KR20180034752A - 천연 보존제 및 선도 유지제 기능을 가지는 동충하초의 배양방법, 그에 의한 동충하초 추출물 및 그에 의한 천연복합물 - Google Patents
천연 보존제 및 선도 유지제 기능을 가지는 동충하초의 배양방법, 그에 의한 동충하초 추출물 및 그에 의한 천연복합물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 따른 동충하초 배양 방법은 액체 배지, 고형 배지 또는 충체에 코디셉스 밀리타리스 또는 코디셉스 누탄스균을 접종하여 균사체를 얻는 단계; 및 상기 얻어진 균사체를 고형 배지 또는 충체에서 배양하여 자실체를 형성시키는 단계를 포함하고, 상기 자실체를 형성하는 고형 배지는 옥수수와 액체 배지로 이루어지거나, 쌀, 누에고치 번데기 및 액체 배지로 이루어지고, 수분 함량 50 내지 70 %, 상대습도 80 내지 95 %, 분위기 온도 15 내지 25 ℃ 및 광도 700 내지 1200 럭스가 되고, 상기 균사체를 얻는 액체 배지는 MgSO₄·7H₂O, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 효모 추출물, 펩톤 및 덱스트로오스로 이루어지거나 또는 효모 추출물, 덱스트로오스, 에비오스 및 하이포넥스로 이루어지는 것을 특징으로 하고, 상기 균사체를 얻는 고형 배지는 쌀, 감자, 옥수수 및 누에고치 번데기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 및 액체 배지로 이루어진다.
Description
본 발명은 천연 보존제 및 선도 유지제 기능을 가지는 동충하초의 배양 방법, 그에 의한 동충하초 추출물 및 그에 의한 천연 복합물에 관한 것이고, 구체적으로 배지에서 동충하초를 배양하고, 배지의 동충하초 추출물의 코디세핀 효율을 높이고자 발효가 되거나, 녹차, 마늘, 코코넛, 포도 또는 이와 유사한 천연물을 혼합하여 추출하거나, 천연항균 보존 또는 선도유지를 위하여 천연고분자를 첨가한 동충하초 추출물 또는 동충하초 복합물에 관한 것이다.
장시간 동안 병원성 미생물의 발생을 억제하여 저장 또는 보관하기 위하여 가열, 초고압, 방사선 또는 광 펄스에 의하여 물리적으로 처리되거나, 안식향산(benzoic acid), 솔빈산(sorbic acid), 염소제제, 아질산염 또는 아황산나트륨과 같은 합성보존제가 식품에 첨가될 수 있다. 그러나 이와 같은 물리적 처리 또는 합성보존제의 첨가는 식품의 영양 성분의 파괴 또는 체내 축척에 따른 부작용과 같은 문제를 발생시킬 수 있다. 이로 인하여 인공 합성보존제의 사용이 점차로 제한되고 이를 대체하기 위한 다양한 천연 항균성 물질을 이용하는 연구가 집중적으로 이루어지고 있다. 예를 들어 소금, 식초, 식물 추출 단백질, 니신(nisin), 이-폴리라이신(e-polylysine), 나타마이신(natamycin), 키토산 또는 유기산과 같은 물질이 천연 항균 보존제로 사용될 수 있다. 그러나 이와 같은 맛, 냄새 또는 자극성을 가지거나 항균성이 약하거나 항균 범위가 좁다는 문제점을 가진다.
일본특허공개번호 제2004-242507A호는 탄소 공급원으로 쌀 또는 옥수수를 함유하고, 질소 공급원으로 펩톤, 이스트, 몰트 및 밀크로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 및 아스파라긴, 아스파라긴산 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 및 비오틴 또는 비타민 B 종류를 포함하고, 코디세핀의 함유량의 증가되도록 하는 자낭균류 버섯을 위한 배양지에 대하여 개시한다.
국제공개번호 WO 제2012-108557호는 도정된 쌀과 해양 심층수 혼합물을 혼합하여 식물성 탄소섬유가 내부에 포함된 멸균 용기에 담는 혼합 단계; 상기 혼합 단계 후 121 ℃, 10~30 분 조건으로 멸균하는 멸균 단계; 상기 멸균 단계 후 자연 냉각 방식으로 내용물 온도가 20~25 ℃로 유지하는 냉각 단계; 상기 냉각 단계 후 무균 상태에서 PDA 배지에서 10~15일 동안 배양된 동충하초 균을 내용물 500 g 대비 20 %(W/v) 접종하는 접종 단계; 상기 접종하는 단계 후 암실 습도 70 % 이상, 온도 20~25 ℃의 조건 하에서 2~8일간 배양하는 암실 배양 단계; 상기 암실 배양 단계 후 습도 70 % 이상, 온도 20~25 ℃의 조건 하에서 10일간 LED 램프를 이용하여 1000 Lux 이상의 조도 하에서 내용물의 희석이 이루어지도록 1일 2회 흔들어주며 빛을 쪼이는 명실 배양 단계; 및 상기 명실 배양 단계 후 50~70 ℃에서 15~30시간 건조하는 건조 단계를 포함하는 코디세핀 성분이 다량 함유된 기능성 쌀 생산방법에 대하여 개시한다.
상기 선행기술에서 개시된 배지 또는 쌀 생산방법은 천연 항균 보존제 또는 선도 유지제의 기능을 가지도록 식품, 과일 또는 야채에 직접 처리되기 어렵다는 단점을 가진다. 그러므로 효율향상을 위한 발효기술을 접목하고 녹차, 마늘, 코코넛, 포도 등을 혼합하여 추출하거나 천연항균 보존 또는 선도유지를 위하여 천연고분자를 첨가한 천연 보존제 또는 선도 유지제로 직접 사용될 수 있는 코디세핀 추출물이 개발될 필요가 있다. 그러나 상기 선행기술은 이와 같은 방법에 대하여 개시하지 않는다.
본 발명은 선행기술이 가진 문제점을 해결하기 위한 것으로 아래와 같은 목적을 가진다.
본 발명의 목적은 배지에서 균사체 또는 자실체 형태로 천연 보존제 및 선도 유지제 기능을 가지는 동충하초를 인공적으로 배양하는 동충하초 배양 방법 및 그에 의한 동충하초 코디세핀 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 공지의 동물성 유충 또는 번데기를 기주로 하는 식물성 현미배양을 통한 동충하초를 개발하고, 현미배양 추출물에서 발생하는 항균 및 항산화 활성, 혈당강하작용 및 면역세포 탐식능 강화작용, 항암 및 스트레스 억제, 피로회복 및 간 보호 작용, 천식에 대한 작용, 방사선 방호 효과와 같은 다양한 기능성이 알려진 코디세핀(cordycepin)의 발현 수준을 높이기 위하여 유산균 현미 동충하초 발효, 동충하초에 한약재 및 식품의 병용을 통하여 동충하초 추출물의 효과를 높이면서 이와 동시에 신선도의 유지 능력과 보존 능력이 향상된 동충하초 추출물 및 그에 의한 천연복합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 실시 예에 따르면, 동충하초의 배양 방법은 액체 배지, 고형 배지 또는 충체에 코디셉스 밀리타리스 또는 코디셉스 누탄스균을 접종하여 균사체를 얻는 단계; 및 상기 얻어진 균사체를 고형 배지 또는 충체에서 배양하여 자실체를 형성시키는 단계를 포함하고, 상기 자실체를 형성하는 고형 배지는 옥수수와 액체 배지로 이루어지거나, 쌀, 누에고치 번데기 및 액체 배지로 이루어지고, 수분 함량 50 내지 70 %, 상대습도 80 내지 95 %, 분위기 온도 15 내지 25 ℃ 및 광도 700 내지 1200 럭스가 되고, 상기 균사체를 얻는 액체 배지는 MgSO₄·7H₂O, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 효모 추출물, 펩톤 및 덱스트로오스로 이루어지거나 또는 효모 추출물, 덱스트로오스, 에비오스 및 하이포넥스로 이루어지는 것을 특징으로 하고 상기 균사체를 얻는 고형 배지는 쌀, 감자, 옥수수 및 누에고치 번데기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 및 액체 배지로 이루어진다.
본 발명의 다른 실시 예에 따르면, 상기 균사체 또는 자실체로부터 얻어진 추출물이 유산균에 의하여 발효가 되는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 예에 따르면, 동충하초 천연 복합물은 액체 배지, 고형 배지 또는 충체에서 배양된 균사체 또는 자실체로부터 추출되고, 2.0 내지 8.0 wt%의 수분, 2.0 내지 3.5 wt%의 조지방, 30 내지 50 wt%의 조단백, 5.0 내지 8.0 wt%의 조회분과 같은 추출 성분; 및 셀룰로오즈, 펙틴, 카리기난, 녹말, 단백질, 효소 또는 키토산을 포함하는 첨가물로 이루어고, 선도 유지 또는 천연 항균 보존을 위하여 과채류에 살포되거나 또는 식품에 첨가된다.
본 발명의 또 다른 실시 예에 따르면, 동충하초 천연 복합물은 동충하초로부터 추출되고, 2.0 내지 8.0 wt%의 수분, 2.0 내지 3.5 wt%의 조지방, 30 내지 50 wt%의 조단백, 5.0 내지 8.0 wt%의 조회분을 포함하는 기초재; 및 항균 효과를 높이기 위한 녹차, 마늘, 코코넛, 포도 또는 한약재와 같은 첨가제를 포함한다.
본 발명에 따른 발효 배양 방법에 따라 배양된 동충하초의 균사체 또는 자실체의 코디세핀 추출물은 큰 항균성을 가지면서 앞서 언급한 동충하초 코디세핀 추출물과 녹차, 마늘, 코코넛, 포도를 혼합하여 사용하면 항균 범위가 넓은 천연 항균 보존제로 사용될 수 있다. 또한 추출된 코디세핀 추출물은 과채류의 저장 유통 과정에서 발생되는 갈변과 부패의 억제를 위한 선도 유지제로 사용될 수 있다. 또한 천연고분자로서 셀룰로오즈, 펙틴, 카리기난, 녹말, 단백질, 효소, 키토산 등의 보조 첨가물을 첨가하면 보다 선도유지 시간이 더 유지할 수 있다. 이로 인하여 공지의 보존 또는 선도 유지를 위하여 사용되는 물리 처리 또는 인공 합성 보존제를 대체할 수 있도록 한다. 또한 발효방법으로 추출된 코디세핀 추출물은 햄버거, 어묵 또는 냉장면과 같은 음식에 적용될 수 있고, 식품 자체의 pH에 영향을 미치지 않으면서 독성을 가지지 않는다. 이와 같은 본 발명에 따른 코디세핀 추출물은 높은 안정성 및 관능 특성을 가진다.
본 발명에 따른 배양 방법은 기존의 동물성 유충 또는 번데기를 기주로 한 식물성 현미배양을 통한 동충하초를 개발하고 현미배양 추출물에서 발생하는 항균 및 항산화 활성, 혈당강하작용 및 면역세포 탐식능 강화작용, 항암 및 스트레스 억제, 피로회복 및 간 보호 작용, 천식에 대한 작용, 방사선 방호 효과 등 다양한 기능성이 알려진 코디세핀(cordycepin)의 발현 수준이 향상되도록 한다. 이와 같은 효과는 유산균 현미 동충하초 발효에 의하여 이루어지고, 또한 본 발명에 따른 추출물 또는 복합물은 한약재 및 식품의 병용을 통해 식품의 신선도 유지 능력과 보존 능력이 높아지도록 한다. 추가로 본 발명에 따른 추출물 또는 복합물은 녹차, 마늘, 코코넛 또는 포도와 같은 천연물의 첨가에 의하여 우수한 항균 병용 효과가 나타나도록 하고, 이에 의하여 유산균 발효 동충하초 복합추출물은 유황 처리의 대체가 가하도록 한다. 또한 유산균 발효 동충하초 복합추출물의 경우 관능 평가 시 참여 인원의 80 % 이상이 무 처리구와 차이를 느끼지 못하거나 단독 섭취의 경우 느끼지 않는 것으로 확인되어 천연 보존제로서의 효능이 있다는 것을 알 수 있고, 이와 함께 신선도의 유지에 효과가 있다.
도 1a 내지 1i는 본 발명에 따른 추출물의 항균 보존제의 효능 시험의 결과를 나타낸 것이다. 도 1a 내지 도 1i에서 대조군(control)은 천연에서 생산되는 동충하초 추출물로부터 제조된 항균 보존제가 되고, 저장 시간(storage time)은 일 단위(day)가 되고, A, B 및 C는 각각 햄버거, 어묵 또는 냉장면을 나타낸다.
도 2a 내지 2c는 본 발명에 따른 추출물의 처리에 따른 pH 영향의 결과를 나타낸 것이다. 도 2a 내지 도 2c에서 대조군(control)은 천연에서 생산되는 동충하초 추출물로부터 제조된 항균 보존제가 되고, 저장 시간(storage time)은 일 단위(day)가 되고, A, B 및 C는 각각 햄버거, 어묵 또는 냉장면을 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 본 발명에 따른 추출물의 처리에 따른 산도 변화 결과를 나타낸 것이다. 도 3a 내지 도 3c에서 대조군(control)은 천연에서 생산되는 동충하초 추출물로부터 제조된 항균 보존제가 되고, 저장 시간(storage time)은 일 단위(day)가 되고, A, B 및 C는 각각 햄버거, 어묵 또는 냉장면을 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 본 발명에 따른 추출물의 처리에 따른 관능검사의 경과를 나타낸 것이다. 도 4a에서 도 4c에서 대조군은 대조군(control)은 천연에서 생산되는 동충하초 추출물로부터 제조된 항균 보존제가 되고, 저장 시간(storage time)은 일 단위(day)가 되고, 저장 기간 0, 1, 2, 3 및 4일 및 12 ℃의 온도에서 시험된 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5d는 본 발명에 따른 추출물의 독성 시험 결과를 나타낸 것으로,도 5a 도 5b는 각각 A375 세포 및 HaCat 셀에 대하여 1 %의 농도로 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c 및 도 7a 내지 7e는 본 발명에 따른 추출물의 선도 유지제의 효능 시험의 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 0, 24 및 72 시간에 대한 수분 증발 억제력의 평가 결과를 나타낸 것으로 무처리, 상업적으로 이용 가능한 코팅제 및 본 발명에 따른 처리 결과를 나타낸 것이다. 도 7a 및 7c는 각각 분리균 접종 후 5일, 10일 및 20일 경과 후 결과를 나타낸 것이고, 도 7d 및 도 7e는 1 내지 6일 및 16 내지 22일 경과 후 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명에 따른 추출물의 처리에 따른 pH 영향의 결과를 나타낸 것이다. 도 2a 내지 도 2c에서 대조군(control)은 천연에서 생산되는 동충하초 추출물로부터 제조된 항균 보존제가 되고, 저장 시간(storage time)은 일 단위(day)가 되고, A, B 및 C는 각각 햄버거, 어묵 또는 냉장면을 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 본 발명에 따른 추출물의 처리에 따른 산도 변화 결과를 나타낸 것이다. 도 3a 내지 도 3c에서 대조군(control)은 천연에서 생산되는 동충하초 추출물로부터 제조된 항균 보존제가 되고, 저장 시간(storage time)은 일 단위(day)가 되고, A, B 및 C는 각각 햄버거, 어묵 또는 냉장면을 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 본 발명에 따른 추출물의 처리에 따른 관능검사의 경과를 나타낸 것이다. 도 4a에서 도 4c에서 대조군은 대조군(control)은 천연에서 생산되는 동충하초 추출물로부터 제조된 항균 보존제가 되고, 저장 시간(storage time)은 일 단위(day)가 되고, 저장 기간 0, 1, 2, 3 및 4일 및 12 ℃의 온도에서 시험된 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5d는 본 발명에 따른 추출물의 독성 시험 결과를 나타낸 것으로,도 5a 도 5b는 각각 A375 세포 및 HaCat 셀에 대하여 1 %의 농도로 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c 및 도 7a 내지 7e는 본 발명에 따른 추출물의 선도 유지제의 효능 시험의 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 0, 24 및 72 시간에 대한 수분 증발 억제력의 평가 결과를 나타낸 것으로 무처리, 상업적으로 이용 가능한 코팅제 및 본 발명에 따른 처리 결과를 나타낸 것이다. 도 7a 및 7c는 각각 분리균 접종 후 5일, 10일 및 20일 경과 후 결과를 나타낸 것이고, 도 7d 및 도 7e는 1 내지 6일 및 16 내지 22일 경과 후 결과를 나타낸 것이다.
아래에서 본 발명은 첨부된 도면에 제시된 실시 예를 참조하여 상세하게 설명이 되지만 실시 예는 본 발명의 명확한 이해를 위한 것으로 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 아래의 설명에서 서로 다른 도면에서 동일한 도면 부호를 가지는 구성요소는 유사한 기능을 가지므로 발명의 이해를 위하여 필요하지 않는다면 반복하여 설명이 되지 않으며 공지의 구성요소는 간략하게 설명이 되거나 생략이 되지만 본 발명의 실시 예에서 제외되는 것으로 이해되지 않아야 한다.
본 발명에 따른 동충하초의 배양 방법은 액체 배지, 고형 배지 또는 충체에 코디셉스 밀리타리스 또는 코디셉스 누탄스균을 접종하여 균사체를 얻는 단계; 및 상기 얻어진 균사체를 고형 배지 또는 충체에서 배양하여 자실체를 형성시키는 단계를 포함하고, 상기 자실체를 형성하는 고형 배지는 옥수수와 액체 배지로 이루어지거나, 쌀, 누에고치 번데기 및 액체 배지로 이루어지고, 수분 함량 50 내지 70 %, 상대습도 80 내지 95 %, 분위기 온도 15 내지 25 ℃ 및 광도 700 내지 1200 럭스가 된다.
배지에서 배양된 동충하초는 균사체 또는 자실체 형태가 되고, 균사체 또는 자실체는 배지로부터 분리될 수 있다. 그리고 분리된 동충하초의 균사체 또는 자실체로부터 유효 성분이 추출될 수 있다. 위와 같이 발효공정을 통해 얻어진 균사체 또는 자실체 추출물은 식품, 의약품, 화장품, 섬유 또는 생활 용품에 첨가되어 항균, 보존, 선도 유지 또는 항산화 기능이 나타나도록 할 수 있다. 배지에서 배양된 동충하초의 균사체 또는 자실체는 천연 동충하초와 동일한 성분을 포함하고 있고, 항균 보존 또는 선도 유지를 위하여 필요한 코디세핀 성분을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과에 따라 추출된 발효 동충하초 코디세핀 추출물은 천연 동충하초의 코디세핀 추출물과 동등하거나 그 이상의 유효 성분을 포함하고 이로 인하여 합성 보존제를 대체할 수 있는 것으로 나타났다.
아래에서 구체적으로 설명된다.
1. 균사체의 배양
균사체는 액체 배지, 고체 배지 또는 충체에서 배양되어 얻어질 수 있고, 액체 배지, 고체 배지 또는 충체를 위한 배지는 다양한 방법으로 만들어질 수 있다.
가. 액체 배지에서 균사체 배양
코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 또는 코디셉스 누탄스균(Cordyceps nutans)을 분리하여 7 종의 액체배지 20 ㎖에 접종하여 배양 온도 24~25 ℃, 통기량 1.0±0.5vvm, pH 5±0.5vvm, 7 일 동안 배양하여 배양액으로부터 균사를 여과하여 80 ℃에서 2 시간 동안 건조하여 건조 균사체를 획득하였다.
| 배지 | 배지1 | 배지2 | 배지3 | 배지4 | 배지5 | 배지6 | 배지7 |
| 슈가 | 2 | 1 | 2 | ||||
| 맥아추출물 | 2 | 0.3 | |||||
| 감자 | 20 | 20 | |||||
| 효모추출물 | 0.2 | 0.3 | |||||
| 펩톤 | 0.2 | 0.5 | |||||
| MgSO₄·7H₂O | 0.05 | 0.015 | 0.05 | ||||
| KH₂PO₄ | 0.046 | 0.015 | 0.1 | ||||
| K₂HPO₄ | 0.1 | ||||||
| 덱스트로오스 | 2 | 1 | 2 | ||||
| CaCl₂ | 0.005 | ||||||
| NaCl | 0.00025 | ||||||
| FeCl₃(1%)(㎖) | 0.12 | ||||||
| 티아민-HCl | 0.000001 | ||||||
| 에비오스 | 0.5 | 0.5 | |||||
| 하이포넥스 | 0.3 | ||||||
| 물 | 100㎖ | 100㎖ | 100㎖ | 100㎖ | 100㎖ | 100㎖ | 100㎖ |
<균사체 배양을 위한 액체 배지 성분(단위: g)>
각각의 배지에서 배양된 건조 균사체의 양은 아래와 같다.
| 배지 | 코디셉스 밀리타리스 (C. militaris) |
코디셉스 누탄스 (C. nutans) |
| 배지1 | 0.196 | 0.198 |
| 배지2 | 0.134 | 0.128 |
| 배지3 | 0.262 | 0.262 |
| 배지4 | 0.092 | 0.102 |
| 배지5 | 0.164 | 0.172 |
| 배지6 | 0.560 | 0.342 |
| 배지7 | 0.120 | 0.230 |
<액체 배지 배양된 건조 균사체(g/20 ㎖)>
나. 고형 배지에서 발효 균사체 배양
고형 배지에서 충체에서 균사체는 액체 배지에서 배양된 균사체로부터 얻어질 수 있고, 예를 들어 액체 배지 3과 같은 배지에서 배양된 균사체가 고형 배지에 고루 접종되어 균사체가 얻어질 수 있다. 고형 배지는 70 내지 90 %의 습도, 20 내지 30 ℃의 온도로 유지될 수 있고, 25 내지 40일 동안 배양될 수 있다.
| 고형배지조성 |
| 쌀 5g + 액체배지 50㎖ |
| 감자 5g + 액체배지 50㎖ |
| 옥수수 5g + 액체배지 50㎖ |
| 쌀 5g + 옥수수 5g + 액체배지 50㎖ |
| 쌀 50g + 누에고치 번데기 5g + 액체배지 75㎖ |
<균사체 배양을 위한 고형 배지 조성>
다. 충체에서 균사체 배양
충체에서 균사체 배양은 고형 배지에서 균사체 배양과 동일 또는 유사한 조건에서 이루어질 수 있다.
| 충체배지조성 |
| 누에고치 번데기 20g + 멸균수 100㎖ |
| 누에고치 번데기 20g |
| 누에고치 번데기 20g + 한천수 20㎖ |
<균사체 배양을 위한 충체 배지 조성>
액체 배지, 고형 배지 및 충체 배지에서 균사체의 배양 상태를 확인하였고, 고형 배지에서 균사체 배양 결과는 완전히 분리가 어려워 육안으로 관찰하여 배지 면적당 균사체 생육 면적비를 측정하였다.
| 고형배지 | 균사체 성장 |
| 쌀 5g + 액체배지 50㎖ | + |
| 감자 5g + 액체배지 50㎖ | ++ |
| 옥수수 5g +액체배지 50㎖ | +++ |
| 쌀 5g + 옥수수 5g +액체배지 50㎖ | +++ |
| 쌀 50g + 누에고치 번데기 5g + 액체배지 75㎖ | +++ |
<고형 배지에서 배양된 동충하초 균사체>
| 충체배지 | 균사체 성장 |
| 누에 고치 번데기 20g + 멸균수 100㎖ | +++ |
| 누에 고치 번데기 20g | ++ |
| 누에 고치 번데기 20g + 한천수 20㎖ | +++ |
<충체에서 배양된 동충하초 균사체>
+ : 10 내지 30 %의 균사 형성
++ : 30 내지 70 %의 균사 형성
+++ : 70 % 이상 균사 형성
표 3 내지 6으로부터 알 수 있는 것처럼, 균사체는 옥수수 5g에 액체배지 50㎖을 넣은 고형배지에서 가장 양호하게 배양되었고, 쌀 5g + 옥수수 5g + 액체배지 50㎖로 만들어진 고형배지에서 양호한 생장을 보인다는 것을 알 수 있다. 또한 충체 배지의 경우 균사체 성장은 누에고치 번데기 20g와 멸균수 100㎖를 첨가한 경우에 가장 양호하게 성장된다는 것을 알 수 있다.
2. 발효에 의한 자실체 배양
가. 고형 배지에서 자실체 형성
고형 배지에서 배양된 균사체로부터 자실체가 배양되었고, 자실체는 고형 배지에서 형성되었다. 자실체를 위하여 고형 배지는 50 내지 70 %의 수분 함량, 80 내지 95 %의 상대 습도 및 15 내지 25 ℃ 분위기 온도로 유지되었고, 800 내지 1500 럭스의 광도로 60 내지 90일 동안 균사체가 배양되어 자실체로 만들어졌다.
| 고형배지 | 균사체 형성 |
| 쌀 5g + 액체배지 50㎖ | + |
| 감자 5g + 액체배지 50㎖ | ++ |
| 옥수수 5g + 액체배지 50㎖ | +++ |
| 쌀 5g + 옥수수 5g + 액체배지 50㎖ | +++ |
| 쌀 50g + 누에고치 번데기 5g + 액체배지 75㎖ | +++ |
+ : 10 내지 30 %의 자실체 형성
++ : 30 내지 70 %의 자실체 형성
+++ : 70 % 이상 자실체 형성
고형 배지에 배양된 자실체는 고형 배지로부터 분리가 어려워 자실체를 육안으로 관찰하여 배지 면적당 자실체의 형성 면적비를 측정하여 자실체의 형성 수준을 측정하였다.
나. 충체에서 자실체 형성
고형 배지에서 배양된 균사체를 충체에 고루 접종하여 자실체를 형성하였고, 충체에서 자실체의 배양 조건의 고형 배지에서 자실체의 배양 조건과 동일하게 유지되었다.
| 충체배지 | 균사체 성장 |
| 누에 고치 번데기 20g + 멸균수100㎖ | +++ |
| 누에 고치 번데기 20g | ++ |
| 누에 고치 번데기 20g + 한천수20㎖ | +++ |
<충체에서 배양된 동충하초 자실체 >
+ : 10 내지 30 %의 자실체 형성
++ : 30 내지 70 %의 자실체 형성
+++ : 70 % 이상 자실체 형성
표 7 및 8로부터 알 수 있는 것처럼, 자실체는 쌀 50g + 누에고치 번데기 5g + 액체배지 75㎖을 혼합한 고형배지에서 가장 양호하였고, 쌀 5g + 옥수수 5g +액체배지 50㎖을 혼합한 고형배지, 쌀 5g + 액체배지 50㎖을 첨가한 고형배지, 감자 5g에 액체배지 50㎖을 첨가한 고형배지 순으로 배양이 양호한 것으로 나타났다. 충체 배지를 이용하여 자실체를 형성시키는 경우 누에고치 번데기 20g와 한천수 20㎖을 첨가한 고형배지에서 가장 양호한 배양 상태를 나타내는 것을 알 수 있다.
3. 균사체 및 자실체의 성분 분석
액체 배지, 고체 배지 또는 충체에서 발효 배양된 균사체 또는 자실체의 성분을 분석하였다. 액체 배지에서 배양된 균사체는 여과가 되어 동결 건조가 되었고, 자실체가 획득되어 동결 건조가 되었다. 이후 수거된 균사체 및 자실체가 각각 식품 공전에 명시된 미크로-켈달(Micro-Kjeldhl)을 이용한 조단백 측정법 및 속슬렛(Soxhlet) 추출법에 의한 조지방 측정법, 강열건조 감량법에 의한 조회분 측정법에 따라 균사체와 자실체의 성분이 분석되었다. 또한 임의로 선택된 자연산 동충하초의 성분이 동일한 방법에 따라 분석되어 비교되었다. 자연산 동충하초의 경우 균사체와 자실체의 분리가 어려워 균사체와 자실체의 전체 성분이 함께 분석되었다.
| 동충하초 성분 | 균사체 | 자실체 | 자연산 |
| 수분 | 2.8 | 6.0 | 10.84 |
| 조지방 | 3.07 | 2.08 | 8.4 |
| 조단백 | 40.36 | 30.93 | 25.32 |
| 조회분 | 7.51 | 5.32 | 4.1 |
<배양 동충하초의 균사체 및 자실체와 자연산 동충하초의 성분 대비(단위: %)>
표 9에 나타난 결과로부터, 자연산 동충하초와 본 발명에 따라 발효 배양된 균사체와 자실체의 성분은 서로 유사한 것으로 나타났다. 그러므로 본 발명에 따른 균사체 및 자실체는 동충하초속균의 인공 발효 배양 형태라는 것을 알 수 있다. 이에 따라 본 발명에 따른 균사체 및 자실체는 코디세핀 성분에 기초하는 항균 보존제 또는 선도 유지제로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 더 나아가 생산된 배양액 및 배양물의 코디세핀 효능을 높이고자 발효기술을 접목하고 녹차, 마늘, 코코넛, 포도 등을 혼합하여 추출하거나 천연항균 보존 또는 선도유지를 위하여 천연고분자를 첨가한다면 천연 보존능 및 선도 유지능을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 또한 따른 균사체 및 자실체의 항균 보존제 또는 선도 유지제로 효능을 위한 시험이 진행되었다.
4. 효능 시험
효능 시험을 위하여 추출된 균사체 및 자실체로부터 항균 보존제 및 선도 유지제를 제조하였고, 초산이 첨가되지 않은 BHC-G3(초산 미첨가) 및 초산이 첨가된 BHC-F3(초산 첨가)으로 분류하였다. 그리고 각각에 대하여 항균 활성, 항산화활성(DPPH), MIC 및 생리 활성, 관능 평가 또는 보존 효과가 시험되었다.
가. 항균 보존제 효능 시험
배양된 균사체 및 자실체가 항균 보존제로 효능을 시험하기 위하여 햄버거 패티, 어묵 및 냉장 면과 같은 세 개의 식품군이 선택되었고, 항균 보존제 종류 및 농도 선택을 위한 12 ℃에서 가속저장시험으로 저장성(미생물 및 관능 품질) 시험이 실시되었다.
A. 보존제 효능
햄버거 패티, 어묵 및 냉장 면에 대하여 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 시험 결과에 따라 기준이 설정되었고, 1/2×MIC 및 2×MIC 농도에 대한 시험이 추가되었다.
- 햄버거 패티: 0.200, 0.400 및 0.800 wt%
- 어묵: 0.225, 0.450 및 0.900 wt%
- 냉장면: 0.100, 0.200 및 0.400 wt%
BHC-G3 및 BHC-F3을 10 ㎖의 물에 위에서 정해진 농도로 되도록 혼합하고, 햄버거 패티, 어묵 및 냉장면을 처리하여 각각 10 g으로 만들어 지퍼 백에 넣고 12 ℃에서 0, 2, 4 및 6일 동안 저장하면서 결과를 관찰하였다. 그리고 각각에 대하여 미생물학적 품질 특성 분석, pH 측정, 적정 산도 측정 및 관능검사가 이루어지고, 시험 결과는 SAS 통계 프로그램 (Version 9.1, SAS Institute, Cary, North Carolina, USA)의 ANOVA procedure을 이용하여 분석되었다. 각각의 처리구가 통계적인 유의차를 나타내는 경우에 (p ≤ 0.05) 평균값은 Duncan’s multiple range test를 이용하여 산출되었다.
a. 미생물학적 품질 특성 분석
총균수의 검사를 위하여 Rojas-Graua et al. (2008)에 따라 무균적으로 시료 10 g을 멸균백 (3M)에 취한 뒤 20 mL의 멸균된 0.2% peptone water (PW, Difco, Detroit, MI, USA)를 혼합하여 stomacher (Bagmixer® 400, Interscience, France)를 이용하여 90초간 되었다. 각각의 시료액 0.1 mL을 취하여 9.9 mL의 희석액에 단계적으로 희석하였다. 단계 희석액 1 mL씩 3M™ aerobic count Petrifilm (3M, St Paul, MN, USA)에 분주하여 37 ℃에서 24~48 시간 배양시킨 후 colony 수를 측정하여 log CFU/g으로 표시하였다. 효모/곰팡이수는 총균수와 동일한 방법으로 시료를 전처리를 하여 단계적으로 희석하여 1 mL씩 건조배지필름인 3M™ Yeast and mold Petrifilm에 분주하여 25 ℃ 온도에서, 3~5 일 배양시키고 colony 수를 측정하였다. 대장균/대장균군수 총균수 검사와 동일한 방법으로 시료를 전처리한 후 단계적으로 희석하여 각각 1 mL를 건조배지필름인 3M™ E.coli/Coliform Petrifilm에 무균적으로 분주하여 37 ℃의 온도에서 24~48 시간동안 배양하여 colony 수를 측정하였다.
측정 결과가 도 1a 내지 도 1i로 제시되었다.
도 1a 내지 도 1c는 햄버거 패티에 항균 보존제가 첨가된 경우 총균수, 대장균/대장균군수, 효모/곰팡이수를 나타낸 것이다. G3과 F3을 0.200, 0.400, 0.800 wt%의 농도로 첨가하여 12 ℃에서 0, 2, 4, 6일간 저장하여 관찰하였고, G3 0.800 wt%가 첨가되면, 저장 4일 동안 총균수가 0.83-1.89 log CFU/g로 대조구와 비교하여 낮은 수준을 유지한다는 것을 알 수 있다. 특히, G3 0.800 wt% 첨가 시, 저장 6일 동안 효모/곰팡이수가 검출한계(≤ 0.48 log CFU/g)까지 저해되어 효과적이라는 것을 알 수 있다. F3 0.800 wt% 첨가 시, 저장 6일에 총균수가 6.54 log CFU/g 저해되어 가장 큰 효과를 나타냈었다. 그러나 F3 0.800 wt% 첨가 시, 효모/곰팡이수는 저장 2일까지 효과를 나타내지만, 저장 4일부터 급격한 증가를 보여 효모/곰팡이수에 대해 미비한 효과를 보이는 것으로 나타났다. 그러므로 햄버거 패티의 경우 G3 0.800 wt% 첨가 시 저장 4일까지 미생물학적 안전성에 가장 효과적이라는 것을 알 수 있다.
도 1d 내지 도 1f는 어묵에 항균보존제를 첨가하였을 때 총균수, 대장균/대장균군수, 효모/곰팡이수를 나타낸 것이다. G3와 F3를 0.225, 0.450, 0.900 wt%의 농도로 첨가하여 12 ℃에서 0, 2, 4, 6일간 저장하여 관찰하였다. G3 0.900 wt% 첨가 시, 저장 4일에 대조구와 비교하여 총균수가 7.42 log CFU/g 저해되었고, 저장 6일에 총균수가 급격히 증가하나 대조구에 비해 2.78 log CFU/g 낮은 수준으로 총균수 저해에 효과적인 것으로 나타났다. F3 0.900 wt% 첨가 시, 저장 6일에 총균수가 검출한계(≤ 0.48 log CFU/g)까지 저해되어 효과적인 것이라는 것을 보여주었다. 대장균/대장균군수는 대조구와 비교하여 처리구에서 낮은 수준을 유지하나, 유의적인 차이는 없었다(p > 0.05). 효모/곰팡이수는 G3와 F3을 0.450, 0.900 wt%의 농도로 첨가 시, 저장 6일 대조구에 비해 3-4 log CFU/g 낮은 수준을 유지하고 있어 효과적인 것으로 나타났다. 그러므로 어묵에 G3 또는 F3 0.900 wt% 첨가하는 것이 미생물학적 안전성에 가장 효과적이라는 것을 알 수 있다.
도 1g 내지 도 1i는 냉장면에 항균 보존제를 첨가하였을 때 총균수, 대장균/대장균군수, 효모/곰팡이수를 나타낸 것이다. G3와 F3을 0.100, 0.200, 0.400 wt%의 농도로 첨가하여 12 ℃에서 0, 1, 2, 3일간 저장하여 관찰하였다. 저장 3일에는, F3-1를 0.400% 처리 시총균수, 대장균/대장균군수가 대조구에 비해 각각 5.50, 1.99 log CFU/g 낮은 수준으로 효과적이라는 것을 알 수 있다. 그러나 G3 처리 시 대장균/대장균군수와 효모/곰팡이수가 대조구에 비해 낮은 수준으로 유지를 하지만 총균수의 효과가 미비한 것으로 나타났다. 그러므로 냉장면의 경우 F3 0.400 wt% 첨가하는 것이 미생물학적 안전성의 관점에서 가장 효과적인 것으로 나타났다.
b. pH 측정
pH는 Kwak et al.의 방법에 따라 시료 10 g과 증류수 20 mL을 멸균백에 넣어 stomacher로 90초간 균질하게 만들고, 이후 시료가 digital pH-meter (Beckman Counter, model pH, USA)를 이용하여 측정되는 방법으로 이루어졌고 결과가 도 2a 내지 도 2c로 제시되었다.
도 2a 내지 도 2c를 참조하면, 햄버거 패티, 어묵, 냉장면의 초기 pH는 각각 5.98, 6.92, 5.84이 되고, G3의 경우 모든 농도에서 pH의 변화를 발생시키지 않는다는 것을 알 수 있다. 저장 0일에 F3 2x MIC 농도를 처리했을 때 햄버거 패티, 어묵, 냉장면의 pH가 각각 0.07, 0.78, 0.90으로 감소되었으나, 실질적인 변화는 없는 것으로 판단된다. 그러므로 전체적으로 저장 기간 동안 pH의 실질적인 변화가 나타나지 않으며, G3와 F3이 식품에 미치는 pH 영향은 없는 것으로 판단된다.
c. 적정 산도 측정
적정 산도는 AOAC 표준 시험법에 따라 이루어지고, 이를 위하여 시료 10 g과 증류수 20 mL을 멸균백에 넣어 Stomacher로 90초간 균질하게 만들었다. 이후 균질하게 된 시료 10 mL에 1% 페놀프탈레인 (77-09-8, Duksan pure chemicals, Gyeonggi-do, Korea) 용액 1~2 방울을 떨어뜨리고, 0.1 N NaOH (S0610, Samchun pure chemical, Gyeonggi-do, Korea)로 적정하였다. 무색에서 30초간 붉은색이 유지되는 상태를 종말점으로 판단하고, 소비된 0.1 N NaOH의 양을 측정하여 유기산의 함량(%)으로 계산하여 나타냈다.
상기 식에서
- Vol. of NaOH (ml) = Total volume of NaOH used for titration
- N = Normality of titration (NaOH)
- Acid meq factor = miliequivalent weight of acid
을 각각 나타낸다.
측정 결과가 도 3a 내지 도 3c로 제시되었다. 도 3a 내지 도 3c를 참조하면, 햄버거 패티, 어묵 및 냉장면에 항균 보존제가 첨가되는 경우 초기 산도는 각각 0.10, 0.11, 0.02 %로 나타나고, 저장 기간 동안 모든 처리구에서 산도의 변화가 실질적으로 나타나지 않는다는 것을 알 수 있다. 그러므로 햄버거 패티, 어묵, 냉장면에 G3와 F3을 제시된 농도로 첨가하여도 산도에 변화가 없다는 것을 알 수 있다.
d. 관능검사
100명의 시험자를 대상으로 햄버거 패티 , 어묵 및 냉장면을 대상으로 외관, 색, 향, 전체적인 기호도로 나누어 5점 측도로 관능검사가 시행되었고, 점수가 높을수록 우수한 것을 나타내고, 저장 0일의 경우 맛에 대한 평가 항목이 추가되었다. 관능검사 결과가 도 4a 내지 4c로 제시되었다.
도 4a는 햄버거 패티에 항균 보존제를 첨가한 경우 관능 평가 결과를 나타내 것으로 저장 0일의 경우 G3, F3 0.800 wt% 처리 시 각각 1.75, 2.50점으로 맛에 좋지 않은 영향을 주는 것으로 나타났다. 이에 비하여 외관, 색, 향, 전체적인 기호도의 경우 모든 처리구에서 3.00점 이상으로 허용 가능한 수준이 되는 것을 나타났다. 저장 6일의 경우 F3 0.800 wt% 처리 시 모든 평가 항목에서 대조구에 비해 높은 점수를 받아 관능에 좋은 영향을 주는 것으로 나타났다. 또한 G3 0.800 wt% 처리의 경우 모든 평가 항목에서 3.00점 이상으로 허용 가능한 수준이 되는 것으로 나타났다.
도 4b는 어묵에 항균 보존제를 첨가하였을 때 관능평가 결과를 나타낸 것으로 저장 0일의 경우 G3 0.900 wt% F3 0.450, 0.800 wt% 처리 시 각각 2.00, 2.67, 2.50점으로 맛에 좋지 않은 영향을 주는 것으로 나타났다. 그러나 외관, 색, 향은 모든 처리구에서 3.00점 이상으로 허용 가능한 수준이 되는 것으로 나타났다. 그러나 전체적인 기호도의 경우 맛의 영향으로 F3 0.450, 0.900 wt% 처리 시 각각 2.86점으로 낮게 나타났다. G3 0.900 wt% 처리 시 저장 동안 다른 처리구에 비해 높은 점수로 나타났고, 저장 6일의 경우 대조구와 유사하거나 높은 점수를 받아 관능에 좋은 영향을 주는 것으로 나타났다.
도 4c는 냉장면에 항균 보존제를 첨가하여 관능평가를 한 결과를 나타낸 것으로 저장 0일의 경우 모든 처리구에서 맛은 3.00점 이상으로 모두 허용 가능한 수준이 되는 것으로 나타났다. 또한 외관과 색은 대조구와 유사하거나 조금 낮은 3.43~4.29점으로 나타났고, 모두 허용 가능한 수준이 되었다. 그러나 저장 0일에 향과 전체적인 기호도에서는 F3 0.400 wt% 처리 시 각각 2.00, 2.86점으로 허용 가능한 수준이 아닌 것으로 나타났다. 저장 6일의 경우 G3 0.100 wt% 처리 시 모든 평가 항목에서 3.00점 이상으로 허용 가능한 수준으로 나타났다. 그리고 F3 0.200, 0.400 wt% 처리 시 외관과 색은 3.00점 이상으로 대조구보다 높은 점수로 나타나고, 관능에 좋은 영향을 준다는 것을 알 수 있다.
위와 같은 결과에 따라 햄버거 패티, 어묵의 경우 각각 G3-1 0.800%, 0.900%를 첨가하는 것이 맛을 제외한 관능에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있고, 냉장면의 경우 G3 0.100 wt% 또는 F3 0.200 wt%를 첨가하는 경우 관능에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있다.
B. 독성 시험
탈수 효소 작용에 의하여 노락색의 수용성 기질이 MTT 테트라조리움(tetrazolium)을 불용성으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이영하는 MTT 분석법에 의하여 독성 시험이 되었다. 처리되지 않은 샘플의 흡광도가 측정되고, 이후 각각의 샘플을 처리하여 마이크로 플레이트 리더로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하는 방법으로 독성이 시험되었고, 시험 결과가 도 5a 내지 5d로 나타냈었다.
도 5a 내지 5d를 참조하면, G3 1 wt%농도로 처리하였을 때 각질세포 HaCaT cell의 경우 세포의 성장을 증가하는 결과를 나타내고, 독성에 영향이 없다는 것을 알 수 있다. 그리고 F3 1 wt% 처리하는 경우 정상 세포인 각질세포와 멜라닌을 생성하는 암세포의 경우 세포의 성장에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
나. 선도유지제
G3 및 F3의 선도유지제 기능을 시험하기 위하여 청과류에 대한 시험이 이루어졌고, 결과가 도 6a 내지 도 6c로 제시되었다.
도 6a 내지 도 6c를 참조하면, G3 또는 F3로 청과류를 처리하고 이후 천연 식품 보존제로 처리하는 것이 균 제어에 유리하다는 것을 알 수 있다. 구체적으로 G3 또는 F3을 선도유지제의 기능을 위하여 농산물을 처리하고 가공하면 천연식품 보존제의 효과가 향상된다는 것을 알 수 있다.
선도유지제로 효능 시험을 위하여 G3 또는 F3의 농도가 3 내지 6 %가 되도록 수용을 제조하고 곶감을 50 내지 80초 동안 침지시킨 후 건조하였다. 이후 2일차에 곶감에서 분리된 진균 2종 및 보유 균주 1종이 배양된 평판 배지 위에 멸균수를 첨가하여 포자를 수득하였다. 그리고 수득된 진균 포자를 현미경 또는 도말을 통하여 균수를 확인하여 농도가 조절되도록 희석하여 준비하여 여러 번에 걸쳐 곶감에 접종하였다. 이후 접종 후 가습 조건을 유지하면서 용기에 넣고 관찰되었고, 결과가 도 7a 내지 도 7e로 제시되었다.
도 7a 내지 7c는 각각 5일차, 10일차 및 20일차 관찰 결과를 나타낸 것이고, 도 7d 및 7d는 외부 기관에 의뢰하여 1 내지 6일차 및 16 내지 22일차 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7e를 참조하면, 진균 접종 및 가습 조건과 같은 가혹 조건에서 무처리의 경우 5일차 이전에 진균이 발생하고, 유황처리, BHC-F3, BHC-G3의 경우 진균이 거의 발생하지 않는다는 것을 알 수 있다. 구체적으로 무처리의 경우
발병 개체수 : 8/10 및 진균 발병 면적률 : 전체 40%가 되고, BHC-G3의 경우 발병 개체수 : 1/10이 된다는 것을 알 수 있다. 또한 진균 접종 20일차의 경우 유황 처리 및 BHC-F3의 경우 발병 개체수 : 10/10, 발병 면적률 : 20% 그리고 발병 개체수 : 8/10, 발병 면적률 : 40%가 된다는 것을 알 수 있다. 그러므로 가혹 조건에서 BHC-F3가 유황 처리를 대체할 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한 BHC-F3의 경우 관능 평가 시 참여 인원의 80% 이상이 무처리구와 차이를 느끼지 못하거나 단독 섭취의 경우 느끼지 않는 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 배양 방법에 따라 배양된 동충하초의 균사체 또는 자실체의 코디세핀 추출물은 큰 항균성을 가지면서 항균 범위가 넓은 천연 항균 보존제로 사용될 수 있다. 또한 생산된 배양액 및 배양물의 코디세핀 효능을 높이고자 발효기술을 접목하고 녹차, 마늘, 코코넛, 포도 등을 혼합하여 추출하거나 천연항균 보존 또는 선도유지를 위하여 천연고분자를 첨가하여 효율을 높인 발효액 및 발효물에서 추출된 코디세핀 추출물은 과채류의 저장 유통 과정에서 발생되는 갈변과 부패의 억제를 위한 선도유지제로 사용될 수 있다. 이로 인하여 공지의 보존 또는 선도 유지를 위하여 사용되는 물리 처리 또는 인공 합성 보존제를 대체할 수 있도록 한다. 또한 추출된 코디세핀 추출물은 햄버거, 어묵 또는 냉장면과 같은 음식에 적용될 수 있고, 식품 자체의 pH에 영향을 미치지 않으면서 독성을 가지지 않는다. 이와 같은 본 발명에 따른 코디세핀 추출물은 높은 안정성 및 관능 특성을 가진다.
위에서 본 발명은 제시된 실시 예를 참조하여 상세하게 설명이 되었지만 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 제시된 실시 예를 참조하여 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형 및 수정 발명을 만들 수 있을 것이다. 본 발명은 이와 같은 변형 및 수정 발명에 의하여 제한되지 않으며 다만 아래에 첨부된 청구범위에 의하여 제한된다.
BHC-G3: 초산 미 첨가 추출물
BHC-F3: 초산 첨가 추출물
BHC-F3: 초산 첨가 추출물
Claims (4)
- 액체 배지, 고형 배지 또는 충체에 코디셉스 밀리타리스 또는 코디셉스 누탄스균을 접종하여 균사체를 얻는 단계; 및
상기 얻어진 균사체를 고형 배지 또는 충체에서 배양하여 자실체를 형성시키는 단계를 포함하고,
상기 자실체를 형성하는 고형 배지는 옥수수와 액체 배지로 이루어지거나, 쌀, 누에고치 번데기 및 액체 배지로 이루어지고, 수분 함량 50 내지 70 %, 상대습도 80 내지 95 %, 분위기 온도 15 내지 25 ℃ 및 광도 700 내지 1200 럭스가 되고,
상기 균사체를 얻는 액체 배지는 MgSO₄·7H₂O, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 효모 추출물, 펩톤 및 덱스트로오스로 이루어지거나 또는 효모 추출물, 덱스트로오스, 에비오스 및 하이포넥스로 이루어지는 것을 특징으로 하고 상기 균사체를 얻는 고형 배지는 쌀, 감자, 옥수수 및 누에고치 번데기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 및 액체 배지로 이루어지는 것을 특징으로 하는 천연 보존제 및 선도유지제 기능을 가지는 동충하초의 배양 방법. - 청구항 1항에 있어서, 상기 균사체 또는 자실체로부터 얻어진 추출물이 유산균에 의하여 발효가 되는 단계를 더 포함하는 천연 보존제 및 선도유지제 기능을 가지는 동충하초의 배양 방법.
- 액체 배지, 고형 배지 또는 충체에서 배양된 균사체 또는 자실체로부터 추출되고, 2.0 내지 8.0 wt%의 수분, 2.0 내지 3.5 wt%의 조지방, 30 내지 50 wt%의 조단백, 5.0 내지 8.0 wt%의 조회분과 같은 추출 성분; 및
셀룰로오즈, 펙틴, 카리기난, 녹말, 단백질, 효소 또는 키토산을 포함하는 첨가물로 이루어지고,
선도 유지 또는 천연 항균 보존을 위하여 과채류에 살포되거나 또는 식품에 첨가되는 동충하초 천연 복합물. - 동충하초로부터 추출되고, 2.0 내지 8.0 wt%의 수분, 2.0 내지 3.5 wt%의 조지방, 30 내지 50 wt%의 조단백, 5.0 내지 8.0 wt%의 조회분을 포함하는 기초재; 및
항균 효과를 높이기 위한 녹차, 마늘, 코코넛, 포도 또는 한약재와 같은 첨가제를 포함하는 동충하초를 포함하는 동충하초 천연 복합물.
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