KR20170081187A - 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 gg 세포의 제조 방법과 이의 정성적인 및 정량적인 분석 방법 - Google Patents
면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 gg 세포의 제조 방법과 이의 정성적인 및 정량적인 분석 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포; 이의 제조 방법 및 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 정량적인 및 정성적인 측정을 위한 분석 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포; 이의 제조 방법 뿐 아니라 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 정성 및 정량적인 측정을 위한 분석 방법에 관한 것이다.
틴달화 (tyndallization) 처리된 포자 또는 박테리아의 제조 기법들은 널리 공지되어 있다. 틴달화는, 80 - 100℃의 온도에서 30분간의 열처리가 배치 (batch) 방식으로 적용되는, 간헐 멸균법 (fractional sterilization method)이다. 1차 열 처리는 영양형 (vegetative form)을 사멸시키며, 이 후 24시간의 인큐베이션 기간을 두어 포자 발아를 촉진한다. 이렇게 처리된 물질을 다시 30분간 80 - 100℃의 온도에 두어, 포자 발아로부터 기원한 영양 세포 (vegetative cell)를 사멸시킨다. 이 과정은 2회 또는 3회 반복되어야 한다. 틴달화는, 예를 들어 포자 또는 유산균과 같이 고온에서 견디지 못하는 물질에 적용된다.
틴달화 박테리아 세포는 복제능과 효소적 능력이 불활화된 세포이다. 그러나, 틴달화 세포는 세포 구조와 세포벽을 변형되지 않은 상태로 유지한다. 따라서, 틴달화 박테리아 세포는, 활성 측면에서 생리학적으로 무손상 세포로서 정의될 수 있으며, 그래서 면역학적으로 활성을 나타낸다. 이는, 틴달화 무손상 세포가 GALT에 대해 특이적인 면역자극성을 유지한다는 것을 내포한다.
GALT라 하는 장-관련 림프 조직 (Gut-Associated Lymphoid Tissue)은 일반적으로 소화관 수준에서 존재하는 면역계 부위를 의미한다. GALT는 1차 반응 및 2차 반응 둘다에서 병원체 공격에 대한 점막 방어를 담당하는 점막-관련 림프 조직의 일 예이다. 실제, 위장 시스템은 외부 환경과 소통하는 통로로서, 잠재적인 병원성 미생물이 (특히, 장) 주로 거주하고 있어, 점막 수준에서 이러한 개체군에 대한 통제를 보장하는 강력한 면역 시스템의 존재가 요구된다.
가장 많이 연구된 유산균들 중에는 당연히 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG ATCC 53103가 포함되며, 이 유산균은 놀라운 면역자극 특성/활성으로 인해 인간 및 소아용의 다수 제형들에서 효과적으로 사용되고 있다. 그러나, 아직까지 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC53103)의 틴달화 박테리아 세포를 포함하는 제형은 존재하지 않는 실정이다. 그 이유는, 무엇보다도, 지금까지는 박테리아 세포 샘플에 존재하는 틴달화된 무손상 세포의 정확한 수를 측정할 수 없기 때문이다.
따라서, 신속하고, 믿을 수 있으며, 완전히 재현가능한 분석 방법을 통해 샘플내 면역학적으로 활성인 무손상 세포 (세포벽이 변형되지 않은 세포)를 가진 틴달화 박테리아 세포의 정확한 수를 측정하는 것이 매우 유용할 것이다. 또한, 용이한 투여, 사용 투여량의 재현성 확보, 심지어 30℃의 온도에서도 저장 수명이 연장되어 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포를 더운 국가로 운송할 수 있고, 최종 제품 (제형)으로의 박테리아 세포의 가공 처리의 편의를 위해, 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 세포 수로서 측정된 측정치가 테스트된 틴달화 샘플에 실제 존재하는 값과 일치함을 확인할 수 있는 것이 중요할 것이다.
그러나, 신속, 정확하고, 신뢰할 수 있으며, 완전히 재현가능한 방법에 의해 측정된 세포 수를 가지는, 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 박테리아 세포의 배양물을 제조하는 방법은 현재 이용불가한 실정이다.
이에, 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 배양물을 제조하는 방법; 정확하고, 신뢰할 수 있으며, 완전히 재현가능한 세포 수를 가진 상기한 배양물이 여전히 요구되어 있다. 또한, 신속, 정확하고, 신뢰할 수 있고, 완전히 재현가능한 방식으로, 세포벽이 변형되지 않아 면역 시스템에 대한 고유 특성을 유지하는 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포만을 계수할 수 있는 분석 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 과제는 첨부된 청구항에 기술된 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 배양물을 제공하는 것으로서, 이 배양물은 틴달화된 박테리아 세포를 정확하고, 신뢰할 수 있으며, 완전히 재현가능한 농도 수치로 포함한다.
본 발명의 과제는 첨부된 청구항에 기술된 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 제조 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 신속, 정확하고, 신뢰할 수 있으며, 완전히 재현가능하다.
본 발명의 과제는, 첨부된 청구항에 기술된, 제조 후 틴달화를 거친 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 박테리아 세포 배양물에 존재하는 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포를 정성 및 정량적으로 측정하는 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는, 첨부된 청구항에 기술된, 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포 샘플에 존재하는 무손상 사멸 세포를 계수하기 위한 유세포 형광측정법의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예들은 후술한 상세한 설명에서 기술될 것이다.
본 발명은, 일차적으로, 1x106 내지 1x1010 UFC/g, 바람직하게는 1x107 내지 1x109 UFC/g 범위의 농도를 가지는 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 박테리아 세포 배양물의, 예를 들어, 건조, 탈수 또는 냉동-건조된 배양물과 같은 고형물 형태의 제조 방법에 관한 것이다. 이 배양물은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법 및 디바이스에 따라 제조된다. 박테리아 세포 배양물이 준비되면, 틴달화된 박테리아 세포 배양물을 수득하기 위해, 당업자에게 공지된 기법에 따라, 틴달화 공정을 수행한다.
그런 후, 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 박테리아 세포를 정량하기 위해, 본 출원인은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (53103)에 효과적으로 활용되며 세포 형광측정법에 기반한, 틴달화된 박테리아 세포의 정성 및 정량적인 측정을 위한 혁신적이고 분석적인 계수 방법을 개발하였다.
본 출원인은 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 샘플에 유세포 형광측정법을 적용하며, 이때 샘플은 공지된 틴달화 기법 및 디바이스에 의해 수득된다.
본 방법은, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법 및 디바이스에 의한 제조 후, 복제능 및 효소적 능력을 불활화하는, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법 및 디바이스로 수행되는 틴달화 공정을 거친, 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 박테리아 세포를 신속 정확하게 계산 (computation)하는데 유용하다.
전통적인 계수 방법으로는 틴달화된 생물 샘플에 존재하는 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 박테리아 사멸 세포를 정량할 수 없으며, 잘 확립되고 재현가능한 생물학적 활성 (면역계의 자극 및/또는 생활성 펩타이드)을 가진 샘플을 보장해줄 수 없어, 본 출원인은 본 방법을 개발하게 되었다. 유익하게는, 본 방법은, 복제불가하지만 세포벽 측면에서는 구조적 온전성 (structural integrity)을 가진, 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 박테리아 세포에 성공적으로 적용가능하다.
본 발명의 방법은 명세서에서 보다 상세하게 후술된 일련의 단계들을 포함한다.
최초로, 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포를 계수하기 위해 유세포 형광측정법을 활용한다.
이에, 본 발명의 과제는 틴달화된 샘플에서 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 박테리아 세포 수 및 그 생물 활성을 입수, 계수 및 확인하는데 있어서의 세포 형광측정법의 용도를 제공하는 것이다.
유세포 측정법은 박테리아 현탁액에 존재하는 생 세포/사멸 세포를 정량하는 신속하고 믿을 수 있는 방법을 제공해준다. 세포 형광측정 분석을 통해, 세포벽의 온전성을 특히 평가하는 "BD™ Cell Viability" kit (Becton Dickinson Company에서 시판함)에 첨부된 특이 염료들의 조합을 이용하여, 예를 들어, 박테리아 세포 배양물과 같은 생물 샘플에서 생 세포와 사멸 세포를 구분할 수 있다.
시판 키트 (commercially available kit)는 모든 세포, 즉 생 세포 및 사멸 세포를 표지할 수 있는 티아졸 오렌지 (TO)와, 사멸 세포에 특이적인 요오드화프로피디움과 같은 제2 염색 시약을 포함한다.
세포를 정량적으로 측정하기 위해서는, Becton Dickinson Company에 의해 시판된 형광 비드 "BD™ Liquid Counting Beads" 현탁액을 전술한 키트와 조합하여야 한다. 비드 현탁액은 0.1% 아지드화나트륨 용액에 현탁된 형광성 폴리스티렌 마이크로스피어 (microsphere) 현탁액이다.
10 내지 100 ㎕, 바람직하게는 40 내지 60 ㎕ 범위의 기지량 (known amount)의 비드를 첨가하여, 수집된 데이타를 외삽함으로써 절대 세포 수 (absolute cell count)를 결정한다.
무손상 세포질막을 가진 생 세포는 요오드화프로피디움 (PI)과 같은 염료에 비-투과성을 나타낸다. 반대로, 요오드화프로피디움 (PI)과 같은 염료는 손상된 세포질막을 가진 세포에는 침투할 수 있다. 티아졸 오렌지 (TO)는 모든 세포, 즉 생 세포 및 사멸 세포 둘다에 침투할 수 있는 염료이다. 이 2종의 염색 시약의 조합은 구조적 온전성을 가진 박테리아 세포를 생 세포와 사멸 세포로 구분하는 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공해준다.
시약과 테스트 샘플을 컨디셔닝 (conditioning)하기 위한 예비 단계를 수행하는 것이 중요하다.
따라서, 그 절차는 다음과 같다:
●
키트 시약들을 모두 사용전에 실온에 둔다.
●
박테리아 세포가 함유된 생물 샘플을 실온에서 1-6시간, 바람직하게는 1.5-3시간, 예를 들어, -20℃의 온도에서 보관한 경우에는 2-2.5시간, +4℃에서 보관한 경우에는 약 60분간, 예를 들어 30분간 실온에 둔다.
●
비드가 함유된 현탁액을 천천히 부드럽게 교반한다.
다음으로, 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103)의 박테리아 세포 배양물 제조 및 후속적인 이의 틴달 처리를 통해, 틴달화된 박테리아 세포의 배양물을, 예를 들어, 1x106 내지 1x1010 UFC/g, 바람직하게는 1x107 내지 1x109 UFC/g 범위의 농도를 가진 건조, 탈수된 또는 동결-건조된 배양물과 같은 고형물 형태로, 수득하는 과정이 수행된다.
그런 후, 테스트 샘플을 준비한다.
●
액체 형태의 샘플의 경우, 약 세포 105-107 개/ml의 농도 비율에 도달할 때까지 0.1% 멸균 펩톤 염수에 1:10로 연속 희석한다.
●
무수 샘플의 경우, 샘플을 무균 백에서 1:10으로 재구성하고 전체를 흔들어 (stomaching) 조제물을 균질화한다. 이후, 액체 형태의 샘플에서와 같이 1:10으로 후속적인 희석을 수행한다.
그런 다음, 세포 형광측정법을 이용해 생 세포/사멸 세포의 계수 분석을 수행한다.
염색 단계로서, 그 절차는 다음과 같다:
●
적정 희석물 0.5 ml에 티아졸 오렌지 TO 2.5 ㎕와 요오드화프로피디움 PI 1.5 ㎕를 첨가하여 교반한 다음, 실온에서 2분간 인큐베이션하고;
●
비드 함유 현탁액 50 ㎕를 첨가한 다음, 이 샘플에 대해 세포 형광측정 분석을 수행한다.
그런 후, 데이타 획득 및 분석을 수행한다.
집단 (population)의 분석 범위를 정하기 위해, x축이 전방 산란 (FSC, Forward scatter)이고; y축이 측방 산란 (SSC, Side Scatter)인 사이토그램 (cytogram)을 확립한다.
사용 염료의 내재화에 기초하여 차별적으로 구분되는 세포 아군을 적절하게 가시화하기 위해, x축이 FL-1 (TO, 도 2 참조)이고; y축이 FL-3 (PI, 도 2 참조)인 제2 사이토그램을 확립한다.
도 1은 FSC vs SSC 사이토그램이고, 도 2는 FL1 vs FL3 사이토그램이다.
그 후, 결과를 계산하고, 표시한다.
샘플내 박테리아 사멸 세포의 수를 구하기 위해, 아래 식을 이용한다.
(*) 적용 값은 사용 비드의 패키지에 기재된 값이며, 배치에 따라 달라짐; D.F. = 희석 배율 (dilution factor).
그 결과는 액체 형태의 샘플일 경우 세포 수/ml로, 또는 무수 형태의 샘플일 경우 세포 수/g으로 표시된다.
상기 식과 구역 (R6)에 의해 설정된 세포 현상 (cellular event)에 의해, 샘플내 존재하는 사멸 세포의 수를 구한다.
사멸 세포이지만 구조 온전성을 유지한 세포는 액체 형태의 샘플의 경우 세포 수/ml로, 또는 무수 형태의 샘플의 경우 세포 수/g으로 표시한다.
일 구현예는 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 샘플에서 무손상 세포막을 가진 사멸 세포의 수를 계수하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 연속 희석에 의해, 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포를 105 내지 107개의 세포/ml 범위의 농도로 포함하는 샘플을 준비하는 단계;
- 상기 샘플에 제1 시약 티아졸 오렌지 및 제2 시약 요오드화프로피디움을 첨가하여, 용액을 수득하는 단계;
- 상기 용액에, 아지드화나트륨 중의 형광 마이크로스피어 현탁액을 첨가하여, 테스트 샘플을 수득하는 단계;
- 상기 테스트 샘플에 대해, 생 세포 및 사멸 세포를 포함하는 전체 세포 수의 계수 및 사멸 세포 수만의 계수를 실시하는 단계;
- 틴달화된 샘플에 존재하는 사멸 세포의 수를 산출하는 단계.
바람직하게는, 본 방법은, 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포를 105 - 107 세포/ml 범위의 농도로 포함하는 샘플 0.5 ml에, 제1 시약 2.5 ㎕ 및 제2 시약 1.5 ㎕를 첨가하여 용액을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은, 아지드화나트륨 중의 형광성 마이크로스피어 현탁액이 폴리스티렌 마이크로스피어를 포함하며, 바람직하게는 비드 현탁액이 0.1% 아지드화나트륨 용액 중의 형광성 폴리스티렌 마이크로스피어 현탁액인 것을, 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은, 세포 계수 측정을 위해, 10 내지 100 ㎕, 바람직하게는 40 내지 60 ㎕ 범위의 기지량 (known amount)의 비드 첨가를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예는 하기 단계를 포함하는 무손상 세포벽을 가진 틴달화 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 제조 방법에 관한 것이다:
- 1x106 - 1x1010 UFC/g 범위의 농도를 가진 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포 배양물을 제조하는 단계;
- 배양물에 대해 틴달화 공정을 수행하여, 틴달화된 박테리아 세포 배양물을 수득하는 단계;
- 전술한 계수 방법을 적용하는 단계.
또 다른 구현예는 전술한 박테리아 세포 제조 방법에 의해 수득되는 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포 배양물에 관한 것이다.
또 다른 구현예는 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 샘플에서 무손상 세포막을 가진 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 사멸 세포의 수를 계수하기 위한 유세포 형광측정법의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 이러한 용도는, 무손상 세포막을 가진 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 사멸 세포를 전술한 계수 방법으로 계수하는 것을 포함한다.
락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포에 대해 수행된 실험예를 아래에 나타낸다 (값은 bn/g으로 표시됨):
| 샘플 | 틴달화 처리 전 | 틴달화 처리 후 | ||
| 생 세포 | 사멸 세포 | 생 세포 | 사멸 세포 | |
| 1 | 211 | 137 | 0.001 | 179 |
도 3은 상기 샘플의 FSC vs SSC 사이토그램이고, 도 4는 상기 샘플의 FL1 vs FL3 사이토그램이다.
본원에서 사용되는 세포 형광측정기와 키트는 다음과 같은 사양을 가진다.
●
488 nm 레이저 여기 및 CellQuest™ 소프트웨어가 구비된 유세포 측정기 FACSCalibur 3CA (Becton Dickinson Italia, cat No 343020).
●
BD™ 새포 생존성 키트 (Cell Viability Kit) 및 BD 액상 카운팅 비드 (Liquid Counting Beads) (cat No 34948).
Claims (8)
- 틴달화된 (tyndallized) 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 샘플에서 무손상 세포막을 가진 사멸 세포의 수를 계수하는 방법으로서,
- 연속 희석 (serial dilution)에 의해, 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포를 105 - 107 세포/ml 범위의 농도로 포함하는 샘플을 준비하는 단계;
- 상기 샘플에 제1 시약 티아졸 오렌지와 제2 시약 요오드화프로피디움을 첨가하여, 용액을 수득하는 단계;
- 상기 용액에, 아지드화나트륨 중의 형광성 마이크로스피어 (fluorescent microsphere) 현탁액을 첨가하여, 테스트 샘플을 수득하는 단계;
- 상기 테스트 샘플에 대해, 유세포 형광측정법 (flow cytofluorometry)에 의해, 생 세포 및 사멸 세포를 포함하는 전체 세포 수의 계수 및 사멸 세포 수만의 계수를 실시하는 단계;
- 틴달화 샘플에 존재하는 사멸 세포의 수를 산출하는 단계. - 제1항에 있어서,
틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포를 105 - 107 세포/ml 범위의 농도로 포함하는 샘플 0.5 ml에, 상기 제1 시약 2.5 ㎕과 상기 제2 시약 1.5 ㎕를 첨가하여 용액을 제조하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 아지드화나트륨 중의 형광성 마이크로스피어 현탁액이 폴리스티렌 마이크로스피어를 포함하며, 바람직하게는 비드 현탁액이 0.1% 요오드화나트륨 용액 중의 형광성 폴리스티렌 마이크로스피어 현탁액인, 방법. - 제3항에 있어서,
세포 수 측정을 위해, 10 내지 100 ㎕, 바람직하게는 40 내지 60 ㎕ 범위의 기지량 (known amount)의 비드를 첨가하는, 방법. - 무손상 세포벽을 가진 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포의 제조 방법으로서,
- 1x106 내지 1x1010 UFC/g 범위의 농도를 가진 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포 배양물을 제조하는 단계;
- 상기 배양물에 틴달화 공정을 수행하여, 틴달화된 박테리아 세포 배양물을 수득하는 단계;
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 계수 방법을 적용하는 단계를 포함하는, 방법. - 제5항에 따른 방법으로 수득되는 면역학적으로 활성인 틴달화된 무손상 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포 배양물.
- 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 세포 샘플에서 무손상 세포막을 가진 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 사멸 세포의 수를 계수하는데 있어서의 유세포 형광측정법의 용도.
- 제7항에 있어서,
상기 무손상 세포막을 가진 틴달화된 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 박테리아 사멸 세포는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 계수되는, 용도.
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Legal Events
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| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20220728 Patent event code: PE09021S01D |
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| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20221017 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20220728 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |