KR20180068649A

KR20180068649A - 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP (polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법과 Chlorin e6의 제조 방법

Info

Publication number: KR20180068649A
Application number: KR1020160170548A
Authority: KR
Inventors: 김용완; 이양구
Original assignee: 동성제약주식회사
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-06-22
Also published as: WO2018110777A1

Abstract

일 실시예에 따르면, 분자식(molecular formula) C₃₄H₃₆N₄O₆ 로 표현되는 클로린 e6(Chlorin e6), PVP (polyvinylpyrrolidone), NaOH, 및 HCl을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합하는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계;를 포함하며, 상기 혼합하는 단계는 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체를 생성하는 단계인 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법이 개시된다.

Description

고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP (polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법과 Chlorin e6의 제조 방법{Process for preparing high purity trisodium Chlorin e6 and PVP complex, and Chlorin e6 from spirulina extracts}

본 발명은 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법과 Chlorin e6의 제조 방법에 관한 것이다.

종래 클로린 e6를 제조하는 특허문헌들에는, 스피루리나 또는 클로렐라에서 클로로필 추출, 산 처리, 중화, 가수분해, 페오포비드 a의 추출, 아세톤에의 용해, 강염기 첨가, 중화, 및 재침전 등의 복잡하고 오랜 시간 추출/분리/정제공정 과정을 통해 클로린 e6를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 방법들은 클로로필 a와 페오피틴 a가 완전 정제된 상태가 아닌 추출액과 추출물 형태로 다음 반응이 진행되므로, 최종물질인 클로린 e6의 순도는 낮아진다.

또한 종래 방법들에 의해 제조된 클로린 e6는 식품이나 의약품으로 사용할 수 없고, 또한 긴 반응시간과 복잡한 반응과정으로 인하여 상업적으로 이용하기에는 한계가 있고, 클로린 e6 특유의 의약품 또는 식품산업분야에 적용되기에는 부적합하다. 따라서 현재까지 알려진 스피루리나로부터 클로린 e6의 제조방법은 식품 또는 의약품 분야에서 사용이 제한된 유해 유기용매를 사용하고, 반응 시간도 길고 복잡할 뿐만 아니라 멸균공정 부재로 인해 식품, 의약품 생산공정에 적용하기에는 한계가 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 클로린 e6의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 짧은 제조 시간 및 높은 재현성을 가지는 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 위생적으로 멸균 처리되어 식품 및 의약품 원료로 사용하기 적합한 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 다음의 구조

를 가지고, 분자식(molecular formula) C₃₄H₃₆N₄O₆ 로 표현되는 클로린 e6(Chlorin e6),

PVP (polyvinylpyrrolidone), NaOH, 및 HCl을 혼합하는 단계; 및

상기 혼합하는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계;를 포함하며,

상기 혼합하는 단계는 다음의 구조

를 가지며 분자식 C₃₄Н₃₃О₆N₄Na₃로 표현되는 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 상기 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체를 생성하는 단계인 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법에 있어서,

클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액에 넣어 클로로필 추출물을 추출하는 단계;

상기 클로로필 추출물에 헥산과 물을 넣고 교반 하는 단계;

교반 된 용액에서 헥산 층을 분리하여 클로로필을 정제하는 단계;

정제된 클로로필을 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 용해시킨 후, 산을 첨가하여 산성화하는 단계;

상기 산성화하는 단계의 수행 결과물에 물을 첨가하여 페오피틴(pheophytin) 침전물을 획득하는 단계; 및

상기 페오피틴 침전물을 아세톤에 용해시키고 염기를 첨가하여 클로린 e6을 생성하는 단계;를 포함하는 것인, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 스피루리나로부터 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP 복합체를 제조하는 일련의 과정을 수행함에 있어, 클로로필 및 페오피틴의 정제과정을 필수 공정으로 포함하여 최종적으로 제조되는 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6) 또는 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP 의 복합체의 순도와 정제 공정기간을 크게 개선하는 효과를 얻는다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 클로로필에 대한 헥산과 물의 용해도 차이, 동적 복합파장 초음파 공정, 다공성 알루미나 세라믹필터를 이용하여 클로로필 추출물로부터 순도 높은 클로로필을 침전물로 수득하는 효과를 얻는다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 클로로필을 산 처리하여 페오피틴으로 전환한 용액에, 물을 직접 투입하여 반응용액을 중화시킴은 물론이고 초음파공정을 이용하여 페오피틴의 침전속도 및 침전율을 향상시켜 순도 높은 페오피틴을 수득하는 효과를 동시에 얻는다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 페오피틴을 클로린 e6로 전환하는 과정을 염기 존재, 가열 조건, 멸균여과 공정에서 수행하여, 반응시간의 단축, 위생적 공정 및 제조 수율을 향상시키는 효과를 얻는다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 고순도 클로린 e6와 PVP를 온도, 교반, 산, 염기 존재 조건에서 수행하여 수용성 트리소듐 클로린 e6 와 PVP의 복합체로 전환하는 과정으로 제조 수율을 향상시키는 효과를 얻는다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 수용성으로 전환된 트리소듐 클로린 e6 용액에 산, 염기 존재 및 특정 pH 조건에서 트리소듐 클로린 e6와 PVP의 복합체로 전환하는 과정을 수행하며 특정 동결건조 조건을 이용하여 식품과 의약품에 사용 가능한 복합체로 건조되는 효과를 얻는다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 전환된 트리소듐 클로린 e6을 멸균 및 여과 후에 동결 건조하여 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP의 복합체의 파우더 형태로 전환하여 식품과 의약품에 사용 가능한 복합체로 제조 수율을 향상시키는 효과를 얻는다.

따라서, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따르면, 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP의 복합체의 대량생산이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 클로로필 추출물에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 고순도 클로로필 추출물에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 페오피틴에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 고순도 클로린 e6(Chlorin e6)의 핵자기공명(NMR) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 클로린 e6(Chlorin e6)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 클로린 e6(Chlorin e6)의 액체 크로마토그래피 질량분석법 (Liquid Chromatography Mass Spectrometry LC/MS) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 고순도 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6) (sample)와 상용화된 제품(standard - Frontiers)의 HPLC 비교 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6) 와 분자량 10,000 이하 PVP 복합체의 자외가시부 흡광도 측정법의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6) 의 함량을 계산하는 수식을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP 복합체에서 UV/VIS Spectrophotometry를 이용한 흡광도 비교 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소는 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본원 명세서에서 용어 "암" 및 "종양"은 통상적으로 제어되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병증을 의미하거나 기술한다. 양성 및 악성 암, 및 휴면 종양 또는 미소전이가 이 정의에 포함된다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 암의 더 특정한 예는 예를 들어 피부암, 구순암, 흑색종(피부전이), 유방암(피부전이), 피부기저세포암, 변형성 피부암, 피부편평상피세포암, 및 아랫입술의 편평세포암을 포함하지만, 이들로 제한 되지는 않는다. 다른 암은 예를 들어 유방암, 편평세포암, 폐암(소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종 포함), 전신경 교모세포종, 신경 교모세포종, 전형적 교모세포종 및 중간엽 교모세포종, 복막의 암, 위장암,위암(위장관암 포함), 췌장암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 방광암, 대장암, 대장직장암, 자궁내 막암, 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암, B 세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 소림프성 (small lymphocytic: SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아 구성 NHL; 고등급 작은 비분할 세포 NHL; 벌키 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 포함), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), 급성 림프아구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL), 모발 세포 백혈병, 만성 골수아구성 백혈병, 이식 후 림프증식성 장 애(post-transplant lymphoproliferative disorder: PTLD), , 모반증과 연관된 이상 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 연관된 것), 및 메이그스 증후군(Meigs' syndrome)을 포함한다.

또한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "암" 및 "종양"은 모든 신생 세포 성장 및 증식(악성이든 또는 양성이든), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본 명세서에 언급되는 것으로 상호 배타적이지 않다.

본원 명세서에서, 용어 '복합체'는 트리소듐 Chlorin e6(trisodium Chlorin e6)와 분자량 15,000 이하 폴리비닐피로리돈(이하, "PVP")(polyvinylpyrrolidone)의 복합체를 의미하는 것으로 사용하기로 한다.

본 발명의 실시예에 따라서 제조된 트리소듐 Chlorin e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체는, 광역학적으로 암을 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 트리소듐 Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법은, Chlorin e6, PVP (polyvinylpyrrolidone), NaOH, 및 HCl을 혼합하는 단계와 상기 혼합하는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계를 포함한다.

본 실시예에서, Chlorin e6 는 다음의 구조

를 가지며, 분자식(molecular formula) C₃₄H₃₆N₄O₆ 로 표현된다.

본 실시예에서, 혼합하는 단계는 다음의 구조

를 가지며 분자식 C₃₄Н₃₃О₆N₄Na₃로 표현되는 트리소듐 Chlorin e6와 상기 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체를 생성하는 단계이다.

제1실시예

제1실시예에 따르면, 트리소듐 Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법은, Chlorin e6를 멸균 및 여과시키는 단계(S50), Chlorin e6, PVP (polyvinylpyrrolidone), NaOH, 및 HCl을 혼합하는 단계(S100), 및 상기 혼합하는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계(S110)를 포함한다.

즉, 제1실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)를 수행하기 전에, Chlorin e6를 멸균 및 여과시키는 단계(S50)를 수행한다.

제1실시예에 따르면, 멸균 및 여과 시키는 단계(S50)는,

Chlorin e6를 물에 용해시키고, 용해물의 pH를 7 보다 적도록 pH를 조절하는 제1 pH 조절단계; pH가 7 보다 적은 용해물의 pH를 7 이상으로 pH를 조절하는 제2 pH 조절단계; 및 pH가 7 이상인 상기 용해물을 마이크로 필터를 이용하여 멸균 및 여과시키는 단계;를 포함한다. 여기서, 마이크로 필터는 예를 들면, 0.22㎛ 직경을 가진 것일 수 있으나 이러한 수치는 예시적인 것이다.

제1실시예에 따르면, 예를 들면, 제1 pH 조절단계는 용해물의 pH를 2로 조절하는 단계이고, 제2 pH 조절단계는 상기 용해물의 pH를 7.1로 조절하는 단계이다.

제1실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는 혼합하는 단계(S100)의 수행결과인 혼합물의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계를 포함한다.

제1실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는, 혼합하는 단계(S100)의 수행결과인 혼합물의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계와 마이크로 필터를 이용하여 혼합물을 멸균 및 여과시키는 단계를 포함하도록 구현될 수 있다.

제1실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는 혼합물에서 NaCl의 중량 퍼센트가 5% 이하가 되도록 수행될 수 있다.

제2실시예

제2실시예에 따르면, Chlorin e6, PVP (polyvinylpyrrolidone), NaOH, 및 HCl을 혼합하는 단계(S100), 및 상기 혼합하는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계(S110)를 포함하고, 여기서 혼합하는 단계(S110)는 혼합하는 단계(S110)의 수행결과인 혼합물의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계와 마이크로 필터를 이용하여 혼합물을 멸균 및 여과시키는 단계를 포함한다. 마이크로 필터는 예를 들면, 0.22㎛ 직경을 가진 것일 수 있으나 이러한 수치는 예시적인 것이다.

제2실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는 혼합물에서 NaCl의 중량 퍼센트가 5% 이하가 되도록 수행될 수 있다.

본원 명세서에서, 용어 '복합체'라고 함은 트리소듐 Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 복합체는, 트리소듐 Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)가 1:9, 5:5, 4:6, 또는 6:4, 9:1로 구성된 것일 수 있다. 이러한 수치는 예시적인 것이므로 본원 발명의 권리범위가 그러한 수치에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는, 혼합하는 단계의 수행결과인 혼합물의 PH가 7 - 9가 되도록 수행된다.

한편, 혼합하는 단계(S100)는

또는

와 같이 표현될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는,

Chlorin e6와 분자량 15,000 이하 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 먼저 혼합시키고 난 후, Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 혼합물과 NaOH와 HCl을 혼합시키는 방법으로 구현될 수 있다. 여기서, NaOH와 HCl의 몰수는 혼합하는 단계의 결과물의 PH가 7 내지 9가 되도록 정해진다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는

Chlorin e6와 NaOH와 HCl를 먼저 혼합시키고 난 후, Chlorin e6와 NaOH와 HCl의 혼합물과 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 혼합시키는 방법으로 구현될 수 있다. 여기서, NaOH와 HCl의 몰수는 혼합하는 단계의 결과물의 PH가 7 내지 9가 되도록 정해진다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 혼합하는 단계(S100)는

Chlorin e6와 NaOH와 HCl와 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 동시에 혼합시키고, 혼합물의 PH가 7 내지 9가 되도록 하는 방법으로 구현될 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 Chlorin e6를 제조하는 방법을 설명하기로 한다. 본 방법에 따라 제조된 Chlorin e6는 상술한 복합체를 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 Chlorin e6를 제조하는 방법은, 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액에 넣어 클로로필 추출물을 추출하는 단계, 클로로필 추출물에 헥산과 물을 넣고 교반하는 단), 교반된 용액에서 헥산층을 분리하여 클로로필을 정제하는 단계, 정제된 클로로필을 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 용해시킨 후, 산을 첨가하여 산성화하는 단계, 산성화하는 단계의 수행 결과물에 물을 첨가하여 페오피틴(pheophytin) 침전물을 획득하는 단계, 및 페오피틴 침전물을 아세톤에 용해시키고 염기를 첨가하여 클로린 e6을 생성하는 단계를 포함한다.

본 실시예에 따르면, 추출하는 단계는, 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액에 넣는 단계와 수용액에 초음파를 가하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 초음파는 주파수가 10 내지 50 kHz 일 수 있다.

본 실시예는, 교반하는 단계의 수행 전에, 추출하는 단계의 수행 결과물을 필터를 이용하여 분리 농축시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 실시예에 따르면, 교반하는 단계는 클로로필 추출물에 헥산과 물을 넣어 제1 혼합물을 생성하는 단계와 혼합물에 초음파를 가하면서 제1 혼합물을 교반시키는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 초음파는 주파수가 10 내지 50 kHz 일 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 트리소듐 Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법과 Chlorin e6를 제조하는 방법을 구체적으로 설명하기로 한다.

클로로필의 추출 및 정제 방법

본 방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 클로로필 a와 b의 추출 및 정제 방법이다. 본 방법에 따라 추출 및 정제된 클로로필 a와 b는 상술한 복합체를 제조하는데 사용될 수 있다.

본 방법에 따르면, 스피루리나를 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 동적 복합파장 초음파 추출기술을 이용하여 클로로필을 추출하여 획득하는 방법이다.

본 방법에 따르면, 클로로필 수득에 사용된 녹색 식물 또는 미세조류의 선택에 특별한 제한을 두고 있지 않으며, 클로로필을 함유하는 모든 식물 또는 미세조류라면 모두 적용될 수 있다.

본 방법에 따르면, 녹색식물 또는 미세조류를 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이의 수용액과 같이 극성이 상대적으로 큰 용매와 초음파 추출 방법을 이용하여 추출하고 다공성 알루미나 세라믹 필터 (5-20μm)를 이용하여 분리 및 농축하여 클로로필 추출물을 얻는다. 이후, 클로로필에 대한 용해도가 높고 극성이 비교적 낮은 헥산을 상기 클로로필 추출물에 첨가하고 초음파 추출 및 교반 하여 클로로필을 최대한 헥산 층으로 이동시킨 후, 여기에 물을 첨가하고 교반해주면 헥산 층에 포함될 수 있는 클로로필 이외의 불순물을 물 층으로 이동시키는 정제 과정을 통해 고순도의 클로로필을 헥산 층에서 얻는다.

본 방법에 따르면, 헥산은 클로로필과 같은 비극성 특성을 가지고 있어 클로로필에 대한 용해도가 높을 뿐만 아니라, 헥산은 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액과 서로 섞이지 않고 층 분리되는 특성을 가지고 있다. 따라서, 클로로필 추출물을 초음파, 헥산과 물을 사용하여 정제함에 의해 클로로필은 헥산 층에 보다 쉽게 용해되어 분포하게 되고, 클로로필 이외의 불순물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 아세톤 층으로 보다 쉽게 층 분리되어 분포하게 되므로, 고순도의 클로로필 수득이 가능하다.

본 방법에 따르면, 스피루리나에서 클로로필 추출시 사용되는 초음파는 10-50 kHz, 100-500 W로 조절가능하며, 추출율 100% 도달에 걸리는 시간이 최대 2시간으로서 기존 6시간 - 12시간보다 매우 효과적이며 경제적이다.

본 방법에 따르면, 클로로필 추출용매로서 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액을 사용하는 경우, 추출용매 중의 물 함유량은 30 부피% 미만으로 조절 가능하다. 그 이유는 초음파 추출 장비를 사용하게 되면 짧은 시간내에 클로로필의 추출이 가능해 클로로필의 분해 및 변성을 방지할 수 있기 때문이다.

본 방법에 따르면, 초음파와 함께 사용되는 정제용매 헥산은, 농축된 클로로필 추출물의 부피에 대하여 최대 3배 내로 줄이며 사용 가능하다. 초음파가 사용되면 상대적으로 적은 양의 헥산으로 클로로필이 헥산 층으로 쉽게 이동하여 경제적으로 클로로필의 수율을 증가시키는 원인이 될 수 있고, 경제적이다. 초음파를 동반한 헥산에 의한 추출과정에서 교반시간은 1 시간 이내이며, 초음파를 사용하지 않는 경우 교반시간 3시간 보다 단축하게 된다.

또한, 본 방법에 따르면, 클로로필의 정제를 위하여 헥산으로 추출한 후에, 추가로 초음파 및 물을 이용하여 추출하게 되면 클로로필의 정제효과는 보다 극대화될 수 있다. 즉 초음파 처리와 물을 첨가하여 불순물을 수층으로 쉽게 이동시켜 헥산 층으로부터 고순도의 클로로필을 얻을 수 있다. 이때 다공성 알루미나 세라믹 필터 (5-20 μm)를 이용하여 여과할 수 있으며, 또한 초음파는 10-50kHz, 100-500W로 조절 가능하며 5분 내지 10분 이내로 짧은 시간 처리하는 것이 좋다. 이 과정에서 초음파를 사용함으로써 에멀젼 형성을 방지할 수 있으므로 경제적이다.

이상 설명한 본 발명에 따른 클로로필의 추출 및 정제 방법은, 종래 3일의 공정기간을 단 12시간 이내로 단축가능하며 정제된 클로로필 a와 b는 90% 이상의 순도를 가진다.

페오피틴 합성 방법

본 방법은 본 발명의 일 실시예에 따른 페오피틴 수득 방법이다.

본 방법에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 클로로필 a를 산으로 처리하여 마그네슘이 제거된 하기 화학식 2로 표시되는 페오피틴을 수득한다.

<화학식 1>

<화학식 2>

본 방법에 따르면, 클로로필을 용매에 용해시킨 후에, 산을 첨가하고 초음파 처리 (10-50kHz, 100-500 W로 조절 가능) 및 상온 교반 하여 클로로필 분자 내에 포함된 마그네슘 원자를 탈리 시켜, 30분 - 1시간 이내에 페오피틴으로 전환시킨다.

본 방법에 따르면, 마그네슘 탈리를 위해 첨가하는 산은 클로로필 한 분자당 3 당량 이내이며, 반응용액의 pH는 1 내지 3의 범위로 조절된다. 이때 사용되는 산의 첨가량은 초음파 처리와 더불어 소량 사용하여 경제적이며, 과다반응으로 인한 페오포비드 부산물 형성을 방지할 수 있는 특징이 있다. 마그네슘 탈리를 위해 첨가되는 산의 종류에 대해 특별한 제약은 없으며, 염산, 황산, 또는 인산 등의 통상의 무기산 또는 아세트산 등과 같은 유기산으로부터 선택하여 사용될 수 있다.

한, 본 방법에 따르면, 초음파 처리와 더불어 산을 첨가하여 생성된 페오피틴을 경제적으로 고순도로 분리 정제함으로써 중간물질 클로린 e6의 순도를 높일 수 있다. 본 방법에 따르면, 상술한 바와 같이 초음파 처리 및 산 처리하여 생성된 페오피틴은 다공성 알루미나 세라믹필터 (5-20 μm)에 의해 여과된다. 그리고, 여과된 페오피틴 침전물을 -20℃ ~ -40℃의 저온 및 20mbar의 저압으로 유지하면서 냉각시키고 콜드트랩 (-70℃ ~ -80℃)을 이용하여 수분을 제거한다. 상술한 범위의 저온 및 저압에서는 수분이 증기상태로 승화/제거될 수 있는 진공상태가 형성된다. 이처럼, 동결상태에서 승화 건조되므로 페오피틴 입자 표면이 경화되거나 수축되지 않는다. 많은 신약은 과도한 건조에 의해 피해 입을 수 있으므로 최종 수분의 양이1.5% - 2.0%사이에서 건조 됐을 때 최고의 적정량으로 유지된다.

본 방법에 따르면 페오피틴의 정제를 위하여, 클로로필이 용해된 용액에 초음파 (10 ~ 50kHz, 100 ~ 500 W로 조절가능)가 가해지고 에탄올과 물을 이용하여 세척하는 동작이 수행되면, 페오피틴의 정제 효과는 보다 극대화될 수 있다. 즉, 초음파 처리와 에탄올과 물의 첨가가 이루어짐으로써, 불순물을 수용액 층으로 쉽게 이동시켜 헥산 층으로부터 고순도의 페오피틴을 얻을 수 있다. 이때 처리되는 초음파는 10-50kHz, 100-500 W로 조절 가능하며 5분 내지 10분 이내로 짧은 시간 처리하는 것이 좋다.

이상의 산 처리 방법을 수행하고 다공성 알루미나 세라믹필터를 통해 얻은 페오피틴 침전물은 95% 이상의 순도를 가지며, 사용된 클로로필 중량에 대비하여 95% 이상의 수율로 수득된다.

클로린 e6 제조

본 방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 클로린 e6의 제조 방법이다.

본 방법에 따르면, 페오피틴에 염기를 넣고 가열 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 클로린 e6을 수득한다.

<화학식 3>

본 방법에 따르면, 농축한 페오피틴 건조물을 아세톤으로 용해시킨다. 용해한 아세톤 용액의 잔존 수분을 Na₂SO₄를 이용하여 제거하고, 환류 반응 장치에 에탄올과 함께 첨가한다. 60℃ 내지 70℃ 환류하에서 수산화나트륨을 이용하여 pH 13 이상으로 맞춘다. 이때, 염기는 통상적으로 사용되는 것으로 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 수산화물 등의 무기염기, 또는 암모늄염 등의 유기염기를 사용할 수 있다. pH 적정은 전위차 자동적정기를 이용하여, 실시간으로 빠른 pH를 적정할 수 있다.

상기 반응이 종료된 후, 반응물로부터 다공성 알루미나 세라믹 필터(5-20 μm)를 이용하여 클로린 e6를 수득하고, 수득한 클로린 e6를 진공 및 건조 공정으로 건조한다. 이상의 방법으로 수득한 클로린 e6는 90% 이상이며 사용된 페오피틴 중량에 대비하여 90% 이상의 수율로 수득된다.

클로린 e6 및 트리소듐 클로린 e6 정제

본 방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 클로린 e6 정제 방법이다.

본 방법에 따르면, 건조된 클로린 e6에 산처리 및 알카리 처리를 하여, 고순도 클로린 e6를 수득하는 과정이다.

본 방법에 따르면, 건조한 클로린 e6를 물에 용해시킨 후, 전위차 자동적정기를 이용하여 pH를 7 내지 9까지 맞추고, 물에 용해되지 않는 미세입자를 0.22μm 마이크로필터를 이용하여 멸균여과 하면서 제거한다. 그리고, 멸균 여과된 용해물에 산처리를 하면서 전위차 자동적정기를 이용하여 상기 용해물의 pH를 2까지 조절하고 클로린 e6를 0.22 μm 마이크로필터를 이용하여 멸균 여과하여 수득한다. 클로린 e6를 정제하기 위하여 에탄올에 1% 무게비율로 넣고 1시간 이상 교반 한 후 진공건조를 통해 고순도 클로린 e6를 얻는다. 이상의 방법으로 수득한 클로린 e6는 95% 이상이다.

이후 건조된 고순도 클로린 e6를 아세톤 또는 물에 용해시킨 후, pH를 천천히 8.5에 맞추고, 0.22 μm 마이크로필터를 이용하여 멸균여과 하고 동결건조 공정으로 건조한다. 이상의 방법으로 고순도 트리소듐 클로린 e6를 얻는다.

트리소듐 클로린 e6와 PVP의 복합체 제조

본 방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 트리소듐 클로린 e6와 PVP 복합체 제조 방법이다.

본 방법의 일 실시예에 따르면, 고순도 클로린 e6 또는 고순도 트리소듐 클로린 e6를 PVP와 일대일 또는 일대 십 또는 십대 일로 상온에서 수용액에 혼합하며 교반 한다. 이때 전위차 자동적정기를 이용하여 혼합물의 pH를 7 내지 9에 맞추며 NaCl 생성량이 최소로 유지되게 하여 트리소듐 클로린 e6와 PVP 복합체를 제조한다. 이 과정에서 교반은 1시간 이내로 한다.

복합체는 0.22 μm 마이크로필터로 멸균 여과된다. 이후, 멸균 여과된 복합체는 동결건조를 위하여, -20℃ ~ -40℃의 저온과 20 mbar의 저압을 유지하면서 냉각시키고 콜드트랩 (-70℃ ~ -80℃)을 이용하여 수분을 제거한다. 상술한 저온 및 저압에서는 수분이 증기상태로 승화/제거될 수 있는 진공상태가 된다. 동결상태에서 승화 건조되므로 복합체의 표면이 경화되거나 수축되지 않는다.

과도한 건조에 의해 피해를 입을 수 있으므로 최종 수분의 양이 1.5% - 2% 사이에서 건조되도록 유지한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시예들에 따르면, 특정 원재료의 제약이 없이 클로로필을 함유하는 출발 물질로부터 트리소듐 클로린 e6를 경제적으로 단기공정을 적용하여 분리, 추출, 및 정제한다. 원료물질에서 용매의 용해도 차이와 극성도, 초음파공정을 이용하여 클로로필 이외의 물질을 제거하는 간단하고 효율적인 방법으로 순도 높은 클로로필을 얻을 수 있으며, 이를 통해 페오피틴과 클로린 e6 합성에서는 반응 시간과 유기 용매의 양을 단축하는 경제적인 공정을 이용하고, 분리 및 정제도를 향상할 수 있는 매우 효과적인 공정을 개발하였다. 또한 본 발명은 기존의 방법보다 우수한 멸균여과와 자동적정기를 이용하여, 고도로 정제된 고순도의 트리소듐 클로린 e6와 PVP 복합체를 제조하였다. 특히 멸균여과를 통한 새로운 위생적인 공정으로 생리활성을 대폭 향상시키고, 초음파를 이용하여 수율을 획기적으로 단시간 향상시킴으로써 대량신약생산에 적합한 공정으로 트리소듐 클로린 e6 복합체를 합성 제조하는 특징을 가진다.

이하에서는 본 발명의 실시예들에 따라서 실험한 예들을 설명한다.

실험 1. 클로로필 추출물의 수득

스피루리나 75kg에 추출용매로서 에탄올 750리터를 넣고 초음파 처리(30kHz, 300W)하며 1시간 동안 교반하고 다공성 알루미나 세라믹 필터 (5-20 μm)를 이용, 여과하여 클로로필 추출물을 얻었다. 상기에서 수득한 클로로필 추출물은 하기 조건에서 HPLC(High Pressure Liquid Chromatography) 분석하였다. 이때 사용된 용매는 메탄올, 아세토나이트릴, 디클로로메탄, 물 등이었으며 HPLC 분석은 450 nm에서 수행되었다. 상기에서 수득한 클로로필 추출물에 대한 HPLC 분석 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 HPLC 분석결과에 의하면, 머무름 시간(retention time) 5∼8 분에서 클로로필에 해당하는 피크를 관찰할 수 있었으며, 0∼3분 사이에서 불순물들이 상당량 존재하는 것으로 확인되었다. 이때 레퍼런스(reference)로는, Sigma-aldrich 회사의 클로로필을 사용하였다.

실험 2. 고순도 클로로필의 수득

실험 2에서 얻은 클로로필 추출액의 부피가 최대 10%가 되도록 농축하고, 농축된 클로로필 추출물에 같은 부피의 헥산을 넣고 30분동안 초음파 처리(20kHz, 300W)와 함께 교반하였다. 추가로 상기 헥산과 같은 부피의 물을 첨가하고 초음파 처리와 함께 10분 동안 계속 교반하였다. 교반시킨 반응용액을 -10℃ 조건에서 5시간동안 정체시킨 후, 반응용액을 층 분리하여 유기층을 수득하였다. 이후, 유기층을 감압 증류하여 고순도 클로로필을 수득하였다. 수득한 클로로필 추출물에 대한 HPLC 분석 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 HPLC 분석결과에 의하면, 0∼3분 사이의 불순물은 거의 제거되었음을 확인할 수 있었다. 또한 클로로필의 정제도는 약 90%임을 확인할 수 있었다. 이것의 수득율은 해당 출발물질이 함유하는 클로로필의 양에 대비하여 90% 이상 추출되었음을 의미한다.

실험 3. 클로로필부터 고순도 페오피틴의 수득

실험 2에서 얻어진 클로로필 헥산 용액에 염산 또는 황산을 투여하여 용액의 pH가 2가 되도록 하고 초음파 처리(20kHz, 300W)하면서 1시간 교반 하였다. 반응이 완료된 후, 상기 용액에 상기 클로로필 헥산 용액과 같은 부피의 70% 에탄올을 첨가하고 10분 동안 교반한 후, -10℃에서 3시간동안 정체하여 침전시켰다. 침전물을 동결 건조하여 페오피틴(HPLC 순도 90%, 수율 95%)을 수득하였다(다른 방법으로, 다공성 알루미나 세라믹필터 (5-20 μm)로 여과시켜 건조시키는 방법도 가능하다)

도 3에 나타낸 HPLC 분석결과에 의하면 페오피틴의 해당 피크를 확인할 수 있었으며, 다른 시간대에서 불순물은 거의 확인되지 않았다. 이상의 산처리 방법을 수행하여 얻은 페오피틴 침전물은 95% 이상의 순도를 가지며, 사용된 클로로필 중량에 대비하여 95% 이상의 수율로 수득된다.

실험 4. 페오피틴으로부터 클로린 e6의 합성

실험 3에서 얻어진 페오피틴 1g을 아세톤 50 mL에 용해한 후, 1M 수산화나트륨 수용액을 2.297mL를 첨가하면, 용액의 pH는 약 12가 된다. 이러한 용액을 60℃ 온도로 가열하면서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 0.22 μm 마이크로필터를 이용하여 멸균 및 여과하여 클로린 e6 0.653g (HPLC 순도 90%, 수율 90% 이상)을 수득하였다.

또한, 수득한 상기 클로린 e6를 고순도로 정제하기 위하여, 클로린 e6 1 g에 대하여 에탄올 100mL에 넣고 1시간 동안 교반하고 멸균 및 여과하여 고순도의 클로린 e6 0.95g (HPLC 순도 95%, 수율 95% 이상)을 수득하였다. 분리 정제한 고순도 클로린 e6의 핵자기공명(NMR) 분석 결과를 확인하였다(도 4).

또한, 수득한 상기 클로린 e6에 대해서는 아세토나이트릴과 0.1% 트리플루오르아세트산 용매를 이용하여 407 nm에서 HPLC 분석하였다(도 5). HPLC 분석결과에 의하면, 머무름 시간(retention time) 3∼4분에서 클로린 e6에 해당하는 피크를 관찰할 수 있었으며, 다른 시간대에서 불순물은 거의 확인되지 않았다. 또한 클로린 e6의 정제도는 약 95% 이상임을 확인할 수 있었다. 또한 액체 크로마토그래피 질량분석법 (Liquid Chromatography Mass Spectrometry LC/MS)) 분석결과에 의하면, 클로린 e6의 해당피크를 확인할 수 있었으며, 불순물은 거의 제거되었음을 확인할 수 있었다(도 6).

실험 5. 트리소듐 클로린 e6 제조 및 정제

실험 4에서 얻어진 클로린 e6 1g을 물에 용해 시킨 후, 전위차 자동적정기를 이용하여 pH를 7.1까지 맞추고, 물에 용해되지 않는 미세입자를 0.22 μm 마이크로필터를 이용하여 멸균 및 여과하면서 제거한다. 멸균 및 여과 처리된 용액에 다시 산 처리를 하여 전위차 자동적정기를 이용, pH를 2까지 맞춘다.

이후, 클로린 e6 용액으로부터, 고순도 클로린 e6를 수득하거나 또는 고순도 트리소듐 클로린 e6를 수득한다.

먼저, 고순도 클로린 e6를 수득하는 과정을 설명한다.

클로린 e6 용액을 0.22 μm 마이크로필터를 이용하여 멸균 및 여과하여 클로린 e6를 수득한다. 수득된 클로린 e6를 95% 이상의 아세톤으로 용해한 후 pH를 7.1에 맞추며 멸균 및 여과하고 진공 건조하여 고순도 클로린 e6를 수득한다.

이제, 고순도 트리소듐 클로린 e6를 수득하는 과정을 설명한다.

클로린 e6 용액을 pH 7 내지 9에 맞추며 트리소듐 클로린 e6를 형성한 후, 0.22 μm 마이크로 필터를 이용하여 멸균 및 여과하고 동결건조하여 고순도 트리소듐 클로린 e6를 수득한다. 수득한 고순도 트리소듐 클로린 e6의 HPLC 분석결과에 의하면, 머무름 시간(retention time) 4 분에서 클로린 e6의 해당 피크를 확인할 수 있었으며, 상용화된 클로린e6 시약 (Frontiers)과 비교하여 95% 이상의 순도를 지니며 불순물은 거의 제거되었음을 확인할 수 있었다(도 7).

실험 6. 트리소듐 클로린 e6 와 PVP 복합체 제조

실험 5에서 얻어진 트리소듐 클로린 e6 1g을 물에 용해시킨 후, 분자량 10,000 이하 PVP 1g을 첨가하여 1시간 교반 하면서 전위차 자동적정기를 이용하여 pH를 7 내지 9에 맞춘다. 복합체가 형성된 뒤 용액을 0.22 μm 마이크로 필터를 이용하여 멸균 및 여과한다. 멸균 및 여과된 용액을 무균상태에서 동결 건조시켜 복합체를 획득한다. 멸균 및 여과를 통해 미생물의 증가 가능성을 방지하고 엔토톡신의 증가 가능성을 배제한다.

복합체는 0.22 μm 마이크로필터로 멸균 여과된다. 이후, 멸균 여과된 복합체는 동결건조를 위하여, -20℃ ~ -40℃의 저온과 20 mbar의 저압을 유지하면서 냉각시키고 콜드트랩 (-70℃ ~ -80℃)을 이용하여 수분을 제거한다. 상술한 저온 및 저압에서는 수분이 증기상태로 승화/제거될 수 있는 진공상태가 된다. 동결상태에서 승화 건조되므로 복합체의 표면이 경화되거나 수축되지 않는다. 한편, 과도한 건조에 의해 피해 입을 수 있으므로 최종 수분의 양이 1.5% - 2%사이에서 건조되도록 유지한다.

실험 7. 트리소듐 클로린 e6 와 PVP 복합체 확인 시험

본 발명의 일 실시예에 따른 복합체는 물에 잘 용해되며, 함량시험을 위해 조제한 용액은 흑녹색이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 복합체 200 mg을 물 25 mL로 희석시키고 10 분간 방치한다. 이 액 0.2mL을 취하여 100mL 용량 플라스크에 넣고 희석액(95% 에탄올)을 넣어 완전 용해시킨다. 자외가시부 흡광도 측정법에 따라 400 ~ 700nm에서 흡수스펙트럼을 측정할 때 402.4, 503.2, 531.7, 608.0, 및 662.7의 파장들에서 흡수를 나타낸다(도 8 참조).

실험 8. 트리소듐 클로린 e6 와 PVP 복합체 함량 시험

본 발명의 일 실시예에 따른 복합체 200 mg을 물 25mL로 희석시키고 10 분간 방치한다. 이 액 0.2mL을 취하여 100mL 용량 플라스크에 넣고 희석액(95% 에탄올)을 넣어 표선까지 채운 다음 녹여 검액으로 한다. (표준액: 95% 에탄올) 검액 및 표준액을 가지고 1cm 분광광도계용 셀에 넣어 자외가시부 흡광도 측정법에 따라 662nm에서 투과율을 측정하여 계산한다 (도 9의 수식 참조). 모든 시험물질의 조제는 차광 아래에서 수행한다. 정확성은 각 농도에서 회수율로 계산되고 평균 회수율은 각 농도에서 100% 이내이어야 한다. 정밀성은 각 농도의 회수율에 대한 변동계수로 계산되고 5 % 이하이어야 한다.

회수율을 계산하는 수식은 다음과 같다.

회수율 (또는 함량) = 역환산된농도 / 이론농도 ×100

실험 8. 트리소듐 클로린 e6 와 PVP 복합체에서 NaCl 정량 시험

본 발명의 일 실시예에 따른 복합체 샘플 약 30mg을 측정한 후 비커에 옮겨 물 50 ml을 넣은 후 녹인다. 물 50ml에 지시약 10% 크롬산칼륨을 넣은 후 0.1N 질산은으로 용액에서 적갈색이 나타나 15초간 유지되는 시점을 최종 적정한 것으로 한다. 위와 같은 방법을 통하여 NaCl의 정량 적정 자료를 바탕으로 복합체의 NaCl 함량을 계산할 수 있으며, 복합체에 NaCl이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있다.

실험 9. 트리소듐 클로린 e6 와 PVP 복합체에서 클로린e6 분석법

UV/VIS Spectrophotometry를 이용하여 생리식염수 중 Chlorin e6에 대하여 분석을 하였고, 이러한 분석을 통해서 정확성 (복합체1), 정밀성(복합체2), 안정성(복합체3)을 조사하였다.

100 mg/mL (Chlorin e6 로서)의 주사용 조제물을 조제하기 위해 복합체에 부형제를 넣은 후 약 30 분간 초음파 진탕하여 녹인다. 저농도의 조제물은 고농도 조제물(100 mg/mL)에서 목적 농도 1 mg/mL이 되도록 부형제를 이용하여 희석하여 준비한다. 모든 시험물질의 조제는 차광 아래에서 수행한다. 부형제 중 2.5, 5, 10 mg/mL의 Chlorin e6는 일내(intra-day) 및 일간(inter-day) 분석을 통해 평가한다. 일내 분석은 한 농도당 세 개의 시료를 각각 조제하여 세 농도에서 평가한다. 일간 분석은 일내 분석과 동일한 방법으로 최소 3일의 결과로 평가하고, 실험자간 재현성을 확인하기 위하여 그 중 한 샘플은 다른 실험자가 수행한다. 정확성은 각 농도에서 회수율로 계산되고 평균 회수율은 각 농도에서 100% 이내이어야 한다. 정밀성은 각 농도의 회수율에 대한 변동계수로 계산되고 5% 이하이어야 한다. 복합체의 안정성은 부형제 중 2.5, 10 mg/mL의 복합체 시료를 각 보관 조건에 보관 후에 중층에서 세 번 취한다. 각 샘플은 차광하여 냉장에서 약 7일 간 보관한다. 적합기준은 이론농도 대비 함량은 100% 이내이어야 한다. 도 10을 참조하면, 정확성, 정밀성, 안정성 클로린 e6에 대한 분석결과를 참고할 수 있다.

상기와 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims

다음의 구조

를 가지고, 분자식(molecular formula) C₃₄H₃₆N₄O₆ 로 표현되는 클로린 e6(Chlorin e6), 분자량 15,000 이하 PVP (polyvinylpyrrolidone), NaOH, 및 HCl을 혼합하는 단계; 및
상기 혼합하는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계;를 포함하며,
상기 혼합하는 단계는 다음의 구조

를 가지며 분자식 C₃₄Н₃₃О₆N₄Na₃로 표현되는 트리소듐 Chlorin e6와 상기 분자량 15,000 이하 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체를 생성하는 단계인 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합하는 단계를 수행하기 전에, 상기 Chlorin e6를 멸균 및 여과시키는 단계;를 더 포함하는 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 멸균 및 여과 시키는 단계는,
상기 혼합하는 단계를 수행하기 전에 상기 Chlorin e6를 물에 용해시키고, 용해물의 pH를 7 보다 적도록 pH를 조절하는 제1 pH 조절단계;
pH가 7 보다 적은 상기 용해물의 pH를 7 이상으로 pH를 조절하는 제2 pH 조절단계; 및
pH가 7 이상인 상기 용해물을 마이크로 필터를 이용하여 멸균 및 여과시키는 단계;를 포함하는 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제3항에 있어서,
상기 제1 pH 조절단계는 상기 용해물의 pH를 2로 조절하는 단계이고, 상기 제2 pH 조절단계는 상기 용해물의 pH를 7.1로 조절하는 단계인 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는
상기 혼합하는 단계의 수행결과인 혼합물의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계; 및
마이크로 필터를 이용하여 상기 혼합물을 멸균 및 여과시키는 단계;를 포함하는 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는
상기 혼합하는 단계의 수행결과인 혼합물의 pH를 7 - 9로 조절하는 단계; 및
마이크로 필터를 이용하여 상기 혼합물을 멸균 및 여과시키는 단계;를 포함하는 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는
상기 혼합하는 단계의 수행결과인 혼합물에서 NaCl의 중량 퍼센트가 5% 이하인 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는,
상기 Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 혼합시키는 단계와,
상기 Chlorin e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 혼합물과 NaOH와 HCl을 혼합시키는 단계를 순차적으로 수행하는 단계인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는,
상기 Chlorin e6와 NaOH와 HCl를 혼합시키는 단계와
상기 Chlorin e6와 NaOH와 HCl의 혼합물과 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 혼합시키는 단계를 순차적으로 수행하는 단계인 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는
상기 Chlorin e6와 NaOH와 HCl와 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 동시에 혼합시키는 단계인 것인, 트리소듐 클로린 e6(trisodium Chlorin e6)와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조 방법.
클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법에 있어서,
클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액에 넣어 클로로필 추출물을 추출하는 단계;
상기 클로로필 추출물에 헥산과 물을 넣고 교반하는 단계;
교반된 용액에서 헥산층을 분리하여 클로로필을 정제하는 단계;
정제된 클로로필을 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 용해시킨 후, 산을 첨가하여 산성화하는 단계;
상기 산성화하는 단계의 수행 결과물에 물을 첨가하여 페오피틴(pheophytin) 침전물을 획득하는 단계; 및
상기 페오피틴 침전물을 아세톤에 용해시키고 염기를 첨가하여 클로린 e6(Chlorin e6)을 생성하는 단계;를 포함하는 것인, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 추출하는 단계는,
녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액에 넣는 단계; 및
상기 수용액에 초음파를 가하는 단계;를 포함하는 것인, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 초음파는 주파수가 10 내지 50 kHz 인 것인, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 교반하는 단계의 수행 전에, 상기 추출하는 단계의 수행 결과물을 필터를 이용하여 분리 농축시키는 단계를 더 포함하는 것인, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 교반하는 단계는
상기 클로로필 추출물에 헥산과 물을 넣어 제1 혼합물을 생성하는 단계; 및
제1 혼합물에 초음파를 가하면서 제1 혼합물을 교반시키는 단계; 를 포함하는 것인, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법.
제15항에 있어서,
상기 초음파는 주파수가 10 내지 50 kHz 인 것인, 클로린 e6(Chlorin e6)를 제조하는 방법.