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KR20170109541A - 알파9 인테그린 길항제를 사용한 골수 줄기 세포 니치로부터의 hsc의 이탈 및 방출 - Google Patents

알파9 인테그린 길항제를 사용한 골수 줄기 세포 니치로부터의 hsc의 이탈 및 방출 Download PDF

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KR20170109541A
KR20170109541A KR1020177019250A KR20177019250A KR20170109541A KR 20170109541 A KR20170109541 A KR 20170109541A KR 1020177019250 A KR1020177019250 A KR 1020177019250A KR 20177019250 A KR20177019250 A KR 20177019250A KR 20170109541 A KR20170109541 A KR 20170109541A
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KR
South Korea
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optionally substituted
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alkyl
integrin
alpha
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Ceased
Application number
KR1020177019250A
Other languages
English (en)
Inventor
수잔 케이 닐슨
데이비드 노먼 헤일락
벤자민 벤 밍 카오
Original Assignee
커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 filed Critical 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션
Priority to KR1020217032814A priority Critical patent/KR20210128024A/ko
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Abstract

조혈 줄기 세포 동원은 조혈 줄기 세포가 골수 공간으로부터 나오도록 자극되는 과정이다. HSC가 동원할 수 있기 전에, 이들은 이들이 존재하고 부착 상호작용에 의해 보유되는 BM 줄기 세포 니치로부터 이탈되고 방출되어야 한다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 생체내에서 또는 생체외에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 방법으로서, 유효량의 α9 인테그린 길항제 또는 이의 활성 부분을 BM 줄기 세포 니치에 생체내 또는 생체외 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. HSC는 일단 말초 혈액(PB)으로 동원되면 이식을 위해 채취될 수 있다. HSC의 동원을 향상시키는 방법은 혈액학적 장애의 치료도 개선할 수 있다.

Description

알파9 인테그린 길항제를 사용한 골수 줄기 세포 니치로부터의 HSC의 이탈 및 방출{DISLODGEMENT AND RELEASE OF HSC FROM THE BONE MARROW STEM CELL NICHE USING ALPHA9 INTEGRIN ANTAGONISTS}
본 발명은 골수(BM) 줄기 세포 니치(niche)로부터의 조혈 줄기 세포(HSC) 및 이의 전구체 및 전구세포(progenitor)의 이탈 및 방출을 향상시키는 것, 및 BM 및 줄기 세포 니치로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈 및 방출을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈 및 방출을 향상시키는 데 사용될 조성물에 관한 것이다. 상기 방법 및 조성물에 의해 이탈되고 방출된 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 세포 집단뿐만 아니라, 혈액학적 장애의 치료, 및 HSC, 이의 전구체 및 전구세포의 이식을 위한 상기 세포 집단의 용도도 포함된다.
BM 줄기 세포 니치 내에서의 HSC 조절 및 체류는 HSC 표면 수용체들과 주변 세포, 예컨대, 조골세포 및 굴내피세포에 의해 발현된 그들 각각의 리간드 사이의 상호작용을 통해 매개된다. 기능적 어세이, 및 생체내 및 생체외 영상화를 이용한 BM 내의 HSC의 공간적 분포 분석은 이들이 우선적으로 골내막 니치 내의 골/BM 계면에 가장 가깝게 위치한다는 것을 시사한다. 무엇보다도, 고전적인 Lin-Sca-1+ckit+CD150+CD48- 표현형과 동일하나 골내막 BM으로부터 단리된 HSC는 중추 골수강으로부터 단리된 HSC에 비해 더 큰 귀소 잠재력 및 향상된 장기간 다중-계통 조혈 재구성을 가진다. 따라서, 동원(mobilization)을 위한 골내막 HSC의 치료적 표적화는 보다 우수한 이식 결과를 제공해야 한다.
BM으로의 조혈의 국소화는 원시 조혈 세포와, BM 줄기 세포 니치의 간질-세포-매개된 조혈 미세환경 사이의 발생학적으로 조절된 부착 상호작용을 수반한다. 정상-상태 조건 하에서, HSC는 BM에서의 원시 조혈 전구세포의 생리학적 체류를 유발하는, 간질 요소(예컨대, VCAM-1 및 오스테오폰틴(Opn))와의 부착 상호작용에 의해 BM 니치에 보유된다. 상기 부착 상호작용의 교란은 BM에 보유된 HSC의 방출을 유발할 수 있고 골수 니치로부터의 줄기/전구세포의 방출 및 궁극적으로 동원에 의한 순환계 내로의 방출을 유발할 수 있다. 골수로부터 궁극적으로 말초 혈액으로의 백혈구의 생리학적 배출 또는 동원뿐만 아니라, 정상 골수 환경으로부터 순환계로의 소수의 줄기/전구세포의 탈출은 잘 이해되지 않는 현상이다. 골수의 혈관외 공간으로부터 순환계로의 세포의 이동은 조화된 순서의 가역적 부착 및 이동 단계들을 요구할 수 있다. 골수에서 줄기/전구세포 또는 간질 세포에 의해 발현된 부착 분자의 레퍼토리는 이 과정에서 중추적이다. 다양한 자극들에 의해 유발된 전구세포의 부착 및/또는 이동에서의 변경은 골수와 말초 혈액 사이에서 그들의 이탈 또는 재분포를 초래할 가능성이 있다.
HSC의 특정 집단의 방출 및 동원은 이식, 유전자 요법, 암, 예컨대, 백혈병, 유방암을 비롯한 신생물성 암을 비롯한 질환의 치료, 또는 조직 및 피부의 회복을 비롯한 다양한 상황들에서의 사용을 허용할 수 있다. 그러나, HSC의 동원을 위해, 초기에 BM으로부터 HSC를 이탈시킬 수 있는 신속하고 선택적인 동원 방식을 요구한다. BM 줄기 세포 니치로부터의 HSC의 특정 세포 집단의 이탈 및 방출은 더 큰 장기간 다중-계통 조혈 재구성을 제공할 수 있다.
동원된 말초 혈액(PB) 조혈 줄기 세포(HSC)를, 혈액 질환에 대한 치료를 받고 있는 환자 내로 이식하는 것은 본질적으로 전통적인 골수(BM) 이식을 대체하였다. HSC 동원을 위한 일부 임상적 실시는 CXCR4/SDF-1 상호작용을 절단하는 프로테아제의 생성을 자극하는 것으로 생각되는 재조합 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)의 5일 과정으로 달성된다. 그러나, G-CSF는 큰 환자 코호트에서 비효과적이고 여러 부작용들, 예컨대, 골 통증, 비장 확장 및 드물게 비장 파열, 심근 경색 및 뇌허혈과 관련되어 있다.
G-CSF의 이들 고유의 단점들은 소분자에 기초한 대안적 동원 방법을 확인하고자 하는 노력을 이끌어내었다. 예를 들면, FDA에 의해 승인된 CXCR4 길항제 AMD3100(플레릭사포르(Plerixafor); MozobilTM)은 제한된 독성 문제를 가지면서 HSC를 신속히 동원하는 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, AMD3100을 사용한 임상적 동원은 G-CSF와 병용될 때에만 효과적이고, 신속하고 선택적이고 G-CSF 독립적인 동원 방식에 대한 검색은 임상적 관심의 주제로 남아있다. 임상적으로 G-CSF가 가장 광범위하게 사용된 동원제일지라도, 그의 단점은 잠재적으로 독성 부작용, 상대적으로 긴 치료 과정(5일 내지 7일의 연속 주사) 및 환자의 가변적인 반응을 추가로 포함한다.
그러나, 동원을 달성하기 위해, HSC는 BM 줄기 세포 니치에의 그의 부착으로부터 방출되어야 한다. 니치 기능 및 니치 환경에서의 HSC 보유에 중요한 분자는 VCAM-1, 오스테오폰틴(Opn) 및 테나신(Tenasin)-C를 포함한다.
인테그린(integrin), 예컨대, α4β1은 HSC의 동원과 관련되어 있다. 구체적으로, HSC에 의해 발현된 α4β1(VLA-4) 인테그린 및 α9β1 인테그린 둘 다가 줄기 세포 정지, 및 골내막 영역 내의 VCAM-1 및 오스테오폰틴(Opn)에의 결합을 통한 니치 체류와 관련되어 있다. HSC 동원에서의 α9β1 인테그린의 역할은 공지되어 있지 않지만, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID)을 사용한 Opn의 하향조절뿐만 아니라 인테그린 α4 또는 G-CSF의 선택적인 억제도 HSC 동원을 위한 효과적인 표적으로서 인테그린에 결합하는 Opn/VCAM-1을 입증하였다. 그러나, 다양한 특징들, 예컨대, 소분자, 예컨대, 인테그린에의 결합은 이들이 구별되게 상이한 분자라는 것을 보여준다.
문헌(Pepinsky et al. (2002))에서, α4β1 인테그린과 α9β1 인테그린 사이의 차이는 이들의 결합 특징에서 분명하다. 펩핀스카이(Pepinsky)는 소분자 N-(벤젠-설포닐)-(L)-프롤릴-(L)-O-(1-피롤리디닐 카보닐) 티로신(BOP)에의 결합에서의 차이가 EGTA 처리 시 분명하다는 것을 보여준다. 상기 처리는 단일클론 항체 9EG7과 α4β1의 결합을 억제한 반면, 9EG7과 α9β1의 결합을 자극하였다. 10 nM의 겉보기 Kd로 α4β1에 결합하고 10 μM 초과의 겉보기 Kd로 α9β1에 결합하는 VCAM-1에 대한 상기 인테그린들의 친화성에 있어서 1000배 초과의 추정된 차이가 가장 주목할 만하였다. α9β1 및 α4β1과 오스테오폰틴의 결합에서의 차이도 관찰되었다.
따라서, HSC의 이탈 및 방출을 향상시켜 HSC의 동원을 개선시키기 위한 신속하고 선택적인 HSC 이탈 및 방출 화합물 및 G-CSF와 무관한 방법을 확인하는 것이 본 발명의 목적이다. 이 화합물을 특정 HSC 집단에 표적화함으로써 재구성 및 이식 결과를 개선할 수 있다.
문헌, 법률, 자료, 장치, 논문 등의 논의는 본 발명의 내용을 제공할 목적으로만 본 명세서에 포함된다. 임의의 또는 모든 이들 사항들이 본원의 각각의 청구항의 우선일 전에 존재했던 것처럼 종래기술 기초의 일부를 형성하였거나 본 발명과 관련된 분야에서 통상의 일반적인 지식이었다는 것을 암시하거나 표시하는 것은 아니다.
본 발명의 한 양태에서, 생체내에서 또는 생체외에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 방법으로서, G-CSF의 존재 또는 부재 하에서 유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 BM 줄기 세포 니치에 생체내 또는 생체외 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, HSC의 이탈은 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC의 방출을 유발하며 이는 HSC를 BM으로부터 PB로의 동원을 가능하게 하고 이에 따라 HSC의 동원을 향상시킨다. 동원의 추가 자극은 PB로의 HSC의 동원을 추가로 향상시키는 동원제의 사용에 의해 보조될 수 있다.
바람직하게는, HSC는 CD34+ 세포, CD38+ 세포, CD90+ 세포, CD133+ 세포, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁(lineage-committed) CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택된 골내막 전구세포이다.
바람직하게는, α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제는 α9β1 인테그린 또는 이의 활성 부분이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 α4 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, α4 인테그린은 α4β1 또는 이의 활성 부분의 길항제이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 길항제는 α9 및 α4와 교차-반응하고, 임의적으로 α9β1 및 α4β1과 교차-반응한다. 임의적으로, 상기 길항제는 α9β1/α4β1 길항제 또는 이의 활성 부분이다.
바람직하게는, 상기 길항제는 하기 화학식을 가진 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00001
상기 식에서,
X는 결합 및 -SO2-로 구성된 군으로부터 선택되고;
R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R3은 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
R4는 H 및 -OR6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R5는 H 및 -OR7로 구성된 군으로부터 선택되고;
단, R4가 H일 때 R5는 -OR7이고, R4가 -OR6일 때 R5는 H이고;
R6은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R8, -C(O)R9 및 -C(O)NR10R11로 구성된 군으로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8은 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R9는 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R10 및 R11은 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00002
.
보다 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00003
.
가장 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00004
.
또 다른 실시양태에서, BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC의 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 조성물로서, 본원에 기재된 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체로부터 HSC를 채취하는 방법으로서,
G-CSF의 존재 또는 부재 하에서 유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 유효량이 BM 줄기 세포 니치에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 것인 단계;
이탈된 HSC를 PB로 동원시키는 단계; 및
PB로부터 HSC를 채취하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 방법의 추가 양태에서, 대상체에서 혈액학적 장애를 치료하는 방법으로서, G-CSF의 존재 또는 부재 하에서 치료 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제, 또는 본원에 기재된 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 투여받은 대상체로부터 채취된 HSC를 포함하는 세포 조성물을 대상체에게 투여하여, BM으로부터 PB로의 HSC의 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈액학적 장애는 조혈 신생물성 장애이고, 상기 방법은 비효과적인 화학요법제가 더 효과적이게 되도록 HSC를 화학감작하여 HSC의 민감성을 변경시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, HSC를 환자 내로 이식하는 방법으로서,
α9 인테그린 길항제를 대상체에게 투여하여 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터 HSC를 이탈시키는 단계;
HSC를 BM으로부터 PB로 방출 및 동원시키는 단계;
대상체로부터의 PB로부터 HSC를 채취하는 단계; 및
HSC를 환자에게 이식하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 특정 실시양태의 하기 설명에 비추어 볼 때 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명해질 것이다.
본 발명의 양태 및 장점의 추가 이해를 위해, 첨부된 도면과 함께 하기 상세한 설명을 참조해야 한다.
도 1은 LN18 유래 세포주의 생성을 보여준다. 인간 교모세포종 LN18 세포주의 레트로바이러스 형질도입을 통해 인간 인테그린 α4β1 및 α9β1을 과다발현하는 안정한 LN18 세포를 생성하였다. 모 LN18 세포 및 α9β1 형질도입된 LN18 세포에서의 배경 α4 발현의 침묵은 α4 shRNA의 레트로바이러스 벡터 전달에 의해 달성되었다.
도 2는 α4β1 및 α9β1 LN18 세포의 항체 염색을 보여준다. 대조군 LN18 SiA4, LN18 α4β1 및 LN18 α9β1 세포를 마우스 이소타입 대조군, 마우스-항-인간 α4 항체 또는 마우스-항-인간 α9β1 항체로 염색한 후, 염소-항-마우스 IgG1에 접합된 알렉사 플루오르 594로 이차 표지하였다. 세포를 DAPI로 반대염색하였다(청색).
도 3은 (a) 1 mM Ca2+/Mg2+(개방된 부호)의 존재 하에서 화합물 22 및 (b) 1 mM Ca2+/Mg2+(개방된 부호) 또는 1 mM Mn2+(폐쇄된 부호)의 존재 하에서 R-BC154를 사용하여 화합물 22 및 R-BC154와 대조군(인테그린 부재; 십자-점선), α4β1(원형-파선) 및 α9β1(정사각형-직선) LN18 세포의 포화 결합 실험을 보여준다. 표시된 데이터는 평균 형광 강도(MFI)±SEM(n=3)으로서 표현된다. 도 3c는 Ca2+/Mg2+ 및 Mn2+ 조건 하에서 50 nM R-BC154로 염색된 과다발현 LN18 세포 및 대조군 LN18 세포(적색)의 형광 현미경관찰 영상을 보여준다. 세포를 DAPI로 반대염색하였다(청색).
도 4는 R-BC154의 양이온 의존적 결합을 보여준다. LN18 α9β1 세포를 TBS 완충제 단독(흑색 막대), 1 mM Ca2+/Mg2+(적색 막대) 또는 1 mM Mn2+(청색 막대)에서 소정의 농도의 R-BC154로 처리하였다. 수득된 데이터는 단일 실험으로부터의 데이터이고, % 최대 형광으로서 표현된다.
도 5는 R-BC154와 LN18 세포의 결합의 결합의 동력학적 측정을 보여준다. 37℃에서 0분, 0.5분, 1분, 2분, 3분, 5분, 10분, 15분 및 20분 동안 세포를 50 nM R-BC154로 처리함으로써 R-BC154와 (a) α4β1(원형-파선) 및 (b) α9β1(정사각형 직선) 인테그린의 결합에 대한 결합 속도를 TBS 완충제 중의 1 mM Ca2+/Mg2+(개방된 부호) 및 1 mM Mn2+(폐쇄된 부호)의 존재 하에서 측정하였다. (c) R-BC154와 α4β1(원형 파선) 및 α9β1(정사각형 직선) 인테그린의 결합에 대한 해리 속도 측정을 0분, 2.5분, 5분, 15분, 30분, 45분 및 60분에서 TBS 완충제 중의 1 mM Ca2+/Mg2+(개방된 부호) 및 1 mM Mn2+(폐쇄된 부호)의 존재 하에서 측정하였다. 데이터는 최대 형광의 % 평균±SEM(n=3)으로서 표현되고 시간의 함수로서 작도된다. 결합 속도 데이터를 모든 곡선들에 대한 2-상 결합 함수에 피팅하였다(R2 > 0.997). 해리 속도 데이터를, 2-상 기하급수적 붕괴 함수에 피팅된 α4β1(Ca2+/Mg2+)을 제외한 모든 곡선들에 대한 1-상 기하급수적 붕괴 함수에 피팅하였다(R2 > 0.999).
도 6은 (a) 골수 조혈 전구세포(LSK), 및 (b) 비치료된 57Bl/6 마우스(회색 선) 및 R-BC154(10 mg kg-1) 주사를 제공받은 C57Bl/6 마우스(적색 선)의 유세포측정 막대그래프 도표를 보여준다. 데이터는 3개의 생물학적 샘플들을 대표한다. (c) 비치료된 마우스 및 (d) R-BC154 주사를 제공받은 마우스로부터 단리된 FACS 분류된 전구세포(계통-Sca-1+c-Kit+)의 형광 현미경관찰 영상(삽도). Sca-1+(청색), c-Kit+(녹색), R-BC154+(적색).
도 7은 R-BC154가 시험관내에서 뮤린 및 인간 조혈 전구세포에 우선적으로 결합한다. (a) R-BC154(1)의 화학구조. (b) 1 mM Ca2+/Mg2+의 존재 하에서 R-BC154와 대조군 SiA4(α4 넉다운; 흑색), α4β1(적색) 및 α9β1(청색) 형질도입된 LN18 세포주의 결합의 대표적인 유세포측정 막대그래프 도표. (c) 골내막(적색) 및 중추(청색) BM을 보여주는 대퇴골의 도식, 및 BM Lin-Sca+c-kit+(LSK) 및 LSKCD150+CD48-(LSKSLAM)의 대표적인 유세포측정 도표. (d) 10 mM EDTA(탈활성화; 흑색) 및 1 mM Ca2+/Mg2+(활성화; 녹색)의 존재 하에서 R-BC154(10 nM)로 염색된 LSK 및 LSKSLAM 세포의 막대그래프 도표. 비염색된 LSK 및 LSKSLAM 세포는 회색으로 표시되어 있다. (e) 10 mM EDTA(탈활성화; 흑색) 및 1 mM Ca2+/Mg2+(활성화; 녹색)의 존재 하에서 염색된 중추 및 골내막 BM으로부터 채취된 LSK 및 LSKSLAM 세포에 결합하는 R-BC154. 비염색된 세포는 회색으로 표시되어 있다. 데이터는 % 최대 평균 형광 강도(MFI)±SEM(n=3)으로서 표현되고 적어도 3회 별도의 실험들을 대표한다. (f) 양이온의 부재 하에서 중추(청색) 및 골내막(적색) LSK 세포에 결합하는 R-BC154. 점선 음영 곡선은 비염색된 LSK 세포를 나타낸다. (g) 1 mM Ca2+/Mg2+ 결합의 존재 하에서 R-BC154와, 중추(청색 막대) 및 골내막(적색 막대) BM으로부터의 림프(B220+ 및 CD3+) 및 골수(Gr1Mac1+), LSK 및 LSKSLAM 세포의 결합 비교. 데이터는 2회 별도의 실험들을 대표한다. 일측 ANOVA p<0.0001. (h) 야생형(흑색 막대) 및 α4 -/-/α9 -/- 조건부 KO 마우스(백색 막대)로부터의 중추 및 골내막 LSK 및 LSKSLAM 세포에 결합하는 R-BC154. (i) 1 mM Ca2+/Mg2+의 존재 하에서(녹색; 활성화됨) 및 양이온의 부재 하에서(흑색; 비활성화됨) R-BC154와 인간 단핵 세포(MNC)의 용량 반응 결합. (j) CD34+ 및 CD38-을 발현하는 인간 MNC의 대표적인 유세포측정 도표. 게이팅된 집단은 계통 위탁 세포(P1 = CD34-), 조혈 전구세포(P2 = CD34+CD38+) 및 풍부해진 줄기 세포 및 전구세포(P3 = CD34+CD38-)를 대표한다. (k) 1 mM Ca2+/Mg2+의 존재 하에서(녹색; 활성화) 및 양이온의 부재 하에서(흑색; 비활성화) R-BC154와 CD34-, CD34+CD38- 및 CD34+CD38- 세포의 결합. 비염색된 세포는 회색으로 표시되어 있다. 데이터는 3명의 개별 제대혈 기증자들로부터 수득되고 표준화된 MFI(평균±SEM)로서 표현된다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 및 ****p<0.001.
도 8은 10 mM EDTA 및 1 mM Ca2+/Mg2+의 존재 하에서 R-BC154(10 nM)로 처리된 WBM으로부터의 게이팅된 림프(B220+ 및 CD3+), 골수(Gr1Mac1+) 및 계통- 집단의 막대그래프 도표를 보여준다. 비염색된 세포는 회색으로 표시되어 있다. 데이터는 평균±SEM(n=3)이다.
도 9는 R-BC154가 제자리에서 골내막 니치 내의 내재적으로 활성화된 α4/α9 인테그린을 통해 HSC 및 전구세포를 표적화한다는 것을 보여준다. (a) R-BC154 주사를 제공받은 마우스로부터 채취된 중추(청색) 및 골내막(적색) BM으로부터의 게이팅된 LSK 세포에 대한 R-BC154 결합의 대표적인 막대그래프 도표. R-BC154hi 집단이 표시되어 있다. 주사를 제공받지 않은 마우스로부터의 LSK 세포는 흑색으로 표시되어 있다. (b) 골내막(적색) 및 중추(청색) BM(시점당 n=3)으로부터 단리된 LSK 및 LSKSLAM 세포 내의 R-BC154hi 세포의 비율을 보여주는 생체내 시간 경과 실험. p-값(2측 ANOVA)은 소정의 시점에서 중추와 골내막 사이의 비교를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM이다. (c) R-BC154 주사로부터 5분 후 골내막(적색 막대) 및 중추(청색 막대) BM으로부터 단리된 림프(B220+ 및 CD3+) 및 골수(Gr1+ 및 Mac1+) 자손 내의 % R-BC154hi 세포(n=3). 데이터는 평균±SEM이고 2회 독립적인 실험들을 대표한다. 생체내 R-BC154 결합은 LSK 세포 상에서의 α4 및 α9 인테그린 발현에 의해 좌우된다. R-BC154 주사를 제공받은 야생형 및 α4 -/-/α9 -/- 조건부 KO 마우스로부터의 계통-고갈된 FACS 분류된 Sca-1+c-kit+ 세포의 형광 현미경관찰 영상(좌측). R-BC154(적색); Sca-1-PB(청색); c-kit(녹색). R-BC154 주사를 제공받은 야생형(적색) 및 α4 -/-/α9 -/- 조건부 KO 마우스(회색)로부터의 게이팅된 LSK 세포의 유세포측정 막대그래프 도표(우측). 주사를 제공받지 않은 마우스로부터의 LSK 세포는 흑색으로 표시되어 있다. 데이터는 2회 별도의 실험들을 대표한다. (e) 피하 투여 후 PB 및 BM에서 R-BC154와 LSK 세포의 시간 경과 결합. 데이터는 평균±SEM이다(n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 및 ****p<0.001.
도 10은 주사한 지 15분 및 30분 후 R-BC154로 치료받은 마우스의 말초 혈액에서 (a) WBC 함량, (b) LSK 함량 및 (c) LSKSLAM 함량의 분석을 보여준다. 데이터는 평균±SEM이고 유의하지 않다(일측 ANOVA).
도 11은 소분자 α9β1/α4β1 인테그린 길항제 BOP가 HSC 및 전구세포를 신속히 동원시킨다는 것을 보여준다. (a) α9β1/α4β1 인테그린 길항제 BOP(2)의 화학구조. (b) 1 mM Ca2+/Mg2+의 존재 하에서 BOP를 사용한, R-BC154와 α4β1(점선) 및 α9β1(직선) LN18 세포의 결합의 경쟁적 억제. 계산된 IC50 값은 삽도에 표시되어 있다. (c) 1 mM Ca2+/Mg2+의 존재 하에서 BOP를 사용한, R-BC154와 골내막 LSK 및 LSKSLAM 세포의 결합의 경쟁적 치환. 데이터는 평균±SEM이다(n=3). 90분에 걸쳐 BOP(10 mg/kg)로 치료받은 마우스의 말초 혈액에서 (d) WBC, (e) LSK 및 (f) LSKSLAM 함량의 분석. 데이터는 평균±SEM이다(시점당 n=5).
조혈 줄기 세포 동원은 조혈 줄기 세포들이 골수 공간(예를 들면, 관골 및 흉골)으로부터 나와 혈류 내로 들어가도록 자극함으로써, 이들이 향후 재주입을 위한 채취를 위해 이용될 수 있거나, 이들이 천연적으로 골수로부터 나와 신체 전체에 걸쳐 이동하여 장기, 예컨대, 비장에 정착하여 혈액 세포를 제공하는 과정이다. HSC들이 이식과 같은 목적을 위해 채취되고 사용될 수 있는 혈류 내로의 HSC들의 동원을 인위적으로 유발할 수 있는 물질이 발견된다면, 종종 다양한 혈액학적 장애들을 동반하는 이 흥미로운 천연 현상은 요법의 유용한 구성요소로서 채택될 수 있다. 화합물, 예컨대, G-CSF 및 FDA-승인된 CXCR-4 길항제 AMD 3100은 HSC를 동원시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 독성 문제 및 다양한 부작용들이 이 치료로부터 초래될 수 있다.
HSC는 동원될 수 있기 전에 그 자신이 체류하고 부착 상호작용에 의해 보유되는 BM 줄기 세포 니치로부터 이탈되고 방출되어야 한다.
따라서, 본 발명의 양태에서, 생체내에서 또는 생체외에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 방법으로서, 유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 BM 줄기 세포 니치에 생체내 또는 생체외 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
정상 상태 조건에서, HSC는 BM 줄기 세포 니치로서 지칭되는 특수한 위치에서 BM 내에 존재한다. 여기서 이들은 방출되기 전에 정지 줄기 세포로서 체류하여, PB로 들어가고 조직에 정착하여 분화를 시작할 준비를 한다. HSC는 부착 분자 또는 결합 리간드, 예컨대, VCAM-1, Opn 및 테나신-C(그러나, 이들로 한정되지 않음)에 의해 BM 줄기 세포 니치 내에 체류된다. HSC/BM 줄기 세포 니치 상호작용의 관리는 BM 줄기 세포 니치 및 궁극적으로 PB로의 HSC의 이탈 및 방출에 중요하다.
따라서, 본 발명은 HSC와 BM 줄기 세포 니치 환경 사이의 부착 상호작용 및 결합 리간드를 파괴함으로써 HSC를 BM 줄기 세포 니치에서의 상호작용으로부터 이탈시키고 방출하는 수단을 제공한다. 그 다음, 상기 세포는 PB로의 동원을 위해 이용가능하게 되거나 BM에 남아있을 수 있다.
BM 줄기 세포 니치는 골내막 니치 및 중추 골수강을 포함한다. 골내막 줄기 세포 니치는 골수의 골내막에 위치하고, 여기서 조골세포는 HSC 기능, 예컨대, 증식 및 정지의 주요 조절제이다. 나아가, 상당한 비율의 HSC가 말초 혈액으로 들어가 분화를 시작할 준비를 하는 내피 니치 내의 굴내피세포와 밀접하게 관련되어 있다. 중추 골수강은 골수로서 공지되어 있는 적혈구 및 백혈구의 형성을 담당하는 골의 중추강이다.
본 출원인은 소분자 길항제로 적어도 α9 인테그린을 억제함으로써, HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포가 BM 줄기 세포 니치로부터 바람직하게는 골내막 니치 내로 이탈할 수 있거나 장기간 다중-계통 생착력을 가진 PB 내로 동원할 수 있다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, α9 인테그린 또는 이의 활성 부분에 대한 길항제 의 사용이 혈액 내로의 적어도 CD34+ 줄기 세포 및 전구세포의 이탈 및 방출을 유의하게 증가시킨다는 것을 발견하였다.
본 출원인은 활성화된 인간 및 뮤린 α9β1 및 α4β1 인테그린뿐만 아니라 BM HSC 및 전구세포에도 결합하는, 일련의 N-페닐설포닐프롤린 디펩티드에 기초한 형광 소분자 인테그린 길항제인 R-BC154(1)(도 1a)를 개발하였다(도 1a). 본 출원인은 이 패밀리의 화합물이 골내막 BM 내에서의 α9β1/α4β1과 Opn 사이의 제한된 상호작용에 기초한 동원을 위해 강력한 골내막 HSC를 표적화할 것이라고 추정하였다. R-BC154(1) 및 이의 비-표지된 유도체 BOP(2)가 생체내에서 내재적으로 활성화된 α9β1/α4β1 인테그린을 통해 마우스 및 인간 HSC 및 전구세포에 우선적으로 결합하고 이들을 동원시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, α9β1/α4β1 인테그린 억제제를 사용하는 골내막 HSC의 치료적 표적화는 줄기 세포 이식 적용을 위한 현재의 동원 방법에 대한 기대되는 대안을 제공한다.
인테그린은 주로 세포 부착 및 세포 신호전달 과정의 매개자로서 작용하는 비-공유연결된 αβ 이종이량체성 경막 단백질이다. 포유동물에서, 18개의 α-쇄 및 8개의 β-쇄가 확인되었고, 이때 적어도 24개의 상이한 유일무이한 αβ 조합들이 현재까지 기재되어 있다.
α4β1 인테그린(매우 늦은 항원-4; VLA-4)은 주로 백혈구 상에서 발현되고 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1), 피브로넥틴 및 오스테오폰틴(Opn)에 대한 수용체인 것으로 공지되어 있다. α4β1 인테그린은 백혈구 동원, 동원 및 활성화의 핵심 조절제이고 염증 및 자가면역 질환에서 중요한 역할을 가진다. 따라서, 천식, 다발성 경화증 및 크론병의 치료를 위한 α4β1 인테그린 기능의 소분자 억제제의 개발에 상당한 노력이 집중되어 왔고, 여러 후보들이 I 및 II 기 임상시험까지 진행되고 있다.
관련 인테그린 β1 인테그린인 α9β1이 α4β1과 많은 구조적 및 기능적 성질을 공유하고 VCAM-1 및 Opn을 포함하는 일부 리간드들 중 여러 리간드들에도 결합하지만, 인테그린 α4β1과 α9β1 사이의 차이가 존재하고, 이 차이는 이들을 구별되게 한다. 주로 백혈구 상에 존재하는 제한된 발현을 가진 α4β1과 달리, α9β1의 세포 발현은 광범위하다.
예를 들면, 소분자와 α9β1 및 α4β1 인테그린의 결합은 상이한 것으로 밝혀졌다. 본원의 실시예에서 밝혀진 바와 같이, 가장 큰 차이는 해리 속도 동력학에 있다. α9β1 길항제(R-BC154)뿐만 아니라 BOP도 α4β1에 비해 α9β1에 대한 유의하게 감소된 해리 속도를 가진 것으로 밝혀졌다. R-BC154에 대한 상세한 내용은 본원의 실시예 2에 예시되어 있고(도 5c), BOP에 대한 상세한 내용은 문헌(Pepinsky et al (2002))에 예시되어 있다(도 4b).
종래, α4β1 및 α9β1 인테그린 둘 다가 조혈 줄기 세포(HSC)에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다. 인테그린 α4β1 및 α9β1은 주로 골수로의 HSC의 격리 및 동원뿐만 아니라 장기간 재증식 줄기 세포에 대한 핵심 특징인 HSC 휴지기의 유지에도 관여한다.
α4β1 및 α9β1 인테그린에 의한 HSC 조절은 골-내벽 조골세포, 내피세포 및 골수 환경의 다른 세포에 의해 발현되고/되거나 분비되는 VCAM-1 및 Opn과의 상호작용을 통해 매개된다. 그러나, 문헌(Pepinsky et al (2002))에 논의되어 있는 바와 같이, VCAM-1 및 Opn에 대한 결합 친화성의 차이는 α4β1과 α9β1 사이에 현저히 상이하다. α4β1의 소분자 억제제는 효과적인 HSC 동원제로서 연루되어 있다. 그러나, α4β1과 α9β1 사이의 구조적 및 기능적 유사성에도 불구하고, 결합 특징은 상이하므로, 이러한 면에서 α9β1 인테그린의 역할은 조사되지 않은 상태로 남아있다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, α9 인테그린 길항제는 α9β1 인테그린 길항제이다. 인테그린 α9는 인간에서 ITGA9 유전자에 의해 코딩된 단백질이다. 이 유전자는 알파 인테그린을 코딩한다. 인테그린은 세포 기능을 매개하는, 알파 쇄 및 베타 쇄로 구성된 이종이량체성 일체형 막 당단백질이다. α9 서브유닛은 β1 서브유닛과 이종이량체성 복합체를 형성하여 α9β1 인테그린을 형성한다. 따라서, α9 인테그린의 길항제는 α9β1 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, α9β1 인테그린 또는 α4β1 인테그린의 활성 부분은 인테그린의 활성을 보유하는 α9β1 단백질 또는 α4β1 단백질의 부분이다. 즉, 상기 부분은 완전한 단백질보다 더 작지만 전체 α9β1 또는 α4β1 단백질과 동일한 또는 유사한 방식으로 여전히 작용할 수 있는 α9β1 단백질 또는 α4β1 단백질의 부분이다. 용어 "α9 인테그린" 또는 "α4 인테그린" 또는 "α9β1 인테그린" 또는 "α4β1 인테그린"이 본원에서 사용되는 경우, 이것은 이의 임의의 활성 부분의 언급도 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, α9 인테그린, 바람직하게는 α9β1 인테그린의 길항제는 α4 인테그린, 바람직하게는 α4β1 인테그린의 길항제이기도 하다. 본 발명의 α9 인테그린 길항제가 α9β1 인테그린 및 α4β1 인테그린 둘 다의 활성을 억제할 수 있는 것이 요구된다. 따라서, 상기 길항제가 α9β1/α4β1 인테그린 길항제인 것이 바람직하다.
α9 인테그린, 바람직하게는 α9β1 인테그린의 길항제는 α4 인테그린, 바람직하게는 α4β1 인테그린의 길항제와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 길항제가 동일한 경우, 단일 길항제가 α9 인테그린 및 α4 인테그린 둘 다의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 별도의 길항제가 α9 인테그린, 바람직하게는 α9β1 인테그린 및 α4 인테그린, 바람직하게는 α4β1 인테그린을 억제하기 위해 동시적으로 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 인테그린 길항제의 상호작용 전에 α9 인테그린, 바람직하게는 α9β1 인테그린 및 α4 인테그린, 바람직하게는 α4β1 인테그린이 활성화되는 것이 바람직하다. 상기 길항제는 바람직하게는 내재적으로 활성화된 인테그린과 상호작용한다. 따라서, α9 인테그린은 내재적으로 활성화되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, α9β1 인테그린이 내재적으로 활성화된다. 상기 고려된 바와 같이, 인테그린 길항제가 골내막 니치 내의 내재적으로 활성화된 α9/α4 인테그린을 통해 HSC 및 전구세포를 표적화하도록 α9β1 인테그린/α4β1 인테그린 둘 다가 동시적으로 또는 순차적으로 활성화되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, α9 인테그린의 길항제, 바람직하게는 α9β1 인테그린, 보다 바람직하게는 α9β1/α4β1 인테그린의 길항제는 하기 식을 가진 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
Figure pct00005
상기 식에서,
X는 결합 및 -SO2-로 구성된 군으로부터 선택되고;
R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R3은 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
R4는 H 및 -OR6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R5는 H 및 -OR7로 구성된 군으로부터 선택되고;
단, R4가 H일 때, R5는 -OR7이고, R4가 -OR6일 때, R5는 H이고;
R6은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R8, -C(O)R9 및 -C(O)NR10R11로 구성된 군으로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8은 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R9는 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R10 및 R11은 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
화학식 (I)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서,
R4는 H이고;
R5는 -OR7이고;
X, R1, R2, R3 및 R7은 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다.
이러한 실시양태들에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (II)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00006
상기 식에서,
X는 결합 및 -SO2-로 구성된 군으로부터 선택되고;
R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R3은 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서,
R7은 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12는 -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 1 또는 2이다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 실시양태에서, R7은 C1-C4 알킬로부터 선택된다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 기에 대해 본원에 기재된 예시적인 C1-C4 알킬은 선형일 수 있거나 분지될 수 있다. 일부 실시양태에서, C1-C4 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸 및 tert-부틸로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, -OR7이 -OCH3 또는 -OC(CH3)3이도록 R7은 메틸 또는 tert-부틸일 수 있다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 실시양태에서, R7은 -(CH2)n-R12이다. 이러한 실시양태에서, R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, n은 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 실시양태에서, R7은 -(CH2)n-R12이고, 이때 R12는 -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, n은 1 또는 2이다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 실시양태에서, R7은 -(CH2)n-R12이고, 이때 R12는 -OCH3이고, n은 2이거나, R12는 임의적으로 치환된 테트라졸릴(바람직하게는 5-테트라졸릴)이고, n은 1이다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 실시양태에서, R7은 -C(O)R13이다. 이러한 실시양태에서, R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
실시양태들의 한 세트에서, R13은 임의적으로 치환된 5-원 또는 6-원 사이클로알킬 고리일 수 있다. 예시적인 사이클로알킬 고리는 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실일 수 있다.
실시양태들의 한 세트에서, R13은 임의적으로 치환된 아릴 고리일 수 있다. 예시적인 아릴 고리는 페닐이다.
실시양태들의 한 세트에서, R13은 임의적으로 치환된 헤테로아릴 고리일 수 있다. 예시적인 헤테로아릴 고리는 피롤릴이다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 실시양태에서, R7은 -C(O)NR14R15이다.
R7이 -C(O)NR14R15인 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 실시양태에서, R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
R7이 -C(O)NR14R15인 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 특정 실시양태에서, R14 및 R15는 각각 에틸 또는 이소-프로필이다.
R7이 -C(O)NR14R15인 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 특정 실시양태에서, R14 및 R15 중 하나는 메틸이고 R14 및 R15 중 나머지 하나는 페닐이다.
R7이 -C(O)NR14R15인 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 특정 실시양태에서, R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성할 수 있다. 한 형태에서, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리는 임의적으로 치환된 5-원 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리일 수 있다. 구체적인 헤테로사이클로알킬 고리는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 및 모르폴리닐 고리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
R7이 -C(O)NR14R15인 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 특정 실시양태에서, R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 피롤리디닐 고리를 형성한다.
화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 일부 특정 실시양태에서, R7은 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12는 C1-C4 알킬, -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 5-테트라졸릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 2-피롤릴이고;
R14 및 R15는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 피롤리디닐 또는 모르폴리닐 고리를 형성하고;
n은 1 또는 2이다.
화학식 (I)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서, X는 -SO2-이다. 이러한 실시양태들에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (III)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00007
상기 식에서,
R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R3은 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
R4는 H 및 -OR6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R5는 H 및 -OR7로 구성된 군으로부터 선택되고;
단, R4가 H일 때 R5는 -OR7이고, R4가 -OR6일 때 R5는 H이고;
R6은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R8, -C(O)R9 및 -C(O)NR10R11로 구성된 군으로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8은 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R9는 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R10 및 R11은 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
화학식 (III)의 화합물의 일부 실시양태에서, 화학식 (IIIa)의 화합물을 제공하기 위해 R4는 H이고 R5는 OR7이다:
Figure pct00008
상기 식에서,
R1, R2 및 R3은 화학식 (III)에서 정의된 바와 같고;
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
화학식 (IIIa)의 일부 실시양태에서, R7은 C1-C4 알킬(바람직하게는 메틸 또는 tert-부틸), -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
이때, R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 1, 2 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 정수이다.
화학식 (IIIa)의 특정 실시양태에서, R7은 -C(O)NR14R15이고, 이때 R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성한다. 한 형태에서, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리는 임의적으로 치환된 5-원 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리일 수 있다. 구체적인 헤테로사이클로알킬 고리는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 및 모르폴리닐 고리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
화학식 (I)의 특정 실시양태에서, X는 -SO2-이고, R4는 H이고, R5는 -OR7이고, 이때 R7은 -C(O)NR14R15이고, R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 피롤리디닐 고리를 형성한다. 이러한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (IIIb)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00009
상기 식에서, R1, R2 및 R3은 본원에서 정의된 바와 같다.
본원에 기재된 화학식 (I), (II), (III), (IIIa) 또는 (IIIb)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서, R1은 임의적으로 치환된 아릴이다. 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 치환된 페닐이다.
실시양태들의 한 세트에서, R1은 적어도 하나의 할로겐 기로 치환된 페닐이다. 할로겐 치환기는 클로로, 플루오로, 브로모 및 요오도로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 클로로일 수 있다.
일부 실시양태에서, R1은 복수의 할로겐 기들로 치환된 페닐이다. 할로겐 치환기는 페닐 고리의 3-위치 및 5-위치에 위치할 수 있다.
한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (IVa) 또는 (IVb)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00010
상기 식에서, 화학식 (IVa) 및 (IVb) 각각에서 R2, R3 및 R7은 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다.
화학식 (IVa) 또는 (IVb)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서,
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
본원에 기재된 화학식 (I), (II), (III), (IIIa), (IIIb), (IVa) 또는 (IVb)의 화합물의 일부 실시양태에서, R3은 H이다.
R3이 H인 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (V)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00011
상기 식에서,
X는 결합 및 -SO2-로 구성된 군으로부터 선택되고;
R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R4는 H 및 -OR6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R5는 H 및 -OR7로 구성된 군으로부터 선택되고;
단, R4가 H일 때 R5는 -OR7이고, R4가 -OR6일 때 R5는 H이고;
R6은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R8, -C(O)R9 및 -C(O)NR10R11로 구성된 군으로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8은 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R9는 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R10 및 R11은 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
화학식 (V)의 화합물의 일부 실시양태에서, 하기 화학식 (Va)의 화합물을 제공하기 위해 R4는 H이고 R5는 OR7이다:
Figure pct00012
상기 식에서,
X, R1, R2 및 R7은 화학식 (V)에서 정의된 바와 같다.
화학식 (Va)의 화합물의 일부 실시양태에서, R7은 C1-C4 알킬(바람직하게는 메틸 또는 tert-부틸), -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고; 이때 R12, R13, R14, R15 및 n은 화학식 (V)에 대해 본원에서 정의된 바와 같다.
화학식 (Va)의 화합물의 특정 실시양태에서, R7은 -C(O)NR14R15이고, 이때 R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성한다. 한 형태에서, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리는 임의적으로 치환된 5-원 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리일 수 있다. 구체적인 헤테로사이클로알킬 고리는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 및 모르폴리닐 고리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
화학식 (V) 또는 (Va)의 화합물의 일부 실시양태에서, X는 -SO2-이다.
화학식 (Va)의 화합물의 특정 실시양태에서, X는 -SO2-이고, R3 및 R4는 각각 H이고, R5는 -OR7이고, 이때 R7은 -C(O)NR14R15이고, R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 피롤리디닐 고리를 형성한다. 이러한 실시양태에서, 화학식 (V)의 화합물은 하기 화학식 (Vb)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00013
.
화학식 (V) 또는 (Va)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서, R1은 임의적으로 치환된 아릴, 바람직하게는 임의적으로 치환된 페닐이다. 임의적 치환기는 바람직하게는 클로로, 플루오로, 브로모 및 요오도로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 할로겐 기, 바람직하게는 클로로이다.
실시양태들의 한 세트에서, R1은 적어도 하나의 할로겐 기로 치환된 페닐이다. 일부 실시양태에서, R1은 복수의 할로겐 기들로 치환된 페닐이다. 할로겐 치환기는 바람직하게는 페닐 고리의 3-위치 및 5-위치에 위치한다.
한 실시양태에서, 화학식 (V)의 화합물은 하기 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00014
상기 식에서, 화학식 (VIa) 및 (VIb) 각각에서, R2 및 R7은 화학식 (V)에서 정의된 바와 같다.
화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서,
R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물의 실시양태들의 또 다른 세트에서, R7은 메틸, tert-부틸 및 -(CH2)n-R12로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 R12는 -CN, -CH3, -C(CH3)3 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴(바람직하게는 5-테트라졸릴)로 구성된 군으로부터 선택되고, n은 1 또는 2이다.
화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물의 실시양태들의 또 다른 세트에서, R7은 -C(O)R13이고, 이때 R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬(바람직하게는 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실), 임의적으로 치환된 아릴(바람직하게는 페닐) 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴(바람직하게는 피롤릴)로 구성된 군으로부터 선택된다.
화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 실시양태들의 또 다른 세트에서, R7은 -C(O)NR14R15이고, 이때 R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성한다. 한 형태에서, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리는 임의적으로 치환된 5-원 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리일 수 있다. 구체적인 헤테로사이클로알킬 고리는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 및 모르폴리닐 고리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (VII)의 구조를 가진다:
Figure pct00015
상기 식에서, R2 및 R3은 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다.
화학식 (I)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서, R3은 H이므로, 하기 화학식 (VIII)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00016
상기 식에서, R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택된다.
화학식 (I)의 화합물의 한 형태에서, R2는 H이므로, 하기 화학식 (IX)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure pct00017
바람직한 특정 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00018
본원에 기재된 바와 같이, 화학식 (I), (II), (III), (IIIa), (IIIb), (IVa), (IVb), (V), (Va), (Vb), (VIa), (VIb), (VII) 또는 (VIII)의 화합물에서, R2는 일부 실시양태에서 치환기일 수 있다.
실시양태들의 한 세트에서, R2는 임의적으로 치환된 헤테로아릴, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 하이드록시, 아미노 및 아지도로 구성된 군으로부터 선택된 치환기이거나, R2는 하기 화학식 (A)의 구조를 가진 치환기이다:
Figure pct00019
상기 식에서,
Y는 임의적으로 치환된 헤테로아릴 또는 임의적으로 치환된 헤테로아릴-C(O)NH-이고;
링커는 -(CH2)p-, -(CH2CH2O)p- 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고;
p는 각각의 경우 1 내지 4의 범위 내의 정수이고;
Z는 형광단(바람직하게는 로다민 기)이다.
화학식 (I), (II), (III), (IIIa), (IIIb), (IVa), (IVb), (V), (Va), (Vb), (VIa), (VIb), (VII) 또는 (VIII)의 화합물의 일부 실시양태에서, R2는 임의적으로 치환된 헤테로아릴이다. 적합한 임의적으로 치환된 헤테로아릴은 5개 내지 10개의 고리 원자, 및 O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 임의적으로 치환된 헤테로아릴은 모노사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다.
일부 실시양태에서, R2는 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 인다졸, 4,5,6,7-테트라하이드로인다졸 및 벤즈이미다졸로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로아릴일 수 있다.
화학식 (I), (II), (III), (IIIa), (IIIb), (IVa), (IVb), (V), (Va), (Vb), (VIa), (VIb), (VII) 또는 (VIII)의 화합물의 일부 실시양태에서, R2는 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이다. 적합한 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬은 3개 내지 10개의 고리 원자, 바람직하게는 4개 내지 8개의 고리 원자, 및 O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬은 모노사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다.
일부 실시양태에서, R2는 임의적으로 치환된 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판, 모르폴린 및 티오모르폴린으로 구성된 군으로부터 선택된 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬일 수 있다.
일부 실시양태에서, R2는 임의적으로 치환된 피페리딘일 수 있다. 일부 실시양태에서, 피페리딘은 적어도 하나의 C1-C4 알킬 치환기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, C1-C4 알킬 치환기는 메틸일 수 있다.
일부 실시양태에서, R2는 2-메틸피페리딘, 3-메틸피페리딘, 4-메틸피페리딘, 3,5-디메틸피페리딘 및 3,3-디메틸피페리딘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
R2가 임의적으로 치환된 헤테로아릴 또는 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 기일 때, R2는 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬 고리 상의 헤테로원자를 통해 화학식 (I), (II), (III), (IIIa), (IIIb), (IVa), (IVb), (V), (Va), (Vb), (VIa), (VIb), (VII) 또는 (VIII)의 화합물의 피롤리딘 고리에 연결될 수 있다. 예를 들면, R2가 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 인다졸, 4,5,6,7-테트라하이드로인다졸 및 벤즈이미다졸로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로아릴일 때, 또는 R2가 임의적으로 치환된 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판, 모르폴린 및 티오모르폴린으로 구성된 군으로부터 선택된 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬일 때, R2는 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬 기의 질소(N) 헤테로원자를 통해 화합물의 나머지에 공유연결된다.
화학식 (I), (II), (III), (IIIa), (IIIb), (IVa), (IVb), (V), (Va), (Vb), (VIa), (VIb), (VII) 또는 (VIII)의 화합물의 일부 실시양태에서, R2는 하기 화학식 (A)의 구조를 가진 치환기이다:
Figure pct00020
상기 식에서,
Y는 임의적으로 치환된 헤테로아릴 또는 임의적으로 치환된 헤테로아릴-C(O)NH-이고;
링커는 -(CH2)p-, -(CH2CH2O)p- 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고;
p는 각각의 경우 1 내지 4의 범위 내의 정수이고;
Z는 형광단(바람직하게는 로다민 기)이다.
일부 실시양태에서, Y는 트리아졸 및 트리아졸-C(O)NH-로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 (A)의 구조가 하기 화학식 (A1) 또는 (A2)로 제공되도록 Y는 트리아졸 또는 트리아졸-C(O)NH-일 수 있다:
Figure pct00021
.
일부 실시양태에서, 링커는 -(CH2)p-, -(CH2CH2O)p- 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이때 p는 각각의 경우 1 내지 4의 범위 내의 정수이다.
일부 실시양태에서, 링커는 하기 화학식 (A3) 또는 (A4)로 제공될 수 있다:
Figure pct00022
상기 식에서, p는 각각의 경우 1 내지 4의 범위 내의 정수이다.
화학식 (A), (A1), (A2), (A3) 또는 (A4)의 일부 실시양태에서, Z는 하기 기로부터 선택된 로다민 형광단이다:
Figure pct00023
특정 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가진다:
Figure pct00024
또 다른 특정 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가진다:
Figure pct00025
이론에 의해 한정되고자 하지 않지만, 본원에 기재된 화학식의 화합물들에서 피롤리딘 카바메이트 모이어티는 α9 인테그린, 보다 구체적으로 α9β1 인테그린 또는 이의 활성 부분에 대한 높은 결합 친화성을 보장하는 데 중요하다고 생각된다. 또한, 카복실산 작용기가 길항제 활성을 위해 필수적이라고 생각된다.
상기 설명에서, 당업자에게 잘 공지되어 있는 다수의 용어들이 사용된다. 그럼에도 불구하고, 명료함을 위해, 다수의 용어들이 다음과 같이 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비치환된"은 치환기가 없거나 유일한 치환기가 수소라는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에서 사용된 용어 "임의적으로 치환된"은 기가 하나 이상의 비-수소 치환기로 더 치환될 수 있거나 치환될 수 없거나, (축합된 폴리사이클릭 시스템을 형성하도록) 하나 이상의 비-수소 치환기와 더 융합될 수 있거나 융합될 수 없다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 치환기는 할로겐, =O, =S, -CN, -NO2, -CF3, -OCF3, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 할로알케닐, 할로알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬알케닐, 헤테로사이클로알킬알케닐, 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 사이클로알킬헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬헤테로알킬, 아릴헤테로알킬, 헤테로아릴헤테로알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 알킬옥시, 알킬옥시알킬, 알킬옥시사이클로알킬, 알킬옥시헤테로사이클로알킬, 알킬옥시아릴, 알킬옥시헤테로아릴, 알킬옥시카보닐, 알킬아미노카보닐, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 사이클로알킬옥시, 사이클로알케닐옥시, 헤테로사이클로알킬옥시, 헤테로사이클로알케닐옥시, 아릴옥시, 페녹시, 벤질옥시, 헤테로아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아미노, 알킬아미노, 아실아미노, 아미노알킬, 아릴아미노, 설포닐아미노, 설피닐아미노, 설포닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아미노설포닐, 설피닐, 알킬설피닐, 아릴설피닐, 아미노설피닐아미노알킬, C(=O)OH, -C(=O)Re, C(=O)ORe, C(=O)NReRf, C(=NOH)Re, C(=NRe)NRfRg, NReRf, NReC(=O)Rf, NReC(=O)ORf, NReC(=O)NRfRg, NReC(=NRf)NRgRh, NReSO2Rf, -SRe, SO2NReRf, -ORe, OC(=O)NReRf, OC(=O)Re 및 아실로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이고,
이때, Re와 Rf, 및 Rg와 Rh는 H, C1-C4알킬, C1-C12할로알킬, C2-C12알케닐, C2-C12알키닐, C1-C10헤테로알킬, C3-C6사이클로알킬, C3-C12사이클로알케닐, C5-C6헤테로사이클로알킬, C1-C12헤테로사이클로알케닐, C6아릴, 및 C1-C5헤테로아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나, Re 및 Rf는 이들이 부착된 원자와 함께 3개 내지 12개의 고리 원자를 가진 사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리 시스템을 형성한다.
일부 실시양태에서, 임의적 치환기는 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, -C(O)Re, -C(O)ORe, -C(O)NReRf, -ORe, -OC(O)NReRf, OC(O)Re 및 아실로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이때 Re 및 Rf는 H, C1-C4알킬, C3-C6사이클로알킬, C5-C6헤테로사이클로알킬, C6아릴 및 C1-C5헤테로아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나, Re 및 Rf는 이들이 부착된 원자와 함께 3개 내지 12개의 고리 원자를 가진 사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리 시스템을 형성한다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 기 또는 기의 부분으로서 "알킬"은 직쇄 또는 분지쇄 지방족 탄화수소 기, 바람직하게는 C1-C12 알킬, 보다 바람직하게는 C1-C10 알킬, 가장 바람직하게는 C1-C4 알킬을 지칭한다. 적합한 직쇄 및 분지쇄 C1-C4 알킬 치환기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 2-프로필, n-부틸, sec-부틸 및 t-부틸이 있다. 기는 말단 기 또는 가교 기일 수 있다.
기 또는 기의 부분으로서 "아릴"은 (i) 바람직하게는 고리당 5개 내지 12개의 원자를 가진 임의적으로 치환된 모노사이클릭 또는 융합된 폴리사이클릭 방향족 카보사이클(모두 탄소인 고리 원자를 가진 고리 구조)을 의미한다. 아릴 기의 예로는 페닐, 나프틸 등; (ii) 페닐과 C5-7 사이클로알킬 또는 C5-7 사이클로알케닐 기가 함께 융합되어 사이클릭 구조, 예컨대, 테트라하이드로나프틸, 인데닐 또는 인다닐을 형성하는, 임의적으로 치환된 부분적으로 포화된 비사이클릭 방향족 카보사이클릭 모이어티가 있다. 기는 말단 기 또는 가교 기일 수 있다. 전형적으로, 아릴 기는 C6-C18 아릴 기이다.
"결합"은 화합물 또는 분자 내의 원자들 사이의 연결이다. 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물의 실시양태들의 한 세트에서, 결합은 단일 결합이다.
달리 특정되어 있지 않은 한, "사이클로알킬"은 바람직하게는 고리당 3개 내지 9개의 탄소를 함유하는 포화된 모노사이클릭 또는 융합된 또는 스피로 폴리사이클릭 카보사이클, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 지칭한다. 이것은 모노사이클릭 시스템(예컨대, 사이클로헥실), 비사이클릭 시스템, 예컨대, 데칼린 및 폴리사이클릭 시스템, 예컨대, 아다만탄을 포함한다. 사이클로알킬 기는 전형적으로 C3-C12 알킬 기이다. 기는 말단 기 또는 가교 기일 수 있다.
"할로겐"은 염소, 불소, 브롬 또는 요오드를 나타낸다.
단독으로 또는 기의 부분으로서 "헤테로아릴"은 방향족 고리 내의 고리 원자로서 하나 이상의 헤테로원자를 갖고 나머지 고리 원자로서 탄소 원자를 가진 방향족 고리(바람직하게는 5-원 또는 6-원 방향족 고리)를 함유하는 기를 지칭한다. 적합한 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 기는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 헤테로아릴 기일 수 있다. 헤테로아릴의 예로는 티오펜, 벤조티오펜, 벤조푸란, 벤즈이미다졸, 벤즈옥사졸, 벤조티아졸, 벤즈이소티아졸, 나프토[2,3-b]티오펜, 푸란, 이소인돌리진, 잔톨렌, 페녹사틴, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 테트라졸, 인돌, 이소인돌, 1H-인다졸, 푸린, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 신놀린, 카바졸, 페난쓰리딘, 아크리딘, 페나진, 티아졸, 이소티아졸, 페노티아진, 옥사졸, 이소옥사졸, 푸라잔, 페녹사진, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 2-, 3-, 4-, 5- 또는 8-퀴놀릴, 1-, 3-, 4- 또는 5-이소퀴놀리닐, 1-, 2- 또는 3-인돌릴, 및 2- 또는 3-티에닐이 있다. 헤테로아릴 기는 전형적으로 C1-C18 헤테로아릴 기이다. 기는 말단 기 또는 가교 기일 수 있다.
"헤테로사이클로알킬"은 적어도 하나의 고리 내에 질소, 황 및 산소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 1개 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 포화된 모노사이클릭, 비사이클릭 또는 폴리사이클릭 고리를 지칭한다. 각각의 고리는 바람직하게는 3-원 내지 10-원, 보다 바람직하게는 4-원 내지 7-원 고리이다. 적합한 헤테로사이클로알킬의 예로는 피롤리디닐, 테트라하이드로푸릴, 테트라하이드로티오푸라닐, 피페리딜, 피페라질, 테트라하이드로피라닐 및 모르폴리노가 있다. 기는 말단 기 또는 가교 기일 수 있다.
부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 호변이성질체, 및 "E" 또는 "Z" 배열의 기하이성질체 또는 E 이성질체와 Z 이성질체의 혼합물을 포함하는 이성질체 형태는 화학식 (I)의 화합물의 패밀리에 포함된다는 것이 이해된다. 일부 이성질체 형태, 예컨대, 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 기하이성질체는 물리적 및/또는 화학적 방법 및 당업자에 의해 분리될 수 있다는 것도 이해된다. 기하이성질체화의 가능성이 있는 화합물의 경우, 본 출원인은 다른 이성질체가 정확한 구조적 배정일 수 있다는 것이 인식될지라도 화합물이 취할 것으로 생각되는 이성질체를 도출하였다.
개시된 실시양태의 화합물들 중 일부는 단일 입체이성질체, 라세미체, 및/또는 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체의 혼합물로서 존재할 수 있다. 모든 이러한 단일 입체이성질체, 라세미체 및 이들의 혼합물은 기재되고 청구된 보호대상의 범위 내에 있다.
추가로, 화학식 (I)은 적용가능한 경우 화합물의 용매화된 형태뿐만 아니라 비용매화된 형태도 포함하기 위한 것이다. 따라서, 각각의 화학식은 수화된 형태뿐만 아니라 비-수화된 형태도 포함하는, 표시된 구조를 가진 화합물을 포함한다.
화학식 (I)은 화합물의 약학적으로 허용가능한 염도 포괄하기 위한 것이다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 확인된 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하는 염을 지칭하고, 약학적으로 허용가능한 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 화학식 (I)의 화합물의 적합한 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 무기산 또는 유기산으로부터 제조될 수 있다. 이러한 무기산의 예는 염산, 황산 및 인산이다. 적절한 유기산은 지방족, 지환족, 방향족, 헤테로사이클릭, 카복실산 및 설폰산 클래스의 유기산들로부터 선택될 수 있고, 이들의 예는 포름산, 아세트산, 프로판산, 석신산, 글리콜산, 글루콘산, 젖산, 말산, 주석산, 구연산, 푸마르산, 말레산, 알킬설폰산 및 아릴설폰산이다. 유사한 방식으로, 염기 부가 염은 유기 또는 무기 염기를 사용함으로써 당분야에서 잘 공지된 방식에 의해 제조될 수 있다. 적합한 유기 염기의 예로는 단순 아민, 예컨대, 메틸아민, 에틸아민, 트리에틸아민 등이 있다. 적합한 무기 염기의 예로는 NaOH, KOH 등이 있다. 약학적으로 허용가능한 염에 대한 추가 정보는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA 1995)에서 발견될 수 있다. 고체인 물질의 경우, 당업자는 본 발명의 화합물, 물질 및 염이 상이한 결정질 또는 다형체 형태로 존재할 수 있고 이들 모두가 본 발명의 범위 및 특정된 화학식 내에 있다는 것을 이해한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 생체내에서 또는 생체외에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 방출을 향상시키는 방법으로서, 유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 BM 줄기 세포 니치에 생체내 또는 생체외 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일단 HSC들이 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터 이탈되면, 이들은 BM에 더 이상 고착되어 있지 않고 BM으로부터 방출되도록 이용가능하고 증식 및 분화를 향해 세포 주기로 들어간다. 대안적으로, 이들은 BM에 머무를 수 있고 BM에서 세포 주기로 들어갈 수 있다.
추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 생체내에서 또는 생체외에서 BM 줄기 세포 니치로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 동원을 향상시키는 방법으로서, 유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 BM 줄기 세포 니치에 생체내 또는 생체외 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
HSC는 이탈되고 방출됨으로써 PB로 동원하도록 이용가능하게 된다. 이탈 및 방출은 동원을 가능하게 하기 위해 필수적이다. HSC의 향상된 방출은 결과적으로 더 많은 세포들이 동원될 수 있게 할 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 G-CSF의 존재 또는 부재 하에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 방법은 G-CSF의 부재 하에서 수행된다.
임상적으로 G-CSF는 HSC를 위해 가장 광범위하게 사용되는 동원제이지만, 그의 단점은 잠재적으로 독성 부작용, 상대적으로 긴 치료 과정(5일 내지 7일의 연속적인 주사) 및 환자의 가변적 반응성을 포함한다. 따라서, 본 발명의 장점은 효과적인 동원이 G-CSF의 부재 하에서 일어날 수 있고, 이것이 실질적으로 독성 부작용을 피할 수 있다는 점이다.
본 발명에서 사용된 "조혈 줄기 세포"는 궁극적으로 적혈구, 백혈구, 거핵구 및 혈소판을 비롯한 모든 혈액 세포들로 분화할 수 있는 전능성 줄기 세포를 의미한다. 이것은 전구세포 또는 배세포로의 중간 분화 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "조혈 줄기 세포", "HSC", "조혈 전구세포", "HPC", "전구세포" 또는 "배세포"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되고 감소된 분화력을 가진 HSC를 기술하지만, 여전히 특정 계통, 예컨대, 골수 또는 림프 계통의 상이한 세포로 성숙할 수 있다. "조혈 전구세포"는 적혈구 파열 형성 유닛, 과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구 콜로니 형성 유닛, 과립구, 적혈구, 대식세포 및 과립구 대식세포 콜로니 형성 유닛을 포함한다.
본 발명은 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 것에 관한 것이다. 세포들은 일단 이탈되면 그들이 머무를 수 있는 BM 줄기 세포 니치로부터 방출될 수 있거나, 바람직하게는 방출되어 PB로 동원될 수 있다. 이들 세포들은 조혈 재구성 능력을 가진다. 본 발명은 바람직하게는 골내막 니치 내의 골/BM 계면에 가장 가까운 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의, 또는 중추 골수강으로부터의 HSC의 이탈에 의해 보조된 HSC의 동원을 향상시키는 방법을 제공한다. 보다 바람직하게는, HSC는 골내막 니치 내의 골/BM 계면으로부터 동원되는데, 이는 이 세포가 중추 골수강으로부터 단리된 HSC에 비해 더 큰 장기간 다중-계통 조혈 재구성을 제공하는 것으로 밝혀졌기 때문이다.
이탈되거나, 방출되거나 동원되는 세포의 유형도 BM 유래 전구세포 풍부 Lin-Sca-1+ckit+(본원에서 LSK로서 지칭됨) 세포 또는 줄기 세포 풍부 LSKCD150+CD48- 세포(본원에서 LSKSLAM으로서 지칭됨)를 포함하는 군으로부터 선택된 뮤린 집단에서 발견될 수 있다. 이들 동등한 뮤린 집단은 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제의 사용에 의해 BM 줄기 세포 니치로부터 이탈될 수 있거나, 방출될 수 있거나 동원될 수 있는 세포 유형의 표시를 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포 유형은 줄기 세포 풍부 LSKCD150+CD48- 세포(LSKSLAM)에서 발견된 세포 유형에 해당한다.
바람직하게는, 이탈되거나, 방출되거나, 동원되는 세포는 골내막 전구세포이고, CD34+, CD38+, CD90+, CD133+, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁 CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 생체내에서 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 즉, α9의 길항제, 바람직하게는 α9β1의 길항제, 보다 바람직하게는 α9β1/α4β1의 길항제는 생체내에서 필요로 하는 대상체 또는 생체외 샘플에게 투여되어, BM으로부터 HSC를 동원시킬 수 있다.
본원에서 사용된 "대상체"는 애완 동물, 농장 동물 및 동물원 동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 포유동물 및 다른 동물을 비롯한 모든 동물들을 포함한다. 용어 "동물"은 예를 들면, 포유동물, 조류, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 설치류 등을 포함하는 범주인 임의의 살아있는 다세포 척추동물 유기체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 용어 "포유동물"은 인간 및 비-인간 포유동물 둘 다를 포함한다.
본 발명은 HSC 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 것에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "향상", "향상시킨다" 또는 "향상시키는"은 세포 또는 유기체의 성능의 개선, 또는 세포 또는 유기체의 특정 파라미터의 다른 생리학적으로 유리한 증가를 지칭한다. 종종, 현상의 향상은 특정 파라미터의 측정의 감소로서 정량될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포의 동원은 순환계에서 순환하는 줄기 세포 수의 감소로서 측정될 수 있으나, 그럼에도 불구하고 이것은 이들 세포가 상실된 또는 손상된 기능을 대체하거나 보정하는 세포로의 분화를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 유리한 생리학적 결과를 수행할 수 있거나 용이하게 할 수 있는 신체 부위로의 이들 세포의 동원의 향상을 표시할 수 있다. 동시에, 향상은 BM으로부터 PB로의 HSC 동원의 결과로서 말초 혈액에서 임의의 한 세포 유형의 증가로서 측정될 수 있다. 향상은 순환 줄기 세포 수의 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 초과의 감소를 지칭할 수 있거나, 대안적으로 순환 줄기 세포 수의 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 초과의 증가를 표시할 수 있다. 줄기 세포 동원의 향상은 비-조혈 계통 세포 집단의 감소, 예컨대, 세포 집단 또는 세포 집단의 반응의 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75% 이상의 감소를 야기할 수 있거나 이러한 감소에 의해 측정될 수 있다. 또 다른 방식으로, 향상된 파라미터는 줄기 세포의 수송으로서 간주될 수 있다. 한 실시양태에서, 향상된 파라미터는 기원 조직, 예컨대, BM으로부터의 줄기 세포의 방출이다. 한 실시양태에서, 향상된 파라미터는 줄기 세포의 이동이다. 또 다른 실시양태에서, 파라미터는 줄기 세포의 분화이다.
한 실시양태에서, α9 인테그린 길항제는 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 경피, 경점막 또는 복강내으로 투여되고; 임의적으로 상기 길항제는 정맥내 또는 피하 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체에서 BM 줄기 세포 니치 내의 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC의 이탈을 향상시키는 데 사용될 조성물로서, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 보다 바람직하게는, 상기 길항제는 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제이다. 가장 바람직하게는, 길항제는 본원에 기재된 α4β1/α9β1 길항제이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 BM 줄기 세포 니치에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC의 방출을 향상시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물은 BM 줄기 세포 니치로부터 PB로의 HSC의 이동성 또는 동원을 향상시킨다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물일 수 있다. 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제는 단독으로, 또는 α9 인테그린, α4 인테그린, α9β1 인테그린 또는 α4β1 인테그린의 추가 길항제와 함께 조성물에 제공될 수 있거나, α9β1/α4β1 인테그린의 조합된 길항제일 수 있다. 상기 길항제들은 동일할 수 있거나 상이할 수 있으나, 모두 적어도 α9 인테그린의 길항제로서 작용할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 환자에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제의 용도를 제공한다.
본원에 기재된 방법은 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키기 위한 활성 성분으로서 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 포함하는 조성물 및 약학 조성물의 제조 및 사용을 포함한다. 바람직하게는, HSC의 방출은 향상된다. 보다 바람직하게는, HSC 동원은 향상된다. 약학 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "약학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 공지되어 있는 약학 투여에 적합한 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 지연 흡수제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물, 예를 들면, 성장 인자, 예컨대, G-CSF도 조성물 내로 도입될 수 있다.
약학 조성물은 전형적으로 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 경피(국소), 경점막, 복강내 및 직장 투여가 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제는 피하로 투여된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 골수, 바람직하게는 BM 줄기 세포 니치, 보다 바람직하게는 BM 줄기 세포 니치의 골내막 니치에 전달하는 것을 표적화하도록 제형화된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제는 리포좀 나노현탁액 및 (예들 들면, 사이클로덱스트린과 함께) 봉입 복합체로 제형화될 수 있고, 이것은 부작용을 감소시키면서 BM으로의 보다 더 표적화된 전달을 달성할 수 있다.
약학 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 분배기 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체로부터 HSC를 채취하는 방법으로서,
유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 유효량이 BM 줄기 세포 니치에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 것인 단계;
이탈된 HSC를 PB로 동원시키는 단계; 및
PB로부터 HSC를 채취하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, α9 인테그린 길항제는 G-CSF의 부재 하에 투여된다.
BM 줄기 세포 니치에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키기 위한 화합물, 예컨대, 본원에 기재된 α9β1 인테그린 길항제의 사용은 상기 세포가 궁극적으로 추가 채취를 위해 PB로 동원할 수 있게 한다. 상기 세포는 BM으로부터 천연적으로 동원하고 벗어날 수 있거나, 다른 HSC 동원제, 예컨대, 인터류킨-17, 사이클로포스파마이드(Cy), 도세탁셀 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)(그러나, 이들로 한정되지 않음)의 사용에 의해 동원하도록 자극될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 일단 채취되면 환자의 조혈 전구세포 집단을 보충하거나 재충전하기 위해 신체로 돌려보내질 수 있거나(동종 또는 자가 이식), 대안적으로 그의 조혈 전구세포 집단을 재충전하기 위해 또 다른 환자에게 이식될 수 있다는(이종 또는 동종이계 이식) 것이 고려된다. 이것은 예를 들면, 개체가 화학요법을 받는 기간 후 유리할 수 있다. 나아가, HSC 및 HPC 수가 감소되는 일부 유전적 질환들, 예컨대, 지중해빈혈, 겸상 세포 빈혈, 선천성 이상각화증, 슈와크만-다이아몬드(Shwachman-Diamond) 증후군 및 다이아몬드-블랙판(Diamond-Blackfan) 빈혈이 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 HSC 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 데 유용하고 적용될 수 있다.
골수 이식의 수용자, 예컨대, 노인 대상체들 또는 면역 고갈 치료, 예컨대, 화학요법에 이미 노출된 대상체들은 제한된 골수 비축량을 가질 수 있다. 이들은 감소된 혈액 세포 수준을 가질 수 있거나 대조군 혈액 세포 수준에 비해 감소된 혈액 세포 수준을 발생시킬 위험에 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 대조군 혈액 세포 수준은 대상체에서 혈액 세포 수준을 변화시키는 사건 전에 또는 이러한 사건의 실질적인 부재 하에서 대상체에서의 혈액 세포의 평균 수준을 지칭한다. 대상체에서의 혈액 세포 수준을 변화시키는 사건은 예를 들면, 빈혈, 외상, 화학요법, 골수 이식 및 방사선 요법을 포함한다. 예를 들면, 대상체는 빈혈 또는, 예를 들면, 외상으로 인한 혈액 손실을 가진다.
전형적으로, 유효량의 α9 인테그린 길항제, 예컨대, α9β1 인테그린 길항제, 보다 바람직하게는 α9β1/α4β1 인테그린 길항제는 기증자에게 투여되어, BM으로부터의 HSC의 이탈, 방출 또는 바람직하게는 동원을 유도하고 HSC를 방출하고 PB로 동원시킨다. 일단 HSC가 PB로 동원되면, 혈액 기증을 위해 일반적으로 이용될 수 있는 방법, 예컨대, 혈액 은행에서 이용되는 기법들(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 이용하여 혈액의 채취 및 HSC의 분리를 진행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 일단 PB 또는 BM이 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제의 사용을 통해 치료된 대상체로부터 수득되면, 표준 방법, 예컨대, 분리반출법 또는 백혈구분리반출법을 이용하여 PB 또는 BM으로부터 HSC를 단리할 수 있다.
바람직하게는, α9 인테그린 길항제의 유효량은 25 내지 1000 ㎍/kg 체중, 보다 바람직하게는 50 내지 500 ㎍/kg 체중, 가장 바람직하게는 50 내지 250 ㎍/kg 체중의 범위 내에 있다. 상기 유효량은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250 ㎍/kg 체중을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
이탈, 방출 또는 바람직하게는 동원은 사용된 α9 인테그린 길항제의 양에 따라 즉시 일어날 수 있다. 그러나, HSC는 투여 후 대략 1시간 이내에 채취될 수 있다. α9 인테그린 길항제의 실제 시간 및 양은 대상체의 생리학적 상태(연령, 성별, 질환 유형 및 단계, 일반적인 물리적 상태, 소정의 용량에 대한 반응성, 원하는 임상 효과) 및 투여 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 요인들에 따라 달라질 수 있다. 임상 및 약학 분야에서 숙련된 자는 관용적인 실험 및 대조군 곡선의 사용을 통해 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에서 간주되는 바와 같이, 용어 "대조군 곡선"은 동일한 조건 하에서 상이한 농도의 α9 인테그린 길항제의 HSC 이탈, 방출 또는 동원 특징의 측정을 통해 생성된 통계학적 및 수학적으로 적절한 곡선을 지칭하는 것으로 간주되고, 이때 상기 세포는 규칙적인 시간 간격에 걸쳐 채취되고 카운팅될 수 있다. 본 발명에서 간주되는 이들 "대조군 곡선"은 향후 종종 투여될 상이한 농도를 추정하는 한 방법으로서 이용될 수 있다.
본 발명에서 간주되는 바와 같이, 용어 "조혈 줄기 세포의 채취", "조혈 전구세포의 채취", "HSC의 채취" 또는 "HPC의 채취"는 PB로부터의 세포의 분리를 지칭하는 것으로 간주되고, 당업자가 알고 있을 기법으로서 간주된다. 세포는 임의적으로 채취되고 분리되고 임의적으로 더 증폭되어, HSC 및 분화된 자손의 훨씬 더 큰 집단을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 투여하여 BM으로부터 PB로의 HSC의 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 방법으로부터 수득된 HSC를 포함하는 세포 조성물을 제공한다.
HSC의 향상된 이탈의 결과로서, 더 많은 HSC가 PB로의 후속 동원을 위해 BM 줄기 세포 니치로 방출될 수 있다고 추정된다. 따라서, 유효량의 α9 인테그린 길항제 또는 이의 활성 부분을 BM 줄기 세포 니치에 투여받은 대상체로부터 채취된 세포 조성물에는 HSC가 풍부할 것이다.
바람직하게는, 상기 세포 조성물에는 골내막 니치의 세포가 풍부할 것이고 CD34+, CD38+, CD90+, CD133+, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁 CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택된 골내막 전구세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 투여하여 BM으로부터 PB로의 HSC의 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 방법으로부터 수득된 HSC를 포함하는 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액학적 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 대상체에게 투여하여 BM으로부터 PB로의 HSC의 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액학적 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈액학적 장애는 조혈 신생물성 장애이고, 상기 방법은 비효과적인 화학요법제가 보다 더 효과적이게 되도록 HSC를 화학감작하여 HSC의 민감성을 변경시키는 단계를 포함한다.
백혈병의 치료에 있어서 오래된 쟁점은 휴면 상태의 악성 세포가 세포독성제의 효과를 회피하여 재발을 유발할 수 있을 가능성이 있다는 개념이다. 암세포 휴면의 조절을 이해하기 위해 많은 노력이 기울여져 왔지만, 미세환경 및 특히 골수 줄기 세포 니치의 역할에 대해서는 노력이 거의 집중되지 않았다. 최근에, 골수에서 정상 조혈 줄기 세포를 고착시키는 것으로 공지된 세포외 매트릭스 분자 오스테오폰틴도 백혈병 세포, 특히 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 세포를 골수 미세환경의 핵심 영역에서 고착시킴으로써 이들 세포의 휴면을 뒷받침하는 데 일정한 역할을 수행한다는 것을 입증하는 데이터가 등장하였다. 나아가, 추가 데이터는 재발된 ALL이 유의하게 상승된 수준의 인테그린 α4β1을 가진다는 것을 보여준다. 본원에서 제공된 이들 데이터는 α9β1과 이의 세포외 매트릭스 리간드의 상호작용과 경쟁하는 물질이 이들 세포들을 세포 주기 내로 유도하여, 이들을 세포독성 화학요법에 취약하게 만들 것임을 암시한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 증가된 수의 줄기 세포를 필요로 하는 혈액학적 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 예를 들면, 이종 또는 자가 이식에 사용하기 위해 줄기 세포, 예컨대, HSC를 기증하도록 예정되어 있거나 기증할 의도를 가진다. 일반적으로, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를, 이러한 치료를 필요로 하거나 필요로 하는 것으로 확인된 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 대상체의 치료를 위한 치료 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제, 바람직하게는 α9β1 길항제, 보다 바람직하게는 α9β1/α4β1 인테그린 길항제의 투여는 PB 또는 BM에서 HSC의 수 및/또는 빈도를 증가시킬 것이다.
본원에서 사용된 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하고, 이때 목적은 치료가 궁극적으로 성공적이지 않다 하더라도 표적화된 상태, 질환 또는 장애(총괄적으로 "질병")를 예방하거나 늦추는(경감시키는) 것이다. 치료를 필요로 하는 대상체는 질병을 이미 가진 대상체뿐만 아니라 질병을 갖기 쉬운 대상체 또는 질병이 예방되어야 하는 대상체도 포함할 수 있다.
"유효량"은 PB 또는 BM에서의 HSC의 수 및/또는 빈도의 유의한 증가 또는 감소를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투약으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "치료 유효량"은 치료되는 대상체에서 원하는 효과를 달성하기에 충분한 특정 조성물의 양 또는 이 조성물 중의 활성 성분의 양을 지칭한다. 예를 들면, 이것은 조직을 재충전하거나, 회복시키거나 부활시키는 HSC의 동원을 향상시키는 데 효과적인 양일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, "치료 유효량"은 혈류에서의 순환 줄기 세포의 상승된 수준에 의해 입증될 수 있는, HSC의 수송을 향상시키는 데, 예컨대, HSC의 방출을 증가시키는 데 효과적인 양이다. 또 다른 실시양태에서, "치료 유효량"은 혈류에서의 순환 HSC의 감소된 수준 및/또는 귀소 및 동원과 관련된 표면 마커의 발현에 의해 입증될 수 있는, 순환계로부터 다양한 조직들 또는 장기들로의 HSC의 귀소 및 동원을 향상시키는 데 효과적인 양이다. 치료 유효량은 대상체의 생리학적 상태(연령, 성별, 질환 유형 및 단계, 일반적인 물리적 상태, 소정의 용량에 대한 반응성, 원하는 임상 효과) 및 투여 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 요인들에 따라 달라질 수 있다. 임상 및 약학 분야에서 숙련된 자는 관용적인 실험을 통해 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 이틀마다 1회를 포함하는, 매일 1회 이상 내지 매주 1회 이상 투여될 수 있다. 당업자는 선행 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 일부 요인들이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 시간조절에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식할 것이다. 더욱이, 유효량의 본원에 기재된 조성물을 사용한 대상체의 치료는 단회 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 투여는 PB에서 HSC의 수를 약 10배 내지 200배 증가시킬 것이다.
화합물의 용량, 독성 및 치료 효과는 예를 들면, 세포 배양물 또는 실험 동물에서, 예를 들면, LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하는 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 이러한 화합물을 영향받은 조직 부위로 표적화하는 전달 시스템을 디자인하는 것에 관심을 기울여야 한다.
세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용될 용량의 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않으면서 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 용량은 사용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료 유효 용량은 처음에 세포 배양 어세이로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 측정된 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확히 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 방법은 또 다른 HSC 동원제, 예를 들면, 인터류킨-17, 사이클로포스파마이드(Cy), 도세탁셀 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)(그러나, 이들로 한정되지 않음)로 구성된 군으로부터 선택된 물질을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, α9 인테그린 길항제는 G-CSF와 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 단리된 줄기 세포를 대상체에게 투여하는 단계, 예컨대, 세포를 동일한 대상체 내로 재도입하거나 세포를 제2 대상체, 예를 들면, HLA 유형-매칭된 제2 대상체 내로 이식하는(동종이식) 단계를 포함한다.
본 발명은 α9 인테그린 길항제를 환자에게 직접적으로 투여하여 그들 자신의 HSC를 동원시키는 것, 또는 α9 인테그린 길항제로 치료받은 또 다른 기증자(이로부터 HSC가 채취됨)로부터의 HSC를 사용하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 투여받은 대상체는 건강하다. 다른 실시양태에서, 대상체는 질환 또는 생리학적 상태, 예컨대, 면역억제, 만성병, 외상성 손상, 퇴행성 질환, 감염 또는 이들의 조합을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 피부, 소화계, 신경계, 림프계, 심혈관계, 내분비계 또는 이들의 조합의 질환 또는 병태를 앓고 있을 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체는 골다공증, 알츠하이머병, 심근 경색, 파킨슨병, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 간 경변증 또는 이들의 조합을 앓고 있다.
상기 방법의 적용 및 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제의 사용이 이들 용도로 한정되지 않지만, 치료 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제의 투여는 상기 언급된 질환들 중 임의의 질환을 예방할 수 있고/있거나, 치료할 수 있고/있거나 이러한 질환의 중증도를 경감시킬 수 있거나 이러한 질환과 관련하여 유리한 임상적 이익을 제공할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 조성물 및 방법은 특히 골격 조직, 예컨대, 골, 연골, 힘줄 및 인대의 치료뿐만 아니라 퇴행성 질환, 예컨대, 파킨슨병 및 당뇨병의 치료에도 치료적으로 유용하다. 혈액으로부터 조직으로의 줄기 세포의 방출, 순환, 귀소 및/또는 동원의 향상은 증가된 회복 효율을 위해 결함 부위로의 HSC의 보다 효율적인 전달을 유발할 수 있다.
일부 실시양태에서, HSC, PB 또는 BM을 사용하여 성공적으로 치료할 수 있는 대상체는 통상적으로 골수 또는 줄기 세포 이식으로 치료받을 수 있는 임의의 대상체, 예를 들면, 암, 예를 들면, 신경모세포종(미성숙 신경 세포에서 발생하고 주로 유아 및 소아에게 영향을 미치는 암), 골수이형성증, 골수섬유증, 유방암, 신장 세포 암종 또는 다발성 골수종을 가진 대상체를 포함한다. 예를 들면, 암을 치료하거나 HSC를 동원시키기 위한 G-CSF 치료에 대한 비-반응자를 치료하는 데 사용된 고용량의 화학요법 및/또는 방사선 요법에 의해 파괴된 줄기 세포를 복구하기 위해 방사선 요법 또는 화학요법을 사용한 치료에 대한 내성을 나타내는 암을 가진 대상체 내로 세포를 이식할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 조혈 신생물성 장애를 가진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조혈 신생물성 장애"는 조혈 유래, 예를 들면, 골수, 림프 또는 적혈구 계통으로부터 발생되는 과형성/신생물성 세포, 또는 이의 전구세포를 수반하는 질환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환은 잘 분화되지 않은 급성 백혈병, 예를 들면, 적혈모구성 백혈병 및 급성 거핵모구성 백혈병으로부터 발생된다. 추가 예시적인 골수 장애는 급성 전구골수 백혈병(APML) 및 만성 골수성 백혈병(CML)을 포함하나 이들로 한정되지 않고; 림프 악성종양은 B-계통 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 T-계통 ALL을 포함하는 ALL, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 모발 세포 백혈병(HLL) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 악성 림프종의 추가 형태는 호지킨병 및 중/고등급(공격성) 비-호지킨 림프종 및 이들의 변이체, 말초 T 세포 림프종, 성숙 T 세포 백혈병/림프종(ATL), 피부 T-세포 림프종(CTCL), 큰 과립형 림프구성 백혈병(LGF), 호지킨병 및 리드-스턴베르그병(Reed-Sternberg disease)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일반적으로, 상기 방법은 고용량의 화학요법 및/또는 방사선 요법, 예를 들면, 장애를 치료하는 데 사용된 요법에 의해 파괴된 줄기 세포를 복구시키기 위해 세포 조성물을 투여하거나 줄기 세포를 이탈시키거나, 방출하거나 동원시키는 단계를 포함할 것이다. 대안적으로, HSC는 BM 줄기 세포 니치로부터 이탈되거나, 방출되거나 동원되고, BM 또는 PB에서 세포 주기로 들어가면서 화학감작된다. 바람직하게는, 조혈 신생물성 장애는 ALL이다.
일부 실시양태에서, BM, PB 또는 HSC는 자가면역 질환, 예를 들면, 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증, 자가면역 신경병증, 피부경화증, 재생불량성 빈혈 및 전신 홍반 루푸스를 가진 대상체를 치료하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 치료받는 대상체는 비-악성 장애, 예컨대, 재생불량성 빈혈, 겸상 세포 빈혈을 포함하는 혈색소병증, 또는 면역 결핍 장애를 가진다.
본 발명은 투약법도 제공한다. 한 실시양태에서, 투약법은 치료되는 질환 상태의 중증도 및 반응성에 의해 좌우되고, 이때 치료 과정은 수일 및/또는 수주에 걸쳐 단회 투여부터 반복된 투여까지 지속된다. 또 다른 실시양태에서, 투약법은 대상체의 말초 혈액 스트림에서의 순환 CD34+ HSC의 수에 의해 좌우된다. 또 다른 실시양태에서, 투약법은 대상체의 말초 혈액 스트림에서의 순환 골수 유래 줄기 세포의 수에 의해 좌우된다. 예를 들면, BM으로부터의 HSC의 동원성 정도는 PB에서 이미 순환하는 HSC의 수에 의해 좌우될 수 있다.
본 발명은 대상체에서 HSC의 수송을 향상시키는 방법으로서, 치료 유효량의 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다. 한 실시양태에서, HSC의 수송 수준은 대상체의 말초 혈액에서의 순환 CD34+ HSC의 수와 관련되어 있다. 또 다른 실시양태에서, HSC의 수송 수준은 대상체의 말초 혈액에서의 순환 골수 유래 HSC의 수와 관련되어 있다.
본 발명은 순환 HSC, 예컨대, 골내막 전구세포의 집단의 일시적인 증가를 유도하는 방법도 제공하고, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 대상체에게 투여한 후 CD34+, CD38+, CD90+, CD133+, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁 CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제를 대상체에게 제공하는 것은 투여 후 일정 기간, 예컨대, 12일 미만, 6일 미만, 3일 미만, 2일 미만 또는 1일 미만, 12시간 미만, 6시간 미만, 약 4시간 미만, 약 2시간 미만 또는 약 1시간 미만 이내에 그 대상체의 HSC의 방출을 향상시킬 것이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 α9 인테그린 길항제의 투여는 투여 후 약 30분 내지 약 90분 동안 HSC를 순환계 내로 방출시킨다. 바람직하게는, HSC의 방출은 투여 후 약 60분일 것이다. 또 다른 실시양태에서, 방출된 HSC는 순환계로 들어가고 대상체의 신체 내부에서 순환 HSC의 수를 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 정상 기준에 비해 순환 HSC 수의 백분율 증가는 대조군에 비해 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 약 100%, 또는 약 100% 초과의 증가일 수 있다. 한 실시양태에서, 대조군은 동일한 대상체로부터의 기준 값이다. 또 다른 실시양태에서, 대조군은 비치료된 대상체, 또는 플라세보 또는 약학적 담체로 치료받은 대상체에서의 순환 줄기 세포 또는 HSC의 수이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, HSC를 환자 내로 이식하는 방법으로서,
α9 인테그린 길항제를 대상체에게 투여하여 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터 HSC를 이탈시키는 단계;
HSC를 BM으로부터 PB로 방출 및 동원시키는 단계;
대상체로부터의 PB로부터 HSC를 채취하는 단계; 및
HSC를 환자에게 이식하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 세포는 일단 채취되면 대상체의 조혈 전구세포 집단을 보충하거나 재충전하기 위해 신체로 돌려보내질 수 있거나, 대안적으로 그들의 조혈 전구세포 집단을 재충전하기 위해 또 다른 대상체로 이식될 수 있는 세포 조성물을 제공한다고 생각된다. 이것은 예를 들면, 개체가 화학요법을 받은 기간 후 유리할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 구체적으로 HSC 서브세트의 이식에 관한 것이다. 이 세포는 조혈 재구성 능력을 갖고 줄기 세포 니치 내의 BM에 존재한다. 본 발명은 바람직하게는 골내막 니치 내의 골/BM 계면에 가장 가까운 줄기 세포 니치 또는 중추 골수강으로부터 HSC를 이식하는 방법을 제공한다. 보다 바람직하게는, HSC는 골내막 니치 내의 골/BM 계면으로부터 이식되는데, 이는 이 세포가 중추 골수강으로부터 단리된 HSC에 비해 보다 큰 장기간 다중-계통 조혈 재구성을 제공하는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 바람직하게는, 이식된 세포는 줄기 세포 니치, 보다 바람직하게는 중추 또는 골내막 니치에서 발견된다.
이식될 수 있는 동등한 유형의 세포는 BM 유래 전구세포 풍부 Lin-Sca-1+ckit+(본원에서 LSK로서도 지칭됨) 세포 또는 줄기 세포 풍부 LSKCD150+CD48- 세포(본원에서 LSKSLAM으로서도 지칭됨)를 포함하는 군으로부터 선택된 뮤린 집단에서 발견될 수 있다.
바람직하게는, 이식되는 세포는 골내막 전구세포이고, CD34+, CD38+, CD90+, CD133+, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁 CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택된다.
문헌, 법률, 자료, 장치, 논문 등의 논의는 본 발명의 내용을 제공할 목적으로만 본 명세서에 포함된다. 임의의 또는 모든 이들 사항들이 본원의 각각의 청구항의 우선일 전에 존재했던 것처럼 종래기술 기초의 일부를 형성하였거나 본 발명과 관련된 분야에서 통상의 일반적인 지식이었다는 것을 암시하거나 표시하는 것은 아니다.
용어 "포함한다", "포함하고", "포함된" 또는 "포함하는"이 (청구범위를 포함하는) 본 명세서에서 사용되는 경우, 이들은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 특정하는 것으로서 해석되지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 성분, 또는 이들의 군의 존재를 배제하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본 발명은 하기 비-한정적인 실시예를 참조함으로써 더 완전히 기재될 것이다.
실시예
방법
(i) 유세포측정
문헌(J. Grassinger, et al Blood, 2009, 114, 49-59)에 이미 기재된 바와 같이 LSR II(BD Biosciences)를 사용하여 유세포측정 분석을 수행하였다. R-BC154를 585 nm에서 검출하고 황색-녹색 레이저(561 nm)로 여기하였다. BM 및 PB 분석을 위해, 최대 5 x 106개의 세포를 10-20k 세포 사건/초의 속도로 분석하였다. PB LSKSLAM의 분석을 위해, 최대 1 x 106개의 사건을 저장하였다. 문헌(J. Grassinger, et al.)에 이미 기재된 바와 같이 사이토페이아 인플럭스(Cytopeia Influx)(BD) 상에서 세포 분류를 수행하였다.
(ii) 세포주
문헌(J Grassinger, et al Blood, 2009, 114, 49-59)에 이미 기재된 바와 같이 pMSCV-hITGA4-IRES-hITGB1 및 pMSCV-hITGA9-IRES-hITGB1 벡터를 사용한 레트로바이러스 형질도입으로 안정한 LN18 세포((ATCC 번호: CRL-2610), 인테그린 α4β1(LN18 α4β1) 또는 α9β1(LN18 α9β1)을 과다발현함)를 생성하였고 10% FBS 중의 2 mM L-글루타메이트로 보충된 DMEM에서 유지하였다. PBS-2% FBS 중의 2.5 ㎍ ㎖-1의 PE-Cy5-접합된 마우스-항-인간 α4 항체(BD Bioscience) 또는 20 ㎍ ㎖-1의 마우스-항-인간 α9β1 항체(Millipore)에 이어 0.5 ㎍ ㎖-1의 PE-접합된 염소-항-마우스 IgG(BD Bio-science)를 사용하여 형질도입된 세포를 2 라운드의 FACS로 선택하였다. pSM2c-shITGA4(Open Biosystems)를 사용하여 전술된 바와 같이 LN18 및 LN18 α9β1 세포에서의 α4 발현의 침묵을 수행하였다. FACS를 이용하여 α4-침묵된 LN18 세포(대조군 세포주; LN18 SiA4) 및 LN18 α9β1(LN18 α9β1SiA4)을 α4 발현에 대해 음성적으로 선택하였다.
(iii) 면역조직화학
(a) 항체 염색
LN18 SiA4(대조군 세포주), LN18 α4β1 및 LN18 α9β1 세포를 1시간 동안 PBS-2% FBS 중의 2.5 ㎍ ㎖-1의 마우스-항-인간 α4 항체(BD Bioscience), 4 ㎍ ㎖-1의 마우스-항-인간 α9β1 항체(Millipore) 또는 4 ㎍ ㎖-1의 마우스 이소타입 대조군(BD Bioscience)으로 염색한 후, 1시간 동안 5 ㎍ ㎖-1의 알렉사 플루오르 594 접합된 염소-항-마우스 IgG1로 염색한 다음, PBS-2% FBS로 3회 세척하였다.
(b) 항체 칵테일
뮤린 전구세포(LSK; 계통-Sca-1+c-kit+) 및 HSC(LSKSLAM; LSKCD150+CD48-)에 결합하는 R-BC154를 분석하기 위해, BM 및 PB 세포를 계통 칵테일(항-Ter119, 항-B220, 항-CD3, 항-Gr-1, 항-Mac-1), 항-Sca-1, 항-c-kit, 항-CD48 및 항-CD150으로 면역표지하였다. 계통 분석을 위해, 항-CD3을 사용하여 세포를 T-세포에 대해 따로 염색하였고, 항-B220을 사용하여 세포를 B-세포에 대해 따로 염색하였고, 항-Mac-1을 사용하여 세포를 대식세포에 대해 따로 염색하였고, 항-Gr-1을 사용하여 세포를 과립구에 대해 따로 염색하였다. 대안적으로, 항-CD3/B220(접합된 PB) 및 항-B220/Gr1/Mac-1(접합된 AF647)을 함유하는 칵테일도 사용하여 계통 분석을 수행함으로써, B220+ 세포를 +/+ 세포로서 확인하였고, CD3+ 세포는 +/- 집단이고 Gr1/Mac-1+ 세포는 -/+ 집단이다. 제대혈 MNC로부터의 인간 WBC, 또는 인간화된 NSG 마우스로부터의 BM 및 PB를 분석하기 위해, 세포를 항-huCD3/CD14/CD15(모두 접합된 AF488), 항-CD14/CD15/CD19/CD20(모두 접합된 AF647), 항-huCD45-PB, 항-muCD45-BV510 및 항-huCD34-PECy7을 함유하는 계통 칵테일로 세포를 면역표지하였다. 사용된 접합된 항체들의 전체 목록은 하기 표 1 및 2에 상세히 기재되어 있다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
(c) R-BC154(25) 염색
배양된 LN18 SiA4(대조군 세포주), LN18 α4β1 및 LN18 α9β1 세포를, 1 mM CaCl2-MgCl2 또는 1 mM MnCl2를 함유하는 TBS-2% FBS(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM 글루코스, 10 mM Hepes, pH 7.4) 중의 R-BC154(50 nM)로 처리하고 37℃에서 20분 동안 항온처리한 후, TBS-2% FBS로 3회 세척하였다. 염색된 세포를 5분 동안 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 물로 3회 세척한 후, 2.5 ㎍ ㎖-1의 DAPI로 염색하였다. 세포를 벡터쉴드(Vectorshield)에 올려놓고 물로 세척하고 커버슬립으로 덮고 4℃에서 밤새 저장한 후, 형광 현미경(Olympus BX51) 하에서 영상을 촬영하였다.
(iv) 포화 결합 실험
배양된 α4β1, α9β1 및 대조군 LN18 세포(0.5 x 106개의 세포)를, (양이온, 1 mM CaCl2-MgCl2 또는 1 mM MnCl2를 함유하지 않는) TBS-2% FBS 중의 0, 1, 3, 10, 30 및 100 nM의 100 ㎕ 화합물 22 또는 25(R-BC154)로 처리하였다. 세포를 37℃에서 60분 동안 항온처리하고 TBS-2% FBS로 1회 세척하고 건조 펠렛화하고 유세포측정 분석을 위해 적당한 결합 완충제에 재현탁하였다. 평균 채널 형광을 농도에 대해 작도하였고 그래프패드 프리즘(GraphPad) 6을 이용하여 1-부위 포화 리간드 결합 곡선에 피팅하였다. 해리 상수 Kd를 상기 곡선으로부터 결정하였다.
(v) 해리 속도(off-rate) 동력학 측정
α4β1 또는 α9β1 LN18 세포(0.5 x 106개의 세포)를 함유하는 에펜도르프 바이알을 30분 동안 37℃에서 50 nM의 R-BC154(1 mM CaCl2-MgCl2 또는 1 mM MnCl2을 함유하는 TBS-2% FBS 중의 100 ㎕)로 처리하고 적당한 결합 완충제로 1회 세척하고 건조 펠렛화하였다. 상기 세포를 표시된 시간(0분, 2.5분, 5분, 15분, 30분, 45분 또는 60분) 동안 37℃에서 500 nM의 비표지된 경쟁 억제제(1 mM CaCl2-MgCl2 또는 1 mM MnCl2을 함유하는 TBS-2% FBS 중의 100 ㎕)로 처리하였다. 상기 세포를, (적당한 양이온을 함유하는) 냉각된 TBS-2% FBS로 희석하고 원심분리로 펠렛화하고 1회 세척하고 유세포측정 분석을 위해 결합 완충제에 재현탁하였다(약 200 ㎕). 평균 채널 형광을 시간에 대해 작도하였고 그래프패드 프리즘 6을 이용하여 데이터를 1-상 또는 2-상 지수 붕괴 함수에 피팅하였다. 해리 속도 koff를 상기 곡선으로부터 추정하였다.
(vi) 결합 속도(on-rate) 동력학 측정
1 mM CaCl2-MgCl2 또는 1 mM MnCl2을 함유하는 50 ㎕ TBS-2% FBS 중의 α4β1 또는 α9β1 LN18 세포(0.5 x 106개의 세포)를 함유하는 에펜도르프 바이알을 37℃에서 20분 동안 가열 블록에서 예비-활성화시켰다. (적절한 양이온을 가진) 적절한 TBS-2% FBS 중의 100 nM R-BC154(50 ㎕ - 최종 농도 = 50 nM)를 각각의 튜브에 첨가하고 37℃에서 0분, 0.5분, 1분, 2분, 3분, 5분, 10분, 15분 및 20분 항온처리 후, (적절한 양이온을 가진) 3 ㎖의 TBS-2% FBS를 첨가하여 상기 튜브를 켄칭하였다. 상기 세포를 (적절한 양이온을 가진) TBS-2% FBS로 1회 세척하고 원심분리로 펠렛화하고 유세포측정 분석을 위해 적절한 결합 완충제에 재현탁하였다(200 ㎕). 평균 채널 형광을 시간에 대해 작도하였고 그래프패드 프리즘 6을 이용하여 데이터를 1-상 또는 2-상 결합 함수에 피팅하였다. 관찰된 결합 속도 kobs를 상기 곡선으로부터 추정하였고, 하기 식을 이용하여 kon을 계산하였다:
(kobs - koff)/[R-BC154 = 50 nM].
(vii) 마우스
C57Bl/6 마우스들을 모나쉬(Monash) 동물 서비스(모나쉬 대학, 호주 클레이톤 소재)에서 사육하였다. 마우스들은 6주령 내지 8주령이었고 실험을 위해 성별-매칭되었다. 모든 실험은 모나쉬 동물 연구 플랫폼 윤리위원회에 의해 승인되었다(MARP/2012/128).
C57Bl/6(C57), RFP, GFP 및 α4 flox/flox/α9 flox/flox vav-cre 마우스들을 모나쉬 동물 서비스(모나쉬 대학, 호주 클레이톤 소재)에서 사육하였다. 적색 형광 단백질(RFP) 마우스들은 패트릭 탐 교수(Professor Patrick Tam)(호주 시드니 소재의 소아 의학 연구소)에 의해 제공되었다. α4 flox/flox 마우스(탈리아 파파야노포울로우(halia Papayannopoulou)로부터의 선물, 워싱톤주 시애틀 소재의 워싱턴 대학 의학/혈액과)를 α9 flox/flox 마우스(딘 쉐파드(Dean Sheppard)로부터의 친절한 선물, 샌프란시스코 소재의 캘리포니아 대학 의학과) 및 vav-cre 마우스(워렌 알렉산더(Warren Alexander)로부터의 친절한 선물, 멜보른 소재의 WEHI 연구소)와 이종교배함으로써 조건부 α4 flox/flox/α9 flox/flox 마우스를 먼저 생성하였다. NODSIL2Rγ-/-(NSG) 마우스들을 사내(호주 재생의학 연구소)에서 수득하였다. 새로 분류된 제대혈 CD34+ 세포(>150k)를 2 x 106개의 방사선조사된 단핵 지지 세포와 함께 꼬리 정맥내로 주사함으로써 인간화된 NSG 마우스를 생성하였다. 이식 후 4주 내지 5주 후, NSG 마우스들의 눈으로부터 채혈하고 huCD45 및 muCD45, 및 CD34 생착을 평가하였다. C57Bl/6 마우스를 사용한 이식 실험을 위해, 이식 24시간 전에 6시간 간격으로 분할 용량(각각 5.25 Gy)으로 방사선조사를 수행하였다. 총 2 x 105개의 방사선조사된(15 Gy) C57 BM 세포를 모든 수용자를 위한 담체 세포로서 사용하였다. 모든 실험들은 모나쉬 동물 서비스 윤리위원회에 의해 승인되었다.
(viii) 생체내 골수 결합 어세이
PBS 중의 R-BC154(25)(10 mg kg-1)를 C57 마우스 내로 정맥내로 주사하였다. 5분 후, 골수 세포를 문헌(D. N. Haylock et al Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069) 및 문헌(J. Grassinger, et al Cytokine, 2012, 58, 218-225)에 이미 기재된 바와 같이 단리하였다. 요약하건대, 1개의 대퇴골, 경골 및 장골능을 절개하고 근육을 씻어내었다. 골단 및 골간단 영역을 제거한 후, 골을 PBS-2% FBS로 씻어내어 전체 골수를 수득하였고, 이 골수를 PBS-2% FBS로 세척한 후 유세포측정을 위해 면역표지하였다. R-BC154 결합을 분석하기 위해, 방사 스펙트럼 중첩을 최소화하도록 하기 항체 조합을 선택하였다. 전구세포(LSK; 계통-Sca-1+c-kit+) 및 HSC(LSKSLAM; LSKCD150+CD48-)를 염색하기 위해, 세포를 계통 칵테일(CD3, Ter-119, Gr-1, Mac-1, B220; 모두 APC-Cy7 접합된 항체), 항-Sca-1-PB, 항-c-kit-AF647, 항-CD48-FITC 및 항-CD150-BV650으로 표지하였다.
(ix) 조혈 세포 단리
골내막 및 중심 뮤린 골수 세포의 집단을 문헌(J. Grassinger, et al Cytokine, 2012, 58, 218-225) 및 문헌(D. N. Haylock et al Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069)에 이미 기재된 바와 같이 단리하였다. 요약하건대, 1개의 대퇴골, 경골 및 장골을 절개하고 근육을 씻어내었다. 골단 및 골간단 영역을 제거한 후, 골을 PBS-2% FBS로 씻어내어 중추 골수 세포를 수득하였다. 씻어낸 장골, 및 골단 및 골간단 단편들을 모으고, 막자사발을 이용하여 분쇄하였다. 골 단편을 750 rpm에서 37℃의 궤도 진탕기에서 콜라게나제(Collagenase) I(3 mg/㎖) 및 디스파제(Dispase) II(4 mg/㎖)로 분해하였다. 5분 후, 골 단편을 PBS로 1회 세척하고 PBS-2% FBS로 1회 세척하여 골내막 골수 세포를 채취하였다. 말초 혈액을 안와 천자로 채취하고, 실온에서 5분 동안 NH4Cl 용해 완충제를 사용하여 적혈구를 용해시켰다. 단리된 세포 집단을 PBS-2% FBS로 세척한 후, 상기 항체 칵테일에 기재된 바와 같이 유세포측정을 위해 염색하였다.
(x) 인간 CD34+ 세포의 단리
문헌(Nilsson, S. K. et al Blood 106, 1232-1239, (2005)) 및 문헌(Grassinger, J. et al. Blood 114, 49-59, (2009))에 이미 기재된 바와 같이 제대혈로부터 단핵 세포(MNC)를 단리하였다. MNC를, 마우스 항-인간 CD3, CD11b, CD14, CD16, CD20, CD24 및 CD235a(BD)를 함유하는 계통 항체 칵테일과 함께 항온처리한 후, 일정하게 회전시키면서 4℃에서 5분 및 이어서 10분 동안 세포당 2개 비드의 비로 2 라운드의 Dynal 양 항-마우스 IgG 비드(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 처리하였다. 풍부해진 MNC를 CD34-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 염색하고 CD34+ 세포를 FACS로 정제하였다.
(xi) 시험관내 및 생체내 R-BC154 결합
시험관내 표지부착 실험을 위해, C57 마우스, 조건부 α4 -/-/α9 -/- 마우스 및 인간화된 NODSCIDIL2Rγ-/- 마우스로부터의 5 x 106개 BM 세포, 및 인간 제대혈 MNC를, 1 mM CaCl2/MgCl2(활성화) 또는 10 mM EDTA(탈활성화)를 함유하는 PBS(0.5% BSA) 중의 R-BC154(최대 100 nM)로 4℃에서 20분 동안 40 x 106개 세포/㎖의 농도로 처리하였다. 세포를 냉각된 PBS(2% FBS)로 세척한 후, 유세포측정 분석 전에 "항체 칵테일"에 기재된 바와 같이 면역표지하였다. 생체내 실험을 위해, C57BL/6 마우스, α4 -/-/α9 -/- vav-cre 마우스 및 인간화된 NODSCIDIL2Rγ-/- 마우스는 100 ㎕/10 gm 마우스 중량으로 R-BC1541(10 mg/kg)의 정맥내 또는 피하 주사를 제공받았고 전술된 바와 같이 분석되었다.
형광 현미경관찰에 의한 전구세포(LSK 세포)의 분류된 집단에 대한 R-BC154 결합 분석을 수행하였는데, 이때 비처리된 마우스 및 R-BC154 주사를 제공받은 마우스로부터 채취된 BM 세포를 B220, Gr-1, Mac-1 및 Ter-119에 대해 계통 고갈시키고 항-Sca-1-PB 및 항-c-kit-FITC로 염색하고 Sca1+c-kit+에 대해 분류하였다. 올림푸스 BX51 현미경을 이용하여 분류된 세포를 영상화하였다.
(xii) 경쟁 억제 어세이
α4β1 및 α9β1 LN18 세포(1-2 x 105개 세포)를 10분 동안 37℃에서 50 nM의 R-BC154(1 mM CaCl2/MgCl2를 함유하는 PBS-2% FBS 중의 80 ㎕)로 처리하고 PBS로 세척하고 원심분리로 펠렛화한 후, 0, 0.01, 0.1, 0.3, 1, 10, 100 및 300 nM에서 BOP(80 ㎕, 1 mM CaCl2/MgCl2를 함유하는 PBS-2% FBS)로 처리하였다. 세포를 37℃에서 90분 동안 항온처리하고 PBS로 세척하고 원심분리로 펠렛화하고 유세포측정 분석을 위해 PBS(200 ㎕)에 재현탁하였다. % 최대 평균 형광 강도(MFI)를 BOP의 로그 농도에 대해 작도하였고, 데이터를 리간드 결합-S자형 용량-반응 곡선에 피팅하였고, 그래프로부터 IC50 값을 수득하였다. LSK 및 LSKSLAM 세포에 결합하는 R-BC154의 경쟁적 치환을 위해, R-BC154 주사를 제공받은 마우스로부터 단리된 WBM 세포를 유세포측정 분석 전에 37℃에서 45분 동안 (0.5% BSA 및 1 mM CaCl2/MgCl2를 함유하는) PBS 중의 500 nM BOP로 처리하였다.
(xiii) 동원 프로토콜
동원 실험을 위해, 모든 마우스들은 100 ㎕/10 gm 체중의 피하 주사를 제공받았고, EDTA로 코팅된 주사기를 이용하여 목 채혈로 PB를 채취하였다.
(a) R-BC154 및 BOP. 표시된 시간에 목 채혈로 PB를 채취하기 전에, 마우스들은 표시된 용량에서 식염수 중의 R-BC154 및 BOP의 새로 제조된 용액의 단회 주사를 제공받았다.
(b) G-CSF. 마우스들은 연속 4일 동안 6시간 내지 8시간 간격으로 매일 2회(500 ㎍/kg/일)의 G-CSF를 제공받았다. G-CSF 및 BOP를 제공받는 군은 전술된 바와 같이 표준 G-CSF 요법을 제공받은 후, 채취 1시간 전에 단회 BOP 주사를 제공받았다. 대조군 마우스들은 동등한 부피의 식염수를 제공받았다.
(xiv) 인간화된 NODSIL2Rγ(NSG) 마우스의 동원
2 x 106개의 방사선조사된 단핵 지지 세포와 함께 새로 분류된 제대혈 CD34+ 세포(>150k)를 꼬리 정맥내로 주사하여 인간화된 NSG 마우스를 생성하였다. 이식 후 4주 내지 5주 후, NSG 마우스의 눈으로부터 채혈하고 huCD45 및 muCD45에 대해 평가하였다. 이 조건들 하에서, 총 %CD45에 비해 %huCD45를 기준으로 유세포측정 분석으로 측정하였을 때 90% 초과의 인간화가 달성되었다. 인간화된 NSG 마우스를 회복시키기 위해 적어도 실험 1주 전에 제공하였다. 마우스를 "동원 프로토콜"에 특정된 적절한 조건 하에서 동원시킨 후, PB를 목 채혈로 채취하고 용해시키고 "항체 칵테일"에 기재된 바와 같이 면역표지하였다.
(xv) 저-증식력 콜로니 형성 세포 및 고-증식력 콜로니 형성 세포 어세이
저-증식력 콜로니 형성 세포 및 고-증식력 콜로니 형성 세포(각각 LPP-CFC 및 HPP-CFC)를 문헌(J. Grassinger et al Cytokine, 2012, 58, 218-225) 및 문헌(Bartelmez, S. H. et al Experimental Hematology 17, 240-245 (1989))에 이미 기재된 바와 같이 분석하였다. 요약하건대, 동원된 PB를 용해시켰고, 재조합 마우스 줄기 세포 인자 및 재조합 인간 콜로니 자극 인자-1, 인터류킨-1α(IL-1α) 및 IL-3을 함유하는 이중층 영양분 한천 배양 시스템에서 35 mm 페트리 접시에 4000 WBC를 플레이팅하였다. 배양물을 5% O2, 10% CO2 및 85% N2에서 37℃의 가습 항온처리기 내에서 항온처리하였다. 14일의 항온처리 후, LPP-CFC 및 HPP-CFC의 수를 문헌(J. Grassinger, et al (2012))에 이미 기재된 바와 같이 세었다.
(xvi) 장기간 이식 어세이
(a) 제한 희석 분석
RFP 마우스를 BOP(n=15)로 치료하고, 1시간 후 PB를 채취하였다. 치료군당 각각의 기증자 마우스로부터 PB를 모아 용해시키고 PBS에서 원래 혈액 부피의 1/3로 줄였다. 방사선조사된 WBM 충전제 세포(2 x 105/마우스)를 특정된 이식 부피에서 용해된 PB의 분취물에 첨가한 후, PBS로 토핑하여 200 ㎕ 주사/마우스를 가능하게 하였다. 방사선조사된 C57BL/6 마우스를 꼬리 정맥 주사로 투여하고 다중-계통 RFP 생착을 이식 후 6주, 12주 및 20주에서 평가하였다.
(b) 경쟁 일차 및 이차 이식 어세이
RFP(n=5) 및 GFP(n=5) 마우스들을 "동원 프로토콜"에 기재된 바와 같이 각각 BOP(1시간) 및 G-CSF(4일 동안 매일 2회)로 치료하였다. 그 다음, PB를 채취하고 RFP 및 GFP 군들 내에서 혈액을 모아 용해시키고 세척하고 PBS에서 원래 혈액 부피의 1/3까지 재현탁하였다. 동등한 부피의 RFP 및 GFP 혈액을 혼합하여, 마우스당 500 ㎕의 RFP 및 GFP 혈액의 이식을 가능하게 하였다. 방사선조사된 WBM 충전제 세포(2 x 105/마우스)를 첨가하고 혼합물을 PBS로 토핑하여 200 ㎕ 주사/마우스를 가능하게 하였다. 방사선조사된 C57BL/6 수용자(n=5)에게 꼬리 정맥 주사로 투여하였고 RFP 및 GFP 생착을 이식 후 6주, 12주 및 20주에서 평가하였다. 20주 테이크다운(takedown)에서, 각각의 일차 수용자(n=5)로부터의 WBM 세포(대퇴골의 10분의 1)를 방사선조사된 C57 이차 수용자(n=4/일차 수용자) 내로 이식하고 이식 후 6주, 12주 및 20주에서 다중-계통 생착에 대해 평가하였다.
(xvii) 통계학적 분석
적절하게 데이터 세트에 대해 스튜던트 t-검정, 일측 또는 양측 ANOVA를 이용하여 데이터를 분석하였다. 줄기 세포 재증식 빈도를 측정하기 위해, L-CALC 소프트웨어(Stem Cell Technologies)를 이용하여 포아송(Poisson) 분석을 수행하였다. 로그-순위(맨텔-콕스(Mantel-Cox)) 검정을 이용하여 생존 곡선들을 비교하였다. p<0.05는 유의한 것으로서 간주되었다.
실시예 1: α 9 β 1 인테그린 길항제의 제조
(a) 길항제 화합물의 합성
이하에 기재된 반응 경로 및 합성 반응식을 이용하여 다양한 실시양태들의 물질들을 제조할 수 있다. 실시양태들의 특정 화합물의 제조는 하기 실시예에 상세히 기재되어 있으나, 당업자는 기재된 화학반응이 다양한 실시양태들의 다수의 다른 물질들을 제조하는 데 용이하게 적용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 예시되지 않은 화합물의 합성은 당업자에게 자명한 변경, 예를 들면, 방해 기의 적절한 보호, 당분야에서 공지된 다른 적합한 시약으로의 교체, 또는 반응 조건의 관용적인 변경에 의해 성공적으로 수행될 수 있다. 유기합성에서 적합한 보호기의 목록은 문헌(T.W. Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 1991)에서 발견될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 다른 반응은 다양한 실시양태들의 다른 화합물들의 제조에 적용될 수 있는 것으로서 인식될 것이다.
화합물의 합성에 유용한 시약은 당분야에서 공지되어 있는 기법에 따라 수득될 수 있거나 제조될 수 있다.
과정, 반응식 및 실시예에서 부호, 약어 및 약정은 현대 과학문헌에서 사용되는 것들과 일치한다. 구체적으로(그러나, 한정하기 위한 것이 아님), 하기 약어들이 실시예 및 본 명세서 전체에서 사용될 수 있다.
Figure pct00029
Ac(아세틸)
Figure pct00030
BOP(N-(벤젠설포닐)-L-O-(1-피롤리디닐카보닐)티로신)
Figure pct00031
Cbz(카복시벤질)
Figure pct00032
CDCl3(중수소첨가된 클로로포름)
Figure pct00033
CHCl3(클로로포름)
Figure pct00034
CuAAC(구리(I)-촉진된 아자이드 알킨 고리첨가)
Figure pct00035
DCC(N,N'-디사이클로헥실카보디이미드)
Figure pct00036
DCM(디클로로메탄)
Figure pct00037
DIAD(디이소프로필 아조디카복실레이트)
Figure pct00038
DIPEA(디이소프로필 에틸 아민)
Figure pct00039
DMF(N,N-디메틸포름아미드)
Figure pct00040
DMSO(디메틸설폭사이드)
Figure pct00041
EtOAc(에틸 아세테이트)
Figure pct00042
EtOH(에탄올)
Figure pct00043
FTIR(푸리에 변환 적외선)
Figure pct00044
g(그램)
Figure pct00045
h(시간)
Figure pct00046
HATU(O-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트)
Figure pct00047
HBTU(O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트)
Figure pct00048
HCl(염산)
Figure pct00049
HPLC(고압/고성능 액체 크로마토그래피)
Figure pct00050
HRMS(고해상 질량 분광측정)
Figure pct00051
Hz(헤르츠)
Figure pct00052
K2CO3(탄산칼륨)
Figure pct00053
ℓ(리터)
Figure pct00054
MeOH(메탄올)
Figure pct00055
mg(밀리그램)
Figure pct00056
MHz(메가헤르츠)
Figure pct00057
min(분)
Figure pct00058
㎖(밀리리터)
Figure pct00059
mM(밀리몰)
Figure pct00060
mol(몰)
Figure pct00061
Ms(메실레이트)
Figure pct00062
Na2SO4(황산나트륨)
Figure pct00063
NHS(N-하이드록시석신이미드)
Figure pct00064
NMR(핵 자기 공명)
Figure pct00065
PEG(폴리에틸렌 글리콜)
Figure pct00066
pet. spirits(석유 스피릿)
Figure pct00067
ppm(백만분율)
Figure pct00068
psi(제곱 인치당 파운드)
Figure pct00069
SN2(치환 - 친핵성, 이분자)
Figure pct00070
TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민)
Figure pct00071
TEA(트리에틸아민)
Figure pct00072
TFA(트리플루오로아세트산)
Figure pct00073
Tf(트리플레이트)
Figure pct00074
THF(테트라하이드로푸란)
Figure pct00075
TLC(박층 크로마토그래피)
Figure pct00076
UV(자외선)
Figure pct00077
RM(반응 혼합물)
Figure pct00078
Rt(체류 시간)
Figure pct00079
rt(실온)
달리 표시되어 있지 않은 한, 모든 온도는 ℃(섭씨 온도)로 표현된다. 달리 언급되어 있지 않은 한, 모든 반응은 실온에서 수행된다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 모든 출발 물질들, 시약들 및 용매들은 상업적 공급원으로부터 수득되었고 추가 정제 없이 사용되었다. N-(벤질옥시카보닐)-L-프롤릴-L-O-(tert-부틸에테르)티로신 메틸 에스테르(26)를 진스크립트(Genscript)로부터 수득하였다. 모든 무수 반응들을 건조 질소 대기 하에서 수행하였다. 제이. 씨. 메이어(J. C. Meyer)에 의해 구축되었고 그룹스와 그의 동료들(Grubbs and co-workers)에 의한 원래의 디자인에 기초한 용매 분배 시스템 상에서 활성화된 중성 알루미나의 2개 순차적인 컬럼들에 통과시킴으로써 디에틸 에테르, 디클로로메탄, 테트라하이드로푸란 및 톨루엔을 건조하였다. 석유 스피릿은 40℃ 내지 60℃에서 끓는 분획을 지칭한다. 머크(Merck) 예비-코팅된 0.25 mm 실리카 알루미늄-백킹된 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하였고 UV 광 및/또는 닌하이드린 용액 또는 포스포폴리브드산 용액에의 침지에 이은 가열로 가시화하였다. 머크 실리카 겔 60(230-400 mesh) 또는 역상 C18 실리카 겔을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 반응 생성물의 정제를 수행하였다. 리차드-정 써모바르(Reichert-Jung Thermovar) 핫-스테이지 현미경 융점 장치 상에서 융점을 기록하였다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 모델 341 편광계 상에서 광학 회전을 기록하였다. 다이아몬드 창과 피팅된 SmartATR(약화된 총 반사율) 부착을 이용하는 ThermoNicolet 6700 분광계를 이용하여 FTIR 스펙트럼을 수득하였다. 양성자(1H) 및 탄소(13C) NMR 스펙트럼을 각각 400 및 100 MHz에서 BrukerAV400 분광계 상에서 기록하였다. 내부 표준물(7.26 ppm에서 CDCl3)로서 용매를 사용하여 1H NMR을 ppm으로 보고하였다. 내부 표준물(77.16 ppm에서 CDCl3)로서 용매를 사용하여 양성자-탈커플링된 13C NMR(100 MHz)을 ppm으로 보고하였다. 전자분무 이온화(ESI)를 이용하는 WATERS QTOF II(CMSE, Clayton, VIC 3168) 또는 핀니간(Finnigan) 하이브리드 LTQ-FT 질량 분광계(Thermo Electron Corp., Bio21 Institute, University of Melbourne, Parkville, VIC 3010) 상에서 고해상 질량 분광측정을 획득하였다.
실시예 1A: N -(벤젠설포닐)-L-프롤릴-L- O -(1-피롤리디닐카보닐)티로신(BOP)의 제조
BOP의 합성은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 디펩티드(26)로부터 시작되었다:
Figure pct00080
0℃에서 트리플루오로아세트산을 사용하여 디펩티드(26)의 tert-부틸 보호기의 탈보호를 수행하여 페놀(27)을 제공하였고, 이 페놀을 수성 마무리처리 후 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 페놀(27)과 1-피롤리딘카보닐 클로라이드의 반응을 탄산칼륨의 존재 하에서 원활하게 진행시켜 두 단계에 걸쳐 우수한 수율(74%)로 카바메이트(28)를 제공하였다. Cbz 보호기의 수소분해를 3시간 이내에 완결하였고, 생성된 아민을 플래쉬 크로마토그래피 후 우수한 수율(85%)로 수득하였다. 그 다음, 아민(29)을 염기의 존재 하에서 벤젠설포닐 클로라이드와 반응시켜, 플래쉬 크로마토그래피 후 현저한 수율(96%)로 설폰아미드(30)를 제공하였다. 마지막으로, 수산화나트륨을 사용하여 설폰아미드(30)의 메틸 에스테르 모이어티를 비누화한 후 암버라이스트(Amberlyst) 수지 상에서 이온-교환을 수행하여, 플래쉬 크로마토그래피 후 81% 수율로 BOP를 제공하였다.
예시로써, 본 출원인은 디펩티드(26)로부터 출발하는 BOP의 형성을 위한 실제 반응 조건을 제공한다.
단계 1: N-(벤질옥시카보닐)-L-프롤릴-L-O-티로신 메틸 에스테르(27)
TFA(1.27 ㎖, 16.6 mmol)을 0℃에서 건조 CH2Cl2(10 ㎖) 중의 N-(벤질옥시카보닐)-L-프롤릴-L-O-(tert-부틸에테르)티로신 메틸 에스테르(26)(0.80 g, 1.66 mmol; 진스크립트(Genscript)로부터 주문제작 펩티드 합성) 현탁액에 적가하였다. 혼합물을 실온까지 서서히 가온하고 3시간 동안 교반하였는데, 이 시점에서 TLC(70:30 EtOAc/석유 스피릿)는 출발 물질의 완전한 소모를 표시하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고 H2O 및 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 톨루엔(X3)으로 농축하여, 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용된 무색 오일로서 미정제 N-(벤질옥시카보닐)-L-프롤릴-L-O-티로신 메틸 에스테르(27)(700 mg)를 제공하였다.
단계 2: N-(벤질옥시카보닐)-L-프롤릴-L-O-(1-피롤리디닐카보닐)티로신 메틸 에스테르(28)
1-피롤리딘카보닐 클로라이드(147 ㎕, 1.38 mmol)를 DMF(5 ㎖) 중의 미정제 페놀(27)(393 mg, 0.922 mmol)과 K2CO3(256 mg, 1.84 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하고 EtOAc/H2O로 희석하고 유기층을 분리하였다. 유기층을 5% HCl, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(70% EtOAc/석유 스피릿)로 정제하여, 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용된 무색 포말로서 카바메이트(28)(355 mg, 74%)를 제공하였다.
단계 3: L-프롤릴-L-O-(1-피롤리디닐카보닐)티로신 메틸 에스테르(29)
MeOH(30 ㎖) 중의 Cbz 보호된 디펩티드(28)(356 mg, 0.681 mmol)와 10% Pd/C (50% H2O, 150 mg)의 혼합물을 H2로 3회 퍼징하였다. 상기 혼합물을 3시간 동안 H2 대기 하에서 교반하였는데, 이 시점에서 TLC(10% MeOH/CH2Cl2)는 출발 물질의 완전한 소모를 표시하였다. 셀라이트의 층을 통해 상기 혼합물을 여과하였고 여과액을 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(5% 내지 10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 무색 오일로서 아민(29)(224 mg, 85%)을 제공하였다. δH(400 MHz, CDCl3) 1.64-1.78 (2 H, m), 1.82-1.92 (5 H, m), 2.16-2.25 (1 H, m), 2.97-3.15 (4 H, m), 3.39 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.49 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.65 (3 H, s), 4.03 (1 H, dd, J = 5.7, 8.3 Hz) 4.72 (1 H, dd, J = 7.8, 13.3 Hz), 5.69 (1 H, br s), 6.99 (2 H, d, J = 8.3 Hz), 7.13 (2 H, d, J = 8.3 Hz), 8.41 (1 H, d, J = 7.9 Hz).
단계 4: N-(벤젠설포닐)-L-프롤릴-L-O-(1-피롤리디닐카보닐)티로신 메틸 에스테르(30)
DIPEA(95 ㎕, 0.546 mmol)을, CH2Cl2(3 ㎖) 중의 아민 D(71 mg, 0.182 mmol), PhSO2Cl(35 ㎕, 0.273 mmol) 및 DMAP(2.2 mg, 0.018 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 감압 하에서 농축하였고 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(2.5% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 무색 포말로서 생성물 E(93 mg, 96%)를 제공하였다. δH(400 MHz, CDCl3) 1.42-1.56 (3 H, m), 1.90-2.05 (5 H, m), 3.03 (1 H, dd, J = 7.6, 14.0 Hz), 3.10-3.16 (1 H, m), 3.26 (1 H, dd, J = 5.6, 14.0 Hz), 3.35-3.40 (1 H, m), 3.45 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.54 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.77 (3 H, s), 4.08 (1 H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz), 4.82 (1 H, dt, J = 5.7, 11.6 Hz), 7.06 (2 H, d, J = 8.7 Hz), 7.13 (2 H, d, J = 8.7 Hz), 7.25 (1 H, d, J = 7.5 Hz; 용매 피크에 의해 불분명해짐), 7.52-7.57 (2 H, m), 7.61-7.65 (1 H, m), 7.83-7.85 (2 H, m).
단계 5: N-(벤젠설포닐)-L-프롤릴-L-O-(1-피롤리디닐카보닐)티로신(BOP)
0.1 M NaOH(3.2 ㎖, 0.162 mmol)을 MeOH(10 ㎖) 중의 에스테르(30)(86 mg, 0.162 mmol) 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 암버라이스트 수지(H+ 형태)로 켄칭하고 여과하였고 여과액을 감압 하에서 농축하였다. 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여, 무색 유리로서 생성물 BOP(68 mg, 81%)를 제공하였다. δH(400 MHz, d4-MeOH) 1.47-1.55 (1 H, m), 1.59-1.72 (2 H, m), 1.77-1.85 (1 H, m), 1.93-2.00 (4 H, m), 3.11 (1 H, dd, J = 7.8, 13.7 Hz), 3.18-3.24 (1 H, m), 3.27 (1 H, dd, J = 5.0, 13.7 Hz), 3.35-3.44 (3 H, m), 3.56 (2 H, d, J = 6.5 Hz), 4.14 (1 H, dd, J = 4.0, 8.5 Hz), 4.69 (1 H, m), 7.04 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 7.27 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 7.60 (2 H, t, J = 7.6 Hz), 7.69 (1 H, t, J = 7.4 Hz), 7.86 (2H, d, J = 7.4 Hz).
시험관내 및 생체내 실험을 위해, MeOH 중의 BOP의 유리산 용액을 0.98 당량의 NaOH(0.01 M NaOH)로 처리함으로써 BOP를 나트륨 염으로 전환시켰다. 0.45 ㎛ 주사기 필터 유닛을 통해 용액을 여과하였고, 생성물을 동결건조하여 솜털 같은 무색 분말로서 나트륨 염을 제공하였다. δH(400 MHz, D2O) 1.47-1.59 (2 H, m), 1.68-1.83 (2 H, m), 1.87-1.92 (4 H, m), 3.01 (1 H, dd, J = 7.7, 13.8 Hz), 3.18-3.26 (2 H, m), 3.34-3.40 (3 H, m), 3.48-3.51 (2 H, m), 4.06 (1 H, dd, J = 4.4, 8.7 Hz), 4.43 (1 H, dd, J = 5.0, 7.7 Hz), 7.04 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 7.27 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 7.61 (2 H, t, J = 8.1 Hz), 7.73 (1 H, t, J = 7.5 Hz), 7.78 (2 H, d, J = 7.5 Hz).
실시예 1B - PEG 스페이서를 가진 형광 표지된 인테그린 길항제(화합물 22)의 제조
Figure pct00081
BOP의 형광 표지부착을 위한 일반적인 방법은 형광 태그에의 후속 접합을 위해 BOP의 C4-위치에서 트랜스-배열 이작용성 PEG 링커를 배치하기 위한 효율적인 방법에 기초하였다.
락톤(4)은 보호된 아미노산을 사용한 직접적인 아실화를 통해 4-시스-하이드록시 프롤린 기반 디펩티드에 접근하기 위한 다용도 신톤(synthon)으로서 이미 보고되었다. 그 다음, 4-시스-하이드록시 기의 후속 활성화에 이은 친핵체를 사용한 SN2 치환은 원하는 4-트랜스-배열 프롤린 유도체를 제공할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 락톤(4) 및 티로신 유도체(7)로부터 출발하여 BOP의 다양한 C4-작용화된 유도체들을 획득할 수 있다는 것을 예상한다(반응식 2). DIAD 및 PPh3을 사용하는 미츠노부(Mitsunobu) 조건 하에서 N-페닐설포닐-트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 처리하여 락톤(4)을 용이하게 제조하였다. K2CO3의 존재 하에서 피롤리딘 카보닐 클로라이드로 처리하여 중간체(6)를 제공한 후, Cbz 보호기를 제거함으로써 보호된 화합물(5)로부터 티로신 유도체(7)를 합성하였다. 이상(biphasic) 조건 하에서 락톤(4)을 티로신 유도체(7)에 노출시켜 단일 부분입체이성질체로서 89% 수율로 디펩티드(8)를 제공하였다. 이 방법은 비사이클릭 락톤의 활성화된 성질을 이용하고 탈수 펩티드 커플링에 의존하지 않으면서 4-시스-하이드록시 프롤린 디펩티드로의 완전한 전환을 허용한다. PEG 링커를 배치하는 데 있어서 초기 시도는 상업적으로 입수가능한 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민으로부터 용이하게 수득될 수 있는, 아미노 PEG 유도체(10)에 의한 시스-배열 트리플레이트(9)의 직접적인 치환에 집중하였다. 아민에 의한 4-시스-트리플레이트의 SN2 치환은 생성된 연결의 낮은 입체적 벌크를 고려해 볼 때 현 상황에서 흥미로운, 상응하는 트랜스-아미노 프롤린 유도체를 제공하는 것으로 보고되었다. 따라서, PEG 유도체(10)로 처리하기 전에, 화합물(8)의 하이드록실 기를 상응하는 트리플레이트(9)로 전환시켜, (2 단계에 걸쳐 27%) 실망적인 수율에도 불구하고 PEG화된 생성물(11)을 제공하였다(반응식 2).
주요 부 생성물이 트리플레이트(9) 또는 PEG 유도체(10)의 형성 동안 단리되지 않았지만, N-알킬화 반응의 좋지 않은 수율에 대한 가능한 합리화는 트리플루오로메탄설포닐 이미데이트의 중간체 형성이었다. 따라서, 이차 아미드를 결여하는 단순화된 시스-하이드록시 화합물(12)도 조사하였다.
프롤린 잔기의 4-위치에서의 N-연결된 방향족 헤테로환(예를 들면, 이미다졸, 트리아졸, 테트라졸 및 벤즈이미다졸)의 도입은 이미 기재되어 있다. 이 관찰결과를 근거로, 본 출원인은 트리아졸을 통한 PEG 링커의 부착도 α9β1 인테그린 결합을 위해 용인될 것임을 예상하였다. 결과적으로, 이것은 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 알킨 작용화된 PEG 유도체(15)와 트랜스-아지도 인테그린 길항제(18) 사이의 Cu(I)-촉진된 아자이드 알킨 사이클로첨가(CuAAC) 반응을 사용한 PEG 링커의 배치를 가능하게 할 것이다.
Figure pct00082
DCC 커플링 조건 하에서 프로피온산과 축합시켜 한 단계에서 PEG 유도체(10)로부터 알킨 작용화된 PEG 유도체(15)를 수득하였다(반응식 2a). 트랜스-아자이도 작용화된 디펩티드(18)의 합성을 락톤(4)으로부터 용이하게 달성하였다(반응식 2b). MeOH에서 락톤(4)을 Na2CO3으로 처리하여 80% 수율로 시스-하이드록시 프롤린 에스테르(12)를 제공하였다. 시스-하이드록시 프롤린 에스테르(12)의 시스-알코올을 상응하는 메실레이트로 전환시킨 후, 상기 메실레이트를 나트륨 아자이드로 치환시켜 2 단계에 걸쳐 88% 수율로 트랜스-아자이도 프롤린 에스테르(16)를 제공하였다. 트랜스-아자이도 프롤린 에스테르(16)의 메틸 에스테르를 가수분해하여 프롤린산(17)을 제공한 후, 이를 표준 HBTU 커를링 조건 하에서 티로신 유도체(7)와 반응시켜 93% 수율로 디펩티드(18)를 제공하였다. 대안적으로, 디펩티드(18)는 (반응식 1로부터) 시스-알코올(8)로부터도 입수가능하다. 편리하게는, 알코올(8)의 메실화 및 후속 아자이드 치환은 원활하게 진행되어 생성물(18)을 제공하였고, 이 생성물은 크로마토그래피 정제를 필요로 하지 않으면서 수득되었다.
수중에 있는 PEG 알킨(15) 및 아자이드(18)를 사용할 때, 하기 반응식 4에 나타낸 바와 같이, CuAAC 반응을 이용한 그들의 커플링에 주의를 돌렸다.
Figure pct00083
만족스럽게도, CuSO4, 아스코르브산나트륨 및 Cu(I)-안정화 리간드 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA)을 사용한 PEG 알킨(15) 및 아자이드(18)의 처리는 사실상 정량적 수율로 1,4-이치환된 트리아졸(19)을 제공하였다. 메틸 에스테르(19)의 가수분해는 산(20)을 제공하였고, 수소분해에 의한 Cbz 기의 제거 후, 전체적으로 탈보호된 PEG-작용화된 인테그린 길항제(21)를 우수한 수율(2 단계에 걸쳐 87%)로 수득하였다. 마지막으로, 수성 조건 하에서 아민(21)을 NHS-로다민으로 처리하여 C18 역상 크로마토그래피에 의한 정제 후 5-카복시테트라메틸로다민 위치이성질체와 6-카복시테트라메틸로다민 위치이성질체의 5:1 혼합물로서 38% 수율로 형광 표지된 인테그린 길항제(22)를 제공하였다.
예시로써, 본 발명자들은 N-페닐설포닐-트랜스-4-하이드록시-L-프롤린으로부터 출발하여 형광 표지된 BOP 유도체(22)의 형성을 위한 실제 반응 조건을 제공한다.
단계 1: (1S,4S)-5-(페닐설포닐)-2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-3-온(4)
디이소프로필아조카복실레이트(1.87 ㎖, 9.48 mmol)를 N2 하에서 0℃에서 CH2Cl2(150 ㎖) 중의 N-페닐설포닐-트랜스-4-하이드록시-L-프롤린(2.45 g, 9.03 mmol) 및 트리페닐포스핀(2.49 g, 9.48 mmol)의 교반된 현탁액에 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응액을 실온까지 가온하고 밤새 교반하고 감압 하에서 농축하였고, 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(50:50 EtOAc/석유 스피릿)로 정제하여 무색 고체로서 락톤(4)(1.77 g, 78%)을 제공하였다. 분광학적 데이터는 이미 보고된 값과 동일하다.
단계 2: (S)-4-(2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-3-메톡시-3-옥소프로필)페닐 피롤리딘-1-카복실레이트(6)
1-피롤리딘카보닐 클로라이드(336 ㎕, 3.04 mmol)를, CH3CN(9 ㎖) 중의 티로신(5)(500 mg, 1.52 mmol) 및 K2CO3(420 mg, 3.04 mmol)의 혼합물을 함유하는 BiotageTM 마이크로파 바이알에 첨가하였다. 혼합물을 45분 동안 마이크로파 반응기에서 100℃까지 가열하고 H2O로 희석한 후 30분 동안 교반하였다. 수층을 EtOAc(2 x 20 ㎖)로 추출하였고 모아진 유기층을 포화된 수성 NaHCO3으로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 재결정화하여(EtOAc/석유 스피릿) 무색 결정으로서 카바메이트(6)(484 mg, 75%)를 제공하였다. mp 116-117℃; [α]D +42.5(CHCl3에서 c 0.81); δH(400 MHz, CDCl3) 1.94 (4 H, m, (CH2)2), 3.09 (2 H, m), 3.47 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.55 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.71 (3 H, s), 4.64 (1 H, m), 5.10 (2 H, s), 5.22 (1 H, d, J = 8.0 Hz), 7.03-7.38 (9 H, m); δC(100 MHz, CDCl3) 25.0, 25.8, 37.5, 46.3, 46.4, 52.3, 54.8, 67.00, 121.9 (2 C), 128.1 (2 C), 128.1, 128.5 (2 C), 130.0 (2 C), 132.4, 136.2, 150.6, 153.0, 155.6, 171.9; ν/cm-1 3331, 2954, 1719, 1698; 1511, 1402, 1345, 1216, 1061, 1020, 866, 754, 699; HRMS (ESI+) m/z 449.1686(C23H26N2NaO6[M+Na]+는 449.1689를 요구함).
단계 3: (S)-4-(2-아미노-3-메톡시-3-옥소프로필)페닐 피롤리딘-1-카복실레이트(7)
MeOH(40 ㎖) 중의 보호된 티로신(6)(950 mg, 1.13 mmol)과 Pd/C(10%, 50 mg)의 혼합물을 H2로 3회 퍼징하였다. 혼합물을 2시간 동안 H2 대기 하에서 교반하였고, 이 시점에서 TLC는 출발 물질의 완전한 소모를 표시하였다. 셀라이트의 층을 통해 혼합물을 여과하였고 여과액을 감압 하에서 농축하여, 정치 시 고체로 경화되는 무색 오일로서 미정제 아민(7)(637 mg, 98%)을 제공하였다. 작은 부분을, 특징규명을 위해 플래쉬 크로마토그래피(5:95 내지 10:90 MeOH/CH2Cl2)로 더 정제하였다. [α]D -11.6(MeOH에서 c 1.09); δH(400 MHz, CDCl3) 1.97 (4 H, m), 2.91 (1 H, dd, J = 7.1, 13.6 Hz), 3.02 (1 H, dd, J = 6.1, 13.6 Hz), 3.42 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.43 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.68 (3 H, s), 4.84 (2 H, br s), 3.70 (1 H, dd, J = 6.2, 7.1 Hz), 7.05 (2 H, m), 7.21 (2 H, m); δC(100 MHz, CDCl3) 25.9, 26.7, 41.1, 47.5, 47.5, 52.4, 56.7, 123.0 (2 C), 131.2 (2 C), 135.6, 151.6, 155.1, 176.1; ν/cm-1 3311, 2954, 2878, 1714, 1510, 1399, 1344, 1214, 1168, 1086, 1062, 1020, 864, 755; HRMS (ESI+) m/z 293.1497(C15H20N2O4SH[M+H]+는 293.1496을 요구함).
단계 4: 4-((S)-2-((2S,4S)-4-하이드록시-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복스아미도)-3-메톡시-3-옥소프로필)페닐 피롤리딘-1-카복실레이트(8)
톨루엔/H2O(5:1, 6 ㎖) 중의 락톤(4)(466 mg, 1.84 mmol) 및 아민(7)(510 mg, 1.76 mmol)을 2일 동안 80℃에서 교반한 후, EtOAc로 희석하고 1 M HCl, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(100% EtOAc 내지 5% MeOH/EtOAc)로 정제하여 무색 포말로서 알코올(8)(851 mg, 89%)을 제공하였다. [α]D -31.4(MeOH에서 c 1.66); δH(400 MHz, CDCl3) 1.57 (1 H, m), 1.89-2.00 (5 H, m), 2.94 (1 H, dd, J = 9.5, 14.0 Hz), 3.13 (1 H, dd, J = 4.0, 10.5 Hz), 3.23 (1 H, d, J = 10.5 Hz), 3.35 (1 H, dd, J = 5.0, 14.0 Hz), 3.40 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.51-3.56 (3 H, m), 3.78 (3 H, s), 4.03 (1 H, m), 4.12 (1 H, d, J = 9.0 Hz), 4.75 (1 H, m), 6.99 (2 H, d, J = 8.3 Hz), 7.07 (1 H, d, J = 7.5 Hz), 7.19 (2 H, 8.3 Hz), 7.51-7.63 (3 H, m), 7.83 (2 H, d, J = 7.5 Hz); δC(100 MHz, CDCl3) 25.1, 25.9, 37.0, 37.6, 46.5, 46.6, 52.6, 53.3, 57.8, 61.7, 69.7, 122.5 (2 C), 127.9 (2 C), 129.4 (2 C), 130.5 (2 C), 133.4, 133.8, 136.3, 150.2, 154.1, 171.6, 171.7; ν/cm-1 3408, 1743, 1718, 1701, 1663; HRMS (ESI+) m/z 568.1723(C26H31NaN3O8S[M+Na]+는 568.1730을 요구함).
단계 5: 4-((R)-3-메톡시-3-옥소-2-((2S,4R)-4-((3-옥소-1-페닐-2,8,11,14-테트라옥사-4-아자헵타데칸-17-일)아미노)-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복스아미도)프로필)페닐 피롤리딘-1-카복실레이트(11)
알코올(8)(105 mg, 0.19 mmol)을 -20℃에서 N2 하에서 무수 CH2Cl2(2 ㎖)에 용해시켰다. DIPEA(99 ㎕, 0.57 mmol)에 이어 Tf2O(50 ㎕, 0.57 mmol)를 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응액을 -20℃에서 2시간 동안 교반한 후 포화된 수성 NaHCO3으로 켄칭하고 EtOAc로 희석하였고 유기층을 분리하였다. 유기층을 H2O, 2% 구연산, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 수층을 EtOAc로 (2회) 추출하고 모아진 유기층을 건조하고(MgSO4) 잔사를 감압 하에서 농축하여 미정제 트리플레이트(9)를 제공하였다. 무수 THF(200 ㎕) 중의 PEG 아민(10)(141 mg, 0.39 mmol)을 이 잔사에 첨가하였고 반응액을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 10% 부탄-2-올/EtOAc(20 ㎖)로 희석하고 유기층을 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 미정제 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(2% 내지 3% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 무색 오일로서 화합물 11(46 mg, 2 단계에 걸쳐 27%)을 제공하였다. 작은 부분을, 특징규명을 위해 C18-실리카 겔 크로마토그래피(40% H2O/MeCN)로 더 정제하였다. δH(400 MHz, CDCl3) 1.40 (1H, m), 1.55 (2H, m), 1.77 (2H, m), 1.93 (4H, m), 2.12 (1H, m), 2.43 (2H, m), 2.82 (1H, dd, J = 7.8, 9.2 Hz), 2.94 (1 H, m), 3.02 (1 H, dd, J = 7.8, 14.0 Hz), 3.23-3.32 (4 H, m), 3.38 (2H, t, J = 6.1 Hz), 3.44 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.46-3.60 (14H, m), 3.76 (3H, s), 4.09 (1H, dd, J = 3.0, 8.9 Hz), 4.85 (1H, td, J = 5.7, 7.8 Hz), 5.07 (2H, s), 5.42 (1H, brs), 7.05 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.14 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.21 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.28-7.35 (5H, br m), 7.53 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.60 (1H, br t, J = 7.04), 7.81 (1H, br d, J = 7.05 Hz); δC(100 MHz, CDCl3) 25.1, 25.9, 29.6, 30.1, 36.5, 37.5, 39.4, 45.9, 46.5, 46.6, 52.6, 53.3, 54.7, 56.5, 61.6, 66.6, 69.8, 69.7, 70.3, 70.3, 70.67, 70.72, 122.0 (2 C), 128.1 (2 C), 128.2 (2 C), 128.6 (3 C), 129.4 (2 C), 130.2 (2 C), 133.0, 133.5, 136.0, 137.0, 150.7, 153.2, 156.6, 170.9, 171.6; ν/cm-1 3334, 2877, 2341, 1706, 1521. HRMS (ESI+) m/z 904.3770(C44H59NaN5O12S[M+Na]+는 904.3779를 요구함).
단계 6: 메틸 (2S,4S)-4-하이드록시-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복실레이트(12)
락톤(4)(1.74 g, 6.88 mmol)과 Na2CO3(3.65 g, 34.4 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 MeOH(50 ㎖)에서 교반하였다. 잔사를 농축하고 EtOAc(100 ㎖)에 용해시켰고, H2O과 유기층을 분리하였다. 수층을 EtOAc(2 x 30 ㎖)로 추출하였고 모아진 유기층을 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하여 무색 고체로서 메틸 에스테르(12)(1.57 g, 80%)를 제공하였다. 분광학적 데이터는 보고된 값과 일치하고, 상기 물질을 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 7: 메틸 (2S,4R)-4-아자이도-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복실레이트(16)
MsCl(304 ㎕, 3.93 mmol)을 N2 하에 0℃에서 무수 CH2Cl2(20 ㎖) 중의 알코올(12)(934 mg, 3.27 mmol)과 트리에틸아민(620 ㎕, 4.48 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고 CH2Cl2로 희석하고 5% HCl, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 순차적으로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하여 엷은 황색 오일로서 미정제 메실레이트를 제공하였다. 이 잔사를 DMSO(13 ㎖)에 용해시키고 NaN3(638 mg, 9.81 mmol)으로 처리하고 혼합물을 80℃에서 밤새 교반하였다. 반응액을 EtOAc로 희석하고 H2O 및 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 농축하였다. 잔사를 재결정화(MeOH)로 정제하여 무색 바늘로서 화합물(16)(874 mg, 2 단계에 걸쳐 86%)을 제공하였다. mp 98-100℃, [α]D -33.4(CHCl3에서 c 1.02); δH(400 MHz, CDCl3) 2.17-2.21 (2 H, m), 3.43 (1 H, ddd, J = 0.7, 3.0, 11.0 Hz), 3.71 (1 H, dd, J = 5.0, 11.0 Hz), 3.76 (3 H, s), 4.18-4.22 (1 H, m), 4.30 (1 H, t, J = 7.5 Hz), 7.53-7.58 (2 H, m), 7.61-7.65 (1 H, m), 7.87-7.89 (2 H, m); δC(100 MHz, CDCl3) 36.5, 52.9, 53.2, 59.45, 59.51, 127.6 (2 C), 129.3 (2 C), 133.3, 137.6, 171.9; ν/cm-1 2101, 1747, 1445, 1345, 1207, 1158, 1095, 1017, 758, 722, 696; HRMS (ESI+) m/z 311.0808(C12H14N4O4SH[M+H]+는 311.0809를 요구함); m/z 328.1073(C12H14N4O4SNH4[M+NH4]+는 328.1074를 요구함).
단계 8: (2S,4R)-4-아자이도-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복실산(17)
3:1 EtOH/THF(40 ㎖) 중의 메틸 에스테르(16)(586 mg, 1.89 mmol)를 0.2 M NaOH(12.3 ㎖, 2.45 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후 감압 하에서 농축하였다. 미정제 물질을 디에틸 에테르로 희석하고 수층을 분리하였다. 유기층을 0.2 M NaOH(2 x 10 ㎖)로 추출하고 모아진 수성 추출물을 10% HCl로 산성화하였다. 수층을 CHCl3(4 x 30 ㎖)로 추출하였고, 모아진 유기층을 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 미정제 물질을 플래쉬 크로마토그래피(0.5% AcOH를 가진 5% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 무색 오일로서 산(17)(492 mg, 88%)을 제공하였다. [α]D -34.4(MeOH에서 c 0.82); δH(400 MHz, CDCl3) 2.18-2.32 (2 H, m), 3.40 (1 H, m), 3.73 (1 H, dd, J = 4.8, 11.5 Hz, H5'), 4.22 (1 H, m, H4), 4.29 (1 H, t, J = 7.7 Hz), 7.56 (2 H, m), 7.64 (1 H, m), 7.88 (2 H, m), 10.72 (1 H, br s); δC(100 MHz, CDCl3) 36.1, 53.4, 59.5, 127.6 (2 C), 129.4 (2 C), 133.6, 136.9, 176.6; ν/cm-1 3500-2500, 2107, 1731; HRMS (ESI+) m/z 319.0472(C11H12N4NaO4S[M+Na]+는 319.0472를 요구함).
단계 9: 4-((S)-2-((2S,4R)-4-아자이도-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복스아미도)-3-메톡시-3-옥소프로필)페닐 피롤리딘-1-카복실레이트(18)
O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸 유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)(693 mg, 1.83 mmol)를 0℃에서 DMF(6 ㎖) 중의 산(17)(491 mg, 1.66 mmol)과 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(578 ㎕, 3.32 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 그 다음, DMF(6 ㎖) 중의 아민(7)(484 mg, 1.66 mmol)을 적가하였고, 모아진 혼합물을 실온까지 가온하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고 5% HCl, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 순차적으로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(3% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 엷은 황색 포말로서 디펩티드(7)(928 mg, 98%)를 제공하였다. [α]D -4.6(CHCl3에서 c 0.85); δH(400 MHz, CDCl3) 1.67 (1 H, m), 1.86-1.98 (4 H, m), 2.04 (1 H, dt, J = 5.5, 13.2 Hz), 2.99 (1 H, dd, J = 8.5, 14.0 Hz), 3.19 (1 H, dd, J = 4.5, 10.9 Hz), 3.30 (1 H, dd, J = 5.5 14.0 Hz), 3.44 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.48 (1 H, dd, J = 5.5, 11.5 Hz), 3.53 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.78 (3 H, s), 3.82 (1 H, m), 4.09 (1 H, dd, J = 5.5, 8.4 Hz), 4.87 (1H, dt, J = 8.3, 8.3, 5.5 Hz), 7.05, 7.15 (4 H, 2 x d, J = 8.5 Hz), 7.19 (1 H, d, J = 8.2 Hz), 7.53-7.57 (2 H, m), 7.62-7.66 (1 H, m), 7.83-7.86 (2 H, m); δC(100 MHz, CDCl3) 25.1, 25.9, 35.6, 37.5, 46.4, 46.6, 52.7, 53.1, 53.8, 58.9, 61.1, 122.1 (2 C), 128.0 (2 C), 129.5 (2 C), 130.2 (2 C), 132.9, 133.7, 136.0, 150.7, 153.1, 169.9, 171.5; ν/cm-1 3316, 2975, 2880, 2105, 1716, 1682; HRMS (ESI+) m/z 593.1789(C26H30N6NaO7S[M+Na]+는 593.1789를 요구함).
알코올(8)을 통한 화합물(18)의 합성
메탄설포닐 클로라이드(92 ㎕, 1.18 mmol)를 N2 하에서 0℃에서 무수 CH2Cl2 중의 알코올(8)(251 mg, 0.394 mmol)과 트리에틸아민(170 ㎕, 1.22 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 반응액을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후 실온까지 가온하고 추가 1시간 동안 교반하였다. 반응액을 CH2Cl2로 희석하고 5% HCl, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하여, 추가 정제 없이 사용된 무색 포말로서 중간체 메실레이트(4-((S)-3-메톡시-2-((2S,4S)-4-((메틸설포닐)옥시)-1-(페닐설포닐) 피롤리딘-2-카복스아미도)-3-옥소프로필)페닐 피롤리딘-1-카복실레이트)(270 mg, 정량)를 제공하였다. [α]D -13.5(CHCl3에서 c 1.0); δH(400 MHz, CDCl3) 1.81 (1 H, m), 1.89-1.96 (4 H, m), 2.63 (1 H, br d), 2.82 (3 H, s), 3.06-3.18 (2 H, m), 3.44 (2 H, t, J = 6.4 Hz), 3.50-3.55 (3 H, m), 3.68 (1 H, dt, J = 1.3, 12.5 Hz), 3.71 (3 H, s), 4.63 (1 H, dd, J = 2.0, 10.1 Hz), 4.73 (1 H, dd, J = 6.7, 13.4 Hz), 5.02 (1 H, tt, J = 1.4, 4.7 Hz), 7.07 (2 H, d, J = 8.6), 7.16 (2 H, d, J = 8.6 Hz), 7.39 (1 H, d, J = 7.5 Hz), 7.56 (2 H, t, J = 7.6 Hz), 7.64-7.68 (1 H, m), 7.81-7.84 (2 H, m); δC(100 MHz, CDCl3) 25.1, 25.9, 35.5, 37.4, 38.9, 46.5, 46.5, 52.5, 54.0, 55.4, 61.0, 78.0, 122.1 (2 C), 128.0 (2 C), 129.8 (2 C), 130.1 (2 C), 132.8, 134.1, 135.4, 150.7, 153.1, 169.8, 171.3; ν/cm-1 3409, 2954, 2880, 1715, 1678, 1511; HRMS (ESI+) m/z 646.1497(C27H33NaN3O10S2[M+Na]+는 646.1505를 요구함).
상기 메실레이트(97 mg, 0.16 mmol)를 DMSO(1.5 ㎖)에 용해시키고 NaN3(30.4 mg, 0.47 mmol)으로 처리하였고, 혼합물을 80℃에서 밤새 교반하였다. 반응액을 EtOAc로 희석하고 H2O 및 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 농축하여 아자이드(18)(82 mg, 92%)를 제공하였다. 분광학적 데이터는 화합물(18)에 대해 상기 보고된 분광학적 데이터와 일치하였다.
단계 10: 4-((R)-3-메톡시-3-옥소-2-((2S,4R)-4-(4-((3-옥소-1-페닐-2,8,11,14-테트라옥사-4-아자헵타데칸-17-일)카바모일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복스아미도)프로필)페닐 피롤리딘-1-카복실레이트(19)
아스코르브산나트륨(4.4 mg, 22.2 μmol), CuSO4(224 ㎕, 2.24 μmol, H2O 중의 0.01 M) 및 TBTA(281 ㎕, 2.81 μmol, THF 중의 0.01 M)를 DMF(1 ㎖) 중의 아자이드(18)(32 mg, 56.1 μmol)와 알킨(15)(25 mg, 61.8 μmol)의 혼합물에 순차적으로 첨가하였다. 반응액을 2시간 동안 60℃에서 교반한 후 EtOAc(20 ㎖)로 희석하였다. 유기층을 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(21:2:1:1 EtOAc/아세톤/MeOH/H2O)로 정제하여 무색 오일로서 트리아졸 생성물(19)(54 mg, 99%)을 제공하였다. [α]D +10.7(CHCl3에서 c 1.0); δH(400 MHz, CDCl3) 1.72-1.94 (8 H, m), 2.14 (1 H, dt, J = 12.8, 13.9 Hz), 2.54 (1 H, ddd, J = 2.3, 6.5, 12.9 Hz), 2.92 (1 H, dd, J = 10.0, 13.9 Hz), 3.29 (2 H, dd, J = 6.0, 12.3 Hz), 3.38 (1 H, dd, J = 4.8 Hz, 13.9 Hz), 3.41-3.63 (19 H, m), 3.80 (3 H, s), 3.83 (1 H, m), 4.29 (1 H, dd, J = 2.0, 8.7 Hz), 4.65 (1 H, m), 4.94 (1 H, dt, J = 4.9, 9.8 Hz), 5.06 (2 H, br s), 5.44 (1 H, br t, J = 5.7 Hz), 7.04 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 7.23 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 7.28-7.33 (5 H, m), 7.38-7.43 (2 H, m), 7.52 (2 H, t, J = 7.7 Hz), 7.62 (1 H, t, J = 7.5 Hz), 7.79 (2 H, d, J = 7.3 Hz), 8.18 (1 H, s); δC(100 MHz, CDCl3) 25.1, 25.9, 29.4, 29.5, 33.7, 37.2, 37.9, 39.4, 46.4, 46.6, 52.7, 53.2, 53.6, 57.9, 60.7, 66.5, 69.7, 69.7, 70.3, 70.5, 70.6, 70.7, 122.2 (2 C), 126.1, 127.7 (2 C), 128.1, 128.2, 128.5 (3 C), 129.7 (2 C), 130.3 (2 C), 133.1, 133.9, 135.5, 136.9, 143.2, 150.6, 153.3, 156.6, 159.8, 169.0, 171.5; ν/cm-1 3331, 2951, 2875, 1714, 1667, 1575, 1512; HRMS (ESI+) m/z 999.3891(C47H60NaN8O13S[M+Na]+는 999.3893을 요구함).
단계 11: (R)-2-((2S,4R)-4-(4-((3-(2-(2-(3-아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프로필)카바모일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복스아미도)-3-(4-((피롤리딘-1-카보닐)옥시)페닐)프로판산(21)
수성 NaOH(1.13 ㎖, 0.225 mmol, 0.2 M)을 EtOH/THF(2:1, 3 ㎖) 중의 메틸 에스테르(19)(110 mg, 0.113 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 1 M HCl로 켄칭하고 EtOAc로 희석하고 유기층을 분리하였다. 수층을 CHCl3로 2회 추출하고 모아진 유기층을 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하여 미정제 산(20)(100 mg)을 제공하였다. MeOH/H2O(5:1, 12 ㎖) 중의 미정제 산과 10% Pd/C(50 mg, 50% H2O)의 혼합물을 실온에서 2시간 동안 H2 대기 하에서 교반하였다. 셀라이트의 층을 통해 혼합물을 여과하고 감압 하에서 농축하였고, C18 역상 카트리지(100% H2O 내지 50% MeOH/H2O)를 사용하여 잔사를 정제하였다. 정제된 물질을 동결건조하여 무색 솜털 같은 분말로서 아민(21)(81.3 mg, 2 단계에 걸쳐 87%)을 제공하였다. [α]D -16.0(MeOH에서 c 0.49); δH(400 MHz, D2O) 1.81 (4 H, m), 1.91 (4 H, m), 2.38 (1 H, m), 2.98-3.09 (4 H, m), 3.21-3.30 (3 H, m), 3.30 (2 H, m), 3.45 (2 H, t, J = 6.8 Hz), 3.59-3.66 (12 H, m), 3.89 (1 H, d, J = 12.9 Hz), 4.04 (1 H, dd, J = 4.8, 12.9 Hz), 4.41 (1 H, t, J = 8.2 Hz), 4.53 (1 H, dd, J = 5.3, 7.4 Hz), 5.00 (1 H, br s), 6.99 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 7.306-7.356 (4 H, m), 7.43-7.50 (3 H, m), 7.99 (1 H, s); δC(100 MHz, 아세톤을 가진 D2O) 25.2, 25.8, 27.2, 29.1, 35.5, 36.9, 37.2, 38.3, 47.1, 47.1, 49.5, 55.1, 56.7, 60.4, 61.7, 68.9, 69.3, 70.1, 70.2, 70.3, 122.6 (2 C), 125.8, 127.5 (2 C), 130.2 (2 C), 131.2 (2 C), 134.5, 135.1, 135.6, 142.9, 150.4, 155.6, 161.9, 173.2, 175.8; ν/cm-1 3382, 3064, 2950, 2878, 1706, 1658, 1511; HRMS (ESI+) m/z 829.3550(C38H52N8O11S[M+H]+는 829.3549를 요구함).
단계 12: 5(6)-카복시테트라메틸 로다민 표지된 화합물 22
0.2 M NaHCO3(1 ㎖) 중의 아민(21)(9.5 mg, 11.3 μmol)의 혼합물을 5(6)-카복시테트라메틸 로다민 N-석신미딜 에스테르(NHS-로다민, Thermo Scientific)(8.9 mg, 16.9 μmol)로 처리하였고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 아세톤으로 켄칭하고 농축하였고, 잔사를 역상 크로마토그래피(50% MeOH/H2O 내지 100% MeOH)로 정제하여, 동결건조 후 자주색 분말로서 로다민 표지된 화합물 22(5.3 mg, 38%)을 제공하였다. 화합물 22를 위치이성질체들의 5:1 혼합물로서 단리하였다: δH(400 MHz, d4-메탄올) 주요 이성질체: 1.80-1.99 (9 H, m), 2.37 (1 H, dt, J = 6.6, 13.5 Hz), 2.70 (1 H, m), 3.08 (1 H, dd, J = 7.5, 13.9 Hz), 3.22-3.26 (1 H, m), 3.26 (6 H, s), 3.27 (6 H, s), 3.35 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.43 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.48-3.66 (17 H, m), 3.74 (1 H, dd, J = 3.7, 12.0 Hz), 3.91 (1 H, dd, J = 6.0, 12.0 Hz), 4.45 (1 H, t, J = 7.1 Hz), 4.61 (1 H, t, J = 5.6 Hz), 4.94 (1 H, m), 6.86 (2 H, br s), 6.95-6.99 (4 H, m), 7.16 (2 H, d, J = 9.5 Hz), 7.28 (2 H, d, J = 8.1 Hz), 7.35-7.42 (3 H, m), 7.51 (1 H, t, J = 7.3 Hz), 7.60-7.63 (2 H, m), 8.06-8.08 (2 H, m), 8.56 (1 H, s); δC(100 MHz, d4-메탄올) 주요 이성질체: 25.9, 26.7, 30.4, 36.6, 38.0, 38.1, 38.9, 40.9 (4 C), 47.47, 47.53, 55.9, 60.3, 62.3, 70.3, 70.5, 71.35, 71.4, 71.6 (2 C), 97.3 (2 C), 114.8 (2 C), 115.2 (2 C), 122.7 (4 C), 126.3, 128.6 (2 C), 130.0, 130.1, 130.5 (2 C), 131.1, 131.7 (4 C), 132.5 (2 C), 134.4 (2 C), 136.0, 137.2, 137.3, 138.1, 144.0, 151.6, 155.1, 158.7 (2 C), 159.0 (2 C), 161.6, 162.0, 168.7, 172.6; HRMS (ESI+) m/z 1241.4970(C63H72N10O15SH[M+H]+는 1241.4972를 요구함).
실시예 1C - R-BC154(화합물 25)의 제조
PEG-스페이서를 결여하는 화합물 25(R-BC154)도 하기 반응식 5에 나타낸 바와 같이 합성하였다:
Figure pct00084
따라서, NaOH를 사용한 메틸 에스테르(18)의 가수분해는 탈보호된 아지드 억제제(23)를 제공하였고, 그 후 상기 억제제를 CuSO4, 아스코르브산나트륨 및 TBTA의 존재 하에서 N-프로피닐 설포로다민 B(24)와 반응시켜, HPLC에 의한 정제 후 43% 수율로 형광 표지된 화합물 25(R-BC154)를 제공하였다(반응식 4).
예시로써, 본 출원인은 메틸 에스테르(18)로부터 출발하는, 형광 표지된 BOP 유도체(25)의 형성을 위한 실제 반응 조건을 제공한다.
단계 1: (S)-2-((2S,4R)-4-아지도-1-(페닐설포닐)피롤리딘-2-카복스아미도)-3-(4-((피롤리딘-1-카보닐)옥시)페닐)프로판산(23)
EtOH(10 ㎖) 중의 메틸 에스테르(18)(420 mg, 0.737 mmol)를 0.2 M NaOH(4.05 ㎖, 0.811 mmol)로 처리하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 EtOH를 제거하였고, 수층을 10% HCl로 산성화하였다. 수층을 CHCl3(4 x 10 ㎖)로 추출하였고, 모아진 유기층을 염수로 세척하고 건조하고(MgSO4) 감압 하에서 농축하였다. 미정제 물질을 플래쉬 크로마토그래피(0.5% AcOH를 가진 10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 엷은 황색 포말로서 산(23)(384 mg, 94%)을 제공하였다. [α]D -0.7 (CHCl3에서 c 1.00); δH(400 MHz, CDCl3) 1.67-1.73 (1 H, m), 1.89-1.96 (5 H, m), 3.10 (1 H, dd, J = 8.0, 13.8 Hz), 3.21 (1 H, dd, J = 4.0, 11.5 Hz), 3.38 (1 H, dd, J = 5.3, 14.0 Hz), 3.44-3.55 (5 H, m), 3.81 (1 H, m), 4.11 (1 H, t, J = 6.5 Hz), 4.89 (1 H, m), 7.05, 7.22 (4 H, 2 x d, J = 8.0 Hz), 7.41 (1 H, d, J = 6.8 Hz), 7.53-7.64 (3 H, m), 7.85 (2 H, d, J = 7.5 Hz); δC(100 MHz, CDCl3) 25.0, 25.8, 36.1, 36.8, 46.5, 46.6, 53.2, 53.9, 58.9, 61.2, 122.0 (2 C), 128.0 (2 C), 129.4 (2 C), 130.5 (2 C), 133.6, 133.7, 136.0, 150.5, 153.6, 170.9, 173.7; ν/cm-1 3329, 2977, 2881, 2105, 1706, 1672; HRMS (ESI+) m/z 557.1817(C25H29N7O6S[M+H]+는 557.1813을 요구함).
단계 2: R-BC154(25)
DMF(2 ㎖) 중의 아지드(23)(12 mg, 22 μmol) 및 N-프로피닐 설포로다민 B(24)(14 mg, 24 μmol)를 CuSO4(86 ㎕, 0.86 μmol, H2O 중의 0.01 M), 아스코르브산나트륨(430 ㎕, 4.3 μmol, H2O 중의 0.01 M) 및 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA)(108 ㎕, 1.08 μmol, DMF 중의 0.01 M)으로 처리하였다. 혼합물을 2시간 동안 60℃에서 교반하였는데, 이 시점에서 TLC는 신규 형광 생성물의 형성을 표시하였다. 상기 혼합물을 감압 하에서 농축하였고 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(0.5% AcOH를 가진 40:10:1 CHCl3/MeOH/H2O)로 부분적으로 정제하였다. 이 물질을 HPLC(15분에 걸쳐 50%-98% MeCN/H2O(0.1% TFA) 구배; Rt = 14.9분)로 더 정제하여 자주색 유리로서 순수한 화합물 25(10.6 mg, 43%)를 제공하였다. δH(400 MHz, d4-메탄올) 1.27-1.31 (12 H, dt, J = 7.0, 3.5 Hz), 1.91-1.98 (4 H, m), 2.29-2.35 (1 H, m), 2.71-2.78 (1 H, m), 3.08 (1 H, dd, J = 7.5, 13.8 Hz), 3.22 (1 H, dd, J = 5.3, 13.8 Hz), 3.41 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.54 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.63-3.70 (8 H, m), 3.85 (1 H, dd, J = 3.5, 12.0 Hz), 3.97 (1 H, dd, J = 5.6, 11.6 Hz), 4.21 (2 H, d, J = 1.4 Hz), 4.41 (1 H, t, J = 7.3 Hz), 4.72 (1 H, dd, J = 5.4, 7.5 Hz), 5.08 (1 H, m), 6.91 (2 H, t, J = 2.2 Hz), 6.98-7.04 (4 H, m), 7.11 (2 H, t, J = 9.0 Hz), 7.30 (2 H, d, J = 8.6 Hz), 7.40 (1 H, d, J = 8.0 Hz), 7.44 (2 H, t, J = 7.5 Hz), 7.58-7.68 (4 H, m), 8.00 (1 H, dd, J = 1.9, 8.0 Hz), 8.37 (1 H, d, J = 1.8 Hz); δC(100 MHz, d4-메탄올) 12.9 (4 C), 25.9, 26.7, 37.1, 37.6, 39.0, 46.8 (4 C), 47.5, 47.6, 54.8, 55.7, 60.3, 62.1, 97.0 (2 C), 115.0 (2 C), 115.26, 115.29, 122.9 (2 C), 123.9, 127.5, 128.6 (2 C), 129.3, 130.5 (2 C), 131.6 (2 C), 132.3, 133.8, 133.9, 134.4, 135.26, 135.34, 138.3, 144.1, 144.8, 146.9, 151.7, 155.2, 157.16, 157.17, 157.2, 157.8, 159.4, 173.1, 173.8; ν/cm-1 3088-3418, 2977, 2876, 1711, 1649, 1588; HRMS (ESI+) m/z 1174.3447(C55H61N9NaO13S3[M+Na]+은 1174.3443을 요구함). 시험관내 및 생체내 시험을 위해, 화합물 25의 유리산(11.7 mg, 9.97 μmol)을 0.01 M NaOH(997 ㎕, 9.97 μmol)에 용해시켰고, 0.45 ㎛ 주사기 필터 유닛을 통해 어두운 자주색 용액을 여과하였다. 생성물을 동결건조하여 솜털 같은 자주색 분말로서 화합물 25의 나트륨 염(11.6 mg, 99%)을 제공하였다.
실시예 2: 화합물 22 및 25(R-BC154)와 α 4 β 1 및 α 9 β 1 의 시험관내 결합 성질
전구세포(LSK 세포)의 분류된 집단에 대한 R-BC154 결합을 평가하기 위해, 비치료된 마우스 및 치료된(R-BC154; 10 mg kg-1) 마우스(군당 3마리 마우스)로부터 전체 골수를 채취하였다. 계통 칵테일(B220, Gr-1, Mac-1 및 Ter-119)을 사용하여 계통 양성 세포를 면역표지한 후, 제조사의 설명서에 따라 양 항-래트 접합된 다이나비즈(Dynabeads)(Invitrogen)를 사용한 면역자성 선택으로 제거하였다. 생성된 계통 고갈된 세포를 항-Sca-1-PB 및 항-c-kit-FITC로 염색하였다. 사이토페이아 인플럭스(Cytopeia Influx)(BD Biosciences) 세포 분류기를 이용하여 면역표지된 세포를 Sca-1+c-kit+에 대해 분류하고 올림푸스 BX51 현미경을 이용하여 영상화하였다.
생성된 α4β1 및 α9β1 과다발현 인간 교모세포종 LN18 세포주를 수중에 있는 형광 프로브 화합물 22 및 25(R-BC154)와 함께 사용하여 인테그린 의존적 세포 결합 성질을 평가하였다. 요약하건대, 인간 교모세포종 LN18 세포주의 레트로바이러스 형질도입을 통해 인테그린 α4β1 및 α9β1을 과다발현하는 안정한 LN18 세포를 생성하였다. 모 LN18 세포 및 α9β1 형질도입된 LN18 세포에서의 배경 α4 발현의 침묵을 α4 shRNA의 레트로바이러스 벡터 전달로 달성하였다(J Grassinger, et al Blood, 2009, 114, 49-59)(도 1 및 2 참조).
각각의 LN18 세포주를 생리학적 모방 조건(1 mM Ca2+/Mg2+) 하에서 화합물 22 및 R-BC154(25)로 처리하였을 때, 두 화합물들은 용량 의존적 방식으로 α4β1 및 α9β1 LN18 세포에 결합하는 것으로 확인되었다(도 3a 및 3b). 인테그린 발현을 결여하는 대조군 세포주에서는 사실상 결합이 관찰되지 않았는데, 이것은 결합이 인테그린 특이적이라는 것을 시사한다(도 3a 및 3b). PEG-연결된 화합물 22 및 R-BC154(25) 둘 다가 그들의 계산된 해리 상수(Kd)에 의해 확인되었을 때 α4β1 인테그린보다 더 큰 선택성으로 α9β1 인테그린에 결합하였다. 구체적으로, 화합물 22는 α4β1(Kd = 20.1 nM)보다 2.4배 더 큰 친화성으로 α9β1(Kd = 8.4 nM)에 결합하고, R-BC154는 Ca2+/Mg2+ 조건 하에서 α4β1(Kd = 38.0 nM)에 비해 α9β1(Kd = 12.7 nM)에 대한 3배 더 큰 친화성을 가진다(도 3a 및 3b).
흥미롭게도, 화합물 22와 비교되었을 때, R-BC154는 α4β1 및 α9β1 인테그린에 대한 결합 친화성의 각각 단지 1.9배 및 1.5배 감소와 관련되어 있었다.
이들 결과는 α4β1 및 α9β1 인테그린 둘 다가 이 클래스의 N-페닐설포닐 프롤린-기반 인테그린 길항제에 대한 프롤린 잔기의 4-위치에서 상당한 입체적 방해를 실제로 견딜 수 있다는 것을 암시한다. 이 관찰결과는 PEG 링커의 도입에 대한 최소한의 이점이 존재할 수 있다는 것을 시사한다.
α9β1/α4β1 인테그린에 대한 R-BC154의 놀라울 정도로 높은 친화성은 그의 결합 성질의 추가 조사를 촉진하였다. 많은 인테그린 리간드들처럼, R-BC154의 친화성 및 결합 동력학도 2가 금속 양이온에 의해 조절될 수 있는 인테그린의 활성화 상태에 의해 좌우된다. 예상된 바와 같이, 양이온의 부재 하에서 인테그린 결합은 관찰되지 않았다(도 4). 그러나, 보다 높은 친화성 결합 확인을 채택하기 위해 인테그린을 유도하는 것으로 공지된 조건인 1 mM Mn2+의 존재 하에서, α4β1 및 α9β1 과다발현 LN18 세포주들 둘 다에 대한 더 큰 전체 결합이 관찰되었다(도 3b 및 3c). 추가로, Mn2+ 활성화 하에서, Ca2+/Mg2+ 조건(Kd = 38.0 nM)과 비교되었을 때 α4β1에 대한 R-BC154의 결합 친화성의 3.1배 증가(Kd = 12.4 nM)가 관찰되었다(도 3b). Mn2+의 첨가에 의해 유도된 더 큰 전체 수준의 α9β1 인테그린 결합에도 불구하고, Ca2+/Mg2+ 조건(Kd = 각각 14.4 nM 대 12.7 nM)과 비교되었을 때 결합 친화성의 최소한의 변화가 분명하였다(도 3b).
R-BC154 결합의 동력학을 측정함으로써 α4β1 및 α9β1 인테그린의 생화학적 성질의 차이를 더 조사하였다. 결합 속도 측정은 α4β1 및 α9β1 인테그린 둘 다에 대한 R-BC154 결합이 Mn2+ 조건에 비해 Ca2+/Mg2+ 조건 하에서 더 빠르다는 것을 보여주었다(각각 도 5a 및 5b). 결합 속도 상수(kon)의 계산은 α4β1 인테그린에의 R-BC154 결합(kon = 0.094 nM-1 분-1)이 생리학적 조건 하에서 α9β1 결합(kon = 0.061 nM-1 분-1)보다 더 빠르다는 것을 보여주었다(표 3). 그럼에도 불구하고, α4β1(kon = 0.038 nM-1 분-1) 및 α9β1 인테그린(kon ~ 0.04 nM-1 분-1) 둘 다에 대한 유사한 kon 값이 Mn2+ 활성화 하에서 관찰되었다(표 3).
R-BC154 결합의 해리 속도 동력학을 해리 실험으로 측정하였다. Ca2+/Mg2+ 및 Mn2+ 상태 둘 다 하에서, R-BC154-α4β1 복합체에 대한 해리 속도(koff = 0.717 및 0.014 분-1)는 그의 α9β1(koff = 0.054 및 <0.01 분-1) 대응물에 비해 더 빨랐다(도 5c 및 표 3). 추가로, Mn2+의 존재 하에서 R-BC154와 α4β1 및 α9β1 인테그린의 결합에 대한 koff 값은 Ca2+/Mg2+ 조건에 비해 유의하게 더 느렸고, 이때 60% 초과의 R-BC154는 60분 후 여전히 결합되어 있었다(도 5c). 이들 조건 하에서 관찰된 더 느린 해리 속도는 Mn2+가 리간드 결합된 입체구조를 안정화시키는 작용을 한다는 것을 암시하고 방사성표지된 기질을 사용한 종래 보고와 일치한다. 따라서, Ca2+/Mg2+ 조건의 사용 시 더 빠른 결합 속도 및 해리 속도가 관찰되는 반면, Mn2+ 활성화는 α4β1 및 α9β1 인테그린 결합에 대한 더 느린 결합 속도 및 해리 속도와 관련되어 있다. 결과적으로, Mn2+ 활성화 하에서 과도하게 느린 해리 속도가 훨씬 더 긴 항온처리 시간을 요구할 것이기 때문에, Ca2+/Mg2+ 조건 하에서 소분자 인테그린 억제제의 시험관내 스크리닝을 위해 R-BC154를 사용하는 경쟁 억제 어세이가 바람직하다.
이들 결과는 α4β1 인테그린이 α9β1에 비해 이 클래스의 N-페닐설포닐 프롤린-기반 길항제에 약간 더 빠르게 결합하지만, α9β1 인테그린에 대한 더 연장된 결합이 관찰된다는 것을 암시한다(표 3). 따라서, 생리학적으로 적절한 조건 하에서, 이 클래스의 이중 α9β1/α4β1 인테그린 억제제는 α4β1 인테그린에 대해 관찰된 더 높은 결합 속도에도 불구하고 α9β1에 대한 그들의 유의하게 더 느린 해리 속도 때문에 생체내에서 α9β1 인테그린 의존적 상호작용에 대한 더 큰 영향을 이끌어낼 것으로 예상된다.
Figure pct00085
실시예 3: 화합물 25(R-BC154)와 골수 HSC 및 전구세포의 생체내 결합
시험관내 결합 데이터는 R-BC154가 고친화성 α4β1 및 α9β1 인테그린 길항제이고 그의 결합 활성이 인테그린 활성화에 매우 의존한다는 것을 입증하였다. 이 실시예는 R-BC154가 소정의 HSC 집단에 대한 α9β1/α4β1 인테그린 활성을 조사하기 위한 생체내 결합 실험에서 사용될 수 있는지를 시험한다. 현재까지, HSC에 대한 인테그린 활성의 평가는 형광 표지된 항체를 사용하는 골수 세포 또는 정제된 HSC의 시험관내 또는 생체외 염색에 주로 의존하였다. 생체외 염색은 HSC에 의한 인테그린 발현의 확인을 제공하는 반면, 골수 내에서 그들의 천연 상태에서 인테그린 활성화의 연구는 생체내 결합 실험을 통해서만 결정될 수 있는데, 이는 복잡한 골수 미세환경이 시험관내에서 적절하게 재구성될 수 없기 때문이다.
R-BC154 및 이 클래스의 N-페닐설포닐 프롤린계 펩티도미메틱(peptidomimetics)이 HSC에 직접적으로 결합할 수 있는지를 평가하기 위해, R-BC154(10 mg kg-1)를 마우스 내로 정맥내 주사하였고, 다중-색채 유세포측정을 이용하여 표현형적으로 정의된 골수 전구세포(LSK 세포; 계통-Sca-1+c-Kit+) 및 HSC(LSKSLAM 세포; LSKCD48-CD150+)의 R-BC154 표지부착에 대해 분석하였다(도 6a 및 6b). R-BC154 결합의 결과로서 증가된 세포 관련 형광은 주사를 제공받지 않은 마우스로부터의 골수에 비해 R-BC154 주사를 제공받은 마우스로부터 단리된 전구세포 및 HSC 집단 둘 다에서 관찰되었다. 나아가, 생체내 R-BC154 결합도 전구세포(계통-Sca-1+c-Kit+)의 정제된 집단에 대한 형광 현미경관찰로 확인하였다(도 6c 및 6d). R-BC154로 표지된 전구세포는 형광 할로를 나타내었는데, 이것은 R-BC154 결합이 인테그린 결합과 마찬가지로 주로 세포 표면에서 일어났다는 것을 시사한다. 생체내 결합 결과는 이 클래스의 α9β1/α4β1 인테그린 길항제가 뮤린 골수 내의 단핵 세포의 각각 단지 0.2% 및 0.002%만을 차지하는 매우 드문 조혈 전구세포 및 HSC 집단에 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
α4β1 및 α9β1 인테그린은 VCAM-1 및 Opn에의 결합을 통해 골수 내의 HSC 정착의 중요한 조절제인 것으로 인식된다(J. Grassinger et al, Blood, 2009, 114, 49-59). BOP는 나노몰 억제 효능으로 시험관내에서 α9β1 및 α4β1 인테그린과 VCAM-1 및 Opn 둘 다의 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌다. R-BC154를 사용한 이들 생체내 결합 결과는 HSC에 의해 발현된 α4β1 및 α9β1 인테그린이 제자리에서 활성 결합 입체구조로 존재한다는 것을 시사한다. 이것은 소분자 α9β1/α4β1 인테그린 길항제, 예컨대, 화합물 22 및 25가 골수 HSC에 직접적으로 결합할뿐만 아니라 α9β1/α4β1 의존적 부착 상호작용을 억제할 수도 있고 이하에 나타낸 바와 같이 말초 순환계 내로의 골수 HSC의 동원을 유도하기 위한 효과적인 물질로서 잠재적으로 작용한다는 것을 암시한다.
실시예 4: R-BC154는 시험관내에서 마우스 및 인간 조혈 전구세포에 우선적으로 결합한다.
R-BC154(도 7a)가 시험관내에서 고친화성 인테그린 결합을 위해 요구되는 입체구조적 변화를 유도하는 작용을 하는 2가 금속 양이온, 예컨대, Ca2+, Mg2+ 또는 Mn2+의 존재 하에서만 인간 α9β1 및 α4β1 인테그린을 과다발현하는 인간 교모세포종 LN18 세포(도 7b)에 결합한다는 것이 상기 실시예에서 밝혀졌다. 인테그린 활성화가 중추 및 골내막 BM 전구세포(Lin-Sca-1+ckit+ 세포; LSK) 및 HSC(LSKCD150+CD48- 세포; LSKSLAM)에의 결합을 위해 요구되는지를 확인하기 위해(도 7c), R-BC154 결합을 1 mM Ca2+/Mg2+의 존재 하에서 평가하였다(도 7d). 이들 조건 하에서, 그들의 골내막 대응물들에 비해 중추 LSK 및 LSKSLAM에의 더 큰 결합이 관찰되었다(p<0.005)(도 7e). EDTA를 사용한 공-처리에 의한 표면 인테그린의 탈활성화는 활성을 완전히 제거하였는데, 이것은 R-BC154와 HSC 및 전구세포의 효율적인 결합을 위한 인테그린 활성화의 요구를 입증한다(도 7e). 활성화 양이온 및 EDTA 둘 다의 부재 하에서, R-BC154와 골내막 LSK 세포의 결합은 여전히 분명하였으나 중추 LSK와의 결합은 그러하지 않았다(도 7f). 이들 결과는 골내막 BM으로부터 단리된 HSC 및 전구세포에 의해 발현된 인테그린이 채취 시 활성화된 상태로 유지된다는 것을 암시한다.
인테그린 α4β1이 모든 백혈구들 상에서 편재적으로 발현되고 α9β1이 호중구 상에서 널리 발현되는 것으로 공지되어 있기 때문에, R-BC154와 계통-위탁 조혈 세포의 결합을 평가하였다. 활성화 의존적 결합이 외인성 활성화 하에서 중추 및 골내막 BM 영역 둘 다로부터 단리된 모든 계통 위탁 림프(B220+ 및 CD3+) 및 골수(Gr1/Mac1+) 자손 상에서 관찰되었다는 것을 확인하였다(도 8). 그러나, 이 결합은 LSKSLAM(p<0.0001) 및 LSK(p<0.0001) 세포에 비해 유의하게 더 낮았다(도 7g). HSC 및 전구세포에의 결합이 α4β1 및 α9β1 인테그린 의존적인지를 확인하기 위해, 조혈 세포(α4 flox/floxα9 flox/flox vav-cre 마우스)에서 α4 및 α9 인테그린을 결여한 BM 세포를 R-BC154로 처리하였다. 결합은 LSK(p<0.005) 및 LSKSLAM(p<0.005) α4 -/-/α9 -/- 세포 상에 본질적으로 부재하였는데, 이것은 R-BC154 활성을 위한 이들 2개의 인테그린들의 요구를 확인시켜준다(도 7h).
인간 제대혈 단핵 세포(MNC) 상에서의 R-BC154의 2가 양이온 및 용량 의존적 결합도 확인되었다(도 7i). 활성화 조건 하에서, CD34+CD38+ 전구세포에 비해 더 낮은 정도이기는 하지만, 계통-위탁 CD34- 세포에 비해 더 높은 결합이 줄기 세포 풍부 CD34+CD38- 세포 상에서 관찰되었다(도 7i 및 7k). 이들 결과는 R-BC154와 뮤린 및 인간 조혈 세포의 결합이 2가 금속 양이온 의존적이고 시험관내에서 외인성 활성화 하에서 HSC에 비해 조혈 전구세포 쪽으로 편향되어 있다는 것을 보여준다.
실시예 5 - R-BC154는 제자리에서( in situ) 골내막 니치 내의 내재적으로 활성화된 α 4 / α 9 인테그린을 통해 HSC 및 전구세포를 표적화한다.
인테그린은 다수의 활성화 상태로 존재하고, 줄기 세포 니치에 의한 그들의 조절은 복잡하고 시험관내에서 정확히 모방될 수 없거나 재현될 수 없다. BM 내의 HSC 및 전구세포에 의해 발현된 α9β1/α4β1 인테그린이 제자리에서 내재적으로 및 차등적으로 활성화되는지를 평가하기 위해, LSKSLAM에 대한 면역표지부착 전에 R-BC154를 C57Bl/6 마우스에게 주사하였다. 중추 및 골내막 BM 영역 둘 다로부터의 LSK 세포를 정맥내 투여 후 R-BC154로 효과적으로 표지하였다(도 9a). 그러나, 골내막 BM 내의 LSK 및 LSKSLAM 세포 둘 다가 그들의 중추 BM 대응물들에 비해 더 큰 비율의 R-BC154hi 세포를 나타내었고(도 9b) 활성화 2가 금속 양이온의 부재 하에서 수행된 시험관내 실험과 일치한다(도 7f 참조). 림프(B220+ 및 CD3+) 및 골수(Gr1+ 및 Mac1+) 자손도 골내막 BM 내에서 더 큰 비율의 R-BC154hi 세포를 나타내었는데, 이것은 향상된 인테그린 활성화가 원시 조혈 집단으로 제한되지 않는다는 것을 암시한다(도 9c). α4 -/-/α9 -/- LSK 세포 상에서 R-BC154의 결합은 분명하지 않았는데, 이것은 생체내 활성을 위한 α4 및 α9 인테그린의 요구를 확인시켜준다(도 9d). 이들 데이터는 α9β1/α4β1 인테그린이 요구될 뿐만 아니라, 제자리에서 골내막 BM 영역 내의 세포 상에서도 내재적으로 및 차등적으로 활성화된다는 것을 암시한다.
실시예 6 - 소분자 α 9 β 1 /α 4 β 1 인테그린 길항제는 HSC 및 전구세포를 신속히 동원시킨다.
예컨대, 문헌(Herbert, K. E., et al Biol Blood Marrow Tr 14, 603-621, (2008))에 기재된 바와 같이 PB 내로의 HSC의 이탈을 유도하는 능력 면에서 신규 동원제를 평가하는 여러 뮤린 어세이들이 존재한다. 정상 PB에서 LSK 및 LSKSLAM 세포가 순환 WBC의 각각 약 0.005% 약 0.0005%만을 구성할지라도, PB로부터의 분류된 LSK 및 LSKSLAM은 콜로니 형성 세포(CFC)를 발생시킴으로써 조혈 재구성 능력을 가질 수 있는 세포를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, PB에서의 LSK 및 LSKSLAM 함량의 측정은 처음에 줄기 세포 및 전구세포 함량의 대용 척도로서 사용되었다.
먼저, 정맥내 투여 후 R-BC154의 신속한 제거(<5분)는 다른 투여 방식의 평가, 및 피하 주사가 생체내에서 지속된 결합 활성을 제공함으로써 가장 큰 동원 효율을 허용할지에 대한 평가를 촉진하였다. 정맥내 주사와 대조적으로, BM LSK에의 지속적인 결합은 피하 치료 후 30분에서 관찰되었다(도 9e). 최소한의 결합이 PB 내의 LSK 상에서 그의 BM 대응물에 비해 관찰되었는데, 이것은 효과적인 활성화 및 인테그린 의존적 결합을 위한 줄기 세포 니치의 요구의 추가 증거를 제공한다(도 9e). 그럼에도 불구하고, R-BC154로 치료받은 마우스는 PB 내의 WBC, LSK 또는 LSKSLAM 수의 유의한 증가를 제공하는 것으로 확인되지 않았다(도 10). 비-형광 표지된 BOP(2)를 사용하여 α9β1/α4β1 인테그린 억제제를 사용한 HSC 동원을 더 조사하였다(도 11a). BOP는 R-BC154 및 과다발현 LN18 세포주를 사용한 경쟁 억제 어세이에 근거할 때 α9β1 및 α4β1 인테그린의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌고(도 11b) VCAM-1 및 쓰롬빈-절단된 Opn에의 인테그린 의존적 부착을 억제할 수 있다. 추가로, BOP는 활성화 조건 하에서 LSK 및 LSKSLAM에 결합하는 R-BC154의 경쟁적 치환에 의해 입증된 바와 같이 HSC 및 전구세포 상에서의 α9β1 및 α4β1 인테그린 결합을 효과적으로 억제하였다(도 11c). 최대 90분 동안 C57BL/6 마우스 내로의 BOP(10 mg/kg)의 투여는 식염수 대조군에 비해 PB WBC(도 11d), LSK(도 11e) 및 LSKSLAM(도 11f)의 유의한 증가를 제공하였다. R-BC154와 달리, BOP의 사용 시 추정컨대 그의 더 높은 결합 친화성 및 더 느린 해리 속도로 인해 더 크고 더 오래 지속된 동원이 관찰되었다.
HSC는 αvβ3, αLβ2, α2β1, α5β1, α6β1, α4β1 및 α9β1을 포함하는 여러 인테그린 하위유형들(이들 중 대다수는 BM 내에서의 HSC 체류와 관련되어 있음)을 발현하는 것으로 공지되어 있다. 상기 실시예들에서, 소분자 길항제 BOP를 사용한 α9β1/α4β1 인테그린의 억제가 VCAM-1 및 Opn에의 인테그린 의존적 결합의 억제를 통해 장기간 재증식 HSC의 신속한 동원을 유도한다는 것을 보여주기 위한 증거가 제공되어 있다.
종래 연구는 중화 항체 또는 소분자 억제제에 의한 인테그린 α4β1 및 VCAM-1 상호작용의 억제가 마우스 및 영장류 둘 다에서 HSC를 동원시지만, BM 내에서 이들 표적 세포의 동원 및 위치를 위해 표적화되는 특정 세포 유형이 아직 조사되어야 한다는 것을 확인시켜주었다. 2가 금속 양이온에 의해 활성화되었을 때에만 α4β1 및 α9β1 인테그린에 결합하는 형광 소분자 인테그린 길항제(R-BC154)를 사용하여, 뮤린 및 인간 HSC 상의 이들 두 β1 인테그린들의 활성화 상태가 생체내 골내막 니치에 의해 내재적으로 활성화되고 차등적으로 특정된다는 것을 처음으로 밝혔다.
줄기 세포 니치의 개념이 1978년 쇼필드(Schofield)에 의해 최초로 추정되었기 때문에 골내막 BM의 기능적 특성은 철저히 조사되었다. 이러한 연구는 세포 성분들, 예컨대, 조골세포 및 그들의 관련 세포외 매트릭스 단백질들이 HSC 유지 및 기능의 중요한 니치 특이적 조절제인 저산소성 환경으로서 골내막 니치를 강조하였다. 이들 실시예들은 HSC 및 전구세포를 포함하는 골내막 니치 내의 BM 세포가 중추 골수 구획 내에서 관찰된 친화성 결합 상태보다 더 높은 친화성 결합 상태로 존재하는 α9β1/α4β1 인테그린을 발현한다는 것을 보여준다. 이 차등적 인테그린 활성의 생리학적 관련성이 비공지된 상태로 남아있지만, 이들 관찰결과는 쓰롬빈-절단된 Opn(trOpn)과 α4β1 및 α9β1 인테그린 사이의 HSC 의존적 결합이 골내막 골수로 제한된다는 종래 보고와 일치한다.
골내막에 의한 인테그린의 향상된 활성화는 원시 HSC 및 전구세포에 특이적이지 않았고 α9β1 및 α4β1 인테그린으로만 제한될 것 같지 않다. 이론에 의해 한정되지 않지만, 골내막 BM 내에서 관찰된 향상된 인테그린 활성화에 대한 한 가능한 설명은 골에의 그의 가까운 인접성이다. 그의 높은 미네랄 함량을 기준으로 다른 미세환경 세포와 식별될 수 있는 골은 칼슘 및 마그네슘뿐만 아니라 미량 금속, 예컨대, 망간(이들 모두가 고친화성 리간드-결합 입체구조를 채택하기 위해 α9β1 및 α4β1 인테그린을 유도하는 것으로 공지되어 있음)의 무기 염의 일차 저장 부위이다. 따라서, 골내막 표면으로부터 나오는 Ca2+(및 아마도 Mg2+ 및 Mn2+)의 높은 이온 구배가 관찰된 향상된 인테그린 결합 활성의 원인이라는 것은 여전히 타당한 듯하다. 실제로, 이 개념은 G 단백질-커플링된 칼슘-감작 수용체(CaR)를 통한 세포외 Ca2+의 인식을 통해 골내막 BM 내의 HSC의 우선적 편재화를 합리화하는 데 이미 적용되었다. 총체적으로, 이들 관찰결과는 골내막 니치의 독특한 성질, 즉 골내막 니치가 외관상 표현형적으로 동일한 세포에게 부여하는 차등적 영향을 더 정의하고 줄기 세포 요법을 위한 줄기 세포 니치의 치료적 표적화의 입증을 제공한다.
요약하건대, α4β1 및 α9β1 인테그린의 소분자 억제제인 BOP는 장기간 다중-계통 생착력을 가진 HSC를 효과적으로 신속히 동원시켰다는 것이 입증된다.
본 발명의 상기 작성된 설명은 통상의 기술을 가진 자가 그의 가장 우수한 방식인 것으로 현재 간주되는 것을 만들고 사용할 수 있게 하지만, 통상의 기술을 가진 자는 본원의 특정 실시양태, 방법 및 실시예의 변경, 조합 및 등가물의 존재를 이해하고 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 전술된 실시양태, 방법 및 실시예에 의해 한정되는 것이 아니라, 본원에 넓게 기재된 본 발명의 범위 및 사상 내의 모든 실시양태들 및 방법들에 의해 한정되어야 한다.
참고문헌
Figure pct00086

Claims (71)

  1. 생체내에서 또는 생체외에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 방법으로서, 유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 BM 줄기 세포 니치(niche)에 생체내 또는 생체외 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 추가적으로 BM 줄기 세포 니치로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 방출을 향상시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가적으로 BM 줄기 세포 니치로부터의 HSC의 동원을 향상시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린이 α9β1 인테그린 또는 이의 활성 부분인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, α4 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, α4 인테그린이 α4β1 또는 이의 활성 부분의 길항제인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 α9 및 α4와 교차-반응하고, 임의적으로 α9β1 및 α4β1과 교차-반응하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 하기 화학식을 가진 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00087

    상기 식에서,
    X는 결합 및 -SO2-로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R3은 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R4는 H 및 -OR6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R5는 H 및 -OR7로 구성된 군으로부터 선택되고;
    단, R4가 H일 때 R5는 -OR7이고, R4가 -OR6일 때 R5는 H이고;
    R6은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R8, -C(O)R9 및 -C(O)NR10R11로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R8은 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R9는 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R10 및 R11은 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
    R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
  9. 제8항에 있어서, R4가 H이고; R5가 -OR7인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    R7이 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R12가 C1-C4 알킬, -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13이 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R14 및 R15가 C1-C4 알킬, 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
    R14 및 R15가 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    n이 1 또는 2인 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    R7이 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R12가 C1-C4 알킬, -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 5-테트라졸릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13이 2-피롤릴이고;
    R14 및 R15가 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이거나,
    R14 및 R15가 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 피롤리디닐 또는 모르폴리닐 고리를 형성하고;
    n이 1 또는 2인 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00088
    .
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 임의적으로 치환된 페닐인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 페닐이 적어도 하나의 할로겐 기로 임의적으로 치환되는 것인 방법.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00089
    .
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00090
    .
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제를 G-CSF의 부재 하에 투여하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린 길항제를 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 경피, 경점막 또는 복강내로 투여하고; 임의적으로 길항제를 정맥내 또는 피하 투여하는 것인 방법.
  19. 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린 길항제를 α4 인테그린 길항제와 동시적으로, 연속적으로 또는 조합하여 투여하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 골수로부터 유래하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, HSC가 줄기 세포 니치, 임의적으로 골수의 중추 또는 골내막 니치로부터 유래하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 CD34+ 세포, CD38+ 세포, CD90+ 세포, CD133+ 세포, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁(lineage-committed) CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택된 골내막 전구세포인 방법.
  23. BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC의 이탈을 향상시키는 조성물로서, α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 추가적으로 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC의 방출을 향상시키는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 추가적으로 BM 줄기 세포 니치로부터 PB로의 HSC의 동원을 향상시키는 조성물.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린이 α9β1 인테그린 또는 이의 활성 부분인 조성물.
  27. 제23항 또는 제26항에 있어서, α4 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 추가로 포함하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, α4 인테그린이 α4β1 또는 이의 활성 부분의 길항제인 조성물.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 α9 및 α4와 교차-반응하고, 임의적으로 α9β1 및 α4β1과 교차-반응하는 것인 조성물.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린 길항제가 하기 화학식을 가진 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 조성물:
    Figure pct00091

    상기 식에서,
    X는 결합 및 -SO2-로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R3은 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R4는 H 및 -OR6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R5는 H 및 -OR7로 구성된 군으로부터 선택되고;
    단, R4가 H일 때 R5는 -OR7이고, R4가 -OR6일 때 R5는 H이고;
    R6은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R8, -C(O)R9 및 -C(O)NR10R11로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R8은 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R9는 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R10 및 R11은 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
    R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
  31. 제30항에 있어서, R4가 H이고; R5가 -OR7인 조성물.
  32. 제23항 또는 제31항에 있어서,
    R7이 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R12가 -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13이 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R14 및 R15가 C1-C4 알킬, 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
    R14 및 R15가 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    n이 1 또는 2인 조성물.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    R7이 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R12가 C1-C4 알킬, -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 5-테트라졸릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13이 2-피롤릴이고;
    R14 및 R15가 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이거나,
    R14 및 R15가 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 피롤리디닐 또는 모르폴리닐 고리를 형성하고;
    n이 1 또는 2인 조성물.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 조성물:
    Figure pct00092
    .
  35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 임의적으로 치환된 페닐인 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 페닐이 적어도 하나의 할로겐 기로 임의적으로 치환되는 것인 조성물.
  37. 제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 조성물:
    Figure pct00093
    .
  38. 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 조성물:
    Figure pct00094
    .
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, G-CSF의 부재 하에 투여되기 위한 조성물.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 경피, 경점막 또는 복강내로 투여되기 위한 것이고, 임의적으로 정맥내 또는 피하 투여되는 조성물.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린 길항제가 α4 인테그린 길항제와 동시적으로, 연속적으로 또는 조합되어 투여되는 것인 조성물.
  42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 골수로부터 유래하는 것인 조성물.
  43. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 줄기 세포 니치, 임의적으로 골수의 중추 또는 골내막 니치로부터 유래하는 것인 조성물.
  44. 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 CD34+ 세포, CD38+ 세포, CD90+ 세포, CD133+ 세포, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁 CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택된 골내막 전구세포인 조성물.
  45. 대상체로부터 HSC를 채취하는 방법으로서,
    유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 대상체에게 투여하는 단계로서, 이때 상기 유효량이 BM 줄기 세포 니치에서 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터의 HSC 및 이의 전구체 및 이의 전구세포의 이탈을 향상시키는 것인 단계;
    이탈된 HSC를 PB로 동원시키는 단계; 및
    PB로부터 HSC를 채취하는 단계
    를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, α9 인테그린 길항제를 G-CSF의 부재 하에 투여하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, HSC가 다른 HSC 동원제, 예컨대, 인터류킨-17, 사이클로포스파마이드(Cy), 도세탁셀 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)(그러나, 이들로 한정되지 않음)의 사용에 의해 추가로 동원되는 것인 방법.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, 유효량의 인테그린 길항제가 25 내지 1000 ㎍/kg 체중, 보다 바람직하게는 50 내지 500 ㎍/kg 체중, 가장 바람직하게는 50 내지 250 ㎍/kg 체중의 범위 내에 있는 것인 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 수득된 HSC를 포함하는 세포 조성물.
  50. 혈액학적 장애를 치료하는 방법으로서, 제23항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 세포 조성물 또는 제49항에 따른 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 대상체에서 혈액학적 장애를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 α9 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 대상체에게 투여하여 BM으로부터 PB로의 HSC의 이탈, 방출 또는 동원을 향상시키는 단계를 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, α9 인테그린이 α9β1 인테그린 또는 이의 활성 부분인 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, α4 인테그린 또는 이의 활성 부분의 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, α4 인테그린이 α4β1 또는 이의 활성 부분의 길항제인 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 α9 및 α4와 교차-반응하고, 임의적으로 α9β1 및 α4β1과 교차-반응하는 것인 방법.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 하기 화학식을 가진 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00095

    상기 식에서,
    X는 결합 및 -SO2-로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R1은 H, 알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R2는 H 및 치환기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R3은 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R4는 H 및 -OR6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R5는 H 및 -OR7로 구성된 군으로부터 선택되고;
    단, R4가 H일 때 R5는 -OR7이고, R4가 -OR6일 때 R5는 H이고;
    R6은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R8, -C(O)R9 및 -C(O)NR10R11로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R7은 H, C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R8은 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R9는 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R10 및 R11은 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    R12는 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, -O(C1-C4 알킬), -C(O)-(C1-C4 알킬), -C(O)O-(C1-C4 알킬) 및 -CN으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13은 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R14 및 R15는 C1-C4 알킬 및 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
    R14 및 R15는 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    n은 각각의 경우 1 내지 3의 범위 내의 정수이다.
  57. 제56항에 있어서, R4가 H이고; R5가 -OR7인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서,
    R7이 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R12가 -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13이 임의적으로 치환된 사이클로알킬, 임의적으로 치환된 아릴 및 임의적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R14 및 R15가 C1-C4 알킬, 임의적으로 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
    R14 및 R15가 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
    n이 1 또는 2인 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    R7이 C1-C4 알킬, -(CH2)n-R12, -C(O)R13 및 -C(O)NR14R15로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R12가 C1-C4 알킬, -CN, -O(C1-C4 알킬) 및 5-테트라졸릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R13이 2-피롤릴이고;
    R14 및 R15가 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이거나,
    R14 및 R15가 이들이 부착된 질소와 함께 임의적으로 치환된 피롤리디닐 또는 모르폴리닐 고리를 형성하고;
    n이 1 또는 2인 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00096
    .
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 임의적으로 치환된 페닐인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 페닐이 적어도 하나의 할로겐 기로 임의적으로 치환되는 것인 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00097
    .
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00098
    .
  65. 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제를 G-CSF의 부재 하에 투여하는 것인 방법.
  66. 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린 길항제를 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 경피 또는 경점막으로 투여하고; 임의적으로 상기 길항제를 정맥내 또는 피하 투여하는 것인 방법.
  67. 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, α9 인테그린 길항제를 α4 인테그린 길항제와 동시적으로, 연속적으로 또는 조합하여 투여하는 것인 방법.
  68. 제51항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액학적 장애가 면역억제, 만성 병, 외상성 손상, 퇴행성 질환, 감염 또는 이들의 조합; 피부, 소화계, 신경계, 림프계, 심혈관계, 내분비계 또는 이들의 조합의 질환 또는 병태; 골다공증, 알츠하이머병, 심근 경색, 파킨슨병, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 간 경변증 또는 이들의 조합; 신경모세포종, 골수이형성증, 골수섬유증, 유방암, 신장 세포 암종 또는 다발성 골수종; 조혈 신생물성 장애; 자가면역 질환; 또는 비-악성 장애를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 혈액학적 장애가 B-계통 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 T-계통 ALL을 포함하는 군으로부터 선택된 ALL, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 모발 세포 백혈병(HLL) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM)인 방법.
  70. HSC를 환자 내로 이식하는 방법으로서,
    α9 인테그린 길항제를 대상체에게 투여하여 BM 줄기 세포 결합 리간드로부터 HSC를 이탈시키는 단계;
    HSC를 BM으로부터 PB로 방출 및 동원시키는 단계;
    대상체의 PB로부터 HSC를 채취하는 단계; 및
    HSC를 환자에게 이식하는 단계
    를 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, HSC가 골내막 전구세포이고 CD34+, CD38+, CD90+, CD133+, CD34+CD38- 세포, 계통-위탁 CD34- 세포 또는 CD34+CD38+ 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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