KR20170103920A - 위장관, 대사성 및/또는 기타 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 박테리아-함유 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 L-라이신을 부티르산 및/또는 프룩토오스-라이신을 부티레이트로 전환시킬 수 있는 신규한 인간 장내 분리체에 관한 것이다. 신규한 분리체는 위장관에서 부티테이트의 생산을 촉진하기 위한 프로바이오틱 또는 보충제로 사용될 수 있으며, 부티레이트의 생산으로부터 이익을 얻는 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 또한, 분리체는 위장관 내 병원성 박테리아 과다에 의해 유발되는, L-라이신 또는 프룩토오스-라이신 또는 고급 당화 최종 산물(advanced glycation end products)에 의해 매개되는 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 박테리아를 포함하는 장내 미생물, 대사성 전환 및 약학, 식품 또는 사료 조성물 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 L-라이신을 부티레이트로 전환시킬 수 있고, 또한, 당화된 라이신을 부티레이트로 더 전환시킬 수 있는, 인간으로부터 분리된 새로운 장내 박테리아성 균주, 즉, 인간 장내 분리체(intestinal isolate)를 제공한다. 상기 장내 박테리아성 균주를 포함하는 조성물 및 상기 장내 박테리아성 균주를 이용하는 방법이 또한 제공된다.
인간의 위장관에는 소위 '위장관 미생물(GI microbiota)'을 형성하는 100 조 개 이상의 미생물(박테리아, 고세균, 진균 및 바이러스)이 서식한다. 위장관 미생물은 숙주에 의해 식이로 섭취되거나 점액, 항체 또는 소화 효소와 같은 숙주 자체에 의해 생성되는 발효용 기질을 통해 숙주(예를 들어, 인간)로부터 이익을 얻는다. 숙주에서 위장관 미생물은 숙주에 의해 사용되는 짧은 사슬 지방산(SCFA)으로 기질을 발효시키고, 바람직하지 않은 화합물을 해독하고, 면역계를 훈련시키고, 장 세포의 성장(예를 들어, 장 상피세포)을 촉진시키며, 유해한 병원성 박테리아의 성장을 막고, 장의 발달을 조절하며, 비오틴 및 비타민 K 등 숙주를 위한 비타민을 생산하고, 지방을 저장하기 위해 숙주를 유도하는 호르몬을 생산하며, 결장(colonic)의 pH를 낮추고, 물 및 나트륨 흡수를 촉진시키면서 위장관 및 대사의 건강을 촉진한다. 위장관은 간, 지방 조직 및 뇌와 같은 신체의 다른 기관과 긴밀한 상호 작용을 하면서 위장관 미생물이 숙주의 건강에 미치는 영향을 보여준다. 더욱이, 위장관 미생물이 식이 요법에 의해 강력한 영향을 받기 때문에 식이 전환(dietary conversions)에서 위장관 미생물의 역할이 매우 중요하다. 위장관 미생물 군의 구성은 개인마다 다르며 식이 요법과는 별도로 유전자, 연령, 항생제 사용 등 다양한 요인에 의해 영향을 받는다(Salonen and de Vos. Annu Rev Food Sci Technol. 2014; 5 : 239-62).
위장관 미생물의 변이는 병원성 박테리아 종의 증식을 유발할 수 있으며 그 결과 유익한 박테리아 종의 수를 넘어설 수 있다. 유익한 박테리아 종은 중요 영양소와 비타민의 생성, 장 세포의 성장과 보존의 촉진, 병원성 박테리아에 대한 방어를 통한 면역 증진 촉진 등과 같은 일련의 유익한 효과와 관련된다. 장내 균주의 잘 알려진 유익한 기능은 소위 부티로제닉(butyrogenic) 박테리아라 불리는 균주에 의해 SCFA, 부티레이트 또는 부티르산 중 하나를 생산하는 것이다. 장 수준에서, 부티레이트는 상피 유체를 전달하는 조절 역할을 하고, 점막의 염증 및 산화 상태를 완화시키며, 상피의 방어 장벽을 강화시키고, 내장의 감수성 및 장 운동성을 조절한다. 또한, 대장암의 예방 및 억제에서 부티레이트의 역할에 관한 연구가 점점 증가하고 있는 추세이다. 부티레이트는 전신 수준에서 이상혈색소 병증(hemoglobinopathies) 및 고 콜레스테롤 혈증, 인슐린 저항성 및 허혈성 뇌졸중과 같은 다른 유전적 또는 대사성 질환을 포함하여 많은 조건들에서 잠재적으로 유용한 효과를 보였다(Canani 등, World J Gastroenterol. 2011, 17:1519-28). 제한된 수의 혐기성 장내 박테리아만이 부티레이트를 생산하는 것으로 알려져 있다. 특히 부티로제닉(butyrogenic) 박테리아는 대사 증후군 및 인슐린 내성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군 또는 지방 이상증에 의한 비만)에서의 인슐린 내성뿐만 아니라, 이상 지질혈증 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성의 합병증을 갖는 개체의 위장관에서 고갈된다(Hartstra 등, Diabetes Care. 2015, 38:159-165).
위장관에서 부티로제닉 박테리아의 감소와 종종 관련이 있는, 위장관의 과도한 병원성 박테리아 종은 면역 관련 질환, 염증 관련 질환 및 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 제 2형 당뇨, 비만, 박테리아성 또는 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로 감염 등을 포함하는 다른 질환에 관련된다.
더욱이, 식이(diet)는 질환의 주요 원인이며 음식의 특정 성분은 위장관 미생물을 통해 간접적으로 질환에 기여할 수 있다. 이것은 특히, 고급 당화 최종 산물(Advanced Glycation End products, AGE)과 관련이 있다. AGE는 Schiff 염기 중간체의 형성으로 발생하는 당화 반응에 이어 케토아민 첨가물을 제공하는 Amadori 재배치에 의해 형성된다. 글루코스가 환원당일때, Amadori 재배열 생성물은 프룩토오스-라이신으로 알려져 있다. 약간의 알칼리성 조건하에서 자발적인 화학적 전환은 프룩토오스-라이신의 추가 재배열, 단편화 및 산화 반응을 초래하여 Nε-(카르복시메틸)라이신과 같이 잘 알려진 AGE를 형성한다(Hellwig and Henle, Angew., 2014, 53, 10316-10329). 따라서, 프룩토오스-라이신이 AGE 형성의 중추적 생성물이고, 포도당이 가장 풍부한 당류들 중 하나이며 라이신이 지구상 가장 풍부한 아미노산 중 하나인 이상, 매우 필수적이다. 프룩토오스-라이신은 AGE 형성의 지표로도 사용되며 프룩토오스-라이신의 함량은 분유, 무가당 연유(evaporated milk) 또는 일부 파스타 제품과 같은 가열 식품에서 매우 높을 수 있다. AGE는 대사 증후군, 제 2형 당뇨, 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭상 난소 증후군 및 알츠하이머 병, 다발성 경화증 및 치매와 같은 신경 퇴행성 장애와 같은 다양한 질환에 관련된다. 부티로제닉 박테리아를 제외한 일부 위장관 미생물은 AGE의 대사성 전환에 관여한다(Tuohy 등 Mol. Nutr. Food Res. 2006. 50, 847 - 857 DOI 10.1002 / mnfr.200500126 847).
위장관에서 L-라이신은 간성 뇌병증이나 심혈관 질환을 유발하는 독성 화합물로 전환될 수 있다(Fujita 등, Clin Chim Acta, 1999. 287 (1-2) : 99-109, Tang 등, J Card Fail. 2013. 19(4):219-224).
몇 가지 제품 또는 방법이, 위장관 미생물에서 유익한 박테리와 종과 병원 박테리아 종 사이의 균형을 회복시키거나 유익한 박테리아 종의 수 증가 및/또는 병원성 박테리아 종의 수 감소를 통해 해로운 박테리아성 변이(예를 들어, 과도한 병원성 박테리아 및/또는 유익한 박테리아의 부족)로 인한 질환을 예방 또는 치료하기 위해 개발되었다. 위장관의 건강을 개선 및/또는 복원하기 위해 가장 많이 사용되는 제품 중에는 소위 '프리바이오틱(prebiotic)' 및 '프로바이오틱(probiotic)'제품이 있다. 대변 미생물의 이식 방법 또한 빈번하지는 않으나 사용되어 왔으며 신생 분야로서 위장관에서 분리한 특정 박테리아의 합성 공동체가 사용된다.
프로바이오틱 제품은 본질적으로 살아있는 미생물로 구성되며, 유효한 량으로 투여될 경우 숙주(예를 들어, 인간)에게 건강상의 이익을 준다. 프로바이오틱스는 일반적으로 창자에서 유익한 박테리아 종의 개체 수를 늘리거나 유익한 장내 박테리아로 내장을 재충전하고, 항생제, 질환, 노화 또는 영양 부족과 같은 결핍을 보완하는 역할을 한다. 프로바이오틱스는 건강한 위장관을 유지하는데 도움이 되는 살아있는 미생물이고, 프리바이오틱스는 유익한 장내 박테리아에 연료를 공급하는데 도움을 주는 물질이다. 보다 구체적으로, 프리바이오틱스는 주로 이러한 유익한 장내 박테리아의 성장과 활성을 자극하는 발효성 섬유 또는 비소화성 탄수화물로 구성된다. 유익한 박테리아에 의한 이들 섬유의 발효는 SCFA와 같은 유익한 최종 산물의 생산을 촉진한다.
여러 가지 프로바이오틱스 제품은 조성물, 음료(예를 들어, 유제품 음료, 발효 음료 등), 제제, 식품(예를 들어, 요구르트, 치즈 등) 또는 영양 보충제(예를 들어, 캡슐, 정제, 분말) 등의 형태로 시판되고 있다. 대부분의 프로바이오틱스는 락토바실리(Lactobacilli) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria)와 같은 유산균 박테리아를 포함한다.
일반적으로 위장관 건강의 유지, 회복 및/또는 개선, 및/또는 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로감염, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증(dyslipidemia) 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군(Cushing's disease) 또는 지방 이상증(lipodystrophy syndromes)에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 또는 치매와 같은 신경 퇴행성 장애, 뇌병증 등과 같은 상태 또는 질환의 예방 및/또는 치료에 적합한 프로바이오틱스와 같은 추가의 조성물이 필요하다. 또한, AGE의 형성을 예방 또는 감소시키기 위한 프룩토오스-라이신을 대사 또는 분해할 수 있는 유익한 위장관 박테리아가 필요하다.
발명의 요약
첫 번째 측면에서, 본 발명은 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있는 라이신 경로 유전자 세트를 포함하는 분리된 장내 박테리아성 균주, 즉, 인간 장내 분리체 또는 그로부터 유래된 균주를 제공한다.
하나의 구체예에서, 라이신 경로 유전자 세트는 하기의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한다: 라이신 2,3-아미노뮤타제(lysine 2,3-aminomutase); L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛(L-beta-lysine 5,6-aminomutase alpha subunit); L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛(L-beta-lysine 5,6-aminomutase beta subunit); 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소(3,5-diaminobexanoate dehydrogenase); 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소(3-keto-5-aminohexanoate cleavage enzyme); 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제(3-aminobutyryl-CoA ammonia-lyase); 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A(butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit A); 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B(butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit B); 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase).
하나의 구체예에서, 하기의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 발현은, 박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 상향조절되었다: 라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 및 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제.
하나의 구체예에서, 하기의 단백질 중 적어도 하나는, 박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 과량발현되었다: 라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 및 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제.
또한, 본 발명은 기탁번호 CBS 139326으로 기탁된 분리된 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주와 관련된다. 상기 박테리아성 균주는 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있다. 상기 박테리아성 균주는 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체 및 아세테이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있다.
본 명세서에서 교시된 상기 박테리아성 균주는 당화된 라이신 흡수 및 분해 오페론을 추가로 포함할 수 있고, 당화된 라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있다.
당화된 라이신은 프룩토오스-라이신일 수 있고, 당화된 라이신의 흡수 및 분해 오페론은 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론일 수 있다.
하나의 구체예에서, 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론은 하기의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한다: 프룩토오스-라이신 키나아제(fructose-lysine kinase); 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제(fructoselysine 3-epimerase); 프룩토사민 디글리케이즈(fructosamine deglycase); ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD(ABC transporter periplasmic spermidine putrescine-binding protein PotD); 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC(spermidine putrescine ABC transporter permease component PotC); 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB(spermidine putrescine ABC transporter permease component PotB); 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA(putrescine transport ATP-binding protein PotA).
하나의 구체예에서, 하기의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 발현은, 박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 과량발현되었다: 프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA.
하나의 구체예에서, 적어도 하나의 하기 단백질은 박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 과량발현되었다: 프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA.
본 명세서에 교시된 균주는 Firmicutes 문, Taxon Clostridium cluster IV 분류군, Intestinimonas 속 및 바람직하게는 Intestinimonas butyriciproducens 종에 속한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 박테리아성 균주는 인간의 장으로부터 분리된 것, 즉 인간 장내 분리체이다.
바람직하게는, 상기 인간 장내 분리체는 20 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 15 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 10 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 7 μg/㎖ 미만, 더욱 바람직하게는 5 μg/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 4 미만, 3 미만 또는 2 μg/㎖ 미만의 에리트로마이신 최소 저지 농도(MIC)를 갖는다.
본 발명은 또한, 본 명세서에 교시된 바와 같은 박테리아성 균주 및 생리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 식품, 식품 보충제, 사료, 사료 보충제 또는 약학 조성물일 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 조성물은 유제품, 예를 들어, 요구르트 또는 요구르트 음료와 같은 발효 유제품과 같은 식품 조성물이다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 조성물은 약학 조성물 또는 식품 보조제 조성물이다. 상기 조성물은 고체 투여 형태일 수 있으며, 예를 들어, 캡슐, 정제 또는 분말일 수 있다. 본 명세서에 교시된 박테리아성 균주에 속하는 박테리아는 동결 건조된 형태로 조성물에 혼합될 수 있다.
상기 박테리아는 약 102 내지 약 1012, 바람직하게는 106 내지 약 1010의 콜로니 형성 단위(CFU)의 양으로 조성물에 존재할 수 있다.
상기 조성물은 프리바이오틱스, 프로바이오틱스, 탄수화물, 폴리펩타이드, 지질, 비타민, 미네랄, 약제, 방부제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 라이신이 풍부한 공급원을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 명세서에서 교시한 바와 같이 의약으로서 사용하기 위해 박테리아성 균주뿐만 아니라 의약으로서 사용하기 위해 본 명세서에 교시한 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 프로바이오틱 및/또는 공생 용도를 위해 본 명세서에서 교시한 바와 같은 박테리아성 균주뿐만 아니라, 프로바이오틱 및/또는 공생 용도를 위해 본 명세서에서 교시한 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 교시한 바와 같은 박테리아성 균주 또는 일반적으로 위장관 건강을 유지, 회복 및/또는 개선, 및/또는 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로감염, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군 또는 지방 이상증에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 또는 치매와 같은 신경 퇴행성 장애, 뇌병증 등과 같은 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는 용도를 위한, 본 명세서에서 교시한 바와 같은 조성물을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 위장관 건강을 유지, 회복 및/또는 개선, 및/또는 이를 필요로 하는 개체에서 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로감염, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군 또는 지방 이상증에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 또는 치매와 같은 신경 퇴행성 장애, 뇌병증 등과 같은 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 것이며, 상기 방법은 상기 개체에서 본 발명에 교시된 바와 같은 박테리아성 균주의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에서 교시된 바와 같은 박테리아성 균주의 수준은, 상기 개체에 대한 유효한 량의 상기 박테리아성 균주의 투여 및 상기 개체에서 상기 박테리아성 균주의 수준을 증가시킬 수 있는 유효한 량의 화합물의 투여로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 상기 개체에서 증가될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 본 명세서에서 교시된 바와 같은 박테리아성 균주의 수준을 증가시키는 단계를 포함하는 개체에서 당화된 라이신의 생산을 예방 및/또는 감소시키는 방법과 관련된다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 박테리아성 균주의 수준은, 상기 개체에 대한 유효한 량의 상기 박테리아성 균주의 투여 및 상기 개체에 서 상기 박테리아성 균주의 수준을 증가시킬 수 있는 유효한 량의 화합물의 투여로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 상기 개체에서 증가될 수 있다.
바람직하게는, 상기 개체는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다.
도 1은 탄소원으로서 L-라이신상에서 AF211 균주의 성장에서, 라이신 전환 및 부티레이트 및 아세테이트의 생산을 보여준다.
일반적 정의
본 명세서에서 사용된 용어 '프로바이오틱스(probiotics)' 또는 '프로바이오틱 제품(probiotic products)'은 장내 박테리아와 같은 미생물을 말하며, 유효한 량으로 투여 또는 섭취되었을 때 숙주(예를 들어, 인간 또는 포유동물)의 건강을 증진시킨다. 바람직하게는, 프로바이오틱스는 투여될 때, 살아있거나 생존할 수 있어야 하고, 따라서, 숙주의 대장에 정착할 수 있도록 한다. 그러나 특정 조건하에서, 프로바이오틱스가 숙주에서 프로바이오틱, 유익한 효과를 계속 영향을 주는 것에 의해 생산된 물질이 투여될 때, 프로바이오틱스는 또한 죽을 수 있다. 대부분의 프로바이오틱스 또는 프로바이오틱 제품은 락토바실리 또는 비피도박테리아와 같은 유산균 박테리아로 구성된다. 통상의 기술자는 프로바이오틱스 분야에 대해 잘 알고 있으며 프로바이오틱스의 활성이 부여된 유산균 박테리아를 선택하는 방법을 잘 알고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '프리바이오틱스' 또는 '프리바이오틱 제품'은 일반적으로 숙주의 건강에 기여하는 위장관 미생물의 성장 및/또는 활성을 촉진시키는 화합물을 의미한다. 프리바이오틱스 또는 프리바이오틱 제품은 주로 발효성 섬유 또는 비소화성 탄수화물로 구성된다. 프로바이오틱스에 의한 이들 섬유의 발효는 SCFA, 특히 부티레이트와 같은 유익한 최종 산물의 생산을 촉진시킨다. 통상의 기술자는 프리바이오틱스 분야 및 프리바이오틱스의 활성이 부여된 성분을 선택하는 방법을 잘 알고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "공생 물질(symbiotics)" 또는 "공생 생성물(symbiotic products)"은 일반적으로 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스와 같은 위장관 미생물의 성장 및/또는 활성을 촉진시키는 하나 이상의 화합물을 하나의 제품으로 조합하는 조성물 및/또는 영양 보충제를 의미한다. 공생 물질은 선택적으로 성장을 자극하거나 및/또는 프로바이오틱스의 신진 대사를 활성화시킴으로써 위장관에서의 프로바이오틱스의 생존 및 정착을 향상시킴으로써 숙주에 유리하게 작용하여 숙주의 건강을 향상시킨다. 통상의 기술자는 공생 물질 및 공생 물질로 결합될 수 있는 성분을 선택하는 방법을 잘 알고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '짧은 지방산(short chain fatty acids)(약어: SCFA)'은 가지 친 지방산(branched chain fatty acids, BCFA)이 이소 부티르산(2-메틸프로판산) 및 이소 발레르산(3-메틸부타노익산) 등을 포함하는 반면에, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 발레르산(펜탄산)을 포함하는 탄소가 최대 6개인 지방족 화합물 꼬리를 갖는 지방산을 의미한다. BCFA가 주로 단백질 발효로 형성되는 동안 SCFA는 식이 섬유가 포유동물의 장 하측에서 발효될 때 생성될 수 있다. 특히, 포유동물의 장 하측에서의 SCFA 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 생산은 식이 탄수화물의 발효에 의한 결과이다.
본 명세서에서 사용된 용어 '부티르산'(공지된 이름으로는 부탄산)은 CH3CH2CH2COOH의 구조식을 갖는 카르복실산을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 '부티르산 또는 이의 유도체'는 부티르산으로부터 유도된 화합물을 의미하며, 부티레이트 또는 부타노에이트(butanoates)로 알려진 부티르산의 염 및 에스테르를 포함한다. 부티레이트 염의 비제한적인 예로는 나트륨 부티레이트, 칼슘 부티레이트, 마그네슘 부티레이트, 망간 부티레이트, 코발트 부티레이트, 바륨 부티레이트, 리튬 부티레이트, 아연 부티레이트, 칼륨 부티레이트, 철 부티레이트 등을 포함한다. 부티레이트 에스테르(즉, 부티르산의 에스테르)의 비제한적인 예는 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 메틸 부티레이트, 에틸 부티레이트, 부틸 부티레이트 또는 펜틸 부티레이트 등을 포함한다.
본 명세서에서 용어, '부티레이트-생산 박테리아' 또는 '부티르산-생산 박테리아' 또는 '부티로제닉 박테리아'는 상호 교환적으로 사용되며 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 하나 이상의 유도체를 생산할 수 있는 박테리아를 의미한다. 부티르산 및/또는 부티레이트 및 이의 유도체가 포유동물 장 내에서(또는 시험관 내 배양에서) 그 자리에서(in situ) 생성될 수 있는 중요한 경로는 소위 '아세틸-CoA 경로'이다. 아세틸-CoA 경로는 잘 정립화되어 있으며, 예를 들어, Lachnospiraceae 및 Ruminococcaceae 속(함께 총 장내 미생물의 최대 20%를 형성할 수 있음)에 속하는 장내 박테리아 종에서 특히 널리 퍼지는 것으로 알려져 있다. 아세틸-CoA 경로에 따르면, 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체는 탄수화물 발효를 통한 단일 박테리아 종 및/또는 다른 유기체로부터의 대사 산물이 부티로제닉 박테리아를 위한 기질로 작용하는 미생물 군에 의해 형성될 수 있다. 기존의 아세틸-CoA 경로는 부틸릴-CoA 트랜스퍼라아제(butyryl-CoA transferase, But) 및 부티레이트 키나아제(butyrate kinase, Buk)로 불리는 두 가지 주요 효소를 포함하는(다른 효소 중에서) 효소의 단계들을 수반한다. 통상의 기술자는 효소 및 상기 경로를 갖는 장내 박테리아 종 및 상기 경로의 기능을 수행하는 다른 요소를 코딩하는 유전자를 포함하는 '아세틸-CoA 경로'에 대해 잘 알고 있다.
부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체의 다른 경로가 인간 위장관 에서 생성될 수 있다는 다른 경로에 대한 가설이 있다. 그러한 경로 중 하나는 소위 '라이신 이용 경로(lysine utilization pathway)' 또는 '라이신 경로'이다. 그러나, 상기 경로가 인간 위장관으로부터 분리된 박테리아 종에서 존재함이 보고된 바는 없다(Vital 등. 2014, mBio 5(2) doi:10.1128/mBio.00889-14).
본 명세서에 사용된 용어 '라이신 경로 유전자 세트'는 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시키기 위해 라이신 경로에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자 세트를 말한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, '라이신 경로 유전자 세트'는 하기의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다: 라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 및 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제. 상기 라이신 경로 유전자 세트는 하기의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함할 수 있다: L-라이신 투과효소(L-Lysine permease); 부틸릴-CoA 탈수소효소 Etf(butyryl-CoA dehydrogenase Etf); 4-하이드록시부티레이트 조효소 A 트랜스퍼라제(4-hydroxy butyrate coenzyme A transferase); 3-케토아실-CoA 티올라아제/아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제(3-ketoacyl-CoA thiolase/acetyl-CoA acetyltransferase); 인산염 아세틸트랜스퍼라제(phosphate acetyltransferase); 아세테이트 키나아제(acetate kinase); 양성자 펌핑 Rnf 군집(proton pumping Rnf cluster)(A, B, C, D, E, G 서브유닛); V-형 ATP 합성 효소 군집(V-type ATP synthase cluster)(A, B, C, D, E, F, I, K 서브유닛); 무기 파이로포스파타제(inorganic pyrophosphatase); 암모늄 운반체(ammonium transporter); 유력한 짧은 사슬 지방산 운반체(putative short chain fatty acids transporter); 및 Na+/H+ 역운반체(antiporter).
하나의 구체예에서, '라이신 경로 유전자 세트'는 하기 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다: 3-하이드록시부틸릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase); D-베타-하이드록시부티레이트 투과효소(D-beta-hydroxybutyrate permease); 전자 전달 플라보단백질 알파 서브유닛(electron transfer flavoprotein alpha subunit); 전자 전달 플라보단백질 베타 서브유닛(electron transfer flavoprotein beta subunit); NAD-감소 수소화효소 서브유닛 HoxE(NAD-reducing hydrogenase subunit HoxE); 페레독신(ferredoxin); NAD-감소 수소화효소 서브유닛 HoxF(NAD-reducing hydrogenase subunit HoxF); 원형질[Fe] 수소화효소 대형 서브유닛(periplasmic [Fe] hydrogenase large subunit); 및 리보플라빈 ECF 운반체의 기질 특이적 성분 RibU(Substrate-specific component RibU of riboflavin ECF transporter).
본 발명의 문맥에서 사용된 용어 '라이신'은 'L-라이신'을 주로 의미하며, 상호 교환적으로도 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론' 또는 '당화된 라이신 흡수 및 분해 오페론'이라는 용어는 프룩토오스-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시키기 위한 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 경로에 관여하는 유전자 세트를 의미한다.
하나의 구체예에서, '프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론'은 하기의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다: 프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; 및 4개의 서브유닛으로 구성된 ABC 운반체: 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA
본 명세서에서 사용된 용어 '유익한 장내 박테리아 종'은 포유동물(예를 들어, 인간)의 장에 서식하는(즉, 선천적인) 박테리아를 의미하며, 거주하는 포유동물 내의 위장관, 대사 및 기타 건강에 있어 유익한 효과(예를 들어, 병원성 박테리아 종으로부터의 보호, 부티르산 및/또는 부티레이트 및 유도체의 생산 등)를 발휘한다.
유익한 장내 박테리아 종의 비제한적인 예로는 락토바실리 및 비피도박테리아속의 유산균 박테리아가 있다. 유익한 박테리아 종의 다른 비제한적인 예로는 US2014/0242654, WO 2014/150094 또는 WO2013032328 A1에 교시된 박테리아성 균주와 같이, 부티르산 및/또는 부티레이트 및 유도체를 생성하기 위해 아세틸-CoA를 사용하는 부티레이트-생산 박테리아 종을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 '병원성 박테리아 종'은 포유동물(예를 들어, 인간)의 장에 서식하는(즉, 선천적인) 박테리아를 의미하며, 거주하는 포유동물 내의 위장관 건강에 해로운 영향(예를 들어, 감염)을 미친다. 병원성 박테리아 종의 비제한적인 악명 높은 예로는 독소를 생성하는 Clostridium difficile이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "당화된 라이신" 또는 " Amadori 당화된 라이신" 또는 "프룩토오스-라이신"은 라이신 입실론(epsilon) NH2 그룹이 Amadori 재배열에 의해 당화된 라이신을 포함하는 생성물을 의미한다. 통상의 기술자에게 Amadori 당화된 라이신 또는 프룩토오스-라이신의 형성에 의한 과정은 잘 알려져 있다. 상기 용어 프룩토오스-라이신은 포도당 일부분이 Amadori 배열을 통해 라이신과 공유 결합될 때 사용된다. 프룩토오스-라이신은 ε-프룩토오스-라이신(ε-fructose-lysine), 1- 데옥시-1-(ε-N-L-리시노)-D-프룩토오스(1-Deoxy-1-(ε-N-L-lysino)-D-fructose); 프룩토실라이신(fructosyllysine); Nε-(1-데옥시-D-프룩토오스-1-일)-L-라이신(Nε-(1-Deoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysine); D-1-[(L-5-아미노-5-카르복시펜틸) 아미노] -1-데옥시프룩토오스(D-1-[(L-5-Amino-5-carboxypentyl)amino]-1-deoxyfructose); 또는 (S)-1-[(5-아미노-5-카르복시펜틸)아미노]-1-데옥시-D-프룩토오스((S)-1-[(5-Amino-5-carboxypentyl)amino]-1-deoxy-D-Fructose)로도 알려져 있다.
Amadori 당화된 라이신 및 프룩토오스-라이신은 조리된 식품에 풍부하다. Amadori 당화된 라이신 또는 프룩토오스-라이신은 일반적으로 식품 가열 과정에서 포도당 및 아미노산의 비효소 반응을 통해 형성된다. 약간의 알칼리성 조건하에서 자발적 화학적 전환은 FL의 추가 재배치, 단편화 및 산화 반응을 초래하여 Nε-(카르복시메틸)라이신과 같이 잘 알려진 AGE를 생성한다. AGE는 대사 증후군, 제 2형 당뇨, 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군 및 알츠하이머 병, 다발성 경화증 및 치매와 같은 신경 퇴행성 장애와 같은 다양한 질환과 관련된다.
본 명세서에서 사용된 용어 '유효한 량(effective amount)'은 본 명세서에서 교시된 효과를 달성하기 위해 필요한 양을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 교시된 바와 같은 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주의 유효한 량은 인간의 위장관 건강을 유지, 회복 및/또는 개선하고, Amadori 당화된 라이신 또는 프룩토오스-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시키며, 개체에서, 바람직하게, 인간에서 라이신의 존재, 부티로제닉 위장관 박테리아의 부재 또는 감소, 또는 AGE의 존재와 관련된 것으로 본 명세서에 서술된 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 양이다. 이러한 상태 또는 질환은 비제한적으로, 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로감염, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군 또는 지방 이상증에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 또는 치매와 같은 신경 퇴행성 장애, 뇌병증을 포함한다. 유효한 량은 통상의 기술자에 의해 과도한 실험없이 쉽게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '이로부터 유래된 균주'는 출발 물질로서 본 명세서에 교시된 바와 같이 기탁된 균주를 사용하여 수득된 균주에 관한 것이다. 이로부터 유래된 균주는 돌연변이 균주일 수 있으며, 예를 들어, 유전 공학, 방사선, 자외선, 화학적 처리에 의해 본 발명의 균주로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 상기 유래물(derivative) 또는 돌연변이 균주는 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여, 더 빠른 성장, 장 내에서의 더 나은 생존, 라이신 및/또는 당화된 라이신(예를 들어, 프룩토오스-라이신 등)에서의 성장에 적응하여 라이신에서 부티레이트로의 전환 증가 및/또는 프룩토오스-라이신과 같이 당화된 라이신의 부티레이트로의 전환 증가와 같은 추가적인 이점들을 유래물 균주(derivative strain)에 더해주면서, 특정 조건에 대한 성장 적응을 할 수 있는 본 명세서에 교시된 기탁된 균주로부터 유래된 균주일 수 있다. 유래물 또는 돌연변이는 본 명세서에서 교시된 바와 같이 기탁된 균주와 기능적으로 동등한 것이 바람직하다. 본 명세서에 교시된 바람직한 유래물 또는 돌연변이는 본 명세서에 교시된 바와 같이 기탁된 균주와 실질적으로 동일한 활성 또는 기능을 가지며, 즉 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 및 유도체로 전환시키는 능력을 가지며, 및/또는 당화된 라이신, 예를 들어, 프룩토오스-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시키는 능력을 갖는다. 유래물 또는 돌연변이는 상기 유래물 또는 돌연변이가 투여된 포유동물(예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물)에게 기탁된 균주를 투여한 것과 실질적으로 동일한 이점을 제공한다. 유래물 또는 돌연변이는 또한, 기탁된 균주에 대해 본 명세서에 서술된 바와 동일한 특성을 갖는 자발적인 유래물 또는 돌연변이 균주일 수 있다.
용어 '소비에 적합한' 또는 '영양학적으로 허용되는'은 인간(다른 포유동물까지)의 소비로 일반적으로 간주되는 성분 또는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration)" 또는 "MIC"는 미생물을 밤새 배양한 뒤, 시각적으로 성장의 억제를 확인할 수 있는 항균제의 최저 농도를 의미한다. 최소 억제 농도는 항균제에 대한 미생물의 내성을 확인하고 새로운 항균제의 활성을 모니터링하기 위한 진단 실험에 중요하다. 최소 억제 농도는 유기체에 대한 항균제제의 활성의 가장 기본적인 실험 측정치로 일반적으로 간주된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약(about)"은 당업계에서 일반적인 오차범위, 예를 들어, 평균의 표준 편차 2 이내를 의미한다. 상기 용어 '약(about)'은 표시된 값의 대부분 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 정도의 값을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(to comprise)" 및 이들의 활용형은 상기 단어가 비제한적인 의미로 사용되어 상기 단어에 후속되는 항목들이 포함되는 상황을 의미하며, 특별히 언급되지 않은 항목들은 제외되지는 않는다. 또한, 이는 '본질적으로 구성되는(to consist essentially of)' 및 '~로 구성되는(to consist of)'이라는 보다 제한적인 동사를 고려한다.
불명료한 관사 'a' 또는 'an'에 의한 요소에 대한 언급은 문맥상 하나의 요소만이 분명히 요구되는 경우를 제외하고는 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지는 않는다. 불명료한 관사 'a' 또는 'an'은 대개 '적어도 하나'를 의미한다.
용어, '증가하는(to increase)' 및 '증가된 수준(increased level)'과 용어, '감소하는(to decrease)' 및 '감소된 수준(decreased level)'은 크게 증가시키거나 또는 크게 감소시키는 능력 또는 크게 증가된 수준 또는 크게 감소된 수준을 의미한다. 일반적으로 대조 또는 참조의 해당 수준보다 각각 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 또는 이하와 같이 적어도 5%일 때, 수준은 증가하거나 감소되었다. 대안적으로, 샘플 중의 수준은 대조군(control) 또는 참조(reference)의 수준과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가 또는 감소되었을 때, 증가 또는 감소된 것일 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 본 명세서에서 Intestinimonas AF211로 의미하는 신규한 장내 박테리아성 균주를 인간 위장관으로부터 처음으로 분리하였다. 특히, 상기 새로운 장내 박테리아성 균주는 소위 '라이신 이용 경로'를 통해 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있는, 부티르산 및/또는 부티레이트-생산(부티로제닉(butyrogenic)) 박테리아이다. 본 발명의 새로운 장내 박테리아성 균주는 당화된 라이신 또는 다른 AGE, 예를 들어, 프룩토오스-라이신을 소위 '프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 경로"를 통해 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 추가로 전환시킬 수 있다.
이론에 구애되지 않고, 본 명세서에 교시된 장내 박테리아성 균주(또는 이로부터 유래된 균주)는 인간에게 투여되거나 인간에 의해 충분한 양으로 섭취될 때, 상기 인간의 위장관에 정착할 수 있다. 이러한 정착(colonization)은 상기 인간의 위장관에서 프룩토오스-라이신 또는 다른 당화된 라이신의 대사뿐만 아니라, 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체의 생산을 그 자리에서(in situ) 효과적일 수 있게 한다. 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 그 유도체 생산의 증가 및/또는 위장관에서 프룩토오스-라이신의 증가된 대사는 본 명세서에 교시된 바와 같이 예를 들어, 일반적으로 위장관 건강을 유지, 회복 및/또는 개선, 및/또는 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군 또는 지방 이상증에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군 및 알츠하이머 병, 다발성 경화증 및 치매와 같은 신경 퇴행성 장애, 또는 기타의 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유익한 효과의 기초가 되는 것으로 믿어진다.
박테리아
첫 번째 측면에서, 본 발명은 라이신 경로 유전자 세트를 포함하고 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있는 박테리아 균주 또는 이로부터 유래된 균주에 관한 것이다. 상기 박테리아성 균주는 바람직하게 인간 장내 분리체이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 2015년 1월 5일자로 Wageningen 대학에 의해 네덜란드 위트레흐트(Utrecht)에 소재한 Centraalbureau voor Schimmelcultures에 기탁 번호 CBS 139326으로 기탁한 박테리아성 균주에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 분리된 박테리아는 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체 및 아세테이트 또는 이의 유도체로 추가로 전환시킬 수 있다. 아세테이트는 식욕을 감소시키는 것으로 여겨지며, 따라서 체중 감소의 목적, 예를 들어 비만의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 장내 박테리아성 균주는 라이신을 포함하는 임의의 단백질 공급원으로부터 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있다. 라이신을 포함하는 단백질 공급원의 비제한적 예는 덱스트로스(dextrose), 트립톤(trypton), 캐시톤(casiton), 식물성 펩톤(vegetable peptone), 효모 추출물, 박테리아성 펩톤(bacterial peptone), 카제인 가수 분해물, 메틸 라이신(methyllysine) 등이 없는 트립신 소이 배지(tryptic soy broth)를 포함한다.
하나의 구체예에서, 라이신 경로 유전자 세트는 하기의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다: 라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 및 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제. 라이신 경로 유전자 세트는 하기 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함할 수 있다: L-라이신 투과효소; 부틸릴-CoA 탈수소효소 Etf; 4-하이드록시부티레이트 조효소 A 트랜스퍼라제; 3-케토아실-CoA 티올라아제/아세틸-CoA 아세틸 트랜스퍼라제; 인산염 아세틸 트랜스퍼라제; 아세테이트 키나아제; 양성자 펌핑 Rnf 군집(A, B, C, D, E, G 서브유닛); V-형 ATP 합성 효소 군집(A, B, C, D, E, F, I, K 서브유닛); 무기 파이로포스파타제; 암모늄 운반체; 유력한 짧은 사슬 지방산 운반체; 및 Na+/H+ 역운반체.
또한, 라이신 경로 유전자 세트는 하기 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함할 수 있다: 3-하이드록시부틸릴-CoA 탈수효소; D-베타-하이드록시부티레이트 투과효소; 전자 전달 플라보단백질 알파 서브유닛; 전자 전달 플라보단백질 베타 서브유닛; NAD-감소 수소화효소 서브유닛 HoxE; 페레독신; NAD-감소 수소화효소 서브유닛 HoxF; 원형질[Fe] 수소화효소 대형 서브유닛; 및 리보플라빈 ECF 운반체의 기질 특이적 성분 RibU.
하나의 구체예에서, 하기의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현은, 박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 상향조절되었다: 라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제.
하나의 구체예에서, 하기 단백질 중 적어도 하나는 박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 과량발현되었다: 라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제.
본 발명의 맥락에서, 사용되는 L-라이신의 양은 약 5 mM 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 50 mM, 더욱 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 25 mM, 가장 바람직하게는 약 20 mM의 범위에서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장하였을 때와 비교하여 유전자가 상향조절되거나 단백질이 과량발현되는 것에 따라 결정된다(특히, 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 박테리아성 균주의 비교 실험이 40 mM의 포도당 및 40 mM의 아세테이트에서 수행되었을 때).
본 발명의 맥락에서, 본 명세서에서 의미하는 등몰의 포도당 및 아세테이트는 소듐 아세테이트와 같은 아세테이트 염의 형태로서 제공되는 약 1 mM 내지 약 200 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 150 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 보다 더욱 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 75 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 더 바람직하게는 약 25 mM 부터 약 55 mM까지, 약 30 mM 부터 약 50 mM까지, 약 35 mM 부터 약 55 mM까지의 포도당 및 아세테이트 모두와 같은, 약 20 mM 내지 약 60 mM의 포도당 및 아세테이트 모두일 수 있으며, 가장 바람직하게는 약 40 mM의 포도당 및 아세테이트 모두일 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 분리된 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유도되는 균주는 당화된 라이신 흡수 및 분해 오페론을 추가로 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 분리된 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유도되는 균주는 당화된 라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 당화된 라이신은 프룩토오스-라이신이고, 당화된 라이신 흡수 및 분해 오페론은 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론이다.
하나의 구체예에서, 상기 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론은 하기의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한다: 프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; 및 4개의 서브유닛으로 구성된 ABC 운반체: ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA. 예를 들어, 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론은 하기 단백질을 코딩하는 유전자의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개를 모두 포함할 수 있다: 프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; 및 4개의 서브유닛으로 구성된 ABC 운반체: ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA.
하나의 구체예에서, 하기 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현은박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 상향조절되었다: 프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA.
다른 측면에서, 하기의 단백질 중 적어도 하나의 단백질이 박테리아가 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 성장하였을 때, 과량발현되었다: 프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA.
본 발명의 맥락에서, L-라이신의 양은 박테리아성 균주 내에서 상기 박테리아가 약 5 mM 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 50 mM, 더욱 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 25 mM, 가장 바람직하게는 약 20 mM의 범위에서 등몰의 포도당 및 아세테이트 모두에서 성장하였을 때와 비교하여 유전자가 상향조절되거나 단백질이 과량발현되는 것에 따라 결정된다(특히, 탄소원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트 모두에서 성장한 박테리아성 균주의 비교 실험이 40 mM의 포도당 및 40 mM의 아세테이트에서 수행되었을 때).
본 명세서에 교시된 바에 따른 등몰의 포도당 및 아세테이트는 소듐 아세테이트와 같은 아세테이트 염의 형태로서 제공되는 약 1 mM 내지 약 200 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 150 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 보다 더욱 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 75 mM의 포도당 및 아세테이트 모두, 더 바람직하게는 약 25 mM 부터 약 55 mM까지, 약 30 mM 부터 약 50 mM까지, 약 35 mM 부터 약 55 mM까지의 포도당 및 아세테이트 모두와 같은, 약 20 mM 내지 약 60 mM의 포도당 및 아세테이트 모두일 수 있으며, 가장 바람직하게는 약 40 mM의 포도당 및 아세테이트 모두일 수 있다
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 분리된 인간의 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주는 교시된 바와 같은 라이신 경로 유전자 세트 및/또는 상기 교시된 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론을 포함한다.
바람직한 일례에서, 본 명세서에 교시된 분리된 인간 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주는 교시된 바와 같은 라이신 경로 유전자 세트 및 상기 교시된 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론을 모두 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 바와 같이 분리된 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주는 인간으로부터 분리된 박테리아이며, 상기 라이신 경로 유전자 세트 및/또는 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론을 자연적으로 포함하고, L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시키고 및/또는 프룩토오스-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 명세서에 교시된 박테리아성 균주는 본 명세서에 교시된 바와 같이 라이신 경로 유전자 세트 및/또는 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론으로 형질 감염(transfected)된 박테리아성 균주이며, L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 그의 유도체로 전환시킬 수 있고 및/또는 프룩토오스-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있다. 통상의 기술자는 박테리아를 원하는 유전자 구조물(예를 들어, 오페론 또는 경로 유전자 세트)로 형질 감염시키는 방법을 알고 있다.
바람직하게, 본 명세서에 교시된 인간 장내 분리체는 에리트로마이신에 민감하며, 20 μg/㎖ 미만, 바람직하게는 15 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 10 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 7 μg/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 5 μg/㎖ 미만, 가장 바람직하게는 4 미만, 3 미만 또는 2 μg/㎖ 미만의 에리트로마이신 최소 저해 농도를 갖는다. 이는 에리트로마이신 내성 박테리아를 도입하지 않고도 분리체를 인간에게 투여할 수 있게 한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 인간 장내 분리체는 세포탁심(cefotaxime)에 민감하며, 20 μg/㎖ 미만, 바람직하게는 15 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 10 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 7 μg/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 5 μg/㎖ 미만, 가장 바람직하게는 4 미만, 3 미만 또는 2 μg/㎖ 미만, 이보다 더 바람직하게는 1 μg/㎖ 미만의 세포탁심 최소 저해 농도를 갖는다. 이는 세포탁심 내성 박테리아를 도입하지 않고도 분리체를 인간에게 투여할 수 있게 한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 인간 장내 분리체는 옥사실린(oxacillin)에 민감하며, 20 μg/㎖ 미만, 바람직하게는 15 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 10 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 7 μg/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 5 μg/㎖ 미만, 가장 바람직하게는 4 미만, 3 미만 또는 2 μg/㎖ 미만, 이보다 더 바람직하게 1 μg/㎖ 미만의 옥사실린 최소 저해 농도를 갖는다. 이는 옥사실린 내성 박테리아를 도입하지 않고도 분리체를 인간에게 투여할 수 있게 한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 인간 장내 분리체는 테이코플라닌(teicoplanin)에 민감하며, 20 μg/㎖ 미만, 바람직하게는 15 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 10 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 7 μg/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 5 μg/㎖ 미만, 가장 바람직하게는 4 미만, 3 미만 또는 2 μg/㎖ 미만, 이보다 더 바람직하게 1 μg/㎖ 미만의 테이코플라닌 최소 저해 농도를 갖는다. 이는 테이코플라닌 내성 박테리아를 도입하지 않고도 분리체를 인간에게 투여할 수 있게 한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 인간 장내 분리체는 토브라마이신(tobramycin)에 민감하며, 20 μg/㎖ 미만, 바람직하게는 15 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 10 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 7 μg/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 5 μg/㎖ 미만, 가장 바람직하게는 4 미만 또는 3 μg/㎖ 미만의 토브라마이신 최소 저해 농도를 갖는다. 이는 토브라마이신 내성 박테리아를 도입하지 않고도 분리체를 인간에게 투여할 수 있게 한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 인간 장내 분리체는 반코마이신(vancomycin)에 민감하며, 20 μg/㎖ 미만, 바람직하게는 15 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 10 μg/㎖ 미만, 더 바람직하게는 7 μg/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 5 μg/㎖ 미만, 가장 바람직하게는 4 미만, 3 미만 또는 2 μg/㎖ 미만, 이보다 더 바람직하게 1 μg/㎖ 미만의 반코마이신 최소 저해 농도를 갖는다. 이는 반코마이신 내성 박테리아를 도입하지 않고도 분리체를 인간에게 투여할 수 있게 한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에서 교시된 분리체는 세포탁심, 에리트로마이신, 옥사실린, 테이코플라닌, 토브라마이신 및 반코마이신 모두에 민감하다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에서 교시된 분리된 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주는 Firmicutes 문, 바람직하게는 taxon Clostridium cluster IV(Ruminococcacaea; Rajilic-Stojanovic & De Vos 2014, FEMS Microbiol Rev 38:996-1047)에 속하며, 더욱 바람직하게는 Intestinimonas 속, 더 바람직하게는 Intestinimonas Butyriciproducens 종에 속한다.
Klaring 등(2013. Int J of Syst and Evol Microbiol, 63:4606)에는 Intestinimonas Butyriciproducens 균주 SRB-521-5-I(DSM 2658로 기탁)로 명명된 마우스 장내 분리체가 공개되어 있다. 마우스 장내 분리체는 인간에게 투여하기에 부적합하다. 특히, 두 균주 모두 당 및 라이신으로부터 부티레이트를 생산할 수 있었으나, 인간 균주 AF211가 마우스 분리체보다 이들 전환에 더 효율적이었다. 주목할 것은, 아라비노스 및 갈락토오스가 함께 관찰되었는데, 두 가지 당은 인간 식단에서 발견되었지만 쥐의 식단에서는 발견되지 않았다(미공개 자료).
Pfleiderer 등(2013. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 32:1471)에는 새로운 박테리아 종을 서술하고 있는데, 그 중 하나는 Clostridium anorexicus 균주 AP4로 현재 16S rRNA 서열에 기초하여 "Intestinimonas butyriciproducens 균주 AP4"로 재분류되었다. 상기 균주는 공개적으로 사용할 수 없으며 자세히 설명하지 않았다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은, 분리된 박테리아성 균주 또는 균주는 Intestinimonas Butyriciproducens 균주 ER1, 및/또는 Intestinimonas Butyriciproducens 균주 SRB-521-5-I(DSM 26588, 마우스 장내 분리체) 및/또는 Clostridium anorexicus 균주 AP4(Intestinimonas butyriciproducens 균주 AP4라고도 함)이 아니다.
조성물
세 번째 측면에서, 본 발명은 상기 분리된 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주 중 어느 것 및 생리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 상기 교시된 분리된 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주는Intestinimonas butyriciproducens 균주 ER1, 및/또는 Intestinimonas butyriciproducens 균주 SRB-521-5-I(DSM 26588), 및/또는 Clostridium anorexicus 균주 AP4가 아니다.
바람직한 일례에서, 상기 교시된 조성물은 CBS 139326으로 기탁된, 분리된 장내 박테리아성 균주('Intestinimonas AF211'로도 칭함) 또는 이로부터 유래된 균주, 및 생리학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
하나의 구체예에서, 생리학적으로 허용 가능한 담체는 개체(예를 들어, 인간 및/또는 동물)에 의해 소비될 때까지 장내 박테리아성 균주를 유지시키는데 적합한 어떤 담체일 수 있다. 예를 들어, 허용 가능한 담체의 비제한적인 예는 이러한 목적에 적합하다고 잘 알려진 생리학적 또는 약학 담체, 완충제, 부형제 중 어떤 것을 포함한다. 적합한 생리학적 또는 약학 담체의 선택은 상기에 교시되어 있는 조성물 투여의 의도된 방법(예를 들어, 경구) 및 조성물의 형태(예를 들어, 음료수, 요거트, 분말, 캡슐 등)에 따라 평가된다. 통상의 기술자는 교시된 대로, 조성물에 적합한 생리학적 또는 약학 담체를 어떻게 선택하는지 안다.
하나의 구체예에서, 상기 교시된 조성물은 식품 조성물, 사료 조성물, 사료 보충제 조성물, 식품 보충제 조성물 또는 약학 조성물의 형태일 수 있다. 상기 조성물은 인간에 의한 섭취에 적합하다.
하나의 구체예에서, 상기 조성물은 식품 또는 식품 보충제 조성물이다. 상기 식품 또는 식품 보충제 조성물은 액체, 액체음료(유제품 음료 및 발효 음료를 포함), 요거트, 치즈, 겔, 젤라틴, 젤라틴 캡슐, 분말, 페이스트, 압착된 정제(pressed tablet)및 겔 캡(gel cap)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 일례에서, 상기 조성물은 액체, 바람직하게는 액체 음료(예를 들어, 유제품 음료)이다. 상기 식품 또는 식품 보충제 조성물은 유제품, 바람직하게는 발효 유제품, 바람직하게는 요거트 또는 요거트 음료일 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 교시된 조성물은 프로바이오틱 조성물일 수 있다. 이와 같은 프로바이오틱 조성물은 본 명세서에서 교시한 바와 같은 분리된 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주를 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 교시된 조성물은 하나 또는 그 이상의 추가적인 유익한 분리된 장내 박테리아성 균주를 더 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가적인 유익한 분리된 장내 박테리아성 균주는 아세틸-CoA 경로를 거쳐 부티레이트를 생산하는 락토바실리 및/또는 비피도박테리아 및/또는 어떤 부티레이트-생산 박테리아로부터 선택되는 어떤 유산균 박테리아일 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 조성물은 공생용 조성물일 수 있다. 예를 들면, 상기 교시한 바와 같이, 장내 박테리아성 균주의 효과(예를 들어, 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체의 생산)를 증가시키기 위해 하나 이상의 프리바이오틱 성분을 상기 조성물에 추가하는 것은 유익할 수 있다.
하나의 구체예에서, 하나 이상의 프리바이오틱 성분은 상기 교시한 바와 같이, 분리된 장내 박테리아 또는 이로부터 유래한 균주의 활성을 증가시키거나 및/또는 성장을 촉진시키기에 적합한 어떤 프리바이오틱 성분일 수 있다. 적합한 프리바이오틱 재료의 비제한적인 예는 섬유, 셀로비오스, 말토오스, 만노오스, 살리신(salicine), 트레할로스, 아미그달린, 아라비노오스, 멜리비오스, 람노스(rhamnose) 및/또는 자일로오스를 포함한다.
하나의 구체예에서, 상기 조성물은 라이신이 풍부한(rich) 공급원(source) 및/또는 라이신을 포함한다. 예를 들면, 상기 교시한 바와 같이, 포유동물(예를 들어, 인간)의 위장관 내에서 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체의 생산을 추가로 증가시키기 위해 라이신이 풍부한 공급원 및/또는 라이신을 상기 조성물에 추가하는 것은 유익할 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 조성물은 교시한 바와 같이, 저장 및/또는 담즙산에의 노출 및/또는 포유동물(예를 들어, 인간)의 위장관 통로를 통과하는 동안, 분리된 장내 박테리아 균주 또는 이로부터 유래한 균주의 생존(survival) 및/또는 생존 능력(viability)을 촉진하기에 적합한 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 상기 성분의 비제한적인 예는 장용성 피막(enteric coating) 및 위의 통과를 허용하는 제어 방출 제제(controlled release agents)를 포함한다. 통상의 기술자는 그들의 본래의 기능을 수행할 수 있도록 분리된 장내 박테리아성 균주(교시된 어떤 분리된 장내 박테리아와 같이)를 유지하기 위한 적합한 조성물을 선택하는 방법을 잘 알 것이다.
하나의 구체예에서, 상기 교시된 조성물은 상기 교시된 영양상의 가치 및/또는 치료적 가치를 더욱 향상시키는 하나 이상의 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 아미노산, 효소, 무기염(mineral salts), 비타민(예를 들어, 염산 티아민(thiamine HCl), 리보플라빈, 피리독신 염산(pyridoxine HCl), 나이아신(niacin), 이노시톨, 콜린 클로라이드(choline chloride), 판토텐산 칼슘(calcium pantothenate), 비오틴, 엽산, 아스코르브산, 비타민 B12, p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 비타민 A 아세테이트, 비타민 K, 비타민 D 및 비타민 E 등), 당(sugar) 및 복합 탄수화물(예를 들어, 수용성 및 비 수용성 단당류, 이당류, 다당류), 의약 화합물(예를 들어, 항생제), 항산화제, 미량 원소 성분(예를 들어, 코발트, 구리, 망간, 철, 아연, 주석, 니켈, 크롬, 몰리브덴, 요오드, 염소, 규소, 바나듐, 셀레늄, 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 칼륨 등 화합물)로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 성분(예를 들어, 영양 성분, 수의학 또는 의약 제제 등)을 추가하는 것은 유익할 수 있다. 통상의 기술자라면 상기 교시된 조성물의 영양상 및/또는 치료/의약 가치를 향상시키기에 적합한 방법 및 조성물에 대해 잘 알 것이다.
상기 교시된 박테리아성 균주는 동결 건조 형태, 마이크로 캡슐화된 형태(예를 들어, Solanki et al. BioMed Res. Int. 2013, Article ID 620719에서 검토됨) 또는 박테리아성 균주의 활성 및/또는 생존 능력을 보존하기 위한 모든 형태로 조성물에 통합될 수 있다.
상기 교시된 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 약학 조성물은 보충제로 사용될 수 있다. 약학 조성물은 상기 교시된 박테리아성 균주에 추가하여, 통상적으로 약학 담체를 포함할 것이다. 상기 담체는 바람직하게는 불활성 담체이다. 바람직한 형태는 투여 방법 및 (치료) 적용에 따라 달라진다. 약학 담체는 상기 교시된 박테리아성 균주의 박테리아를 개체의 위장관으로 전달하는데 적합한 임의의 호환 가능한 비독성 물질일 수 있다. 예를 들어, 멸균수 또는 불활성 고체는 일반적으로 약학으로 허용 가능한 보조제(adjuvant), 완충제, 분산제 등과 함께 보충되어 담체로써 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물은 예를 들면, 상기 교시된 바와 같은 박테리아성 균주의 안정화된 박테리아 현탁액과 같은 액체 형태 또는 예를 들면, 상기 교시된 바와 같은 박테리아성 균주의 동결 건조된 박테리아 분말과 같은 고체형태로 존재한다. 상기 박테리아성 균주가 동결 건조되는 경우, 락토오스, 트레할로스 또는 글리코겐과 같은 동결 방지제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위해 상기 교시된 박테리아성 균주의 균주가 동결 건조된 박테리아를 포함하는 캡슐제, 정제 및 분말과 같은 고체 투여 형태 또는 엘릭시르(elixirs) 시럽 및 현탁액과 같은 액체 투여 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 동결 건조화된 상기 박테리아성 균주의 박테리아는 젤라틴 캡슐 및 예를 들어, 포도당, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 전분, 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 스테아르 산(stearic acid), 나트륨 사카린, 활석, 탄산 마그네슘 등과 같은 비활성 성분 및 분말화된 담체와 함께 캡슐화될 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 교시된 장내 박테리아 또는 이로부터 유래된 균주는 약 106 내지 약 1015의 집락 형성 단위(colony forming units, CFU)의 범위 내에서 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 장내 박테리아는 약 1014 CFU에서 약 107 CFU, 바람직하게는 약 108 CFU에서 약 1013 CFU, 바람직하게는 약 109 CFU에서 약 1012 CFU, 보다 바람직하게는 약 1010 CFU 에서 약 1012 CFU의 양으로 조성물에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 임의의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
발명의
실시예
다른 측면에서, 본 발명은 상기 교시된 박테리아성 균주 또는 상기 교시된 조성물을 식품 또는 식품 보충제, 또는 프로바이오틱 및/또는 공생 물질로서 사용하기 위한 용도를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 위장관 건강을 유지, 회복 및/또는 개선 및/또는 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로감염, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군 또는 지방 이상증에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 또는 치매와 같은 신경 퇴행성 장애, 또는 뇌병증과 같은 상태 또는 질환의 예방 및/또는 치료의 용도로서 상기 교시된 박테리아성 균주 또는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한, 이를 필요로 하는 개체에서 일반적으로 위장관 건강을 유지, 회복 및/또는 개선시키거나, 및/또는 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로감염, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군 또는 지방 이상증에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 또는 치매와 같은 신경 퇴행성 장애, 또는 뇌병증과 같은 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법 및 상기 개체에서 상기 교시된 박테리아성 균주의 수준을 증가시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 개체 내 상기 교시된 박테리아성 균주의 수준은 상기 박테리아성 균주의 유효한 량을 개체에 투여하거나 및/또는 개체의 위장관 내 상기 박테리아성 균주의 수준을 증가시킬 수 있는 화합물의 유효한 량을 투여함으로써 증가될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 프룩토오스-라이신을 대사시키거나 및/또는 프룩토오스-라이신 또는 다른 AGE과 같은 당화된 라이신의 형성을 예방 및/또는 감소시키거나 및/또는 개체의 위장관내에서 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체의 수준을 증가시키기 위한 방법 및 상기 개체에서 박테리아성 균주의 수준을 증가시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 상기 개체의 위장관 내 상기 교시된 장내 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주의 수준은 상기 분리된 장내 박테리아성 균주의 유효한 량을 개체에 투여하거나 또는 개체의 위장관 내 상기 장내 박테리아의 수준을 증가시킬 수 있는 화합물의 유효한 량을 투여함으로써 증가될 수 있다.
본 명세서에 교시된 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주는 상기 교시된 바와 같은 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 교시된 박테리아성 균주 또는 이로부터 유래된 균주는 단백질 또는, 콩, 동부(cowpea) 또는 다른 콩류와 같은 식물 기원뿐만 아니라 소 등의 우유로부터 분리한 단백질 단편과 같은 라이신이 풍부한 공급원 또는 라이신과 함께 병용 투여될 수 있다.
바람직한 일례로, 상기 개체의 위장관 내 박테리아성 균주 또는 그로부터 유래된 균주의 수준은 상기 박테리아성 균주 또는 그로부터 유래된 균주의 유효한 량 및/또는 상기 조성물, 바람직하게는 Intestinimonas AF211 및/또는 Intestinimonas AF211을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써 증가될 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 개체는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 랫, 개, 소, 및 돼지로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 개체는 인간이다. 특정 실시예에서 상기 개체는 감소된 양의 부티로제닉 박테리아, 특히, 상기 위장관 내의 부티로제닉 박테리아를 가진 인간이다.
본 발명은 또한, 박테리아성 균주가 에너지원을 부티레이트로 전환시키는 조건하에서, 상기 박테리아성 균주를 라이신 또는 포도당/아세테이트와 같은 적합한 에너지원에 접촉시키는 단계를 포함하는 부티레이트의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 박테리아성 균주가 프룩토오스-라이신을 부티레이트로 전환시키는 조건하에서, 상기 박테리아성 균주를 프룩토오스-라이신과 접촉시키는 과정을 포함하는 부티레이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 시험관 내(in vitro)의 방법일 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 예시되지만, 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자라면 상기의 논의한 바 및 하기의 실시예로부터, 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 교시된 바 및 이의 범위를 벗어나지 않고, 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명을 다양하게 변화 및 수정할 수 있다. 따라서, 상기 교시된 바에 추가한 본 발명의 다양한 변형들은 이전에 기술된 바로부터 당업계의 통상적인 기술자에게 자명하다. 상기의 변형은 본 발명에 첨부된 청구항 범위 내에 포함된다.
실험예
실험예
1.
Intestinimonas
AF211의 기능적 분석
본 실험은 균주 Intestinimonas AF211가 L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환 가능한지 알아보기 위해 수행하였다.
배양
건강한 개체로부터 대변 샘플을 수집하였다. 상기 대변 샘플을, 에너지 및 탄소원으로서 40 mM의 락테이트 및 40 mM의 아세테이트를 함유하는 혐기성 중탄산 완충 무기염 배지(anaerobic bicarbonate buffered mineral salt medium)에 넣었다. 배양은 1.5기압의 CO2/N2(1:5), 37℃에서 수행하였고, 이어서, 균주 Intestinimonas AF211가 강화된 clostridium 배지(RCM, Difco)에서 연속 희석 및 최소 3회 이상의 플레이팅으로 분리되었다. 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 통해 정제를 확인하였다. 균주 Intestinimonas AF21는 RCM 배지에서 37℃로 배양하였다.
기능적 분석
L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 및 이의 유도체로 전환시키는 Intestinimonas AF211의 능력을 평가하기 위해, Intestinimonas AF211의 그룹을 탄소 및 에너지원으로서 20 mM 의 라이신을 포함하는 중탄산 완충 배지에서 배양하였다. 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체를 생산하는 Intestinimonas AF211의 능력은 20 mM의 D-라이신, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 아르기닌, 아스파르트산 또는 메티오닌을 포함하는 중탄산 완충 배지에서 각각의 Intestinimonas AF211을 배양함으로 측정되었다. 다른 Intestinimonas AF211 그룹은 20 mM의 포도당, 갈락토오스, 아라비노스, 락토오스, 말토오스 또는 아세테이트를 첨가한 프룩토오스를 포함하는 중탄산 완충 배지에서 배양되었다.
다른 생성물(예를 들어, 아세테이트)뿐만 아니라, 부티르산 및/또는 부티레이트의 생산을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC) 및 600 nm 파장에서의 스펙트로포토미터(spectrophotometer)에 의한 OD값 측정을 통해 평가하였다. 흐름 속도는 분당 0.5 ㎖이었다. A2-이동상 용리액(eluent mobile phase)은 24 mM의 아세트산, 용매 A로서 8%의 아세토니트릴(acetonitrile)(pH 6.6), 용매 B로서 아세토니트릴:2-프로판올(60:40)을 구성하였다. 용리액 구배(eluent gradient)는 용매 A 95% 및 용매 B 5%에서 용매 A 25% 및 용매 B 75%로 설정하여 처음 15분 및 각 단계 22분 동안 수행하였다. 내부 표준은 4 mM의 노르루신(norleucine)으로 하였다. 생성물 형성의 측정은 37℃에서 10 mM의 아라비노스 용리액으로 가동된, Agilent Metacarb 67H 300 x 6.5 mm 칼럼을 장착한 Thermo Scientific HPLC Spectra 시스템으로 측정하였다. 검출기는 굴절률(refractive index) 검출기였다. 용리액 흐름 속도는 분당 0.8 ㎖이었다. 상기 서술된 바와 같이 가스의 생산이 이루어졌으며, 모든 분석은 이중으로(duplicate) 수행되었다.
Intestinimonas AF211을 20 mM의 [2-13C] L-라이신 또는 [6-13C] L-라이신을 포함하는 중탄산 완충 배지에서 배양하였다. 라벨링된 라이신은 Campro Scientific(넨달, 네덜란드)에서 구입하였다. 샘플은 하룻밤 동안 성장시켜 10,000 g에서 원심 분리한 후 얻었으며, 상등액을 0.5 m의 D2O(99.9%, Sigma Aldrich)에서 용해시킨 후, 이어서 NMR 튜브(Campro Scientific)에 담았다. 13C NMR 스펙트럼은 네덜란드에 위치한 Wageninge의 Wageninge NMR 센터(WNMRC)에서 Bruker Avance-III-500 스펙트로미터 상의 300 K의 프로브(probe) 온도에서 기록되었다. 화학적 이동(chemical shifts)은 41.75 \(PPM)에서 C-6에 대한 추가 [6-13C] 라이신으로 관찰되었다(생물 자기 공명 데이터 뱅크(Biological Magnetic Resonance Data Bank) 사이트 http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/metabolomics_standards). 생성물은 상기 데이터베이스에서 비교한 화학적 이동에 따라 확인되었다.
결과
실험의 결과를 도 1에 나타내었다. 간략히, 균주 Intestinimonas AF211가 L-라이신을 부티레이트로 전환시킴을 확인하였다. 구체적으로, Intestinimonas AF211가 대략 16.8 mM의 L-라이신을 14.2 mM의 부티레이트 및 15.6 mM의 아세테이트로 전환시켰음을 확인하였다(도 1). 상기 결과는 또한, L-라이신 외 다른 아미노산의 존재하에서 배양된 경우, Intestinimonas AF211에서 부티레이트를 생성하지 않음을 보여주었다.
실험예
2.
라이신
경로에 관여하는 유전자 확인
본 실험은 Intestinimonas AF211이 라이신 경로의 유전자 구성을 포함하는 지 여부를 확인하기 위해 수행하였다. 이를 위해, 단일 분자 차세대 서열(single molecule next generation sequencing)(NCBI 수탁번호 CP009497)를 사용하여 Intestinimonas AF211의 유전자를 서열분석하였으며, 그 다음, 라이신 경로에 속하는 유전자의 존재를 분석하였다.
서열분석
RCM(O/N)에서 성장시킨 Intestinimonas AF211의 DNA를 추출하였다. 제조사의 설명서에 따라, ZR Fungal/Bacteria DNA MiniPrep kit(ZYMO)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 15kb 라이브러리(library)의 유전자 시퀀싱은 P4/C2 chemistry(Pacific Biosciences, Menlo Park CA, 미국)를 사용하여 PacBio RS II 장비로 수행하였다. 데이터의 처리 및 필터링은 PacBio SMRT 분석 파이프라인(analysis pipeline) v2.2 및 Hierarchical Genome Assembly Process(HGAP) 프로토콜 (http://www.pacb.com/devnet)을 사용하여 수행하였다.
결과
실험결과, Intestinimonas AF211의 게놈이, NCBI 수탁번호 CP009497로 주석이 달린(annotated) 3359개의 코딩 서열을 보유하는 3,376,476 bp의 단일 원형 염색체로 이루어져 있음을 확인하였다. 두드러지게, 전체 라이신 경로 유전자 세트(군집(cluster) AF976-982라고도 함)가 Intestinimonas AF211에서 발견되었다. 보다 구체적으로, 라이신 경로 유전자 세트에 포함될 수있는 유전자를 하기 표 1에 열거하였다.
| 라이신 경로 유전자를 구성 및 Intestinimonas AF211에서 검출된 유전자. | 좌위(Locus) 태그(tag) | |
| 1 | L-라이신 투과효소 | AF887 |
| 2 | 라이신 2,3-아미노뮤타제(EC 5.4.3.2) | AF980 |
| 3 | L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛(EC 5.4.3.3) | AF981 |
| 4 | L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛(EC 5.4.3.3) | AF982 |
| 5 | 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소(EC 1.4.1.11) | AF979 |
| 6 | 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소 | AF977 |
| 7 | 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제 | AF976 |
| 8 | 부틸릴-CoA 탈수소효소(EC 1.3.99.2)/Etf | AF2889 to 2891 |
| 9 | 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A (EC 2.8.3.9) | AF3339 |
| 10 | 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B(EC 2.8.3.9) | AF3340 |
| 11 | 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.8) | AF155 |
| 12 | 3- 케토아실CoA- 티올라아제(EC 2.3.1.16)/아세틸-CoA 아세틸 트랜스퍼라제(EC 2.3.1.9) | AF3338 |
| 13 | 인산염 아세틸 트랜스퍼라제(EC 2.3.1.8) | AF212 |
| 14 | 아세테이트 키나아제(EC 2.7.2.1) | AF1052 |
| 15 | 양성자 펌핑 Rnf 클러스터(A, B, C, D, E, G 서브유닛) | AF682 to 687 |
| 16 | V-형 ATP 합성 효소 클러스터(A, B, C, D, E, F, I, K 서브유닛) | AF3050 to 3057 |
| 17 | 무기 파이로포스파타제(EC 3.6.1.1) | AF2617 |
| 18 | 암모늄 운반체 | AF653, AF1882, AF1747, AF2982, AF3082, AF3208 |
| 19 | 유력한 짧은 사슬 지방산 운반체 | AF191, AF924, AF1158 |
| 20 | Na+ / H+ 역운반체 | AF1159, AF2156, AF3116 |
실험예
3.
라이신
이용 경로의 단백질 분석
Intestinimonas AF211이 라이신 분해 경로의 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산할 수 있는지 여부를 확인하기 위해(표 1, 실시예 2 참조), 하기의 실험을 수행하였다.
배양
Intestinimonas AF211의 첫 번째 그룹을 에너지 및 탄소의 유일한 공급원으로서 20 mM의 L-라이신을 포함하는 500 ㎖의 중탄산 완충 배지에서 배양하였다. Intestinimonas AF211의 두 번째 그룹은 에너지 및 탄소의 유일한 공급원으로서 40 mM 의 포도당 및 40 mM의 소듐 아세테이트(GA)를 포함하는 500 ㎖의 중탄산 완충 배지에서 배양하였다. 다음으로, 두 그룹에서 생성된 단백질을 4℃에서 20분 동안 10,000 x g로 각각 원심 분리하여 각 실험 조건에서 대수기(exponential phase)의 Intestinimonas AF211을 수득하였다. 수득된 펠렛은 100 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 1 mM의 디티오에리트리톨(dithioerythreitol, DTE)에서 2회 세척하였고, 100 mM의 Tris/HCl(pH 7.5), 4%의 SDS 및 0.1 M의 디티오트레이톨을 포함하는 0.1 M의 SDT- 용해 완충액에서 현탁하였다. 다음 단계에서, 상기 단백질은 Bennett 등(1995), FEMS Microbiology Reviews, Vol: 17, pAGE 241-249에 교시된 방법에 따라 추출하였다. 상기 각각의 실험 조건으로부터 추출된 단백질의 풍부성(abundance)은 LC-MS/MS를 사용하여 확인하였다.
단백질 분석
정량 프로테오믹스(proteomics) 분석은 세포질 단백질 분획물에 대해 수행되었다. 이를 위해 Intestinimonas AF211 데이터베이스를 유전자 서열로부터 추론하여, 예를 들면, BSA, 트립신, 케라틴, 소혈청 알부민. 프로테오믹스 등 보통의 불필요 서열을 포함하는, 불필요 서열 포함 데이터베이스와 함께 사용하였다. 프로테오믹스 결과는 오류 발견율(False Discovery Rate, FDR)이 1% 미만인 펩타이드 및 단백질과, 고유하면서 역전된 부위없이 변형되지 않아야 하는 적어도 2개의 확인된 펩타이드를 포함하였다. 정상 대수(normal logarithm)는 단백질 라벨 자유 정량(protein label free quantitation, LFQ)의 강도로부터 얻었다. 민감한 비율의 계산을 가능하도록 하기 위해 "로그(log) LFQ" 값이 값 5.4(최저 값 바로 아래)로 대체되었다.
제어를 위한 샘플의 상대적인 단백질 양은 FDR을 0.05로 설정하고 S0를 1로 설정하여 얻은“LFQ intensity" 컬럼을 사용한 두 개의 샘플 T-테스트를 적용하여Perseus 1.3.0.4에서 수행되었다. 측정 가능한 트립신(tryptic) 펩타이드의 수에 대해 보정된, 총 비정량화된(non-normalized) 단백질의 강도는, 강도에 기초한 절대 정량 강도(intensity based absolute quantitation intensity, iBAQ)를 제공하였다. 총 단백질은 제조사의 설명서에 따라 Qubit® 2.0 형광 측정기(Invitrogen)를 사용하여 정량하였다.
결과
프로테오믹스 분석 결과, Intestinimonas AF211은 L-라이신의 부티레이트로의 전환에 관여하는 모든 단백질을 생산할 수 있으며, 본 명세서에 교시된 라이신 이용 경로를 사용함을 확인하였다(즉, 라이신 경로 유전자 세트 AF976-982에 포함된 유전자에 의해 코딩됨, 표 1, 실시예 2 참조). 또한, Intestinimonas AF211이 포도당과 아세테이트를 부티레이트로 전환시키는데 관련된 모든 단백질을 생산할 수 있고, Clostridium cluster IV의 다른 구성원과 마찬가지로 아세틸-CoA 경로를 사용함을 확인하였다. 종합하여, 상기 결과는 Intestinimonas AF211이 본 명세서에 교시된 라이신 이용 경로 및 통상적인 아세틸-CoA 경로 모두를 포함하고 있음을 나타낸다.
게다가, Intestinimonas AF21이 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로서 등몰의 포도당 및 아세테이트(GA)에서 성장한 경우와 비교하여, Intestinimonas AF2가 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로서 L-라이신의 존재하에서 성장했을 때, 라이신 경로 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생산이 상향조절되는 것을 확인하였다.예를 들어, 본 발명자들은 유일한 탄소원으로서 아세테이트(GA) 대비, L-라이신의 존재하에서 하기의 단백질이 상향조절됨을 확인하였다: 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제(4.08 배 증가); 인산염 아세틸 트랜스퍼라제(3.25 배 증가); 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소(10.87 배 증가); 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소(7.07 배 증가); 라이신 2,3-아미노뮤타제(11.11 배 증가); L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛(6.25 배 증가); L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛(11.26 배 증가); 아세테이트 키나아제(2.83 배 증가); 3-케토아실CoA-티올라아제/아세틸-CoA 아세틸 트랜스퍼라제(1.34 배 증가); 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제(1.57 배 증가); 및 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 베타 서브유닛(2.03 배 증가)
실험예
4.
Amadori
당화된
생성물의 대사
본 실험은 Intestinimonas AF211이 프룩토오스-라이신을 포함하는 배지에서 효율적으로 성장할 수 있는지 확인하고, Intestinimonas AF211이 프룩토오스-라이신을 부티레이트로 전환시킬 수 있는지를 확인하기 위해 수행하였다. 또한, Intestinimonas AF211의 유전자 및 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론에 포함된 유전자의 존재를 분석 및 스크리닝하였다.
기능적 분석
Intestinimonas AF211이 Amadori 당화된 라이신(프룩토오스-라이신)을 대사할 수 있는지 알아보기 위해, Intestinimonas AF211을 20 mM의 프룩토오스-라이신을 포함하는 중탄산 배지에서 4일간 배양하였다.
결과
유전자 분석의 결과, Intestinimonas AF211은 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해를 위한 유전자를 가진 오페론과 같은 군집(cluster)을 가지고 있음이 밝혀졌다(AF949-955). 상기 유전자는 하기의 표 2에 나타내었다.
기능적 분석의 결과는 Intestinimonas AF211이 프룩토오스-라이신 기질에서 효율적으로 자랄 수 있을 뿐만 아니라, 프룩토오스-라이신을 부티레이트로 전환시킬 수 있음을 나타냈다. 보다 구체적으로, Intestinimonas AF211은 4일 동안, 20 mM의 프룩토오스-라이신을 16.4 mM 의 부티레이트, 0.2 mM의 아세테이트 및 9.4 mM의 암모니아(NH4+)로 전환시킬 수 있음을 보여주었다.
| 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론에 포함되고 Intestinimonas AF211에서 검출 된 유전자 | 좌위(Locus) 태그(tag) | |
| 1 | 프룩토오스-라이신 키나아제 | AF949 |
| 2 | 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제 | AF950 |
| 3 | 프룩토사민 디글리케이즈 | AF951 |
| 4 | ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD | A F952 |
| 5 | 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC | AF953 |
| 6 | 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotB | AF954 |
| 7 | 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA | AF955 |
실험예
5. 프룩토오스-
라이신
흡수 및 분해 경로의
프로테오믹
(
Proteomic
) 분석
Intestinimonas AF211이 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 경로(표 2, 실시예 4 참조)의 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산할 수 있는지 여부를 알아보기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.
배양
Intestinimonas AF211의 첫 번째 그룹을 에너지 및 탄소의 유일한 공급원으로서 20 mM의 L-라이신을 포함하는 500 ㎖의 중탄산 완충 배지에서 배양하였다. Intestinimonas AF211의 두 번째 그룹은 에너지 및 탄소의 유일한 공급원으로서 40 mM 의 포도당 및 40 mM의 소듐 아세테이트(GA)를 포함하는 500 ㎖의 중탄산 완충 배지에서 배양하였다. 다음으로, 두 그룹에서 생성된 단백질을 4℃에서 20분 동안 10,000 x g로 각각 원심 분리하여 각 실험 조건의 대수기(exponential phase)의 Intestinimonas AF211을 수득하였다. 수득된 펠렛은 100 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 1 mM의 디티오에리트리톨(dithioerythreitol, DTE)에서 2회 세척하였고, 100 mM의 Tris/HCl(pH 7.5), 4%의 SDS 및 0.1 M의 디티오트레이톨을 포함하는 0.1 M의 SDT- 용해 완충액에서 현탁하였다. 다음 단계에서, 상기 단백질은 Bennett 등(1995), FEMS Microbiology Reviews, Vol: 17, pAGE 241-249에 교시된 방법에 따라 추출하였다. 상기 각각의 실험 조건으로부터 추출된 단백질의 풍부성(abundance)은 LC-MS/MS를 사용하여 확인하였다.
단백질 분석
상기 실시예 3에 기재한 바와 같이, 세포질 단백질 분획물에 대한 정량적 프로테오믹스 분석을 수행하였다.
결과
프로테오믹스 분석 결과, Intestinimonas AF211은 프룩토오스-라이신의 부티레이트로의 전환에 관여하는 모든 단백질을 생산할 수 있으며, 본 명세서에 교시된 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 이용 경로를 사용함을 확인하였다(표 2, 실시예 3 참조) .
게다가, Intestinimonas AF21이 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로서 GA에서 성장한 경우와 비교하여, Intestinimonas AF21이 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로서 라이신의 존재하에서 성장했을 때, 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 경로 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생산이 상향조절되는 것을 확인하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 GA 대비, 라이신의 존재하에서 다음의 단백질이 상향 조절됨을 확인하였다: 프룩토오스-라이신 키나아제(16.51 배 증가); 프룩토사민 디글리케이즈(9.42 배 증가); ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD(2.78 배 증가); 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC(24.8 배 증가); 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA(20.21 배 증가)
실험예
6.
Intestinimonas
균주 AF211의 항생제 감수성
Rettedal 등(Nature Comm(2014), 5:4714)에서는 박테리아를 인간의 장내에서 분리 및 배양하기 위한 항생제의 사용에 대해 기술하고 있다. 그러나, 이러한 접근법은 종종 항생제 내성 박테리아를 유발하며, 이는 인간 또는 동물의 사용을 목표로 하는 제형에 있어 바람직하지 않다. 분리된 Intestinimonas 균주 P1C2는 인간에서 종종 매크로라이트(macrolide) 계열의 항생제인 에리트로마이신(MIC 32 μg/㎖)에 내성을 가진 것으로 기술되었다. 따라서, 에리트로마이신에 대한 Intestinimonas 균주 AF211의 민감도를 측정하였다. 균주 AF211은 1 μg/㎖의 에리트로마이신 MIC를 가짐으로서, 에리트로마이신에 민감한 것으로 밝혀졌다.
| 항생제 | MIC(μg/㎖) |
| 세포탁심 | 0.064-0.05 |
| 에리트로마이신 | 0.75-1 |
| 옥사실린 | 0.38 |
| 테이코플라닌 | 0.047 |
| 토브라마이신 | 2 |
| 반코마이신 | 0.75 |
Claims (15)
- 라이신 경로 유전자 세트, L-라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있는 박테리아, 또는 이로부터 유래된 균주를 포함하며, 당화된 라이신 흡수 및 분해 오페론, 당화된 라이신을 부티르산 및/또는 부티레이트 또는 이의 유도체로 전환시킬 수 있는 박테리아를 추가적으로 포함하는 인간 장내 분리체.
- 제 1항에 있어서, 상기 라이신 경로 유전자 세트가 하기의 단백질 중 어느 하나 이상을 코딩하는 유전자를 포함하는 인간 장내 분리체:
라이신 2,3-아미노뮤타제(lysine 2,3-aminomutase); L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛(L-beta-lysine 5,6-aminomutase alpha subunit); L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛(L-beta-lysine 5,6-aminomutase beta subunit); 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소(3,5-diaminobexanoate dehydrogenase); 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소(3-keto-5-aminohexanoate cleavage enzyme); 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제(3-aminobutyryl-CoA ammonia-lyase); 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A(butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit A); 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B(butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit B); 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase).
- 제 2항에 있어서, 하기의 단백질을 코딩하는 적어도 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 상향조절되고:
라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제,
및/또한 적어도 하나 이상의 하기의 단백질이 과량발현되는 인간 장내 분리체:
라이신 2,3-아미노뮤타제; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 알파 서브유닛; L-베타-라이신 5,6-아미노뮤타제 베타 서브유닛; 3,5-디아미노헥사노에이트 탈수소효소; 3-케토-5-아미노헥사노에이트 절단효소; 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라아제; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 A; 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제 서브유닛 B; 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제,
이때, 박테리아가 탄소원으로서 등몰(equimolar)의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 배양됨
- 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당화된 라이신이 프룩토오스-라이신이고, 상기 당화된 라이신 흡수 및 분해 오페론이 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론인, 인간 장내 분리체.
- 제 4항에 있어서, 상기 프룩토오스-라이신 흡수 및 분해 오페론이 하기의 단백질을 코딩하는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 인간 장내 분리체:
프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스 페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반 체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA.
- 제 5항에 있어서, 하기의 단백질을 코딩하는 적어도 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 상향조절되고:
프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스 페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반 체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA,
및/또한 적어도 하나 이상의 하기의 단백질이 과량발현되는 인간 장내 분리체:
프룩토오스-라이신 키나아제; 프룩토오스-라이신 3-에피머라아제; 프룩토사민 디글리케이즈; ABC 운반체 원형질 스페르미딘 퓨트레신-결합 단백질 PotD; 스 페르미딘 퓨트레신 ABC 운반체 투과효소 성분 PotC; 스페르미딘 퓨트레신 ABC 운반 체 투과효소 성분 PotB; 및 퓨트레신 운반 ATP-결합 단백질 PotA,
이때, 박테리아가 탄소원으로서 등몰(equimolar)의 포도당 및 아세테이트에서 성장한 경우와 비교하여, 박테리아가 탄소원으로서 L-라이신에서 배양됨.
- 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 에리트로마이신에 민감하고, 에리트로마이신의 최소 저해 농도가 20 μg/㎖ 미만인 인간 장내 분리체.
- 기탁번호 CBS 139326으로 기탁된 인간 장내 분리체 또는 그로부터 유래된 균주.
- 상기 항들 중 어느 한 항에 따른 인간 장내 분리체 및 이의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
- 제 9항에 있어서, 식품 조성물, 바람직하게는 유제품, 더 바람직하게는 발효 유제품, 바람직하게는 요거트 또는 요거트 음료인 조성물.
- 제 9항 내지 제 10항에 있어서, 약학 조성물, 바람직하게는 캡슐, 정제 또는 분말과 같은 고체 투여 형태인 조성물.
- 제 11항에 있어서, 상기 박테리아성 균주에 속하는 박테리아가 동결 건조 또는 마이크로 캡슐화되거나 그 활성을 보존하는 다른 형태로 존재하는 조성물.
- 의약 용도로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 인간 장내 분리체 또는 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- 프로바이오틱 및/또는 공생 용도로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 인간 장내 분리체 또는 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- 일반적으로 위장관 건강을 유지, 회복 및/또는 개선시키거나, 및/또는 암(예를 들어, 대장암), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군(IBS), 비만, 박테리아성 및 바이러스성 설사, 변비, 복부팽창, 알러지, 요로감염, 대사 증후군 및 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환 또는 내분비 질환에서 인슐린 저항성뿐만 아니라, 이상 지질혈증(dyslipidemia) 및 제 2형 당뇨와 같은 인슐린 저항성 관련 합병증(예를 들어, 제 1형 당뇨, 쿠싱 증후군(Cushing's disease) 또는 지방 이상증(lipodystrophy syndromes)에 의한 비만), 심혈관 질환, 난소 노화, 다낭성 난소 증후군, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 또는 치매와 같은 신경 퇴행성 장애 또는 뇌병증과 같은 상태 또는 질환의 예방 및/또는 치료 용도로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 인간 장내 분리체 또는 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20170809 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20200828 Comment text: Request for Examination of Application |
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| PC1202 | Submission of document of withdrawal before decision of registration |
Comment text: [Withdrawal of Procedure relating to Patent, etc.] Withdrawal (Abandonment) Patent event code: PC12021R01D Patent event date: 20210119 |
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| WITB | Written withdrawal of application |