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KR20170003403A - 디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법 - Google Patents

디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법 Download PDF

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KR20170003403A
KR20170003403A KR1020160076563A KR20160076563A KR20170003403A KR 20170003403 A KR20170003403 A KR 20170003403A KR 1020160076563 A KR1020160076563 A KR 1020160076563A KR 20160076563 A KR20160076563 A KR 20160076563A KR 20170003403 A KR20170003403 A KR 20170003403A
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South Korea
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pcr
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staphylococcus aureus
food poisoning
primer
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Abstract

본 발명은 디지털 PCR을 이용한 식중독균의 검출 방법, 이에 사용되는 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 식품에 존재하는 소량의 식중독균을 검출하기 위하여 사용되는 디지털 PCR 방법으로 식품에 존재하는 게놈 DNA에서 4종의 식중독균 즉, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli)의 양질을 판단함으로써 실시간 PCR 방법보다 감수성이 좋으며, 표준 물질 없이 양적인 값을 알려주는 방법으로 정량분석에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

디지털 PCR을 이용한 식중독균의 검출 방법{Method for detecting food borne pathogens using digital PCR}
본 발명은 디지털 PCR을 이용한 식중독균의 검출 방법, 이에 사용되는 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출 키트에 관한 것이다.
식중독균은 주로 육류, 낙농제품, 식수 등 음식을 통하여 전파되므로, 음식과 같은 시료에서 식중독균의 존재 여부를 신속하고 경제적으로 확인할 수 있는 방법이 요구된다. 식중독균을 검출하기 위한 통상적 방법은 선택적 배지에서 시료를 배양하여, 식중독균으로 추측되는 균을 분리한 후, 이를 생화학적 또는 면역학적 방법으로 확인하는 것이다. 그러나, 항체를 이용한 면역학적인 방법은 높은 정확도로 세균의 검출이 가능하지만, 많은 양의 시료가 필요하고, 각 진단에 필요한 항체를 생산하기 위해서는 해당 세균의 단백질 순화, 생산 또는 펩타이드 제작이 필수적이며, 높은 항체 생산 비용이 요구된다. 또한, 단백질의 특성상 보관과 이용상의 어려움이 많고, 한 번에 한 종류 또는 제한된 종류의 세균 검출만이 가능하며, 세균의 배양 및 실험 단계에 있어서 긴 시간이 소모된다. 이러한 단점을 개선하기 위하여, PCR 방법을 이용한 각종 세균 검출 키트들이 연구 개발되기 시작하였다. PCR 방법을 이용한 검출 키트들은 높은 정확성과 간편성, 신속성 때문에 각종 분야에서 날로 그 수요가 증가하고 있다.
이러한 PCR은 실시간(Real-Time) PCR(qPCR), 디지털(Digital) PCR(dPCR)로 진화하고 있으며, 전통적 PCR이 제공하지 못했던 실시간 진단, 고민감도, 측정 결과 디지털화 등의 장점을 제공하고 있다.
실시간 PCR 방법은 PCR 증폭 산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭 산물과 반응하는 형광 물질의 검출과 정량으로 해석하는 방법이다. 이 방법은 기존의 PCR 방법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기 영동 후 PCR 증폭 산물을 확인하는 것에 비해, 전기영동의 추가 작업이 필요 없고, 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하며, 결과를 수치화할 수 있고, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 유해문제에 따른 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있다는 장점이 있다.
새롭게 부상되고 있는 디지털 PCR(dPCR)은 핵산을 탐지하고 정량하는 새로운 접근법으로서, 샘플 내에 단일 반응을 수행하나, 샘플은 다수의 분할 내에 분리되며, 반응은 개별적으로 각각의 분할에서 수행된다. 이 분리는 핵산 양의 민감한 측정을 가능하게 한다. qPCR에 비해 dPCR은 10~1,000피코리터(pico liter)의 극소량 시료로도 분석이 가능하며, 많은 수의 시료를 동시에 처리할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 정확한 정량 분석과 타겟 핵산 분자의 고감도 탐지, 병원균 탐지 등 다양한 방면에서 활용이 가능하다.
dPCR에서, 샘플은 샘플 내의 개별 핵산 분자가 국부화되고 많은 별개의 영역 내에 농축되도록 분할된다. 샘플은 단순 희석 절차에 의해 각각의 분획이 대략 하나 이하의 DNA 주형의 카피를 함유하도록 분획화된다. 개별 DNA 주형을 격리시킴으로써, 이 절차는 원래의 샘플에서 매우 낮은 수준으로 존재했던 DNA 분자를 효과적으로 풍부화한다. 샘플의 분할은 포아송(Poisson) 통계를 사용한 분자의 계수를 촉진시킨다. 결과적으로, 각각의 분할은 "0개" 또는 "1개"의 분자(들)/음성 또는 양성 반응을 각각 함유할 것이다. 분자의 출발 카피 수는 전통적 PCR에서 증폭 주기의 수에 비례하는 반면, dPCR은 최초 샘플 양을 결정하기 위해 증폭 주기의 수에 의존하지 않는다.
이에, 음식물 내 소량의 식중독균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하기 위해 dPCR 방법을 이용한 식중독균의 검출 방법 및 검출 키트 개발의 필요성이 요구되고 있다.
한국등록특허 제1456646호에는 '식중독균 검출용 키트 및 이를 이용한 식중독균 검출 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0007562호에는 '그람양성 식중독 유발 세균 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 디지털 PCR을 이용한 식중독균의 검출 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 4쌍의 PCR 프라이머를 이용하여 1회의 디지털 PCR 수행으로 4종의 식중독균을 동시에 신속하게 검출하고 식중독균의 정량 분석을 할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 프라이머를 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라제 및 서열번호 1 내지 8로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계; 상기 생성된 드롭렛에서 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 표적 핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적 핵산의 양을 결정하는 단계를 포함하는 식중독균의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 식품에 존재하는 소량의 식중독균을 검출하기 위하여 사용되는 디지털 PCR 방법으로 식품에 존재하는 게놈 DNA에서 4종의 식중독균 즉, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli)의 양질을 판단할 수 있으므로, 실시간 PCR 방법보다 감수성이 좋으며, 표준 물질 없이 양적인 값을 알려주는 방법으로 정량분석에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 사용된 디지털 PCR 기기인 QX200의 작업흐름(1. 분할(partition)->2. 열 주기(Thermal cycle)->3. 카운트(count))을 나타낸 것이다.
도 2는 바실러스 세레우스(B.C)의 단일 디지털 PCR 반응을 수행한 결과를 이벤트(드롭렛)에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A)와 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(B)로 나타낸 것이다.
도 3은 스타필로코커스 아우레우스(S.A)의 단일 디지털 PCR 반응을 수행한 결과를 이벤트에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A)와 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(B)로 나타낸 것이다.
도 4는 살모넬라 티피무리움(S.T)의 단일 디지털 PCR 반응을 수행한 결과를 이벤트에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A)와 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(B)로 나타낸 것이다.
도 5는 대장균(E.coli)의 단일 디지털 PCR 반응을 수행한 결과를 이벤트에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A)와 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(B)로 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 세레우스의 검출 한계를 확인한 결과를 이벤트에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A), DNA 연속 희석 농도별 형광값 변화 그래프(B) 및 DNA 연속 희석 농도별 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(C)로 나타낸 것이다.
도 7은 스타필로코커스 아우레우스의 검출 한계를 확인한 결과를 이벤트에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A), DNA 연속 희석 농도별 형광값 변화 그래프(B) 및 DNA 연속 희석 농도별 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(C)로 나타낸 것이다.
도 8은 살모넬라 티피무리움의 검출 한계를 확인한 결과를 이벤트에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A), DNA 연속 희석 농도별 형광값 변화 그래프(B) 및 DNA 연속 희석 농도별 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(C)로 나타낸 것이다.
도 9는 대장균의 검출 한계를 확인한 결과를 이벤트에 따른 형광값으로 표시한 그래프(A), DNA 연속 희석 농도별 형광값 변화 그래프(B) 및 DNA 연속 희석 농도별 타겟의 카피 수를 계산한 정량분석 데이터(C)로 나타낸 것이다.
도 10은 살모넬라 티피무리움(S.T)과 대장균(E.coli)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)로 나타낸 것이다.
도 11은 살모넬라 티피무리움(S.T)과 스타필로코커스 아우레우스(S.A)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)를 나타낸다.
도 12는 살모넬라 티피무리움(S.T)과 바실러스 세레우스(B.C)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)를 나타낸다.
도 13은 스타필로코커스 아우레우스(S.A)와 대장균(E.coli)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)를 나타낸다.
도 14는 바실러스 세레우스(B.C)와 대장균(E.coli)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)를 나타낸다.
도 15는 스타필로코커스 아우레우스(S.A)와 바실러스 세레우스(B.C)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)를 나타낸다.
도 16은 스타필로코커스 아우레우스(S.A), 살모넬라 티피무리움(S.T) 및 대장균(E.coli)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)를 나타낸다.
도 17은 살모넬라 티피무리움(S.T), 바실러스 세레우스(B.C) 및 대장균(E.coli)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A) 및 정량분석 데이터(B)를 나타낸다.
도 18은 스타필로코커스 아우레우스(S.A), 살모넬라 티피무리움(S.T) 및 바실러스 세레우스(B.C)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A,B) 및 정량분석 데이터(C)를 나타낸다.
도 19는 스타필로코커스 아우레우스(S.A), 바실러스 세레우스(B.C) 및 대장균(E.coli)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A,B) 및 정량분석 데이터(C)를 나타낸다.
도 20은 스타필로코커스 아우레우스(S.A), 살모넬라 티피무리움(S.T), 바실러스 세레우스(B.C) 및 대장균(E.coli)의 다중 디지털 PCR 반응을 수행한 결과 그래프(A,B) 및 정량분석 데이터(C)를 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트는 상기 제1프라이머 세트, 제2프라이머 세트, 제3프라이머 세트 및 제4프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.
프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 즉, 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, DNA 폴리머라제 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성을 개시할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말하는 것이다.
또한, 본 발명의 프라이머는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 이러한 프라이머는 4종의 식중독균 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형(예를 들면: 부가, 결실, 치환)될 수 있으며, 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 4종의 식중독균을 검출하기 위한 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 세트는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 hem 유전자 185bp를 특이적으로 증폭하며; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 세트는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 nuc 유전자 275bp를 특이적으로 증폭하며; 상기 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 세트는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 HTO 유전자 496bp를 특이적으로 증폭하며; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 세트는 대장균(Escherichia coli) O157:H7의 stx2 유전자 255bp를 특이적으로 증폭한다. 즉, 본 발명의 식중독균를 검출하기 위한 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트는 4종의 식중독균 각각에 대하여 특이성을 가지고 있을 뿐만 아니라 특이 유전자를 서로 다른 크기로 증폭시킬 수 있기 때문에 4종의 식중독균 각각을 동시에 신속하게 탐지할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 통상적인 PCR 반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 디지털 PCR에 사용될 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 프라이머를 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 PCR 증폭 반응을 수행하기 위해 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라제 및 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계; 상기 생성된 드롭렛에서 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 표적 핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적 핵산의 양을 결정하는 단계를 포함하는 식중독균의 검출 방법을 제공한다.
상기 시료는 식중독균이 검출될 수 있는 시료이면 제한되지 않으나, 바람직하게는 가검물, 분변, 식품, 양상추와 같은 식품의 재료일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식중독균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식중독균일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 시료에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 페놀:클로로포름 추출에 후속한 에탄올 침전화 방법을 이용할 수도 있다.
본 발명의 식중독균의 검출 방법은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 한 디지털 PCR 방법을 이용한 방법일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 디지털 PCR 방법으로 드롭렛 디지털 PCR 시스템을 사용하였으며, 상기 시스템은 20㎕의 PCR 반응액을 15,000~20,000개 정도의 드롭렛으로 쪼개어 증폭시킨 후 표적 핵산을 계수하는 시스템이다. 드롭렛에서의 표적 핵산의 증폭 여부에 따라 양성 드롭렛(1)과 음성 드롭렛(0)으로 디지털 시그널처럼 받아들여 계수하고 포아송 분포를 통해 표적 핵산의 카피 수를 계산해 최종적으로 샘플 부피(㎕)당 카피 수로 결과 값을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법은 시료에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라제 및 서열번호 1 내지 8로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 반응액은 FAM, HEX 또는 VIC 등의 프로브 또는 EvaGreen 형광염료를 포함한 반응액과 오일을 카트리지에 분주하여 드롭렛 생성기에 정착하여 2만 개 가량의 드롭렛을 생성할 수 있다.
상기 생성된 드롭렛에서 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계를 포함한다. 상기단계는 PCR 반응을 수행하여 표적 핵산 서열을 증폭할 수 있으나 이에 제한하지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, 생성된 드롭렛은 96-웰 PCR 플레이트로 옮긴 후, 96-웰 타입의 PCR에 장착하여 PCR 반응을 진행할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서 상기 1종의 식중독균에 대한 프라이머 세트를 이용하여 각각의 식중독균을 검출할 수 있는 프라이머 세트는 각 검출 식중독균의 종류에 따라 상기 4쌍의 프라이머 세트에서 선택된 하나 이상을 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 검출 방법에서 상기 2종 이상의 식중독균의 특이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR을 수행함으로써, 2종 이상의 식중독균을 동시에 검출할 수 있다.
바람직하게는, 상기 표적 서열의 증폭은 다중(multiplex) PCR을 통해 수행될 수 있다. 다중 PCR이란 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 PCR 증폭하는 방법을 말한다. 상기 다중 PCR의 프라이머 어닐링 온도는 50℃~60℃일 수 있으며, 바람직하게는 52℃~58℃일 수 있고, 가장 바람직하게는 58℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 PCR은 통상의 PCR용 기기를 사용하여 실시할 수 있으며, 상기 PCR용 기기는 바람직하게는 실시간 PCR용 기기, 열 블록 PCR(Thermal Block PCR)용 기기, 디지털 PCR용 기기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 디지털 PCR용 기기일 수 있다. 일 예로, QX200(BioRad사, 미국)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 상기 증폭된 표적 핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적 핵산의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 다중 디지탈 PCR를 통해 동시에 2종 이상의 식중독균을 검출할 수 있으며, 추가로 표적 핵산의 양을 정량화할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, PCR이 완료된 PCR 플레이트를 디지털 PCR(QX200)의 드롭렛 리더에 장착하여 QuantaSoft를 통해 드롭렛의 EvaGreen 형광값을 확인하고 계수하여 최종 표적 핵산의 카피 수를 분석할 수 있었다.
이상적으로, 표지는 형광 표지이고, 상기 형광 표지 물질은 FAM(5- 또는 6-카르복시플루오레세인), VIC, NED, 플루오레세인, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 야키마 옐로우(Yakima Yellow), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) PET, 바이오서치 블루(Biosearch Blue™), 마리나 블루(Marina Blue ), 보텔 블루(Bothell Blue), 350 FAM™, SYBR 그린 1, 플루오레세인, EvaGreen™, 알렉사 플루오르 488 JOE™, VIC™, HEX™, TET™, 칼 플루오르 골드 540, 야키마 옐로우, ROX™, 칼 플루오르 레드 610, Cy3.5™, 텍사스 레드, 568 Cy5™, 쿠아사르(Quasar™) 670, 라이트사이클러 레드640(LightCycler Red640), 알렉사 플루오르 633, 쿠아사르™ 705, 라이트사이클러 레드705, 알렉사 플루오르 680, 사이토 9, LC 그린, LC 그린 플러스+의 군으로부터 선택되어질 수 있으며, 바람직하게는 FAM, HEX, SYBR Green 또는 EvaGreen로 구성된 군으로부터 선택되어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형광 표지 물질은 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르며, 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 물질은 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 물질에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 시료의 준비
바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 대장균(Escherichia coli) 박테리아를 각각 액상 배지에 접종하여 37℃에서 교반하여(250rpm) 충분한 시간 동안 배양하였다. 각 배양액에서 박테리아를 원심분리하여 게놈 DNA를 추출(NucleoSpin Tissue XS 사용, MN, Germany)하여 농도 및 순도를 측정하였다. 시료 각각 20ng를 사용하여 디지털 PCR의 주형으로 사용하였다.
2. 본 발명에서 사용된 QX200의 작업 흐름(work flow)
(1) 분할(Partitioning): 1×QX200 EvaGreen master mix(BioRad사, 미국), 200nM의 프라이머(Bioneer사)(서열번호 1 내지 8, 표 1 참고), 20ng의 주형을 포함하는 총 20㎕의 반응액을 드롭렛 생성기(Droplet generator)에 넣어 분할을 통해 드롭렛(droplet)을 생산하였다. 이때 생산되는 드롭렛의 수는 15,000~20,000 개 정도가 생산되었다. QX 200 디지털 PCR에 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
본 발명에 사용된 PCR 프라이머
종명 종 특이적 프라이머(명칭:염기서열) 서열번호 증폭산물크기
바실러스 세레우스
ATCC		 hem-F: 5'-CTGTAGCGAATCGTACGTATC-3' 1 185bp
hem-R: 5'-TACTGCTCCAGCCACATTAC-3' 2
스타필로코커스 아우레우스 ATCC6994 nuc-F: 5'-GCGATTGATGGTGATACGG-3' 3 275bp
nuc-R: 5'-CAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3' 4
살모넬라 티피무리움
ATCC19585		 HTO-F: 5'-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3' 5 496bp
HTO-R: 5'-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3' 6
대장균O157:H7
ATCC19585		 stx2-F: 5'-GGCACTGTCTGAAACTGCTCC-3' 7 255bp
stx2-R: 5'-TCGCCAGTTATCTGACATTCTG-3' 8
(2) 열 주기(Thermal cycle): 생산된 드롭렛을 PCR 장비로 옮겨 PCR 반응을 실시하였다. 열 사이클 단계의 PCR 반응 조건은 하기 표 2와 같이 구성하여 PCR을 수행하였다.
QX200 PCR 반응 조건
단계 온도 시간 사이클
중합효소 활성화 95℃ 10분 1
변성 95℃ 15초 40
어닐링/연장 58℃ 1분
신호 안정화 4℃ 5분 1
90℃ 5분 1
냉각 및 저장 4℃ 지속
(3)카운트(Count): PCR 반응이 완료된 드롭렛들을 드롭렛 리더(droplet reader)에 넣어서 신호(signal)를 확인하였다.
실시예 1: 박테리아 타겟의 증폭 검출 확인
본 실시예에서는 20ng 게놈 DNA를 주형으로 하여 디지털 PCR을 진행했으며, 타겟이 존재하는 드롭렛으로 역치(threshold)(도 2 내지 도 5의 그래프(A) 상의 분홍색 선) 이상의 형광값을 보이면 양성(positive)으로 구분되어 그 숫자들이 계산되었다. 이들 숫자들은 반응에 사용한 반응 부피를 고려하여 단위 부피 당 숫자로 표현되어 타겟의 카피(copy) 수를 계산하였다.
도 2 내지 5에서 각각 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 대장균(Escherichia coli) 게놈 DNA를 주형으로 하여 단일 디지털 PCR를 수행한 결과 각각의 식중독균을 검출할 수 있으며 타겟 물질의 양을 정량할 수 있었다.
실시예 2: 식중독균 검출 한계 측정
검출한계 규정을 위해 타겟 식중독균의 게놈 DNA 농도를 연속 희석(serial dilution)하여 피코그램(pg) 이하까지 QX200의 민감도(sensitivity)를 관찰하고자 하였다.
PCR 민감도 측정을 위하여 4종의 식중독균 게놈 DNA 주형을 각각 10ng에서 100fg까지 연속 10배 희석하여 각 희석액(10 ng, 1ng, 100pg, 10pg, 10pg, 100fg)을 PCR 주형으로 실시예 1과 동일한 PCR을 수행하였다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균에서 검출 한계 확인 실험 결과 DNA의 연속 희석에 의한 농도가 1/10씩 감소하는 경향성을 보이며, 1pg/㎕까지도 검출이 확인되었다(도 6).
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)균에서 검출 한계 확인 실험 결과 DNA의 연속 희석에 의한 농도가 1/10씩 감소하는 경향성을 보이며, 100fg/㎕까지도 검출이 확인되었다(도 7).
살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)에서 검출 한계 확인 실험 결과 DNA의 연속 희석에 의한 농도가 1/10씩 감소하는 경향성을 보이며, 100fg/㎕까지도 검출이 확인되었다(도 8).
대장균(Escherichia coli) DNA의 연속 희석에 의한 농도가 1/10씩 감소하는 경향성을 보이며, 100fg/㎕까지도 검출이 확인되었다(도 9). 100fg의 대장균 게놈 DNA는 대장균의 게놈 사이즈(4×106 base pair)로 계산하면 대장균 10 ~ 20 마리에 해당되는 수치이다.
실시예 3: 식중독균 검출을 위한 다중 PCR 수행
QX 200 디지털 PCR의 장점 중에 하나인 다중 PCR 방법은 타겟 유전자의 프라이머 농도를 다르게 하여 한 웰(well)에서 확인할 수 있는 방법이다. 4종의 식중독균 샘플(바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium))의 다중 PCR을 수행하였다. 이 때 4종의 샘플의 게놈 DNA를 각각 10ng으로 정규화(normalization)하여 풀링(pooling)하여 사용하였다. 풀링한 샘플을 0.1ng으로 희석하여 사용하였다.
3-1. 스타필로코커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ) 및 대장균( Escherichia coli )
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 대장균(Escherichia coli)의 다중 PCR 반응을 수행하기 위하여 최종 반응 시료상태에서 스타필로코커스 아우레우스는 각각 80 nM, 대장균은 정방향 프라이머의 농도가 20 nM, 역방향 프라이머의 농도가 45 nM가 되도록 조절하였다.
도 10에서 개시된 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스와 대장균의 존재가 서로 다른 채널 1의 형광값(ch1 amplitude)을 보이며(대장균 8000 ~ 11000, 스타필로코커스 아우레우스 12000 ~ 15000), 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-2. 스타필로코커스 아우레우스( Staphylococcus aureus ) 및 살모넬라 티피무리움( Salmonella typhimurium )
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 다중 PCR을 수행하기 위해 스타필로코커스 아우레우스에 대한 프라이머 농도는 최종 반응 시료상태에서 80nM, 살모넬라 티피무리움은 110nM이 되도록 조절하였다.
도 11에서 개시된 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스와 살모넬라 티피무리움의 존재가 서로 다른 형광값(스타필로코커스 11000 ~ 12000, 살모넬라 12000~ 15000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-3. 살모넬라 티피무리움 ( Salmonella typhimurium ) 및 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
살모넬라 티피무리움 및 바실러스 세레우스의 다중 PCR 반응을 수행하기 위하여 각 타겟 박테리아에 대한 프라이머 농도를 다르게 하여 실험에 적용하였다. 이는 그래프 상에 나타나는 타겟의 분포가 다르게 구별되도록 하기 위함이다. 살모넬라 티피무리움에 대한 프라이머 농도는 최종 반응 시료상태에서 80nM, 바실러스 세레우스는 정방향 프라이머 80nM, 역방향 프라이머 35nM이 되도록 조절하였다.
도 12에서 개시된 바와 같이, 살모넬라 티피무리움과 바실러스 세레우스의 존재가 서로 다른 형광값(바실러스 6000 ~ 12000, 살모넬라 12000 ~ 15000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-4. 대장균( Escherichia coli ) 및 스타필로코커스 아우레우스( Staphylococcus aureus )
대장균과 스타필로코커스 아우레우스의 다중 PCR을 수행하기 위해 대장균은 정방향 프라이머 20nM, 역방향 프라이머 45nM, 스타필로코커스 아우레우스는 110nM이 되도록 조절하였다.
도 13에서 개시된 바와 같이, 대장균과 스타필로코커스 아우레우스의 존재가 서로 다른 형광값(대장균 8000 ~ 10000, 스타필로코커스 14000 ~ 16000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-5. 대장균( Escherichia coli ) 및 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
대장균과 바실러스 세레우스의 다중 PCR 반응을 수행하기 위하여 각 타겟 박테리아에 대한 프라이머 농도를 다르게 하여 실험에 적용하였다. 이는 그래프 상에 나타나는 타겟의 분포가 다르게 구별되도록 하기 위함이다. 대장균은 정방향 프라이머 20nM, 역방향 프라이머 45nM, 바실러스 세레우스는 정방향 프라이머 85nM, 역방향 프라이머 35nM이 되도록 조절하였다.
도 14에서 개시된 바와 같이, 대장균과 바실러스 세레우스의 존재가 서로 다른 형광값(대장균 5000 ~ 9000, 바실러스 10000 ~ 13000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-6. 스타필로코커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ) 및 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
스타필로코커스 아우레우스 및 바실러스 세레우스의 다중 PCR 반응을 수행하기 위하여 각 타겟 박테리아에 대한 프라이머 농도를 다르게 하여 실험에 적용하였다. 이는 그래프 상에 나타나는 타겟의 분포가 다르게 구별되도록 하기 위함이다. 스타필로코커스 아우레우스는 110nM, 바실러스 세레우스는 정방향 프라이머 85nM, 역방향 프라이머 35nM이 되도록 조절하였다.
도 15에서 개시된 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스와 바실러스 세레우스의 존재가 서로 다른 형광값(바실러스 5000 ~ 12000, 스타필로코커스 13000 ~ 16000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-7. 스타필로코커스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 대장균( Escherichia coli ) 및 살모넬라 티피무리움( Salmonella typhimurium )
스타필로코커스 아우레우스, 대장균 및 살모넬라 티피무리움의 다중 PCR을 수행하기 위해 스타필로코커스 아우레우스에 대한 프라이머 농도는 최종 반응 시료상태에서 80nM, 대장균은 정방향 프라이머 20nM, 역방향 프라이머 45nM, 살모넬라 티피무리움은 110nM이 되도록 조절하였다.
도 16에서 개시된 바와 같이, 상기 박테리아 각각은 서로 다른 형광값(대장균 6000 ~ 8000, 살모넬라 10000 ~ 11000, 스타필로코커스 12000 ~ 13000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-8. 살모넬라 티피무리움 ( Salmonella typhimurium ) , 대장균( Escherichia coli ) 및 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
살모넬라 티피무리움, 대장균 및 바실러스 세레우스의 다중 PCR을 수행하기 위해 살모넬라 티피무리움에 대한 프라이머 농도는 최종 반응 시료상태에서 80nM, 대장균은 정방향 프라이머 20nM, 역방향 프라이머 45nM, 바실러스는 정방향 프라이머 85nM, 역방향 프라이머 35nM이 되도록 조절하였다.
도 17에서 개시된 바와 같이, 상기 박테리아 각각은 서로 다른 형광값(대장균 6000 ~ 8000, 바실러스 8000 ~ 9000, 살모넬라 12000 ~ 13000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다.
3-9. 스타필로코커스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 살모넬라 티피무리움( Salmonella typhimurium ) 및 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 티피무리움 및 바실러스 세레우스의 다중 PCR을 수행하기 위해 스타필로코커스 아우레우스에 대한 프라이머 농도는 최종 반응 시료상태에서 80nM, 살모넬라 티피무리움은 110nM, 바실러스 세레우스는 정방향 프라이머 85nM, 역방향 프라이머 35nM이 되도록 조절하였다.
도 18에서 개시된 바와 같이, 상기 박테리아 각각은 서로 다른 형광값(바실러스 6000 ~ 8000, 살모넬라 10000 ~ 12000, 스타필로코커스 12000 ~ 13000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다. 도 18B는 2D로 표현한 그래프이며, 1D로 보았을 때 구분이 잘 안되는 것을 좀 더 명확하게 구분할 수 있었다. 본 실험에 사용된 형광표지인 Evagreen의 방출파장(Emission wavelength)이 520~580nm정도이며, 이는 FAM 방출파장인 520 nm 및 HEX 방출파장인 550 nm를 모두 포함하고 있기 때문에 Evagreen 하나만 사용하더라도 QX200에서 CH1(FAM), CH2(HEX)에서 검출이 되기 때문에 1D와 2D에서 확인이 가능하였다.
3-10. 스타필로코커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ), 대장균( Escherichia coli ) 및 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
스타필로코커스 아우레우스, 대장균 및 바실러스 세레우스의 다중 PCR을 수행하기 위해 스타필로코커스 아우레우스에 대한 프라이머 농도는 최종 반응 시료상태에서 110nM, 대장균은 정방향 프라이머 20nM, 역방향 프라이머 45nM, 바실러스 세레우스는 정방향 프라이머 85nM, 역방향 프라이머 35nM이 되도록 조절하였다.
도 19에서 개시된 바와 같이, 상기 박테리아 각각은 서로 다른 형광값(대장균 7000 ~ 8000, 바실러스 80000 ~ 10000, 스타필로코커스 12000 ~ 13000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다. 도 19B는 2D로 표현한 그래프이며, 1D로 보았을 때 구분이 잘 안되는 것을 좀 더 명확하게 구분할 수 있었다.
3-11. 스타필로코커스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 살모넬라 티피무리움( Salmonella typhimurium ), 대장균( Escherichia coli ) 및 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 티피무리움, 대장균 및 바실러스 세레우스의 다중 PCR을 수행하기 위해 스타필로코커스 아우레우스와 살모넬라 티피무리움에 대한 프라이머 농도는 최종 반응 시료상태에서 각각 110nM, 80nM, 대장균은 정방향 프라이머 20nM, 역방향 프라이머 45nM, 바실러스 세레우스는 정방향 프라이머 85nM, 역방향 프라이머 35nM이 되도록 조절하였다.
도 20에서 개시된 바와 같이, 상기 박테리아 각각은 서로 다른 형광값(대장균 12000 ~ 13000, 바실러스 15000 ~ 18000, 살모넬라 18000 ~ 20000, 스타필로코커스 21000 ~ 23000)을 보이며, 분획이 잘 되어 구분할 수 있음을 확인하였다. 도 20B는 2D로 표현한 그래프이며, 1D로 보았을 때 구분이 잘 안되는 것을 좀 더 명확하게 구분할 수 있었다.
<110> Bio-Medical Science Co., Ltd. <120> Method for detecting food borne pathogens using digital PCR <130> PN16234 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctgtagcgaa tcgtacgtat c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tactgctcca gccacattac 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcgattgatg gtgatacgg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caagccttga cgaactaaag c 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 actggcgtta tccctttctc tggtg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atgttgtcct gcccctggta agaga 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggcactgtct gaaactgctc c 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcgccagtta tctgacattc tg 22

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제1프라이머 세트;
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제2프라이머 세트;
    서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제3프라이머 세트; 및
    서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 제4프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1프라이머 세트, 제2프라이머 세트, 제3프라이머 세트 및 제4프라이머 세트를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식중독균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 PCR 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 식중독균 검출용 다중 디지털 PCR 키트.
  5. 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라제 및 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 다중 디지털 PCR용 프라이머 세트를 포함하는 반응액으로부터 복수의 드롭렛을 생성하는 단계;
    상기 생성된 드롭렛에서 표적 핵산 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 표적 핵산을 갖는 드롭렛의 수를 계수하여 표적 핵산의 양을 결정하는 단계를 포함하는 식중독균의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열의 증폭은 다중 PCR을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 식중독균의 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 주형 DNA의 농도는 1ng~100fg/㎕인 것을 특징으로 하는 식중독균의 검출 방법.
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