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KR20170095364A - 합성 이중-에피토프 화합물 - Google Patents

합성 이중-에피토프 화합물 Download PDF

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KR20170095364A
KR20170095364A KR1020177019780A KR20177019780A KR20170095364A KR 20170095364 A KR20170095364 A KR 20170095364A KR 1020177019780 A KR1020177019780 A KR 1020177019780A KR 20177019780 A KR20177019780 A KR 20177019780A KR 20170095364 A KR20170095364 A KR 20170095364A
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KR
South Korea
Prior art keywords
epitope
analyte
compound
test
immunoassay
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020177019780A
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English (en)
Inventor
플로랭스 벳스워스
상드린 뷔세르
까뜨린느 뽀티용
Original Assignee
비오메리으
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 비오메리으 filed Critical 비오메리으
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Abstract

본 발명은 식 I의 이중-에피토프 화합물에 관한 것이다:
[식 I]
Figure pct00010

상기 식에서, - E1 및 E2는, 동일하거나 상이한, 각각 독립적으로 분석물의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드 서열을 나타내고, - X 및 Y는, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 링커 암(linker arm)을 나타내며, - 캐리어 분자는 가용성이고, - Z는 캐리어 분자와의 결합 이전에 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 나타낸다. 본 발명은 또한 상기 화합물을 함유하는 조성물, 및 면역검정에서 대조군 또는 표준물로서 이러한 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 조성물의 용도, 대조군 또는 표준물로서 상기 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 조성물을 사용하는 방법, 및 최종적으로 상기 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 면역검정을 시행하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

합성 이중-에피토프 화합물{SYNTHETIC BI-EPITOPE COMPOUND}
본 발명은 진단 또는 예후 분야에 관한 것이다. 특히, 이는 면역검정의 실행동안 사용되는 합성 이중-에피토프 화합물(synthetic bi-epitope compound)에 관한 것이다.
면역검정은 임상, 식품, 약제 및 화학적 분석의 분야에서 일반적으로 사용된다. 따라서, 이들의 목적은 단백질(항원/항체), 펩타이드 또는 햅텐(hapten)의 형태, 예를 들면, 스테로이드 또는 비타민 형태의 다수의 분석물을 함유할 수 있는 샘플 속에서 이들 분석물의 존재를 측정하는 것이다. 면역검정은 검출될 분석물과 당해 분석을 위한 하나 이상의 결합 파트너(들) 사이의 면역학적 반응을 포함하는 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 시험이다. 이러한 면역검정의 예로서, "샌드위치(sandwich)" 원리에 따라서, 또는 또한 "경쟁" 원리에 따라서 작동시킬 수 있는 ELISA(효소 결합된 면역 흡착성 검정: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), ELFA(효소 결합된 형광성 검정: Enzyme Linked Fluorescent Assay) 및 RIA(방사 면역 검정: Radio Immuno Assay)과 같은 방법, 및 면역조직화학, 면역세포화학, 면역형광성, 웨스턴 블롯(Western blot) 및 도트 블롯(dot blot)과 같은 면역검출 방법을 언급할 수 있다.
특히 생물학적 시험 실험실에서 시행된 이들 면역검정은 결합 파트너, 리빌링 제제(revealing agent)와 같은, 시험에 필요한 제제 또는 종종 동시에, 연구될 샘플에 대한 시험의 조건과 유사한 조건 하에서 사용된, 면역검정이 정확하게 시행되었는지를 입증하기 위해 제공될 시험에 대한 양성 대조군의 희석 용액을 필요로 하는 시약 외에도, 제조업자에 의한 조항을 필요로 한다. 양성 대조군이 실제로 양성인 것으로 밝혀지는 경우, 당해 시험의 결과는 입증되고 해석될 수 있다. 양성 대조군이 양성인 것으로 밝혀지지 않는 경우, 이는 면역검정의 시행이 예측과 부합되도록 일어나지 않았음을 나타낸다. 타당하지 않은 시험의 결과는 이후에 해석되지 않아야 하고 분석이 재추천되어야 한다.
상기 분석물을 함유할 수 있는 생물학적 샘플 속의 면역검정에 의한 분석물의 정량화와 관련하여, 이는 시험 및 양성 대조군에 대해 필요한 상기언급한 시약외에, 표준 곡선의 사용을 필요로 한다. 당해 곡선은 i) 사용된 면역검정에서 분석물과 동일한 항원 반응성을 갖는 분석물 또는 화합물의 증가하는 및 공지된 양 또는 농도에 상응하는, 계측기(calibrator)라고 또한 불리는, 표준물에 의해 생성된 시그날(signal)을 측정하는 단계, ii) 및 이후에 상기 양 또는 농도의 함수로서 주어진 시그날을 곡선에 도시하는 단계에 의해 수득된다. 매우 흔히, 정량적 면역검정의 결과를 용이하게 계산할 수 있도록 하기 위하여, 시그날과 양 또는 농도 사이의 이러한 관계를 가능한 신뢰성있게 나타내는 수학적 모델을 찾는 것이 표준 실행이다.
이를 수행하기 위하여, 대조군 또는 표준 용액은 고려하는 분석물을 모사(mimic)하여야만 하고 면역검정에 사용된 결합 파트너에 의해 동일한 방식으로 인식되어야 한다. 따라서, 면역검정의 방법이 샌드위치 방법인 경우, 대조군 또는 표준 용액은 사용된 2개의 결합 파트너의 인식을 위한 2개의 에피토프(epitope)를 갖는 화합물을 포함하여야 한다. 용어 "이중-에피토프 화합물"은 이후에 사용된다.
이중-에피토프 화합물의 2개의 에피토프가 동일하여야 하는 것은 문제가 되지 않는다. 검출되거나 정량화될 분석물이 다량체, 적어도 이량체인 경우, 샌드위치 면역검정의 포획 및 검출시 동일한 결합 파트너를 사용하는 것이 가능하다. 당해 경우에, 이중-에피토프 화합물은 동일한 에피토프를 2회 함유할 것이다.
면역검정 시험에 일반적으로 사용된 대조군 또는 표준 용액은 사람 또는 동물 기원일 수 있으며 천연 상태에서 분석물 자체를 함유할 수 있다. 이들 용액은 동결건조물로부터 제조되어 단위 투여량으로 동결되고 -20℃ 또는 -80℃에서 저장된다. 이러한 저장은 유액 실험실 실시에는 적합하지 않다. 더욱이, 이들 동결건조된 대조군 또는 표준 용액은 이들을 사용하는 것이 가능하도록 하기 위해 재용해될 필요가 있다. 그러나, 면역검정 내용에서, 시험의 시행은 신속하여야만 하고 이러한 재용해는 시간의 손실을 초래한다. 더욱이, 이러한 재용해를 수행하는 것은, 희석에 기인한 편향으로 인하여 측정 오차를 가져올 수 있다. 즉시 사용형 대조군 또는 표준 용액은 +2/8℃에서 액체 형태로 저장되므로, 편리성의 명백한 이유에서 특히 추천된다. 그럼에도 불구하고, 검정의 실제 조건을 나타내기 위하여, 이들 즉시 사용형 대조군 또는 표준 용액은 관련된 분석물의 측정 범위에 따라, 단지 저 농도의 분석물, 예를 들면 약 1pg/ml, 1ng/ml 또는 1μg/mL를 함유하며, 이는 2/8℃의 온도에서 이들의 안정성이 영향을 받게 된다. 결과적으로, 이러한 단점을 극복하기 위하여, 합성 표준물이 사용되어 왔다.
유럽 특허원 제EP　0　650　053A호는 흡착성 구조물에 의해 다른 하나에 결합된 하나 이상의 수용체에 대한 활성 부위를 함유하는 합성 표준물을 기술하고 있다. 당해 출원은 보다 구체적으로 트로포닌 T 합성 표준물을 기술하고 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 표준물은 4℃에서 3주를 초과하지 않는 용액 속의 안정성 시간을 갖는다.
특허원 제WO 98/24816호는 이의 일부에서 트로포닌 I을 검정하기 위한 "샌드위치" 면역검정에서 표준물로서 사용될 수 있고, 수개월 동안 안정한 합성의 이중-에피토프 화합물을 제공한다. 식 Σ-E1-Ζ-E2-Ψ의, 기술된 화합물은 최소의 트로포닌 I 에피토프를 포함하는 2개의 펩타이드 서열 E1 및 E2를 포함하며, 이들 에피토프 각각은 1 내지 40개의 아미노산을 포함하는 중심 펩타이드일 수 있는 링커 그룹 Ζ에 의해 서로 결합되어 있다. 각각의 에피토프는 또한 이의 말단에 1 내지 10개의 아미노산의 펩타이드 서열(Σ 및 Ψ)를 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 특허원에서 제안된 용액은 기술된 이중-에피토프 화합물이 면역검정에 사용된 결합 파트너와 충분히 면역반응성이 되도록 하기 위하여, 유의적이지 않은 수의 아미노산을 가지지 않아서, 이들이 용이하게 합성되지 않도록 하여야 한다는 단점을 갖는다. 더욱이, 이들의 독특한 펩타이드 특성으로 인하여, 다량의 화합물이 면역검정에서 사용된 결합 파트너와 최적의 면역반응성을 가지도록 하기 위해 대조군 또는 표준 용액 속에서 요구되며, 이는 이러한 대조군 또는 이러한 표준물을 함유하는 키트(kit)의 제작자 및 이와 같이 생산된 키트를 사용하는 실험실에게 유의적인 비용이 들도록 함을 나타낸다.
특허 제US 6　114　180호는, 이의 일부에서, 용액 속에서 이의 가용성 및/또는 이의 안정성을 증가시킬 목적으로, BSA와 같은 캐리어 분자(carrier molecule)에 의해 서로 연결된 2개의 트로포닌 I 에피토프를 포함하는 면역검정에서 대조군 또는 표준물로서 사용될 수 있는 합성 화합물을 제안하고 있다. 그러나, 이러한 화합물의 특수한 구조는 이를 생산하기 어렵게하고 캐리어 분자에 연결된 2개의 에피토프 사이의 등몰성(equimolarity)의 문제를 유발한다.
본 출원인은 놀랍게도, 선행 기술에 기재된 단점을 극복하는 "샌드위치" 면역검정에서 사용될 합성 화합물을 확인하였다. 실제로, 이의 합성은 용이하고 단순하며, 이는 -2/8℃에서 저 농도에서 안정하고, 이는 가용성이며 이는 면역검정에 사용된 결합 파트너와 탁월한 면역반응성을 나타낸다. 더욱이, 화합물이 대조군 또는 표준 용액 속에 존재하는 경우, 면역검정에 사용된 결합 파트너와 최적의 면역반응성을 갖기 위하여, 이를 다량으로 사용하는 것이 필수적이지 않다. 마지막으로, 본 발명에 따른 화합물의 구조는 특히 2개의 에피토프의 등몰성(equimolarity)을 보장한다.
따라서, 본 발명의 제1 주제는 식 I의 이중-에피토프 화합물이다:
[식 I]
Figure pct00001
상기 식 I에서,
- E1 및 E2는, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 분석물의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드 서열을 나타내고,
- X 및 Y는, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 링커 암(linker arm)을 나타내며,
- 캐리어 분자는 가용성이고,
- Z는 캐리어 분자와의 결합 이전에 티올 작용기를 지니는 아미노산 유도체를 나타낸다.
본 발명의 다른 주제는 물, 완충제 또는 생물학적 유체 중의 용액 속에 식 I의 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
여전히 또 다른 주제는 이러한 이중-에피토프 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 이러한 조성물의 면역검정에서 대조군 또는 표준물 또는 조절인자로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 여전히 다른 주제는 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 조성물을, 대조군 및/또는 표준물 또는 조절인자로서 사용하는 면역검정 방법에 관한 것이다.
최종적으로, 본 발명의 마지막 주제는 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 이러한 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는, 면역검정을 시행하기 위한 키트이다.
따라서, 본 출원인은 모든 예측에 대하여, 상기 언급한 선행 기술의 모든 단점을 극복할 수 있도록 하는 합성의 이중-에피토프 화합물을 개발하여 왔다. 본 발명의 화합물은 하기 식 I을 갖는다:
[식 I]
Figure pct00002
상기 식 I에서,
E1 및 E2는, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 분석물의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드 서열을 나타내고,
- X 및 Y는, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 링커 암을 나타내며,
- 캐리어 분자는 가용성이고,
- Z는 캐리어 분자와 이의 결합 이전에 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 화합물은 이중-에피토프 화합물이다. 용어 "이중-에피토프 화합물"은 샌드위치 면역검정에서 분석물의 항원성 인식을 모사하기 위하여 하나 및 동일한 분석물의 2개의 에피토프를 포함하는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 물론, 어떠한 방식으로도 합성의 이중-에피토프 화합물은 이것이 모사하는 분석물과 동일한 서열로 이루어져 있다. 따라서, 당해 합성 화합물은 천연적으로 존재하는 아미노산의 서열, 예를 들면, 단백질 또는 단백질 단편에 상응하지 않는다. 본 발명의 화합물은 본 출원 전체에서 명백하고 동등한의 방식으로, 이중-에피토프 화합물, 비-천연 이중-에피토프 화합물, 합성의 이중-에피토프 화합물 또는 비-천연의 합성 이중-에피토프 화합물로 언급될 것이다.
예를 들어, 용어 "면역검정"에서 접두사 "면역"은, 본 출원에서는, 결합 파트너가 필수적으로 항체 또는 항체 단편과 같은, 면역학적 기원의 파트너임을 엄격하게 나타내는 것으로서 고려되어서는 안된다. 실제로, 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 당해 용어는 또한 결합 파트너가 면역학적 기원/특성의 파트너가 아니지만, 예를 들면, 이것이 검출하고/하거나 정량화하기를 원하는 분석물의 수용체로 이루어진 시험 및 방법을 나타내기 위해 보다 더 광범위하게 사용된다. 이의 기원 또는 이의 특성과 상관없이, 관련된 결합제 파트너는 고려하는 분석물에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있어야 한다. 따라서, 엄격한 의미에서 "리간드 결합 검정"으로서 또한 광범위하게 공지된 비-면역학적인 결합 파트너를 사용하는 검정의 경우 용어 "ELISA 검정"을 사용하는 것이 실제로 알려져 있는 반면, 용어 "면역"은 두문자어 ELISA에 완전하게(in extenso) 상응하는 용어 속에 포함된다. 명확성 및 획일성의 관점에서, 용어 "면역"은 본 출원에서 조사된 분석물을 결합시키고, 상기 결합 파트너가 엄격한 의미에서 면역학적 특성 또는 기원이 아닌 경우에서조차, 후자를 바람직하게는 구체적으로 검출하고/하거나 정량화하는데 적합한 적어도 하나의 결합 파트너를 사용한 어떠한 생물학적 분석도 나타내기 위해 사용된다.
샌드위치-형 면역검정(또는 보다 간단히 "샌드위치 면역검정")은 조사된 분석물에 특이적으로 결합하는 "포획 결합 파트너"로 명명된, 제1의 결합 파트너, 및 표지되고 또한 조사된 분석물에 특이적으로 결합함으로써 포획 결합 파트너와 분석물 사이의 결합을 나타냄으로써, 분석물의 존재를 나타내는 것으로 또한 의도된 "검출 결합 파트너"로 명명된 제2의 결합 파트너를 사용한다. 다시 말해서, 조사된 분석물은 "샌드위치에서" 상기 제1의 결합 파트너와 제2의 결합 파트너 사이를 취하며, 제1("포획") 결합 파트너는 일반적으로 조사된 분석물에 비해 과도하게 존재한다. 예를 들면, 상기 포획 결합 파트너는 고체 지지체 상에서(공유 결합, 흡착 또는 어떠한 다른 적절한 방법에 의해) 고정될 수 있다.
또한 항원성 결정인자로 불리는 에피토프는 항체의 가변성 부분인 파라토프(paratope)에 의해 인식될 수 있는 항원의 가장 작은 부분이다. 에피토프의 구조는 항체의 파라토프에 대해 상보성이다. 관여된 구조는 선형 에피토프의 경우에, 또한 순차적인 에피토프(sequential epitope)로 불리는 1차 구조, 또는 구조적 에피토프(conformational epitope)의 경우에, 또한 불연속 에피토프로 불리는 3차 구조일 수 있다.
선형 에피토프의 서열은 특이성의 관점으로부터 에피토프와 항체 사이의 결합을 유의적으로 변화시키지 않는 "보존적" 변형을 포함할 수 있다.
미모토프(mimotope)는 제공된 에피토프의 3차원 구조를 모사하는, 거대분자, 흔히 펩타이드이다. 상기 에피토프를 인식하는 항체는 또한 당해 에피토프를 모사하는 미모토프를 인식하여 결합할 수 있다. 단백질 특성의 항원의 경우, 따라서 선형인 펩타이드 미모토프는 흔히 구조적 에피토프를 모사하기 위해 사용된다. 본 발명에 따라서, 구조적 에피토프는 미모토프로 대체될 수 있다. 미모토프는 또한 용어 에피토프에 대한 대체물로서 본 출원의 범위에 포함된다.
항원이 흔한 경우로서, 단백질 특성인 경우, 선형 에피토프 및 미모토프는 다양한 길이의 펩타이드 서열에 상응한다. 선형 에피토프의 경우에, 최소의 에피토프와 최적의 에피토프의 인식 사이가 구별되어져야 한다. 최소의 에피토프는 상응하는 항체에 의해 특이적으로 인식된 가장 작은 크기의 펩타이드 서열에 상응한다. 상기 펩타이드 서열의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산이 결실된 경우, 항체의 결합은 더 이상 가능하지 않으며, 인식은 상실된다. 최소의 에피토프는 3 내지 20개의 아미노산, 보다 흔히 4 내지 8개의 아미노산을 함유할 수 있다.
최적의 에피토프는 특이적으로 인식되며 상응하는 항체와 관련하여 가장 우수한 가능한 반응성(가장 강한 시그날)을 갖는다. 이는 매우 흔히 길이가 6 내지 30개 아미노산인 펩타이드 서열을 포함한다. 일반적으로 최적의 에피토프는 최소의 에피토프를 포함한다. 드믄 경우에, 최적의 에피토프 및 최소의 에피토프가 합해질 수 있다.
본 발명의 화합물은, 이것이 분석물의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 2개의 펩타이드 서열 E1 및 E2를 함유하도록 존재한다. 표현 "분석물의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드 서열"은 당해 펩타이드 서열이 최소의 에피토프의 적어도 아미노산으로 이루어짐을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 하나의 구현예에 따라서, 펩타이드 서열은 기껏해야 최적의 에피토프의 아미노산으로 이루어진다. 물론, 당해 분야의 숙련가는, 최적의 에피토프의 한쪽 측면에 또는 양쪽 측면에 항원성 인식에 있어 아주 큰 효과를 가지지 않고, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산을 가할 수 있음을 알고 있다. 이러한 추가의 아미노산은 또한 상기 정의 내에 포함된다.
이들 펩타이드 서열의 아미노산은 분석물의 서열에서 천연적으로 발견된 아미노산 또는 또한 유사한 아미노산일 수 있다. 용어 "유사한 아미노산(analogous amino acids)"은, 천연적으로 발생하는, 즉, 아미노산의 계열에서 일어나는, 보존적 치환의 대체인, 2개의 아미노산을 의미하는 것으로 의도된다. 구체적으로, 아미노산은 일반적으로 4개의 계열, 즉, (1) 아스파르테이트 및 글루타메이트와 같은 산성 아미노산, (2) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 아미노산, (3) 알라닌, 류이신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판과 같은 비극성 아미노산 및 (4) 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 타이로신과 같은 극성의 하전되지 않는 아미노산으로 나누어진다. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 예를 들면, 류신의 이소류신 또는 발린으로의 분리된 대체, 아스파르테이트의 글루탐산으로의 분리된 대체, 트레오닌의 세린으로의 분리된 대체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 다른 아미노산으로의 유사한 보존적 대체를 생물학적 활성 또는 항원성에 주요한 효과를 가지지 않을 것이라는 사실은 충분히 예측될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 당해 분야에 잘 알려진 호프(Hopp)/우드(Woods) 및 차이트-둘라이트 플롯(Kyte-Doolite plot)을 참조하여 변화를 견딜 수 있는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 하나의 구현예에 따라서, 펩타이드 서열의 아미노산은 분석물 속에서 천연적으로 발견된 아미노산이다. 다른 구현예에 따라서, 펩타이드 서열 E1 또는 펩타이드 서열 E2 또는 둘 다는 미모토프(mimotope)이며 결과적으로 펩타이드 서열의 아미노산은 분석물 속에 천연적으로 발견된 아미노산과는 매우 상이하다.
용어 "분석물(analyte)"은 분석(analysis)에 의해 검출되고/되거나, 확인되고/되거나 정량화된 샘플 속에 함유된, 생물학적 기원의 물질을 나타낸다. 광의의 의미에서, 하나 이상의 분석물의 대상인 화학적, 생물학적 또는 생화학적 물질을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 분석물의 예로서, 단백질 또는 펩타이드가 언급될 수 있다.
분석물은 배지 속에서 병리학적 조건 또는 미생물의 존재를 나타낼 것이다. 용어 "병리학적 조건"은 환경적(감염성), 유전적 및/또는 생물학적 인자와 같은 다수의 인자에 의해 유발된 질환으로 인한, 환자의 건강의 어떠한 손상된 상태를 의미하기 위해 의도된다. 질환의 예로서, 바이러스, 세균 또는 기생충(간염, 패혈증 등)과 같은 미생물, 자가면역 질환, 신경변성 질환, 암(유방, 전립샘, 결장 등), 심혈관 질환(심근 경색 등) 등이 언급될 수 있다. 이후에, 분석물은 다양한 질환과 관련된다. 분석물의 예로서, 심근 경색용 분석물로서 사용되는 심장 트로포닌 I 및 결장암 분석물로서 프로디펜신-A6가 언급될 수 있다. 이들 분석물은 후속적으로 보다 상세히 기술될 것이다. 일 구현예에 따라서, E1 및 E2는 적어도 하나의 심장 트로포닌　I 에피토프 또는 프로디펜신-A6 에피토프를 포함하는 펩타이드 서열이다.
중심 라디칼 Z는 캐리어 분자와 이의 결합 전에 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체이다. 용어 "아미노산 유도체"는 이것이 결합된 링커 암 X 및 Y와 함께 2개의 펩타이드 결합 -CO-NH-를 형성하는 어떠한 분자도 의미하는 것으로 의도된다. 이를 수행하기 위해, 상응하는 아미노산은 링커 암 X 또는 Y와 결합하기 전에, 반응성 그룹 -NH2 및 반응성 그룹 -COOH를 포함한다. 링커 암 X 및 Y에 결합한 후, 따라서 아미노산 유도체는 캐리어 분자와 이의 결합 전에 티올 작용기(-SH)를 포함한다. 이러한 라디칼 Z의 예는 시스테인 유도체, 호모시스테인 유도체 및 페니실아민 유도체를 포함한다. 이들 유도체를 형성하는데 사용된 상응하는 아미노산은 물론 시스테인, 호모시스테인 및 페니실린이며, 이들은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 아미노산이다.
본 발명의 화합물의 2개의 링커 암 X 및 Y는 서로 동일하거나 상이하다. 링커 암은 한편으로는 E1 또는 E2와, 다른 한편으로는 중심 라디칼 Z와 2개의 펩타이드 결합 -CO-NH-를 각각 형성하는 이들의 능력을 특징으로 한다. 링커 암 X 및 Y는 이후에 그룹 -NH 및 그룹 -CO를 포함하는 아미노산 유도체이다. 이를 수행하기 위해, 링커 암을 형성하는데 사용된 화합물은 펩타이드 서열 E1 또는 E2와 이의 결합 전에, 반응성 그룹 -NH2 및 반응성 그룹 -COOH를 포함한다. 물론, 링커 암은 다른 그룹, 예를 들면, 자체로는 반응성이 아니거나 이들이 당해 분야의 숙련가에게 공지된 보호 그룹, 예를 들면, 트리틸, t-부틸 에테르 벤질 또는 벤질 에스테르 그룹에 의해 보호되어 있으므로 반응성이 아닌 측쇄 그룹을 포함할 수 있다. 링커 암은, 이들이 본 발명의 이중-에피토프 화합물에 관여되기 전에 반응성 그룹 -COOH 및 반응성 그룹 -NH2를 각각 갖는 하나 이상의 화합물로부터 수득될 수 있다. 이들 화합물은 "링커 암을 형성하는데 사용된 단량체"로 언급될 것이다.
링커 암을 형성하는데 사용된 단량체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된, 생물학적 단백질의 합성을 위해 요구되는 단백질생성(proteingenic) α-아미노산일 수 있다. 이들 단백질 생성 α-아미노산은 유전학적으로 암호화되며, 이 경우 이들 중 22개가 존재한다. 모든 살아있는 것에 균일하게 분포하는 이들 단백질생성 α-아미노산은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르테이트, L-시스테인, L-글루타메이트, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신 및 L-발린이다. 다른 2개의 단백질생성 아미노산은 훨씬 더 드믈고: L-피로라이신은 일부 메탄생성 고세균류에서만 발견되며 L-셀레노시스테인은 옥시도리덕타제 계열의 일부 효소에서만 존재한다.
이들 22개의 유전적으로 암호화된 아미노산 외에, 효소적 변형, 예를 들면, L-시트룰린, L-피로글루탐산, L-오르니틴, L-3,4-디하이드록시페닐알라닌, γ-아미노부티르산 및 도모익산에 의해 상기로부터 수득될 수 있는 수십개의 다른 생물학적 아미노산이 존재한다.
링커 암을 형성하는데 사용되는 단량체는 또한 인공 아미노산, 즉, 비-생물학적 아미노산으로 또한 공지된 슈도 아미노산일 수 있다. 이 경우에, 유일한 요건은 이들 화합물이 2개의 유리 작용기, -COOH 및 -NH2를 포함한다는 것이다.
본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 링커 암 X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 하나 이상의 아미노산 유도체(예를 들면, 단백질생성 α-아미노산, 및/또는 슈도 아미노산)을 포함한다. 링커 암은 1 내지 6개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 4개의 아미노산으로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 링커 암은 서열 GGGS, 또는 서열 SGGG, 또는 서열 GSGSGS 또는 또한 서열 SGSGSG를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라서, 즉, E1/E2/Z와의 펩타이드 결합의 형성 후, 식 I에서 X 및 Y는 하기 식 II의 단량체의 하나 이상의 유도체를 나타낸다:
[식 II]
-NH-R-CO-
상기 식 II에서,
R은 그룹 (-C(R')H-C(R"))H, (-C(R')H-C(R")H-O-), (-C(R')H-) 및 (-C(R')H-O-)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 이루어진 라디칼이고,
R' 및 R"는 수소, 하이드록실 그룹 및 C1-C5 알킬 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
일 구현예에 따라서, R은 (-CH2-CH2-O-), (-CH2-O-) 및 (-CH2-)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 이루어진다. 하나의 특수한 구현예에 따라서, 라디칼 R은 1 내지 6개의 그룹 (-CH2-CH2-O-), 바람직하게는 1 내지 4개의 그룹 (-CH2-CH2-O-)을 포함할 수 있다. 라디칼 R의 비제한적 예로서, 펜타옥사옥타데카노일, 테트라옥사펜타데카노일, 트리옥사도데카노일, 트리옥사트리데카노일, 디옥사옥타노일, 옥사펜토일 및 헥사옥사헤네이코사노일 및 이들의 유도체가 언급될 수 있다. 식 II의 단량체 유도체를 제공하기 위해 사용되는 화합물의 예로서, 공지된 슈도 아미노산인, 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산(CAS No.: 134978-97-5)가 언급될 수 있다. 예를 들면, 링커 암은 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산, (Ado)2 또는 (Ado)3의 이량체 또는 삼량체일 수 있다.
라디칼 R의 그룹의 다른 예로서, 상기 언급한 생물학적 아미노산 유도체(biological amino acid derivative)의 잔기 형태(residue form), 즉, 이들의 -COOH 및 -NH2 그룹을 지니지 않지만 -NH- 그룹 및 -CO- 그룹을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 링커 암을 형성하는 화합물이 식 (CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH의 류신(leucine)인 경우, 식 II의 화합물의 R은
Figure pct00003
일 수 있다.
각각의 링커 암은 2개의 말단의 -CO 그룹과 -NH 그룹 사이에, 10 내지 60Å, 바람직하게는 20 내지 30Å의 크기를 갖는데, 이는 본 발명의 하나의 특수한 구현예를 구성한다.
링커 암 X 및 Y를 형성하기 위해 사용되는 단량체가, 이들이 본 발명의 이중-에피토프 화합물에 관여되기 전에 반응성 그룹 -COOH 및 -NH2를 가지고 펩타이드 결합의 형성을 허용하므로, 서열 E1-X-Z-Y-E2는 이후에 이중-에피토프 펩타이드로 언급되는 펩타이드이어서, 펩타이드 합성에 의해 생산될 수 있는 것으로 고려될 수 있으며, 이는:
- 용이하고, 신속하며 표준화된, 재생가능하고 단순화된 합성,
- E1 및 E2와 관련하여 등몰인 화합물의 생산
의 장점을 갖는다.
이중-에피토프 펩타이드는 문헌(Merrifield, 1963)에 기술된 고체-상 펩타이드 합성과 같은, 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 과정에 따라 수득된다. 당해 기술의 개선은 문헌(Fields and Noble, 1990)에서 토의되며 논의되어 있다. 이러한 합성은 제1의 C-말단 아미노산이 부착된 고체 상을 사용한다. 이와 관련하여, 첨가되어 펩타이드를 형성하는 신규한 아미노산의 각각의 -NH2 그룹은 Fmoc(9-플루오레닐메톡시카보닐) 또는 Boc(t-부톡시카보닐) 유형의 보호 그룹으로 보호되어 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 바와 같이, 고체 상에 의해 제공된 -NH2 그룹과 첨가된 신규 아미노산의 -COOH 그룹 사이의 반응을 촉진한다.
본 발명에 따라서, 이중-에피토프 펩타이드의 길이는 100개 아미노산에 상응하는 길이를 초과하지 않으며, 바람직하게 이는 20 내지 30개 아미노산에 상응하는 길이를 초과하지 않고 보다 바람직하게는 25 내지 27개의 아미노산에 상응하는 길이를 초과하지 않는다.
이중-에피토프 펩타이드는 라디칼 Z를 통해 캐리어 분자에 결합된다. 캐리어 분자는 이중-에피토프 화합물을 안정화시키는 역활을 가지며 상기 이중-에피토프 화합물의 분석물의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드 서열 E1 및 E2가 보다 이용가능하도록 하며, 이는 동시에 E1과 E2 사이의 등몰성을 보존한다.
용어 "캐리어 분자(carrier molecule)"는 펩타이드에 커플링될 수 있는 어떠한 가용성 분자도 의미하는 것으로 의도된다. 가용성 분자로서, 소 혈청 알부민, 면역글로불린 G 및 타이로글로불린과 같은 단백질, 및 폴리라이신과 같은 중합체가 언급될 수 있다. 일 구현예에 따라서, 캐리어 분자는 분자량이 20　kDa 내지 700　kDa, 바람직하게는 60　kDa 내지 250　kDa인 단백질이다.
폴리라이신은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 중합체이다. 이들은 예를 들면, Sigma-Aldrich로부터 이용가능하다.
소 혈청 알부민 및 타이로글로불린은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 면역글로불린 G의 경우, 이것이 면역검정의 항체를 수득하기 위해 사용된 종으로부터, 또는 샘플이 분석될 종으로부터 오지 않도록 선택하여, 간섭 문제를 피한다. 예로서, 토끼, 마우스, 말, 염소, 돼지 등의 면역글로불린 G(비-독립적인 목록)가 언급될 수 있다.
일 구현예에 따라서, 캐리어 분자는 소 혈청 알부민이다.
다른 구현예에 따라서, 캐리어 분자는 항체가 마우스로부터 오고 분석될 샘플이 사람으로부터 오는 면역검정에서 토끼 면역글로불린 G이다.
이중-에피토프 펩타이드와 라디칼 Z의 수준에서 단백질 특성의 캐리어 분자 사이의 커플링은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 방법에 따라서, 공유결합으로 일어날 수 있다. 라디칼 Z의 측쇄에 존재하는 설프하이드릴 그룹(-SH)은 말레이미드, 할로아세틸 및 피리딜 디설파이드 그룹과 반응성이다. 따라서, 제1 단게에서, 캐리어 분자는 캐리어 분자의 접근가능한 아민 그룹(-NH2)의 수준에서 반응성일 수 있으므로, 캐리어 분자의 표면에서 말레이미드 또는 할로아세틸로부터 선택된 반응성 그룹을 도입할 수 있을 몰 과량의 가교결합제와의 반응에 의해 활성화되어야 한다. 이들 그룹은 안정한 티오에테르 결합을 통해 커플링을 수득할 수 있도록 하므로 바람직하다. 말레이미드 그룹을 도입하는 것을 가능하도록 하는 가교결합제 중에서, 비-독점적으로 N-(ε-말레이미도카프로일옥시)석신이미드 에스테르, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 또는 다른 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트가 언급될 수 있다. 할로아세틸 그룹을 도입하는 것을 가능하게 하는 가교결합제 중에서, 비-독립적으로, N-석신이미딜(4-요도도아세틸)아미노벤조에이트 및 설포석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트가 언급될 수 있다. 활성화된 캐리어 분자는 이후에 탈염에 의해, 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 또는 다른 투석에 의해 정제되어 과도한 가교결합제 및 부산물을 제거한다. 마지막으로, 활성화된 캐리어 분자는 비교적 중심 위치에서 라디칼 Z를 포함하는 이중-에피토프 펩타이드의 존재하에 위치한다. 말레이미드 또는 할로아세틸 그룹은 이중-에피토프 펩타이드의 라디칼 Z의 설프하이드릴 그룹(-SH)과 반응하여 안정한 공유 티오에테르 결합을 형성한다. 말레이미드와 설프하이드릴 그룹 사이의 반응은 중성 pH(pH 6.5 내지 7.5)에 근접한 조건하에서 수행될 수 있으며 외부 티올, 예를 들면, 대부분의 환원제를 반응 완충제의 조성물로부터 배제하여 커플링 부위에 대한 경쟁을 피하여야 한다. 할로아세틸 그룹과 설프하이드릴 그룹 사이의 반응은 pH 7.2 내지 9에서 수행하여야 한다. 타이로신, 히스티딘 및 트립토판과 반응할 수 있는 유리 요오드의 생성을 제한하기 위하여, 반응을 암실에서 수행하는 것이 바람직하다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된, 이러한 방법은 예를 들면, "Chemistry of protein Conjugation and Cross-linking" by Shan S. Wong, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, United States, 1991에 기술되어 있다.
라디칼 Z에서 이중-에피토프 펩타이드의 커플링을 촉진하기 위하여, 링커 암 X/Y 및/또는 펩타이드 서열 E1/E2이 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 함유하는 경우, 상기 펩타이드의 형성을 위해 당해 티올 작용의 수준에서 상기 펩타이드의 합성 단계 동안 및 또한 캐리어 분자와의 커플링 동안 안정한 보호 그룹으로 보호된 아미노산을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 라디칼 Z를 제공하기 위해 사용된 아미노산만이 반응성 티올 작용기를 지닐 것이다. 암 X/Y 및/또는 펩타이드 서열 E1/E2의 티올 작용기를 보호하는 이러한 단계를 피하기 위하여, X, 또는 Y, 또는 E1 또는 E2도 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 함유하지 않는 것이 바람직하며, 이는 본 발명의 하나의 특수한 구현예를 구성한다.
이들의 티올 작용 수준에서 보호된 아미노산은 예를 들면, Novabiochem®으로부터 이용가능하다.
이중-에피토프 펩타이드를 캐리어 분자와 커플링한 후, 티올 작용은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술에 따라 임의로 탈보호시킬 것이다. 보호 그룹으로서, DTT(디티오트레이톨)의 존재하에서 수성 매질(0.1M 중탄산암모늄) 속에서 용이하게 제거되는 t-부틸티오 그룹이 언급될 수 있다. 커플링 암 X/Y만이 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 함유하는 경우, 이러한 탈보호는 필수적이지 않을 것이며 추천되지 않을 것이다. 펩타이드 서열 E1/E2가 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 함유하는 경우, 이러한 탈보호는 이것이 에피토프 인식에 영향을 미치는 경우 필수적일 것이다.
커플링 암(coupling arm) 및/또는 펩타이드 서열이 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 함유하지 않도록 하는 것이 또한 가능하다. 따라서, 본 발명의 이중-에피토프 화합물은 다음 특성들 중의 하나 이상을 포함한다:
- 링커 암 X는 티올 작용기를 지닌 아미노산을 포함하지 않는다,
- 링커 암 Y는 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 포함하지 않는다,
- 펩타이드 서열 E1은 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 포함하지 않는다, 및
- 펩타이드 서열 E2는 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 포함하지 않는다.
하나의 특수한 구현예에 따라서, 펩타이드 서열 E1 및 E2는 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 포함하지 않는다. 여전히 다른 구현예에서, X, Y, E1 및 E2 중 어느 성분도 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 포함하지 않는다.
본 발명의 화합물은, 면역검정시 이의 시행을 위해, 물, 완충제 또는 생물학적 유체 속의 용액으로서 상기 식 I의 화합물을 포함하거나 함유하는 조성물 속에 함유될 수 있으며, 이는 본 발명의 다른 목적을 구성한다.
물 속의 용액으로서 식 I의 이중-에피토프 화합물을 함유하는 조성물은 상기 화합물의 완전한 용해에 의해 수득된 투명한 액체 용액이며 이의 주요 용매는 용액의 총 용적에 대해 적어도 50용적%를 나타내는 물이다. 용매의 양은 물론 관련된 분석물에 의존하며 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 것이다.
식 I의 화합물은 또한 완충제 속의 용액일 수 있다. 사용될 완충제는 당해 분야의 숙련가에게 광범위하게 공지되어 있으며 관련된 분석물에 의존한다. 완충제의 예로서, PBS, HEPES 및 트리스-HCl 완충제와 같은 완충제가 언급될 수 있다.
조성물이 생물학적 유액을 함유하는 경우, 상기 유액은 시험하기에 바람직한 샘플에 상응할 수 있다. 예로서, 전혈(total blood) 또는 이의 유도체, 예를 들면, 혈청 또는 혈장, 뇨, 타액 또는 삼출액(effusion)이 언급될 수 있다.
본 발명의 조성물 중 식 I의 화합물의 양은 관련된 분석물 및 상응하는 측정 범위에 의존한다. 이는 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 것이다. 따라서, 이는 약 1pg/ml, 1ng/ml 또는 1μg/ml일 수 있다.
특히, E1, E2, X, Y, Z, 캐리어 분자 및 분석물의 선택과 관련하여, 앞서 기술된 동일한 특징 및 선호도(preference)를 또한 본 발명의 조성물에 적용한다.
물론, 본 발명의 조성물은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된, 염과 같은 다른 화합물, BSA와 같은 충전제 단백질 또는 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜 유형의 합성 중합체, 또는 세제(detergent)를 포함할 수 있다.
앞서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물 및 조성물은 용이하게 합성되고 +2/8℃에서 안정하며 면역검정의 조건하에서 가용성이므로 특히 유리하다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 모든 예측에 대해 매우 높은, 즉 결합 파트너가 이들을 특히 잘 인식하는 면역검정에서 사용된 결합 파트너에 대해 면역반응성을 가짐으로써, 이들을 대조군, 표준물 및/또는 조절인자로서 사용하는 것이 바람직한 경우, 이들은 상기 대조군, 표준물 및 조절인자 용액 속에 소량으로 함유될 수 있으며,동시에 면역검정 조건하에서 안정하다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 면역검정에서 대조군, 표준물 또는 조절인자로서 이러한 이중-에피토프 화합물 또는 이러한 화합물을 함유하는 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
용어 "식 I의 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 조성물의 대조군으로서의 용도"는 특히, 면역검정이 예측에 따라 작동하는(또한 양성 대조군으로 불림) 및 시험 샘플 속의 분석물의 검출이 거짓의 음성이 아님을 입증하는 이의 용도를 의미하는 것으로 의도된다.
표현 "식 I의 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 조성물의 표준물(standard)로서의 용도"는 표준 범위를 확립하기 위한 이의 용도를 의미한다. 분석물의 정량화를 수행할 수 있는 필수적인 단계인, 표준 범위의 확립은 이미 기술된 바와 같은 당해 분야의 숙련가에게 광범위하게 공지된 단계이다. 이는 양 또는 농도의 기능으로서 시그날을 제공하는 곡선을 플롯팅하는데 있어서 및 가능한 신뢰성있게 당해 관계를 나타내는 수학적 모델을 발견하는데 있어서, 분석물의 공지된 양 또는 농도를 증가시킴으로써 생성된 시그날을 측정하는 것으로 이루어진다. 이를 수행하기 위하여, 본 발명의 수개의 수성 조성물이 사용되며, 이들 각각은 상이한 농도의 분석물을 함유한다. 수학적 모델은 시험 샘플 속에 함유된 분석물의 미지의 양 또는 농도를 외삽하여 측정하는데 사용될 것이다.
표현 "특히 표준인, 식 I의 화합물 또는 당해 화합물을 함유하는 조성물의, 또한 측정기라고 불리는, 조절 장치로서의 용도"는 분석물의 면역검정의 측정을 조절하기 위한 이의 용도를 의미하는 것으로 의도된다. 이 경우에, 분석물의 농도는 고정되며 알려져 있다. 조절 장치에 의한 면역검정시 사용하는 동안 생성된 시그날이 또한 알려져 있다. 조절 장치는 면역검정의 시행 동안 생산된 측정(시그날)이 실제로 예측된 값에 상응하는지를 입증하기 위해 제공된다. 이것이 당해 경우에 해당되지 않는 경우, 조절 장치는 적절하게는 측정 장치(조정)에 있어서 물리적 개입에 의해 수학적으로 정확하거나 정확하도록 하는 것이 가능할 편차를 측정하기 위해 제공된다. 편의상, 용어 "표준"은 본 출원에서 용어 "조절 장치(adjuster)"를 포함할 것이다.
앞서 나타낸 바와 같이, 분석물은 분석에 의해 검출되고/되거나, 확인되고/되거나 정량화되는, 샘플 속에 함유된 생물학적, 화학적 또는 생화학적 기원의 어떠한 물질이다.
제1 구현예에 따라서, 분석물은 심장 트로포닌 I이고 식 I의 화합물 또는 이를 함유하는 조성물은 심장 트로포닌 I 면역검정에서 대조군, 표준물 또는 조절 장치로서 사용된다.
트로포닌이 3개의 단백질, 트로포닌 I, T 및 C로 이루어진 근원섬유 단백질 복합체임은 알려져 있다. 당해 단백질 복합체는 미오신 및 액틴과 상호작용함으로써, Ca2 + 이온-매개된 근육 수축의 조절에 기여하는 것이 가능하도록 한다.
심장 트로포닌 I(유니프로트(Uniprot) 수탁 번호 제P19429호)은 미오신과 액틴 사이의 결합의 억제에 관여하는 트로포닌 소단위이다.
심장 트로포닌 I 에피토프 및 미모토프(mimotope)는 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 본 발명의 하나의 특수한 양식에서, 펩타이드 서열 E1 및 E2는 다음의 서열로부터 선택된다:
서열 1: ATEPHAKKK
서열 2: AGLGFAELQDL
서열 3: KISASRKLQLKT
아미노산의 치환, 결실 또는 삽입에 의한 상기 펩타이드 서열로부터 기원한 펩타이드 서열은, 이들이 문제의 항체에 의해 인식될 능력을 보유하는 한, 본 발명의 분야에 속한다.
다른 구현예에 따라서, 식 I의 화합물 또는 이를 함유하는 조성물은 프로디펜신-A6 면역검정에서 대조군, 표준물 또는 조절 인자로서 사용된다.
디펜신(Defensin)은 미생물 공격에 대한 숙주 방어에 관여하는 항미생물 펩타이드의 계열이다. 성숙한 형태에서, 이들은 30 내지 40개 아미노산으로 이루어지며 막을 선택적으로 분해하는 특성을 갖는다. 다른 진핵세포 단백질과 유사하게, 디펜신은 성숙한 단백질 형태로 뿐만 아니라 전구체 형태로도 존재할 수 있다. 용어 "프로디펜신"이 이후에 사용된다. 프레디펜신-A6(유니프로트 수탁 번호 제Q01524호)은 특히 본 출원인의 특허원 제WO　2010/112777호에서, 가능한 한 암 및 특히 직결정암과 관련하여 마커로서의 용도인 것으로 기술되어 있다.
프로디펜신-A6 단백질 에피토프 및 미모토프는 공지되어 있으며 예를 들면, 특허원 제WO　2010/112777호에 기술되어 있다. 본 발명의 하나의 특수한 유형에서, 펩타이드 서열 E1 및 E2는 다음의 서열들의 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 단 E1은 하나의 그룹으로부터 선택되고, E2는 다른 그룹으로부터 선택된다:
그룹 1:
- 서열 4: NYVTPPWAIFRH
- 서열 5: WTGVLSPTQEYR
- 서열 6: SHLTPPWMDYRV
- 서열 7: VMAVTCSTCDSR
- 서열 8: LTPPTEDLRPPD
그룹 2:
- 서열 9: YGNHSCTHIGHC
- 서열 10: GPSYTCLHFGHC
- 서열 11: TEREVHNWFPFH
그룹 3:
- 서열 12: YPHPWSMHVIRA
- 서열 13: TTTPHPWALFAV
- 서열 14: TPHPWQRWVVYS
- 서열 15: EDVLRWHPEWPG
그룹 4:
- 서열 16: YHETWPPKSAQL
- 서열 17: YHDNWPQPSRSW
- 서열 18: QHNHQRHGAMGA
- 서열 19: YHDMWPMSGRMA
- 서열 20: YHDNWPPLNGAR
- 서열 21: YHDMWPAIQLSP
- 서열 22: YHEKFPGPVVLP
그룹 5:
- 서열 23: QAEDDPLQAK
이들 대조군, 표준물 및/또는 조절인자는 분석물을 함유할 수 있는 시험 샘플 속에서 면역검정에 의해 분석물을 검출하고/하거나 정량화하는데 있어서 사용하기에 특히 접합하다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은, 분석물을 함유할 수 있는 시험 샘플 속에서 면역검정에 의해 상기 분석물을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
i. 시험 샘플을 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴에 의한 면역검정 시험 단계,
ii. 양성 대조군으로서 앞서 정의한 바와 같은 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 앞서 정의한 바와 같은 조성물을 상기 분석물에 대한 상기 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴으로써 면역검정 시험의 유효성을 입증하기 위한 시험 단계,
iii. 유효성 입증 시험이 양성인지에 대한 면역검정 시험의 판독 단계,
iv. 단계 i의 면역검정 시험에 의해 수득된 시그날이 면역검정 시험의 검출 한계점(threshold)보다 큰 경우 시험 샘플 속에서의 상기 분석물의 존재의 측정 단계 .
본 발명과 관련하여 시험 샘플은 다양한 기원, 예를 들면, 식품, 환경, 생물학적, 수의학적, 임상학적, 약제학적 또는 화장 기원일 수 있다.
식품 기원의 샘플 중에서는, 비-배타적으로, 우유 제품의 샘플(요구르트, 치즈 등), 고기, 어류, 달걀, 과일, 야채, 물, 음료(우유, 과일 쥬스, 탄산수 등)를 언급할 수 있다. 물론, 식품 기원의 이들 샘플들은 또한 소스(sauce) 또는 정교한 음식 또는 형질전환되지 않거나 부분 형질전환된 원료로부터 올 수 있다. 음식 샘플은 또한 오일 케이크 또는 동물 고기와 같은 동물 사료로부터 유도될 수 있다. 모든 이들 샘플은, 이들이 액체가 아닌 경우, 액체 형태가 되도록 예비처리된다.
앞서 나타낸 바와 같이, 샘플은 환경 기원일 수 있으며 예를 들면, 표면 샘플링, 물 샘플링 등으로 이루어질 수 있다.
샘플은 또한 생물학적 샘플, 사람 또는 동물 기원으로 이루어질 수 있으며, 이는 생물학적 유체(뇨, 전혈 또는 혈청 또는 혈장과 같은 유도체, 타액, 고름, 뇌척수액 등), 대변(예를 들면, 콜레라성 설사), 코, 인후, 피부, 상처, 기관, 조직 또는 분리된 세포 샘플링, 또는 면봉 샘플에 상응할 수 있다. 상기 목록은 명확하게 배타적인 것은 아니다.
일반적으로, 용어 "샘플"은 하나 이상의 분석 목적용 실체로부터 취한, 부위 또는 양, 보다 특히 소 부위 또는 소량을 말한다. 이러한 샘플은, 특히 출발 실체가 고체 상태인 경우, 예를 들면, 혼합, 희석 또는 다른 분쇄 단계를 포함하는 예비처리를 임의로 겪을 수 있다.
분석된 샘플은 일반적으로 검출되거나, 특징화되거나 언급될 미생물 또는 질환의 존재를 대표하는 적어도 하나의 분석물을 함유할 수 있거나, 함유하는 것으로 예측된다.
면역검정에 의해 분석물을 검출하는 당해 방법의 단계는 이미 기술된 당해 분야의 숙련가에게 광범위하게 공지된 단계이다. 특히, 제1 단계는 시험 샘플을 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너, 바람직하게는 샌드위치 시험을 위한 2개의 결합 파트너와 접촉시키는 것으로 이루어진다. 앞서 기술한 바와 같이, 2개의 파트너 중 하나는 표지에 커플링시켜 접합체(conjugate) 또는 트레이서(tracer)를 형성할 수 있다. 다른 결합 파트너는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 고체 지지체 상에 포획될 수 있다. 용어 "포획 파트너"는 이후에 후자를 위해 및 전자를 위한 "검출 파트너"로 사용된다.
접합체에 의해 방사된 측정된 시그날은 이후에 생물학적 샘플 속의 분석물의 양에 비례한다.
목적한 분석물에 대한 결합 파트너는 분석물에 결합할 수 있는 어떠한 분자이다. 분석물에 대한 결합 파트너의 예로서, 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된, (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체 및 항체 단편과 같은 면역학적 특성 또는 기원의 결합 파트너, 및 또한 나노피틴, 이들이 존재하는 경우 분석물에 대한 수용체, 아프타머(aptamer), DARPin 또는 상기 분석물과 상호작용하는 것으로 공지된 어떠한 다른 분자와 같은 면역학적 특성 또는 기원이 아닌 결합 파트너가 언급될 수 있다.
나노피틴(Nanofitins)(상표명)은 항체와 같이, 생물학적 표적에 결합함으로써 이를 검출하거나, 이를 포획하거나 유기체 내에서 이를 매우 간단하게 표적화할 수 있도록 하는 작은 단백질이다.
아프타머(Aptamer)는 SELEX("지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 발달(Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment)")(Ellington AD and Szostak JW., 1990)라고 불리는 시험관내(in vitro) 선택의 조합 방법에 의해 1015개 이하의 상이한 서열을 함유하는 라이브러리에서 확인된 올리고뉴클레오타이드, 일반적으로 RNA 또는 DNA이다. 대부분의 아프타머는 다양한 복합체 구조를 채택함으로써, 이의 표면에 다양한 기하학의 구멍을 생성시킬 수 있도록 하고, 다양한 리간드와 결합할 수 있도록 하는 RNA의 능력으로 인한, RNA 화합물이다. 이들은 생명공학적, 진단학적 또는 치료학적 응용에 사용될 수 있는 목적한 생화학적 도구이다. 이들의 선택성 및 이들의 리간드-결합 특성은 항체의 것들과 비교가능하다.
설계된 안키린 반복체 ProteINS(Designed Ankyrin Repeat ProteINS)(Boersma YL and Plutckthun A, 2011)에 대한 "DARPin"는 항체를 모사하여 고 친화성 및 고 선택성으로 표적 단백질에 결합할 수 있도록 할 수 있는 단백질의 다른 부류이다. 이들은 세포 혈장 막의 "척추"를 구성하는 스펙트린/액틴 네트워크에 필수적인 막 단백질에 결합할 수 있도록 하는 어댑터 단백질(adaptor protein)인 안키린 단백질의 계열로부터 기원한다. 안키린의 구조는 대략 33개 아미노산의 단위의 반복을 기본으로 하며 DARPin에 대해서도 동일하다. 각각의 단위는 나선 대 나선 연결구조(helix-turn-helix) 유형의 2차 구조를 갖는다. DARPin는 적어도 3개, 바람직하게는 4 내지 5개의 반복된 단위를 함유하며 조합 라이브러리의 스크리닝(screening)에 의해 수득된다.
용어 "표지(label)"는 특히 화학적 변형없이 직접, 또는 화학적 변형 후 이러한 그룹을 포함하는, 결합 파트너의 그룹과 반응성인 그룹을 함유하는 어떠한 분자도 의미하며, 당해 분자는 검출가능한 시그날을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 이들 직접적인 검출 표지의 비제한적 목록은:
Figure pct00004
예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 비색법, 형광성 또는 발광성에 의해 검출가능한 시그날을 생산하는 효소,
Figure pct00005
형광성, 발광성 또는 염료 화합물과 같은 화학단,
Figure pct00006
32P, 35S 또는 125와 같은 방사활성 분자,
Figure pct00007
알렉사 또는 피코시아닌과 같은 형광성 분자, 및
Figure pct00008
아크리디늄 또는 루테늄을 기본으로 하는 유기금속 유도체와 같은 전기화학발광성 염(electrochemiluminescent salt)으로 이루어진다.
간접적인 검출 시스템은 또한 예를 들면, 항-리간드와 반응할 수 있는 리간드에 사용될 수 있다. 이후에 리간드는 결합 파트너, 접합체를 구성하기 위한 표지에 상응한다.
리간드/항-리간드 쌍은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 이는 예를 들면, 다음의 쌍의 경우이다: 비오틴/스트렙타비딘, 햅텐/항체, 항원/항체, 펩타이드/항체, 당/렉틴, 폴리뉴클레오타이드/이에 대한 폴리뉴클레오타이드 상보체.
이후에 항-리간드는 앞서 기술한 직접적인 검출 표지에 의해 직접 검출가능하거나 다른 리간드/항-리간드 쌍 등에 의해 자체적으로 검출될 수 있다.
이들 간접적인 검출 시스템은 특정 조건 하에서, 시그날의 증폭을 초래할 수 있다. 이러한 시그날 증폭 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며, 본 출원인의 선행 특허원 제FR　2781802호 또는 제WO　95/08000호를 참조할 수 있다.
사용된 표지의 유형에 따라서, 당해 분야의 숙련가는 어떠한 유형의 적절한 측정 장치, 예를 들면, 분광광도계, 분광형광계, 농도계 또는 다른 고화질 카메라에 의해 검출가능한 시그날의 표지 또는 방사를 가시화할 수 있는 시약을 가할 것이다.
면역검정의 유효성을 입증하기 위한 시험인 단계는 앞서 기술된 바와 같다.
면역검정 시험 단계 i) 및 입증 시험 단계 ii)는 어떠한 순서로도, 동시에 또는 연속적으로, 임의로 동일한 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다.
면역검정 시험의 판독은 또한 사용된 시험에 의존하는 당해 분야의 숙련가에게 광범위하게 공지된 단계이다.
최종적으로, 마지막 단계는 단계 i의 면역검정 시험에 의해 수득된 시그날이 면역검정 시험의 검출 한계치보다 더 큰 경우 시험 샘플 속에서 상기 분석물의 존재를 측정하는 것으로 이루어진다. 당해 단계는 또한 당해 분야의 숙련가에게 널리 알려져 있다.
검출 외에도, 본 발명의 화합물은 또한 시험 샘플 속에서 분석물을 적량화하는데 적합하다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 하기를 포함하는, 분석물을 함유할 수 있는 시험 샘플 속에서 면역검정에 의해 상기 분석물을 정량화하기 위한 방법에 관한 것이다:
i. 시험 샘플을 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴에 의한 면역검정 시험 단계,
ii. 양성 대조군을 분석물에 대한 상기 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴으로써 면역검정 시험의 유효성을 입증하기 위한 시험 단계,
iii. 유효성 입증 시험이 양성인지에 대한 면역검정 시험의 판독단계, 및
iv. 앞서 정의한 바와 같은 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 앞서 정의한 바와 같은 조성물을 사용하여 면역검정 시험의 시그날을 사전에 수득한 표준 곡선과 비교함에 의한 시험 샘플 속의 상기 분석물의 양의 측정 단계.
정량화 방법의 상기 단계들은 앞서 정의되어 있다. 특히, 면역검정 시험 단계 i) 및 유효성 시험 단계 ii)는 어떠한 순서로도, 동시에 또는 연속적으로, 임의로 동일한 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다.
당해 정량화 방법에서, 양성 대조군은 대조군으로서 사용되는 어떠한 화합물일 수 있으며, 이는 사용된 면역검정에서 분석물과 비교가능한 항원 반응성을 갖는다. 일 구현예에 따라서, 양성 대조군은 앞서 정의한 바와 같은 이중-에피토프 화합물이거나 조성물이다.
표준 곡선은 본 발명의 화합물 또는 조성물로 제조한다. 그럼에도 불구하고, 어떠한 다른 적절한 표준 용액도 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은, 하기를 포함하는, 분석물을 함유할 수 있는 시험 샘플 속에서 면역검정에 의해 상기 분석물을 정량화하기 위한 방법에 관한 것이다:
i. 상기 시험 샘플을 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴에 의한 면역검정 시험 단계,
ii. 양성 대조군으로서, 앞서 정의한 바와 같은 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 앞서 정의한 바와 같은 조성물을 분석물에 대한 상기 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴으로써 면역검정 시험의 유효성을 입증하기 위한 시험 단계,
iii. 유효성 입증 시험이 양성인지에 대한 면역검정 시험의 판독 단계, 및
iv. 면역검정 시험의 시그날과 표준 곡선의 비교에 의한 시험 샘플 속에서 상기 분석물의 양의 측정 단계.
특히 면역검정의 다양한 단계에 대한, 특수한 화합물 및 분석물의 선택과 관련하여, 앞서 기술된 동일한 특징 및 선호도는 또한 본 발명의 검출 및 정량화 방법에 적용된다.
특히, 모든 이들 검출 및 정량화 방법에서, 분석물은 심장 트로포닌 I 또는 프로디펜신-A6일 수 있다.
본 발명의 면역검정 방법은 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는 진단 키트의 사용을 포함하며, 이는 본 발명의 다른 주제를 구성한다.
상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 화합물 및 조성물 외에도, 결합 파트너 및 결합 파트너(들)과 목적한 분석물 사이의 반응을 입증하는데 필요한 모든 화합물과 같은 목적한 분석물의 존재를 면역검정에 의해, 예를 들면, 샌드위치-형 면역검정에 의해 검출하거나 정량화하기 위한 방법의 시행에 필요한 화합물을 함유할 수 있다.
본 발명은 비제한된 예증에 의해, 및 또한 도면에 의해 제공된 다음의 실시예에 의해 보다 명확하게 이해될 것이다:
- 도 1은 선행 기술에 따른 이중-에피토프 화합물(REF 화합물), 본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물(화합물 1) 및 본 발명의 이중-에피토프 화합물 1에 상응하지만 캐리어 분자에 커플링되지 않는 이중-에피토프 펩타이드(커플링되지 않은 펩타이드 1)에 의해 방사된, 이들 농도의 함수로서, VIDAS® 자동화된 장치에 의해 측정된, 형광성 시그날 RFV를 제공하는 그래프이다.
- 도 2는 선행 기술에 따른 이중-에피토프 화합물(REF 화합물) 및 본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물(화합물 1 및 3)에 의해 방사된, 이들의 농도의 함수로서, VIDAS® 자동화된 장치에 의해 측정된, 형광성 시그날 RFV를 제공하는 그래프이다.
- 도 3은 선행 기술에 따른 이중-에피토프 화합물(REF 화합물) 및 본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물(화합물 1 및 4)에 의해 방사된, 이들의 농도에 대한 함수로서, VIDAS® 자동화된 장치에 의해 측정된, 형광성 시그날 RFV를 제공하는 그래프이다.
실시예
실시예 1: 펩타이드 합성
펩타이드 합성을 Applied Biosystems(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)으로부터의 ABI 433A 합성기, 또는 CEM Corporation(미국 노쓰캐롤라이나주 매튜스 소재)으로부터의 Liberty 합성기를 사용하여 수행하였다. 링크 아미드(Rink Amide) MBHA 수지(제품 번호 855003, Novabiochem® Merck Millipore, 프랑스 몰샤임 소재)를 중합체성 고체 지지체로서 사용하였다.
화학적 합성 말기에, 펩타이드를 탈보호시키고 트리플루오로아세트산-에탄디티올-트리이소프로필실란-물((94/2.5/1/2.5 V/V/V/V)의 혼합물의 존재하에 대략 2시간 동안 중합체로부터 절단하였다. 여과에 의해 중합체를 제거한 후, 펩타이드를 0℃에서 디에틸 에테르로부터 침전에 의해 분리하였다.
이들의 순도를 증가시키기 위하여, 펩타이드를 Vynac DenaliTM 120Å C18, 10μm 컬럼(Mandel Scientific Company Inc., 캐나다 온타리오주 귈프 소재) 상에서 역상 제조 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 각각의 펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 수용액 속에서 아세토니트릴(0 내지 95%)의 단계별 구배로 용출시키며, 상기 단계의 아세토니트릴의 퍼센트는 목적한 펩타이드에 상응하는 피크의 분리를 최적화하도록 선택된다. 당해 최종 단계 후에, 2개의 상이한 분석 기술을 수행하여 수득된 펩타이드를 확인하고 특성화하였다.
각각의 펩타이드에 대해, 분석 HPLC 프로파일(profile)을 Chromolith® 고 분해능 RP-18 포획된 역상 컬럼(Merck Millipore, 프랑스 몰샤임 소재)에서 생성시켰다. 용출을 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 수용액 속에서 아세토니트릴의 선형 구배(0 내지 100%)로 수행하고 214nm에서 흡광도를 측정하여 모니터링하였다. 당해 분석은 펩타이드의 순도의 수준을 측정할 수 있도록 한다.
각각의 펩타이드를 또한 Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD 2.1 x 50 mm 컬럼, Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6540UHD 질량 분광기(Agilent Technologies)에 커플링된 입자 크기 1.8μm(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 상에서 액체 크로마토그래피-질량 분광법으로 분석하였다. 당해 분석은 펩타이드의 몰 질량을 측정할 수 있도록 한다.
합성된 펩타이드의 서열 및 또한 특성화 결과는 표 1에 나타낸다.
[표 1] 합성된 펩타이드의 서열 및 특성화
확인인자 분석물 서열 수득된 양(mg) 순도 측정된 몰 질량
(달톤)
펩타이드 1
 TnI ATEPHAKKK-Ado2-C-Ado2-AGLGFAELQDL-NH2 78.8 97% 2806.47
펩타이드 2
 TnI ATEPHAKKKC-NH2 48.0 97% 1110.60
펩타이드 3
 TnI AGLGFAELQDLC-NH2 50.0 95% 1234.60
펩타이드 4
 TnI KISASRKLQLKT-Ado2-C-Ado2-AGLGFAELQDL-NH2 59.7 99% 3169.75
펩타이드 5
TnI ATEPHAKKKGGGSCSGGGAGLGFAELQDL-NH2 10.0 89% 2741.36
펩타이드 6
 PDEF-A6 QAEDDPLQAK-Ado2-C-Ado2-WTGVLSPTQEYR-NH2 32.0 99% 3215.50
약어 TnI는 심장 트로포닌 I에 상응하고 PDEF-A6는 프로디펜신-A6에 상응한다. 약어 Ado는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산(제품 번호: 134978-97-5)에 상응한다.
[표 2] 수득되어 면역반응성 측면에서 시험된 본 발명에 따른 이중- 에피토프 화합물(식 I)의 요약
확인인자 분석물 에피토프 E1 에피토프 E2 Arm X Arm Y 캐리어 분자
화합물 1 TnI ATEPHAKKK AGLGFAELQDL (Ado)2 (Ado)2 BSA
화합물 2 TnI KISASRKLQLKT AGLGFAELQDL (Ado)2 (Ado)2 BSA
화합물 3 TnI ATEPHAKKK AGLGFAELQDL (Ado)2 (Ado)2 IgG
화합물 4 TnI ATEPHAKKK AGLGFAELQDL GGGS SGGG BSA
화합물 5 PDEF-A6 QAEDDPLQAK WTGVLSPTQEYR (Ado)2 (Ado)2 BSA
약어 TnI는 심장 트로포닌 I에 상응하고 PDEFA6은 프로디펜신-A6에 상응한다. 약어 Ado는 8-아미노-3,6-디옥타노산(제품 번호: 134978-97-5)에 상응한다. 약어 BSA는 소 혈청 알부민에 상응한다. IgG는 토끼 면역글로불린 G이다.
실시예 2: 이중-에피토프 화합물의 제조
이중-에피토프 화합물을 한편으로는 실시예 1에서 수득된 펩타이드와, 다른 한편으로는 캐리어 분자 사이에 공유 커플링을 수행함으로서 수득하였다. 표 2는 제조된 본 발명에 따른 다양한 이중-에피토프 화합물을 상세히 나타낸다. 모든 이들 화합물은 식 I에 상응한다. 이의 일부에 대해, 표 3은 펩타이드 및 캐리어-분자 쌍을 규정하면서, 수행된 커플링 모두를 요약한다.
커플링을 위한 과정은 다음과 같다:
우선, 캐리어 분자로서 선택한 단백질을 과량의 설포-SMCC(설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 제품 번호: 92921-24-9, 제품 번호 22322, Pierce, Thermo Scientific, 프랑스 빌레봉 수르 예트 소재)의 존재하에서 활성화시켰다. 소 혈청 알부민(BSA, Proliant Health & Biologicals, 미국 아이오와주 안케니 소재)에 대해, 1/20 BSA/SMCC 몰 비를 선택하였다. 따라서, BSA를 PBS(포스페이트 완충된 염수), pH 7.2 속에서 10 mg/ml로 희석시키고, 즉석으로 제조한, 수중 25 mg/ml에서 53μl의 설포-SMCC 용액을 적가하였다. 수욕 속에서 30℃ ± 2℃로 온화하게 자기 교반하면서 1시간 ± 5분 동안 항온처리한 후, BSA-SMCC를 12 내지 14kDa의 절단 한계치를 갖는 투석 튜빙 속에서 150 mM NaCl, pH 6.8을 함유하는 50 mM 포스페이트 완충액에 대하여 투석하였다. 투석은 주위 온도에서 수행하였고, 투석 욕은 매시간마다 3회 변화시켰다. 투석 후에, BSA-SMCC 용액은 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하고 이러한 농도를 150mM NaCl, pH 6.8을 함유하는 50mM 인산염 완충액 속에서 5mg/ml로 조절하였다. 당해 단계는, 이후에 말레이미드 유형의 수개의 반응성 그룹을 지니는 캐리어 분자의 표면을 개질시킬 수 있다.
커플링될 펩타이드를 순도를 고려하여, 150mM NaCl 및 5mM EDTA, pH 6.8를 함유하는 50mM 포스페이트 완충액 속에서 5mg/ml로 용해시켰다. 1/10　BSA/펩타이드 몰 비를 선택하였다. 따라서, 5mg/ml(0.47ml)의 농도에서 2.35mg의 BSA-SMCC를 5mg/ml(200μl)의 농도에서 1mg의 펩타이드에 가하였다. 당해 혼합물을 최소 16시간 동안 2/8℃에서 휠(wheel) 위에서 항온처리하였다. 이후에 반응을 즉시 제조된, 150mM NaCl, pH 6.8을 함유하는 50mM의 포스페이트 완충액 중 0.1M의 2-머캅토에틸아민(제품 번호: 60-23-1, 시스테아민)을 가하여 차단시켰다. 실험실 온도에서 휠 상에서 20 ± 5분 동안 항온처리 후, 펩타이드-BSA 접합체를 PBS 완충액, pH 7.2에 대해 12 내지 14kDa의 절단 한계치를 갖는 투석 튜빙 속에서 투석하였다. 투석을 2/8℃에서 최소 16시간 동안 지속시켰다. 투석 후, 단백질 농도를 PBS 완충액, pH 7.2 속에서 2mg/ml의 BSA의 이론 농도로 조절하였다. 이후에 펩타이드-BSA 접합체의 농도를 280nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 당해 단계는 펩타이드의 말레이미드 그룹과 설프하이드릴 그룹(-SH) 사이의 반응을 커플링될 펩타이드 서열에 따라 말단 또는 중간 시스테인의 수준에서 허용함으로써 티오에테르 결합을 형성시킨다.
화합물 1, 2, 4 및 5를 모두 상기 기술된 과정을 적용시켜 수득하였다. 특허 제US 6 114 180호에 기술된 바와 같은 이중-에피토프 화합물에 상응하는, REF 화합물의 경우, 2 펩타이드(펩타이드 2 및 펩타이드 3)을 BSA-SMCC의 동시 존재하에 위치시키고 각각의 펩타이드를 1/10의 이론적인 BSA/펩타이드 몰 비로 커플링시키는 것을 제외하고는, 동일한 과정을 또한 적용시켰다. 화합물 3의 경우, 펩타이드 1을 토끼 폴리클로날 면역글로불린 G(bioMerieux)에 커플링시켰다. BSA를 다른 캐리어 분자로 대체하는 것 외에는 과정이 동일하였다. 이론적인 캐리어 분자/펩타이드 분자 비는 1/10이었다.
[표 3] 펩타이드-캐리어 분자 커플링의 요약
확인인자 펩타이드 캐리어 분자
본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물 화합물 1 펩타이드 1 BSA (소 혈청 알부민)
화합물 2 펩타이드 4 BSA
화합물 3 펩타이드 1 토기 면역글로불린 G
화합물 4 펩타이드 5 BSA
화합물 5 펩타이드 6 BSA
선행 기술에 따른 이중-에피토프 화합물
(제US　6　114　180호)		 REF 화합물 펩타이드 2 및 펩타이드 3 BSA
실시예 3: 본 발명에 따른 이중- 에피토프 화합물 1의 면역반응성의 연구
화합물의 이중-에피토프 특성의 연구를 VIDAS® 면역분석 자동화 장치(bioMerieux)를 사용하여 심장 트로포닌 I 면역검정으로 수행하였다. 1회용 팁을 반응용 고체 상 및 피펫팅 시스템 둘 다로서 제공한다. 카트리지는 밀봉되고 표지된 알루미늄 시이트로 덮힌 10개의 웰(X0 내지 X9)로 구성된다. 제1 웰(X0)은 예비절단 부분을 포함함으로써 샘플의 유도를 촉진시킨다. 마지막 웰(X9)은 기질의 형광성이 측정되는 광학 큐베트(optical cuvette)이다. 분석을 위해 필요한 다양한 시약이 중간 웰에 함유되어 있다. 시험의 모든 단계를 장치에 의해 자동적으로 수행한다. 이들은 반응 매질의 흡입/역 취입의 주기의 연속으로 이루어진다. 심장 트로포닌 I 면역검정은 일단계 샌드위치 시험으로 수행하였다.
a) 팁의 감작화(sensitization) 및 부동화(passivation)
사용된 항체의 특징 및 공급업자는 표 4에 나타낸다. 팁을 각각 PBS 완충액, pH 6.2 속에 2.5μg/ml로 희석된 19C7 및 B90 모노클로날 항체의 300μl의 용액으로 감작화시켰다. 감작화 용액을 사용하여 +18/25℃에서 대략 20시간 항온처리 후, 팁을 비웠다. 10g/l의 소 혈청 알부민을 함유하는 300μl의 당해 동일한 용액을 이후에 가한다. 부동화를 +18/25℃에서 밤새 지속한다. 팁을 비우고, 건조시킨 후, 사용할 때까지 습기가 없는 환경 속에서 +4℃로 저장하였다.
[표 4] 심장 트로포닌 I 면역검정에 사용된 항체
항체명 표적 E1 또는 E2의 서열 공급업자(제품 번호)
19C7 TnI KISASRKLQLKT Hytest
(4T21-19C7)
B90 TnI ATEPHAKKK SDIX
(B9085MA06-MA)
3D5F7 TnI AGLGFAELQDL bioMerieux
(noncommercial)
7B9 TnC NA Hytest
(4T27-7B9)
NA: 이용가능하지 않음. 약어 TnI는 심장 트로포닌 I에 상응하고 약어 TnC은 심장 트로포닌 C에 상응한다. 약어 제품 번호는 공급업자의 카탈로그 참고에 상응한다.
b) 면역검정 과정
시험 화합물을 PBS-BSA 완충액 속에 다양한 농도로 희석시키고 샘플로서 검정하였다.
VIDAS® 팁을 샘플과 접촉시키자 마자, 포획 항체가 당해 팁에 고정되기 때문에 면역학적 반응이 시작된다. 자동화된 장치는 시험 샘플(135μl)을 270μl의 접합체 용액과 혼합한다. 당해 용액은 2개의 모노클로날 항체 항체, 3D5F7 및 7B9를 알칼린 포스파타제에 커플링된 Fab' 단편의 형태로 함유한다. 이들 접합체를 또한 150mM의 NaCl 및 충전제 단백질을 함유하는, 10mM 포스페이트 완충액, pH 6.4 속에서 대략 0.75μg/ml로 희석시켰다.
항온처리를 37℃에서 6.8분 동안 지속시켜 한편으로는 팁 상에 흡착된 항체에 대한 및, 다른 한편으로는 접합체에 대한 심장 트로포닌 I, 또는 심장 TnI 이중-에피토프 화합물, 또는 심장 TnI 펩타이드의 특이적인 결합을 가능하도록 한다. 이후에, 결합되지 않은 성분을 300mM NaCl 및 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는, 200mM 트리스 완충액, pH 7.8로 3회 세척하여 제거한다. 최종의 노출 단계 동안, 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 기질을 흡인시킨 후 다시 팁내로 취입하며; 접합체의 효소는 4-메틸움벨리페론에 대한 당해 기질의 가수분해를 위한 반응을 촉매하며, 이의 방사된 형광성은 450nm에서 측정한다. 형광성 시그날의 값(RFV=상대적인 형광성 값)은 샘플 속에 존재하는 항원의 농도에 비례한다.
표 5는, REF 이중-에피토프 화합물(선행 기술), 본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물 1 및 커플링되지 않은 펩타이드 1(실시예 1)의 면역반응성을 비교하는 경우에 VIDAS® 자동화 장치로 측정된 형광성 시그날(RFV=상대적인 형광성 값)을 요약한다. 도 1은 그래프 형태의 이들 동일한 데이타를 나타낸다. 나머지로서, 펩타이드 1은 2개의 심장 TnI 에피토프를 포함하며, 하나는 앞서 기술된 면역검정의 B90 포획 항체에 의해 인식되고, 다른 것은 3D5F7 검출 항체에 의해 인식된다. 본 발명에 따른 화합물 1에서, 펩타이드 1은 BSA에서 중간 시스테인을 통헤 커플링되어 이의 보다 우수한 항원 제시 및 개선된 안정성을 보증한다. REF 화합물은 또한 BSA에 커플링된 동일한 2개의 TnI 에피토프를 갖는다. 화합물 1과는 달리, 2개의 에피토프 각각은 말단 시스테인의 수준에서 BSA에 커플링된 개개의 펩타이드(펩타이드 2 및 3)의 형태이다. 특허 제US　6　114　180호에 기술된 바와 같은 이중-에피토프 화합물에 상응하는, 화합물 1인, REF 화합물, 및 특허원 제WO　98/24816호에 기술된 바와 같은 합성의 이중-에피토프 화합물에 상응하는 펩타이드 1은 둘 다 심장 TnI 면역검정에서 반응성이지만, 이들의 반응성 수준은 매우 상이하다. 따라서, 대략 1000 RFV의 시그날을 수득하기 위하여, 21μM의 화합물 1은 1118μM의 REF 화합물과 비교하여 필수적인데, 다시 말해서 대략 50배 적다. 따라서, 화합물　1은 REF 화합물보다 훨씬 더 우수한 면역반응성을 나타낸다. 또한, 화합물 1로 수득된 VIDAS® 시그날의 우수한 역학은, 훨씬 더 높은 농도의 당해 화합물을 시험하는 경우에도, REF 화합물로 재생되지 않는다. 커플링되지 않은 펩타이드 1은 BSA에 커플링된 2개의 이중-에피토프 화합물보다 훨씬 더 잘 인식되지 않는다.
[표 5] 이중- 에피토프 화합물 1, 3, 4 및 REF와 심장 TnI 펩타이드 1의 면역반응성
[c] 펩타이드 (ng/mL) REF 화합물
(89 kDa)		 화합물 1
(94 kDa)
펩타이드 1-BSA 		커플링되지 않은 펩타이드 1
(28 kDa)		 화합물 3
(188 kDa)
펩타이드 1-IgG 		화합물 4
(93 kDa)
펩타이드 5-BSA
[c] S [c] S [c] S [c] S [c] S
0.5 5.3 270
1 11 451 5,3 175 11 60
2 21 935 11 360 21 118
5 56 62 53 1903 27 882 54 295
10 112 120 106 3606 53 1688 107 545
20 224 223 213 5911 713 2 106 3276 214 1100
50 559 617 1781 21 266 6209 535 2569
100 1118 997 3562 69
200 2236 1484 7125 356
500 5589 2102 17811 1825
1000 11179 2155 35623 3798
2000 71245 6140
4000 142491 7542
약어 [c]는 화합물의 μM의 농도에 상응한다. 약어 S는 RFV에서 시그날에 상응한다.
실시예 4: 다양한 캐리어 분자를 사용한 본 발명에 따른 이중- 에피토프 화합물의 면역반응성의 비교
당해 실시예에서, 심장 TnI의 2개의 상이한 에피토프를 포함하는 펩타이드 1은 2개의 상이한 캐리어 분자: BSA(화합물 1) 및 토끼 면역글로불린 G(화합물 3)에 커플링되었다. 이들 이중-에피토프 화합물의 수득은 실시예 2에 기술되어 있다. 심장 TnI 면역검정에서 이들 화합물의 면역반응성의 비교는 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였으며 결과는 상기 표 5 및 도 2에 나타내고, 이는 이들의 농도의 함수로서, 다양한 화합물, 즉, 선행 기술에 따른 이중-에피토프 화합물(REF 화합물) 및 본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물(화합물 1 및 3)에 의해 방사된 REV 형광성 시그날을 제공하는 그래프를 나타낸다. 결과는 화합물 1 및 3이 심장 TnI 면역검정에서 둘 다 반응성이며 REF 화합물에 대해 관찰된 것보다 훨씬 더 높은 비교가능한 반응성을 나타냄을 나타낸다.
실시예 5: 다양한 스페이서 암(spacer arm)을 사용한 본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물의 면역반응성의 비교
당해 실시예에서, 비교한 이중-에피토프 화합물은 스페이서 암의 측면에서만 상이하다. 화합물 1의 경우에, 2개의 스페이서 암은 동일하며, 이는 Ado 인공 아미노산의 이량체이다. 화합물 4는 이의 일부분의 경우 암 X로서 GGGS 서열을 포함하고 암 Y로서 SGGG 서열을 포함한다. 나머지로서, 2개의 화합물은 2개의 심장 TnI 에피토프를 가지며 캐리어 분자는 BSA이다. 이들 이중-에피토프 화합물의 수득은 실시예 2에 기술되어 있다. 심장 TnI 면역검정에서 이들 화합물의 면역반응성의 비교는 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였으며 결과는 상기 표 5 및 도 3에 나타내고, 이는 이들의 농도의 함수로서, 다양한 화합물, 즉 선행 기술에 따른 이중-에피토프 화합물(REF 화합물) 및 본 발명에 따른 이중-에피토프 화합물(화합물 1 및 4)에 의해 방사된 REV 형광성 시그날을 제공하는 그래프를 나타낸다. 결과는 GGGS 및 SGGG 암을 포함하는 화합물 4가 Ado 암을 포함하는 화합물 1보다 잘 인식되지 않지만, REF 화합물보다는 훨신 더 큼을 나타낸다.
실시예 6: 안정성 시험
화합물 1 및 2를 표 6에 나타낸 다양한 완충액 속에서 3.75ng/ml로 희석시켰다. 제1 검정은 D0에서 수행하였으며, 이 날에 용액을 제조하였다. 수득된 값은 안정성을 모니터링하기 위한 참고로서 제공하였다. 이중-에피토프 화합물의 희석 용액을 +2/8℃에서 저장하고 D7(제조후 7일째 날)에 검정하였다. 하기 표 6은 D0와 D7 사이의 면역검정의 RFV 시그날에 있어서의 변화(시그날 D7 / 시그날 D0 x 100)를 나타낸다. 화합물 1 및 2는 안정하며 이들의 항원 특성은, 이들을 1주 동안 +2/8℃에서 저장하는 경우 보존된다.
[표 6] +2/8℃에서 7일 동안 화합물 1 및 2의 안정성
희석 완충액 화합물 1 화합물 2
시트레이트 pH5, 150 mM NaCl, 50 g/l BSA 102% 98%
시트레이트 pH6, 150 mM NaCl, 50 g/l BSA 99% 95%
PBS, pH 6.2, 50 g/l BSA 99% 89%
제2 단계에서, 보다 긴 기간의 안정성 연구를 50g/l의 BSA를 함유하는 PBS, pH 6.2 속에 희석된 화합물 1에 대해서만 수행하였다. +2/8℃에서 저장하는 경우, 화합물 1은 희석 용액 속에서 안정하다: 면역검정의 시그날의 97%는 1개월 저장시 발견되고, 94%는 3개월 저장시 및 90%는 6개월 저장시 발견된다. +18/25℃에서 저장하는 경우, 화합물 1은 대략 1개월 동안 희석 용액 속에서 안정하다(시그날의 88%가 발견된다). 화합물 1이 이의 항원 특성의 어떠한 분해없이 -20℃에서 적어도 3회의 해동/동결 주기에 견딜 수 있음이 또한 중요하다. 보다 많은 수의 동결/해동 주기는 시험되지 않았다.
이들 결과 모두는 본 발명에 다른 화합물 1의 용액의 탁월한 안정성을 입증한다.
실시예 7: 미모토프(mimotope)를 포함하는 본 발명에 따른 이중- 에피토프 화합물 5의 면역반응성의 연구
이중-에피토프 화합물 5를 설계하여 프로디펜신 A6 면역검정 동안 대조군 및/또는 표준물 및/또는 조절인자로서 작동하도록 하였다. 화합물 5를 선형 에피토프(QAEDDPLQAKL) 및 미모토프(WTGVLSPTQEYR)와 합하였다. 프로디펜신 A6 면역검정을 VIDAS® 자동화된 면역분석 장치(bioMerieux)를 사용하여 특허원 제WO　2010/112777호에 기술된 프로토콜에 따라, 즉, 서열 EDDPLQ의 선형의 최소 에피토프를 인식하는, 포획 항체, 12H4E1 클론(bioMerieux), 및 검출 항체로서, 이의 에피토프가 선형이 아니지만 서열 WTGVLSPTQEYR의 미모토프인, 1H8C9 clone(bioMerieux)를 사용하여 수행하였다. 이들 에피토프/미모토프는 화합물 5에서 발견된 것들이다.
하기 표 7은 다양한 농도의 화합물 5(분자 몰 질량: 98 155 달톤)를 시험하는 경우 VIDAS® 자동화 장치에 의해 측정된 형광성 시그날(RFV=상대적인 형광성 값)을 요약한다. 화합물 5는 실제로 프로디펜신 A6 면역검정에서 반응성이다.
[표 7] 이중- 에피토프 화합물 5의 면역반응성
[c] 펩타이드 (ng/ml) [c] (mM) RFV 시그날
17.5 0.2 385
35 0.4 583
175 1.8 1306
1750 18 2637
17 500 178 3448
참고 문헌
- Boersma YL and Plutckthun A, 2011, Curr. Opin. Biotechnol, 22 : 849-857
- Ellington AD and Szostak JW., 1990, Nature, 346: 818-822
- Fields and Noble, 1990, Int J Pept Protein Res., 35:161-214
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- Shan S. Wong, 1991, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking >>, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, United States
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Claims (17)

  1. 하기 식 I의 이중-에피토프(bi-epitope) 화합물:
    [식 I]
    Figure pct00009

    상기 식에서,
    - E1 및 E2는, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 분석물(analyte)의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드 서열을 나타내고,
    - X 및 Y는, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 링커 암(linker arm)을 나타내며,
    - 캐리어 분자는 가용성이고,
    - Z는 캐리어 분자와의 결합 이전에 티올 작용기를 지닌 아미노산 유도체를 나타냄.
  2. 청구항 1에 있어서,
    링커 암 X 및 Y가 한편으로는 E1 또는 E2와, 또 다른 한편으로는 Z와, 2개의 펩타이드 결합 -CO-NH-를 각각 형성하는 아미노산 유도체인, 식 I의 이중-에피토프 화합물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    링커 암 X 및 Y가, 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 하나 이상의 아미노산 유도체를 포함하는, 식 I의 이중-에피토프 화합물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항에 있어서,
    Z가 시스테인 유도체, 호모시스테인 유도체 및 페니실라민 유도체로부터 선택되는, 식 I의 이중-에피토프 화합물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 캐리어 분자가, 분자량이 20kDa 내지 700kDa, 바람직하게는 60kDa 내지 250kDa인 단백질인, 식 I의 이중-에피토프 화합물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 캐리어 분자가 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)인, 식 I의 이중-에피토프 화합물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중의 어느 한 항에 있어서,
    E1 및 E2가 적어도 하나의 심장 트로포닌 I 에피토프(cardiac troponin I epitope) 또는 프로디펜신-A6 에피토프(prodefensin-A6 epitope)를 포함하는 펩타이드 서열인, 식 I의 이중-에피토프 화합물.
  8. 물, 완충액 또는 생물학적 유체 내 용액 중에, 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 식 I의 이중-에피토프 화합물을 포함하는 조성물.
  9. 면역검정(immunoassay)에서의 대조군 또는 표준물로서의, 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 화합물 또는 청구항 8에 따른 조성물의 용도.
  10. 심장 트로포닌 I 면역검정 또는 프로디펜신-A6 면역검정에서의 대조군 또는 표준으로서의, 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 화합물 또는 청구항 8에 따른 조성물의 용도.
  11. 하기를 포함하는, 분석물을 함유할 수 있는 시험 샘플에서 면역검정(immunoassay)에 의해 상기 분석물을 검출하는 방법:
    i. 시험 샘플을 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴에 의한 면역검정 시험의 단계,
    ii. 양성 대조군으로서 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 청구항 8에 따른 조성물을 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴으로써 면역검정 시험의 유효성(validity)을 입증하기 위한 시험의 단계,
    iii. 유효성 입증 시험이 양성인지에 대한, 면역검정 시험의 판독 단계,
    iv. 단계 i의 면역검정 시험에 의해 수득된 시그날이 면역검정 시험의 검출 한계점(threshold)보다 큰 경우, 시험 샘플 내 상기 분석물의 존재의 측정 단계.
  12. 청구항 11에 있어서,
    분석물이 심장 트로포닌 I 또는 프로디펜신-A6인, 면역검정에 의해 분석물을 검출하는 방법.
  13. 하기를 포함하는, 분석물을 함유할 수 있는 시험 샘플 속에서, 면역검정에 의해 상기 분석물을 정량화하는 방법:
    i. 상기 시험 샘플을, 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴에 의한 면역검정 시험 단계,
    ii. 양성 대조군을 상기 분석물에 대한 상기 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴으로써 면역검정 시험의 유효성을 입증하기 위한 시험 단계,
    iii. 유효성 입증 시험이 양성인지에 대한 면역검정 시험의 판독 단계,
    iv. 상기 면역검정 시험에 의해 수득된 시그날을 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 청구항 8에 따른 조성물을 사용하여 사전에 수득한 표준 곡선과 비교함에 의한 시험 샘플 속에서의 상기 분석물의 존재의 측정 단계.
  14. 청구항 13에 있어서,
    양성 대조군이 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 식 I의 이중-에피토프 화합물이거나 또는 청구항 8에 따른 조성물인, 면역검정에 의해 정량화하는 방법.
  15. 하기를 포함하는, 분석물을 함유할 수 있는 시험 샘플 속에서 면역검정에 의해 상기 분석물을 정량화하는 방법:
    i. 시험 샘플을 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴에 의한 면역검정 시험 단계,
    ii. 양성 대조군으로서, 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 식 I의 이중-에피토프 화합물 또는 청구항 8에 따른 조성물을, 분석물에 대한 하나 이상의 결합 파트너와 접촉시킴에 의한 면역검정 시험의 유효성을 입증하기 위한 시험 단계,
    iii. 유효성 입증 시험이 양성인 경우, 면역검정 시험을 판독하는 단계,
    iv. 면역검정 시험을 표준 곡선과 비교함에 의한 시험 샘플 속에서의 상기 분석물의 양의 측정 단계.
  16. 청구항 13 내지 청구항 15 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석물이 심장 트로포닌 I 또는 프로디펜신-A6인, 면역검정에 의해 분석물을 정량화하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 따른 식 I의 이중-에피토프 화합물, 또는 청구항 8에 따른 조성물을 포함하는, 면역검정을 시행하기 위한 키트(kit).
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