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KR20180013945A - 글리칸 의존성 면역치료 분자 - Google Patents

글리칸 의존성 면역치료 분자 Download PDF

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KR20180013945A
KR20180013945A KR1020177034787A KR20177034787A KR20180013945A KR 20180013945 A KR20180013945 A KR 20180013945A KR 1020177034787 A KR1020177034787 A KR 1020177034787A KR 20177034787 A KR20177034787 A KR 20177034787A KR 20180013945 A KR20180013945 A KR 20180013945A
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amino acid
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마이클 디미트리우
레이몬드 웬후 주
Original Assignee
더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 핵산 및 상기 펩티드를 발현하는 세포를 사용하고, 상기 펩티드는 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함한다.

Description

글리칸 의존성 면역치료 분자
관련 출원에 대한 교차-참고
본 특허 출원은 2015년 5월 1일 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 62/155,761의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로서 포함된다.
화학요법 및 방사선요법의 고전적인 접근법 이외에, 단클론성 항체가 암을 치료하기 위한 유망한 약물로서 개발되고 있다. 종양 세포 상에서 과발현된 단백질을 표적화하는 단클론성 항체는 그들의 결합 상대, 주로 악성 세포의 사멸을 유도하기 위해 화학치료 약물 또는 방사성동위원소와 콘주게이트시킬 수 있다. 또한, 네이키드(naked) 단클론성 항체는 환자 면역계를 이용하여 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)의 면역 기전을 통해 그들의 결합 상대의 사멸을 매개할 수 있다. 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포 및 호중구와 같은 면역 효과기 세포는 치료적 항체의 Fc 쇄를 인식하는 Fc 수용체를 보유하여 표적 세포 파괴를 유도한다. 항체는 면역계의 이러한 Fc 수용체 발현 효과기 세포를 동원하지만, 이러한 세포는 단지 소수의 효과기 집단을 구성한다. 이것은 그들의 임상 효능을 제한한다.
가장 강력하고 풍부한 효과기는 T 세포이다. 그러나, T 세포는 Fc 수용체를 갖지 않는다. T 세포의 효과기 기능을 이용하기 위해, 이중특이적 항체의 부류는 T 세포 및 암 세포 모두에 결합하는 능력을 갖도록 가공되었다. 암세포 사멸용 T 세포를 동원하기 위한 이중특이적 항체를 사용하는 개념은 1985년에 제시되었다(Staerz et al. 1985, Nature, 314: 628-631). 그 이후로, 이중특이적 항체의 상이한 포맷/구조가 생성되었다. 최신의 가장 성공적인 이중특이적 항체는 이중특이적 T 세포 연관체(BiTE) 항체이다. 2014년에, FDA는 ALL의 드문 형태인 필라델피아 염색체-음성 전구체 B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-세포 ALL)을 치료하기 위해, T 세포 상의 CD3 및 B 세포 상의 CD19에 결합하는 BiTE 항체인 블리나투모맙(블린사이토)을 승인했다. BiTE 항체는 펩티드의 짧은 서열에 의해 연결된 2개의 결합 아암(arm)으로 이루어지는 이중특이적 단일 쇄 폴리펩티드이다. 각각의 아암(arm) 또는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 단클론성 항체의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 유도된다. 예를 들면, 블린사이토(Blincyto)는 항-인간 CD19에 항-인간 CD3의 결합 도메인을 연결함으로써 유도된다.
암 항원을 표적화하기 위해 단클론성 또는 BiTE를 사용하는데 여러 가지 문제가 있다. 첫째, 암 표적화 단클론성 항체를 생성하기 위해, 특정 항원을 먼저 암세포 상에서 식별해야 한다. 실제로, 2012년까지 미국 식품의약국(FDA)은 암의 특정 유형을 치료하기 위해 12개의 단클론성 항체만을 승인했다 (Scott et al., 2012, Nat Rev Cancer, 12: 278-287). 또한, 다른 암 유형에 걸쳐 공유 단백질 항원의 부족은 단일 키메라 BiTE 단백질에 의해 표적화될 수 있는 암의 수를 크게 제한한다. 따라서, 많은 고유의 BiTE 단백질은 각각의 암에 대해 생성될 필요가 있어 개발 비용을 크게 증가시킨다. 마지막으로, 종양 특이적 항원은 보다 낮은 수준이지만 정상 조직에서 또한 종종 발현된다. 따라서, 정상 조직은 또한 사멸을 위해 표적화될 수 있다. 이러한 모든 문제는 1) 미국에서 연간 단지 약(~) 1000건의 단일의 희귀한 치료 실패 암을 표적화하고, 2) 정상 B 세포에서 발현되는 CD19를 표적화하여 암 세포 사멸 이외에 정상 B 세포 고갈을 유도할 때 블린사이토에 의해 볼 수 있다. 더 나은 접근법은 정상 조직에서 발현이 제한적이거나 전혀 없는 복수의 일반적인 암에 존재하는 항원을 표적화하는 것이다.
따라서, 당해 기술 분야에서 암을 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법이 필요하다. 본 발명은 이 충족되지 않은 요구를 만족시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 포함하는, 암 치료용 조성물을 제공하며, 상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x /a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합한다. 일 구현예에서, TACA-결합 도메인은 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드이다.
일 구현예에서, 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합한다. 일 구현예에서, T-세포 결합 도메인은 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 9, 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열. 일 구현예에서, 펩티드는 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합한다.
일 구현예에서, 펩티드는 TACA 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는, 암 치료용 조성물을 제공하며, 상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x /a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드이다.
일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 T-세포-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 번호: 9, 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열. 일 구현예에서, 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하며, 상기 항원 인식 도메인은 TACA-결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 CAR의 항원 인식 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열. 일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 CAR의 세포내 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인 및 공자극성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 발현 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 시험관내 전사된 RNA를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 제제를 포함하는, 암 치료용 조성물을 제공하며, 상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 제제는 렉틴-결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 펩티드는 렉틴-결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 항원 결합 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 암호화하며, 상기 항원 결합 도메인은 렉틴-결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포를 제공하며, 상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다. 일 양태에서, 세포는, 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형되며, 상기 항원 인식 도메인은 TACA-결합 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL) 및 조절성 T 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x /a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합한다. 일 구현예에서, TACA-결합 도메인은 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드이다.
일 구현예에서, 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합한다. 일 구현예에서, T-세포 결합 도메인은 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 9, 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열. 일 구현예에서, 펩티드는 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합한다.
일 구현예에서, 펩티드는 TACA 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다.
일 구현예에서, 대상체는 TACA를 발현하는 고형 종양을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 이는 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x /a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드이다.
일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 T-세포-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 번호: 9, 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열. 일 구현예에서, 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
일 구현예에서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하며, 상기 항원 인식 도메인은 TACA-결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 CAR의 항원 인식 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열. 일 구현예에서, 핵산 분자에 의하여 암호화된 CAR의 세포내 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인 및 공자극성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 발현 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 시험관내 전사된 RNA를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 대상체는 TACA를 발현하는 고형 종양을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, 세포는, 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형되며, 상기 항원 인식 도메인은 TACA-결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL) 및 조절성 T 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 세포는 자가조직성이다.
일 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 하기를 포함한다: a.) 렉틴으로부터 유도된 종양-연관된 탄수화물 항원 (TACA)-결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 제제를 포함하는 제1 조성물을 대상체에 투여하는 단계, 및 b) TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체에 투여하는 단계.
일 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 하기를 포함한다: a.) 렉틴으로부터 유도된 종양-연관된 탄수화물 항원 (TACA)-결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형된 세포를 대상체에 투여하는 단계, 및 b) TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계. 일 구현예에서, 상기 CAR의 상기 항원 결합 도메인은 렉틴-결합 도메인을 포함하되, 상기 렉틴-결합 도메인은 TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합한다.
본 발명의 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독되는 경우 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위한 목적으로, 본 발명에서 바람직한 도면들의 구현예가 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 구현예들의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 N-글리코실화 분지화 경로를 묘사하는 도면이다. 올리고당전달효소는 ER에서 당단백질의 NxS/T 모티프로 미리조립된 글리칸, Glc3Man9glcNAc2 를 전달한다. 당단백질이 골지(Golgi)를 통해 통과함에 따라, N-아세틸글루코사미닐전달효소 효소(Mgat1, Mgat2, Mgat4 및 Mgat5)는 갈렉틴에 대한 친화도의 증가를 나타내는 분지형 N-글리칸을 생성하기 위해 순차적인 방식으로 작용한다. 갈락토실전달효소 3은 갈락토스를 갈렉틴에 의해 결합될 수 있는 N-아세틸락토사민을 생성하는 GlcNAc에 첨가하여 분지를 확장시킨다. L-PHA 결합 부위가 표시된다. GI, 글루코시다제 I; GII, 글루코시다제 II; MI, 만노시다제 I; MII, 만노시다제 II; GalT3, 갈락토실전달효소 3.
도 2는 L-PHA x CD3 키메라 단백질의 원리를 묘사하는 도면이다. 키메라 단백질은 항-CD3 단클론성 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 및 식물 렉틴 L-PHA를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 이는 T 세포 및 암 세포를 β1,6GlcNAc-분지형 N-글리칸과 계합시킬 수 있다. 이러한 상호작용은 T 세포를 활성화시키고 암세포의 세포독성 사멸을 유도 할 수 있다.
도 3은 GlyTR L-PHA x CD3이 CD3 및 테트라-안테너리(tetra-antennary) 분지형 N-글리칸 모두에 결합한다는 것을 입증하는 예시 실험의 결과를 나타낸다. 10μM 키푸넨신(Kif)에 의한 3일 전처리 존재 및 부재하에 주르카트(좌측) 및 K562(우측) 상의 세포 표면 L-PHA x CD3의 유동 세포 계측법 분석. 주르카트 세포(좌측) 상에서, L-PHA x CD3은 CD3 및 테트라-안테너리 분지형 N-글리칸 모두에 결합할 수 있었고, 결합은 세포가 분지를 없애지만 결합을 위한 세포 표면 상에 CD3을 남긴 Kif로 전처리되었을 경우 감소되었다. 결합은 Kif-처리된 K562 세포에서가 아니라 CD3-음성 만성 골수성 백혈병 암세포에서 K562(우측) 상에서 검출되었다.'
도 4a 내지 도 4j를 포함하는 도 4는 GlyTR L-PHA x CD3이 암세포의 사멸을 매개한다는 것을 입증하는 예시 실험의 결과를 나타낸다. CFSE 표지된 K562(도 4a 내지 도 4c), 키푸넨신 처리된 K562(도 4b), 라지(도 4d), RPMI 8226(도 4e), RS4;11(도 4f), MCF7(도 4g), HT-29(도 4h), Hep G2(도 4i) 또는 HeLa(도 4j)를 96-웰 플레이트에서 시딩하였다. 인간 휴지 PBMC 및 GlyTR L-PHA x CD3의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 세포독성은 요오드화프로피듐(PI)(도 4a 내지 도 4c, 도 4j) 또는 7AAD(도 4d 내지 도 4i) 염색으로 검출하고, 유동 세포 계측법으로 분석하였다. 특정 세포독성 % = CFSE+PI+ %GlyTR - CFSE+PI+ % 미처리됨(도 4a 내지 도 4c, 도 4j) 또는 = CFSE+7-AAD+ %GlyTR - CFSE+7-AAD + % 미처리됨(도 4d 내지 도 4i) 및 CFSE-PI+ 세포는 PBMC에 대한 세포독성 분석을 위해 게이팅되었다(도 4c).
도 5는 T 세포가 종양 세포 상에서 발현된 TACA에 결합하는 TACA-결합 도메인을 포함하는 렉틴-유도 펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된, 본 발명의 예시적인 구현예를 예시하는 개략도이다.
도 6은 T 세포가 렉틴 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 본 발명의 예시적인 구현예의 개략도이다. 렉틴 결합 도메인은 종양 세포 상에서 발현된 TACA에 결합하는 TACA 결합 도메인을 포함하는 렉틴 유래 펩티드에 결합할 수 있다.
본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 종양-연관된 탄수화물 항원 (TACA)에 특이적으로 결합하는 제1 도메인을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 도메인은 T 세포에 결합한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 단백질은 종양 세포 상에 존재하는 TACA 및 T 세포 상에 존재하는 생체분자(예: 표면 단백질)에 결합하여 T 세포를 종양 세포로 동원한다. 특정 경우에, TACA 결합 도메인과 T-세포 결합 도메인을 포함하는 펩티드는 본원에서 글리칸-의존성성 T 세포 동원자(GlyTR)로서 지칭된다. 일 구현예에서, 조성물은 TACA 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 융합 펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 융합 펩티드를 발현하도록 유전자 변형된 세포를 포함한다.
본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 방법은 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포에 결합하는 제2 도메인, 및 TACA에 결합하는 제1 도메인을 포함하는 융합 펩티드를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 융합 펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 융합 펩티드를 발현하도록 변형된 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 전체 기술 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같이 동일한 의미를 갖는다. 여기에서 설명된 것들과 유사한 또는 동등한 임의의 방법들 및 재료들은 본 발명의 실시 또는 검사 시 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 재료들이 설명된다.
본원에 사용된 바와 같이, 다음의 용어들의 각각은 이 섹션에서 그것과 연관된 의미를 갖는다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 계측가능한 값, 예를 들면, 양, 시간 지속 기간 등을 지칭할 때 “약”은 특정된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, 또는 ±0.1%의 변이를 포괄하는 것으로 의미되는데, 그 이유는 이런 변형이 개시된 방법을 수행하는데 적절하기 때문이다.
본원에 사용된 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 나타낸다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생산 및 검출 가능한 효과기 기능과 관련 될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 무엇보다도 세포 분열을 겪고 있는 T 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 항체는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유도된 무손상 면역글로불린일 수 있고, 무손상 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명에서 항체는, 예를 들면, 다클론성 항체, 단클론성 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일 쇄 항체 및 인간화 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 지칭하고 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "항체 중쇄"는 천연 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2 유형의 폴리펩티드 쇄 중 큰 것을 의미한다.
본원에 사용된 "항체 경쇄"는 천연 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2 유형의 폴리펩티드 쇄 중 보다 작은 것을 의미한다. κ 및 λ 경쇄는 두 가지 주요 항체의 경쇄 이소형을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "합성 항체"란, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현된 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 하기를 의미하는 것으로 해석된다: 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된, 그리고 DNA 분자가 항체 단백질을 발현시키는, 항체, 또는 상기 항체를 특정화하는 아미노산 서열 (여기서 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 기술 분야에서 이용 가능하고 익히 공지된 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된 것임).
본원에서 사용된 용어 "항-종양 효과"는 종양 용적의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 수명의 증가 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 완화에 의해 나타낼 수 있는 생물학적 효과를 나타낸다. "항-종양 효과"는 또한 먼저 종양의 발생을 예방하는 데 있어서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "자가 조직"은 이후 개체에게 재도입될 동일 개체로부터 유도된 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유도된 이식편을 지칭한다.
"이종성"은 다른 종의 동물로부터 유도된 이식편을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "암"은 비정상 세포의 신속하고 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로서 정의된다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태이며, 질환이 호전되지 않으면 동물의 건강은 계속 악화된다. 대조적으로, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태는 장애가 없는 경우보다 덜 바람직한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면, 장애는 동물의 건강 상태의 추가의 감소를 반드시 일으키지는 않는다.
본원에 사용된 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 의미한다.
"암호화(encoding)"은 정의된 뉴클레오티드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 서열 또는 정의된 아미노산의 서열 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대 분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는, 만약 상기 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 체계 내의 단백질을 생성할 경우, 단백질에 대해 암호화한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하며 일반적으로 서열 목록에 제공되는 암호화 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용된 비암호화 가닥 모두는 단백질 또는 그 유전자 또는 cDNA의 다른 생성물을 암호화하는 것으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "내인성(endogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 또는 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부로부터 도입되거나 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "발현"은 그의 프로모터에 의해 유도된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현계에 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 코스미드, 플라스미드(예: 네이키드(naked) 또는 리포좀에 함유된) 및 바이러스(예: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 당업계에 공지된 모든 것들을 포함한다.
"상동성"은 두 폴리펩티드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 두 비교 서열 둘 다에서 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 하부단위에 의해 점유될 때, 예를 들어, 각각의 두 DNA 분자 내 위치가 아데닌에 의해 점유된다면, 분자는 해당 위치에서 상동성이다. 2개의 서열 사이의 상동성의 백분율은 2개의 서열이 공유하는 일치하는 또는 상동성 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱(X)한 함수이다. 예를 들어, 2개 서열에서 위치의 10개 중 6개가 매칭되거나 상동성이라면, 두 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 2개 서열이 최대 상동성을 제공하도록 배열될 때 비교가 이루어진다.
본원에서 사용된 용어 "면역글로불린"또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질의 부류로서 정의된다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 종종 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 지칭된다. 이 부류의 단백질에 포함된 5개의 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 타액, 눈물, 모유, 위장 분비물 및 호흡기 및 비뇨생식기관의 점액 분비물과 같은 신체 분비물에 존재하는 1차 항체이다. IgG는 가장 일반적인 순환 항체이다. IgM은 대부분의 대상체의 1차 면역 반응에서 생성되는 주요 면역글로불린이다. 이는 응집, 보체 고정 및 기타 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이고, 박테리아 및 바이러스에 대한 방어에서 중요하다. IgD는 공지된 항체 기능은 갖지 않지만, 항원 수용체로서 기능할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알레르겐에 노출시 비만 세포와 호염기구로부터 매개인자의 방출을 유발하여 즉각적인 과민 반응을 매개하는 면역글로불린이다.
본원에 사용된 바와 같이, "교육용 자료"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록, 도표 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육용 자료는, 예를 들면, 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 운송될 수 있다. 대안적으로, 교육용 자료는 교육용 자료와 화합물이 수용자에 의해 협력적으로 사용되도록 하는 의도로 용기와 함께 별도로 운송할 수 있다.
"단리된"은 자연 상태에서 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리되지" 않지만, 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들면, 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 다음과 같은 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
달리 명시되지 않는다면, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 변성 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전으로 인트론(들)을 함유할 수 있을 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "렉틴"은 탄수화물 구조에 결합하는 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 당업자는 렉틴이 당 모이어티에 대한 결합에 대해 매우 특이적인 단백질 또는 펩티드임을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "종양 관련 탄수화물 항원"또는 "TACA"는 암에서 발견된 탄수화물 구조를 지칭한다. 당업자는 탄수화물 구조가 하나 이상의 연결된 당 또는 단당류로 이루어진다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 탄수화물 구조가 당단백질 및 당지질로 공지된 단백질 또는 지질에서 자립되고/되거나 부착될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 이러한 탄수화물 구조가 렉틴에 결합한다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과 계통의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 유일하고; 그들은 상당량의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있기 때문에, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중의 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유도된 벡터는 생체내에서 상당 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
본원에서 사용된 "조절하는"이란 용어는 치료 또는 화합물의 부재하의 대상체에서의 반응 수준과 비교하고/하거나 치료되지 않은 것 외에는 동일한 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 대상체에서의 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 상기 용어는 원래의 신호 또는 반응을 혼란시키고/시키거나 영향을 미쳐 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
달리 명시되지 않는다면, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 변성 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
용어 “작동가능하게 연결된”은 후자의 발현을 야기하는 조절 서열 및 이종성 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때, 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 프로모터는, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미칠 경우, 암호화 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 필요할 경우, 동일한 판독 틀 내에서 2개의 단백질 암호화 영역을 결합시킨다.
"과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"이란 용어는 그 조직 또는 기관의 정상 세포에서의 발현 수준과 비교하여 종양 항원의 환자의 특정 조직 또는 기관 내의 고형 종양과 같은 질환 영역의 세포에서 종양 항원의 비정상적인 발현 수준을 나타내는 것으로 의도된다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양을 갖는 환자는 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 계측될 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들면, 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 “환자”, “피험자”, “개체” 등은 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 시험관내 또는 원지인 지에 상관없이, 본원에서 설명된 방법에 순응하는 임의의 동물, 또는 이의 세포를 지칭한다. 일정한 비제한적인 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 또한, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에서 사용되는 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환 가능하다. 당업자는 핵산이 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다라는 일반적인 지식을 갖는다. 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 제한 없이 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 PCR™ 등을 사용하는 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝을 포함하는 당업계에서 이용 가능한 임의의 수단에 의해 그리고 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드," "폴리펩티드", 및 "단백질"은 호환 가능하게 사용되며, 그리고 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 제한 없이, 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 최대 개수의 아미노산 상에 배치된다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 또한 통상적으로 당업계에서, 예를 들면, 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로서 지칭되는 짧은 쇄 및 일반적으로 당업계에서 단백질로서 지칭되고 다수의 종류가 존재하는 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는, 예를 들어, 특히, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드의 동종이량체, 이종이량체, 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "프로모터"는, 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시시키는데 요구되는, 세포의 합성 기작에 의해 인식된 또는 합성기에 의해 도입된 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에서, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 인핸서 서열 및 유전자 산물의 발현을 위하여 요구되는 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들면, 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 특정화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우, 세포의 거의 또는 모든 생리적 조건 하에서 세포에서 유전자 생성물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 특정화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우, 프로모터에 대응하는 인듀서(inducer)가 세포에 존재할 경우에만 실질적으로 세포 내에서 유전자 생성물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이적" 프로모터는 유전자에 의해 암호화되거나 구체화된 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때, 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 산물이 실질적으로 세포 내에서 생산될 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열이다.
항체와 관련하여 본원에서 사용된 "특이적으로 결합한다"란 용어는 특정 항원을 인식하지만 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들면, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 종 반응성은 그 자체로 항체의 분류를 특이적으로 변경하지 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립 유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 그 자체로 항체의 분류를 특이적으로 변경하지 않는다. 일부 예에서, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, 단백질 또는 펩티드와 제2 화학 종의 상호작용과 관련하여 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조(예: 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미하기 위해 사용될 수 있고; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 항체가 에피토프 A에 특이적인 경우, 표지된 A 및 항체를 함유하는 반응물 중에 에피토프 A (또는 유리된, 비표지된 A)를 함유하는 분자의 존재는, 항체에 결합하는 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연적으로 발생하는 상태에서 정상적으로 결합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부의 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 관련되는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 기타 구현예에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 억제, 완화 또는 관해에 의해 수득된다.
용어 "치료적 유효량”은 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 추구되는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발할 대상 화합물의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"이란 용어는 투여시, 치료되는 장애 또는 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발병을 예방하거나 어느 정도로 완화시키기에 충분한 화합물의 양을 포함한다. “치료적 유효량”은 화합물, 질환과 이의 중증도, 그리고 치료되는 개체의 연령, 체중 등에 따라 변할 것이다.
상기 용어가 본원에서 사용될 때 질환을 "치료한다"는 것은 대상체가 경험하는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나 변형되거나 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 그 자손을 포함한다.
본원에 사용된 "전사 조절하는" 또는 "작동가능하게 연결된"이라는 어구는 RNA 폴리머라제 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 전사의 개시를 조절하기 위해 프로모터가 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 존재한다는 것을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 세포의 내부에 단리된 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 다수의 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들면, 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같은, 핵산의 세포로의 전달을 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
범위: 본 기재내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면들은 범위 형식(range format)으로 나타내어질 수 있다. 범위 형식으로의 기재는 단순히 편의성 및 간결성을 위한 것이며, 발명의 범위에 대한 완고한 제한으로서 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 이 범위내의 개별적인 수치를 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위범위 뿐만 아니라 이 범위내의 개별적인 숫자, 예를 들면, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
기재사항
본 발명은 암 뿐만 아니라 기타 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 암은 혈액학적 악성종양, 고형 종양, 원발성 종양 또는 전이성 종양일 수 있다. 본 발명의 조성물은 TACA 결합 도메인을 포함하는 펩티드, TACA 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, TACA 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포, 및 상기 펩티드, 핵산, 세포 또는 이들의 조합을 포함하는 기질을 포함한다.
펩티드
일 구현예에서, 본 발명은 TACA 결합 도메인을 포함하는 융합 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. TACA 결합 도메인은 TACA에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 펩티드, 단백질, 렉틴, 렉틴 단편, 항체, 항체 단편, 소분자, 핵산 등을 포함할 수 있다. 예시적 TACA 및 그들의 결합 상대는 표 1에 나열되어 있다.
예시적 TACA는 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x /a, 디시알릴-루이스x /a, 시알릴 6-설포 레식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 N-글리칸에 결합한다. 특정 구현예에서, TACA 결합 도메인은 트리- 및 테트라-안테너리 올리고당에 결합한다. 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 β1,6GlcNAc-분지형 N-글리칸에 결합한다. 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 Tn 에피토프에 결합한다.
일반적인 TACA 및 그들의 결합 상대
TACA 담체 잠재적 렉틴 상대
β1, 6 분지화 N-글리칸 갈렉틴, 시글렉, L-PHA, 리코페르시콘 에스쿨렌툼 렉틴(LEA)
T 항원 O-연결된 탄수화물, 뮤신, CD44,β1 인테그린, 오스테오폰틴 갈렉틴, 아라키스 히포가애 응집소(PNA), 렉틴(자칼린 레틴)
시알릴-T 에피토프 O-연결된 글리칸 갈렉틴, 시글렉
Tn 에피토프 O-연결된 글리칸 갈렉틴, 비시아 빌로사 응집소(VVA), 헬릭스 포마티아 응집소(HPA), 위스테리아 플로리분다 응집소(WFA), C-형 렉틴(즉, CD301)
시알릴-Tn 에피토프 O-연결된 글리칸 시글렉, 갈렉틴, 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA)
α2, 6 시알화 N-글리칸 　
시알화 뮤신 N-글리칸 셀렉틴, 시글렉, 갈렉틴
시알릴-루이스x /a 뮤신 셀렉틴
디-시알릴-루이스x/a 뮤신, 당지질 셀렉틴
시알릴 6-설포 레식스x 　 　
Globo H 　당지질 　시글렉, 갈렉틴, BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아로부터의 렉틴)
GD2 당지질 시글렉, 갈렉틴
GD3 당지질 시글렉, 갈렉틴
GM3 당지질 시글렉, 갈렉틴
푸코실 GM1 당지질 시글렉, 갈렉틴
특정 구현예에서, TACA 결합 도메인은 렉틴 단백질로부터 유도된 펩티드 서열이다. 특정 구현예에서, 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 특정 구현예에서 TACA-결합 도메인은 하기로부터 유도된다: 갈렉틴, 예컨대 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15; 시글렉, 예컨대 시글렉-1 (시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2 (CD22), 시글렉-3 (CD33), 시글렉-4 (미엘린 연관된 당단백질), 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H; 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴.
특정 구현예에서, TACA 결합 도메인은 렉틴의 단편으로부터 유도된다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 TACA에 결합하는 능력을 보유하는 렉틴의 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, TACA 결합 도메인은 렉틴의 돌연변이 변이체 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 돌연변이 변이체는 보다 큰 특이성, 증가된 결합 친화도 또는 감소된 올리고머화를 나타낸다.
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 L-PHA로부터 유도된다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
SNDIYFNFQRFNETNLILQRDASVSSSGQLRLTNLNGNGEPRVGSLGRAFYSAPIQIWDNTTGTVASFATSFTFNIQVPNNAGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPTERHIGIDVNSIRSIKTTRWDFVNGENAEVLITYDSSTNLLVASLVYPSQKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVSVGFSATTGINKGNVETNDVLSWSFASKLSDGTTSEGLNLANLVLNKIL (서열 번호: 1).
일 구현예에서, TACA-결합 도메인은 돌연변이화된 L-PHA를 포함하고, 여기서 L-PHA는 분자를 단량체화하기 위하여 잔기 1-5에서 절단된다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
FNFQRFNETNLILQRDASVSSSGQLRLTNLNGNGEPRVGSLGRAFYSAPIQIWDNTTGTVASFATSFTFNIQVPNNAGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPTERHIGIDVNSIRSIKTTRWDFVNGENAEVLITYDSSTNLLVASLVYPSQKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVSVGFSATTGINKGNVETNDVLSWSFASKLSDGTTSEGLNLANLVLNKIL (서열 번호: 2)
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 돌연변이화된 L-PHA를 포함하며, 여기서 L-PHA는 결합 친화도를 증가시키도록 돌연변이화된다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
ASQTSFSFQRFNETNLILQRDATVSSKGQLRLTNVNDNGEPTLSSLGRAFYSAPIQIWDNTTGAVAASPTSFTFNIDVPNNSGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPKPRHIGIDVNSIKSIKTTTWDFVKGENAEVLITYDSSTKLLVASLVYPSLKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVIVGFTATTGITKGNVETNDILSWSFASKLSDGTTSEALNLANFALNQIL (서열 번호: 3)
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 L-PHA가 분자를 단량체화하고 결합 친화도를 증가시키도록 돌연변이되는 돌연변이된 L-PHA를 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
FSFQRFNETNLILQRDATVSSKGQLRLTNVNDNGEPTLSSLGRAFYSAPIQIWDNTTGAVAASPTSFTFNIDVPNNSGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPKPRHIGIDVNSIKSIKTTTWDFVKGENAEVLITYDSSTKLLVASLVYPSLKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVIVGFTATTGITKGNVETNDILSWSFASKLSDGTTSEALNLANFALNQIL (서열 번호: 4).
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 Tn 에피토프에 결합하고, VVA(비시아 빌로사 이소렉틴 B)로부터 유도된다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
TESTSFSFTNFNPNQNNLILQEDALVNSAGTLELTAVAAGAPVPDSLGRALYAAPIHIHDNTTLASFTTSFSFVMAAPAAAAVADGLAFFLAPPDTQPQARGGFLGLFADRAHDASYQTVAVEFDTYSNAWDPNYTHIGIDTNGIESKKTTPFDMVYGEKANIVITYQASTKALAASLVFPVSQTSYAVSARVDLRDILPEYVRVGFSATTGLNAGVVETHDIVSWSFAVSLA (서열 번호: 5).
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 Tn 에피토프에 결합하고, 돌연변이된 VVA(비시아 빌로사 이소렉틴 B)를 포함하고, 여기서 VVA는 분자를 단량체화하기 위해 잔기 1-5에서 절단된다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
FSFTNFNPNQNNLILQEDALVNSAGTLELTAVAAGAPVPDSLGRALYAAPIHIHDNTTLASFTTSFSFVMAAPAAAAVADGLAFFLAPPDTQPQARGGFLGLFADRAHDASYQTVAVEFDTYSNAWDPNYTHIGIDTNGIESKKTTPFDMVYGEKANIVITYQASTKALAASLVFPVSQTSYAVSARVDLRDILPEYVRVGFSATTGLNAGVVETHDIVSWSFAVSLA (서열 번호: 6).
일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 Tn 에피토프에 결합하고, CD301 (CLEC10A)로부터 유도된다. 예를 들면, 일 구현예에서, TACA 결합 도메인은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
QNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEGFKQERQAGVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVPVHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLVVINSREEQNFVQKYLGSAYTWMGLSDPEGAWKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCAHFHPDGRWNDDVCQRPYHWVCEAGLGQTSQESH (서열 번호: 7).
특정 구현예에서, 펩티드는 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 펩티드의 번역을 증진하거나, 펩티드를 특정 세포 또는 세포외 위치로 표적화하거나, 펩티드의 분비를 지시하도록 기능할 수 있다. 일 구현예에서, 펩티드는 서열 번호: 8의 아미노산 서열의 리더 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
MGWSCIILFLVATATGVHS (서열 번호: 8).
특정 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드를 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 조성물은 렉틴 유래된 TACA 결합 펩티드에 결합하는 펩티드를 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 조성물은 렉틴 결합 도메인을 포함하고, 여기서 렉틴 결합 도메인은 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴 유래된 펩티드에 결합한다. 예를 들면, TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드를 TACA 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 구현예에서, TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드는 관련된 TACA 자체로부터 유도될 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 하나 이상의 TACA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 융합 단백질은 표적 영역은 하나 이상의 TACA 결합 도메인 및 하나 이상의 표적화 도메인을 포함하고, 여기서 표적화 도메인은 특정 세포 또는 조직 영역에 융합 단백질을 지시할 수 있다. 일 구현예에서, 융합 단백질은, 항체 Fc 도메인에 연결된 하나 이상의 TACA-결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 TACA 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은, 하나 이상의 TACA-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 하나 이상의 TACA 결합 도메인에 결합하는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 렉틴 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 여기서 렉틴 결합 도메인은 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴 유도된 펩티드에 결합한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 융합 단백질은 표적 영역은 하나 이상의 렉틴-결합 도메인 및 하나 이상의 표적화 도메인을 포함하고, 여기서 표적화 도메인은 특정 세포 또는 조직 영역에 융합 단백질을 지시할 수 있다. 일 구현예에서, 융합 단백질은, 항체 Fc 도메인에 연결된 하나 이상의 렉틴-결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 렉틴 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은, 하나 이상의 렉틴-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다.
일 양태에서, 조성물은 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는 펩티드를 포함하고, 따라서 2개의 상이한 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 펩티드는 제1 항원에 결합하는 제1 항원 인식 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 인식 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 항원 인식 도메인은 TACA 결합 도메인이다. TACA의 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있고, 이들 모두는 본 발명의 펩티드에 의해 표적화될 수 있다.
특정 구현예에서, 제2 항원 인식 도메인은 면역 효과기 세포에 결합한다. 예시적인 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, 제2 항원 인식부는 NK 세포 항원에 결합하고, 그리고 이는 본원에서 NK-세포-결합 도메인이라고 지칭된다.
일 구현예에서, 제2 항원 인식 도메인은 T 세포 항원에 결합하고, 그리고 이는 본원에서 T 세포-결합 도메인이라고 지칭된다.
특정 구현예에서, 펩티드는 TACA 결합 도메인 및 면역 효과기 세포-결합 도메인을 갖는 이중특이적 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드는 TACA 결합 도메인 및 NK-세포-결합 도메인을 갖는 이중특이적 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드는 TACA 결합 도메인 및 T 세포-결합 도메인을 갖는 이중특이적 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 이중특이적 펩티드는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 이중특이적 펩티드는 렉틴, 렉틴 단편 또는 이의 돌연변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 펩티드는 면역 효과기 세포-결합 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 면역 효과기 세포 결합 도메인은 면역 효과기 세포 상에 존재하는 생체분자에 결합하는 펩티드, 단백질, 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 펩티드는 NK 세포-결합 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, NK 세포 결합 도메인은 NK 세포 상에 존재하는 생체분자에 결합하는 펩티드, 단백질, 항체 또는 항체 단편을 포함한다. NK 세포-결합 도메인이 결합할 수 있는 NK 세포의 예시적 분자는 CD16 및 NKG2D를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
특정 구현예에서, 펩티드는 T 세포-결합 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, T 세포 결합 도메인은 T 세포 상에 존재하는 생체분자에 결합하는 펩티드, 단백질, 항체 또는 항체 단편을 포함한다. T-세포-결합 도메인이 결합할 수 있는 T 세포의 예시적 분자는 CD3, T 세포 수용체, CD2, CD28 및 CD25를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일 구현예에서, T 세포 결합 도메인은 T 세포 상에 존재하는 CD3에 결합하는 펩티드, 단백질, 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, T 세포-결합 도메인은 CD3에 특이적으로 결합하는 항체 단편을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, T-세포 결합 도메인은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하며, 하기와 같이 도시된다:
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK (서열 번호: 9).
일 구현예에서, 펩티드는 TACA 결합 도메인 및 T 세포-결합 도메인을 포함한다. 특정 경우에서, TACA 결합 도메인과 T-세포 결합 도메인을 포함하는 펩티드는 글리칸-의존성성 T 세포 동원인자(GlyTR)로서 지칭된다.
특정 구현예에서, 펩티드는 TACA-결합 도메인 및 면역 효과기 세포 결합 도메인 사이의 링커 도메인을 포함한다. 링커 영역은 임의의 적절한 크기 또는 서열일 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 링커 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: GGGGS (서열 번호: 10).
일 구현예에서, 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 또는 서열 번호: 17 (실시예 2에 도시됨). 특정 구현예에서, 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 또는 서열 번호: 17 (상기 내 함유된 C-말단 His-태그의 부재 하에서). 다른 예시적 펩티드는 표 2에 나열된 것들을 포함한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 TACA 결합 도메인, 면역 효과기 세포 결합 도메인, NK 세포 결합 도메인 또는 T 세포 결합 도메인에 한정되지 않는다. 오히려 임의의 TACA 결합 도메인, 면역 효과기 세포 결합 도메인, NK 세포 결합 도메인, T 세포 결합 도메인 또는 이의 조합이 이용될 수 있다.
Figure pct00001
일 구현예에서, 본 조성물의 펩티드는 본원에 다른 곳에서 기술된 TACA 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 힌지 도메인, 막투과성 도메인, 세포질 도메인, 공-자극성 도메인 또는 제타 쇄를 추가로 포함한다. 막투과성 및 세포질 도메인을 포함하는 CAR은, 예를 들면, 전문이 참조로 인용된 US 특허 출원 공보 제US2013/0287748호, 제US2014/0370017호, 제US2014/0099309호 및 제US2014/0271635호에 상세히 기재된다. 예를 들면, 특정 구현예에서, CAR은 공-자극성 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 공-자극성 도메인은 공-자극성 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 공-자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그들의 리간드가 아닌 다른 세포 표면 분자이다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 바람직한 예는 세포질 T 세포 수용체(TCR) 및 항원 수용체 계합에 이어지는 신호 형질도입을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공동 수용체의 세포질 서열뿐만 아니라 이러한 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
TCR만을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전 활성화에 불충분하고, 2차 또는 공-자극성 신호가 또한 필요하다는 것이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 별개의 부류의 세포질 신호 서열: TCR을 통해 항원 의존성 1차 활성화를 개시하는 것들(1차 세포질 신호전달 서열) 및 2차 또는 공-자극성 신호를 제공하기 위해 항원 독립적 방식으로 작용하는 것들(2차 세포질 신호전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 간주될 수 있다.
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용한 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 iTAM으로서 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특히 사용되는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유도된 것들을 포함한다. 본 발명의 CAR 중의 세포질 신호전달 분자가 CD3 제타로부터 유도된 세포질 신호전달 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은, 그 자체로, 또는 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 기타 목적 세포질 도메인(들)과 조합된, CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공-자극성 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공자극 신호전달 영역은 공자극성 도메인의 세포내 분자를 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공-자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 리간드 이외의 다른 세포 표면 분자이다. 그와 같은 분자의 예시는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
본 발명의 펩티드는 화학적 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 고상 기술(Roberge JY et al (1995), Science 269: 202-204)에 의해 합성되고, 수지로부터 절단되고, 분취 고성능 액체 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들면, 제조업자에 의해 제공된 지침에 따라서 ABI 431 A 펩티드 합성기(퍼킨 엘머)를 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 펩티드와 실질적인 상동성을 갖는 펩티드의 임의의 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바람직하게는, "실질적으로 상동성"인 펩티드는 본원에 개시된 펩티드의 아미노산 서열과 약 50% 상동성, 보다 바람직하게는 약 70% 상동성, 더욱 더 바람직하게는 약 80% 상동성, 더욱 바람직하게는 약 90% 상동성, 더욱 더 바람직하게는 약 95% 상동성, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 상동성이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 1 - 17 중 임의의 것의 아미노산 서열과 약 50% 상동성, 약 70% 상동성, 약 80% 상동성, 약 90% 상동성, 약 95% 상동성 또는 약 99% 상동성인 펩티드를 포함한다.
펩티드는 대안적으로 재조합 수단에 의해 또는 긴 폴리펩티드로부터 절단하여 제조될 수 있다. 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석으로 확인할 수 있다.
본 발명에 따르는 펩티드의 변이체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 비보존된 아미노산 잔기(바람하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전 코드에 의해 암호화된 것일 수 있거나 아닐 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기, 예를 들면, 치환체 그룹의 부착에 의해 변형된 잔기가 존재하는 것, (iii) 펩티드가 본 발명의 펩티드의 대안적인 스플라이스 변이체인 것, (iv) 펩티드의 단편 및/또는 (v) 펩티드가 리더 또는 분비 서열 또는 정제(예: His-태그) 또는 검출(예: Sv5 에피토프 태그)에 사용되는 서열과 같은 또 다른 펩티드와 융합되는 것일 수 있다. 단편은 본래의 서열의 (다중 부위 단백질 분해를 포함하는) 단백질 분해 절단을 통해 생성된 펩티드를 포함한다. 변이체는 번역후 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변이체는 본원의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
당해 분야에 공지된 바와 같이 2개의 펩티드의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 제2의 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 변이체는 본래 서열과 상이한, 바람직하게는 관심 절편 당 모이어티의 40% 미만이 본래 서열과 상이한, 더욱 바람직하게는 관심 절편 당 잔기의 25% 미만이 본래 서열과 상이한, 보다 바람직하게는 관심 절편 당 잔기의 10% 미만이 상이한, 가장 바람직하게는 관심 절편 당 단지 몇 개의 잔기가 원래 단백질 서열과 상이한 동시에 본래 서열의 기능성 및/또는 TACA에 결합하는 능력을 보존하기 위해 본래 서열에 충분히 상동성인 펩티드 서열을 포함하는 것으로 정의된다. 본 발명은 원래 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% 또는 95% 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 두 펩티드 사이의 동일성의 정도는 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘과 방법을 사용하여 계측된다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 계측된다 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
본 발명의 펩티드는 번역 후 변형될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 범위 내에 속하는 번역 후 변형은 신호 펩티드 절단, 글리코실화, 아세틸화, 이소프레닐화, 단백질 분해, 미리스토일화, 단백질 폴딩 및 단백질 분해 처리 등을 포함한다. 일부 변형 또는 처리 사건은 추가의 생물학적 기작의 도입을 필요로 한다. 예를 들면, 신호 펩티드 절단 및 코어 글리코실화와 같은 처리 이벤트는 개과 마이크로솜 막 또는 제노푸스 난 추출물(미국 특허 제 6,103,489호)을 표준 번역 반응에 첨가함으로써 시험된다.
본 발명의 펩티드는 번역 후 변형에 의해 또는 번역 동안 비천연 아미노산을 도입함으로써 형성되는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 다양한 접근법이 단백질 번역 동안 비천연 아미노산을 도입하는 데 이용 가능하다.
본 발명의 펩티드 또는 단백질은 융합 단백질을 제조하기 위해 단백질과 같은 다른 분자와 콘주게이트될 수 있다. 이는, 예를 들면, 생성되는 융합 단백질이 펩티드의 기능성을 유지하는 한 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질의 합성에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 펩티드 또는 단백질은 하기에 기술된 방법과 같은 전통적 장법을 사용하여 포스포릴화될 수 있다: Reedijk et al. (The EMBO Journal 11(4):1365, 1992).
본 발명의 펩티드의 사이클릭 유도체도 본 발명의 일부이다. 사이클릭화는 펩티드가 다른 분자와의 결합에 보다 유리한 형태인 것으로 추정할 수 있도록 한다. 사이클릭화는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 디설파이드 결합이 유리 설프하이드릴 그룹을 갖는 2개의 적합하게 이격된 성분 사이에 형성될 수 있거나, 또는 아미드 결합이 하나의 성분의 아미노기와 다른 성분의 카복실기 사이에 형성될 수 있다. 환화는 또한 하기에 기술된 바와 같은 아조벤젠-함유 아미노산을 사용하여 성취될 수 있다: Ulysse, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8466-8467. 결합을 형성하는 성분은 아미노산의 측쇄, 비아미노산 성분 또는 2개의 조합일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 환계 펩티드는 오른쪽 위치에서 베타-턴(Beta-turn)을 포함할 수 있다. 베타-턴(Beta-turn)은 오른쪽 위치에 아미노산 Pro-Gly를 첨가함으로써 본 발명의 펩티드로 도입될 수 있다.
상기한 바와 같은 펩티드 결합 연결을 함유하는 환계 펩티드보다 더 가요성인 환계 펩티드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 더 가요성인 펩티드는 펩티드의 오른쪽 및 왼쪽 위치에 시스테인을 도입하고 두 시스테인 사이에 이황화 가교를 형성함으로써 제조될 수 있다. 두 시스테인은 베타-시트 및 턴을 변형시키지 않도록 배열한다. 펩티드는 디설파이드 연결의 길이 및 베타-시트 부분 중의 보다 적은 수의 수소 결합의 결과로서 더 가요성이다. 환계 펩티드의 상대적 가요성은 분자 동력학 시뮬레이션에 의해 계측될 수 있다.
본 발명은 또한 표적 단백질에 융합되거나 통합된 펩티드 및/또는 키메라 단백질을 목적하는 세포 성분 또는 세포 유형 또는 조직으로 유도할 수 있는 표적화 도메인에 관한 것이다. 키메라 단백질은 또한 추가의 아미노산 서열 또는 도메인을 함유할 수 있다. 키메라 단백질은 다양한 성분이 상이한 공급원으로부터 유도되거나, 그 자체가 자연에서 함께 발견되지 않는다(즉, 이종성이다)는 점에서 재조합성이다.
일 구현예에서, 표적화 도메인은 멤브레인 스패닝 도메인, 막 결합 도메인, 또는 단백질이, 예를 들면, 소포 또는 핵과 결합하도록 지시하는 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 표적화 도메인은 펩티드를 특정 세포 유형 또는 조직으로 표적화할 수 있다. 예를 들면, 표적화 도메인은 세포 표면 리간드 또는 표적 조직(예: 뼈, 재생 뼈, 변성 뼈, 연골)의 세포 표면 항원에 대한 항체일 수 있다. 표적화 도메인은 본 발명의 펩티드를 세포 성분으로 표적화할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 통상의 기술에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 또는 키메라 단백질은 고체 상 펩티드 합성을 사용하는 화학적 합성에 의해 합성될 수 있다. 이러한 방법은 고체 상 또는 용액 상 합성 방법을 채용할 수 있다 (참고: 예를 들어, J. M. Stewart, and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford Ill. (1984) 및 G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis Synthesis, Biology editors E. Gross and J. Meienhofer Vol. 2 Academic Press, New York, 1980, pp. 3-254 (고체 상 합성 기술에 대하여); 및 M Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin 1984, 및 E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, suprs, Vol 1 (전통적 용액 합성에 대하여). 예로서, 본 발명의 펩티드는 N-플루오레닐메톡시-카보닐-O-벤질-L-포스포트레오닌 유도체로서 포스포트레오닌을 직접 도입하여 9-플루오레닐 메톡시카보닐(Fmoc) 고체 상 화학을 사용하여 합성될 수 있다.
다른 분자에 콘주게이트된 본 발명의 펩티드 또는 키메라 단백질을 포함하는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질은 재조합 기술을 통해 펩티드 또는 키메라 단백질의 N-말단 또는 C- 말단과 목적하는 생물학적 기능을 갖는 선택된 단백질 또는 선택가능한 마커의 서열을 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 생성되는 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 선택된 단백질 또는 선택가능한 마커 단백질에 융합된 본 발명의 펩티드를 함유한다. 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있는 단백질의 예는 면역글로불린, 글루타티온-S-전달효소(GST), 헤마글루티닌(HA) 및 절단된 myc를 포함한다.
본 발명의 펩티드는 생물학적 발현계를 이용하여 개발될 수 있다. 이러한 시스템의 사용은 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리의 생산 및 특정 단백질에 결합하는 펩티드 서열에 대한 이들 라이브러리의 스크리닝을 가능하게 한다. 라이브러리는 무작위 펩티드 서열을 암호화하는 합성 DNA를 적합한 발현 벡터로 클로닝함으로써 생산될 수 있다 (참고: Christian et al 1992, J. Mol. Biol. 227:711; Devlin et al, 1990 Science 249:404; Cwirla et al 1990, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 87:6378). 라이브러리는 또한 중첩 펩티드의 동시 합성에 의해 작제될 수 있다 (참고: 미국 특허 번호 4,708,871).
본 발명의 펩티드 및 키메라 단백질은, 염산, 황산, 브롬화수소산, 인산 등의 무기산, 또는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 석신산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 살리실산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산과 반응시킴으로써 약제학적 염으로 전환시킬 수 있다.
핵산
일 구현예에서, 본 발명은 본원 다른 곳에서 기술된 TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 TACA 결합 도메인을 암호화한다. 특정 구현예에서, 단리된 핵산은 하기로부터 유도된 펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다: 갈렉틴, 예컨대 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15; 시글렉, 예컨대 시글렉-1 (시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2 (CD22), 시글렉-3 (CD33), 시글렉-4 (미엘린 연관된 당단백질), 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H; 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴.
예를 들면, 다양한 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 TACA 결합 도메인을 암호화한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 7.
특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 리더 서열을 암호화한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 암호화한다.
특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 T 세포 결합 도메인을 암호화한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 T-세포 결합 도메인을 암호화한다.
특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 TACA-결합 도메인 및 T-세포-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 또는 서열 번호: 17. 특정 구현예에서, 단리된 핵산은 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화한다: 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 또는 서열 번호: 17 (상기 내 함유된 C-말단 His-태그의 부재 하에서).
일 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 TACA 결합 도메인을 포함하는 CAR을 암호화한다. 특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 막투과성 도메인 및 세포질 도메인 중 하나 이상 및 TACA-결합 도메인을 포함하는 CAR을 암호화한다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 펩티드와 실질적인 상동성을 갖는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 1-17로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 펩티드를 암호화한다.
추가로, 본 발명은 본원에 개시된 펩티드와 실질적인 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 단리된 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 18과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는다.
본 발명의 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 서열은 당업계에 공지된 많은 재조합 방법 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들면, 유전자를 발현시키는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도하거나, 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리시킴으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝되지 않고 합성적으로 생산될 수 있다.
단리된 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하지만 제한되지 않는 임의의 유형의 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 조성물은, 예를 들어, 본 발명의 펩티드, 또는 이의 작용성 단편을 암호화하는, 단리된 DNA 분자를 포함하는, 단리된 cDNA 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 본 발명의 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 단리된 RNA 분자를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 혈청 또는 세포 배양용 성장 배지에서 안정성을 증진시키기 위해 변형될 수 있다. 변형은 안정성, 기능 및/또는 특이성을 증진시키고, 본 발명의 핵산 분자의 면역자극성을 최소화하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들면, 안정성을 증진시키기 위해, 3'-잔기는 분해에 대해 안정화될 수 있고, 예를 들면, 이들은 이들이 퓨린 뉴클레오티드, 특히 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드로 구성되도록 선택될 수 있다. 대안적으로, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환, 예를 들면, 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘의 치환은 허용되고, 분자의 기능에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 유사체를 함유할 수 있다. 예를 들면, 말단은 변형된 뉴클레오티드 유사체를 도입함으로써 안정화될 수 있다.
뉴클레오티드 유사체의 비제한적인 예는 당- 및/또는 골격 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다(즉, 포스페이트-당 골격에 대한 변형을 포함한다). 예를 들면, 천연 RNA의 포스포디에스테르 연결은 질소 또는 황 헤테로원자 중의 적어도 하나를 포함하도록 변형될 수 있다. 바람직한 골격 변형된 리보뉴클레오티드에서, 인접한 리보뉴클레오티드에 연결되는 포스포에스테르 그룹은, 예를 들면, 포스포티오에이트 그룹의 변형된 그룹에 의해 치환된다. 바람직한 당-변형 리보뉴클레오티드에서, 2'-OH 기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 ON으로부터 선택된 기로 대체되며, 여기서 R은 C1-C6 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br, 또는 I이다.
변형의 다른 예는 핵염기 변형된 리보뉴클레오티드, 즉 천연 핵염기 대신 적어도 하나의 비천연 핵염기를 함유하는 리보뉴클레오티드이다. 염기는 아데노신 데아미나제의 활성을 차단하도록 변형될 수 있다. 예시적인 변형된 핵염기는 5 위치에서 변형된 우리딘 및/또는 시티딘, 예를 들면, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘을 포함하지만, 이에 국한되지 않고; 8 위치에서 변형된 아데노신 및/또는 구아노신, 예를 들면, 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들면, 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화된 뉴클레오티드, 예를 들면, N6-메틸 아데노신이 적합하다. 상기 변형이 조합될 수 있음을 주목해야 한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 다음과 같은 화학적 변형 중의 적어도 하나를 포함한다: 하나 이상의 뉴클레오티드의 2'-H, 2'-O-메틸 또는 2'-OH 변형. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 뉴클레아제에 대한 증진된 내성을 가질 수 있다. 증가된 뉴클레아제 내성을 위해, 핵산 분자는, 예를 들면, 2'-변형된 리보스 단위 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 예를 들면, 2' 하이드록실 기(OH)는 변형될 수 있거나 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체로 대체될 수 있다. 증가된 뉴클레아제 내성을 위해, 본 발명의 핵산 분자는 2'-O-메틸, 2'-불소, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-아미노프로필, 2'-아미노 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 예를 들면, 록킹된 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 예를 들면, 2'-4'-에틸렌 가교된 핵산 및 특정 핵염기 변형, 예를 들면, 2-아미노-A, 2-티오(예: 2-티오-U), G-클램프 변형의 포함도 또한 표적에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 2'-변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O--N-메틸아세트아미도 (2'-O--NMA)를 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 2'-O- 메틸 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 일부 구현예에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 모두는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다:
본원에서 논의된 핵산 제제는 달리 비변형된 RNA 및 DNA뿐만 아니라, 효능을 개선시키기 위해 변형된 RNA 및 DNA, 및 뉴클레오시드 대용물의 중합체를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 성분, 즉, 당, 염기 및 포스페이트 잔기가 자연에서 발생하는 것, 바람직하게는 인체에서 자연적으로 발생하는 것과 동일하거나 본질적으로 동일한 분자를 의미한다. 당해 기술 분야는 변형된 RNA로서 희귀하거나 비정상적이지만 천연인 RNA를 지칭했다(참조: 예를 들면, Limbach et al. (Nucleic Acids Res., 1994, 22:2183-2196)). 종종 변형된 RNA로 명명되는 이러한 희귀하거나 비정상적인 RNA는 전형적으로 전사-후 변형의 결과이며, 본원에 사용된 용어 비변형된 RNA 내에 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 변형된 RNA는, 핵산의 성분 중 하나 이상의 것, 즉, 당, 염기, 및 포스페이트 모이어티가, 천연 발생하는 것과 상이하고, 바람직하게는 인체 내 발생하는 것과 상이한, 분자를 지칭한다. 그들은 "변형된 RNA"로서 칭명되는 동안 그들은 물론, 변형 때문에, 염격하게 말하자면 RNA가 아닌 분자를 포함한다. 뉴클레오시드 대용물은 리보포스페이트 골격이, 염기가 하이브리드화가 리보포스페이트 골격, 예를 들면, 리보포스페이트 골격의 비하전된 모방체로 볼 수 있는 것과 실질적으로 유사하도록 올바른 공간 관계로 제시되도록 하는 비-리보포스페이트 작제물로 대체되는 분자이다.
본 발명의 핵산의 변형은 하나 이상의 포스페이트 기, 당 기, 골격, N-말단, C-말단 또는 핵염기에 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단리된 핵산이 삽입된 벡터를 포함한다. 당해 기술 분야는 본 발명에 유용한 적합한 벡터가 풍부하다.
간단히 요약하면, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 프로모터에 펩티드 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 작동가능하게 연결하고, 작제물을 발현 벡터에 도입함으로써 달성된다. 사용되는 벡터는 복제 및, 임의로, 진핵 세포에의 통합에 적합하다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 벡터는 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 치료에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466 (이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 치료 벡터를 제공한다.
본 발명의 단리된 핵산은 다수의 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하나, 이에 국한되지 않는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특히 관심이 있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.
또한, 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 본 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 하기에 기술된다: Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 일반적으로, 적절한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제의 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다 (예컨대, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
다수의 바이러스계 시스템이 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. 예를 들면, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터에 삽입될 수 있고, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자로 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내 또는 생체외로 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템은 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
예를 들면, 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유도된 벡터는 그들이 이식유전자의 장기간 무변성 통합 및 딸 세포에서 이의 전파를 가능하게 하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하기 위한 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 그들이 간세포와 같은 비증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유도된 벡터에 대한 추가 이점을 갖는다. 그들은 또한 낮은 면역원성의 추가 이점을 갖는다. 일 구현예에서, 조성물은 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 유도된 벡터를 포함한다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 다양한 장애의 치료를 위한 강력한 유전자 전달 도구가 되었다. AAV 벡터는 그들이 이상적으로 병원성의 결여, 최소한의 면역원성 및 안정적이고 효율적인 방식으로 유사분열 후 세포를 형질 도입하는 능력을 포함하는 유전자 치료에 이상적으로 적합하게 하는 다수의 특징을 포함한다. AAV 벡터 내에 함유된 특정 유전자의 발현은 구체적으로는 AAV 혈청형, 프로모터 및 전달 방법의 적절한 조합을 선택함으로써 하나 이상의 유형의 세포로 특이적으로 표적화될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 또는 본 발명에 의해 생성된 바이러스에 의해 감염된 세포에서 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동가능하게 연결된 통상적인 조절 요소를 또한 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 대상의 유전자와 인접한 발현 조절 서열과 도중에 또는 관심 대상의 유전자를 조절하기 위한 거리에서 작용하는 발현 조절 서열을 둘 다 포함한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 필요할 때 암호화된 산물의 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직 특이적인 프로모터를 포함하는 매우 다수의 발현 조절 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 이용될 수 있다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들면, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 업스트림 30 내지 110bp 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 최근에 개시 부위의 다운스트림에 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은, 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동될 때 프로모터의 기능이 보존되도록, 가요성이다. 티미딘 키나제(tK) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화하기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 촉진제의 일례는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 고수준의 발현을 구동할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 적절한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예를 들면, 국한되지 않지만, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 국한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터도 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 목적시 되는 경우에는 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 작동시키거나 발현이 목적시 되지 않는 경우에는 발현을 차단할 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
벡터에서 발견된 인핸서 서열은 또한 내부에 함유된 유전자의 발현을 조절한다. 전형적으로, 인핸서는 유전자의 전사를 증진시키는 단백질 인자와 결합된다. 인핸서는 그것이 조절하는 유전자의 다운스트림 또는 업스트림에 위치될 수 있다. 인핸서는 또한 특정 세포 또는 조직 유형에서 전사를 증진시키기 위해 조직 특이적일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 벡터 내에 존재하는 유전자의 전사를 촉진하는 하나 이상의 인핸서를 포함한다.
펩티드의 발현을 평가하기 위해, 세포로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염되고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 기타 양태에서, 선택가능한 마커는 별개의 DNA 단편 상에 보유될 수 있고, 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자는 모두 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열에 인접할 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는, 예를 들면, 네오 등과 같은 항생제 내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질 감염된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하거나 이에 의해 발현되지 않고, 발현이 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들면 효소 활성에 의해 입증되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적절한 시점에서 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 클로르암페니콜 아세틸 전달효소를 암호화하는 유전자, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예: Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적절한 발현계는 익히 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있거나 상업적으로 입수된다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측접(flanking) 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어 프로모터 구동 전사를 조절하는 능력에 대해 제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유전자를 세포에 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법으로 숙주 세포, 예를 들면, 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 물리적 방법은 인산칼슘 침전 등 리포펙션, 입자 충격, 미세 주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 참고: 예를 들면, Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들면, 인간 세포에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어 다음을 참조한다: 미국 특허 5,350,674 및 5,585,362.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질계 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적 콜로이드성 시스템은 리포좀(예: 인공 막 소포)이다.
비바이러스성 전달 시스템이 이용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용은 핵산을 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 숙주 세포로 도입하기 위해 고려된다. 기타 양태에서, 핵산은 지질과 관련될 수 있다. 지질과 관련된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내부에 산재되어 있거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 관련된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중의 현택액으로서 함유되거나, 미셀과 함유 또는 복합체화되거나, 또는 달리는 지질과 관련될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 중의 임의의 특정 구조로 국한되지 않는다. 예를 들면, 그들은 이중층 구조, 미셀 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그들은 또한 단순히 용액에 산재되어 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 천연 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들면, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다. 사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다.
예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 케이 앤 케이 라보라토리즈(K & K Laboratories)(Plaiview, NY)에서 수득할 수 있고; 콜레스테롤("Choi")는 칼바이오켐-베링거(Calbiochem-Behring)로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈 인코포레이티드(Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 저장 용액은 약 -20℃에서 저장할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포좀"은 밀폐된 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수용성 배지를 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 다중층 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 복수의 지질 층을 갖는다. 그들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁되는 경우 자발적으로 형성한다. 지질 성분은 밀폐된 구조를 형성하기 전에 자체 재배열을 경험하고, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 통상적인 소포 구조보다 용액에서 상이한 구조를 갖는 조성물도 또한 포함된다. 예를 들면, 지질은 미셀 구조를 가정할 수 있거나, 단지 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위해 사용되는 방법에 관계 없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들면, 당업자에게 익히 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예를 들면, 사우던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들면, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범위에 속하는 제제를 식별하기 위해 본원에 기술된 검정에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자는 시험관내 전사(IVT)된 RNA를 포함한다. RNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 PCR에 의해 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하는 시험관내 mRNA 합성용 주형으로 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들면, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다.
일 구현예에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 개방 판독 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터의 천연 DNA 서열로부터 유도될 수 있다. 일 구현예에서, DNA는 유전자의 일부의 관심 전장 유전자이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, PCR에 사용하는 DNA는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. DNA를 대안적으로 천연 유기체에서 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 결찰되는 DNA의 부분은 단일 유기체 또는 1 초과의 유기체로부터 유도될 수 있다.
PCR을 위한 DNA의 공급원으로서 사용될 수 있는 유전자는 유기체에 치료적 또는 예방적 효과를 제공하는 폴리펩티드를 암호화하거나 유기체에서 질환 또는 장애를 진단하기 위해 사용될 수 있는 유전자를 포함한다. 바람직한 유전자는 단기간 치료에 유용한 유전자 또는 투여량 또는 발현된 유전자에 관한 안전성 문제가 있는 유전자이다. 예를 들면, 암, 자가면역 장애, 기생충, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 다른 감염의 치료를 위해, 발현되는 이식유전자(들)은 면역계 세포를 위한 리간드 또는 수용체로서 기능하는 폴리펩티드를 암호화할 수 있거나, 유기체의 면역계를 자극하거나 억제하는 기능을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역계의 지속적으로 진행 중인 자극을 갖는 것이 바람직하지 않고, 성공적인 치료 후 지속되는 변화를 생성하는 것이 필요하지 않을 수 있는데, 이는 이후 새로운 문제를 야기할 수 있기 때문이다. 자가면역 장애의 치료의 경우, 장기간은 아니지만 플레어-업 동안 면역계를 억제하거나 억압하는 것이 바람직할 수 있고, 이는 환자에서 야기되어 감염에 지나치게 민감해질 수 있다.
PCR은 형질감염에 사용되는 mRNA를 시험관내 전사용 주형을 생성하는 데 사용된다. PCR 수행 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR용 주형으로 사용되는 DNA의 영역에 실질적으로 상보성인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 상보성"은 프라이머 서열 중의 대다수 또는 모든 염기가 상보성이거나 하나 이상의 염기가 비상보성이거나 부조화되는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적 서열은 PCR을 위해 사용된 어닐링 조건하에 의도된 DNA 표적과 어닐링 또는 하이브리드화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 일부와 실질적으로 상보성이도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 5 '및 3' UTR를 포함하여 세포에서 정상적으로 전사되는 유전자의 부분(개방 판독 프레임)을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 프라이머는 관심 특정 도메인을 암호화하는 유전자의 부분을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 일 구현예에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 모두 또는 일부를 포함하여, 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭하도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당업계에서 익히 공지된 합성 방법에 의해 생성된다. "정방향 프라이머"는 증폭되는 DNA 서열의 업스트림에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "업스트림"는 암호화 가닥에 대해 증폭되는 DNA 서열에 대한 위치 5를 의미하기 지칭하기 위해 본원에 사용된다. "역 프라이머"는 증폭되는 DNA 서열의 다운스트림에 있는 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "다운스트림"은 암호화 가닥에 대해 증폭되는 DNA 서열에 대한 위치 3'를 의미하기 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라제는 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 다수의 공급원으로부터 시판되고 있다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진시키는 능력을 갖는 화학적 구조도 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR를 갖는다. 일 구현예에서, 5' UTR은 제로와 길이 3,000개 뉴클레오티드 사이이다. 암호화 영역에 첨가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역으로 어닐링되는 PCR용 프라이머를 설계함을 포함하나, 이에 국한되지 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역 효율을 달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형할 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 유전자를 위한 천연의 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 전방 및 역방 프라이머에 도입하거나 주형의 임의의 다른 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형하는 데 유용 할 수 있다. 예를 들면, 3' UTR 서열 중의 AU 풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다고 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 익히 공지되어 있는 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기한 바와 같은 PCR에 의해 첨가되는 경우, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열을 첨가함으로써 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역을 수행하는 데 필요한 것으로 나타나지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열의 요건은 당업계에 공지되어 있다. 다른 구현예에, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 무변성 RNA 바이러스로부터 유도될 수 있다. 다른 구현예에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체는 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝을 필요로 하지 않고 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해, 전사의 프로모터가 전사될 서열의 DNA 주형 업스트림에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 첨가되는 경우, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사될 개방 판독 프레임의 업스트림에서 PCR 생성물에 혼입된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 프로모터는, 본원의 다른 부분에서 기술한 바와 같이, T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다.
바람직한 구현예에서, mRNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서 mRNA 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 상에 캡을 모두 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들면, 플라스미드 DNA 상에, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카타머성(concatameric) 생성물을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에도 진핵 세포 형질감염에 효과적이지 않은 정상 크기의 mRNA를 유발한다.
선형 DNA 주형 상에, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 주형의 마지막 염기중합 효소는 주형의 마지막 염기 이상으로 전사체의 3' 말단을 연장시킬 수 있다 (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
폴리A/T 신장부를 DNA 주형으로 통합시키는 통상적인 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유보할 수 있는데, 그 이유는 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 수차로 매우 오염되기 때문이다. 이는 클로닝 절차가 힘들고 시간 소모적일 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 한다. 그것은 클로닝 없이 폴리A/T 3' 신장부로 DNA 주형의 작제를 가능하게 하는 방법이 매우 바람직한 이유이다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 100T 꼬리(크기는 50 내지 5000T일 수 있다)과 같은 폴리T 꼬리를 함유하는 역방 프라이머를 사용하여 PCR 동안 또는 DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하고 그들의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양성으로 상관 관계가 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000개 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 폴리(A) 폴리머라제, 예를 들면, 이. 콜라이 폴리A 폴리머라제(E-PAP)를 사용하는 시험관내 전사후 추가로 연장시킬 수 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100 뉴클레오티드 내지 300-400 뉴클레오티드로 증가시키는 것은, RNA의 번역 효율의 약 2배의 증가를 유발한다. 추가로, 3' 말단에 상이한 화학적 그룹의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들면, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A)에 도입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당해 분야에 공지되어 있으며, 본원에 기술된 기술을 이용하여 제공된다 (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡 독립적 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 촉진시키는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 당, 펩티드, 지질, 단백질, 산화 방지제 및 계면활성제와 같은 세포 투과성및 생존력을 촉진시키는 인자를 함유하는 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는, 예를 들면, 임의의 다수의 상이한 방법, 예를 들면, 전기천공(아막사 뉴클레오펙토르-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 유전자 펄서 II(BioRad, Denver, Colo.), 다중천공기(Eppendort, Hamburg, Germany), 리포펙션을 사용하는 양이온성 리포좀 매개된 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩피드 매개된 형질감염, 또는 "유전자 총"(참조: 하기)과 같은 바이오리스틱 입자 전달 시스템을 포함하나, 이에 국한되지 않은 시판되는 방법을 사용하여 표적 세포로 도입될 수 있다: 예를 들어, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).
기타 양태에서, RNA 작제물은 전기천공에 의해 세포에 전달될 수 있다. 예를 들면, US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1에 교시된 바와 같은 포유동물 세포로의 핵산 작제물의 전기천공의 제형 및 방법론을 참조한다. 임의의 공지된 세포 유형의 전기천공에 필요한 전기장 강도를 포함하는 다양한 파라미터는 일반적으로 관련 연구 문헌뿐만 아니라 그 분야에의 다수의 특허 및 출원에 공지되어 있다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 6,678,556, 미국 특허 번호 7,171,264, 및 미국 특허 번호 7,173,116. 전기천공의 치료적 적용을 위한 장치는 시판되는, 예를 들면, MedPulser™ DNA 전기천공 치료 시스템(Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.)이고, 특허, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,567,694; 미국 특허 번호 6,516,223, 미국 특허 번호 5,993,434, 미국 특허 번호 6,181,964, 미국 특허 번호 6,241,701, 및 미국 특허 제6,233,482호에 기재되어 있고; 전기천공은 또한, 예를 들면, US20070128708A1에 기재된 시험관내 세포의 형질감염용으로 사용될 수 있다. 전기천공은 또한 핵산을 시험관내 세포로 전달하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 당업자에게 공지된 임의의 많은 이용가능한 장치 및 전기천공 시스템을 사용하는 발현 작제물을 포함하는 핵산의 세포로 전기천공 매개된 투여는 표적 세포에 관심 RNA를 전달하기 위한 흥미로운 새로운 수단을 제시한다.
키메라 항원 수용체
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 CAR은 TACA 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 세포외 및 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 달리는 항원 결합 모이어티로서 지칭되는 표적 특이적 결합 요소를 포함한다. 세포내 도메인 또는 달리는 세포질 도메인은, 공자극 신호전달 영역 및 제타 쇄 부분을 포함한다. 공자극 신호전달 영역은 공자극성 도메인의 세포내 분자를 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공-자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그들의 리간드가 아닌 다른 세포 표면 분자이다.
세포외 도메인과 CAR의 막투과성 도메인 사이에, 또는 세포질 도메인과 CAR의 막투과성 도메인 사이에 스페이서 도메인이 혼입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 막투과성 도메인을 세포외 도메인 또는 폴리펩티드 쇄 중의 세포질 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 스페이서 도메인은 최대 300개 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개 아미노산을 포함할 수 있다.
항원 결합 모이어티
일 구현예에서, 본 발명의 CAR은 달리는 항원 결합 모이어티로서 지칭되는 표적 특이적 결합 요소를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 모이어티는 본원의 다른 부분에 기재된 하나 이상의 TACA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 하기 중 임의의 것의 하나 이상의 TACA 결합 도메인 또는 이의 상동성 펩티드, 또는 이의 상동한 펩티드를 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호; 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7.
일 구현예에서, 조성물은 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자는 하기 중 임의의 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상동한 펩티드을 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호; 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7.
일 구현예에서, CAR의 항원 결합 모이어티는 본원에 기술된 TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드를 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, CAR의 항원 결합 모이어티는 렉틴 결합 도메인을 포함하고, 여기서 렉틴 결합 도메인은 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴 유래된 펩티드에 결합한다.
막투과성 도메인
막투과성 도메인에 관하여, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막투과성 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 일 구현예에서, CAR 내 도메인 중 하나와 천연적으로 연관된 막투과성 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 막투과성 도메인은 수용체 복합체의 기타 구성원을 갖는 상호작용을 최소화하기 위하여 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막투과성 도메인에 대한 그러한 도메인의 결합을 회피하기 위한 아미노산 치환에 의하여 선택 또는 변형될 수 있다.
막투과성 도메인은 천연으로부터, 또는 합성 공급원으로부터 유도될 수 있다. 공급원이 천연일 경우, 막투과성 도메인은 임의의 막-결합 또는 막투과성 단백질로부터 유도될 수 있다. 본 발명에서 특정 용도의 막투과성 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154(즉, 의 적어도 막투과성 영역(들)을 포함)으로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 막투과성 도메인은 합성적일 수 있고, 이 경우, 이는 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항이 합성 막투과성 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 임의로, 바람직하게는 길이 2 내지 10개 아미노산의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 막투과성 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중항은 특히 적합한 링커를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 CAR 중의 막투과성 도메인은 CD8 막투과성 도메인이다. 일부 예에서, 본 발명의 CAR의 막투과성 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다.
세포질 도메인
세포질 도메인 또는 달리, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 배치되어 있는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화에 책임이 있다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 형질유도하여 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 말한다. 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있으나, 많은 경우에 전체 쇄를 사용하는 것은 필수적이지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부위가 용도를 찾을 수 있을 정도까지, 이러한 절단된 부위가 효과기 기능 신호를 형질유도하는 한, 이를 완전한 쇄 대신에 사용한다. 따라서 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 도입하는데 충분한 세포 내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 바람직한 예는 세포질 T 세포 수용체(TCR) 및 항원 수용체 계합에 이어지는 신호 형질도입을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공동 수용체의 세포질 서열뿐만 아니라 이러한 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
TCR만을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전 활성화에 불충분하고, 2차 또는 공-자극성 신호가 또한 필요하다는 것이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 별개의 부류의 세포질 신호 서열: TCR을 통해 항원 의존성 1차 활성화를 개시하는 것들(1차 세포질 신호전달 서열) 및 2차 또는 공-자극성 신호을 제공하기 위해 항원 독립적 방식으로 작용하는 것들(2차 세포질 신호전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 간주될 수 있다.
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용한 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특히 사용되는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유도된 것들을 포함한다. 본 발명의 CAR 중의 세포질 신호전달 분자가 CD3 제타로부터 유도된 세포질 신호전달 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은, 그 자체로, 또는 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 기타 목적 세포질 도메인(들)과 조합된, CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공-자극성 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공자극 신호전달 영역은 공자극성 도메인의 세포내 분자를 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공-자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 리간드 이외의 다른 세포 표면 분자이다. 그와 같은 분자의 예시는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 따라서, 본 발명은 공-자극성 신호전달 요소로서 4-1BB로 주로 예시되지만, 다른 공-자극성 요소는 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 신호 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커 (바람직하게는 2개 내지 10개의 아미노산 길이)가 연결부를 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중항은 특히 적합한 링커를 제공한다.
일 구현예에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 또 다른 구현예에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 추가의 또 다른 구현예에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다.
벡터
본 발명은 CAR를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 상기 서열은 세포내 도메인을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 항원 결합 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, CAR을 암호화하는 분자는, 하기 중 임의의 것의 하나 이상의 TACA-결합 도메인을 포함하는 항원 결합 모이어티를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 상동한 펩티드를 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호; 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7. 일 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산 분자는 하기 중 임의의 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 이의 상동한 펩티드를 포함한다: 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호; 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7. 일 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산 분자는 TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산 분자는 렉틴 결합 도메인에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 렉틴 결합 도메인은 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴 유래된 펩티드에 결합한다.
핵산 분자는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 DNA 또는 RNA 작제물, 벡터 또는 플라스미드일 수 있다.
유전자 변형된 세포
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 펩티드를 발현하도록 변형된 세포를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 세포는 TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 세포는 TACA-결합 도메인 및 T-세포-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 세포는 TACA 결합 도메인을 포함하는 CAR를 발현하도록 변형된다.
특정 구현예에서, 세포는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산과 세포를 접촉시킴으로써 유전자 변형된다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 세포로 전달된다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드를 발현하는 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터는 캡슐화되거나 결합되거나 네이키드(naked) 벡터의 담체 또는 무세포 국소 또는 전신 전달로서 형질도입된 세포를 사용하여 상이한 유형의 진핵 세포로뿐만 아니라 조직 또는 전체 유기체로 전달될 수 있다. 사용되는 방법은 무변성 발현이 필요하거나 충분한 임의의 목적을 위해서일 수 있다.
다른 구현예에서, 핵산 서열은 시험관내 전사된 mRNA를 사용하여 세포로 전달된다. 시험관내 전사된 mRNA는 캡슐화되거나 결합되거나 네이키드 mRNA의 담체 또는 무세포 국소 또는 전신 전달로서 형질감염된 세포를 사용하여 상이한 유형의 진핵 세포로뿐만 아니라 조직 또는 전체 유기체로 전달될 수 있다. 사용되는 방법은 일시적 발현이 필요하거나 충분한 임의의 목적을 위해서일 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 목적하는 펩티드를 발현시킬 수 있는 임의의 적합한 세포 유형일 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 세포가 수용자에게 도입되는 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 세포는 수용자와 관련하여 자가, 동종이계, 동계 또는 이종성이다.
일 구현예에서, 세포는 T 세포이다. 개시된 조성물 및 방법은 표적 암 세포를 사멸하는 유전자 변형 T 세포의 능력의 평가를 포함하여, 암, 줄기 세포, 급성 및 만성 감염, 및 자가면역 질환 분야의 기초 연구 및 치료에서 T 세포 활성의 조절에 적용될 수 있다.
본 발명의 T 세포의 증식 및 유전적 변형 이전에, T 세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. T 세포는 말초 혈액 단핵구, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, T 세포는 숙련가에 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 Ficoll™ 분리를 이용하여 대상체 유래의 수집된 혈액의 단위체로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법에 의해 수득된다. 분리반출법 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵의 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 일 구현예에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포는 후속의 가공 단계를 위하여 혈장 분획을 제거하기 위해 그리고 적절한 버퍼 또는 배지에서 세포를 배치시키기 위해 세정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세정한다. 대안적인 구현예에서, 세정 용액은 칼슘이 부족하고, 마그네슘이 부족할 수 있거나, 모든 2가 양이온은 아니라해도 다수가 부족할 수 있다. 또한, 놀랍게도, 칼슘의 부재하에 초기 활성화 단계는 증식된 활성화를 유도한다. 당업자들은 세정 단계가 제조사의 설명서에 따라서 반자동 "관류" 원심분리기(예: Cobe 2991 세포 가공 처리기, the Baxter CytoMate, 또는 the Haemonetics Cell Saver 5) 사용하는 것과 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 세정 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들면, Ca2 + 비함유, Mg2 + 비함유 PBS, 플라스마라이트(PlasmaLyte) A, 또는 완충제를 포함하거나 포함하지 않는 다른 식염수 용액에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 분리반출법 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고 세포는 배양 배지에서 직접 재-현탁될 수 있다.
또 다른 구현예에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들면, PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심 세광에 의해 단핵세포를 고갈시킴으로써 말초혈 림프구로부터 단리된다. T 세포, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포의 특이적 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들면, 일 구현예에서, T 세포는 항-CD3/항-CD28(즉, 3x28) 콘주게이트된 비드, 예를 들면, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 목적하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 동안 항온처리함으로써 단리된다. 일 구현예에서, 시간은 약 30분이다. 추가의 구현예에서, 시간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상이고, 그 사이에 존재하는 모든 정수 값이다. 추가의 구현예에서, 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 추가의 또 다른 구현예에서, 상기 기간은 10 내지 24시간이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 항온처리 시간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포의 단리를 위해, 24시간과 같은 더 긴 항온처리 시간을 사용하여 세포 수율을 높일 수 있다. 종양 조직 또는 면역 손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 것과 같이 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 T 세포를 단리시키기 위해 더 긴 항온처리 시간이 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 항온처리 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합되도록 하는 시간을 단순하게 단축시키거나 연장시킴에 의하여, 그리고/또는 T 세포 (본원에 추가로 기술됨)에 대한 비드의 비율을 증가시키거나 감소시킴에 의하여, T 세포의 하위집단은 상기 과정 동안 배양 개시에서, 또는 기타 시점에서, 이에 대해, 또는 이에 반하여 우선적으로 선택될 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 우선적으로 배양 개시를 위해 또는 배양 개시에 대해 또는 다른 목적하는 시점에 선택될 수 있다. 당업자는 다수의 선택 순회(rounds)가 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 특정 구현예에서, 선택 절차를 수행하고, 활성화 및 증식 과정에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가의 선택 순회를 실시할 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 고유의 표면 마커에 지시된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 일 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재한 세포 표면 마커로 지향된 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역부착 또는 유세포측정을 통한 세포 분급 및/또는 선택이다. 예를 들면, 음성 선택으로 CD4+ 세포를 농축시키기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+ 를 발현시키는 조절성 T 세포를 농축시키거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 구현예에서, T 조절성 세포는 항-C25 콘주게이트된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의해 목적하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면(예: 비드와 같은 입자)의 농도를 변화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는(즉, 세포의 농도를 증가시키는) 용적을 상당히 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일 구현예에서, 10억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1억개 초과의 세포/㎖가 사용된다. 추가 구현예에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 백만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 추가 구현예에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 백만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1억 2천 5백만개 또는 1억 5천만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증식을 유발할 수 있다. 추가로, 고농도의 세포를 사용하는 것은 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)으로부터 약하게 발현할 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있도록 한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 고농도의 세포를 사용하는 것은 일반적으로 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
관련된 구현예에서, 저농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예: 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석함으로써, 입자와 세포 간의 상호작용이 최소화된다. 이는 입자에 결합되는 목적하는 항원의 높은 양을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들면, CD4+ T 세포는 높은 수준의 CD28를 발현시키고, 희석된 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일 구현예에서, 사용되는 세포의 농도는 5 × 106/㎖이다. 다른 구현예에서, 사용된 농도는 약 1 × 105/㎖ 내지 1 × 106/㎖ 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
다른 구현예에서, 세포는 2 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도에서 시간의 길이를 변화시키는 회전기에서 항온처리될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세정 단계 후 동결될 수 있다. 이론에 결부시키지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 세포 집단에서 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세정 단계 후, 세포를 동결 용액에 현탁시킬 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 맥락에서 유용하지만, 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는, 예를 들면, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적절한 세포 동결 배지를 사용함을 포함하고, 이어서, 세포는 분당 1°의 속도로 -80℃에서 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장한다. -20 ℃에서 또는 액체 질소에서 즉시 조절되지 않은 동결뿐만 아니라 다른 조절된 동결 방법이 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 동결보존된 세포를 해동시키고, 본원에 기술된 바와 같이 세정하고, 실온에서 1시간 동안 휴지시킨 후 본 발명의 방법을 사용하여 활성화시킨다.
본 발명의 맥락에서 본원에 기술된 증식된 세포가 필요할 수 있는 시기 이전의 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출법 생성물의 수집도 또한 고려된다. 이와 같이, 증식될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있고, T 세포와 같은 목적하는 세포는 본원에 기술된 것들과 같은 T 세포 요법으로 부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 수의 질환 또는 병태를 위한 T 세포 요법에서 나중에 사용하기 위해 단리시키고 동결시킬 수 있다. 일 구현예에서, 혈액 샘플 또는 분리반출법은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해진다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플 또는 분리반출법은, 일반적으로 질환의 발병 위험에 처해 있지만, 질환이 발병한 적이 아직 없는 건강한 대상체로부터 취해지며, 그리고 관심 세포는 단리되고, 그리고 이후 사용을 위하여 동결된다. 특정 구현예에서, T 세포는 증식되고, 동결되고 나중에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 본원에 기술된 특정 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가의 구현예에서, 세포는 제제, 예를 들면, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예를 들면, CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코 페놀산, 스테로이드, FR901228 및 조사에 의한 치료를 포함하나, 이에 국한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양식 전에 대상체의 혈액 샘플 또는 분리반출법로부터 단리된다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시네우린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제(라파마이신)를 억제한다(참조: Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun.). 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가의 구현예에서, 세포는 환자를 위해 단리시키고, 골수 또는 줄기 세포 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용하는 T 세포 제거 요법과 함께(예: 전, 동시에 또는 후에) 차후 사용을 위해 동결시킨다. 또 다른 구현예에서, 세포는 이전에 단리시키고, CD20와 반응하는 제제, 예를 들면, 리툭산과 같은 B-세포 제거 용법 후 치료에 차후 사용하기 위해 동결시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서, T 세포는 치료 직후 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물에 의한 치료 후에, 환자가 그 치료로부터 정상적으로 회복될 수 있을 기간 동안 치료 직후에, 수득된 T 세포의 품질은 생체외 증식하는 이의 능력에 대해 최적이거나 증진될 수 있다는 것이 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기술된 방법을 사용하는 생체외 가공 후에, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체내 증식에 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 이러한 회복 단계 동안, T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함한 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 또한, 특정 구현예에서, 동원(예: GM-CSF에 의한 동원) 및 컨디셔닝 레지멘(conditioning regimen)이, 특히 요법 후 정의된 시간 윈도우 동안, 특정 세포 유형의 재집단, 재순환, 재생 및/또는 증식이 유리한 대상체에서 상태(condition)를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예시적 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
본 발명의 펩티드를 발현시키는 T 세포의 유전적 변형 이전 또는 이후 여부에 상관 없이, T 세포는 일반적으로, 예를 들면, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공보 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 증식될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련된 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면 상의 공-자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착되어 있는 표면과 접촉시킴으로써 증식된다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들면, 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어(ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예: 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 액세서리 분자의 공-자극을 위해서, 액세서리 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들면, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하는데 적합한 조건하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위한, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)이 포함되고 당해 기술분야에 통상적으로 공지된 다른 방법에서와 같이 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
특정 구현예에서, T 세포에 대한 1차 자극성 신호 및 공-자극성 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 상태이거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우, 제제는 동일한 표면(즉, "시스" 형태)에 또는 별개의 표면(즉, "트랜스" 형태)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 커플링될 수 있고, 다른 제제는 용액 내일 수 있다. 일 구현예에서, 공-자극성 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 상태이거나 표면에 커플링될 수 있다. 특정 구현예에서, 두 제제는 모두 용액 상태이다. 다른 구현예에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서 세포 발현 Fc 수용체와 같은 표면 또는 항체 또는 제제와 결합하는 다른 결합제에 가교결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들면, 본 발명에서 T 세포를 활성화시키고 증식시키는데 사용하기 위한 것으로 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대한 미국 특허 출원 공보 제20040101519호 및 제20060034810호를 참고하라.
일 구현예에서, 두 가지 제제는 동일한 비드 상에, 즉 "시스"로, 또는 별개의 비드 상에, 즉 "트랜스"로 비드 상에 고정화된다. 예로써, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 공-자극성 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다; 두 제제는 등가의 분자량으로 동일한 비드에 공동-고정화된다. 일 구현예에서, CD4+ T 세포 증식 및 T 세포 성장을 위하여, 결합된 각 항체 대 비드의 1:1 비율이 사용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 증식에 비해 T 세포 증식의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 특정 구현예에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 증식에 비해 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 이들 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 일 양태에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉 CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1보다 크다. 하나의 특정 구현예에서, 비드에 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28 비가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 비드에 결합된 항체의 1:75 CD3:CD28 비가 사용된다. 추가 구현예에서, 비드에 결합된 항체의 1:50 CD3:CD28 비가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 비드에 결합된 항체의 1:30 CD3:CD28 비가 사용된다. 일 바람직한 구현예에서, 비드에 결합된 항체의 1:10 CD3:CD28 비가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 비드에 결합된 항체의 1:3 CD3:CD28 비가 사용된다. 추가의 또 다른 구현예에서, 비드에 결합된 항체의 3:1 CD3:CD28 비가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하기 위해서 사용될 수 있다. 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들면, 작은 크기의 비드는 단지 몇 개의 세포에 결합할 수 있는 반면, 더 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값의 범위이며, 추가의 구현예에서, 상기 비는 1:9 내지 9:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값을 포함하며, 또한 T 세포를 자극하기 위해서 사용될 수 있다. T 세포 자극을 유발하는 T 세포에 대한 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자의 비는 상기 언급한 바와 같이 달라질 수 있지만, 특정의 바람직한 값에는 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 및 15:1이 포함되며, 하나의 바람직한 비는 T 세포당 적어도 1:1 입자이다. 일 구현예에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 하나의 특정 구현예에서, 바람직한 입자:세포 비는 1:5이다. 추가의 구현예에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일수에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 일 구현예에서 입자 대 세포의 비는 1일째에 1:1 내지 10:1이고, 그 후 최대 10일 동안 추가의 입자를 최종 1:1 내지 1:10의 비(첨가일의 세포 계수를 기준으로 함)로 매일 또는 격일로 세포에 첨가한다. 하나의 특정 구현예에서, 입자 대 세포의 비는 자극 1일째에 1:1이고, 자극의 3일 및 5일째에 1:5로 조정된다. 또 다른 구현예에서, 입자는, 매일 또는 격일을 기반으로 하여, 자극 제1일에 1:1, 그리고 제3일 및 제5일에 1:5의 최종 농도로 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 2:1이고, 자극의 제3일 및 제5일에 1:10으로 조정된다. 또 다른 구현예에서, 입자는, 매일 또는 격일을 기반으로 하여, 자극 제1일에 1:1, 그리고 제3일 및 제5일에 1:10의 최종 농도로 첨가된다. 당업자는 다양한 다른 비가 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 추가의 구현예에서, T 세포와 같은 세포는 제제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포는 후속적으로 분리한 다음, 세포를 배양한다. 대안적인 구현예에서, 배양하기 전에 제제-코팅된 비드 및 세포를 분리시키지 않고 함께 배양한다. 추가의 구현예에서, 비드 및 세포를 우선 자기력과 같은 힘의 적용에 의해 농축시켜 세포 표면 마커의 증가된 결찰을 유발함으로써 세포 자극을 유도한다.
예로써, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드(3x28 비드)를 T 세포와 접촉하도록 허용함으로써 결찰될 수 있다. 일 구현예에서, 세포(예: 104 내지 109 T 세포) 및 비드(예: 1:1의 비인 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충제, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 부재) 중에서 조합한다. 또한, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들면, 표적 세포는 샘플 내에서 매우 희귀할 수 있고, 샘플의 0.01%만을 구성할 수 있거나, 전체 샘플(즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 맥락 내이다. 특정 구현예에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는(즉, 세포의 농도를 증가시키는) 용적을 상당히 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 약 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 다른 구현예에서, 1억개 초과의 세포/㎖가 사용된다. 추가 구현예에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 백만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 추가 구현예에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 백만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1억 2천 5백만개 또는 1억 5천만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증식을 유발할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포의 더 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 특정 구현예에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 고농도의 세포를 사용하는 것은 일반적으로 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 혼합물은 수시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 시간의 정수 값 동안 배양될 수 있다. 다른 구현예에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 비드 및 T 세포는 함께 약 8일 동안 배양된다. 다른 구현예에서, 비드 및 T 세포는 함께 2-3일 동안 배양된다. T 세포의 배양시간이 60일 이상이 될 수 있도록 몇몇 자극 주기가 또한 목적시될 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예: 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지되어 있는 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예: 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라즈마네이트(plasmanate), 및 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 배지는 아미노산, 나트륨 피루베이트 및 비타민이 첨가되고, 혈청 부재 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 증식에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들면, 페니실린 및 스트렙토마이신은 단지 실험적 배양물에는 포함되지만, 대상체에게 주입될 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는데 필요한 조건, 예를 들면, 적절한 온도(예: 37℃) 및 분위기(예: 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 전형적인 혈액 또는 성분채집 말초 혈액 단핵세포 산물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단(TC, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함에 의한 T 세포의 생체외 증식은 약 8-9일 전에는 주로 TH 세포로 구성된 반면, 약 8-9일 후에는 T 세포의 집단이 TC 세포의 점점 더 큰 집단을 포함하는 T 세포의 집단을 생산한다. 따라서, 치료의 목적에 따라서 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 단리된 경우, 이 서브세트를 더 큰 정도까지 증식하는 것이 유익할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 이외에, 다른 표현형 마커는 세포 증식 공정의 과정 동안 현저하게, 그러나 대부분, 재생적으로 달라진다. 따라서, 이러한 재생력은 특정한 목적을 위해 활성화된 T 세포 산물을 맞춤화하는 능력을 허용한다.
스캐폴드
본 발명은 하기를 포함하는 스캐폴드 또는 기질 조성물을 제공한다: TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포, 또는 이의 조합. 예를 들어, 일 구현예에서, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포, 또는 이의 조합이 스캐폴드 내 존재한다. 또 다른 구현예에서, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포, 또는 이의 조합이 스캐폴드의 표면에 적용된다. 본 발명의 스캐폴드는 당업계에 공지된 임의의 유형일 수 있다. 이러한 스캐폴드의 비제한적인 예는 하이드로겔, 전기방사 스캐폴드, 발포체, 메시, 시트, 패치 및 스폰지를 포함한다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 본원에 기술된 조성물 중에서 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 제형은 통상적인 부형제, 즉 창상 또는 치료 부위에 투여하기에 적합한 약제학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 담체 물질과 혼합물로서 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균화될 수 있고, 필요시 보조제, 예를 들어, 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압 완충제를 위한 염, 착색제, 및/또는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 이들은 또한 필요시 기타 활성 제제, 예를 들어 기타 진통제와 조합될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는, 예를 들면, 비경구, 정맥내, 종양내, 피하, 근육내 또는 복강내 주사에 의해 또는 주입에 의해 또는 임의의 다른 허용 가능한 전신 방법에 의해 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, “추가 성분”은, 일반적으로, 비제한적으로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 착색제; 보존제; 젤라틴과 같은 생리학적으로 분해 가능한 조성물; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 산화방지제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 약제학적으로 허용가능한 중합체성 또는 소수성 물질. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 추가 성분은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면 문헌 [Genaro, ed. (1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA]에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 조성물은 조성물의 총 중량의 약 0.005% 내지 2.0%의 보존제를 포함할 수 있다. 보존제는 환경 오염물질에 노출될 경우 부패를 방지하기 위해 사용된다. 본 발명에 따라 유용한 보존제의 예는 벤질 알콜, 소르브산, 파라벤, 이미두레아 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 특히 바람직한 보존제는 약 0.5% 내지 2.0%의 벤질 알콜과 0.05% 내지 0.5%의 소르브산의 조합이다.
일 구현예에서, 조성물은 산화방지제 및 조성물의 하나 이상의 성분의 분해를 억제하는 킬레이트제를 포함한다. 일부 화합물에 대한 바람직한 산화방지제는 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.01중량% 내지 0.3중량%의 바람직한 범위의 BHT, BHA, α-토코페롤과 아스코르브산, 더욱 바람직하게는 0.03중량% 내지 약 0.1중량% 범위의 BHT이다. 바람직하게는, 킬레이트제는 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.01중량% 내지 0.5중량%의 양으로 존재한다. 특히 바람직한 킬레이트제는 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.01중량% 내지 0.20중량%의 범위로, 더욱 바람직하게는 0.02중량% 내지 약 0.10중량%의 범위로 에데테이트 염(예: 나트륨 에데테이트) 및 시트르산을 포함한다. 킬레이트제는 제제의 저장 수명에 유해할 수 있는 조성물 중의 금속 이온을 킬레이트화하는 데 유용하다. BHT 및 2나트륨 에데테이트는 일부 화합물에 대해 각각 특히 바람직한 산화방지제 및 킬레이트제인 반면, 다른 적합한 등가의 산화방지제 및 킬레이트제는 당업자들에게 공지된 바와 같이 따라서 치환될 수 있다.
액체 현탁액은 수성 또는 유성 비히클 중의 본 발명의 펩티드 또는 다른 조성의 현탁액을 달성하기 위해 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 수성 비히클은, 예를 들면, 물 및 등장성 식염수를 포함한다. 유성 비히클은, 예를 들면, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜, 식물성 오일, 예를 들면, 아라키스, 올리브, 참깨 또는 코코넛 오일, 분획화 식물성 오일, 및 광유, 예를 들면, 액체 파라핀을 포함한다. 액체 현탁액은 현탁화제, 분산제 또는 습윤제, 유화제, 완화제, 보존제, 완충제, 염, 향료, 착색제 및 감미제를 포함하나, 이에 국한되지 않는 하나 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 유성 현탁액은 증점제를 추가로 포함할 수 있다. 공지된 현탁화제는 소르비톨 시럽, 수소화 식용 지방, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검, 아카시아 검, 및 셀룰로스 유도체, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 공지된 분산제 또는 습윤제는 천연 포스파티드, 예를 들면, 레시틴, 장쇄 지방족 알콜, 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르(예: 각각 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 헵타데카에릴렌옥시세탄올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트)와 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 공지된 유화제는 비제한적으로 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 공지된 보존제는 메틸, 에틸 또는 n-프로필-파라-하이드록시벤조에이트, 아스코르브산 및 소르브산을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
치료적 적용
본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 혈액학적 악성종양, 고형 종양, 원발성 또는 전이성 종양을 포함하는 임의의 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 대상체와 본 발명의 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 조성물을 대상체에 접촉시키는 단계를 포함한다: TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포, 또는 이의 조합. 일 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 조성물을 대상체에 접촉시키는 단계를 포함한다: TACA-결합 도메인 및 T-세포-결합 도메인을 포함하는 펩티드, TACA-결합 도메인 및 T-세포-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, TACA-결합 도메인 및 T-세포-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포, 또는 이의 조합.
본 발명은 종양 세포에 존재하는 TACA에의 결합을 통해 종양 세포에 특이적으로 결합하는 TACA 결합 도메인을 포함하는 펩티드의 사용을 제공한다. 특정 구현예에서, 펩티드는 TACA을 발현하는 종양 세포에 T 세포에 대한 T 세포 결합 도메인의 결합을 통해 T 세포를 보충하는 데 사용된다. 따라서, 본 발명은 조성물은 또한 본원에 기술된 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 조성물을 대상체에 접촉시키는 단계를 포함한다: TACA-결합 도메인에 결합하는 펩티드, TACA-결합 도메인에 결합하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 또는 TACA-결합 도메인에 결합하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 조성물을 대상체에 접촉시키는 단계를 포함한다: 렉틴-결합 도메인을 포함하는 펩티드, 렉틴-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 렉틴-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포 (여기서 상기 렉틴-결합 도메인은 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴-유도된 펩티드에 결합한다).
일 구현예에서, 상기 방법은 (1) TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드, TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 또는 TACA 결합 도메인에 결합하는 펩티드를 발현시키도록 변형된 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 및 (2) TACA 결합 도메인 또는 TACA 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 방법은 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴-유도된 펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 렉틴 또는 렉틴-유도된 펩티드에 결합하는 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 투여하는 단계로서, 상기 CAR은 렉틴-결합 도메인을 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함하는, 상기 투여 단계, 및 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴-유도된 펩티드를 포함하는 조성물을 투여하여, 이로써 CAR이 TACA에 결합하는 렉틴 또는 렉틴-유도된 펩티드에 결합하도록 하는 단계를 포함한다. 특정 경우에는, TACA 결합 렉틴 및 렉틴 결합 조성물(예: 항-렉틴 CAR을 발현하도록 가공된 T 세포)을 투여하는 것이 유리할 수 있다. 첫째, 이 방법은 렉틴의 반감기가 가공된 T 세포보다 훨씬 더 짧기 때문에 T세포 반응을 시간 제한하는 능력을 가질 수 있다. 가공된 T 세포는 수년 동안 잔류할 수 있지만, 렉틴 없이, T 세포는 비활성이어서 반응의 지속성을 제한하여 고형암을 쉽게 표적화할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 T 세포가 본 발명의 펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형되고, 세포가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 일종의 세포 요법을 포함한다. 특정 구현예에서, 주입된 세포는 수용자에서 종양 세포를 사멸할 수 있다. 항체 요법과는 달리, 변형된 세포는 생체내에서 복제하여 지속된 종양 조절을 유발할 수 있는 장기간 지속성을 유발할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 변형된 T 세포는 강건한 생체내 T 세포 증식을 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 T 세포는 임의의 추가의 종양 형성 또는 성장을 억제하도록 재활성화될 수 있는 특정 기억 T 세포로 진화한다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 T 세포는, 활발한 생체내 T 세포 증식을 경험하고, 혈액 및 골수 내 연장된 시간 동안 높은 수준에서 지속하고, 그리고 특이적 기억 T 세포를 형성할 수 있다.
치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않거나, 아직 실질적으로 혈관화되지 않은 종양뿐만 아니라 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양(예: 혈액 종양, 예를 들면, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료될 암의 유형에는 암종, 모세포종 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프구 악성종양, 양성 및 악성종양, 및 악성종양, 예를 들면, 육종, 암종 및 흑색종이 포함되지만, 이에 국한되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암도 또한 포함된다.
혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적 (또는 조혈성) 암의 예로는 급성 백혈병(예: 급성 림프성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수모구성, 전골수성, 골수단핵구성, 단구성 및 적백혈병), 만성 백혈병(예: 만성 골수성 (과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병), 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종(무통성 및 고등급 형태), 다발성 골수종, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환, 골수형성이상 증후군, 모양 세포 백혈병 및 골수이형성을 포함하는 백혈병이 포함된다.
고형 종양은 일반적으로 낭종이나 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형은 이를 형성하는 세포의 유형에 대해 명명된다(예를 들면, 육종, 암종 및 림프종). 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예로는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프성 악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종(sweat gland carcinoma), 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 유두상 갑상선암, 크롬친화성 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간세포암, 담관암, 융모암, 윌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양(예: 신경교종(예: 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 아교모세포종(또한, 다형성 아교모세포종으로도 공지됨), 성상세포종, CNS 림프종, 종자세포종, 수아세포종, 슈반세포종 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초종, 희돌기아세교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종 및 뇌전이)이 포함된다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 함께 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 간단하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본원에 기술된 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예를 들면, 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 등; 탄수화물, 예를 들면, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들면, 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예: 수산화알루미늄); 보존제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료(또는 예방)될 질환에 대해서 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해서 결정될 것이지만, 적절한 용량은 임상 시험에 의해서 결정될 수 있다.
"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량" 또는 "치료적 양"이 지시되는 경우에, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 병태에서의 개인적 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식 또는 이식술에 의함을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 절내(intranodally), 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사 또는 복강내 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 피내 또는 피하 주입에 의하여 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 i.v. 주사로 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 종양 또는 림프절에 직접 주사될 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예를 들면, CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 조사에 의한 치료를 포함하나, 이에 국한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께(예: 전에, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여된다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시네우린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제(라파마이신)를 억제한다(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용하는 T 세포 제거 요법과 함께(예: 전, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD20과 반응하는 제제, 예를 들면, 리툭산과 같은 B-세포 제거 요법 후에 투여된다. 예를 들면, 일 구현예에서, 대상체는 고용량의 화학요법을 이용한 표준 치료에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식을 겪을 수 있다. 특정 구현예에서, 이식 후, 대상체는 본 발명의 증식된 면역 세포의 주입을 제공받는다. 추가의 구현예에서, 증식된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 종양 또는 병든 조직의 외과적 절제술 또는 용적 축소 동안 투여된다. 예를 들면, 병에 걸린 조직 또는 종양의 외과적 치료를 받은 대상체에서, 조성물은 종양을 추가로 치료하기 위해 그 부위에 투여할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 스캐폴드를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다: TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, TACA-결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포, 또는 이의 조합.
조성물 및 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및 다른 영장류, 상업적으로 중요한 포유동물을 포함하는 포유동물, 예를 들면, 비인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 또는 개를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
환자에게 투여되는 상기 치료제의 투여량은 치료되는 상태의 정확한 특성 및 치료의 수용자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 당해 기술 분야에서 허용되는 관행에 따라 수행될 수 있다. T 세포 투여 및 스케줄링이 검토되어 왔다 (Ertl et al, 2011, Cancer Res, 71:3175-81; Junghans, 2010, Journal of Translational Medicine, 8:55).
실험적 실시예
본 발명은 이하의 실험적 실시예를 참조하여 상세히 더욱 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 목적을 위하여 제공되며, 달리 특정되지 않는 한 제한이 되도록 의도되지 않는다. 따라서 본 발명은 여하튼 이하의 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되고, 오히려 본 명세서에서 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 모든 변형을 망라하도록 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이도, 당업자라면, 선행하는 설명 및 이하의 예시적인 실시예를 이용해서 본 발명을 제조하고 이용하고 그리고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 다음의 작업 실시예는 이런 이유로, 본 발명의 바람직한 구현예를 구체적으로 지적하고, 그리고 본 발명의 나머지를 어떤 방식으로도 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 글리칸 -의존 T 세포 동원인자 ( GlyTR )
세포의 악성 형질 전환은 거의 보편적으로 세포 표면 상의 글리코실화의 비정상적인 변화를 수반한다 (Kim and Varki, 1997, Glycoconj J, 14: 569-576). 실제로, 세포 표면 글리코실화의 변경은 모든 유형의 실험 및 인간 암에서 관찰되었고(Hakomori , 2002, PNAS USA, 99: 10231-10233), 이러한 변경된 당 구조는 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)이라 지칭된다(표 1). 이러한 종양 특이적 특성은 세포 표면 TACA가 많은 일반적인 암을 표적화하는 단클론성 항체의 생산을 위한 우수한 표적 항원이 되게 한다. 그러나, 수십 년간의 노력에도 불구하고, TACA에 대해 높은 친화력을 갖는 특정 항체는 탄수화물 항원에 대한 항체를 생성하는 어려움으로 인해 아직 이용할 수 없다.
이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 탄수화물에 결합하는 단백질인 렉틴을 이용하는 것이다. 진화는 수 많은 다른 탄수화물 잔기에 대해 매우 특이적인 수백 가지의 상이한 탄수화물 결합 단백질을 생산했다. 또한, 식물과 동물 모두에서 렉틴은 수십 년 동안 광범위하게 사용되어 왔고, 이들의 결합 특성은 잘 이해된다.
T 세포 및/또는 다른 암 사멸 세포에 결합할 항체 도메인에 커플링된 렉틴으로부터의 탄수화물 결합 도메인으로 이루어진 키메라 단백질의 부류가 본원에 기술된다. 키메라 단백질의 이러한 부류는 본원에서 글리칸-의존적 T 세포 동원인자 (GlyTR)로 지칭된다. GlyTR 키메라 단백질은 암 특이적 탄수화물 항원을 표적화하고, T 세포 매개 사망을 유도하도록 설계된다. 신규한 GlyTR 분자의 예시는 표 2에 열거된다.
GlyTR의 분자의 사용을 입증하기 위해, 상피 및 조혈암을 포함하는 많은 상이한 종류의 암 세포 상에서 종종 과발현되는 탄수화물 구조인 β1,6 GlcNAc-분지형 Asn (N) 결합된 글리칸 및 T 세포 상에서 CD3을 표적화하는 GlyTR가 설계되어 생산되었다.
β1,6GlcNAc-분지형 N-글리칸은 복합체-유형 N-글리칸의 서브세트를 구성하는 트리- 및 테트라-안테너리 올리고당이다(도 1). 고도로 특이적인 식물 렉틴 L-PHA(페이스올러스 불가리스, 백혈구응집소)는 세포의 β1,6GlcNAc 분지화 수준을 측정하는 데 사용되었다. β1,6GlcNAc 분지형 N-글리칸에 대한 L-PHA의 매우 특이적인 결합 특성 및 이중특이적 항체의 기술을 이용하기 위해, 신규 이중특이성 키메라 단백질이 렉틴 L-PHA 및 항-CD3의 scFv 모두로 이루어진 단일 쇄 폴리펩티드(L-PHA x CD3, 도 2)를 생성시킴으로써 생성되었다.
유동 세포계측 분석은, 세포가 골지(Golgi) 분지화 억제제 키푸넨신으로 예비처리되었을 때 만성 골수성 백혈병 세포주인 K562에 대한 결합의 완전한 역전에 의해 입증된 바와 같이, GlyTR L-PHA x CD3이 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리칸에 특이적으로 결합한다는 것을 확인했다(도 3). CD3에 대한 결합은 또한 CD3을 발현하는 주르카트 T 세포의 분석에 의해 확인하고 키푸넨신으로 처리하였고, 여기서 치료는 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리칸에 대한 결합을 제거했다(도 3).
GlyTR L-PHA의 X CD3는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 검정에서 효과기 세포로서 휴지성 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 K562, B 세포 림프종(Raji), 다발성 골수종(RPMI 8226), 급성 림프모구 백혈병(RS4; 11), 유방 선암종(MCF7), 결장직장 선암종(HT-29), 간 간세포 암종(Hep G2) 및 자궁 경부암(HeLa) 세포에 한 T 세포 사멸을 지시하는 이의 능력에 대해 시험했다(도 4a-도 4j). 결과는, GlyTR L-PHA x CD3이 투여량 의존적으로 암 세포의 T 세포 사멸을 투여량 의존적으로 유도했다는 것을 입증한다. 중요하게는, β1,6GlcNAc 분지화를 감소시키는 골지 억제제 키푸넨신으로 예비 처리된 암 세포의 사멸은 심하게 억제되어(도 4b) GlyTR L-PHA x CD3에 의해 유도된 사멸이 탄수화물 항원이 존재에 의존한다는 것을 입증한다. 또한, 오프 타겟(비-암) PBMC의 사멸은 매우 낮아서 암에 대한 특이성을 입증한다(도 4c).
요약하면, GlyTR 키메라 단백질은 기존 기술에 비해 상당한 이점을 갖는, 암 면역요법에 대한 신규 부류의 치료 약물의 개발 기회를 제공한다. GlyTR 개념 및 많은 상이한 TACA에 특이적인 많은 상이한 렉틴의 이용가능성에 기초하여, 복수의 GlyTR은 L-PHA를 다른 렉틴으로 대체함으로써 생성될 수 있거나; 키메라 단백질은 다른 면역 효과기 세포를 동원할 수 있는 렉틴 및 scFv로 구성되는 키메라 단백질을 생산할 수 있다.
렉틴 도메인의 기능성은 돌연변이를 통해 개선될 수 있다. 예를 들면, GlyTR L-PHA x CD3은 결합을 약(~) 20 내지 30배 증가시키는 L-PHA와 E-PHA의 탄수화물 결합 도메인을 교환함으로써 추가로 개선될 수 시간 있다 (Kaneda et al., 2002, J Biol Chem, 277: 16928-16935). GlyTR L-PHA x CD3은 이량체인 것으로 보이고, 이것이 문제로 입증되면, 이량체 형성을 매개하는 L-PHA 도메인의 처음 5개 N-말단 아미노산이 이량체화를 예방하기 위해 GlyTR L-PHA x CD3 단백질에서 결실될 수 있다. 최종적으로, 이중특이적 키메라 단백질을 생성하는 것 이외에, 렉틴은 암을 위한 키메라 항원 수용체에 이용될 수 있다 (Barrett et al., 2014, Ann Rev Med, 65: 333-347).
실시예 2: 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
GlyTR L-PHA x CD3
리더 서열―L-PHA-링커-항-CD3 scFv-His 태그
단백질 서열: 525 aa
MGWSCIILFLVATATGVHSSNDIYFNFQRFNETNLILQRDASVSSSGQLRLTNLNGNGEPRVGSLGRAFYSAPIQIWDNTTGTVASFATSFTFNIQVPNNAGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPTERHIGIDVNSIRSIKTTRWDFVNGENAEVLITYDSSTNLLVASLVYPSQKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVSVGFSATTGINKGNVETNDVLSWSFASKLSDGTTSEGLNLANLVLNKILGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH. (서열 번호: 11)
분자를 단량체화하는, 돌연변이화된 GlyTR L-PHA x CD3.
리더 서열―L-PHA( Δ1 -5)-링커 -- 항-CD3 scFv-His-태그
단백질 서열: 520 aa
MGWSCIILFLVATATGVHSFNFQRFNETNLILQRDASVSSSGQLRLTNLNGNGEPRVGSLGRAFYSAPIQIWDNTTGTVASFATSFTFNIQVPNNAGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPTERHIGIDVNSIRSIKTTRWDFVNGENAEVLITYDSSTNLLVASLVYPSQKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVSVGFSATTGINKGNVETNDVLSWSFASKLSDGTTSEGLNLANLVLNKILGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH (서열 번호: 12)
결합 친화도를 증가시키는, 돌연변이화된 GlyTR L-PHA x CD3.
리더 서열―돌연변이화된 L-PHA - 링커 -- 항-CD3 scFv-His 태그
단백질 서열
MGWSCIILFLVATATGVHSASQTSFSFQRFNETNLILQRDATVSSKGQLRLTNVNDNGEPTLSSLGRAFYSAPIQIWDNTTGAVAASPTSFTFNIDVPNNSGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPKPRHIGIDVNSIKSIKTTTWDFVKGENAEVLITYDSSTKLLVASLVYPSLKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVIVGFTATTGITKGNVETNDILSWSFASKLSDGTTSEALNLANFALNQILGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH (서열 번호: 13)
분자를 단량체화하고, 그리고 결합 친화도를 증가시키는, 돌연변이화된 GlyTR L-PHA x CD3.
리더 서열―돌연변이화된 L-PHA - 링커 -- 항-CD3 scFv-His 태그
단백질 서열
MGWSCIILFLVATATGVHSFSFQRFNETNLILQRDATVSSKGQLRLTNVNDNGEPTLSSLGRAFYSAPIQIWDNTTGAVAASPTSFTFNIDVPNNSGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTVAVEFDTLYNKDWDPKPRHIGIDVNSIKSIKTTTWDFVKGENAEVLITYDSSTKLLVASLVYPSLKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVIVGFTATTGITKGNVETNDILSWSFASKLSDGTTSEALNLANFALNQILGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH (서열 번호: 14)
비시아 빌로사 이소렉틴 B x CD3 scFv (VVAb x CD3)
VVA - 링커 - CD3 scFV - His 태그
단백질 서열
TESTSFSFTNFNPNQNNLILQEDALVNSAGTLELTAVAAGAPVPDSLGRALYAAPIHIHDNTTLASFTTSFSFVMAAPAAAAVADGLAFFLAPPDTQPQARGGFLGLFADRAHDASYQTVAVEFDTYSNAWDPNYTHIGIDTNGIESKKTTPFDMVYGEKANIVITYQASTKALAASLVFPVSQTSYAVSARVDLRDILPEYVRVGFSATTGLNAGVVETHDIVSWSFAVSLAGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH (서열 번호: 15)
VVAb x CD3 (VVAbΔ1 - 5 x CD3 scFV)
VVAbΔ1 -5 - 링커 - CD3 scFV - His 태그
단백질 서열
FSFTNFNPNQNNLILQEDALVNSAGTLELTAVAAGAPVPDSLGRALYAAPIHIHDNTTLASFTTSFSFVMAAPAAAAVADGLAFFLAPPDTQPQARGGFLGLFADRAHDASYQTVAVEFDTYSNAWDPNYTHIGIDTNGIESKKTTPFDMVYGEKANIVITYQASTKALAASLVFPVSQTSYAVSARVDLRDILPEYVRVGFSATTGLNAGVVETHDIVSWSFAVSLAGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH (서열 번호: 16)
CD301 x CD3 scFv ( CD301 EC x CD3)의 세포외 도메인
CD301EC - 링커 - CD3 scFV - His 태그
단백질 서열
QNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEGFKQERQAGVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVPVHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLVVINSREEQNFVQKYLGSAYTWMGLSDPEGAWKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCAHFHPDGRWNDDVCQRPYHWVCEAGLGQTSQESHGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH (서열 번호: 17)
GlyTR L-PHA x CD3
유전자 서열: 1604bp (293 및 CHO 둘 모두로의 코돈 최적화)
EcoRI--코작 서열--리더 서열―L-PHA-링커-항-CD3 scFv-His 태그―XbaI
EcoRI 및 XbaI 서열은 밑줄로 표시된다. 코작 서열은 볼드체이다.
GAATTCCCGCCGCCACCCAAGGCCACCCTGACCACCGATAAGTCTTCCAGCACAGCTTATATGCAGCTGTCTTCCCTGACCAGCGAGGACTCTGCCGTGTACTATTGCGCTAGGTACTATGACGATCATTACTGTCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACACTGACAGTGAGCTCTGTGGAGGGAGGCTCCGGAGGCAGCGGAGGCTCTGGAGGCTCCGGAGGAGTGGACGACATCCAGCTGACCCAGTCCCCTGCCATCATGTCTGCTTCCCCCGGCGAGAAGGTCACCATGACATGCAGGGCCTCCAGCTCTGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGAGCGGCACATCTCCTAAGAGATGGATCTACGACACCAGCAAGGTGGCCTCTGGCGTGCCATATAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGCATGGAGGCTGAGGATGCCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCTTCCAATCCTCTGACATTTGGGGCTGGGACTAAACTGGAACTGAAACACCACCACCACCACCACTGATAAtctaga (서열 번호: 18)
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원, 및 공보의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 통합된다. 본 발명은 특정 구현예에 대한 참조로 개시되는 한편, 본 발명의 다른 구현예 및 변형예는 본 발명의 실제 사상 및 범위를 벗어남 없이 본 기술분야의 숙련가에 의해 구상될 수 있다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 구현예 및 등가 변형예를 포함하는 것으로 의도된 것으로 해석되어야 한다.
<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> Glycan-dependent Immunotherapeutic Molecules <130> MPI17-020 <150> US 62/155,761 <151> 2015-05-01 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Phaseolus vulgaris <400> 1 Ser Asn Asp Ile Tyr Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ile Leu Gln Arg Asp Ala Ser Val Ser Ser Ser Gly Gln Leu Arg Leu 20 25 30 Thr Asn Leu Asn Gly Asn Gly Glu Pro Arg Val Gly Ser Leu Gly Arg 35 40 45 Ala Phe Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Thr 50 55 60 Val Ala Ser Phe Ala Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Gln Val Pro Asn 65 70 75 80 Asn Ala Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly 85 90 95 Ser Gln Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser 100 105 110 Asn Ser Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn 115 120 125 Lys Asp Trp Asp Pro Thr Glu Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser 130 135 140 Ile Arg Ser Ile Lys Thr Thr Arg Trp Asp Phe Val Asn Gly Glu Asn 145 150 155 160 Ala 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His His His His His 515 520 525 <210> 12 <211> 520 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 12 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu Ile Leu 20 25 30 Gln Arg Asp Ala Ser Val Ser Ser Ser Gly Gln Leu Arg Leu Thr Asn 35 40 45 Leu Asn Gly Asn Gly Glu Pro Arg Val Gly Ser Leu Gly Arg Ala Phe 50 55 60 Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Thr Val Ala 65 70 75 80 Ser Phe Ala Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Gln Val Pro Asn Asn Ala 85 90 95 Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly Ser Gln 100 105 110 Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser Asn Ser 115 120 125 Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn Lys Asp 130 135 140 Trp Asp Pro Thr Glu Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Arg 145 150 155 160 Ser Ile Lys Thr Thr Arg Trp Asp Phe Val Asn Gly Glu Asn Ala Glu 165 170 175 Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Asn Leu 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Gly Ser Gly Gly 385 390 395 400 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 405 410 415 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg 420 425 430 Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly 435 440 445 Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly 450 455 460 Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 465 470 475 480 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 485 490 495 Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 500 505 510 Leu Lys His His His His His His 515 520 <210> 13 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 13 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Ser Gln Thr Ser Phe Ser Phe Gln Arg Phe Asn Glu 20 25 30 Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg Asp Ala Thr Val Ser Ser Lys Gly Gln 35 40 45 Leu Arg Leu Thr Asn Val Asn Asp Asn Gly Glu Pro Thr Leu Ser Ser 50 55 60 Leu Gly Arg Ala Phe Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr 65 70 75 80 Thr Gly Ala Val Ala Ala Ser Pro Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Asp 85 90 95 Val Pro Asn Asn Ser Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val 100 105 110 Pro Val Gly Ser Gln Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe 115 120 125 Asp Gly Ser Asn Ser Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr 130 135 140 Leu Tyr Asn Lys Asp Trp Asp Pro Lys Pro Arg His Ile Gly Ile Asp 145 150 155 160 Val Asn Ser Ile Lys Ser Ile Lys Thr Thr Thr Trp Asp Phe Val Lys 165 170 175 Gly Glu Asn Ala Glu Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Lys Leu 180 185 190 Leu Val Ala Ser Leu Val Tyr Pro Ser Leu Lys Thr Ser Phe Ile Val 195 200 205 Ser Asp Thr Val Asp Leu Lys Ser Val Leu Pro Glu Trp Val Ile Val 210 215 220 Gly Phe Thr Ala Thr Thr Gly Ile Thr Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn 225 230 235 240 Asp Ile Leu Ser Trp Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr 245 250 255 Ser Glu Ala Leu Asn Leu Ala Asn Phe Ala Leu Asn Gln Ile Leu Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala 275 280 285 Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr 290 295 300 Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly 305 310 315 320 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr 325 330 335 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser 340 345 350 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 355 360 365 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 370 375 380 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln 405 410 415 Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val 420 425 430 Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr 435 440 445 Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser 450 455 460 Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 465 470 475 480 Thr Ser 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Ser Ala Gly Thr Leu 20 25 30 Glu Leu Thr Ala Val Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Asp Ser Leu Gly 35 40 45 Arg Ala Leu Tyr Ala Ala Pro Ile His Ile His Asp Asn Thr Thr Leu 50 55 60 Ala Ser Phe Thr Thr Ser Phe Ser Phe Val Met Ala Ala Pro Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Val Ala Asp Gly Leu Ala Phe Phe Leu Ala Pro Pro Asp Thr 85 90 95 Gln Pro Gln Ala Arg Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Ala Asp Arg Ala 100 105 110 His Asp Ala Ser Tyr Gln Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Tyr Ser 115 120 125 Asn Ala Trp Asp Pro Asn Tyr Thr His Ile Gly Ile Asp Thr Asn Gly 130 135 140 Ile Glu Ser Lys Lys Thr Thr Pro Phe Asp Met Val Tyr Gly Glu Lys 145 150 155 160 Ala Asn Ile Val Ile Thr Tyr Gln Ala Ser Thr Lys Ala Leu Ala Ala 165 170 175 Ser Leu Val Phe Pro Val Ser Gln Thr Ser Tyr Ala Val Ser Ala Arg 180 185 190 Val Asp Leu Arg Asp Ile Leu Pro Glu Tyr Val Arg Val Gly Phe Ser 195 200 205 Ala Thr Thr Gly Leu Asn Ala Gly Val Val Glu Thr His Asp Ile Val 210 215 220 Ser Trp Ser Phe Ala Val Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 355 360 365 Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser 370 375 380 Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 385 390 395 400 Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp 405 410 415 Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser 420 425 430 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 435 440 445 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro 450 455 460 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His 465 470 475 480 His His <210> 17 <211> 510 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 17 Gln Asn Ser Lys Phe Gln Arg Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr Asp Phe 1 5 10 15 Ser Asn Phe Thr Ser Asn Thr Val Ala Glu Ile Gln Ala Leu Thr Ser 20 25 30 Gln Gly Ser Ser Leu Glu Glu Thr Ile Ala Ser Leu Lys Ala Glu Val 35 40 45 Glu Gly Phe Lys Gln Glu Arg Gln Ala Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu 50 55 60 His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser 65 70 75 80 Val Cys Val Pro Val His Ser Glu Met Leu Leu Arg Val Gln Gln Leu 85 90 95 Val Gln Asp Leu Lys Lys Leu Thr Cys Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn 100 105 110 Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His 115 120 125 Gln Asp Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Met Ser Trp Ala Glu 130 135 140 Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Lys Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn 145 150 155 160 Ser Arg Glu Glu Gln Asn Phe Val Gln Lys Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr 165 170 175 Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Ala Trp Lys Trp Val Asp 180 185 190 Gly Thr Asp Tyr Ala Thr Gly Phe Gln Asn Trp Lys Pro Gly Gln Pro 195 200 205 Asp Asp Trp Gln Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His 210 215 220 Phe His Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr 225 230 235 240 His Trp Val Cys Glu Ala Gly Leu Gly Gln Thr Ser Gln Glu Ser His 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 260 265 270 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr 275 280 285 Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 290 295 300 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser 325 330 335 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 340 345 350 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp 355 360 365 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile 385 390 395 400 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 405 410 415 Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp 420 425 430 Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr 435 440 445 Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 450 455 460 Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala 465 470 475 480 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly 485 490 495 Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His 500 505 510 <210> 18 <211> 1604 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 18 gaattcccgc cgccaccatg ggttggtctt gcatcatcct gttcctggtc gccactgcta 60 ctggggtcca ctcttctaac gacatctact ttaactttca gcgtttcaat gagacaaacc 120 tgatcctgca gagggacgcc agcgtgtcca gctctggcca gctgcggctg accaacctga 180 atggcaacgg agagccaagg gtgggctccc tgggacgggc cttctattcc gcccccatcc 240 agatctggga caataccaca ggcacagtgg cctccttcgc cacctccttc accttcaaca 300 tccaagtgcc caacaatgcc ggccctgctg atggcctggc cttcgctctg gtgccagtgg 360 gctctcagcc caaggacaag ggcggcttcc tgggcctctt tgatggcagc aattctaact 420 tccacaccgt ggctgtggag tttgacacac tgtacaataa ggactgggac cccaccgaga 480 ggcatatcgg catcgacgtg aactccatca gaagcatcaa gaccacaaga tgggattttg 540 tgaatggcga gaacgccgag gtcctgatca cctatgattc cagcacaaac ctgctggtgg 600 ctagcctggt gtacccctct cagaagacct ccttcatcgt gagcgataca gtggatctga 660 agtctgtgct gcctgagtgg gtgtctgtgg gcttttccgc caccaccggc atcaataagg 720 gcaacgtgga gaccaatgac gtgctgtcct ggagctttgc ctctaagctg tccgatggca 780 ccacatctga gggcctgaat ctggctaacc tggtgctgaa caagatcctg ggcggcggcg 840 gctctgacat caagctgcag cagtccggag ctgagctggc taggcctgga gctagcgtga 900 agatgtcttg caagacctcc ggctacacct tcacaaggta tacaatgcac tgggtcaagc 960 agagacccgg ccagggcctg gagtggatcg gctatatcaa tccttcccgg ggctatacca 1020 attataacca gaagtttaag gacaaggcca ccctgaccac cgataagtct tccagcacag 1080 cttatatgca gctgtcttcc ctgaccagcg aggactctgc cgtgtactat tgcgctaggt 1140 actatgacga tcattactgt ctggattatt ggggccaagg caccacactg acagtgagct 1200 ctgtggaggg aggctccgga ggcagcggag gctctggagg ctccggagga gtggacgaca 1260 tccagctgac ccagtcccct gccatcatgt ctgcttcccc cggcgagaag gtcaccatga 1320 catgcagggc ctccagctct gtgagctaca tgaactggta tcagcagaag agcggcacat 1380 ctcctaagag atggatctac gacaccagca aggtggcctc tggcgtgcca tataggttca 1440 gcggctctgg ctccggcacc agctactctc tgacaatctc cagcatggag gctgaggatg 1500 ccgctaccta ctattgtcag cagtggtctt ccaatcctct gacatttggg gctgggacta 1560 aactggaact gaaacaccac caccaccacc actgataatc taga 1604

Claims (96)

  1. 암 치료용 조성물로서,
    렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 포함하고,
    상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x/a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합하는, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합하는, 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 TACA-결합 도메인은 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 상기 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드인, 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합하는, 조성물.
  14. 청구항 12에 있어서, T-세포 결합 도메인은 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물: 서열 번호: 9, 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 펩티드는 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  16. 청구항 11에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합하는, 조성물.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는 상기 TACA 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는, 조성물.
  19. 암 치료용 조성물로서,
    렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하고,
    상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  24. 청구항 19에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x/a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합하는, 조성물.
  25. 청구항 19에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합하는, 조성물.
  26. 청구항 19에 있어서, 상기 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  27. 청구항 19에 있어서, 상기 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 상기 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드인, 조성물.
  28. 청구항 19에 있어서, 상기 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함하는, 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합하는, 조성물.
  32. 청구항 30에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호: 9 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 T-세포 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
  33. 청구항 30에 있어서, 상기 핵산 분자가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  34. 청구항 28에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합하는, 조성물.
  36. 청구항 19에 있어서, 상기 핵산 분자는 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하며, 상기 항원 인식 도메인은 TACA-결합 도메인을 포함하는, 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 핵산 분자에 의하여 암호화된 상기 CAR의 상기 항원 인식 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 포함하는, 조성물: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  38. 청구항 36에 있어서, 상기 핵산 분자에 의하여 암호화된 상기 CAR의 상기 세포내 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인 및 공자극성 도메인을 포함하는, 조성물.
  39. 청구항 19에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 조성물.
  40. 청구항 19에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자가 시험관내 전사된 RNA를 포함하는, 조성물.
  41. 암 치료용 조성물로서,
    렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 제제를 포함하고,
    상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 제제가 렉틴 결합 도메인을 포함하는, 조성물.
  43. 암 치료용 조성물로서,
    렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하고,
    상기 TACA 결합 도메인은 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 핵산 분자에 의하여 암호화된 상기 펩티드는 렉틴-결합 도메인을 포함하는, 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자는 항원 결합 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 암호화하며, 상기 항원 결합 도메인은 상기 렉틴-결합 도메인을 포함하는, 조성물.
  46. 렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포로서,
    상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 세포.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 세포는, 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형되며, 상기 항원 인식 도메인은 상기 TACA-결합 도메인을 포함하는, 세포.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL) 및 조절성 T 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포.
  49. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  51. 청구항 49에 있어서, 상기 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  52. 청구항 50에 있어서, 상기 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  53. 청구항 50에 있어서, 상기 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 청구항 49에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x/a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합하는, 방법.
  55. 청구항 49에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합하는, 방법.
  56. 청구항 49에 있어서, 상기 TACA-결합 도메인은 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  57. 청구항 49에 있어서, 상기 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 상기 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드인, 방법.
  58. 청구항 49에 있어서, 상기 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  59. 청구항 49에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합하는, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합하는, 방법.
  62. 청구항 60에 있어서, 상기 T-세포 결합 도메인은 서열 번호: 9, 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  63. 청구항 60에 있어서, 상기 펩티드는 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  64. 청구항 59에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합하는, 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합하는, 방법.
  66. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 TACA를 발현하는 고형 종양을 갖는, 방법.
  67. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법으로서,
    렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 렉틴은 포유동물 렉틴, 인간 렉틴, 식물 렉틴, 박테리아 렉틴, 바이러스 렉틴, 진균 렉틴 및 원생동물 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  69. 청구항 67에 있어서, 상기 렉틴은 갈렉틴, 시글렉, 셀렉틴; C형 렉틴; CD301, L-PHA(페이스올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 백혈구응집소); E-PHA(페이스올루스 불가리스 에리트로아글루티넨); 토마토 렉틴(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴; LEA); 피넛 렉틴(아라키스 히포가애(Arachis hypogaea) 응집소; PNA); 포테이토 렉틴(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴), 포크위크 미토겐(피톨라카 아메리칸(Phytolacca American) 렉틴), 밀 배아 응집소(트리티쿰 불가리스(Triticum Vulgaris) 렉틴); 아르토카르푸스 폴리페무스(Artocarpus polyphemus) 렉틴(자칼린(Jacalin) 레틴); 비시아 빌로사(Vicia villosa) 응집소(VVA); 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소(HPA); 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소(WFA); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소(SNA), BC2LCM(그람 음성 박테리아 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia)로부터의 렉틴), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 백혈구응집소(MAL), 프사티렐라 벨루티나(Psathyrella velutina)(PVL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 렉틴(SRL), 유케마 세라(Eucheuma serra) 응집소(ESA), CLEC17A(프롤렉틴), 알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 렉틴(SSA), 글레초마 헤데라세아(Glechoma hederacea) 렉틴(Gleheda), 모루스 니그라(Morus nigra) 응집소(Morniga G), 샐비어 스클라리아(Salvia sclarea) 렉틴, 샐비어 보고텐시스(Salvia bogotensis) 렉틴, 샐비어 호르미눔(Salvia horminum) 렉틴, 클레로덴드룸 트리초토뭄(Clerodendrum trichotomum) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Moluccella laevis) 렉틴, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia)(GsLA4), 프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)(산성 WBAI), 아브루스 프레카토리우스(Abrus precatorius) 렉틴, 몰루셀라 레비스(Molucella laevis) 렉틴(MLL), 아마란서스 코다투스(Amaranthus caudatus) 렉틴, 아마란서스 류코카르푸스(Amaranthus leucocarpus) 렉틴, 렐리아 오툼랄리스(Laelia autumnalis) 렉틴, 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴, 마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴, 아르토카르푸스 라코차(Artocarpus lakoocha) 렉틴, 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos biflorusagglutinin), 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 렉틴, 글리신 최대 렉틴 및 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  70. 청구항 68에 있어서, 상기 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-2, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-5, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-11, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 갈렉틴-14 및 갈렉틴-15으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  71. 청구항 68에 있어서, 상기 시글렉은 시글렉-1(시알로접합체(sialoadhesion)), 시글렉-2(CD22), 시글렉-3(CD33), 시글렉-4(미엘린 관련 당단백질) 시글렉-5, 시글렉-6, 시글렉-7, 시글렉-8, 시글렉-9, 시글렉-10, 시글렉-11, 시글렉-12, 시글렉-13, 시글렉-14, 시글렉-15, 시글렉-16, 시글렉-17, 시글렉 E, 시글렉 F, 시글렉 G 및 시글렉 H로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  72. 청구항 67에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인은 β1, 6 분지화, T 항원, 시알릴-T 에피토프, Tn 에피토프, 시알릴-Tn 에피토프, α2, 6 시알화, 시알화, 시알릴-루이스x/a, 디-시알릴-루이스x/a, 시알릴 6-설포 루식스x, 글로보 H, GD2, GD3, GM3 및 푸코실 GM1로 구성된 군으로부터 선택된 TACA에 결합하는, 방법.
  73. 청구항 67에 있어서, 상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 β1,6GlcNAc 분지형 N-글리신에 결합하는, 방법.
  74. 청구항 67에 있어서, 상기 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  75. 청구항 67에 있어서, 상기 펩티드는 Fc 도메인에 연결된 상기 TACA 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드인, 방법.
  76. 청구항 67에 있어서, 상기 펩티드는 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 호중구로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 T-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 T-세포-결합 도메인은 T-세포에 특이적으로 결합하는, 방법.
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 T-세포-결합 도메인은 CD3, T-세포 수용체, CD2, CD28, 및 CD25으로 구성된 군 중 적어도 하나와 결합하는, 방법.
  80. 청구항 79에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호: 9, 및 서열 번호: 9와 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 T-세포 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  81. 청구항 78에 있어서, 상기 핵산 분자가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법: 서열 번호: 11, 서열 번호: 11과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 12, 서열 번호: 12와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 13, 서열 번호: 13과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 14, 서열 번호: 14와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 15, 서열 번호: 15와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 16, 서열 번호: 16과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  82. 청구항 76에 있어서, 면역 효과기 세포에 특이적으로 결합하는 상기 도메인은 NK-세포-결합 도메인을 포함하며, 상기 NK-세포-결합 도메인은 NK-세포에 특이적으로 결합하는, 방법.
  83. 청구항 82에 있어서, 상기 NK-세포 결합 도메인은 CD16 및 NKG2D로 구성된 군 중 적어도 하나에 결합하는, 방법.
  84. 청구항 67에 있어서, 상기 핵산 분자는 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하며, 상기 항원 인식 도메인은 상기 TACA-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 핵산 분자에 의하여 암호화된 상기 CAR의 상기 항원 인식 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TACA-결합 도메인을 포함하는, 방법: 서열 번호: 1, 서열 번호: 1과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 2, 서열 번호: 2와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 3, 서열 번호: 3과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 5, 서열 번호: 5와 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 6, 서열 번호: 6과 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 7과 약 90% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  86. 청구항 84에 있어서, 상기 핵산 분자에 의하여 암호화된 상기 CAR의 상기 세포내 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인 및 공자극성 도메인을 포함하는, 방법.
  87. 청구항 67에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 방법.
  88. 청구항 67에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자가 시험관내 전사된 RNA를 포함하는, 방법.
  89. 청구항 67에 있어서, 상기 대상체가 TACA를 발현하는 고형 종양을 갖는, 방법.
  90. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    렉틴으로부터 유도된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA) 결합 도메인을 포함하는 펩티드를 발현하도록 변형된 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 TACA 결합 도메인이 종양 세포의 TACA에 특이적으로 결합하는, 방법.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 세포는, 항원 인식 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형되며, 상기 항원 인식 도메인은 상기 TACA-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  92. 청구항 90에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL) 및 조절성 T 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  93. 청구항 90에 있어서, 상기 세포는 자가조직성인, 방법.
  94. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    a.) 렉틴으로부터 유도된 종양-연관된 탄수화물 항원 (TACA)-결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 제제를 포함하는 제1 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계, 및
    b) 상기 TACA 결합 도메인을 상기 펩티드를 포함하는 제2 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  95. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    a.) 렉틴으로부터 유도된 종양-연관된 탄수화물 항원 (TACA)-결합 도메인을 포함하는 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형된 세포를 상기 대상체에 투여하는 단계, 및
    b) 상기 TACA 결합 도메인을 포함하는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  96. 청구항 95에 있어서, 상기 CAR의 상기 항원 결합 도메인은 렉틴-결합 도메인을 포함하고, 상기 렉틴-결합 도메인은 상기 TACA-결합 도메인을 포함하는 상기 펩티드에 결합하는, 방법.

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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4088732A1 (en) * 2015-05-01 2022-11-16 The Regents of The University of California Glycan-dependent immunotherapeutic molecules
US20190233479A1 (en) 2017-10-19 2019-08-01 City Of Hope Recombinant lectin and uses thereof
WO2019173829A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Delivering biological drugs to tissues
WO2019222642A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Senti Biosciences, Inc. Engineered immune cells and methods of use
CN112512573A (zh) 2018-05-23 2021-03-16 百提威生技股份有限公司 双特异性t细胞衔接蛋白及其用途
US11760786B2 (en) * 2019-02-06 2023-09-19 The Regents Of The University Of Michigan Chimeric antigen receptors targeting abnormal glycobiology
JOP20210298A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Provention Bio Inc طرق وتركيبات للوقاية من مرض السكري من النوع الأول
AU2020298104A1 (en) * 2019-06-21 2022-02-24 Università Degli Studi Magna Graecia Catanzaro Monoclonal antibody targeting a unique cancer-associated epitope of CD43
MX2021015426A (es) * 2019-07-09 2022-01-24 Unichem Lab Ltd Formulaciones estables de proteinas recombinantes.
PH12022551035A1 (en) 2019-11-04 2023-06-14 Alector Llc Siglec-9 ecd fusion molecules and methods of use thereof
JP2023530109A (ja) 2020-06-11 2023-07-13 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
WO2022034022A1 (en) * 2020-08-10 2022-02-17 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Siglec-6-binding polypeptides
AU2022249398A1 (en) * 2021-04-02 2023-10-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bispecific molecules and related compositions and methods
KR20250036972A (ko) * 2022-06-13 2025-03-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 개선된 글리칸 의존성 키메라 항원 수용체 세포
AU2023292071A1 (en) * 2022-06-13 2025-01-02 The Regents Of The University Of California Improved glycan-dependent immunotherapeutic bi-specific fusion proteins and chimeric antigen receptors
IL317581A (en) * 2022-06-13 2025-02-01 Univ California Improved glycan-dependent bispecific proteins with longer half-life
WO2025111484A1 (en) * 2023-11-21 2025-05-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cellular therapies targeting aberrant glycosylation in solid malignancies

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006514690A (ja) * 2002-08-02 2006-05-11 エール大学 オリゴ糖標的物質による疾病治療薬及び疾病治療方法
WO2008053486A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Sylvie Luria Methods for screening for therapeutic molecules and use of the molecules therefrom
WO2013158856A2 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Emergent Product Development Seattle, Llc Cd3 binding polypeptides
US20140031687A1 (en) * 2012-04-11 2014-01-30 Toshiba Medical Systems Corporation Ultrasonic diagnostic apparatus
WO2014031687A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy
US20150110789A1 (en) * 2012-05-18 2015-04-23 Scott & White Healthcare Bispecific SCFV Immunofusion (BIF)
US20150119555A1 (en) * 2011-12-19 2015-04-30 Synimmune Gmbh Bispecific antibody molecule

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1247080A (en) 1983-03-08 1988-12-20 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5993434A (en) 1993-04-01 1999-11-30 Genetronics, Inc. Method of treatment using electroporation mediated delivery of drugs and genes
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US6103489A (en) 1997-03-21 2000-08-15 University Of Hawaii Cell-free protein synthesis system with protein translocation and processing
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
US6991794B1 (en) 1997-06-24 2006-01-31 Imclone Systems Incorporated Progenitor cell preservation factors and methods for and products of their use
US6055453A (en) 1997-08-01 2000-04-25 Genetronics, Inc. Apparatus for addressing needle array electrodes for electroporation therapy
US6241701B1 (en) 1997-08-01 2001-06-05 Genetronics, Inc. Apparatus for electroporation mediated delivery of drugs and genes
US6678556B1 (en) 1998-07-13 2004-01-13 Genetronics, Inc. Electrical field therapy with reduced histopathological change in muscle
US7171264B1 (en) 1999-05-10 2007-01-30 Genetronics, Inc. Intradermal delivery of active agents by needle-free injection and electroporation
EP1235842A4 (en) 1999-10-15 2003-04-23 Univ Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
EP1257632B1 (en) 2000-02-24 2007-09-12 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
JP4987205B2 (ja) 2000-03-03 2012-07-25 ジェネトロニクス， インコーポレイテッド 遺伝子送達用核酸製剤および使用方法
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US8209006B2 (en) 2002-03-07 2012-06-26 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Constant current electroporation device and methods of use
US20040014645A1 (en) 2002-05-28 2004-01-22 Advisys, Inc. Increased delivery of a nucleic acid construct in vivo by the poly-L-glutamate ("PLG") system
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
US20050070841A1 (en) 2002-07-04 2005-03-31 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
ES2653570T3 (es) 2004-05-27 2018-02-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Células presentadoras de antígeno artificiales novedosas y usos de las mismas
TWI281401B (en) 2004-12-31 2007-05-21 Univ Nat Cheng Kung Composition for treating tumor and/or preventing tumor transfer and recurrence
US20070128708A1 (en) 2005-12-07 2007-06-07 Genetronics, Inc. Variable volume electroporation chamber and methods therefore
IL198479A (en) 2006-11-02 2012-12-31 Procognia Israel Ltd Methods for screening for therapeutic molecules and use of the molecules therefrom
WO2011145085A2 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Procognia (Israel) Ltd Novel antibodies and methods of use for the treatment and diagnosis of cancer
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2013151649A1 (en) * 2012-04-04 2013-10-10 Sialix Inc Glycan-interacting compounds
KR20150036606A (ko) * 2012-07-13 2015-04-07 자임워크스 인코포레이티드 항-cd3 구조체를 포함하는 이중특이적 비대칭 이형이합체
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
JP6692294B2 (ja) 2013-07-31 2020-05-13 バイオベンチャーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ， ＬＬＣ 腫瘍関連糖鎖抗原を標的として癌を治療及び予防するための組成物及び方法
EP3054974A4 (en) * 2013-10-10 2017-06-14 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
US20180280504A1 (en) * 2014-10-10 2018-10-04 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
US20170306046A1 (en) * 2014-11-12 2017-10-26 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
EP4088732A1 (en) * 2015-05-01 2022-11-16 The Regents of The University of California Glycan-dependent immunotherapeutic molecules

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006514690A (ja) * 2002-08-02 2006-05-11 エール大学 オリゴ糖標的物質による疾病治療薬及び疾病治療方法
WO2008053486A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Sylvie Luria Methods for screening for therapeutic molecules and use of the molecules therefrom
US20150119555A1 (en) * 2011-12-19 2015-04-30 Synimmune Gmbh Bispecific antibody molecule
US20140031687A1 (en) * 2012-04-11 2014-01-30 Toshiba Medical Systems Corporation Ultrasonic diagnostic apparatus
WO2013158856A2 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Emergent Product Development Seattle, Llc Cd3 binding polypeptides
KR20150004856A (ko) * 2012-04-20 2015-01-13 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 Cd3 결합 폴리펩타이드
US20150110789A1 (en) * 2012-05-18 2015-04-23 Scott & White Healthcare Bispecific SCFV Immunofusion (BIF)
WO2014031687A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy

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