KR20170135818A

KR20170135818A - 선택적 il-6-트랜스-신호전달 억제제 조성물

Info

Publication number: KR20170135818A
Application number: KR1020177018154A
Authority: KR
Inventors: 이안 코팅함; 다니엘 플레이크신; 제레미 두보유프
Original assignee: 훼링 비.브이.
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2017-12-08
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: WO2016089206A3; DK3227325T3; PT3227325T; JP2017536848A; EP4356962A2; KR102699098B1; JP7184936B2; RS65665B1; FI3227325T3; MX2021007899A; LT3227325T; KR20240131465A; ES2981475T3; EP4356962A3; CA2969314A1; EP3227325B1; US10519218B2; CN107406491A; JP2021073229A; HUE066987T2

Abstract

선택적 IL-6 트랜스 신호전달 억제제는 염증성 질환 및 암을 비롯한 다양한 IL-6 매개 병증을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 억제제는 다양한 투여량으로 인간에게 안전하게 투여될 수 있다.

Description

선택적 IL-6-트랜스-신호전달 억제제 조성물{SELECTIVE IL-6-TRANS-SIGNALLING INHIBITOR COMPOSITIONS}

IL-6은, 예를 들어 감염 및 조직 손상에 반응하여, 조혈 세포 및 비 조혈 세포에 의해, 생성되는 다면 발현성 사이토카인이다. IL-6은 2개의 주요 신호전달 경로, 이른바, 주로 간세포와 특정 백혈구에 존재하는 막 결합 IL-6R을 통한 전형적인 리간드 수용체 경로 및 막 결합 IL-6R의 단백분해성 절단 또는 선택적 스플라이싱으로부터 유래하는 순환 sIL-6R을 통한 트랜스 신호전달 경로를 통해, 여러 생물학적 활성을 수행한다.

전형적인 경로에서, IL-6은 제한된 범위의 세포 유형의 표면에서 막 결합 IL-6R에 직접 결합한다. IL-6/IL-6R 복합체는 신호 변환 gp130 수용체 단백질의 예비 형성 이량체와 결합하여, gp130 동형 이량체에 입체적 변화를 일으켜, 세포 내 신호전달 케스케이드(signalling cascade)를 개시한다. 전형적 신호전달은 장 상피 세포의 성장 및 재생 신호와 같은 급성 염증 방어 기작 및 주요 생리학적 IL-6 기능을 담당한다.

IL-6R 및 gp130의 세포 외 도메인은 sIL-6R 및 sgp130 변이체를 유발하는 선택적으로 스플라이싱된 mRNA의 번역에 의해, 막 고정 도메인 없이 생성될 수 있다. 또한, IL-6R의 세포 외 도메인은 A 디스인테그린과 메탈로프로테아제 (ADAM) 계열 (인간에서는 ADAM17)의 막 결합 프로테아제에 의해 유리되어, sIL-6R을 생성할 수 있다. 트랜스-신호전달 과정에서, sIL-6R은 IL-6에 결합하여, 막 결합 IL-6R을 발현하지 않는 다수의 세포 유형에 존재하는 막투과 gp130 이량체와 결합하는 작용 복합체를 형성하고; 그 후, IL-6에 정상적으로 반응하지 않는 세포에서, 전사의 신호 변환기 및 활성 인자 (STAT)에 의한 IL-6 신호전달이 유도된다. IL-6/sIL-6R 복합체의 활성은 막 결합 gp130과 효과적으로 경쟁하는 것으로서, 순환계에 존재하는 높은 수준의 sgp130에 의해, 정상적으로 제어된다. 트랜스-신호전달은 주로 만성 염증에 관여하며, 질환-촉진 점막 T-세포 집단의 세포 사멸로의 진행을 억제하는 것으로 나타났다.

천연 트랜스-신호전달 억제제 sgp130을 모방하나, 더욱 큰 결합 친화력 및 결과적으로 더 강한 억제 활성을 가지는 분자를 가지는 것이 바람직할 것이다. 또한, 최소한의 독성 및 면역원성 잠재력을 가지는 인간에게 투여될 수 있는 분자를 가지는 것이 바람직할 것이다.

현재, 선택적인 IL-6 트랜스 신호전달 억제제가 대규모 투여량 범위에서 현저한 유해 효과 없이, 인간에게 투여될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 억제제는 면역원성 잠재력과 관련된 응집 및 글리코실화 패턴이 실질적으로 존재하지 않는다. 또한, 상기 억제제는 인간에서 적절한 반감기를 제공한다.

본 발명은 서열 번호 1의 2개의 단량체를 포함하는 폴리펩티드 이량체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 단량체는 하나 이상의 디설파이드 가교에 의해 결합된다. 바람직하게는, 이량체는 서열 번호 1의 Cys₆₂₃ 및 Cys₆₂₆ 위치의 디설파이드 가교에 의해 결합된다. 본 발명은 또한 서열 번호 2의 두 단량체를 포함하는 폴리펩티드 이량체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 단량체는 하나 이상의 디설파이드 가교에 의해 결합된다. 바람직하게는, 상기 이량체는 서열 번호 2의 Cys₆₂₃ 및 Cys₆₂₆ 위치에서 디설파이드 가교에 의해 결합된다.

바람직하게는, 상기 폴리펩티드 이량체는 폴리펩티드 1몰당 6% 이하의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스를 포함하고/거나, 하나 이상의 시알산 잔기를 가지는 적어도 52%의 글리칸을 포함한다.

본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 이량체를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물 중의 5% 이하의 폴리펩티드 이량체는 올리고머 응집체로서 존재하고/거나, 상기 조성물은, 상기 폴리펩티드의 절단형 변이인 폴리펩티드 (예를 들어, 서열 번호 1의 폴리펩티드에 대해서, 서열 번호 1의 절단형 버젼 또는 서열 번호 2의 폴리펩티드에 대해서, 서열 번호 2의 절단형 버전)를 10.0중량%, 8.0중량%, 6.0중량% 또는 4.0중량% 이하로 포함한다. 더욱이, 이러한 조성물의 이량체는 상기 단락에서 기술되고, 하기에 더욱 상세히 설명되는 특징을 포함할 수 있다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 병증을 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 이량체 또는 조성물로 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 병증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 이량체 및 조성물의 용도를 포함한다.

또한, 본 발명은, 관련된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리펩티드 이량체, 발현 벡터, 상기 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드를 정제하는 세포를 제조하는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 본 명세서에 개시된 폴리펩티드, 특히 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 도 3 또는 도 7의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일하고, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 폴리펩티드를 인코딩한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 도 7의 뉴클레오티드 서열이다.

도 1은 IL-6의 트랜스-신호전달 경로를 도시한다. 선택적으로 스플라이싱된 mRNA 또는 단백분해성 절단으로부터 생성된 sIL-6R은 IL-6에 결합하여, 대다수의 신체 세포 유형에 존재하는 gp130에 결합하는 IL-6/sIL-6 복합체를 형성하여, 세포 내 신호전달계를 유도할 수 있다.
도 2는 서열 번호 1의 두 단량체를 포함하는 폴리펩티드 이량체가 막 결합 IL-6R에 대한 IL-6 결합 (전형적 신호전달)을 방해하지 않으나, IL-6/sIL-6R 복합체에 선택적으로 결합하여, 트랜스-신호전달을 억제하는 것을 보여준다.
도 3은 단일 gp130-Fc 하위 단위의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 4는 발현 벡터 pANTVhG1의 맵을 도시한다. 인간 IgG 또는 융합 단백질 발현 및 진핵 세포에서의 선택을 위한 요소뿐만 아니라 관련 제한 효소 절단 부위 (정확한 크기는 아님)가 제시되어 있다. 요소에는 CMV P, 시토메갈로바이러스 발현 프로모터; 인간 IgG1 서열: VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3; hIgG1 폴리 A, 인간 IgG 폴리아데닐화 서열; pAT153; 암피실린에 대한 박테리아 내성을 위한 Amp 유전자 및 복제 오리진을 함유하는 pBR322로부터 유래된 발현 벡터 서열; SV40 프로모터 서열; DHFR, 디하이드로폴레이트 리덕타제 코딩 서열; MluI, HindIII, EagI 및 SspI 제한 효소 절단 서열; 및 쥣과 동물 공통 신호 서열이 포함된다. 원핵생물 증식 및 선택을 위한 요소의 세부 사항은 제시되지 않는다.
도 5는 발현 벡터 pFER02의 맵을 도시한다. 펩티드 1의 발현 및 진핵 세포에서의 선택을 위한 요소뿐만 아니라 관련 제한 효소 절단 부위 (정확한 크기는 아님)가 제시되어 있다. 요소에는 CMV P, 시토메갈로바이러스 발현 프로모터; 서열 번호 2, 코딩 서열; hIgG1 폴리 A, 인간 IgG 폴리아데닐화 서열; pAT153; 암피실린에 대한 박테리아 내성을 위한 Amp 유전자 및 복제 오리진을 함유하는 pBR322로부터 유래된 발현 벡터 서열; SV40 프로모터 서열; DHFR, 디하이드로폴레이트 리덕타제 코딩 서열; MluI, EagI 및 SspI 제한 효소 절단 서열; 및 쥣과 동물 공통 신호 서열이 포함된다.
도 6은 발현 플라스미드 pFER02의 뉴클레오티드 서열 요소를 도시한다.
도 7은 단일 gp130-Fc 하위 단위의 아미노산 서열 및 CHO 세포에서 최적의 코돈 사용을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열을 도시한다.

본 발명의 일 양상은 2개의 gp130-Fc 융합 단량체 (예를 들어, 서열 번호 1의 두 단량체)의 이량체를 제공한다. 그의 활성 형태에서, 서열 번호 1의 폴리펩티드는 Cys₆₂₃ 및 Cys₆₂₆에서 2개의 디설파이드 가교에 의해 결합된 이량체로 존재한다 (도 2). 서열 번호 2는 내인성 신호 펩티드를 가지는 gp130-Fc 융합 단량체의 아미노산 서열에 상응한다. 신호 펩티드는 단백질 합성 과정 동안 제거되어, 서열 번호 1의 폴리펩티드를 생성하게 된다.

본 명세서에 기재된 폴리펩티드 이량체는 과도한 트랜스-신호전달을 선택적으로 억제하고 (도 1), 다중 염증성 질환에 관여하는 유해한 T-세포의 세포 사멸을 유도한다. 상기 폴리펩티드 이량체는 IL-6/sIL-6R 복합체를 표적으로 하여, 중화시키므로, 원하는 치료 농도에서 IL-6 트랜스-신호전달만을 억제하여, 전형적 신호전달 및 그의 다수의 생리 기능뿐만 아니라 그의 급성 염증 방어 기작을 손상되지 않은 채로 유지시킬 것으로 예상된다 (도 2). 상기 폴리펩티드 이량체는 입체 장애로 인해 전형적인 IL-6 신호전달을 방해할 수 없다고 여겨지며; Fc 부분은 세포막에 삽입될 수 없으므로, gp130 부분이 막 결합 IL-6/sIL-6R 복합체에 결합할 수 없도록 한다. 따라서, 상기 폴리펩티드는 전체적 IL6 차단 (예를 들어, 토실리주맙, 시루쿠맙)과 유사한 효능을 가지나, 부작용은 더 적을 것으로 예상된다.

본 명세서에 기재된 폴리펩티드 이량체는 바람직하게는 서열 번호 1에 상응하는 서열을 가지는 gp130-Fc 단량체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 단량체는 서열 번호 2에 상응하는 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 이량체는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대해 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 gp130 D6 도메인 (특히, 아미노산 TFTTPKFAQGE: 서열 번호 1의 아미노산 585-595 위치), Fc 도메인 힌지 영역의 AEGA (서열 번호 1의 아미노산 609-612 위치)를 포함하고, gp130 부분과 Fc 도메인 사이에 링커를 포함하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 2개의 단량체를 포함하는 폴리펩티드 이량체로서, 상기 아미노산 서열이 gp130 D6 도메인, Fc 도메인 힌지 영역의 AEGA를 포함하고, gp130 부분과 Fc 도메인 사이에는 링커가 존재하지 않는 폴리펩티드 이량체를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 2와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 2개의 단량체를 포함하는 폴리펩티드 이량체로서, 상기 아미노산 서열이 gp130 D6 도메인, Fc 도메인 힌지 영역의 AEGA를 포함하고, gp130 부분과 Fc 도메인 사이에 링커가 존재하지 않으며, 바람직하게는, 상기 단량체가 하나 이상의 디설파이드 가교에 의해 결합되고, 더욱 바람직하게는:

a. 상기 폴리펩티드 이량체가 폴리펩티드 1몰당 6% 이하의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스, 바람직하게는 3 몰% 이하, 더욱 바람직하게는 1 몰% 이하, 추가로 더욱 바람직하게는 0.5 몰%의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스를 포함하거나,

b. 상기 폴리펩티드 이량체가 글리칸을 포함하며, 여기서, 평균 적어도 52%, 바람직하게는 적어도 54%의 글리칸, 더욱 바람직하게는 52-65%의 글리칸이 하나 이상의 시알산 잔기를 포함하거나, 또는

c. 상기 두 경우 모두를 포함하는 폴리펩티드 이량체를 제공한다.

폴리펩티드가 면역원성 반응과 관련되므로, 실질적으로 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스 모이어티가 존재하지 않는 것이 바람직하다. 놀랍게도, 본 발명의 이량체는 이러한 모이어티를 낮은 수준으로 가진다는 것이 밝혀졌다. 바람직한 실시형태에서, 상기 폴리펩티드 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 단량체 및/또는 이량체)는 폴리펩티드 1몰당 6% 이하의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스를 함유한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 4 몰%, 3 몰%, 2 몰%, 1 몰%, 0.5 몰%, 0.2 몰%, 0.1 몰% 이하 또는 심지어 검출할 수 없는 수준의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스를 함유한다 (예를 들어, WAX-HPLC, NP-HPLC 또는 WAX로 측정된 바와 같고, 바람직하게는 WAX-HPLC로 측정된 바와 같음). 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 질량 또는 몰 기준으로, 글리칸의 총 양에 대해, 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 심지어 0.1% 미만의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스를 함유한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드가 시알릴화되어, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 것이 또한 바람직하다. 상기 폴리펩티드의 각 사슬은 10개의 추정 N-글리코실화 부위를 함유하며; 9개의 N-글리코실화 부위는 gp130 부분에 위치하고, 하나의 N-글리코실화 부위는 Fc 부분에 위치한다. 따라서, 상기 폴리펩티드는 총 20개의 글리코실화 부위를 함유한다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 평균 적어도 52% 또는 적어도 54%의 글리칸, 예를 들어 평균 52-65%의 글리칸이 시알산 잔기를 포함한다 (예를 들어, WAX-HPLC, NP-HPLC 또는 WAX로 측정된 바와 같고, 바람직하게는 WAX-HPLC로 측정된 바와 같음). 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 대략 220 kDa의 분자량을 가지며; 각각의 93 kDa는 10개의 N-글리코실화 사슬로부터 유래된 추가의 ~20 kDa 분자량을 가진다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 다수의 폴리펩티드 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 다수의 폴리펩티드 단량체 및/또는 폴리펩티드 이량체)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은, 상기 조성물 중 글리칸 기에 대해, 평균 적어도 25% (예를 들어, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%)의 모노-시알릴화 폴리펩티드; 평균 적어도 10% (예를 들어, 적어도 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 25%)의 디-시알릴화 폴리펩티드; 평균 적어도 1% (예를 들어, 적어도 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5% 또는 6%)의 트리-시알릴화 폴리펩티드; 및/또는 평균 적어도 0.1% (예를 들어, 적어도 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%)의 테트라-시알릴화 글리칸을 포함한다.

본 명세서에서 올리고머 응집체를 초래하는 올리고머화로서 지칭되는 것으로서, 폴리펩티드가 응집되는 정도를 최소화하는 것이 더욱 바람직하다. 본 명세서에 사용되는 "올리고머 응집체"는 활성 이량체화 펩티드를 지칭하지 않는다. 대신에, 이러한 용어는 적어도 3개의 단량체 (예를 들어, 서열 번호 1), 또는 더욱 전형적으로 활성 이량체 중 적어도 하나의 이량체의 응집체를 지칭한다. 놀랍게도, 본 발명의 펩티드 이량체는 낮은 수준의 응집을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 특정 실시형태에서, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만 또는 심지어 1.0% 미만의 폴리펩티드가 올리고머로서 존재한다. 올리고머 함량은, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피-멀티 앵글 라이트 스캐팅 (SEC-MALS) 또는 SEC-UV에 의해, 측정될 수 있다.

바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 그의 전장 형태 (예를 들어, 서열 번호 1의 2개의 전장 단량체를 포함함)로 존재한다. 그러나, 세포 배양은 본 명세서에서 단일 gp130 형태 (SGF)로 지칭되는 절단형 변이체를 생성할 수 있다. SGF는 공유 결합된 2-사슬 분자이며, 하나의 사슬은 전장 gp130-Fc 단량체 (예를 들어, 서열 번호 1)를 포함하고, 두 번째 사슬은 절단형 gp130-Fc 단량체 (예를 들어, 서열 번호 1의 절단형)를 포함하며, 두 번째 사슬은 Fc 도메인을 포함하고, gp130 도메인 (예를 들어, Fc 영역으로의 링커 서열 전에 종결됨)의 전부 또는 그 대부분이 결여되어 있다. 지금까지의 연구에 따르면, SGF는 이종 아미노 말단을 가지지 않는다는 것이 입증되었다. SGF는 생물 반응기에서 일정한 수준으로 생성될 수 있으며, 일단 생성되면, SGF 수준은 정제, 처리 또는 가속 저장 조건 (accelerated storage condition) 중에 쉽게 변하지 않는다. SGF 수준은 상기 폴리펩티드 이량체의 전장 형태와 유사한 물리 화학적 특성으로 인해, 정제 과정 동안 제거되기 어려우며; 따라서, SGF를 제거하고자 하는 경우, 수율의 현저한 감소가 초래될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 이량체는 거의 항상 전장인 것으로 밝혀졌다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 서열 번호 1의 폴리펩티드에 대해, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 절단형 변이인 폴리펩티드를 4.0 중량%, 3.0 중량%, 2.0 중량% 또는 심지어 1.5 중량% 이하로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 서열 번호 2의 폴리펩티드에 대해, 서열 번호 2의 폴리펩티드의 절단형 변이인 폴리펩티드를 4.0 중량%, 3.0 중량%, 2.0 중량% 또는 심지어 1.5 중량% 이하로 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 정맥 내 또는 피하와 같이 비경구적으로 투여된다.

적절한 제형에는 계면활성제, 특히 폴리소르베이트 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하는 것들이 포함된다. 제형에는 또한 완충제 및 당이 포함될 수 있다. 예시적인 완충제에는 히스티딘이 있다. 예시적인 당에는 수크로오스가 있다. 따라서, 적절한 제형에는 폴리소르베이트 20 (예를 들어, 0.01-1 mg/mL, 0.02-0.5 mg/mL, 0.05-0.2 mg/mL), 히스티딘 (예를 들어, 0.5 mM-250 mM, 1-100 mM, 5-50 mM, 10-20 mM) 및 수크로오스 (예를 들어, 10-1000 mM, 20-500 mM, 100-300 mM, 150-250 mM)가 포함될 수 있다.

징후 (Indication)

급성 염증에서, IL-6은 간에서 급성기 반응을 유도하여, 급성기 단백질, 특히 CRP의 일련의 방출을 초래한다는 것이 밝혀졌다. 염증 부위의 세포 사멸성 호중구에 의해 유리되는 sIL-6R과의 복합체의 생성 및, 내피 세포에서, 생성된 IL-6/sIL-6R 트랜스-신호전달 복합체와 신호 변환기 gp130의 결합에 의해, IL-6은 케모카인, 예를 들어 단핵구 주화성 단백질 (monocyte chemotactic protein) (MCP) -1의 발현을 유도하고, 단핵 세포를 유인한다. 이것은 급성 염증의 호전과 적응 면역 반응의 개시로 이어진다. 따라서, 급성 염증에서 sIL-6R과 IL-6의 복합체는 염증의 초기 우세 호중성 단계 (early predominantly neutrophilic stage)와 더욱 지속적인 단핵 세포 유입 사이의 전환을 지원하여, 궁극적으로 또한 염증의 호전을 초래한다.

크론병 (CD), 궤양성 대장염 (UC), 류머티스성 관절염 (RA) 또는 건선과 같은 만성 염증은 조직학적으로, 급성 염증 단계의 호전을 위해, 누적된 후, 조직 내에 유지되는 대식세포와 림프구와 같은 단핵 세포의 존재와 연관되어 있다. 만성 염증성 질환의 모델에서, IL-6은 지속적인 MCP-1 분비, 혈관 증식 및 T 세포에서의 항 세포 사멸 작용을 유도하여, 손상 부위에서 단핵 세포 축적에 유리한 유해 역할을 하는 것으로 보인다.

염증성 장 질환 (IBD), 즉 CD 또는 UC는, 특정 병원균과는 무관한 것으로 여겨지는 감수성 개체의 소화관에서 발생하는 만성 염증이다. 장내 투과성이 증가되는 상피 점막 장벽의 변형은 점막 면역계의 내강 항원에 대한 노출의 증가를 초래하여, 환자의 장내 면역계의 부적절한 활성화를 야기한다. 전 염증성 사이토카인의 지속적인 과도한 방출에 의한 점막의 CD4+ T-림프구의 제어되지 않은 활성화는 병원성 위장 염증 및 조직 손상을 유도한다. IBD의 발병 기전과 관련된 주요 활성 면역 세포는 장내 T 세포 및 대식세포라는 공통 의견이 있다.

IL-6은 인간의 IBD에서 주요 사이토카인인 것으로 나타났다. CD 및 UC 환자는 대조군에 비해 증가된 수준의 IL-6이 생성되는 것으로 밝혀졌으며, IL-6 수준은 임상 활성과 관련이 있다. CD 환자는 또한 증가된 수준의 sIL-6R을 가지며, 결과적으로 혈청에 증가된 수준의 IL-6/sIL-6R 복합체를 가지는 것으로 밝혀졌다. CD와 UC 환자의 외과적 결장 표본에서 얻은 점막 고유층 단핵 세포의 경우, CD4+ T 세포와 대식세포 모두 대조군에 비해 증가된 양의 IL-6을 생성하는 것으로 나타났다. sIL-6R은 대식세포와 단핵 세포의 표면으로부터의 유리를 통해 방출되고, 그 생성의 증가가 IL-6 수준의 증가와 관련되는 것으로 밝혀졌다. CD 환자에서, 점막 T 세포는 STAT3, bcl-2 및 bcl-xl의 활성화에 의해, IL-6 트랜스 신호전달에 대한 강력한 증거를 제시하였다. IL-6 트랜스 신호전달의 차단은 T 세포의 세포 사멸을 야기하였으며, 이는 IL-6/sIL-6R 시스템이 CD에서의 세포 사멸에 대한 T 세포의 내성을 매개한다는 것을 나타낸다.

따라서, IBD 환자에서, 염증의 지속으로 이어지는 점막 고유층에서의 질환-촉진 CD4+ T 세포의 누적된 축적은 결정적으로 항-세포 사멸성 IL 6/sIL-6R 트랜스-신호전달에 의존한다. IL-6/sIL-6R 복합체에 작용함으로써, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드는 CD 및 다른 염증성 질환을 치료하는데 유용한 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 IL-6 매개 병증을 치료할 수 있다. IL-6 매개 병증에는 염증성 질환 또는 암이 포함된다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 및 조성물은 염증성 질환, 예를 들어 청소년 특발성 관절염, 크론병, 대장염 (예를 들어, 방사선 대장염, 게실성 대장염, 허혈성 대장염, 감염성 대장염, 체강 질환, 자가 면역성 대장염 또는 결장에 영향을 미치는 알레르기로 인한 대장염을 비롯한 것으로서, IBD와 무관한 대장염), 피부염, 건선, 포도막염, 게실염, 간염, 과민성 대장 증후군 (IBS), 홍반성 루푸스, 신염, 파킨슨병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증 (MS), 알츠하이머병, 관절염, 류머티스성 관절염, 천식 및 각종 심혈관 질환, 예를 들어 죽상 동맥 경화증 및 혈관염을 가지는 대상체에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 염증성 질환에는 당뇨병, 통풍, 크라이오피린 관련 주기적 증후군 및 만성 폐색성 폐질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

바람직하게는, 상기 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증은 염증성 장 질환이며, 바람직하게는 상기 치료가 염증성 장 질환의 관해 (remission)를 유도한다. 바람직하게는, 상기 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염이며, 바람직하게는 상기 치료가 염증성 장 질환의 관해를 유지시킨다. 바람직하게는, 상기 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증은 류머티스성 관절염, 건선, 포도막염 또는 죽상 동맥 경화증이다. 바람직하게는, 상기 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증은 염증성 장 질환과 관련이 없는 대장염이며, 바람직하게는 상기 대장염은 방사선 대장염, 게실성 대장염, 허혈성 대장염, 감염성 대장염, 체강 질환, 자가 면역성 대장염 또는 결장에 영향을 미치는 알레르기로 인한 대장염이다. 바람직하게는, 상기 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증은 크론병, 궤양성 대장염, 류머티스성 관절염 및 건선, 더욱 바람직하게는 크론병 및 궤양성 대장염으로부터 선택된다.

염증성 장 질환과 같은 염증성 질환의 경우, 치료에는 병증의 관해, 병증의 관해의 유지 또는 양자의 경우가 포함될 수 있다.

다른 실시형태는, 이로 제한되는 것은 아니나, 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 신세포 암종, 카포시육종, 대장암, 위암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 신경교종, 다형성 교모세포종, 폐암 (이로 제한되는 것은 아니나, 비 소세포 폐암 (NSCLC; 선암 및 편평세포암종 두 경우) 포함), 비-호지킨 림프종, 호지킨병, 형질 세포종, 육종, 흉선종, 유방암, 전립선암, 간세포 암종, 방광암, 자궁암, 췌장암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 난소암, 경부암, 고환암, 위암, 식도암, 간암, 급성 림프 구성 백혈병 (ALL), T-ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 타액 암종 또는 기타 암을 비롯한 암의 치료, 그 중증도의 감소 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 실시형태는 패혈증, 골 흡수 (골다공증), 악액질, 암 관련 피로, 건선, 전신 발병 청소년 특발성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 메산지움 증식성 사구체신염, 과감마글로불린혈증, 캐슬만병, IgM 감마 병증, 심장 점액종 및 자가 면역 인슐린 의존성 당뇨병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환의 치료, 그 중증도의 감소 또는 예방 방법을 제공한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애 또는 그의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 발병 지연 또는 진행의 억제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 하나 이상의 증상이 발생한 후에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료는 증상의 부재하에 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 이전에 (예를 들어, 증상의 병력 및/또는 유전적 또는 다른 감수성 요인에 비추어), 감수성 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 재발을 예방하거나 지연시키기 위해, 증상이 호전된 후에도 치료를 계속할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 제2 활성제와 함께 투여될 수 있다. 제2 활성제는 5-아미노살리실산, 아자티오프린, 5-머캅토퓨린 및 코르티코스테로이드 중 하나 이상의 것일 수 있다. 5-아미노살리실산, 아자티오프린, 5-머캅토퓨린 및 코르티코스테로이드의 투여시 투여 정량은 당업자에게 잘 알려져 있다.

생성 방법

본 발명의 추가의 양상은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA는, 신호 펩티드가 항체 사슬의 아미노산 서열의 아미노 말단에 인-프레임으로 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 상기 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계는 형질 전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다. 포유동물 숙주 세포 발현의 조절 서열에는 포유동물 세포에서 높은 단백질 발현 수준을 유도하는 바이러스 요소, 예를 들어 레트로바이러스 LTR, 시토메갈로바이러스 (CMV) (예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예를 들어, SV40 프로모터/인핸서 등), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서 및 강력한 포유동물 프로모터, 예를 들어 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터가 포함된다. 숙주 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 박테리아 또는 효모 세포일 수 있으며, 바람직하게는 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유동물 세포이다. 예시적인 CHO 세포에는 유러피언 콜렌션 오브 셀 컬쳐 (European Collection of Cell Cultures) (ECACC, No. 9406067)에서 입수한 (CHO)/dhfr- 세포가 있다.

바람직하게는, 숙주 세포는 CHO 세포이고, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 CHO 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 도 3 또는 도 7에 도시된 서열이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 디설파이드 가교에 의해 결합된 서열 번호 1의 두 단량체를 포함하는 이량체를 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포에서 서열 번호 1을 발현시키는 단계 및 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 디설파이드 가교에 의해 결합된 서열 번호 2의 두 단량체를 포함하는 이량체를 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포에서 서열 번호 2를 발현시키는 단계 및 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다. 핵산 벡터를 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 전기천공법, 형질감염 등을 포함한다. 형질감염 세포를 배양하여, 세포가 원하는 단백질을 발현하도록 한다. 그 후, 세포 및 배양 배지를 회수하고, 폴리펩티드 이량체를, 예를 들어 크로마토그래피 칼럼 단계 (예를 들어, MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q)에 의해 정제한다. 이량체는 농축되고/거나 바이러스 감소/불활성화 단계로 처리될 수 있다.

본 발명의 추가적 양상은 본 명세서에 개시된 방법에 의해, 생성된 폴리펩티드 이량체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 이량체는 본 명세서에 기술된 특성 (예를 들어, 폴리펩티드 1몰당 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스의 백분율, 시알릴화)을 가진다. 상기 방법에 의해 생성된 이량체를 사용하여, 적절한 조성물을 제조할 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 본 명세서에 기술된 특성 (예를 들어, 낮은 응집, 절단)을 가진다.

실시예

실시예 1

펩티드 1 (그의 활성 이량체 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드)의 제조 및 특성화

CHO / dhfr - 세포에서의 펩티드 1의 클로닝 및 발현

CHO/dhfr ^- 세포는 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐 (ECACC, No. 9406067)에서 입수하였다. 부착 CHO/dhfr ^- 세포는 폴레이트의 디하이드로폴레이트로의 환원 및 그 후, 테트라하이드로폴레이트로의 환원을 촉매하는 효소인 디하이드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR)가 결여되어 있다. 따라서, CHO/dhfr ^- 세포는 항폴레이트 약제인 메토트렉세이트 (MTX)에 대해 감수성을 나타낸다.

CHO/dhfr ^- 세포주는 잘 특성화하고, 시험한다. 인간에서 사용하기 위한 생물 의약의 생성을 위한 세포 기질로서 CHO/dhfr ^- 부모 세포주의 안전성은 21 CFR에 따른 미생물 무균성, 마이코플라스마 및 외래성 바이러스에 대해 ECACC (영국 Porton Down)에 의해, 확인하였다.

cDNA 서열의 선택 및 제작

gp130의 세포 외 도메인 (IL6ST, NCBI Gene ID 3572, 전사 변이체 1 (NP_002175), 아미노산 23-617) 및 인간 IgG1의 Fc 도메인 (IGHG1, NCBI Gene ID 3500, 아미노산 221-447/Kabat EU 번호)의 서열을 사용하여, GeneArt AG (독일 레겐스부르그)에 의해, 단일 DNA 단편으로서, 펩티드 1 (서열 번호 1의 폴리펩티드 서열)의 cDNA 서열을 합성하였다. 상기 서열을 CHO 세포에서 최적의 코돈 사용을 위해 최적화하였다. Fc 부분의 하부 힌지 영역에 잘 특성화된 3개의 점 돌연변이를 도입시켰다.

CHO 세포 발현 시스템에서 본래의 gp130 신호 펩티드를 그 효과가 공지된 마우스 IgG 중쇄 신호 펩티드로 대체함으로써, cDNA 서열을 추가로 변형시켰다. 신호 펩티드는 단백질 합성 과정 동안 절단된다. Fc 영역의 IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys 서열의 존재는, 함께 펩티드 1을 형성하는 것으로서, Fc 영역의 설프하이드릴 잔기를 통해 두 개의 동일한 gp130-Fc 하위 단위의 이량체화를 초래한다.

도 3은 펩티드 1의 생성에 사용된 gp130-Fc 하위 단위의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.

마스터 세포 은행 ( MCB )의 선택을 위한 발현 플라스미드의 제작

펩티드 1 cDNA를 하기와 같이 MTX로의 형질감염체 선택을 위해, dhfr 유전자를 함유하는 pANTVhG1 발현 벡터 (Antitope) (도 4)에 클로닝하였다: 먼저, 펩티드 1 cDNA의 삽입을 가능하게 하기 위해, 발현 벡터를 MluI 및 EagI 제한 효소로 절단하였다. 두 번째로, 펩티드 1 코딩 영역을 OL1425 및 OL1426 프라이머 (표 1)를 사용하여 PCR 증폭시키고, MluI 및 EagI 제한 효소로 절단하였다. 세 번째로, 절단된 단편을 겔 정제하고, 함께 결찰시켜, pFER02 발현 벡터 (도 5)를 생성시켰다. 펩티드 1 cDNA를 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 조절 하에 삽입하였다.

표 2는 pFER02 발현 요소의 기능을 제시한다. 도 6은 pFER02 발현 요소의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.

pANTVhG1에 클로닝하기 위해 펩티드 1 코딩 영역을 증폭시키는데 사용된 올리고뉴클레오티드 서열

프라이머	서열 (5'-3')*
OL1425	ctgttgctacgcgtgtccactccGAGCTGCTGGATCCTTGCGGC
OL1426	gcgggggcttgccggccgtggcactcaCTTGCCAGGAGACAGAGACAG

*펩티드 1-특이적 서열은 대문자로 표시하고, 벡터-특이적 서열은 소문자로 표시하고, 제한 부위에는 밑줄을 그었다.

pFER02발현 요소

특성	기능
CMV 프로모터	급속 초기 프로모터/인핸서. 재조합 단백질의 효율적이고 높은 수준의 발현을 가능하게 한다.
hIgG1 폴리A	인간 IgG 폴리아데닐화 서열
암피실린 내성 유전자 (β-락타마아제)	E. coli에서의 벡터의 선택
SV40 초기 프로모터 및 오리진	SV40 거대 T 항원을 발현하는 세포에서 에피솜 복제 및 네오마이신 내성 유전자의 효율적이고 높은 수준의 발현을 가능하게 한다
DHFR	CHO dhfr ^- 세포에서의 안정한 형질감염체의 선택
SV40 폴리아데닐화 신호	효율적인 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화

최종 펩티드 1 생성 클론에 이르는 세포주 선택 과정

pFER02 벡터는, 베타-락타마제 유전자 내에 위치한 단일 인식 부위를 가지는 평활 말단 제한 효소 SspI로 선형화하였다. 선형화된 플라스미드를 지질 매개 형질감염을 이용하여, 5 x 10⁶ CHO/dhfr ^- 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에, 형질감염된 세포를 5% 투석 태아 송아지 혈청 (FCS) 및 100 nM 메토트렉세이트 (MTX)가 보충된 배지에서 선택하였다. 형질감염된 세포를 다양한 밀도로 이러한 배지로 희석하고, 96-웰 평 바닥 조직 배양 플레이트에 분배시켰다. 그 후, 세포를 5% CO₂, 37℃의 습한 대기에서 인큐베이션하였다. MTX 수준과 양분 수준이 일정하게 유지되도록 하기 위해, 인큐베이션 시간 동안 일정한 간격으로 신선한 MTX 선택 배지를 첨가했다.

MTX 선택에 의한 초기 세포주 선택

형질감염 후 몇 주 동안, 조직 배양 플레이트를 Genetix CloneSelect^® Imager를 사용하여 검사하였으며, >2,000개의 웰에서 활발히 성장하는 콜로니가 관찰되었다. 이들 웰의 상청액을 샘플링하고, ELISA에 의해, 펩티드 1의 역가를 분석하였다. 이 분석 결과에 기초하여, 가장 잘 발현된 총 105개의 웰을 48-웰 플레이트로 확장시켰다. 총 83개의 세포주를 6-웰 플레이트 또는 T-25 플라스크로의 확장을 위해 선택하고; 각각의 세포주로부터의 상청액을 샘플링하고, 펩티드 1의 역가에 대해 분석하였다 (ELISA). 이러한 결과를 바탕으로, T-75 또는 T-175 플라스크로의 확장을 위해, 최적 성장 특성을 나타내는 54개의 가장 잘 발현된 세포주를 선택한 후; 융합성 플라스크 (confluent flask)로부터의 상청액을 샘플링하고, 펩티드 1의 역가를 정량화하였다 (ELISA). 세포주 사이의 발현 수준을 비교함으로써, 생산성 분석을 위해 선택된 38개의 최상의 세포주의 확인이 가능하였다. 생산성은 하기와 같이 평가하였다:

생산성 (pg/세포/일) = ((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/시간

상기 식에서,

Th는 수확 역가 [μg/mL]이고,

Ti는 초기 역가 [μg/mL]이며,

Vh는 수확시의 생존 세포 수 [x 10⁶ 세포/mL]이고,

Vi는 초기 생존 세포 수 [x 10⁶ 세포/mL]이며,

시간은 Ti와 Th 사이의 경과 시간 (일)이다.

생산성 결과 (pg/세포/일)에 기초하여, 유전자 증폭을 위해 13개의 세포주를 선택했다.

펩티드 1 세포주 선택을 위한 MTX 구동 유전자 증폭

선택된 13개의 세포주를 증가하는 농도의 MTX (0.1-50 M) 하에서의 선택적 압력에 의해, 유전자 증폭의 첫 번째 라운드를 위해 선정하였다. 7-10일 후, 13개의 각 세포주의 각 웰의 상청액을 샘플링하고, 펩티드 1의 역가에 대해 분석하였다 (ELISA). 펩티드 1의 높은 발현 수준을 나타내는 각 세포주의 웰을 생산성 (pg/세포/일)에 대해 평가하였다. 현저한 생산성 증가를 나타낸 세포주에서 총 16개의 웰로 유전자 증폭의 두 번째 라운드를 개시하였다.

유전자 증폭의 두 번째 라운드는 증가된 MTX 농도의 존재하에서 수행하고; 각 배양의 상청액을 펩티드 1의 역가에 대해 분석하였다 (ELISA). 각 세포주에서 선택된 웰을 확장시키고, 생산성 (pg/세포/일)을 평가하였으며; 증가된 MTX 선택 압력에 대한 반응으로, 증가된 생산성을 나타내는 5개의 세포주가 확인되었다. 이러한 5개의 세포주를 증가된 MTX 농도하에서 선택 압력을 사용하여, 유전자 증폭의 3번째 라운드로 진행시키고; 각 웰의 상청액을 펩티드 1의 역가에 대해 분석하였다 (ELISA). 각 세포주에 대해 선택된 웰을 확장시키고, 생산성 (pg/세포/일)을 평가하였으며; 펩티드 1의 높은 발현이 입증된 5개의 세포주를 선택하였다.

클론의 제한 희석

제한 희석 클로닝을 펩티드 1의 발현이 입증된 5개의 세포주에서 수행하였다. 인큐베이션 1주 후, 플레이트를 Genetix CloneSelect® Imager를 사용하여 검사하였으며, 단일 콜로니가 확인되었다. 희석 클로닝 동안 두 세포주의 성장 속도가 특히 느린 것으로 기록되었으므로, 이들 세포주는 중단되었다. 총 3개의 나머지 세포주로부터, 58개의 클론 콜로니를 우선 48-웰 플레이트로의 확장을 위해 선택한 다음, MTX 부재하에 12-웰 플레이트, T-25 플라스크 및 T-75 플라스크를 통해 연속적으로 확장시켰다. 그 후, 58개의 선택된 각 클론을 생산성 (pg/세포/일)에 대해 평가하고; 16개의 클론을 화학적으로 한정된 배지에서의 현탁 적응 및 성장 적응을 위해 선택하였다.

화학적으로 한정된 배지에서 현탁 배양에 대한 세포주의 적응

16개의 세포주를 하기와 같이 화학적으로 한정된 배지에서 현탁 배양에 적응시켰다: 부착 배양에서 선택된 세포주를 먼저 CHO 현탁 성장 배지 (DMEM 고 글루코오스, L-글루타민 및 소듐 피루베이트, 5% 투석 FCS, 20mg/L L-프롤린, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 1% 플루로닉 F68) 및 이어서 화학적으로 한정된 현탁 성장 배지 (Life Technologies Ltd. (Paisley, UK)의 CD Opti-CHO^®, 2.5% 투석 FCS, 0.1x 페니실린/스트렙토마이신, 8 mM Glutamax^®) 둘 모두에서 현탁에 적응시켰다.

일단 현탁 배양에 적응되면, 세포주를 무 혈청의 화학적으로 한정된 현탁 성장 배지 (CD Opti-CHO^®, 0.1x 페니실린/스트렙토마이신, 8 mM Glutamax^®)에 단계적으로 위닝 (weaning)하였다. MTX는 모든 현탁 배양에서 생략하였다. 적응된 세포주를 확장시키고, 종자 세포 은행 (seed cell bank)을 제조했다. 간단히 말하면, 세포를 총 용적 300mL로 확장시키고, 세포 밀도가 0.85 x 10⁶ 세포/mL를 초과하고, 생존률이 >90%일 때 수확했다. 성장 및 생산성 분석을 위해, 70mL 현탁 성장 배지가 들어있는 새 플라스크에 추가로 3 x 10⁷개의 세포를 시딩 (seeding)했다. 나머지 세포를 원심 분리에 의해, 수확하고, 적절한 용적의 동결 배지에 재현탁시켜, 1 x 10⁷ 세포/mL의 세포 현탁액을 수득하였다. 바이알을 -80℃까지 동결시켰다. 그 후, 장기 보관을 위해, 세포 은행을 액체 질소로 옮겼다.

무 혈청 적응 후, 16개의 세포주를 5개의 클론으로 추가 정제했다. 5개의 클론을 성장 (세포 밀도 및 세포 배증 시간) 및 생산성 (pg/세포/일)으로 평가한 후, 3개의 클론을 선택하였다. 하나의 클론을 마스터 세포 은행을 제조하기 위해 선택하였다.

마스터 세포 은행 (MCB) 및 작업 세포 은행 (WCB)의 제조를 수행하였다. 예비 종자 원액 중 하나의 바이알을 사용하여, 200개의 바이알 MCB를 제조하고, 하나의 바이알의 MCB를 사용하여, 200개의 바이알 WCB를 제조하였다. 각각의 경우에, 바이알을 해동시키고, 원심 분리에 의해, 동결 보존 배지를 제거하였다. 세포를 성장 배지 (CD OptiCHO^®/4 mM의 L-글루타민)에 재현탁하고, 용적을 증가시켰다. MCB 생성 과정에서 네 번의 계대 배양이 수행되었고, WCB 생성 과정에서 여섯 번의 계대 배양이 수행되었다.

충분한 세포가 수득되면, 세포를 동결 보존 배지 (92.5% CD OptiCHO^®/7.5% DMSO)에서 폴리프로필렌 바이알 (각각 약 1.5 x 10⁷ 생존 세포 포함)에 분취하였고, 점진적 동결 과정으로 적어도 60분의 시간 동안 온도를 -100℃까지 하락시킴으로써 동결 보존하였다. 바이알은 GMP 조절 구역의 기상 액체 질소 자동 충전 용기에 보관한다.

약제 기질 ( DS ) 제조 과정의 설명

펩티드 1 DS 제조 과정의 간단한 설명은 하기와 같다. WCB 바이알의 세포를 생산 생물 반응기에 접종하기 전에 무 단백질 배지를 사용하여 소생시킨 후, 점진적으로 확장시킨다. 세포 배양이 완료되면, 세포 및 세포 잔해를 배양 여과에 의해, 제거한다.

정제 과정은 크로마토그래피 칼럼 3 단계 (MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q), 농도 및 투석 여과 (diafiltration) 단계로 구성되며, 두 개의 특정 바이러스 감소/불활성화 단계; Triton X-100 (외피 바이러스 불활성화) 처리 및 나노 여과 단계 (외피 및 비 외피 바이러스 제거)를 포함한다.

농축 및 투석 여과 후, DS의 제형을 위해 부형제를 첨가한다. 제형화된 펩티드 1을 용기에 0.22μm 여과시킨다.

Capto Q 칼럼 대신에 10,000 L 배치에 사용되는 Sartobind Phenyl 칼럼은 올리고머의 존재의 감소에 효과적이다. 이러한 칼럼은 올리고머 형태의 수준을 평균 2.7%에서 1%까지 감소시킬 수 있었다.

분석 방법

글리칸 구조 분석을 Procognia Limited (Ashdod, Israel)에서 수행하였다. N-글리칸을 PNGase F를 사용하여 샘플에서 방출시킨 다음, 2-아미노벤즈아미드로 표지하였다. 방출된 글리칸을 일련의 엑소글리코시다아제의 존재 또는 부재하에 처리하여, 상이한 글리칸 형태를 생성하였다. 글리칸을 2차원 HPLC 분석 (NP-HPLC 및 WAX)으로 분리하고, 동일한 2차원 HPLC 분석에 의해 분리 및 분석한 자체 제조 표준을 사용하여 구축된 보유 시간 데이터베이스와 비교하여 확인했다.

시알산 함량

초고압 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 사용하여, 시알산 함량을 측정하고, 펩티드 동일성을 확인하였다. 이 방법은 Acquity UPLC BEH C18 1.7μm 2.1 x 50 칼럼을 사용하고, 그 후, 이동상: 9:7:84/아세토니트릴:메탄올:물을 사용하여 유속 0.3mL/min으로 수행하였다. 시알산을 시알리다아제 (sialydase)로 효소적 절단에 의해, 시험 샘플로부터 방출시킨 다음, 형광 표지 (1,2 디아미노 4,5 메틸렌디옥시벤젠 디하이드로클로라이드 (DMB))로 유도체화하였다. 표지된 시험 샘플을 등용매 용출 및 373nm의 여기 파장 및 448nm의 방출 파장에 의한 형광 검출을 사용하여, UPLC로 분리하였다. 테스트 샘플의 시알산 함량을 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA) 및 N-아세틸뉴라민산 (NANA) 표준에 대해 표준 곡선으로 측정하여 정량화하였다. NGNA 및 NANA 시알산 함량은 pmol 시알산/pmol 단백질로 기록된다.

시알릴화 패턴

약한 음이온 교환 (WAX)-HPLC를 사용하여, 중성, 모노-, 디-, 트리- 및 테트라- 시알릴화 글리칸 %를 측정했다. 이 방법은 PNGase에 의한 약제 물질로부터의 N-글리칸의 효소적 방출, 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)를 이용한 형광 표지, Ludger D1 카트리지를 이용한 탈염을 수반한다. 시알릴화된 글리칸의 분리를 40℃에서 20% 아세토니트릴/0.5M 암모늄 포맷 구배에 의한 Glyco Sep C 칼럼을 사용하여, WAX-HPLC에 의해, 수행하였다. 형광 검출은 330nm 여기 및 420nm 방출로 설정하였다. 참조 표준의 시험을 병행 수행하였다. 중성, 모노-, 디-, 트리- 및 테트라- 시알릴화된 글리칸 %를 WAX-HPLC 크로마토그램으로부터 측정하고, 기록하였다.

순도, SEC

크기-배제 HPLC (SEC)를 사용하여, 손상되지 않은 활성 이량체를 SGF 및 올리고머 형태 (주로 활성 이량체의 이량체로 이루어짐)로부터 분리함으로써, 약제 물질 순도를 측정하였다. 손상되지 않은 활성 이량체 분자는 두 개의 동일한 글리코실화된 단백질 하위 단위 (인간 IgG1 중쇄의 Fc 부분에 융합된 gp130 세포 외 도메인)로 구성된다. 샘플을 유속 1mL/분 및 0.2M 인산나트륨 pH 7.0의 이동 상의 겔 투과 칼럼 (TSK G3000_SWXL)을 사용하여, 분자량 기준으로 분리하였다. 칼럼 용출물을 280nm에서 모니터하였다. 손상되지 않은 종류를 특성 보유 시간에 의해, 확인하고; 활성 이량체의 순도 %는 총 통합 피크 면적의 백분율로 표시된다.

올리고머 형태

올리고머 형태의 백분율은 상기에 제시된 SEC 방법을 사용하여 측정한다. 올리고머 형태의 백분율은 총 통합 피크 면적의 백분율로 표시된다.

단일 gp130 형태 ( SGF )

SGF의 백분율을 상기에 제시된 SEC 방법을 사용하여 측정하였다. SGF의 백분율은 총 통합 피크 면적의 백분율로 표시된다.

분석 결과는 표 3에 제시된다.

특성화 시험

약제 생성물 (DP)의 설명 및 조성

DP는 정맥(i.v.) 주입에 의해 투여될 수 있는 멸균 용액이다. DP는 pH 7.6의 25mM의 L-히스티딘, 200mM의 수크로오스 및 0.1mg의 폴리소르베이트 20/mL를 함유하는 등장액 중 15mg/mL의 농도의 펩티드 1로 구성된다. 산화 방지를 위해 바이알을 질소로 도포한다. 이러한 생성물은 단일 사용을 위한 것이며, 임상 투여를 위해 해동될 때까지, -20℃에서 보관한다.

조성물 및 배치 제형

약제 생성물의 배치 제형은 표 4에 제시되어 있다.

DP 배치 조성물


성분	양	특질 표준
펩티드 1	720 g	페링 사양
L-히스티딘	186.18 g	Ph.Eur./USP*
수크로오스	3286.08 g	Ph.Eur./USP*
폴리소르베이트 20	4.8 g	Ph.Eur./USP*
WFI	ad 49536 g	Ph.Eur./USP*
수산화 나트륨	적당량	Ph.Eur./USP*
질소	적당량	Ph.Eur./USP*
* curr. Ed.

실시예 2

임상 시험 000067 (단일 투여)

설계

이것은 단일 투여형, 위약 대조군, 단일 블라인드, 무작위 투여, 병용 그룹 투여 확대 시험이었다. 이 시험은 2개의 파트로 수행되었으며, 파트 1에는 건강한 대상체가 포함되었고, 파트 2에는 임상적 관해기의 CD 환자가 포함되었다. 목적은 펩티드 1의 단일 투여 후, 안전성 및 내약성을 검사하고, 가능한 경우, 약리학적 효과의 징후를 얻는 것이었다.

파트 1에서는 64명의 대상체가 포함되었으며, 그 중 48명 (남성 44명, 여성 4명)은 활성 치료를 받았고, 16명 (전부 남성)은 위약을 받았다. 7회 투여를 조사하고, 30분 (0.75mg, 7.5mg, 75mg) 또는 1시간 (150mg, 300mg, 600mg 및 750mg) 동안 정맥(i.v.) 주입으로 투여되었다. 또한, 6명의 대상체는 피하(s.c.) 복용량 60mg의 펩티드 1를 투여하였으며, 펩티드 1 및 2명의 대상체는 피하 복용량의 위약을 투여하였다. 펩티드 1은 25mM의 히스티딘, 200mM의 수크로오스 및 0.1mg/mL의 폴리소르베이트 20 중 15mg/mL로 투여하였다.

파트 2에는 24명의 환자가 포함되었으며, 그 중 18명 (남성 11명, 여성 7명)은 활성 치료 (75mg, 300mg, 750mg)를 받았고, 6명 (남성 4명, 여성 2명)은 위약을 받았으며, 두 경우 모두 정맥(i.v.) 투여하였다.

결과

펩티드 1의 정맥 투여 후의 PK 평가는 0.75mg 내지 750mg 범위에서 Cmax 및 AUC 모두에서 투여 비례성을 나타내었고, 혈장 내 Cmax 농도는 0.2 내지 170 μg/ml 범위이었다 (도 3). 제거율은 대략 0.13 L/h이었고, 평균 최종 반감기는 대략 4.5일이었으며, 분포량은 대략 20L이었고, 후반부는 일부 혈관 외 분포를 나타내었다. 60mg의 펩티드 1의 피하 투여는 2.3일에 1.1 μg/mL의 Cmax 및 5.0일의 반감기를 나타내었다. 펩티드 1의 피하 투여 후, 생체 이용률은 대략 50%로 계산되었다.

관해기의 CD 환자에 75, 300 및 750mg의 정맥 투여는 건강한 대상체와 매우 유사한 결과를 나타내었다 (도 4). AUC 및 Cmax는 투여 비례하였고, Cmax 농도는 16, 76, 및 186 μg/mL (건강한 대상체의 경우, 16, 77, 및 161 μg/mL)이었다. 제거율은 대략 0.13 L/h이었고, 평균 최종 반감기는 대략 4.6일이었으며, 분포량은 대략 22L이었다.

펩티드 1의 안전성 프로파일은 유리한 것이었으며, 위약 그룹을 포함하여, 모든 치료 그룹에서 부작용이 거의 발생하지 않았고, 모두 경미 (mild)하거나 온건 (moderate)했다. 부작용 발생률 또는 발생 빈도에서 명백한 투여 관련 경향은 관찰되지 않았다. 2명의 대상체의 경우, 주입이 중단되었으며, 한 명은 경미한 주입 반응으로 인한 것이었고 (파트 1, 300mg 그룹), 한 명은 온건한 주입 반응으로 인한 것이었다 (파트 2, 75mg 그룹).

생체 징후, ECG 또는 임상 화학 파라미터에서 명백한 투여 관련 경향이나 치료 관련 변화는 존재하지 않았다.

300mg 그룹 중 한 명의 건강한 대상체가 투여 후 5-6주의 추적 방문시 비 중화 치료 응급 항 펩티드 1 항체 (non-neutralising treatment emergent

anti-Peptide 1 antibody)를 나타내었다.

전반적으로, 펩티드는 안전하였고, 정맥 내 투여되는 경우, 단일 정맥 투여로서, 최대 750mg까지, 단일 피하 투여로서 60mg에서 양호한 내약성을 나타내었다.

실시예 3

임상 시험 000115 (다중 상승 투여)

설계

이것은 위약 대조군, 이중 블라인드, 무작위 투여 그룹, 병용 그룹 시험이었고, 그 목적은 펩티드 1의 다중 상승 투여의 안전성, 내약성 및 약리학을 조사하는 것이었다. 조사 투여는 75, 300 및 600mg의 펩티드 1로서, 30분 (75mg) 또는 1시간 (300mg 및 600mg)에 걸친 정맥 주입에 의해, 4주 동안 1주일에 한 번 투여되었다.

24명의 건강한 대상체가 포함되었으며, 그 중 18명 (남성 11명, 여성 7명)은 활성 치료를 받았고, 6명 (남성 2명, 여성 4명)은 위약을 받았다.

결과

PK 평가는 치료 첫날과 치료 마지막 날에 매우 근사한 특성을 나타내었고, 단일 투여 연구 결과와 유사하였다. AUC 및 Cmax는 제1회 및 제4회 투여 후, 투여 비례하였고, Cmax 농도는 제1회 투여 후, 19, 78, 및 148 μg/mL이었고, 제4회 투여 후, 19, 79, 및 142 μg/mL이었다 (건강한 대상체에서 단일 투여의 경우 16, 77, 및 161 μg/mL; 도 5). 3회 투여 수준에 상응하는 저점 값 (trough value)은 0.66, 2.68, 4.56 μg/mL 및 0.98, 3.95 및 7.67 μg/mL이었다. 마지막 투여 후 계산된 평균 최종 반감기는 대략 5.5일이었다.

펩티드 1의 안전성 프로파일은 유리한 것이었으며, 위약 그룹을 포함하여, 모든 치료 그룹에서 부작용이 거의 발생하지 않았고, 모두 경미하거나 온건했다. 부작용 발생률 또는 발생 빈도에서의 명백한 투여 관련 경향은 관찰되지 않았다. 경미한 주입 반응으로 인해, 1명의 대상체 (600mg 그룹)가 철회하였다.

생체 징후, ECG 또는 임상 화학적 파라미터에서 명백한 투여 관련 경향 또는 치료 관련 변화는 존재하지 않았다.

대상체 모두에서 항 펩티드 1 항체가 검출되지 않았다.

전반적으로, 펩티드 1은 안전하였고, i.v. 투여되는 경우, 4주 동안 매주 1회 최대 600mg까지 양호한 내약성을 나타내었다.

서열 목록

서열 번호 1

서열 번호 2

Claims

서열 번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 2개의 gp130-Fc 단량체를 포함하는 폴리펩티드 이량체로서, 상기 단량체가 서열 번호 1의 585-595 위치의 아미노산에 상응하는 gp130 D6 도메인, 서열 번호 1의 609-612 위치의 아미노산을 포함하는 Fc 도메인 힌지 영역을 포함하고, 상기 단량체가 gp130 부분과 Fc 도메인 사이에 링커를 포함하지 않으며, 바람직하게는, 상기 단량체가 하나 이상의 디설파이드 가교에 의해 결합되고:
a. 상기 폴리펩티드 이량체가 폴리펩티드 1몰당 6% 이하의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스, 바람직하게는 3 몰% 이하, 더욱 바람직하게는 1 몰% 이하, 추가로 더욱 바람직하게는 0.5 몰%의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스를 포함하거나,
b. 상기 폴리펩티드 이량체가 글리칸을 포함하며, 여기서, 평균 적어도 52%, 바람직하게는 적어도 54%의 글리칸, 더욱 바람직하게는 52-65%의 글리칸이 하나 이상의 시알산 잔기를 포함하거나, 또는
c. 상기 두 경우 모두를 포함하는 폴리펩티드 이량체.
제1항에 있어서, 상기 단량체가 서열 번호 1을 가지는 폴리펩티드 이량체.
제1항에 있어서, 상기 단량체가 서열 번호 2를 가지는 폴리펩티드 이량체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 서열 번호 1을 발현시키는 단계, 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계, 상기 세포 및/또는 세포 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드 이량체를 회수하는 단계에 의해, 수득 가능하며, 바람직하게는 상기 이량체가 정제 및/또는 농축되는 폴리펩티드 이량체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 조성물로서,
a. 5% 이하의 상기 폴리펩티드 이량체가 올리고머 응집체로서 존재하며,
b. 상기 조성물이 서열 번호 1의 폴리펩티드에 대해서, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 절단형 변이인 폴리펩티드를 4.0중량 이하로 포함하고, 바람직하게는 3% 이하, 더욱 바람직하게는 1.5% 이하, 가장 바람직하게는 1.0% 이하의 상기 폴리펩티드가 올리고머로서 존재하거나 또는
c. 상기 두 경우 모두를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 조성물 또는 제5항에 따른 조성물로서, 상기 조성물이 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 계면활성제가 비이온성 계면활성제이고, 바람직하게는 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 계면활성제이고, 더욱 바람직하게는 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 20인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 조성물 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물로서, 상기 조성물이 완충제 및 당을 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 완충제가 히스티딘이고, 바람직하게는 상기 당이 수크로오스인 조성물.
인간의 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 이량체 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
제9항에 있어서, 상기 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증이 염증성 장 질환 이고, 바람직하게는, 상기 치료가 염증성 장 질환의 관해 (remission)를 유도하는 폴리펩티드 이량체 또는 조성물.
제9항에 있어서, 상기 염증성 장 질환이 크론병 또는 궤양성 대장염이고, 바람직하게는 상기 치료가 염증성 장 질환의 관해를 유지시키는 폴리펩티드 이량체 또는 조성물.
제9항에 있어서, 상기 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증이 류머티스성 관절염, 건선, 포도막염 또는 죽상 동맥 경화증이거나, 또는 상기 염증성 질환 또는 IL-6 매개 병증이 염증성 장 질환과 관련이 없는 대장염이고, 바람직하게는 상기 대장염이 방사선 대장염, 게실성 대장염, 허혈성 대장염, 감염성 대장염, 체강 질환, 자가 면역성 대장염 또는 결장에 영향을 미치는 알레르기로 인한 대장염인 폴리펩티드 이량체 또는 조성물.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 이량체 또는 조성물이 비경구적으로, 바람직하게는 정맥 내 또는 피하로 투여되는 폴리펩티드 이량체 또는 조성물.
세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 서열 번호 1을 포함하는 아미노산 서열을 발현시키는 단계, 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계, 상기 세포 및/또는 세포 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드 이량체를 회수하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 이량체가 정제 및/또는 농축되는 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩티드 이량체의 생성 방법.
서열 번호 1을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
제15항에 따른 벡터를 포함하는 세포.