KR20180088919A - 인간 알파-n-아세틸갈락토사미니다아제 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편, 이를 인코딩하는 핵산, 및 파브리병, 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법에서의 용도를 포함하는 관련 제품 및 용도의 새로운 형태를 제공한다.
Description
본 발명은 광범위한 효소 보충 요법(enzyme replacement therapy, ERT) 분야, 더욱 정확하게는 용해소체축적병(Lysosomal Storage Diseases, LSDs)의 치료용 폴리펩티드 제품의 분야이다. 특히, 본 발명은 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 제품, 및 관련 제품, 용도 및 방법과 관련된다.
용해소체축적병(LSDs)은 분해 시에 관련되는 대사 효소의 손상된 활성에 기인하여 리소좀에서 저장물의 축적을 특징으로 하는 다양한 군의 유전적 대사 장애이다. 저장물의 증가(build-up)는 세포 기능 장애 및 진행성 임상 증상을 초래한다. 투여된 효소가 질환 세포의 리소좀에 효과적으로 표적될 수 있는 한, 리소좀 효소 활성, 특히 리소좀 가수 분해 효소 활성의 결함은 효소 대체 요법 (ERT)에 의해 교정될 수 있다. 현재 ERT는 LSD, 특히 전신 LSD를 치료하기 위해 선호되는 개입 경로이다.
종래의 파브리병은 말단 α-D-갈락토오스 잔기를 글리코리피드로부터 절단하는 리소좀 효소 α-갈락토시다아제 A (α-Gal A)의 결함에 의해 야기되는 드문 X-결합 대사 장애이다(Brady et al., 1967, N. Engl. J. Med., 276(21):1163-7). 효소 결함은 혈관 내피 및 다른 조직에서 글리코스핀고리피드(glycosphingolipids), 주로 글로보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide)(Gb3)의 전신 및 평생 리소좀 축적을 초래한다. 이것은 주로 신장, 심장 및 뇌 혈관 시스템에 영향을 미치는 다기관 병리를 일으킨다(Clarke et al., 2007, Ann Intern Med., 146(6):425-33; Zarate and Hopkin, 2008, Lancet, 372(9647):1427-35). 개별 남성은 40,000명의 남성 출생 중 1명으로 추정되는 발병률을 보이기 때문에 X-결합 특성에 기인한 파브리병의 발전이 더 흔하다(Spada et al., 2006, Am J Hum Genet., 79(1):31-40). 하나의 변이 α-Gal A 대립 유전자를 갖는 이종 여성도 영향을 받지만, α-Gal A 활성 수준 및 질병의 발병 및 진행 속도는 더욱 다양하다(MacDermot et al., 2001, J Med Genet, 38(11):769-75).
현재, 2개의 별개의 재조합 α-Gal A 단백질은 파브리 환자의 ERT 치료에 사용된다: 아갈시다아제 알파(agalsidase alpha)(Replagal®: Shire Human Genetic Therapies, Dublin, Ireland) 및 아갈시다아제 베타(Fabrazyme®: Genzyme Corporation - a Sanofi company, Cambridge, USA). 아갈시다아제 알파는 인간 세포주에서 생성되고, 격주에 0.2 mg/kg 정맥 투여되지만, 아갈시다아제 베타는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에서 재조합되어 생성되고, 격주에 1 mg/kg 체중으로 투여된다.
이들 포유류의 발현 시스템은 높은 비용의 원료와 발효 식물의 낮은 회전율(turnover)로 인해 가동에 비용이 많이 든다. 또한, 확장성에 관한 상당한 문제가 있으며 이러한 생산 공정의 특성에 기인해 바이러스 오염 가능성이 커진다.
또한, 포유류의 글리코실화 시스템의 복잡한 특성은 상당한 N- 글리칸 이질성을 초래하며, 배치-배치(batch-to-batch) 재현성을 입증하는 중요한 문제를 제기하며, 하류 처리와 관련된 비용을 추가로 증가시킨다. 글리칸의 특성은 제품의 효능을 결정하는 중요한 요소이기 때문에, 글리코실화를 조절할 수 있는 능력이 없는 것이 주요 관심사이다. 보다 구체적으로, 이들 포유 동물 세포 발현 시스템에 의해 생성된 분비된 당단백질은 복합 형태 및 높은 만노오스 유형의 글리코실화 (30개 이상의 상이한 N-글리칸 구조가 두 형태의 재조합 α-갈락토시다아제 A에서 발견됨)의 이종 혼합물을 나타내며, 말단 만노오스-6-포스페이트 (M6P) 잔기를 가진 N-글리칸의 양(Lee et al., 2003, Glycobiology, 13 (4) : 305-13), 그 결과 이러한 효소의 리소좀으로의 흡수의 효능을 제한한다. 최근, 신장 간질 세포(kidney interstitial cells), 근위부 관상 세포(proximal tubular cells) 및 유두 세포(podocytes)에 의한 α-Gal A의 흡수가 M6P-리셉터를 통해 다른 곳에서 일어나는 것으로 나타났다(Christensen et al., 2007, J Am Soc Nephrol., 18(3):698-706; Christensen et al., 2009, Pflugers Arch., 458(6):1039-48; Prabakaran et al., 2011, PLoS One, 6(9)).
또한, 현재의 포유 동물 발현 재조합 α- 갈락토시다아제 생성물의 순환 반감기는 짧다. 이는 부분적으로 단백질 안정성이 낮기 때문이다(Sakuraba et al., 2006, J Hum Genet., 51(4):341-52; Tajima et al., 2009, Am J Hum Genet., 85(5):569-80). 생리적 pH (pH 7) 및 리소좀 pH (pH 4.5) 모두에서, 효소 활성은 2시간 후 각각 약 30% 또는 20%로 떨어지고, 활성의 거의 완전한 소실은 pH 4.5에서 15시간 후 관측되었다. 37 ℃에서 인간 혈청에서의 배양은 단지 30분 후에 활성이 75% 소실되었고, 최소한 2시간 후 활성이 관측되지 않았다.
추가로, 이 질환에 대해 반접합성인 다수의 남성 환자는 α-Gal A를 전혀 생성하지 않으므로, 이 환자의 면역 시스템에 의해 효소가 스스로 인식되지 않는다. 이는 현재의 파브리병 ERT로 이런 환자를 치료할 때 추가적인 문제를 야기하는데, 즉 치료 효소의 반복된 일생의 고용량 투여는 종종 잠재적으로 생명을 위협하는 과민증 반응을 포함하여(Bodensteiner et al., 2008, Genet Med., 10(5):353-8), 알러지 반응을 일으킨다(Eng et al., 2001, N Engl J Med., 345(1):9-16; Wilcox et al., 2012, Mol Genet Metab., 105(3):443-9). 또한, 치료적 단백질에 대해 유도된 항체 반응은 파브리 환자의 추가 치료 동안 ERT의 감소된 효과를 초래한다(Ohashi et al., 2007, Mol Genet Metab., 92(3):271-3; Ohashi et al., 2008, Mol Genet Metab., 94(3):313-8; Vedder et al., 2008, Mol Genet Metab., 94(3):319-25; Rombach et al., 2012, PLoS One, 7(10)).
이러한 점에서, 파브리병과 같은 리소좀 저장 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 추가의 개선된 제품을 제공하는 것이 본 기술 분야에서 요구되고 있다.
본 발명자들은 균류 세포에서 인간 α-Gal A 자체 이외에 증가된 α-갈락토시다아제(α-Gal A) 활성을 갖는 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL)를 생성함으로써 상기 문제들을 해결하고자 했다. 인간 NAGAL 유전자는 인간 α-Gal A를 인코딩하는 유전자와 밀접한 관련이 있다. 이들의 인코딩된 단백질은 46% 서열 동일성을 공유하며, 유사한 폴드(fold)지만 상이한 기질 특이성을 갖는다(Tomasic et al., 2010, J. Biol. Chem., 285(28):21560-6). 2개의 아미노산 치환기(Ser188Glu 및 Ala191Leu, 인간 NAGAL의 개시 메티오닌으로부터 시작하는 넘버링)를 인간 NAGAL의 활성 부위로 도입함으로써, 증가된 α-갈락토시다아제의 활성을 갖는 효소가 얻어지는 것이 다른 사람에 의해 이전에 밝혀졌다(Tajima et al., 2009, Am J Hum Genet., 85(5): 569-80; Tomasic et al., 2010, supra). 이것은 α-Gal A보다 더 높은 혈장 안정성을 보이는 NAGAL을 변경하고, α-Gal A에 대한 항체를 함유하는 파브리 환자의 혈청에 면역 반응성이 없는 것을 보여준다.
실험 부분에서 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 균류 세포에서 인간 NAGAL을 발현하기 시작하지만, 균류 세포, 특히 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아슐라 아데니니보란스( Arxula adeninivorans )에서 인간 NAGAL의 발현 수준이 인간 α-Gal A에서 얻어지는 발현 수준과 비교하여 불만족스러운 것임을 깨달았다. 그러나, 본 발명의 특정 대표적인 실시형태를 설명하는 여기에 기재되는 실험에 의해 제공되는 바와 같이, 본 발명자들은 NAGAL 발현의 현저한 증가가 여기서 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 변형된 형태에서 얻어지는 것을 깨달았다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되는, 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 제1 아미노산을 치환되는 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 제2 아미노산을 치환되는 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나와 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 제공하고, 상기 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은, 제1 도메인이 제2 도메인을 갖는 적어도 하나의 (추가의) 이온쌍을 형성할 수 있도록 변형된다. 상기 이온쌍은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 형성되는 단독 이온쌍일 수 있고, 또는 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 다른 이온쌍이 추가될 수 있다. 실시예를 이용하여, 제한 없이, 본 발명자들에 의한 인간 NAGAL의 3차원 구조의 분석은, 이온쌍이 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파르트산 220과 아르기닌 298 사이에 야생형 인간 NAGAL에서 형성될 수 있음을 예측했다.
유리하게, 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 하나에 기재되는 인간 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은 균류 세포, 특히 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica )에서와 같은 숙주 세포에서 재조합 발현될 때 만족스러운 발현 수준을 보여준다. 제한 없이, 본 발명자들은 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은 비변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드와 비교하여 사실상 증가된 안정성도 보일 수 있는 것을 상정했다.
다른 양태는 치료에 이용되는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편과 관련된다.
다른 양태는 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법에 이용되는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편과 관련된다.
다른 양태는 파브리병의 치료 방법에 사용하기 위한 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편과 관련된다. 유리하게, 파브리병의 치료에 이용되는 경우, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자의 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자의 파브리병의 치료 방법을 제공한다. 유리하게, 파브리병을 치료할 때, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형될 수 있다.
다른 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태는 이하에 관한 것이다:
-여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
-여기에 정의된 핵산 분자 및 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 포함하는 발현 카셋 또는 발현 벡터.
치료에 사용하기 위한, 여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터.
파브리병의 치료 방법에 이용되거나 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법에 이용되는, 여기에 정의된 핵산 분자 또는 여기에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터.
여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자의 파브리병의 치료 방법, 또는 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법.
여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 여기에 정의되는 숙주 세포의 사실상 순수한 배양액(culture).
- 숙주 세포에서 여기에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 발현을 달성하기 위해 여기에 정의된 핵산 분자의 또는 여기에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터의 용도.
-여기에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 제조 방법으로,
a) 여기에 정의된 숙주 세포를 배양하여, 숙주 세포가 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 발현하는 단계,
b) 상기 숙주 세포로부터 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 수집하고, 분리하거나 분리하지 않는 단계, 를 포함하는, 방법.
본 발명의 상기 및 추가 양태 및 바람직한 실시형태는 이하 부분 및 첨부되는 청구항에 기재된다. 첨부하는 청구항의 주제는 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
도 1은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 1). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴(N) 213; 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인(C) 326.
도 2는 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 2). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산(D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R).
도 3은 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 3). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R).
도 4는 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 4). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산(D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S).
도 5는 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 5). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S).
도 6은 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 6). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산(D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 7은 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 7). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 8은 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 8). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산 (D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 9는 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 9). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 10은 α-GalA 또는 NAGAL1 발현 카셋의 단독 또는 3개의 복제물을 함유하는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)의 24웰 배양액로부터 유래된 환원된(왼쪽) 또는 비환원된(오른쪽) 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본 실험에서, 단일 복제 균주는 단일 발현 카셋의 임의의 통합의 결과인 균주를 말하는 반면, 3개의 복제 균주는 3개의 상이한 선택 마커를 이용하여 3개의 발현 카셋의 임의의 통합의 결과라는 것을 주목한다. 임의의 발현 카셋은 변형 시에 한번 또는 한번 이상 게놈으로 통합, 예컨대 직렬 삽입(tandem insertion)될 수 있다. 그 결과, 단일 복제 균주로서 실시예에 나타내는 균주의 게놈으로 통합되는 발현 카셋의 수는 하나 또는 하나 이상일 수 있고(예컨대, 2, 3, 또는 4), 3개의 복제 균주로서 실시예에 나타내는 균주의 게놈으로 통합되는 발현 카셋의 수는 3개 또는 3개 이상일 수 있다(예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12). 임의의 특정 균주에서 복제물의 수는 필요에 따라 유전자 분석에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 40 ng의 Fabrazyme® (아갈시다아제 베타, 재조합 인간 a-갈락토시다아제 A) (Genzyme Corporation, a Sanofi company, Cambridge, USA) 또는 시판되는 재조합 인간 NAGAL (카달로그 # 6717-GH-020, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA)은 참조로 적재된다. 검출은 항-Fabrazyme® 항체 (Fabrazyme®을 이용한 토끼의 종래의 면역화에 의해 생성된 폴리클로날 토끼 항체) (마커로부터 왼쪽 레인) 및 항-NAGAL 항체 (Abcam; Ab139526) (마커의 오른손쪽에서의 레인)을 이용하여 수행된다. 여기 및 다른 실시예에서, 적외 형광 신호 부근의 검출(오디세이 적외 이미징 시스템(Li-Cor)을 이용한)을 위한 2차 항체는 염소 항-토끼 IRDye 680LT이고(Westburg; 926-68024); 적외 형광 신호 부근의 웨스턴 블롯 검출은 오디세이 적외 이미징 시스템(Li-Cor)을 이용하여 수행된다.
도 11은 EndoH를 이용하여 탈글리코실화 전(레인 1) 및 후(레인 2)에 NAGAL1 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 발현 균주의 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 샘플을 나타낸다(Bioke; P0702L).
도 12는 pH가 상이한 3개의 배지에서 구동되는 3-복제 NAGAL1 발현 균주의 바이오리액터 배양의 상이한 시점(tp) 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 시점 2, 5 및 7은 탄소 제한을 시작한 후 35시간, 106시간, 및 178시간을 나타낸다. 마커 전 마지막 레인은 20 ng의 재조합 인간 NAGAL이다(카달로그 # 6717-GH-020, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA).
도 13은 NAGAL1(Mut), NAGAL1#1, NAGAL1#2 및 NAGAL1#3에 대해 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 14는 (왼쪽)펩티드-N-글리코시다아제 F(PNGaseF; Bioke; P0704L) 치료 전(오른쪽) 또는 후(왼쪽), NAGAL1#2에 대해 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배지 샘플에 대한 감소 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 15는 NAGAL1(Mut), NAGAL1#2 및 NAGAL1#3의 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배지 샘플에 대한, 항-NAGAL 항체를 이용하여 비감소 SDS-PAGE 후, 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 16은 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal을 갖는 24웰 배지의 2시간 배양 후 방출된 4-메틸움버리페릴(methylumberriferyl) (μM)을 나타낸다(Carbosynth Limited; EM05182). 숫자는 측정 값의 평균을 나타낸다.
도 17은 상이한 NAGAL1 변이체를 발현하는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 균주의 바이오리액터 배양 동안 다양한 시점의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 18은 상이한 NAGAL1 변이체를 발현하는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 균주의 바이오리액터 배양 동안 다양한 시점의 SDS-PAGE 겔의 쿠마시(Coomassie) 염색을 나타낸다. 겔의 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 19는 단일 복제 NAGAL1(Mut), NAGAL1#2, 및 NAGAL1#3 발현 균주의 발효 샘플을 갖는 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal의 1시간 배양 후 방출된 4-메틸움버리페릴 (μM)을 나타내고: 균주 당 활성 수준은 발효가 진행되는 최종에서 두번째 및 최종 시점에 평가된다. 숫자는 측정값의 평균을 나타낸다. 활성 시험 전에 NAGAL(Mut) 배지 샘플에서 α-갈락토시다아제 활성의 열 불활성화(90 ℃에서 20분)는, 미처리된 NAGAL1#3 및 NAGAL(Mut) 샘플의 경우에, 방출된 4MU의 낮은 수준이 백그라운드 측정보다 명확하게 높으며, 따라서 실제 효소 활성을 나타낸다.
도 20은 NAGAL1#2를 발현하는 OXYY2163에서 잠정적인 단일 복제 변형의 SDS-PAGE/쿠마시 염색(왼쪽) 및 웨스턴 블롯 분석(오른쪽)을 나타낸다.
도 21은 몇개의 참조 단일 복제 균주에 대한 3-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 24웰 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석(상부 패널) 및 α-갈락토시다아제 활성 분석(하부 패널)을 나타낸다.
도 22는 단일 복제 및 2개의 3-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 바이오리액터 배양 동안 상이한 시점의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 23은 단일 복제 및 2개의 3-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 바이오리액터 배양 동안 상이한 시점의 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 24는 단일- 및 복수-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 발효 샘플을 갖는 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal의 1시간 배양 후 방출된 4-메틸움버리페릴 (μM)을 나타내고: 균주 당 활성 수준은 발효가 진행되는 최종에서 두번째 및 최종 시점에 평가된다. 숫자는 측정값의 평균을 나타낸다.
도 25는 복수-복제 NAGAL1#2 발현 클론의 1L 발효액에서 총 단백질 함량으로부터 유래되는 APTS-표지 N-글리칸에 대한 모세관 전기영동법을 통해 N-글리칸 프로파일링을 나타낸다. M5, M6, M8, M9: Man5 -6-8- 9GlcNAc2; MP-M8, (MP)2-M8: 각각 하나 또는 2개의 만노세포스페이트 부위를 갖는 Man8GlcNAc2.
도 26은 Asn213 (N213)에서 Asp (D213)로의 전환 및 Cys326 (C326)에서 Arg (R326)로의 전환 후, 닭(ch; 연회색) 및 인간(hu; 진회색)의 중첩을 나타낸다. 박스 내에서: 닭과 인간 NAGAL 사이에서 전환된 이온쌍. 타원 내에서: 닭(R328)과 인간 NAGAL (R327) 사이에서 전환된 Arg. 변이된 인간 NAGAL의 아미노산 부위 쇄들 사이의 4 및 3 Å의 거리는 이온쌍을 허용하는 범위 내이다.
도 27은 Asn213 (N213)의 Arg (R213)로의 전환 및 Cys326 (C326)의 Asp (D326)로의 전환 후, 닭(ch; 연회색) 및 인간(hu; 진회색)의 중첩을 나타낸다. 타원 내에서: 닭(R328)과 인간 NAGAL (R327) 사이에서 전환된 Arg. 변이된 인간 NAGAL의 아미노산 부위 쇄들 사이의 5.2 Å의 거리는 이온쌍을 허용하는 최적 범위 내에 있지 않다.
도 28은 8개의 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석; 단일 복제 NAGAL1(Mut) 발현 클론과의 비교를 나타낸다.
도 29는 NAGAL1(Mut), NAGAL1#2, NAGAL1#3, NAGAL1#4, NAGAL1#5 및 NAGAL1#6에 대한 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 30은 상이한 NAGAL1 변이체를 발현하는 균주의 바이오리액터 배양 동안 상이한 시점의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다. DG072, 유닛 3: NAGAL1(Mut); DG100, 유닛 8: NAGAL1#2; DG069, 유닛 6: NAGAL1#3; DG098, 유닛 6 내지 8: NAGAL1#4 resp. #5, resp. #6.
도 31은 상이한 NAGAL1 변이체의 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양액(왼쪽) 또는 소규모 발효(오른쪽) 샘플을 갖는 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal의 1시간 배양 후 μM의 양으로 방출된 4-메틸움버리페릴의 오버뷰를 나타낸다. 각각의 바의 상단의 숫자는 측정 값의 평균을 나타낸다. DG072, 유닛 3: NAGAL1(Mut); DG100, 유닛 8: NAGAL1#2; DG098, 유닛 6: NAGAL1#4.
도 32 및 33은 본 명세서의 실시예 부분에서 사용되고, 생성되는 플라스미드의 오버뷰를 제공한다.
도 34a-c는 본 명세서의 실시예 부분에서 사용되고, 생성되는 균주의 오버뷰를 제공한다.
도 2는 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 2). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산(D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R).
도 3은 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 3). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R).
도 4는 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 4). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산(D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S).
도 5는 본 발명의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 5). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S).
도 6은 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 6). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산(D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 7은 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 7). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아르기닌 (R); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 8은 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 8). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아스파르트산 (D); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 9는 본 발명의 실시형태에 따른 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 9). 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산(아스파라긴, N); 볼드 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 세린 (S); 볼드 이탤릭체 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 세린 171에 대응하는 아미노산을 치환하는 글루탐산 (E); 볼드 이탤릭체 이중 언더라인된 것: SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 알라닌 174에 대응하는 아미노산을 치환하는 류신 (L).
도 10은 α-GalA 또는 NAGAL1 발현 카셋의 단독 또는 3개의 복제물을 함유하는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)의 24웰 배양액로부터 유래된 환원된(왼쪽) 또는 비환원된(오른쪽) 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본 실험에서, 단일 복제 균주는 단일 발현 카셋의 임의의 통합의 결과인 균주를 말하는 반면, 3개의 복제 균주는 3개의 상이한 선택 마커를 이용하여 3개의 발현 카셋의 임의의 통합의 결과라는 것을 주목한다. 임의의 발현 카셋은 변형 시에 한번 또는 한번 이상 게놈으로 통합, 예컨대 직렬 삽입(tandem insertion)될 수 있다. 그 결과, 단일 복제 균주로서 실시예에 나타내는 균주의 게놈으로 통합되는 발현 카셋의 수는 하나 또는 하나 이상일 수 있고(예컨대, 2, 3, 또는 4), 3개의 복제 균주로서 실시예에 나타내는 균주의 게놈으로 통합되는 발현 카셋의 수는 3개 또는 3개 이상일 수 있다(예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12). 임의의 특정 균주에서 복제물의 수는 필요에 따라 유전자 분석에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 40 ng의 Fabrazyme® (아갈시다아제 베타, 재조합 인간 a-갈락토시다아제 A) (Genzyme Corporation, a Sanofi company, Cambridge, USA) 또는 시판되는 재조합 인간 NAGAL (카달로그 # 6717-GH-020, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA)은 참조로 적재된다. 검출은 항-Fabrazyme® 항체 (Fabrazyme®을 이용한 토끼의 종래의 면역화에 의해 생성된 폴리클로날 토끼 항체) (마커로부터 왼쪽 레인) 및 항-NAGAL 항체 (Abcam; Ab139526) (마커의 오른손쪽에서의 레인)을 이용하여 수행된다. 여기 및 다른 실시예에서, 적외 형광 신호 부근의 검출(오디세이 적외 이미징 시스템(Li-Cor)을 이용한)을 위한 2차 항체는 염소 항-토끼 IRDye 680LT이고(Westburg; 926-68024); 적외 형광 신호 부근의 웨스턴 블롯 검출은 오디세이 적외 이미징 시스템(Li-Cor)을 이용하여 수행된다.
도 11은 EndoH를 이용하여 탈글리코실화 전(레인 1) 및 후(레인 2)에 NAGAL1 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 발현 균주의 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 샘플을 나타낸다(Bioke; P0702L).
도 12는 pH가 상이한 3개의 배지에서 구동되는 3-복제 NAGAL1 발현 균주의 바이오리액터 배양의 상이한 시점(tp) 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 시점 2, 5 및 7은 탄소 제한을 시작한 후 35시간, 106시간, 및 178시간을 나타낸다. 마커 전 마지막 레인은 20 ng의 재조합 인간 NAGAL이다(카달로그 # 6717-GH-020, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA).
도 13은 NAGAL1(Mut), NAGAL1#1, NAGAL1#2 및 NAGAL1#3에 대해 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 14는 (왼쪽)펩티드-N-글리코시다아제 F(PNGaseF; Bioke; P0704L) 치료 전(오른쪽) 또는 후(왼쪽), NAGAL1#2에 대해 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배지 샘플에 대한 감소 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 15는 NAGAL1(Mut), NAGAL1#2 및 NAGAL1#3의 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배지 샘플에 대한, 항-NAGAL 항체를 이용하여 비감소 SDS-PAGE 후, 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 16은 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal을 갖는 24웰 배지의 2시간 배양 후 방출된 4-메틸움버리페릴(methylumberriferyl) (μM)을 나타낸다(Carbosynth Limited; EM05182). 숫자는 측정 값의 평균을 나타낸다.
도 17은 상이한 NAGAL1 변이체를 발현하는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 균주의 바이오리액터 배양 동안 다양한 시점의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 18은 상이한 NAGAL1 변이체를 발현하는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 균주의 바이오리액터 배양 동안 다양한 시점의 SDS-PAGE 겔의 쿠마시(Coomassie) 염색을 나타낸다. 겔의 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 19는 단일 복제 NAGAL1(Mut), NAGAL1#2, 및 NAGAL1#3 발현 균주의 발효 샘플을 갖는 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal의 1시간 배양 후 방출된 4-메틸움버리페릴 (μM)을 나타내고: 균주 당 활성 수준은 발효가 진행되는 최종에서 두번째 및 최종 시점에 평가된다. 숫자는 측정값의 평균을 나타낸다. 활성 시험 전에 NAGAL(Mut) 배지 샘플에서 α-갈락토시다아제 활성의 열 불활성화(90 ℃에서 20분)는, 미처리된 NAGAL1#3 및 NAGAL(Mut) 샘플의 경우에, 방출된 4MU의 낮은 수준이 백그라운드 측정보다 명확하게 높으며, 따라서 실제 효소 활성을 나타낸다.
도 20은 NAGAL1#2를 발현하는 OXYY2163에서 잠정적인 단일 복제 변형의 SDS-PAGE/쿠마시 염색(왼쪽) 및 웨스턴 블롯 분석(오른쪽)을 나타낸다.
도 21은 몇개의 참조 단일 복제 균주에 대한 3-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 24웰 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석(상부 패널) 및 α-갈락토시다아제 활성 분석(하부 패널)을 나타낸다.
도 22는 단일 복제 및 2개의 3-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 바이오리액터 배양 동안 상이한 시점의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 23은 단일 복제 및 2개의 3-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 바이오리액터 배양 동안 상이한 시점의 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다.
도 24는 단일- 및 복수-복제 NAGAL1#2 발현 균주의 발효 샘플을 갖는 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal의 1시간 배양 후 방출된 4-메틸움버리페릴 (μM)을 나타내고: 균주 당 활성 수준은 발효가 진행되는 최종에서 두번째 및 최종 시점에 평가된다. 숫자는 측정값의 평균을 나타낸다.
도 25는 복수-복제 NAGAL1#2 발현 클론의 1L 발효액에서 총 단백질 함량으로부터 유래되는 APTS-표지 N-글리칸에 대한 모세관 전기영동법을 통해 N-글리칸 프로파일링을 나타낸다. M5, M6, M8, M9: Man5 -6-8- 9GlcNAc2; MP-M8, (MP)2-M8: 각각 하나 또는 2개의 만노세포스페이트 부위를 갖는 Man8GlcNAc2.
도 26은 Asn213 (N213)에서 Asp (D213)로의 전환 및 Cys326 (C326)에서 Arg (R326)로의 전환 후, 닭(ch; 연회색) 및 인간(hu; 진회색)의 중첩을 나타낸다. 박스 내에서: 닭과 인간 NAGAL 사이에서 전환된 이온쌍. 타원 내에서: 닭(R328)과 인간 NAGAL (R327) 사이에서 전환된 Arg. 변이된 인간 NAGAL의 아미노산 부위 쇄들 사이의 4 및 3 Å의 거리는 이온쌍을 허용하는 범위 내이다.
도 27은 Asn213 (N213)의 Arg (R213)로의 전환 및 Cys326 (C326)의 Asp (D326)로의 전환 후, 닭(ch; 연회색) 및 인간(hu; 진회색)의 중첩을 나타낸다. 타원 내에서: 닭(R328)과 인간 NAGAL (R327) 사이에서 전환된 Arg. 변이된 인간 NAGAL의 아미노산 부위 쇄들 사이의 5.2 Å의 거리는 이온쌍을 허용하는 최적 범위 내에 있지 않다.
도 28은 8개의 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석; 단일 복제 NAGAL1(Mut) 발현 클론과의 비교를 나타낸다.
도 29는 NAGAL1(Mut), NAGAL1#2, NAGAL1#3, NAGAL1#4, NAGAL1#5 및 NAGAL1#6에 대한 상이한 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 30은 상이한 NAGAL1 변이체를 발현하는 균주의 바이오리액터 배양 동안 상이한 시점의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 블롯 상단의 숫자는 피드 단계 II에서 배양 시간의 수를 나타낸다. DG072, 유닛 3: NAGAL1(Mut); DG100, 유닛 8: NAGAL1#2; DG069, 유닛 6: NAGAL1#3; DG098, 유닛 6 내지 8: NAGAL1#4 resp. #5, resp. #6.
도 31은 상이한 NAGAL1 변이체의 단일 복제 발현 균주의 24웰 배양액(왼쪽) 또는 소규모 발효(오른쪽) 샘플을 갖는 플루오로메트릭 기질 4MU-α-Gal의 1시간 배양 후 μM의 양으로 방출된 4-메틸움버리페릴의 오버뷰를 나타낸다. 각각의 바의 상단의 숫자는 측정 값의 평균을 나타낸다. DG072, 유닛 3: NAGAL1(Mut); DG100, 유닛 8: NAGAL1#2; DG098, 유닛 6: NAGAL1#4.
도 32 및 33은 본 명세서의 실시예 부분에서 사용되고, 생성되는 플라스미드의 오버뷰를 제공한다.
도 34a-c는 본 명세서의 실시예 부분에서 사용되고, 생성되는 균주의 오버뷰를 제공한다.
여기서 사용되는, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥이 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수의 지시 대상 모두를 포함한다.
여기서 사용되는 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprises)" 및 "~로 구성되는(comprised of)"의 용어는 "포함하는(including)", "포함한다(includes)" 또는 "함유하는(containing)", "함유한다(contains)"와 동의어이고, 포괄적이거나 조정이 가능하고, 추가적, 기재되지 않은 구성 요소, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 또한, 이 용어는 특허 용어에서 잘 확립된 의미를 향유하는 "로 이루어진(consisting of)" 및 "~로 필수적으로 이루어진"을 포함한다.
종결점에 의한 수치 범위의 제한은 개시된 종결점 및 각각의 범위 내에 포함된 모든 숫자와 분수를 포함한다.
파라미터, 양, 시간적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 여기서 사용되는 "약(about)" 또는 "약(approximately)"의 용어는 특정 값의, 특정 값으로부터의 변이, 예컨대 이러한 변이가 개시된 발명에서 수행하기에 적합한 한, 특정 값으로부터 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/-1% 이하, 보다 더욱 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변이를 포함하는 것을 의미한다. 한정자 "약"이 의미하는 값 자체가 구체적으로, 바람직하게는 개시되는 것으로 이해되어야 한다.
반면에, "하나 이상(one or more)" 또는 "적어도 하나(at least one)"의 용어, 예컨대 하나 이상의 구성 요소 또는 군의 구성 요소 중 적어도 하나의 구성 요소는 다음 예시화를 이용해 그 자체로 명확하고, 이 용어는 특히 상기 구성 요소 중 어느 하나 또는 상기 구성 요소 중 어느 둘 이상의 구성 요소, 예컨대 상기 구성 요소 중 임의의 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 또는 ≥7 등, 상기 구성 요소 전체까지에 대한 언급을 포함한다. 다른 실시예에서, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상을 말하는 것일 수 있다.
여기에 본 발명에 대한 배경의 논의는 본 발명의 맥락에서 설명하기 위해 포함된다. 이는 언급된 자료 중 어떤 것이 청구항의 우선일로 공개되거나, 공지되거나, 또는 어떤 국가에서 일반적인 지식의 일부인지를 인정하는 것으로 받아들여서는 안된다.
본 명세서에 걸쳐, 다양한 공개물, 특허 및 공개 특허 명세서는 식별 인용에 의해 참조된다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 그 전체가 여기에 참조로 인용된다. 특히, 본 명세서에서 구체적으로 언급된 이러한 문서의 교시 또는 부분은 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어를 포함하여 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가 지침에 의해, 용어 정의가 본 발명의 교시를 더 잘 이해하기 위해 포함된다. 특정 용어가 본 발명의 특정 양태 또는 본 발명의 특정 실시형태와 관련하여 정의되는 경우, 이러한 의미는 다른 설명이 없는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐, 즉 본 발명의 다른 양태 또는 실시형태와 관련하여 적용되는 의미이다.
다음의 구절에서, 본 발명의 상이한 양태 또는 실시형태가 보다 상세하게 정의된다. 이렇게 정의된 각각의 양태 또는 실시형태는 명확하게 반대되는 경우를 제외하고는 임의의 다른 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시되는 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 명세서에서 "일 실시형태", "실시형태"는 실시형태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 곳에서 "일 실시형태에서" 또는 "실시형태에서"라는 표현의 출현은 반드시 동일한 실시형태를 지칭하는 것이 아니라, 동일한 실시형태를 말하는 것일 수도 있다. 또한, 특정 특징들, 구조들 또는 특성들은 하나 이상의 실시형태에서 본 개시 내용으로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다. 또한, 여기에 기재된 일부 실시형태는 다른 실시형태에 포함되는 일부 특징을 포함하지만, 다른 특징을 포함하지는 않으면서, 다른 실시형태의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있고, 당업자가 이해할 수 있는 다른 실시형태를 형성하는 것을 의미한다. 예컨대, 첨부된 청구 범위에서, 청구된 실시형태 중 임의의 것을 임의의 조합으로 사용할 수 있다.
본 발명자들은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 재조합 발현 수준의 엄청난 증가가 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 변형된 형태에 대해 얻어지는 것을 깨달았다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는,
인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되는, 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 제공한다.
본 발명의 제2 양태는,
인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나,
인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나,
인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 제1 아미노산을 치환되는 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 제2 아미노산을 치환되는 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나와 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 제공한다.
본 발명의 제3 양태는,
제1 도메인과 제2 도메인을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로, 상기 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은, 제1 도메인이 제2 도메인을 갖는 적어도 하나의 (추가의) 이온쌍을 형성할 수 있도록 변형되는, 제1 도메인과 제2 도메인을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 제공한다.
"펩티드(peptide)", "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 "단백질(protein)"의 용어는 상호 교환 가능하게 이용될 수 있고, 임의의 특성, 합성, 또는 인접하는 아미노산 잔기 사이에서 펩티드 결합에 의해 함께 결합되는 아미노산을 포함하는 재조합 분자와 관련된다. "펩티드 결합(peptide bond)", "펩티드 결합(peptide link)" 또는 "아미드 결합(amide bond)"은, 하나의 아미노산의 카르복실기가 다른 아미노산의 아미노기와 반응하여, 물 분자를 방출할 때, 2개의 아미노산 사이에서 형성되는 공유 결합이다. 폴리펩티드는 임의의 공급원, 예컨대 자연적으로 발생하는 폴리펩티드, 화학적으로 합성되는 폴리펩티드, 재조합 분자 유전 기술로 생성되는 폴리펩티드, 또는 세포 또는 변이 시스템으로부터 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 재조합 분자 유전 기술로 생성되는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 직쇄일 수 있거나 구상 형태로 접힐 수 있다. "아미노산(amino acid)" 및 "아미노산 잔기(amino acid residue)"의 용어는 여기서 상호 교환하여 이용될 수 있다.
"재조합(recombinant)"의 용어는 일반적으로 물질(예컨대, 핵산, 유전 구조체 또는 단백질)이 인간 개입(human intervention)을 통해 기술적 수단(즉, 비자연스럽게)으로 변경된다. "재조합 핵산(recombinant nucleic acid)"의 용어는 일반적으로 재조합 DNA 기술을 이용하여 함께 결합되는 단편으로 이루어지는 핵산을 말할 수 있다. 여기서 사용되는, 용어는 바람직하게는 돌연변이 유발의 기술적 수단으로 변형되는 물질(예컨대, 핵산, 유전 구조체 또는 단백질)을 의미한다. 여기서 사용되는 "재조합 단백질 또는 폴리펩티드"의 용어는 재조합 DNA와 같은 재조합 핵산의 발현을 일으킬 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다.
"핵산"은 뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드로 필수적으로 이루어지는 임의의 길이의 올리고머 및 폴리머를 의미한다. 핵산은 푸린 및/또는 피리미딘 염기 및/또는 다른 특성(예컨대, 크산틴(xanthine), 이노신(inosine), 하이포잔틴(hypoxanthine)), 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된(예컨대 메틸화된), 비자연적, 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 핵산의 백본은, 일반적으로 RNA 또는 DNA, 및/또는 하나 이상의 변형된 또는 치환된 당 및/또는 하나 이상의 변형된 또는 치환된 포스페이트기에서 발견될 수 있기 때문에, 당 및 포스페이트기를 포함할 수 있다. 포스페이트기 또는 당의 변형은 안정성, 효소적 분해에 대한 내성, 또는 일부 다른 유용한 특성을 개선하기 위해 도입될 수 있다. "핵산"은, 예컨대 이중 가닥(double-stranded), 부분적으로 이중 가닥, 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다. 여기서 사용되는 "핵산"의 용어는 바람직하게는, 구체적으로 RNA, 게놈 RNA, cDNA, DNA, 프로바이러스(provirus), 프리(pre)-mRNA 및 mRNA를 포함하는 DNA 및 RNA를 포함한다.
인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(EC 3.2.1.49)는 당지질 및 당단백질로부터 말단 알파-N-아세틸갈락토사민(α-GalNAc) 단당류를 제거하는 글리코사이드 가수분해효소이다. 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제는 인간 혈액 그룹 A 및 AB 뮤신 당단백질, 포르스만 헵텐(Forssman hapten) 및 혈액 그룹 A 락토 시리즈 당지질로(blood group A lacto series glycolipids)부터 비환원 α-(1→3)-N-아세틸갈락토사민의 분해를 촉진한다. 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제는 Clark 및 Garman(2009, J. Mol. Biol., 393(2): 435-447)과 같은 문헌에 기재된다.
용어 "알파-N-아세틸갈락토사미니다아제", "α-N-아세틸갈락토사미니다아제", "α-갈락토시다아제 B", "α-아세틸갈락토사미니다아제", "N-아세틸-α-D-갈락토사미니다아제", "N-아세틸-α-갈락토사미니다아제", "알파-GalNAcase", "α-NAGA", "α-NAGAL", 및 "NAGAL"은 여기서 상호 교환하여 사용될 수 있다.
예시적인 인간 NAGAL 단백질 서열은 미국 정부의 국립 생물 정보 센터(NCBI) 진뱅크(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 수탁 번호 NP_000253.1 (서열 버전 1), 또는 Swissprot/Uniprot (http://www.uniprot.org/) 수탁 번호 P17050-2 (서열 버전 2) 하에 주석을 달 수 있다. 예시적인 인간 NAGAL mRNA (cDNA) 서열은 NCBI 진뱅크 수탁 번호 NM_000262.2 (서열 버전 2) 하에서 주석을 달 수 있다(annotate).
NP_000253.1 하에 주석이 달린 인간 NAGAL 아미노산 서열은 이하에 재생성된다:
MLLKTVLLLGHVAQVLMLDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCSWPAYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILNWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSCRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ (SEQ ID NO: 21).
상기 대표적인 인간 NAGAL 폴리펩티드 서열은 N-말단 신호 펩티드(signal peptide)를 포함하는 NAGAL 전구체의 것이다. 인간 NAGAL의 가공 동안, SEQ ID NO: 21에서 아미노산 1 내지 17에 대응하는 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 18 내지 411에 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 단백질을 형성하기 위해 가공되어, 394-아미노산 길이이다.
그 결과, 예시적인 성숙한 인간 NAGAL의 아미노산 서열은 이하에 재생성된다:
LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCSWPAYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILNWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSCRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ (SEQ ID NO: 1).
여기서 사용되는 인간 NAGAL 폴리펩티드에 대한 언급은 맥락에서 명백한 바와 같이, 인간 NAGAL 전구체 폴리펩티드 및 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 본래의 신호 펩티드가 적절한 숙주 세포에서 활성인 신호 펩티드로 대체되는 인간 NAGAL 폴리펩티드도 맥락으로부터 명백한 바와 같이 포함된다.
NAGAL 폴리펩티드와 연결하여 여기서 사용되는 수식어 "인간"은 그 기원 또는 공급원 이외에, NAGAL 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열을 말한다. 예컨대, 인간 NAGAL 폴리펩티드는 기술적 수단, 예컨대 재조합 발현, 무세포 번역(cell-free translation), 또는 비생물학적 펩티드 합성에 의해 얻어질 수 있다.
성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드는 394 잔기를 함유하는 각각의 모노머를 갖는 호모다이머를 형성한다(17 잔기 신호 서열을 포함하지 않음). 인간 NAGAL 폴리펩티드는 2개의 도메인을 포함한다. 제1 도메인(즉, 도메인 I 또는 도메인 1)은 (β/α)8 배럴을 형성하고, 제2 도메인(즉, 도메인 II 또는 도메인 2)은 2개의 β 시트에서 8개의 안티페럴 β 가닥을 함유한다(Clark and Garman, 2009, J. Mol. Biol., 393(2):435-447).
인간 NAGAL의 제1 도메인은 제2 도메인에 대해 N-말단에 위치하고, 제2 도메인은 제1 도메인에 대해 C-말단에 위치하고, 즉 인간 NAGAL의 도메인 I은 N-말단이고, 도메인 II는 C-말단이다. 인간 NAGAL의 제1 도메인과 제2 도메인 사이의 개념상의 경계는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 292과 296 사이의 위치(예컨대, 아미노산 292-295, 292-294, 292-293, 293-296, 293-295, 293-294, 294-296, 294-295, 또는 295-296 사이의 위치)에 대응하는 아미노산 위치에 편리하게 위치할 수 있다. 그 결과, 실시예를 이용하여, 한정하지 않고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 도메인 I은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-296, 또는 1-295, 또는 1-294, 또는 1-293, 또는 1-292, 바람직하게는 1-291로 구성될 수 있다. SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 도메인 II는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 292-394, 또는 293-394, 또는 294-394, 또는 295-394, 또는 296-394, 바람직하게는 297-394로 구성될 수 있다.
그 결과, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 예시적인 제1 도메인(도메인 I)의 아미노산 서열은 이하에 재생될 수 있다:
LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCSWPAYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILNWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQD (SEQ ID NO: 22).
인간 NAGAL 폴리펩티드의 예시적인 제2 도메인(도메인 II)의 아미노산 서열은 이하에 재생될 수 있다:
GRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSCRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ (SEQ ID NO: 23).
인간 NAGAL의 활성 부위는 β 가닥의 C-말단에서 (β/α)8 배럴 도메인(즉 제1 도메인)에서 발견된다. 특히, 인간 NAGAL의 활성 부위는 C-터미널에서 6개의 연속적 β 가닥, 가닥 β1-β6까지 루프에 의해 형성된다. 엑소글리코시다아제 기능과 일치하여, 활성 부위는 분자 표면에 작은 포켓을 형성한다. 활성 부위를 형성하는 잔기는 W33, D78, D79, Y119, C127, K154, D156, C158, S188, A191, Y192, R213, 및 D217를 포함한다(개시 메티오닌으로부터 시작하는 아미노산 넘버링, 예컨대 SEQ ID NO: 21 참조).
성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드는 5개의 N-결합 글리코실화 부위(즉, N124, N177, N201, N359, 및 N385), 4개의 디설파이드 결합(C38-C80, C42-C49, C127-C158, C187-C209), 및 자유 시스테인(C343)을 함유한다(개시 메티오닌으로부터 시작하는 아미노산 넘버링, 예컨대 SEQ ID NO: 21 참조).
여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은 "변형된", 또는 "변이된" 또는 "변이" 또는 하나 이상의 변이를 포함하는, 즉, 특히 야생형 인간 NAGAL의 아미노산 서열과 비교하여 변이되지 않는 인간 NAGAL의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 서열의 변화를 포함하는 것으로 편리하게 나타낼 수 있다.
여기서 사용되는, 핵산 또는 폴리펩티드에 적용되는 "야생형(wild-type)"의 용어는, 생물학적 기관이 자연에 존재할 때 생물학적 기관에 의해 생성되거나, 생물학적 기관에서 발생하는 핵산 또는 폴리펩티드를 말한다. 용어 "야생형"은 "본래의(native)"와 일부 범위 동의어 일 수 있으며, 후자는 본래의 서열을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하며, 즉 1차 서열이 자연에서 발견되거나 자연에서 유래되는 핵산 또는 폴리펩티드와 동일하다. 당업자는, 본래의 서열이 제공된 종 내에서 보통의 유전적 다양성(변이)에 기인하여 동일한 종의 다양한 개체들 사이에서 또는 내에서 달라질 수 있음을 이해한다. 또한, 본래의 서열은 전사 후(post-transcriptional) 또는 번역 후 변형(post-translational modifications)의 다양한 개체들 사이에서 또는 내에서 달라질 수 있다. 핵산 또는 폴리펩티드의 이러한 변이체 또는 이소폼(isoforms)은 여기서 "본래의"를 포함한다. 따라서, 자연으로부터 유래된 또는 자연에서 발견된 핵산 또는 폴리펩티드 전체 서열은 "본래의"로 간주된다. 용어 "본래의"는 이러한 공급원으로부터 적어도 부분적으로 분리될 때, 그리고 생물학적 샘플의 일부를 형성할 때, 살아 있는 유기체, 기관, 조직 또는 세포의 일부를 형성할 때, 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 이 용어는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 때 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 대부분의 본래의 인간 NAGAL 핵산 또는 폴리펩티드가 "야생형"으로 간주될 수 있지만, 쉰들러병 또는 칸자키병과 같은 질병 유전자형을 야기하거나, 연관되는 자연적으로 발생하는 변이를 수반하는 것(이러한 변이는 NAGAL의 발현 및/또는 활성을 감소 또는 제거할 수 있음)은 일반적으로 용어 "야생형"의 범위로부터 배제된다. 그 결과, 특정 실시형태에서, 여기서 의도되는 바와 같이 변형할 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은 쉰들러병 또는 칸자키병과 같은 질병 유전자형을 야기하거나 이와 관련되지 않는 것이다. 그러나, 인간 NAGAL 발현 및/또는 활성을 방해하는 자연 발생적 돌연변이가 상기 α-Gal A 활성을 획득하기 위해 추가로 변형된 경우, NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 잠재적 α-Gal A 활성을 간섭하지 않는 한, 이러한 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 여기에서 유용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편은 화학적 폴리펩티드 합성 동안(예컨대 바람직한 아미노산에서 화학적 확립에 의해, 또는 재조합 분자 유전 기술에 의해, 또는 무세포 번역에 의해 폴리펩티드의 생산 동안 변형될 수 있다.
또한, 본 발명은 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 "기능적으로 활성인 변이체 또는 단편"을 말한다. 발현은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 기능적으로 활성인 변이체, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 기능적으로 활성인 단편, 및 인간 NAGAL 폴리펩티드의 단편의 기능적으로 활성인 변이체를 포함한다.
단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 "단편"의 용어는 일반적으로 상기 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 제거되거나 절단된 형태를 말한다. 이 용어는, 예컨대 물리적, 화학적 및/또는 효소적 단백질 가수분해에 의해, 예컨대 생체 내 또는 생체 외에서, 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 번역, 엑소- 및/또는 엔도-단백질 가수 분해 및/또는 분해에 의해 제한 없이 임의의 메카니즘에 의해 발생하는 단편을 포함한다. 제한 없이, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 단편은 상기 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드, 예컨대 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 적어도 약 5% (아미노산 수로), 또는 적어도 약 10%, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 또는 40% 이상, 예컨대 바람직하게는 50% 이상, 예컨대 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상을 나타낼 수 있다.
예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 단편은 대응하는 전체 길이의 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 5 이상의 연속 아미노산, 10 이상의 연속 아미노산, 20 이상의 연속 아미노산, 30 이상의 연속 아미노산, 예컨대 40 이상의 연속 아미노산, 예컨대 50 이상의 연속 아미노산, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상, 200 이상, 300 이상, 310 이상, 320 이상, 330 이상, 340 이상, 350 이상, 360 이상, 370 이상, 380 이상, 또는 390 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 단편은, 대응하는 전체 길이의 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드와 비교하여, 1 내지 약 20개의 아미노산, 예컨대 1 내지 약 15개의 아미노산, 또는 1 내지 약 10개의 아미노산, 또는 1 내지 약 5개의 아미노산에 의해 N-말단 및/또는 C-말단 절단될 수 있다.
단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 "변이체"라는 용어는 일반적으로 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 서열과 아미노산 서열이 사실상 동일한(즉 널리, 그러나 전체 동일하지는 않은), 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 서열과, 예컨대 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 서열과, 예컨대 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드와 적어도 약 80% 동일하거나 적어도 약 85% 동일한, 예컨대 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하고, 예컨대 적어도 91% 동일하고, 92% 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 93% 동일하고, 예컨대 적어도 94% 동일하고, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 동일하고, 예컨대 적어도 96% 동일하고, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 97% 동일하고, 예컨대 적어도 98% 동일하고, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 말한다. 바람직하게는, 변이체는 기재된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 전체 서열이 서열 얼라인먼트에서 쿼리될 때 기재된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 이러한 정도의 동일성을 보여줄 수 있다(즉, 전체 서열 동일성). 서열 동일성은 그 자체로 알려진 서열 동일성의 결정 및 서열 얼라인먼트를 수행하기 위해 적합한 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 예시적이지만 비제한적인 알고리즘은 예컨대 공개된 디폴트 세팅 또는 다른 적합한 세팅(예컨대, BLASTN 알고리즘에서: 갭을 개방하기 위한 비용(cost to open a gap)= 5, 갭을 연장하기 위한 비용(cost to extend a gap)= 2, 미스매치에 대한 패널티(penalty for a mismatch)= -2, 매치에 대한 보상(reward for a match)= 1, 갭(gap) x_드롭 오프(dropoff)= 50, 기대값= 10.0, 워드 크기= 28; 또는 BLASTP 알고리즘에서: 매트릭스= Blosum62 (Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:10915-10919), 갭을 개방하기 위한 비용= 11, 갭을 연장하기 위한 비용= 1, 기대값= 10.0, 워드 크기 = 3)을 이용하여 Altschul et al. 1990(J Mol Biol 215: 403-10)에 의해 원래 기재되는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool), 예컨대 Tatusova and Madden 1999에 의해 기재된 "Blast 2 sequences" 알고리즘에 기초한 것을 포함한다.
쿼리 폴리펩티드(query polypeptide)(예컨대, 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드)의 특정 아미노산 서열과 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 예시 절차는 적합한 알고리즘 파라미터를 이용하여 NCBI 웹 사이트에서 웹 어플리케이션으로서 또는 자립형 실행 가능한 프로그램으로서 이용 가능한 블라스트 2 서열(Bl2seq) 알고리즘을 이용하여 2개의 아미노산 서열을 얼라이닝 하는 것을 수반할 것이다. 적합한 알고리즘 파라미터의 예는 이하를 포함한다: 매트릭스= Blosum62, 갭을 개방하기 위한 비용=11, 갭을 연장하기 위한 비용= 1, 기대값= 10.0, 워드 크기 = 3). 2개의 비교되는 서열이 상동성을 공유하는 경우, 출력은 얼라이닝되는 서열과 상동성인 영역이 존재할 것이다. 2개의 비교되는 서열이 상동성을 공유하지 않는 경우, 출력은 얼라이닝되는 서열이 존재하지 않을 것이다. 한번 얼라이닝되면(aligned), 매칭되는 수는 동일한 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 존재하는 위치의 수를 카운팅함으로써 결정될 것이다. 퍼센트 동일성은 매칭의 수를 쿼리 폴리펩티드의 길이로 나눈 후, 얻어진 값을 100으로 곱함으로써 결정된다. 퍼센트 동일성 값은, 반드시 그런 것은 아니지만, 가장 소수 첫째 자리까지 반올림될 수 있다. 예컨대, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 78.1로 반올림될 수 있지만, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 반올림될 수 있다. 또한, Bl2seq로 출력되는 얼라인먼트의 각각의 단편에 대한 상세한 뷰는 이미 편리하게 동일성의 퍼센트를 포함한다.
단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 변이체는 상기 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 동족체(homology)(예컨대, 오르토로그(orthologue) 또는 파라로그(paralogue))일 수 있다. 여기서 사용되는 용어 "동족체"는 일반적으로 동일하거나 상이한 분류군으로부터 2개의 거대분자들 사이에, 특히 2개의 단백질 또는 폴리펩티드 사이에 구조적 유사성을 나타내고, 상기 유사성은 공유된 혈통에 기인한다.
단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 변이체는 대응하는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드에 비해(즉, ~와 비교하여) 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다.
예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 변이체(치환 변이체)는 대응하는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드에 대해(즉, ~와 비교하여) 50까지(예컨대 하나 이하, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50)의 연속 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
연속 아미노산 치환은 유사한 특성을 갖는 다른 것에 대해 하나의 아미노산의 치환이다. 연속 아미노산 치환은 이하 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 류신, 발린, 및 이소류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인, 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성 소수성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하(즉 염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음전아(즉 산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 상술한 극성, 염기, 또는 산성기 중 하나의 구성 요소의 동일한 기의 다른 구성 요소로의 임의의 치환은 연속 치환일 수 있다. 반대로, 비연속 치환은 하나의 아미노산을 상이한 특성을 갖는 다른 것으로의 치환이다.
대안적으로 또는 추가로, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 변이체(결실 변이체)는 대응하는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 대응하는 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드에 대해(즉, ~와 비교하여) 20까지의 아미노산 단편(예컨대, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 단편)이 부족할 수 있다. 결실 단편은 하나의 아미노산, 2개의 연속 아미노산 또는 3개의 연속 아미노산으로 각각 독립적으로 이루어질 수 있다. 결실 단편은 비연속적이거나 둘 이상일 수 있거나, 결실 단편 전체가 연속적일 수 있다.
여기에 기재되는, 인간 NAGAL 폴리펩티드는 하나 이상의 내부의 및/또는 말단의(즉, N- 및/또는 C-말단의) 무관한 또는 이종의 아미노산 서열과 융합될 수 있다(즉, 융합 단백질). 이종 서열은, 예컨대 재조합 단백질의 정제에 사용되는 서열일 수 있다(예컨대, FLAG, 폴리히스티딘 (예컨대, 헥사히스티딘), 헤마글루타닌(hemagluttanin, HA), 글루타티온-S-트랜스페라아제 (GST), 또는 말토오스-결합 단백질 (MBP)). 또한, 이종 서열은 진단성 또는 검출 가능한 마커, 예컨대 루시페라아제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라아제(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)로 유용한 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 다른 단백질로부터 신호 서열을 함유할 수 있다. 특정 숙주 세포(예컨대, 효모 숙주 세포)에서, 표적 단백질의 발현 및/또는 분비는 이종 신호 서열의 사용을 통해 증가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은, 예컨대 면역 반응(예컨대 항체 생성을 위해; 이하 참조) 또는 소포체(endoplasmic reticulum) 또는 골지체 체류 신호(Golgi apparatus retention signal)를 유발하는 것에 유용한 담체(예컨대 KLH)를 함유할 수 있다. 이종 서열은 길이가 달라질 수 있고, 일부 경우에 이종 서열이 부착되는 전체 길이 단백질 또는 폴리펩티드보다 더 긴 서열일 수 있다.
본 명세서는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 변이체 및/또는 단편을 말하거나 포함하는 경우, 이는 각각의 또는 대응하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 기능적으로 활성인 또는 기능적인, 즉 의도된 작용성 또는 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 유지하는 변이체 또는 단편을 의미한다. 실시예를 이용하여, 제한 없이, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 유지할 것이다. 예컨대, 그 글리코사이드 가수 분해 효소 활성과 같은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 생물학적 활성의 하나 이상의 양태를 유지할 것이다. 바람직하게는, 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 대응하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 비교하여 의도된 생물학적 활성 또는 작용성이 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 또는 약 100% 조차 유지할 수 있다. 인간 NAGAL 폴리펩티드와 같은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 "활성"이라는 언급은 일반적으로, 예컨대 세포, 조직, 기관 또는 유기체 내에서, 그 생화학적 활성, 효소적 활성, 신호 활성, 상호 작용 활성, 리간드 활성, 및/또는 구조적 활성 중 어느 하나 이상의 양태에 제한 없이 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 생물학적 활성 중 어느 하나 이상의 양태를 포함할 수 있다. 실시예를 이용하여, 제한 없이, 인간 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 활성이라는 언급은 특히 글리코사이드 가수분해 효소로서의 그 활성, 즉 말단 α-GalNAc 단당류를 제거하는 그 능력을 의미하는 것일 수 있다. 인간 NAGAL 폴리펩티드와 같은 제공된 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 활성이 확립된 분석법, 예컨대 효소 분석법(예컨대 형광 분석과 같은)에 의해 쉽게 측정될 수 있는 경우, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 이러한 분석에서 각각의 또는 대응하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 활성의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 또는 약 100% 조차 활성을 나타낼 수 있다.
예컨대, 인간 NAGAL 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 α-N-아세틸갈락토사미니다아제 활성은 기질로서 MU-α-D-N-아세틸갈락토사민(예컨대, MU-2-아세트아미드-2-이독시-a-D-갈락토피라노사이드; Toronto Research Chemicals, North York, ON, Canada)에 의한 것과 같은 효소 분석법으로 측정될 수 있다. NAGAL 활성은, 예컨대 355 nm에서 여기(excitation) 후 460 nm에서 Wallac 1420 ARVO MX 멀티라벨 카운터 (Perkin Elmer, Waltham, MA)를 이용하여 측정될 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에 기재되는 바와 같이, 특정 실시형태에서, 여기에 기재되는 것과 같이 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형될 수 있다. "얻다(acquire)"(얻다(obtain), 이루다(attain), 얻다(gain))라는 용어는, 추가 변형 전에 검출 가능한 임의의 α-갈락토시다아제 활성과 비교하여, 추가 변형이 폴리펩티드의 추가적인(증가되는, 향상되는) α-갈락토시다아제 활성을 보이도록 하는 경우, 또한 변형 전에 이러한 활성이 검출되지 않는 경우에, 추가 변형이 폴리펩티드의 α-갈락토시다아제 활성을 보이도록 하는 경우를 포함하여 폭넓게 이용된다. 또한, 본 명세서의 다른 곳에 기재되는 바와 같이, 추가 변형은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 171의 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 S에서 E로의 치환, 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 174의 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 A에서 L로의 치환을 수반할 수 있다.
이러한 실시형태에서, 이러한 추가 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 추가 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 α-갈락토시다아제 활성을 적어도 부분적으로 유지할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실시형태에서, 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 추가 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 α-갈락토시다아제의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 약 100% 보다 높게 유지할 수 있다.
예컨대, 더 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 α-갈락토시다아제 활성은 효소 분석법, 예컨대 Tajima et al. 2009, Am. J. Hum. Genet., 85(5): 569-80 및 Tomasic et al., 2010, J. Biol. Chem., 285(28):21560-6에 기재된 형광 분석법에 의해 측정될 수 있다. 간단히, 형광 분석법은 기질로서 4-메틸움버리페릴-α-D-갈락토피라노사이드(4MU-α-Gal)를 이용하여 37 ℃의 온도 및 pH 4.5에서 수행된다. 활성 α-갈락토시다아제가 존재해는 경우(예컨대 배양 배지에서), 4MU-α-Gal은 가수 분해되어, 4-메틸움벨리페릴(4-methylumbelliferyl)을 유리시킨다. 후자는 365 nm에서 여기 후 450 nm에서 측정될 수 있다.
특정 실시예에서, 인간 NAGAL의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 또는 5에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 NAGAL 효소 활성의 적어도 25%(예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%, 또는 100% 초과)를 가질 수 있다. 기능적 변이체 또는 단편은 일반적으로 항상은 아니지만 단백질의 연속 영역으로 이루어질 수 있고, 그 영역은 기능적 활성을 갖는다. 인간 NAGAL 폴리펩티드의 활성 부위의 아미노산 서열은 문헌에 기재되어 있다(Clark and Garman, 2009, J. Mol. Biol., 393(2): 435-447). 활성 부위를 형성하는 잔기는 제1 도메인에 위치하고, W33, D78, D79, Y119, C127, K154, D156, C158, S188, A191, Y192, R213, 및 D217을 포함한다(아미노산 넘버링은 메티오닌으로부터 시작하는 것으로 제공됨). 따라서, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 후보 기능적 변이체 또는 단편은 상동성 모델링(homology modelling) 및 컴퓨터 엔지니어링(computational engineering)과 같이 잘 알려진 방법을 이용하여 당업자에 의해 생성되어, 바람직한 효소 활성에 대해 시험된다.
특정 실시예에서, 여기에 기재되는 더 변형된 인간 NAGAL의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 SEQ ID NO: 6, 7, 8 또는 9에 제시된 더 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 α-갈락토시다아제 효소 활성의 적어도 25%(예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%, 또는 100% 초과)를 가질 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 추가 변형은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 171 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 S에서 E로의 치환, 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 174의 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 A에서 L로의 치환을 수반할 수 있다. 기능적 변이체 또는 단편은 일반적으로 항상은 아니지만 단백질의 연속 영역으로 이루어질 수 있고, 그 영역은 기능적 활성을 갖는다. 추가 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 후보 기능적 변이체 또는 단편은 상동성 모델링 및 컴퓨터 엔지니어링과 같이 잘 알려진 방법을 이용하여 당업자에 의해 생성되어, 바람직한 효소 활성에 대해 시험된다.
또한, 문맥에서 달리 명백한 경우가 아니면, 임의의 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 및 이의 변이체 또는 단편에 대한 언급은 일반적으로, 예컨대, 포스포릴화, 글리코실화, 리피드화(lipidation), 메틸화(methylation), 시스테인화(cysteinylation), 설폰화(sulphonation), 글루타티온화(glutathionylation), 아세틸화, 메티오닌의 메티오닌 설폭시드 또는 메티오닌 술폰으로의 산화 등을 포함하는 후-발현(post-expression) 변형을 포함하는 것과 같은 변이체 또는 단편, 단백질 또는 상기 핵산, 펩티드, 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
편리하게, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 특정 아미노산은 여기서 참조 인간 NAGAL 폴리펩티드, 보통 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 특정 아미노산에 "대응하는(corresponding to)" 것이라 할 수 있다.
당업자는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 2가지 형태의 아미노산 사이에서 일치성을 즉시 이해할 것이다. 실시예를 이용하여, 이러한 대응 아미노산은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 2가지 형태의 1차 아미노산 서열의 배열에서 동일한 위치에 위치할 수 있다. 서열 얼라인먼트(sequence alignment)는 서열 동일성의 범위의 결정과 연관하여 명세서의 다른 곳에 설명되는 바와 같이 생성될 것이다. 또한, 이러한 대응 아미노산은 인간 NAGAL 폴리펩티드의 2가지 형태의 2차 및/또는 3차 구조에서 함께 위치할 수 있다(co-locate).
편의를 위해, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 여기에 기재되는, 특히 본 발명의 제1 양태 및 제2 양태와 관련하여 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산은 "제1 아미노산" 또는 "상기 제1 아미노산"으로 여기서 언급될 수 있지만; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 여기에 기재되는, 특히 본 발명의 제1 양태 및 제2 양태와 관련하여 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산은 "제2 아미노산" 또는 "상기 제2 아미노산"으로 여기서 언급될 수 있다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본 맥락에서 "제1" "제2"라는 서수는 각각 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213 및 시스테인 326에 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편에서 특정 아미노산을 나타내는 역할을 하고, 더욱 특히 상기 아미노산 사이에서의 구별을 하게 해준다. 결과적으로, "제1" 및 "제2" 아미노산의 용어는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 1차 아미노산 서열에서 각각 첫번째, 두번째가 되는 아미노산을 말하는 것이 아니다.
"제1" 및 "제2" 아미노산의 위치는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산의 대응하는 위치를 언급함으로써 편리하게 정의될 수 있다. SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 1(즉 류신)의 위치는 위치 1을 의미한다.
"아미노산 치환" 또는 "아미노산 교환"의 용어는 여기서 상호 교환하여 사용될 수 있고, 아미노산 서열에서 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체, 또는 아미노산 서열에서 아미노산의 둘 이상의 아미노산의 단편으로의 대체를 포함한다.
여기서 사용되는 아미노산이라는 용어는 일반적으로 아민과 카르복실 작용기를 함유하는 분자를 말한다. 생화학 분야에서, 이 용어는 특히 화학식 H2NCHRCOOH를 갖는 알파-아미노산을 말하고, 여기서 R은 유기 치환기이다. 알파-아미노산에서, 아미노 및 카르복실레이트기는 동일한 탄소, 즉 α-탄소에 부착된다. 이 용어는 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산을 포함한다; 이들 아미노산은, 예컨대 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 포함하여 생체 내에서 후-번역적으로 변형되고; 다른 평범하지 않은 아미노산은 그것에 한정되지 않지만 2-아미노아디프산(2-aminoadipic acid), 하이드록시로신(hydroxylysine), 이소데스모신(isodesmosine), 노르발린(norvaline), 노르류신(norleucine) 및 오르니틴(ornithine)을 포함한다. 이 용어는 D- 및 L-아미노산을 포함한다. L-아미노산이 바람직하다.
그 결과, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제1 아미노산, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 하나 이상의 아미노산으로, 예컨대 1 내지 20 아미노산으로, 바람직하게는 1 내지 15 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 아미노산으로, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 아미노산으로, 예컨대 1 내지 4 아미노산, 1 내지 3 아미노산, 또는 1 내지 2 아미노산으로 치환될 수 있다.
그 결과, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제2 아미노산, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 하나 이상의 아미노산으로, 예컨대 1 내지 20 아미노산으로, 바람직하게는 1 내지 15 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 아미노산으로, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 아미노산으로, 예컨대 1 내지 4 아미노산, 1 내지 3 아미노산, 또는 1 내지 2 아미노산으로 치환될 수 있다.
그 결과, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제1 아미노산, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 하나 이상의 아미노산으로, 예컨대 1 내지 20 아미노산으로, 바람직하게는 1 내지 15 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 아미노산으로, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 아미노산으로, 예컨대 1 내지 4 아미노산, 1 내지 3 아미노산, 또는 1 내지 2 아미노산으로 치환될 수 있고; 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제2 아미노산, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 하나 이상의 아미노산으로, 예컨대 1 내지 20 아미노산으로, 바람직하게는 1 내지 15 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 아미노산으로, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 아미노산으로, 예컨대 1 내지 4 아미노산, 1 내지 3 아미노산, 또는 1 내지 2 아미노산으로 치환될 수 있다.
특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 다른 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 다른 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환되고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
따라서, 특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환된다.
특정 다른 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환된다.
특정 다른 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환된다.
특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고, 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고, 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 아스파라긴 이외에 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고, 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나의 아미노산으로 치환된다.
그 결과, 특정 특정 바람직한 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에 아스파라긴 이외에 아미노산(더욱 특히 하나의 아미노산)을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 시스테인이고, 시스테인은 시스테인 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 시스테인이고, 시스테인은 시스테인 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 시스테인 이외에 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 시스테인이고, 시스테인은 시스테인 이외에 하나의 아미노산으로 치환된다.
그 결과, 특정 특정 바람직한 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에 시스테인 이외에 아미노산(더욱 특히 하나의 아미노산)을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고, 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환되고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 시스테인이고, 시스테인은 시스테인 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고, 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 아스파라긴 이외에 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환되고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 시스테인이고, 시스테인은 시스테인 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 시스테인 이외에 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고, 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나의 아미노산으로 치환되고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 상기 제2 아미노산은 시스테인이고, 시스테인은 시스테인 이외에 하나의 아미노산으로 치환된다.
그 결과, 특정 특정 바람직한 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에 아스파라긴 이외에 아미노산(더욱 특히 하나의 아미노산), 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에 시스테인 이외에 아미노산(더욱 특히 하나의 아미노산)을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 상술한 바와 같이 L-아미노산은 바람직하게는 예상된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 상기 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 상술한 바와 같이 L-아미노산은 바람직하게는 예상된다.
특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 상술한 바와 같이 L-아미노산은 바람직하게는 예상된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 상기 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 상술한 바와 같이 L-아미노산은 바람직하게는 예상된다.
특정 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 상술한 바와 같이 L-아미노산은 바람직하게는 예상된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 상기 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 상기 아미노산 또는 아미노산들은 각각 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 상술한 바와 같이 L-아미노산은 바람직하게는 예상된다.
특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산으로 치환된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
바람직하게, 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 적어도 하나의 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산, 바람직하게는 아스파르트산이다.
그 결과, 특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)으로 치환된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산으로 치환된다.
그 결과, 특정 실시형태는 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
바람직하게, 양전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 적어도 하나의 아미노산은 아르기닌, 히스티딘 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이고, 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 적어도 하나의 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민, 바람직하게는 세린이다.
그 결과, 특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)으로 치환된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
그 결과, 특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 보다 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)으로 치환된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나 또는 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나 이상의 아미노산으로 치환되고;
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기를 함유하는, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 극성 비전하 측쇄기를 함유하는, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나 이상의 아미노산으로 치환된다.
특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나, 둘 또는 3개의, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환되고;
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기를 함유하는, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나, 둘 또는 3개의, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환되거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 그 중 적어도 하나가 극성 비전하 측쇄기를 함유하는, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나, 둘 또는 3개의, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산으로 치환된다.
특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산으로, 바람직하게는 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)으로 치환되고;
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산, 바람직하게는 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)으로 치환되거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산, 바람직하게는 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)으로 치환된다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나, 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산; 및
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나, 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나, 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나의 아미노산; 및
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나, 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 아르기닌, 히스티딘 또는 리신(바람직하게는 아르기닌)인 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
그 결과, 특정 실시형태는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나, 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 아스파르트산 또는 글루탐산(바람직하게는 아스파르트산)인 하나의 아미노산; 및
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나, 둘 또는 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 그 중 적어도 하나가 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나, 2개의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민(바람직하게는 세린)인 하나의 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
따라서, 특정 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 아스파르트산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 아르기닌으로 치환된다.
따라서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 아스파르트산, 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 아르기닌을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 제공된다.
특정 다른 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 제공되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 아르기닌으로 치환된다.
따라서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 아르기닌을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 제공된다.
특정 더욱 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 아스파르트산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 세린으로 치환된다.
따라서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 아미노산 위치에서 아스파르트산, 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 세린을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
특정다른 바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 세린으로 치환된다.
따라서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에서 세린을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된다(도 2).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 2와 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된다(도 3).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 3과 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된다(도 4).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 4와 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 4와 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된다(도 5).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 5와 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
여기서 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213 및 시스테인 326에 대응하는 아미노산 위치에 위치하는 아미노산들 사이에서 직접 또는 간접 상호 작용을 유리하게 포함할 수 있다.
따라서, 상술한 바와 같이, 제2 양태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 여기에 기재되는 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나;
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 여기에 기재되는 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나;
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 여기에 기재되는 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 제1 아미노산을 치환하는 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 제2 아미노산을 치환하는 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나와 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있다.
특정 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환될 수 있다.
특정 다른 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환될 수 있다.
특정 다른 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환될 수 있고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환될 수 있다.
특정 다른 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환될 수 있다.
특정 다른 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환될 수 있다.
특정 다른 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환될 수 있고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환될 수 있다.
특정 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 아스파라긴 이외에 하나 이상의 아미노산으로, 바람직하게는 아스파라긴 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 아스파라긴 이외에 하나의 아미노산으로 치환된 아스파라긴일 수 있다.
특정 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 시스테인 이외에 하나 이상의 아미노산으로, 바람직하게는 시스테인 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 시스테인 이외에 하나의 아미노산으로 치환된 시스테인일 수 있다.
특정 실시형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산은 아스파라긴 이외에 하나 이상의 아미노산으로, 바람직하게는 아스파라긴 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 아스파라긴 이외에 하나의 아미노산으로 치환된 아스파라긴일 수 있고; SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산은 시스테인 이외에 하나 이상의 아미노산으로, 바람직하게는 시스테인 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로, 바람직하게는 시스테인 이외에 하나의 아미노산으로 치환된 시스테인일 수 있다.
"상호작용", "상호작용하는", "상호작용할 수 있는" 또는 유사 용어는 분자들 사이 또는 분자들 내에 존재하는 비공유 상호작용을 말한다.
더욱 특히 여기서 이 용어는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 사이에, 더욱 특히 아미노산들의 측쇄 사이에, 더욱 일반적으로 2개의 아미노산의 측쇄 사이에서의 비공유 상호작용을 말한다.
비공유 상호작용에 참여하기 위해, 아미노산, 예컨대 2개의 아미노산, 더욱 특히 아미노산들의 측쇄는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 3차원 구조에서 공간적으로 근접할 수 있다. 실시예를 이용하여, 아미노산들의 측쇄 사이의 거리, 더욱 특히 측쇄들 사이에서 직접 상호작용을 기저에 이루는 원자 또는 작용기 사이의 거리는 이온 상호작용의 경우에 많아야 약 5.0 Å, 바람직하게는 많아야 약 4.5 Å, 더욱 바람직하게는 많아야 약 4.0 Å (e.g., 4.0 Å, 3.9 Å, 3.8 Å, 3.7 Å, 3.6 Å, 3.5 Å, 3.4 Å, 3.3 Å, 3.2 Å 3.1 Å, 3.0 Å, 이하)일 수 있다. 실시예를 이용하여, 아미노산들의 측쇄 사이의 거리, 더욱 특히 측쇄들 사이에서 직접 상호작용을 기저에 이루는 원자 또는 작용기 사이의 거리는 수소 결합 상호 작용의 경우에 많아야 약 4.0 Å(주개-받개 거리), 예컨대 2.2 Å 내지 2.5 Å, 또는 2.5 Å 내지 3.2 Å, 또는 3.2 Å 내지 4.0 Å (주개-받개 거리)일 수 있다. 실시예를 이용하여, 아미노산들의 측쇄 사이의 거리, 더욱 특히 측쇄들 사이에서 직접 상호작용을 기저에 이루는 원자 또는 작용기 사이의 거리는 반데르발스 상호 작용의 경우에 사실상 각각의 상호 작용 원자 또는 작용기의 반데르발스 반지름의 총 합 이하일 수 있다.
아미노산들 사이의 직접 상호작용의 언급은 아미노산, 특히 아미노산의 측쇄, 더욱 특히 측쇄의 특정 원자 또는 작용기가 서로, 더욱 특히 이온 상호작용, 또는 수소 결합 상호작용, 또는 서로 사이에서 반데르발스 상호작용을 형성함으로써 상호 작용하는 것을 의미한다.
아미노산들 사이의 직접 상호작용의 언급은 아미노산, 특히 아미노산의 측쇄, 더욱 특히 측쇄의 특정 원자 또는 작용기가 그들 사이에 있는 하나 이상의 분자와 상호작용할 수 있다. 실시예를 이용하여, 2개의 아미노산 측쇄 각각은 용매, 예컨대 물의 동일 분자와 수소 결합을 형성하여 직접 상호작용에 참여할 수 있다.
그 결과, 특정 실시형태에서, 상호작용은 이온 상호작용 또는 수소결합 상호작용 또는 반데르발스 상호작용일 수 있고, 이 용어는 해당 기술 분애에서 이해될 것이다. 설명을 이용하여, 한정되지 않고, 이온 상호작용은 반대로 하전된 이온들 사이에서 정전기적 인력을 포함하는 비공유 상호작용 또는 결합을 말하고; 수소 결합 상호작용은 N, O 또는 F와 같은 높은 음전성 원자에 결합되는 수소 원자가 그것에 가까운 다른 높은 음전성 원자(예컨대 N, O 또는 F)에 부착되는 경우에 발생하는, 극성 기들 사이에서 정전기적 인력을 포함하는 비공유 상호작용 또는 결합을 말하고; 반데르발스 상호작용은 런던 분산력(London Dispersion Forces) 및 이중극자-이중극자 인력을 포함한다.
특정 실시형태에서, 이온 상호작용은 적어도 하나의 이온쌍의 형성을 포함한다.
"이온쌍(ion pair)"이라는 용어는 일반적으로 그들 사이의 정전기적 인력에 의해 함께 일시적으로 결합되는 양이온 및 음이온으로 이루어지는 하전된 입자(보통 하전된 원자 또는 분자)의 듀플렉스를 말한다.
바람직하게는, 여기서, "이온쌍"이라는 용어는 산성 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기(basic amino acid residue)의 질소 원자(N 원자)와 카르복실레이트 산소 원자(O 원자) 사이의 정전기적 상호 작용을 말한다. 염기성 아미노산 잔기는 아르기닌, 히스티딘 또는 리신일 수 있다. 산성 아미노산 잔기는 아스파르트산(또는 아스파르테이트) 또는 글루탐산(또는 글루타메이트)일 수 있다.
염기성 아미노산 잔기에 있어서, 히스티딘의 ND1 원자 및/또는 NE2 원자, 아르기닌의 NH1 원자 및/또는 NH2 원자, 및/또는 리신의 NZ 원자는 이온쌍의 형성에 관련될 수 있다. 산성 아미노산 잔기에 있어서, 아스파르테이트의 OD1 원자 및/또는 OD2 원자, 및/또는 글루타메이트의 OE1 원자 및/또는 OE2 원자는 이온쌍의 형성에 관련될 수 있다.
특정 실시형태에서, 이온쌍은 완전한 이온쌍 또는 불완전한 이온쌍일 수 있다.
"완전한 이온쌍(complete ion pair)"의 용어는 이온쌍을 말하고, 1) 각각의 아미노산 잔기의 원자 모두(즉, 산성 아미노산 잔기 및 염기성 아미노산 잔기), 또는 2) 산성 아미노산 잔기로부터의 원자 모두(예컨대 아스파르트산의 2개의 카르복실레이트 산소 원자) 및 하나의 원자(예컨대 리신의 질소 원자) 또는 염기성 아미노산 잔기로부터의 원자 모두(예컨대 아르기닌의 2개의 질소 원자), 또는 3) 염기성 아미노산 잔기로부터의 원자 모두(예컨대 아르기닌의 2개의 질소 원자) 및 산성 아미노산으로부터의 하나의 원자(아스파르트산의 하나의 카르복실레이트 산소 원자) 또는 원자 모두(예컨대 아스파르트산의 2개의 카르복실레이트 산소 원자)는 이온쌍에 관련되거나 참여한다.
"불완전한 이온쌍"의 용어는 이온쌍을 말하고, 각각의 아미노산 잔기 중 오직 하나의 원자(즉 산성 아미노산 잔기 및 염기성 아미노산 잔기)는 이온쌍에 관련되거나 참여한다. 이온쌍은 염 브릿지, 질소-산소(N-O) 브릿지, 탄소-탄소(C-C) 브릿지, 또는 기하학적 기준에 기초하여 더 긴 범위의 이온쌍으로 분류될 수 있다(Kumar and Nussinov, 2002, Biophys. J., 83(3): 1595-612).
이온쌍의 존재는 핵자기 공명(NMR) 분광학 또는 x선 결정학과 같은 기술에 알려진 바와 같은 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 결정 구조 가시화 및 분자 디자인 프로그램을 이용한 단백질 구조 분석은 각각의 원자들 사이의 접촉을 간파시켜준다. 이온쌍과 같은 접촉의 검출은 주로 원자 사이의 거리 및 기하학적 형태에 의해 구동된다.
"염 브릿지(salt bridge)"의 용어는 이온쌍을 말하며, 하전된 아미노산 잔기의 측쇄 원자의 중심은 2.5 Å 내지 4.0 Å의 거리 내이고, 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복실레이트 산소 원자 및 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신의 측쇄 질소 원자의 적어도 하나의 쌍은 4.0 Å의 거리 내이다.
"C-C 브릿지(C-C bridge)"의 용어는 이온쌍을 말하며, 하전된 아미노산 잔기의 측쇄 원자의 중심은 2.5 Å 내지 4.0 Å의 거리 내이고, 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복실레이트 산소 원자와 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신의 측쇄 질소 원자 사이의 거리는 4.0 Å의 거리 내이다.
"N-O 브릿지(N-O bridge)"의 용어는 이온쌍을 말하며, 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복실레이트 산소 원자와 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신의 측쇄 질소 원자 중 적어도 하나의 쌍은 4.0 Å의 거리 내이고, 하전된 아미노산 잔기의 측쇄 원자의 중심 사이의 거리는 4.0 Å 초과이다.
"더 긴 범위의 이온쌍(longer-range ion pair)"의 용어는 이온쌍을 말하고, 측쇄 질소와 산소 원자 사이에서, 또한 하전된 아미노산 잔기의 측쇄 원자의 중심들 사이에서의 거리는 4.0 Å 이상이다.
특정 실시형태에서, 이온쌍은 염 브릿지, N-O 브릿지, C-C 브릿지, 또는 더 긴 범위의 이온쌍일 수 있다. 바람직하게는, 이온쌍은 염 브릿지 또는 N-O 브릿지이다. 더욱 바람직하게는, 이온쌍은 염 브릿지이다.
특정 실시형태에서, 하전된(즉 염기성 및 산성) 아미노산 잔기의 측쇄 원자의 중심들 사이의 거리는 NMR 분광기에 의해 측정되는 바와 같이, 많아야 5.0 Å, 바람직하게는 많아야 4.0 Å, 더욱 바람직하게는 2.5 Å 내지 4.0 Å일 수 있다.
특정 실시형태에서, 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 카르복실레이트 산소 원자와 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신의 측쇄 질소 원자의 적어도 하나의 쌍 사이의 거리는 NMR 분광기에 의해 측정되는 바와 같이, 많아야 4.0 Å, 바람직하게는 2.5 Å 내지 4.0 Å일 수 있다.
특정 실시형태에서, 이온쌍은 분자 내 또는 분자 사이의 이온쌍일 수 있다. Clark and Garman 2009를 참조하는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 성숙한 인간 NAGAL 폴리펩티드는 호모다이머를 형성한다. 그 결과, 분자 내 이온쌍은 동일한 NAGAL 폴리펩티드의 제1 도메인과 제2 도메인 사이에, 즉 하나 및 동일한 NAGAL 모노머의 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 형성되는 이온쌍을 말한다. 분자 사이의 이온쌍은 NAGAL 호모다이머에서 NAGAL 폴리펩티드 중 하나의 제1 도메인과 NAGAL 호모다이머에서 다른 NAGAL 폴리펩티드의 제2 도메인 사이에, 즉 2개의 별개의 NAGAL 모노머의 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 형성되는 이온쌍을 말한다. 바람직하게는 이온쌍은 분자 내 이온쌍일 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 이온쌍은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 하나 이상(바람직하게는 하나, 둘 또는 3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개, 보다 더욱 바람직하게는 하나)의 아미노산으로 구성되는 아미노산의 음전하를 띄는 측쇄기와, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 하나 이상(바람직하게는 하나, 둘 또는 3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개, 보다 더욱 바람직하게는 하나)의 아미노산으로 구성되는 아미노산의 양전하를 띄는 측쇄기 사이에 형성될 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 이온쌍은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 하나 이상(바람직하게는 하나, 둘 또는 3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개, 보다 더욱 바람직하게는 하나)의 아미노산으로 구성되는 아스파르트산 또는 글루탐산의 음전하를 띄는 측쇄기와, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 하나 이상(바람직하게는 하나, 둘 또는 3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개, 보다 더욱 바람직하게는 하나)의 아미노산으로 구성되는 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 양전하를 띄는 측쇄기 사이에 형성될 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 이온쌍은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산을 치환하는 하나 이상(바람직하게는 하나, 둘 또는 3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개, 보다 더욱 바람직하게는 하나)의 아미노산으로 구성되는 아스파르트산의 음전하를 띄는 측쇄기와, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산을 치환하는 하나 이상(바람직하게는 하나, 둘 또는 3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개, 보다 더욱 바람직하게는 하나)의 아미노산으로 구성되는 아르기닌의 양전하를 띄는 측쇄기 사이에 형성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 수소 결합 상호작용은 직접 상호작용일 수 있거나 하나 이상의 용매 분자, 바람직하게는 하나 이상의 물 분자를 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 제3 양태는 제1 도메인과 제2 도메인을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 제1 도메인이 제2 도메인과 적어도 하나의(추가적인) 이온쌍을 형성할 수 있도록 변형된다.
여기에 의도되는 "제1 도메인이 제2 도메인과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있도록 변형된다"라는 용어는, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 임의의 변형 또는 변형들(변경(들), 변화(들), 적용(들))을 포함하고, 이는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 형성되는 적어도 하나의 이온쌍의 능력을 가능하게 한다. 실시예를 이용하여, 한정되지 않고, 이러한 변형(들)은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 1차 아미노산 서열을 변경, 및/또는 예컨대 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 하나 이상의 아미노산 측쇄를 화학적 반응에 의해 변경하는 것을 수반할 수 있다.
특히 바람직하게는, 여기에 의도되는 "제1 도메인이 제2 도메인과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있도록 변형된다"라는 용어는, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 말하고, 이의 1차 아미노산 서열은 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 형성되는 적어도 하나의 이온쌍에 허용되는 것과 같이 변형된다.
실시예를 이용하여, 변형(들)은 오직 제1 도메인에, 또는 오직 제2 도메인에, 또는 제1 도메인과 제2 도메인에 있을 수 있다.
예컨대, 여기서 사용되는 "변형된(modified)"의 용어는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산(잔기)이 다른 아미노산(잔기)으로 치환; 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 서열에 적어도 하나의 아미노산(잔기)의 첨가; 또는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산(잔기)의 제거; 또는 이들의 조합을 말하는 것일 수 있다.
특정 실시형태에서, 여기에 의도되는 변형은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 이로 필수적으로 이루어지는, 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 여기에 의도되는 변형은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 2개의 아미노산 치환을 포함하는, 이로 필수적으로 이루어지는, 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 여기에 의도되는 변형은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제1 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 이로 필수적으로 이루어지는, 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 여기에 의도되는 변형은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제2 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 이로 필수적으로 이루어지는, 또는 이로 이루어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 여기에 의도되는 변형은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제1 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산 치환; 및 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제2 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 이로 필수적으로 이루어지는, 또는 이로 이루어질 수 있다.
돌연변이는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 서열의 변형을 야기하여, 제1 도메인은 상기 폴리펩티드에 대한 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)에 포함되는 일반적으로 핵산 잔기에 있는 여기에 의도되는 바와 같이 제2 도메인과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있다. 여기서 사용되는 "개방형 해독틀" 또는 "ORF"는 번역 개시 코돈(translation initiation codon)으로 시작하고, 그 자체로 알려진 번역 종결 코돈으로 정지(closing)되고, 임의의 내부의 프레임 내 번역 종결 코돈을 함유하지 않고, 잠재적으로 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 코딩한 뉴클레오티드 트리플렛(코돈)의 연속(succession of coding nucleotide triplets (codons))을 말한다.
인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형하는 것과 같이 의도된 효과를 얻기 위한 임의의 형태의 돌연변이가 여기에 고려된다. 예컨대, 적합한 돌연변이는 핵산 결실, 삽입, 및/또는 치환을 포함할 수 있다. "핵산 결실(nucleic acid deletion)"의 용어는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 연속 뉴클레오티드가 핵산으로부터 제거, 즉 결실되는 돌연변이를 말한다. "핵산 삽입(nucleic acid insertion)"의 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 연속 뉴클레오티드가 핵산으로 첨가, 즉 삽입되는 돌연변이를 말한다. "핵산 치환(nucleic acid substitution)"의 용어는 핵산 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 다른 뉴클레오티드에 의해 각각 독립적으로 대체, 즉 치환되는 돌연변이를 말한다.
"제1 도메인은 제2 도메인과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있다"는 설명은 "제2 도메인은 제1 도메인과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있다" 및 "제1 도메인과 제2 도메인은 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있다"라는 설명과 상호 교환하여 사용될 수 있고, 이온쌍에 관련시키는 제1 도메인의 아미노산 및 제2 도메인의 아미노산의 능력, 더욱 특히 이온쌍에 관련시키는 제1 도메인의 아미노산 측쇄 및 제2 도메인의 측쇄의 능력을 말한다.
특정 실시형태에서, 제1 도메인은 (β/α)8 배럴(barrel)을 포함하고, 제2 도메인은 2β 시트에서 8개의 역평행의 β 가닥을 포함한다.
특정 실시형태는 (β/α)8 배럴 및 8개의 역평행의 β 가닥을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 말하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 변형되어, (β/α)8 배럴은 8개의 역평행의 β 가닥과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있다.
특정 실시형태에서, 이온쌍은 제1 아미노산 및 제2 아미노산에 의해 형성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이온쌍은 제1 아미노산 및 제2 아미노산에 의해 형성될 수 있고, 제1 도메인은 제1 아미노산을 포함하고, 제2 도메인은 제2 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이온쌍은 제1 아미노산 및 제2 아미노산에 의해 형성될 수 있고, 제1 아미노산은 제1 도메인의 일부이고, 제2 아미노산은 제2 도메인의 일부이다.
편의를 위해, 여기에 기재되는, 특히 본 발명의 제3 양태와 관련하여 기재되고, 이온쌍의 형성에 참여하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산은 여기서 "제1 아미노산" 또는 "상기 제1 아미노산"으로, 또한 "제2 아미노산" 또는 "상기 제2 아미노산"으로 언급될 수 있다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본 맥락에서 "제1" "제2"라는 서수는 각각 이온쌍의 형성에 참여하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편에서 특정 아미노산을 나타내는 역할을 하고, 더욱 특히 상기 아미노산 사이에서의 구별을 하게 해준다. 결과적으로, "제1" 및 "제2" 아미노산의 용어는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 1차 아미노산 서열에서 각각 첫번째, 두번째가 되는 아미노산을 말하는 것이 아니다.
이온쌍이 제1 아미노산 및 제2 아미노산으로 형성되는 경우, 제1 아미노산 및/또는 제2 아미노산의 위치는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 대응하는 위치를 참조함으로써 편리하게 정의될 수 있다. SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 1(즉, 류신)의 위치는 위치 1을 의미한다.
특정 실시형태에서, 이온쌍의 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 208 내지 218 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서, 이온쌍의 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 321 내지 331 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
실시예를 이용하여, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 변형은 이온쌍의 제1 아미노산을 도입을 수반할 수 있지만, 이온쌍의 제2 아미노산은 변형되지 않은 인간 NAGAL에 이미 존재하고; 또는 이온쌍의 제2 아미노산의 도입을 수반할 수 있지만, 이온쌍의 제1 아미노산은 변형되지 않은 인간 NAGAL에 이미 존재하고; 또는 이온쌍의 제1 아미노산 및 제2 아미노산 모두의 도입을 수반할 수 있다.
실시예를 이용하여, 제1 아미노산의 도입은 상기 제1 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열에 의해 인간 NAGAL의 하나 이상의(예컨대 2, 3, 4 또는 5 또는 10까지) 연속 아미노산의 치환을 수반할 수 있고, 또는 제1 아미노산의 도입은 상기 제1 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 인간 NAGAL에 첨가하는 것을 수반한다. 제1 아미노산을 포함하는 아미노산 서열은, 예컨대 2, 3, 4 또는 5 또는 10까지의 아미노산 길이일 수 있다. 독립적으로, 실시예를 이용하여, 제2 아미노산의 도입은 상기 제2 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열에 의해 인간 NAGAL의 하나 이상의(예컨대 2, 3, 4 또는 5 또는 10까지) 연속 아미노산의 치환을 수반할 수 있고, 또는 제2 아미노산의 도입은 상기 제2 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 인간 NAGAL에 첨가하는 것을 수반한다. 제2 아미노산을 포함하는 아미노산 서열은, 예컨대 2, 3, 4 또는 5 또는 10까지의 아미노산 길이일 수 있다.
특정 실시형태에서, 이온쌍은 제1 아미노산 및 제2 아미노산에 의해 형성될 수 있고, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 208 내지 218 사이의 위치에 대응하는 변이된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및")
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 321 내지 331 사이의 위치에 대응하는 변이된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
여기에 사용되는 "SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 xx 내지 xx+n 사이의 위치"의 설명에서, "사이(between)"의 용어는 설명된 아미노산 xx와 xx+n의 위치를 포함하는 것을 의미한다(xx 및 n은 양의 정수임).
그 결과, 여기에 사용되는 "SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 xx 내지 xx+n 사이의 위치"의 설명은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 xx, 아미노산 xx+1, 아미노산 xx+2, 아미노산 xx+3, 아미노산 xx+4…, 또는 아미노산 xx+n의 위치를 말한다.
예컨대, 여기에 사용되는 "SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 208 내지 218 사이의 위치"의 설명은 SEQ ID NO: 1에서 설명하는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 208, 아미노산 209, 아미노산 210, 아미노산 211, 아미노산 212, 아미노산 213, 아미노산 214, 아미노산 215, 아미노산 216, 아미노산 217, 또는 아미노산 218의 위치를 말한다.
예컨대, 여기에 사용되는 "SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 321 내지 331 사이의 위치"의 설명은 SEQ ID NO: 1에서 설명하는 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 321, 아미노산 322, 아미노산 323, 아미노산 324, 아미노산 325, 아미노산 326, 아미노산 327, 아미노산 328, 아미노산 329, 아미노산 330, 또는 아미노산 331의 위치를 말한다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 209 내지 217 사이의 위치, 바람직하게는 아미노산 210 내지 216 사이의 위치, 더욱 바람직하게는 아미노산 211 내지 215 사이의 위치, 보다 더욱 바람직하게는 아미노산 212 내지 214 사이의 위치, 가장 바람직하게는 아미노산 213의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및")
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 322 내지 330 사이의 위치, 바람직하게는 아미노산 323 내지 329 사이의 위치, 더욱 바람직하게는 아미노산 324 내지 328 사이의 위치, 보다 더욱 바람직하게는 아미노산 325 내지 327 사이의 위치, 가장 바람직하게는 아미노산 326의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 209 내지 217 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 322 내지 330 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 210 내지 216 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 323 내지 329 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 211 내지 215 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 324 내지 328 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 212 내지 214 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 325 내지 327 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 표 1에 기재된 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및")
제2 아미노산은 표 1에 기재된 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAx"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAy"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 AA208, AA209, AA210, AA211, AA212, AA213, AA214, AA215, AA216, AA2017, 또는 AA218의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 AA 321, AA322, AA323, AA324, AA325, AA326, AA327, AA328, AA329, AA330, 또는 AA331의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
"제1 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAx"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및 제2 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAy"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다"는 설명은 표 1에 기재되는 제1 아미노산과 제2 아미노산의 아미노산 위치의 모든 조합과 같은 임의의 하나 이상의 조합, 특히 "AAx + AAy"의 표현으로 표 1의 각 필드에 구체화된 조합을 말한다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및/또는
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다(바람직하게는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다).
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다(바람직하게는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있다).
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고, 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, 더욱 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산이고, 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 포함할 수 있고, 바람직하게는 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고, 더욱 바람직하게는 제2 아미노산은 아르기닌이고; 또는
제1 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 포함할 수 있고, 바람직하게는 제1 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고, 제2 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 포함할 수 있고, 바람직하게는 제2 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이다.
특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 산성 아미노산 잔기일 수 있고, 제2 아미노산은 염기성 아미노산 잔기일 수 있고; 또는 제1 아미노산은 염기성 아미노산 잔기일 수 있고, 제2 아미노산은 산성 아미노산 잔기일 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있고, 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신일 수 있고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신일 수 있고, 제2 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 아스파르트산일 수 있고, 제2 아미노산은 아르기닌일 수 있고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌일 수 있고, 제2 아미노산은 아스파르트산일 수 있다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 208 내지 218 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 321 내지 331 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및
제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고, 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고; 또는 제1 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고, 제2 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고; 바람직하게는 제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하고, 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAx"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAy"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및
제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고, 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고; 또는 제1 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고, 제2 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고; 바람직하게는 제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하고, 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및
제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고, 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고; 또는 제1 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고, 제2 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있고; 바람직하게는 제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하고, 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 208 내지 218 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 321 내지 331 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및
-제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고, 제2 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고; 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAx"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAy"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및
제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고, 제2 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고; 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및
제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이고, 제2 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고; 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, 제2 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신이다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 208 내지 218 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 321 내지 331 사이의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및
제1 아미노산은 아스파르트산이고, 제2 아미노산은 아르기닌이고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌이고, 제2 아미노산은 아스파르트산이고; 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산이고, 제2 아미노산은 아르기닌이다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAx"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및/또는(바람직하게는 "및") 제2 아미노산은 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 "AAy"의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고; 및
제1 아미노산은 아스파르트산이고, 제2 아미노산은 아르기닌이고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌이고, 제2 아미노산은 아스파르트산이고; 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산이고, 제2 아미노산은 아르기닌이다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고(바람직하게는 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치할 수 있고); 및
제1 아미노산은 아스파르트산이고, 제2 아미노산은 아르기닌이고; 또는 제1 아미노산은 아르기닌이고, 제2 아미노산은 아스파르트산이고; 바람직하게는 제1 아미노산은 아스파르트산이고, 제2 아미노산은 아르기닌이다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치한 아스파르트산일 수 있고; 및
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326의 위치에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치한 아르기닌일 수 있다.
특정 실시형태에서,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치되는 아스파르트산일 수 있고; 및
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326을 치환하고 이에 대응하는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치되는 아르기닌일 수 있다.
특정 실시형태는 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 포함하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고,
제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213의 위치에 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치한 아스파르트산일 수 있고; 및
제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326의 위치에 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 아미노산 위치에 위치한 아르기닌일 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 아미노산은 제1 도메인의 일부이고, 제2 아미노산은 제2 도메인의 일부이다.
특정 실시형태에서, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 안정성은 비변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편에 대응하는 안정성과 비교하여 적어도 1% 증가할 수 있다. 예컨대, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 안정성은 대응하는 비변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 안정성과 비교하여 적어도 2%, 적어도 3%, 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 증가할 수 있다.
여기서 사용되는 "대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편" 또는 "대응하는 비변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편"은 여기서 기재되는 것과 같이 변형되지 않는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 말한다. 대응하는 (비변형된) 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은, 그러나, 예컨대 α-갈락토시다아제 활성을 얻는 것과 같은 다른 방법으로 변경될 수 있다. 예컨대, 대응하는 (비변형된) 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 171 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 S에서 E로의 치환, 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 174 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 A에서 L로의 치환을 포함할 수 있다.
인간 NAGAL 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성은 특정 기간 동안(예컨대 16시간 동안), 특정 온도에서(예컨대 37 ℃에서), 특정 조건 하에서(예컨대 다른 조성 및 pH를 갖는 완충액에서(예컨대 10 mM 소듐 시트레이트 완충액(sodium citrate buffer) (pH 4.0), 10 mM 소듐 아세테이트 완충액(sodium acetate buffer) (pH 4.5 및 5.0), 10 mM 시트르산/소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer) (pH 5.5, 6.0 및 6.5), 또는 10 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0, 7.5 및 8.0)), 다른 pH를 갖는 완충액에서(예컨대, pH 4.5 및 pH 7.0), 또는 혈장에서), 단백질 또는 폴리펩티드를 배양하고, 시간과의 함수로 NAGAL 활성을 측정하는(예컨대, 본 명세서의 다른 곳에 기재되는 바와 같이 MU-α-D-N-아세틸갈락토사민을 이용한 형광 분석에 의해) 것을 포함하는 방법에 의해 측정될 수 있다.
대조군으로서, 대응하는 비변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 사용될 수 있다. 0시간에 효소 활성(예컨대, 여기에 기재되는 바와 같이 기질로서 MU-α-D-N-아세틸갈락토사민을 이용한 형광 분석에 의해 측정되는 2 mmol/h/ml의 NAGAL 활성)은 각각의 조건 하에서 100%로 세팅될 수 있다. 각각의 효소의 안정성은 특정 배양 시점에서 효소 활성의 값 대 0시간의 값의 비로 산출 및 표현될 수 있다. 마찬가지로, 안정성은 α-갈락토시다아제 활성의 보존을 측정함으로써 결정될 수 있고, 변형 또는 비변형된 인간 NAGAL 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형된다.
대안적으로 또는 추가로, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편과 같은 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성은 DSF(differential scanning fluorimetry)라고도 하는 열 이동 분석(thermal shift assay)에 의해 예측될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편과 같은 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성은 단백질 또는 폴리펩티드의 용융 온도(Tm)를 측정함으로써 예측될 수 있다.
변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편과 같은 단백질 또는 폴리펩티드의 "용융 온도(Tm)"는 가역적 열 변성 동안 50%의 단백질 또는 폴리펩티드가 불활성화되는 온도를 말한다.
단백질 또는 폴리펩티드의 용융 온도는 원평광 이색성(CD) 분광법을 이용하여 측정될 수 있다. "원평광 이색성 분광법(Circular dichroism spectroscopy)"의 용어는 일반적으로 단백질 또는 단백질 폴딩의 2차 구조를 연구하기 위한 툴을 말한다. 원평광 이색성 분광법은 원편광된 빛의 흡수를 측정한다. 단백질에서, 알파 헬릭스 및 베타 헬릭스와 같은 2차 구조가 키랄이므로, 이러한 광을 흡수한다. 이러한 광의 흡수는 단백질의 폴딩 정도의 마커로 역할을 할 수 있다. CD는 형태의 변화를 보여주기 위한 중요한 툴이다. 기술은 온도와의 함수로 흡수의 변화를 측정함으로써 단백질의 2차 구조가 어떻게 변화하는지를 연구하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법에서, CD는 쉽게 얻어질 수 없는 단백질에 대한 중요한 열역학 정보(예컨대 변성의 엔탈피 및 깁스 자유 에너지)를 드러낼 수 있다.
특정 실시형태에서, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 용융 온도는 대응하는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편과 비교하여 적어도 2.0 ℃ 증가할 수 있다. 예컨대, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 용융 온도는 대응하는 비변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 용융 온도와 비교하여 적어도 2.0 ℃, 적어도 3.0 ℃, 적어도 4.0 ℃, 적어도 5.0 ℃, 적어도 10.0 ℃, 적어도 15.0 ℃, 적어도 20.0 ℃, 적어도 25.0 ℃, 또는 적어도 30.0 ℃ 증가할 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 안정성은 원평광 이색성과 같은 적합한 방법에 의해 검출할 수 있는 단백질 폴딩을 증진 또는 생성하기 위해 증가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 안정성은 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 검출 또는 쿠마시 염색과 같은 적합한 방법에 의해 검출 가능한 재조합 단백질 발현을 생성하기 위해 증가될 수 있다.
그 결과, 제4 양태는 대응하는 비변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 안정성과 비교하여 증가된 안정성(예컨대 상기 설명되는 바와 같이)을 보이도록 변형되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공한다.
특정 실시형태에서, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2 (도 2에 도시되는 바와 같이)에 제시된다. SEQ ID NO: 2에 제시되는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 213(즉 아스파르트산)의 위치는 도 2에 나타낸다(언더라인됨). SEQ ID NO: 2에 제시되는 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 326(즉 아르기닌)의 위치는 도 2에 나타낸다(볼드 언더라인됨).
특정 실시형태에서, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 서열 동일성을 보인다.
특정 실시형태에서, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 2와 적어도 91% 서열 동일성, 예컨대 SEQ ID NO: 2와 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 보일 수 있다.
특정 실시형태에서, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 기능적으로 활성인 변이체의 아미노산 서열을 변형함으로써 얻어질 수 있어, 제1 도메인은 제2 도메인과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 SEQ ID NO: 1과 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 기능적으로 활성인 변이체를 변형함으로써 얻어질 수 있어, 제1 도메인은 제2 도메인과 적어도 하나의 이온쌍을 형성할 수 있다.
본 명세서의 이하 부분은 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 용도와 관련된 주제를 추가로 기재 및 개발한다. "여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편" 또는 유사어는 여기에 기재되는 임의의 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 포함하고, 더욱 특히 상기 설명되는 바와 같은 제1, 제2, 제3 및 제4 양태 중 임의의 하나 이상 또는 전체 및 이의 실시형태에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
특정 실시형태에서, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형될 수 있다.
예컨대, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 171 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 S에서 E로의 치환, 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 174 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 A에서 L로의 치환을 더 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시한다(도 6).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 6과 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된다(도 7).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 7과 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 7과 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8에 제시된다(도 8).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 8과 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9에 제시된다(도 9).
바람직한 실시형태는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 제공하고, 기능적으로 활성인 변이체는 SEQ ID NO: 9와 적어도 90% 서열 동일성을 보이고, 예컨대 기능적으로 활성인 변이체는 선호도의 오름차순으로 SEQ ID NO: 9와 90%, 적어도 91%(예컨대 91%), 적어도 92%(예컨대 92%), 적어도 93%(예컨대 93%), 적어도 94%(예컨대 94%), 적어도 95%(예컨대 95%), 적어도 96%(예컨대 96%), 적어도 97%(예컨대 97%), 적어도 98%(예컨대 98%), 또는 적어도 99%(예컨대 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 서열 동일성을 보인다.
특정 실시형태에서, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 C- 또는 N- 말단에 또는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 양 말단에 하나 이상의 결합 펩티드를 선택적으로 이용하여 연결되는 하나 이상의 이종 아미노산 서열과 같은 하나 이상의 이종(논-NAGAL) 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서,
이종 아미노산 서열은 만노오스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptor)를 표적하는 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 표적하는 리셉터와 같은 리셉터 표적 아미노산 서열(receptor targeting amino acid sequence)일 수 있고; 또는
이종 아미노산 서열은 야로위아(Yarrowia ) Lip2 prepro, 야로위아(Yarrowia ) Lip2 pre, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ) α-메이팅 인자, 야로위아(Yarrowia) XPR2 prepro, 또는 야로위아(Yarrowia ) XPR2 pre 서열과 같은 분비 신호 서열일 수 있거나, 이를 포함할 수 있고; 또는
이종 아미노산 서열은 야로위아(Yarrowia ) Lip2 prepro, 야로위아(Yarrowia ) Lip2 pre, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ) α-메이팅 인자, 야로위아(Yarrowia) XPR2 prepro, 또는 야로위아(Yarrowia ) XPR2 pre 서열과 같은 분비 신호 서열을 포함할 수 있고, 분비 신호 서열에 C-말단으로 2개의 X-Ala 반복을 더 포함할 수 있고; 또는
이종 아미노산 서열은 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 정제를 허용할 수 있고; 또는
이종 아미노산 서열은 진단적 또는 검출 가능한 마커로 사용하기 위해 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이종 아미노산 서열은 포유류 세포로 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 수송 효능을 향상시키기 위해 이용된다. 예컨대, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 만노오스-6-포스페이트 리셉터에 결합하는 인간 인슐린 유사 성장 인자 II의 도메인 또는 우로키나제 타입 플라스미노겐 활성자 리셉터, 표적 세포의 표면 상의 리셉터의 세포 외 도메인을 결합하는 표적 도메인, 세포 외 리셉터의 리간드에 용융될 수 있다(예컨대, 인간 인슐린 유사 성장 인자의 아미노산 1-67 또는 1-87; 적어도 아미노산 48-55; 적어도 아미노산 8-28 및 41- 61; 또는 적어도 아미노산 8-87; 인간 인슐린 유사 성장 인자 II의 서열 변이체(예컨대 R68A) 또는 인간 인슐린 유사 성장 인자의 절단된 형태(예컨대 위치 62에서 C-말단으로 절단된)). 이종 아미노산 서열은 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에서 용융될 수 있다. 일 실시형태에서, 펩티드 테그는 스페이서에 의해 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단으로 용융된다(예컨대 5-30 아미노산 또는 10-25 아미노산).
특정 실시형태에서, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 하나 이상의 N-결합된 글리칸(N-글리칸)을 포함할 수 있다. 실시예를 이용하여, 인간 NAGAL 폴리펩티드는 5개의 N-결합 글리코실화 부위(N124, N177, N201, N359, 및 N385; 개시 메티오닌으로부터 시작하는 아미노산 넘버링)를 함유하는 것이 Clark and Garman 2009 (supra)에 의해 보고되었다. 그 결과, 특정 실시형태에서 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 상기 부위에 대응하는 임의의 하나 이상의 Asn 잔기와 같은 하나, 둘, 셋, 넷 다섯개의 N-글리칸을 수반할 수 있다. 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 호모다미어를 형성하는 경우, 모노머 중 적어도 하나는 하나 이상의 N-결합 글리칸을 포함할 수 있고, 예컨대 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯개의 N-글리칸을 수반할 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 하나 이상의 N-글리칸을 포함할 수 있고, 상기 하나 이상의 N-글리칸은 포스포릴화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 하나 이상의 N-글리칸을 포함할 수 있고, 상기 N-글리칸의 수의 40% 이상은 포스포릴화될 수 있다. 예컨대, 상기 N-글리칸의 수의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이 포스포릴화될 수 있다. N-글리칸은 일반적으로 하나 또는 2개의 포스페이트기를 수반한다. 포스포릴화 N-글리칸의 언급은 모노- 및 디-포스포릴화 N-글리칸을 포함한다. 그 결과, N-글리칸의 수의 40% 이상(예컨대, 수의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상)은 적어도 하나의 포스페이트기를 수반할 수 있다. 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 호모다이머를 형성하는 경우, 적어도 하나의 모노머는 하나 이상의 N-결합 글리칸을 포함할 수 있고, 그 중 하나 이상은 포스포릴화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 하나 이상의 포스포릴화된 N-글리칸은 언캡핑될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 포스포릴화된 N-글리칸의 수의 40% 이상이 언캡핑될 수 있다. 예컨대, 상기 포스포릴화된 N-글리칸의 수의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이 언캡핑될 수 있다.
이와 관련하여, "언캡핑된(uncapped)"은 특히 포스포-6-만노오스 부위(phospho-6-mannose moiety)의 포스페이트기가 다른 부위, 예컨대 만노오스-1-일 부위(mannos-1-yl moiety)에 공유 결합되지 않는 것을 의미한다. 실시예를 이용하여, 균류 세포와 같은 특정 유기체는 포스포릴화된 N-글리칸을 합성할 수 있고, 포스페이트 부위는 만노오스 잔기로 "캡핑"되어 만노오스-1-포스포-6-만노오스기를 형성한다. 이러한 환경에서, "언캡핑"은 만노오스-1-일 잔지를 제거하여 포스페이트 부위를 노출시키는 것을 말하는 것일 수 있다. N-글리칸이 하나 이상의 포스페이트기를 함유하는 경우, 상기 포스페이트기 중 적어도 하나가 언캡핑되면 N-글리칸은 "언캡핑"되는 것을 의미하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포스페이트기는 언캡핑될 수 있다. 언캡핑된 포스페이트기를 함유하는 N-글리칸은 캡핑된 포스페이트기(들)을 함유하는 N-글리칸보다 포유류 세포에서 만노오스-6-포스페이트 리셉터에 사실상 더 잘 결합하여, 효율을 증가시켜, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 포유류 세포의 내부에, 결과적으로 리소좀에 전송된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 상기 포스포릴화된 N-글리칸은 탈만노실화(demannosylated)될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 포스포릴화된 N-글리칸의 수의 40% 이상이 탈만노실화될 수 있다. 예컨대, 상기 포스포릴화된 N-글리칸의 수의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이 탈만노실화될 수 있다. 이와 관련하여, "탈만노실화"는 언더라잉 만노오스가 포스포릴화되는 경우 말단 알파-1,2-만노오스를 포함하여, 포스페이트-함유 N-글리칸의 말단 알파-1,2-만노오스 부위의 적어도 가수분해를 말하는 것일 수 있다. 그 결과, 이는 말단 만노오스가 되는 6 위치에서 포스페이트를 함유하는 만노오스를 생성한다. 특정 실시형태에서, "탈만노실화"는 포스페이트-함유 N-글리칸의 말단 알파-1,2 만노오스, 알파-1,3 만노오스 및/또는(바람직하게는 "및") 알파-1,6 만노오스 결합 또는 부위의 가수분해를 말하는 것일 수 있다. 더욱 특히, 포스포릴화된(모노- 또는 디-포스포릴화된) N-글리칸에서, 탈만노실화는 언더라잉 만노오스가 포스포릴화되는 경우, N-글리칸의 논-포스포릴화된 팔(non-phosphorylated arm)의 가수 분해 및 말단 알파-1,2-만노오스의 가수분해를 포함할 수 있다. 이 경우에, 탈만노실화의 최종 가수분해 생성물은 ManPMan3GlcNAc2 및 (ManP)2Man5GlcNAc2을 포함하고, 이로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다(Man은 만노오스 잔기를 의미하고, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민 잔기를 의미함). 언캡핑되는 포스페이트기(들)를 함유하는 탈만노실화되는 N-글리칸은 언캡핑되는 포스페이트기(들)을 함유하는 논-탈만노실화되는 N-글리칸보다 포유류 세포 상에 만노오스-6-포스페이트 리셉터에 사실상 더 결합하여, 효율을 증가시켜, 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 포유류의 세포의 내부에, 결과적으로 리소좀에 전송된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 상기 포스포릴화된 N-글리칸은 언캡핑되고 탈만노실화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 포스포릴화된 N-글리칸의 수의 40% 이상은 언캡핑되고 탈만노실화될 수 있다. 예컨대, 상기 포스포릴화된 N-글리칸의 수의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상은 언캡핑되고 탈만노실화될 수 있다. 탈만노실화 및 언캡핑되는 최종 가수분해 산물은 PMan3GlcNAc2 및 P2Man5GlcNAc2을 포함하고, 이로 필수적으로 이루어지고, 이로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다(Man은 만노오스 잔기를 의미하고, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민 잔기를 의미함).
그 결과, 특정 실시형태에서, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 하나 이상의 N-글리칸, 예컨대 하나, 둘, 셋, 넷 또는 5개의 N-글리칸을 포함할 수 있고, 상기 N-글리칸의 수의 40% 이상, 예컨대 상기 N-글리칸의 수의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상이 포스포릴화되고, 언캡핑되고, 탈만노실화된다. 실시예를 이용하여, N-글리칸의 수의 40% 이상, 예컨대 상기 N-글리칸의 수의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상은 PMan3GlcNAc2 및 P2Man5GlcNAc2를 포함하고, 이로 필수적으로 이루어지고, 이로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
포스포릴화된 N-글리칸을 함유하는 당단백질은 탈만노실화될 수 있고, 만노오스-1-포스포-6-만노오스 결합 또는 부위를 함유하는 포스포릴화된 N-글리칸을 함유하는 당단백질은 (i) 만노오스-6-포스페이트에 만노오스-1-포스포-6-만노오스 결합 또는 부위를 가수분해 및 (ii) 말단 알파-1,2 만노오스, 알파-1,3 만노오스 및/또는 알파-1,6 만노오스 결합 또는 부위를 가수분해할 수 있는 만노시다아제(mannosidase)와 당단백질을 접촉함으로써 언캡핑 및 탈만노실화될 수 있다. 이러한 만노시다아제의 비제한적인 예는 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis) (잭 빈(Jack bean)) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 만노시다아제 (예컨대, AMS1)를 포함한다. 잭 빈 및 AMS1 만노시다아제는 패밀리 38 글리코사이드 가수분해 효소이다.
잭 빈 만노시다아제는, 예컨대 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 제품의 암모늄 설페이트 현탁액(카달로그 No. M7257) 및 프로테오믹스 등급 제재(proteomics grade preparation) (카달로그 No. M5573)로서 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 시판 제재는 포스페이타아제(phosphatases)와 같은 오염물을 제거하기 위해, 예컨대 겔 여과 크로마토그래피에 의해 더 정제될 수 있다.
야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제는 재조합 생성될 수 있다. AMS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 WO 2013/136189에서 SEQ ID NO: 5에 제시된다.
일부 실시형태에서, 언캡핑 및 탈만노실화 단계는 2개의 다른 효소에 의해 촉진된다. 예컨대, 만노오스-1-포스포-6 만노오스 결합 또는 부위의 언캡핑은 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans )(예컨대 CcMan5)로부터 만노시다아제를 이용하여 수행될 수 있다. CcMan5 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 WO 2013/136189에서 SEQ ID NO: 2에 제시된다. 단일 서열을 함유하는 CcMan5 폴리펩티드의 아미노산 서열은 WO 2013/136189에서 SEQ ID NO: 3에 제시된다. 단일 서열 없이 CcMan5 폴리펩티드의 아미노산 서열은 WO 2013/136189에서 SEQ ID NO: 4에 제시된다. 일부 실시형태에서, CcMan5 폴리펩티드의 생물학적으로 활성 단편이 사용된다. 예컨대, 생물학적으로 활성인 단편은 WO 2013/136189에서 SEQ ID NO: 4에 제시된 아미노산 서열의 잔기 1-774를 포함할 수 있다. 또한, WO 2011/039634를 참조한다. CcMan5 만노시다아제는 패밀리 92 글리코사이드 가수분해 효소이다.
언캡핑된 당단백질 또는 당단백질의 분자 복합체의 탈만노실화는 아스페르질루스 사토이(Aspergillus satoi, As)(아스페르질루스 포에니시스(Aspergillus phoenicis)라고도 알려진)로부터 만노시다아제 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(예컨대, CcMan4)로부터의 만노시다아제를 이용하여 촉진될 수 있다. 아스퍼길러스 사토이 만노시다아제는 패밀리 47 글리코사이드 가수 분해 효소이고, CcMan4 만노시다아제는 패밀리 92 글리코사이드 가수 분해 효소이다. 러스 사토이 만노시다아제는 WO 2013/136189에서 진뱅크 수탁번호 BAA08634.1에서 SEQ ID NO: 6에 제시된다. CcMan4 폴리펩티드의 아미노산 서열은 WO 2013/136189의 도 8에서 시작된다.
또한, 언캡핑된 당단백질 또는 당단백질의 분자 복합체의 탈만노실화는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 또는 야로위아 리포리티카 만노시다아제(예컨대 AMS1)와 같은 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소로부터 만노시다아제를 이용하여 촉진될 수 있다. 예컨대, CcMan5는 당단백질(또는 당단백질의 분자 복합체) 상에 만노오스-1-포스포-6 만노오스 부위를 언캡핑하기 위해 이용될 수 있고, 잭 빈 만노시다아제는 언캡핑된 당단백질(또는 당단백질의 분자 복합체)을 탈만노실화 하기 위해 이용될 수 있다.
탈만노실화된 당단백질, 또는 언캡핑된 및 탈만노실화된 당단백질을 생성하기 위해, 만노오스-1-포스포-6 만노오스 결합 또는 부위를 함유하는 당단백질은 적합한 본래의 또는 재조합되어 생성되는 만노시다아제를 함유하는 세포 용해물 및/또는 적합한 만노시다아제를 갖는 적합한 조건 하에서 접촉된다. 적합한 만노시다아제는 상기 기재된다. 세포 용해물은 균류 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포를 포함하여 임의의 유전적으로 조작된 세포로부터일 수 있다. 동물 세포의 비제한적인 예는 선충, 곤충, 식물, 새, 파충류, 및 마우스, 레트, 토끼, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이, 염소, 돼지, 소, 말, 고래, 원숭이, 또는 인간과 같은 포유류를 포함한다.
당단백질과 정제된 만노시다아제 및/또는 세포 용해물의 접촉 시에, 만노오스-1-포스포-6-만노오스 결합 또는 부위는 포스포-6-만노오스로 가수 분해될 수 있고, 글리칸을 함유하는 이러한 포스페이트의 말단 알파-1,2 만노오스, 알파-1,3 만노오스 및/또는 (바람직하게는 "및") 알파-1,6 만노오스 결합 또는 부위는 언캡핑 및 탈만노실화된 당단백질을 생성하기 위해 가수분해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나의 만노시다아제는, 언캡핑 및 탈만노실화 단계에서 촉진하도록 이용된다. 일부 실시형태에서, 하나의 만노시다아제는 언캡핑 단계를 촉진하기 위해 이용되고, 다양한 만노시다아제는 탈만노실화 단계를 촉진하기 위해 이용된다. 만노시다아제에 의한 처리 후, 당단백질은 분리될 수 있다.
용해물에서 만노시다아제 활성의 온전함 또는 활성을 보존하는 세포 용해물을 얻기 위한 적합한 방법은 세포 용해물에서 N-글리코실화 활성의 변화를 보존 또는 최소화하는 뉴클레아제, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제를 포함하여 적절한 완충액 및/또는 억제제의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 억제제는, 예컨대 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA), 에틸렌글리콜-비스(P-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 어프로티닌(aprotinin), 류펩틴(leupeptin), 안티펜(antipain) 등, 및 포스파타아제 억제제, 예컨대 포스페이트, 소듐 플루오라이드, 바나듐산염(vanadate) 등을 포함한다. 효소적 활성을 함유하는 용해물을 얻기 위해 적절한 완충액 및 조건은, 예컨대 Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia, (1999)에 기재되어 있다.
세포 용해물은 적절하게 간섭 물질의 존재를 제거 또는 최소화 하기 위해 더 가공될 수 있다. 필요에 따라, 세포 용해물은 초원심세포분획법(subcellular fractionation) 및 이온 교환, 소수성 및 역상, 크기 배제, 친밀성, 소수성 전하-유도 크로마토 그래피와 같은 크로마토그래피 기술 등을 포함하여 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 분획될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물은 전체 세포 기관이 온전하고 및/또는 기능적으로 남아 있도록 제조될 수 있다. 예컨대, 용해물은 하나 이상의 온전한 조면 소포체, 온전한 활면 소포체, 또는 온전한 골지체(Golgi apparatus)를 함유할 수 있다. 온전한 세포 기관을 함유하는 용해물을 제조하고, 세포 기관의 기능을 시험하는 적합한 방법은, 예컨대 Moreau et al., 1991, J. Biol. Chem., 266(7):4329-4333; Moreau et al., 1991, J. Biol. Chem., 266(7):4322-4328; Rexach et al., 1991, J. Cell Biol., 114(2):219-229; 및 Paulik et al., 1999, Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273에 기재된다.
언캡핑된 및 탈만노실화된 포스포릴화된 N-글리칸을 함유하는 당단백질과 포유류 세포의 접촉 시에, 당단백질은 포유류 세포(예컨대 인간 세포)의 내부에 전송될 수 있다. 언캡핑된, 탈만노실화되지 않은 포스포릴화된 N-글리칸을 갖는 당단백질은 포유류 세포 상에 사실상 만노오스-6-포스페이트 리셉터를 결합하지 않고, 세포의 내부에 효율적으로 전송되지 않는다. 그러나, 이러한 당단백질이, 언더라잉 만노오스가 포스포릴화되는 경우에 말단 알파-1,2 만노오스 결합 또는 부위를 가수분해 할 수 있는 만노시다아제와 접촉하는 경우, 탈만노실화되는 당단백질은 세포의 내부에 효율적으로 전달되고, 포유류의 세포 상에 만노오스-6-포스페이트 리셉터를 사실상 결합하도록 생성된다. 언캡핑되지만 포스포릴화 N-글리칸을 탈만노실화 하지 않는 효소를 함유하는 제재(예컨대, 재조합 숙주 세포 또는 무세포 제재)는 포스포릴화된 N-글리칸을 탈만노실화 하는 효소로 오염될 수 있는 것을 이해해야 한다. 이러한 제재와 접촉한 후 당단백질 샘플은 언캡핑 및 탈만노실화되는 오직 언캡핑되는 일부 포스포릴화된 N-글리칸 및 기타를 갖는 단백질 분자를 함유할 수 있다. 자연적으로, 언캡핑되는 및 탈만노실화되는 포스포릴화 N-글리칸을 함유하는 단백질 분자는 만노오스-6-포스페이트 리셉터와 사실상 결합할 수 있다.
따라서, 이 명세서는 포유류 세포 상에 만노오스-6-포스페이트 리셉터를 결합하지 않는 제1 형태에서, 포유류 세포 상에 만노오스-6-포스페이트 리셉터를 결합한 제2 형태로, 당단백질, 특히 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 전환하는 방법을 제공한다. 제1 형태에서, 당단백질은 1 위치에서 결합되는 하나 이상의 만노오스 잔기에서 6 위치에서 포스페이트 잔기를 함유하는 만노오스 잔기를 함유하는 하나 이상의 N-글리칸을 포함한다. 이러한 방법에서, 당단백질의 제1 형태는 말단 만노오스 잔기를 탈만노실화 하는 만노시다아제와 접촉하여 말단 만노오스가 되는 6 위치에서 포스페이트를 함유하는 만노오스를 생성한다. 일부 실시형태에서, 만노시다아제는 언캡핑 및 탈만노실화 활성을 갖는다(예컨대, 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 또는 야로위아 리포리티카(AMS1 만노시다아제)). 일부 실시형태에서, 만노시다아제는 언캡핑 활성을 갖지 않는다(예컨대, 아스페르질루스 사토이로부터의 만노시다아제 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스로부터의 만노시다아제(예컨대 CcMan4)).
세포의 내부에 당단백질의 전송은 세포 흡수 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 예컨대, 포유류 세포 및 언캡핑된 및 탈만노실화된 포스포릴화 N-글리칸을 함유하는 당단백질이 배양될 수 있고, 그 후 세포는 세정 및 용해된다. 세포 용해물은 당단백질, 특히 변형된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 존재에 대해, 예컨대 웨스턴 블롯에 의해, 또는 세포 용해물에서 NAGAL 활성 또는 α-Gal A 활성에 의해 평가될 수 있다. 예컨대, 흡수는 NAGAL 또는 α-Gal A 활성에서 섬유아세포 결핍을 평가할 수 있다. 세포 내의 NAGAL 활성은 본 명세서의 다른 곳에 기재되는 바와 같이 기질로서 MU-α-D-N-아세틸갈락토사민을 이용하여 평가될 수 있다. 세포 내 α-Gal A 활성은 본 명세서의 다른 곳에 기재되는 바와 같이 기질로서 4MU-α-Gal을 이용하여 평가될 수 있다.
본 발명자는, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편이 효소 보충 요법과 같은 치료에, 예컨대 다른 치료 옵션이 이용 가능하지 않은 파브리병 및 쉰들러병 또는 칸자키병과 같은 리소좀 저장병의 치료에 유리하게 이용될 수 있는 것을 깨달았다. "효소 보충 요법"은 특정 효소가 부족하거나 없는 대상에 효소를 대체하는 의학 치료를 말한다.
따라서, 다른 양태는 치료에 사용되는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편에 관한 것이다.
다른 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편에 관한 것이고, 특히 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 파브리병의 치료 방법에 사용하기 위한 또는 파브리병의 치료(본 명세서에서 치료적 및/또는 예방적 수단을 포함함)에 사용되는 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형된다. 이러한 치료는 일반적으로 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 비경구 투여, 바람직하게는 정맥 내 투여(예컨대 투입)를 포함할 수 있다.
따라서, 관련된 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 용도를 제공하고, 특히 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 파브리병의 치료약의 제조를 위해 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형된다. 이러한 치료는 일반적으로 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 비경구 투여, 바람직하게는 정맥 내 투여(예컨대 투입)를 포함할 수 있다.
관련된 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 인간 환자에게 파브리병의 치료 방법을 제공하고, 특히 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형된다. 이러한 치료 방법은 일반적으로 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 비경구 투여, 바람직하게는 정맥 내 투여(예컨대, 투입)을 포함할 수 있다.
"파브리병(Fabry disease)", "파브리병(Fabry's disease)", "앤더슨-파브리병(Anderson-Fabry disease)", "미만성구간혈관각화종(angiokeratoma corporis diffusum)", 및 "알파-갈락토시다아제 A 결핍(alpha-galactosidase A deficiency)"의 용어는 상호 교환하여 이용될 수 있고, 리소좀 효소 α-갈락토시다아제 A (α-Gal A)의 결핍에 의해 야기되는 X-결합 방법으로 유래되는 희귀 유전적 리소좀 저장병을 말한다. 효소 α-Gal A는 당지질로부터 말단 α-D-갈락토오스 잔기를 쪼갠다. α-Gal A 결핍은 혈관 내피 세포 및 다른 조직에서 글리코스핑고리피드, 주로 글라보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide, Gb3)의 침투성 및 생애 리소좀 축적을 발생시킨다. 이는 주로 신장, 심장, 및 뇌혈관계에 영향을 주는 다기관 병리학을 야기한다. 파브리병에 걸린 환자는 위장 질환, 통증, 뇌졸중, 및 심장병 및 콩팥 결함, 및 종종 뇌졸중, 심장병, 또는 신장 고장으로부터의 합병증의 조기 사망을 포함하는 증상 과다로부터 고통을 겪는다. 파브리병의 추정 진단을 위해 제공할 수 있는 신호 및 증상은 각화 혈관종 및 나이테 각막(corneal verticillata)을 포함한다. 조기 신장 질환, 조기 뇌졸중 및 초기 심장 질환과 같은 증상을 가진 가족 구성원에 대해 가족 역사를 기록하면 추가 지원이 제공될 수 있다. 혈장, 백혈구, 배양된 피부 섬유아세포, 생검 조직 또는 건조 혈액과 같은 생물학적 샘플에서 α-갈락토시다아제 A (α-Gal A) 효소 활성이 결핍되었는지를 검사하여 남성에게 확실한 진단을 할 수 있다. 여성에서, 돌연변이 또는 결합 분석은 이형 접합 돌연변이 보균자(carrier)를 식별할 수 있다. 다수의 여성 보균자 (증상이 있거나 없는)는 정상보다 낮은 수준의 α-Gal A 활성 및/또는 특징적인 각막 혼탁을 갖는다.
다른 양태는 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료방법에 사용하기 위한, 또는 쉰들러병 또는 칸자키병의 (본 명세서에서 치료적 및/또는 예방적 수단을 포함함) 치료에 사용하기 위한, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편에 관한 것이다. 이러한 치료는 일반적으로 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 비경구 투여, 바람직하게는 정맥 내 투여(예컨대 투입)을 포함할 수 있다.
따라서, 관련 양태는 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료약의 제조를 위해 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 용도를 제공한다. 이러한 치료는 일반적으로 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 비경구 투여, 바람직하게는 정맥 내 투여(예컨대 투입)을 포함할 수 있다.
관련된 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 인간 환자에게 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법을 제공한다. 이러한 치료 방법은 일반적으로 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 비경구 투여, 바람직하게는 정맥 내 투여(예컨대 투입)를 포함할 수 있다.
"쉰들러병", "칸자키병" 및 "알파-N-아세틸갈락토사미니다아제 결핍"의 용어는 상호 교환하여 사용될 수 있고, 효소 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL)의 결핍에 의해 야기되는 희귀 선천성 리소좀 저장병을 말한다. 효소 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제의 결핍은 염색체 22 상에 NAGA 유전자에서 변이에 기인할 수 있어, 당단백질의 과도한 리소좀 축적을 생성시킨다. NAGAL 효소의 결핍은 신체에서 글리코스핑고리피드의 축적을 발생시킨다. 각각이 그 자체의 독특한 증상을 갖는 3개의 주요 타입의 질병(즉 타입 I 소아 형태, 타입 II 성인 형태, 및 타입 III)이 존재한다.
언급되는 경우를 제외하고, "피험자(subject)" 또는 "환자"는 상호 교환적으로 사용되고, 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 보다 바람직하게는 척추 동물, 더욱 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 영장류를 말하며, 특히 인간 환자 및 비인간 포유 동물 및 영장류를 포함한다. 바람직한 환자는 인간 피험자이다.
"포유류"의 용어는 그것에 한정되지 않지만 인간, 가축, 농경용 가축, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 반려 동물 및 실험실 동물, 예컨대 마우스, 레트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 기니피그, 게르빌루스쥐, 소, 양, 말, 돼지 및 영장류, 예컨대 원숭이 및 유인원(예컨대 침팬지, 개코원숭이 또는 원숭이)을 포함하여 분류되는 임의의 동물을 포함한다. 특히 바람직하게는 양쪽 성별 및 이들의 모든 연령 카테고리를 포함하는 인간 환자이다.
여기서 사용되는 "질병에 걸린 환자(diseased subject)"의 용어는 파브리병을 갖거나 갖는다고 진단된 환자, 또는 쉰들러병 또는 칸자키병을 갖거나 갖는다고 진단된 환자를 말한다. 여기서 사용되는 "치료가 필요한 환자(a subject in need of treatment)"는 제공된 질병, 특히 파브리병, 또는 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료에 유용한 환자를 포함한다. 이러한 환자는 제한 없이 상기 질병으로 진단된 사람, 상기 질병으로 발전하기 쉬운 사람(예컨대 α-Gal A (파브리병) 또는 NAGAL (쉰들러병 또는 칸자키병)을 인코딩하는 유전자의 변이에 기인하여) 및/또는 상기 질병이 예방된 사람을 포함할 수 있다.
"치료하는(treat)" 또는 "치료(treatment)"의 용어는 이미 발전된 질병 또는 질환의 치료적 치료, 예컨대 이미 발전된 파브리병, 또는 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료, 및 예방 또는 방지 수단을 포함하고, 목적은 파브리병, 또는 쉰들러병 또는 칸자키병의 발생, 발전 및 진행을 억제하기 위해 바람직하지 않은 고통의 발생 가능성을 억제 또는 줄이는 것이다. 유리한 또는 바람직한 임상 결과는 제한 없이 하나 이상의 증상 또는 하나 이상의 생물학적 마커의 완화, 질병 범위의 감소, 질병의 안정화된(즉 나빠지지 않은) 상태, 질병 진행이 지연 또는 느려짐, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 등을 포함할 수 있다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않는 경우 기대되는 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다.
"예방적 유효량(prophylactically effective amount)"의 용어는 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 탐색되는 장애의 개시를 환자에게서 억제 또는 지연하는 활성 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 말한다. 여기서 사용되는 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 탐색되는 환자에 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 말하며, 이는 그 중에서도 치료될 질병 또는 질환의 증상을 경감하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 여기에 기재되는 약제학적 제형을 위해 치료학적으로 및 예방학적으로 효과적인 양을 결정하기 위해 해당 기술 분야에 알려진다.
투여될 임의로 하나 이상의 다른 활성 화합물과의 조합하여 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 복용량 또는 양은 개인의 경우에 따라 달라지고, 관례적으로 최적의 효과를 달성하기 위해 개인의 환경에 적용되어야 한다. 따라서, 단위 복용량 및 처방은 치료할 질병의 특성 및 중증도, 및 피험자의 종, 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 식이 요법, 투여 형태 및 시간, 면역 상태 및 치료할 사람 또는 동물의 개별 반응성, 사용되는 화합물의 효능, 대사 안정성 및 작용 지속 시간과 같은 요소, 치료가 급성 또는 만성 또는 예방인지의 여부, 또는 다른 활성 화합물이 본 발명의 제제에 추가하여 투여되는 지의 여부에 따라 달라진다. 치료적 효능을 최적화 하기 위해, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 우선 다른 투여 방침으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 조직에서 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 수준은, 예컨대 제공되는 치료 방침의 효능을 결정하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 적절한 스크리닝 분석을 이용하여 모니터링될 수 있다.
복용 빈도는 의사(예컨대, 의사 또는 간호사)의 기술 및 임상학적 판단 내이다. 일반적으로, 투여 방침은 최적의 투여 파라미터를 확립할 수 있는 임상학적 시도에 의해 확립된다. 그러나, 의사는 상기 인자 중 하나 이상, 예컨대 환자의 연령, 건강, 체중, 성별 및 의학적 상태에 따라 이러한 투여 방침을 변경할 수 있다. 복용 빈도는 치료가 예방적이거나 치료적인지에 따라 달라질 수 있다.
여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 독성 및 치료적 효능은, 예컨대 세포 배양액 또는 실험 동물에서 공지된 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 절차는, 예컨대 LD50 (집단의 50%까지 치사량) 및 ED50 (집단의 50%가 치료학적으로 유효한 양)를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 독성과 치료학적 효과 사이의 복용 비율은 치료학적 지표이고, LD50/ED50 비율로 나타낼 수 있다. 높은 치료학적 지표를 보여주는 약제학적 조성물이 바람직하다. 독성 역효과를 보이는 약제학적 조성물이 이용될 수 있지만, 보통의 세포(예컨대 비표적 세포)에 잠재적인 손상을 최소화 하기 위해 영향을 받는 조직 부위에 이러한 화합물을 표적하는 전달 시스템을 고안하도록 케어가 취해져야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어지는 데이터는 적절한 피험자(예컨대 인간 환자)에 사용하기 위한 복용 범위를 제형하는데 사용될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물의 복용양은 일반적으로 독성이 적거나 없는 ED50를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 복용량은 사용되는 투여 루트 및 적용되는 복용 형태에 따라 달라지는 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 여기에 기재되는 사용되는 약제학적 조성물에 대해서, 치료학적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 최초에 추정될 수 있다. 복용량은 세포 배양액에서 결정되는 바와 같이 IC50(즉, 증상의 최대의 반의 억제를 달성하는 약제학적 조성물의 농도)을 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위를 얻기 위해 동물 모델에서 제형될 수 있다. 이러한 정보는 인간에 유용한 양을 더욱 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
제한 없이, 질병의 유형 및 중증도에 따라 달라지는, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 일반적인 복용량(예컨대, 일반적인 일일 복용량 또는 일반적인 간헐적인 복용량, 예컨대 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 1.5주마다, 매2주, 매3주, 매달 또는 기타 동안 일반적인 복용량)은 상술한 인자에 따라 달라지는 복용량 당 약 10 μg/kg 내지 약 100 mg/kg의 환자의 체중의 범위 일 수 있고, 예컨대 복용량 당 약 100 μg/kg 내지 약 10 mg/kg 환자의 체중, 또는 복용량 당 약 200 μg/kg 내지 약 2 mg/kg 환자의 체중의 범위일 수 있고, 예컨대 매일 또는 간헐적으로, 바람직하게는 간헐적으로, 더욱 바람직하게는 매주, 보다 더욱 바람직하게는 격주, 보다 더욱 바람직하게는 매달 또는 그 이하로 자주 복용량 당 약 100 μg/kg, 약 200 μg/kg, 약 300 μg/kg, 약 400 μg/kg, 약 500 μg/kg, 약 600 μg/kg, 약 700 μg/kg, 약 800 μg/kg, 약 900 μg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.6 mg/kg, 약 1.7 mg/kg, 약 1.8 mg/kg, 약 1.9 mg/kg, 또는 약 2.0 mg/kg 환자의 체중일 수 있다. 실시예를 이용하여, 제한 없이, 인간 NAGAL은 약 0.5 mg/kg, 또는 약 0.6 mg/kg, 또는 약 0.7 mg/kg, 또는 약 0.8 mg/kg, 또는 약 0.9 mg/kg, 또는 약 1.0 mg/kg, 또는 약 1.5 mg/kg, 또는 약 2.0 mg/kg, 또는 약 2.5 mg/kg, 또는 약 3.0 mg/kg, 또는 약 3.5 mg/kg, 또는 약 4.0 mg/kg, 예컨대 약 0.6-0.8 mg/kg 또는 약 3-4 mg/kg, 바람직하게는 격주로 투여될 수 있다.
다른 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 다른 양태는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터 또는 여기에 정의되는 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"약제학적 조성물" 및 "약제학적 제형"의 용어는 상호 교환하여 사용될 수 있다. 여기에 기재되는 약제학적 제형은 여기에 특히 구체화되는 성분 이외에 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 복용 형태 및 활성 성분의 동일성에 따라 달라지고, 당업자에 의해 선택될 수 있다(예컨대 Handbook of Pharmaceutical Excipients 7th Edition 2012, eds. Rowe et al.을 참조하여). 여기에 사용되는 "담체" 또는 "부형제"는 임의의 및 모든 용매, 완충액(예컨대 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수), 가용화제, 콜로이드, 분산 매체, 운반체, 필러, 킬레이트제(예컨대 EDTA 또는 글루타티온), 아미노산(예컨대 글리신), 단백질, 붕괴제, 바인더, 윤활제, 습윤제, 에멀젼화제, 감미료, 착색제, 향미료, 방향제, 증점제, 디포 효과를 얻기 위한 제제(agents for achieving a depot effect), 코팅제, 항매제(antifungal agents), 보존제, 안정화제, 산화방지제, 긴장성 조절제(tonicity controlling agents), 흡수 지연제(absorption delaying agents) 등을 포함한다. 허용되는 희석제, 담체 및 부형제는 일반적으로 수용자의 항상성(예컨대 전해질 균형)에 역효과를 주지 않는다. 이러한 매체 및 약제학적 활성 물질을 위한 제제의 용도는 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하고, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 활성을 간섭해서는 안된다. 허용되는 담체는 생체에 적합하고, 불활성이거나 생흡수성염, 완충제, 올리고- 또는 다당류, 폴리머, 점도-개선제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 담체는 생리적 식염수(0.15 M NaCl, pH 7.0 내지 7.4)이다. 다른 예시적인 담체는 50 mM 소듐 포스페이트, 100 mM 소듐 클로라이드이다.
담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 약제학적 조성물은 비경구로 허용되는 수용액의 형태일 수 있고, 이는 발열인자(pyrogen)가 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는다.
약제학적 제형은 대략의 생리학적 조건에 요구되는 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조절 및 완충제, 보존제, 복합제, 긴장성 조절제, 습윤제 등, 예컨대 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 포스페이트, 소듐 히드록시드, 하이드로겐 클로라이드, 벤질 알콜, 파라벤, EDTA, 소듐 올레이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 제형의 pH 값은 생리학적 pH 범위 내이고, 예컨대 특히 제형의 pH는 약 5 내지 약 9.5, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 8.5, 보다 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 이러한 약제학적 제형의 제조는 당업자의 보통 기술 내이다.
약제학적 조성물의 투여는 전체 또는 국부적일 수 있다. 약제학적 조성물은 비경구 및/또는 경구 투여에 적합하도록 제형될 수 있다. 특정 투여 양상은 피하, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 경피성, 척추 강내(intrathecal), 경구, 직장, 구강의, 국부의, 코의, 눈의, 관절 내, 동맥 내, 지주막하, 기관지, 림프의, 질의 및 자궁 내 투여를 포함한다.
투여는 약제학적 조성물의 덩어리의 주기적 주입에 의할 수 있거나, 외부(예컨대 IV 백) 또는 내부(예컨대 생체부식성 이식, 인공 장기, 또는 이식된 숙주 세포의 콜로니)의 저장소로부터 정맥 내 또는 복강 내 투여에 의해 중단되지 않거나 연속적일 수 있다. 약제학적 조성물의 투여는 적합한 전달 수단, 예컨대: 펌프, 마이크로캡슐화, 연속 방출 폴리머 이식, 마크로캡슐화, 주입을 이용하여, 피하에, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 또는 다른 적합한 부위에, 또는 경우 투여로, 캡슐, 액체, 타블렛, 필, 또는 방출 지연된 제형을 이용하여 달성될 수 있다.
비경구 전달 시스템의 예는 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머 입자, 삼투압 펌프, 이식 가능한 투입 시스템, 펌프 전달, 캡슐화 세포 전달, 리포좀 전달, 니들-전달 주입, 니들 없는(needle-less) 주입, 네뷸라이저, 분무기, 전기천공, 및 경피 패치를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 제형은 편리하게 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 살균 수용성 제제를 함유하고, 이는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장이다(예컨대 생리적 식염수 용액). 제형은 단위 복용량 또는 다중 복용 형태로 제시될 수 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 캡슐, 카세제(cachet), 타블렛, 또는 캔디(lozenges)와 같은 개별 단위로, 각각 소정량의 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편, 또는 수용성 액체 또는 시럽, 엘릭서(elixir), 에멀젼, 또는 물약(draught)과 같은 비수용성 액체에서 현탁액을 함유하여 제시될 수 있다.
국소 투여에 적합한 제형은, 예컨대 크림, 스프레이, 폼, 젤, 연고, 살브(salve) 또는 건조 러브(dry rub)로 제시될 수 있다. 건조 러브는 투여 부위에 재수화될 수 있다. 또한, 이러한 제형은 밴드, 거즈 또는 패치로 직접 투여될 수 있고(예컨대 흡수 및 건조), 그 후 국부적으로 적용될 수 있다. 또한, 이러한 제형은 국부 투여를 위해 밴드, 거즈 또는 패치에서 반액체, 겔화된 또는 완전히 액체 상태로 유지될 수 있다.
일반적으로, ERT는 효소를 함유하는 정맥 내(IV) 주입 또는 투입을 환자에게 제공함으로써 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 따라서 여기에 기재되는 약제학적 조성물은 비경구 투여 또는 주입과 같은 비경구 투여를 위해 구성될 수 있다. 바람직하게는, 여기에 기재되는 약제학적 조성물은 정맥 내 투여와 같은 정맥 내 투여를 위해 구성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 동결 건조될 수 있다. 여기에 기재되는 임의의 약제학적 조성물은 투여를 위한 지침과 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 단일 용도의 병으로 패키징된다.
또한, 핵산을 동물 세포로 도입하는 공지된 방법이 몇개 존재하고, 이들 중 일부는 여기에 이용될 수 있다. 가장 간단하게, 핵산은 표적 세포/표적 조직으로 직접 주입될 수 있다. 다른 방법은 핵산을 함유하는 박테리아 원형질체와 수용자 세포의 융합, 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 리튬 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 양이온 지질 또는 리포좀과 같은 조성물의 용도 또는 리셉터-조절 엔도시토시스, 유전자 총법(biolistic particle bombardment)("유전자 총(gene gun)"법), 바이러스 벡터로의 감염, 예컨대 여기에 기재되는 전기 천공법 등과 같은 방법을 포함한다. 표적 세포에 핵산 분자를 전달하기 적합한 다른 기술 또는 방법은 폴리(락틱-코-글리코산) 중합성 마이크로스피어(poly (lactic-Co-Glycolic Acid) polymeric microspheres)로부터 NA 분자의 연속 전달 또는 보호된(안정화된) NA 분자의 제품을 전달하는 마이크로펌프(micropump)로의 직접 주입을 포함한다. 다른 가능성은 이식 가능한 약물-방출 생분해 가능한 마이크로스피어의 용도이다. 또한, 다양한 유형의 리포솜(면역리포솜, PEG화된(PEGylated) (면역) 리포솜), 양이온성 지질 및 폴리머, 나노입자 또는 덴드리머, 폴리(락틱-코글리코산) 중합성 마이크로스피어, 이식 가능한 약물 방출 생분해 가능한 마이크로스피어, 등에서 NA의 캡슐화; 및 뉴클레아제 억제제 아우린트리카르복실산(aurintricarboxylic acid)과 같은 보호제와 NA의 공동 주입(co-injection)이 예상된다. 또한, 상이한 상술한 전달 모드 또는 방법의 조합이 이용될 수 있는 것이 명백하다.
핵산의 세포 내 전달의 바람직한 방법은 여기에 기재되는 바이러스 벡터로 감염을 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 여기에 기재되는 재조합 바이러스 벡터는 숙주 세포와 접촉하게 되고, 예컨대 숙주 유기체에 도입(예컨대 국부적으로 또는 전체적으로)되고, 및 바이러스 감염에 유리한 조건에서 배양되어, 세포를 감염시키는바이러스의 자연적인 능력을 이용한다. 예컨대, 레트로바이러스(retroviruses)는 숙주 세포의 표면 상에 리셉터로 작용하는 막관통 단백질과 레트로바이러스의 단백질의 상호 작용을 통해 숙주 세포로 들어간다. 핵산의 바이러스 벡터-조절된 전달의 다른 접근법은 WO 2006/129080에 기재된 바이러스의 벡터-조절 전달과 조합하여 물리적 세포 진입-기반 기술, 예컨대 초음파 및 마이크로버블을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
핵산 전달의 다른 방법은 이미 공개된 방법을 적용할 수 있다. 예컨대, 핵산의 세포 내 전달은 블럭 코폴리머의 유효량 및 핵산 분자의 혼합물을 포함하는 조성물을 통할 수 있다. 이 방법의 예는 US 2004/0248833에 기재된다.
핵산의 핵으로의 다른 전달 방법은 Mann et al. 2001 (Proc Natl Acad Science 98(1): 42-47) 및 Gebski et al. 2003 (Human Molecular Genetics 12(15): 1801-1811)에 기재된다.
액체 담체에 네이크드 DNA로서 또는 복합체화된 발현 벡터를 이용한 핵산 분자의 세포로의 도입 방법은 US 6,806,084에 기재되어 있다.
콜로이드 분산 시스템에서 핵산 분자를 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 콜로이드 분산 시스템은 마크로분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비즈 및 수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합된 마이셀, 및 리포솜 또는 리포솜 제형을 포함하는 리피드-기반 시스템을 포함한다. 리포솜은 생체 외 및 생체 내 전달 운반체로 유용한 인공 멤브레인 운반체이다. 이러한 제형은 전체 양이온성, 음이온성 또는 중성 전하 특성을 가질 수 있고, 생체 외, 생체 내 및 탈체 전달 방법에서 유용한 특성이다. 크기가 0.2-4.0 PHI.m 범위인 LUV(large unilamellar vesicles)가 큰 마크로분자를 함유하는 수용성 완충액의 상당한 퍼센트를 캡슐화할 수 있는 것이 밝혀졌다. RNA 및 DNA는 수성 내부 내에 캡슐화되고, 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(Fraley et al. 1981 (Trends Biochem ScL 6: 77).
리포좀이 효율적인 유전자 전달 운반체가 되기 위해서, 이하 특성이 제공되어야 한다: (1) 그들의 생물학적 활성을 타협하지 않고 높은 효율로 관심 있는 핵산 분자의 캡슐화; (2) 표적하지 않는 세포와 비교하여 표적 세포에 우선적 및 상당한 결합; (3) 고효율로 운반체의 수성 내용물을 표적 세포의 세포질로 전달; 및 유전 정보의 정확하고 효율적인 발현(Mannino et al. 1988 (Biotechniques 6: 682).
리포솜의 조성은 보통 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 조합하는 인지질, 특히 고-상-전이-온도 인지질(high-phase-transition-temperature phospholipid)의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질도 사용될 수 있다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도, 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
또는, 핵산 분자는 약제학적 조성물을 생성하기 위해 다른 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 적합한 담체 또는 희석제는 등장 식염수 용액, 예컨대 포스페이트-완충 식염수를 포함한다. 조성물은 비경구, 근육 내, 정맥 내, 피하, 안구 내, 구강 또는 경피 두여를 위해 제형될 수 있다.
당업자가 임의의 특정 동물 및 상태에 대한 최적 투여 경로 및 임의의 투여량을 용이하게 결정할 수 있기 때문에, 투여 경로는 가이드로서만 의도된다. 생체 외 및 생체 내에서 기능적 새로운 유전 물질의 세포로의 도입을 위한 다수의 접근법이 시도되었다(Friedmann 1989 (Science 244: 1275-1280)). 이러한 접근법은 발현할 유전자의 변형된 레트로바이러스로의 통합(Friedmann 1989, supra; Rosenberg 1991(Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S)); 비레트로바이러스 벡터로의 통합(Rosenfeld et al. 1992 (Cell 68: 143-155); Rosenfeld et al. 1991 (Science 252: 431-434)); 또는 리포솜을 통해 이종 프로모터-향상 요소에 결합되는 이식 유전자의 전달(Friedmann 1989, supra; Brigham et al. 1989 (Am J Med Sci 298: 278-281); Nabel et al. 1990 (Science 249: 1285-1288); Hazinski et al. 1991 (Am J Resp Cell Molec Biol 4: 206-209); 및 Wang and Huang 1987 (Proc Natl Acad Sci USA,84: 7851-7855)); 리간드-특이, 양이온-기반의 수송 시스템과 결합(Wu and Wu 1988 (J Biol Chem 263: 14621-14624)) 또는 네이크드 DNA, 발현 벡터의 용도(Nabel et al. 1990, supra); Wolff et al. 1990 (Science 247: 1465-1468))를 포함한다. 이식 유전자의 조직으로의 직접 주입은 오직 국부화된 발현을 생성한다(Rosenfeld 1992, supra; Rosenfeld et al. 1991, supra; Brigham et al. 1989, supra; Nabel 1990, supra; 및 Hazinski et al. 1991, supra). Brigham 등의 그룹(Am J Med Sci 298: 278-281 (1989) 및 Clinical Research 39 (abstract) (1991))은 마우스의 오직 폐의 생체 내 형질 감염 후 DNA 리포솜 복합체의 정맥 내 또는 기관 내 투여를 보고했다. 인간 유전자 치료 절차의 리뷰 아티클의 예는 Anderson 1992 (Science 256: 808-813)이다.
특정 실시형태에서, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 파브리병의 치료, 또는 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료에 적합한 하나 이상의 활성 화합물과의 조합으로(즉 조합 치료) 또는 단독으로 사용될 수 있다. 하나 이상의 활성 화합물은 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 투여 전후 또는 동시에 투여될 수 있다.
"활성 화합물" 또는 "활성 약제학적 성분"의 설명은 이 맥락에서 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편 이외에 물질 또는 조성물을 말한다. "활성 화합물" 또는 "활성 약제학적 성분"의 설명에서 "활성"의 용어는 "약학적으로 활성"인 것을 말한다.
실시예를 이용하여, 이러한 다른 치료는, 파브리병의 경우에, 재조합 α-Gal A 단백질, 예컨대 아갈시다아제 알파(Replagal®: Shire Human Genetic Therapies, Dublin, Ireland) 또는 아갈시다아제 베타(Fabrazyme®: Genzyme Corporation - a Sanofi company, Cambridge, USA)와 같은 다른 효소 대체 요법일 수 있다. 다른 실시예를 이용하여, 이러한 다른 요법은 대증 요법, 예컨대 통증을 치료하기 위한 페니토인(phenytoin) 및 카르바마제핀(carbamazepine)과 같은 항경련제, 위장의 활동 과잉 및/또는 투석 또는 신장 이식을 치료하기 위한 메토클로프라미드(metoclopramide)일 수 있다.
다른 양태는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
"인코딩"은 특히 핵산 서열 또는 그 일부가 템플레이트-전사 생성물(예컨대, RNA 또는 RNA 유사체) 관계의 다른 핵산 서열에 대응시키거나, 또는 당해 유기체의 유전적 코드를 이용하여 특정한 아미노산 서열, 예컨대 하나 이상의 바람직한 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대응시키는 것을 의미한다.
특정 실시형태에서, 핵산 분자는 숙주 세포에 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 발현에 최적화된 코돈일 수 있다. 예컨대, 박테리아 세포, 효소 세포를 포함하는 균류 세포, 동물 세포, 또는 인간 세포와 비인간 포유류 세포를 포함하는 포유류 세포에서. 바람직하게는, 핵산 분자는 균류 세포에서, 더욱 바람직하게는 야로위아 리포리티카 또는 아슐라 아데니니보란스에서 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 발현에 최적화된 코돈이다.
특정 실시형태에서, 핵산 분자는 인간 NAGAL 뉴클레오티드 서열의 개시 코돈 전에 CACA 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다.
다른 양태는 여기에 정의되는 핵산 분자 및 핵산 분자에 작동 가능하게 결합되는 프로모터를 포함하는 발현 카셋 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 카셋 또는 발현 벡터는 숙주 세포에 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 발현에 영향을 미치도록 구성될 수 있다. 예컨대, 박테리아 세포, 효소 세포를 포함하는 균류 세포, 동물 세포, 또는 인간 세포와 비인간 포유류 세포를 포함하는 포유류 세포에서. 바람직하게는, 발현 카셋 또는 발현 벡터는 균류 세포에서, 더욱 바람직하게는 야로위아 리포리티카 또는 아슐라 아데니니보란스에서 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 발현에 영향을 미치도록 구성된다.
여기서 사용되는 "발현 벡터" 또는 "벡터"의 용어는 여기에 정의되는 핵산 분자 단편, 바람직하게는 재조합 핵산 분자가 삽입 및 클로닝, 즉 번식될 수 있는 핵산 분자, 일반적으로 DNA를 말한다. 그 결과, 벡터는 일반적으로 하나 이상의 특이한 제한 부위를 함유할 것이고, 정의된 숙주 세포 또는 운반체 유기체에서 자율 증식(autonomous replication)하여, 클로닝된 서열은 재생성 가능할 수 있다. 또한, 벡터는 바람직하게는 벡터를 함유하는 수용자 세포의 선택이 가능하도록 선택 마커, 예컨대 항생제 내성 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는 제한 없이 적절한 플라스미드, 파스미드, 박테리오파지, 박테리오파지-유래 벡터, PAC, BAC, 선형 핵산, 예컨대 선형 DNA, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다(예컨대 Sambrook et al., 1989; Ausubel 1992 참조). 발현 벡터는 일반적으로 바람직한 발현 시스템, 예컨대 생체 외에서, 숙주 세포, 숙주 기관 및/또는 숙주 유기체에서 그것에 도입되는 핵산 또는 ORFs을 발현하고 및/또는 이에 영향을 미치도록 구성된다. 예컨대, 발현 벡터는 유리하게 적합한 조절 서열을 포함할 수 있다.
특정 벡터를 선택하는데 중요한 인자는 그 중에서도 이하를 포함한다: 수용 숙주 세포의 선택, 벡터를 함유하는 수용자 세포가 벡터를 함유하지 않는 수용자 세포로부터 인식되고 선택되는 용이함; 특정 수용자 세포에 바람직한 벡터의 복제물의 수; 벡터가 염색체에 통합되거나 수용자 세포에 염색체 외에(extra-chromosomal) 남아있는 것이 바람직한지 여부; 그리고 다른 종의 수용자 세포 사이에서 벡터를 "왕복(shuttle)"할 수 있는지의 여부.
발현 벡터는 자율적이거나 통합적일 수 있다. 재조합 핵산은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드 또는 바이러스 입자와 같은 발현 벡터의 형태로 숙주 세포로 도입될 수 있다. 재조합 핵산은 염색체 외에 유지될 수 있거나 세포 염색체 DNA로 통합될 수 있다. 발현 벡터는 바람직한 핵산으로 형질 전환되는 세포를 검출 및/또는 선택시키기 위해 선택된 조건(예컨대, 우라실 생합성에 필요한 효소를 인코딩하는 URA3 또는 트립토판 생합성에 필요한 효소를 인코딩하는 TRP1) 하에 세포 생존에 요구되는 단백질을 인코딩하는 선택 마커 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 발현 벡터는 자율 증식 서열(ARS)을 포함할 수 있다.
통합적 벡터는 일반적으로 적어도 하나의 제1 삽입 가능한 DNA 단편, 선별 마커 유전자, 및 제2 삽입 가능한 DNA 단편의 일련의 배열된 서열을 포함한다. 제1 및 제2 삽입 가능한 DNA 단편은 각각 약 200(예컨대, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 또는 약 1000 이상) 뉴클레오티드의 길이이고, 형질 전환될 숙주 세포 종의 게놈 DNA의 부위와 상동인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 발현에 관심 있는 유전자를 함유하는 뉴클레오티드 서열은 마커 유전자 전후에 제1 및 제2 삽입 가능한 DNA 단편 사이에서 이 벡터에 삽입된다. 통합적 벡터는 숙주 세포 게놈으로 관심 있는 뉴클레오티드 서열의 통합을 용이하게 하기 위해 형질 전환 전에 선형화될 수 있다.
여기에 사용되는 "프로모터"의 용어는 유전자를 전사시킬 수 있는 DNA 서열을 말한다. 프로모터는 RNA 중합 효소에 의해 인식된 후 전사를 개시한다. 따라서, 프로모터는 직접 결합되거나 또는 유입(recruitment)과 관련되는 RNA 중합 효소의 DNA 서열을 함유한다. 또한, 프로모터 서열은 유전자-클러스터(gene-cluster)에서 유전자의 전사 수준을 향상시키기 위해 단백질(즉 전사 인자(trans-acting factors))과 결합될 수 있는 하나 이상의 DNA 영역인 "증폭자 영역(enhancer regions)"을 포함할 수 있다. 증폭자는 전형적으로 코딩 영역의 5' 말단에 있지만, 프로모터 서열로부터 분리될 수 있으며, 예컨대 유전자의 인트론 영역 내 또는 유전자의 코딩 영역의 3' 내에 있을 수 있다.
"작동 가능한 결합(operable linkage)"은 조절 서열 및 발현될 것으로 보이는 서열이 상기 발현이 가능한 방법으로 연결되는 결합이다. 예컨대, 서열, 예컨대 프로모터 및 ORF는 상기 서열들 사이의 결합 특성이 (1) 프레임-시프트 변이의 도입을 야기, (2) ORF의 전사를 지시하는 프로모터의 능력을 간섭, (3) 프로모터 서열로부터 전사될 ORF의 능력을 간섭하지 않는 경우, 작동 가능하게 결합되었다고 할 수 있다. 그 결과, "작동 가능하게 결합된"은 유전적 구조물로 통합되는 수단이어서, 프로모터와 같은 발현 조절 서열은 여기에 정의된 핵산 분자와 같은 관심 있는 코딩 서열의 발현을 효율적으로 조절할 수 있다.
프로모터는 항시성 또는 유도성(조건부) 프로모터일 수 있다. 항시성 프로모터(constitutive promoter)는 표준 배양 조건 하에서 발현이 일정한 프로모터로 이해된다. 유도성 프로모터(Inducible promoter)는 하나 이상의 유도 신호(induction cues)에 대해 반응하는 프로모터이다. 예컨대, 유도성 프로모터는 화학적으로 조절되거나(예컨대, 프로모터의 전사 활성이 알콜, 테트라사이클린, 스테로이드, 금속 또는 다른 소분자와 같은 화학 유도제의 존재 또는 비존재에 의해 조절됨) 물리적으로 조절될 수 있다(예컨대 프로모터의 전사 활성은 광 또는 높은 온도 또는 낮은 온도와 같은 물리적 유도제의 존재 또는 비존재에 의해 조절됨). 또한, 유도성 프로모터는 화학적 또는 물리적 신호에 의해 직접 조절되는 하나 이상의 전사 인자에 의해 간접적으로 조절될 수 있다.
예컨대, 프로모터는 야로위아 리포리티카 세포와 같은 균류 세포에서 발현을 위한 프로모터, 예컨대 야로위아 리포리티카, 아슐라 아데니니보란스, P. 파스토리스와 같은 적합한 균류 종, 또는 다른 적합한 균류 종으로부터의 프로모터일 수 있다. 적합한 균류 또는 효모 프로모터는, 예컨대 ADC1, TPI1, ADH2, hp4d, TEF1, POX2, 또는 Gal10 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 프로모터는 hp4d 또는 POX2이다. 더욱 바람직하게는, 프로모터는 hp4d이다. 예컨대, Guarente et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(23):7410; Zhu and Zhang, 1999, Bioinformatics 15(7-8):608-611; 또는 U.S. Patent No. 6,265,185를 참조한다.
재조합 핵산은 스페로플라스트 기술(spheroplast technique) 또는 전체-세포 리튬 클로라이드 효모 형질 전환법(whole-cell lithium chloride yeast transformation method)과 같은 다양한 방법을 이용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 플라스미드 또는 선형 핵산 벡터의 세포로의 형질 전환에 유리한 다른 방법은, 예컨대 U.S. Patent No. 4,929,555; Hinnen et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75:1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153:163; U.S. Patent No. 4,879,231; 및 Sreekrishna et al., 1987, Gene, 59:115에 기재되어 있다. 또한, Cregg and Russel, Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Chapter 3, Humana Press, Totowa, N.J., pp. 27-39 (1998)에 기재된 바와 같이, 전기 천공법 및 PEG1000 전체 세포 형질 전환 절차가 사용될 수 있다.
형질 전환된 균류 세포는 그것에 한정되지 않지만 요구되는 생화학적 산물 없이 형질 전환 후 영양 요구 세포의 배양(세포의 영양 요구성(auxotrophy)에 기인하여), 새로운 표현형의 선택 및 검출, 또는 형질 전환체에 함유되는 내성 유전자 없이 효모에 독성인 항생제의 존재 하에 배양을 포함하는 적합한 기술을 이용함으로써 선택될 수 있다. 또한, 형질 전환체는 발현 카셋의 게놈으로의 통합에 의해 선택 및/또는 입증되어, 예컨대 서던 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 분석될 수 있다.
벡터를 관심 있는 표적 세포에 도입하기 전에, 벡터는 대장균(E. coli)와 같은 박테리아 세포에서 성장(예컨대 증폭)할 수 있다. 벡터 DNA는 해당 기술 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 박테리아 세포로부터 분리되어, 박테리아 환경(bacterial milieu)으로부터 벡터 DNA의 정제를 일으킬 수 있다. 정제된 벡터 DNA는, 대장균 단백질이 포유류 세포에 독성일 수 있기 때문에 플라스미드 DNA 제조 시에 존재하는 것을 보증하도록, 페놀, 클로로포름 및 에테르로 광범위하게 추출될 수 있다.
여기에 의도되는 임의의 유전적으로 조작된 변형이 조건부일 수 있는 것을 이해해야 한다. 예컨대, 유전자는, 예컨대 Cre-loxP 시스템과 같은 부위-특이적 DNA 재조합 효소를 이용하여 조건적으로 결실될 수 있다(예컨대, Gossen et al., 2002, Ann. Rev. Genetics, 36:153-173 및 U.S. 20060014264 참조).
발현 벡터 또는 카셋은 류신 (예컨대 LEU2), 우라실 (예컨대 URA3), 아데닌 (예컨대 ADE2), 리신 (예컨대 LYS5), 아르기닌, 트립토판의 생성, 또는 글리세롤 이용(glycerol utilization, Gut), 및 히그로마이신(hygromycin) B 포스포트랜스페라아제 (hph) 마커에 필요한 임의의 하나 이상의 유전자를 포함하여 하나 이상의 선택 마커를 더 포함할 수 있다.
발현 벡터 또는 발현 카셋은 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있다. 예컨대, 발현 벡터 또는 발현 카셋은 레트로트랜스포존(retrotransposon), 예컨대 제한 없이 Ylt1 또는 Tyl6 레트로트랜스포존 또는 당업자에게 알려진 기타의 긴 말단 반복과 같은 제타 요소(zeta element)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 통합은 표적 통합이다.
또는, 발현 벡터 또는 발현 카셋은 통합 이외에 복제형일 수 있다. 예컨대, 복제 발현 벡터 또는 발현 카셋은 하나 이상의 상염색체 복제 서열(autosomal replication sequences, ARS)을 포함할 수 있다. ARS는 동원체(centromere, CEN) 및 복제 기점(origin of replication, ORI)을 포함할 수 있다. 예컨대, ARS는 ARS18 또는 ARS68일 수 있다.
다른 양태는 치료에 사용되는 상기 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터 또는 상기 정의된 핵산 분자를 제공한다.
바람직하게는, 치료는 유전자 치료 또는 mRNA 치료일 수 있다.
더욱 특히 그 중에서 LSDs(Lysosomal Storage Diseases)의 ERT(Enzyme Replacement Treatment)에 적용되는 유전자 치료 또는 mRNA 치료의 일반적인 원리는 해당 기술 분야에 잘 개발되었다.
일반적으로, "유전자 치료"의 용어는 관심 있는 치료적 산물을 인코딩하는 핵산 분자 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터, 예컨대 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편과 같은 유전적 물질을 함유하는 조성물의 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터를 통해 탈체 또는 생체 내 전달을 이용하여 LSD와 같은 질병의 치료 또는 예방을 말한다.
특정 실시형태에서, 전달되는 재조합 유전 물질은 관심 있는 치료적 산물을 인코딩하는 DNA를 포함하고, 이로 필수적으로 이루어지거나 이루어질 수 있어, 세포 전사 및 번역 기기는 표적 세포에 관심 있는 치료적 산물을 생성하기 위해 적용될 수 있다.
특정 다른 실시형태에서, 전달된 유전 물질은 관심 있는 치료적 산물을 인코딩하는 RNA, 더욱 특히 메신저 RNA(mRNA)를 포함하고, 이로 필수적으로 이루어지거나 이루어질 수 있어, mRNA는 관심 있는 치료적 산물을 생성하기 위해 표적 세포의 번역 기기에 의해 직접 번역될 수 있다("mRNA 치료").
이 맥락에서 "탈체(ex vivo )" 전달의 용어는 유전 물질을 함유하는 조성물의 인간과 같은 피험자의 몸의 외부에서 세포, 조직, 유사 기관, 기관 등으로의 도입 후, 제형, 투여 부위나 경로에 한정되지 않고 동일한(자가) 또는 다른(동종이계) 피험자의 몸으로 이러한 도입된 조성물을 함유하는 세포, 조직, 유사 기관, 기관 등을 투여하는 것을 의미한다.
유리하게, 여기에 예상되는 ERT에 의한 LSD의 치료를 위해, 여기에 기재되는 핵산 분자(예컨대 DNA 또는 mRNA) 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터는 피험자의 간, 더욱 특히 피험자의 실질 간 세포(parenchymal liver cell), 보다 더욱 특히 피험자의 간세포로 전달될 수 있다. 바람직하게는, 그렇게 전달되는 경우, 관심 있는 치료적 산물, 예컨대 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은, 예컨대 폴리펩티드의 서열에 적합한 분비 신호의 내포에 의해 간세포에 의한 분비를 위해 표적될 수 있다. 그 결과, 여기에 기재되는 핵산 분자 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터를 함유하는 간 세포는 관심 있는 치료적 산물을 생성 및 분비하고, 이는 피험자의 혈류로 방출되어, 예방적 또는 치료적 효과를 발휘할 수 있는 간 이외의 다른 세포, 조직 및 기관까지 전달 및 흡수된다.
여기에 기재되는 핵산 분자(예컨대 DNA 또는 mRNA) 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터의 투여는, 예컨대 피험자의 혈류에서 검출되는 관심 있는 치료적 산물의 수준에 기초하여 필요에 따라 반복될 수 있다. 실시예를 이용하여, mRNA 치료에서, 투여는 약 2주마다, 또는 약 3주마다, 약 4, 5, 6, 7 또는 8주마다 반복될 수 있다.
제한 없이 유전자 치료에 사용하기 적합한 벡터는 그것에 한정되지 않지만 레트로바이러스, 종두증 바이러스, 수두바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터를 포함하고, 잘 알려진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는 여기에 기재되는 핵산 서열에 도입하기 위해 그 자체로 알려진 재조합 기술에 의해 조작될 수 있다.
예컨대, 레트로바이러스 벡터가 여기에 이용될 수 있다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 관심 있는 핵산 서열 및 숙주 세포 게놈으로 재조합 바이러스 게놈(임의로)의 통합에 필요한 성분을 인코딩하는 레트로바이러스 게놈 서열을 포함할 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는, 예컨대 B, C, 및 D 타입 레트로바이러스 및 스푸마바이러스(spumaviruses) 및 렌티바이러스(lentiviruses)를 포함하는 광범위한 레트로바이러스로부터 표준 재조합 기술(예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)을 이용하여 쉽게 구성될 수 있다(RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985 참조).
또한, 재조합 아데노바이러스 벡터는 숙주 세포에 관심 있는 핵산 서열의 전달 밀 발현이 고려될 수 있다. 아데노바이러스 기반의 바이러스 벡터는 분배되지 않은 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 이점이 있지만, 재조합 바이러스 게놈은 숙주 세포 게놈으로 통합되지 않는다. 예컨대, 적합한 아데노바이러스 벡터, 이의 재조합 아데노바이러스 벡터를 구성하는 방법, 및 숙주 세포로 재조합 벡터를 전달하는 방법은 Xia H et al. (2002) (Nat. Biotech. 20: 1006-1010)에 기재되어 있다. 또한, 재조합 AAV (RAAV) 벡터의 사용이 여기에 고려된다. RAAV 벡터는 분배 및 분배되지 않은 세포를 감염시킬 수 있고, 숙주 세포로 재조합 바이러스 게놈을 도입할 수 있다. RAAV 벡터는, 예컨대 항원형 1 내지 6을 포함하는 다양한 아데노-관련 바이러스로부터 생성될 수 있다. 일반적으로, RAAV 벡터는 순서대로, 5' 아데노-관련 바이러스 반전 말단 반복부(ITR), 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현을 조절하는 서열에 작동 가능하게 결합되는 관심 있는 핵산, 및 3' 아데노-관련 바이러스 ITR을 포함할 수 있다. 또한, rAAV 벡터는 바람직하게는 폴리아데닐화 신호를 가질 수 있다. 적합한 RAAV 벡터는 그 중에서 WO 1994/13788, WO 1993/24641, 및 in Goyenvalle et al. 2004 (Science 306: 1796-1799)에 기재되어 있다.
여기에 사용되는 다른 바람직한 바이러스 벡터는 백신 바이러스와 같은 수두 바이러스(pox virus), 예컨대 MVA(Modified Virus Ankara) 또는 NYVAC와 같은 약독 백신 바이러스(attenuated vaccinia virus), 계두 바이러스(fowl pox virus) 또는 카나리아두 바이러스(canary pox virus)와 같은 조류 폭스바이러스(avipox virus)로부터 유래된 벡터이다.
그 결과, 파브리병의 치료 방법에 이용되는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 인코딩하는 여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터가 제공된다. 바람직하게는, 치료는 유전자 치료 또는 mRNA 치료일 수 있다.
또한, 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법에 이용되는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 인코딩하는 여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터가 제공된다. 바람직하게는, 치료는 유전자 치료 또는 mRNA 치료일 수 있다.
또한, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 인코딩하는 여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터의 치료학적 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 이러한 치료가 필요한 인간 환자의 파브리병의 치료 방법이 제공된다. 바람직하게는, 치료는 유전자 치료 또는 mRNA 치료일 수 있다.
또한, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 인코딩하는 여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터의 치료학적 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 이러한 치료가 필요한 인간 환자의 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법이 제공된다. 바람직하게는, 치료는 유전자 치료 또는 mRNA 치료일 수 있다.
다른 양태는 여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
실시예를 이용하여, 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포를 포함하는 균류 세포, 동물 세포, 또는 인간 세포와 비인간 포유류 세포를 포함하는 포유류 세포일 수 있다.
폴리펩티드의 소규모 또는 대규모 생성을 위해 이용될 수 있는 발현 시스템(숙주 세포)은, 제한 없이, 예컨대 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환되는 박테리아(예컨대 대장균, Yersinia enterocolitica, Brucella sp., Salmonella tymphimurium, Serratia marcescens, or Bacillus subtilis)와 같은 미생물; 또는, 예컨대 재조합 균류 발현 벡터로 형질 전환되는 균류 세포(예컨대 야로위아 리포리티카, 아슐라 아데니니보란스, 메틸로트로픽 효모(methylotrophic yeast)(예컨대 메틸로트로픽 효모속 칸디다(Candida ), 한세뉼라(Hansenula), 오가타에아(Oogataea ), 피치아(Pichia) 또는 토룰롭시스(Torulopsis), 예컨대 피치아 파스토리스(Pichia pastoris ), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha ), 오가타에아 미뉴타(Ogataea minuta ) 또는 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica )) 또는 곰팡이 속 아스페르길루스(Aspergillus ), 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora ), 후사리움(Fusarium ), 또는 크리소스포리움(Crysosporium,) 예컨대, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei ), 또는 효모 속 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces ), 예컨대, 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae ), 또는 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe )를 포함한다. 또한, 유용한 발현 시스템은, 핵산 분자를 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대 바큐로바이러스)로 감염되는 곤충 세포 시스템(예컨대, 노랑 초파리(Drosophila melanogaster)로부터 유래된 세포, 예컨대 슈나이더 2 세포(Schneider 2 cells), 거염 벌레(army worm) 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda )로부터 유래된 세포주, 예컨대 Sf9 및 Sf21 세포, 또는 cells derived from the cabbage looper Trichoplusia ni, such as High Five cells), 및 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대 Ti 플라스미드)로 형질 전환되는 식물 세포 시스템을 포함한다. 포유류 발현 시스템은 큰 쥐 세포, 영장류 세포, 또는 인간 세포와 같은 인간 및 비인간 포유류 세포를 포함한다. 인간 또는 비인간 포유류 세포와 같은 포유류 세포는 1차 세포, 2차, 3차 등 세포를 포함할 수 있거나, 클로날 세포주를 포함하여 불멸화된(immortalise) 세포주를 포함할 수 있다. 바람직한 동물 세포는 조직 배양액에 쉽게 유지 및 형질 전환될 수 있다. 인간 세포의 비제한적인 실시예는 인간 HeLa (자궁경부암) 세포주를 포함한다. 조직 배양 실행에 일반적인 다른 인간 세포주는 그 중에서 인간 배아 신장 293 세포 (HEK 세포), DU145 (전립선암), Lncap (전립선암), MCF-7 (유방암), MDA-MB-438 (유방암), PC3 (전립선암), T47D (유방암), THP-1 (급성 골수성 백혈병), U87 (악성 뇌교종), SHSY5Y (신경아세포종), 또는 Saos-2 세포(골암)를 포함한다. 영장류 세포의 비제한적인 예는 Vero (아프리카 녹색 원숭이 버빗원숭이속 신장 상피세포주) 세포, 및 COS 세포이다. 큰 쥐 세포의 비제한적인 예는 레트 GH3 (하수체종양), CHO (중국 햄스터 난소), PC12 (갈색 세포종) 세포주, 또는 마우스 MC3T3 (배아 두개관(embryonic calvarium)) 세포주이다. 여기에 구체화된 유전자 조작 전에 이러한 세포는, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, Rockville, MD)과 같은 다양한 상업적 공급원 및 연구 기관으로부터 얻어질 수 있다. 다양한 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터(adenovirus late promoter), 또는 거대 세포 바이러스 프로모터는 포유류 세포의 발현에 적합할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 균류 세포일 수 있다. 균류 세포는 효모 세포, 예컨대, 야로위아 리포리티카 세포, 아슐라 아데니니보란스 세포, 또는 메틸로트로픽 효모 세포(예컨대, 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카, 오가타에아 미뉴타, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis ), 스키조사카로미세스 폼베일 수 있다. 또는, 균류 세포는 사상균의 세포(예컨대, 아스페르길루스 카에실루스(Aspergillus caesiellus ), 아스페르길루스 칸디더스( Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네이우스( Aspergillus carneus ), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus ), 아스페르길루스 디펙터스( Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라버스( Aspergillus flavus ), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus ), 아스페르길루스 글라우커스( Aspergillus glaucus ), 아스페르길루스 니둘란스( Aspergillus nidulans ), 아스페르길루스 나이거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오차세우스( Aspergillus ochraceus ), 아스페르길루스 오리자에( Aspergillus oryzae ), 아스페르길루스 파라시티커스(Aspergillus parasiticus ), 아스페르길루스 페니실로이데스( Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레트릭터스( Aspergillus restrictus ), 아스페르길루스 소자에( Aspergillus sojae ), 아스페르길루스 시도위( Aspergillus sydowi ), 아스페르길루스 타마리( Aspergillus tamari ), 아스페르길루스 테레우스( Aspergillus terreus), 아스페르길루스 우스투스( Aspergillus ustus ), 아스페르길루스 베르시컬러(Aspergillus versicolor ), 트리코데르마( Trichoderma ), 또는 뉴로스포라(Neurospora))일 수 있다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 야로위아 리포리티카 또는 아슐라 아데니니보란스일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 야로위아 리포리티카이다. 유리하게, 실시예에서 설명되는 바와 같이, 균류 세포에서, 특히 야로위아 리포리티카에서 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 생성은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 만족할만한 발현 수준을 생성한다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는,
-OCH1 활성의 결핍과 같은 N-글리칸 활성의 외측 쇄 연장의 결핍을 포함하고; 및/또는
-MNN4, PNO1, MNN6과 같은 N-글리칸의 만노실 포스포릴화에 영향을 줄 수 있는 폴리펩티드 또는 이들의 임의의 하나의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 단편의 발현을 포함하기 위해 유전자 조작될 수 있다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 유전자 조작되어, 말단 포스포-6-만노오스에 말단 만노오스-1-포스포-6-만노오스 부위를 가수분해할 수 있는 만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편을 발현할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)로부터 CcMan5를 포함하는 패밀리 92 글리코사이드 가수분해 효소일 수 있다.
만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편은 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 언더라잉 만노오스에 알파 1,2 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 제거할 수 있다. 또한, 만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편은 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 글리칸의 언더라잉 만노오스에 말단 알파-1,3 만노오스 및/또는 알파-1,6 만노오스 및/또는 알파-1,2 만노오스 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 가수분해할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis )(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수분해 효소일 수 있다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 유전자 조작되어, 말단 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위에서 언더라잉 만노오스에 알파 1,2 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 제거할 수 있는 만노시다아제 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 발현할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제를 포함하는 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소; 아스페르길루스 사토이(AS) 만노시다아제를 포함하는 패밀리 47 글리코사이드 가수 분해 효소; 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스 CcMan4 만노시다아제를 포함하는 패밀리 92 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편은 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 글리칸의 언더라잉 만노오스에 말단 알파-1,3 만노오스 및/또는 알파-1,6 만노오스 및/또는 알파-1,2 만노오스 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 가수분해할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 그것에 한정되지 않지만 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수분해 효소일 수 있다.
다른 양태는 여기에 정의되는 숙주 세포의 사실상 순수한 배양액에 관한 것이다.
여기서 사용되는 숙주 세포의 "사실상 순수한 배양액(substantially pure culture)"은 배양액에서 살아 있는 세포의 총 수의 약 40% 미만(즉, 약 35% 미만, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.50%, 0.25%; 0.10%; 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 또는 그 이하)이 숙주 세포 이외에 살아 있는 세포인 세포 배양액이다.
이러한 숙주 세포의 배양액은 세포 및 성장, 저장 또는 수송 배지를 포함한다. 배지는 액체, 반고체(예컨대 젤리같은 배지), 고체, 또는 동결될 수 있다. 배양액은 동결 저장 또는 수송 배지를 포함하여 저장 또는 수송 배지에 저장 또는 수송되는 또는 액체에서 또는 반고체 배지 내에서/상에서 성장하는 세포를 포함한다. 배양액은 배양 용기 또는 저장 용기 또는 기질 내에 있다(예컨대 배양 접시, 플라스크, 또는 튜브 또는 저장병 또는 튜브). 여기에 기재되는 숙주 세포는, 예컨대 동결된 세포 현탁액으로서, 예컨대 동결 건조된 세포로서, 글리세롤 또는 슈크로오스와 같은 동결 보호제(cryoprotectant)를 함유하는 완충액에 저장될 수 있다. 또는, 이들은, 예컨대 유동상 건조 또는 스프레이 건조, 또는 임의의 다른 적합한 건조 방법에 의해 얻어지는 건조된 세포 제재를 저장할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 숙주 세포에 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 발현을 얻기 위해 여기에 정의되는 핵산 분자 또는 여기에 정의되는 발현 카셋 또는 발현 벡터의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 균류 세포, 바람직하게는 야로위아 리포리티카이다.
다른 양태는 이하를 포함하는, 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 제조 방법을 제공한다:
a) 여기에 정의된 숙주 세포를 배양하여, 숙주 세포가 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 발현하는 단계,
b) 숙주 세포로부터, 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 수집 및 임의로 분리하는 단계. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 균류 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 야로위아 리포리티카 세포이다.
특정 실시형태에서, 방법은 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 포함하는 포스포릴화 N-글리칸의 적어도 한 분획의 언캡핑 및/또는(바람직하게는 "및") 탈만노실화를 더 포함할 수 있고, 예컨대 언캡핑 및 탈만노실화는 생체 외에서, 또는 숙주 세포 내에서, 또는 숙주 세포의 용해물 내에서 발생한다.
따라서, 여기에 기재된 유전자 조작된 숙주 세포는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 여기에 기재되는 유전자 조작된 숙주 세포는 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편의 언캡핑 및 탈만노실화를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
언캡핑 및 탈만노실화되는 당단백질을 생성하는 세포-기반법(cell-based method)은 만노오스-1-포스포-6-만노오스 결합 또는 부위를 포스포-6-만노오스로 가수분해할 수 있는 만노시다아제를 인코딩하는 핵산, 당단백질, 특히 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하도록 유전자 조작된 균류 숙주 세포로 도입되어, 숙주 세포가 언캡핑된 포스포릴화된 N-글리칸을 함유하는 당단백질을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 포스포릴화된 N-글리칸은 본 명세서의 다른 곳에 기재되는 바와 같이 탈만노실화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 만노시다아제 및 당단백질을 인코딩하는 핵산은 분비 서열을 함유하여, 만노시다아제 및 당단백질은 공동-분비(co-secreted)된다.
다른 세포 기반법은, (i) 만노오스-1-포스포-6-만노오스 결합 또는 부위를 포스포-6-만노오스로 가수분해할 수 있고, (ii) 글리칸을 함유하는 포스페이트의 말단 알파-1,2 만노오스, 알파-1,3 만노오스 및/또는 알파-1,6 만노오스 결합 또는 부위를 가수분해할 수 있는 만노시다아제를 인코딩하는 핵산, 당단백질, 특히 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하도록 유전자 조작된 균류 숙주 세포로 도입되어, 숙주 세포가 언캡핑된 포스포릴화된 N-글리칸을 함유하는 당단백질을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 만노시다아제 및 당단백질을 인코딩하는 핵산은 분비 서열을 함유하여, 만노시다아제 및 당단백질은 공동 분비된다.
당단백질의 생체 내 제조에 적합한 숙주 세포, 예컨대 야로위아 리포리티카 또는 아슐라 아데니니보란스, 바람직하게는 야로위아 리포리티카는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 균류 기원(fungal origin)일 수 있다.
당단백질, 특히 여기에 기재되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 재조합 발현하도록 의도 또는 구성되는 숙주 세포의 유전자 조작은, 이하와 같은 하나 이상의 유전자 변형을 더 포함할 수 있다: (i) OCH1(Outer CHain elongation) 단백질을 인코딩하는 내인성 유전자의 결실; (ii) 만노오스 잔기의 포스포릴화를 증가시키기 위해 만노실 포스포릴화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산의 도입(예컨대, 야로위아 리포리티카, 에스. 세레비지에, 오가타에아 미뉴타, 피치아 파스토리스, 또는, 씨. 알비칸스로부터의 MNN4 폴리펩티드, 또는 피. 파스토리스로부터의 PNO1 폴리펩티드; (iii) OCH1 단백질의 기능적 발현을 간섭하는 RNA 분자의 도입 또는 발현; (iv) N-글리코실화 활성을 갖는 야생형(예컨대 내인성 또는 외인성) 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산의 도입(즉, N-글리코실화 활성을 갖는 단백질의 발현); 또는 (v) N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 프로모터 또는 증폭자 요소를 변경하여 그 인코딩된 단백질의 발현을 변경. RNA 분자는, 예컨대 siRNA(small-interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 안티 센스 RNA 또는 miRNA(micro RNA)를 포함한다. 또한, 유전자 조작은 첨가(예컨대 이종 서열), 결실 또는 치환(예컨대 점 돌연변이와 같은 돌연변이; 보호적 또는 비보호적 돌연변이)을 갖는 단백질을 제조하기 위해 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 내인성 유전자를 변형하는 것을 포함한다. 돌연변이는 특이적으로 도입(예컨대, 부위-지정 돌연변이 생성 또는 상동 재조합에 의해)될 수 있거나 임의로 도입(예컨대, Newman and Ferro-Novick, 1987, J. Cell Biol., 105(4):1587에 기재된 바와 같이 화학적으로 돌연변이 생성될 수 있음)될 수 있다.
여기에 기재되는 유전자 변형은, (i) 유전자 변형된 세포에서 하나 이상의 활성의 증가, (ii) 유전자 변형된 세포에서 하나 이상의 활성의 감소, 또는 (iii) 유전자 변형된 세포에서 하나 이상의 활성의 국부화 또는 세포 내 분배의 변화 중 하나 이상을 일으킬 수 있다. 특정 활성(예컨대 만노실 포스포릴화를 증진하는)량의 증가는 만노실 포스포릴화를 증진할 수 있는 하나 이상의 단백질의 과발현, 내생의 유전자의 복제수의 증가(예컨대 유전자 복제), 또는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현의 증가를 자극하는 내인성 유전자의 프로모터 또는 증폭제의 변경에 기인할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 특정 활성의 감소는 돌연변이 형태의 과발현(예컨대 우세한 네거티브 형태), 특정 활성을 갖는 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시키는 하나 이상의 간삽 RNA 분자의 도입 또는 발현, 또는 특정 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 결실에 기인할 수 있다.
상동성 재조합에 의해 유전자를 파괴시키기 위해, "유전자 대체(gene replacement)" 벡터는 선별 마커 유전자를 포함하는 방식으로 구성될 수 있다. 선별 마커 유전자는 상동성 재조합을 매개하기에 충분한 길이의 유전자 부위에 5' 및 3' 말단 모두에서 작동 가능하게 연결될 수 있다. 선별 마커는 URA3, LEU2 및 HIS3 유전자를 포함하여 숙주 세포 영양 요구성을 보완하거나 항생제 내성을 제공하는 임의의 수의 유전자 중 하나 일 수 있다. 다른 적합한 선별 마커는 효모 세포에 클로람페니콜 내성을 부여하는 CAT 유전자 또는 β-갈락토시다아제의 발현에 기인한 청색 콜로니를 생성하는 lacZ 유전자를 포함한다. 그 후, 유전자 대체 벡터의 선형화된 DNA 단편을 해당 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 세포 내로 도입시킨다. 선형 단편의 게놈 내로의 통합 및 유전자의 파괴는 선택 마커에 기초하여 결정될 수 있고, 예컨대 서던 블롯 분석에 의해 입증될 수 있다. 선별 마커는, 예컨대 Cre-loxP 시스템에 의해 숙주 세포의 게놈으로부터 제거될 수 있다.
또는, 유전자 대체 벡터는 임의의 내인성 유전자 프로모터 서열이 없고, 유전자의 코딩 서열의 불활성 단편을 인코딩하거나 아무것도 인코딩하지 않는 파괴될 유전자의 부위를 포함하는 방식으로 구성될 수 있다. "불활성 단편(inactive fragment)"은, 예컨대 유전자의 전체 길이 코딩 서열로부터 생성되는 단백질의 활성의 약 10% 미만(예컨대 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 0%)을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 단편이다. 유전자의 이러한 부위는 공지된 프로모터 서열이 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되지 않지만, 종결 코돈 및 전사 종결 서열이 유전자 서열의 일부에 작동 가능하게 연결되는 방식으로 벡터에 삽입된다. 이 벡터는 이어서 유전자 서열 부위에서 선형화되고, 세포로 형질 전환될 수 있다. 단일 상 동성 재조합에 의해, 그 후 이 선형화된 벡터는 유전자의 내인성 대응물에 통합된다.
그 결과, 일부 실시형태에서, 숙주 세포, 특히 균류 숙주 세포는 OCH1 유전자 또는 이의 유전자 산물(예컨대 mRNA 또는 단백질)이 부족하고, OCH1 활성이 부족하다. 그 중에서 WO 2008/120107에서 설명되는 바와 같이, 예컨대 야로위아 리포리티카 세포에서 OCH1 결핍은, 예컨대 Man8GlcNAc2 N-글리칸의 우세한 생성 시에, Man5GlcNAc2 N-글리칸 구조 상에 알파-1,2-결합된 만노오스 잔기를 갖는 글리코실화된 단백질과 사실상 상동인 생성을 초래할 수있다.
특정 실시형태에서, 방법은 MNN4(예컨대, 야로위아 리포리티카, 에스. 세레비지에, 오가타에아 미뉴타, 피치아 파스토리스, 또는 씨. 알비칸으로부터 MNN4 폴리펩티드) 또는 MNN6을 포함하는 만노실 포스포릴화에 영향을 줄 수 있는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산을 숙주 세포로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 균류 세포는 와이. 리포리티카(진뱅크 수탁 번호: XM_503217.1)로부터 MNN4 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작 세포는 OCH1 활성이 부족하고, 만노실 포스포릴화를 증진할 수 있는 폴리펩티드를 발현한다.
특정 실시형태에서, 방법은 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질의 기능적 발현을 방해하는 RNA 분자의 전사를 위한 핵산 또는 RNA 분자를 숙주 세포로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, N-글리코실화 활성을 갖는 단백질은 OCH1이다. 예컨대, RNA 분자는 siRNA(small-interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 안티센스 RNA 또는 miRNA(micro RNA)를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 말단 만노오스-1-포스포-6-만노오스 부위를 말단 포스포-6-만노오스로 가수분해할 수 있는 만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 그것에 한정되지 않지만 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)로부터 CcMan5와 같은 패밀리 92 글리코사이드 가수 분해 효소, 또는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제와 같은 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
또한, 만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편 또는 변이체는 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 언더라잉 만노오스에 알파 1,2 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 제거할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
만노시다아제 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체는 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 글리칸 부위의 말단 알파-1,3 만노오스 및/또는 알파-1,6 만노오스 및/또는 알파-1,2 만노오스 결합 또는 부위를 더 가수분해 할 수 있다. 예컨대, 이러한 만노시다아제는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 말단 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위에 언더라잉 만노오스에 알파-1,2 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 제거할 수 있는 만노시다아제 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제와 같은 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소 또는 그것에 한정되지 않지만 아스페르길루스 사토이(AS) 만노시다아제를 포함하는 패밀리 47 글리코사이드 가수 분해 효소, 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스 CcMan4 만노시다아제를 포함하는 패밀리 92 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
또는, 특정 실시형태에서, 방법은, 말단 만노오스-1-포스포-6-만노오스 부위를 포스포-6-만노오스로 가수분해할 수 있는 만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편을 이용하여, 단계 (b)에서 수집된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 그것에 한정되지 않지만 셀룰로시마이크로비움 셀루란스로부터 CcMan5와 같은 패밀리 92 글리코사이드 가수 분해 효소, 또는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제와 같은 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
만노시다아제, 또는 만노시다아제의 기능적 단편은 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 언더라잉 만노오스에 알파 1,2 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 제거할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
만노시다아제는 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 글리칸 부위의 말단 알파-1,3 만노오스 및/또는 알파-1,6 만노오스 및/또는 알파-1,2 만노오스 결합 또는 부위를 더 가수분해 할 수 있다. 예컨대, 이러한 만노시다아제는 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 말단 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위의 언더라잉 만노오스에 알파 1,2 결합에 의해 결합되는 만노오스 잔기를 제거할 수 있는 만노시다아제를 이용하여, 단계(b)에서 수집되는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 그것에 한정되지 않지만 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어진 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소 또는 그것에 한정되지 않지만 아스페르길루스 사토이(AS) 만노시다아제를 포함하는 패밀리 47 글리코사이드 가수 분해 효소, 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스 CcMan4 만노시다아제를 포함하는 패밀리 92 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다. 만노시다아제는 만노오스-1-포스포-6-만노오스 또는 포스포-6-만노오스 부위를 함유하는 글리칸 부위의 말단 알파-1,3 만노오스 및/또는 알파-1,6 만노오스 및/또는 알파-1,2 만노오스 결합 또는 부위를 더 가수분해할 수 있다. 예컨대, 만노시다아제는 그것에 한정되지 않지만 카나발리아 엔시포르미스(잭 빈) 만노시다아제 및 야로위아 리포리티카 AMS1 만노시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 패밀리 38 글리코사이드 가수 분해 효소일 수 있다.
분자의 글리코실화 검출 방법은 DSA(DNA sequencer-assisted), FACE(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis) 또는 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)를 포함한다. 예컨대, 분석은, 예컨대 당단백질이 변질된 후, 예컨대 멤브레인 상에 고정화되는 DSA-FACE를 이용할 수 있다. 그 후, 당단백질은 DTT(디티오트레이톨) 또는 베타-메르캅토에탄올과 같은 적합한 환원제로 환원될 수 있다. 단백질의 설프하이드릴기(sulfhydryl groups)는 요오드 아세트산과 같은 산을 이용하여 카르복실화될 수 있다. 다음으로, N-글리칸은 N-글리코시다아제 F와 같은 효소를 이용하여 단백질로부터 방출될 수 있다. N-글리칸은 임의로 환원적 아미노화에 의해 재구성 및 유도체 합성될 수 있다. 예컨대, 방출된 N-글리칸은 환원적 아미노화에 의한 환원 말단에서 APTS (8-아미노피렌-1,3,6-트리설폰산)과 같은 형광 물질로 표지될 수 있다. 표지의 화학량론은 올리고당의 각 분자에 하나의 APTS 분자만 부착되어 있는 것이다. 유도체화된 N-글리칸은 농축될 수 있다. N-글리칸 분석에 적합한 계측은, 예컨대 ABI PRISM® 377 DNA 시퀀서 (Applied Biosystems)를 포함한다. 데이터 분석은, 예컨대 GENESCAN® 3.1 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 수행될 수 있다. 분리된 N-글리칸은 그 N-글리 칸 상태를 확인하기 위해 만노시다아제 및/또는 송아지 장 포스파타아제페와 같은 하나 이상의 효소로 추가로 처리될 수 있다. N-글리칸 분석의 추가 방법으로는 질량 분광법(예 : MALDI-TOF-MS), 정상 상의 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 역상 및 이온 교환 크로마토그래피(예: 글리칸이 적절히 표지된 경우 UV 흡광도 또는 형광을 이용하여, 및 글리칸이 표지되지 않은 경우 펄스 전류 측정 검출을 이용하여)를 포함한다. 또한, Callewaert et al., 2001, Glycobiology, 11(4):275-281 및 Freire et al., 2006, Bioconjug. Chem., 17(2):559-564를 참조한다.
일부 실시형태에서, 당단백질, 특히 언캡핑 및 탈만노실화될 수 있는 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은 균류 숙주 세포와 같은 숙주 세포 내에서 유지되고, 세포 용해 시에 방출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 당단백질은 세포로부터 당단백질의 분비를 지시하는 코딩 서열(외인성 핵산에 고유하거나 발현 벡터 내로 조작된)에 의해 제공된 메카니즘을 통해 배양 배지로 분비될 수 있다. 세포 용해물 또는 배양 배지에서 당단백질의 존재는 다양한 표준 검출 프로토콜, 예컨대 당단백질에 특이적인 항체로 면역 블로팅 또는 방사 면역 침전 또는 특정 효소 활성에 대한 시험에 의해 입증될 수 있다.
특정 실시형태에서, 분리 또는 정제 단계는, 그것에 한정되지 않지만, 원심 분리, 여과에 의한 중간 정화, 탈염, 농축, 암모늄 침전, 크로마토그래피 (예컨대, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토 그래피, 친화성 크로마토 그래피 및/또는 소수성 전하 유도 크로마토 그래피), 폴리펩티드 태그를 통한 선택적 정제(예컨대, FLAG 태그, 폴리히스티딘 (예컨대, 헥사히스티딘) 태그, 헤마글루타닌 (HA) 태그, 글루타티온 -S- 트랜스퍼라아제 (GST) 태그 또는 말토오스-결합 단백질 (MBP) 태그), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 당업자에게 알려진 임의의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 예컨대, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, third edition, Springer-Verlag, New York (1993); Burton and Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81 (1998)를 참조한다.
일부 실시형태에서, 분리 후, 언캡핑 및 탈만노실화될 수 있는 당단백질, 특히 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체 또는 단편은, 예컨대 효소적 또는 화학적 수단을 이용하여 이종 부위에 부착될 수 있다. "이종 부위(heterologous moiety)"는 당 단백질에 원래 존재하는 구성 성분과는 다른, 당단백질에 결합(예컨대, 공유 결합 또는 비공유 결합)되는 임의의 성분을 말한다. 이종 부위는, 예컨대 폴리머, 담체, 보조제, 면역 보강제, 또는 검출 가능한(예컨대, 형광성, 발광성) 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 N-글리칸은 변경되는 표적 부위에 첨가될 수 있다.
3문자 코드 및 1문자 코드를 이용한 아미노산이 표 2에 나열된다.
본 발명은 이의 특정 실시형태와 관련하여 설명되었지만, 상술한 설명에 비추어 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백하다는 것이 명백하다. 따라서, 첨부된 특허 청구 범위의 사상 및 범위 내에서 다음의 모든 대안, 수정 및 변형을 포함하는 것이 의도된다.
여기에 기재된 본 발명의 양태 및 실시형태는 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 뒷받침 된다.
실시예
1:
증가된
α-갈락토시다아제 활성을 갖는 인간
NAGAL을
발현하는 야로위아
리포리티카의
생성 (
NAGAL1
)
본 실험의 목적은 증가된 α-갈락토시다아제 활성을 갖도록 아미노산 치환체Ser188Glu 및 Ala191Leu (개시 메티오닌으로부터 시작하여 인간 NAGAL의 17-아미노산 신호 펩티드를 포함하는 아미노산 넘버링; 서열 번호 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드에서, 이것은 치환 Ser171Glu 및 Ala174Leu에 상응함)에 의해 변형되는 인간 리소좀 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 효소의 분비된 발현을 위한 야로위아 리포리티카 균주를 개발하는 것이다.
이 목적을 위해, 야로위아 코돈-최적화된 합성 유전자는 야로위아 Lip2p (Lip2pre 서열)의 신호 펩티드와 성숙한 형태의 NAGAL(인간 NAGAL의 아미노산 18로 시작하고, 포유류의 분비 신호 펩티드를 생략함) 사이의 융합을 인코딩하는 GenScript로 오더되었다. 또한, 합성 유전자는 Lip2pre 서열과 제1 NAGAL-특이 아미노산 사이에 2개의 X-Ala 반복을 인코딩하여, 효모 ER(endoplasmatic reticulum) 내에 신호 펩티드의 효율적인 가공을 보증한다(Gasmi et al., 2012, Appl. Microbiol. Biotechnol., 96(1):89-101). 야로위아의 번역 개시에 유리한 것으로 확인되기 때문에, CACA 뉴클레오티드 서열은 ATG 개시 코돈 전에 도입된다(Gasmi et al., 2011, Appl. Microbiol. Biotechnol., 89(1):109-19). 그 이후로, 아미노산 치환체 Ser188Glu 및 Ala191Leu(개시 메티오닌으로부터 시작하는 아미노산 넘버링)를 함유하는 인간 NAGAL은 편리하게 "NAGAL1" 또는 "NAGAL1(Mut)"라고 한다. 야로위아 리포리티카의 발현을 위한 합성 NAGAL1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 10에 제공된다(볼드 언더라인: 개시 ATG; 이탤릭체 언더라인: 종결 코돈):
caca atg aagctctctactattctctttaccgcctgcgccaccctcgccgctgctctcgacaacggactcctccagactcctcctatgggctggctggcttgggagcgattccgatgcaacatcaactgtgacgaggaccccaagaactgcatttctgagcagctctttatggagatggctgaccgaatggcccaggacggatggcgagatatgggctacacctacctgaacatcgacgattgttggattggcggtcgagacgcctctggtcgactcatgcccgatcctaagcgattcccccacggaatcccttttctggctgactacgtccattccctgggcctcaagctgggtatttacgccgacatgggcaacttcacctgcatgggctaccccggtaccactctcgacaaggtcgtgcaggatgctcagaccttcgccgagtggaaggtggacatgctcaagctggatggatgtttttccactcctgaggagcgagctcagggataccctaagatggccgctgccctgaacgctaccggtcgacccatcgccttctcctgcgagtggcctctctacgagggaggactgcctcctcgagtcaactactctctgctcgctgacatctgtaacctctggcgaaactacgacgatattcaggattcgtggtggtccgtcctctctatcctgaactggttcgtggagcaccaggacattctgcagcccgtggccggtcctggacattggaacgaccccgatatgctgctcatcggaaactttggcctctcgctggagcagtcccgagctcagatggctctctggaccgttctggctgctcctctgctcatgtcgaccgacctgcgaactatctccgctcagaacatggatattctccagaaccccctgatgatcaagattaaccaggaccctctcggtatccagggacgacgaatccacaaggagaagtcgctgattgaggtttacatgcgacccctctctaacaaggcttcggccctggtcttcttttcctgccgaaccgacatgccttaccgataccattcctctctcggccagctgaacttcactggttctgtgatctacgaggcccaggacgtttactccggtgatatcatttctggactgcgagacgagaccaactttactgtgatcattaacccctctggagttgtcatgtggtacctctaccctattaagaacctggagatgtcgcagcag taatag (SEQ ID NO: 10)
재조합 NAGAL1(야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복을 포함함)의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 11로 제공된다(볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILNWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSCRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ (SEQ ID NO: 11)
비교를 위해, 야로위아 리포리티카에서 발현을 위해 최적화된 코돈 및 인간 α-갈락토시다아제 A(α-Gal A)를 인코딩하는 합성 유전자가 GeneArt와 오더되었다. 또한, 단백질의 분비는 야로위아 Lip2p 전 서열(pre-sequence)에 인간 α-갈락토시다아제 A의 제1 아미노산을 융합시킴으로써 구동된다. 이 경우에, 야로위아 Lip2p 전 서열은 신호 펩티다아제 절단 부위에서 더 우수한 가공을 보증하도록 1 X-Ala가 이어진다(Pignede et al., 2000, J. Bacteriol., 182(10):2802-10). 야로위아 리포리티카의 발현을 위한 합성 α-GalA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 12로 제공된다(볼드 언더라인: 개시 ATG; 이탤릭체 언더라인: 종결 코돈):
atg aagctttccaccatcctcttcacagcctgcgctaccctggccctggacaacggcctggcccgaacccccaccatgggctggctgcactgggagcgattcatgtgtaacctggactgtcaggaagagcccgactcttgtatctctgagaagctgttcatggaaatggccgagctgatggtgtctgagggctggaaggacgccggctacgagtacctgtgtatcgacgactgttggatggccccccagcgagactctgagggccgactccaggccgacccccagcgattcccccacggcatccgacagctcgccaactacgtgcactctaagggcctgaagctgggcatctacgccgacgtgggcaacaagacctgtgccggcttccccggctctttcggctactacgacatcgacgcccagaccttcgccgactggggcgtggacctgctgaagttcgacggctgttactgtgactctctcgagaacctggccgacggctacaagcacatgtctctggccctgaaccgaaccggccgatctatcgtgtactcttgtgagtggcccctgtacatgtggcccttccagaagcccaactacaccgagatccgacagtactgtaaccactggcgaaacttcgccgacatcgacgactcgtggaagtctatcaagtctattctggactggacctctttcaaccaggagcgaatcgtcgacgtcgccggacccggcggatggaacgaccccgacatgctggtgatcggcaacttcggcctgtcttggaaccagcaggtgacccagatggccctgtgggctatcatggctgcccccctgttcatgtctaacgacctgcgacacatctctccccaggccaaggccctgctccaggacaaggacgtgatcgccatcaaccaggaccccctgggcaagcagggctaccagctccgacagggcgacaacttcgaggtgtgggagcgacccctgtctggcctggcctgggccgtggccatgatcaaccgacaggagatcggcggaccccgatcttacaccatcgccgtggcctccctgggaaagggcgtggcctgtaaccccgcctgtttcatcacccagctcctgcccgtgaagcgaaagctgggattctacgagtggacctctcgactgcgatctcacatcaaccccaccggcaccgtgctgctccagctcgagaacaccatgcagatgtctctgaaggacctgctgtaataa (seq id no: 12)
재조합 α-GalA(야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 하나의 X-Ala를 포함함)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13로 제공된다(볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 하나의 X-Ala 반복):
MKLSTILFTACATLA LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO: 13)
NAGAL1 및 α-Gal A를 인코딩하는 합성 서열은 반연속 성장 상-의존 Hp4d 프로모터 뒤에서 클로닝된다. URA3, LEU2, 또는 ADE2 선별 마커를 갖는 플라스미드 변이체는 각각 우라실, 류신 또는 아데닌이 부족한 최소 배지에서 야로위아 형질 전환체를 선택할 수 있도록 생성되었다. 발현 플라스미드는 임의의 통합을 통해 야로위아 리포리티카 균주 OXYY2163로 변형되었다. 모 균주 OXYY2163은 높은 수준의 포스포릴화 N-글리칸을 합성할 높은 수용력을 가지며, 이하 유전자형 특징들을 포함한다: MatA, leu2-958, ura3-302, xpr2-322, ade2-844, ΔScsuc2, Δoch1, URA3::POX2-MNN4, OCH1::Hp4d-MNN4. 그 결과, OXYY2163은 N-글리칸 과도한 글리코실화(hyperglycosylation)를 감소시키기 위해 α-1,6-만노실트랜스페라아제 유전자 OCH1를 개시하기 위한 세포 외 프로테아제 유전자 XPR2를 결실시켰다. YlMNN4 유전자의 과발현은 증가된 N-글리칸 포스포릴화를 보증하며, ade-, leu- 및 ura-영양 요구성은 다중 형질 전환 사건을 허용한다.
단일 복제물 NAGAL1 또는 α-Gal A 균주가 ADE2 선별 마커를 함유하는 발현 플라스미드를 OXYY2163 게놈에 통합시킴으로써 생성된다. 3개의 복제물 발현 균주는 이러한 배경으로부터 LEU2 및 URA3 함유 발현 구조물의 공동 형질 전환(co-transformation)을 통해 생성된다. 정의된 미네랄 배지에서 단일 복제물 균주의 제어된 바이오리액터 배양을 허용하기 위해, URA3 및 LEU2 선별 마커로 형질 전환시켜 독립 영양 세포를 다시 얻었다. 또는, OXYY2163의 URA3 및 LEU2 보체 변이체인 OXYY1315 균주를 발현 플라스미드를 함유하는 단일 ADE2로 형질 전환시켰다. 선택된 형질 전환체의 게놈으로의 발현 구조물의 존재를 PCR을 통해 확인했다. 여기에서, 야로위아 형질 전환체의 PCR 스크리닝은 SapphireAmp Fast PCR Master Mix (Takara, RR350A) 또는 EmeraldAmpMaxHS PCR Master Mix (Takara, RR330A)를 사용하여 수행했다. PCR 반응은 세포 현탁액 또는 제조된 게놈 DNA에 대해 제조자의 권고에 따라 수행했다.
NAGAL1 및 α-Gal A의 발현 수준은 2 ml 농축 배지에서 24-웰 배양을 통해 PCR-양성 야로위아 형질 전환체에 대해 평가했다. 간단히, YPD (YPD: 1 % w/v 효모 추출물, 2% w/v 펩톤; 2% w/v 글루코오스/덱스트로오스) 2ml를 함유하는 웰에 여러 형질 전환체를 접종하고, 밤새 28 ℃ 및 180 rpm에서 배양했다. 다음날 (+/- 24 시간 후), 이 배양액 1 내지 2 μl를 새로운 YPD가 있는 새로운 웰로 옮기고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 재배양했다. 다음 날, 24-웰 플레이트를 원심 분리하고, 배지를 세포 펠릿으로부터 제거했다. 세포를 2 ml SuperT/글리세롤 농축 배지(0.5% w/v 효모 추출물; 2% w/v 맥아 추출물; 1% w/v 트립톤; 1.5% v/v 글리세롤; 200 mM 포스페이트 완충액 pH 6.8)에 재현탁하고, 28 ℃에서 3시간 성장시켰다. 배양 마지막에, 배지를 수확하여 NAGAL1 또는 α-Gal A의 발현을 분석했다.
배양 배지에서 재조합 단백질의 분비는 우선 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 검출을 통해 분석했다. Fabrazyme® (아갈시다아제 베타, 재조합 인간 α-갈락토시다아제 A) (Genzyme Corporation, a Sanofi company, Cambridge, USA) 또는 상업적으로 이용 가능한 CHO-생성된 인간 NAGAL (카탈로그 # 6717-GH-020, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA)를 양성 대조군으로 역할을 하도록 로딩했다(도 10). 환원 및 비환원 SDS-PAGE 조건을 이용하여 분석을 수행했다. 아미노산 조성에 기초하고, 잠재적으로 첨가되는 N-글리칸(α-Gal A가 3N-부위 및 NAGAL1가 5N-부위)의 크기를 고려하여, 재조합 단백질의 모노머 형태가 약 50 kDa에서 주행하는 것이 기대된다.
분석은, NAGAL1이 α-갈락토시다아제에서 얻어지는 발현 레벨과 비교하여 야로위아에 의해 덜 발현되는 것을 보여준다. 또한, 상당한 양의 NAGAL1-특이 단백질 가수 분해물이 관측된다. 비환원 웨스턴 블롯 분석에서, 전체 크기의 모노머 NAGAL1 생성물은 눈에 잘 띄지 않았다(또는 대조군 재조합 NAGAL). 또한, 효모-유래 NAGAL1은, NAGAL-관련 물질의 현저한 번짐이 고분자량(MW) 범위에서 관측되었지만, 저 MW 분해 밴드는 거의 존재하지 않았다. 이는 전체 크기의 모노머 NAGAL1과 그의 분해물 사이의 응집을, 예컨대 잠재적으로 원하지 않는 디설파이드 브릿지의 형성을 통해 나타냈다.
환원 웨스턴 블롯 분석은, 전체 크기 모노머 α-Gal A가 모노머 NAGAL1보다 약간 더 빠르게 진행되었고, 후자는 실제로 이중 밴드로 주행한다는 것을 보여준다. 이는 엔도글리코시다아제(Endoglycosidase) H (EndoH) (Bioke, P0702L)로 샘플을 탈글리콜화시킨 후 NAGAL1 더블렛에 대해 나타낸 바와 같이 N-글리코실화 부위 점유율의 차이에 기인한다 (도 11). N-글리칸의 제거는 단일 밴드(도 11, 레인 2)를 생성하여, EndoH 처리 전에 관측된 이중 NAGAL1 밴드(도 11, 레인 1)가 실제로 글리코실화와 관련되었음을 나타낸다.
실시예
2:
증가된
α-갈락토시다아제 활성을 갖는 인간
NAGAL을
발현하는 야로위아 리포리티카 균주의 제어된 바이오리액터 배양 (NAGAL1)
NAGAL1 발현 균주의 초기 제어된 바이오리액터 배양을 위해, DASGIP에 의해 개발된 8-평행 1L 발효 시스템이 사용되었다. 이 시스템은 pH, 온도, 용존 산소, 및 재배 중 산소 섭취율 (OUR) 및 이산화탄소 발생률 (CER)을 평가하기 위한 오프 가스 분석을 온라인으로 모니터링 하도록 구비된다.
선택된 균주의 종균 배양은 농축 배지를 포함하는 진탕 플라스크에서 28 ℃에서 성장시켰다. 그 후, 배양액을 탄소원으로서 글리세롤을 갖는 정의된 미네랄 배지를 함유하는 발효기에 접종하고, 28 ℃에서 무제한 성장으로 배치 단계(batch phase)를 시작했다. 이 단계는 빠르게 높은 바이오 매스 농도에 도달시키는데 사용된다. 글리세롤이 고갈된 후, 이 과정은 두 개의 연속적인 지수식 글리세롤 공급물을 적용하여 탄소 제한에서 수행했다. 첫 번째 공급 단계는 고정상 초기에 도달하도록 44 시간 동안 상대적으로 빠른 지수의 글리세롤 공급물이었다. 다음 공급 단계는 약 다른 130 시간 동안 상대적으로 느린 지수의 글리세롤 공급이었다. 발효 공정 동안, 용존 산소, pH, 온도, 거품 수준 및 공급 속도가 적극적으로 제어되었다. 용존 산소 수준은 순수한 산소로 교반 및 급상승하여 유지되었다. 14 % v/v 암모늄 히드록시드를 첨가하여 pH를 조정했다. 거품은 소포제 프로브의 활성화시 소포제를 첨가함으로써 대응되었다. 이 과정 동안, 샘플을 정기적으로 채취하여, 이하 파라미터를 평가했다: 1) 재조합 단백질 발현, 2) 활성 분석을 통한 기능적 효소의 발현, 3) 분비체(secretome)의 N-글리코실화 프로파일의 진화, 4) 바이오매스 농도, 5 ) pH, 6) 세포 형태학, 및 7) 총 단백질 농도.
웨스턴 블롯 분석은 3-복제물 균주의 바이오리액터 배양 동안 상이한 시점에 NAGAL1 발현 수준을 평가하기 위해 수행했다 (도 12). 이 분석은 중요한 NAGAL1 분해가 제어된 배양 후에도 여전히 관찰되었음을 보여준다. 배양 배지의 pH가 5.0 내지 5.5로 유지될 때 효모가 발현된 닭 NAGAL의 감소된 분해가 관찰된다고 기재되어있다(Zhu et al., 1996, Protein Expr Purif., 8 (4) : 456-62). 그러나, 우리의 경우에, pH를 6.8에서 5.5로 감소시키는 것은 NAGAL1 단백질 분해를 감소시키지 않았다 (도 12).
발효 샘플로부터의 웨스턴 블롯 신호와 20 ng의 공동-로딩된 재조합 인간 NAGAL (HuNAGAL)의 신호의 비교는 발현된 균주의 바이오리액터 배양 후에도 낮은 수준의 분비된 NAGAL1를 명확하게 보여준다 (도 12).
제2 분석법에서, 세포 외 α-갈락토시다아제 활성 (NAGAL1 또는 α-Gal A 야로위아 발현으로부터 유래된)의 존재를 기질로서 4-메틸움버리페릴-α-D-갈락토피라노사이드 (4MU-α-Gal)를 이용하여 pH 4.5 및 37 ℃의 온도에서 효소 분석을 통해 모니터링 했다. 이 형광 분석은 기본적으로 Tajima et al. 2009 (Am.J.Hum.Genet., 85 (5) : 569-80) 및 Tomasic et al., 2010 (J. Biol. Chem., 285 (28) : 21560-6)에 기재된 바와 같이 수행했다. 간단히, 활성 α-갈락토시다아제가 배양 배지에 존재할 때, 4MU-α-Gal은 가수 분해되어, 4-메틸움벨리페릴(4-methylumbelliferyl)을 방출한다. 후자는 365 nm에서 여기 후 450 nm에서 측정될 수 있다.
단일 복제물 α-GalA 발현 균주 대 3 복제물 NAGAL1 균주의 동일한 체적의 발효 배지(수확 시간에 취한)의 4MU-α-Gal 분석을 통한 평가는 방출된 4-메틸움벨리페릴의 총 μM 양에서 100 배 이상의 차이를 보였다(도시되지 않음). 즉, 세포 외 α-갈락토시다아제 활성 수준은 3- 복제물 NAGAL1 균주에 비해 단일 복제물 α-GalA 균주에서 100 배 이상 더 높았다. 이는 야로위아-생산된 NAGAL1의 수준이 낮다은 것을 다시 한번 나타낸다.
야로위아 칼넥신(Yarrowia calnexin), 야로위아 단백질 디설파이드 아이소머라아제(Yarrowia protein disulphide isomerase, PDI), 야로위아 결합 단백질 (BiP), 인간 칼넥신, 인간 PDI 또는 인간 BiP와 같은 샤페론(chaperone)의 동시 발현을 통해 재조합 NAGAL1의 발현 수준을 증가시키려는 시도가 임의의 성공 없이 있어왔다. 폴딩되지 않은 단백질 반응 (unfolded protein response, UPR) 민감 전사 인자 HAC1의 스플라이싱된 변이체의 동시 발현도 성공적이지 못했다. 또한, Lip2prepro 서열에 대한 Lip2pre 리더 서열을 교환은 NAGAL1의 분비가 증가하지 않았다. 또한, 다중 프로테아제 녹아웃 균주에서 발현 연구를 수행하여 NAGAL1 분해 수준을 제한하려고 시도했다. ProT01의 녹아웃은 분비된 전체 크기의 NAGAL1의 증가를 초래하는 것으로 보였다 (웨스턴 블롯을 통해 나타냄). 그러나, 이러한 결과와 달리, NAGAL1을 생산하는 ProT01 녹아웃 균주의 배지에서 총 분비된 α-갈락토시다아제 활성의 증가는 관찰되지 않았다.
실시예
3:
증가된
α-갈락토시다아제 활성을 갖는 인간
NAGAL의
변이체를
발현하는 야로위아 리포리티카 균주의 생성 (NAGAL1)
높은 서열 유사성 (전체 46 %)과 α-GalA와 NAGAL 사이의 매우 유사한 단백질 폴딩에 근거하여, 야로위아가 생산한 NAGAL1의 상당히 낮은 발현 수준은 예측되지 않는다.
야로위아 리포피티카에서 NAGAL1의 발현을 증가시키기 위해, 다양한 전략이 시험되었다:
(i) 첫번째 전략에서, 전체 도메인 II 스와핑은 NAGAL1의 도메인 II가 인간 α-GalA의 도메인 II로 대체되고;
(ii) 두번째 전략에서, NAGAL1의 도메인 I과 도메인 II 사이에 (추가로) 이온쌍을 형성할 수 있는 가능성이 도입될 수 있다는 가설에 기초하여, NAGAL1 도메인 I의 아스파라긴 213이 아스파르트산으로 대체되고, NAGAL1의 도메인 II의 시스테인 326이 아르기닌으로 대체되는 경우 NAGAL1 변이체가 발현되고(성숙한 NAGAL1의 제1 아미노산에서 시작하는 아미노산의 넘버링, 즉 포유류 분비 신호를 생략 함); 및
(iii) 세번째 전략에서, NAGAL1(성숙한 NAGAL1의 제1 아미노산에서 시작하는 아미노산의 넘버링, 즉 포유류 분비 신호를 생략 함)의 도메인 II의 짝 없는 시스테인 326이 원하지 않은 디설파이드 브릿지 스크램블링(disulphide bridge scrambling)의 선동자(instigator)가 될 수 있다는 가설에 기초하여, 시스테인 326은 아미노산 세린(크기 및 소수성이 유사한)으로 대체된다.
따라서, NAGAL1의 3개의 새로운 변이체가 생성되었다: # 1: 도메인 II 스왑의 결과; # 2: 이중 아미노산 변화의 결과: Asn213Asp 및 Cys326Arg; 및 # 3: 단일 아미노산 변화의 결과: Cys326Ser. 합성 뉴클레오티드 서열, 야로위아 리포리티카에 최적화된 코돈은 한편으로는 도메인 II 스왑을 허용하거나, 다른 한편으로는 NAGAL1 서열에서 단일 또는 이중 아미노산 치환의 도입을 허용하도록 설계되었다. 이들 서열의 서브 클로닝은 N-말단 Lip2pre 분비 신호를 갖는 새로운 NAGAL1 변이체 각각을 인코딩하는 플라스미드, 그 후 두 개의 X-Ala 반복, 즉 NAGAL1#1 (서열 번호 14), NAGAL1#2 (서열 번호 : 15) 및 NAGAL1#3 (서열 번호 16)으로 생성된다:
SEQ ID NO: 14 (볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복, 언더라인: NAGAL1로부터의 서열 분기(sequence divergence)):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILNWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL
SEQ ID NO: 15 (볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복, 언더라인: NAGAL1로부터의 서열 분기(sequence divergence)):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILDWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSRRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ
SEQ ID NO: 16(볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복, 언더라인: NAGAL1로부터의 서열 분기(sequence divergence)):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILNWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSSRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ
NAGAL1 변이체의 발현은 반연속 성장-단계 관련 Hp4d 프로모터에 의해 구동된다.
변이체 NAGAL1#1, NAGAL1#2 및 NAGAL1#3의 단일 복제물 발현 균주는 야로위아 균주 OXYY1315로 발현 플라스미드를 함유하는 대응하는 ADE2의 형질 전환체를 통해 생성했다. 형질 전환체는 임의의 아데닌을 추가하지 않고 최소 배지 플레이트에서 성장시킬 용량에 기초하여 선택된다. 비교를 위해, NAGAL1의 ADE2 발현 플라스미드를 동일한 균쥬 백그라운드로 형질 전환했다. 발현 구조물의 존재를 선택된 형질 전환체의 게놈으로의 존재를 PCR을 통해 확인했다.
PCR 분석에서 양성인 야로위아 형질 변환체에 의한 다양한 NAGAL 변이체의 발현 수준은 2 ml 농축 배지에서 24-웰 배양 후에 평가했다. 간단히, 2 ml의 YPD를 함유하는 웰에 여러 형질 전환체를 접종하고, 밤새 28 ℃ 및 180 rpm에서 배양했다. 다음날, 이 배양액 1 내지 2 μl를 새로운 YPD가 있는 새로운 웰로 옮기고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 재배양했다. 다음 날, 24-웰 플레이트를 원심 분리하고, 배지를 세포 펠릿으로부터 제거했다. 세포를 2 ml SuperT/글리세롤 농축 배지(0.5% w/v 효모 추출물; 2% w/v 맥아 추출물; 1% w/v 트립톤; 1.5% v/v 글리세롤; 200 mM 포스페이트 완충액 pH 6.8)에 재현탁하고, 28 ℃에서 3시간 성장시켰다. 배양 마지막에, 배지를 수확하여 다양하게 변형된 NAGAL1 폴리펩티드의 발현을 분석했다.
배양 배지에서 재조합 단백질의 분비는 우선 환원 SDS-PAGE 전기 영동 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석했다(도 13; 변이체 당 3개의 복제물). 아미노산 조성에 기초하고, 잠재적으로 첨가되는 N-글리칸의 크기를 고려하여, 4개의 NAGAL 변이체의 모노머 형태가 약 50 kDa에서 주행하는 것이 기대된다. 발현은 원래의 NAGAL1 (Mut) 및 Cys326Ser 아미노산 전환이 일어난 NAGAL1#3에서 관측되었다. NAGAL1#1로 형질 전환된 클론에 대해서는 발현이 관찰되지 않았지만, 2개의 아미노산 변화 Asn213Asp 및 Cys326Arg를 함유하는 NAGAL1#2 발현 구조물의 형질 전환체에 대해서는 NAGAL1 발현의 실질적인 증가가 얻어졌다. 이러한 결과는 NAGAL1 도메인 II를 인간 α-GalA로 대체하면 안정적으로 해당 하이브리드 단백질을 생산할 수 없음을 나타낸다. 잠재적인 비정상적인 디설파이드 브릿지 형성을 감소시키기 위한 시도로서 세린에 의한 Cys326의 교환은 NAGAL1 발현 수준에 약간의 영향을 미쳤다. NAGAL1 도메인 I 및 II 사이에 안정화 이온쌍을 도입하는 것으로 고려되는 이중 아미노산 치환은 분비된 NAGAL1의 상당히 우수한 발현을 야기했다(도 13, NAGAL1#2). 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드는 본 발명의 원리를 설명하는 실시형태를 나타낸다.
변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드는 환원성 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색 후 매우 잘 검출 가능하다 (도 14). 샘플을 탈글리코실화 하기 위한 펩티드-N-글리코시다아제 F (PNGaseF) (Bioke; P0704L) 처리는 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드가 서로 N-글리코실화의 정도만 다른 2가지 형태로 생성되었음을 나타내는 하나의 더 낮은 MW NAGAL1 밴드를 생성했다 (도 14).
다음으로, 야로위아 생산된 변형 NAGAL1#2 폴리펩티드가 비환원성 SDS-PAGE 전기 영동 및 웨스턴 블롯 분석 후 어떻게 행동하는지를 조사했다. 2개의 NAGAL1#2 발현 클론에 대한 크루드한 배지를 겔 및 1/5 희석물 (하나의 클론에 대해) 및 1/10 희석물 (2개의 클론에 대해)에 로딩했다 (도 15). 이 샘플을 2개의 NAGAL1 (Mut) 및 2개의 NAGAL1#3 (Cys326Ser) 발현 클론의 크루드한(비희석한) 배지와 비교했다. NAGAL1#2에 대한 희석되지 않은 샘플에서, 응집체를 형성하는 것처럼 보이는 분획이 여전히 존재했다. 그러나, 희석물 시리즈에 기초하여, 응집체 대 응집되지 않은 생성물의 비 (즉, 약 50 kDa에서 주행하는 모노머 NAGAL1 밴드)는 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드의 발현 대 NAGAL1(Mut) 또는 NAGAL1#3 발현에 훨씬 유리한 것으로 결론 내릴 수 있다. 후자의 2개 변이체의 희석되지 않은 샘플과 비교하여, NAGAL1#2 샘플의 1/10 희석물은 상당히 더 많은 50kDa 모노머 생성물을 나타냈지만, 응집된 물질은 거의 검출되지 않았다 (도 15). NAGAL1 (Mut)과 NAGAL1#3 사이의 비교는 응집되지 않은 재료와 응집된 재료 사이의 비율에서 후자에 대한 약간의 개선을 보였다.
다양한 NAGAL1 변이체의 24-웰 배양에 대한 또 다른 분석으로서, 배지로의 활성 α-갈락토시다아제 효소 활성의 방출을 시험했다. 상술한 바와 같이 기질로서 4-메틸움버리페릴-α-D-갈락토피라노사이드 (4MU-α-Gal)를 사용하여 표준 형광 분석법을 일련의 배지의 희석물 상에서 pH 4.5에서 수행했다. α-갈락토시다아제의 세포 외 존재는 37 ℃에서 2시간 배양하는 동안 방출된 4-메틸움벨리페릴의 양으로 측정되었고(도 16), 인간 α-GalA에 대한 단일 복제물 및 3-복제물 야로위아 발현 균주의 24-웰 배양과 비교했다. 동일한 변이체를 발현하는 클론간에 관찰된 변이는 배양 조건 (예컨대, 농축 배지에서 딥-웰 배양 동안의 성장 조건을 조절할 수 없음) 또는 클론 차이 (예컨대, 야로위아 형질 전환체는 발현 카셋의 임의의 통합에 의해 생성되어 클론 사이의 게놈 차이를 야기함)에 기인할 수 있다.
분석은 NAGAL1 (Mut) 클론과 비교하여 본 발명의 원리를 설명하는 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드를 발현하는 야로위아 균주에 대한 α-갈락토시다아제 활성을 100배까지 증가시킨 것으로 나타났다. 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드를 발현하는 야로위아 균주의 수득된 활성 수준은 인간 α-GalA 발현 균주에 의해 생성된 범위 내에 있다. 또한, 분석은 변형된 NAGAL1#3 폴리펩티드를 발현하는 야로위아 균주에 대한 α-갈락토시다아제 활성의 측정 가능한 증가를 보여준다.
실시예
4: 다양한 인간
NAGAL1
변이체를
발현하는
야로위아
리포리티카
균주의 조절된 바이오리액터 배양
제어된 바이오리액터 배양은 1L 발효 시스템 (DASGIP)에서 수행되었다. 간단히, 선택된 균주의 종균 배양은 농축 배지가 들어있는 진탕 플라스크에서 28 ℃에서 밤새 성장시켰다. 그 후, 종균을 글리세롤이 탄소 공급원으로서 지정된 미네랄 배지가 들어있는 발효 용기에 접종하여, 28 ℃에서 무제한 성장시키는 배치 단계를 시작했다. 글리세롤 제거 후에 과정은 2개의 연속적 지수 글리세롤 공급물을 적용함으로써 탄소 제한 하에 주행된다: 40시간 동안 상대적으로 빠른 지수의 글리세롤 공급물을 갖는 제1 단계 및 약 115시간 동안 더 느린 지수의 공급물을 갖는 제2 단계. 발효 과정 전반에 걸쳐, 용존 산소 (약 20 %), pH (6.8), 온도 (28 ℃), 거품 수준 및 공급물 비율이 적극적으로 제어되었다. 용존 산소 수준은 순수한 산소로 교반 및 스파이킹함으로써 유지하고, pH는 14% 암모늄 하이드록시드를 첨가함으로써 조절하고, 거품은 소포제 프로브의 활성화 시 소포제를 첨가함으로써 대응했다. 공정 동안, 샘플은 이하 파라미터를 평가했다: 1) 재조합 단백질 발현, 2) 활성 분석을 통한 기능적 효소의 발현, 3) 분비체(secretome)의 N-글리코실화 프로파일의 진화, 4) 바이오매스 농도, 5 ) 외부 pH, 6) 세포 형태학, 및 7) 총 단백질 농도.
1L 바이오리액터 배양 동안 상이한 NAGAL1 변이체의 시간에 따른 발현을 환원성 SDS-PAGE/쿠마시 염색을 통해 및 웨스턴 블롯 검출을 통해 분석했다 (도 17 및 18). 24-웰 배양과 유사하게, NAGAL1#1 (도메인 Ⅱ 스왑)의 발현은 관찰되지 않았다 (도시하지 않음). NAGAL1#3 (Cys326Ser)은 원래의 NAGAL1 (Mut) 변이체에 비해 약간 더 잘 생산되었지만, SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색시 둘 다 변이체를 검출할 수 없었다 (도 18). 대조적으로, NAGAL1#2 (Asn213Asp/Cys326Arg)의 발현은 쿠마시 염색 시 명확하게 볼 수 있었고, 발효 초기에 이미 잘 검출되었다 (도 18). 웨스턴 블롯 분석은 NAGAL1(Mut) 또는 NAGAL1#3과 비교하여 NAGAL1#2의 우수한 발현 수준을 명백하게 나타냈다 (도 17).
다음으로, 분비된 α-갈락토시다아제 활성의 수준은 기질로서 4-MU-α-Gal를 이용하여 상술한 바와 같이 측정되었다 (도 19). NAGAL1 (Mut) 액에 대한 NAGAL1#3 발효액의 두 번째 마지막 시점에서 분비된 효소의 증가가 관찰되었지만, 발효가 끝날 때 최종 수준은 같아 보였다. 반복적인 바이오리액터 배양은 NAGAL1#3과 NAGAL1(Mut) 발현 클론 간의 발효 종료 시점에 분비된 α-갈락토시다아제 활성의 통계적 차이를 결정할 수 있다. NAGAL1(Mut) 균주의 유사한 발효 활성과 비교하여 NAGAL1#2 발현 균주의 바이오리액터 배양액에서 분비된 α-갈락토시다아제 활성의 100배 이상 증가가 관찰되었다.
실시예
5:
NAGAL1
#2의 발현을 위한 다중-복제
야로위아
리포리티카
균주
우선, 본 발명의 원리를 설명하는 변형된 NAGAL 폴리펩티드를 인코딩하는 NAGAL1#2 발현 구조물의 ADE2 변이체는 leu2- 및 ura3- 영양 요구성을 갖는 단일 복제 발현 균주를 생성하기 위해 OXYY2163으로 형질 전환되었다. 플라스미드의 게놈 통합은 형질 전환체에 대한 PCR 스크리닝으로 확인했다. 여러 PCR-양성 클론을 24 딥-웰 플레이트에서 배양 후 재조합 NAGAL1#2의 생산을 시험했다. 간단히, 여러 개의 형질 전환체를 2 ml YPD가 들어있는 웰에 접종하고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 배양시켰다. 다음날, 1 내지 2 μl의 이 배양액을 신선한 YPD가 있는 새로운 웰로 옮기고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 재배양했다. 다음 날, 24-웰 플레이트를 원심 분리하고, 배지를 세포 펠릿으로부터 제거했다. 세포를 2 ml SuperT/글리세롤 농축 배지에 재현탁하고, 28 ℃에서 3 내지 4일 성장시켰다. 배양 마지막에, 배지를 수확하여, NAGAL1#2 발현을 SDS-PAGE/쿠마시 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가했다(도 20).
이것에 기초하여, 2개의 단일 복제 형질 전환체를 NAGAL1#2 발현 구조체를 함유하는 LEU2 및 URA3과 동시 형질 전환을 위해 선택하고, 클론은 아데닌, 우라실 및 루신을 첨가하지 않은 최소 배지에서 성장 능력에 기초하여 선택했다. 2개의 여분의 발현 카세트의 통합은 PCR 분석을 통해 확인했고, 여러 PCR-양성 클론을 24-웰 배양 후 재조합 NAGAL1#2의 생산에 대해 시험했다 (상술한 바와 같음).
크루드한 배지를 웨스턴 블롯 분석을 통해 재조합 단백질의 발현에 대해 분석하고, 기질로서 4-MU-α-Gal을 사용하여 상술한 바와 같이 α-갈락토시다아제 효소 활성을 측정했다 (도 21). 웨스턴 블롯 분석에 기초하여, 전체, 독립 영양의 3-복제 균주는 독립 영양의 단일 복제 균주와 비교하여 재조합 NAGAL1#2가 적게 생성된 것을 나타낸다. 앞서 언급한 바와 같이, 배양 조건의 제어되지 않은 성질 또는 발현 플라스미드의 임의의 통합의 결과로서의 유전자형의 차이에 기인하여 일부 클론 변이가 관측될 수 있다. 클론 변이체는 분비된 α-갈락토시다아제 활성의 수준을 평가할 때 더욱 두드러졌다: 평균적으로 3-복제 균주에서 관찰된 활성 수준은 독립 영양성 단일 복제 균주의 활성 수준과 동일한 범위에 있다. 이 관측은 야로위아의 번역 및/또는 폴딩 기기가 이 실시예에 적용된 배양 조건 하에서 다중-복제 균주에서 NAGAL1#2 변이체의 발현에 대해 포화되거나 제한적일 수 있음을 나타낼 수 있다.
2개의 선택된 다중 복제 NAGAL1#2 균주의 제어된 바이오리액터 배양을 1L 발효 시스템에서 수행했다. 간단히, 선택된 균주의 종균 배양은 농축 배지가 들어있는 진탕 플라스크에서 28 ℃에서 밤새 성장시켰다. 그 후, 종균을 글리세롤이 탄소 공급원으로서 지정된 미네랄 배지가 들어있는 발효 용기에 접종하여, 28 ℃에서 무제한 성장시키는 배치 단계를 시작했다. 글리세롤 제거 후에 과정은 2개의 연속적 지수 글리세롤 공급물을 적용함으로써 탄소 제한 하에 주행된다: 44시간 동안 상대적으로 빠른 지수의 글리세롤 공급물을 갖는 제1 단계 및 다른 110시간 동안 더 느린 지수의 공급물을 갖는 제2 단계. 발효 과정 전반에 걸쳐, 용존 산소 (약 20 %), pH (6.8), 온도 (28 ℃), 거품 수준 및 공급물 비율이 적극적으로 제어되고, 필요 시에 조절되었다. 공정 동안, 샘플은 여기에 기재되는 바와 같이 다양한 발효 파라미터를 평가하기 위해 정기적으로 취해졌다.
2개의 다중 복제 발현 균주의 바이오리액터 배양 후 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드의 생산을 단일 복제 클론의 생산과 비교했다. 1L 발효 동안 시간 경과에 따른 생산은 환원성 SDS-PAGE/쿠마시 염색을 통해 및 웨스턴 블롯 검출을 통해 분석했다 (도 22 및 도 23). 단일 복제 변이체의 NAGAL1 발현 수준과 비교할 때, 다중-복제 균주 클론 3에 대한 단백질 발현의 명백한 증가가 관찰되었다. 이는 최소 배지에서의 제어된 바이오리액터 배양 동안, 본 발명을 설명하는 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드를 훨씬 더 높은 수준으로 생산하는 균주의 용량이 아직 포화되지 않았 음을 나타낸다.
또한, 기질로서 4-MU-α-Gal을 이용하여 크루드한 발효 샘플에 대해 α-갈락토시다아제 효소 활성 분석을 수행할 때 기능적 NAGAL1#2의 증가된 발현이 관측된다 (도 24). 기능적 효소의 수준은 37 ℃에서 1시간 배양한 후 가수 분해된 4-메틸움버리페릴의 μM 양으로 나타냈다. 동일한 시점을 서로 비교할 때, 다중 복제 균주의 α-갈락토시다아제 수준은 단일 복제 균주보다 약 1.7 내지 2.15배 더 높았다 (도 24).
SDS-PAGE/쿠마시 염색은 발효액 중 총 단백질의 상당 부분이 NAGAL-관련 산물로 구성되어 있음을 보여준다. N-글리칸 프로파일링은 존재하는 주요 N-글리칸에 대한 첫 번째 징후를 얻기 위해 크루드한 수확 배지 샘플에서 (Laroy et al., 2006, Nat Protoc., 1 (1) : 397-405)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 간단히, 중간 단백질을 포획하고, 멤브레인 상에서 변성시킨 후 PNGaseF 처리하여 N 결합 올리고당을 제거했다. 플루오로포어(fluorophore) APTS (8-아미노피렌-1,3,6-트리설폰산)로 라벨링한 후, N-글리칸을 모세관 전기 영동으로 분석하고, 이들의 주행 특성을 공지된 표준 올리고당과 비교했다. 그 결과를 변형된 NAGAL1#2 폴리펩티드를 발현하는 다중 복제 균주의 발효액 중 총 단백질에 대해서 도 25에 도시했다. 모노포스포릴화된 (MP-M8) 및 바이포스포릴화된 ((MP)2-M8) Man8GlcNAc2에 대응하는 N-글리칸 프로파일에서 2개의 주요 피크가 확인되었다 (도 25, 클론 3 및 클론 8).
실시예
6:
NAGAL
폴리펩티드의 3D-
모델링
인간 NAGAL (PDB 3H54, 진회색) 및 닭 NAGAL (PDB 1KTB, 연회색)의 구조적 얼라인먼트 및 중첩에 대해 PyMOL 소프트웨어(DeLano, 2002, The PyMOL Molecular Graphics System, www.pymol.org)를 사용했다. 이는, 두 효소가 매우 유사한 3차 폴드를 갖는 것을 보여준다 (도 26 참조). 닭 NAGAL에서 도메인 I과 II 사이의 계면은 2개의 안정화 이온쌍 Asp214-Arg327 및 Asp221-Arg299이 확인된다 (as described in Garman et al., 2002, Structure, 10(3):425-34). 후자(도 26 박스 참조)는 사람의 NAGAL에서의 위치가 엄격하게 보존된 것으로 보이지만, 첫 번째 것은 인간의 오토로그(orthologue)에서 빠진 것으로 보인다. Asn213이 Asp213으로 전환되고 동시에 Cys326이 Arg326으로 전환된 인간 NAGAL의 3D 변이체를 PyMOL 돌연변이 유발 도구를 사용하여 인실리코(in silico)에서 모델링하고, 인접한 잔기와의 입체적 충돌을 피하기 위해 특정 회전 이성질체(rotamer)를 선택했다. 본 발명자들은 도입된 Asp213과 Arg326 측쇄 사이의 거리를 PyMOL 측정 도구를 이용하여 평가했고, 이들이 4Å 이하인 것을 발견했다. 제한 없이, 본 발명자들은 이 발견이 NAGAL 폴리펩티드의 도메인 I과 II 사이의 상호 작용을 안정화시킬 수 있는 돌연변이된 인간 NAGAL에서 두 번째 Asp-Arg 이온쌍을 형성할 가능성을 확인한다고 가정한다.
야생형 인간 NAGAL에서, Cys326은 위치 327에서 Arg가 이어진다(도 26 타원 참조). 그러나, 3D 구조에 기초하여, 본 발명자들은 Arg327의 아미노산 측쇄가 돌연변이 NAGAL에서 도입된 Asp213과 이온쌍을 형성하는 것이 불가능한 방식으로 위치한다고 가정한다. 따라서, 본 발명자들은 Asn213만 Asp로의 전환은 이미 존재하는 Arg327과 이온쌍을 형성시키지 않을 것으로 예측했다.
두번째 인실리코 활동에서, 본 발명자는 NAGAL1#2에 도입된 전하의 전도(inversion)가 인간 NAGAL의 도메인 I과 II 사이의 제2 이온쌍으로 귀결될 수 있는지를 평가했다. 이를 위해, Asn213이 Arg213으로 전환되고, 동시에 Cys326이 Asp326으로 전환된 인간 NAGAL의 변이체를 PyMOL 돌연변이 유발 도구를 사용하여 인실리코 3D 모델링하고, 회전 이성질체가 인접 잔기와의 입체적 충돌을 피하기 위해 선택되었다 (도 27).
도입된 Arg213 및 Asp326 부위 쇄 사이의 거리는 PyMOL 측정 도구를 사용하여 평가했으며, 그 중 하나 (5.2 Å)는 4 Å보다 유의하게 높았다. 따라서, 이 모델을 기초로 하여, 이런 인간 NAGAL 내의 돌연변이된 아미노산의 기하학적 형태는이 효소의 대안적인 변이체에서 제2의 Asp-Arg 이온쌍의 형성에 최적이 아니라는 것을 예측할 수 있다.
야로위아 리포리티카에 최적화된 합성 뉴클레오티드 서열, 코돈은 NAGAL1 서열에서 상기 이중 아미노산 치환을 도입하도록 고안되었다. 생성된 새로운 변이체는 NAGAL1#7로 명명된다(서열 번호 17). 원래의 NAGAL1 발현 벡터로 합성 단편을 서브 클로닝하면 N-말단 Lip2pre 분비 신호를 갖는 NAGAL1#7 변이체를 인코딩하는 야로위아 발현 플라스미드가 생성된 후, 2개의 X-Ala 반복이 이어진다. 이전에 발현된 NAGAL1 변이체와 유사하게, NAGAL1#7의 발현은 반-구성적 성장-단계 관련 Hp4d 프로모터에 의해 유도된다.
SEQ ID NO: 17 (볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복, 언더라인: NAGAL1로부터의 서열 분기(sequence divergence)):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILRWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSDRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ
NAGAL1#7의 단일 복제 발현 균주는 발현 플라스미드를 함유하는 대응하는 ADE2 변형 균주의 OXYY1315로의 형질 전환을 통해 생성되었다. 형질 전환체를 임의의 아데닌이 첨가되지 않는 최소 배지 플레이트에서 성장시킬 능력에 기초하여 선택했다. 선택된 형질 전환체의 게놈에서 발현 구조물의 존재를 PCR을 통해 확인하고, NAGAL1#7 변이체의 발현 수준을 2 ml 농축 배지에서 24-웰 배양 후 평가햇다. 배양은 상기와 같이 행해졌다. 간단히, 여러 개의 형질 전환체를 2 ml YPD가 들어있는 웰에 접종하고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 배양시켰다. 다음날, 1 내지 2 μl의 이 배양액을 신선한 YPD가 있는 새로운 웰로 옮기고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 재배양했다. 다음 날, 24-웰 플레이트를 원심 분리하고, 배지를 세포 펠릿으로부터 제거했다. 세포를 2 ml SuperT/글리세롤 농축 배지에 재현탁하고, 28 ℃에서 3 내지 4일 성장시켰다. 배양 마지막에, 배지를 수확하여, 다양한 NAGAL 변이체의 발현을 분석했다.
배양 배지에서 재조합 NAGAL1#7의 분비를 환원성 SDS-PAGE 전기 영동을 통해, 이어서 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석하고, 원래의 NAGAL1(Mut) 변이체와 비교했다 (도 28). 단일 복제 야로위아 형질 전환체로부터 NAGAL1#7의 발현 수준은 단일 복제 NAGAL1 (Mut) 생산 클론에 대해 수득된 발현 수준과 비교하여 유사하거나 더 낮았다. 그 결과, NAGAL1#2 (즉, 도메인 I에서 Asp213 대신 Arg213, 도메인 II에서 Arg326 대신 Asp326)은 변이체 NAGAL1#2에 대한 도입된 Asn213Asp 및 Cys326Arg 변형과 동일한 효과를 갖지 않는다. 이는 NAGAL1#7에서의 돌연변이된 아미노산의 기하학적 배열이 NAGAL 폴리펩티드의 도메인 I과 II 사이의 제2 Asp-Arg 이온쌍의 형성에 최적이 아니라는 인실리코 모델링에 기초한 발명자의 예측과 일치한다.
실시예
7: 위치 213 및 326에서
잔기들
사이의 개선된 상호 작용을 설명하는 다른 인간 NAGAL 폴리펩티드
본 발명자는 NAGAL1의 다음 변이체를 추가로 제조했다: # 4: 단일 아미노산 변화의 결과: Cys326Arg (서열 번호 18); # 5: 단일 아미노산 변화의 결과 Asn213Asp (서열 번호 19); 및 # 6: 이중 아미노산 변화의 결과 Cys326Ser 및 Asn213Asp (서열 번호 20).
SEQ ID NO: 18 (볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복, 언더라인: NAGAL1로부터의 서열 분기(sequence divergence)):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILNWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSRRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ
SEQ ID NO: 19 (볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복, 언더라인: NAGAL1로부터의 서열 분기(sequence divergence)):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILDWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSCRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ
SEQ ID NO: 20 (볼드 언더라인: 야로위아 Lip2pre 신호 펩티드 및 2개의 X-Ala 반복, 언더라인: NAGAL1로부터의 서열 분기(sequence divergence)):
MKLSTILFTACATLAAA LDNGLLQTPPMGWLAWERFRCNINCDEDPKNCISEQLFMEMADRMAQDGWRDMGYTYLNIDDCWIGGRDASGRLMPDPKRFPHGIPFLADYVHSLGLKLGIYADMGNFTCMGYPGTTLDKVVQDAQTFAEWKVDMLKLDGCFSTPEERAQGYPKMAAALNATGRPIAFSCEWPLYEGGLPPRVNYSLLADICNLWRNYDDIQDSWWSVLSILDWFVEHQDILQPVAGPGHWNDPDMLLIGNFGLSLEQSRAQMALWTVLAAPLLMSTDLRTISAQNMDILQNPLMIKINQDPLGIQGRRIHKEKSLIEVYMRPLSNKASALVFFSSRTDMPYRYHSSLGQLNFTGSVIYEAQDVYSGDIISGLRDETNFTVIINPSGVVMWYLYPIKNLEMSQQ
NAGAL #4, #5 및 #6의 3가지 변이체 모두는 아미노산 위치 213 (고발현 변이체 NAGAL1#2에서 Asp로 돌연변이)과 326 (고발현 변이체 NAGAL1#2에서 Arg로 돌연변이) 사이의 여분의 안정화 이온쌍을 형성하는 능력이 결핍될 것으로 예측될 것이다: NAGAL1#4 변이체는 326 위치에 양전하를 띤 아미노산만을 함유하고, NAGAL1#5 및 NAGAL1#6 변이체는 213 위치에 음전하를 띤 아미노산만을 함유한다. NAGAL1#6의 경우에, 유사체 NAGAL1#3과 유사하게, 유리 Cys326은 잠재적인 비정상적인 디설파이드 브릿지 형성을 방지하기 위해 Ser로 돌연변이 되었다.
NAGAL1(Mut), NAGAL1#2 및 NAGAL1#2에 대한 발현 구조물을 사용하여 표준 DNA 클로닝 기술을 통해 상기 NAGAL1 변이체 각각을 인코딩하는 발현 플라스미드 (N-말단 Lip2pre 분비 신호, 이어서 2개의 X-Ala 반복)는 생성된다. 이들 NAGAL1 변이체의 발현은 반-구성적 성장-단계 의존성 Hp4d 프로모터에 의해서도 유도되었다. NAGAL1#4, NAGAL1#5 및 NAGAL1#6 변이체의 단일 복제 발현 균주는 발현 플라스미드를 함유하는 대응하는 ADE2 변형 균주의 OXYY1315로의 형질 전환을 통해 생성되었다. 형질 전환체는 추가된 아데닌 없이 최소 배지에서 성장할 수 있는 능력에 기초하여 선택되었다. 선택된 형질 전환체의 게놈에서 발현 구조물의 통합을 PCR을 통해 확인했다. 다양한 NAGAL 변이체를 발현하기 위한 야로위아 형질 전환체의 능력을 상기와 같은 2 ml 농축 배지에서 24-웰 배양 후 평가햇다. 간단히, 여러 개의 형질 전환체를 2 ml YPD가 들어있는 웰에 접종하고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 배양시켰다. 다음날, 1 내지 2 μl의 이 배양액을 신선한 YPD가 있는 새로운 웰로 옮기고, 28 ℃ 및 180 rpm에서 밤새 재배양했다. 다음 날, 24-웰 플레이트를 원심 분리하고, 배지를 세포 펠릿으로부터 제거했다. 세포를 2 ml SuperT/글리세롤 농축 배지에 재현탁하고, 28 ℃에서 3 내지 4일 성장시켰다. 배양 마지막에, 배지를 수확하여, 다양한 NAGAL 변이체의 발현을 분석했다.
배양 배지에서 재조합 단백질의 분비를 우선 환원성 SDS-PAGE 전기 영동을 통해, 이어서 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석했다 (도 29).
앞서 도시한 바와 같이, 원래의 NAGAL1(Mut)에서는 낮은 발현 수준이, NAGAL1#2 (Asn213Asp 및 Cys326Arg)에서는 높은 발현 수준이 관측되었다. Asn213 만 Asp로 전환된 변이체 NAGAL1#5는 NAGAL1 (Mut)과 유사한 낮은 발현 수준을 보였다. 잠재적으로 도메인 II (Cys326Ser) 내에서 여분의 아미노산 변형에 기인하여, 변이체 NAGAL1#6은 NAGAL1#5와 비교하여 약간 더 높은 발현 수준을 보였다. 이는 NAGAL1#3 (Cys326Ser 변형만)이 NAGAL1 (Mut) (자유 Cys326을 포함)과 비교하여 약간 더 높은 발현 수준을 가졌다는 이전 관찰과 일치했다.
NAGAL1#4에서 관측된 상당히 더 높은 발현 수준은 도메인 II의 단일 아미노산 변형 Cys326Arg가 NAGAL1#2 변이에서 관측된 발현 수준의 매우 높은 증가에 이미 중요한 인자임을 나타내는 것을 제시한다. NAGAL1#4의 분비된 수준은 NAGAL1#2에서 관측된 것보다 약 2.5-3배 (오디세이 소프트웨어를 통해 정량화된)가 낮아, Arg326이 Asp213과 이온쌍을 형성할 가능성이 NAGAL1#2의 잠재적 발현을 더 증가시킨다는 발명자의 가설을 지지하는 것으로 보인다.
소규모 바이로리액터 배양은 상술한 바와 같이 변이체 NAGAL1#4, NAGAL1#5 및 NAGAL1#6의 야로위아 발현 균주에 대해 수행되고, NAGAL1(Mut), NAGAL1#2 및 NAGAL1#3 발현 균주의 발효와 비교하였다. 환원성 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 분석을 통한 발효의 다른 시점에서의 배양액 분석은 서로 다른 변이체의 발현 양상을 더 확인했다: NAGAL1#2> NAGAL1#4 >> 다른 모든 NAGAL1 변이체 (도 30). 제어된 바이오리액터 배양 후, NAGAL1#4 발현 수준은 NAGAL1#2의 발현 수준보다 약 5배 낮았다.
활성 NAGAL1 단백질의 분비는 상이한 NAGAL1 변이체를 발현하는 야로위아 균주의 배양액 중 α-갈락토시다아제 활성을 분석함으로써 확인했다. 활성 분석은 4-메틸움버리페릴-α-D-갈락토피라노사이드 (4MU-α-Gal)를 기질로 사용하여 24-웰 배양 또는 소규모 발효 배지의 희석물 시리즈에 대해 pH 4.5로 수행되었다 (Tajima et al. 2009, Tomasic et al., 2010). α-갈락토시다아제의 세포 외 존재는 37 ℃에서 1시간 배양하는 동안 방출된 4-메틸움벨리페릴의 양으로 측정되었고, 다른 샘플들 사이에서 비교되었다(도 31).
상기 결과는 선택된 NAGAL1#2 균주가 24-웰 배양 동안 NAGAL1#4 발현 클론보다 2.5-3배 이상의 α-갈락토시다아제 활성을 분비하는 것을 보여준다 (도 31, 좌측). 이는 세포 외 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석 후 분비된 NAGAL의 정량화와 유사하며, 웨스턴 블롯을 통해 관찰된 NAGAL1 발현의 증가가 여분의 Asn213Asp 돌연변이의 도입시 주로 활성 단백질의 여분 생산을 나타내는 것을 나타낸다. 발효 배양액에서의 활성 측정은 NAGAL1#4 발현 균주에 비해 NAGAL1#2에서 분비된 α-갈 락토시다아제 활성이 대략 6배 증가를 나타내며, NAGAL1(Mut) 균주에 대해서는 매우 적은 양의 활성 생성물만을 나타낸다.
실시예
8: 생성된 플라스미드 및 균주의
오버뷰
이하 실험에 사용되는 플라스미드는 도 32 및 33에 더 기재된다.
이하 실험에 사용되는 균쥬는 도 34a-c에 더 기재된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Oxyrane UK Ltd
<120> HUMAN ALPHA-N-ACETYLGALACTOSAMINIDASE POLYPEPTIDE
<130> OXY-022-PCT
<150> EP15202729.8
<151> 2015-12-24
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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<220>
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numbering as in mature human NAGAL)
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165 170 175
Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile Cys
180 185 190
Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser Val
195 200 205
Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln Pro
210 215 220
Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile Gly
225 230 235 240
Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu Trp
245 250 255
Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr Ile
260 265 270
Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys Ile
275 280 285
Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu Lys
290 295 300
Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Phe Phe Ser Arg Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His Ser
325 330 335
Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala Gln
340 345 350
Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr Asn
355 360 365
Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu Tyr
370 375 380
Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
385 390
<210> 8
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide N213D C326S S171E A174L (amino
acid numbering as in mature human NAGAL)
<400> 8
Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala Trp
1 5 10 15
Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn Cys
20 25 30
Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln Asp
35 40 45
Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys Trp
50 55 60
Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys Arg
65 70 75 80
Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu Gly
85 90 95
Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met Gly
100 105 110
Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr Phe
115 120 125
Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser Thr
130 135 140
Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu Asn
145 150 155 160
Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Glu
165 170 175
Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile Cys
180 185 190
Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser Val
195 200 205
Leu Ser Ile Leu Asp Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln Pro
210 215 220
Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile Gly
225 230 235 240
Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu Trp
245 250 255
Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr Ile
260 265 270
Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys Ile
275 280 285
Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu Lys
290 295 300
Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Phe Phe Ser Ser Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His Ser
325 330 335
Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala Gln
340 345 350
Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr Asn
355 360 365
Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu Tyr
370 375 380
Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
385 390
<210> 9
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide C326S S171E A174L (amino acid
numbering as in mature human NAGAL)
<400> 9
Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala Trp
1 5 10 15
Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn Cys
20 25 30
Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln Asp
35 40 45
Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys Trp
50 55 60
Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys Arg
65 70 75 80
Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu Gly
85 90 95
Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met Gly
100 105 110
Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr Phe
115 120 125
Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser Thr
130 135 140
Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu Asn
145 150 155 160
Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Glu
165 170 175
Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile Cys
180 185 190
Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser Val
195 200 205
Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln Pro
210 215 220
Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile Gly
225 230 235 240
Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu Trp
245 250 255
Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr Ile
260 265 270
Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys Ile
275 280 285
Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu Lys
290 295 300
Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Phe Phe Ser Ser Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His Ser
325 330 335
Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala Gln
340 345 350
Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr Asn
355 360 365
Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu Tyr
370 375 380
Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
385 390
<210> 10
<211> 1243
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding modified human NAGAL polypeptide
S188E A191L (amino acid numbering starting from the starting
methionine) for expression in Yarrowia lipolytica
<400> 10
cacaatgaag ctctctacta ttctctttac cgcctgcgcc accctcgccg ctgctctcga 60
caacggactc ctccagactc ctcctatggg ctggctggct tgggagcgat tccgatgcaa 120
catcaactgt gacgaggacc ccaagaactg catttctgag cagctcttta tggagatggc 180
tgaccgaatg gcccaggacg gatggcgaga tatgggctac acctacctga acatcgacga 240
ttgttggatt ggcggtcgag acgcctctgg tcgactcatg cccgatccta agcgattccc 300
ccacggaatc ccttttctgg ctgactacgt ccattccctg ggcctcaagc tgggtattta 360
cgccgacatg ggcaacttca cctgcatggg ctaccccggt accactctcg acaaggtcgt 420
gcaggatgct cagaccttcg ccgagtggaa ggtggacatg ctcaagctgg atggatgttt 480
ttccactcct gaggagcgag ctcagggata ccctaagatg gccgctgccc tgaacgctac 540
cggtcgaccc atcgccttct cctgcgagtg gcctctctac gagggaggac tgcctcctcg 600
agtcaactac tctctgctcg ctgacatctg taacctctgg cgaaactacg acgatattca 660
ggattcgtgg tggtccgtcc tctctatcct gaactggttc gtggagcacc aggacattct 720
gcagcccgtg gccggtcctg gacattggaa cgaccccgat atgctgctca tcggaaactt 780
tggcctctcg ctggagcagt cccgagctca gatggctctc tggaccgttc tggctgctcc 840
tctgctcatg tcgaccgacc tgcgaactat ctccgctcag aacatggata ttctccagaa 900
ccccctgatg atcaagatta accaggaccc tctcggtatc cagggacgac gaatccacaa 960
ggagaagtcg ctgattgagg tttacatgcg acccctctct aacaaggctt cggccctggt 1020
cttcttttcc tgccgaaccg acatgcctta ccgataccat tcctctctcg gccagctgaa 1080
cttcactggt tctgtgatct acgaggccca ggacgtttac tccggtgata tcatttctgg 1140
actgcgagac gagaccaact ttactgtgat cattaacccc tctggagttg tcatgtggta 1200
cctctaccct attaagaacc tggagatgtc gcagcagtaa tag 1243
<210> 11
<211> 411
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide S188E A191L (amino acid
numbering starting from the starting methionine)
<400> 11
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met
115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser
145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile
195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
Val Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln
225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His
340 345 350
Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala
355 360 365
Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr
370 375 380
Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 12
<211> 1245
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding human alpha-galactosidase for
expression in Yarrowia lipolytica
<400> 12
atgaagcttt ccaccatcct cttcacagcc tgcgctaccc tggccctgga caacggcctg 60
gcccgaaccc ccaccatggg ctggctgcac tgggagcgat tcatgtgtaa cctggactgt 120
caggaagagc ccgactcttg tatctctgag aagctgttca tggaaatggc cgagctgatg 180
gtgtctgagg gctggaagga cgccggctac gagtacctgt gtatcgacga ctgttggatg 240
gccccccagc gagactctga gggccgactc caggccgacc cccagcgatt cccccacggc 300
atccgacagc tcgccaacta cgtgcactct aagggcctga agctgggcat ctacgccgac 360
gtgggcaaca agacctgtgc cggcttcccc ggctctttcg gctactacga catcgacgcc 420
cagaccttcg ccgactgggg cgtggacctg ctgaagttcg acggctgtta ctgtgactct 480
ctcgagaacc tggccgacgg ctacaagcac atgtctctgg ccctgaaccg aaccggccga 540
tctatcgtgt actcttgtga gtggcccctg tacatgtggc ccttccagaa gcccaactac 600
accgagatcc gacagtactg taaccactgg cgaaacttcg ccgacatcga cgactcgtgg 660
aagtctatca agtctattct ggactggacc tctttcaacc aggagcgaat cgtcgacgtc 720
gccggacccg gcggatggaa cgaccccgac atgctggtga tcggcaactt cggcctgtct 780
tggaaccagc aggtgaccca gatggccctg tgggctatca tggctgcccc cctgttcatg 840
tctaacgacc tgcgacacat ctctccccag gccaaggccc tgctccagga caaggacgtg 900
atcgccatca accaggaccc cctgggcaag cagggctacc agctccgaca gggcgacaac 960
ttcgaggtgt gggagcgacc cctgtctggc ctggcctggg ccgtggccat gatcaaccga 1020
caggagatcg gcggaccccg atcttacacc atcgccgtgg cctccctggg aaagggcgtg 1080
gcctgtaacc ccgcctgttt catcacccag ctcctgcccg tgaagcgaaa gctgggattc 1140
tacgagtgga cctctcgact gcgatctcac atcaacccca ccggcaccgt gctgctccag 1200
ctcgagaaca ccatgcagat gtctctgaag gacctgctgt aataa 1245
<210> 13
<211> 413
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> human alpha-galactosidase containing Yarrowia Lip2pre signal
peptide and one X-Ala repeat
<400> 13
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Leu
1 5 10 15
Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu
20 25 30
Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile
35 40 45
Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly
50 55 60
Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met
65 70 75 80
Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg
85 90 95
Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly
100 105 110
Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly
115 120 125
Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala
130 135 140
Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser
145 150 155 160
Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn
165 170 175
Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met
180 185 190
Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn
195 200 205
His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys
210 215 220
Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn
245 250 255
Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala
260 265 270
Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser
275 280 285
Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn
290 295 300
Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn
305 310 315 320
Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala
325 330 335
Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala
340 345 350
Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile
355 360 365
Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr
370 375 380
Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu
405 410
<210> 14
<211> 415
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide S171E A174L (amino acid
numbering as in mature human NAGAL), domain II swapped with human
alpha-galactosidase, and containing Yarrowia Lip2pre signal
peptide and two X-Ala repeats
<400> 14
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met
115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser
145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile
195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
Val Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln
225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly
305 310 315 320
Asp Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala
325 330 335
Val Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr
340 345 350
Ile Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys
355 360 365
Phe Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu
370 375 380
Trp Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu
385 390 395 400
Leu Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu
405 410 415
<210> 15
<211> 411
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide N213D C326R S171E A174L (amino
acid numbering as in mature human NAGAL), and containing Yarrowia
Lip2pre signal peptide and two X-Ala repeats
<400> 15
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met
115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser
145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile
195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
Val Leu Ser Ile Leu Asp Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln
225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Val Phe Phe Ser Arg Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His
340 345 350
Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala
355 360 365
Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr
370 375 380
Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 16
<211> 411
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide C326S S171E A174L (amino acid
numbering as in mature human NAGAL), and containing Yarrowia
Lip2pre signal peptide and two X-Ala repeats
<400> 16
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met
115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser
145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile
195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
Val Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln
225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Val Phe Phe Ser Ser Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His
340 345 350
Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala
355 360 365
Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr
370 375 380
Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 17
<211> 411
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide N213R C326D S171E A174L (amino
acid numbering as in mature human NAGAL), and containing Yarrowia
Lip2pre signal peptide and two X-Ala repeats
<400> 17
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met
115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile
195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
Val Leu Ser Ile Leu Arg Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln
225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 18
<211> 411
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide C326R S171E A174L (amino acid
numbering as in mature human NAGAL), and containing Yarrowia
Lip2pre signal peptide and two X-Ala repeats
<400> 18
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
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20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Val Phe Phe Ser Arg Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His
340 345 350
Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala
355 360 365
Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr
370 375 380
Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 19
<211> 411
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide N213D S171E A174L (amino acid
numbering as in mature human NAGAL), and containing Yarrowia
Lip2pre signal peptide and two X-Ala repeats
<400> 19
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met
115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser
145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile
195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
Val Leu Ser Ile Leu Asp Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln
225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His
340 345 350
Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala
355 360 365
Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr
370 375 380
Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 20
<211> 411
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> modified human NAGAL polypeptide N213D C326S S171E A174L (amino
acid numbering as in mature human NAGAL), and containing Yarrowia
Lip2pre signal peptide and two X-Ala repeats
<400> 20
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
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115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
Phe Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser
145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Glu Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile
195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
Val Leu Ser Ile Leu Asp Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln
225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Val Phe Phe Ser Ser Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His
340 345 350
Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala
355 360 365
Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr
370 375 380
Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 21
<211> 411
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Leu Leu Lys Thr Val Leu Leu Leu Gly His Val Ala Gln Val Leu
1 5 10 15
Met Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn
35 40 45
Cys Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln
50 55 60
Asp Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys
65 70 75 80
Trp Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys
85 90 95
Arg Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu
100 105 110
Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met
115 120 125
Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Ser Trp Pro Ala Tyr
180 185 190
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195 200 205
Cys Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Pro Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile
245 250 255
Gly Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu
260 265 270
Trp Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr
275 280 285
Ile Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys
290 295 300
Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His
340 345 350
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355 360 365
Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr
370 375 380
Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
405 410
<210> 22
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> domain I of human NAGAL polypeptide
<400> 22
Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala Trp
1 5 10 15
Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn Cys
20 25 30
Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln Asp
35 40 45
Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys Trp
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu Asn
145 150 155 160
Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Ser Trp Pro Ala Tyr Glu
165 170 175
Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile Cys
180 185 190
Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser Val
195 200 205
Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln Pro
210 215 220
Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile Gly
225 230 235 240
Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu Trp
245 250 255
Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr Ile
260 265 270
Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys Ile
275 280 285
Asn Gln Asp
290
<210> 23
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> domain II of human NAGAL polypeptide
<400> 23
Gly Arg Arg Ile His Lys Glu Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg
1 5 10 15
Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser Ala Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr
20 25 30
Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His Ser Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr
35 40 45
Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala Gln Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile
50 55 60
Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr Asn Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser
65 70 75 80
Gly Val Val Met Trp Tyr Leu Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser
85 90 95
Gln Gln
Claims (48)
- 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되는, 인간 α-N-아세틸갈락토사미니다아제(NAGAL) 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 세 개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 세 개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 세 개의 아미노산으로 치환되고, 상기 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 세 개의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되고, 상기 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고,
상기 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
상기 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 아미노산은 시스테인이고,
상기 시스테인은 시스테인 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
상기 시스테인은 시스테인 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 시스테인은 시스테인 이외에 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 아미노산을 치환하는 아미노산 또는 아미노산들은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 아미노산을 치환하는 아미노산 또는 아미노산들은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 하나 이상의 아미노산으로 치환되는데, 이들 아미노산 중 적어도 하나는 음전하를 띄는 측쇄기(negatively charged side-chain group)를 함유하거나,
상기 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되는데, 이들 아미노산 중 적어도 하나는 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하거나,
상기 제1 아미노산은 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제8항에 있어서,
상기 음전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 적어도 하나의 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산, 바람직하게는 아스파르트산인 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 아미노산은 하나 이상의 아미노산으로 치환되는데, 이들 아미노산 중 적어도 하나는 양전하를 띄는 측쇄기(positively charged side-chain group) 또는 극성 비전하 측쇄기(polar uncharged side-chain group)를 함유하거나,
상기 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되는데, 이들 아미노산 중 적어도 하나는 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하거나,
상기 제2 아미노산은 양전하를 띄는 측쇄기 또는 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제10항에 있어서,
상기 양전하를 띄는 측쇄기를 함유하는 적어도 하나의 아미노산은 아르기닌, 히스티딘 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이고, 또는 상기 극성 비전하 측쇄기를 함유하는 적어도 하나의 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민, 바람직하게는 세린인 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 아스파르트산으로 치환되고, 상기 제2 아미노산은 아르기닌으로 치환되거나,
상기 제2 아미노산은 아르기닌으로 치환되거나,
상기 제1 아미노산은 아스파르트산으로 치환되고, 상기 제2 아미노산은 세린으로 치환되거나,
상기 제2 아미노산은 세린으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 서열 동일성을 보이거나,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 서열 동일성을 보이거나,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 4와 적어도 90% 서열 동일성을 보이거나,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 서열 동일성을 보이는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편으로,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있거나,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아스파라긴 213에 대응하는 제1 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 시스테인 326에 대응하는 제2 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환되어, 제1 아미노산을 치환하는 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나는 제2 아미노산을 치환하는 상기 하나 이상의 아미노산 중 적어도 하나와 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제14항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제1 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되고, 상기 제2 아미노산은 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제14항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되거나,
상기 제1 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되고, 상기 제2 아미노산은 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 아미노산은 아스파라긴이고,
상기 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
상기 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 아스파라긴은 아스파라긴 이외에 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 아미노산은 시스테인이고,
상기 시스테인은 시스테인 이외에 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나,
상기 시스테인은 시스테인 이외에 하나, 둘 또는 3개의 아미노산으로 치환되거나,
상기 시스테인은 시스테인 이외에 하나의 아미노산으로 치환되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 상호 작용은 이온 상호 작용 또는 수소 결합 상호 작용 또는 반데르발스 상호 작용인 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제19항에 있어서,
상기 이온 상호 작용은 적어도 하나의 이온쌍의 형성을 포함하는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제20항에 있어서,
상기 적어도 하나의 이온쌍은 제1 아미노산을 치환하는 상기 하나 이상의 아미노산으로 구성되는 아미노산의 음전하를 띄는 측쇄기와, 제2 아미노산을 치환하는 상기 하나 이상의 아미노산으로 구성되는 아미노산의 양전하를 띄는 측쇄기 사이에 형성되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제19항에 있어서,
상기 수소 결합 상호 작용은 직접 상호 작용이고, 또는 상기 수소 결합 상호 작용은 하나 이상의 용매 분자, 바람직하게는 하나 이상의 물 분자를 포함하는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
α-갈락토시다아제 활성을 얻기 위해 더 변형되는, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제23항에 있어서,
SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 171의 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 S에서 E로의 치환, 및 SEQ ID NO: 1에 제시된 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 174의 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 A에서 L로의 치환을 포함하는, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제23항 또는 제24항에 있어서,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90% 서열 동일성을 보이거나,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 7과 적어도 90% 서열 동일성을 보이거나,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90% 서열 동일성을 보이거나,
상기 인간 NAGAL 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9에 제시된 것이고, 또는 상기 기능적 활성 변이체는 SEQ ID NO: 9와 적어도 90% 서열 동일성을 보이는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 결합 펩티드를 이용하거나 이용하지 않고, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 C- 또는 N-말단에 또는 양 말단에 결합된 하나 이상의 이종(heterologous) 아미노산 서열과 같은, 하나 이상의 이종 아미노산 서열을 더 포함하는, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 N-글리칸을 포함하고,
바람직하게는, 상기 N-글리칸 중 하나 이상은 인산화되고, 더욱 바람직하게는 상기 N-글리칸 수의 40% 이상이 인산화되는 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제27항에 있어서,
상기 인산화된 N-글리칸 중 하나 이상은 언캡핑되고(uncapped), 탈만노실화되고(demannosylated), 바람직하게는 상기 인산화된 N-글리칸 수의 40% 이상이 언캡핑되고 탈만노실화된 것인, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
치료에 사용되는, 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 파브리병의 치료 방법에 사용하기 위한, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항 또는 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편, 또는
쉰들러병 또는 칸자키병(Kanzaki disease)의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항 또는 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에서 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자의 파브리병의 치료 방법, 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에서 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자의 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제33항에 정의된 핵산 분자 및 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 포함하는 발현 카셋 또는 발현 벡터로,
바람직하게는, 상기 발현 카셋 또는 발현 벡터는 숙주 세포, 바람직하게는 균류 세포, 더욱 바람직하게는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica ) 또는 아슐라 아데니니보란스( Arxula adeninivorans )에서 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 발현을 야기하도록 구성되는 것인, 발현 카셋 또는 발현 벡터.
- 치료에 사용되는, 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터.
- 제35항에 따라 사용되는 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터로,
상기 치료는 유전자 치료 또는 mRNA 치료인 것인, 핵산 분자 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터.
- 파브리병의 치료 방법에 이용되는, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항 또는 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 인코딩하는 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터로,
바람직하게는 상기 방법은 유전자 치료 방법 또는 mRNA 치료 방법인 것인, 핵산 분자 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터.
- 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법에 이용되는, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 인코딩하는 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터로,
바람직하게는 상기 방법은 유전자 치료 방법 또는 mRNA 치료 방법인 것인, 핵산 분자 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항 또는 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 인코딩하는 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자의 파브리병의 치료 방법으로,
바람직하게는 상기 방법은 유전자 치료 방법 또는 mRNA 치료 방법인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 종속할 때 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 인코딩하는 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자의 쉰들러병 또는 칸자키병의 치료 방법으로,
바람직하게는 상기 방법은 유전자 치료 방법 또는 mRNA 치료 방법인 것인, 방법.
- 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제33항에 정의된 핵산 분자 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제42항에 있어서,
상기 숙주 세포는 균류 세포, 바람직하게는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아슐라 아데니니보란스( Arxula adeninivorans )인 것인, 숙주 세포.
- 제42항 또는 제43항에 있어서,
상기 숙주 세포는,
-OCH1 활성 결핍과 같은 N-글리칸 활성의 외측 쇄 연장의 결핍을 포함하도록; 및/또는
-MNN4, PNO1, MNN6 또는 이들 중 어느 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편과 같은 N-글리칸의 만노실 인산화 반응을 야기할 수 있는 폴리펩티드의 발현을 포함하도록 유전자 조작되는 것인, 숙주 세포.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 하나에 정의된 숙주 세포의 사실상 순수한 배양액(culture).
- 숙주 세포에 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 발현을 달성하기 위한 제33항에 정의된 핵산 분자의 용도 또는 제34항에 정의된 발현 카셋 또는 발현 벡터로,
바람직하게는 상기 숙주 세포는 균류 세포, 더욱 바람직하게는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica ) 또는 아슐라 아데니니보란스( Arxula adeninivorans)인 것인, 핵산 분자의 용도 또는 발현 카셋 또는 발현 벡터.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편의 제조 방법으로,
a) 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 숙주 세포를 배양하여, 숙주 세포가 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 발현하는 단계,
b) 상기 숙주 세포로부터 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 수집하고, 분리하거나 분리하지 않는 단계,
를 포함하는, 방법.
- 제47항에 있어서,
인간 NAGAL 폴리펩티드 또는 이의 기능적 활성 변이체 또는 단편을 포함하는 인산화 N-글리칸의 적어도 한 분획의 언캡핑 및 탈만노실화를 더 포함하고,
예컨대 상기 언캡핑 및 탈만노실화는 생체 외에서, 또는 숙주 세포 내에서, 또는 숙주 세포의 용해물 내에서 발생하는 것인, 방법.
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| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20240709 Patent event code: PE09021S01D |
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| PC1902 | Submission of document of abandonment before decision of registration |