KR20170074237A

KR20170074237A - 세포 단리 방법 및 세포 포착 필터

Info

Publication number: KR20170074237A
Application number: KR1020177014027A
Authority: KR
Inventors: 도모코 요시노; 츠요시 다나카; 다다시 마츠나가; 료 네기시; 히사시게 간바라; 세이타 나카무라
Original assignee: 고꾸리쯔 다이가꾸호우징 도쿄노우코우다이가쿠; 히타치가세이가부시끼가이샤
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2017-06-29
Also published as: SG11201703487TA; US10538732B2; JPWO2016068249A1; EP3214166A1; WO2016068249A1; JP6619353B2; CN107075447A; TW201627501A; EP3214166A4; US20170321183A1

Abstract

세포 단리 방법은 두께 방향으로 복수의 관통 구멍을 갖는 세포 포착 필터에 대하여 피검액을 통과시킴으로써, 세포 포착 필터의 한쪽의 면 위에 피검액에 포함되는 단리 대상의 세포를 포착하는 세포 포착 스텝과, 세포 포착 스텝에 있어서, 세포가 포착된 세포 포착 필터의 한쪽의 면 위에 자극 응답성 하이드로겔을 도입하고, 당해 자극 응답성 하이드로겔에 의해 세포를 포매하는 겔 포매 스텝과, 세포를 포매한 자극 응답성 하이드로겔에 대하여 자극을 부여함으로써, 당해 자극 응답성 하이드로겔을 경화시키는 겔 경화 스텝과, 겔 경화 스텝에 있어서, 경화한 자극 응답성 하이드로겔을 세포 포착 필터로부터 박리하는 박리 스텝을 갖는다.

Description

세포 단리 방법 및 세포 포착 필터 {CELL ISOLATION METHOD AND CELL TRAPPING FILTER}

본 발명은 세포 단리 방법 및 이 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터에 관한 것이다.

암은 세계 각국에서 사인의 상위를 차지하기 때문에, 그의 조기 발견 및 치료가 요망되고 있다. 암에 의한 사람의 사망은 암의 전이 재발에 의한 것이 대부분이다. 암의 전이 재발은 암세포가 원발소로부터 혈관 또는 림프관을 경유하여, 다른 장기 조직의 혈관벽에 정착, 침윤하여 미소 전이소를 형성함으로써 일어난다. 이와 같은 혈관 또는 림프관을 통해 사람의 체내를 순환하는 암세포는 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cell, 이하 경우에 따라 「CTC」라고 함)라고 부르고 있다.

암의 전이 재발을 일으킬 가능성이 있는 혈관 중의 암세포(CTC)의 유무 및 그의 양을 측정할 수 있다면, 암 치료에 큰 공헌이 가능해진다. 혈액 중의 암세포를 포착하는 종래 기술로서는, 예를 들어 특허문헌 1에 기재된 구성이 알려져 있다. 특허문헌 1에 기재된 기술은 혈액 중의 암세포를 필터로 포획하려고 하는 것이고, 여기서는 필터의 반도체 기술을 사용한 제조 방법, 필터를 수납한 셀 유닛의 형상, 및 혈액 및 처리액을 흐르게 하는 유로의 구조가 개시되어 있다.

미국 특허 출원 공개 제2011/0053152호 명세서

그러나, 최근, 혈관 중의 암세포의 상황에 대하여 보다 정확하게 파악을 할 목적으로, 암세포의 개체에 대하여 각각 관찰하고자 하는 요구가 있다. 그러나, 예를 들어 특허문헌 1에 기재된 기술을 사용하여 필터 위에 암세포를 포착했다고 해도, 암세포 개체를 관찰하는 것은 곤란하다. 또한, 필터 위의 암세포는 탄성 변형되기 쉬우므로 취급이 곤란한 한편, 손상시켜 버리면 암세포의 관찰을 적합하게 행할 수 없다.

본 발명은 상기를 감안하여 이루어진 것이고, 세포 포착 필터 위에 포착된 암세포를 손상시키지 않고 단리하는 것이 가능한 세포 단리 방법 및 이 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 형태에 관한 세포 단리 방법은, 두께 방향으로 복수의 관통 구멍을 갖는 세포 포착 필터에 대하여 피검액을 통과시킴으로써, 세포 포착 필터의 한쪽의 면 위에 상기 피검액에 포함되는 단리 대상의 세포를 포착하는 세포 포착 스텝과, 상기 세포 포착 스텝에 있어서, 상기 세포가 포착된 상기 세포 포착 필터의 한쪽의 면 위에 자극 응답성 하이드로겔을 도입하고, 당해 자극 응답성 하이드로겔에 의해 상기 세포를 포매하는 겔 포매 스텝과, 상기 세포를 포매한 상기 자극 응답성 하이드로겔에 대하여 자극을 부여함으로써, 당해 자극 응답성 하이드로겔을 경화시키는 겔 경화 스텝과, 상기 겔 경화 스텝에 있어서, 경화한 상기 자극 응답성 하이드로겔을 상기 세포 포착 필터로부터 박리하는 박리 스텝을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기의 세포 단리 방법에서는, 세포 포착 스텝에 있어서, 세포가 포착된 세포 포착 필터(2)의 한쪽의 면 위에 자극 응답성 하이드로겔을 도입하고, 당해 자극 응답성 하이드로겔에 의해 세포를 포매한 후, 자극 응답성 하이드로겔에 대하여 자극을 부여함으로써, 당해 자극 응답성 하이드로겔을 경화시키고, 경화한 자극 응답성 하이드로겔을 세포 포착 필터로부터 박리한다. 이와 같이, 자극 응답성 하이드로겔을 사용하여 세포를 단리함으로써, 세포가 자극 응답성 하이드로겔에 포매된 상태로 세포를 조작하기 때문에, 단리 대상의 세포를 직접 조작하는 경우와 비교하여 취급성이 향상되어, 세포를 손상시키지 않고 단리하는 것이 가능해진다.

여기서, 상기 겔 경화 스텝에 있어서, 상기 세포를 포매한 상기 자극 응답성 하이드로겔 중 단리 대상의 상기 세포의 주위만을 국소적으로 경화시키는 형태로 할 수 있다.

이와 같이, 겔 경화 스텝에 있어서, 단리 대상의 상기 세포의 주위만을 국소적으로 경화시키는 구성으로 한 경우에는, 세포마다 개별로 경화된 하이드로겔을 조작할 수 있기 때문에, 취급성이 더욱 향상된다.

또한, 본 발명의 일 형태에 관한 세포 포착 필터는, 상기의 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터이며, 상기 한쪽의 면측에 있어서 인접하는 상기 관통 구멍간의 거리가 80㎛ 이상인 것을 특징으로 한다.

상기의 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터(2)는 한쪽의 면측에 있어서 인접하는 관통 구멍간의 거리가 80㎛ 이상인 구성으로 함으로써, 인접하는 관통 구멍에 포착된 세포가 하이드로겔에 의해 한꺼번에 경화되는 것을 방지할 수 있기 때문에, 세포의 단리를 적합하게 행할 수 있다.

본 발명에 따르면, 세포 포착 필터 위에 포착된 세포를 손상시키지 않고 단리하는 것이 가능한 세포 단리 방법 및 이 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터가 제공된다.

도 1은 세포 포착 디바이스의 개략 구성도이다.
도 2는 세포 포착 디바이스의 분해 사시도이다.
도 3은 세포 포착 필터에 대하여 설명하는 도면이다.
도 4는 세포 포착 필터에 대하여 설명하는 도면이다.
도 5는 세포 단리 방법에 대하여 설명하는 도면이다.
도 6은 PEGDA에 대하여 설명하는 도면이다.
도 7은 경화 후의 PEGDA의 구조에 대하여 설명하는 도면이다.
도 8은 단리 후의 PEGDA의 SEM 화상이다.

이하, 첨부 도면을 참조하여, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 상세하게 설명한다. 또한, 도면의 설명에 있어서는 동일 요소에는 동일 부호를 부여하여, 중복되는 설명을 생략한다.

도 1은 본 발명의 일 형태에 관한 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터를 포함하는 세포 포착 디바이스의 구성을 설명하는 도면이고, 도 2는 세포 포착 디바이스의 분해 사시도이다. 또한, 도 3 및 도 4는 세포 포착 필터에 대하여 설명하는 도면이다.

세포 포착 디바이스는 피검액이 되는 세포 분산액을 세포 포착 필터에 의해 여과함으로써, 피검액 중에 포함되는 세포를 포착하는 장치이다. 또한, 세포 포착 필터에 의해 포착된 세포를 이하의 실시 형태에서 설명하는 단리 방법에 의해 단리함으로써, 세포의 특정 및 세포의 개체수의 카운트 등이 행해진다. 피검액이 되는 세포 분산액으로서는, 예를 들어 혈액 및 혈액을 희석한 액체를 들 수 있다. 세포 포착 디바이스는, 예를 들어 CTC라고 불리는 순환 암세포 등의 희소 세포가 포함되는 혈액 중에서, 혈액 중에 포함되는 적혈구, 혈소판 및 백혈구(이하, 이들을 총칭하여 「혈구 성분」이라 함)를 통과시키는 한편, 희소 세포를 포착할 목적으로 적합하게 사용된다. 희소 세포의 종류는 CTC로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 순환 내피 세포(Circulating endothelial cells: CEC) 및 혈관 순환 내피 전구 세포(Circulating endothelial progenitor cells: CEP) 등도 포착 대상의 희소 세포로서 취급할 수 있다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포 포착 디바이스(1)는, 두께 방향으로 관통 구멍이 복수 형성된 세포 포착 필터(2)의 상방에 프레임재(3)가 설치되어 있음과 함께 하방에 배출 유로가 형성된 것이다.

세포 포착 필터(2)의 재질로서는 가능한 한 경질인 것이 좋고, 특히 금속이 바람직하다. 금속은 가공성이 우수하기 때문에, 필터의 가공 정밀도를 높일 수 있다. 이에 의해, 포획 대상으로 하는 성분의 포획률을 더욱 향상시킬 수 있다. 또한, 금속은 플라스틱 등의 다른 재료에 비해 강직하기 때문에, 외부로부터 힘이 가해져도 그의 사이즈 및 형상이 유지된다. 이로 인해, 관통 구멍보다도 약간 큰 성분을 변형시켜 통과시키는 경우, 보다 고정밀도의 분리ㆍ농축이 가능해진다.

금속의 주성분으로서는, 니켈, 은, 팔라듐, 구리, 이리듐, 루테늄, 크롬 중 어느 것, 혹은 이들의 합금이 바람직하다. 이 중, 특히 금속의 주성분으로서 구리 또는 니켈이 사용되는 것이 바람직하다.

세포 포착 필터(2)로서, 본 실시 형태에서는 두께 25㎛의 니켈 기판을 사용한 경우에 대하여 설명하지만, 두께는 적절히 변경할 수 있고, 예를 들어 10㎛ 내지 100㎛로 할 수 있다. 세포 포착 필터(2)는, 도 3에 나타낸 바와 같이 중앙에 복수의 관통 구멍(21)이 형성된 필터 영역(22)이 형성된다.

세포 포착 필터(2)의 필터 영역(22)은, 도 4의 (A)에 나타낸 바와 같이 상방에서 보았을 때에 직경 8㎛인 원형의 관통 구멍(21)이 복수 형성되어 있다. 관통 구멍(21)은 인접하는 관통 구멍(21)과의 간격이 125㎛가 되도록 격자상으로 배치되어 있고, 필터 영역(22) 내에 관통 구멍(21)이 63×63=3969개 배치되어 있다. 또한, 단면으로부터 본 경우, 도 4의 (B)에 나타낸 바와 같이, 상면측(피검액이 도입되는 측)에서는 관통 구멍(21)의 주위에 깊이 2㎛의 오목부(23)가 형성되어 있다. 또한, 상면측으로부터 하면측(피검액이 배출되는 측)을 향해, 관통 구멍(21)의 구멍 직경이 서서히 커지도록 경사져 있다.

관통 구멍(21)의 형상 및 배치는 적절히 변경할 수 있지만, 본 실시 형태에 관한 세포 포착 필터(2)에서는 인접하는 관통 구멍(21)과의 거리가 80㎛ 이상인 것이 바람직하다. 관통 구멍(21)간의 거리를 상기의 범위로 함으로써, 포착한 세포의 단리가 용이해진다.

도 1 및 도 2로 돌아가, 세포 포착 필터(2)의 상방의 프레임재(3)는 세포 포착 필터(2)의 필터 영역(22)보다도 외측에 두고, 세포 포착 필터(2)를 둘러싸도록 설치된다. 프레임재(3)는, 예를 들어 수지 등과 같이 세포 포착 필터(2)에 대하여 밀착성을 갖는 재료에 의해 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 프레임재(3)보다도 상방에 있어서, 세포 포착 디바이스(1)에 대하여 피검액 또는 처리액을 도입하기 위해 도입 유로를 갖는 도입 부재 등을 설치하는 구성으로 해도 된다.

세포 포착 필터(2)의 하방에는, 프레임재(5) 및 유로 부재(6)에 의해, 세포 포착 필터(2)의 관통 구멍(21)을 상방으로부터 하방으로 통과한 피검액을 외부로 배출하기 위한 배출 유로(61)와, 배출 유로(61)에 대하여 피검액을 이동시키는 배출 영역(62)이 설치되어 있다.

구체적으로는, 유로 부재(6)에는 배출 유로(61)가 형성되어 있다. 유로 부재(6)의 상부에는 시일 부재(7)를 개재하여 프레임재(5)가 설치되어 있다. 프레임재(5)는 내측에 필터 영역(22)에 대응한 개구가 형성된 환상의 부재이다. 이 프레임재(5)에 의해 둘러싸인 영역이 배출 영역(62)이 된다. 세포 포착 필터(2)와 프레임재(5) 사이에는 시일 부재(8)가 설치된다.

프레임재(5) 및 유로 부재(6)는 수지 등에 의해 구성할 수 있다. 프레임재(5)는, 예를 들어 PMMA[폴리(메틸 메타크릴레이트)(Poly(methyl methacrylate))]에 의해 구성할 수 있다. 또한, 유로 부재(6)는, 예를 들어 배출 유로(61)를 실리콘 튜브에 의해 형성하고, 그의 주위를 PDMS[폴리(디메틸실록산)(poly(dimethylsiloxane))]에 의해 덮음으로써 성형하는 구성으로 할 수 있다. 시일 부재(7, 8)는 각각 세포 포착 필터(2), 프레임재(5) 및 유로 부재(6)에 대하여 밀착성을 갖는 재료에 의해 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 프레임재(3), 시일 부재(7, 8)로서는, 예를 들어 계내 PCR 시일(in situ PCR seal)(Bio-Rad Laboratories사제)을 사용할 수 있다.

이와 같이 형성한 세포 포착 디바이스(1)는 배출 유로(61)를 펌프 등에 접속하고, 펌프에 의한 흡인에 의해 피검액 등을 흡인함으로써, 피검액이 세포 포착 필터(2)의 관통 구멍(21)을 통과함과 함께 통과할 수 없는 세포가 세포 포착 필터(2)의 상면측에 포착된다.

또한, 피검액을 도입하기 전에는, 예를 들어 PBS(0.5% BSA(N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드), 2mM EDTA(에틸렌디아민사아세트산)) 등에 의해 세포 포착 디바이스(1) 내를 채워 둠으로써, 피검액을 적합하게 도입할 수 있다. 또한, 세포를 포착한 후에도, PBS 등에 의해 포착된 세포의 세정 처리를 행하는 것이 바람직하다. 또한, 포착한 후의 세포에 대해서는, 고정액, 염색액 등을 사용하여 원하는 처리를 행해도 된다. 이 경우, 세포 포착 디바이스(1) 내에 고정액, 염색액 등을 도입하여 소정의 시간 정치한 후에, PBS에 의해 세정하는 방법을 사용할 수 있다.

이어서, 세포 포착 디바이스(1)로부터의 세포의 단리 방법에 대하여, 도 5를 참조하면서 설명한다. 도 5는 세포 포착 디바이스(1)를 사용한 세포의 단리 방법을 설명하는 도면이다. 먼저, 도 5의 (A)에 나타낸 바와 같이, 피검액을 세포 포착 필터(2)의 관통 구멍(21)에 통과시킴으로써, 예를 들어 CTC 등의 포착 대상의 세포가 관통 구멍(21) 위에 포착된다(세포 포착 스텝). 이때, 포착 대상인 CTC(91) 외에, 혈중 성분인 적혈구(92) 및 백혈구(93) 등의 다른 세포도 세포 포착 필터(2) 위에 포착되는 경우가 있다.

이어서, 자극 응답성 하이드로겔을 세포 포착 필터(2)의 세포가 포착되어 있는 상면측에 도입하여 자극 응답성 하이드로겔(31)에 의해 포착된 세포를 포매한다(겔 포매 스텝). 자극 응답성 하이드로겔(31)은 온도, 전기장, 광 등의 외부 환경의 약간의 변화에 응답하여, 친ㆍ소수성 등의 물리 화학적 특성이 극적으로 변화되는 하이드로겔을 의미한다. 본 실시 형태에 관한 세포 단리 방법에서는 자극에 응답하여, 경화되는 겔이 적합하게 사용된다.

이와 같은 자극 응답성 하이드로겔로서는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(Polyethyleneglycol diacrylate)(PEGDA)를 사용할 수 있다. PEGDA는, 도 6에 나타낸 바와 같이 자외선 조사에 의해 가교 구조를 얻을 수 있다. 또한, 다른 자극 응답성 하이드로겔로서는, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(Poly(N-isopropylacrylamide))(PNIPAAm), 키토산 겔 등을 들 수 있다.

PEGDA를 사용하는 경우, 예를 들어 2-히드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropiophenone)을 첨가한 용액을 세포 포착 필터(2) 위에 도입하고 프레임재(3) 위로부터 커버 유리를 적층하는 방법을 사용할 수 있다.

PEGDA를 사용하는 경우, 자극 응답성 하이드로겔의 도입량은 단리 대상의 세포를 포매할 수 있는 양이라면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 세포 포착 필터(2) 위에 도입된 자극 응답성 하이드로겔의 높이가 100㎛ 내지 600㎛ 정도가 되도록 도입하는 것이 바람직하다. 이와 같은 범위로 함으로써, 10㎛ 내지 수십㎛ 정도의 크기의 단리 대상의 세포를 적합하게 포매할 수 있다. 또한, 경화 후의 하이드로겔의 취급성이 향상된다. 높이가 100㎛ 이하인 경우에는 경화 후의 하이드로겔의 취급이 어려워진다. 또한, 높이가 600㎛보다도 높아지면, 경화하는 영역의 크기를 적합하게 제어하는 것이 어려워질 가능성이 있다. 자극 응답성 하이드로겔의 도입량에 대하여, 보다 바람직하게는 높이가 200㎛ 내지 300㎛ 정도가 된다.

이어서, 도 5의 (C) 및 도 5의 (D)에 나타낸 바와 같이, 자극 응답성 하이드로겔(31)을 경화시킨다(겔 경화 스텝). 자극 응답성 하이드로겔(31)이 광경화성인 경우에는, 광원으로부터의 광을 포착 대상의 세포의 주위에 대해서만 광을 조사함으로써, 세포의 주위만을 경화시킬 수 있다. 또한, 자극 응답성 하이드로겔(31)로서 PEGDA를 사용하는 경우, 자외선 레이저광을 조사함으로써, 세포 주위의 PEGDA를 경화시킬 수 있다. 세포 주위의 자극 응답성 하이드로겔을 선택적으로 경화시킴으로써, 다른 세포와는 별도로 당해 세포를 경화시킬 수 있다.

그 후, 도 5의 (E)에 나타낸 바와 같이, 경화 후의 자극 응답성 하이드로겔(32)을 세포 포착 필터(2) 위로부터 박리한다(박리 스텝). 이에 의해, 단리 대상의 세포(CTC(91))를 개별로 취출할 수 있다. 박리한 후에는 하이드로겔 중으로부터 세포를 개별로 취출해도 되고, 그대로 분석에 사용해도 된다.

여기서, 자극 응답성 하이드로겔로서 PEGDA를 사용하는 경우에 대하여 상세를 검토한 결과를 나타낸다.

세포 포착 필터(2)로서, 직경 8㎛의 관통 구멍(21)이 간격 125㎛로 격자상으로 배치된 Ni 기판을 준비했다. 또한, 포착 대상의 세포로서, NCI-H1975 세포 또는 HCC827 세포 100 또는 1000cells를 정상인 혈액 및 PBS(0.5% BSA, 2mM EDTA) 1ml 중에 첨가한 것을 피검액으로 했다.

먼저, 세포 포착 디바이스(1)에 대하여 PBS 1ml를 도입하여 세포 포착 디바이스(1) 내의 PBS로 채웠다. 이어서, 세포 포착 디바이스(1) 내에 피검액을 도입하고, 연동 펌프를 사용하여 유량 150-1750μl/min으로 송액했다. 그 후, 피검액 중의 혈구 성분을 흘려보내기 위해 PBS 1ml를 도입하여 세정을 행하고, 연동 펌프에 의해 용액을 흡인 조작함으로써, 세포 포착 디바이스(1) 내의 PBS를 제거함과 함께, 세포 포착 필터(2)의 관통 구멍(21) 위에 세포를 포착했다. 그 후 유량을 200㎛/min으로 변경하고, 세포 고정 처리로서 PBS 중 4% 파라포름알데히드(PFA)(4% paraformaldehyde(PFA) in PBS)를 도입하고, 15분간 정치했다. 세포 포착 디바이스(1) 내를, PBS에 의해 PBS 중 PFA(PFA in PBS)를 세정하고, PBS 중 0.2% TritonX-100(0.2% TritonX-100 in PBS)로 치환하여 15분간 정치함으로써 투과 처리를 행하였다. 이어서, PBS로 세정한 후, 염색액(FITC 표지 항 시토케라틴(cytokeratin) 항체, PE 표지 항 CD45 항체, Hoechst33342)으로 치환하여 30분간 정치함으로써 염색을 행하였다. 그 후, PBS로 세정했다.

그 후, Mn 250, 575, 700의 PEGDA에 대하여, 2-히드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropiophenone)을 1.0%의 비율로 첨가한 용액을 제조하고, 세포 포착 디바이스(1)의 세포 포착 필터(2) 위에 도입하고, 그의 상면에 커버 유리를 적층했다. 그 후, 세포 포착 디바이스(1)를 공초점 레이저 주사형 현미경(FV1000-D IX81; Olympus사제)에 설치하고, 10배 대물 렌즈를 사용하여 기판 위의 단리 대상 세포를 선택했다. 대물 렌즈 100배 유침 렌즈로 전환한 후에, 렌즈를 커버 유리에 접촉시키고, 레이저 강도 1.4㎽, 파장 405㎚의 여기광을 180초간 조사하여, 국소적으로 PEGDA를 경화시켰다. 그 후, 커버 유리를 박리하여 경화한 하이드로겔을 세포 포착 필터(2) 위로부터 박리함으로써, 하이드로겔 중에 포매된 세포를 단리할 수 있었다.

세포 포착 필터(2) 위에서 커버 유리(51)에 덮인 후에 광에 의해 경화하는 하이드로겔(32)의 형상을 모식적으로 나타낸 것이 도 7이다. 하이드로겔(31) 중, 파선으로 나타내는 광선 L에 둘러싸인 영역이 경화된다. 또한, 박리한 하이드로겔(PEGDA)의 주사형 전자 현미경(SEM)으로 촬영한 결과를 나타낸 것이 도 8이다. 도 8의 (A)는 박리한 하이드로겔의 전체상이다. 또한, 도 8의 (B)는 박리한 하이드로겔이 존재한 영역을 파선으로 나타낸 상이다. 또한, 도 8의 (C)는 세포 포착 필터(2)의 관통 구멍(21) 주변에 대응하는 하이드로겔의 확대상이고, 세포를 포착하고 있는 것을 나타낸 것이다.

경화 후의 하이드로겔(32)은 폭(세포 포착 필터(2)와 대향하는 면에서의 크기)이 100㎛ 내지 400㎛ 정도가 되고, 높이가 100㎛ 내지 500㎛ 정도가 된다. 또한, 레이저광을 PEGDA에 대하여 조사한 경우, 경화 후의 하이드로겔은, 도 7에 나타낸 바와 같이 중앙 부분이 선 대칭의 잘록부를 갖는 형상이 된다. 이때의 잘록부 S(도 7 참조)는 대물 렌즈의 초점면이라고 생각된다. 또한, 잘록부 S의 유무 등의 하이드로겔의 형상은 레이저광 조사 조건 또는 하이드로겔의 높이 등에 따라 변경된다. 경화 후의 하이드로겔이 잘록부 S를 갖는 경우, 핀셋 등으로 하이드로겔을 유지하는 것이 용이해지므로, 취급성이 향상된다. 또한, 세포가 포매된 하이드로겔은 세포 단체와 비교하여 충분히 커지므로, 육안으로도 시인이 가능해진다. 따라서, 세포 단체를 취급하는 경우와 비교하여, 취급성이 더욱 향상된다.

경화 후의 하이드로겔(PEDGA)의 높이를 200㎛ 내지 300㎛로 한 경우, 레이저광에 의한 경화 영역에 대하여, 세포 포착 필터(2)에 대향하는 측의 면(단리 대상의 세포가 존재하는 측의 면)에 있어서 반경 250㎛ 이하로 할 수 있었다. 경화 영역의 면적을 작게 할 수 있으면, 세포의 단리 정밀도를 향상시킬 수 있으므로, PEDGA의 높이는 200㎛ 내지 300㎛로 하는 것이 바람직하다. 한편, 복수의 세포를 그의 위치 관계를 유지한 채 세포 포착 필터(2)로부터 박리하는 것을 목적으로 한 경우에는, PEDGA의 높이 등의 조건은 적절히 변경할 수 있다.

또한, 상기와 같이 PEDGA를 사용하여 단리한 세포에 대하여, 전체 게놈 증폭 반응을 행한바, PEDGA를 사용하지 않고 세포를 단리한 경우와 마찬가지로, 유전자량이 45-53만배 정도로 증폭되는 것이 확인되었다. 즉, PEDGA의 하이드로겔에 의한 게놈 증폭 저해는 확인되지 않았다. 또한, 세포가 PEDGA의 하이드로겔에 모두 포매되어 있는 경우에는, 전체 게놈 증폭에 관여하는 효소 등이 세포에 접근할 수 없었기 때문에, 유전자량의 증폭이 발생하지 않는 것도 확인되었으므로, 세포의 일부가 외부에 노출된 상태라면, 전체 게놈 증폭이 가능한 점에서, 단리된 세포에 관한 해석(유전자 변이 해석 등) 등을 실시하는 것이 가능하다.

이상과 같이, 본 실시 형태에 관한 세포 단리 방법에서는, 세포 포착 스텝에 있어서 세포가 포착된 세포 포착 필터(2)의 한쪽의 면 위에 자극 응답성 하이드로겔을 도입하고, 당해 자극 응답성 하이드로겔에 의해 세포를 포매한 후, 자극 응답성 하이드로겔에 대하여 자극을 부여함으로써, 당해 자극 응답성 하이드로겔을 경화시키고, 경화한 자극 응답성 하이드로겔을 세포 포착 필터로부터 박리한다. 이와 같이, 자극 응답성 하이드로겔을 사용하여 세포를 단리함으로써, 세포가 자극 응답성 하이드로겔에 포매된 상태로 세포를 조작하기 때문에, 단리 대상의 세포를 직접 조작하는 경우와 비교하여 취급성이 향상되어, 세포를 손상시키지 않고 단리하는 것이 가능해진다.

특히, 겔 경화 스텝에 있어서, 상기 세포를 포매한 상기 자극 응답성 하이드로겔 중 단리 대상의 상기 세포의 주위만을 국소적으로 경화시키는 구성으로 한 경우에는, 세포마다 개별로 경화된 하이드로겔을 조작할 수 있기 때문에, 취급성이 더욱 향상된다.

또한, 상기의 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터(2)는 한쪽의 면측에 있어서 인접하는 관통 구멍(21)간의 거리가 80㎛ 이상인 구성으로 함으로써, 인접하는 관통 구멍에 포착된 세포가 하이드로겔에 의해 한꺼번에 경화되는 것을 방지할 수 있으므로, 세포의 단리를 적합하게 행할 수 있다. 종래에는 세포 포착의 속도를 향상시키기 위해, 예를 들어 관통 구멍간의 거리를 60㎛ 정도로 하고 있었다. 이 경우에는, 세포의 포착 자체는 적합하게 행해지지만, 관통 구멍마다 개별로 하이드로겔을 경화시키는 것이 곤란하기 때문에, 하이드로겔을 사용하여 세포를 하나씩 단리하는 것이 어려웠다. 이에 대해, 세포 포착 필터(2)에 있어서의 관통 구멍(21)간의 거리를 크게 함으로써, 하이드로겔을 사용한 세포마다의 단리를 적합하게 행할 수 있다. 또한, 복수의 세포가 하나의 하이드로겔 중에 포함된 상태로 하이드로겔을 경화시켜 취출해도 되는 경우에는, 관통 구멍(21)간의 거리는 80㎛보다도 작아도 된다. 이 경우라도, 하이드로겔을 사용함으로써, 포착 후의 세포의 단리를 적합하게 행할 수 있다.

이상, 본 실시 형태에 관한 세포 단리 방법 및 세포 포착 필터에 대하여 설명했지만, 본 발명에 관한 세포 단리 방법 및 세포 포착 필터는 상기 실시 형태로 한정되지 않고, 다양한 변경을 행할 수 있다.

예를 들어, 세포 포착 필터가 사용되는 세포 포착 디바이스는 상기 실시 형태의 구조로 한정되지 않고 적절히 변경된다. 세포 포착 필터(2)의 관통 구멍(21)에 단리 대상의 세포를 포착할 수 있으면 되고, 그의 형상 등은 한정되지 않는다. 또한, 세포 포착 필터(2)의 관통 구멍(21)의 형상 등에 대해서도 특별히 한정되지 않고, 개구 형상으로서는, 타원, 정사각형, 직사각형, 모서리가 둥근 직사각형, 다각형 등을 예시할 수 있다. 또한, 세포의 포착 효율의 관점에서는, 원, 직사각형 또는 모서리가 둥근 직사각형이 바람직하다. 모서리가 둥근 직사각형이란 2개의 동등한 길이의 긴 변과 2개의 반원형으로 이루어지는 형상이다.

1 : 세포 포착 디바이스
2 : 세포 포착 필터
3, 5 : 프레임재
6 : 유로 부재
7, 8 : 시일 부재
61 : 배출 유로
62 : 배출 영역

Claims

두께 방향으로 복수의 관통 구멍을 갖는 세포 포착 필터에 대하여 피검액을 통과시킴으로써, 세포 포착 필터의 한쪽의 면 위에 상기 피검액에 포함되는 단리 대상의 세포를 포착하는 세포 포착 스텝과,
상기 세포 포착 스텝에 있어서, 상기 세포가 포착된 상기 세포 포착 필터의 한쪽의 면 위에 자극 응답성 하이드로겔을 도입하고, 당해 자극 응답성 하이드로겔에 의해 상기 세포를 포매하는 겔 포매 스텝과,
상기 세포를 포매한 상기 자극 응답성 하이드로겔에 대하여 자극을 부여함으로써, 당해 자극 응답성 하이드로겔을 경화시키는 겔 경화 스텝과,
상기 겔 경화 스텝에 있어서, 경화한 상기 자극 응답성 하이드로겔을 상기 세포 포착 필터로부터 박리하는 박리 스텝
을 포함하는 세포 단리 방법.
제1항에 있어서, 상기 겔 경화 스텝에 있어서, 상기 세포를 포매한 상기 자극 응답성 하이드로겔 중 단리 대상의 상기 세포의 주위만을 국소적으로 경화시키는 세포 단리 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 세포 단리 방법에 사용되는 세포 포착 필터이며,
상기 한쪽의 면측에 있어서 인접하는 상기 관통 구멍간의 거리가 80㎛ 이상인 세포 포착 필터.