KR20180041331A - 분자결합핵산 선정과 표적분자 동정 방법 및 키드, 그리고 그들의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다중의 분자들로 이루어진 시료에 대한 생물학적 의미의 분석에 보다 효율적으로 사용할 수 있는 분자결합핵산 선정과 표적분자 동정 방법, 및 이의 용도에 관한 것이며, 보다 상세하게는 시료를 구성하는 다중의 분자에 결합하는 분자결합핵산 라이브러리와 이로부터 제조되는 균등화(Normalization) 분자결합핵산 라이브러리, 감산화(Subtraction) 분자결합핵산 라이브러리, SSH(Suppression Subtractive Hybridization) 분자결합핵산 라이브러리, 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산들의 염기서열과 출현빈도를 분석, 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산을 선정하고 상기 선정된 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 분리, 동정 및 정량하는 방법 및 키트 그리고 그들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 다중의 분자들로 이루어진 시료에 대한 생물학적 의미의 분석에 보다 효율적으로 사용할 수 있는 분자결합핵산 선정과 표적분자 동정 방법, 및 이의 용도에 관한 것이며, 보다 상세하게는 시료를 구성하는 다중의 분자에 결합하는 분자결합핵산 라이브러리와 이로부터 제조되는 균등화(Normalization) 분자결합핵산 라이브러리, 감산화(Subtraction) 분자결합핵산 라이브러리, SSH(Suppression Subtractive Hybridization) 분자결합핵산 라이브러리, 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산들의 염기서열과 출현빈도를 분석, 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산을 선정하고 상기 선정된 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 분리, 동정 및 정량하는 방법 및 키트 그리고 그들의 용도에 관한 것이다.
시료를 구성하는 다중의 분자를 분석하는 기술, 시료에 포함된 분자들의 정량 및 양적인 상태를 종합화한 정보, 즉 분자의 프로파일(profile)을 생산하는 기술와 표적분자를 동정하는 기술은 물리학, 생화학 및 생물정보학의 발달로 널리 개발되었으나, 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다.
최근에, 2-D 겔 전기영동 및 질량 분석 검정이 개발되었고, 이는 가장 덜 풍부한 혈장 성분들의 측정을 가능하게 하였다. 그러나, 고농도로 존재하는 단백질의 혈장/혈청을 제거하는 노동집약적 예비분류 프로토콜을 수행하여 시료들을 준비해야 한다. Anderson, Proteomics (2005); Anderson and Anderson, Electrophoresis (1991); Gygi and Aebersold, Curr Opin Chem Biol (2000); Liotta, et al., JAMA (2001); Yates, Trends Genet (2000); and Adkin, et al., Mol Cell Proteomics (2002) 참조. 또한, 이런 검정들은 시간 소비적이고, 이들 방법을 수행하기 위해 필수 장비들을 구입하고 유지하는데 비용이 많이 든다.
생체시료의 프로테옴, 예를 들어 혈장 프로테옴이 질병 진단 및 치료적 모니터링을 위해 편리한 표본으로서 매우 유망하지만, 기존 검정 및 기술이 감도 제한, 시간 및 효율 제한, 및 관련된 과도할 수 있는 비용을 포함하는 여러 결점을 갖는다. 또한, 기존 검정 및 기술은 바이오마커를 위해 원료로서 생체시료을 충분히 이용하지 못한다. 예를 들어, 전기영동 및 질량분석 모두는 단백질 크기 및 전하에 기초하여 혈장 단백질을 분리하지만, 단백질의 기타 물성에 기초한 검정 및 기술이 결여되어 있다. 시료의 프로테오믹 프로파일을 수득하고 이용하는 방법에 대한 요구가 당업계에 있고, 상기-언급된 기존 기술의 단점들을 극복하기 위해 노력하고 있다.
압타머(aptamer)는 표적 분자들에 대해 높은 특이적 결합성을 가지는, 표적 화합물 또는 분자에 대한 특이적 단일가닥핵산인 리간드이다. 압타머의 제조방법으로는, "SELEX"(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)" 방법이 널리 사용되고 있다. SELEX(셀렉스) 방법은 표적분자에 높은 특이적 결합성을 가진 핵산 분자의 생체외 전개에 관한 방법으로, 1990. 6. 11 출원의 미국특허 출원 제07/536,428호(현재 포기), 미국특허 제5,475,096호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 및 미국특허 제5,270,163호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 등에 기재되어 있다.
SELEX 방법은, 핵산이 다양한 2 차원 및 3 차원 구조를 형성하기에 충분한 능력과, 실질적으로 임의의 화학적 화합물(단량체 또는 중합체 상관없이)에 대해 리간드로서 작용(즉, 특이적 결합 쌍을 형성)하기에 충분한, 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 보유한다는 것을 바탕으로 한다. 임의의 크기 또는 조성을 갖는 분자가 표적분자로 이용될 수 있다. 압타머는 매우 유용한 리간드로 많이 연구되고 있으나, 압타머의 일반적인 선별방법은 기지 분자 혹은 물질을 대상으로 실시되는 한계가 있다.
본 발명자는 미지분자 또는 기지분자를 포함하는 복합시료를 대상으로 분자에 결합하는 단일가닥핵산(분자결합핵산)을 선발하고 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 정량하는 방법 등을 제안하였다. 즉, 단백체에 대한 프로파일을 생산하는 reverse-SELEX(대한민국 특허등록 제10-0670799호 참조), 분자결합핵산기반 바이오칩 (대한민국 특허등록 제10-0464225 참조), 분자결합핵산기반 바이오칩을 이용한 생물학적 의미 분석 기술(대한민국 특허등록 제10-0923048호 참조) 등의 단일가닥핵산을 이용하여 프로테오믹 프로파일을 생산하는 방법 및 생체시료를 구성하는 다중의 분자에 결합한 분자결합핵산의 선정하는 방법 등을 제시하였다.
본 발명은 프로테옴을 분석하는 기존 기술, 기존 Reverse-SELEX 및 분자결합핵산 선별방법의 한계들을 극복하기 위해 다중의 분자들로 이루어진 시료를 대상으로 분자결합핵산 라이브러리의 효율적인 제작 방법, 분석시료 및 비교시료에 대해 특이적인 결합을 하고 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분석적 분자결합핵산을 효율적으로 선별하는 방법을 제시하고 추가적으로 상기 선별된 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 동정하는 방법을 제시하고자한다.
본 발명의 목적은, 다중의 분자로 이루어진 시료를 구성하는 분자들의 분석을 보다 효율적으로 하기 위한 단일가닥핵산 라이브러리로부터 상기 시료를 구성하는 다중의 분자에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리로부터 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리인 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 분석하는 방법 및 키트를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적은, 단일가닥핵산 라이브러리로부터 시료를 구성하는 분자의 구성 및 다양성을 반영하는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적은, 분석을 요하는 분석시료에 결합하는 분자결합핵산 라이브러리(분석시료-분자결합핵산 라이브러리)와 분석시료와 구분되는 비교시료에 결합하는 분자결합핵산라이브러리(비교시료-분자결합핵산 라이브러리)에 대해, 균등화, 감산화, SSH, 또는 균등화-감산화 과정을 적용함으로써, 목적하는 분석시료에 대한 분석 효율이 향상된, 균등화, 감산화, SSH, 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리인 분자결합핵산 이차 라이브러리 및 분자결합핵산들을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적은, 상기 라이브러리들을 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 이용하여 분석시료 및 비교시료의 분자와 분자결합핵산의 결합 자료 데이터베이스를 구축한 후, 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산들을 선정하는 과정을 적용함으로써, 목적하는 분석시료 및 비교시료에 대한 분석 효율이 향상되고, 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산 선정 방법 및 그들의 용도를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적은, 상기 선정된 분자결합핵산들을 이용하여 표적분자를 분리하고 동정하는 과정을 적용함으로써, 시료에서 표적분자를 분리 및 동정하는 방법 및 그들의 용도를 제공하고자 하는 것이다.
본 명세서는 기존 프로테옴을 분석하는 기술, SELEX와 기존 Reverse-SELEX 방법의 한계들을 극복하기 위한 시료를 구성하는 분자에 결합하고 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산을 효율적으로 선정하고, 상기 분석적 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 분리, 동정 및 정량하며, 상기 시료에 존재할 수 있는 다중의 표적분자에 결합하는 분석적 분자결합핵산의 검출 및/또는 정량을 위한 방법, 기구, 시약 및 키트 그리고 그들의 용도를 포함한다.
본 명세서에서 다음 용어들은 다른 언급된 사항이 없으면 다음을 의미한다.
"시료(test sample)"는 다수의 분자들을 포함하는 임의의 물질, 용액 또는 혼합물을 말하며, 적어도 하나의 표적 분자를 포함할 수 있다. 상기 시료는 하기에 기재된 것과 같이 생물학적 시료 및 예를 들어, 오염되거나 오염되었을 가능성이 있는 물 및 공업 폐수와 같은 환경 또는 독물 검사를 하기 위하여 사용될 수 있는 시료를 포함한다. 시료는 또한 최종 생성물(end product), 중간 생성물(intermediate product) 또는 예를 들어, 제조 공정과 같은 준비하는 과정에서의 부산물일 수 있다. 시료는 생물 또는 어떤 다른 원(source)(예를 들어, 환경 또는 공업원)으로부터 얻어진 물질, 용액 또는 혼합물이 첨가된 임의의 적절한 검정 배지, 버퍼 또는 희석제를 포함할 수 있다.
"생물학적 시료(biological sample)"은 생물로부터 얻어진 임의의 물질, 용액 또는 혼합물을 말한다. 이것은 혈액(전혈(whole blood), 백혈구, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells), 혈장 및 혈청), 가래(sputum), 입김(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함한다. 이것은 또한 대표적으로 앞서 말한 모든 것들의 분리된 단편들을 포함한다. 용어 "생물학적 시료"은 또한 예를 들어, 대변(stool) 시료, 조직 시료 또는 조직 생검과 같은 물질, 용액 또는 균등화된 고형 물질을 포함하는 혼합물을 포함한다. 용어 "생물학적 시료"은 또한 조직 반응, 세포 반응, 세균 반응 또는 바이러스 반응으로부터 유래된 물질, 용액 또는 혼합물을 포함한다.
"분자"는 핵산을 제외하고 분자결합핵산이 높은 친화력과 특이성으로 결합할 수 있고 시료에 존재할 수 있는 관심있는 임의의 분자를 말한다. "분자"는 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 대표적인 분자는 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 다당, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 애피바디(affibody), 항체 모조체(antibody mimics), 바이러스, 병원체, 독성 물질, 기질, 대사 산물, 전이 유사물(transition state analogs), 보조인자(cofactors), 저해제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직 및 앞서 말한 임의의 것들에 대한 임의의 단편 또는 부분을 포함한다. "관심있는 분자(molecule of interest)"는 단백질의 경우에 예를 들어, 아미노산에서의 경미한 변이(minor variation), 이황화 결합(disulfide bond formation), 당화(glycosylation), 지질화(lipidation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation) 또는 분자의 본질을 실질적으로 변경하지 않는 표지 성분과의 결합과 같은 임의의 다른 조작(manipulation) 또는 변형(modification)과 같은 특정 분자의 임의의 경미한 변이들도 포함한다. "분자"는 분자결합핵산와 결합할 수 있는 분자 또는 다분자(multimolecular) 구조의 한 형태 또는 종류의 복제 세트이다.
"단백질(protein)"은 임의의 길이를 가지는 아미노산의 폴리머를 말하는 것으로 상호 교환적으로 사용된다. 폴리머는 직선이거나 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어들은 또한 자연적으로 변형되거나, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지된 성분과의 결합과 같은 임의의 다른 변형이 있는 아미노산 폴리머도 포함한다. 또한 정의 내에는 예를 들어, 당업계에 공지된 다른 변형 뿐만 아니라 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함)의 하나 또는 그 이상의 유사물을 포함하는 폴리펩티드도 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연결된 사슬(associated chains)일 수 있다.
“표적분자"은 분자결합핵산에 결합하는 분자로 시료에 하나 또는 그 이상으로 존재할 수 있다. 분자결합핵산의 친화적 상호작용은 정도의 문제(matter of degree)라고 인식되고 있으나, 표적분자에 대한 분자결합핵산의 "특이적 결합 친화력"은 분자결합핵산이 시료의 다른 분자와 결합하는 것보다 일반적으로 더욱 높은 친화력을 가지고 표적분자와 결합하는 것을 의미한다.
"비-표적 분자(non-target molecule)"은 분자결합핵산과 비특이적인 복합체를 형성할 수 있는 시료 내에 포함된 분자를 말하는 것으로 상호 교환적으로 사용된다. 비-표적 분자는 분자결합핵산과 결합할 수 있는 하나의 형태 또는 종류의 분자 또는 복합 분자 구조의 복제 세트이다. 비-표적 분자는 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 제1 분자결합핵산에 대한 비-표적 분자는 제2 분자결합핵산에 대한 표적분자가 될 수도 있다. 마찬가지로, 제1 분자결합핵산에 대한 표적분자는 제2 분자결합핵산에 대한 비-표적분자가 될 수 있다.
"비특이적 복합체(non-specific complex)"는 분자결합핵산과 상응하는 표적분자를 제외한 둘 또는 그 이상의 분자간 비-공유적 결합을 말한다. 비특이적 복합체는 그것의 구성 분자들 간의 친화 상호작용에 기초하여 선택되지는 않지만 분자 종류들 간의 상호작용을 나타내기 때문에, 비특이적 복합체에 결합된 분자들은 대체로 서로 매우 낮은 친화력을 나타낼 것이고, 분자결합핵산과 상응하는 표적분자들보다 그에 상응하는 더 낮은 친화력을 가질 것이다. 비특이적 복합체는 분자결합핵산과 비표적분자, 경쟁자와 비표적분자, 경쟁자와 표적분자, 및 표적분자와 비표적분자간에 형성된 복합체를 포함한다.
“압타머”은 특정분자와 결합하는 핵산으로 구체적으로, 상기 특정분자와의 해리상수(Kd)가 2.0x10-9 미만이고 상기 해리상수와 다른 분자 해리상수의 비인 특이도가 5이상인 핵산을 의미하며(PCT/US1992/001383 참조)， 분자결합핵산에 포함되는 물질이다．.
"Reverse-SELEX"는 일반적으로 (1) 예를 들어, 시료를 구성하는 다중의 분자들에 대해 높은 친화력으로 바람직한 방법으로 결합하는 핵산들로 구성된 분자결합핵산 라이브러리의 제작과 (2) 그렇게 제작된 라이브러리에서 선택된 핵산들을 사용하여 시료에서 상응하는 분자들의 양태를 조사하여 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분석적 분자결합핵산을 선정하는 공정을 말하는 것으로 사용된다.
"분자결합핵산(Molecule Binding Nucleic Acid; MBNA)"은 상기 Reverse-SELEX 공정으로 선정되고 분자와 결합하는 핵산으로 상기 압타머를 포함하는 개념이며, 분자결합핵산들과 다중의 분자들로 구성된 시료와 반응시켜 확보한 결과를 다변량 분석(Multivariate analysis) 방법으로 분석한 결과를 바탕으로 분석 시료에서 분자결합핵산들의 생물학적 의미 분석에 기여하는 정도를 결정할 수도 있다. 본 발명에서 Reverse-SELEX 공정으로 선별되는 분자결합핵산들에서 생물학적 의미의 분석에 기여하는 핵산을 "분석적 분자결합핵산"이라 명명하였다. 분자결합핵산은 특정 뉴클레오티드 서열을 가지는 한 형태 또는 종류의 핵산 분자의 세트이다. 분자결합핵산은 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 서로 다른 분자결합핵산들은 동일하거나 서로 다른 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 또한 특히 동일한 분자에 결합하는 둘 또는 그 이상의 분자결합핵산들이 존재할 수 있다. 분자결합핵산은 기존 Reverse-SELEX 공정을 포함한 임의의 공지의 방법을 사용하여 개발될 수 있다. 단백체에 대한 프로파일을 생산하는 reverse-SELEX(대한민국 특허등록 제10-0670799호), 분자결합핵산기반 바이오칩 (대한민국 특허등록 제10-0464225), 분자결합핵산기반 바이오칩을 이용한 생물학적 의미 분석 기술(대한민국 특허등록 제10-0923048호) 참조. 분자결합핵산은 화학적 합성 방법 및 효소적 합성 방법을 포함하는 임의의 공지의 방법에 따라 제조되거나 합성될 수 있다.
"분자-분자결합핵산 복합체" 또는 "분자결합핵산 복합체"는 특정분자와 분자결합핵산의 상호작용에 의해 형성된 비공유적 복합체를 말한다. 상기 분자결합핵산 복합체는 대응하는 분자에 결합하는 분자결합핵산에 의해 형성된 한 형태 또는 종류의 복합체이다. 분자결합핵산 복합체는 일반적으로 예를 들어, 온도를 높이고, 염 농도를 높이거나 변성제(denaturant)의 첨가와 같은 환경 조건에서의 변화에 의해 전환되거나 분리될 수 있다.
"경쟁 분자(competitor molecule)" 및 "경쟁자(competitor)" 는 비표적 분자와 비특이적 복합체를 형성할 수 있는 임의의 분자를 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 비표적 분자는 예를 들어, 경쟁자가 사용되어 비특이적으로 다른 비표적 분자에 결합(재결합)하는 것으로부터 분자결합핵산을 저해할 수 있는 자유 분자결합핵산을 포함한다. "경쟁 분자" 또는 "경쟁자"는 하나의 형태 또는 종류의 분자의 복제 세트이다. "경쟁 분자" 또는 "경쟁자"는 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 경쟁 분자는 이에 한정하는 것은 아니나, 올리고뉴클레오티드, 다중 음이온(예를 들어, 헤파린, 청어 정액 DNA, 연어 정자 DNA, tRNA, 덱스트란 설페이트, 폴리덱스트란, 비염기성 포스포디에스테르 폴리머, dNTPs 및 피로포스페이트)를 포함한다. 다수의 견지에 있어서, 하나 이상의 경쟁자의 결합이 사용될 수 있다.
"핵산", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 칭하는 것으로 상호호환하여 사용되며, 이러한 뉴클레오티드들은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 유사체 또는 화학적으로 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어, "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 이중 또는 단일 가닥 분자뿐만 아니라 삼중 나선 분자를 포함한다.
"주형"은 핵산 중합효소에 의하여 복사될 핵산분자이다. 주형은 중합효소에 따라 단일가닥, 이중가닥 또는 부분적 이중가닥일 수 있다. 합성된 복사체는 주형에 상보적이거나 적어도 이중가닥 또는 부분적 이중가닥주형의 한 가닥에 상보적이다. RNA 및 DNA 모두 5'에서 3' 방향으로 합성되며 핵산 이중가닥의 두 가닥은 항상 두 가닥의 5' 말단이 이중가닥의 반대 끝에 있다.
"프라이머"는 주형에 상보적인 올리고뉴클레오티드로서 주형과 결합(수소결합 또는 혼성화)하여 DNA 중합효소(DNA Polymerase)에 의한 합성개시로 쓰여지는 프라이머/주형 복합체를 형성하며, DNA 합성단계에서 주형에 상보적인 3'말단에 결합된 공유결합염기의 첨가에 의해 신장된다. 결과적으로 프라이머 신장생성물이 만들어진다. 실질적으로 이미 알려진 모든 DNA 중합효소(역전사효소 포함)들은 DNA 합성을 개시하기 위하여 단일 가닥 주형에 올리고뉴클레오티드의 결합을 필요로 한다. DNA 사슬 중에서 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 방법인 PCR(Polymerase Chain Reaction; 중합효소 연쇄반응)을 하기 위해 DNA 중합효소는 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머(Reverse primer)을 요구한다. 핵산합성의 명칭은 이중가닥의 두 상보가닥을 지칭하는 용어를 채택하여 분류 및 단순화한다. 일반적으로 단백질 또는 구조 RNA을 생산하는데 사용되는 서열을 코드하고 있는 가닥을 (+)가닥으로 명명하며 그 상보가닥을 (-)가닥으로 명명한다. 정방향 프라이머는 (+)가닥에 결합하는 염기서열이고 역방향 프라이머는 (-)가닥에 결합하는 염기서열이다.
“차세대염기서열분석법(Next Generation Sequencing: NGS)”은 Massive parallel sequencing을 의미하며 이 분석법의 기본 발상은 컴퓨터 공학에서 한 작업을 동시에 수행하는 것을 뜻하는 병렬 컴퓨팅(Massively parallel processing)과 유사한데, 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 이렇게 얻은 데이터를 생물정보학적 기법을 이용하여 조합함으로써 방대한 유전체정보를 빠르게 해독하고자 하기 위함임. 현재는 2세대에 해당하는 NGS 기술 발달에 힘입어 수십만 내지 수십억 개의 서로 다른 대용량 염기서열 분석 반응이 동시에 진행되고 판독되는 기술을 말한다. NGS는 칩(Chip)기반 그리고 PCR기반 페어드엔드(paired end)형식으로 전장유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다. NGS는 illumina, 로슈, 아이언토론토 등의 시퀀싱 기술을 의미하는 것으로, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio, RainDance 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함한다. 이러한 기술의 차이는 Chip 혹은 Bead기반이 올리고의 화학적 반응에 기초를 둔 것이 차세대 기술이고, DNA를 해독하는 방법에 있서 속도 및 시퀀싱기술이 획기적으로 개선되면 제 3세대 또는 제 4세대 등으로 구분된다.
“시퀀싱 라이브러리 (Sequencing Library)”는 시퀀서로 염기서열분석을 실행(run)할 수 있는 양쪽 끝에 어댑터가 결합된 주어진 크기 범위의 DNA 또는 cDNA 단편의 모음이며 라이브러리는 DNA 또는 cDNA일 수 있다(cDNA 라이브러리는 RNA-seq 수행 시 제조됨).
“라드”는 염기서열분석(시퀀싱, sequencing) 라이브러리에 포함된 DNA 또는 cDNA 단편에서 생성한 분석량에 대한 염기쌍 정보를 의미하는 것으로 염기서열분석으로 나온 출력데이터, 시퀀스(염기서열)의 조각을 의미한다.
“시퀀싱 정도 (Sequencing Depth)”는 특정 샘플을 시퀀싱 하였을 때 출력된 데이터에서 특정 염기에 대한 시퀀싱 결과의 중복된 횟수(리드의 개수)로 10X, 20X 등으로 표현하며 coverage, depth of coverage라고도 한다.
본 발명은 시료를 구성하는 분자들의 분석을 보다 효율적으로 하기 위한 단일가닥핵산 라이브러리, 상기 제조된 단일가닥핵산 라이브러리로부터 상기 시료를 구성하는 분자에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리, 그리고 상기 제조된 분자결합핵산 라이브러리로부터 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리인 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 염기서열 출현빈도 분석하는 방법과 키트를 제공한다.
"참조서열(reference sequence)"이란 상기 리드들로부터 전체 염기 서열을 생성하는 데 참조가 되는 염기 서열을 의미한다. 즉, 염기 서열 분석에서는 시퀀서에서 출력되는 다량의 리드들을 참조 염기서열을 참조하여 맵핑함으로써 전체 염기 서열을 완성하게 된다.
단일가닥핵산 라이브러리로부터 제공되고 시료를 구성하는 다중의 각각의 분자들에 결합하는 핵산들로 이루어진 라이브러리를 "분자결합핵산 일차 라이브러리", 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리를 대상으로 균등화(Normalization) 공정, 감산화(Subtraction) 공정, SSH(Suppression Subtractive Hybridization) 공정 또는 균등화-감산화 공정을 하여 제공되는 분자결합핵산 라이브러리를 "분자결합핵산 이차 라이브러리"라고 지칭한다.
"균등화(Normalization)"는 상기 분자결합핵산 라이브러리는 둘 또는 그 이상의 분자들로 이루어진 시료의 구성성분들의 출현빈도 다양성을 반영하고 있어 상기 분자결합핵산 라이브러리의 구성핵산 출현빈도를 일정하게 하는 공정을 의미한다.
"감산화(Subtraction)"는 상기 분석시료_분자결합핵산 라이브러리의 구성성분들에서 비교시료_분자결합핵산 라이브러리의 구성성분을 제거하는 공정을 의미하며, 바람직하게, 균등화 공정을 수행한 라이브러리들을 이용하여 감산화를 수행할 수 있다.
"SSH(Suppression Subtractive Hybridization)"는 상기 분자결합핵산 라이브러리의 구성핵산을 대상으로 선택적 증폭하는 공정으로 분석하고자하는 분석시료에 상응하는 분자결합핵산 라이브러리(분석시료_분자결합핵산 라이브러리)와 비교하고자하는 비교시료에 상응하는 분자결합핵산 라이브러리(비교시료_분자결합핵산 라이브러리)을 이용하여 분석시료_분자결합핵산 라이브러리에 특이적으로 존재하는 핵산을 증폭하게 할 수 있다.
본 발명에서 시료를 구성하는 다중의 분자 각각에 결합하는 분자결합핵산을 보다 효율적으로 선별하는 방법의 전체적인 실현 단계는 도1과 같으며, 상기 시료를 구성하는 다중의 분자 각각에 결합하는 단일가닥핵산 라이브러리를 제조하거나, 또는 분석을 요하는 분석시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리(분석시료-분자결합핵산 일차 라이브러리)와 비교시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리(비교시료-분자결합핵산 일차 라이브러리)를 제조하고 이에 대해, SSH(Suppression subtraction hybridization) 공정, 균등화(Normalization) 공정, 감산화(Subtraction) 공정 또는 균등화-감산화 공정을 수행하여 각각에 해당하는 SSH 분자결합핵산 라이브러리, 균등화 분자결합핵산 라이브러리, 감산화 분자결합핵산 라이브러리 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리인 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 분석하는 방법 및 키트를 제공하며 상기 분자결합핵산 라이브러리들을 구성하는 분자결합핵산들의 출현빈도를 이용하여 유용한 분자결합핵산들을 선정하고 선정된 분자결합핵산들에 결합하는 표적분자를 분리, 동정 및 정량하는 방법 및 키트 그리고 그들의 용도를 제공하고 있다.
(단일가닥핵산의 구조)
본 발명에서 시료를 구성하는 다중의 분자 각각에 결합하는 분자결합핵산들을 선별하고 상기 핵산에 결합하는 표적분자를 동정하기 위한 단일 또는 이중가닥 DNA 라이브러리, 단일가닥 RNA 라이브러리 및 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조 그리고 시료를 구성하는 분자에 결합하는 일차 분자결합핵산 라이브러리에 대해, SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리인 분자결합핵산 이차 라이브러리를 제조하기 위해 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 단일가닥핵산 즉, 올리고뉴클레오타이드의 구조는 도2와 같으며, 다음 요소들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 구조는 하기 일반식(I)과 일반식(II)이다．
5'－5'보존영역－가변영역－3'보존영역-3'(일반식 I)
5'－가변영역-3'(일반식 II)
일반적으로 압타머를 선정하기 위해서 사용되는 핵산 라이브러리 그리고 본 발명에 사용되는 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오타이드는 상기 <일반식 I>로 일정한 염기서열로 이루어진 보존영역이 전 염기서열의 절반이상 차지하고 있다. 이런 보존영역은 임의의 염기서열을 갖는 가변영역과 비특이적 상호작용을 하여 핵산라이브러리의 복잡성을 제한하는 경우가 발생한다.
상기 문제를 극복하기 위해, 유기합성 등 다양한 방법에 의해 제작되는 고정영역이 없는 단일가닥핵산으로 이루어진 라이브러리를 이용하여 표적분자에 결합하는 압타머를 개발하는 기술인 “primer free” selex 기술이 제안되고 있으며 <일반식 II> 구조이다.
본 발명에서 제안하고 있는 균등화, 감산화, 균등화-감산화 또는 SSH 과정에는 고정서열이 요구됨으로, 이를 위해 “primer free” selex 결과 산물의 단일가닥핵산에 인위적으로 상기 공정이 가능한 염기서열을 부가하여 필요한 공정을 수행할 수 있다.
<일반식 I>의 ５'－5'보존영역－3' 과 ５'－보존영역3'－3'에 있는 5'보존영역의 염기서열과 3'보존영역의 염기서열로 올리고뉴클레오타이드를 제작하여 <일반식 II> 구조의 올리고뉴클레오타이드 부가반응하여 상기 <일반식 II> 구조의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 단일가닥핵산 라이브러리를 <일반식 I>구조의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 라이브러리로 제조할 수도 있다.
본 발명에서는 <일반식 II> 올리고뉴클레오타이드 라이브러리와 시료를 구성하는 분자를 접촉시켜 형성된 분자-분자결합핵산 복합체 풀에서 분리된 분자결합핵산 풀의 분자결합핵산에 일반식 I>의 ５'－5'보존영역－3' 과 ５'－보존영역3'－3'에 있는 5'보존영역의 염기서열과 3'보존영역의 염기서열로 제작된 올리고뉴클레오타이드를 분가하여 분자결합핵산 이차 라이브러리를 제작하였다.
일반적으로 Reverse-SELEX 공정은 일반적으로 서로 다른 서열의 핵산인 단일가닥핵산 라이브러리의 제조로부터 시작한다. 상기 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 두 개의 보존영역(즉, 후보 혼합물의 각각의 구성요소들은 동일한 위치에 동일한 서열을 포함한다) 및 가변영역을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 전형적으로, 상기 보존영역은 하기에 기재된 증폭 단계에 도움을 주거나, 상기 단일가닥핵산 라이브러리에서 핵산의 주어진 구조적 배열의 가능성을 강화시키기 위해 선택된다. 상기 가변영역은 전형적으로 분자에 대해 각각의 핵산의 표적 결합 부위를 제공하고, 이 가변 영역은 완전하게 랜덤화되거나(즉, 임의의 위치에서 염기를 찾을 가능성은 4개 중 1개이다) 부분적으로 랜덤화(즉, 임의의 위치에서 염기를 찾을 가능성은 1 및 100 퍼센트 사이의 임의의 레벨에서 선택될 수 있다)될 수 있다.
본 발명에서 상기 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 부위는 5' 보존영역, 및 3' 말단 부위는 3' 보존영역으로 구성되며 상기 보존영역은 PCR 공정이 가능하도록 프라이머가 상보적으로 결합할 수 있는 위치를 제공할 수 있도록 제조되어야 한다.
상기 5' 및 3' 보존영역은 RNA 합성에 사용될 수 있는 이중 DNA 라이브러리의 제조 공정에 필수적인 프라이머(DS 정방향 및 역방향 프라이머), 상기 단일가닥 DNA 라이브러리 및 RNA로부터 이중가닥 DNA의 제조 공정에 필수적인 프라이머(RS 정방향 및 역방향 프라이머)와 상기 분자결합 단일가닥핵산 라이브러리의 SSH 또는 감산화 공정에 필수적인 프라이머(SSH 정방향 및 역방향 프라이머)의 결합위치를 제공할 수 있어야 한다.
본 발명에 사용하는 상기 단일가닥핵산 라이브러리로부터 이중가닥 DNA와 단일가닥 RNA 라이브러리 제조의 경우, 상기 보존영역에 상보적 프라이머(DS 정방향 프라이머 및 DS 역방향 프라이머)를 이용하여 PCR 공정으로 상기 이중 DNA 라이브러리를 제조하고 생체외 전사반응으로 RNA를 제조할 수 있으며 올리고뉴클레오타이드의 구조와 프라이머는 도3와 같다.
본 발명에 사용하는 상기 단일가닥핵산 라이브러리로부터 단일가닥 DNA와 상기 단일가닥핵산 라이브러리로부터 제조된 단일가닥 RNA 라이브러리에서 이중가닥 DNA 라이브러리 제조의 경우, 상기 올리고뉴클레오티드는 5'보존영역의 상보적 염기서열로 이루어진 RS 정방향 프라이머 및 RS 역방향 프라이머의 상보적 결합 위치를 제공하는 올리고뉴클레오타이드의 구조와 프라이머는 도4와 같다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 상기 DS 프라이머가 상보적 결합하는 DS 보존영역, 상기 RS 프라이머가 상보적 결합하는 RS 보존영역과 상기 SSH 프라이머가 상보적 결합하는 SSH 보존영역의 염기서열은 전부 또는 일부가 중첩하거나 서로 완전히 상이하게 구성할 수 있으며, 상기 보존 서열의 길이는 최소 10개 이상에서 60개 이하로 존재하는 염기서열이다.
바람직하게, DS 보존영역, RS 보존영역과 SSH 보존영역이 동일한 염기서열을 사용할 수도 있다.
상기 양쪽의 보존영역의 사이에 다양성이 있는 가변 영역의 임의의 염기서열이 최소 15개 이상에서 100개 이하로 존재하는 올리고뉴클레오티드이다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 가변영역을 구성하는 무작위 서열을 합성하기 위한는, 모두 4종의 뉴클레오티드 혼합물을 합성 과정중의 각 뉴클레오티드 부가 단계에 첨가하여, 뉴클레오티드가 무작위로 혼입될 수 있도록 한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 비 DNA, RNA 또는 DNA/ RNA 하이브리드일 수 있다. 상기 무작위 올리고뉴클레오타이드는 전부 무작위 서열이거나 부분적으로 무작위해 서열부분을 포함할 수도 있다. 예를 들어 풀은 100% 무작위하거나 부분적으로 부작위해 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 부분적으로 무작위해 서열은 각각의 부가 단계에서 4가지 뉴클레오티드를 상이한 몰 비로 첨가함으로써 제조할 수 있다. 통상적으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 30∼50 개의 무작위뉴클레오티드로 이루어진 내부 영역의 측면에 존재하는 일정한 5' 및 3' 보존 말단서열을 가진다.
무작위 뉴클레오티드는 화학적 합성 및 무작위 절단된 세포내 핵산의 크기별 선별을 포함한 다수의 방법으로 생산할 수 있다. 핵산 내 서열 변이는 또한 선별/증폭 과정을 반복 실시하기 이전 또는 도중에 돌연 변이 유발법으로 도입하거나 또는 증가시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 무작위 서열부분은 임의의 길이를 가질 수 있으며, 리보뉴클레오티드-데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한 변형 또는 비-천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다(참고: 미국특허 제5,958,691호 미국특허 제5,660,985호 미국특허 제5,958,691호 ; 미국특허 제5,698,687호 ; 미국특허 제5,817,635호 ; 미국특허 제5,672,695호 및 PCT 공보 제WO92/07065호).
무작위 올리고뉴클레오티드는 해당 업계에 널리 공지된 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-결합 뉴클레오티드로부터 합성할 수 있다(참조: Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) 및 Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)). 무작위 올리고뉴클레오티드는 트리에스테르 합성 방법과 같은 용액상 방법을 이용하여 합성할 수도 있다(참조: Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 및 Hirose 외 다수, Tet. Lett., 28:2449 (1978)). 자동화된 DNA 합성 장비를 사용하여 수행한 통상의 합성 결과, 1014~ 1016 개(대부분의 셀렉스 실험에 사용하기에 충분한 수)의 개별 분자들이 생산된다. 서열 디자인에 있어서 무작위 서열의 충분히 거대한 영역은 각각의 합성 분자가 독특한 서열을 나타낼 가능성을 높여준다.
본 발명에 따라 무작위 서열을 포함하는 단일가닥핵산 라이브러리 및 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리를 제조하는 방법 및 시료를 구성하는 분자에 결합하는 분자결합핵산을 선별하고 상기 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 동정하기 위한, 단일가닥핵산 라이브러리 제조 과 SSH 공정, 균등화 공정, 감산화 공정 또는 균등화-감산화 공정에 사용되는 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조방법이 제공되며 전체적인 단계는 도5과 같다.
(단일가닥핵산 라이브러리 제조)
상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥핵산 라이브러리, <일반식 II> 구조의 단일가닥핵산 라이브러리 또는 상기 <일반식 I> 구조인 단일가닥핵산 라이브러리에서 제조된 단일가닥핵산 라이브러리를 시료를 구성하는 분자와 접촉시켜 분자결합핵산을 분리할 수 있다. 전자 두 종류의 라이브러리는 일반적인 유기합성 방법으로 합성하여 사용할 수 있으며, 후자 한 종류의 라이브러리는 효소학적 방법으로 합성하여 사용할 수 있다.
<일반식 I> 구조의 단일가닥핵산 라이브러리로부터 시료를 구성하는 분자와 접촉하는 단일가닥핵산 라이브러리를 효소학적인 방법으로 제조하는 방법을 다음과 같다.
본 발명에 사용하는 상기 <일반식 I> 구조인 올리고뉴클레오타이드 라이브러리로부터 이중가닥 DNA와 단일가닥 RNA 라이브러리 제조의 경우, 상기 보존영역에 상보적 프라이머(DS 정방향 프라이머 및 DS 역방향 프라이머)를 이용하여 PCR 공정으로 상기 이중가닥 DNA 라이브러리, 생체외 전사로 단일가닥 RNA 라이브러리를 제조할 수 있으며 상기 올리고뉴클레오타이드의 구조와 이에 필요한 프라이머는 도3와 같다.
바람직하게, 도4의 <일반식 I> 구조인 단일가닥핵산 라이브러리 제조의 경우는 상기 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오타이드의 5' 보존영역 및 3' 보존영역에 상보적으로 결합하는 RS 정방향 프라이머 및 RS 역방향 프라이머를 이용하여 One way-PCR 공정을 실시하여 단일가닥 DNA 라이브러리를 제조할 수 있다.
바람직하게, 도5의 <일반식 I> 구조인 단일가닥 DNA 라이브러리로부터 단일가닥 RNA 라이브러리 제조방법은, 단일가닥핵산 라이브러리의 단일가닥핵산을 주형으로 하여 상기 DS 정방향 프라이머 및 상기 DS 역방향 프라이머로 PCR를 수행하여 T7 프로모터가 있는 이중가닥 DNA 절편을 제조한다. 상기 제조된 이중가닥 DNA 절편을 주형으로 생체외 전사하여 RNA 단일가닥 핵산라이브러리를 제조함으로써 얻는 것이다.
단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한, 모두 4종의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드 혼합물을 합성 과정중의 각 뉴클레오티드 부가 단계에 첨가하여, 단일가닥핵산 라이브러리의 단일가닥핵산의 가변 부위에는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 변형된 단일가닥핵산을 상기에 언급된 방법, 장치 및 키트 모두에서 사용할 수 있다. 변형된 염기를 가진 뉴클레오티드를 포함하는 단일가닥핵산은 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드(즉, 변형되지 않은 뉴클레오티드)를 포함하는 표준 단일가닥핵산의 성질과는 많이 다르다. 뉴클레오티드의 변형 방법은 아미드 결합의 사용을 포함한다. 그러나 다른 적절한 변형 방법이 사용될 수 있다. 변형된 단일가닥핵산의 구조가 표준 염기쌍 모델에 의하여 예상된 구조와 전적으로 일치하지 않는 것으로 관찰되었다. 이러한 현상은 단일가닥핵산의 측정된 녹는점이 모델에 의하여 예상된 녹는점과 일치하지 않는다는 사실에 의하여 뒷받침된다. 공지된 바와 같이, 단일가닥핵산의 측정된 녹는점과 예상된 녹는점 사이의 연관성이 없다. 평균적으로, 계산된 녹는점(Tm)는 측정된 Tm보다 6℃ 더 낮다. 측정된 녹는 점은 이들 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 단일가닥핵산이 보다 더 안정하고, 신규한 2차 구조를 갖는 것으로 예견되며, 그 가능성이 존재한다. 변형된 뉴클레오티드를 단일가닥핵산 라이브러리를 생산하는 데에 사용할 때, 표적에 대한 단일가닥핵산이 더 잘 분리된다． 여기에 기재한 바와 같이, "변형된 핵산"은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 가리킨다. 어떤 실시예에서, 변형 뉴클레오티드와 Reverse-SELEX 방법이 양립할 수 있는 것이 바람직하다.
뉴클레오티드의 화학적 변형은 2'-위치의 당 변형, 5-위치의 피리미딘 변형(예를 들어, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-[2-(1H-인돌-3일)에틸]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄)프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-(N-나프틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 또는 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘), 8-위치의 퓨린 변형, 엑소시클릭 아민(exocyclic amines)에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모- 또는 5-아이오도-우라실(5-iodo-uracil)의 치환, 기본골격(backbone) 변형, 메틸화, 이소베이스 이소시티딘(isobases isocytidine) 및 이소구아니딘(isoguanidine) 등과 같은 비정상적 염기쌍 조합(unusual base-pairing combinations)을 단독 또는 조합하여 포함할 수 있다. 변형은 또한 캡핑(capping) 또는 페길화(pegylation)과 같은 3' 및 5' 변형을 포함할 수 있다. 다른 변형은 유사체와 함께 하나 또는 그 이상의 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드의 치환, 비전하 결합(uncharged linkage)을 갖는 메틸 포스페이트(methyl phosphonates), 포스포트리에스테르(phosphotriesters), 포스포아미데이트(phosphoamidates), 및 카바메이트(carbamate) 등과, 전하 결합(charged linkage)된 포스포로시오에이트(phosphorothioates), 포스포로디시오에이트(phosphorodithioates) 등과, 인터컬레이터(intercalators)를 포함하는 아크리딘(acridine), 솔라렌(psoralen) 등과, 킬레이터를 포함하는 금속, 방사선 금속, 붕소, 산화금속 등과, 알킬레이터를 포함하는 것 및 개질 결합된 알파 아노머(alpha anomeric) 핵산 등과 같은 뉴클레오티드간 변형을 포함한다. 또한, 당에 보통 존재하는 임의의 하이드록실기는 포스포네이트기(phosphonate group) 또는 포스페이트기(phosphate group)에 의해 치환될 수 있고 표준 보호기(protecting groups)에 의해 보호될 수 있거나 추가적인 뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부가적인 결합을 만들기 위해 활성화될 수 있다. 5' 및 3' 말단의 OH기는 인산화(phosphorylated)될 수 있거나, 아민, 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자로부터의 유기 캡핑기 부분(organic capping group moieties), 또는 약 1 내지 약 20 개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머들 또는 다른 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 폴리머들로부터의 유기 캡핑기 부분으로 치환될 수 있다. 만일 존재한다면, 뉴클레오티드 구조는 폴리머 조합 전 또는 후에 변형될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에 성분의 라벨링과 함께 접합(conjugation)에 의한 것과 같이 더 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 또한 2'-O-메틸-(2'-O-methyl-), 2'-O-알릴(2'-O-allyl), 2'-플루오로-(2'-fluoro-) 또는 2'-아지도-리보오스(2'-azido-ribose), 카보시클릭 당 유사체(carbocyclic sugar analogs), α-아노메릭 당(α-anomeric sugars), 아라비노스, 자일로스 또는 리소오스(lyxoses)와 같은 에피메릭 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars), 세도헵툴로오스(sedoheptuloses), 아시클릭 유사체(acyclic analogs) 및 메틸 리보사이드와 같은 염기 결여 뉴클레오티드 유사체(abasic nucleotide analogs)를 포함하는 당업자에게 일반적으로 잘 알려져 있는 리보오스 또는 데옥시리보오스의 유사체 형태를 포함할 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 포스포디에스테르 결합들은 대체가능한 연결기(alternative linking group)로 대체될 수 있다. 이러한 대안적 연결기들은 포스페이트가 P(O)S("티오에이트(thioate)"), P(S)S("디티오에이트(dithioate)"), (O)NR2("아미데이트(amidate)"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈(formacetal)")로 대체되고, 각 R 또는 R'는 독립적으로 H 이거나 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜(araldyl)을 선택적으로 포함하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오티드의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 당, 퓨린 및 피리미딘의 유사한 형태의 치환은 예를 들어, 폴리아미드 기본골격과 같은 대체적 기본골격 구조와 같이 최종 생성물을 설계하는데 유리할 수 있다.
(분자결합핵산 일차 라이브러리 제조)
제조된 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 단일가닥핵산들은 시료를 구성하는 분자 각각에 결합을 용이하게 하는 조건 하에서 선택된 분자들과 접촉한다. 이 조건 하에서, 각각의 분자와 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 핵산의 상호작용은 일반적으로 한 쌍의 구성성분 간에 가장 강한 상대적 친화력을 가지는 분자결합핵산 복합체를 형성한다. 각각의 분자에 대한 가장 높은 친화력을 가지는 핵산은 각각의 분자에 대하여 더 낮은 친화력을 가지는 핵산으로부터 분리할 수 있다. 분리 공정은 최대 높은 친화력의 핵산을 유지하는 방법으로 수행한다. 각각의 분자에 대해 상대적으로 높은 친화력을 가지도록 분리하는 동안 선택된 핵산들은 각각의 분자에 대하여 상대적으로 높은 친화력을 가지는 핵산에서 강화된 새로운 후보 핵산을 만들기 위하여 증폭한다. 상기의 분리 및 증폭 단계를 적절하게 반복함으로써, 새롭게 형성된 후보 핵산은 점점 더 적은 고유 서열을 포함하고, 각각의 분자에 대한 핵산 혼합물의 평균 친화도(average degree of affinity)는 일반적으로 증가할 것이다. 극단적인 측면에서 보면, 각각의 분자에 대하여 높은 친화력을 가지는 원래의 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터의 하나 또는 그 이상의 수의 고유 핵산들을 포함하는 분자결합핵산들이 존재한다.
다중의 분자로 구성된 시료의 경우, 특히 혈청은 분자의 다양성이 매우 높고 상기 분자들의 출현빈도의 편차도 매우 다양하다. 상기 분리와 증폭 단계의 적절한 반복으로 시료를 구성하는 다중의 분자 각각에 대해 하나 또는 그 이상의 수의 고유 핵산들을 포함하는 분자결합핵산이 제작이 가능하다면 Reverse-SELEX 공정으로 시료를 구성하는 분자의 다양성과 출현빈도를 반영하는 분자결합핵산들로 이루어진 라이브러리, 즉 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제공할 수도 있다.
Reverse-SELEX 공정에는 단일가닥핵산 라이브러리로부터 시료를 구성하는 분자들의 다양성 및 출현빈도를 반영하는 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제작하는 단계가 있다. 상기 분자의 다양성 및 출현빈도를 내포한 분자결합핵산 일차 라이브러리 제작은 Reverse-SELEX 공정에서 시료와 핵산 풀의 반응시간 및 시료의 분자결합핵산 복합체를 세척하는 조건 등으로 이루어진 분자결합핵산 복합체 형성 및 분리 단계로 할 수 있다. 제작된 분자결합핵산 일차 라이브러리에서는 구성 핵산의 종류는 시료를 구성하는 분자의 종류 다양성을 반응하며 또한, 구성 핵산의 출현빈도는 상응하는 시료 분자의 출현빈도를 반영하게 제작된다.
시료를 구성하는 다중의 분자들의 다양성 및 출현빈도를 반영하는 일차 핵산 라이브러리를 제작하는 단계에서 상기 분자결합핵산 복합체의 특이도를 증가시키고, 비특이적 결합을 감소시키는 동적 유발(kinetic challenge)을 선택적으로 사용될 수 있으며, 비특이적 결합에 있어서의 추가적인 감소는 시료와 경쟁자(competitor)을 시료와 핵산 라이브러리의 반응 이전 단계인 전반응(pre-incubation) 또는 평형 결합(equilibrium binding) 동안 혼합물에 경쟁자의 첨가 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다. 다른 구현에서, 동적 유발은 희석(dilution)에 의해 수행된다.
Reverse-SELEX 공정에서 분자결합핵산 분리 공정은 다중의 분자 각각에 대해 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체의 상대적인 농도가 낮은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체의 농도에 비해 더 신속하게 증가되도록 단일가닥핵산 라이브러리에서 특정 단일가닥핵산 성분의 상대적 농도를 변경하는 공정을 의미한다. 상기 분자결합핵산 분리 공정은 용액-기반 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체 분리 공정이다. 용액-기반 분자결합핵산 분리 공정은 단일가닥핵산 라이브러리 내에서 분자결합핵산 복합체를 형성하는 표적 혹은 핵산이 분자결합핵산 분리 공정도중 고체 지지체상으로 이동되지 않도록 용액 내에서 수행된다. 상기 분자결합핵산 분리 공정은 경쟁 분자의 첨가 및 반응, 혼합물의 희석, 혹은 이들의 결합(예를 들어, 경쟁 분자의 존재 하에 혼합물의 희석)을 포함하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 분자결합핵산 분리 공정의 효과는 일반적으로 다른 분자결합핵산 복합체(즉, 단일가닥핵산 라이브러리 내에서 표적 분자와 다른 핵산 간 형성된 분자결합핵산 복합체)의 분해 속도를 변경함에 따라 좌우되기 때문에, 상기 분자결합핵산 분리 공정의 지속 기간은 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체의 비율을 높게 유지하는 반면 낮은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체의 수는 실질적으로 저감시키도록 선택된다. 따라서 유사한 친화력이 있는 분자결합핵산 복합체들이 생체시료를 구성하는 분자의 다양성을 반영하도록 적절한 분리 공정을 실시해야 한다. 상기 분자결합핵산 분리 공정은 Reverse-SELEX 공정 도중 1회 이상 사용될 수 있다. 희석 및 경쟁자 첨가가 함께 사용될 때, 이들은 동시에 혹은 어떠한 순서로든 순차적으로 수행될 수 있다.
상기 분자결합핵산 분리 공정은 반응용액 내 총표적(단백질) 농도가 낮을 때 사용될 수 있다. 상기 분자결합핵산 분리 공정이 희석을 포함할 때, 상기 반응용액은 있는 만큼 그 자체로 희석될 수 있으며, 상기 분자결합핵산을 포함하는 단일가닥핵산 풀은 Reverse-SELEX 공정의 후속 라운드를 통해 회수될 수 있다． 상기 분자결합핵산 분리 공정은 희석뿐 아니라 경쟁자의 사용도 포함하며, 이는 경쟁자를 사용하지 않을 때 필요한 것보다 반응용액을 덜 희석하게 할 수 있다. 상기 분자결합핵산 분리 공정은 경쟁자의 첨가를 포함하며, 상기 경쟁자는 다중 음이온(예를 들면, 헤파린 혹은 덱스트란 설페이트(덱스트란))이다. 헤파린 혹은 덱스트란은 종래 Reverse-SELEX 선별 공정에서 분자결합핵산을 분리하는데 사용되어져 왔다. 그러나 이와 같은 방법에서, 헤파린 혹은 덱스트란은 표적분자와 분자결합핵산이 결합하여 복합체를 형성하는 평형 단계 도중 존재한다. 이와 같은 방법에서는, 헤파린 혹은 덱스트란의 농도가 증가함에 따라 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체대 낮은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체의 비가 증가된다. 그러나 높은 농도의 헤파린 또는 덱스트란은 핵산과 경쟁자간 결합하는 표적에 대한 경쟁때문에 평형에서 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체의 수를 저감시킬 수 있다. 이에 반해, 본 발명의 방법은 분자결합핵산 복합체를 형성한 다음 경쟁자를 첨가함으로써 형성된 복합체의 수에 영향을 미치지 않는다. 다중의 분자 각각과 분자결합핵산사이 형성된 평형상태가 다음 경쟁자를 첨가함으로써 분자결합핵산 복합체에 새로운 평형 도달을 포함하는 비-평형 상태를 생성한다. 새로운 평형에 도달하기 전에 분자결합핵산 복합체를 분리하는 것은 낮은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체가 먼저 분해될 것이므로 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산에 대한 시료를 풍부하게 한다.
다중음이온 경쟁자 (예를 들면, 덱스트란 설페이트 혹은 또 다른 다중음이온 물질)가 다중음이온의 존재에 불응하는 분자결합핵산의 식별을 용이하게 하도록 분자결합핵산 분리 공정 내에서 사용된다. "다중음이온 불응성 분자결합핵산"은 비-다중음이온 불응성 물질을 포함하는 용액 내에서 분자결합핵산 복합체보다 다중음이온 불응성 물질을 포함하는 용액 내에서 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체를 형성할 수 있는 분자결합핵산이다. 이와 같은 방식으로, 다중음이온 불응성 분자결합핵산은 시료 내 다중의 분자 각각의 존재 혹은 농도 혹은 함량을 검출하는 분석 방법의 수행에 사용될 수 있고, 여기서 상기 검출 방법은 분자결합핵산이 불응성인 다중음이온 물질(예를 들어, 덱스트란 설페이트)의 사용을 포함한다.
따라서, 다중음이온 불응성 분자결합핵산을 생산하는 방법이 제공된다. 단일가닥핵산 라이브러리와 생체시료를 접촉시킨 다음 다중의 분자 각각과 단일가닥핵산 라이브러리 내 핵산이 평형에 도달하게 한다. 다중음이온 경쟁자를 도입하고 용액 내에서 단일가닥핵산 라이브러리 내 대다수의 단일가닥핵산을 다중의 분자 각각과 접촉하여 복합체를 형성하기에 충분한 시간동안 반응하게 한다. 또한, 다중음이온 경쟁자의 존재하에 분리될 수 있는 단일가닥핵산 라이브러리 내 분자결합핵산들이 다중의 분자 각각으로부터 방출될 것이다. 상기 혼합물은 다중의 분자 각각에 결합된 채 남아있는 높은 친화력을 갖는 단일가닥핵산을 분리하고, 용액으로부터 미결합 단일가닥핵산들을 제거하도록 분리한다. 그런 다음 상기 단일가닥핵산은 각각의 분자로부터 방출되고 분리된다. 분리된 단일가닥핵산은 다시 증폭되어 선별의 추가 라운드에 적용되어 선별된 분자결합핵산의 총 성능을 증가시킬 수도 있다. 만약 분자결합핵산의 선별이 특정 목적에 필요하지 않다면 상기 공정은 또한 최소화된 반응 시간으로 사용될 수도 있다.
따라서, 생체시료와 단일가닥핵산 라이브러리가 접촉되고 다중의 분자 각각과 단일가닥핵산 라이브러리 내에 포함된 핵산들 사이 평형 결합이 형성되기 충분한 시간동안 함께 반응하는 단일가닥핵산의 분리하기 위하여 변형된 Reverse-SELEX 공정이 제공된다. 평형 결합에 이어 과량의 경쟁 분자, 예를 들어 다중음이온 경쟁자가 혼합물에 첨가되고 상기 혼합물은 소정 시간동안 과량의 경쟁 분자와 함께 반응시킨다. 이와 같은 소정의 반응 시간보다 단일가닥핵산 중 현저한 부분이 소정 반응 시간 도중 상응하는 다중의 분자 각각으로부터 분리될 것이다. 이들 "낮은" 친화력인 단일가닥핵산과 분자와의 재결합은 분자에 비특이적으로 결합하여 분자 결합 자리를 점유하는 과량의 경쟁 분자로 인하여 최소화된다. 보다 높은 친화력인 단일가닥핵산 중 현저한 부분은 소정 반응 시기도중 분자에 복합화된 채 잔류할 것이다. 반응 시기 말단에서, 혼합물로부터 분자결합핵산 복합체를 분리함으로서 낮은 친화력인 개체군과 높은 친화력인 단일가닥핵산의 개체군을 분리하게 한다. 분리 단계는 그 분자로부터 높은 친화력인 단일가닥핵산들을 분리하는데 사용될 수 있으며, 분자에 높은 친화 및 특이성을 갖는 단일가닥핵산(개별 단일가닥핵산 중 일종 혹은 높은 친화력인 단일가닥핵산의 그룹 중)의 분리, 식별, 시퀀싱, 합성 및 증폭하게 한다. 통상의 Rervse-SELEX와 마찬가지로, 본 발명의 Reverse-SELEX 공정의 일 라운드로부터 분리된 단일가닥핵산 라이브러리는 새로운 단일가닥핵산 라이브러리의 합성에 사용되도록 접촉, 평형 결합, 경쟁 분자의 추가, 경쟁 분자와의 반응, 및 높은 친화력을 갖는 단일가닥핵산의 분리 단계가 필요한 만큼 수차례 반복될 수 있다. 경쟁자를 첨가하기에 앞서 다중의 분자 각각과 단일가닥핵산 라이브러리사이의 평형 결합을 달성하게 한 결합물에 과량의 경쟁자를 첨가하고 소정 시간동안 상기 경쟁자로 반응하게 하여 종래 달성되던 것보다 훨씬 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 개체군을 선별하게 한다.
평형 결합을 달성하기 위해, 상기 단일가닥핵산 라이브러리는 적어도 약 5 분, 혹은 적어도 약 15 분, 약 30 분, 약 45분, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간 또는 약 6 시간 동안 생체시료에 반응될 수 있다. 희석은 분자결합핵산 분리 공정으로서 사용되며, 희석된 단일가닥핵산 라이브러리, 분자결합핵산 복합체의 반응은 적어도 약 5 분, 적어도 약 10 분, 적어도 약 20 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 45 분, 적어도 약 1 시간, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 3 시간, 적어도 약 4 시간, 적어도 약 5 시간 적어도 약 6 시간 중에서 선택된 소정 시간 동안 수행될 수 있다.
분자결합핵산의 분리, 생산, 합성 및 사용은 연관성이 있다. 본 발명의 Reverse-SELEX는 종래의 Reverse-SELEX에 의해 수득된 보통의 분자결합핵산보다 비공유 분자결합핵산 복합체로부터의 분해 속도(t1/2)가 높아진 분자결합핵산들이 존재한다. 분자결합핵산과 표적의 비공유 분자결합핵산 복합체를 포함하는 혼합물에 대하여, 상기 t1/2는 분자결합핵산 복합체로부터 해리되는 분자결합핵산의 반감기를 나타낸다. 본 발명에 따른 분자결합핵산의 t1/2는 약 30 분 이상 약 30 분 내지 약 240 분 약 30 분 내지 약 60 분 약 60 분 내지 약 90 분 약 90 분 내지 약 120 분 약 120 분 내지 약 150분 약 150 분 내지 약 180 분 약 180 분 내지 약 210 분 약 210 분 내지 약 240 분중 일종으로부터 선택된다.
본 발명의 Reverse-SELEX 절차에 의해 분리된 분자결합핵산의 특징은 그것의 표적에 대한 높은 친화력에 있다. 분자결합핵산은 그것의 표적에 대한 분해 상수 (Kd)가 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 100 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 1 pM 미만 중 일종으로부터 선택될 것이다.
바람직하게, 본 발명은 단일가닥핵산 라이브러리로부터 분자에 대해 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 일차 라이브러리를 분리하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 단일가닥핵산 라이브러리를 준비하는 단계, (b) 분자들과 단일가닥핵산 라이브러리를 접촉시켜, 높은 친화력을 갖는 단일가닥핵산을 분자에 우선적으로 결합하여 분자결합핵산 복합체를 형성하는 단계, (c) 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 분리 공정을 적용하여 상대적으로 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체를 분리하는 단계, 및 (d) 분자에 대한 분자결합핵산을 분리하는 단계를 포함하여 이루어진다.
상기 방법은 나아가 다중의 분자 각각에 결합할 수 있는 특정 단일가닥핵산이 풍부한 ㄹ단일가닥핵산 풀을 수득하면서도 가장 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 복합체를 생산하도록 다중의 분자 각각에 결합하는 핵산을 증폭하는 단계를 반복하여 포함할 수 있다. 보다 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 분리 공정은 분자결합핵산 복합체를 포함하는 단일가닥핵산 라이브러리를 희석하는 단계, 최소 1종의 경쟁자를 분자결합핵산 복합체를 포함하는 단일가닥핵산 라이브러리에 첨가하는 단계, 및 상기 분자결합핵산 복합체를 포함하는 단일가닥핵산 라이브러리를 희석하고 최소 1종의 경쟁자를 분자결합핵산 복합체를 포함하는 단일가닥핵산 라이브러리에 첨가하는 단계, 중 선택될 수 있다.
생체시료를 구성하는 다중의 분자 각각에 대해 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 분리 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 단일가닥핵산 라이브러리를 준비하는 단계, (b) 다중의 분자와 단일가닥핵산 라이브러리를 접촉시키되, 단일가닥핵산 라이브러리에서 다른 단일가닥핵산보다 증가된 친화력을 갖는 단일가닥핵산이 다중의 분자 각각과 결합하여 분자결합핵산 복합체를 형성하는 단계, (c) 평형 결합을 달성하기에 충분한 시간 동안에 단일가닥핵산 라이브러리와 다중의 분자를 반응하는 단계, (d) 상기 (c) 단계의 반응용액에 최소한 하나의 경쟁 분자를 과량 첨가하는 단계, (e) 상기 (d) 단계로부터의 단일가닥핵산 라이브러리, 분자결합핵산 복합체 및 경쟁 분자로 된 반응용액을 소정의 시간 동안에 반응하는 단계, (f) 상기 반응용액으로부터 분자결합핵산 복합체를 분리하는 단계, (g) 자유 핵산을 생성하기 위해 분자결합핵산 복합체를 해리하는 단계, 및 (h) 증가된 친화력으로 다중의 분자 각각에 결합할 수 있는 단일가닥핵산들에서 보다 높아진 친화력을 갖는 단일가닥핵산 풀을 수득하도록 자유 단일가닥핵산들을 증폭하여, 상응하는 다중의 분자에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리를 분리할 수 있는 단계를 포함하여 이루어진다.
생체시료를 구성하는 다중의 분자에 대해 높은 친화력을 갖는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 분리 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 단일가닥핵산 라이브러리를 준비하되, 상기 단일가닥핵산 라이브러리는 단일가닥핵산 라이브러리의 최소한 하나 혹은 각각의 단일가닥핵산에 있는 1종, 다수 혹은 모든 피리미딘이 5-위치에서 화학적으로 변형된, 개질된 핵산을 포함하여 이루어지는 단계, (b) 다중의 분자와 단일가닥핵산 라이브러리를 접촉시켜, 단일가닥핵산 라이브러리에서 다른 단일가닥핵산보다 증가된 친화력을 갖는 단일가닥핵산들이 다중의 분자와 결합하여 분자결합핵산 복합체를 형성하는 단계, (c) 단일가닥핵산 라이브러리로부터 증가된 친화력을 갖는 단일가닥핵산 풀을 분리하는 단계, 및 (d) 증가된 친화력으로 다중의 분자에 결합할 수 있는 단일가닥핵산 라이브러리 내에서 높아진 친화력을 갖는 단일가닥핵산 풀을 수득하도록 증가된 친화력을 갖는 단일가닥핵산들을 증폭하여, 그것에 의해 다중의 분자에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리를 분리할 수 있는 단계를 포함하여 이루어진다.
시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리는 시료의 다양성을 있는 그대로 반영하여야 한다. 따라서 Reverse-SELEX은 선택과 증폭을 반복적으로 수행하여 특정한 분자에 특이적으로 강력하게 결합하는 단일가닥핵산 풀을 선정하는 과정인 바, 본 발명에서는 Reverse-SELEX의 이런 목적을 달성하기 위해 한정된 선택과 증폭만을 수행하는 대신 세척단계를 다양화하여 시료에 포함된 분자들의 다양성을 잘 반영하는 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제공한다.
상기 다양한 반응용액 및 조건에서 형성되는 시료를 구성하는 분자에 결합하는 단일가닥핵산 복합체 풀의 분리는 고체 지지체， 모세관 전기영동， 여과 등을 이용한 다양 방법으로 수행할 수 있다.
바람직하게는, 고체지지체를 이용하는 경우, 시료를 나이트로셀룰로스 막 디스크(nitrocellulose membrane disc)가 있는 반응용액(50 mM TrisCl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3)에 넣어 30분간 흔들어 주면서 반응시켰다. 이 생체시료를 구성하는 분자가 부착된 디스크를 단일가닥핵산 라이브러리 또는 분자결합핵산 풀이 있는 상기 반응용액에 처리하여 30분간 반응시켰다. 반응 후 다양한 세척버퍼로 세척 과정을 반복하는 일회의 선택과정으로 미결합 또는 비특이적으로 결합한 단일가닥핵산 또는 미결합 분자결합핵산을 제거하여 디스크에 부착된 분자-단일가닥핵산 복합체들을 확보함으로써 시료의 분자들과 결합하는 단일가닥핵산을 확보하였다. 상기 분자-단일가닥핵산 복합체들을 확보하기 위한 세척버퍼는 0 내지 1 x 반응용액 또는 0 내지 500 mM EDTA 용액을 사용하였다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 실시할 수도 있다. 상기 세척한 복합체를 사용하여 분자결합핵산 라이브러리를 제작할 수도 있다.
바람직하게는, 모세관 전기영동를 이용한 방법, 시료를 단일가닥핵산 라이브러리 또는 분자결합핵산 풀이 있는 상기 반응용액에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 상기 반응혼합용액을 완충용액 (50mMTris-HCl, pH 8.2)으로 모세관 전기영동을 실시한다. 본 발명의 모세관 전기영동을 이용한 모든 분석은 fused-silica capillary(Beckman Coulter; 길이 37 cm X 내경 75 m)를 장착한 P/ACE 5000 CE-LIF system(Beckman Coulter)을 사용하여 실시하였다. 시스템에 부착되어 있는 488nm 의 3 mW 아르곤 이온 레이져(Ar-ion)로 형광물질을 여기(excitation)하여 520 nm의 필터로 방출(emission)된 시그널을 LIF system 내의 검출기(detector)를 통해 포집한다.분석 및 모세관 처리에 사용되는 모든 용액은 0.2-um 공경(pore size)필터에 여과시켰고 모세관은 1 N NaOH와 증류수를 각각 5분간 흘려주어 세척한 후 사용하며 각 전기영동 사이에는 1N NaOH, 증류수, 완충용액으로 2분씩 모세관을 씻어준다. 여기에 10 kV의 전압을 걸어 전기영동을 실시하고 그 결과를 분석한다. 모세관 전기영동을 이용하여 분자-단일가닥핵산의 복합체 생성을 분석한 그래프로 분자-단일가닥핵산 복합체가 특이적으로 생성, 분리됨을 확인한다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 실시할 수도 있다. 상기 세척한 복합체를 사용하여 분자결합핵산 라이브러리를 제작할 수도 있다.
바람직하게는, 나이트로셀룰로즈와 나일론의 구조체를 이용한 여과방법, 시료를 단일가닥핵산 라이브러리 또는 분자결합핵산 풀이 있는 상기 반응용액에서 30분간 반응시켜 분자-분자결합핵산 복합체를 생성시킨다. 시료(분자)와 결합하는 분자결합핵산 풀의 선정은, 상기 반응혼합용액을 나이트로셀룰로스(nitrocellulose)와 나일론(nylon)으로 이루어진 구조체에 처리하여 압력을 가하면, 분자-단일가닥핵산 복합체는 나이트로셀룰로스 필터상에 있고, 미결합한 단일가닥핵산은 나일론 상에 존재한다. 상기 나이트로셀룰로스 필터를 회수하여, 다양한 세척버퍼로 세척 과정을 반복하는 일회의 선택과정으로 나이트로셀룰로스 필터에 있는 미결합하거나 비특이적으로 결합한 단일가닥핵산을 제거하여 분자-단일가닥핵산 복합체들을 확보할 수 있다. 상기 분자-분자결합핵산 복합체들을 확보하기 위한 세척버퍼는 0 내지 1 x 반응용액 또는 0 내지 500 mM EDTA 용액을 사용한다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 실시할 수도 있다. 상기 세척한 복합체를 사용하여 분자결합핵산 라이브러리를 제작할 수도 있다.
(분자결합핵산 이차 라이브러리 제조)
시료에 있는 다중의 분자의 종류와 존재하는 정도, 출현빈도가 다양하여 바이오마커 개발 그리고 미지 및 기지의 다중의 분자로 이루어진 시료의 분석을 위한, 리간드（ligand), 분석한계(limits of detection), 해상력 및 다이나믹 레인지(dynamic range) 등에 많은 문제가 발생한다. 따라서 본 발명은 이런 문제를 극복하기 위해 생체시료에서 분자의 종류와 출현빈도를 잘 반영하는 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조한 후, 정상화, 감산화, SSH 및 정상화-감산화 공정을 실시하여 분자결합핵산 이차 라이브러리를 제공하고자한다.
시료는 분석시료와 비교시료로 나눌 수 있다. "분석시료"은 다수의 분자를 함유하며 적어도 하나의 표적분자를 포함한다고 알려져 있는 임의의 물질, 용액 또는 혼합물을 말한다. 분석시료 내에 존재하는 임의의 표적 분자의 정확한 양 또는 농도 또한 잘 알려져 있을 수 있다. 상기 분석시료는 생물학적 시료 및 예를 들어, 오염되거나 오염되었을 가능성이 있는 물 및 공업폐수와 같은 환경 또는 독소 테스트를 위해 사용될 수 있는 시료를 포함한다. 분석시료는 또한 최종 산물(end product), 중간 산물(intermediate product) 또는 제조 공정, 예를 들어 준비 과정의 부산물(by-product)일 수 있다. 분석시료는 생물 또는 다른 어떤 원(예를 들어, 환경원 또는 공업원)으로부터 얻어진 물질, 용액 또는 혼합물에 첨가될 수 있는 임의의 적절한 검정 배지, 버퍼 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하는 분자결합핵산 이차 라이브러리의 제조는, 상기 제조된 단일가닥핵산 라이브러리로부터, 분석대상이 되는 생물학적인 분석시료에 있는 분자와 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리(분석시료-분자결합핵산 일차 라이브러리)와, 상기 분석시료에 비교되는 생물학적인 비교시료에 있는 분자와 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리(비교시료-분자결합핵산 이차 라이브러리)를 각각 제조할 수 있다.
본 발명은 시료의 분자결합핵산 일차 라이브러리로부터 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리 제조방법이 제공된다.
감산화의 기본적인 개념은 "차별적으로 존재하여 관심이 있는 염기서열을 포함하는 핵산풀(테스터)과 관심이 있는 염기서열이 없을 것으로 생각되는 핵산풀(드라이버)을 테스터보다 드라이버의 양을 과량으로 하여 혼성화하는 방법"이다.
상기 테스터와 드라이버 DNA 군집은 양 DNA 군집에 공동적으로 있는 DNA만이 이중가닥을 형성하도록 혼성화 반응을 시킬 수 있다. 혼성화 반응이 종료 된 후, 테스터-드라이버의 이중가닥핵산, 비결합한 드라이버 단일가닥핵산은 제거되고, 남아있는 핵산은 테스터에만 존재하는 염기서열인 단일가닥핵산 풀을 제조하기 위해 사용된다.
본 발명은, 라이브러리에 있는 DNA를 균등화하는 것뿐만이 아니라 다른 라이브러리에 공통적으로 존재하는 DNAs를 제거하는 것(감산화 하는 것)이므로, 본 발명에 따른 방법은 SSH 및 균등화-감산화는 특히, 상보성 DNAs의 제조에 효율적이다.
먼저 본 발명에서 SSH과정을 살펴보면, 상기 올리고뉴클레오티드에서 제조된 분자결합핵산에서부터 예비테스터 및 테스터 제조를 위해 올리고뉴클레오티드의 구조와 프라이머는 도6 및 도7과 같다.
바람직하게, 상기 분석시료-RNA 분자결합핵산을 역전사하여 분석시료-cDNA 분자결합핵산을 만든 후, 상기 제조된 분석시료-cDNA 분자결합핵산 및 분석시료-DNA 분자결합핵산을 주형으로 예비테스터 및 테스터를 제조한다.
바람직하게, 예비테스터1 제조를 위한 프라이머는 DS 프라이머이고 테스터1 제조를 위한 프라이머인 SSH 프라이머는 아댑터(adaptor: 부가적인 염기서열)1과 5' 보존영역의 상보적인 염기서열에 상보적으로 결합하는 염기서열로 구성된 프라이머(SSH 정방향 프라이머_테스터1)와 3' 보존영역에 상보적인 결합하는 프라이머(DS 역방향 프라이머)인 SSH 역방향 프라이머_테스터1이다. 분석시료-RNA 분자결합핵산는 상기 프라이머에 상응하는 기능적인 염기서열을 갖고 있는 구조이다.
바람직하게, 상기 예비테스터2의 제조를 위한 프라이머는 DS 프라이머이고 상기 테스터2의 제조를 위한 프라이머인 SSH 프라이머는 상기 분석시료-DNA 분자결합핵산을 주형으로 5' 보존영역의 상보적인 염기서열에 상보적으로 결합하는 프라이머(DS 정방향 프라이머)인 SSH 정방향 프라이머_테스터2와 3' 보존영역에 상보적 결합을 하는 염기서열과 아댑터2가 있는 프라이머(SSH 역방향 프라이머_테스터2)이다. 분석시료-RNA 분자결합핵산는 상기 프라이머에 상응하는 기능적인 염기서열을 갖고 있는 구조이다.
바람직하게, 상기 아댑터1과 아댑터2의 염기서열은 PCR 공정이 가능하도록 이에 상응하는 프라이머가 상보적으로 결합할 수 있는 위치를 제공할 수 있도록 디자인되어야 한다.
바람직하게, 상기 드라이버의 제조를 위해 올리고뉴클레오티드의 구조와 프라이머는 도8과 같으며, 상기 프라이머는 DS 프라이머이고 올리고뉴클레티드는 상기 DS 역방향 프라이머가 상보적으로 결합하여 역전사할 수 있고 그 산물인 cDNA를 주형으로 DS 프라이머에 상응하는 염기서열을 갖고 있는 구조이다.
바람직하게, 상기 비교시료-RNA 분자결합핵산 라이브러리를 구성하는 RNA 분자결합핵산에 대해 DS 역방향 프라이머로 역전사하여 단일가닥 cDNA 라이브러리를 제조하고 이를 주형으로 DS 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR 공정으로 비교시료-이중가닥 DNA 분자결합핵산을 제조하여 예비 테스터 및 드라이버로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 SSH 분자결합핵산 라이브러리 제조를 위해 구체적인 방법은 도 9와 같으며, (a) 상기 분석시료-RNA인 분자결합핵산 라이브러리를 구성하는 RNA를 주형으로 DS 역방향 프라이머로 역전사하여 단일가닥 cDNA 라이브러리를 제작하고 DS 프라이머 쌍으로 표준 PCR 방법으로 이중가닥 DNA 예비테스터를 준비하는 단계, (b) 상기 비교시료-RNA인 분자결합핵산 라이브러리의 RNA를 주형으로 DS 역방향 프라이머로 역전사하여 단일가닥 cDNA 라이브러리를 제작하고 DS 프라이머 쌍으로 표준 PCR 공정으로 이중가닥 DNA 드라이버를 제조하는 단계 (c) 상기 예비테스터를 예비테스터1과 예비테스터2로 나누어 전자를 주형으로 SSH 정방향 프라이머_테스터1과 DS 역방향 프라이머로 테스터1 및 후자를 주형으로 DS 정방향 프라이머와 3' SSH 역방향 프라이머_테스터2를 사용하여 PCR 공정으로 테스터2를 제조하는 단계 (d) 상기 드라이버, 테스터 1 및 테스터 2로 일차 혼성화, 이차 혼성화 및 nested PCR하는 단계 및 (e) 상기 SSH 분자결합핵산 라이브러리를 취득하는 단계를 포함하며, 이로써 상기 비교시료에 대비하여 상기 분석시료의 분석에 보다 효율적인 SSH 분자결합핵산 라이브러리를 제조할 수 있다.
바람직하게, 상기 테스터와 상기 드라이버의 반응은, 2회의 용액 혼성화로 실행한다.
바람직하게, 상기 테스터는 2개의 상기 테스터 혼성화 용액을 제조하고, 각각의 상기 테스터 혼성화 용액에 상기 드라이버 혼성화 용액을 혼합하여 1차 혼성화를 실행한다.
바람직하게, 상기 두 종류 테스터와 상기 드라이버를 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥과 비-결합된 단일가닥의 상기 드라이버를 PCR 공정으로 제거하는 단계를 실행한다.
바람직하게, 미네랄 오일이 포함된 상기 드라이버 혼성화 용액을 DNA의 이중가닥 분리 온도로 가열한 후, 상기 1차 혼성화한 2개의 상기 테스터 혼성화 용액 중에 하나를 상기 드라이버 혼성화 용액에 첨가하고, 이어서 나머지 하나의 1차 혼성화한 상기 테스터 혼성화 용액을 첨가하여 2차 혼성화를 실행한다.
바람직하게, 상기 2차 혼성화가 종료된 후에, 형성된 코헨시브(cohensive) 말단인 이중가닥 DNA의 양쪽 말단을 블런트(blunt) 말단으로 전환시켜 네스트(nest) PCR을 할 수 있는 DNA를 제조한다. 바람직하게 제조된 상기 DNA는 RNA 중합효소 결합위치 및 제한효소 인식부위가 있는 DNA이다.
본 발명에서 Duplex-Specific Nuclease(DSN)를 이용한 균등화 DNA 분자결합핵산 라이브러리 제조는 도 10과 같이 (a) 상기 DNA 분자결합핵산 라이브러리를 주형으로 RS 정방향 프라이머와 RS 역방향 프라이머를 이용하여 표준 PCR 공정으로 이중가닥 DNA를 제조하는 단계, (b) 상기 이중가닥 DNA을 용액을 혼성화하는 단계, (c) 효소를 이용하여 상기 이중가닥 DNA를 제거하는 단계, 및 (d) 남아있는 단일가닥 DNA를 주형으로 증폭하는 단계를 포함한다. 상기 분석시료-DNA 분자결합핵산 라이브러리는 생체시료에 결합하는 RNA 분자결합핵산 라이브러리의 역전사 산물이거나 생체시료에 결합하는 DNA 분자결합핵산 라이브러리일 수 있다.
Duplex-Specific Nuclease(DSN)를 이용한 감산화 DNA 분자결합핵산 라이브러리 제조는 도 10과 같이(a) 상기 분석시료-DNA 분자결합핵산 라이브러리를 주형으로 아댑터1과 5' 보존영역의 상보적인 염기서열과 상보적으로 결합하는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머와 3' 보존영역과 상보적 결합하는 염기서열과 아댑터2로 이루어진 역방향 프라이머를 이용하여 표준 PCR 방법으로 이중가닥 DNA를 제조하고 이를 주형으로 다시 One-way PCR 공정을 실행하여 단일가닥 테스터를 제조하는 단계, (b) 상기 비교시료-DNA 분자결합핵산 라이브러리를 주형으로 DS 정방향 프라이머와 DS 역방향 프라이머를 이용하여 표준 PCR 공정으로 드라이버 DNA를 제조하는 단계, 및 (c) 상기 테스터와 상기 드라이버를 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥 및 비-결합된 단일가닥의 상기 드라이버를 효소를 이용하여 제거하고, 남아있는 상기 단일가닥 테스터를 증폭하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 상기 분석시료-DNA 분자결합핵산 라이브러리는 생체시료에 결합하는 RNA 분자결합핵산 라이브러리의 역전사 산물이거나 생체시료에 결합하는 DNA 분자결합핵산 라이브러리일 수 있다.
바람직하게, 상기 분자결합핵산 DNA 라이브러리는 분자결합핵산 RNA 라이브러리를 주형으로 역전사하여 제조된 분자결합핵산 cDNA 라이브러리이거나 분자결합핵산 DNA 라이브러리 등이다.
바람직하게, 상기 아댑터1과 아댑터2의 염기서열은 PCR 공정이 가능하도록 이에 상응하는 프라이머가 상보적으로 결합할 수 있는 위치를 제공할 수 있도록 디자인되어야 한다.
본 발명은, 상기 균등화 및 감산화를 연속적으로 실시하여 균등화 라이브러리로부터 감산화 라이브러리를 제조하여 균등화-감산화 라이브러리를 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 분자결합핵산 라이브러리의 SSH 공정, 균등화 공정, 감산화 공정, 균등화-감산화 공정의 실시방법은, 분자생물학의 실험방법 중에 생물학적 시료에서 mRNA를 유효하게 분석하기 위해 cDNA 라이브러리에 대해 수행하는 "SSH 공정, 균등화 공정, 감산화 공정 및 균등화-감산화 공정" 방법을 상기 분자결합핵산 라이브러리(일차 핵산 라이브러리)에서 시료의 분석에 보다 효율적인 분자결합핵산들로 이루어진 라이브러리(이차 핵산 라이브러리)획득할 수 있도록 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 구조, 일차 핵산 라이브러리의 SSH 공정, 균등화 공정, 감산화 공정 및 균등화-감산화 공정를 실시할 수 있도록 최적화된 프라이머 디자인 및 일차 핵산 라이브러리의 SSH 공정, 균등화 공정, 감산화 공정 및 균등화-감산화 공정등의 실시 단계를 발명하여 그 방법을 제공하고자한다.
cDNA 라이브러리에서 균등화는 cDNA 라이브러리에서 과다 발현된 전사체의 수를 감소시키고 드물게 표현된 전사체의 수를 증가시키는 과정이며, 감산화는 두 개의 cDNA 라이브러리 중 특정 라이브러리에만 존재하는 전사체의 종류만 증가시키는 과정이다. 이와 같이 생체시료에서 추출된 mRNA를 cDNA로 전환시켜 mRNA를 균등화 및 감산화하는 방법이 제안되어 있을 뿐 mRNA외 분자들에 대한 균등화 및 감산화하는 방법들이 구체적으로 제안된 바가 없다.
본 발명에 따른 분자결합핵산 이차 라이브러리 제조방법은, 분석 대상이 되는 분석시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리를 바로 제조하는 것이 아니라. 분석 대상이 되는 분석시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리와는 별도로, 분석시료와는 다른 비교시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조하고, 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리에 균등화와 감산화 공정을 적용하여 분석시료와 비교시료에서 차이를 보이는 분석시료 또는 비교시료에 특이적으로 결합하는 분자결합핵산 이차 라이브러리를 제조함으로써, 분자결합핵산에 의한 분석시료의 분석 효율을 향상시키는 한편, 최종적으로 선정된 분자결합핵산에 결합하는 분석시료의 특성을 규명하는 것에 사용할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명에 따라 제조된 균등화, 감산화, 균등화-감산화 또는 SSH 분자결합핵산 라이브러리인 분자결합핵산 이차 라이브러리는, 양적 차이에 대한 정보를 제공할 수 있는지를 확인하는 근거가 되며, 따라서 본 발명은 정량상의 차별적 스크리닝 기술"에 해당된다.
상기 선별된 분자결합핵산들을 이용하여 분석시료 및 비교시료의 분자와 분자결합핵산의 복합체에 있는 분자결합핵산의 정량화 공정은 Q-PCR, MS 및 혼성화로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 검출되고 선택적으로 하는 정량화할 수 있다. 상기 Q-PCR 공정은 TaqMan PCR, PCR 동안의 삽입성 형광 염료(intercalating fluorescent dye), 또는 PCR 동안의 분자 비콘(molecular beacon)을 사용하여 수행할 수도 있으며, 상기 혼성화 공정은 상기 분자결합핵산 또는 상기 분자결합핵산의 증폭산물이 포착프로브와 결합하는 것이다.
본 발명에서 균등화 공정, 감산화 공정, 균등화-감산화 또는 SSH 공정을 실시할 경우 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화의 정도관리용 기준물질은 인간유래 생체시료를 분석하는 경우 한정된 분자 물질을 정도관리용 기준물질 물질로 사용할 수 있으며 출현빈도가 서로 상이한 분자들 즉, 출현빈도가 높은 분자 및 낮은 분자를 균등화 공정의 기준물질로 사용하여 균등화 정도를 평가할 수 있다.
본 발명의 목적은, 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리와 분자결합핵산 이차 라이브러리에서 선별된 분자결합핵산들을 이용하여 분석시료 및 비교 시료의 분자와 분자결합핵산의 결합 자료 데이터베이스를 구축한 후, 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산들을 선정하는 과정을 적용함으로써, 목적하는 분석시료 및 비교시료에 대한 분석 효율이 향상되고, 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분석적 분자결합핵산 선정 방법 및 그들의 용도를 제공하고자 하는 것이다.
(분석적 분자결합핵산 선정)
상기 분자결합핵산 일차 라이브러리와 이차 라이브러리를 이용하여 유용한 분자결합핵산의 선정방법은 상기 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 분석하여 분석시료 및 비교시료에 대한 데이터베이스를 구축하여 생물학적 의미있는 분자결합핵산을 선정하는 방법을 구현하는 것으로 그 단계는 도 11과 같다.
상기 제조된 라이브러리에서 취득되는 분자결합핵산을 사용하여 분석시료 및 비교시료의 분자와 상기 취득되는 분자결합핵산과 분자의 결합 양태를 검사하여 이에 대한 데이터베이스를 구축하여 분석시료 및 비교시료에서 생물학적 의미가 있는 분자결합핵산을 선정할 수 있으며 또한, 선정된 분석적 분자결합핵산을 이용하여 분자를 분리하여 동정하는 방법을 제시할 수 있다.
본 발명에 따라, 분자결합핵산과 분자의 결합 프로파일을 생성하는 것에 사용되는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 분석하는 방법이 제공되며, 본 발명에 따른 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도는 시료에 포함된 분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위해 사용된다.
본 발명에 따른 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도 분석방법은, 상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리 또는 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산을 대상으로 차세대염기서열결정(Next Generation Sequecing: NGS) 과정을 포함한다. 상기 NGS는 칩(Chip)기반 그리고 PCR기반 페어드엔드(paired end)형식으로 전장유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다.
차세대시퀀싱은 illumina, 로슈, 아이언토론토 등의 시퀀싱 기술을 의미하는 것으로, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio, RainDance 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함한다. 이러한 기술의 차이는 Chip 혹은 Bead기반이 올리고의 화학적 반응에 기초를 둔 것이 차세대 기술이고, DNA를 해독하는 방법에 있서 속도 및 시퀀싱 기술이 획기적으로 개선되면 제 3세대 또는 제 4세대 등으로 구분된다.
시그널강도(signal intensity)는 올리고(oligo)와 같은 DNA조각이 칩에 붙어있는 DNA조각에 결합된 형태를 스케너로 읽으면 결합 및 염기의 특징에 따라 색 및 강도가 측정되는 값을 말한다. 시퀀싱 회수(sequencing folds)는 시퀀싱을 수행하는 회수를 의미하는 것으로 10x로 시퀀싱을 하는 것이 일반적이나, 20x를 하면 보통 정도의 결과가 나오고, 40x 배수로 시퀀싱을 수행하면 희기 대립유전자를 많이 안정적으로 확보가 가능하다.
차세대 염기서열 분석장치(Next Generation Sequencer)는 기존 Sanger방식의 염기서열분석과 비교할 때, 몇 주가 걸리던 DNA 라이브러리 제작 및 박테리아 클로닝 과정을 몇 시간의 중합효소 연쇄반응 증폭으로 대체하였으며, 수개의 모세관 어레이(capillary array)에서 이루어지던 병행 염기서열 분석(parallel sequencing)은 수십만 개의 클론(clone)을 동시에 시퀀싱할 수 있다. 또한, 다수의 염기서열 분석 결과물을 산출이 가능하여 고 처리량 염기서열 분석법(high-throughput sequencing)으로 불리며, 이러한 높은 밀도의 병행 염기서열 분석(parallel sequencing)은 많은 표적분자를 동시에 검출하기에 효과적이다. 하지만, 라이브러리 제작을 위한 중합효소 연쇄반응도중 생겨나는 편향현상으로 인하여 소량으로 있는 표적분자는 많은 양으로 있는 표적분자에 의하여 묻혀버리는 현상이 생긴다.
실제 임상 시료는 표적분자가 극소량으로 존재하는 경우가 많기 때문에, 기존의 방법으로는 극소량의 표적분자의 검출이 어려운 문제점이 있다. 상기 문제점을 해결하기 위해, NGS sequencing의 depth(read 수)를 높여 한계 수치를 높이는 방법으로 해결할 수도 있다.
일반적으로 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 분리하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 방법과 공정에 대해서는, 통상의 기술자라면 서로 다른 시퀀싱 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상세한 공정은, Illumina Company 등의 시퀀서 제조사에 의해 제공되는 프로시저를 참조할 수 있으며, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 원용되는, Illumina Company의 Multiplexing Sample Preparation Guide (Part#1005361; Feb 2010) 또는 Paired-End Sample Prep Guide(Part#1005063, Feb 2010)를 참조할 수 있다. 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 방법과 장치는 특별히 제한되지 않으며, 이는 상업용 핵산 추출 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서는 분자결합핵산의 선정을 위한 시퀀싱 라이브러리를 구축하기 위한 핵산 시료의 준비 방법과 공정에 대해서는, 분석하고자하는 시료를 구성하는 다중의 분자와 단일가닥핵산 라이브러리, 분자결합핵산 라이브러리 또는 후보 압타머 풀과 반응시켜 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 형성하는 단계, 형성된 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 분리하여 핵산 시료를 준비하는 단계 및 준비된 핵산시료로부터 염기서열 라이브러리를 구축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 구성할 수 있다.
상기 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 제조하는 방법 및 공정에 대해서는, 분자와 분자결합핵산의 결합 특이성과 친화도를 고려하여 설계할 수 있으며 분자결합핵산 라이브러리 제조 과정을 참조할 수 있다．
상기 다양한 반응용액 및 조건에서 형성되는 시료를 구성하는 분자-분자결합핵산 복합체 풀의 분리는 다양 방법으로 수행할 수 있다. 시료를 구성하는 분자들을 고체지지체에 고정하여 분자결합핵산 라이브러리와 접촉시켜 형성된 고체지지체에 부착된 분자-분자결합핵산 복합체 풀을 고체지지체를 수확함으로써 분자-분자결합핵산 복합체 풀을 분리하는 방법, 시료를 구성하는 분자와 분자결합핵산 라이브러리를 접촉시킨 후 모세관 전기영동을 수행하고 분자-분자결합핵산 복합체 풀과 미결합 분자 또는 미결합 단일가닥핵산을 분리하는 모세관 전기영동 방법, 시료를 구성하는 분자와 분자결합핵산 라이브러리를 접촉시킨 후 나이트로셀룰로즈와 나일론의 구조체에 처리하여 여과시켜 분자-단일가닥핵산 풀을 수확하는 여과법 등이 있으며 선택되어지는 한 방법에 의해 수행할 수 있다.
상기와 같이 분리된 분자-분자결합핵산 풀에서 분자결합핵산 풀을 분리하고 이를 대상으로 공지된 방법으로 시쿼싱 라이브러리를 제조할 수 있다.
시퀀싱 라이브러리가 구축된 후, 얻은 시퀀싱 라이브러리를 시퀀서에 적용하여, 다중의 염기서열 데이터(참조 염기서열, reference sequences)로 이루어지는 대응하는 염기서열 결과를 얻는다. 본 개시 내용의 실시예들에 따르면, 시퀀싱을 위한 방법과 장치는 연쇄종료법(Sanger)을 포함하지만, 특별히 이러한 예로 제한되지 않으며, 고 처리량 시퀀싱 방법(high-throughput sequencing method)이 바람직하다. 따라서, 이러한 장치들의 딥 시퀀싱과 고 처리량인 특징을 이용함으로써, 효율을 더욱 개선할 수 있고, 이 의해 통계 시험 등의 시퀀싱 데이터를 이용한 후속 분석을 정밀하고 정확하게 더욱 개선할 수 있다. 고 처리량 시퀀싱 방법은 차세대 시퀀싱 기술 또는 단일 시퀀싱 기술을 포함하지만, 이러한 예로 제한되지는 않는다. 차세대 시퀀싱 플랫폼(Metzker ML, Sequencing technologies-the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11(1):31-46)은, Illumina-Solexa(GATM, HiSeq2000TM, 등), ABISolid, 및. Roche-454 (파이로시퀀싱) 시퀀싱 플랫폼을 포함하지만, 이러한 예로 제한되지 않으며, 단일 시퀀싱 플랫폼(기술)은, Helicos Company의 트루 단분자(True Single Molecule) DNA 시퀀싱, Pacific Biosciences Company의 단분자 실시간(SMRTTM), 및 Oxford Nanopore Technologies의 노나포어 시퀀싱 기술(Rusk, Nicole (2009-04-01). Cheap Third-Generation Sequencing. Nature Methods 6 (4): 244-245) 등을 포함하지만, 이러한 예들로 제한되지 않는다. 시퀀싱 기술이 점진적으로 발전함에 따라, 통상의 기술자라면 모든 게놈 시퀀싱에 사용될 수 있는 다른 시퀀싱 방법들을 이해할 수 있다. 본 개시 내용의 특정 예들에 따르면, 전체 게놈 시퀀싱 라이브러리는, Illumina-Solexa, ABI-SOLiD, Roche-454, 및 단분자 시퀀싱 장치 중에서 선택되는 적어도 하나에 의해 시퀀싱될 수 있다.
본 발명에서 분자결합핵산 시퀀싱 결과를 얻은 후에, 일차적으로 분자결합핵산 일차 라이브러리의 시퀀싱 결과는, 분석시료에서 준비된 염기서열들은 “분석 염기서열 풀” 및 비교시료에서 준비된 염기서열들 “비교염기서열 풀”로 구분하는 단계, 풀의 리드 염기서열을 분석하여 동일한 염기서열(즉 동일한 분자결합핵산)을 결정하는 단계, 결정된 염기서열에 대해 분석 염기서열 풀 또는 비교 염기서열 풀에서 출현빈도를 결정하는 단계, 분석시료 및 비교시료를 비교하거나 대표할 수 있는 염기서열(즉, 분자결합핵산)을 선정하는 단계를 포함하여 분석할 수 있다.
상기 NGS 분석 결과로부터 얻은 분자결합핵산의 출현빈도는 분자-분자결합핵산 복합체 풀에서 특정 분자결합핵산에 의해 형성된 복합체의 비율을 의미하며 즉, 시료를 구성하는 다중의 분자에서 특정분자의 비율을 뜻하는 것으로 해석할 수도 합리적이다. 즉 분자결합핵산의 출현빈도가 높으면 이에 상응하는 분자의 출현빈도가 높다고 판단하는 것도 합리적이며 본 발명의 실시례에서 이를 입증하였다.
본 발명은 내부정도관리 및 측정용 기준물질(reference material)를 결정하여 시료를 구성하는 분자와 함께 같은 시험구에서 같이 분석하여 상기 기준물질의 출현빈도와 분자량을 출현빈도를 알고 있는 분자결합핵산에 상응하는 분자를 정량화할 수 있다.
바람직하게는, 생물학적 의미가 있는 분석시료 및 비교시료를 통계적으로 유의한 시료를 수집하여 상기 과정을 반복하여 생물학적 의미를 기초하여 데이터베이스를 구축한 후 통계적으로 분석시료와 비교시료를 비교하거나 대표할 수 있는 유의한 분자결합핵산을 결정할 수 도 있다.
또한, 분자결합핵산 이차 라이브러리의 시퀀싱 결과는 상기 분석염기서열 풀 및 비교염기서열 풀을 참조서열(reference sequence)로 비교대조하여 분석시료 및 비교시료를 서로 비교하거나 대표할 수 있는 분자결합핵산을 선정하는 단계를 포함하여 분석할 수 있다. 또한 상기 분자결합핵산과 통계적으로 유의한 분석시료 또는 비교시료와 반응시켜 얻은 분자－분자결합핵산 복합체 풀의 핵산을 핵산분석방법으로 분석하여 분석시료 및 비교시료를 비교하거나 대표할 수 있는 분자결합핵산을 선정하는 단계를 더 포함하여 분석할 수도 있다.
상기 핵산분석방법은 NGS, 바이오칩 기술, PCR 기반 분석 기술 등이 있으며 이중에 선택되어지는 하나로 분석하는 내용이다. 각각 서로 다른 분석물(analyte)을 인식하고 선택적으로 다수의 분자결합핵산들이 시료에 도입되고, 임의의 상기에 기재된 검정법들이 수행될 수 있다. 분자결합핵산들을 분리한 후, 분리된 서로 다른 분자결합핵산들을 측정하기 위하여 임의의 적절한 다중 핵산 검출 방법이 적용될 수 있다. 고체표면 상에 개별적으로 배열된 상보적 프로브에 대한 혼성화에 의해 달성될 수 있있으며 각각의 서로 다른 분자결합핵산들이 질량 분석법을 사용하여 분자량에 기초하여 검출될 수 있다. 각각의 서로 다른 분자결합핵산들은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)에서, 겔에서 또는 액체 크로마토그래피에서와 같은 전기영동도(electrophoretic mobility)에 기초하여 검출될 수 있다. 고유의 PCR 프로브는 QPCR을 사용한 각각의 서로 다른 분자결합핵산을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 각각의 서로 다른 분자결합핵산들은 질량 분석법을 사용한 분자량에 기초하여 검출될 수 있다.
추가적으로 참조서열은 분석염기서열과 비교염기서열과 비교분석하여 참조서열을 확정하는 단계, 및 알고리즘을 이용하여 참조서열의 임상정보를 기초하여 분석염기서열과 비교염기서열의 염기서열들을 확정하여 참조서열을 추가적으로 확보하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 분자결합핵산과 분자 복합체 풀의 핵산을 NGS로 분석한 결과인 핵산의 염기서열 및 출현빈도는 분자결합핵산과 결합하는 시료의 분자의 양태를 반영하는 “결합 프로파일”을 의미한다고 할 수도 있다.
본 발명에 따른 분자결합핵산은 동일 유사한 정도의 정밀도로 생채분자의 생물학적 의미를 분석할 수만 있다면 분석하는 분자결합핵산의 수를 작게 하는 것이 시퀀싱의 제조비용 및 분석의 효율성 측면에서 바람직하다.
이와 같은 이유로, 분자의 생물학적 의미 분석에 대한 각각의 분자결합핵산들의 기여도를 분석하고, 분자의 생물학적 의미를 분석할 수 있는 범위 내에서, 분석된 기여도에 기초하여 분자결합핵산들을 선별함으로써 본 발명의 분자결합핵산들의 수를 감소시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게, 취득한 상기 분자결합핵산을 합성하여 상기 분자결합핵산 분석을 포함하는 방법으로 제조되고 생체시료에 포함된 분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위해, 상기 분자결합핵산과 분자들의 결합 프로파일을 생성하는 것에 사용할 있는 분자결합핵산들을 제공할 수 있다.
바람직하게, 상기 취득한 SSH, 균등화, 감산화, 균등화-감산화 분자결합핵산 및/또는 상기 분자결합핵산으로 구성된 것을 특징으로 하는, 시료에 포함된 분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위해, 분자들과 분자결합핵산들의 결합 프로파일을 생성하는 것에 사용되는 분자결합핵산들을 제공할 수 있다.
바람직하게, 상기 취득한 SSH, 균등화, 감산화, 균등화-감산화 분자결합핵산들 및/또는 상기 분자결합핵산들을 준비하는 단계, 상기 분자결합핵산들과 상기 생체시료의 분자들을 반응시켜 분자-분자결합핵산 복합체 풀을 형성하고 상기 분자-분자결합핵산 복합체 풀을 분리하는 단계, 분리된 상기 분자-분자결합핵산 복합체 풀로부터 분리된 분자결합핵산들을 분석하여 결합 프로파일을 획득하는 단계 및 획득된 상기 프로파일과 이미 확보되어 있는 프로파일 데이터를 비교하여 상기 분자들의 생물학적 의미를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산들 이용한 분자 분석하는 방법을 제공할 수 있다.
바람직하게, 상기 분자결합핵산을 이용한 분자 분석방법을 통해 얻어진 축적된 분석결과로부터, 상기 분자의 생물학적 의미의 분석에 기여하는 특이적인 분자결합핵산들을 결정하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산을 이용한 분자 분석방법을 제공한다.
본 발명의 분자결합핵산 선정 및 제조 방법은 도 12와 같이 비교되는 두 개 이상의 특징적 생리학적 상태, 특히 발병조직 또는 기관과 그것의 생리적인 환경을 반영하는 세포 및 단백질체에 대한 분자결합핵산 라이브러리를 비교분석하여 분석에 보다 효율적인 분자결합핵산들을 선정하여 유기합성으로 제조하는 방법이며, 제조된 분자결합핵산들은 생체시료(분석시료 및 비교시료)들 간의 정성 차이를 증명하고, 생체시료에 포함된 분자를 분리 및 동정하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 분자결합핵산을 이용한 분자 분석방법을 통해 얻어진 축적된 분석결과로부터, 상기 분자의 생물학적 의미의 분석에 기여하는 특이적인 분자결합핵산을 사용하여 상기 분자결합핵산에 결합하는 분자를 동정하는 것을 특징으로 하는, 분자결합핵산을 이용한 분자 분석방법을 제공한다.
상기 NGS를 이용하는 방법이 유용하나, 부가적으로 분석시료 및 비교시료에서 분자결합핵산 풀을 처리하여 상기 시료들에 결합하는 두개의 서로 다른 프로브들을 제조하여 분석할 수도 있다. 하나의 프로브는 Cy3 염료를 가질 수 있고, 다른 하나는 Cy5 염료이다. 예로서 분석시료 및 비교시료에 동일한 분자결합핵산 풀을 반응시키고. 각각의 시료은 동일한 방법으로 개별적으로 처리된다. 상기 시료들은 균일하게 혼합될 수 있고, 검정의 나머지 단계들이 수행될 수 있다. 분석시료 및 비교시료간의 임의의 다른 발현(즉, 시료 내 표적의 서로 다른 양 또는 농도)의 직접적 비교는 개별적으로 각각의 표지 시약으로부터의 시그널을 측정함으로써 가능하다. 이 방법은 임의의 다른 검정법 내로 통합될 수 있다. 게다가, 형광 염료의 사용을 포함하는 서로 다른 염료를 사용하는 것에 더하여, 서로 다른 각각의 프로브들로부터 시그널을 구별하기 위하여 다른 표지가 사용될 수 있다. 각각의 시료에서 사용된 분자결합핵산들은 서로 다른 염색시약을 가질 수 있다. 이 방법은 예를 들어, 판독(readout)이 QPCR 또는 DNA 혼성화 어레이인 경우에 유용하다.
본 명세서는 또한 분자결합핵산 복합체로부터 검정 성분의 분리를 용이하게 하고, 검출 및/또는 정량을 위하여 분자결합핵산을 분리할 수 있게 하는 분자-분자결합핵산 복합체를 기재한다.
(생물학적 의미 결정)
상기 다중검사 기술로 많은 분자결합핵산에 의해 생산되는 데이터에 대한 생물적인 의미의 기준에 따라 유용한 분자결합핵산을 결정할 수도 있며 그 생물학적 의미는 예시적으로 진단이지만 이에만 국한된 것이 아니다.
본 발명으로 생성되는 많은 데이터는 고차원의 특성을 갖는 방대란 양의 정보로 세포, 조직이나 질병에 관련된 다양한 정보를 생산할 수 있다.
생물학적 의미가 잘 정의된 시료인 표준시료에 대한 하나 또는 그 이상의 분자 값으로 생물학적 의미에 따라 데이터베이스를 구축하여 특징선택을 한 후 선정된 특징인 분자로 학습된 분류기를 저장하는 단계와 시료의 하나 또는 그 이상의 분자 분석결과를 확보하고 상기 학습되고 저장된 분류기를 이용하여 생물학적 의미를 결정에 기여하는 핵산을 결정하는 단계로 시스템을 구성할 수 도 있다.
상기 하나 또는 그 이상의 분자 분석결과를 대상으로부터 생물학적 의미를 결정하는 생물학적 의미 결정 시스템을 제공하고 있다.
상기 임상검사 값은 질병이나 다른 상태를 진단, 치료, 완화, 처치, 예방을 목적으로 생물학적 의미에 관한 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정을 지원하는 “분류”, “점수”, “지수”를 의미하고, 생물학적 의미가 결정된 시료 또는 시료를 채취한 사람의 임상 정보(Clinical Information) 및 상기 하나 또는 그 이상의 분자 값들을 수집한 후, 통계학적 기법 또는 기계학습알고리즘을 이용하여 상기 수집한 정보들로부터 질환을 추론 또는 판별할 수 있도록 하는 생산된 특이적 결과일 수도 있다.
상기 입력되는 분자 값에서 상기 임상검사 값의 산정을 위해, 상기 하나 또는 그 이상의 분자에서 중요 변수를 찾아 차원을 축소하거나 특성의 변형을 통해 주요 분자들을 찾아내는 특징 선택(Feature Selection) 절차를 추가적으로 더 포함할 수도 있다.
상기 특징선택은 입력받은 학습 집단의 분자 값으로 최대한 정확한 출력을 내도록 학습을 수행하여 특징 집합의 개개별 특징의 독립된 분자 값만으로 평가하는 필터(filter)방법, 특징선택과 분류기를 하나의 쌍으로 결합하여 특정 분류기의 분류 성능을 평가 척도로 사용하는 래퍼(wrapper)방법, 특징선택과 분류기 학습이 동시에 일어나는 임베디드(Embedded) 방법 또는 필터방법과 래퍼 방법을 혼합한 하이브리드 방법으로 이루어진 군에서 선택되어진 방법으로 결정질 수도 있다. 특징 선택 방법은 특징 부분집합의 생성 방법에 따라 크게 두 가지 유형이 있은데, 첫 번째로, 필터방법은 특징에서 부분집합을 먼저 선택하여 이를 분류 알고리즘을 실행하는데 사용하는 것이다. 선택된 부분집합이 얼마나 좋은가에 대한 평가는 부분집합에 속한 특징과 분류 기준 사이의 고유 속성들을 이용하여 평가하게 된다. 필터방법의 예로 정보이득(information gain)을 들 수 있다. 이는 기계학습 분야에서 용어의 적합도 기준으로 자주 사용되며, 문서에서의 출현 빈도뿐 아니라 출현하지 않은 빈도까지 고려하여 각 범주에서의 용어 정보량을 계산 한다. 두 번째로, 래퍼방법은 최적의 특징을 찾기 위해 분류 알고리즘을 데이터세트(dataset)에 적용시키는 것이다. 필터방식과 달리, 직접 분류기를 사용하여 해당하는 특징 부분집합의 우수성을 평가하며, 사용할 분류기를 미리 결정한 후 매번 특징 부분집합이 생성될 때 마다 분류하고 그 분류 성능이 우수함의 척도가 된다. 래퍼 방법은 특질의 수가 많을 때 시간이 많이 걸린다. 래퍼방법의 대표적인 예는 유전자 알고리즘(genetic algorithm, GA)이다.
상기 전 처리된 결과를 가지고 학습을 수행하여 환자의 모델을 생성하는 모듈은 선택된 특질들을 적합한 분류기(Classifier)를 통해 각 클래스별로 분류하는 절차이다.
본 발명에서 인공신경망(Artificial Neural Network)을 사용하였는데, 입력과 출력에 따라 행동을 결정하는 특성 때문에 패턴인식, 함수근사, 분류기법 등 다양한 분야에서 응용되고 있다. 인공신경망은 그 구조는 여러 개의 층(layers), 노드(nodes), 신경망간 연결 가중치로 구성된다. 본 발명에 사용하는 신경망 층간 연결방식은 전향(Feed-forward)방식이다. 입력패턴에 다라 각 노드에 대한 신경망 연결 가중치와 활성화 함수를 이용하여 출력값을 산출하였다. 생성된 결합정보를 통하여 어떤 일을 처리했을 때 추정한 값과 실제 결과 값이 상이한 경우, 산출된 값을 실제 결과 값과 비교하면서 오차를 줄이는 과정을 반복해서 찾아내는 방식이다.
상기 필터방법은 정보이득(information gain), 신호 대 잡음비(signal to noise ratio), t-통계량, 피어슨 상관계수, 주성분 분석(principal component analysis)으로 이루어진 군에서 선택되어지는 하나로 이루어지고, 여기서 상기 선택된 분자 값으로부터 상기 임상검사 값의 결정은 다층신경망, k-최근접 이웃, 결정 나무(decsion tree), 지지 벡터 기계(support vector machines), 피셔의 선형판별식(Fisher's linear discriminant analysis)으로 이루어진 군에서 선택되어지는 하나로 이루어진 분류기로 수행되는 것일 수도 있다.
상기 래퍼방법은 최적의 분자를 찾기 위해 분류 알고리즘을 데이터세트에 적용시키는 것으로 유전자 알고리즘(genetic algorithm, GA)일 수도 있다.
상기 생물학적 의미는 상기 시료 또는 시료를 채취한 사람의 생리적인 변화를 의미하고, 상기 임상검사 값에 상응하여 예방, 진단, 치료, 완화와 처치의 건강관리를 목적으로 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정에 필요한 정보일 수도 있다.
상기 시료의 다중의 분자 각각의 분석결과에 기초하여 생물학적 의미 결정 방법은 사용자와 대조군 또는 비교군 데이터베이스의 유사도일 수도 있으며 상기 대조군과 비교군을 구성하는 시료들의 임상정보를 참조하여 생물학적 의미를 결정할 수도 있다. 보다 구체적으로 살펴보면, 병리 조건과 건강한 상태의 시료의 다중의 분자에 특이적으로 결합하고 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산을 선정할 수 있어 이런 일렬의 공정은 “분자결합핵산을 선정하는 방법“이다.
(분자결합핵산의 용도)
본 명세서에 기술된 방법들에 따라 선정된 분석적 분자결합핵산은 상기 특정분자와의 해리상수(Kd)가 2.0x10-9 미만이고 상기 해리상수와 다른 분자 해리상수의 비인 특이도가 5이상인 핵산인 압타머들을 포함하고 있으며 상기 분자결합핵산은 바이오마커의 개발, 진단 및 치료 방법 범주내에서 유용하다.
Reverse-SELEX 공정은 미지 또는 기지의 분자들로 이루어진 생체시료에서 상응하는 분자 각각의 양태에 기초하여 생물학적 의미를 기초하여 분자결합핵산 개발 및 개발되는 분자결합핵산에 대한 표적분자를 확인하여 바이오마커 개발에 유용하게 사용할 수 있다.
상기 생물학적 의미 결정은 시료의 상기 분자 분석결과에 기초하여, 사용자의 생물학적 의미 결정은 사용자와 대조군 또는 비교군 데이터베이스의 유사도일 수도 있으며 이런 경우에 상기 대조군과 비교군을 구성하는 시료들의 임상정보를 참조하여 생물학적 의미를 결정할 수도 있다. 본 발명에서 제시하는 NGS 또는 바이오칩 기술을 사용하여 대량의 생체정보를 생산하여 비교분석하는 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 도12와 같이 병리 조건과 건강한 상태의 시료에 특이적으로 결합하고 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산 풀 및 이 풀에 결합하는 둘 또는 그 이상의 분자로 이루어진 시료의 분자를 규명하여, 다양한 방법으로 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산과 이에 상응하는 표적분자를 분석한 결과를 바탕으로 비교하기를 원하는 두 가지 이상의 생리학의 상태를 분석할 수 있는 근거를 제공한다. 따라서 본 발명에 의하면, 새로운 치료 표적이나 진단 도구의 발견에 유용하게 사용될 가능성을 가진다.
본 발명은 분자결합핵산들을 확보하여 그 특징을 규명하고 이에 결합하는 분자를 규명하는 것인 바, 분자결합핵산에 결합하는 분자를 분리, 동정하는 방법은 도13와 같다. SSH, 균등화, 감산화, 균등화-감산화된 분자결합핵산들을 이용하여 특이적으로 결합하는 분자를 분리하고 이 복합체를 PADE-SDS 젤에서 전기영동을 하여 단백질 밴드를 확인한다. 확인된 단백질밴드를 절단하여 단백질을 추출한 후, MALTITOF-TOF로 단백질을 동정하는 단계를 통해, 본 발명에 따라 제조된 분자결합핵산에 특이적으로 결합하는 분자를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 분자결합핵산 제조방법은 생물공학, 의학, 생물학 그리고 생화학의 분야에 응용된다. 본 발명의 응용은 인간 건강 상태, 동물 및 식물 관리에 최종적인 목적이 있다. 본 발명은 바이오마커 개발, 치료 수단과 진단 목적의 분자를 식별하기 위해 다중의 생물학적인 생체시료(예, 분석시료와 비교시료) 각각에 결합하는 분자결합핵산 라이브러리를 비교분석하여 선택적인 분자결합핵산을 개발하고 이에 결합하는 분자를 이용하여 생물학적인 시료를 식별함으로써 가능하다.
본 발명은 시료의 다중화 분석을 위한 방법, 기구, 키트 및 시약을 제공하며, 여기에서 시료 내의 다중 분자는 동시에 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 궁극적으로, 이 방법 및 시약들은 표적 농도(예를 들어, 시료 내의 단백질 표적 농도)를 임의의 다양한 핵산 검출 및 정량 방법에 의해 검출되고 정량될 수 있는 핵산 농도로 전환시킬 수 있다. 상기 분자가 대응하는 핵산 농도로 효과적으로 전환되면, 그후 시그널을 증가시키기 위한 표준 핵산 증폭 및 검출 단계를 사용할 수 있다. 본 명세서는 시료의 다중분석을 위한 방법을 제공한다. 본 명세서에 따른 방법은 시험관 내(in vitro)에서 수행될 수 있다.
본 발명은 압타머를 포함하는 분자결합핵산과 차세대염기서열결정 기술을 사용하여 도14와 같이 시료를 구성하는 핵산과 단백질을 동일한 시료에서 동시에 분석하여 핵산 정보 및 단백질 정보를 생산하는 방법, 기구, 키트 및 시약을 제공하며 핵산정보는 mRNA, miRNA 등을 포함하는 RNA정보와 유전자의 구조적 변이, 메칠화, SNP 등을 포함하는 DNA정보를 포함한다．
진단 또는 검정 장치, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 그 장치의 고상 표면에 고정된 분자결합핵산을 가진 칼럼, 테스트 스트립 또는 바이오칩 또한 제공된다. 상기 장치의 표면에 점착 유지된 분자-분자결합핵산 복합체를 형성하는 고상 표면과 접촉하는 표적분자에 분자결합핵산이 결합되도록 위치할 수 있어서 표적을 포획하고 검출하도록 해 주며, 선별적으로 표적을 정량할 수 있다. (동일하거나 다를 수 있는) 일렬의 분자결합핵산은 상기한 장치에 제공될 수 있다.
이와 같이 본 발명으로 진단 키트, 바이오마커 발견 키트, 환경 테스트 키트, 생물학적 위험(biohazard) 또는 생물무기(bioweapons) 검출 키트를 제한 없이 포함하는 다양한 검출 적용을 위한 키트 및 생명과학(life science) 및 분석화학 적용에서 표적을 검출하기 위한 키트가 본원에 기재된 방법에 기초하여 제조될 수 있다.
표적에 대한 분자결합핵산의 결합이 표적분자 및 분자결합핵산의 연장된 상호작용의 존재, 부재, 함량 혹은 농도를 검출하고, 표적을 검출하는데 용이하도록 하는데 사용될 수 있는 진단 방법에 유용한 것이다. 유사한 이점이 분석적 분자결합핵산이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 조영 방법에 사용될 경우 제공될 수 있다. 분자결합핵산과 표적의 연장된 상호관계 또한 상기 연장된 상호관계가 예를 들어 표적분자 또는 하위 신호전달 단계반응(downstream signaling cascade)을 보다 길게 활성화 혹은 억제함으로써 개선된 치료 효과를 제공한다.
본 발명은 둘 또는 그 이상의 분자들로 이루어진 시료를 보다 효율적으로 분석할 수 있고 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분석적 분자결합핵산을 선정하는 방법, 추가적으로 상기 선정된 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 동정하는 방법 및 그들의 용도를 제공한다.
도1은 단일가닥핵산 라이브러리로부터 다중의 분자로 이루어진 시료를 구성하는 분자에 결합하는 단일가닥핵산 일차 라이브러리를 제조하고, SSH 공정, 균등화 공정, 감산화 공정 또는 균등화-감산화 공정을 수행하여 제조된 분자결합핵산 이차 라이브러리에서 제조된 시퀀싱 라이브러리에서 분석한 분자결합핵산 염기서열 및 출현빈도를 시료에서 분자의 프로파일을 생산하여 유용한 분자결합핵산을 선정하고 선정된 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 분리 및 동정하는 도면이고,
도2는 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 구조이고,
도3은 단일가닥핵산 라이브러리에서 RNA 단일가닥핵산 라이브러리 제조 방법이고
도4는 단일가닥핵산 라이브러리에서 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 라이브러리 제조방법이고,
도5는 단일가닥핵산 라이브러리에서 취득한 분자결합핵산 일차 라이브러리를 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 단계를 걸쳐 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도6은 테스터1을 제조하는 단계의 흐름도이고,
도7은 테스터2를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도8은 드라이버를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도9는 분자결합핵산 일차 라이브러리에서 SSH 라이브러리를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도10은, 분자결합핵산 일차 라이브러리에서 Duplex-Specific Nuclease(DSN) 로 균등화 및 감산화를 수행하여 라이브러리를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도 11은 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상의 라이브러리에서 선별된 분자결합핵산에 기초하여 바이오칩을 제작하고 제작된 바이오칩으로 시료를 분석한 결과로 분석적 분자결합핵산을 선정하며 선정된 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 분리하고 동정하는 단계의 흐름도이고,
도12은 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상의 라이브러리에서 선별된 분자결합핵산을 이용하여 제조된 바이오칩을 이용하여 생체시료 프로파일을 생산하여 데이터베이스를 구축하는 단계의 흐름도이고,
도13은 선정된 분자결합핵산 한쪽에 바이오틴(biotin)을 부착시키고 스트렙타비딘(streptavidin)과 반응시켜 얻은 복합체를 혈청시료와 반응시켜 혈청단백질-복합체를 분리한 다음 전기 영동하여 형성되는 밴드를 분리하여 표적분자를 동정하는 과정의 순서에 대한 흐름도이고,
도 14는 생체시료에서 단백질과 핵산을 동시에 검사하는 흐름도이고,
도 15는 인단 혈청단백질에고 풍부하게 존재하는 단백질을 제거한 후 전기영동하여 얻은 도면이고
도 16은 분자결합핵산 일차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 계산하여 분석구(N) 및 비교구(R)를 비교한 결과 도면이고
도 17은 분석시료인 심근경색환자 혈청와 비교시료인 불안정성 협심증환자 혈청에 대해 균등화-감산화 분자결합핵산 풀로 분석시료 및 비교시료의 균등화-감산화된 정도를 평가한 결과이고,
도 18은 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리에서 획득환 1,149개 분자결합핵산들로 분석시료인 심근경색환자 혈청과 비교시료인 불안정성 협심증 환자의 혈청을 분석하여 얻은 100개의 분자결합핵산의 분포 그래프이고,
도 19는 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리에서 획득환 1,149개 분자결합핵산들로 분석시료인 심근경색환자 혈청과 비교시료인 불안정성 협심증 환자의 혈청을 분석하여 얻은 100개의 분자결합핵산들 이용하여 시료를 클러스터링한 결과도이고
도 20의 a는 분석시료인 심근경색환자혈청과 비교시료인 불안정성 협심증환자 혈청을 바이오칩으로 결정된 생물학적 의미 분석에 기여하는 분석적 분자결합핵산(일련번호 290)로 전기영동 방법으로 분석한 결과이고, 도15의 b는 도15의 a에서 형성된 밴드의 밀도를 구하여 비교한 그래프이고,
도 21은 항암물질 처리 세포와 비처리 세포의 단백질에 결합하는 정도를 분석하여 선정된 분자결합핵산을 형광물질로 표지하여 항암물질 처리 세포와 비처리 세포를 관찰한 결과 도면이고,
도 22는 선정된 간암세포주 특이 분자결합핵산의 간암세포주(Hep3B)에 대한 특이적 결합을 확인한 결과이고,
도23은 Hep3B 분자결합핵산-siRNA cdk2 complex을 간암세포주에 다양한 방법으로 처리한 후 cdk2 mRNA를 분석한 결과이고
도 24는 선정된 1,149개 분자결합핵산을 인간혈청단백질에 반응시킨 후 결합한 분자결합핵산을 바이오칩으로 분석한 결과 도면.
도2는 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 구조이고,
도3은 단일가닥핵산 라이브러리에서 RNA 단일가닥핵산 라이브러리 제조 방법이고
도4는 단일가닥핵산 라이브러리에서 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 라이브러리 제조방법이고,
도5는 단일가닥핵산 라이브러리에서 취득한 분자결합핵산 일차 라이브러리를 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 단계를 걸쳐 SSH, 균등화, 감산화 또는 균등화-감산화 분자결합핵산 라이브러리를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도6은 테스터1을 제조하는 단계의 흐름도이고,
도7은 테스터2를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도8은 드라이버를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도9는 분자결합핵산 일차 라이브러리에서 SSH 라이브러리를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도10은, 분자결합핵산 일차 라이브러리에서 Duplex-Specific Nuclease(DSN) 로 균등화 및 감산화를 수행하여 라이브러리를 제조하는 단계의 흐름도이고,
도 11은 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상의 라이브러리에서 선별된 분자결합핵산에 기초하여 바이오칩을 제작하고 제작된 바이오칩으로 시료를 분석한 결과로 분석적 분자결합핵산을 선정하며 선정된 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 분리하고 동정하는 단계의 흐름도이고,
도12은 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상의 라이브러리에서 선별된 분자결합핵산을 이용하여 제조된 바이오칩을 이용하여 생체시료 프로파일을 생산하여 데이터베이스를 구축하는 단계의 흐름도이고,
도13은 선정된 분자결합핵산 한쪽에 바이오틴(biotin)을 부착시키고 스트렙타비딘(streptavidin)과 반응시켜 얻은 복합체를 혈청시료와 반응시켜 혈청단백질-복합체를 분리한 다음 전기 영동하여 형성되는 밴드를 분리하여 표적분자를 동정하는 과정의 순서에 대한 흐름도이고,
도 14는 생체시료에서 단백질과 핵산을 동시에 검사하는 흐름도이고,
도 15는 인단 혈청단백질에고 풍부하게 존재하는 단백질을 제거한 후 전기영동하여 얻은 도면이고
도 16은 분자결합핵산 일차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 계산하여 분석구(N) 및 비교구(R)를 비교한 결과 도면이고
도 17은 분석시료인 심근경색환자 혈청와 비교시료인 불안정성 협심증환자 혈청에 대해 균등화-감산화 분자결합핵산 풀로 분석시료 및 비교시료의 균등화-감산화된 정도를 평가한 결과이고,
도 18은 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리에서 획득환 1,149개 분자결합핵산들로 분석시료인 심근경색환자 혈청과 비교시료인 불안정성 협심증 환자의 혈청을 분석하여 얻은 100개의 분자결합핵산의 분포 그래프이고,
도 19는 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리에서 획득환 1,149개 분자결합핵산들로 분석시료인 심근경색환자 혈청과 비교시료인 불안정성 협심증 환자의 혈청을 분석하여 얻은 100개의 분자결합핵산들 이용하여 시료를 클러스터링한 결과도이고
도 20의 a는 분석시료인 심근경색환자혈청과 비교시료인 불안정성 협심증환자 혈청을 바이오칩으로 결정된 생물학적 의미 분석에 기여하는 분석적 분자결합핵산(일련번호 290)로 전기영동 방법으로 분석한 결과이고, 도15의 b는 도15의 a에서 형성된 밴드의 밀도를 구하여 비교한 그래프이고,
도 21은 항암물질 처리 세포와 비처리 세포의 단백질에 결합하는 정도를 분석하여 선정된 분자결합핵산을 형광물질로 표지하여 항암물질 처리 세포와 비처리 세포를 관찰한 결과 도면이고,
도 22는 선정된 간암세포주 특이 분자결합핵산의 간암세포주(Hep3B)에 대한 특이적 결합을 확인한 결과이고,
도23은 Hep3B 분자결합핵산-siRNA cdk2 complex을 간암세포주에 다양한 방법으로 처리한 후 cdk2 mRNA를 분석한 결과이고
도 24는 선정된 1,149개 분자결합핵산을 인간혈청단백질에 반응시킨 후 결합한 분자결합핵산을 바이오칩으로 분석한 결과 도면.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.
실시예
1.
단일가닥핵산
라이브러리의 올리고뉴클레오티드 및
프라이머
구조
다중의 분자로 이루어진 생체시료(분석시료 및 비교시료)와 반응시킬 단일가닥핵산 라이브러리 제조를 위한, 상기 <일반식 I>구조의 올리고뉴클레오티드(염기서열 1)들(무작위 단일가닥핵산들)를 제조를 하였다(한국, 바이오니아).
먼저 상기 <일반식 I>구조의 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오티드(염기서열 1)는 도2에 도시 된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드를 5'-5'보존영역-가변영역-3'보존영역-3'으로 구성하였다.
상기 <일반식 I>구조의 올리고뉴클레오티드 염기서열:
5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN40 CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3 (염기서열 I)
(여기에서 밑줄 친 염기배열은 단일가닥핵산 라이브러리의 고정된 부위이며, 가변영역인 40개 염기의 N40은 각 위치에 A, G, T, C 등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.)
상기 단일가닥핵산 라이브러리의 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 하여 PCR 방법로 이중가닥 DNA 라이브러리를 제조하며 이때 사용되는 프라이머는 아래 염기서열의 "DS 정방향 프라이머" 및 "DS 역방향 프라이머"이다.
상기 DS 정방향 프라이머(염기서열 2)는 <일반식 I> 구조인 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 <염기서열 I> 밑줄친 염기들의 5' 말단과 염기결합을 할 수 있고 밑줄친 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위해 프로모터 염기서열을 포함한다.
PCR에 이용되는 상기 DS 역방향 프라이(염기서열 3)는 <일반식 I> 구조인 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 밑줄친 염기들의 3' 말단과 염기결합을 할 수 있다.
DS 정방향 프라이머:
5'-GGGGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG- 3' (염기서열 2)
DS 역방향 프라이머:
5'-GGGGCATCGACCTCTGGGTTATG-3' (염기서열 3)
상기와 같이 제조된 <일반식 I>구조의 단일가닥핵산 라이브러리를 주형으로 상기 DS 정방향 프라이머 및 상기 DS 역방향프라이머로 PCR (Polymerase Chain Reaction) 공정을 통해 T7 프로모터가 있는 이중가닥 DNA(염기서열 4)는 아래와 같으며 하기 PCR 산물(염기서열 4)로 생체외 전사를 하여 제조된 단일가닥 RNA 라이브러리할 수 있다.
상기 프라이머로 PCR산물의 염기서열:
5'-GGGGGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN40 CATAACCCAGAGGTCGATCCCC-3' (염기서열 4)
상기 제조된 단일가닥 RNA 라이브러리 또는 상기 제조된 단일가닥 RNA 라이브러리가 시료를 구성하는 분자를 접촉하여 형성된 분자-분자결합핵산 복합체 풀에서 분리된 단일가닥 RNA 풀을 대상으로 역전사하여 cDNA를 제조하고 이를 주형으로 PCR하여 이중가닥 DNA 라이브러리를 제작할 수 있다.
상기 과정에서 역전사의 priming 역할을 하는 “RS 역방향 프라이머(염기서열 6)”및 역전사 산물 cDNA 대상으로 PCR에 이용되는 상기 “RS 정방향 프라이머(염기서열 5)” 및 “RS 역방향 프라이머”이며 이들의 염기서열은 아래와 같다.
RS 정방향 프라이머:
5'-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3' (염기서열 5)
RS 역방향 프라이머:
5'-TCGACCTCTGGGTTATG-3' (염기서열 6)
실시예
2.
단일가닥핵산
라이브러리 제조
본 실시례에서 생체시료(분석시료 및 비교시료)와 반응할 단일가닥핵산 라이브러리는 변형된 뉴클레오티드인 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 라이브러리인 바, 실시예1에서 제조된 ＜일반식 I>구조의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 단일가닥핵산 라이브러리리 및 프라이머들을 이용하여 PCR 및 생체외 전사 방법으로 제조하였다.
PCR은 1,000pmoles 단일가닥핵산 라이브러리, 2,500pmoles DS 프라이머 쌍(DS 정방향 프라이머, DS 역방향 프라이머)을 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH 8.3), 3mM MgCl2, 0.5mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)에서 PCR를 수행한 후, QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다. T7 프로모터가 있는 이중가닥핵산 DNA를 제조하였다．
상기 제조된 이중가닥 DNA를 이용하여 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 무작위 변형된 RNA 단일가닥핵산들은 Durascribe T7 Transcription Kit (EPICENTRE, USA)로 생체외 전사를 수행하여 합성하고 정제하여 제조하였다. 200pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40mM Tris-Cl (pH 8.0), 12mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5U T7 RNA Polymerase 그리고 1mM (ATP, GTP) 및 3mM (2'F-CTP, 2'F-UTP)를 37℃에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순수도를 분석하였다.
실시예
3.
정도관리
단일가닥핵산의
제조
기준물질은 http://genomics.msu.edu/plant_specific/에서 확보한 A, B, C, D 및 E 등 5개 종류 식물특이단백질로 구성되어 있다(표 1 참조).
| 종류 | Locus | 내 용 | Accession number |
| A | At1g65390.1 | defense/immunity protein | GO:0003793 |
| B | At5g39310.1 | cell elongation | GO:0009826 |
| C | At4g15910.1 | Drought-Induced Protein (Di21) | GO:0009414 |
| D | At1g12860.1 | Bhlh Protein | GO:0003677 |
| E | At4g02530.1 | Chloroplast Thylakoid Lumen Protein | GO:0009543 |
선정된 5개 식물특이단백질은 대장균 발현시스템을 사용하여 상응하는 단백질을 발현시킨 후, 발현된 단백질을 분리하여 표준 SELEX 방법(Ellington, A.D. and J.W. Szostak. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822; Gold, L., P.Allen, J. Binkley, D. Brown, D. Schneider, S.R. Eddy, C. Tuerk, L. Green, S. Macdougal, and D. Tasset. 1993. RNA: the shape of things to come, pp. 497-510. In: R.F. Gestelend and J.F. Atkins (eds.). The RNA World, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)으로 기준물질에 결합하는 단일가닥핵산을 확보하였다. 이를 정도관리용 단일가닥핵산이라고 명명하였으며 이들의 염기서열로 정도관리 단일가닥핵산에 상응하는 포착프로브를 디자인하였다.
실시예 4. 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조
4-1. 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조
분자결합핵산 일차 라이브러리 제조는 다중의 분자로 이루어진 생체시료인 혈청을 시료로 사용하였고, 심근경색 환자의 혈청을 분석시료, 불안정성 협심증 환자의 혈청을 비교시료로 하였다. 환자의 혈청을 MARC 칼럼(Agilent Technologies Inc. USA)을 이용하여 과량으로 존재하는 단백질을 제거한 혈청단백질을 제조사에서 제공하는 방법에 따라 제조하였다(도 1５).
본 발명의 Rervese-SELEX 공정에서 분자결합핵산 일차 라이브러리의 제조 과정은 상기에서 제조된 변형 RNA 단일가닥핵산 라이브러리를 다중의 분자로 구성된 시료에 반응시켜 각각의 분자와 변형 RNA 단일가닥핵산가 결합한 분자결합핵산 복합체 풀을 분리하고 복합체에서 해리된 변형 RNA 단일가닥핵산 풀을 RT-PCR(Reverse transcription－PCR)로 증폭하여 얻은 변형 RNA 단일가닥핵산 풀을 다시 상기 생체시료에 반응시키는 과정을 반복하는 방법으로 이루어진다.
상기에서 합성된 변형된 RNA 라이브러리의 1014 염기서열/1㎖의 농도 용액을 200 pmol/200㎕의 농도로 Rervese-SELEX 반응용액(40mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-20) 에서 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 제조하였다.
혈청단백질을 Nitrocellulose membrane (NC 막) 조각(0.3x0.3 mm2)에 고정시키기 전에, 반응시 사용할 반응용액에 100mM DTT 60㎕ 첨가와 비특이반응 차단완충용액에 100mM DTT, 10% BSA 300㎕를 첨가하였다.
결합 반응 튜브에 결합 완충 용액 50㎕와 제조된 혈청단백질 500㎍를 혼합해서 제조하였다. 태핑 후 quick-spin하여 NC 막이 완전히 결합 완충 용액에 잠기도록 해주었다. 100rpm에서 30분간 교반기를 이용하여 혼합하였다.
NC 막을 상온에서 10분 건조시켜 새로운 1.5㎖ 튜브에 넣었다. 비특이반응 차단완충용액 200㎕ 첨가하고 100rpm에서 30분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 400㎕의 세척완충용액을 첨가하고 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 400㎕의 세척완충용액 첨가하고 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다.
제조된 변형 RNA 단일가닥핵산 풀(100ng/㎕) 5㎕ 와 결합완충용액 195㎕를 첨가하여 200 rpm에서 30분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC membrane을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 세척완충용액 400㎕를 첨가하여 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC membrane을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 세척완충용액 400㎕를 첨가하여 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후, NC막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다.
NC막을 Whatman filter paper 위에 놓고 상온에서 10분간 건조하였다. 건조된 NC membrane을 새로운 1.5㎖ 튜브에 넣고, DEPC 멸균 정제수 40㎕를 첨가하였다. 95℃ heat block에서 10분간 두어 RNA를 용리한다. 탭핑하여 막에 붙은 RNA를 용리하고 quick-spin한 후, 얼음에 둔다. PCR 튜브에 36℃를 옮기고 다음 과정인 역전사반응에 이용하였다. 적절한 선택과 증폭을 수행하고 시료를 구성하는 분자-분자결합핵산 복합체 풀을 분리하였다.
또는 인간혈청시료(분자)와 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 준비는, 일차적으로 인간혈청시료에 결합력을 보이는 분자결합핵산을 대상으로 하며, 반응 후 다양한 세척버퍼로 세척 과정을 반복하여 일회만의 선택과정으로 인간혈청단백질(분자)-단일가닥핵산(분자결합핵산)복합체 라이브러리를 확보하였다.
상기 확보한 인간혈청단백질(분자)-단일가닥핵산(분자결합핵산) 복합체 라이브러리는 시퀀스 라이브러리 제작 목적 핵산시료이다.
4-2. 개선된 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조
본 발명의 Rervese-SELEX 공정에서 분자결합핵산 일차 라이브러리 분리 공정 도중 단일가닥핵산 재결합을 위한 경쟁자로서 덱스트란 설페이트 10 mM를 첨가하면서 수행하였다.
상기 분자결합핵산 일차 라이브러리 분리 공정은 3가지 다른 방식으로 수행하였다. 2번째 및 3번째 라운드에서, 시료는 Rervese-SELEX 반응용액 950 ㎕(37℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하고, 복합체를 포획하기에 앞서 30분간 37 ℃로 배양하였다. 4번째 및 5번째 라운드에서, 시료는 Rervese-SELEX 반응용액 950 ㎕(37℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하고, 30분간 37 ℃로 반응하였다. 6번째 및 7번째 라운드에서, 시료는 Rervese-SELEX 완충액 950 ㎕ (37℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하였다.
각 희석 시료 50 ㎕를 Rervese-SELEX 반응용액 950 ㎕+ 10 mM 5000K 덱스트란 설페이트 (37℃로 예열)에 이동시켜 재희석하고 전체 400 배 희석물을 얻은 다음 37 ℃에서 60분간 반응하였다. 8번째 및 9번째 라운드에서, 시료를 Rervese-SELEX 완충액 950 ㎕(37 ℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하고, 각 시료 50 ㎕ 를 Rervese-SELEX 완충액 950 ㎕(37℃로 예열)에 이동시켜 재희석하고 400 배 희석물을 수득하였다. 최종적으로 각 400 배 희석된 시료 50 ㎕를 950 ㎕ Rervese-SELEX 완충액 + 10 mM 5000K 덱스트란 설페이트 (37℃로 예열)에 이동시켜 재희석하고 전체 8000배 희석물을 수득하고 37 ℃에서 60분간 반응하였다. 복합체를 상기 실시예 2에 기술된 것과 동일한 방식으로 포획하고 세척하였다.
분자결합핵산 복합체들의 세척버퍼는 0 내지 1x Rervese-SELEX 완충액, 0 내지 5% Tween-20 또는 0 내지 500mM EDTA 용액을 사용하였다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조할 수도 있다.
생물학적인 생체시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리는 생체시료에 포함된 분자의 다양성을 있는 그대로 반영하여야 하는 것이 이상적임으로, 한정된 선택과 증폭만을 수행하는 대신 세척단계를 다양화하여 생물학적인 시료의 다양성을 잘 반영하는 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조하였다. 상기 분석시료 및 비교시료에서 제조된 라이브러리를 전자는 분석시료_분자-분자결합핵산 및 후자는 비교시료_분자-분자결합핵산 일차 라이브러리라 지칭하였다.
상기 세척한 복합체에 있는 RNA를 대상으로 역방향 프라이머로 priming하여 역전사（RT)하여 cDNA를 제조하고 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하여 혈청단백질에 결합하는 RNA 단일가닥핵산에 대한 DNA 풀을 증폭 제작하였다. 상기 확보한 PCR 산물은 시퀀스 라이브러리 제작 목적 핵산시료이다.
실시예 5. SSH 분자결합핵산 라이브러리 제조
SSH 분자결합핵산 라이브러리는 도 9와 같이 실시하였다. 실시예3에서 제조된 분석시료 및 비교시료_분자-분자결합핵산 일차 라이브러리를 주형으로 RT-PCR를 수행하여 DNA 풀을 제조하였다. 상기 RT-PCR은 표준방법에 따라 수행하였는데, 먼저 역전사(Reverse transcription)는 PCR 튜브에 반응액 36㎕를 옮겨주고, 5x 역전사완충용액을 10㎕, RS 역방향 프라이머 (25pmol/㎕) 용액 1㎕를 첨가하여 혼합하였다. 상기의 혼합액을 PCR 기계를 이용하여 65℃ 에서 5분 반응후, 25℃ 로 10분간 반응시켰다. 상기의 반응이 끝난 후, DEPC 멸균 정제수 1.5㎕, 20mM dNTP 1㎕, AMV RTase (10u/㎕ BEAMS, Cat. No.3001L) 0.5㎕를 포함한 혼합액을 제조하였다. 제조한 혼합액을 반응이 끝난 PCR 튜브에 3㎕ 첨가하여 최종 부피가 50㎕가 되게 하였다. 상기의 PCR 튜브는 PCR 기계를 이용하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 95℃에서 5분간 반응하였다.
이어서 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 생성물 cDNA를 증폭하는 PCR 증폭 반응은 먼저 RT 반응물 50㎕에 10x PCR 완충용액 10㎕, 20mM dNTP 1㎕, DS 정방향 프라이머 (25pmol/㎕) 1㎕ , DS 역방향 프라이머 (25pmol/㎕) 1㎕, Taq ploymerase (5u/㎕) 0.5㎕, 3차 멸균 정제수 36.5㎕를 첨가하여 최종 부피가 100㎕가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 95℃에서 5분간 예비 변성, 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 신장의 과정을 25 회 반복, 72℃ 에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행한다.
PCR 생성물을 1.5㎖ 튜브로 옮기고 100㎕ D.W.를 첨가하여 부피를 200㎕로 증가시키고 동부피의 phenol:chloroform:isoamylalcohol 200㎕첨가하였다. Vortex로 혼합한 후, 13,000rpm에서 1분간 원심분리하고 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮겼다. 2배 부피의 100% 에탄올과 0.1배 부피의 3M Sodium Acetate(pH 5.2)를 첨가하여 혼합한 후, -20℃ 에 최소 60분간 또는 80℃에 최소 10분간 보관하였다. 보관한 튜브를 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 70% 에탄올을 500㎕를 첨가해 준 후, 4℃, 13,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거했다.
상기 e-튜브를 건조 시킨 후, 3차 멸균 정제수 30㎕를 첨가하여 용해시켜 주었다. 2.5% agarose gel에 5㎕를 loading하고 50bp ladder DNA marker 3ul를 로딩한 100bp 밴드를 기준으로 Alphaimager program으로 정량하였다.
상기의 실시로 준비된 분석시료-분자결합핵산 일차 라이브러리을 주형으로 PCR한 산물을 "예비테스터"로 하여 상기 예비테스터로부터 SSH에 사용할 "테스터"를 그리고 비교시료-분자결합핵산 일차 라이브러리을 주형으로 PCR한 산물을 "드라이버"를 명명하였다.
테스터1 및 테스터2는, 표준방법으로 PCR를 수행하여 제조하였으며, 이때 테스터1의 경우 새로이 디자인한 아댑터1 염기서열 및 RS 역방향 프라이머 염기서열로 구성된 아래의 프라이머 "SSH 정방향 프라이머_테스터1"와 테스터2는 상기 "RS 정방향 프라이머"와 아댑터1 염기서열 구성된 아래의 프라이머 "SSH 역방향 프라이머_테스터2"를 사용하였다.
SSH 정방향 프라이머_테스터1:
5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCGGAAGCGTGCTGCC-3' (염기서열 7)
SSH 역방향 프라이머_테스터2:
5'-CAGCGTGGTCGCGGCCGAGGTTCGACCTCTGGGTTATG-3'(염기서열 8)
1.5㎕인 20ng 테스터1, 1.5㎕인 600ng 드라이버 PCR 산물, 1.0㎕ 4x 혼성화용액(200m MHEPES pH 7.5, 2M NaCl, 0.8m MEDTA)을 혼합하여 반응부피 4.0㎕ 로 60℃에서 1차 혼성화를 12시간정도 수행하였고 1.5㎕인 20ng 테스터 2, 1.5㎕인 600ng 드라이버 PCR 산물, 1.0㎕ 4x 혼성화용액을 혼합하여 반응부피 4.0㎕로 95℃ 에서 5분간처리한 후, 60℃에서 1차 혼성화를 12시간정도 수행하였다. 전자는 "테스터1 혼성용액", 후자는 "테스터2 혼성용액"이다.
드라이버 용액은 1.0㎕인 120㎍ 드라이버, 1.0㎕ 4x 혼성화용액, 2 ㎕ 물을 혼합한 후, 소량의 mineral oil를 위에 첨가하여 PCR 기계를 이용하여 98℃에 90초간 처리하여 제조하였다.
테스터2 혼성용액을 드라이버 혼성용액에 조심스럽게 넣어 혼합하고 이 혼성용액(테스터2 혼성용액와 드라이버 혼성용액의 혼합 혼성용액)을 다시 테스터1 혼성용액에 넣어 피펫으로 잘 혼합한 후, 60℃에서 12시간동안 2차 혼성화를 실시하였다. 2차 혼성화반응이 종결된 용액에 Taq polymerase를 첨가하여 75℃에서 5분간 신장(extension) 반응을 수행하여 2차 혼성화 산물의 이중가닥 핵산의 5' 끝과 3' 끝의 cohensive end에 염기를 추가하여 blunt end로 전환시켰다.
신장반응이 종결된 용액에 대해 아래와 같이 디자인된 "아댑터 1 프라이머" 와 "아댑터 2 프라이머"를 사용하여 PCR를 수행하였다.
아댑터 1 프라이머:
5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' (염기서열 9)
아댑터 2 프라이머:
5'-CAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' (염기서열 10)
상기 PCR 산물에 대해 상기 "RS 정방향 프라이머"와 상기 "RS 역방향 프라이머"로 표준방법으로 Nested PCR를 수행하였다. 상기 확보한 PCR 산물은 시퀀스 라이브러리 제작 목적 핵산시료이다.
실시예 6. Duplex-Specific Nuclease(DSN) 을 이용한 균등화
도10과 같이 다중의 분자로 이루어진 생체시료에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 균등화를 위해, 생체시료에 결합하는 RNA인 분자결합핵산을 주형으로 RS 역방향 프라이머로 역전사하고 RS 프라이머 쌍으로 이중가닥 DNA를 제조하였다. 제조된 이중가닥 DNA를 ~100ng/㎕ 농도 제조하여 1.5㎕씩 나누어 PCR 튜브에 넣은 후, 추가적으로 1㎕의 4x 혼성화용액 및 1.5㎕의 증류수를 넣고 미네랄 오일(mineral oil)을 오버레이 하였다. 98℃에서 3분간 가열한 후 60℃씩에서 4시간 동안 혼성화하였다. 혼성화를 종결한 후, 60℃ 예열된 5㎕의 2x DSN 버퍼(100mM Tris HCl pH 8.0, 10mM MgCl2, 2mM dithiothreitol)를 혼합 반응물에 첨가하였다. 이어서 0.25 Kunitz units의 DSN 효소(Wako 사, 일본)를 첨가하여 반응시켰다. 20분간 반응시킨 후, 10 ㎕의 5mM EDTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이와 같이 균등화가 이루어진 분자결합핵산 일차 라이브러리를 PCR 방법으로 증폭하였다. 확보된 PCR 산물인 DNA를 대상으로 시쿼싱 라이브러리를 제작하여 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 결정한다.
실시예 7. Duplex-Specific Nuclease(DSN)을 이용한 감산화
도 10과 같이 균등화된 테스터와 균등화된 드라이버를 이용하여 감산화를 수행하였다. 실시예5에서 제조된 균등화된 cDNA를 주형으로 증폭하는 PCR 증폭반응은 먼저 RT 반응물 50㎕에 10x PCR 완충용액 10㎕, 20mM dNTP 1㎕, SSH 정방향 프라이머 _테스터1 (25pmol/㎕) 1㎕, SSH 역방향 프라이머_테스터2 (25pmol/ul) 1㎕, Taq ploymerase (5u/㎕) 0.5㎕, 3차 멸균 정제수 36.5㎕를 첨가하여 최종 부피가 100㎕가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 95℃ 에서 5 분간 예비변성, 95℃ 에서 30 초간 변성, 55℃ 에서 30초간 결합, 72℃ 에서 30초간 신장의 과정을 25 회 반복, 72℃ 에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행한다. 먼저 균등화된 테스터를 주형으로 One-way PCR를 수행하여 단일가닥 테스터를 제조하였다. One way PCR 증폭 반응은 먼저 테스터 용액 50㎕에 10x PCR 완충용액 10㎕, 20mM dNTP 1㎕ , SSH 정방향 프라이머_테스터1 (25pmol/㎕) 1㎕, SSH 역방향 프라이머_테스터2 (0.25pmol/㎕) 1㎕, Taq ploymerase (5u/㎕) 0.5㎕, 3차 멸균 정제수 36.5㎕를 첨가하여 최종 부피가 100㎕가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 95℃에서 5분간 예비 변성, 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 신장의 과정을 25회 반복, 72℃에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행한다.
이중가닥 드라이버의 제조는 비교시료-RNA인 분자결합핵산 일차 라이브러리의 분자결합핵산을 주형으로 DS 역방향 프라이머로 역전사하고 DS 프라이머로 PCR하여 제조하였다.
1㎕의 단일가닥 테스터(1ng), 2㎕의 제조된 과량의 이중가닥 드라이버(200ng), 및 1㎕의 4x 혼성화용액을 E-튜브에 첨가한 후, 98℃에서 2분간 가열한 후, 60℃에서 12시간 동안 용액혼성화를 수행하였다. 혼성화가 종결된 후, 5㎕의 60℃에서 예열된 2x DSN 버퍼를 E-튜브에 첨가하여 60℃에서 10분간 처리하였다. 이 반응용액에 1㎕의 DSN을 처리하여 60℃에서 30분간 반응시켜 이중가닥 DNA를 제거하였다. 반응을 종결시킨 후, 페놀 추출을 하고 에탄올 침전을 수행한 후 증류수에 녹였다. 감산화된 단일가닥 테스터의 증폭은 SSH 정방향 프라이머_테스터 1(25pmol/㎕) 1㎕, SSH 정방향 프라이머_테스터2 (25pmol/㎕) 1㎕로 표준방법 PCR로 수행하였다. 이어서 1㎕의 Exonuclease I을 처리하여 30분간 반응시켜 남아있는 단일가닥핵산을 제거하였다. 상기 확보한 PCR 산물은 시퀀스 라이브러리 제작 목적 핵산시료이다.
실시례 8. 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도 결정
상서 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리 또는 균등화, 감산화, 균등화－감산화 및 SSH 공정으로 제조된 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산들을 NGS로 염기서열 및 출현빈도를 결정하였다. 상기 실시례에서 확보한 변형 RNA인 분자결합핵산을 대상으로 역전사 및 PCR를 수행하여 얻은 DNA 풀을 대상으로 HiSeq 2000 (Illumina 사)를 사용하여 분석하였다. 준비된 DNA 풀을 TruSeq DNA sample preparation kit v. 2 (Illumina 사)로 136 ng DNA에 end repair, 아데노신의 추가, 어댑터 부가 및 PCR을 한다. 아데노신 염기 추가를 제외하고 각 단계마다 TruSeq 키트에 포함된 Agencourt AMPure XP beads (Beckman-Coulter)로 세척하였다. Illumina 사에 의해 공급되는 레시피와 PCR 프라이머를 사용하여 15 cycles의 PCR을 하였다.
상기 PCR 산물은 Qubit fluorometer(Invitrogen 사)로 정량하였다. HiSeq 2000의 cBOT cluster station에 한 시료 당 3 ng PCR 산물을 5 pM의 농도로 flowcell에서 혼성화시켰다. cBOT에서 다리 증폭(bridge amplification)로 단일 DNA 분자당 28 번 증폭하여 클러스터를 형성하였다. 각 클러스터는 선형화시킨 후 시퀀싱 프라이머와 혼성화시켰다. 본 flowcell를 HiSeq 2000에 로딩하였다. 본 flowcel은 73 single read bases과 더불어 7 multiplexed bases를 염기서열 분석할 수 있는 HiSeq 2000의 Single Read 80 Base Pair Recipe로 실행하였다. Illumina Real Time Analysis (RTA에 의해 이미지의 생성 및 분석을 실시하여 실시간으로 base-call files,과 품질 점수를 확인하였다.
순방향 및 역방향 가닥이 시퀸스이 종료된 후, Illumina 사 Casava 소프트웨어 품질 분석을 하였으며 추가적으로 내부적으로 개발 된 소프트웨어를 사용하여 다운 스트림 분석을 수행 하였다.
품질분석의 Matching 단계는 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오타이드의 <일반식 I> 구조에서 5‘보존영역(17 bp), 가변영역(40 bp) 및 3’보존영역(17 bp)를 포함하는 서열의 74 염기 쌍 (bp)의 패턴을 기준으로 비교하였다; Filtering 단계는 상기 패턴과 일치하지 않는 임의의 서열을 제외하였다. 패턴 매칭 동안 각 보존영역에서 하나의 불일치는 허용하였다. 보존영역 서열은 다운 스트림 분석을 위해 40 bp의 가변영역 서열만 남기고, 필터링 후에 제외하였다. 역방향 보충 태그는 순방향 서열 태그와 결합하였다. 분자결합핵산 카운트 라운드는 본 단계에서 수행하고 round enrichment analysis를 수행하였다. 품질분석 및 카운트 라운드 결과로 상기 라이브러리를 구성하는 특정한 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 결정하였다.
선정되는 분자결합핵산 일차 라라이브러리에 대한 DNA 분자결합핵산 풀 당 15,000,000 ~ 18,000,000 시퀀스를 분석하였다. 마지막으로, 분석시료에서 준비된 분자결합핵산 일차 라이브러리와 비교시료에서 준비된 분자결합핵산 일차 라이브러리를 구성하는 5395개의 분자결합핵산의 염기서열과 출현빈도의 비율을 비교하였다(도 16).
감산화, 균질화, 균질화-감산화 및 SSH 공정으로 제작된 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산 염기서열 분석은 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리에서 결정된 분자결합핵산 염기서열로 구축된 참조 염기서열(reference sequences)과 시퀀스를 EBI 웹 사이트 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)에 있는 볼 수 Omega Cluster로 클러스터링 분석하였다.
이상의 결과로 분석시료 및 비교시료를 비교 분석하거나 각각을 대표할 수 있는 분자결합핵산은 총 1,149개를 결정하였다.
실시예 9. 균등화 및 감산화의 평가
상기 분자결합핵산 일차 라이브러리의 균등화 및 감산화된 정도의 평가는 혈청을 NC막에 처리하여 고정시킨 후, 균등화 및 감산화된 분자결합핵산 라이브러리를 처리하여 반응시킨 후, 혈청단백질에 결합한 분자결합핵산을 상기의 NC막으로부터 분리하여 이를 주형으로 RT-PCR를 수행하고 전기영동하여 그 결과를 확인하는 방법으로 수행하였다.
본 실시례에서는 분석시료로 심근경색 환자의 혈청을 사용하고 비교 시료로 불안정성 협심증 환자의 혈청을 사용하여 균등화-감산화를 실시하여 얻은 분자결합핵산 라이브러리를 평가한 결과는 도 17과 같다. 분석시료와는 강한 밴드가 형성이 되고 비교시료에는 약한 밴드가 형성이 되어 비교시료에 의해 분석시료가 균등화-감산화 되었음을 확인할 수 있다.
실시례 10. 분자결합핵산의 생물학적 의미 결정
특정 인간혈청 분석시료를 구성하는 분자에 결합하는 분자결합핵산 라이브러리를 상기 NGS를 이용한 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도 분석 결과로 특정 분자결합핵산 라이브러리에서 특정 분자결합핵산의 출현빈도와 혈청시료를 구성하는 특정 분자의 수와 상관관계가 있음을 알 수 있다. 본 발명의 특정 혈청시료를 구성하는 분자에 결합하는 분자결합핵산 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 출현빈도를 반영하는 프로파일은 다중의 분자로 구성된 특정 혈청시료의 분자 프로파일(양적인 상태를 종합화한 정보)이다.
상기 분자 프로파일을 구성하는 분자결합핵산의 정보를 다변량 분석을 하여 분석시료 및 비교시료의 성질을 잘 대변할 수 있는 분자결합핵산을 통계학적으로 선정한 후, 선정된 분자결합핵산들의 패턴을 계층 클러스터링(Hierarchical Clustering) 및 인공신경망(Artificial Neural Network) 등의 방법으로 생물학적 분석에 기여하는 정도를 분석에 사용할 수 있다. 이런 과정을 통해 확보하고 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산을 선정하였다.
심근경색 환자의 혈청(10례) 분석시료(S)와, 불안정협심증 환자의 혈청(21례) 비교시료(C)로 분석하였다(표 2). 상기에서 결정된 1149개의 분자결합핵산과 표준물질에 상응하는 분자결합핵산 풀을 시료와 반응시킨 후 형성된 분자-분자결합핵산 복합체 풀을 NGS로 분자결합핵산의 출현빈도를 분석하였다. 1149개의 분자결합핵산 출현빈도로 심금경색 환자와 불안정협심증 환자를 통계적인 방법으로 구분할 수 있는 분자결합핵산의 분포는 도18과 같다. 선정된 분자결합핵산의 출현빈도로 계층 클러스터링한 결과는 도19와 같으며, 도시된 바와 같이 심근경색과 불안정협심증 환자들은 각각 독립된 클러스터를 형성하고 있음을 알 수 있어 인간혈청분자에 결합하는 분자결합핵산 출현빈도로 환자들의 구분할 수 있음을 보여주고 있다.
| 심근경색 | 불안정협증증 | |
| 성별 | ||
| 남성 | 10 | 21 |
| 여성 | 0 | 1 |
| 나이 | ||
| 40-49 | 1 | 0 |
| 50-59 | 5 | 9 |
| 60-69 | 4 | 11 |
| 70-79 | 0 | 1 |
| 합계 | 10 | 21 |
생체시료를 구성하는 다중의 분자와 결합하는 분자결합핵산을 기초하고 NGS를 이용한 방법으로 특정한 생체시료에서 분자의 프로파일을 탐색 및 분석하여 분석시료인 심근경색 환자 혈청단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분석적 분자결합핵산들을 선정할 수 있다. 이 중에 일련번호768 분자결합핵산의 분석시료인 심근경색 환자의 혈청과 비교시료인 불안정협심증 환자의 혈청에 대한 결합정도를 평가한 결과, 심근경색환자의 혈청에만 특이적으로 반응함을 알 수 있었다(도 20).
실시예
11. 분자결합핵산에 결합하는 단백질 분리 및 동정
질환군별로 구성된 데이터베이스를 비교분석하여 유용한 스폿을 결정하고 이에 상응하는 생물학적 의미의 분석에 기여하는 분자결합핵산을 조제하여 상응하는 단백질을 도 13과 같이 분리하여 동정하였다. 선정된 분자결합핵산 한쪽에 바이오틴(biotin)을 부착시키고 스트렙타비딘(streptavidin)과 반응시켜 얻은 복합체를 혈청시료와 반응시켜 혈청단백질-분자결합핵산 복합체를 분리한 다음 전기 영동하여 형성되는 밴드를 분리하여 혈청단백질을 동정하였다. 선정된 단일가닥핵산에 결합하는 단백질을 분리하여 MALDI-TOF-TOF 기기로 단백질의 아미노산서열을 결정할 수 있으며 분자결합핵산과 결합하는 혈청단백질의 해리상수(Kd)가 20x10-9 미만인 것을 "표적분자"라고 하였다.
실시예
12. 항암제 반응 단백질에 대한 분자결합핵산 선정
약물 반응성 모니터링을 할 수 있는 분자결합핵산 및 단백질을 조사하기 위해서 항암물질 독소루비신(doxorubin)을 처리한 세포와 비처리 세포의 총단백질로 생체시료를 준비하였다. 대상 암세포주는 간암세포주 Hep3B 시료이며 최종농도 5ug/mL가 되도록 독소루비신을 간암세포주 배양액에 처리하였고 처리후 4시간에 독소루비신이 세포속으로 흡수되는 것을 확인하였다.
독소루비린 처리후 6시간 배양한 세포(분석시료) 및 비처리구 세포(비교시료)를 수확하여 총단백질 분리하였다. 실시예 2에서 제조된 단일가닥핵산 라이브러리를 각 세포주에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조하였다. 상기 제조된 라이브러리를 SSH을 하여 제조된 분석시료 간암세포주 SSH 분자결합핵산 라이브러리를 확보한 후, NGS기법으로 선별된 분자결합핵산을 선정하였다.
상기 선별된 분자결합핵산 풀과 암세포주 Hep3B 분석시료와 비교시료를 반응시켜 분석시료 결합 분자결합핵산 풀 및 비교시료 결합 분자결합핵산 풀을 제조하여 NGS 기법으로 단백질 프로파일을 생산하였다.
상기 분석시료 및 비교시료를 대상으로 생산되고 축적된 단백질 프로파일들을 ANOVA 검증을 하여 분석시료에 특이적으로 결합하는 분자결합핵산들을 선정하여 세포수준에서 결합능을 관찰하였다. 상기 선정된 분자결합핵산을 Rhodamine 염색시약으로 표지하여 처리구 세포와 비처리구 세포를 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과 도 21와 같이 처리구 세포에 특이적으로 분자결합핵산이 결합하는 것을 확인하였다.
실시예
13.
간암세포주
특이 분자결합핵산 선정 및 그 용도
실시예 2에서 제조된 단일가닥핵산 라이브러리를 간암세포주 Hep3B 및 GIBCO Hepatocyte 시료에 처리하여 각 세포주에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조하였다. 상기 제조된 라이브러리를 SSH을 하여 제조된 간암세포주 SSH 분자결합핵산 라이브러리를 확보한 후, NGS기법으로 선별된 분자결합핵산을 선정하였다.
상기 선별된 분자결합핵산 풀과 암세포주 Hep3B 분석시료 및 GIBCO Hepatocyte 비교시료를 반응시켜 간암세포주 Hep3B 결합 분자결합핵산 풀 및 GIBCO Hepatocyte 결합 분자결합핵산 풀을 제조하여 NGS 기법으로 세포표면 프로파일을 생산하였다.
암세포주 Hep3B 분석시료 및 GIBCO Hepatocyte 비교시료를 대상으로 생산되고 축적된 세포표면 프로파일들을 ANOVA 검증을 하여 간암세포주 Hep3B에 특이적으로 결합하는 분자결합핵산들을 선정하여 세포수준에서 결합능을 관찰하였다. 선정된 분자결합핵산들과 간암세포주 Hep3B 및 GIBCO Hepatocytes의 결합능을 특정 분자결합핵산을 상기 세포들에 결합시킨 후, 결합된 분자결합핵산들을 증폭하여 전기영동하여 확인한 결과 간암 세포주와 특이적으로 결합하는 핵산임을 확인하였다.
상기 선정된 분자결합핵산을 Rhodamine 염색시약으로 표지하여 간암 세포주 Hep3B 및 GIBCO Hepatocyte를 염색하여 광학현미경으로 관찰한 결과 도 22와 같이 간암세포주 Hep3B에 특이적으로 결합하고 GIBCO Hepatocytes에는 거의 결합 하지 못 함을 확인할 수 있었다.
암세포에서 많이 발현하여 종양유전자로 알려진 cdk2 유전자의 기능을 저해하는 cdk2 siRNA를 제작하였다. 간암세포주 특이 분자결합핵산에 결합시켜 간암세포주에 특이적으로 작용하는 복합체를 개발하여 그 기능을 확인하였다.
Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex를 제작하여 transfection 방법 혹은 direct treatment로 100nM complex, 250nM complex, 및 100 nM cdk 2 siRNA를 간암세포주 Hep3B에 처리하고 3일간 반응하였다.
각각에서 총 RNA를 분리하여 cdk2 mRNA를 정량분석한 결과는 도 2３과 같으며, Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex를 제작하여 100nM(첫 레인) 및 250nM complex(두번째 레인)를,100 nM cdk 2 siRNA(세번째 레인)를 처리하였고, 무처리(네번째 레인)한 후, 3일간 반응한 후 총 RNA를 분리하여 cdk2 mRNA를 정량분석한 결과이다. 즉, Transfection한 경우는 무처리구에 비해 Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex 및 cdk 2 siRNA 모두에서 cdk2 mRNA의 양이 감소하였다.그러나 direct treatment한 경우는 무처리구 및 siRNA 처리구와 비교하여 상대적으로 Hep3B 분자결합핵산cdk 2 siRNA complex 처리구에서 cdk2 mRNA의 양이 감소됨을 확인할 수 있다. 이 결과로 Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex의 경우 complex에 있는 분석적 분자결합핵산이 간암세포주 Hep3B에 있는 단백질에 결합하여 세포 속으로 이동하여 siRNA로 작용하여 cdk2 mRNA의 양을 감소시켰음을 알 수 있다.
실시예
14. 바이오칩의 제조 및 분석
유리 슬라이드 표면에 고착시킬 포착프로브로서, 상기에서 선정된 염기서열을 가지는 1,149여개의 분자결합핵산에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들(올리고뉴클레오티드들)을 유기 합성하여(바이오니아사) 준비하였다.
GAPS(Gamma Amino Propyl Silane)이 코팅된 유리 슬라이드인 UltraGAPSTM Coated Slide(Corning 사)를 사용하여 포착프로브이 일정 규칙으로 고착된 바이오칩을 제조하였다. 바이오칩의 제조는 핀(pin) 방식인 마이크로어레이어 시스템(Microarrayer system, GenPak사)을 사용하였고, 스폿 간격(spot spacing)은 스폿 중심 사이(center-to-center)가 370㎛가 되도록 하였다. 각각의 포착프로브들을 표준용액에 녹여 농도를 조절하였다. 이때 어레이어 안의 습도는 70%로 유지하여 스폿팅(spotting)을 수행하였다. 스폿팅된 슬라이드들은 습도유지챔머(humidified chamber)에서 24 ~ 48 시간 방치한 후, UV crosslinker에서 굽는(baking)과정을 수행하였다. 널리 알려진 방법으로 포착프로브들을 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 슬라이드를 바로 원심분리하여 건조시킨 다음, 빛이 차단된 상태로 보관을 하였다.
상기 실시례 9에서 수확한 심근경색 환자의 혈청단백질(분자)-분자결합핵산 복합체가 붙은 디스크를 RT-PCR 용액에 처리하여 Cy-5로 표지된 DS 정방향 프라이머(5'-Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3')와 DS 역방향 프라이머로 RT-PCR을 수행하면서 표지하였다. 또한, 불안전성 협심증 환자의 혈청단백질(분자)-SNBABB 복합체가 붙은 디스크를 RT-PCR 용액을 처리하여 Cy-3가 표지된 DS 정방향 프라이머(5'-Cy3-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3')와 DS 역방향 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 표지하였다. 상기 두 용액을 동량으로 혼합하여 타깃프로브를 제조하였다.
상기 타깃프로브들을 본 발명의 바이오칩에 처리하여 60℃에서 4 ~12시간 혼성화하고 42℃에서 0.1x SSC 용액으로 세척하였다. 이때 혼성화 용액은 1M 염화나트륨, 0.3M sodium citrate, 0.5% SDS 또는 100㎍/㎖ 살몬스펌 DNA, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산을 포함한다. 전혼성화가 끝난 유리 슬라이드에 혼성화 용액을 처리하여 42℃에서 12시간동안 혼성화(Hybridization)를 수행한 후, 바이오칩을 세척용액으로 세척하였다. 이때, 세척용액의 조성은 예로 들면, 1X SSC + 0.2% SDS, 1X SSC + 0.2%SDS, 0.5X SSC + 0.2% SDS, 0.01X SSC + 0.2% SDS 순의 단계이며 각각 단계마다 42℃에서 30분간 수행하였다.
상기 실시예 10의 세척이 종료된 후, 유리 슬라이드를 원심분리로 건조한 후, 사용한 형광염료를 여기(excitation)하기 위해 적절한 파장의 레이저(Cy5, 635nm; Cy3, 548nm)를 갖는 레이저 스캐너(laser scanner, GenePix4000, Axon사)를 이용하여 탐색하였다. 형광이는 다중-이-태그된 이 파일(multiimagetagged image file, TIFF) 포맷으로 저장한 후, 적절한 화상분석(image analysis) 소프트웨어(GenePix Pro3.0, Axon사)로 분석하였다. 바이오칩 형광 데이터를 생산하고 모든 스폿의 패턴으로 생체시료에서 분자 프로파일을 확인하는 방법을 제공할 수 있다.
스폿의 형광정도는 포착프로브과 타깃프로브가 형성하는 이중가닥의 성질에 따라 다양하게 나타난다. 인간혈청단백질-분자결합핵산 복합체의 결합정도 및 양은 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결정된다. 인간혈청단백질-분자결합핵산 복합체에서 기원하는 타깃프로브와 바이오칩에 부착된 포착프로브의 염기서열은 타깃프로브-포착프로브의 이중가닥 안정성에, 그리고 바이오칩 상의 타깃프로브의 양은 형광정도에 영향을 준다(도 2４).
즉, 형광정도는 타깃프로브의 양을 나타내고, 타깃프로브의 양은 인간혈청단백질-분자결합핵산 복합체의 양을 표현한다. 또한 상기 복합체의 양은 생체시료에 있는 분자의 양을 나타낸다. 따라서 스폿의 형광정도로부터 스폿에 상응하는 의 분자를 포함하는 생체시료에서 특정 분자의 양을 확인할 수 있다. 결국 형성된 스폿의 형광정도를 분석하여 바이오칩의 모든 스폿들의 패턴을 확인함으로써 인간혈청에서 혈청단백질의 프로파일을 확인할 수 있게 된다.
즉, 형성되는 스폿들이 파랑-노랑-빨강색의 칼라 스펙트럼은 보이는 것은 포착프로브에 결합한 Cy-3이 표지된 타깃프로브와 Cy-5가 표지된 타깃프로브의 비율이 다양하여 나타나는 현상이며 특정 스폿의 컬러스펙트럼의 정도는 인간혈청을 구성하는 특정한 혈청시료에 존재하는 특정한 분자(단백질)의 양을 표현함으로 바이오칩 상의 모든 스폿들의 컬러스펙트럼을 보여주는 이는 특정한 생체시료에서 분자 프로파일(양적인 상태를 종합화한 정보)에 해당한다.
즉, 본 발명의 분자 분석방법에서는 특정 스폿에서 포착 프로브과 결합하여 이중가닥을 형성하는 타깃프로브는 Cy-3가 표지된 타깃 단일가닥핵산과 Cy-5가 표지된 타깃프로브로 구성되어 있고, 전자는 일정한 양으로 존재하나 후자는 인간혈청에서 상응하는 분자에 비례하여 존재한다. 이에 따라 특정한 스폿은 후자가 상대적으로 소량으로 존재하면 파란색, 비슷하게 존재하면 노란색, 그리고 과량으로 존재하면 빨간색이 된다.
실시예
15.
NGS를
이용한 생체시료의 핵산 및 단백질의 분석
NGS(next generation sequencing)를 이용한 단백질을 분석하는 방법은 본 발명의 상기 실시례에서 잘 설명하고 있다. NGS은 칩(Chip)기반 그리고 PCR기반 페어드엔드(paired end)형식으로 전장유전체를 조각내고, 상기 조각을 혼성화(hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술로 유전체에 대해 많은 정보를 생산하는 방법은 공지되고 있다.
NGS 기술로 인구집단에서 2~5%의 서로 다른 대립유전자가 있을 수 있는 유전형질 정보인 염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)와 염기다형성의 결과로 Wild type 아미노산이 변형된 형태인 돌연변이(amino acid mutation)를 신속하게 분석할 수 있다. WGS (whole genome sequencing)은 차세대염기서열결정법(NGS)에 의한 전장 유전체시퀀싱을 10X, 20X, 40X형식으로 여러 배수로 인간게놈을 읽는 방법이고 WES (whole exome sequencing)는 위의 WGS중에서 단백질 생성에 관여하는 유전자부위만 염기서열결정을 하는 것이며 TS (Target sequencing)는 위의 WGS중에서 표적단백질 생성에 관여하는 유전자부위만 시퀸싱을 하는 기술이다. 따라서, WGS > WES > TS의 데이터크기가 생성된다. 그러나, 작은 부위이기 때문에 많은 샘플을 시퀀싱할 수 있는 장점이 있다. METseq은 유전자의 DNA methylation 측정을 위한 시퀀싱 기술이고, RNAseq은 유전자의 발현, 즉 DNA transcriptome을 위한 시퀀싱 기술이다. SV(structural variation)는 변이중에서 insertion, inversion, translocation 등에 의하여 생기는 염색체의 큰 단위(DNA segment)에서 생기는 변이로 이에 대한 정보도 NGS로 생산할 수 있다.
NGS 기술을 이용하여 단백질 및 핵산 정보를 동시에 생산하는 과정은 다음과 같다. 먼저, 분석하고자하는 핵산들의 염기서열과 분석하고자하는 분자들의 압타머를 포함하는 분자결합핵산의 염기서열로 참조서열(reference sequences)를 구축해야 한다. 본 실시례에서 1149개의 분자결합핵산의 염기서열과 분석하고자하는 핵산의 염기서열로 참조서열을 구축하였다.
생체시료를 나누어 단백질을 분석할 시료를 준비하였다. 본 발명의 실시례로 시료를 구성하는 분자와 기지 압타머를 포함하는 분자결합핵산 풀을 접촉시키고 형성된 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 분리하였다. 상기 준비된 생체시료를 구성하는 분자를 NC 디스크에 부착하고 반응용액에서 압타머를 포함하는 분자결합핵산 풀을 접촉시키고 형성된 분자－분자결합핵산 복합체 풀를 세척용액으로 세척하여 미결합하거나 비특이적 결합 분자결합핵산을 제거하고 디스크를 분리하였다. 디스크에 부착된 시료를 구성하는 다중의 분자와 결합하는 분자결합핵산 풀에서 확보한 변형 RNA인 분자결합핵산을 대상으로 역전사 및 PCR를 수행하여 얻은 DNA 풀을 준비하였다. 준비된 DNA 풀을 TruSeq DNA sample preparation kit v. 2 (Illumina 사)로 136 ng DNA에 end repair, 아데노신의 추가, 어댑터 부가 및 PCR을 하였다. 아데노신 염기 추가를 제외하고 각 단계마다 TruSeq 키트에 포함된 Agencourt AMPure XP beads (Beckman-Coulter)로 세척하였다. Illumina 사에 의해 공급되는 레시피와 PCR 프라이머를 사용하여 15 회의 PCR을 하여 스쿼싱 라이브러리를 제작하였다.
핵산을 분석하여 핵산정보를 생선하기 위한 선행요소로 표적유전자를 증폭하는 과정에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 디자인이다. 특정 온도에서 어닐링할 수 있는 최적의 길이를 가진 mTAS(multiple target loci assembly sequencing) 올리고뉴클레오타이드를 제작하기 위해, 본 발명자들은 컴퓨터 프로그램인 Perl-mTAS를 이용하였다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 타겟-특이적 서열(타겟 혼성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5’-플랭킹 어셈블리 스페이서 서열(오버래핑 서열)로부터 제작되었다. 모든 프로브들은 거의 25 bp였으며 Tm 60℃에서 어닐링하였다.
각 타겟 게놈 유전자 위치(genomic locus)를 위해, SNP 위치를 포함하는 7 bp의 갭(gap)이 존재하도록(즉, SNP 위치의 좌측, 3 bp; SNP 위치, 1 bp; 및 SNP 위치의 우측, 3 bp) 디자인되었다. 디자인의 용이성을 더 하기 위하여 갭의 간격은 0-3bp로 조절되었다. 비록 어셈블리 스페이서 서열이 임의적으로 제조될 지라도, 어셈블리 서열 상에 존재하는 어닐링 부위는 올리고뉴클레오타이드 간의 중첩 부위(overlapping regions)에 대한 온도값(temperature value)을 계산하기 위해 가장 가까운 인접 방법(nearest neighbor methods)에 기반하여 결정되었다.
생체시료를 나누어 핵산시료를 분리할 시료에서 공지된 방법으로 핵산시료를 준비하였다. 인간 혈청시료로부터 QIAamp DNA 추출 키트(Qiagen, 독일)를 이용하여 DNA(gDNA)를 추출하였다. gDNA의 분리를 위해 혈청시료를 1.5㎖ 마이크로 원심분리튜브에 넣어 프로테아제(protease) K 20 ㎕ 및 완충용액 180 ㎕를 혼합하였고, 1시간 56℃에서 반응시켰다. 이와 같이 얻어진 반응액을 QIAamp 스핀 컬럼(spin column)을 이용하여 정제한 후, 완충 용액으로 2회 세척하였다. 그리고 나서, 70 ℃에서 예열한 완충용액 50 ㎕로 용해하여 gDNA를 추출하였고, 이를 20℃에 보관하였다. 추출한 각 gDNA에 대해서는 Qubit dsDNA HS Assay Kit와 Qubit 2.0(Life Technologies 사, 미국)를 사용하여 gDNA의 양을 측정하였다.
-20 ℃에 보관되어 있는 gDNA 10 ng을 사용하여 17개를 포함한 표적유전자의 패널 프라이머를 이용하여 NGS수행을 위한 라이브러리를 제작하였다. 상기 패널 프라이머를 표 3에 기재하였다.
NGS를 위한 라이브러리제작은 Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life technologies사)를 사용하여 제작하였다. 먼저 시료에서 추출한 DNA에서 표적유전자의 돌연변이 발생부위만을 얻어내기 위하여 선행되어진 패널 프라이머풀을 이용하여 증폭하였다. 5X HiFi 마스터믹스 4 ㎕와 패널 프라이머풀 10 ㎕, DNA 10 ng을 혼합하고, 총 반응액이 20 ㎕가 되도록 멸균증류수로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액은 PCR 기기에서 99℃에서 2분, 99℃에서 15초, 60℃에서 4분의 과정을 21 회를 반복하여 증폭하였다. 얻어진 증폭산물은 2㎕의 Fupa용액을 첨가하여 50℃에서 10분, 55℃에서 10분, 60℃에서 20분간 반응시켜서 증폭산물의 양 말단을 부분적으로 절단하였다. 부분적으로 절단된 증폭산물은 Ion P1 adapter 2 ㎕, Ion Xpress Barcode 2 ㎕를 첨가하여 22℃에서 30분, 72℃에서 10분간 반응하여 시퀀싱 어댑터와 시료를 구분 할 수 있는 바코드를 증폭산물에 결합시켰다. 시퀀싱 어댑터와 바코드가 결합된 증폭산물은 45 ㎕의 AMPure XP 용액을 첨가하여 세척하고 Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하여 스쿼싱 라이브러리를 제작하였다.
혈청시료에서 1.5ml씩 샘플링 하여 상온에서 10,000g로 5분간 원심분리하여 세포를 회수한다. 회수된 세포를 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen사)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도와 질(quality)은 NanoDropTM 1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 260nm와 280nm에서 측정하여 결정하였다.
샘플에서의 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리에서 대량 동시 기술을 이용하여 서열분석이 수행된다. 제조업자의 지시에 따라 또는 약간 변형하여 예를 들어 mRNA-Seq Sample preparation Kit(Illumina사)를 사용하여 cDNA 라이브러리를 합성하였다. 혈장 cDNA의 말단-보수 단계에 5배 희석된 클레노브(Klenow) DNA 중합효소를 사용한다. 각각 말단 보수된 및 아데닐화된 생성물을 정제하기 위해 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 QIAquick MinElute Kit(Qiagen사)를 사용하였다． 10배 희석된 쌍 지은 말단 어댑터(adapter)는 혈장 cDNA 샘플에 결합시켰으며, 2회 라운드의 정제는 AMPure XP 비드(Agencourt사)를 사용하여 어댑터가 결합된 생성물에 대해 수행하고 Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하여 스쿼싱 라이브러리를 제작하였다.
인간혈청시료에서 소형 리보핵산(small RNA) 서열분석(sequencing)으로 전체 유전체 마이크로RNA(genome-wide miRNA)를 분석, 비교하였다. mirVAna miRNA isolation kit(Ambion 사, Austin, TX)를 사용하여, 혈청시료로부터 소형 리보핵산이 풍부한 총 RNA를 추출하였고, miRNA 라이브러리는 Illumina library preparation protocol(Illumina 사, San Diego, CA, USA)에 따라 준비하였다. 각각의 라이브러리는 Illumina 어댑터(adaptor)(6-염기 바코드(base barcode))로 색인화하였다. 소형 리보핵산(small RNA) 라이브러리는 6% TBE 유레아 폴리아크릴아마이드 겔(TBE urea polyacrylamide gel)에서 크기별로 나누고(size fractionation), 140 내지 160 염기 쌍(base pair) 부분(fraction)은 겔로부터 절개하여 얻고 정제하였다. 정제된 miRNA 라이브러리는 Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하여 스쿼싱 라이브러리를 제작하였다.
상기 분획된 생체시료에서 분리한 핵산 시료와 상기 분리한 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 혼합하여 시퀀싱 라이브러리를 제작할 수도 있으나, 본 실시례에서 각기 따로 제작한 시퀀싱 라이브러리를 혼합하여 염기서열을 결정하였다. 상기 제작된 시퀀싱 라이브러리를 구성하는 핵산의 염기서열을 상기 참조서열을 비교분석하여 출현빈도를 결정하였다.
제작된 NGS용 라이브러리가 시퀀싱에 사용될 수 있는가를 확인하기 위하여 Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent, 미국) 기기를 사용하여 High Sensitivity chip을 이용하여 제작된 라이브러리의 길이와 양을 측정하였고, 길이는 100 내지 300bp, 양은 100 pmol/l 이상인 조건에 만족하는 라이브러리를 시퀀싱에 사용하였다. High Sensitivity chip을 이용한 라이브러리 정도관리를 하였다．
상기에서 나타낸 바와 같이 각 시료 별로 통합되고 해당 시료의 바코드 서열이 부착된 PCR 산물은 Qubit fluorometer(Invitrogen 사)로 정량하였다. HiSeq 2000의 cBOT cluster station에 한 시료 당 3 ng PCR 산물을 5 pM의 농도로 flowcell에서 혼성화시켰다. cBOT에서 다리 증폭(bridge amplification)로 단일 DNA 분자당 28 번 증폭하여 클러스터를 형성하였다. 각 클러스터는 선형화시킨 후 시퀀싱 프라이머와 혼성화시켰다. 본 flowcell를 HiSeq 2000에 로딩하였다. 본 flowcel은 73 single read bases과 더불어 7 multiplexed bases를 염기서열 분석할 수 있는 HiSeq 2000의 Single Read 80 Base Pair Recipe로 실행하였다. Illumina Real Time Analysis(RTA）에 의해 이미지의 생성 및 분석을 실시하여 실시간으로 base-call files,과 품질 점수를 확인하였다.
순방향 및 역방향 가닥이 시퀸스이 종료된 후, Illumina 사 Casava 소프트웨어 품질 분석을 하였으며 추가적으로 내부적으로 개발 된 소프트웨어를 사용하여 다운 스트림 분석을 수행하였다.
상기 결정된 시퀀스 라이브러리를 구성하는 핵산의 출현빈도는 표적분자인 핵산 및 단백질의 정보를 반영하고 있어 분석결과를 이용하여 핵산시료의 핵산과 생체시료를 구성하는 표적분자를 분석할 수 있다.
| 정방향primer | 역방향Primer | 표적유전자 |
| TCCTCATGTACTGGTCCCTCAT | GGTGCACTGTAATAATCCAGACTGT | KRAS |
| CATACGCAGCCTGTACCCA | GTGGATGCAGAAGGCAGACAG | RET |
| TGTCCTCTTCTCCTTCATCGTCT | AGGAGTAGCTGACCGGGAA | RET |
| CCATCTCCTCAGCTGAGATGAC | GGACCCTCACCAGGATCTTG | RET |
| CCTATTATGACTTGTCACAATGTCACCA | TAGACGGGACTCGAGTGATGATT | BRAF |
| CACAGCAGGGTCTTCTCTGTTT | CCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCC | EGFR |
| TGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT | ATGTGTTAAACAATACAGCTAGTGGGAA | EGFR |
| GGTGACCCTTGTCTCTGTGTTC | AGGGACCTTACCTTATACACCGT | EGFR |
| GGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCT | GGAAATATACAGCTTGCAAGGACTCT | EGFR |
| cttACCAGCTTGTTCATGTCTGGA | AGAGGACTTCGCTGAATTGACC | MET |
| GCAGCGCGTTGACTTATTCATG | CACAGCTACTCTCAGAAAGCACT | MET |
| AACTGAGCTTGTTGGAATAAGGATGTTAT | CCATTTTGGTTTAATGTATGCTCCACAATC | MET |
| CCCATCCAGTGTCTCCAGAAGT | CAAGTGACACTGGTTGTAAATATGCATTT | MET |
| GTTATGACAGGATTTGCACACATAGTT | CCCAAGCCATTCAATGGGATCT | MET |
| CCCTTCTCTTCACAGATCACGA | CAGACAGATCTGTTGAGTCCATGT | MET |
| GCTTGGGCTGCAGACATTTC | GCCAGCTGTTAGAGATTCCTACC | MET |
| TGGTCCTGCACCAGTAATATGC | ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA | KRAS |
| CCATCCACAAAATGGATCCAGACA | GCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTT | BRAF |
| AGGAAATTCCCACTTAGGAACCATTG | AGCAAACTCAGTTGAAATGGTTTGG | MET |
| GTTCAGTGTGTCAAACAGTATTCTTGAATG | GTTGGATGAATTTCATAGACAATGGGATC | MET |
| ACAAGCATCTTCAGTTACCGTGAA | AAAACTGCAATTCCTCTTGACTATTCTACA | MET |
| GCTATGGATGTTGCCAAGCTGT | TAACATGAAAAAGGCTTTGGTTTTCAGG | MET |
| GCAACAGCTGAATCTGCAACTC | ATTTTCATTGCCCATTGAGATCATCAC | MET |
| CTGTGTTTAAGCCTTTTGAAAAGCCA | CCAAGTACAACAATTGTATTCACATAGCT | MET |
| CATAATTAAATGTTACGCAGTGCTAACCA | GCAAACCACAAAAGTATACTCCATGGT | MET |
| CAGTCAAACCCTCAGGACAAGA | CCCTCGGTCAGAAATTGGGAAA | MET |
| TCTCAGGAATCACTGACATAGGAGAAG | CGAATGAAATTTCGAAGATCTCCATGTTT | MET |
| GCTGGTGGTCCTACCATACATG | TTTTTAAAGACTCAGAGCAGGCCTATT | MET |
| GAGGCCAGATGAAATACTTCCTTCA | AAAATCAGCAACCTTGACTGTGAATTTT | MET |
| TGTCCTTTCTGTAGGCTGGATGA | GGTGGTAAACTTTTGAGTTTGCAGA | MET |
| GTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAG | AAACTGGAATTGGTGGTGTTGAATTTTT | MET |
| CGTCTCCTGGAGATGGATACTCT | CTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTG | FGFR1 |
| GCAGTTACTGGGCTTGTCCAT | GAGGCGGAGAAGCTCTAACAC | FGFR1 |
| GCATGGACAGGTCCAGGTAC | GGAAGACCTGGACCGCATC | FGFR1 |
| CCTTACCTGGTTGGAGGTCAA | GGAGACGTCCCTGACCTTACA | FGFR1 |
| GAGTTCTTTGCTCCACTTGGGA | CCACACTCTGCACCGCTAG | FGFR1 |
| GCACCTTACCTTGTTCAGGCAA | TGGAGTATCCATGGAGATGTGGA | FGFR1 |
| AGGAATGCCTTCAAAAAGTTGGGA | TCCAGTGCATCCATGAACTCTG | FGFR1 |
| GTGATGGCCGAACCAGAAGAAC | CATGTGCCTCTGCCATTGTTG | FGFR1 |
| GAGAGAGGCCTTGGGACTGATA | TCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCG | FGFR1 |
| AGCAGGTTGATGATATTCTTATGCTTCC | CCACTCCCTTAGCCTTTATCCTG | FGFR1 |
| TTAAACCCAATGCCCAGACCCAAA | CCCTTCTTCTTCCCATAGATGCTCT | FGFR1 |
| TCTCCTCTGAAGAGGAGtcatcatc | GGTGTCCGTGTTCATCTGGAAC | FGFR1 |
| GGCAGAAAGAGGACTCCTCAGT | CGACTGCCTGTGAAGTGGATG | FGFR1 |
| TGTAGATCCGGTCAAATAATGCCTC | GGTTTCATCTGAGAAGCAAGGAGT | FGFR1 |
| GCATTAGAGGCCCAGAGAGAGA | TCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTA | FGFR1 |
| GCTGTGGAAGTCACTCTTCTTGG | CTAACACCCTGTTCGCACTGA | FGFR1 |
| TTGGAATGGGACAAGATTTTCTTTGC | CGAAAGACTGGTCTTAGGCAAAC | FGFR1 |
| AGGACAGAAGCATCACTTACACTTC | CAACTTATGCCACTCTCTGTTTCC | FGFR1 |
| AAATGAAAAGCATGTAATCAGGACTTCCTA | ACACTGCGCTGGTTGAAAAATG | FGFR1 |
| TGTGGTCAGGTTTGAATTCTTTGC | GCCGTAGCTCCATATTGGACATC | FGFR1 |
| CATGCAATTTCTTTTCCATCTTTTCTGG | CTCACAGGTGTTGGGCAGAT | FGFR1 |
| CTTTGTCATTTACAAGTACTTTGCAAACAC | TCCCTAAAGCTGGAGTCCCAAATA | ROS1 |
| TTCTAGTAATTTGGGAATGCCTGGTT | cgcctcTGAATATTTCTTTAATGTTGTCTT | ROS1 |
| GCCTAGGTGCTCCATAATGATGG | AGTCTGGCATAGAAGATTAAAGAATCAAAA | ROS1 |
| ACCAATCATGATGCCGGAGAAAG | ACCTGGTGTGGTTGTCAATACC | ALK |
| TCACCGAATGAGGGTGATGTTTT | GCAGAGCCCTGAGTACAAGC | ALK |
| GGTTGTAGTCGGTCATGATGGT | TGGCCTGTGTAGTGCTTCAAG | ALK |
| ccacttcacctagccAGAATTTTTC | CTGACAGGCGATCTTGAACATCA | EML4 |
| AGATGATAGTATTTCTGCTGCAAGTACTTC | CACATGATCTTCAGAGATTGCAAGAC | EML4 |
| CAAGAAGATGAAATCACTGTGCTAAAGG | CAGCTTCAACTTTCAAAGAAAATATTGCAA | EML4 |
| CTCTGTCGGTCCGCTGAAT | GCTGTGTGCGGAAGGAAAAA | EML4 |
| GTTCTAGTTCAGTCTTCTTCATTGTACCTT | CGGAAGAAGGTAAACATTAGCTCTACAG | EML4 |
| TCTGTTAAGATATGGTTATCGAGGAAAGGA | CAACCATTTCACACAGTCTGTATGG | EML4 |
| AGAGAACTCAGCGACACTACCT | TCTGAGCTTTCCACAAGAAATCACTT | EML4 |
| GCTTCCAAATAGAAGTACAGGTAAGCT | CTGAGCACATGTCAAGAGCAAATC | EML4 |
| TCTTGCCACACATCCCTTCAAA | GCCAGTGTGAGGAGTTTCTGTG | EML4 |
| ATGGTATTTCTTTCTTAGAATGTTAGCCCTATC | AAATTTACCTTTATTTCTGCTCCTTTTGCTTT | EML4 |
| GAGCATATGCTTACTGTATGGGACT | GCTTTTGCGACTTACGAATAGATAGTTCTA | EML4 |
| TTTTTCATTTGTTTAAATGTGTATTGTTCCATG | GGAGAAGGTGATGCTCGAATTTG | EML4 |
| gaggaaTCTCATTCTAATGATCAAAGTCCA | CCATTCCCTAGCTCTGTACTTGG | EML4 |
| TGTCAGTTACATGTCTTTGATACTCAGAA | GGGTGTTGAAGGTATTTTCGACAATTTAT | EML4 |
| CTTGGGAAAATTCAGATGATAGCCGTA | CCAGACATACATAACTGTACATGCAAACAT | EML4 |
| CCATAGGGAGACTTTCTCATGTACTC | TAGCATTTAAACATCCCACCACTTCA | EML4 |
| CCCTCCTTCCAAATGGACTTAATTTTAAA | TGCACCACTTCCATTGGTTATACAG | EML4 |
| CCTCGAGCAGTTATTCCCATGTC | AGACAATTCTGCAATGTTAGTTTTTCCC | EML4 |
| aacttttacagtttcttgaggtgattttaatgg | TTTCAATTAGCAAAAATTAAACTAAGAAGGGCA | EML4 |
| ACAAAGGTATTCTGTTGTTTCATGTTTCC | CAATGTCTCTAGGTACAGAAGGCAT | EML4 |
| GTTCTACTGAAGTTTTCTTCCAAATAGACACT | CTCCAGTTAATAACATCCCATTTCTCATCT | EML4 |
| GGCAGTGTGTTCACACTTTGTC | GTGGGACAAAATACCTGAGTTTAGAGTATT | EML4 |
| GACTAAAACTTTGAAGTAGTCATTTTTGTCTT | GAATGAACATGGTAATTGGCCGA | EML4 |
| TGTCTTGTGTTTCAACAGAAGGAGAATAT | GCTGTCATGGTAGAGAAGGATACG | EML4 |
| CCTGAGAAGCTCAAACTGGAGT | cctggccTGATGTTTCCTTTTTAATTTTT | EML4 |
| gcacaccagcgttatgacaaag | TGTGTGGATAGAAACTAGATCTCTGGTT | EML4 |
| GGTGGTTTGTTCTGGATGCAGA | CAATTGCAGTGAAGTGCTGTGAAT | EML4 |
| AGTGGATAGGATTCATTCATTAATTGCCA | TACAGCCAGGAAGGTACCATCT | EML4 |
| ATTTCTCTAGTCAACACTGACCTATTTTATTCT | TCCCAATAATTTTACAACTTGTTCTACTTCACT | EML4 |
| GTAGCAGTAATTGAATTGATACTTGAAGGAGA | CGCTCCAGGTCCAGAAGAAAATATG | EML4 |
| GCAAATACCATAATTACATGCGGTAAATCT | GCCATGACAACTTGATGCTTATTAAACAAT | EML4 |
| TTTTTAAATGGCATTAGTTCTGTGTGCT | GCTCAAAAGTGCCAAGTCCAATA | EML4 |
| TCTGTTACTCTATCCACACTGCAGAT | ACTTCATGGCCACATAAACACAAAAC | EML4 |
| AACAGTATTGGCTAGCTGTTGAACT | ATACTTACAGTACAATATTTCATAGTCTCCCGA | EML4 |
| CCCAGACAACAAGTATATAATGTCTAACTC | CCCTGACAGACACATCTTAGCatatatata | EML4 |
| CAAGCACTATGATTATACTTCCTGTTTCT | ACAAACCACTTCTTTACATCAGGTGT | EML4 |
| TTAATAAGCATCAAGTTGTCATGGCAAAAA | GGCTCTACAGTAGTTTTGCTCCATA | EML4 |
| AGACTCAGGTGGAGTCATGCTTA | CCTGGTCTAAGAGATGGGACTGA | EML4 |
| ATTTCTGAAACAGGCATGTCAAGAATG | CCAGTTGATATCAGGTGACTGTCATTG | EML4 |
| AGCCATGTCACCAATGTCAGTTTTA | GGCTTTGGTTAGAGTAGTATCCGCTA | EML4 |
| AGTTATCTTTGCCTCAGAATGAGACTG | GTGGGAGAACTGCTTATTCTACTTTCC | EML4 |
| GCCCTTAAATGAGACAGCTGAAGA | GCTTATCTCGTTGCATGGCTCTT | EML4 |
| GAGACCTTGGTGAGCCTCTTTATG | ACATGCAGCTGAAGGAAAAGAGTT | EML4 |
| CAGCTATAAATGCAGGCTTCGAGTA | GTTCCTCGTAAAATAAAGTTTCGTGATGT | EML4 |
| GGAAAGGCAGATCAATTTTTAGTAGGC | ACCCTGAAAATGAAAGACACTCATTGTTAT | EML4 |
| GCTAATTTTTCTGCATCCCTGTGTT | GGGATACTGAAACAGATGGACTTTACAAA | EML4 |
| GTGATAGCTGTTGCCGATGACT | GAGTATCATGGAGAGGAATCAGTAACCTAT | EML4 |
| CTTTTGATGACATTGCATACATTCGAAAGA | CAGTTATCTTTTCAGTTCAATGCATGCT | PIK3CA |
| ATCCGCAAATGACTTGCTATTATTGATG | CCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTG | NRAS |
| GGGTGAGGCAGTCTTTACTCAC | GCCGTTGTACACTCATCTTCCTAG | ALK |
| CCTCACCTCTATGGTGGGATCA | GCTCGCCAATTAACCCTGATTACT | NRAS |
| CAGGTCTCTCCGGAGCAAA | GCCAAGTCCCTGTGTACGA | HER2 |
| AGAACCTCTCAACATTGTCAGTTTTCT | GCTCTGAGTAGAACCATTGCTCA | MET |
| TTGGCACAACAACTGCAGCAAA | CCAGAACATTGTTCGCTGCATTG | ALK |
| GTCTCTCGGAGGAAGGACTTGA | CAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGGTTAC | ALK |
| CAGCTGGTGACACAGCTTATG | CTCCGGAGAGACCTGCAAAGAG | HER2 |
| TATGCAGATTGCCAAGGTATGCA | AATGGGAAGCACCCATGTAGAC | HER2 |
| GGGTGTCTCTCTGTGGCTTTAC | ACTCTGTAGGCTGCAGTTCTCA | ALK |
| GCCAATGAAGGTGCCATCATTC | CTCAGGCATCCCAGGCACAT | AKT1 |
| ATTTTACAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACA | AAAGAAAAAGAAACAGAGAATCTCCATTTTAGC | PIK3CA |
| GAAATTTAACAGGGTGTTGTTGTGCA | CTGTTCATCTGACAGCTGGGAAT | DDR2 |
| GCTGGAGGAGCTAGAGCTTGAT | GCTTGTGGGAGACCTTGAACAC | MEK1 |
| TGGGTGGTCAGCTGCAAC | CATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAA | ALK |
| GCTCTGAACCTTTCCATCATACTTAGAAAT | ccagactaacaTGACTCTGCCCTATATAAT | ALK |
| AAAGAAGGTGTGTCTTTAATTGAAGCAT | gggtctaatcccatctccagtct | ALK |
| TCAtgttagtctggttcctccaaga | gggttatacttgcaacacagtct | ALK |
| agggaaggctgggtgaacc | actgactttggctccagaacc | ALK |
| ggagcctaaggaagtttcagcaag | cactgctgtgattgcactgaag | ALK |
| ggttctggagccaaagtcagtc | aactataggaaacacaactgaccaagatc | ALK |
| caatcacagcagtggatttgagg | aggcggaattagagcacagatc | ALK |
| GAAGAGCCACATCAtgaaaagatctct | agttaccatccctgcctacaga | ALK |
| ggacctctttggactgcagttt | ggtagagctctttaggatttttcaaaacca | ALK |
| ggttgtcaatgaaatgaattcaccaacata | ACAGAATCTACCCACTGAATCACAATTT | ALK |
| AAACTCCATGGAAGCCAGAACA | ttcattcgatcctcaggtaacccta | ALK |
| tggaccgaccgtgatcagat | ATCTGCCGGTAGAAGGGAGAT | ALK |
| CCTTTGAGGGATGGCACCATAT | GAGACATGCCCAGGACAGATG | ALK |
| CCTTTCCCTCTGCCCTTTTCAA | AGAGAGATAGGAAAATCGGTTTCTGAGTAT | ALK |
| GGCTCACAGGCTGAACAGAAAT | ACTTCTAGCTCCCACATGCTTC | ALK |
| CATTACATAGGGTGGGAGCCAAA | TGTGTATCCTCCTGGCTGATCA | ALK |
| GCTTTCACCATCGTGATGGACA | AAACGGAAGCTCCCAACCTT | ALK |
| CTGATCAGCCAGGAGGATACAC | CCAAGGTGTCACTTCGTTATGC | ALK |
| CCCACCCAATTCCAGGGACTA | GGCTTTCTCCGGCATCATGAT | ALK |
| TGCTTTTCTAACTCTCTTTGACTGCA | GATTGTGGCACAGAGATTCTGATACTT | MET |
| CACAGCCTGAGACACTATTCAGTC | ACTCTCGCTGATCCTCTCTGT | ALK |
| ATGTATTTAACCATGCAGATCCTCAGTTT | ATCTTGTTCTGTTTGTGGAAGAACTCT | PTEN |
| GGATGAGCTACCTGGAGGATGT | CCATCTGCATGGTACTCTGTCT | HER2 |
| TCTTTGTCTTCGTTTATAAGCACTGTCA | GTGTTCTTGCATAAAAACACTTCAAATG | ROS1 |
| TGAAACTTGTTTCTGGTATCCAAAAATCAT | CTGGCTTGCAAAAATCCAGTAGTAG | ROS1 |
| TTCCTTTAGGAAATGTTAACAGTGCATTTG | GATTAAAAATGGTGTAGTATGATTTGTGTACTT | ROS1 |
| ACTTACCAAAGGTCAGTGGGATTG | CTCTGTGTGCTTAGGTAGAGCTG | ROS1 |
| CTGTGACCACACCTGTCATGTA | AAGAAGGCAAGACCCTTAAAGGAG | RET |
| AGCTCTACCTAAGCACACAGAGTAATA | GTGGTTTGTTgctctctgcaaaaa | ROS1 |
| GGCCCAATGTGTGGATAGAAC | CAGGACAACTTCTCTACATAGCCA | RET |
| GTGTGGATAGAACTTTGGTGGGA | GAAGTGTCCAGGACAACTTCTCT | RET |
| GGGTGGCTATGTAGAGAAGTTGT | CTACATGACAGGTGTGGTCACA | RET |
| CGAAGTACTGAGTCCAAGCCAT | GACAAGTTCCAATGTGCAGAGAAC | RET |
| CTTCTGCACTGAAATCTTTCTACAGAATATATT | gaatctagataccttgccggtgaag | ROS1 |
| cgactagaagcaactccgttca | gctcactgctcttccttctctct | ROS1 |
| tagattcgctcatcaaaattgactagaagg | gcacagttctttggaaaagcaatttc | ROS1 |
| gggaaattgcttttccaaagaactg | cccagggagttcagtaagcttag | ROS1 |
| atcaaaagcaaggtgtttttgcttt | ATAATGCCAACTATTTAGTATCCAAAGACTGAG | ROS1 |
| AAAAACTAATTAAATCCAGGTAAAAAGCCAT | TCGTTTATGGGTGATTTTGACAAATAAGTTTT | ROS1 |
| GCCATATATAAGTACACAAATCATACTACACCA | GTTTGTTTTGGTTTATTTTGACTCGTTTATGG | ROS1 |
| TCACCCATAAACGAGTCAAAATAAACCA | CAATGATAAACACTCTTGTACTCTGCaaaa | ROS1 |
| CTGCACATTGGAACTTGTCCATG | TTCTCCTAGAGTTTTTCCAAGAACCAAG | RET |
| GTGGGAATTCCCTCGGAAGAA | TGCCTGGCAGGTACCTTTC | RET |
| AGTCACTGTCCCTGTGACCAT | ACGTAGGGCTATATAATACCAGAAAACTCA | RET |
| GCATAGGGACACGTTTCTGTCAT | AGGCTGTGCTCATTACACCAG | RET |
| CATTTGGAACAGAGGAAAATTTTGACCTC | AGaccactattgccctcttacaga | RET |
| CCAGTGCCAGCTGGTGTAA | GTGGGAAGGCCTGAGAACAC | RET |
| GGGCAGTAAATGGCAGTACC | TCGGCACCACTGGGTACAG | RET |
| TCACATCCAGGTTATATTCCTCAGTAGAAA | gtaagcttcgttccaatactttttctacat | ROS1 |
| TTTAGGACCAAGAAATCTCAGTCTTTGG | GTTTCCTCTACACAACTGAAACTACCT | ROS1 |
| CTCAGTCTTTGGATACTAAATAGTTGGCA | tcctcatgccatagtttgccag | ROS1 |
| GTCCCAACCATGTCAAAATTACAGAC | CCATGGGCTAGACACCACT | HER2 |
| atttgctcttccatgacaggctta | caagtatctcctgatggatgaatgga | BIM |
| ccagtgtgtgtatatcacatacttcattta | agcaattccacttccaagtatatatccaaaaa | BIM |
| AAAGTTAATGTACCGAGGTAAGTTTTCAGT | CTGTAGAATGTCCAGAGAAAATTATGGACT | BIM |
| GAAAGGACTTAGCCAGATGTGAGTTT | CAAAGTCAAGAGAACCACTTATCAACTCA | BIM |
| GTCTTAGTTCATGCCTGAAGACCA | TGACTTCTTTGTGGAAAATGTATTTTGCAA | BIM |
| ATTCTTTACTCAACCCTATCCATGAAGTTC | CTGGCTAAGGCGAACCTCTTTAT | BIM |
| CATTTCTAAATACCATCCAGCTCTGTCT | CATGTGTAGCTGCTGGGATG | BIM |
| GCACACCTGTGAGGTGGTG | CTGAAATGAGTTCACGAGCAGTAGTA | BIM |
| GGGCTGGAAGTTTTATTATTGCTGT | CCTGTTAACTCATTTAGTAAGCAAGGATGT | BIM |
| GTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGT | TGAGGTTCAGAGCCATGGAC | EGFR |
| CATGCGAAGCCACACTGACGT | CTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCA | EGFR |
| TCATCACGCAGCTCATGCCCTT | GTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTC | EGFR |
| gctggtACTTTGAGCCTTCACAG | CACCAGCCATCACGTATGCTTC | HER2 |
| TCTCCCATACCCTCTCAGCGTA | CAGCCATAGGGCATAAGCTGTG | HER2 |
Claims (78)
- (a) 단일가닥핵산 라이브러리를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 단일가닥핵산 라이브러리와 시료를 구성하는 다중의 분자들을 접촉시켜 상기 시료를 구성하는 분자에 결합하는 분자결합핵산으로 이루어진 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제조한 분자결합핵산 일차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산들의 염기서열 및 출현빈도를 분석하여 상기 시료를 대표할 수 있는 분자결합핵산들을 선정하는 단계를 포함하는 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트． - (a) 단일가닥핵산 라이브러리를 제조하는 단계;
(b) 분석시료와 비교시료를 구성하는 다중의 분자들와 단일가닥핵산 라이브러리를 접촉시켜 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리를 대상으로 균등화, 감산화， 균진화－감산화 또는 SSH를 하여 분자결합핵산 이차 라이브러리를 제조하는 단계，
여기에서,
상기 균등화는, 상기 단계 (b)의 분자결합핵산 일차 라이브러리는 단일가닥핵산 라이브러리가 시료를 구성하는 다중의 상기 분자와 반응하여, 상기 시료를 구성하는 상기 분자의 출현빈도 다양성을 반영하는 분자결합핵산 복합체들을 형성하고, 상기 분자결합핵산 복합체에서 상기 분자결합핵산을 분리하여, 상기 시료에서 상기 분자의 출현빈도 다양성을 유지하는 상기 분자결합핵산으로 구성된 상기 단계 (b)의 분자결합핵산 일차 라이브러리에서 분자결합핵산의 출현빈도를 일정하게(균등화) 하는 과정이고;
상기 감산화는, 표적이 되는 상기 분자와 결합된 상기 단계 (b)의 분자결합핵산 일차 라이브러리의 상기 분자결합핵산에서, 상기 표적과 관련 없는 상기 분자와 결합된 상기 단계 (b)의 분자결합핵산 일차 라이브러리의 상기 분자결합핵산을 제거하는 과정이고;
상기 균등화－감산화 과정은 균등화를 실시한 분자결합핵산 라이브러리를 대상으로 감산화를 실시하는 과정이고;
상기 SSH(Suppression Subtractive Hybridization)은, 상기 단계 (b)의 분자결합핵산 일차 라이브러리의 분자결합핵산을 혼성화하여 형성되는 이중가닥핵산과 단일가닥핵산을 구분하여 선택적으로 증폭하는 과정으로 상기 분석시료의 분자결합핵산 일차 라이브러리와 상기 비교시료의 분자결합핵산 일차 라이브러리를 이용하여 상기 분석시료의 상기 단계 (b)의 분자결합핵산 일차 라이브러리에 특이적으로 존재하는 상기 분자결합핵산을 분리하는 과정이고;
(c) 상기 균등화 과정, 감산화 과정, 균등화-감산화 과정 또는 SSH 과정을 수행하여 제조한 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산들의 염기서열과 출현빈도를 결정하는 단계; 및
(d) 상기 분석시료 및 비교시료에서 확보된 분자결합핵산의 출현빈도를 분석하여 상기 분석시료 및 비교시료를 비교하거나 대표할 수 있는 분자결합핵산을 선정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제１항 내지 제２항에 있어서,
상기 단일가닥핵산 라이브러리는 하기 ＜일반식 I＞ 구조의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트．
5'-5'보존영역-가변영역-3'보존영역-3' ＜일반식 I>
여기에서，
상기 5' 보존영역은 (a) 상기 올리고뉴클레오티드를 주형으로 이중가닥 DNA와 RNA 제조에 사용되는 프라이머(DS 정방향 프라이머)의 염기서열과 상보적으로 결합하는 위치(5' DS 보존영역), (b) 상기 올리고뉴클레오티드를 주형으로 단일가닥 DNA 또는 상기 올리고뉴클레오타이드에서 제조된 RNA에서 이증가닥 DNA의 제조에 사용되는 프라이머(RS 정방향 프라이머)의 염기서열과 상보적으로 결합하는 위치(5' RS 보존영역), 및 (c) 상기 올리고뉴클레오티드로부터 제조되는 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리를 균등화하거나 감산화하거나 상기 균등화와 상기 감산화를 순차적으로 하거나 상기 균등화와 상기 감산화를 동시에 실행하는 과정에 사용되는 프라이머(SSH 정방향 프라이머)의 염기서열과 상보적으로 결합하는 위치(5' SSH 보존영역)를 구비하고;
상기 3' 보존영역은 (a) 상기 올리고뉴클레오티드를 주형으로 이중가닥 DNA와 RNA 제조에 사용되는 프라이머(DS 역방향 프라이머)의 염기서열과 상보적으로 결합하는 위치(3' DS 보존영역), (b) 상기 올리고뉴클레오티드를 주형으로 단일가닥 DNA 또는 상기 올리고뉴클레오타이드에서 제조된 RNA에서 이증가닥 DNA의 제조에 사용되는 프라이머(RS 역방향 프라이머)의 염기서열과 상보적으로 결합하는 위치(3' RS 보존영역), (c) 상기 올리고뉴클레오티드에서 제조되는 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리를 상기 균등화하거나 상기 감산화하거나 상기 균등화와 상기 감산화를 순차적으로 하거나 상기 균등화와 상기 감산화를 동시에 실행하는 과정에 사용되는 프라이머(SSH 역방향 프라이머)의 염기서열과 상보적으로 결합하는 위치(3' SSH 보존영역)를 구비하며;
을 특징으로 하는 분자결합핵산 라이브러리(분자결합핵산 일차 라이브러리와 분자결합핵산 이차 라이브러리를 총징한 라이브러리)를 제조하는 방법. - 제３항에 있어서,
상기 5' DS 보존영역, 5' RS 보존영역, 및 5' SSH 보존영역은 5' 보존영역, 그리고 상기 3' DS 보존영역, 3' RS 보존영역, 및 3' SSH 보존영역은 3' 보존영역에서 서로 일부 또는 전부가 중첩되는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법. - 제３항에 있어서,
상기 DS 프라이머 쌍은 상기 올리고뉴클레오티드를 주형으로 이중가닥 DNA와 RNA합성에 필요한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성되며,
상기 정방향 프라이머는 생체외 RNA polymerase가 결합하는 위치가 있는 염기서열과 올리고뉴클레오티드의 5' 보존영역의 상보적인 염기서열에 상보적으로 결합하는 염기서열로 구성되고,
상기 역방향 프라이머는 올리고뉴클레오티드의 3' 보존영역에 상보적으로 결합하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제３항에 있어서,
상기 RS 프라이머 쌍은 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 올리고뉴클레오타이드의 전사체 RNA를 주형으로 이중 또는 단일가닥 DNA를 제조하는 염기서열로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성되며,
상기 정방향 프라이머는 올리고뉴클레오티드의 5' 보존영역의 상보적인 염기서열에 상보적으로 결합하는 염기서열이고,
상기 역방향 프라이머는 상기 올리고뉴클레오타이드의 전사체 RNA의 역전사에 사용되는 경우 상기 RNA 주형에 결합하여 priming 역할을 하여 cDNA를 합성하며 올리고뉴클레오티드의 3' 보존영역에 상보적으로 결합하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제３항에 있어서,
상기 SSH 프라이머 쌍은 상기 분자결합 단일가닥 RNA를 주형으로 제조된 cDNA 및 이중가닥 DNA인 예비테스터를 주형으로 테스터를 제조하는 염기서열로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성되며,
상기 테스터1의 제조를 위한 프라이머는 아댑터1과 올리고뉴클레오티드의 5' 보존영역의 상보적인 염기서열에 상보적으로 결합하는 염기서열로 구성된 SSH 정방향 프라이머_테스터1와 DS 역방향 프라이머이고,
상기 테스터2의 제조를 위한 프라이머는 상기 DS 정방향 프라이머와 올리고뉴클레오티드의 3' 보존영역에 상보적으로 결합하는 염기서열과 아댑터2로 구성된 SSH 역방향 프라이머_테스터2인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제７항에 있어서,
상기 아댑터1과 아댑터2는 PCR 공정을 가능하게 하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제１항 내지 제２항에 있어서，
상기 단일가닥핵산 라이브러리는 하기 <일반식 II>구조의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트．
5'-가변영역-3' ＜일반식 II> - 제９항에 있어서
상기 <일반식 II>구조의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 단일가닥핵산 라이브러리와 시료를 구성하는 분자를 접촉시켜 형성된 분자－분자결합핵산 복합체 풀에서 분리된 단일가닥핵산에 상기 ＜일반식I>을 구성하는 5'－5'보존영역－３'와 5'－3'보존영역-3' 각각의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드를 부가하여 상기 ＜일반식 I> 구조의 5'-5'보존영역-가변영역-3'보존영역-3' 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1항 내지 제２항에 있어서,
상기 단일가닥핵산 라이브러리의 단일가닥핵산을 구성하는 뉴클레오티드의 화학적 변형은,
리보스 위치, 디옥시리보스 위치, 포스페이트 위치 및 염기 위치로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 화학적인 치환인 것을 특징으로 하는, 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1항 내지 제２항에 있어서,
상기 단일가닥핵산 라이브러리의 단일가닥핵산을 구성하는 뉴클레오티드의 화학적 변형은,
상기 뉴클레오티드 2'-위치 당질 변화된 된 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-0Me)； 상기 뉴클레오티드 5-위치 피리미딘 변형된 시토신 엑소사이클릭 (exocyclic) 아민에 있는 개질, 5-브로모우라실의 치환, 5-브로모데옥시우리딘의 치환, 5-브로모디옥시시티딘의 치환； 주형 변경； 메틸화 반응에 의한 변형된 3 ' 말단과 5 '말단인 캡핑(capping) 또는 페길화(pegylation)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 변형인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1항 내지 제２항에 있어서,
상기 단일가닥핵산 라이브러리의 단일가닥핵산을 구성하는뉴클레오티드의 화학적 변형은,
5-(N-벤질카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-이소부틸카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-[2-(lH-인돌-3일)에틸]카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄)프로필]카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-(N-나프틸카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 및 5-(N-[1-(2,3-디히드록시프로필)]카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 변형인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제１항 내지 제２항에 있어서，
상기 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조하기 위한,
단일가닥핵산 라이브러리를 시료를 구성하는 다중의 분자와 접촉하면서, 반응의 이전이나 평형 상태에서 상기 분자를 희석하거나 상기 분자의 경쟁분자를 첨가함으로써,)상기 분자와 상기 단일가닥핵산 라이브러리의 상기 단일가닥핵산의 결합 친화력과 특이성을 증가시키고 비특이적 결합을 감소시키면서, 상기 시료를 구성하는 다중의 분자와 상기 단일가닥핵산 라이브러리를 접촉시키는 과정을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1４항에 있어서,
상기 경쟁분자는 올리고뉴클레오티드, 다중음이온, 비염기성 포스포디에스테르 폴리머, dNTP 및 피로포스페이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 경쟁분자인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제14항에 있어서,
상기 다중음이온은, 헤파린, 청어 정액 DNA, 연어 정자 DNA, 덱스트란 설페이트 및 폴리덱스트란으로부터 선택되는 다중음이온인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1４항에 있어서,
상기 분자와 높은 친화력을 갖는 상기 분자결합핵산을 더 낮은 친화력을 갖는 상기 분자결합핵산로부터 분리하는 과정을 포함하고 더 낮은 친화력을 갖는 상기 분자결합핵산에서 높은 친화력을 갖는 상기 분자결합핵산의 분리는,
(a) 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액이 평형 결합을 형성하도록 하는 단계;
(b) 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액을 희석하는 단계; 및
(c) 희석된 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액에서 반응을 유지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1４항에 있어서,
상기 더 낮은 친화력을 갖는 분자결합핵산에서 최대 친화력인 분자결합핵산의 분리 과정은,
(a) 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액이 평형 결합을 형성하는 단계;
(b) 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액과 최소한 하나의 경쟁 분자를 혼합하는 단계; 및
(c) 경쟁자와 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액에서 반응을 유지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1４항에 있어서,
상기 더 낮은 친화력을 갖는 분자결합핵산에서 최대 친화력인 분자결합핵산의 분리 과정은,
(a) 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액이 평형 결합을 형성하는 단계;
(b) 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액과 최소한 하나의 경쟁 분자를 혼합하는 단계;
(c) 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액을 희석하는 단계; 및
(d) 경쟁자와 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 희석된 반응용액에서 반응을 유지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1４항에 있어서,
상기 더 낮은 친화력을 갖는 분자결합핵산에서 최대 친화력인 분자결합핵산의 분리 과정은,
(a) 상기 분자결합핵산 복합체 풀을 포함하는 반응용액이 평형 결합을 형성하는 단계;
(b) 평형 결합을 달성하기에 충분한 시간 동안 함께 반응용액과 다중의 분자를 반응하는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 반응용액에 최소한 하나의 경쟁 분자를 과량 첨가하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 반응용액에 최소한 하나의 경쟁 분자를 과량 첨가하는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 반응용액, 분자-분자결합핵산 복합체 풀 및 경쟁 분자로 된 반응용액을 소정의 시간 동안 반응하는 단계;
(f) 반응용액으로부터 분자결합핵산 복합체 풀을 분리하는 단계;
(g) 자유 핵산을 생성하기 위해 분자결합핵산 복합체 풀을 해리하는 단계; 및
(h) 증가된 친화력으로 다중의 분자 각각에 결합할 수 있는 분자결합핵산에서 높아진 친화력을 갖는 분자결합핵산의 혼합물을 수득하도록 자유 핵산을 증폭하되, 그것에 의해 다중의 분자 각각에 대한 분자결합핵산인지를 식별할 수 있는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1항 내지 제２항에 있어서,
상기 단일가닥핵산 라이브러리와 시료를 구성하는 분자에 접촉시켜 형성된 분자－ 분자결합핵산 복합체 풀을 분리 및 제조하는 방법은,
상기 시료를 구성하는 분자를 고체지지체에 고정시켜 상기 단일가닥핵산 라이브러리와 반응시켜 형성된 상기 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 선택하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제1항 내지 제２항에 있어서,
상기 단일가닥핵산 라이브러리와 시료를 구성하는 분자에 접촉시켜 형성된 분자－ 분자결합핵산 복합체 풀을 분리 및 제조하는 방법은,
상기 시료를 구성하는 분자와 상기 단일가닥핵산 라이브러리를 포함하는 반응용액을 모세관 전기영동하여 분자-단일가닥핵산 복합체 풀을 선택하거나, 상기 반응용액을 나이트로셀룰로스 및 나일론으로 이루어진 구조체에 처리하여 분자-분자결합핵산 복합체 풀을 선택하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제２항에 있어서,
상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리로부터 균등화 라이브러리 제작을 위해,
(a) 상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리를 주형으로 이중가닥 DNA를 제조하는 단계;
(b) 상기 이중가닥 DNA을 용액을 혼성화하는 단계;
(c) 효소를 이용하여 상기 이중가닥 DNA를 제거하는 단계; 및
(d) 남아있는 단일가닥 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법. - 제23항에 있어서,
상기 이중가닥 DNA 라이브러리 제조 단계는,
상기 RS 프라이머 쌍을 이용하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제２항에 있어서,
상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리로부터 감산화 라이브러리 제작을 위한,
(a) 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리를, 분석대상이 되는 분석시료에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리(분석시료-분자결합핵산 라이브러리)와, 상기 분석시료에 비교되는 비교시료에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리(비교시료-분자결합핵산 라이브러리)로 나누어 각각 제조하는 단계;
(b) 상기 분석시료-분자결합 단일가닥 DNA 라이브러리를 주형으로 표준 PCR 방법으로 이중가닥 DNA를 제조하고 상기 제조된 이중가닥 DNA를 주형으로 다시 One-way PCR 공정을 실행하여 단일가닥 테스터를 제조하는 단계;
(c) 상기 비교시료-분자결합 단일가닥 DNA 라이브러리를 주형으로 표준 PCR 공정으로 드라이버 이중가닥 DNA를 제조하는 단계; 및
(d) 상기 테스터와 상기 드라이버를 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥 및 비-결합된 단일가닥의 상기 드라이버를 효소를 이용하여 제거하고, 남아있는 상기 단일가닥 테스터를 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제25에 있어서,
상기 단일가닥 테스터 제조 단계는,
상기 분석시료-분자결합 단일가닥 DNA 라이브러리를 구성하는 분자결합 단일가닥 DNA를 주형으로 아댑터1과 5' 보존영역의 상보적인 염기사열과 상보적으로 결합하는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 3' 보존영역과 상보적 결합하는 염기서열과 아댑터2로 이루어진 역방향 프라이머를 이용하여 표준 PCR 공정으로 이중가닥 DNA를 제조하고 상기 제조된 이중가닥 DNA를 주형으로 다시 One-way PCR 공정하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제26항에 있어서,
상기 아댑터1과 아댑터2는 PCR 공정을 가능하게 하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제26항에 있어서,
상기 드라이버 이중가닥 DNA 제조 단계는,
상기 비교시료-분자결합 단일가닥 DNA 라이브러리를 구성하는 분자결합 단일가닥 DNA를 주형으로 DS 정방향 프라이머와 DS 역방향 프라이머를 이용하여 표준PCR 공정을 하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제２항에 있어서,
상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리로부터 균등화-감산화 라이브러리 제작을 위한,
상기 균등화 공정 및 상기 감산화 공정을 연속적으로 수행하여 균등화-감산화하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제２항에 있어서,
상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리로부터 SSH 라이브러리 제작을 위한,
(a) 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리를, 분석대상이 되는 분석시료에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리(분석시료-분자결합핵산 라이브러리)와, 상기 분석시료에 비교되는 비교시료에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리(비교시료-분자결합핵산 라이브러로 각각 나누어 제조하는 단계;
(b) 상기 분석시료-분자결합핵산 라이브러리로부터 주형으로 상기 테스터1과 테스터2를 제조하는 단계;
(c) 상기 비교시료-분자결합핵산 라이브러리를 주형으로 상기 이중가닥 DNA 드라이버를 제조하는 단계; 및
(d) 상기 일차 혼성화, 이차 혼성화 및 nested PCR 방법으로 SSH 공정을 실시하여 단일가닥핵산을 취득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제3０항에 있어서,
상기 테스터의 제조는,
(a) 상기 분자결합 RNA 라이브러리를 주형으로 제조된 cDNA 라이브러리 또는 상기 예비테스터를 주형으로 상기 SSH 정방향 프라이머_테스터1과 상기 DS 역방향 프라이머로 PCR 공정을 하여 상기 테스터1를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 분자결합 RNA 라이브러리를 주형으로 제조된 cDNA 라이브러리 또는 상기 예비테스터를 주형으로 상기 DS 정방향 프라이머와 SSH 역방향 프라이머_테스터2로 PCR 공정을 하여 상기 테스터2를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제3０항에 있어서,
상기 드라이버의 제조는,
상기 비교시료-분자결합 RNA 라이브러리를 구성하는 RNA를 주형으로 RS 역방향 프라이머로 역전사하여 제조된 cDNA 라이브러리를 제조하며 상기 제조된 cDNA 라이브러리를 주형으로 상기 RS 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 공정을 하여 이중가닥 DNA를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제3０항에 있어서,
상기 SSH 공정 단계는,
상기 테스터와 상기 드라이버를 일차 혼성화 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥과 비-결합된 단일가닥의 상기 드라이버를 PCR 공정으로 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제3０항에 있어서,
상기 테스터와 상기 드라이버의 반응은, 2회의 용액 혼성화 공정을 실행하는 것을 특징으로 하는, 분석적 분자결합핵산 선정 방법. - 제3０항에 있어서,
상기 테스터는 2개의 상기 테스터 혼성화 용액을 제조하고, 각각의 상기 테스터 혼성화 용액에 상기 드라이버 혼성화 용액을 혼합하여 1차 혼성화 공정을 실행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제3５항에 있어서,
미네랄 오일이 포함된 상기 드라이버 혼성화 용액을 DNA의 이중가닥 분리 온도로 가열한 후, 1차 혼성화한 2개의 상기 테스터 혼성화 용액 중에 하나를 상기 드라이버 혼성화 용액에 첨가하고, 이어서 나머지 하나의 1차 혼성화한 상기 테스터 혼성화 용액을 가하여 2차 혼성화 공정을 실행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제3６항에 있어서,
상기 2차 혼성화 공정이 종료된 후에, 형성된 코헨시브(cohensive) 말단인 이중가닥 DNA의 양쪽 말단을 블런트(blunt) 말단으로 전환시켜 네스트(nest) PCR 공정을 할 수 있는 DNA를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트.. - a) 상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 라이브러리에서 시퀀싱 라이브러리를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 시퀀싱 라이브러리를 차세대염기서열결정(NGS)로 염기서열을 분석하여 리드를 결정하는 단계;
(c) 상기 결정된 리드를 분석하여 상응하는 분자결합핵산을 결정하는 단계;
(d) 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리 또는 상기 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 출현빈도를 생성하는 단계; 및
(e) 상기 생성된 분자결합핵산들의 출현빈도를 사용하여 분석시료 또는 비교시료를 비교하거나 대표할 수 있는 분자결합핵산을 선정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제３８항에 있어서,
상기 생물학적으로 의미 있는 분자결합핵산을 선정하기 위한，
상기 분자결합핵산 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산들의 출현빈도를 사용하여 시료를 구성하는 분자와 분자결합핵산의 결합양태 정보를 종합화한 프로파일(양적인 상태를 종합화한 정보)을 제조하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제１항 내지 제２항에 있어서，
(a) 상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산들의 출현빈도를 기준으로 선정된 분자결합핵산들로 구성된 분자결합핵산 풀을 제조하고 상기 분자결합핵산들의 염기서열로 참조서열(reference sequences)를 구축하는 단계;
(b 상기 제조된 분자결합핵산 풀을 생물학적으로 의미있는 시료를 구성하는 분자들과 접촉시켜 시료를 구성하는 분자와 결합하는 분자결합핵산 복합체 풀(분자결합핵산 복합체 풀)을 제조하는 단계;
(c) 상기 제조된 분자결합핵산 복합체 풀로부터 시퀀싱 라이브러리를 제조하는 단계;
(d) 상기 제조된 시퀀싱 라이브러리로부터 염기서열을 분석하여 리드를 결정하는 단계;
(e) 상기 결정된 리드를 참조서열과 비교하여 분자결합핵산의 출현빈도를 결정하는 단계;
(f) 생물학적 의미있는 시료들에 대해 단계 (b)와 (e)를 반복하여 생물학적 의미를 중심으로 분자결합핵산 풀의 출현빈도에 대한 데이터베이스를 구축하는 단계; 및
(g) 상기 구축된 데이터베이스를 분석하여 생물학적 의미가 있는 분자결합핵산을 선정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제40항에 있어서,
(a) 분리된 상기 분자-분자결합핵산 복합체들로부터 취득한 상기 분자결합핵산 출현빈도로 결합 프로파일(양적인 상태를 종합화한 정보)을 획득하는 단계; 및
(b) 상기 획득한 프로파일과 이미 확보되어 있는 프로파일 데이터를 비교하여 상기 분자결합핵산들이 생물학적 의미의 분석에 기여하는 정도를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법. - 제41항에 있어서,
상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 라이브러리에서 선별된 분자결합핵산들로 구성된 분자결합핵산 풀과 시료를 구성하는 분자와 결합한 분자결합핵산 복합체 풀에서 제작된 시퀀싱 라이브러리의 염기서열분석 결과로 분자결합핵산 결합 프로파일을 생성하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 결합 프로파일 생성 방법. - 제41항에 있어서,
상기 제조된 분자결합핵산 일차 라이브러리, SSH 라이브러리, 균등화 라이브러리, 감산화 라이브러리 및 균등화-감산화 라이브러리로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 라이브러리에서 선별된 분자결합핵산들로 구성된 분자결합핵산 풀로부터 상기 시료에서 생물학적 의미의 분석에 기여하는 기준으로 선정되는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산. - 제40항에 있어서,
상기 생물학적 의미의 분석에 기여하는 기준은 질병이나 다른 상태를 진단, 치료, 완화, 처치, 예방을 목적으로 생물학적 의미에 관한 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정을 지원하는 “분류”, “점수”, “지수”를 의미하고, 생물학적 의미가 결정된 시료 또는 시료를 채취한 사람의 임상 정보(Clinical Information) 및 상기 생산된 다중의 분자 값들을 수집한 후, 통계학적 기법 또는 기계학습알고리즘을 이용하여 상기 수집한 정보들로부터 질환을 추론 또는 판별할 수 있도록 생산된 특이적 결과인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제44항에 있어서,
상기 생물학적 의미의 분석을 위한,
상기 하나 또는 그 이상의 분자에서 중요 변수를 찾아 차원을 축소하거나 특성의 변형을 통해 주요 분자들을 찾아내는 특징 선택(Feature Selection) 절차를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제45에 있어서,
(a) 상기 특징선택은 입력받은 학습 집단의 분자분석결과로 최대한 정확한 출력을 내도록 학습을 수행하여 특징 집합의 개개별 특징의 독립된 분자 값만으로 평가하는 필터(filter)방법;
(b) 특징선택과 분류기를 하나의 쌍으로 결합하여 특정 분류기의 분류 성능을 평가 척도로 사용하는 래퍼(wrapper)방법:
(c) 특징선택과 분류기 학습이 동시에 일어나는 임베디드(Embedded) 방법; 및
(d) 필터방법과 래퍼 방법을 혼합한 하이브리드 방법으로 이루어진 군에서 선택되어진 방법으로 결정되는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제46항에 있어서,
상기 필터방법은 정보이득(information gain), 신호 대 잡음비(signal to noise ratio), t-통계량, 피어슨 상관계수, 주성분 분석(principal component analysis)으로 이루어진 군에서 선택되어지는 하나로 이루어지고, 여기서 상기 선택된 분자 값으로부터 상기 임상검사 값의 결정은 다층신경망, k-최근접이웃, 결정나무(decsion tree), 지지벡터기계(support vector machines), 피셔의 선형판별식(Fisher's linear discriminant analysis)으로 이루어진 군에서 선택되어지는 하나로 이루어진 분류기로 수행되는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제46항에 있어서,
상기 래퍼방법은 유전자 알고리즘(genetic algorithm, GA)을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제40항에 있어서,
상기 생물학적 의미는 상기 시료 또는 시료를 채취한 사람의 생리적인 변화를 의미하고, 상기 임상검사 값에 상응하여 예방, 진단, 치료, 완화와 처치의 건강관리를 목적으로 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정에 필요한 정보로 이루어진 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제40항에 있어서,
상기 생물학적 의미 결정은 사용자의 상기 임상검사 값에 기초하며, 상기 임상검사 값은 상기 대조군과 비교군의 데이터베이스와의 유사도이며 대조군과 비교군을 구성하는 시료들의 임상정보를 기준으로 하여 생물학적 의미 결정을 하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 선정 방법 및 키트. - 제１항 내지 제２항에 있어서，
상기 선별된 분자결합핵산들과 상기 시료를 반응시켜 취득한 분자-분자결합핵산 복합체에 있는 분자결합핵산들의 정량분석 방법은 Q-PCR, MS 및 혼성화로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 분석 방법 및 키트. - 제51항에 있어서,
상기 Q-PCR 공정은 TaqMan PCR, PCR 동안의 삽입성 형광염료(intercalating fluorescent dye), 또는 PCR 동안의 분자 비콘(molecular beacon)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 분석 방법 및 키트. - 제51항에 있어서,
상기 혼성화 공정은 상기 분자결합핵산 또는 상기 분자결합핵산의 증폭산물이 포착프로브와 결합하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산 분석 방법 및 키트. - 제１항 내지 제２항에 있어서，
상기 선정된 분자결합핵산은 진단 또는 치료 목적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산. - 제54항에 있어서,
상기 진단 또는 치료 목적으로 사용되는 분자결합 핵산은 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자결합핵산. - 제55항에 있어서,
상기 적어도 하나의 화학적 변형은 리보오스 위치, 데옥시리보오스 위치, 포스페이트 위치 및 염기 위치로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서의 화학적 치환인 것을 특징으로 하는 분자결합핵산. - 제１항 내지 제２항에 있어서,
상기 분자결합핵산과 상기 시료를 구성하는 다중의 분자들을 반응시켜 형성된 분자-분자결합핵산 복합체에서 분리된 표적분자를 동정하는 것을 특징으로 하는 표적분자 동정 방법 및 키트. - 제５7항에 있어서,
(a) 상기 분자결합핵산을 고체지지체에 연결시켜 포획분자를 제조하는 단계；
(b) 상기 포획분자와 시료를 구성하는 분자들을 접촉시켜 표적분자－포획분자 복합체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제조된 복합체를 분리하여 표적분자를 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적분자 동정 방법 및 키트. - 제57항에 있어서,
상기 동정된 표적분자는 진단 또는 치료 목적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 표적분자 동정 방법 및 키트. - (a) 내부정도관리 및 정량 목적용 기준물질을 포함한 다중의 표적분자에 대한 기지의 압타머를 포함하는 분자결합핵산들로 구성된 분자결합핵산 풀을 제조하고 상기 분자결합핵산의 염기서열로 구성된 참조서열(reference sequences)를 구축하는 단계;
(b) 상기 제작된 분자결합핵산 풀을 시료를 구성하는 분자와 접촉시켜 상기 분자와 결합한 분자결합핵산 복합체 풀(분자－분자결합핵산 복합체 풀)을 제작하는 단계;
(c) 상기 제작된 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 세척하여 미결합 분자결합핵산 및 비특이적 결합을 한 분자결합핵산을 제거하고 상기 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 분리하는 단계;
(d) 상기 분리한 분자－분자결합핵산 복합체 풀에서 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계;
(e) 상기 제작된 시퀀싱 라이브러리의 염기서열을 분석하여 결정된 리드의 출현빈도를 분석하는 단계;
(f) 상기 결정된 리드를 상기 참조서열과 비교 분석하여 리드에 상응하는 상기 분자결합핵산의 출현빈도를 결정하는 단계; 및
(g) 상기 기준물질을 포함하는 다중의 표적분자에 상응하는 분자결합핵산의 출현빈도를 사용하여 상기 다중의 표적분자를 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60항에 있어서，
상기 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 제조하기 위한,
상기 분자결합핵산 풀을 시료를 구성하는 분자와 접촉하면서, 반응의 이전이나 평형 상태에서 상기 분자를 희석하거나 상기 분자의 경쟁분자를 첨가함으로써, 상기 분자와 상기 분자결합핵산 풀을 구성하는 분자결합핵산의 결합 친화력과 특이성을 증가시키고 비특이적 결합을 감소시키면서, 상기 시료를 구성하는 분자와 상기 분자결합핵산 풀을 접촉시키는 과정을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제61항에 있어서,
상기 경쟁분자는 올리고뉴클레오티드, 다중음이온, 비염기성 포스포디에스테르 폴리머, dNTP 및 피로포스페이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 경쟁분자인 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제62항에 있어서,
상기 다중음이온은, 헤파린, 청어 정액 DNA, 연어 정자 DNA, 덱스트란 설페이트 및 폴리덱스트란으로부터 선택되는 다중음이온인 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60에 있어서，
상기 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 세척하고 분리하기 위한,
상기 분석하고자하는 시료를 구성하는 분자들을 고체지지체에 고정시키고, 상기 시료를 구성하는 분자와 상기 단일가닥핵산 라이브러리를 포함하는 반응용액을 모세관 전기영동하며, 상기 반응용액을 나이트로셀룰로스 및 나일론으로 이루어진 구조체에 처리하는 방법으로 이루어진 군에서 어느 한 방법으로 상기 분자－분자결합핵산 복합체 풀을 선택하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60항에 있어서，
(a) 상기 분리된 분자-분자결합핵산 복합체들로부터 취득한 상기 분자결합핵산 출현빈도로 결합 프로파일(양적인 상태를 종합화한 정보)을 획득하는 단계; 및
(b) 상기 획득한 프로파일과 이미 확보되어 있는 프로파일 데이터를 비교하여 상기 분자결합핵산들이 생물학적 의미의 분석에 기여하는 정도를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60항에 있어서,
상기 기지 압타머를 포함하고 선별된 분자결합핵산들로 구성된 분자결합핵산 풀과 시료를 구성하는 분자와 결합한 분자결합핵산 복합체 풀에서 제작된 시퀀싱 라이브러리의 염기서열분석 결과로 분자결합핵산 결합 프로파일을 생성하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60항에 있어서,
상기 기지 압타머를 포함하고 선별된 분자결합핵산들로 구성된 분자결합핵산 풀과 시료를 구성하는 다중의 분자들이 접촉하여 형성된 분자－분자결합핵산 풀을 구성하는 분자결합핵산의 출현빈도를 분석하여 상기 시료에서 생물학적 의미의 분석에 기여하는 기준으로 분자결합핵산을 선정하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제67항에 있어서,
상기 생물학적 의미의 분석에 기여하는 기준은 질병이나 다른 상태를 진단, 치료, 완화, 처치, 예방을 목적으로 생물학적 의미에 관한 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정을 지원하는 “분류”, “점수”, “지수”를 의미하고, 생물학적 의미가 결정된 시료 또는 시료를 채취한 사람의 임상 정보(Clinical Information) 및 상기 생산된 하나 또는 그 이상의 분자 값들을 수집한 후, 통계학적 기법 또는 기계학습알고리즘을 이용하여 상기 수집한 정보들로부터 질환을 추론 또는 판별할 수 있도록 생산된 특이적 결과인 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제68항에 있어서,
상기 생물학적 의미의 분석을 위한,
상기 하나 또는 그 이상의 분자에서 중요 변수를 찾아 차원을 축소하거나 특성의 변형을 통해 주요 분자들을 찾아내는 특징 선택(Feature Selection) 절차를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제69에 있어서,
(a) 상기 특징선택은 입력받은 학습 집단의 분자분석결과로 최대한 정확한 출력을 내도록 학습을 수행하여 특징 집합의 개개별 특징의 독립된 분자 값만으로 평가하는 필터(filter)방법;
(b) 특징선택과 분류기를 하나의 쌍으로 결합하여 특정 분류기의 분류 성능을 평가 척도로 사용하는 래퍼(wrapper)방법:
(c) 특징선택과 분류기 학습이 동시에 일어나는 임베디드(Embedded) 방법; 및
(d) 필터방법과 래퍼 방법을 혼합한 하이브리드 방법으로 이루어진 군에서 선택되어진 방법으로 결정되는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제70항에 있어서,
상기 필터방법은 정보이득(information gain), 신호 대 잡음비(signal to noise ratio), t-통계량, 피어슨 상관계수, 주성분 분석(principal component analysis)으로 이루어진 군에서 선택되어지는 하나로 이루어지고, 여기서 상기 선택된 분자 값으로부터 상기 임상검사 값의 결정은 다층신경망, k-최근접이웃, 결정나무(decsion tree), 지지벡터기계(support vector machines), 피셔의 선형판별식(Fisher's linear discriminant analysis)으로 이루어진 군에서 선택되어지는 하나로 이루어진 분류기로 수행되는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제70항에 있어서,
상기 래퍼방법은 유전자 알고리즘(genetic algorithm, GA)을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60항에 있어서,
상기 생물학적 의미는 상기 시료 또는 시료를 채취한 사람의 생리적인 변화를 의미하고, 상기 임상검사 값에 상응하여 예방, 진단, 치료, 완화와 처치의 건강관리를 목적으로 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정에 필요한 정보로 이루어진 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60항에 있어서,
상기 생물학적 의미 결정은 사용자의 상기 임상검사 값에 기초하며, 상기 임상검사 값은 상기 대조군과 비교군의 데이터베이스와의 유사도이며 대조군과 비교군을 구성하는 시료들의 임상정보를 기준으로 하여 생물학적 의미 결정을 하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 제60항에 있어서,
상기 분자결합핵산들과 상기 시료를 반응시켜 취득한 분자-분자결합핵산 복합체에 있는 상기 분자결합핵산을 정량함으로써 하기 표적분자를 정량하는 것을 특징으로 하는 표적분자 분석 방법 및 키트. - 기지 압타머를 포함한 분자결합핵산들과 차세대염기서열분석 기술을 사용하여 시료를 구성하는 단백질 및 핵산을 동시에 분석하여 단백질 정보 및 핵산정보를 생산 및 분석하는 것을 특징으로 하는 생체시료 분석 방법 및 키트.
- 제76항에 있어서,
(a) 분석하고자하는 핵산들의 염기서열과 분석하고자하는 분자들의 기지 압타머를 포함하는 분자결합핵산의 염기서열로 참조서열（reference sequences)를 구축하는 단계;
(b) 생체시료를 분획하는 단계;
(c) 상기 분획된 생체시료를 구성하는 분자를 압타머를 포함하는 분자결합핵산 풀과 접촉시키고 형성된 분자－분자결합핵산 복합체 풀를 분리하는 단계;
(d) 상기 분획된 생체시료에서 분리한 핵산 시료와 상기 분리한 분자－분자결합핵산 복합체 풀로부터 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계;
(e) 상기 제작된 시퀀싱 라이브러리를 구성하는 핵산의 염기서열을 상기 참조서열을 비교분석하여 출현빈도를 결정하는 단계; 및
(f) 상기 결정된 시퀀스 라이브러리를 구성하는 핵산의 출현빈도를 사용하여 핵산시료의 핵산과 생체시료를 구성하는 분자를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체시료 분석 방법 및 키트. - 제76항에 있어서,
핵산정보는 mRNA 와 miRNA를 포함하는 RNA정보와 유전자의 구조적 변이,메칠화, SNP를 포함하는 DNA정보를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체시료 분석 방법 및 키트.
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2016
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