 세포 배양 백이다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 용기는 총 약 1×109 세포, 약 5×108 세포, 약 1×108 세포, 약 5×107 세포, 약 1×107 세포, 약 5×106 세포, 또는 약 1×106 세포, 또는 세포의 임의의 개재 양으로 씨딩된다. 특정 실시형태에서, 세포는 PBMC이고, 총 약 1×108 세포로 씨딩된다.
특정 실시형태에서, 세포 모집단, 예를 들면, PBMC는 약 1×107 세포/mL, 약 9×106 세포/mL, 약 8×106 세포/mL, 약 7×106 세포/mL, 약 6×106 세포/mL, 약 5×106 세포/mL, 약 4×106 세포/mL, 약 3×106 세포/mL, 약 2×106 세포/mL, 약 1×106 세포/mL, 약 9×105 세포/mL, 약 8×105 세포/mL, 약 7×105 세포/mL, 약 6×105 세포/mL, 약 5×105 세포/mL, 약 4×105 세포/mL, 약 3×105 세포/mL, 약 2×105 세포/mL, or 약 1×105 세포/mL의 밀도, 또는 세포의 임의의 개재 밀도로 세포 배양 용기에 씨딩된다. 특정 실시형태에서, PBMC는 약 1×106 세포/mL의 밀도로 씨딩된다.
특정 실시형태에서, 세포는 적합한 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 용기에 씨딩된다. 적합한 세포 배양 배지의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 첨가된 아미노산, 나트륨 피루베이트 및 비타민과 함께, 혈청을 함유하지 않거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 소정 세포의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 사이토킨(들)의 양이 보충된, T 세포 성장 배지(TCGM; 2mM GlutaMAX™-I, 10mM HEPES 및 5% 인간 AB 혈청이 보충된 X-VIVO™15), CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM(Life Technologies), CTS™ AIM V® 배지(Life Technologies), RPMI 1640, 클릭(Clicks), DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15(Lonza), CellGro® 혈청-비함유 배지(CellGenix), 및 X-Vivo 20(Lonza)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 TCGM이다.
본원에서 의도된 세포 배양 배지는, 이로써 한정되는 것은 아니지만 혈청(태소 또는 인간 혈청), 인투류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL- 10, IL- 12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α를 포함하는 하나 이상의 인자를 추가로 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 세포 배양 배지는 하나 이상의 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15, 또는 이의 임의의 적합한 조합을 추가로 포함할 수 있다. 각 사이토킨의 적합한 농도 또는 사이토킨의 전체 농도의 예시적 예는 약 25IU/mL, 약 50IU/mL, 약 75IU/mL, 약 100IU/mL, 약 125IU/mL, 약 150IU/mL, 약 175IU/mL, 약 200IU/mL, 약 250IU/mL, 약 300IU/mL, 약 350IU/mL, 약 400IU/mL, 약 450IU/mL 또는 약 500IU/mL 또는 이의 사이토킨의 임의의 개재 양을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 100IU/mL의 IL-2, IL-1 및/또는 IL-15, 또는 이의 임의의 조합을 각각 또는 합계로 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 250IU/mL의 IL-2, IL-1 및/또는 IL-15, 또는 이의 임의의 조합을 각각 또는 합계로 포함한다.
특정 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포는 하ㅏ 이상의 자극제 및 공자극제, 예를 들면, 항-CD3 및 항-CD28 항체, 및 하나 이상의 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15와 접촉시킨다.
T 세포 활성화는, T 세포 TCR/CD3 복합체를 통해 CD2 표면 단백질의 자극을 통해 일차 자극 시그날을 제공하고, 보조 분자, 예를 들면, CD28 또는 4-1BBL를 통한 이차 공자극 시그날을 제공함으로써 달성할 수 있다.
TCR/CD3 복합체는 T 세포를 적합한 CD3 결합제, 예를 들면, CD3 리간드 또는 항-CD3 모노클로날 항체와 접촉시킴으로써 자극시킬 수 있다. CD3 항체의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, OKT3, G19-4, BC3 및 64.1을 포함한다. 상기 기재된 임의의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 항체도 또한 사용할 수 있다. 추가의 항체 또는 항체의 조합은 본원의 다른 개소에 개시된 표준 기술에 의해 제조 및 동정할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 항-CD3 항체는 OKT3이다.
또 다른 실시형태에서, CD2 결합제는 일차 자극 시그날을 T 세포에 제공하기 위해 사용할 수 있다. CD2 결합제의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, CD2 리간드 및 항-CD2 항체, 예를 들면, T11.1 또는 T11.2 항체와 조합된 the T11.3 항체[참조: Meuer, S. C. et al .(1984) Cell 36:897-906] 및 9-1 항체와 조합된 9.6 항체(이는 TI 1.1과 동일한 에피토프를 인식한다)[참조: Yang, S. Y. et al.(1986) J. Immunol. 137:1097-1100].
TCR/CD3 복합체를 통해 또는 CD2에 의해 제공된 일차 자극 시그날 이외에, T 세포 반응의 유도는 이차 공자극 시그날을 필요로 한다. 특정 실시형태에서, CD28 결합제는 공자극 시그날을 제공하기 위해 사용할 수 있다. 적합한 공자극 리간드는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L 1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도가능한 공자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포촉신 베타 수용체, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 공자극 리간드는 T 세포 상에 존재하는 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, CD27, CD28, 4- IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
CD28 결합제의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 천연 CD28 리간드, 예를 들면, CD28에 대한 천연 리간드(예를 들면, 단백질의 B7 계열의 구성원, 예를 들면, B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)); 및 CD28 분자에 가교결합할 수 있는 항-CD28 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, 모노클로날 항체 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 및 EX5.3D10을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 항-CD28 항체는 15E8이다.
한 가지 실시형태에서, 일차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들면, TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통한 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자는 동일한 표면에 커플링된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 시그날을 제공하는 결합제는 세포의 표면 상에 국지화된다. 이는 세포를, 세포 표면 상에서 이의 발현에 적합한 형태로 결합제를 코딩하는 핵산으로 형질감염 또는 형질도입시키거나, 달리는 결합제를 세포 표면에 커플링시킴으로써 달성할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 일차 자극 시그날을 제공하는 분자, 예를 들면, TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통한 자극을 제공하는 분자 및 공자극 분자는 항원 제시 세포 상에 표시된다.
한 가지 실시형태에서, 일차 자극 시그날을 제공하는 분자, 예를 들면, TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통한 자극을 제공하는 분자 및 공자극 분자는 별개의 표면 상에 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 시그날을 제공하는 결합제 중의 하나는 가용성(용액으로 제공)이고, 다른 제제(들)은 하나 이상의 표면 상에 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 시그날을 제공하는 결합제는 둘 다 가용성 형태(용액으로 제공)로 제공된다.
다양한 실시형태에서, 본원에서 의도된 T 세포를 제조하는 방법은 T 세포를 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉시킴으로써 T 세포의 활성화를 포함한다.
특정 실시형태에서, T 세포를 활성화시키기 위한 세포 배양 배지는 약 10ng/mL, 약 20ng/mL, 약 30ng/mL, 약 40ng/mL, 약 50ng/mL, 약 60ng/mL, 약 70ng/mL, 약 80ng/mL, 약 90ng/mL, 약 100ng/mL 또는 약 200ng/mL, 또는 임의의 개재 농도의 항-CD3 항체 또는 CD3 결합제의 농도를 포함한다.
특정 실시형태에서, T 세포를 활성화시키기 위한 세포 배양 배지는 약 10ng/mL, 약 20ng/mL, 약 30ng/mL, 약 40ng/mL, 약 50ng/mL, 약 60ng/mL, 약 70ng/mL, 약 80ng/mL, 약 90ng/mL, 약 100ng/mL 또는 약 200ng/mL, 또는 임의의 개재 농도의 항-CD28 항체 또는 CD28 결합제의 농도를 포함한다.
다양한 실시형태에서, T 세포를 활성화시키기 위한 세포 배양 배지는 약 50ng/mL의 항-CD3 항체 및 50ng/mL의 항-CD28 항체를 포함한다.
세포 배양 용기에 씨딩된 세포 모집단은 적어도 30분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 13시간, 적어도 14시간, 적어도 15시간, 적어도 16시간, 적어도 17시간, 적어도 18시간, 적어도 19시간, 적어도 20시간, 적어도 21시간, 적어도 22시간, 적어도 23시간 또는 적어도 24시간, 또는 임의의 개재하는 시간 길이 동안 활성화된다.
특정 실시형태에서, 세포를 수거하고, 단리하고, 세척하고, 세포 배양물을 개시하고, T 세포를 약 18시간 내지 약 36시간 이내, 또는 약 24시간의 기간 이내, 또는 이의 임의의 개재하는 시간 길이 이내에 활성화시킨다.
6. 형질도입
본원에서 의도된 T 세포 제조 방법은 면역 작동 세포 및/또는 T 세포를 변형시켜 조작된 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, T 세포를 포함하는 세포 모집단을 활성화시키고, 변형시켜 조작된 TCR 또는 CAR을 발현시키고, 이어서 확장을 위해 배양한다. 상기 단계들은 동일한 세포 배양 용기 또는 상이한 용기에서 수행할 수 있다. "형질도입"은, 바이러스 감염에 의해 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포를 포함하는 면역 작동 세포로 유전자(들) 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 조작된 TCR 또는 CAR을 전달하는 것을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포 내로 형질도입된다. 특정 실시형태에서, 표적 세포, 예를 들면, PBMC 또는 T 세포는, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 세포에 전달된 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, "형질도입"된다. 특정 실시형태에서, 형질도입된 세포는 이의 세포 게놈에 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 하나 이상의 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
감염성 바이러스 입자 및 바이러스 저장 용액의 생성은 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 저장 용액을 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Y. Soneoka et al .(1995) Nucl . Acids Res. 23:628-633, 및 N. R. Landau et al .(1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 예시되어 있다. 밀리리터당 수백만의 형질도입 단위(TU/mL)의 역가를 갖는 재조합 바이러스는 공지된 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 초원심분리 후, 약 108 TU/mL, 109 TU/mL, 1010 TU/mL, 1011 TU/mL 또는 1012 TU/mL, 또는 임의의 개재 역가의 농축된 스톡을 수득할 수 있다.
바이러스는 바이러스 역가(TU/mL)에 따라 전달할 수 있고, 이는, 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 p24 역가 분석을 사용하여 측정할 수 있고, 이는 p24 바이러스 코팅 단백질에 대한 ELISA이다. 하기 식은 p24의 pg/mL를 계산하기 위해 사용할 수 있다: 렌티바이러스의 물리 입자(PP)당 p24의 대략 2000개 분자가 존재한다: (2×103)×(PP당 24×103Da의 p24), 48×106/아보가드로=(48×106)I(6×1023) = PP당 8×10-17g의 p24, 1×10-16g의 p24당 대략 1PP, p24의 pg당 1×104PP. 합리적으로 양호하게 팩키징된 VSV-G 위형 렌티바이러스 벡터는 1000 물리 입자(PP)당 1TU 내지 100PP당 1TU(또는 그 이하)의 범위로 감염 지수를 가질 것이다. 따라서, 상기 범위는 대략 10 내지 100TU/p24 pg이다. 이는 TU/mL가 수득되는 것이 이러한 변환을 통한 것이다.
감염 역가는 또한 형질도입된 인간 골육종(HOS) 세포의 분석에 의해 측정할 수 있다[참조: Kutner et al., 2009, Nature Protocols 4: 495-505]. 요약하면, 형질도입된 HOS 세포는, 게놈 DNA를 DNeasy(Qiagen, Venlo Netherlands, Cat# 69506)에 의해 추출한 후에 10% 태소 혈청(FBS)가 보충된 DMEM에서 7일 동안 배양하고, 정량적 PCR(qPCR)로 평가했다. qPCR 프로토콜의 프라이머/프로브 세트는 내인성 인간 RNaseP 카피의 수당 렌티바이러스 psi-gag 영역 카피의 수를 측정함으로써 형질도입된 세포의 벡터 카피 수(VCN)를 측정한다. 프로바이러스의 통합은 개개 프로바이러스 삽입체를 서열분석함으로써 평가했다.
한 가지 실시형태에서, 바이러스 역가는 HOS 세포주 분석을 사용하여 측정한다.
특정 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 포함하는 세포 모집단은 세포 배양 용기에서 활성화 시간, 활성화 약 1시간 후, 활성화 약 2시간 후, 활성화 약 3시간 후, 활성화 약 4시간 후, 활성화 약 5시간 후, 활성화 약 6시간 후, 활성화 약 7시간 후, 활성화 약 8시간 후, 활성화 약 9시간 후, 활성화 약 10시간 후, 활성화 약 11시간 후, 활성화 약 12시간 후, 활성화 약 13시간 후, 활성화 약 14시간 후, 활성화 약 15시간 후, 활성화 약 16시간 후, 활성화 약 17시간 후, 활성화 약 18시간 후, 활성화 약 19시간 후, 활성화 약 20시간 후, 활성화 약 21시간 후, 활성화 약 22시간 후, 활성화 약 23시간 후, 활성화 약 24시간 후, 활성화 약 25시간 후, 활성화 약 26시간 후, 활성화 약 27시간 후, 활성화 약 28시간 후, 활성화 약 29시간 후, 또는 활성화 약 30시간 후, 또는 활성화의 임의 개재 시간 후에 형질도입된다.
한 가지 실시형태에서, 세포 모집단은 활성화 약 20 내지 약 24시간 후에 형질도입된다.
본원에서 의도된 제조 방법은 활성화된 T 세포를 포함하는 PBMC를 세포 배양 용기에서 약 1×108 내지 약 1×1010 TU/108 PBMC, 약 5×108 내지 약 5×109 TU/108 PBMC, 약 1×109 내지 약 5×109 TU/108 PBMC, 약 1×109 내지 약 4×109 TU/108 PBMC, 약 1×109 내지 약 3×109 TU/108 PBMC, 약 1×109 내지 약 2×109 TU/108 PBMC, 또는 이의 임의의 개재 TU의 벡터로 형질도입하는 것을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 본원에서 의도된 제조 방법은 활성화된 T 세포를 포함하는 PBMC를 세포 배양 용기에서 약 1×108 TU/108 PBMC, 약 5×108 TU/108 PBMC, 약 6×108 TU/108 PBMC, 약 7×108 TU/108 PBMC, 약 8×108 TU/108 PBMC, 약 9×108 TU/108 PBMC, 약 1×109 TU/108 PBMC, 약 2×109 TU/108 PBMC, 약 3×109 TU/108 PBMC, 약 4×109 TU/108 PBMC, 약 5×109 TU/108 PBMC, 약 6×109 TU/108 PBMC, 약 7×109 TU/108 PBMC, 약 8×109 TU/108 PBMC, 약 9×109 TU/108 PBMC, 또는 약 1×1010 TU/108 PBMC, 또는 임의의 개재 TU의 벡터로 형질도입하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포는 약 1×107 내지 약 2×109 TU/108 PBMC의 벡터로 형질도입된다.
한 가지 실시형태에서, 본원에서 의도된 제조 방법은 활성화된 T 세포를 포함하는 PBMC를 세포 배양 용기에서 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100, 또는 임의의 개재 정수의 MOI에서 벡터로 형질도입하는 것을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, PBMC는 약 20의 MOI로 벡터로 형질도입된다.
특정 실시형태에서, 벡터는 세포 배양 배지에서 최대 약 10%의 세포 배양 용적, 약 15%의 세포 배양 용적, 약 16%의 세포 배양 용적, 약 17%의 세포 배양 용적, 약 18%의 세포 배양 용적, 약 19%의 세포 배양 용적, 약 20%의 세포 배양 용적, 약 21%의 세포 배양 용적, 약 22%의 세포 배양 용적, 약 23%의 세포 배양 용적, 약 24%의 세포 배양 용적, 약 25%의 세포 배양 용적, 약 30%의 세포 배양 용적, 약 35%의 세포 배양 용적, 약 40%의 세포 배양 용적, 약 45%의 세포 배양 용적, 또는 약 50%의 세포 배양 용적, 또는 이의 임의의 개재 퍼센트로 희석된다.
특정 실시형태에서, 벡터는 세포 배양 배지, 예를 들면, TCGM에서 최대 약 20%의 세포 배양 용적으로 희석된다.
세포 배양 용기에 씨딩된 세포 모집단은 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간 또는 약 60시간, 또는 임의의 개재하는 시간 길이 동안 형질도입된다.
특정 실시형태에서, 세포는 약 48시간 동안 형질도입된다.
세포가 형질도입된 후, 이들은 본원에서 의도된 하나 이상의 세척 단계로 처리할 수 있고, 이어서 확장을 위해 적합한 세포 배양 용기에 씨딩할 수 있다.
7. 확장
본원에서 의도된 T 세포 제조 플랫폼은 1회 이상의 T 세포 확장을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 활성화되고/되거나 형질도입된 T 세포를 포함하는 세포 모집단은 확장에 적합한 세포 배양 배지를 포함하는 적합한 세포 배양 용기에 씨딩된다. 특정 실시형태에서, 세포는 생물반응기에 씨딩되고, 재씨딩 없이 주기적으로 수거된다.
특정 실시형태에서, 세포는 세포의 대수기(log-phase) 성장을 유지하기 위한 밀도로 재씨딩된다.
특정 실시형태에서, 세포는, 세포가 대수기 성장을 유지하는 한, 세포 배양물에 약 0.1×106 내지 약 1×107 세포/mL, 약 0.1×106 내지 약 0.9×106 세포/mL, 약 0.1×106 내지 약 0.8×106 세포/mL, 약 0.1×106 내지 약 0.7×106 세포/mL, 약 0.1×106 내지 약 0.6×106 세포/mL, 약 0.1×106 내지 약 0.5×106 세포/mL, 약 0.2×106 내지 약 0.5×106 세포/mL, 또는 약 0.3×106 내지 약 0.5×106 세포/mL의 밀도, 또는 임의의 개재하는 세포 밀도로 씨딩된다.
특정 실시형태에서, 세포는, 세포가 대수기 성장을 유지하는 한, 세포 배양물에 약 0.1×106 세포/mL, 약 0.2×106 세포/mL, 약 0.3×106 세포/mL, 약 0.4×106 세포/mL, 약 0.5×106 세포/mL, 약 0.6×106 세포/mL, 약 0.7×106 세포/mL, 약 0.8×106 세포/mL, 약 0.9×106 세포/mL 또는 약 1×107 세포/mL의 밀도, 또는 임의의 개재하는 세포 밀도로 씨딩된다.
일부 실시형태에서, 세포는, 세포가 대수기 성장을 유지하는 한, 생물반응기, 예를 들면, WAVE 생물반응기에서 약 0.1×106 세포/mL, 약 0.5×106 세포/mL, 약 1×106 세포/mL, 약 2×106 세포/mL, 약 3×106 세포/mL, 약 4×106 세포/mL, 약 5×106 세포/mL, 약 6×106 세포/mL, 약 7×106 세포/mL, 약 8×106 세포/mL, 약 9×106 세포/mL, 또는 약 1×107 세포/mL의 밀도, 또는 임의의 개재하는 세포 밀도로 씨딩된다.
특정 실시형태에서, 세포는 T 세포 확장을 위해 적합한 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 용기에서 씨딩된다. T 세포 확장을 위한 적합한 세포 배양 배지의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, T 세포 성장 배지(TCGM), CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM(Life Technologies), CTS™ AIM V® 배지(Life Technologies), RPMI 1640, 클릭(Clicks), DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15(Lonza), 및 X-Vivo 20(Lonza) 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 추가의 호르몬, 성장 인자 또는 사이토킨(들)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 TCGM이다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 혈청(예: 태소 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL- 10, IL- 12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 인자를 추가로 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 세포 배양 배지는 하나 이상의 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 각 사이토킨의 적합한 농도 또는 사이토킨의 전체 농도의 예시적 예는 약 25IU/mL, 약 50IU/mL, 약 75IU/mL, 약 100IU/mL, 약 125IU/mL, 약 150IU/mL, 약 175IU/mL, 약 200IU/mL, 약 250IU/mL, 약 300IU/mL, 약 350IU/mL, 약 400IU/mL, 약 450IU/mL, 또는 약 500IU/mL 또는 이의 임의의 개재하는 사이토킨 양을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 100IU/mL의 IL-2, IL-1 및 IL-15, 또는 이의 임의의 조합을 각각 또는 합계로 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 250IU/mL의 IL-2, IL-1 및/또는 IL-15, 또는 이의 임의의 조합을 각각 또는 합계로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 T 세포 제조 방법은 T 세포를 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일 또는 약 3 to 약 7일, 또는 약 5 내지 약 8일 또는 임의의 개재하는 일수 동안 확장시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 T 세포 제조 방법은 T 세포를 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일 또는 약 12일 동안 확장시키는 것을 포함한다. 확장은 전체 확장 기간 동안 동일한 용기 및/또는 유형의 용기, 또는 확장 기간 동안 상이한 용기 및/또는 유형의 용기에서 수행할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, T 세포 확장은 세포 배양 백에서 약 5일 내지 약 8일 동안 수행한다.
한 가지 실시형태에서, T 세포 확장은 세포 배양 백에서 약 5일 내지 약 8일 동안 수행하고, 이어서 확장은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, WAVE 또는 G-REX 생물반응기를 포함하는 생물반응기에서 계속한다. 특정 실시형태에서, 확장은 생물반응기에서 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일 또는 약 5일 또는 그 이상 동안 계속할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, T 세포 확장은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, WAVE 생물반응기 또는 G-REX 생물반응기를 포함하는 생물반응기에서 약 5일 내지 약 8일 동안 수행한다.
WAVE 생물반응기는 상이한 속도의 로킹(rocking) 및 다양한 상이한 로킹 각을 가능하게 한다. 예시적 로킹 속도는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 1분당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 록을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 자극 및 확장 방법은 1.5˚, 2˚, 2.5˚, 3˚, 3.5˚, 4˚, 4.5˚, 5˚, 5.5˚, 6˚, 6.5˚, 7˚, 7.5˚, 8˚, 8.5˚ 또는 9.0˚로 설정되는 로킹 플랫폼의 각도를 가능하게 한다.
한 가지 실시형태에서, WAVE 생물반응기의 용적은 2500mL이고, 로킹 속도는 약 6 또는 약 7rpm이고, 각도는 약 7 내지 약 8이다.
한 가지 실시형태에서, 세포는 초기에 GREX 생물반응기에 100mL로 씨딩되고, 약 200mL의 신선한 성장 배지를 3, 4 및 5일에 배양물에 첨가한다. 특정 실시형태에서, 추가의 배지는 7일에 배양 용적이 약 1L로 되도록 GREX 생물반응기에 첨가된다.
세포 계수 및 생존률은 매일 또는 임의 일수에 검사할 수 있고, 세포 또는 세포의 일부를 동결보존하고/하거나 세포를 마커 발현, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD27, CD197 및 HLA-DR, 도입유전자에 대한 FAC 분석에 의해 특성화한다.
한 가지 실시형태에서, 본원에서 의도된 제조 방법으로 처리된 T 세포 모집단은 출발 T 세포 모집단과 비교하여 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배 또는 적어도 1000배, 또는 그 이상 확장된다.
8. 제조된 T 세포 조성물의 회수
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 T 세포를 제조하는 방법은, 반자동 플로우쓰로우 원심분리, 예를 들면, 코베 2991 세포 프로세서, 세포 세이버 5, 박스터 사이토메이트, LOVO 등을 사용하여 확장된 세포를 수거하고 세척하는 것을 포함하는 제조된 T 세포 조성물을 회수하는 단계를 포함한다.
확장된 세폴ㄹ 수거하기 전에, 예비-수거 샘플 분획을 취하여 세포 계수, 생존률, 세포 특성화, 예를 들면, FAC 분석, 순조 및/또는 세포에 대한 기타 일반적 방출 표준을 확립할 수 있다. 또한, 수거후 샘플 분획을 취하여 세포 계수 및/또는 생존률을 확립할 수 있다.
이어서, 회수된 T 세포 조성물은 하나 이상의 IV 백 또는 기타 적합한 용기, 예를 들면, MACS® GMP 세포 확장 백, MACS® GMP 세포 분화 백, EXP-Pak™ 세포 확장 바이오-용기, VueLife™ 백, KryoSure™ 백, KryoVue™ 백, Lifecell® 백, PermaLife™ 백, X-Fold™ 백, Si-Culture™ 백, 오리겐 생물의약 크리오백 및 VectraCell™ 백에 전달하고, 상기 및 본원의 다른 개소에서 언급된 바와 같이, 세포가 사용 준비가 될 때까지, 조절된 속도의 냉동기에서 동결보존한다. 특정 실시형태에서, 세포는 50% 플라스말라이트 및 50% 크리오스터 10; 50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO); 또는 크리오스터 10에서 동결된다.
치료 T 세포 조성물을 함유하는 백(10 내지 250mL 용량)은 모니터링된 -80℃ 내지 -135℃에서 혈액 뱅크 조건하에 저장한다. 주입 백은 필요할 때까지 냉동기에서 저장한다.
D. 조작된 T 세포 수용체 및 키메라 항원 수용체
의도된 T 세포 제조 방법은 신뢰성 있고 재현가능한 방식으로 고친화성 T 세포 수용체(조작된 TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 T 세포를 확장시키는데 특히 유용하다. 한 가지 실시형태에서, T 세포는 하나 이상의 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 의도된 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하도록 변형된 T 세포는 "항원-특이적 재지시된 T 세포"로서 지칭된다.
1. 조작된 TCR
천연 발생 T 세포 수용체는 2개의 아단위, α-아단위 및 β-아단위를 포함하고, 각각은 각각의 T 세포 게놈에서 재조합 사상에 의해 생성된 고유한 단백질이다. TCR의 라이브러리는 특정 표적 항원에 대한 이들의 선택성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 방식에서, 표적 항원에 대해 고도의 활성 및 반응성을 갖는 천연 TCR을 선별하고, 클로닝하고, 후속적으로 양자 면역요법에 사용된 T 세포 모집단에 도입할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, T 세포는, 표적 항원을 발현하는 T 세포에 특이성을 부여하는 TCR을 형성하는 능력을 갖는 TCR의 아단위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변형시킨다. 특정 실시형태에서, 아단위는, 아단위가 형질감염된 세포에 대해 제자리 능력을 표적 세포에 부여하고 면역학적-관련 사이토킨 시그날전달에 관여하는 한, 천연 발생 아단위와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 변형을 갖는다. 조작된 TCR은 바람직하게는 또한 고도의 친화성을 갖는 관련 종양-연과된 펩티드를 나타내는 표적 세포에 결합하고, 임의로 생체내에서 관련 펩티드를 제시하는 표적 세포의 효율적인 사멸을 매개한다.
조작된 TCR을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 T 세포의 (천연 발생) 염색체에서 천연 문맥으로부터 단리되고, 본원의 다른 개소에 기재된 바와 같이 적합한 벡터에 도입될 수 있다. 이들을 포함하는 핵산 및 벡터 둘 다는 유용하게는 세포 내로 도입될 수 있고, 세포는 바람직하게는 T 세포이다. 이어서, 변형된 T 세포는 형질도입된 핵산 또는 핵산들에 의해 코딩된 TCR의 양 쇄를 발현할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조작된 TCR은 외인성 TCR인데, 이는 특정 TCR을 정상적으로 발현하지 않는 T 세포에 도입되기 때문이다. 조작된 TCR의 중요한 측면은 이것이 주요 조직적합성 복합체(MHC) 또는 유사한 면역학적 성분에 의해 제시된 종양 항원에 대해 고도의 친화성을 갖는다는 것이다. 조작된 TCR과 대조적으로, CAR은 MHC 독립적 방식으로 표적 항원에 결합하도록 조작된다.
본 발명의 핵산에 의해 코딩된 단백질은, 부착된 추가의 폴리펩티드가 기능적 T 세포 수용체를 형성하는 α-쇄 또는 β-쇄의 능력 및 MHC 의존성 항원 인식을 간접하지 않는 한, TCR의 본 발명의 α-쇄 또는 β-쇄의 아미노-말단 또는 카복실-말다넹 부착된 추가의 폴리펩티드와 함께 발현될 수 있다.
본원에서 의도된 조작된 TCR에 의해 인식되는 항원은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 혈액암 및 충실성 종양 둘 다 상의 항원을 포함하는 암 항원을 포함한다. 예시적 항원은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)을 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 및 VEGFR2를 포함한다.
2. 키메라 항원 수용체(CAR)
본원에서 의도된 T 세포 제조 방법은 본원에서 의도된 하나 이상의 CAR을 발현하도록 T 세포를 변형시키는 것을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 종양 세포에 대해 세포독성을 재지시하는 CAR을 발현하도록 설계된 벡터로 유전적으로 변형된 T 세포를 제공한다. CAR은 표적 항원(예: 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성을, 특정의 항-종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하기 위해 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라"는 상이한 단백질의 일부 또는 상이한 기원의 DNA로 구성되는 것을 기재한다.
본원에서 의도되는 CAR은 특정의 표적 항원에 결합하는 세포외 도메인(또한 결합 도메인 또는 항원-특이적 결합 도메인으로 지칭됨), 막관통 도메인 및 세포내 시그날전달 도메인을 포함한다. CAR의 주요 특성은 면역 작동 세포 특이성을 재지시하는 이들의 능력이고, 증식, 사이토킨 생성, 식세포작용, 또는 표적 항원 발현 세포의 세포사를 주요 조직적합성(MHC) 독립적 방식으로 매개할 수 있는 분자의 생성을 유발하고, 모노클로날 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공-수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 개발하는 것이다.
특정 실시형태에서, CAR은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 계류 리간드, 공-수용체의 세포외 도메인을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함하고, 이는 종양-연관된 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)인 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 혈액 암 세포 상에서 발현된다. 또 다른 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 충실성 종양의 세포 상에서 발현된다. 특정 실시형태에서, 충실성 종양은, 신경교아세포종, 비-소세포 폐암 비-소세포 폐암을 제외한 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간암, 대장암, 위암, 비장의 암, 피부암, 신경교아세포종을 제외한 뇌암, 신장암, 갑상선암 등이다.
특정 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 및 VEGFR2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
a. 결합 도메인
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 CAR은, 종양 세포 상에서 발현된, 표적 폴리펩티드(예: 표적 항원)에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 도메인", "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인", "항원-특이적 결합 도메인" 및 "세포외 항원 특이적 결합 도메인"은 상호 교대로 사용되고, 목적하는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR을 제공한다. 결합 도메인은, 생물학적 분자(예: 세포 표면 수용체 또는 종양 단백질, 지질, 다당류, 또는 기타 세포 표면 표적 분자, 또는 이의 성분)을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 목적하는 생물학적 분자를 위한 임의의 천연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합에 의해 생성된 결합 파트너를 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는, 펩티드, 지질, 다당류 또는 항원 결정기를 함유하는 핵산, 예를 들면, 면역 세포에 의해 인식되는 것들 등의 표적 항원의 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 적어도 포함하는 폴리펩티드인 결합제를 지칭한다. 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 이 용어는 또한 유전적으로 조작된 형태, 예를 들면, 키메라 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체), 이종접합체 항체(예: 이중특이적 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다[참조: Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995(Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997].
특정 실시형태에서, 표적 항원은 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 또는 VEGFR2 폴리펩티드의 에피토프이다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 또한 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 불리우는 3개의 초가변 영역에 의해 차단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. CDR은 카바트(Kabat)(Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50,(1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443(1987)) 등에 따른 서열[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , U.S. Department of Health and Human Services, 1991, 이는 참조로서 보원에 도입된다], 또는 코티아 등(Chothia) 등에 따른 구조[참조: Choithia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917(1987), Choithia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883(1989)] 등의 통상의 방법에 의해 정의 또는 동정될 수 있다.
상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 인간 등의 종 내에 비교적 보존되어 있다. 구성 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역인 항체의 프레임워크 영역은 3차원 공간으로 CDR을 위치결정 및 정렬하도록 작용한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합에 관여한다. 각 쇄의 CDR은 N-말단으로부터 순차로 출발하여 넘버링되는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 통상 지칭되고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 배치되어 있는 쇄에 의해 동정된다. 따라서, 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3로 지칭되는 반면, 항체의 경쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로 지칭된다. 상이한 특이성을 갖는 항체(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 조합 부위)는 상이한 CDR을 갖는다. 항체마다 상이한 CDR이 있지만, CDR 내의 아미노산 위치의 제한된 수만이 항원 결합에 직접 관여한다. CDR 내의 이들 위치는 특이성 결정 잔기(CDR)이라 한다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 본원에 개시된 바와 같이 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab 또는 기타 항체 단편의 것을 포함하여 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 본원에 개시된 바와 같이 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab 또는 기타 항체 단편의 것을 포함하여 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
"모노클로날 항체"는 B 림프구의 단일 클론, 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 형질감염되는 세포에 의해 생성된 항체이다. 모노클로날 항체는, 예를 들면, 골수종 세포와 면역 비장 세포와의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 생성된다. 모노클로날 항체는 인간화 모노클로날 항체를 포함한다.
"키메라 항체"는 하나의 종, 예를 들면, 인간으로부터의 프레임워크 잔기, 및 또 다른 종, 예를 들면, 마우스로부터의 CDR(이는 일반적으로 항원 결합을 제공한다)를 갖는다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본원에서 의도되는 CAR은 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항원-특이적 결합 도메인을 포함한다.
특정의 바람직한 실시형태에서, 항체는 종양 세포 상의 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체(예: 인간화 모노클로날 항체)이다. "인간화" 항체는 인간 프레임워크 영역, 및 비-인간(예: 마우스, 랫트, 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린이다. 인간화 항체는 유전자 조작(참조: 미국 특허 제5,585,089호)에 의해 작제할 수 있다.
특정한 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 낙타 Ig(a 낙타과 항체(VHH)), Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv,(scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화도니 Fv 단백질("dsFv") 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 "낙타 Ig" 또는 "낙타과 VHH"는 중쇄 항체의 최소 공지된 항원-결합 단위를 지칭한다[참조: Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498(2007)]. "중쇄 항체" 또는 "낙타과 항체"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄를 함유하지 않는 항체를 지칭한다[참조: Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:2538(1999); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 제6,005,079호].
"면역글로불린 신규 항원 수용체"의 "IgNAR"는 1개의 가변 신규 항원 수용체(VNAR) 도메인 및 5개의 불변 신규 항원 수용체(CNAR) 도메인의 호모이량체로 이루어진 상어 면역 레퍼토리로부터의 항체 부류를 지칭한다.
항체의 파파인 소화는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 불리우는, 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 잔류 "Fc" 단편을 생성하고, 이의 명칭은 용이하게 결정화하는 이의 능력을 반영한다. Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇몇 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 포함하는 Fab'에 대한 본원에서의 명명이다. F(ab')2 항체 단편은 본질적으로, 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 결합도 또한 공지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 단일쇄 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은, 경쇄 및 중쇄가 이본쇄 Fv 종의 것과 유사한 "이량체성" 구조로 회합할 수 있도록, 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다.
용어 "디아바디"는, 단편이 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL) 중의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)를 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭한다. 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개 도메인 사이의 쌍을 이루는 것을 가능하게 하지 않는 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 이루고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적이다. 디아바디는, 예를 들면, 문헌[참조: EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al ., Nat. Med. 9:129-134(2003); and Hollinger et al ., PNAS USA 90: 6444-6448(1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌[참조: Hudson et al ., Nat. Med. 9:129-134(2003)]에 기재되어 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb" 또는 "나노바디"는 항체 중쇄의 가변 영역(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 영역(VL 도메인)으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다[참조: Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490].
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 어느 하나의 배향(예: VL-VH 또는 VH-VL)으로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH 및 VL 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 개설에 대해서는 문헌[참조: Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.
특정 실시형태에서, scFv는 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 또는 VEGFR2 폴리펩티드에 결합한다.
b. 링커
특정 실시형태에서, 본원에서 의도되는 CAR은, 분자의 적절한 간격 및 형태를 위해 부가된, 다양한 도메인, 예를 들면, VH 및 VL 사이에 링커 잔기를 포함할 수 있다. 본원에서 의도된 CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 링커를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커의 길이는 약 1 내지 약 25개 아미노산, 약 5 내지 약 20개 아미노산 또는 약 10 내지 약 20개 아미노산, 또는 아미노산의 임의의 개재하는 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적 예는 글리신 폴리머(G)n; 글리신-세린 폴리머(G1-5S1-5)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이다); 글리신-알라닌 폴리머; 알라닌-세린 폴리머; 및 당해 기술분야에 공지된 기타 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머는 비교적 비구조화되어 있고, 따라서 본원에 기재된 CAR 등의 융합 단백질의 도메인 사이에서 중립적 테더로서 작용할 수 있다. 글리신은 알라닌보다 현저히 많게 파이-사이(phi-psi) 공간에 접근하고, 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다[참조: Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142(1992)]. 당해 기술분야의 숙련가는, 특정 실시형태에서 CAR의 설계가 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있고, 이에 의해 상기 링커가 목적하는 CAR 구조를 제공하기 위해 보다 덜 가요성 구조를 제공하는 하나 이상의 부분 뿐만 아니라 가요성 링커를 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
다른 예시적 링커는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하기 아미노산 서열을 포함한다: GGG; DGGGS(서열번호 1); TGEKP(서열번호 2)[참조: Liu et al ., PNAS 5525-5530(1997)]; GGRR(서열번호 3)[참조: Pomerantz et al . 1995, supra]; (GGGGS)n(여기서, n = 1, 2, 3, 4 또는 5)(서열번호 4)[참조: Kim et al ., PNAS 93, 1156-1160(1996.)]; EGKSSGSGSESKVD(서열번호 5)[참조: Chaudhary et al ., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070]; KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 6)[참조: Bird et al ., 1988, Science 242:423-426], GGRRGGGS(서열번호 7); LRQRDGERP(서열번호 8); LRQKDGGGSERP(서열번호 9); LRQKd(GGGS)2 ERP(서열번호 10). 대안적으로, 가요성 링커는 DNA-결합 부위 및 펩티드 자체 둘 다를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램[참조: Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260(1993), PNAS 91:11099-11103(1994)] 또는 상 디스플레이 방법을 사용하여 합리적으로 설계할 수 있다.
특정 실시형태에서, CAR은, 가변 영역 연결 서열을 추가로 포함하는 scFV를 포함한다. "가변 영역 연결 서열"은, 생성되는 폴리펩티드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화성을 보유하도록, 중쇄 가변 영역을 경쇄 가변 영역에 연결하고 2개 부-결합 도메인의 상호작용과 화합성인 스페이서 기능을 제공하는 아미노산 서열이다. 한 가지 실시형태에서, 가변 영역 연결 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 아미노산 길이이다. 특정 실시형태에서, 가변 영역 연결 서열은 글리신-세린 폴리머(G1-5S1-5)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이다)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 가변 영역 연결 서열은 (G4S)3 아미노산 링커를 포함한다.
c. 스페이서 도메인
특정 실시형태에서, CAR의 결합 도메인은 하나 이상의 "스페이서 도메인"이 후속하고, 이는 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하도록 작동 세포 표면으로부터 떨어져 항원 결합 도메인을 이동시키는 영역을 지칭한다[참조: Patel et al ., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419]. 스페이서 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 스페이서 도메인은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 중쇄 불변 영역(예: CH2 및 CH3)을 포함하는 면역글로불린의 일부이다. 스페이서 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변화된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 스페이서 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3을 포함한다.
d. 힌지 도메인
CAR의 결합 도메인은 일반적으로 하나 이상의 "힌지 도메인"이 후속하고, 이는 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하도록 작동 세포 표면으로부터 떨어져 항원 결합 도메인의 위치결정에 중요한 역할을 담당한다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인(TM) 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변화된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합한 예시적 힌지 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD7 등의 유형 1 막 단백질의 세포외 영역으로부터 유래하는 힌지 영역을 포함하고, 이는 이들 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나 변화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다.
e. 막관통(TM) 도메인
"막관통 도메인"은 세포외 결합 부분 및 세포내 시그날전달 도메인을 융합시키고 면역 작동 세포의 원형질 막에 CAR을 고정시키는 CAR의 일부이다. TM 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다.
예시적 TM 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베터 또는 제타 쇄, CD3 엡실론, CD3 제타, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로부터 유래할 수 있다(즉, 이들의 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다).
한 가지 실시형태에서, 본원에서 의도되는 CAR은 CD8α로부터 유래된 TM 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에서 의도되는 CAR은 CD8α로부터 유래하는 TM 도메인, 및 바람직하게는 TM 도메인과 CAR의 세포내 시그날전달 도메인을 연결하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 글리신-세린 링커는 특히 적합한 링커를 제공한다.
f. 세포내 시그날전달 도메인
특정 실시형태에서, 본원에서 의도되는 CAR은 세포내 시그날전달 도메인을 포함한다. "세포내 시그날전달 도메인"은, 작동 세포 기능, 예를 들면, CAR-결합된 표적 세포에 대한 세포독성 인자의 방출을 포함하는 활성화, 사이토킨 생성, 증식 및 세포독성 활성, 또는 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합으로 유발된 기타 세포 반응을 유발하기 위해 면역 작동 세포의 내부로 표적 항원에 대한 효과적 CAR 결합의 메시지의 전달에 관여하는 CAR의 부분을 지칭한다.
용어 "작동 기능"은 세포의 특수한 기능을 지칭한다. T 세포의 작동 기능은, 예를 들면, 세포용해 활성일 수 있거나, 사이토킨의 분비를 포함하는 활성을 지원할 수 있거나 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 시그날전달 도메인"은 작동 기능 시그날을 전달하고 세포가 특수한 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 시그날전달 도메인이 사용될 수 있지만, 대부분의 경우에 전체 도메인을 사용할 필요는 없다. 세포내 시그날전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 한, 이러한 절단된 부분은 작동 기능 시그날을 전달하면 전체 도메인 대신에 사용될 수 있다. 용어 세포내 시그날전달 도메인은 작동 기능 시그날을 전달하기에 충분한 세포내 시그날전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
TCR 단독을 통해 생성된 시그날은 T 세포의 충분한 활성화에 불충분하고 이차 또는 공-자극 시그날이 또한 요구되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포내 시그날전달 도메인의 2개 상이한 부류에 의해 매개되는 것으로 말할 수 있다: TCR을 통한 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 일차 시그날전달 도메인(예: TCR/CD3 복합체) 및 이차 또는 공-자극 시그날을 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 공-자극 시그날전달 도메인. 바람직한 실시형태에서, 본원에서 의도되는 CAR은, 하나 이상의 "공-자극 신호전달 도메인" 및 "일차 시그날전달 도메인"을 포함하는 세포내 시그날전달 도메인을 포함한다.
일차 시그날전달 도메인은 TCR 복합체의 일차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 시그날전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티브 또는 ITAM으로 공지되어 있는 신호전달 모티브를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특히 유용한 일차 시그날전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예시적 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 일차 시그날전달 도메인 및 하나 이상의 공-자극 시그날전달 도메인을 포함한다. 세포내 일차 시그날전달 및 공-자극 시그날전달 도메인은 임의의 순서로 나란히 막관통 도메인의 카복시 말단에 연결될 수 있다.
본원에서 의도되는 CAR은 CAR 수용체를 발현하는 T 세포의 유효성 및 확장을 증강시키기 위해 하나 이상의 공-자극 시그날전달 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공-자극 시그날전달 도메인" 또는 "공-자극 도메인"은 공-자극 분자의 세포내 시그날전달 도메인을 지칭한다.
이러한 공-자극 분자의 예시적 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS(CD278), CTLA4, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, TRIM, LCK3, SLAM, DAP10, LAG3, HVEM 및 NKD2C 및 CD83을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, CAR은 CD28, CD137 및 CD134로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 공-자극 시그날전달 도메인 및 CD3ζ 일차 시그날전달 도메인을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, CAR은, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 또는 VEGFR2폴리펩티드; CD8α; CD4, CD45, PD1 및 CD152로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드로부터 유래하는 막관통 도메인; 및 CD28, CD54, CD134, CD137, CD152, CD273, CD274 및 CD278로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 공-자극 시그날전달 도메인; 및 CD3ζ 일차 시그날전달 도메인에 결합하는, scFv를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, CAR은, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 또는 VEGFR2폴리펩티드; IgG1 힌지/CH2/CH3 및 CD8α로 이루어진 그룹으로부터 선택된 힌지 도메인 및 CD8α; CD8α; CD4, CD45, PD1 및 CD152로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드로부터 유래하는 막관통 도메인; 및 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 공-자극 시그날전달 도메인; 및 CD3ζ 일차 시그날전달 도메인에 결합하는, scFv를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, CAR은, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 또는 VEGFR2폴리펩티드; IgG1 힌지/CH2/CH3 및 CD8α로 이루어진 그룹으로부터 선택된 힌지 도메인 및 CD8α; CD8α; CD4, CD45, PD1 및 CD152로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드로부터 유래하는 TM 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 바람직하게는 TM 도메인을 CAR의 세포내 시그날전달 도메인에 연결하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 길이의 아미노산 및 짧은 올리고- 및 폴리펩티드 링커; 및 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 공-자극 시그날전달 도메인; 및 CD3ζ 일차 시그날전달 도메인에 결합하는, 링커를 추가로 포함하는, scFv를 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 또는 VEGFR2 폴리펩티드; CD8α 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3개 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 공-자극 시그날전달 도메인; 및 CD3ζ 일차 시그날전달 도메인에 결합하는, scFv를 포함한다.
E. 폴리펩티드
본 발명은, 부분적으로, 조작된 TCR 및 CAR 폴리펩티드 및 이의 단편, 이를 함유하는 세포 및 조성물, 및 폴리펩티드를 발현하는 벡터를 의도한다. "폴리펩티드", "폴리펩티드 단편", "펩티드" 및 "단백질"은 상호 교대로 사용되고 재조합, 합성 또는 비-천연 아미노산 폴리머를 지칭한다. 폴리펩티드는 특정 길이로 한정되지 않고, 예를 들면, 이들은 전장 단백질 서열 또는 전장 단백질의 단편을 포함할 수 있고, 폴리펩티드의 번역후 변형, 예를 들면, 천연 발생 또는 비-천연 발생의 당해 기술분야에 공지된 다른 변형 뿐만 아니라, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본원에서 의도되는 폴리펩티드는 단백질의 N-말단에 시그날(또는 리더) 서열을 포함하고, 이는 번역과 동시에 또는 번역후 단백질의 전이를 지시한다. 본원에 개시에 유용한 적합한 시그날 서열의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, IgG1 중쇄 시그날 폴리펩티드, CD8α 시그날 폴리펩티드 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 시그날 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 다양한 공지된 재조합 및/또는 합성 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본원에서 의도되는 폴리펩티드는 구체적으로는 본 명세서의 CAR, 또는 본원에 의도된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 갖는 서열을 포함한다.
폴리펩티드는 "폴리펩티드 변이체"를 포함한다. 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입의 점에서 천연 발생 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 이러한 변이체는 천연 발생일 수 있거나, 예를 들면, 상기 폴리펩티드 서열의 하나 이상을 변형시킴으로써 합성적으로 생성할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 도입함으로써 조작된 TCR 또는 CAR의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 이와 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
폴리펩티드는 "폴리펩티드 단편"을 포함한다. 폴리펩티드 단편은, 단량체성 또는 다량체성일 수 있고 천연-발생 또는 재조합-생성된 폴리펩티드의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드 단편은 적어도 5 내지 약 500개 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개 아미노산 길이인 것으로 이해된다.
폴리펩티드는 또한 프레임 내에서 융합될 수 있거나, 링커, 또는 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하거나 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 증강시키기 위한 기타 서열에 접합될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본원에서 의도된 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변화시킬 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조할 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변화 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Kunkel(1985, Proc. Natl . Acad . Sci . USA. 82: 488-492), Kunkel et al.,(1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), 미국 특허 제4,873,192호, Watson, J. D. et al.,(Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) 및 본원에 인용된 참조문헌]. 목적하는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 문헌[참조: Dayhoff et al ., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 발견할 수 있다.
특정 실시형태에서, 변이체는 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 것이고, 펩티드 화학 분야의 숙련가는 폴리펩티드의 이차 구조 및 소수성 성질이 실질적으로 변화되지 않는 것으로 기대할 것이다. 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 구조에서 이루어질 수 있고, 또한 목적하는 특성을 갖는 변이체 또는 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 기능적 분자를 수득한다.
폴리펩티드 변이체는 추가로 글리코실화 형태, 다른 분자와의 응집성 접합체, 및 비관련 화학적 잔기와의 공유 접합체(예: 페길화된 분자)를 추가로 포함한다. 공유 변이체는, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 관능기를, 아미노산 쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 그룹에 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 돌연변이 단백질을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실은 또한 변이체이다.
한 가지 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩티드의 발현이 요구되는 경우, 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원의 다른 개소에서 언급된 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩티드는 하나 이상의 자가-절단 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 융합 폴리펩티드, 및 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 융합 폴리펩티드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 폴리펩티드 세그먼트를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 폴리펩티드는 전형적으로, 이들이 또한 C-말단을 C-말단에, N-말단을 N-말단에 또는 N-말단을 C-말단에 연결시킬 수 있지만, C-말단을 N-말단에 연결시킨다. 융합 단백질의 폴리펩티드는 임의의 순서로 또는 지정된 순서로 존재할 수 있다. 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질은, 융합 폴리펩티드의 목적하는 전사 활성이 보존되는 한, 보존적 변형된 변이체, 다형태 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 서브서열 및 종간 상동체를 또한 포함할 수 있다. 융합 폴리펩티드는 화학적 합성 방법 또는 2개 잔기 사이의 화학적 연결에 의해 생성할 수 있거나, 일반적으로 다른 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 융합 폴리펩티드를 포함하는 연결 DNA 서열은 본원의 다른 개소에서 언급된 바와 같이 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동적으로 연결된다.
한 가지 실시형태에서, 융합 파트너는 천연 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질의 발현을 보조하는 서열(발현 인핸서)를 포함한다. 다른 융합 파트너는 단백질의 용해도를 증가시키거나 단백질이 목적하는 세포 구획으로 표적화되는 것을 가능하게 하거나 세포 막을 통해 융합 단백질의 수송을 용이하게 하도록 선택될 수 있다.
융합 폴리펩티드는 본원에 기재된 각각의 폴리펩티드 도메인 사이에 폴리펩티드 절단 시그날을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 부위는 임의의 링커 펩티드 서열에 도입될 수 있다. 예시적 폴리펩티드 절단 시그날은 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예: 드문 제한 효소 인식 부위, 자가-절단 리보자임 인식 부위) 및 자가-절다 바이러스 폴리고펩티드 등의 폴리펩티드 절단 인식 부위를 포함한다[참조: deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26].
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자가-절단 펩티드는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다[참조: Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al .(2004) Nature Biotech. 5, 589-594]. 예시적 프로테아제 절단 부위는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 포티바이러스 Nia 프로테아제(예: 담배 에치 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비오바이러스 NIa 프로테아제, 비오바이러스 RNA-2-코딩된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(벼 툰그로 구형 바이러스) 3C-형 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 플렉 바이러스) 3C-형 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제를 포함한다. 이의 높은 절단 엄격성에 기인하여, TEV(담배 에치 바이러스) 프로테아제 부위, 예를 들면, EXXYXQ(G/S)(서열번호 11), 예를 들면, ENLYFQG(서열번호 12) 및 ENLYFQS(서열번호 13)(여기서, X는 임의의 아미노산(TEV에 의한 절단은 Q와 G 사이 또는 Q와 S 사이에서 발생한다)을 나타낸다)가 한 가지 양태에서 바람직하다.
특정 실시형태에서, 자가-절단 펩티드는 포티바이러스 및 카디오바이러스 2A 펩티드, FMDV(족구 질환 바이러스), 우마 비염 A 바이러스, 토세아 아시그나 바이러스 및 돼지 테스초바이러스로부터 수득된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 자가-절단 폴리펩티드 부위는 2A 또는 2A-형 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다[참조: Donnelly et al ., 2001. J. Gen . Virol. 82:1027-1041].
F. 폴리뉴클레오티드
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 하나 이상의 조작된 TCR 또는 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 메신저 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 사슬 RNA(RNA(+)), 마이너스 사슬 RNA(RNA(-)), 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 재조합 DNA, 합성 DNA, 또는 비-천연 발생 DNA를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 및 이중 사슬 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 전형적으로 변이체가 참조 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 경우에, 본원에 기재된 임의의 참조 서열(참조: 서열 목록)에 대해서 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 변이체를 포함한다. 다양한 예시적 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 발현 벡터, 바이러스 벡터 및 전이 플라스미드, 및 이들을 포함하는 조성물 및 세포를 의도한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 적어도 약 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000개 또는 그 이상의 연속 아미노산 잔기 또한 모든 중간 길이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 제공된다. 이러한 맥락에서, "중간 길이"는 6, 7, 8, 9 등; 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등과 같이 인용된 값 사이의 임의의 길이를 의미하는 것으로 용이하게 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체" 등은 참조 폴리뉴클레오티드 서열 또는, 이하에 정의된 엄격한 조건하에서 참조 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드와 실질적 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이들 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가 또는 결실되거나, 참조 폴리뉴클레오티드와 비교하여 상이한 뉴클레오티드로 대체된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 부가, 결실 및 치환을 포함하는 특정의 변화가 참조 폴리뉴클레오티드에 대해 이루어지고, 이에 의해 변화된 폴리뉴클레오티드가 참조 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유할 수 있음은 당해 기술분야에서 잘 이해된다.
인용 "서열 동일성" 또는, 예를 들면, "와 50% 동일한 서열"은, 본원에 사용된 바와 같이, 서열이 비교 윈도우에 걸쳐 뉴클레오티드 단위끼리 또는 아미노산 단위끼리 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 퍼센트"는, 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예: A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예: Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)이 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 정합된 위치의 수를 수득하고, 정합된 위치의 수를 비교 윈도우(예: 윈도우 크기)에서 전체 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 수득함으로써 계산할 수 있다. 전형적으로, 폴리펩티드 변이체가 참조 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 경우, 본원에 기재도니 임의의 참조 서열 중의 어느 하나에 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 포함된다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 관계를 기재하기 위해 사용된 용어는 "참조 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "서열 동일성 퍼센트" 및 "실질적 동일성"을 포함한다. "참조 서열"은 길이가 적어도 12개, 그러나 종종 15 내지 18개 및 종종 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 25개 단량체 단위이다. 2개 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 2개 폴리뉴클레오티드 사이에서 유사한 서열(즉, 완전 폴리뉴클레오티드 서열의 일부만), 및 (2) 2개 폴리뉴클레오티드 사이에서 상이한 서열을 각각 포함하기 때문에, 2개(또는 이상) 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 동정하고 비교하기 위해 "비교 윈도우"에 걸쳐 2개 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교함으로써 수행된다. "비교 윈도우"는 적어도 6개 연속 위치, 통상 약 50 내지 약 100개, 보다 통상적으로 약 100 내지 150개의 개념적 세그먼트를 지칭하고, 여기서 서열은 2개 서열을 최적으로 정렬한 후에 연속 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교한다. 비교 윈도우는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열과 비교하여(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않는다) 약 20% 이하의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우를 정렬하는 서열의 최적 정렬은 알고리즘의 컴퓨터 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)에 의해 또는 선택된 임의의 다양한 방법에 의해 생성된 검사 및 최상 정렬(즉, 비교 윈도우에 걸쳐 최고 퍼센트 상동성을 생성)에 의해 수행할 수 있다. 참조는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Altschul et al ., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 개시된 바와 같은 프로그램의 BLAST 계열로 수행할 수 있다. 서열 분석의 상세 언급은 문헌[참조: Unit 19.3 of Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15]에서 발견할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 코딩 서열 자체의 길이와 무관하게, 본원의 다른 개소에 개시되거나 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 다른 DNA 서열, 예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역된 영역(UTR), 코작 서열, 폴리아데닐화 시그날, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 리컴비나제 인식 부위(예: LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 시그날 및 자가-절단 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 에피토프 태그와 조합되어, 이의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 사용될 수 있는 것으로 의도되며, 전체 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용 용이성에 의해 제한된다.
폴리뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지되고 이용가능한 임의의 다양한 잘 확립된 기술을 사용하여 제조, 조작 및/또는 발현시킬 수 있다. 목적하는 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적절한 벡터에 삽입할 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 자가 복제 서열 및 전이 요소이다. 추가의 예시적 벡터는, 제한 없이, 플라스미드, 파게미드, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들면, 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC), 또는 P1-유래된 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예를 들면, 람다 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스 범주의 예는, 제한 없이, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예: 헤르페스 심플렉스 바이러스), 폭스바이러스, 바쿨로바이러스, 파필로마바이러스 및 파보바바이러스(예: SV40)를 포함한다. 발현 벡터의 예는 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 pClneo 벡터(Promega); 포유동물 세포에서 렌티바이러스-매개된 유전자 전이 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 키메라 단백질의 코딩 서열은 포유동물 세포에서 키메라 단백질의 발현을 위해 이러한 발현 벡터에 연결될 수 있다.
발현 벡터에 존재하는 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은, 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역된 영역(복제 기원, 선별 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 시그날(Shine Dalgarno 서열 또는 Kozak 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 비번역된 영역)이다. 이러한 요소는 이들의 강도 및 특이성이 상이할 수 있다. 사용된 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 편재성 프로모터 및 유도가능한 프로모터를 포함하는 임의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하는, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 벡터는 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 외인성, 내인성 또는 이종성 조절 서열을 포함한다. "내인성" 조절 서열은 게놈 내에서 소정 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 조절 서열은 당해 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학 기술)의 방법에 의해 유전자에 병렬로 배치된 것이다. "이종성" 조절 서열은 유전적으로 조작된 세포와 상이한 종으로부터 유래하는 외인성 서열이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 폴리머라제는 프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 개시하고 전사한다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포에서 작동하는 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역 및/또는 전사 개시로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열, N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역을 포함한다.
용어 "인핸서"는, 증강된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부의 경우에 또 다른 조절 서열에 대해 이들의 배향과는 독립적으로 기능할 수 있는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 기타 인핸서 요소와 협동적으로 또는 부가적으로 기능할 수 있다. 용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭한다.
용어 "작동적으로 연결된"은 기재된 성분이 이들을 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계로 존재하는 병렬관계를 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 용어는 핵산 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 목적하는 폴리뉴클레오티드 사이의 기능적 연결을 지칭하고, 여기서 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "구성적 발현 조절 서열"은 작동적으로 연결된 서열의 전사를 계속해서 또는 연속적으로 가능하게 하는 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 조절 서열은 광범한 종류의 세포 및 조직 유형에서 발현을 가능하게 하는 "편재성(ubiquitous)" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 제한된 종류의 세포 및 조직 유형에서 각각 발현을 가능하게 하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 편재성 발현 조절 서열에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 바이러스성 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들면, 초기 또는 후기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5 및 P11 프로모터, 신장 인자(elongation factor) 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 진핵성 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 쇼크 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 쇼크 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 쇼크 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌[참조: Irions et al ., (2007) Nature Biotechnology 25, 1477-1482], 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터 및 β-액틴 프로모터, 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 조절 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터를 포함한다[참조: Challita et al., J Virol. 69(2):748-55(1995)].
특정 실시형태에서, 이는 표적 항원을 발현하는 세포에 T 세포를 재지시하는 충분한 수준에서 T 세포에서 안정한 및 장기간 발현을 제공하는 프로모터로부터 조작된 TCR 또는 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 MND 프로모터이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조건적 발현(conditional expression)"은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 유도성 발현; 억제성 발현; 특정한 생리학적, 생물학적 또는 질환 상태를 갖는 세포 또는 조직에서의 발현 등을 포함하는 모든 유형의 조건적 발현을 지칭할 수 있다. 이 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 배제하도록 의도된 것은 아니다. 본 발명의 특정한 실시형태는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 조건적 발현을 제공하고, 예를 들면, 발현은 세포, 조직, 생물체 등을, 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 야기하거나 목적하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리뉴클레오티드의 발현의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건에 적용함으로써 조절된다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적 예로는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 코딩하는 유전자에 대한 프로모터와 같은 스테로이드-유도성 프로모터(상응하는 호르몬으로 처리함으로써 유도가능), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속으로 처리함으로써 유도가능), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도가능), "진스위치" 미페프리스톤-조절가능한 시스템("GeneSwitch" mifepristone-regulatable system)[참조: Sirin et al ., (2003) Gene, 323:67], 쿠메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존성 조절 시스템 등을 포함한다.
조건적 발현은 또한 부위-특이적 DNA 재조합효소를 사용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에 따르면, 벡터는 부위-특이적 재조합효소에 의해 매개된 재조합을 위한 적어도 하나(통상 2개)의 부위(들)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합효소" 또는 "부위-특이적 재조합효소"는 야생형 단백질[참조: Landy, (1993), Current Opinion in Biotechnology 3:699-707], 또는 이의 돌연변이체, 유도체(예를 들면, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있는, 하나 이상의 재조합 부위(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)를 수반하는 재조합 반응에 관여하는 소화성 또는 통합성 단백질, 효소, 보조-인자(co-factors) 또는 연관된 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정한 실시형태에서 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적 예로는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 리졸바제(resolvase), TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA가 포함된다.
G. 바이러스 벡터
특정 실시형태에서, T 세포, 예를 들면, PBMC를 포함하는 세포 모집단 또는 T 세포의 정제된 모집단은 본원에서 의도된 조작된 TCR 또는 CAR을 코딩하는 레트로바이러스 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 형질도입된 T 세포는 안정한 장기간 지속성 T-세포 반응을 유도한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "레트로바이러스"는 이의 게놈 RNA를 선형 이중 사슬 DNA 카피로 역전사시키고, 이어서 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내에 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적 레트로바이러스는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 몰로니 뮤린(Moloney murine) 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하베이(Harvey) 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV), 지본 유인원(gibbon ape) 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스(spumavirus), 프렌드(Friend) 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 및 렌티바이러스를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렌티바이러스"는 복잡한 레트로바이러스의 그룹(또는 속)을 지칭한다. 예시적 레트로바이러스는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2 포함); 비스나-메디(visna-maedi) 바이러스(VMV); 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역결핍 바이러스(BIV); 및 유인원(simian) 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용 서열 요소)이 바람직하다.
용어 "벡터"는 본원에서 또 다른 핵산 분자를 전이시키거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해서 사용된다. 전이된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되는데, 예를 들면, 벡터 핵산 분자 내에 삽입된다. 벡터는 세포에서의 자율적 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 가능하게 하는데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들면, 플라스미드(예를 들면, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포손, 코스미드, 세균 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는, 예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
당해 기술분야의 기술자에게 명백한 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는, 전형적으로 핵산 분자의 전이 또는 세포의 게놈 내로의 통합을 용이하게 하는 바이러스-유래된 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들면, 전이 플라스미드), 또는 핵산 전이를 매개하는 바이러스 입자를 지칭하기 위해서 광범하게 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 핵산(들) 이외에도 다양한 바이러스 성분 및 종종 또한 숙주 세포 성분들을 포함할 것이다.
용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포 내로 전이시킬 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자, 또는 전이된 핵산 그 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전이 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전자 요소를 함유한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 LTR을 포함한 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "하이브리드"는 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스 서열 및 비-렌티바이러스 바이러스 서열 둘 다를 함유하는 벡터, LTR 또는 기타 핵산을 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, 하이브리드 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 팩키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전이 플라스미드를 지칭한다.
특정한 실시형태에서, 용어 "렌티바이러스 벡터", "렌티바이러스 발현 벡터"는 렌티바이러스 전이 플라스미드 및/또는 감염성 렌티바이러스 입자를 지칭하기 위해서 사용될 수 있다. 본원에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종성 핵산 등과 같은 요소들을 언급하는 경우에, 이들 요소의 서열은 본 발명의 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하고 본 발명의 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
프로바이러스의 각각의 말단에는 "긴 말단 반복체(long terminal repeat)" 또는 "LTR"로 불리우는 구조가 존재한다. 용어 "긴 말단 반복체(LTR)"는 이들의 천연 서열 환경에서 직접적인 반복체이고 U3, R 및 U5 영역을 함유하는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치하는 염기쌍의 도메인을 지칭한다. LTR는 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들면, 촉진, 개시 및 유전자 전사물의 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 기본적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 조절 요소, 폴리아데닐화 시그날 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 포함하는 다수의 조절 시그날을 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5로 불리우는 3개 영역으로 구분된다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이고, 폴리아데닐화 서열을 함유한다. R(반복체) 영역은 U3 및 U5 영역에 인접하여 있다. U3, R 및 U5 영역으로 구성된 LTR은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단 둘 다에서 나타난다. 5' LTR에 인접한 것은 게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위)를 위해서, 및 바이러스 RNA의 입자 내로의 효율적 팩키징(Psi 부위)을 위해서 필요한 서열이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "팩키징 시그날" 또는 "팩키징 서열"은 바이러스 RNA를 바이러스 캡시드 또는 입자 내로 삽입하는데 요구되는 레트로바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 지칭한다[참조: Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109]. 몇 가지의 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡시드화에 필요한 최소 팩키징 시그날(또한 psi[Ψ] 서열로도 지칭됨)을 사용한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "팩키징 서열", "팩키징 시그날", "프사이(psi)" 및 기호 "Ψ"는 바이러스 입자 형성 중에 레트로바이러스 RNA 사슬의 캡시드화에 필요한 비-코딩 서열과 관련하여 사용된다.
다양한 실시형태에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. LTR 중의 하나 또는 둘 다는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 3' LTR의 변형은 종종, 바이러스를 복제-결함성으로 되도록 함으로써 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 개선시키기 위해서 이루어진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "복제-결함"은 감염성 비리온이 생산되지 않도록 완전하고 효과적인 복제를 할 수 없는 바이러스를 지칭한다(예를 들면, 복제-결함성 렌티바이러스 자손). 용어 "복제-적격(replication-competent)"은 바이러스의 바이러스 복제가 감염성 비리온(예를 들면, 복제-적격 렌티바이러스 자손)을 생산할 수 있도록 복제할 수 있는 야생형 바이러스 또는 돌연변이 바이러스를 지칭한다.
"자가-불활성화"(SIN) 벡터는, U3 영역으로 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 바이러스 복제의 일차 라운드를 초과하는 바이러스 전사를 방지하도록 변형(예를 들면, 결실 및/또는 치환에 의해)되어 있는 복제-결함 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 이것은 우측(3') LTR U3 영역이 바이러스 복제 중에 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로 사용되고, 이에 따라 바이러스 전사체가 U3 인핸서-프로모터의 부재하에 제조될 수 없기 때문이다. 본 발명의 추가의 실시형태에서, 3' LTR은 U5 영역이, 예를 들면, 이상적 폴리(A) 서열로 대체되도록 변형된다. 3' LTR, 5' LTR, 또는 3' 및 5' LTR 둘 다에 대한 변형과 같은 LTR에 대한 변형도 또한 본 발명에 포함되는 것에 유의해야 한다.
추가의 안전성 증강은 5' LTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체하여 바이러스 입자의 생성 중에 바이러스 게놈의 전사를 유도시킴으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는, 예를 들면, 바이러스성 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들면, 초기 또는 후기), 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들면, 즉시 초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다. 전형적인 프로모터는 Tat-독립적 방식으로 높은 수준의 전사를 유도할 수 있다. 이러한 대체는 복제-적격 바이러스를 생성시키는 재조합의 가능성을 감소시키는데, 이는 바이러스 생성 시스템 내에 완전한 U3 서열이 없기 때문이다. 특정한 실시형태에서, 이종성 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방법을 제어하는 면에서 부가적인 이점을 가진다. 예를 들어, 이종성 프로모터는 유도 인자가 존재하는 경우에만 바이러스 게놈의 전부 또는 일부의 전사가 발생하도록 유도될 수 있다. 유도 인자는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 화학적 화학물, 또는 숙주 세포가 배양되는 생리학적 조건, 예를 들면, 온도 또는 pH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. 용어 "TAR"은 렌티바이러스(예를 들면, HIV) LTR의 R 영역 내에 위치한 "트랜스-활성화 반응" 유전자 요소를 지칭한다. 이 요소는 렌티바이러스 트랜스-활성화인자(tat) 유전자 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 증강시킨다. 그러나, 이 요소는 5' LTR의 U3 영역이 이종성 프로모터에 의해 대체되는 실시형태에서 필요하지 않다.
"R 영역"은 캡핑 그룹의 개시점(즉, 전사의 개시)에서 시작하여 폴리 A 트랙의 개시점 직전에서 종결하는 레트로바이러스 LTR 내의 영역을 지칭한다. R 영역은 또한 U3 및 U5 영역에 인접하는 것으로 정의된다. R 영역은 역전사 중에 게놈의 한 말단으로부터 다른 말단으로 신생 DNA의 전이를 가능하게 하는데 중요한 역할을 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FLAP 요소"는 이의 서열이 레트로바이러스, 예를 들면, HIV-1 또는 HIV-2의 중앙 폴리퓨린 트랙 및 중앙 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호, 및 문헌[참조: Zennou, et al ., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다. HIV-1 역전사 중에, 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT)에서의 플러스-사슬 DNA의 중앙 개시 및 중앙 종결 서열(CTS)에서의 중앙 종결은 3-사슬 DNA 구조: HIV-1 중앙 DNA 플랩의 형성을 유도한다. 어떠한 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 수입의 시스-활성 결정인자로 작용할 수 있고/있거나 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 특정한 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 골격은 벡터 내의 목적하는 이종성 유전자의 상류 또는 하류에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들면, 특정한 실시형태에서, 전이 플라스미드는 FLAP 요소를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 HIV-1로부터 단리된 FLAP 요소를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전이 벡터는 하나 이상의 수출 요소를 포함한다. 용어 "수출 요소"는 핵으로부터 세포의 세포질로 RNA 전사체의 수송을 조절하는 시스-작용성 전사-후 조절 요소를 지칭한다. RNA 수출 요소의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)[참조: Cullen et al ., 1991. J. Virol. 65: 1053; and Cullen et al ., 1991. Cell 58: 423], 및 간염 B 바이러스 전사-후 조절 요소(HPRE)를 포함한다. 일반적으로, RNA 수출 요소는 유전자의 3' UTR 내에 배치되며, 하나 또는 다수의 카피로서 삽입될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 바이러스 벡터 내의 이종성 서열의 발현은 벡터 내에 전사-후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위 및 임의로 전사 종결 시그날을 도입시킴으로써 증가된다. 다양한 전사-후 조절 요소, 예를 들면, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소[참조: WPRE; Zufferey et al ., 1999, J. Virol., 73:2886]; 간염 B 바이러스에 존재하는 전사-후 조절 요소(HPRE)[참조: Huang and Yen, 1995, Mol . Cell . Biol., 5:3864] 및 기타[참조: Liu et al ., 1995, Genes Dev., 9:1766]는 단백질에서 이종성 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 WPRE 또는 HPRE와 같은 전사-후 조절 요소를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 WPRE 또는 HPRE와 같은 전사-후 조절 요소를 결여하거나 포함하지 않는데, 이는 일부 경우에 이들 요소가 세포 형질전환의 위험을 증가시키고/시키거나 mRNA 전사체의 양 또는 mRNA의 안정성을 실질적으로 또는 상당히 증가시키지 않기 때문이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 부가된 안전성 척도로서 WPRE 또는 HPRE를 결여하거나 포함하지 않는다.
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 시그날은 일반적으로 폴리아데닐화 시그날의 하류에서 발견된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 발현되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 폴리아데닐화 서열 3'를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리 A 부위" 또는 "폴리 A 서열"은 RNA 폴리머라제 II에 의한 신생 RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화 둘 다를 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 서열은 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 부가하여 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있고, 따라서 증가된 번역 유효성에 기여할 수 있다. 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직한데, 이는 폴리 A 테일을 결여하는 전사체가 불안정하고 신속하게 분해되기 때문이다. 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있는 폴리 A 시그날의 예시적 예는 이상적 폴리 A 서열(예를 들면, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리 A 서열(BGHpA), 래빗 β-글로빈 폴리 A 서열(rβgpA), 또는 당해 기술분야에서 공지된 또 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리 A 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 조작된 TCR 또는 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 벡터는 하나 이상의 LTR을 가질 수 있고, 여기서 LTR은 하나 이상의 변형, 예를 들면, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 벡터는 형질도입 유효성(예: cPPT/PLAP), 바이러스 팩키징(예: Psi(Ψ) 팩키징 시그날, RRE)를 증가시키기 위해 하나 이상의 보조 요소, 및/또는 치료 유전자 발현을 증가시키는 기타 요소(예: 폴리(A) 서열)를 추가로 포함할 수 있고, 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 다수의 기타 상이한 실시형태가 본원의 기존의 실시형태로부터 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
"숙주 세포"는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 형질감염되거나 감염되거나 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 팩키징 세포, 생산자 세포, 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포는 치료가 필요한 대상체에게 투여된다. 특정한 실시형태에서, 용어 "표적 세포"는 숙주 세포와 상호 교대로 사용되고, 목적하는 세포 유형의 형질감염된, 감염된 또는 형질도입된 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 T 세포이다.
대규모 바이러스 입자 생성은 종종 합리적인 바이러스 역가를 달성하기 위해서 필요하다. 바이러스 입자는 전이 벡터를, 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자, 예를 들면, gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자 또는 기타 레트로바이러스 유전자를 포함하는 팩키징 세포주 내로 형질감염시킴으로써 생산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "팩키징 벡터"는, 팩키징 시그날을 결여하고 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 팩키징 벡터는 팩키징 세포 내에 포함되고, 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 세포 내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염의 방법은 당해 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스/렌티바이러스 전이 벡터는 형질감염, 형질도입 또는 감염에 의해 팩키징 세포주 내로 도입되어 생산자 세포 또는 세포주를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 팩키징 벡터는, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함하는 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 팩키징 벡터는 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스토시딘, 제오신, 티미딘 키나제, DHFR, Gln 신세타제 또는 ADA와 같은 우성 선별가능한 마커와 함께 세포 내로 도입되고, 이어서 적절한 약물의 존재하에서의 선별 및 클론의 단리가 수행된다. 선별가능한 마커 유전자는 팩키징 벡터에 의해, 예를 들면, IRES 또는 자가 절단성 바이러스 펩티드에 의해 코딩하는 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
바이러스 외피 단백질(env)은 세포주로부터 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 궁극적으로 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 범위를 결정한다. HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV와 같은 렌티바이러스의 경우에, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 팩키징 세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은 전술한 바와 같이 바이러스 gag 및 pol 유전자로부터 별개의 벡터 상에서 코딩된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 레트로바이러스-유래된 env 유전자의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, MLV 외피, 10A1 외피, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, 에볼라(Ebola), 센다이(Sendai), FPV(조류 독감(Fowl plague) 바이러스) 및 인플루엔자 바이러스 외피를 포함한다. 유사하게는, RNA 바이러스[예를 들면, 피코르나비리다에(Picornaviridae), 칼시비리다에(Calciviridae), 아스트로비리다에(Astroviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 버나비리다에(Birnaviridae), 레트로비리다에(Retroviridae)의 RNA 바이러스 계열]로부터 뿐만 아니라 DNA 바이러스[헤파드나비리다에(Hepadnaviridae), 서코비리다에(Circoviridae), 파르보비리다에(Parvoviridae), 파포바비리다에(Papovaviridae), 아데노비리다에(Adenoviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 폭시이리다에(Poxyiridae) 및 이리도비리다에(Iridoviridae) 과]로부터의 외피를 코딩하는 유전자가 사용될 수 있다. 대표적인 예는 FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 래비스(Rabies), ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 및 EIAV를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 바이러스를 슈도타이핑(pseudotyping)하기 위한 외피 단백질은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 다음의 바이러스들을 포함한다: H1N1, H1N2, H3N2 및 H5N1(조류 독감)과 같은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타바이러스, 노르워크(Norwalk) 바이러스 그룹의 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스(adenoviruses), 파르보바이러스(parvovirus), 뎅기열(Dengue fever) 바이러스, 원숭이 두창(Monkey pox), 모노네가비랄레스(Mononegavirales), 광견병 바이러스, 라고스 배트(Lagos bat) 바이러스, 모콜라(Mokola) 바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 바이러스, 유로피안 배트(European bat) 바이러스 1 및 2 및 오스트랄리안 배트(Australian bat) 바이러스와 같은 리사바이러스(Lyssavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus), 수포성 구내염(Vesicular Stomatitis) 바이러스(VSV), 단순 포진 바이러스 유형 1 및 2, 수두 대상포진(varicella zoster), 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바르(Epstein-Bar) 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 인간 헤르페스바이러스 유형 6 및 8, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 파필로마 바이러스(papilloma virus), 쥐 감마헤르페스바이러스와 같은 헤르페스바이러스, 아레나바이러스(Arenaviruses), 예를 들면, 아르헨티나 출혈열(Argentine hemorrhagic fever) 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스, 사비아(Sabia)-연관된 출혈열 바이러스, 베네주엘라 출혈열 바이러스, 라사열(Lassa fever) 바이러스, 마쿠포(Machupo) 바이러스, 림프구성 맥락수막염(Lymphocytic choriomeningitis) 바이러스(LCMV), 분야비리다에, 예를 들면, 크리미언-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 바이러스, 한타바이러스(Hantavirus), 신장 증후군 야기 바이러스에 의한 출혈열, 리프트 밸리열(Rift Valley fever) 바이러스, 에볼라 출혈열 및 마르버그(Marburg ) 출혈열을 포함하는 필로비리다에(필로바이러스), 케이사누르 산림병(Kaysanur Forest disease) 바이러스를 포함하는 플라비비리다에, 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스, 진드기-매개 뇌염 야기 바이러스 및 파라믹소비리다에, 예를 들면, 헨드라(Hendra) 바이러스 및 니파(Nipah) 바이러스, 바리올라 메이저(variola major) 및 바리올라 마이너(variola minor)(천연두), 알파바이러스, 예를 들면, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 동부형 말 뇌염(eastern equine encephalitis) 바이러스, 서부형(western) 말 뇌염 바이러스, SARS-연관된 코로나바이러스(SARS-CoV), 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 임의의 뇌염-야기 바이러스.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 VSV-G 당단백질로 슈도타입화된 재조합 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스를 생성하는 팩키징 세포를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "슈도타입" 또는 "슈도타이핑"은 이의 바이러스 외피 단백질이 바람직한 특징을 갖는 다른 바이러스의 것으로 치환된 바이러스를 지칭한다. 예를 들면, HIV 외피 단백질(env 유전자에 의해 코딩됨)은 통상적으로 바이러스를 CD4+ 제시 세포에 대해서 표적화하기 때문에, HIV는 HIV가 더 넓은 범위의 세포를 감염시키도록 하는 소포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질로 슈도타입화될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 렌티바이러스 외피 단백질은 VSV-G에 의해 슈도타입화된다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명은 VSV-G 외피 당단백질로 슈도타입화된 재조합 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스를 생성하는 팩키징 세포를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "팩키징 세포주"는 팩키징 시그날을 함유하지 않지만, 바이러스 입자의 정확한 팩키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들면, gag, pol 및 env)를 안정적으로 또는 일시적으로 발현하는 세포주와 관련하여 사용된다. 임의의 적합한 세포주는 본 발명의 팩키징 세포를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유동물 세포이다. 특정한 실시형태에서, 팩키징 세포주를 생성하기 위해 사용된 세포는 인간 세포이다. 사용될 수 있는 적합한 세포주는, 예를 들면, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 팩키징 세포는 293 세포, 293T 세포 또는 A549 세포이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생산자 세포주"는, 팩키징 세포주 및 팩키징 시그날을 포함하는 전이 벡터를 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자를 생성할 수 있는 세포주를 지칭한다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 저장 용액의 생성은 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 저장 용액을 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Y. Soneoka et al .(1995) Nucl . Acids Res. 23:628-633, 및 N. R. Landau et al .(1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 예시되어 있다. 감염성 바이러스 입자는 통상적인 기술을 사용하여 팩키징 세포로부터 수집될 수 있다. 예를 들면, 감염성 입자는 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이 세포 용해, 또는 세포 배양물의 상청액의 수집에 의해 수집될 수 있다. 임의로, 수집된 바이러스 입자는 필요에 따라 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술은 당해 기술분야에서 기술자에게 공지되어 있다.
형질감염이 아닌 바이러스 감염에 의해 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용한 유전자(들) 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 "형질도입"으로 지칭된다. 한 가지 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포 내로 형질도입된다. 특정한 실시형태에서, 표적 세포(예: T 세포)는, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 세포에 전달된 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, "형질도입"된다. 특정 실시형태에서, 형질도입된 세포는 이의 세포 게놈에 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 하나 이상의 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 숙주 세포는 B-세포 악성종양을 치료하고/하거나 예방하기 위해 대상체에게 투여된다. 본 발명의 특정 실시형태에 따라 이용될 수 있는, 유전자 요법에서 바이러스 벡터의 사용에 관한 기타 방법은 문헌[참조: Kay, M. A.(1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M.(1998) Hum . Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al .(1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al.(2000) Curr . Opin . Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M.(2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S.(1992) Crit . Rev . Biotechnol. 12:335-56; Alt, M.(1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G.(1994) Ann. N.Y . Acad . Sci. 716:90-101; Strayer, D. S.(1999) Expert Opin . Investig . Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S.(2001) Curr . Cardiol. Rep. 3:43-49; and Lee, H. C. et al .(2000) Nature 408:483-8]에서 발견할 수 있다.
H. 조성물 및 제형
본원에서 의도된 조성물은, 본원에서 의도된 바와 같이, 하나 이상의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 T 세포 조성물을 포함할 수 있다. 조성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 약제학적 조성물을 포함한다. "약제학적 조성물"은, 단독으로 또는 하나 이상의 기타 양식의 요법과 조합하여, 세포 또는 동물에게 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 또는 생리학적으로 허용되는 용액에서 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한, 필요한 경우, 본 발명의 조성물은 다른 제제, 예를 들면, 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 소분자, 화학요법제, 프로-드러그, 항체 또는 기타 다양한 약제학적 활성제와 조합하여 투여할 수 있는 것으로 이해된다. 조성물에 또한 포함될 수 있는 다른 성분에는 실질적으로 제한이 없지만, 단 추가의 제제는 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 역으로 영향을 미치지 않아야 한다.
문구 "약제학적으로 허용되는"은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 용량형을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는, 제한 없이, 인간 또는 가축 동물에서 사용하기 위해 허용되는 것으로 미국 식품의약청에 의해 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활주제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증강제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장성제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함한다. 예시적 약제학적으로 허용되는 담체는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 당(예: 락토즈, 글루코즈 및 슈크로즈); 전분(예: 옥수수 전분 및 감자 전분); 셀룰로즈 및 이의 유도체(예: 나트륨 카복실메틸 셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈 및 셀룰로즈 아세테이트); 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 실릭산, 산화아연; 오일(예: 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유); 글리콜(예: 프로필렌 글리콜); 폴리올(예: 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜); 에스테르(예: 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트); 아가; 완충제(예: 수산화망간 및 수산화알루미늄); 알긴산; 피로겐-비함유 물; 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알콜; 인산염 완충 용액; 및 약제학적 제형에 사용된 임의의 기타 호환성 물질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 의도된 방법에 의해 제조된 양의 변형된 T 세포를 포함한다. 이는 일반적으로 본원에서 의도된 방법으로 제조한 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물이, 이들 범위 내의 모든 정수를 포함하여, 102 내지 1010 세포/체중 kg, 바람직하게는 105 내지 106 세포/체중 kg의 용량으로 투여될 수 있음을 말한다. 세포의 수는, 그 안에 포함된 세포 유형과 같이 조성물이 의도되는 궁극적 용도에 의존할 것이다. 본원에 제공된 용도를 위해, 세포는 일반적으로 1리터 이하의 용적으로 존재하고, 500mL 이하, 심지어 250mL 또는 100mL 이하일 것이다. 따라서, 목적하는 세포의 밀도는 전형적으로 106 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 면역 세포의 임상적으로 관련되는 수는 점증적으로 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 1012 세포와 동등하거나 이를 초과하는 다중 주입으로 배분될 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 동종이계, 동계, 이종 또는 자가일 수 있다. 필요한 경우, 치료는 또한 주입된 T 세포의 접종 및 기능을 증강시키기 위해 본원에 기재된 바와 같이 미토겐(예: PHA) 또는 림포카인, 사이토킨 및/또는 케모킨(예: IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-12, TNF-알파, IL-18 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화 및 확장된 세포를 포함하는 조성물은 면역절충되는 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있다. 특히, 본원에서 의도된 방법으로 제조된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 암의 치료에 사용된다. 본 발명의 변형된 T 세포는 단독으로, 또는 담체 희석제, 부형제 및/도는 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15 또는 기타 사이토킨 또는 세포 모집단 등의 다른 성분과 조합하여 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 유전적으로 변형된 T 세포의 양을 포함한다.
본원에서 의도된 변형된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 완충제(예: 중성 완충된 식염수, 인산염 완충된 식염수 등); 탄수화물(예: 글루코즈, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란, 만니톨); 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산(예: 글리신); 항산화제; 킬레이트제(예: EDTA 또는 글루타티온); 보조제(예: 수산화알루미늄); 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들면, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여를 위해 제형화된다.
한 가지 실시형태에서, 조성물은 정맥내 투여된다.
액체 약제학적 조성물은, 이들이 용액, 현탁액 또는 기타 유사 형태이든지, 하나 이상의 하기 성분들을 포함할 수 있다: DMSO, 멸균 희석제(예: 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리학적 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예를 들면, 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있는 합성 모노 또는 디글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매); 항균제(예: 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤); 항산화제(예: 아스코르브산 또는 아황산나트륨); 킬레이트제(예: 에틸렌디아민테트라아세트산); 완충제(예: 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트) 및 등장성 조절제(예: 염화나트륨 또는 덱스트로즈).
특정 실시형태에서, 세포는 주입가능한 극저온 배지, 50% 플라스말라이트 및 50% 크리오스터 10; 50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO); 또는 크리오스터 10에서 동결된다.
비경구 제제는 유리 또는 플라스틱, 앰플, 휴대가능한 시린지 또는 다중 용기 바이알에 봉입될 수 있다. 주사가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균성이다.
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합하여 유효량의 확장된 변형된 T 세포 조성물을 포함한다. 따라서, T 세포 조성물은 단독으로 또는 기타 공지된 암 치료제, 예를 들면, 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광선역학 요법 등과 조합하여 투여할 수 있다. 조성물은 또한 항생물질과 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 치료제는 특정 암 등의 본원에 기재된 특정 질환 상태에 대한 표준 치료로서 당해 기술분야에서 허용될 수 있다. 의도되는 예시적 치료제는 사이토킨, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항-염증제, 화학요법, 방사선요법, 치료학적 항체 또는 기타 활성제 및 보조제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 T 세포를 포함하는 조성물은 임의 수의 화학요법제와 조합하여 투여할 수 있다. 화학요법제의 예시적 예는 알킬화제(예: 티오페파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN™)); 알킬 설포네이트(예: 부설판, 임프로설판 및 피포설판); 아지리딘(예: 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파); 알트레트아민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올멜라민 레슘; 질소 머스타드(예: 클로람부틸, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프로드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드); 니트로스우레아(예: 카부스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴); 항생물질(예: 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 카크티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르퓨신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로돌라마이신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 조니스타틴, 조루비신); 항-대사물질(예: 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체(예: 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트); 퓨린 유사체(예: 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌); 피리미딘 유사체(예: 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU); 안드로겐(예: 칼루스테론, 드로모스탈로론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤); 항-아드레날린(예: 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄); 엽산 보충제(예: 프롤린산); 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포프아민; 데메콜킨; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티니움 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 레티난; 로니다민; 미토구아존; 미토크산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하디드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마니움; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드(예: 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체(예: 시스플라틴 및 카보플라틴); 빈블라스틴; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토크산트론; 빈크리스틴; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴(DMFO); 레틴산 유도체(예: Targretin™(벡사로텐), Panretin™(알리트레티노인); ONTAK™(데니류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 이 정의에는 종양에 대해 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항-호르몬제(예: 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(Fareston)); 항-안드로겐제(예: 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린); 및 상기 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
다양한 기타 치료제가 본원에 기재된 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, T 세포를 포함하는 조성물은 항-염증제와 함게 투여된다. 항-염증제 또는 약물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프로드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론 포함), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 의약, 사이클로포스파미드 및 마이코페놀레이트를 포함하는 비스테로이드 항-염증 약물(NSAIDS)을 포함한다.
기타 예시적 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cos-2 억제제(예: VIOXX®(로페콕시브) 및 CELEBREX®(셀레콕시브)) 및 시알릴레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예시적 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 프로포르지펜 하이드로클로라이드의 트라마돌로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예시적 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프로드니솔론, 프로드니솔론 또는 프레드니손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예시적 생물학적 반응 변형제는 세포 표면 마커에 대해 지시된 분자(예: CD4, CD5 등), 사이토킨 억제제, 예를 들면, TNF 길항제(예: 에타네르셉트(ENBREL®), 아달리누맵(HUMIRA®) 및 인플릭시맵(REMICADE®)), 케모킨 억제제 및 부착 분자 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 생물학적 반응 변형제는 재조합 형태의 분자 뿐만 아니라 모노클로날 항체를 포함한다. 예시적 DMARD는 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노미드, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 골드(경구(오라노핀) 및 근육내) 및 미노사이클린을 포함한다.
본원에서 의도된 CAR 변형된 T 세포와 조합하기에 적합한 치료학적 항체의 예시적 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 아바고보맵, 아데카투무맴, 아푸투주맵, 알렘투주맵, 알투모맵, 아마툭시맵, 아나투모맵, 아르시투모맵, 바비툭시맵, 베크투모맵, 베바시주맵, 비바투주맵, 블리나투모맵, 브렌툭시맵, 칸투주맵, 카투막소맵, 세툭시맵, 시타투주맵, 식수투무맵, 클리바투주맵, 코나투무맵, 다라투무맵, 드로지투맵, 둘리고투맵, 두시지투맵, 데투모맵, 다세투주맵, 달로투주맵, 에크로멕시맵, 엘로투주맵, 엔시툭시맵, 에르투막소맵, 에타라시주맵, 파리에투주맵, 필클라투주맵, 피지투무맵, 플란보투맵, 푸툭시맵, 가니투맵, 겜투주맵, 기렌툭시맵, 글렘바투무맵, 이브리투모맵, 이고보맵, 임가투주맵, 인다툭시맵, 이노투주맵, 인테투무맵, 이필리무맵, 이라투무맵, 라베투주맵, 렉사투무맵, 린투주맵, 로르보투주맵, 루카투무맵, 마파투무맵, 마투주맵, 밀라투주맵, 민레투모맵, 미투모맵, 목세투모맵, 나르나투맵, 나프투모맵, 네시투모맵, 니모투주맵, 노페투모맵, 오카라투주맵, 오파투무맵, 올라라투맵, 오나르투주맵, 오포르투주맵, 오레고보맵, 파니투무맵, 파르사투주맵, 파트리투맵, 펨투모맵, 퍼투주맵, 핀투모맵, 프리투무맵, 라코투모맵, 라드레투맵, 릴로투무맵, 리툭시맵, 로바투무맵, 사투모맵, 시브로투주맵, 실룩시맵, 심투주맵, 솔리토맵, 타카투주맵, 타플리투모맵, 테나투모맵, 테프로투무맵, 티가투주맵, 토시투모맵, 트라스투주맵, 투코투주맵, 우빌리툭시맵, 벨투주맵, 보르세투주맵, 보투무맵, 잘루투무맵, CC49 및 3F8을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 사이토킨과 조합하여 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이 "사이토킨"이란 세포내 매개인자로서 또 다른 세포에 작용하는 한 세포 모집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반 용어를 의미한다. 이러한 사이토킨의 예는 림포카인, 모노카인, 케모킨, 예를 들면, RANTES, MIP1a, 및 종래의 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토킨 중에서는 성장 호르면(예: 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬); 파라티로이드 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렉락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬(예: 난포 자극 호르면(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성 호르몬(LH)); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러관-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자(예: NGF-베타); 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF)(예: TGF-알파 및 TGF-베타); 인슐린-양 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론(예: 인터페론-알파, 베타 및 -감마); 콜로니 자극 인자(CSF)(예: 마크로파지-CSF(M-CSF)); 과립구-마크로파지-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL)(예: IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15); 종양 괴사 인자(예: TNF-알파 또는 TNF-베타); 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 사이토킨은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
I. 표적 세포 및 항원
본 발명은, 부분적으로, 표적 세포(예: 종양 또는 암 세포)에 대해 재지시되고, 세포 상의 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 갖는 조작된 T 세포 수용체 또는 CAR을 포함하는 유전적으로 변형된 면역 작동 세포를 제조하는 세포 제조 플랫폼을 의도한다. 암 세포는 또한 혈액 또는 림프 시스템을 통해 신체의 다른 부분으로 확산할 수 있다. 암의 몇몇 주요 유형이 있다. 암종은 내부 기관을 배열하거나 커버하는 피부 또는 조직에서 개시하는 암이다. 육종은 골, 연골, 지방, 근육, 혈관 또는 기타 결합 또는 지지 조직에서 개시하는 암이다. 백혈병은 혈액-형성 조직, 예를 들면, 골수에서 개시하고 다수의 비정상 혈액 세포가 생성되어 혈액으로 유입되도록 하는 암이다. 림프종 및 다발성 골수종은 면역계의 세포에서 개시하는 암이다. 중추신경계 암은 뇌 및 척수의 조직에서 개시하는 암이다.
한 가지 실시형태에서, 표적 세포는 다른 정상(목적하는) 세포의 표면에서 실질적으로 발견되지 않는 항원, 예를 들면, 표적 항원을 발현한다. 한 가지 실시형태에서, 표적 세포는 췌장실질 세포, 췌관 세포, 간세포, 심근 세포, 골격근 세포, 골아 세포, 골격 근아세포, 신경세포, 혈관 내피 세포, 색소 세포, 평활근 세포, 글리아 세포, 지방 세포, 골 세포, 연골세포, 췌도 세포, CNS 세포, PNS 세포, 간 세포, 지방 세포, 신장 세포, 폐 세포, 피부 세포, 난소 세포, 여포 세포, 상피 세포, 면역 세포 또는 내피 세포이다.
특정 실시형태에서, 표적 세포는 췌장 조직, 신경 조직, 심장 조직, 골수, 근육 조직, 골 조직, 피부조직, 간 조직, 모낭, 혈관 조직, 지방 조직, 폐 조직 및 신장 조직의 일부이다.
특정 실시형태에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포, 예를 들면, 암을 갖는 환의 세포이다. 개시된 방법으로 사멸시킬 수 있는 예시적 세포는 하기 종양의 세포를 포함한다: 액체 종양, 예를 들면, 급성 백혈병(예: 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아구, 전골수구, 골수단구성, 단구 및 적백혈병), 만성 백혈병(예: 만성 골수성(과립구) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병)을 포함하는 백혈병, 진성다혈증, 림프종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발형 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환).
또 다른 실시형태에서, 세포는 충실성 종양 세포, 예를 들면, 육종 및 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 폐암, 결직장암, 편평상피암, 기저 세포암, 선암(예: 췌장, 결장, 난소, 폐, 유방, 위장, 전립선, 자궁경부 또는 식도의 선암), 한선암, 피지선암, 유두상암, 유두상 선암, 수양암, 기관지암, 신장 세포암, 담즙관암, 흉모막암, 빌름 종양, 자궁경부암, 정소 종양, 방광암, CNS 종양(예: 신경교종, 성상세포종, 수아종, 두개인두종, 상의종, 송과체종, 혈관아종, 청신경종, 핍지돌기신경교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아세포종)이다.
한 가지 실시형태에서, 암은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 청구항 제1항의 방법에서 암은 빌름 종양, 유윙 육종, 신경내분비 종양, 신경교아세포종, 신경아세포종, 흑색종, 피부암, 유방암, 결장암, 직장암, 전립선암, 간암, 신장암, 췌장암, 폐암, 담도암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 갑상선 수질암, 난소암, 신경교종, 림프종, 백혈병, 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 및 방광암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 가지 실시형태에서, 표적 세포는 간, 췌장, 폐, 유방, 방광, 뇌, 골, 갑상선, 신장, 피부 및 조혈 시스템의 악성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 세포는 간암, 췌장암, 폐암, 유방암, 방광암, 뇌암, 골암, 갑상선암, 신장암, 피부암 또는 혈액암의 세포이다.
한 가지 실시형태에서, 표적 항원은 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y, Kappa, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈, TAG72, TEM 또는 VEGFR2의 에피토프이다.
J. 치료 방법
본원에서 의도된 방법으로 제조된 변형된 T 세포는, 제한 없이, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증 질환 및 면역결핍증을 포함하는 다양한 상태의 치료에서 사용하기 위한 개선된 양자 면역요법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 일차 T 세포의 특이성은 본원에서 의도된 조작된 TCR 또는 CAR을 갖는 일차 T 세포를 유전적으로 변형시켜 종양 또는 암 세포에 대해 재지시된다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명은 세포 요법의 유형을 포함하고, T 세포는 표적 항원을 발현하는 암 세포를 표적화하는 조작된 TCR 또는 CAR을 발현시키기 위해 유전적으로 변형되고, 변형된 T 세포는 이를 필요로 하는 수용자에게 주입된다. 주입된 세포는 수용자에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, 조작된 TCR 또는 CAR 변형된 T 세포는 생체내에서 복제할 수 있고, 따라서 지속된 암 요법을 유도할 수 있는 장기간 지속성에 기여한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 조작된 TCR 및 CAR T 세포는 강력한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안 지속할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조작된 TCR 또는 CAR T 세포는 임의의 추가 종양 형성 또는 성장을 억제하기 위해 재활성화될 수 있는 특이적 기억 T 세포로 진화한다.
특정 실시형태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 유전적으로 변형된 면역 작동 세포를 포함하는 조성물은, 제한 없이, 간암, 췌장암, 폐암, 유방암, 방광암, 뇌암, 골암, 갑상선암, 신장암 또는 피부암을 포함하는 충실성 종양 또는 암의 치료에 사용된다.
특정 실시형태에서, PSCA 또는 MUC1의 에피토프에 결합하는 항원-특이적 결합 도메인을 포함하는 조작된 TCR 또는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 유전적으로 변형된 면역 작동 세포를 포함하는 조성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 췌장, 방광 및 폐를 포함하는 다양한 암의 치료에 사용된다.
특정 실시형태에서, CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 유전적으로 변형된 면역 작동 세포를 포함하는 조성물은, 액체 종양, 예를 들면, 급성 백혈병(예: ALL, AML 및 골수아구, 전골수구, 골수단구성, 단구 및 적백혈병), 만성 백혈병(예: CLL, SLL, CML, HCL)을 포함하는 백혈병, 진성다혈증, 림프종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발형 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 중쇄 질환의 치료에 사용된다.
특정 실시형태에서, 조작된 TCR 또는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 유전적으로 변형된 면역 작동 세포를 포함하는 조성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 다발성 골수종(MM), 비-호지킨 림프종(NHL) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하는 B-세포 악성종양의 치료에 사용된다.
다발성 골수종은 이들 세포 유형의 단일 클론의 종양성 형질전환을 특징으로 하는 성숙 형질 세포 형태의 B-세포 악성종양이다. 이들 형질 세포는 BM에서 증식하고, 인접한 골 및 종종 혈액으로 침입한다. 변이체 형태의 다발성 골수종은 명백한 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 비-분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 골의 고립성 형질세포종 및 수질외 형질세포종을 포함한다[참조: 예를 들면, Braunwald, et al .(eds), Harrison ’s Principles of Internal Medicine, 15th Edition(McGraw-Hill 2001)].
비-호지킨 림프종은 림프구(백혈구 세포)의 거대 그룹의 암을 포함한다. 비-호지킨 림프종은 모든 연령에서 발생할 수 있고, 종종 정상보다 큰 림프절, 발열 및 체중 감소로 나타난다. 다수의 상이한 유형의 비-호지킨 림프종이 있다. 예를 들면, 비-호지킨 림프종은 적극적(신속-성장) 및 무통성(느린-성장) 유형으로 나뉠 수 있다. 비-호지킨 림프종은 B-세포 및 T-세포로부터 유래할 수 있고, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비-호지킨 림프종" 및 "B-세포 비-호지킨 림프종"은 상호 교대로 사용된다. B-세포 비-호지킨 림프종(NHL)은 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구성 림프종(CLL/SLL), 대세포형 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역 대세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종 및 맨틀 세포 림프종을 포함한다. 골수 또는 줄기 세포 이식 후에 발생하는 림프종은 통상 B-세포 비-호지킨 림프종이다.
만성 림프구성 백혈병(CLL)은, B 림프구로 불리우는 미성숙 백혈구 세포 또는 B 세포에서 느린 증가를 유발하는 완만한(느린-성장) 암이다. 암 세포는 혈액 및 골수를 통해 확산하고, 또한 림프절 또는 간 및 비장 등의 다른 기관에 영향을 미칠 수 있다. CLL은 결국 골수의 실패를 유발한다. 종종, 질환의 후기 단계에서, 상기 질환은 소림프구성 림프종으로 불리운다.
특정 실시형태에서, 본원에서 의도된 치료학적 유효량의 변형된 T 세포 또는 이를 포함하는 조성물을, 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합하여, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포는 암을 발증할 위험에 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은, 치료학적 유효량의 본 발명의 변형된 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 본원에서 의도된 유전적으로 변형된 면역 작동 세포를 포함하는 유효량, 예를 들면, 치료학적 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 투여 양 및 빈도는, 적절한 용량이 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 환자의 상태 및 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
한 가지 실시형태에서, 대상체에게 투여된 조성물 중의 변형된 T 세포의 양은 적어도 0.1×107 변형된 T 세포/m2, 적어도 0.5×107 변형된 T 세포/m2, 적어도 1×107 변형된 T 세포/m2, 적어도 5×107 변형된 T 세포/m2, 적어도 0.1×108 변형된 T 세포/m2, 적어도 0.5×108 변형된 T 세포/m2, 적어도 1×108 변형된 T 세포/m2, 적어도 5×108 변형된 T 세포/m2, or 적어도 1×109 변형된 T 세포/m2, 또는 임의의 개재하는 변형된 T 세포의 수이다.
대상체에게 투여된 변형된 T 세포의 수는 종종 단지 대상체에게 투여된 전체 세포 수의 서브세트이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 적어도 0.1×107 전체 T 세포, 적어도 0.5×107 전체 T 세포, 적어도 1×107 전체 T 세포, 적어도 5×107 전체 T 세포, 적어도 0.1×108 전체 T 세포, 적어도 0.5×108 전체 T 세포, 적어도 1×108 전체 T 세포, 적어도 5×108 전체 T 세포, 적어도 0.1×109 전체 T 세포, 적어도 0.5×109 전체 T 세포, 적어도 1×109 전체 T 세포, 적어도 5×109 전체 T 세포, 또는 적어도 0.1×1010 전체 T 세포 또는 임의의 개재하는 T 세포의 수를 투여한다.
당해 기술분야의 숙련가는 본 발명의 조성물의 복수의 투여가 목적하는 치료를 수행하기 위해 요구될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월 4개월, 5개월, 6개월 1년, 2년, 5년, 10년 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 또는 그 이상 투여할 수 있다.
특정 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 다음 후속적으로 혈액(또는 아페레시스 수행)을 교체하고, 본 발명에 따라 T 세포를 이로부터 활성화시키고, 이들 활성화된 및 확장된 T 세포를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 프로세스는 몇주마다 복수회 수행할 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 혈액 교체로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc 또는 400cc 이상의 혈액 교체로부터 활성화된다. 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 복수 혈액 교체/복수 재주입 프로토콜을 사용하는 것은 T 세포의 특정 모집단을 선별하도록 작동할 수 있다.
본원에서 의도된 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 경구섭취, 수액, 주입 또는 이식을 포함하는 임의의 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 비경구 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같은 문구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된"은 통상 주사에 의한, 장용 및 국소 투여를 제외한 투여 방식을 지칭하고, 제한 없이, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 관절내, 피막내, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 본원에서 의도된 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
한 가지 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 대상체에서 암에 대한 세포 면역 반응을 증가시키기 위해 유효량의 조성물이 투여된다. 면역 반응은 감염된 세포를 삼려시킬 수 있는 세포독성 T 세포에 의해 매개된 세포 면역 반응, 조절 T 세포 및 헬퍼 T 세포 반응을 포함한다. B 세포를 활성화시켜 항체 생성을 유도할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 주로 매개된 체액성 면역 반응이 또한 유도될 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 유도된 면역 반응의 유형을 분석하기 위해 다양한 기술이 사용될 수 있고, 이는 당해 기술분야에 잘 기재되어 있다[참조: Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober(2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.].
T 세포-매개된 사멸의 경우에, CAR-리간드 결합은 T 세포에 대한 CAR 시그날전달을 개시하여, T 세포가 다양한 메카니즘에 의한 표적 세포 아폽토시스를 유도할 수 있는 단백질을 생성 또는 방출하는 것을 유도하는 다양한 T 세포 시그날전달 경로의 활성화를 제공한다. 이들 T 세포-매개된 메카니즘은 (이로써 한정되는 것은 아니지만) T 세포로부터 표적 세포로 세포내 세포독성 과립의 전이, 직접 표적 세포 사멸(또는 다른 킬러 작동 세포의 동원을 통해 간접적으로)을 유도할 수 있는 프로-염증 사이토킨의 T 세포 분비, 및 표적 세포 아폽토시스를 유도하는 T 세포 표면 상에서 사멸 수용체 리간드(예: FasL)의 상향 조절, 이어서 표적 세포 상에서 이들의 동족 사멸 수용체(예: Fas)에 대한 결합을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은, 대상체로부터 면역 작동 세포를 제거하고, 상기 면역 작동 세포를 본원에서 의도된 조작된 TCR 또는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 유전적으로 변형시키고, 이에 의해 변형된 면역 작동 세포의 모집단을 생성하고, 변형된 면역 작동 세포의 모집단을 동일한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암으로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 면역 작동 세포는 T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 또한, 조작된 TCR 또는 CAR 분자를 코딩하는 핵산 작제물을 발현하는 면역 작동 세포 모집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적 세포 모집단에 대한 면역 작동 세포 매개된 면역 조절인자 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 세포 조성물을 투여하는 방법은, 대상체에서 조작된 TCR 또는 CAR을 직접 발현하는 생체외 유전적으로 변형된 면역 작동 세포의 재도입, 또는 대상체 내로 도입시에 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하는 성숙 면역 작동 세포로 분화하는 면역 작동 세포의 유전적으로 변형된 전구세포를 제공하는데 효과적인 모든 방법을 포함한다. 한 가지 방법은 말초혈 T 세포를 생체외에서 본 발명에 따라 핵산 작제물로 형질도입시키고 형질도입된 세포를 대상체에게 반송하는 것을 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허원 및 허여된 특허는, 각각의 개개 간행물, 특허원 또는 허여된 특허가 구체적 및 개별적으로 참조로서 도입되는 것을 나타내는 것과 같이, 본원에서 참조로서 도입된다.
상기 본 발명이 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정한 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음은 본 발명의 교시에 비추어 당해 기술분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 하기 실시예는 한정하는 것이 아닌 예시를 위해서만 제공된다. 당해 기술분야의 숙련가는 본질적으로 유사한 결과를 수득하기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.
실시예
키메라 항원 수용체(CAR)로 조작된 자가 T 세포를 사용한 양자 세포 요법(ACT)는 여전히 단순하고 강력한 제조 프로세스의 결여에 의해 도전받고 있다. 살아있는 세포 배양물 및 환자 사이의 고유한 복잡성에 기인하여, 효율적이고 반복가능하며 확장가능한 방법을 개발하는 것이 중요하다. 추가로, ACT에 대한 밀폐계 처리의 개발은 다수의 환자에 대한 표준 치료로 ACT를 전환하는데 중요할 것이다.
현재, 기존의 T 세포 제조 방법은 CAR T 세포의 단리, 활성화, 형질도입 및 확장을 위한 다양한 복잡한 단계를 포함한다. 대조적으로, 본 발명자들은, 조작된 CAR T 세포를 위한 대규모 임상 cGMP 제조 프로세스로 전이된 단순한, 강력한, 잘 특성화된, 유연한, 밀폐계 T 세포 제조 플랫폼을 개발하기 위해 소규모 연구 모델을 사용했다.
제조는 일관적으로 10일 이내에 평균 6.75(+/- 1.5) 모집단 배가 수준을 달성했다. 평균 형질도입 효율은 65.3%(+/- 12.4%)이었다. 배양물의 순도는 일관되게 > 98% CD3 세포였다. 표현형적으로, T 세포는 동물 모델 및 임상 연구에서 종양 퇴축과 연관된 표면 마커를 발현시켰다. 또한, 조작된 CAR T 세포는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 표적을 발현시켰다.
실시예 1
소규모 제조 플랫폼
단순하고 신뢰성 있으며 재현가능한 신규한 소규모 제조 플랫폼이 확립되었다. 제조 플랫폼은 기존의 방법보다 덜 복잡하고 보다 강력하며, CAR T 세포의 활성화, 형질도입 및 확장과 관련하여 최소 조작을 실행했다. 또한, 본원에서 의도된 방법으로 제조된 CAR T 세포는 동등한(우수하지는 않지만) 기존의 방법에 의해 생성된 조작된 CAR T 세포 치료제를 생성했다.
1. PBMC의 수거
PBMC는 소규모 연구 제조 플랫폼을 위한 T 세포의 공급원으로 사용했다. 전혈로부터의 PBMC는 FICOLL™ 구배 및 세척을 사용하여 수동으로 단리할 수 있다. 이러한 실험에서, 동결된 PBMC를 사용했다. PBMC의 동결된 바이알을 37℃ 수욕에서 해동시켰다. 해동되면, PBMC는 따뜻한 TCGM 배지 약 20-30mL를 함유하는 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음, 10분 동안 175×g으로 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포 펠렛은 250IU/mL IL-2를 함유하는 작은 용적의 TCGM에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 분취량은 멀티사이저 또는 혈구계에 의해 계수하고, 생존 세포의 수를 측정했다.
2. 배양 개시 및 활성화
0(D0)일에서, PBMC는 250IU/mL IL-2와 함께 10mL TCGM의 전체 용적 중의 1×106 세포/mL로 T25 배양 플라스크에서 씨딩했다. T 세포는 배양물에 5μL의 항-CD3 항체를 100ng/μL로 및 5μL의 항-CD28 항체를 100ng/μL로 첨가하여 활성화시켰다. PBMC 배양물이 설정되면, 이들은, 후속 형질도입된 세포를 위해 1일(D1) 또는 세포가 후속적으로 형질도입되지 않으면 3일(D3)까지 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 횡으로 배양했다.
3. 형질도입
CAR T 렌티바이러스의 역가를 측정했다. 세포는 1-2×108 TU/106 PBMC(D0에서 플레이팅된 PBMC의 수)로 형질도입시켰다. 바이러스는 TCGM+IL-2에서 배양 용적의 20mL 또는 20% v/v의 용적으로 희석시켰다. 세포는 3일(D3)까지 약 48시간 동안 바이러스로 형질도입시켰다.
몇몇 실험은 형질도입이 세포의 활성화후 약 20 내지 24시간에서 가장 효율적인 것으로 측정되었다. 세포는 D0, D1 및 D2에서 GFP 발현 렌티바이러스로 1-2×108 TU/106 PBMC에서 형질도입시켰다. 형질도입 후, GFP 발현 세포를 FACS 분석으로 단리하여 다양한 형태의 형질도입된 T 세포의 퍼센트 및 형질도입된 세포의 벡터 카피 수(VCN)를 측정했다. GFP 발현 세포는 T 세포 마커 발현에 기반하여 분석했다. GFP를 발현하는 더욱 형질도입된 세포 및 T 세포 마커 CD3, CD8 또는 CD4는, 세포가 활성화 20 내지 24시간(D1) 후에 형질도입된 경우에 동정되었다. 도 1. 또한, 활성화 20 내지 24 시간(D1) 후에 형질도입된 세포에서 VCN이 더 높았다. 도 1.
추가의 실험은 가용성 CD3 및 CD28 리간드를 사용하여 활성화시킨 T 세포의 형질도입 효율이 다른 방법으로 활성화시킨 T 세포의 형질도입 효율과 동등한 것으로 측정되었다. PBMC는 (i) 20 내지 24시간 동안 1㎍/mL의 농도로 플레이트 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체; (ii) 20 내지 24시간 동안 50ng/mL의 농도로 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시키고; PBMC와 동일한 공급원의 농후화된 림프구는 (iii) 비드 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시키고, CD3/CD28 다이나비드는 20 내지 24시간 동안 3 비드 대 1 T 세포의 비율로 사용했다. 활성화 후, 세포는 항-CD19 발현 렌티바이러스로 1-2×108 TU/106 PBMC에서 형질도입시켰다. 항-CD19 CAR 및 T 세포 마커 CD3, CD8 또는 CD4를 발현하는 더욱 형질도입된 세포는, 세포가 다른 방법과 비교하여 가용성 항-CD3 및 항-CD28로 활성화되는 경우에 동정되었다. 도 2. 또한, 가용성 항-CD3 및 항-CD28로 활성화되는 세포에서 VCN이 더 높았다. 도 2.
실험은 또한 세포 배양 백에서 활성화 및 형질도입이 플라스크에서의 형질도입과 동등한 것으로 측정되었다. PBMC는 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 20 내지 24시간 동안 50ng/mL의 농도로 사용하여 D0에서 활성화시켰다. 활성화 후, 세포는 D1에서 kappaLC 발현 렌티바이러스로 3×108 TU/106 PBMC에서 형질도입시켰다. kappaLC 및 T 세포 마커 CD3, CD8 또는 CD4를 발현하는 형질도입된 세포의 수는, 세포가 세포 배양 백 또는 플라스크에서 활성화되고 형질도입된 경우와 동등했다. 도 3.
4. 확장
상이한 방법으로 활성화시킨 PBMC 중에서 T 세포 확장이 또한 측정되었다. PBMC는 (i) 20 내지 24시간 동안 1㎍/mL의 농도로 플레이트 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체; (ii) 20 내지 24시간 동안 50ng/mL의 농도로 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체; 및 (iii) 비드 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시키고, 다이나비드는 20 내지 24시간 동안 3:1 비드:T 세포의 비율로 사용했다. 활성화 후, 세포는 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 1-2×108 TU/106 PBMC에서 형질도입시켰다. 활성화되고 형질도입된 세포는 최대 10일 동안 배양했다. 3가지 방법에 의해 활성화시킨 PBMC 중에서 세포 확장은 확장 배양 기간 전체에 걸쳐 동등했다. 도 4.
본원에서 의도된 T 세포 제조 방법으로 처리한 복수의 공여체로부터의 PBMC는 재생가능하고 강력한 확장, CAR 세포 표면 발현 및 VCN을 나타냈다. PBMC는 20 내지 24시간 동안 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 50ng/mL에서 활성화시켰다. 활성화된 세포는 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 1-2×108 TU/106 PBMC에서 형질도입시켰다. 10일 동안 배양한 복수의 공여체로부터 활성화되고 형질도입된 세포는 서로간에 및 형질도입되지 않은 대조군(UTD)과 동등한 성장 속도를 나타냈다. 도 5. 도 5는 또한 각각의 확장된 배양물에서 10일에 존재하는 림프구의 수를 나타낸다. FACS 분석은 항-CD19 발현이, 약 61%의 평균 및 29% 내지 80%의 범위(n=5)와 함께, 상이한 환자로부터 생성된 세포 생성물 사이에서 동등한 것으로 측정되었다. 도 6. qPCT은 또한 세포 생성물 중의 VCN이 동등한 것으로 입증되었다. 도 6.
5. 항원 특이적 종양 클리어런스
가용성 항체를 사용하여 활성화시킨 T 세포에 의한 항원 특이적 종양 클리어런스는 다른 방법을 사용하여 활성화시킨 T 세포만큼 양호하거나 이보다 우수했다. PBMC는, (i) 20 내지 24시간 동안 1㎍/mL의 농도에서 플레이트 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체; (ii) 20 내지 24시간 동안 50ng/mL의 농도에서 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체; 및 (iii) 비드 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시키고, 다이나비드는 20 내지 24시간 동안 3:1 비드:T 세포의 비율로 사용했다. 활성화 후, 세포는 항-CD19 CAR 발현 렌티바이러스로 1-2×108 TU/106 PBMC에서 형질도입시켰다. 활성화되고 형질도입된 세포는 최대 10일 동안 확장을 위해 배양했다. 치료 항-CD19 CAR T 세포를 CD19 발현 다우디(Daudi) 세포 또는 비-CD19 발현 K562 세포와 함께 공-배양했다. 공-배양 10일 후, 가용성 항체를 사용하여 활성화시킨 항-CD19 CAR T 세포는 다른 방법을 사용하여 활성화시킨 항-CD19 CAR T 세포만큼 또는 이보다 우수하게 다우디 세포를 사멸시켰다. 도 7 및 도 8.
6. 소규모 제조 플랫폼
전체적으로, 소규모 제조 플랫폼을 사용하여 10일 T 세포 확장 프로세스를 개발했다: D0에서, PBMC를 1×106 세포/mL의 밀도로 플레이팅하고, 약 24시간 동안 50ng/mL의 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 활성화시키고; D1에서, 활성화된 PBMC를 약 24시간 내지 48시간 동안 2×108 TU/106 세포로 형질도입하고; D3 내지 D9에서, 형질도입된 세포를 확장시키고 재씨딩하여 대수기 성장을 유지했다. T 세포 제조 공정은 전형적으로 공여체에 따라 T 세포의 100 내지 600배 확장을 제공한다.
상기 실험은 소규모 연구 프로세스를 대규모 임상 cGMP 제조 프로세스로 이동시키는 중요한 효소를 동정했다. 요소는 표 1에 제시되어 있다.
대규모 제조 플랫폼으로 이동된 소규모 요소
출발 물질 PBMC
배지 제형 TCGM: 5% HABS, 2mM 글루타맥스, 10mM HEPES 및 250IU/mL의IL-2(및 임의로 IL7 및/또는 IL-15)이 보충된 XVIVO-15
활성화 방법 50ng/mL 가용성 항-CD3 및 50ng/mL 가용성 항-CD28 항체
형질도입 활성화후 20-24시간 형질도입
확장 세포는 0.3×106 세포/mL 내지 0.5×106 세포/mL에서 다시 씨딩하여 대수기 성장으로 유지했다.
7. 플랫폼 강건성
제조 플랫폼 강건성은 복수의 렌티바이러스 CAR 작제물을 설계하고 제조하고 평가함으로써 입증했다. 프로모터, scFV, +/- 링커, 힌지, 막관통 영역 및 시그날전달 도메인이 상이한 작제물을 사용했다. 도 16.
CAR-코딩 렌티바이러스 벡터(LV) 상청액은 다른 개소에 기재된 HEK 293T 세포에서 생성했다[참조: Naldini et al., 1996, Dull et al., 1998 and Zufferey et al., 1998]. 293 세포는 4-플라스미드: HIV gag-pol을 코딩하는 플라스미드, VSV-G 외피 단백질을 코딩하는 플라스미드, HIV rev 단백질을 코딩하는 플라스미드 및 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 전이 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다(예: 도 16).
CAR T 세포는 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조했다. 다양한 CAR T 세포 생성물은 모집단 배가에 의해 측정되는 동등한 성장 속도를 나타냈고(도 17A); qPCR은 VCN이, 세포당 대략 1 내지 4개 카피와 함께, 상이한 CAR T 세포 중에서 동등했음을 나타냈고(도 17B); 상이한 CAR 작제물의 동등한 세포 표면 발현이 FACS에 의해 나타났고; 퍼센트 표시는 작제물에 따라 약 40% 내지 60% 범위였다(도 17C).
8. 기능적 CART 약물 생성물의 생성
항-BCMA 발현 CAR T 세포는 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조했다. 이들 CAR T 세포는 항원 특이적 종양 클리어런스를 나타냈다. 항-BCMA 발현 CAR T 세포를 4시간 동안 K562 세포와 함께 공-배양하거나, K562 세포를 변형시켜 BCMA를 발현시켰다. 항원 발현 종야 세포를 카복시플루오로레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하고, 형광을 FACS로 측정했다. 항-BCMA 발현 CAR T 세포는 BCMA 발현 K562 세포를 사멸시켰고(도 18A), IFN-γ를 방출했다(도 18B).(n=3).
실시예 2
소규모 연구 플랫폼을 대규모 임상 cGMP 약물 제조 플랫폼으로 번역
소규모 연구 프로세스는, 데이터가 대규모 cGMP 약물 제조 플랫폼에 대해 동등하다는 보장과 함께 CAR 작제물의 보다 높은 생산량 평가를 가능하게 했다. 이 실시예는 대규모 임상 cGMP 약물 제조 플랫폼을 사용하여 수행한 대표적 실험에 대한 데이터를 제공한다.
1. 소규모 및 대규모 제조 방법 사이의 차이
도 9는 소규모 연구 T 세포 제조 플랫폼과 확장 임상 cGMP 약물 제조 플랫폼의 플로우챠트 비교를 나타낸다. CAR T 세포는 실시예 1에 개략된 절차를 사용하여 제조했다. 대규모 제조의 경우(예: 도 10 내지 12), CAR T 세포는 다음과 같이 제조했다:
수거. 세포는 스펙트라 옥티아(Spectra Optia®) 분리반출 시스템 또는 등가물을 사용하여 백혈구분리반출에 의해 수거했다. 제조 프로세스에 사용된 백혈구분리반출 생성물의 출발 용적은 약 100mL 내지 약 200mL이었다. 세포의 분취량을 계수하고, 생존률을 측정하고, 동결보존하고, FACS 분석을 사용하여 PBMC에 대해 특성화했다.
단리. PBMC는 세포 세이버® 5+ 자가 혈액 회수 시스템(Haemonetics) 상에서 밀폐계 FICOLL™ 구배를 사용하여 단리했다. FICOLL™ 후, 연막(buffy coat)을 CliniMACS 완충제 w/ 2% HABS로 세척하고, 250IUIU/mL IL-2와 함께 TCGM에 재현탁시켰다. 세척 전후의 세포 계수, 생존률 및 PBMC FACS 분석을 수행했다.
동결보존. 대규모 제조 방법의 특정 실시형태는 단리 후 및 임의의 추가 하류 제조 전에 PBMC의 동결보존을 포함한다. PBMC는 TCFM에서 동결보존하고, 조절된 속도의 냉동기에서 1분당 1°의 속도로 약 -80℃ 내지 약 -135℃의 온도에서 조절된 속도의 냉동기에서 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크에서 기상으로 저장했다.
0일: 배양 개시/ 활성화 백 , 신선한 세포. 250IU/mL IL-2와 함께 TCGM 중의 1×106 PBMC/mL의 밀도에서 1×108 PBMC를 100mL MACS® GMP 세포 분화 백에 씨딩했다. PBMC는 배양물에 50ng/mL의 항-CD3 항체 및 50ng/mL의 항-CD28 항체를 처마하여 활성화시키고, 약 24시간 동안 배양했다.
0일: 배양 개시/ 활성화 백 , 동결된 세포. 대규모 제조 프로세스의 특정 실시형태는 동결된 PBMC를 사용하는 것을 포함한다. 동결된 PBMC를 37℃ 수욕에서 해동시키고, 250IU/mL IL-2와 함께 TCGM에서 세척했다. 250IU/mL IL-2와 함께 TCGM 중의 1×108 해동된 PBMC를 100mL MACS® GMP 세포 분화 백에 씨딩했다. 해동된 PBMC는 배양물에 50ng/mL의 항-CD3 항체 및 50ng/mL의 항-CD28 항체를 첨가하여 활성화시키고, 약 24시간 동안 배양했다.
0일: 배양 개시/ 활성화 GREX 생물반응기. 대규모 제조 프로세스의 특정 실시형태는 GREX 생물반응기에서 T 세포를 제조하는 것을 포함한다. 250IU/mL IL-2와 함께 TCGM 중의 1×108 PBMC를 100mL의 TCGM에서 GREX-100에 씨딩했다. PBMC는 50ng/mL의 항-CD3 항체 및 50ng/mL의 항-CD28 항체를 배양물에 첨가하여 활성화시키고, 약 24시간 동안 배양했다.
1일: 형질도입. 활성화된 세포는 1-2×109 TU의 렌티바이러스/108 PBMC로 형질도입시켰다. 렌티바이러스는 배양 용적의 20%까지 TCGM에서 희석시켰다. 예를 들면, 배양 용적이 100mL TCGM인 경우, 바이러스는 TCGM에서 희석시켜, 배양물에 첨가된 20mL의 최대 용적을 수득했다. 세포는 약 48시간 동안 형질도입시켰다.
3일 내지 10일: 확장. 형질도입된 세포는 5 내지 8일 동안 250IU/mL의 IL-2를 함유하는 TCGM에서 확장시켰다. 1일 이상의 확장일 각각에서, 세포의 분취량을 임의로 취하고, 세포를 계수하고, 생존률을 측정하고, 동결보존시키고, FACS 분석을 사용하여 PBMC에 대해 특성화했다. 배양물은 필요에 따라 0.3×106 PBMC/mL 내지 0.5×106 PBMC/mL의 밀도로 재씨딩하여 대수기의 세포 성장을 유지했다. 세포 배양 백-기반 제조의 경우, 7일에 세포는 10일까지 WAVE 생물반응기로 임의로 이동시켜 추가의 확장을 가능하게 했다. 한 가지 실시형태에서, 세포 계수는 3, 4, 5, 6, 7, 8 및/또는 9 및/또는 10일에 수행했다. 한 가지 실시형태에서, if 세포가 7일까지 목적하는 확장 수준에 도달하지 않는 경우, 이들은 8일 및 9일 동안 2L/일로 배지의 관류와 함께 WAVE 생물반응기로 이동시켜 증가된 확장을 가능하게 할 수 있다.
GREX-기반 제조의 경우, 세포는 전체 확장 기간 동안 GREX 생물반응기에서 계속 배양했다.
10일: 회수 및 동결보존. 확장된 세포를 회수하고, 세포 세이버® 5+ 자가 혈액 회수 시스템으로 회수하여 세척했다. 세포는 2L의 0.9% NaCl로 세척한 다음, 최종 세척은 플라스말라이트(PlasmaLyte)로 수행했다. 회수 전후의 세포 계수, 생존률 및 FACS 분석을 수행하여 CAR T 세포의 순도 및 속성을 측정했다. 회수된 세포는 임의로 50% 플라스말라이트 및 50% 크리오스터 10; 50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO); 또는 크리오스터 10에서 동결보존하고, 조절된 속도의 냉동기에서 분당 1°의 속도로 약 -80℃ 내지 약 -135℃의 온도에서 조절된 속도의 냉동기에서 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 기상에서 저장했다.
2. 세포 표현형은 소규모 및 대규모 제조 방법 사이의 최종 세포 생성물에서 동등하다.
CAR T 세포는 실시예 1에 기재된 소규모 방법 및 상기 실시예 2에 기재된 대규모 방법을 사용하여 제조했다. 최종 세포 생성물은 CD4, CD8, CAR T 작제물, CD56 및 CD62L 세포 표면 마커의 발현에 대해 FACS 분석으로 처리하여 최종 생성물의 세포 조성물에서 임의의 차이를 측정했다. 연구 및 임상 규모 플랫폼 사이에서 최종 CAR T 생성물의 표현형의 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 2개 플랫폼 사이에서 모든 표면 마커에 대한 p≥ 0.20. (n=3). 도 13.
3. PBMC 단리 및 T 세포 수거를 위한 단수화된 세포 처리
본원에서 의도된 제조 방법의 주요 이점 중의 하나는 밀폐계 처리 단계의 실시이다. PBMC는 백혈구분리반출에 의해 수거하고, 단리하고, 세포 세이버® 5+ 자가 혈액 회수 시스템(Haemonetics)을 사용하여 세척했다. 세포 세이버® 5+는 또한 최종 제조된 CAR T 세포 생성물의 회수 및 세척을 위해 사용했다.
최종 PBMC 및 CAR T 생성물을 다중 실험(n=18)으로 특성화하여 출발 물질 및 최종 생물의 세포 조성물의 현저하게 일관된 순도를 입증했다. 도 14. 밀폐식 접근법의 이용은 제조를 단순화시켰고 cGMP 처리를 위한 장비를 최소화시켰다.
4. 제조 프로세스 유연성
환자 사이의 변동성을 해결하고 CAr T 세포 생성물의 요구된 용량 수준이 달성되는 것을 보장하기 위해, CAR T 세포의 확장을 위한 복수의 장치를 비교하여 의도된 제조 프로세스에 의해 제공된 유연성을 나타냈다. 소규모(T25 플라스크) 및 대규모(GREX100, 정적 세포 배양 백 및 WAVE 생물반응기) 제조 프로세스는 상기 기재된 바와 같이 수행했다. 상이한 제조 방법으로 제조한 세포는 10일 배양 기간에 걸쳐 동등한 성장 속도 및 확장된 세포 수를 나타냈다. 도 15A. FACS 분석은 CD3+/CAR+ 세포의 양은 제조 방법 사이에서 일관되었음을 나타냈다. 도 15B. 또한, CD3+/CAR+ 세포의 VCN은 시험된 다양한 제조 방법 사이에서 동등했다. 도 15B. 이들 결과는 의도된 T 세포 제조 방법이 유성성이고 동등한 최종 세포 생성물을 생성했음을 입증한다.
일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정의 실시형태로 한정하는 것으로 해석되는 것은 아니며, 이러한 청구범위가 권한을 부여한 등가물의 전체 범위와 함께 모근 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시에 의해 한정되지 않는다.
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Claims (70)

  1. a) T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 세포 모집단을 수득하는 단계;
    b) i) 하나 이상의 사이토킨, ii) 항-CD3 항체 또는 이의 CD3-결합 단편 및 (iii) 항-CD28 항체 또는 이의 CD28-결합 단편, B7-1 또는 이의 CD28-결합 단편, 또는 B7-2 또는 이의 CD28-결합 단편을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포 모집단을 배양하는 단계로서, 여기서 상기 배양은 T 세포를 활성화시키고 자극시키는 단계;
    c) 활성화된 세포의 모집단을 바이러스 벡터로 형질도입시키는 단계; 및
    d) 세포 성장 배지에서 세포 모집단을 배양하여 형질도입된 T 세포를 확장시킴으로써 T 세포 치료제를 제조하는 단계를 포함하는,
    T 세포 치료제를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 모집단이 말초혈, 말초혈 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 이슈, 감염 부위 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 또는 종양으로부터 수득되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 T 세포가 말초혈, 말초혈 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 이슈, 감염 부위 조직, 복수, 흉수, 비장 조직, 종양 또는 T 세포주로부터 수득되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 APC가 말초혈, 말초혈 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 이슈, 감염 부위 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 또는 종양으로부터 수득되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 모집단이 말초혈 단핵구 세포(PBMC)를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 모집단을 수거 또는 수득하는 것이 백혈구분리반출을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 모집단을 단리하는 것이 침강을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 침강이 FICOLL™ 또는 PERCOLL™ 구배를 포함하는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 침강이 반자동 플로우쓰로우 원심분리를 사용하여 수행되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 반자동 플로우쓰로우 원심분리가 코베(Cobe) 2991 세포 프로세서, 세포 세이버(Cell Saver) 5+ 또는 엘루트라(Elutra)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 모집단을 완충제 또는 세포 배양 배지에서 세척하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포 모집단이, 하나 이상의 사이토킨을 함유하는 T 세포 성장 배지(TCGM)에서 세척되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, TCGM 중의 상기 하나 이상의 사이토킨이 IL-2, IL7, IL-15, IL-9 및 IL-21로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 사이토킨이 IL-2인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 IL-2의 농도가 약 250IU/mL인, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 세포 모집단이 PBMC를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포 모집단이 조절된 속도의 냉동기에서 동결보존되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 동결보존된 세포 모집단이 해동되는, 방법.
  19. 제1항 또는 제18항에 있어서, 상기 세포 모집단이 단계(b)에서 배양하기 위해 약 1×106 세포/mL의 밀도로 TCGM에 씨딩되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포 모집단이 세포 배양 백 또는 생물반응기에서 배양되는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 TCGM이 IL-2, IL7, IL-15, IL-9 및 IL-21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 사이토킨을 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토킨이 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토킨이 IL-2를 포함하는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토킨의 농도가 약 250IU/mL인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 모집단이 가용성 항-CD3 항체 및 가용성 항-CD28 항체와 함께 배양되는, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 항-CD3 항체의 농도가 약 50ng/mL인, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 항-CD28 항체의 농도가 약 50ng/mL인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 상기 세포 모집단이 형질도입 전에 약 12시간 내지 약 48시간 동안 배양되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 상기 세포 모집단이 활성화시에 형질도입되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 상기 세포 모집단이 형질도입 전에 약 1시간 내지 약 12시간 동안 배양되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 상기 세포 모집단이 형질도입 전에 약 16시간 내지 약 32시간 동안 배양되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 상기 세포 모집단이 형질도입 전에 적어도 18시간 동안 배양되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 세포 모집단이 형질도입 전에 적어도 24시간 동안 배양되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 d)의 상기 세포 모집단이 레트로바이러스 벡터로 형질도입되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 d)의 상기 세포 모집단이 렌티바이러스 벡터로 형질도입되는, 방법.
  36. 제19항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 1×109 TU 내지 약 2×109 TU의 바이러스 벡터가 1×108 개의 씨딩되는 세포를 형질도입하기 위해 사용되는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 전체 배양 용적의 20% v/v로 희석되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 전체 배양 용적의 약 40% 내지 약 50% v/v로 희석되는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 모집단이 약 18 내지 약 48시간 동안 형질도입되는, 방법.
  40. 제1항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 모집단이 약 18 내지 약 36시간 동안 형질도입되는, 방법.
  41. 제1항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 모집단이 약 24시간 동안 형질도입되는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 CAR이
    a) 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, '글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 르위스-Y(Lewis-Y), Kappa, 메소텔린(Mesothelin), Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 수르비빈(Survivin), TAG72, TEM 및 VEGFR2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 결합하는 세포외 도메인;
    b) CD8α; CD4, CD28, CD45, PD1 및 CD152로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드로부터 유래되는 막관통 도메인;
    c) CD28, CD54(ICAM), CD134(OX40), CD137(41BB), CD152(CTLA4), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1) 및 CD278(ICOS)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 공-자극 시그날전달 도메인; 및
    d) CD3ζ 시그날전달 도메인을 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 항원에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8α 또는 CD28로부터 유래되는, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 하나 이상의 공-자극 시그날전달 도메인이 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제43항에 있어서, 힌지 영역 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 힌지 영역 폴리펩티드가 IgG1 또는 CD8α의 힌지 영역을 포함하는, 방법.
  49. 제43항에 있어서, 시그날 펩티드를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 시그날 펩티드가 IgG1 중쇄 시그날 폴리펩티드, CD8α 시그날 폴리펩티드 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 시그날 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단이 확장을 위해 약 5 내지 약 8일 동안 배양되는, 방법.
  52. 제1항 내지 제50항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단이 확장을 위해 세포 배양 백에서 약 5일 내지 약 8일 동안 배양되는, 방법.
  53. 제1항 내지 제50항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단이 확장을 위해 세포 배양 백에서 약 5일 동안 배양되고, 이어서 생물반응기에서 약 3일 동안 배양되는, 방법.
  54. 제1항 내지 제50항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 상기 세포 모집단이 확장을 위해 생물반응기에서 약 5일 내지 약 8일 동안 배양되는, 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 생물반응기가 WAVE 생물반응기 또는 GREX 생물반응기인, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 수가 단계 d)의 배양 동안 적어도 50배 확장되는, 방법.
  57. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 수가 단계 d)의 배양 동안 적어도 100배 확장되는, 방법.
  58. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 수가 단계 d)의 배양 동안 적어도 200배 확장되는, 방법.
  59. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 수가 단계 d)의 배양 동안 적어도 300배 확장되는, 방법.
  60. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 수가 단계 d)의 배양 동안 적어도 400배 확장되는, 방법.
  61. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 수가 단계 d)의 배양 동안 적어도 500배 확장되는, 방법.
  62. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 수가 단계 d)의 배양 동안 적어도 600배 확장되는, 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 제조된 T 세포 치료제를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 T 세포 치료제를 회수하는 것이 단계 d)에서 확장된 세포를 농축 및 세척하는 것을 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 T 세포 치료제가 반자동 플로우쓰로우 원심분리를 사용하여 농축 및 세척되는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 반자동 플로우쓰로우 원심분리가 세포 세이버 5+ 또는 LOVO인, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 T 세포 치료제를 동결보존하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 동결보존된 T 세포가 양자 세포 요법의 방법에서 사용하기 위해 해동되는, 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중의 어느 한 항의 제조된 T 세포 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  70. 제69항의 T 세포 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 악성종양을 치료하는 방법.
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