KR20170043245A

KR20170043245A - 카자누스 카잔 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는, 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20170043245A
Application number: KR1020150142742A
Authority: KR
Inventors: 송윤선; 장민선; 김소담; 장바이오진; 김수린; 우홍화; 엄상미; 이중구; 최상호; 더 바이트 트란; 반 하이 도
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단; 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-10-13
Filing date: 2015-10-13
Publication date: 2017-04-21
Also published as: WO2017065516A1

Abstract

본 발명은 카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물, 이의 활성분획, 이로부터 분리된 단일 성분 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 여성암 및 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 카자누스 카잔 추출물, 이의 활성분획 및 이로부터 유래된 단일 성분이 여성호르몬성을 나타낸다는 것을 처음으로 확인한 것으로, 본 발명에서 제공하는 여성호르몬성 물질들은, 여성암과 갱년기 증상의 치료 및 예방을 위해 의약품과 건강기능성 식품 분야에서 이용될 수 있다.

Description

카자누스 카잔 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는, 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical compositions for prevention and treatment of cancer and menopausal symptom of women containing Cajanus cajan (L.) Huth or its isolated compound as an active ingredient}

본 발명은 카자누스 카잔(Cajanus cajan extract: CCE) 추출물, 이의 활성분획, 이로부터 분리한 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 여성암 및 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

자궁내막암, 유방암 등의 여성암과 갱년기 증후군 등의 질환은, 에스트로겐 (estrogen) 과다나 감소, 에스트로겐과 프로게스테론(progesterone)의 불균형 등 여성호르몬과 관련되어 있다.

자궁내막암

한국 여성에서 자궁내막암과 난소암 등은 1991년 이후 약 5배 증가하였으며 이와 같은 여성호르몬성 암 발생 빈도의 증가는 향후에도 지속될 것으로 예측된다. 자궁내막을 이상 증식시키는 위험인자로는 프로게스테론(progesterone)의 충분한 길항이 없는 에스트로겐(estrogen)에의 장기간 노출, 과체중, 서구화된 생활 등이 원인으로 생각되고 있다. 자궁내막암의 일차적인 치료는 수술이며, 수술과 화학요법 후 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor: ER) 또는 프로게스테론 수용체(progesterone receptor: PR)가 모두 양성인 환자는 여성호르몬요법이 효과적이다. 자궁내막암의 주요 원인으로서 프로게스테론과 균형이 맞지 않는 과다한 에스트로겐 노출이 자궁내막암을 8배 이상 증가시키는 것으로 알려져 있어, 프로게스테론 수용체 아고니스트(progesterone receptor agonist)인 메게스트롤(megestrol; Megace™)이 널리 사용되고 있다. 그러나 메게스트롤의 부작용으로 고혈압, 혈전성 정맥염, 체중증가 등이 지적되고 있다. 따라서 천연물로부터 프로게스테론과 에스트로겐 효능을 균형있게 조절할 수 있는 물질이 발굴된다면 부작용이 감소된 우수한 효능의 자궁내막암 치료제가 될 수 있을 것이다.

유방암

자궁내막암의 발병과 마찬가지로 에스트로겐(estrogen) 과다로 발생되는 유방암 또한 지난 10년 사이에 한국 여성에서 크게 증가하였으며, 현재 여성에게 제일 높게 나타나는 암이다. 유방암 발병 증가 원인으로서 고지방, 고칼로리의 서구화된 식생활과 비만, 늦은 결혼과 출산율 저하, 수유 기피, 에스트로겐 과다 노출 등이 주요원인으로 지적되고 있다. 서구지역은 한국 여성에 비해서도 3배 이상 유방암 발병 빈도가 높아 세계적으로 유방암 치료제의 수요가 매우 높다. 유방암 치료는 1차적으로 수술을 시행한 뒤, 재발 방지를 위하여 방사선 치료, 항암화학 요법, 호르몬 요법 등을 시행한다. 호르몬 요법은 재발률을 낮추는 데에 효과적이지만, 수년간에 걸쳐 장기 투여되므로 이후 내성이 발현되는 문제가 있다. 제1차 선택약제인 타목시펜의 경우, 전이성 암을 가진 많은 환자에서 장기투여 후 자궁내막암 유발과 세포 내성 발현이 큰 문제점으로 지적되고 있다. 현재 부작용 및 재발률을 한층 개선한 2차 항호르몬 치료제인 아로마타제 억제제로 Anastazole, Letrazole, Exemestane 등이 사용되고 있으나, 이는 사용이 폐경 이후 여성들에게로 한정되어 있다. 유방암의 치료제 개발에 있어서 중요한 관점은 우선 독성을 줄이기 위해서 발암에 관련된 분자를 표적하는 것이며, 장기간 사용과 재발 방지를 위해 약제 내성의 발현을 최소화하는 것이라 할 수 있다. ER/PR 양성 환자가 전체 유방암환자의 3분의 2를 차지하는 만큼 ER/PR은 가장 우수한 분자 표적이라 할 수 있다. 따라서 ER/PR을 분자 표적으로 하면서 부작용 및 약제 내성 발현을 최소화한 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질(selective estrogen receptor modulator; SERM), 프로게스트로겐 수용체 조절물질(selective progesterone receptor modulator; SPRM) 을 개발하는 것은 유방암 치료제 개발의 핵심 목표라고 할 수 있다.

폐경기 증후군

폐경 후 에스트로겐(estrogen)의 급속한 감소로 인하여 안면홍조, 골다공증 악화, 고지혈증, 우울감, 기억력저하 및 인지능력 저하 등을 포함하는 뇌정신 기능 저하, 정신적 불안정 및 급격한 감정의 변화, 질 건조증 등의 증상이 나타나게 된다. 이러한 폐경 후 증상에 대해서는 에스트로겐(estrogen) 단독 또는 에스트로겐/프로게스테론 복합제의 투여가 거의 유일한 치료법인데, 이를 호르몬대체요법(hormone replacement therapy: HRT) 이라고 한다. 하지만 HRT의 장기복용은 ER을 가지고 있는 조직, 예를 들면 유방, 자궁, 난소 등에서의 암 발생율을 증가시키는데 직접적으로 관여한다고 알려져있다. Women‘s Health Initiative (WHI) 연구결과에 의하면, 북미에서 가장 많이 처방되어지는 HRT 제제의 일종인 Premarin과 Prempro의 복용이 유방암 증가 및 심혈관계 질환 발생과 관련이 있다고 한다. 이밖에도 소규모의 다양한 임상결과는 HRT를 복용하고 있는 폐경후 여성에게서 자궁증식이 증가하는 등 HRT의 복용은 과다 세포증식 및 발암과 밀접한 관련이 있음을 시사하고 있다.

HRT와 관련된 발암 기작으로서 E2/ER 상호작용으로 인한 과잉 세포증식과 DNA 돌연변이의 축적 등이 제시되고 있으며, 에스트로겐(estrogen)의 생체 내 약물 대사과정 중 발생하는 반응성 대사체에 의한 유전독성 또한 그 발암 기작으로 제시되어 있다. 이러한 조직 특이적인 에스트로겐의 약리효과는 특정 조직/세포에서 에스트로겐과 ER에 상호작용하는 분자적 기작 및 관여하는 전사인자 등이 다양하기 때문인 것으로 알려져 왔다(Jordan, 2007). 예를 들면, 유방암치료제로 사용되는 타목시펜은 유방에서는 ER 안타고니스트로 작용하나, 자궁과 골에서는 ER 아고니스트로 작용하기 때문에 타목시펜의 장기복용은 자궁내막암의 부작용을 초래하기도 한다. 따라서 유방암 또는 자궁내막암 등 ER이 발암기작에 관여하는 암의 치료제 또는 폐경후증상 치료제의 개발은 ER에 대하여 조직 특이적인 차별효과를 가질 수 있는 물질, 즉 선택적 여성호르몬 수용체 조절물질(SERMs)을 개발하는 것이 치료제 개발의 궁극적인 목표라고 할 수 있다.

한편, 여성 갱년기 증상 개선 및 골다공증 예방/치료를 위한 건강식품으로 석류 추출물, 콩 추출물 및 이소플라본 제제, 달맞이 종자유 등이 이용되고 있다. 식물성 원료로부터 제조된 이러한 제품들은 소비자에게 안전하다는 인식을 주면서 그 시장이 급속히 팽창되고 있다. 그러나 식물성이어서 안전하다라는 인식은 과학적으로 근거가 없으며 이들 제품은 여러 종류의 화학적 성분들로 이루어진 복잡한 추출물로 구성되어 있고 건강보조식품의 경우 엄격한 독성시험을 거치지 않은 경우가 허다하여 그 안전성을 증명할 수 없다. 이들 제품의 부작용은 실제로 정부에서 일일이 모니터하기도 불가능한 상황이다. 또 그 효능에 있어서도 약리효능에 대한 과학적 근거가 부족하고, 엄격하고 정밀한 품질관리 규정을 준수하는지 판단이 어렵다. 따라서 기존 식물 추출물의 단점을 보완할 수 있는, 보다 안전하고 효능이 우수한 천연물 유래 물질이 요구되고 있다.

카자누스 카잔(Cajanus cajan (L.) Huth)은 콩과(Fabaceae) 카자누스속(Cajanus)의 다년생 식물로서 남부 아시아에서 3500여 년 전부터 경작되어 왔으며 동아프리카와 미주지역으로 퍼져나갔다 (Van der Maeson et al. 1995, Fuller, D. Q. et al. 2006). 카자누스 카잔(C.cajan)의 잎은 인도의 민간요법으로서 간질환에 사용되었으며 (Kundu et al., 2008) 남서부 나이지리아에서는 항암요법에 이용하였다 (Ashidi et al., 2010). 뿌리와 잎은 인도에서 당뇨병치료에 사용되었고 (Grover et al., 2002) 코트디부아르에서는 빈혈치료에 사용되었다 (Kone et al., 2012). 또한 브라질의 경우 다양한 감염치료요법 및 면역반응(Braga et al., 2007), 낙태를 유도 하는 것에 C.cajan을 사용하였다 (Lemonica and Alvarenga, 1994). 카자누스 카잔(C.cajan)의 뿌리와 잎의 추출물에서는 생리활성을 가진 물질을 분리한 연구결과가 있는데 주로 플라보노이드(Flavonoids)와 스틸벤(stilbene)이며 베툴린 산(betulinic acid), 제니스타인(Genistein)이 이에 해당한다 (Duker-Eshun et al., 2004). 약리활성으로는 간세포보호작용(Ghosh and Sil, 2006, Sarkar and Sil, 2006, Manna et al., 2007b, Sinha et al., 2007), 신세포보호작용(Manna et al., 2007a, Zhang et al., 2012), 신경세포보호작용(Ruan et al., 2009, Jiang et al., 2012), 콜레스테롤저하작용(Luo et al., 2008, Dai et al., 2013) 및 항염(Datta S et al. 1999), 항산화(Lai YS et al 2012), 항당뇨병(Ezike AC et al. 2010, Amalraj T et al. 1998), 항미생물(Zu YG et al. 2010), 항바이러스(Nwodo UU et al. 2011, Zu Y et al. 2010), 항진균(Brito SA et al. 2012), 항원충(Braga FG et al. 2007), 항암작용(Ashidi JS et al. 2010)이 보고된 바 있다. 카자누스 카잔은 항골다공증 작용에 대한 연구가 보고된 바 있다. 카자누스 카잔 (C.cajan L). 추출물 중 스틸벤(stilbene)이 난소절제술로 유도된 골 손실 쥐에서의 항 골다공증 기능을 나타내었다. 카자누스 카잔 (C.cajan L). 추출물은 혈청 에스트로겐(E2) 농도와 자궁무게에는 영향을 주지 않으면서 여포자극 호르몬(FSH)과 황체 호르몬(LH)을 줄였다 (Zheng YY et al. 2007). 한편 Zheng YY et al. 2007 의 연구에 따르면 카자누스 카잔(C.cajan L). 추출물이 골수유래 파골세포에서 항골다공증 효능을 확인하였다. 이러한 연구들은 카자누스 카잔(C.cajan) 추출물이 폐경기여성에게 유효한 기능을 할 수 있을 것임을 제시하고 있다. 그러나 카자누스 카잔(C.cajan)의 에스트로겐 활성과 관련된 약리활성은 아직 보고된 바 없다.

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본 발명은 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료를 위한 새로운 천연물의약품 및 건강기능성 식품을 제공하고자 하는 것이다. 특히 본 발명은 에스트로겐(estrogen) 활성을 나타내는 카자누스 카잔(Cajanus cajan (L.) Huth) 추출물, 활성분획 및 이로부터 분리된 단일 성분들을 분리 동정하여, 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료를 위한 새로운 천연물의약품 및 건강기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

유방암 또는 자궁내막암 등 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor, ER)가 발암기작에 관여하는 암의 치료제 또는 폐경후증상 치료제의 개발은, ER에 대하여 조직 특이적인 차별효과를 가질 수 있는 물질, 즉 선택적 여성호르몬 수용체 조절물질(SERMs)을 개발하는 것이 궁극적인 목표이다. 본 발명의 중요한 목적의 하나는 종래 자궁내막암 치료제의 부작용을 개선할 수 있으면서 체내 에스트로겐(estrogen) 효능 간에 균형을 맞출 수 있는 식물 유래 물질을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에서는,

카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물, 이의 활성분획, 이로부터 분리된 유효성분의 효능, 약리대사 및 안전성을 규명함으로써, 자궁내막암, 유방암 등의 여성암 그리고 갱년기 증상의 예방 및 치료에 유효한 새로운 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서는,

카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물, 이의 활성분획, 아래 화학식 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)으로 표시되는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명에서는,

카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물, 이의 활성분획, 아래 화학식 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)으로 표시되는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 개선을 위한 식품 조성물이 제공된다.

(Ⅰ)

(Ⅱ)

(Ⅲ)

(Ⅳ)

(Ⅴ)

(Ⅵ)

본 발명은 카자누스 카잔 식물 추출물과 이의 활성분획이 여성호르몬성을 나타낸다는 것을 처음으로 확인한 것이고, 또한 그 유효성분을 처음으로 분리 동정한 것이다.

상기 여성암은, 바람직하게는 자궁내막암, 유방암, 난소암 중 어느 하나이다.

상기 갱년기 증상은, 바람직하게는 안면홍조, 고지혈증, 뇌정신기능 저하, 골다공증, 정맥혈전증 및 위축성 질염 중 어느 하나의 증상을 포함한다.

상기 식품은, 바람직하게는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 갖는 건강기능식품이다.

본 발명은, 카자누스 카잔 (Cajanus cajan) 식물 추출물과 이의 활성분획을 얻고 여성호르몬성을 나타내는 효능을 확인하고, 유효성분을 분리 동정함으로써 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료에 유용한, 새로운 천연물 의약품 및 건강기능식품을 제공한다. 특히, 본 발명은 카자누스 카잔 식물 추출물과 이의 활성분획이 여성호르몬성을 나타낸다는 것을 처음으로 확인한 것으로, 이를 함유하는 본 발명의 약학적 조성물은 여성암 중에서 가장 높은 빈도로 발생하며 그 발병률이 증가하고 있는 유방암과 이와 유사한 발병 기작을 갖고 있는 자궁내막암 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 중수소로 표지된 에스트로겐([³H]estrogen)의 순수한 재조합 휴먼 에스트로겐 수용체 알파(recombinant human estrogen receptor alpha, hERα) 결합에 대한 에스트로겐(estrogen)(●) 및 카자누스 카잔(◆) 추출물의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 카자누스 카잔 세 분획물과 3중수소로 표지된 에스트로겐([³H]estrogen)의 순수한 재조합 휴먼 에스트로겐 수용체 알파(recombinant human estrogen receptor alpha, hERα)에 대한 경쟁적 결합력을 측정한 결과이다.
도 3은 Cajanus cajan의 추출물(CCT)과 분획물 23종(CC1 - 23)에 대하여 ER subtype 선택적인 유전자 전사활성을 측정한 것이다. Cajanus cajan의 추출물(CCT)과 분획물 23종(CC1 - 23) 중에서 분획물 9종(CC 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22)이 ERβ/ERα ratio가 2 이상으로 나타났다.
도 4는 에스트로겐 수용체 반응성인 MCF-7 cell 세포증식 작용을 평가하기 위하여 비히클, 에스트로겐(estrogen), 카자누스 카잔 추출물을 5x10^-6 g/ml ~ 10^-6 g/ml 농도로 처리해준 후 MCF7 cell proliferation을 확인한 것이다. Cajanus cajan 추출물의 경우 5x10^-6 g/ml, 10^-5 g/ml 농도에서 세포 증식을 유도하는 것으로 나타났다.
도 5는 에스트로겐 반응 유전자 서열(Estrogen responsive element, ERE)을 transfection 시킨 MCF-7 세포에서 카자누스 카잔 추출물이 ERE-유전자의 활성을 변화시키는지 실험한 결과이다.
도 6은 에스트로겐 반응 유전자 서열(Estrogen responsive element, ERE)을 transfection 시킨 MCF-7 세포에서 카자누스 카잔 세분획물이 ERE-유전자의 활성을 변화시키는지 실험한 결과이다.
도 7은 에스트로겐 반응 유전자 서열(Estrogen responsive element, ERE)을 transfection 시킨 MCF-7 세포에서 카자누스 카잔 추출물의 ERE유전자 유도성 pS2 gene 발현 증가를 실험한 결과이다.
도 8은 랫트에 카자누스 카잔 투여 시, 랫트의 자궁 조직에서의 pS2 유전자 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 랫트에 카자누스 카잔 추출물 투여 시, 랫트의 자궁 조직에서의 에스트로겐 수용체 알파(ERα), 프로게스테론 수용체 A(PRA), 프로게스테론 수용체 B(PRB)의 단백질 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 사람 신경세포 SKNSH의 Ngb promoter 활성에 카자누스 카잔 추출물이 미치는 효과를 평가한 것이다. 비히클, 양성대조군으로 에스트로겐(estrogen), 제니스타인 (genistein), 카자누스 카잔 추출물을 처리해준 경우 Ngb의 유전자 발현이 양성대조군과 카자누스 카잔 추출물에 의하여 증가되는 것으로 나타났다.
도 11은 생쥐신경세포 N2a 의 Ngb promoter 활성에 카자누스 카잔 추출물 미치는 효과를 평가한 것이다. 비히클, 양성대조군으로 에스트로겐(estrogen), 제니스타인 (genistein), 카자누스 카잔 추출물을 처리해준 경우 Ngb promoter의 activity가 양성대조군과 카자누스 카잔 추출물에 의하여 증가되는 것으로 나타났다.

본 발명에서는, 카자누스 카잔 추출물의 여성호르몬성과 여성암에 대한 치료효능, 약리대사 및 안전성을 규명함으로써, 자궁내막암, 유방암 등의 여성암 그리고 갱년기 증상의 예방 및 치료에 유효한 새로운 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “여성암”은 에스트로겐(estrogen), 프로게스테론 등의 여성호르몬이 직간접적으로 발암기작에 관여하는 자궁내막암, 유방암, 난소암, 기타 여성생식기 암을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 “갱년기 증상”은 갱년기 여성에서 나타나는 안면홍조, 고지혈증, 뇌정신기능 저하, 골다공증, 정맥혈전증 및 위축성 질염 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 “뇌정신기능 저하”는 갱년기 여성에서 나타나는 우울감, 기억력저하 및 인지능력 저하 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 카자누스 카잔(Cajanus cajan)의 활성분획으로부터 분리한, 여성호르몬성을 나타내는 단일 성분은 아래 화학식 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)으로 표시된다.

(Ⅰ)

longistylin A

화학명: (E)-3-methoxy-2-(3-methylbut-2-en-1-yl)-5-styrylphenol

Chemical Formula: C₂₀H₂₂O₂

MW: 294.39

(Ⅱ)

longistylin C

화학명: (E)-3-methoxy-4-(3-methylbut-2-en-1-yl)-5-styrylphenol

Chemical Formula: C₂₀H₂₂O₂

MW: 294.39

(Ⅲ)

genistein

화학명: 5,7-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one

Chemical Formula: C₁₅H₁₀O₅

MW: 270.24

(Ⅳ)

cajanin

화학명: 5,2',4'-Trihydroxy-7-methoxyisoflavone

Chemical Formula: C₁₆H₁₂O₆

MW: 300.26

(Ⅴ)

pinosylvin monomethyl ether

화학명: (E)-3-methoxy-5-styrylphenol

Chemical Formula: C₁₅H₁₄O₂

MW: 226.27

(Ⅵ)

cajanol

화학명: 4',5-dihydroxy-2',7-dimethoxyisoflavanone

Chemical Formula: C₁₇H₁₆O₆

MW: 316.31

카자누스 카잔(Cajanus cajan (L.) Huth)은 콩과(Fabaceae) 카자누스속(Cajanus)의 다년생 식물이다. 본 발명에서 실험에 사용한 카자누스 카잔은 해외생물소재허브센터로부터 분양받은 것이다.

본 발명에서는 카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물 및 세분획의 유효성을 확인하고, 여성암 및 갱년기 증상의 예방, 치료에 유효한 상기 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)의 성분을 카자누스 카잔(Cajanus cajan)로부터 분리 동정하는 과정은 다음과 같다.

1. 카자누스 카잔 추출물 및 세분획의 여성호르몬성 약리 유효성 실험

카자누스 카잔 추출물 및 세분획에 대해 휴먼 에스트로겐 수용체 알파(hERα) 결합의 경쟁적 저해, ER subtype 선택적인 유전자 전사활성 분석, MCF-7 cell 세포증식 작용, 에스트로겐 반응 유전자 서열(Estrogen responsive element, ERE) 활성, MCF-7 세포에서 ERE유전자 유도성 pS2 gene 발현 유도, 래트의 자궁증식 효과 및 자궁 조직에서의 pS2 유전자 발현 및 에스트로겐 수용체 알파(ERα), 프로게스테론 수용체 A와 B(PRA, PRB)의 단백질 발현 확인 실험을 실시하였다.

2. 카자누스 카잔 추출물 및 세분획의 뇌세포 보호 약리 유효성 실험

카자누스 카잔 추출물이 사람 신경세포 SKNSH의 뉴로글로빈(Neuroglobin, Ngb) promoter 활성에 미치는 효과, 생쥐신경세포 N2a 의 Ngb promoter 활성에 미치는 효과를 확인하였다. 또한 카자누스 카잔의 추출물에 대한 항염 활성 효과를 human hematopoietic prostaglandin D synthase(HPDGs)의 저해효과를 통해서 평가하였고 카자누스 카잔 추출물의 in vivo 독성을 평가하기 위하여 단회 투여 급성 독성 실험을 수행하였다.

3. 카자누스 카잔의 유효성분의 분리 및 약리활성 확인

카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물의 분리 분획, 유효성분의 약리활성을 실험하여 23종의 세분획물을 분리·확인하였고 6종의 화합물 분리·동정하였다. 위의 화학식 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)으로 표시된 화합물은 본 발명에서 처음으로 카자누스 카잔(Cajanus cajan)으로부너 분리 동정한 것이다.

본 발명의 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 상기 화학식 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)으로 표시되는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 카자누스 카잔 추출물과 세분획물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이밖에 다른 약학적 활성 성분이나 활성 혼합물을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물 또는 활성분획을 기준으로 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg 으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.

본 발명의 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 개선용 식품 조성물은 카자누스 카잔 추출물과 세분획물 및 이의 식품으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함한다.

상기 식품 조성물은 총 중량 중에 추출물 또는 활성분획을 0.0001 내지 20 중량%로 포함한다. 상기 식품은 특히 건강기능식품을 포함한다. 본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 다양한 식품 또는 음료 등에 기능성 성분을 첨가한 형태의 식품 조성물이 될 수 있다. 상기 식품은, 예를 들어, 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 필수 성분으로 추출물 또는 활성분획을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품이나 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 다양한 성분을 추가로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 그리고 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 그리고 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 전체 중량 중 0 내지 약 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 좋다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실험예]

실험방법

1. 여성 호르몬수용체 결합 실험: 휴먼 에스트로겐 수용체 알파(hERα)

재조합 휴먼 에스트로겐 수용체 알파(Recombinant human estrogen receptor alpha, hERα)는 인비트로겐(Invitrogen)사의 제품을 구매하여 사용했다. 각 수용체 단백질 750 mol을 binding buffer를 이용하여 희석하여 3 nM로 하여 사용했다. Binding buffer의 조성은 10 mM Tris/pH 7.5, 10% glycerol, 1 mM DTT 그리고 1 mg/ml BSA이다. ERα 750 mol, 3 nM 농도의 삼중수소 에스트로겐([³H]estrogen, [³H]E2), 일정 농도의 시험물질(DMSO에 용해)을 microcentrifuge tube에 넣고 최종 반응용량이 100 μl가 되도록 하였다. 28°C에서 3시간 동안 배양 후 Harvester를 이용하여 글래스 필터에 ER-시험물질 복합체(complex)를 여과하여 얻었고 반응하지 않은 프리 삼중수소 에스트로겐([³H]E2)은 세척하여 제거했다. 글래스 필터에 울티마 골드 신틸레이션 용매(Ultima Gold scintillation cocktail) 3ml을 가하고 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 이용하여 글래스 필터에 잔존하는 방사능을 측정하였다. 비 특이적 결합을 측정하기 위해서는 5 nM 에스트로겐(estrogen, E2)을 사용하였다. 비교 대조약물로는 10 nM 에스트로겐(estrogen, E2)을 사용했다. 매 실험에 동일 시험물질에 대하여 여러 농도 값을 함께 시험하여 방사성(radioactive) 에스트로겐(estrogen, E2)의 수용체 결합력을 방해하는 정도를 통해 농도-방사능 카운트에 대한 곡선을 얻을 수 있으며 또한 IC₅₀값을 산출했다. IC₅₀값은 프리즘 3.0 소프트웨어를 이용하여 산출했다.

2. 유전자 리포터 평가시험: 에스트로겐(ERE) 반응성 유전자 전사실험

ERE-루시페라제 분석(luciferase assay)을 위해서 ER의 함량이 높다고 알려진 유방암 세포주 MCF-7을 이용했다. MCF-7 유방암 세포주는 American Tissue Culture Collection(USA)으로부터 구입했다. Seeding하기 24시간 전에 세포를 차콜 덱스트란 처리한 배지(CD-DMEM)에서 배양하며, 약 90% confluency에 도달한 세포를 약 5 × 10⁵/well의 농도로 12-well plate에 seeding 했다. 이후 모든 시험은 CD-DMEM 배지에서 수행되었다. 24시간 배양 후 에스트로겐 반응 유전자(estrogen response element, ERE)-루시페라제, 플라스미드를 Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen, USA)를 이용하여 transfection했다. ERE-luciferase assay의 경우 양성 대조군으로서 에스트로겐(estrogen, E2, 1 nM), 길항제 대조군으로서 ICI-182,780 (1mM)을 처리하였다. 그 외 다양한 농도의 DMSO에 녹인 시험물질을 배지에 희석시킨 후 배양세포에 처리했다. 24시간 배양 후 세포 배양을 종료하고 Passive Lysis Buffer(Promega, USA)를 이용하여 수용성 세포추출물을 얻었다. 여기에 존재하는 루시페라제(luciferase)의 활성도는 루시페라제의 기질 및 반응 완충액 포함하는 루시페라제 분석시스템(Luciferase Assay System, Promega)과 루미노미터(Luminometer)를 이용하여 정량적으로 측정했다. 시험물질이 나타내는 유전자 활성도는 양성 대조군(positive control)이 나타내는 활성도를 100%로 정하여 그 상대적인 활성정도를 나타내어 최종 비교 평가했다.

3. 카자누스 카잔 추출물과 분획물에 대한 ER subtype 선택성 평가

ER을 발현하지 않는 HeLa 세포주를 5x10⁵ cells/well, 24-well plate에 seeding 하고 charcoal 처리한 fetal bovine serum (FBS)을 포함하며 phenol-red 미첨가 DMEM 배지 (이하, estrogen-free media)를 사용하여 배양하였다. ERa 및 ERb를 발현하는 플라스미드(0.25 mg/well)와 ERE3-luciferase 플라스미드 (0.25 mg/well)를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 co-transfection하였다. 1일 배양 후 적절한 시험물질을 세포에 처리한 후 24시간 후 Passive lysis buffer (Promega)를 이용하여 수용성세포추출물을 추출하였다. 이 추출물에 존재하는 luciferase 활성은 luciferase assay system (Promega) 시약을 이용하여 VICTOR3 luminometer (Perkin Elmer) 기기를 이용하여 그 값을 읽어 평가하였다.

4. 카자누스 카잔 추출물의 MCF-7 세포 증식 효과 평가

MCF-7 cell line을 이용하여 카자누스 카잔 추출물의 cell proliferation 작용을 확인하였다. MCF7 cell line 은 human breast cancner에서 유래되어 구축된 cell line으로 estrogen receptor를 풍부하게 발현하기 때문에 카자누스 카잔 추출물의 estrogenicity 를 평가하기에 유용하다. 실험에 사용되는 세포배양 및 시험 물질 처리 시 외재적인 에스트로겐성 효과를 철저히 배제하기 위하여 charcoal dextran treated serum을 포함하는 phenol-red free media (CDFBS-DMEM)를 사용하였다. MCF-7 세포를 96-well plate에 10⁴cells/well이 되도록 seeding 한 후 24시간 후 배지를 제거하고 일정농도의 시험물질을 포함한 배지로 교환하였다. 시험물질을 포함한 CD-DMEM 배지는 DMSO에 용해된 일정농도의 시험물질 stock solution을 실험 직전에 배지에 500~1000배 희석하여 제조하였다. Vehicle 대조군은 DMSO (0.5~0.1%)을 CDFBS-DMEM에 가하였고 양성대조군은 1 nM 17β-ES, 1μM genistein을 처리하였음. 모든 실험계에서의 용매의 최종 농도는 0.1% (v/v)이하로 하였다. 37 °C, 5% CO₂incubator에서 48시간 배양한 후에 살아있는 세포 수의 측정을 위해 MTT assay를 수행하였다. 배양액을 완전히 제거한 후에 DPBS에 녹인 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-) 2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma] 용액을 1mg/ml 농도로 100μl 용량으로 처리한 후 37 °C, 5% CO₂incubator에서 1시간 배양하였다. 배양 후 용액을 완전히 제거하고 isopropanol을 넣어 세포를 lysis함과 동시에 살아있는 세포에 의해 생성된 자주색의 MTT metabolite (결정성)을 용해하였다. Isopropanol 에 용해된 MTT metabolite의 양을 ELISA Plate Reader (UVmax, U.S.A.)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 살아있는 세포의 수와 비례하는 것으로 알려져 있으므로 시험물질에 의한 세포증식정도를 정량적으로 평가 가능하다.

5. 카자누스 카잔 추출물에 의한 MCF-7 세포의 표적 유전자의 전사활성에 대한 효과 평가

카자누스 카잔 추출물의 estrogenicity를 mRNA level에서 확인하기 위하여 잘 알려진 에스트로겐 반응성 유전자인 pS2 (TFF1) gene에 대해서 실험을 수행하였다. 시험물질에 의한 pS2 gene 발현 변화를 측정하기 위해서 60mm² petri dish에 MCF7 세포의 수가 5x10⁵ 로 seeding 한 후 90%가 점유되었을 때 charcoal dextran treated serum을 포함하는 phenol-red free media (CDFBS-DMEM)에 vehicle 대조군인 DMSO (0.1%), 양성 대조군인 17β-ES (1 nM), genistein (1μM), 일정 농도의 시험물질을 처리하였다. 통상적으로 약물 처리 24시간 후 배지를 제거하고 DPBS로 wash하여 세포 배양액을 완전히 제거한 후 trizol을 처리하여 배양용기 표면으로부터 분리하고 세포를 파괴하였다. 세포 내의 mRNA를 Qiagen RNeasy mini kit를 이용하여 isolation 하였다. iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad)를 이용하여 일정량의 mRNA (1μg)를 역전사반응하여 cDNA를 얻었다. cDNA, 표적 유전자의 cDNA를 인식할 수 있는 한 쌍의 primer와 PCR SYBR green kit (Qiagen) 시약을 이용하여 quantitative PCR을 수행하여 해당 유전자의 발현량을 정량적으로 측정하였다. 여러 단계의 반응에 대한 기술적인 실수를 보완하기 위하여 housekeeping 유전자인 GAPDH에 대한 발현량을 동시에 측정하며, 이 유전자의 발현량과 표적유전자의 발현량의 비를 최종적인 정량 분석에 사용하였다. GAPDH를 인식하는 primer는 forward 5‘-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC; 그리고 reverse 5’-TGAGCGATGTGGCTCGGCT. pS2를 인식하는 primer는 forward 5’-CGTGAAAGAC AGAATTGTGGTTTT; 그리고 reverse 5’-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA. Quantitative PCR은 약 40 cycle (95˚C; 30초, 60˚C; 30초, 72˚C; 30초)로 수행하였다. 각각의 유전자 발현 곡선을 logarithm으로 표현한 후 threshold cycle(C_T)값을 수학적으로 얻었다. 이 값을 2^- ^ΔΔCT 식에 대입하여 얻어진 값이 특정 유전자의 상대적인 발현량을 나타내었다. 특정유전자의 발현량을 house keeping 유전자의 발현량으로 나눈 값을 해당 유전자 발현량에 대한 최종값으로서 선택하여 vehicle 군과 17β-ES 처리군, 시험물질 처리군의 그것을 상대적으로 비교 하였다.

6. 생체내 ( in vivo ) 여성호르몬성 평가: uterotrophic assay (자궁증식실험)

자궁증식실험은 에스트로겐(estrogen)에 의해 유발된 자궁 조직량(uterine tissue mass) 증가를 측정함으로써 여성호르몬성(estrogenicity)을 간접적으로 평가하는 방법이다. 시험물질을 생후 21일째인 암컷 랫트에 3일간 피하주사로 투여 시 미성숙 자궁에 미치는 영향을 대조군과 비교 조사함으로써 자궁증식 효과를 측정하였다. 실험에는 미성숙한 암컷 랫트를 사용하였다. 순화기간 중 평균체중에 가까운 개체로 선택하여 무작위법을 이용하여 군 분리를 실시하여 한 군당 5 마리로 하였다. 동물의 개체식별은 tail marking과 사육 상자별 tag 표시법을 사용하였다. 양성 대조군은 에스트로겐(estrogen, E2)을 0.003 mg/ kg 이 되도록 corn oil에 균질하게 현탁 시킨 후 corn oil로 이를 단계적으로 희석하였으며, 시험물질도 옥수수 오일에 현탁하여 사용하였다. 실험군은 세군으로 나누고 각군은 비히클(corn oil 5ml/kg), 에스트로겐(estrogen, E2, 0.003 mg/kg), 카자누스 카잔 추출물(300 mg/kg)을 피하 주사로 3일 간 24시간 간격으로 투여하였다. 투여용량은 미성숙 랫트 체중 10 g 당 0.05ml로 하였으며 물질의 용액제조는 투여 당일 실시하였다. 이 시험에서 검사하고자 하는 검사항목은 체중과 자궁무게이다. 체중 측정은 모든 동물에 대해 투여 직전과 부검 직전에 체중을 측정하며, 자궁무게는 마지막 투여 후 약 24시간이 지난 생후 25일째 경추 탈구하여 희생 시킨 후 자궁을 조심스럽게 적출하여 지방 및 섬유조직을 제거하고 여지 위에서 물기를 완전히 건조시킨 후 미량저울(Mettler microbalance)을 사용하여 각 랫트에서 얻어진 자궁무게를 정확히 측정하였다.

7. 세포내 내재 호르몬 반응성 표적 유전자의 전사활성에 대한 효과 평가 법 21일 령 미성숙 암컷 쥐를 비히클, 에스트로겐(estrogen, E2, 0.003 mg/kg), 카자누스 카잔 (300 mg/kg) 추출물을 피하 주사로 3일 간 24시간 간격으로 투여 후 얻은 쥐의 자궁조직에서 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출했다. iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad)를 이용하여 일정량의 mRNA (1 μg)를 역전사 반응하여 cDNA를 얻었다. cDNA, 표적 유전자의 cDNA를 인식할 수 있는 한 쌍의 프라이머와 PCR SYBR green kit(Qiagen) 시약을 이용하여 실시간(real-time) PCR을 수행하여 해당 유전자의 발현 량을 정량적으로 측정했다. 여러 단계의 반응에 대한 기술적인 실수를 보완하기 위하여 housekeeping 유전자인 GAPDH에 대한 발현 량을 동시에 측정하며, 이 유전자의 발현 량과 표적유전자의 발현 량의 비를 최종적인 정량 분석에 사용했다. GAPDH를 인식하는 프라이머는 forward 5‘-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC; 그리고 reverse 5’-TGAGCGATGTGGCTCGGCT이다. 에스트로겐의 표적유전자로서 Trefoil factor 2(pS2)의 발현도를 측정하였다. Real-time RT PCR 반응을 위해서 pS2를 인식하는 primer는 forward 5‘-CGTGAAAGAC AGAATTGTGGTTTT; 그리고 reverse 5’-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA이다. Real-time PCR은 약 40 cycle (95°C; 30초, 60°C; 30초, 72°C; 30초)로 수행하였다. 각각의 유전자 발현 곡선을 logarithm으로 표현한 후 threshold cycle(C_T) 값을 수학적으로 얻는다. 이 값을 2-DDC_T 대입하여 얻어진 값이 특정 유전자의 상대적인 발현 량을 나타낸다. 특정유전자의 발현 량을 house keeping 유전자의 발현 량으로 나눈 값을 해당 유전자 발현 량에 대한 최종 값으로서 선택하여 ER 길항제 또는 작용제 처리값과 시험물질의 그것을 상대적으로 비교하였다.

8. 세포내 내재 호르몬 반응성 단백질 발현 변화에 대한 효과 평가

21일 령 미성숙 암컷 쥐를 비히클, 에스트로겐(estrogen), 카자누스 카잔 군으로 나누고 각 군에 비히클 (corn oil 5ml/kg), 에스트로겐(estrogen, E2, 0.003 mg/kg), 카자누스 카잔 (300 mg/kg) 추출물을 피하 주사로 3일 간 24시간 간격으로 투여 후 얻은 쥐의 자궁조직에서 에스트로겐 수용체 알파(ERα), 프로게스테론 수용체 A(PRA), 프로게스테론 수용체B(PRB)의 단백질 발현 변화를 확인하였다. 쥐의 자궁 조직에 프로테아제 저해제(protease inhibitor) 및 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitor)를 넣은 lysis buffer를 가해 단백질을 분리하고 추출한 단백질을 BCA 법으로 정량하여 20μg 씩 7.5% SDS-PAGE gel 에 80V에서 2시간 전기 영동하였다. 전기 영동 후 25V에서 3시간 PVDF membrane에 transfer한 다음 BSA로 RT에서 1시간 blocking 하고 primary 및 secondary antibody와 반응시켜 ECL 용액으로 detect 하였다. 이때 primary antibody는 ERα(sc-7207, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.), PR(sc-538, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.)을 1:500 비율로 희석하여 사용하였다. 실험상의 오류에 의한 단백질 양의 차이를 보정하기 위해 β-actin을 사용하였다.

9. 신경세포 기반 Ngb promoter luciferase assay 및 세포에서 Ngb mRNA 발현 변화 평가

(1) Ngb promoter assay : Estrogen과 SERMS가 neuron 의 cell death를 억제하고 survival을 유도하는 것이 알려졌으며, 또한 SERMs는 memory 를 개선시키고 뇌졸중 후 행동 개선 효과를 나타낸다. 본 발명에서는 SERMs가 Ngb 활성화를 통하여 뇌 보호효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다. Ngb는 neuron에서 발견된 globin의 subtype으로 O₂와 결합하여 운반하는 기능을 가지고 있으며 활성산소종 (ROS)의 scavenge 에 관여한다. 또한 G-protein coupled receptor의 signal transduction에 관여하며 mitochondria에서 cytochrome C 의 전자 전달에 관여하여 apoptosis, cell survival을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 또한 stroke 동물모델에서 neuron 보호 효과를 나타낸다. 최근 estrogen이 neuron과 astrocyte에서 Ngb의 발현을 높이며 anti-inflammatory 작용과 관련되어 있다는 선행 연구결과들에 근거하여 신경보호작용을 연구하였다. 카자누스 카잔 추출물이 뇌 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 Neuro2a neuroblastoma cell line (CCL-131 ; ATCC, Manassas, VA, USA) 및 SKNSH (human neuroblastoma cell line) 을 이용하여 luciferase 실험을 수행하였다. 세포 유전자 내에 neuroglobin (Ngb)-luciferase sequence를 삽입하여 정량적으로 카자누스 카잔 추출물의 Ngb promoter 전사 활성을 평가할 수 있다. 세포를 10%FBS DMEM에 culture하였고 96well plate에 3x10⁴cell 수로 seeding한 후 약 24시간 후에 40~50% confluency가 되었을 때 2%FBS DMEM으로 media를 교체해 주었다. 세포를 계속 culture하다가 70~80% confluency가 되었을 때 serum free phenol red free DMEM 에 시험 물질을 녹여 media 를 교체해 주었다. Vehicle (DMSO, 0.1%), 17β-ES (1nM),genistein(1μM)를 대조군으로 하여 추출물 (10^-4~10^-7g/ml)을 세포에 처리해 주고 6시간(SKNSH) 또는 24시간(N2a) 후에 lysis buffer 40μl 를 가하여 RT에서 15분 동안 incubation한 후에 세포를 모아 lysate를 얻고 substrate 를 30μl 가하여 luminescence를 측정하였다.

(2) Ngb mRNA level (quantitative PCR ) : N2a cell과 SKNSH cell을 10%FBS DMEM에 배양하다가 phenol red free DMEM 에 시험물질을 녹여 media 를 교체해 주었디. Vehicle (DMSO, 0.1%), 17β-ES (1nM),genistein(1μM)을 대조군으로 하여 추출물 (10^-4~10^-7g/ml)을 세포에 처리해 주고 24시간 후 세포를 trizol 처리하여 배양용기 표면으로부터 분리하고 세포를 파괴하였다. 세포 내의 mRNA를 Qiagen RNeasy mini kit를 이용하여 isolation 하였다. iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad)를 이용하여 일정량의 mRNA (1μg)를 역전사반응하여 cDNA를 얻었다. cDNA, 표적 유전자의 cDNA를 인식할 수 있는 한 쌍의 primer와 PCR SYBR green kit (Qiagen) 시약을 이용하여 quantitative PCR을 수행하여 해당 유전자의 발현량을 정량적으로 측정하였다. 여러 단계의 반응에 대한 기술적인 실수를 보완하기 위하여 housekeeping 유전자인 GAPDH에 대한 발현량을 동시에 측정하며, 이 유전자의 발현량과 표적유전자의 발현량의 비를 최종적인 정량 분석에 사용하였다. Human GAPDH를 인식하는 primer는 forward 5‘-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT; 그리고 reverse 5’-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA. Mouse GAPDH를 인식하는 primer는 forward 5‘-TGCCAAGTATGATGACATCAAGAA; 그리고 reverse 5’-GCCCAAGATGCCCTTCAGT. Human Ngb를 인식하는 primer는 forward 5’-TGGAAGACCTGTCCTTCACTG; 그리고 reverse 5’-GAGCAGAGACTCACCCACTG. Mouse Ngb 를 인식하는 primer는 forward 5’-TACAATGGCCGCCAGTTCT; 그리고 reverse 5’-TGGTCACTGCAGCATCA. Quantitative PCR은 약 40 cycle (95˚C; 15초, 60˚C; 60초)로 수행하였다. 각각의 유전자 발현 곡선을 logarithm으로 표현한 후 threshold cycle(C_T)값을 수학적으로 얻었다. 이 값을 2^- ^ΔΔCT 식에 대입하여 얻어진 값이 특정 유전자의 상대적인 발현량을 나타낸다. 특정유전자의 발현량을 house keeping 유전자의 발현량으로 나눈 값을 해당 유전자 발현량에 대한 최종값으로서 선택하여 vehicel 군과 시험물질 투여군의 그것을 상대적으로 비교하였다.

10. 항염 활성 효과 평가를 위한 human hematopoietic prostaglandin D synthase ( HPDGs ) 억제력 평가

카자누스 카잔 추출물의 항염 활성 효과를 human hematopoietic prostaglandin D synthase(HPDGs)의 저해효과를 통해서 평가하였다. 효소반응에는 assay buffer (1mM EDTA가 포함된 0.1M potassium phosphate, pH 6.5), GSH 2.5mM, CDNB 1mM, human hematopoietic prostaglandin D synthase (10mg/ml)가 포함되어 있으며. 96-well plate에 assay buffer, CDNB, HPDGs 먼저 넣어서 섞은 후, GSH와 카자누스 카잔 추출물(250mg/ml)을 넣었다. Vehicle control로는 DMSO를 사용하였다. 2분간 반응시킨 후, VICTOR3 luminometer (Perkin Elmer) 기기를 이용하여 CDNB와 글루타티온이 결합된 물질의 양을 340nm에서 측정하고 Control (DMSO)값과 비교하여 HPDGs의 활성을 상대 비교하였다.

11. 급성독성 실험

카자누스 카잔 추출물의 임상 적용 가능성을 높이기 위해 단회 투여 급성 독성 실험을 수행하였다. 실험동물은 female mice를 이용하였고 투여 24h 전부터 절식시켰다. vehicle (1% CMC in saline), 추출물 500mg/ kg, 1000mg/ kg, 1500mg/ kg, 2000mg/ kg 용량을 단회경구투여 하여 체중 변화, 행동 관찰 및 사망률을 측정하였으며. 총 2주간 실험하였으며 투여 volume은 5μl/g 이내로 하였다.

12. 식물추출물 분획에 대한 유효성분 분석

조 추출물(crude extracts)로부터 활성을 갖는 세분획을 분리함으로써 약리효과를 나타내는 주요 세분획을 발견하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

(1) 추출 및 분리: 카자누스 카잔 추출물을 MeOH에 용해 시켜 원심분리한 후 상징액을 high performance liquid chromatography를 수행하여 23개의 분획을 얻었다. 분석에 사용된 기기는 UV detector at 254 nm and 280 nm, equipped with a Waters Fraction Collector II, Agilent Eclipse XDB-C18 column (250 mm×21.2 mm, 7 μm particle size) 등이 있다.

(2) Bioassay-guided fractionation: 각 분획에 대하여 배양 세포에서의 호르몬수용체 효능 및 길항 작용을 표준시험으로서 수행하여 활성을 나타내는 세분획을 선택하였다.

(3) 활성분획에 대한 단일 성분 분리정제: UPLC/TOF-ESIMS, TLC, HPLC 분석에 의해 선택된 활성분획 CC14, CC23 에 대하여 HPLC 분석을 통해 단일 성분을 purify 하였다.

(4) 단일 성분의 화학구조 분석 및 규명: HPLC, ESIMS, NMR 등의 분석법으로 단일성분을 chromatogram상에서 분리하고 단일성분을 확보한 후 NMR 분석(¹H, ¹³C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY)등의 다양한 구조 결정분석법을 이용하였다. 기존 약용식물 DB 등을 활용하여 최종적으로 얻어진 물질이 신물질인지 기지물질인지를 확인하였다.

결과

1. 카자누스 카잔 추출물 및 세분획물의 여성호르몬성 약리유효성

가. ER 결합에 대한 카자누스 카잔 추출물, 세분획물의 경쟁적 저해와 ERβ선택성

In vitro system에서 카자누스 카잔 추출물 (Cajanus cajan extract: CCE) 과 삼중수소 에스트로겐([³H]E2)의 순수한 재조합 휴먼 에스트로겐 수용체(recombinant human estrogen receptor alpha, hERα)에 대한 경쟁적 결합력을 측정하였다. 결과는 도 1 및 표 1에 나타나 있다. 경쟁적 결합 분석에서 에스트로겐(estrogen, E2)(●)의 IC₅₀은 1.81×10^-10g/㎖ (hERα)로 나타났다. 일종의 피토에스트로겐(phytoestrogen) 인 카자누스 카잔(◆)의 IC₅₀는 8.18×10^-6g/㎖ (hERα)이었다. 이러한 결과를 통해서 카자누스 카잔 추출물이 삼중수소 에스트로겐([³H]E2) 분리 결합에 대하여 농도 의존적으로 작용하는 것을 확인하였으며 내인성 에스트로겐(estrogen)에 비교한 RBA는 약 45,000배 가량 낮은 효력(0.0022 % for hERα)을 나타냄을 알 수 있었다 (도1, 표1).

세분획물의 ER 결합력 분석결과 CC, CC20, CC21, CC22, CC23 분획물의 hERα결합력이 우수한 것으로 나타났다 (도2, 표2).

카자누스 카잔 추출물(CCT)과 분획물 23종(CC1 - 23)에 대하여 DMSO 또는 물에 적절한 농도로 용해시킨 후 10 mg/ml 농도의 샘플에 대해서 ER subtype 선택적인 유전자 전사활성을 측정하였다. DMSO대비 luciferase 활성을 상대값으로 추출하여 상대 비교했을 때, 각 샘플의 luciferase 활성의 상대 비교 결과는 도 3와 같다. 카자누스 카잔의 추출물(CCT)과 분획물 23종(CC1 - 23) 중에서 분획물 9종(CC 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22)이 ERβ/ERα ratio가 2 이상으로 나타났다 (도 3).

[표 1] 카자누스 카잔 추출물의 hERα에 대한 IC ₅₀ 및 RBA 값

[표 2] 카자누스 카잔추출물 및 추출물로부터 세분획된 23종류 extract의 ERα 결합력 비교

RBA = [ Ki _(E2 / Ki ₍ _Cajanus _cajan ]×100.

나. 카자누스 카잔 추출물 및 세분획물의 MCF -7 에스트로겐 반응 유전자를 통한 MCF -7 세포증식 및 세포내 전사 분석

MCF-7 cell 세포증식 작용을 평가하기 위하여 카자누스 카잔 추출물을 10^-6 g/ml ~ 10^-5 g/ml 농도로 처리해준 후 MCF7 cell proliferation을 확인하였다. 양성 대조군으로 사용된 17β-ES의 경우 vehicle 군과 비교하여 약 2.3배 MCF7 세포의 증식을 유도하였고 genistein 역시 MCF7 세포의 증식을 약 1.8배 증가시켰다. 카자누스 카잔 추출물의 경우 5x10^-6g/ml, 10^-5g/ml 농도에서 약 1.5배 세포 증식을 유도하는 것으로 확인하였다 (도 4).

에스트로겐 반응 유전자(Estrogen responsive element, ERE)를 transfection 시킨 MCF-7 세포에서 카자누스 카잔이 ERE-유전자의 활성을 변화시키는지 실험하였고 결과는 도 5와 같다. 카자누스 카잔을 단독 처리했을 때 1~20μg/㎖의 농도에서 비히클에 비해 ERE 유전자 활성이 약 10배~40배 증가되었으며 농도 의존적으로 ERE 활성을 유도시키는 것으로 나타났다. 에스트로겐(estrogen, E2)에 의한 ERE 활성을 100% 라 했을 때에 카자누스 카잔 추출물에 의한 ERE 활성이 33%~118%로 나타났다. 특히 15μg/㎖, 20μg/㎖ 농도에서는 에스트로겐(estrogen, E2) 보다 높은 유전자 활성을 나타내었으며 이는 카자누스 카잔의 강력한 ERE 유전자 활성을 시사한다. 본 실험결과를 통하여 유전자 전사 작용 시 카자누스 카잔 추출물이 1μg/㎖의 농도 이상에서 농도 의존적으로 ERE 유전자 활성을 유도하며 15μg/㎖의 농도 이상에서는 에스트로겐(estrogen)보다 높은 ERE 유전자 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 세분획물의 경우 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 번 세분획물이 에스트로겐 보다 높은 ERE 유전자 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도6).

다. 카자누스 카잔 의 에스트로겐반응성 pS2 유전자 활성 유도

카자누스 카잔 추출물을 10^-7 g/ml ~ 10^-5 g/ml 농도로 처리해준 후 MCF7 세포의 pS2 gene 발현 변화를 확인하였다. 양성 대조군으로 사용된 17β-ES의 경우 vehicle 군과 비교하여 pS2 gene의 발현을 약 2.7배 증가시켰고 genistein 역시 pS2 gene의 발현을 약 2.2배 이상 증가시켰다. 카자누스 카잔 추출물의 경우 10^-5 g/ml 농도에서 통계적으로 유의하게 pS2 gene의 발현을 약 2.7 배 증가시켰으나 저농도에서는 pS2 gene 발현이 유도되지 않았다. (* p < 0.05)(도 7).

라. 카자누스 카잔의 자궁증식 효과

내인성 에스트로겐(estrogen, E2)의 작용을 배제한 시스템에서 추출물의 여성호르몬성을 평가하기 위하여 에스트로겐(estrogen) 분비가 매우 낮은 미성숙 생후 21일의 암컷 흰쥐를 사용하여 자궁증식작용을 실험하였다. 자궁증식 실험 결과는 다음의 표 3과 같이 비교 평가하였다. 비히클군으로 corn oil을 투여하였을 때와 비교하여 체중대비(g) 자궁무게(mg) 비율이 0.67이었으며, 양성 대조군으로서 에스트로겐(estrogen, E2, 3 ㎍/㎏)을 피하주사로 투여한 결과 자궁무게 비율이 1.88으로 대조군에 비교하여 자궁비율이 약 2.82배 증가되었다. 카자누스 카잔 추출물을 미성숙 흰쥐에 300㎎/㎏ 용량으로 피하주사 하였을 때 자궁무게 비율이 0.88 이었고 비히클 그룹과 비교 시 약 1.32배 증가하였다. 본 자궁증식실험을 통하여 카자누스 카잔 추출물이 자궁조직증식을 유도함을 평가 할 수 있었다. 약물 투여기간 중에 흰쥐의 체중 증가 현상은 관찰되지 않았으며 비히클 그룹이 유의성 있게 다른 값은 *** 또는 **로 표시하였다(***P < 0.001, **P < 0.05).

[표 3] 카자누스 카잔 추출물에 의한 미성숙 쥐 자궁 증식

마. 카자누스 카잔의 자궁조직에서의 pS2 유전자 활성 유도

21일령 미성숙 암컷 쥐에 비히클 (corn oil 5ml/kg), 에스트로겐(estrogen, E2, 0.003 mg/kg), 카자누스 카잔 (300 mg/kg)추출물을 피하 주사로 3일 간 24시간 간격으로 투여 후 얻은 쥐의 자궁조직에서 pS2 유전자 발현을 확인하였다. 실험결과 비히클에 비해 에스트로겐(estrogen, E2)을 투여한 경우 pS2 유전자의 발현이 약 1.7배 증가한 것을 확인하였고 카자누스 카잔 추출물을 투여한 경우 300mg/kg에서 약 1.44배 증가한 것을 확인하였다 (도5). 이러한 실험 결과를 통해 카자누스 카잔 추출물이 300mg/kg 에서 자궁조직에서의 에스트로겐 활성(estrogenic activity)을 촉진함을 확인 할 수 있었으며, 이때 에스트로겐(estrogen)의 약 80% 수준으로 pS2 유전자의 발현을 유도하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 8).

바. 카자누스 카잔의 자궁조직에서의 ERα 단백질 발현 억제

21일 령 미성숙 암컷 쥐에 비히클 (corn oil 5ml/kg), 에스트로겐(estrogen, E2, 0.003 mg/kg), 카자누스 카잔 (300 mg/kg)추출물을 피하 주사로 3일 간 24시간 간격으로 투여 후 얻은 쥐의 자궁조직에서 에스트로겐 수용체 알파(ERα), 프로게스테론 수용체 A(PRA), 프로게스테론 수용체 B(PRB)의 단백질 발현 변화를 확인하였다. 실험 결과 비히클에 비해 에스트로겐(estrogen)을 투여한 경우 ERα의 단백질 발현이 감소하는 것으로 확인 되었고 카자누스 카잔 추출물을 투여한 경우도 역시 ERα 단백 발현이 감소하였다. 반면 PRA와 PRB의 단백질 발현은 비히클 그룹과 비교하여 카자누스 카잔 추출물을 투여한 경우 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과를 통해 카자누스 카잔 추출물의 자궁조직에서의 에스트로겐 수용체 알파(ERα) 단백질 발현을 억제시키고 프로게스테론 수용체 A와 B 단백질 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 9).

사. 사람과 생쥐 신경세포의 neuroglobin (Ngb) promoter 활성과 mRNA 유전자 발현증가

사람 신경세포 SKNSH의 Ngb promoter 활성에 미치는 효과를 위하여 카자누스 카잔 추출물을 5x10^-6 g/ml ~ 5x10^-5 g/ml 농도로 SKNSH 세포에 처리해준 후 luciferase assay를 수행하여 추출물에 의한 Ngb promoter activity를 정량적으로 평가하였다. 양성 대조군 genistein을 처리해준 경우 Ngb promoter의 activity가 vehicle 군과 비교하여 약 1.4배 증가하는 것을 확인하였고 17β-ES 또한 Ngb promoter activity를 약 1.3 배 이상 증가시켰다. 카자누스 카잔 추출물을 처리해준 경우 모든 농도에서 통계적으로 유의하게 Ngb promoter activity를 약 1.9배 ~ 2배 증가시켰다 (** p < 0.001) (도 10).

생쥐신경세포 N2a 의 Ngb promoter 활성에 카자누스 카잔 추출물 미치는 효과를 평가하였다. 카자누스 카잔 추출물을 5x10^-6 g/ml ~ 5x10^-5 g/ml 농도로 N2a 세포에 처리해준 후 luciferase assay를 수행하여 추출물에 의한 Ngb promoter activity를 정량적으로 평가하였다. 양성 대조군 genistein을 처리해준 경우 Ngb promoter의 activity가 vehicle 군과 비교하여 약 1.7배 증가하는 것을 확인하였고 17β-ES는 Ngb promoter activity를 증가시키지 않았다. 카자누스 카잔 추출물을 처리해준 경우 모든 농도에서 통계적으로 유의하게 Ngb promoter activity를 약 1.8배 ~ 2.2 배 증가시켰다 (** p < 0.01) (도 11).

아. Human hematopoietic prostaglandin D synthase(HPDGs)를 통한 항염증 활성

카자누스 카잔의 추출물(CCT)에 대한 항염 활성 효과를 human hematopoietic prostaglandin D synthase(HPDGs)의 저해효과를 통해서 평가하였을때, 카자누스 카잔 추출물(CCT)의 HPGDs 저해효과는 17.16%로 HPGDs 저해효과를 낮은 수준으로 가지고 있었다 (표4).

[표 4] 카자누스 카잔 추출물에 의한 HPDGs 저해 효과

자. 급성독성시험을 통한 안전성평가

카자누스 카잔 추출물의 생체독성을 평가하기 위하여 단회 투여 급성 독성 실험을 수행하였다. 암컷 생쥐(10주령)에 vehicle (1% CMC saline), 카자누스 카잔 추출물 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 1500 mg/kg, 2000 mg/kg 용량으로 p.o. 투여하여 2주간 사망률, 체중 변화 및 행동을 관찰하였을 때, 정상적인 행동을 보였으며 사료와 물 섭취도 정상적으로 관찰되었다. 총 2주간의 실험 기간 동안 사망률은 vehicle 군을 포함하여 모든 군에서 0% 였으며 각 군간의 체중 변화도 비슷한 수준으로 나타났다. 최대용량 2000 mg/kg 경구투여 용량에도 급성독성이 나타나지 않으므로 안전성이 높은 것으로 평가되었다 (표 5).

[표 5] 카자누스 카잔 추출물의 단회 투여 급성 독성 평가

2. 카자누스 카잔의 생리활성 지향적 화학성분(bioassay-guided analysis) 분석

가. 추출물의 분획 및 분리정제

카자누스 카잔( Cajanus cajan ) 의 메탄올 추출물 (0.9884g)을 MeOH에 용해시킨 후 원심분리하여 상징액만 얻었다. 상징액을 Waters 2545 HPLC (UV detector at 254 nm and 280 nm, equipped with a Waters Fraction Collector II) 장비를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 column은 Agilent Eclipse XDB-C18 column (250 mm×21.2 mm, 7 μm particle size) 이고 flow rate 는 8 mL/min으로 하였다. Mobile phase 는0.1% aqueous formic acid (A) 와 methanol (B)를 혼합하여 사용하였다. 분획물은 시간에 따라 나누어 collect 하였고 (4 min/fraction) 총 23개의 분획물을 얻었다. 이 분획물들의 ERα 결합력을 평가한 결과 분획물 CC14 와 CC23 에서 높은 ERα 결합력과 ERβ 선택적 ERE 활성이 나타났고, 활성 결과를 바탕으로 실험은 2 개의 분획물을 타켓으로 활성이 있는 단일 물질을 찾고자 하였다 (도 13).

나. 단일 성분의 분리 및 구조 규명

분리된 단일물질들을 화학구조 규명을 위해 HPLC, ESIMS chromatogram, NMR 등 분광학적인 방법으로 구조 분석을 진행하여 단일성분 6종(화합물 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ))을 분리 동정하였다. 6종의 단일성분은 표 6과 같다.

[표 6] 카자누스 카잔에 존재하는 단일유효성분

(Ⅰ)

longistylin A

화학명: (E)-3-methoxy-2-(3-methylbut-2-en-1-yl)-5-styrylphenol

Chemical Formula: C₂₀H₂₂O₂

MW: 294.39

¹H NMR (CD₃OD,400MHz)δ _H:7.52(2H,d,J = 7.6 Hz, H-2', 6'), 7.33 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-3', 5'), 7.22 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-4'), 7.05 (2H, br s, H-7, 8), 6.64 (1H, br s, H-2), 6.63 (1H, br s, H-6), 5.19 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-2''), 3.84 (3H, s, -OCH₃),3.33(2H,d,J = 8.0 Hz, H-1''), 1.76 (3H, s, H-4''), 1.65 (3H, s, H-5''); ESI-MS m/z: negative: 293.33 [M-H]^-;positive:318.44[M+H+Na]²⁺,274.41[M-C₃H₇+Na]⁺.

(Ⅱ)

longistylin C

화학명: (E)-3-methoxy-4-(3-methylbut-2-en-1-yl)-5-styrylphenol

Chemical Formula: C₂₀H₂₂O₂

MW: 294.39

¹H NMR (CD₃OD,400MHz)δ _H:8.53(1H,brs,-OH),7.48(2H,d,J = 7.6 Hz, H-2', 6'), 7.34 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-3', 5'), 7.33 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 7.23 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-4'), 6.93 (1H, J = 16.0 Hz, H-8), 6.66 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 6.37 (1H, J = 2.4 Hz, H-6), 5.06 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-2''), 3.78 (3H, s, -OCH₃),3.39(2H,d,J = 6.8 Hz, H-1''), 1.79 (3H, s, H-4''), 1.66 (3H, s, H-5''); ESI-MS m/z: negative: 293.22 [M-H]^-;positive:318.47[M+H+Na]²⁺,274.44[M-C₃H₇+Na]⁺.

(Ⅲ)

genistein

화학명: 5,7-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one

Chemical Formula: C₁₅H₁₀O₅

MW: 270.24

¹HNMR(CD₃OD,400MHz)δ _H:8.07

1H,s,H-2),7.37(2H,d,J=8.4Hz,H-2',6'),6.85(2H,d,J=8.4Hz,H-3',5'),6.35(1H,s,H-8),6.23(1H,s,H-6);(-)-ESI-MSm/z:269.16[M-H]^-.

(Ⅳ)

cajanin

화학명: 5,2',4'-Trihydroxy-7-methoxyisoflavone

Chemical Formula: C₁₆H₁₂O₆

MW: 300.26

¹H NMR (CD₃OD,400MHz)δ _H:8.07(1H,s,H-2),7.05(1H,d,J=8.4Hz,H-6'),6.57(1H,d,J=2.0Hz,H-3'),6.40(1H,d,J=2.0Hz,H-6),6.38(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.37(1H,dd,J=8.4,2.0Hz,H-5'),3.89(3H,s,H-OCH₃);(+)-ESI-MSm/z:301.16[M+H]⁺,(-)-ESI-MSm/z:299.14[M-H]^-.

(Ⅴ)

pinosylvin monomethyl ether

화학명: (E)-3-methoxy-5-styrylphenol

Chemical Formula: C₁₅H₁₄O₂

MW: 226.27

¹HNMR(CD₃OD,400MHz)δ _H:8.55(1H,s,-OH),7.53(2H,d,J=8.4Hz,H-2',6')),7.34(2H,dd,J=8.4,8.0Hz,H-3',5'),7.23(1H,t,J=8.0Hz,H-4'),7.08(1H,s,H-7),7.06(1H,s,H-8),6.61(1H,s,H-2),6.60(1H,s,H-6),6.29(1H,s,H-4),3.79(3H,s,H-OCH₃);¹³CNMR(CD₃OD,150MHz)δ _C:128.4,128.3,128.2,127.1,126.1,54.2.

(Ⅵ)

cajanol

화학명: 4',5-dihydroxy-2',7-dimethoxyisoflavanone

Chemical Formula: C₁₇H₁₆O₆

MW: 316.31

¹H NMR (CD₃OD,400MHz)δ _H:6.92(1H,d,J=8.4Hz,H-6')),6.47(1H,s,H-3'),6.36(1H,d,J=8.4Hz,H-3'),6.06(1H,s,H-6),6.04(1H,s,H-8),4.52(1H,t,J=6.8Hz,H-3),4.38(1H,dd,J=10.8,5.2Hz,H-2a),4.23(1H,dd,J=10.8,5.2Hz,H-2b),3.83(3H,s,2'-OCH₃),3.75(3H,s,7-OCH₃);¹³CNMR(CD₃OD,150MHz)δ _C:199.6,169.3,165.6,165.0,159.9,159.8,132.2,131.4,116.3,115.1,108.4,104.4,100.5,99.2,95.7,94.7,71.6,57.5,56.3,55.9.

[실시예]

제제예 1. 산제의 제조

화합물 (Ⅰ) 1 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

화합물 (Ⅰ) 1 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

화합물 (Ⅰ) 1 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

화합물 (Ⅰ) 1 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

화합물 (Ⅰ) 1 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖ 로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

천연물로부터 유래한 본 발명의 카자누스 카잔 추출물, 이의 활성분획 및 여성호르몬성 물질은, 여성암과 갱년기 증상의 치료 및 예방을 위한 유효물질로 의약품과 건강기능성 식품 분야에서 이용될 수 있다.

Claims

카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물, 이의 활성분획, 아래 화학식 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)으로 표시되는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
(Ⅰ)

(Ⅱ)

(Ⅲ)

(Ⅳ)

(Ⅴ)

(Ⅵ)
제1항에 있어서, 상기 여성암은 자궁내막암, 유방암, 난소암 중 어느 하나인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 갱년기 증상은 안면홍조, 고지혈증, 뇌정신기능 저하, 골다공증, 정맥혈전증 및 위축성 질염 중 어느 하나의 증상을 포함하는 약학적 조성물.
카자누스 카잔(Cajanus cajan) 추출물, 이의 활성분획, 아래 화학식 (Ⅰ) 내지 (Ⅵ)으로 표시되는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 여성암과 갱년기 증상의 예방 및 개선을 위한 식품 조성물.
(Ⅰ)

(Ⅱ)

(Ⅲ)

(Ⅳ)

(Ⅴ)

(Ⅵ)
제4항에 있어서, 상기 여성암은 자궁내막암, 유방암, 난소암 중 어느 하나인 식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 갱년기 증상은 안면홍조, 고지혈증, 뇌정신기능 저하, 골다공증, 정맥혈전증 및 위축성 질염 중 어느 하나의 증상을 포함하는 식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 갖는 건강기능식품인 식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 식품은 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 갖는 식품 조성물.