KR20160134760A

KR20160134760A - 발효를 위한 탄수화물의 제한적 공급을 사용하는 글리세롤의 용도

Info

Publication number: KR20160134760A
Application number: KR1020167028596A
Authority: KR
Inventors: 에스더 단타스 코스타; 오스카 첼더; 하트비크 슈뢰더; 슈테판 해프너; 조안나 마르티나 크라프지크; 그레고리 폰 아벤트로쓰; 크리스티안 리델; 토르스텐 렌츠
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2016-11-23
Also published as: WO2015140226A1; CA2942990A1; EP3119898A1; US20180030418A1; US10513693B2; JP6672162B2; JP2017507665A; CN106661595A; BR112016021406A2

Abstract

본 발명은 방법 단계: I) 미생물을 동화가능한 탄소 공급원으로서 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물이 공급되는 배양 배지에서 배양하여, 미생물이 유기 산을 생산하도록 하고, 그에 따라 유기 산을 포함하는 발효 브로쓰를 수득하는 단계; II) 방법 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 유기 산 또는 그의 염을 회수하는 단계를 포함하며; 여기서, 방법 단계 I)에서 적어도 특정 기간 동안 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_c _{.c. max}; 시간 당 리터 당 g)보다 낮은 것인, 발효에 의해 유기 산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

발효를 위한 탄수화물의 제한적 공급을 사용하는 글리세롤의 용도 {THE USE OF GLYCEROL WITH LIMITED FEED OF CARBOHYDRATES FOR FERMENTATION}

본 발명은 발효에 의해 유기 산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

유기 화합물, 예컨대 6개 이하의 탄소를 갖는 소형 디카르복실산은 다수의 용도를 가지면서 상업적으로 중요한 화학물질이다. 예를 들어, 소형 이산은 1,4-이산, 예컨대 숙신산, 말산 및 타르타르산, 및 5-탄소 분자 이타콘산을 포함한다. 다른 이산은 2 탄소 옥살산, 3 탄소 말론산, 5 탄소 글루타르산 및 6 탄소 아디프산을 포함하고, 또한 이러한 이산의 다수의 유도체가 존재한다.

기로서 소형 이산은 일부 화학적 유사성을 갖고, 중합체 생산에 있어서 그들의 용도는 특수한 특성을 수지에 제공할 수 있다. 이러한 다용도성은 그들이 다운스트림 케미칼 인프라스트럭처(downstream chemical infrastructure) 시장에 용이하게 적합하도록 한다. 예를 들어, 1,4-이산 분자는 그들이 다양한 산업적 화학물질 (테트라히드로푸란, 부티로락톤, 1,4-부탄디올, 2-피롤리돈) 및 숙시네이트 유도체 숙신디아마이드, 숙시노니트릴, 디아미노부탄 및 숙시네이트의 에스테르로 전환된다는 점에서 대규모 화학적 말레산 무수물의 용도 중 다수를 이행한다. 타르타르산은 식품, 가죽, 금속 및 인쇄 산업에서 다수의 용도를 갖는다. 이타콘산은 3-메틸피롤리돈, 메틸-BDO, 메틸-THF 및 다른 것의 생산을 위한 출발 물질을 형성한다.

특히, 숙신산 또는 숙시네이트 - 이들 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨 - 는 식품, 화학 및 제약 산업에서 산업적으로 중요한 다수의 화학물질의 전구체로서 사용되어 왔기 때문에 상당한 관심을 이끌었다. 실제로, 미국 에너지부로부터의 보고서는 숙신산이 바이오매스로부터 제조된 12종의 상위 화학적 빌딩 블록 중 1종이라고 보고한다. 따라서, 박테리아에서 이산을 만드는 능력은 상당한 상업적 중요성을 가지고 있을 것이다.

WO-A-2009/024294는 처음에 반추위로부터 단리된 파스테우렐라세아에(Pasteurellaceae) 과의 구성원이며, 글리세롤을 탄소 공급원으로서 사용할 수 있는 숙신산 생산 박테리아 균주, 및 상기 능력을 보유하는 그로부터 유래된 변이체 및 돌연변이체 균주, 특히 숙신산을 생산하는 능력을 갖는, DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 독일 D-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄. 7B)에 기탁 번호 DSM 18541 (ID 06-614)로 기탁된 명칭 DD1의 박테리아 균주를 개시한다. DD1-균주는 문헌 [Kuhnert et al., 2010]에 의해 분류된 바와 같이 바스피아 숙시니시프로두센스(Basfia succiniciproducens) 종 및 파스테우렐라세아에 과에 속한다. ldhA-유전자 및/또는 pflD - 또는 pflA-유전자가 파괴된 이들 균주의 돌연변이는 WO-A-2010/092155에 개시되며, 이들 돌연변이체 균주는 WO-A-2009/024294에 개시된 DD1-야생형과 비교하여 혐기성 조건 하에, 탄소 공급원, 예컨대 글리세롤 또는 글리세롤 및 탄수화물, 예컨대 말토스의 혼합물로부터의 숙신산의 상당히 증가된 생산을 특징으로 한다.

그러나, 예를 들어 WO-A-2009/024294 또는 WO-A-2010/092155에 개시된 바와 같은 유기 산을 생산하는 방법에서, 유일한 탄소 공급원으로서 글리세롤을 사용하는 경우 공간 시간 수율은 여전히 개선가능하다.

따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 극복하는 것이다.

특히, 선행 기술에 공지된 방법과 비교하여, 글리세롤을 우세한 탄소 공급원으로서 사용하는 경우에 유기 산, 예컨대 숙신산의 생산을 가능하게 하는 발효에 의해 이러한 유기 산을 보다 높은 공간 시간 수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이었다.

상기 언급된 목적을 달성하는 것에 대한 기여는 방법 단계

I) 미생물을 동화가능한 탄소 공급원으로서 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물이 공급되는 배양 배지에서 배양하여, 미생물이 유기 산을 생산하도록 하고, 그에 따라 유기 산을 포함하는 발효 브로쓰를 수득하는 단계;

II) 방법 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 유기 산 또는 그의 염을 회수하는 단계

를 포함하며;

여기서 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)은 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_c _{.c. max}; 시간 당 리터 당 g)보다 낮은 것인, 발효에 의해 유기 산을 생산하는 방법에 의해 제공된다.

본 출원의 본 발명자는 글리세롤이 우세한 탄소 공급원으로서 사용되는 발효 방법에서 유기 산, 예컨대 숙신산을 생산하는 경우, 추가의 탄소질 화합물, 예컨대 수크로스 또는 D-글루코스가 제한적 방식으로 첨가되면 유기 산, 예컨대 숙신산의 공간 시간 수율이 유의하게 개선될 수 있음을 발견하였다. 추가의 탄소질 화합물의 제한적 방식으로의 첨가에 의해 추가의 탄소질 화합물의 소모율이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율보다 낮아진다.

본 발명에 따른 방법의 방법 단계 I)에서 미생물을 동화가능한 탄소 공급원으로서 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물이 공급되는 배양 배지에서 배양하여, 미생물이 유기 산을 생산하도록 하고, 그에 따라 유기 산을 포함하는 발효 브로쓰를 수득한다.

본 발명에 따른 적합한 미생물은 효모, 진균 또는 박테리아일 수 있다. 적합한 박테리아, 효모 또는 진균은 특히 박테리아, 효모 또는 진균 균주로서 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 (DSMZ) (독일 브런즈윅)에 기탁된 박테리아, 효모 또는 진균이다.

본 발명에 따른 적합한 박테리아는

http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm

에 상술된 속에 속하고,

본 발명에 따른 적합한 효모는

http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm

에 상술된 속에 속하고,

본 발명에 따른 적합한 진균은

http://www.dsmz.de/species/fungi.htm

에 상술된 것이다.

바람직하게는, 방법 단계 I)에서 사용되는 미생물은 박테리아 세포이다. 본원에 사용된 용어 "박테리아 세포"는 원핵 유기체, 즉 박테리아를 지칭한다. 박테리아는 그의 생화학적 및 미생물학적 특성뿐만 아니라 그의 형태학에 기초하여 분류될 수 있다. 이들 분류 기준은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에 따르면 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 파스테우렐라세아에, 바실라세아에(Bacillaceae) 또는 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 과에 속한다.

"엔테로박테리아세아에"는 더욱 친숙한 다수의 박테리아, 예컨대 살모넬라(Salmonella) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 비롯한 거대 과의 박테리아를 나타낸다. 이들은 프로테오박테리아(Proteobacteria)에 속하고, 그들 자신의 목 (엔테로박테리알레스(Enterobacteriales))에 주어진다. 엔테로박테리아세아에의 구성원은 막대형이다. 다른 프로테오박테리아와 마찬가지로, 이들은 그람-음성 염색을 갖고, 이들은 당을 발효시켜 락트산 및 다양한 다른 최종 생성물, 예컨대 숙신산을 생산하는 통성 혐기성균이다. 대부분은 또한 니트레이트를 니트라이트로 환원시킨다. 대부분의 유사한 박테리아와는 달리, 엔테로박테리아세아에는 일반적으로 시토크롬 C 옥시다제가 결여되어 있다. 대부분은 이동에 사용되는 많은 편모를 갖지만, 몇몇 속은 비-이동성이다. 이들은 비-포자 형성성이고, 대부분 카탈라제-양성이다. 이 과의 다수의 구성원은 인간 및 다른 동물의 장에서 발견되는 장 균총의 정상적인 일부이지만, 다른 것은 물 또는 토양에서 발견되거나, 다양한 상이한 동물 및 식물 상의 기생충이다. 이. 콜라이(E. coli)로서 보다 널리 공지된 에스케리키아 콜라이는 가장 중요한 모델 유기체 중 하나이고, 그의 유전학 및 생화학이 밀접하게 연구되었다. 엔테로박테리아세아에의 대부분의 구성원은 그의 숙주에 대한 박테리아 세포의 부착에 수반되는 주모성 유형 I 핌브리아를 갖는다. 엔테로박테리아세아에에 대한 예는 이. 콜라이, 프로테우스(Proteus), 살모넬라 및 클레브시엘라(Klebsiella)이다.

"파스테우렐라세아에"는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)와 같은 박테리아에서부터 동물 및 인간 점막의 공생체에 이르는 구성원을 갖는 그람-음성 프로테오박테리아의 거대 과를 포함한다. 대부분의 구성원은 조류 및 포유동물의 점막 표면 상에서, 특히 상기도에서 공생 생물로서 산다. 파스테우렐라세아에는 전형적으로 막대형이고, 통성 혐기성균의 주목할만한 군이다. 이들은 옥시다제의 존재에 의해 관련 엔테로박테리아세아에와 구별될 수 있고, 편모의 부재에 의해 대부분의 다른 유사한 박테리아와 구별될 수 있다. 파스테우렐라세아에 과의 박테리아는 대사 특성 및 그의 16S RNA 및 23S RNA의 서열에 기초하여 다수의 속으로 분류되었다. 대부분의 파스테우렐라세아에는 피루베이트-포르메이트-리아제 유전자를 함유하고, 탄소 공급원을 유기 산으로 혐기적으로 발효시킬 수 있다.

"바실라세아에"는 내생포자를 생산할 수 있는 그람-양성, 종속영양, 막대형 박테리아 과이다. 이 과의 이동성 구성원은 주모성 편모를 특징으로 한다. 일부 바실라세아에는 호기성이고, 다른 것들은 통성 또는 절대 혐기성균이다. 대부분은 비-병원성이지만, 바실루스(Bacillus) 종은 인간에서 질환을 발생시키는 것으로 공지되어 있다. 이 과는 또한 2개의 목, 바실랄레스(Bacillales) 및 락토바실랄레스(Lactobacillales)를 포함하는 바실루스 속을 포함한다. 바실루스 종은 37℃에서 호기성 조건 하에 성장할 수 있는 큰 원통형 박테리아를 나타낸다. 그들은 전형적으로 비-병원성이다. 바실랄레스 속은 알리시클로바실라세아에(Alicyclobacillaceae), 바실라세아에, 카리오파나세아에(Caryophanaceae), 리스테리아세아에(Listeriaceae), 파에니바실라세아에(Paenibacillaceae), 플라노코카세아에(Planococcaceae), 스포로락토바실라세아에(Sporolactobacillaceae), 스타필로코카세아에(Staphylococcaceae), 써모악티노미세타세아에(Thermoactinomycetaceae), 투리시박테라세아에(Turicibacteraceae) 종을 함유한다. 대부분의 바실루스는 피루베이트-포르메이트-리아제 유전자를 함유하고, 탄소 공급원을 유기 산으로 혐기적으로 발효시킬 수 있다.

"코리네박테리아세아에"는 유박테리알레스(Eubacteriales) 목의 주로 그람-양성 및 호기성 및 비이동성 막대형 박테리아의 거대 과이다. 이 과는 또한 그람-양성, 막대형 박테리아의 속인 코리네박테리움(Corynebacterium) 속을 포함한다. 코리네박테리아는 자연에 광범위하게 분포되어 있고, 대부분 무해하다. 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)과 같은 일부는 산업적 세팅에 유용하다.

방법 단계 I)에서 사용되는 미생물이 변형된 미생물인 것이 특히 바람직하다. 용어 "변형된 미생물"은 이것이 유래된 자연-발생 야생형 미생물과 비교하여 변경된, 변형된 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형 (예를 들면, 유전자 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미치는 경우)을 나타내도록 유전자 변경된, 변형된 또는 조작된 (예를 들면, 유전자 조작된) 미생물을 포함한다. 본 발명에 따른 방법의 특정한 바람직한 실시양태에 따르면, 방법 단계 I)에서 사용되는 변형된 미생물은 재조합 미생물이며, 이는 미생물이 재조합 DNA를 사용하여 수득되었음을 의미한다. 본원에 사용된 표현 "재조합 DNA"는 실험실 방법 (분자 클로닝)을 사용하여 다중 공급원으로부터의 유전 물질을 함께 가져와, 생물학적 유기체에서 달리 찾아볼 수 없는 서열을 생성함으로써 생성된 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 재조합 DNA의 예는 이종 DNA-서열이 삽입된 플라스미드이다.

바람직하게는, 방법 단계 I)에서 사용되는 미생물, 특히 변형된 미생물은 파스테우렐라세아에 과에 속하는 야생형으로부터 유래되었다. 이와 관련하여 변형된 미생물이 유래된 야생형은 바스피아(Basfia) 속에 속하는 것이 또한 바람직하고, 변형된 미생물이 유래된 야생형이 바스피아 숙시니시프로두센스 종에 속하는 것이 특히 바람직하다.

가장 바람직하게는, 방법 단계 I)에서 사용되는 변형된 미생물이 유래된 야생형은 부다페스트 조약 하에 독일 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌, 게엠베하)에 기탁 번호 DSM 18541로 기탁된 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1이다. 이 균주는 처음에 독일 기원의 소의 반추위로부터 단리되었다. 파스테우렐라(Pasteurella) 박테리아는 동물 및, 바람직하게는 포유동물의 위장관으로부터 단리될 수 있다. 박테리아 균주 DD1은 특히 소의 반추위로부터 단리될 수 있고, 탄소 공급원으로서 글리세롤 (조 글리세롤 포함)을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 변형된 미생물을 제조하는데 사용될 수 있는 바스피아 속의 추가의 균주는 DSZM에 기탁 번호 DSM 22022 하에 기탁된 바스피아-균주 또는 스웨덴 괴테보르크 유니버시티 컬처 콜렉션 (Culture Collection of the University of Goeteborg) (CCUG)에 기탁 번호 CCUG 57335, CCUG 57762, CCUG 57763, CCUG 57764, CCUG 57765 또는 CCUG 57766으로 기탁된 바스피아-균주이다. 상기 균주는 처음에 독일 또는 스위스 기원의 소의 반추위로부터 단리되었다.

이와 관련하여 본 발명에 따른 방법의 방법 단계 I)에 사용된 변형된 미생물이 유래된 야생형이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 1과 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99.9%의 서열 상동성을 나타내는 서열의 16S rDNA를 갖는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 변형된 미생물이 유래된 야생형이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 2와 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99.9 %의 서열 상동성을 나타내는 서열의 23S rDNA를 갖는 것이 또한 바람직하다.

본 발명에 따른 변형된 미생물에 사용되는 다양한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 언급되는 백분율 값에서의 동일성은 바람직하게는, 예를 들어 디폴트 파라미터, 즉 갭 개방 (갭을 개방하기 위한 페널티): 10.0, 갭 연장 (갭을 연장하기 위한 페널티): 0.5, 및 데이터 파일 (패키지에 포함된 스코어링 매트릭스 파일): EDNAFUL을 갖는 생물정보학 소프트웨어 패키지 EMBOSS (버전 5.0.0, http://emboss.source-forge.net/what/)로부터의 프로그램 니들 (needle)의 도움에 의해 (다소 유사한 서열에 대해) 계산된 동일성과 같은, 정렬된 서열의 완전한 길이에 걸친 잔기의 동일성으로서 계산된다.

본 발명에 따른 방법의 방법 단계 I)에 사용된 변형된 미생물이 상기 언급된 야생형-미생물, 특히 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1으로부터 뿐만 아니라, 이들 균주의 변이체로부터 유래될 수 있다는 것을 유의해야 한다. 이와 관련하여 표현 "균주의 변이체"는 야생형-균주와 동일한 또는 본질적으로 동일한 특징을 갖는 모든 균주를 포함한다. 이와 관련하여 변이체의 16 S rDNA가 변이체가 유래된 야생형과 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95 %, 보다 바람직하게는 적어도 99 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.5 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.6 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.7 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8% 및 가장 바람직하게는 적어도 99.9 %의 동일성을 갖는 것이 특히 바람직하다. 변이체의 23 S rDNA가 변이체가 유래된 야생형과 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95 %, 보다 바람직하게는 적어도 99 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.5 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.6 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.7 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 % 및 가장 바람직하게는 적어도 99.9 %의 동일성을 갖는 것이 또한 특히 바람직하다. 본 정의의 의미에서 균주의 변이체는, 예를 들어 야생형-균주를 돌연변이유발성 화학적 작용제, X선, 또는 UV 광으로 처리함으로써, 또는 유전자가 결실되거나, 과다발현되거나, 이종 유전자가 세포 내로 도입되는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에 따르면, 방법 단계 I)에서 사용되는 변형된 미생물은 그의 야생형과 비교하여

i) 감소된 피루베이트 포르메이트 리아제 활성,

ii) 감소된 락테이트 데히드로게나제 활성, 또는

iii) 감소된 피루베이트 포르메이트 리아제 활성 및 감소된 락테이트 데히드로게나제 활성

을 갖는 미생물이다.

표현 "그의 야생형과 비교하여 x-유전자에 의해 코딩되는 효소의 감소된 활성을 갖는 변형된 미생물" (여기서 x-유전자는 ldhA-유전자, pflA-유전자 및/또는 pflD-유전자임)과 관련하여, 용어 "야생형"은 x-유전자에 의해 코딩되는 효소의 활성이 감소되지 않은 미생물, 즉 그의 게놈이 x-유전자 (특히 ldhA-유전자, pflA-유전자 및/또는 pflD-유전자)의 유전자 변형의 도입 이전과 같은 상태로 존재하는 미생물을 지칭한다. 바람직하게는, 표현 "야생형"은 그의 게놈, 특히 그의 x-유전자가 진화의 결과로서 자연적으로 발생되는 것과 같은 상태로 존재하는 미생물을 지칭한다. 용어는 전체 미생물에 대해, 그러나 바람직하게는 개별 유전자, 예를 들면 ldhA-유전자, pflA-유전자 및/또는 pflD-유전자에 대해 모두 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "효소의 감소된 활성"은 바람직하게는 야생형에서의 상응하는 효소의 활성과 비교하여 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 75 % 및 보다 바람직하게는 적어도 95 %만큼의 상응하는 효소의 활성의 감소에 상응한다.

용어 "효소의 감소된 활성"은, 예를 들어 상기 미생물의 야생형에 의해 발현되는 것보다 낮은 수준에서의 상기 유전자 변형된 (예를 들면, 유전자 조작된) 미생물에 의한 효소의 발현을 포함한다. 효소의 발현을 감소시키기 위한 유전자 조작은 효소를 코딩하는 유전자 또는 그의 일부의 결실, (예를 들면, 강력한 프로모터 또는 억제성 프로모터의 제거에 의한) 효소를 코딩하는 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형, 효소를 코딩하는 유전자의 전사 및/또는 유전자 산물의 번역에 수반되는 단백질 (예를 들면, 조절 단백질, 억제자, 인핸서, 전사 활성화제 등)의 변형, 또는 관련 기술분야에서 상용되는 특정한 유전자의 발현을 감소시키는 임의의 다른 통상적인 수단 (안티센스 핵산 분자 또는 iRNA 또는 표적 단백질의 발현을 녹-아웃 또는 차단하는 다른 방법의 사용을 포함하나, 이에 제한되지는 않음)을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 탈안정화 효소를 mRNA 내로 도입하거나 RNA의 리보솜 결합 부위 (RBS)의 열화를 유발하는 유전자 변형을 도입할 수 있다. 유전자의 코돈 사용빈도를 전사 효율 및 속도가 감소되는 방식으로 변화시키는 것이 또한 가능하다.

효소의 감소된 활성은 또한 효소의 감소된 활성을 유발하는 하나 이상의 유전자 돌연변이를 도입함으로써 수득될 수 있다. 또한, 효소의 활성의 감소는 또한 그의 활성이 감소되어야 할 효소를 활성화시키기 위해 필요한 활성화 효소의 불활성화 (또는 감소된 발현)를 포함할 수 있다. 후자의 접근법에 의해 그의 활성이 감소되어야 할 효소는 바람직하게는 불활성화된 상태로 유지된다.

락테이트 데히드로게나제가 결핍된 및/또는 피루베이트 포르메이트 리아제 활성이 결핍된 변형된 미생물은 WO-A-2010/092155, US 2010/0159543 및 WO-A-2005/052135에 개시되어 있으며, 미생물에서의, 바람직하게는 파스테우렐라 속의 박테리아 세포에서의, 특히 바람직하게는 바스피아 숙시니시프로두센스 균주 DD1에서의 락테이트 데히드로게나제 및/또는 피루베이트 포르메이트 리아제의 활성을 감소시키는 여러 접근법에 관한 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다. 피루베이트 포르메이트 리아제 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 ["Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis", Appl. Environ. Microbiol. (2000), Vol. 66, pages 3773-3777 (Asanuma N. and Hino T.)]에 의해 개시되고, 락테이트 데히드로게나제 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 ["Methods of Enzymatic Analysis", 3^rd Edition, Volume III, pages 126-133, Verlag Chemie, Weinheim (Bergmeyer, H.U., Bergmeyer J. and Grassl, M. (1983-1986))]에 의해 개시된다.

이와 관련하여 락테이트 데히드로게나제의 활성의 감소는 ldhA-유전자 (락테이트 데히드로게나제; LdhA; EC 1.1.1.27 또는 EC 1.1.1.28을 코딩함)의 불활성화에 의해 달성되고 피루베이트 포르메이트 리아제의 감소는 pflA-유전자 (피루베이트 포르메이트 리아제의 활성화제; PflA; EC 1.97.1.4를 코딩함) 또는 pflD-유전자 (피루베이트 포르메이트 리아제; PflD; EC 2.3.1.54를 코딩함)의 불활성화에 의해 달성되는 것이 바람직하며, 여기서 이들 유전자 (즉, ldhA, pflA 및 pflD)의 불활성화는 바람직하게는 이들 유전자 또는 그의 일부의 결실, 이들 유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 이들 유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입에 의해 달성되며, 여기서 이러한 변형은 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 "캠벨(Campbell) 재조합"에 의해 수행된다.

변형된 미생물에서 그의 활성이 감소되는 ldhA-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:

α1) 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;

α2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;

α3) α1) 또는 α2)의 핵산과 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.6 %, 적어도 99.7 %, 적어도 99.8 % 또는 적어도 99.9 %, 가장 바람직하게는 100 % 동일한 핵산 (동일성은 α1) 또는 α2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임); 및

α4) α1) 또는 α2)의 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.6 %, 적어도 99.7 %, 적어도 99.8 % 또는 적어도 99.9 %, 가장 바람직하게는 100 % 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 α1) 또는 α2)의 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임).

변형된 미생물에서 그의 활성이 감소되는 pflA-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:

β1) 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;

β2) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;

β3) β1) 또는 β2)의 핵산과 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.6 %, 적어도 99.7 %, 적어도 99.8 % 또는 적어도 99.9 %, 가장 바람직하게는 100 % 동일한 핵산 (동일성은 β1) 또는 β2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임); 및

β4) β1) 또는 β2)의 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.6 %, 적어도 99.7 %, 적어도 99.8 % 또는 적어도 99.9 %, 가장 바람직하게는 100 % 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 β1) 또는 β2의 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임).

변형된 미생물에서 그의 활성이 감소되는 pflD-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:

γ1) 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;

γ2) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;

γ3) γ1) 또는 γ2)의 핵산과 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.6 %, 적어도 99.7 %, 적어도 99.8 % 또는 적어도 99.9 %, 가장 바람직하게는 100 % 동일한 핵산 (동일성은 γ1) 또는 γ2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임); 및

γ4) γ1) 또는 γ2)의 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.6 %, 적어도 99.7 %, 적어도 99.8 % 또는 적어도 99.9 %, 가장 바람직하게는 100 % 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 γ1) 또는 γ2)의 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임).

이와 관련하여 본 발명에 따른 방법의 방법 단계 I)에서 사용되는 변형된 미생물은 다음을 포함하는 것이 바람직하다:

A) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 ldhA-유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;

B) pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflD-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD-유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;

C) pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflA-유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;

D) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 ldhA-유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입

및

pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflD-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD-유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;

또는

E) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 ldhA-유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입

및

pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflA-유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법의 방법 단계 I)에서 미생물에 의해 생산되는 유기 산은 카르복실산, 예컨대 포름산, 락트산, 프로피온산, 2-히드록시프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 3-히드록시부티르산, 아크릴산, 피루브산 또는 이들 카르복실산의 염, 디카르복실산, 예컨대 말론산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 글루타르산, 이타콘산, 아디프산 또는 그의 염, 또는 트리카르복실산, 예컨대 시트르산 또는 그의 염을 포함한다. 본 발명에 따른 방법의 특정한 바람직한 실시양태에 따르면, 유기 산은 숙신산이다. 본 발명의 문맥에 사용된 용어 "숙신산"은 그의 가장 넓은 의미로 이해되어야 하고, 또한 예를 들어, Na⁺ 및 K⁺-염과 같은 알칼리 금속 염, 또는 Mg² ⁺ 및 Ca² ⁺-염과 같은 알칼리 토금속 염, 또는 암모늄 염 또는 숙신산의 무수물로서 그의 염 (즉, 숙시네이트)을 포괄한다.

미생물은 바람직하게는 약 10 내지 60℃ 또는 20 내지 50℃ 또는 30 내지 45℃의 범위의 온도에서 2.5 내지 9.0 또는 3.5 내지 8.0 또는 4.5 내지 7.0의 pH에서 배양 배지 중에서 인큐베이션된다.

바람직하게는, 유기 산, 특히 숙신산은 혐기성 조건 하에 생산된다. 혐기성 조건은 통상적인 기술의 수단에 의해, 예를 들어 반응 배지의 구성성분을 탈기시키고 이산화탄소 또는 질소 또는 그의 혼합물을 예를 들어, 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유량으로 도입하는 것에 의해 혐기성 조건을 유지하는 것에 의해 확립될 수 있다. 호기성 조건은 통상적인 기술의 수단에 의해, 예를 들어 공기 또는 산소를 예를 들어, 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유량으로 도입하는 것에 의해 확립될 수 있다. 적절한 경우에, 0.1 내지 1.5 bar의 다소 과도한 압력이 방법에 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_c _{.c. max}; 시간 당 리터 당 g)보다 낮은 것을 특징으로 한다. 추가의 탄소질 화합물의 소모율은, 추가의 탄소질 화합물의 양 (즉, 배양 배지 내로 공급되는 양 및 배양 배지에 이미 함유될 수 있고 아직 소모되지 않은 양)이 세포가 이론적으로 소모할 수 있는 추가의 탄소질 화합물의 최대량보다 낮은 경우에 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율보다 낮다. 추가의 탄소질 화합물의 양은 따라서 제한된다.

본 발명의 방법에서 추가의 탄소질 화합물의 소모율은, 예를 들어 추가의 탄소질 화합물의 공급률에 의해 제어될 수 있다 (단, 배양 배지 중에 이미 존재할 수 있고 아직 소모되지 않은 추가의 탄소질 화합물의 양은 충분히 낮다). 이와 관련하여 추가의 탄소질 화합물의 공급률은 추가의 탄소질 화합물의 최대 소모율의 50 % 이하, 보다 바람직하게는 25 % 이하, 보다 바람직하게는 10 % 이하 및 가장 바람직하게는 5 % 이하인 것이 바람직하다. 추가의 탄소질 화합물의 소모율을 추가의 탄소질 화합물의 공급률에 의해 제어하는 것은 특히, 배양 배지가 임의의 (아직 소모되지 않은) 추가의 탄소질 화합물을 본질적으로 갖지 않는 경우 또는 추가의 탄소질 화합물의 양이 0.5 g/l 미만, 바람직하게는 0.05 g/l 미만, 가장 바람직하게는 검출 한계 미만인 경우에 가능하다. 바람직한 실시양태에서 배양 배지 내로 공급되는 추가의 탄소질 화합물은 즉시 및 완전히 세포에 의해 소모된다. 이러한 조건 하에 추가의 탄소질 화합물은 제한적 방식으로 공급된다.

본 발명의 방법에서 추가의 탄소질 화합물의 소모율이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율보다 낮은 조건은 특정 기간, 바람직하게는 적어도 30분, 바람직하게는 적어도 1시간, 보다 바람직하게는 적어도 6시간, 보다 더 바람직하게는 적어도 12시간 및 가장 바람직하게는 적어도 20시간의 배양 기간 동안 유지되는 것이 또한 바람직하다. 일반적으로, 추가의 탄소질 화합물의 제한적 공급의 조건은 총 배양 시간의 적어도 25 %, 바람직하게는 적어도 50 % 및 가장 바람직하게는 적어도 70 % 동안 실현된다.

바람직하게는, 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)은 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_c _{.c. max}; 시간 당 리터 당 g)의 50 % 이하, 보다 바람직하게는 25 % 이하, 보다 바람직하게는 10 % 이하 및 가장 바람직하게는 5 % 이하이다. 예를 들어, 추가의 탄소질 화합물에 대한 최대 소모율이 1 g/L/h일 경우, 소모율은 0.5 g/L/h (50 %) 이하, 바람직하게는 0.25 g/L/h (25 %) 이하, 보다 바람직하게는 0.1 g/L/h (10 %) 이하 및 가장 바람직하게는 0.05 g/L/h (5 %) 이하일 것이다.

이와 관련하여, 이와 동시에 (즉, 추가의 탄소질 화합물의 소모율이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율보다 낮은 동일한 기간 내에) 글리세롤의 양은 제한되지는 않으나, 바람직하게는 과량으로 존재한다 (글리세롤이 바람직하게는 세포가 글리세롤이 세포 배양물에 첨가되는 것보다 및/또는 배양 배지 중에 존재하는 것보다 더 빠르게 이를 소모할 수 없는 양으로 첨가되고/거나, 배양 배지 중에 이러한 양으로 존재하는 것을 의미함). 이와 관련하여 글리세롤의 소모율 (CR_g _.; 시간 당 리터 당 g)이 글리세롤의 최대 이론적 소모율 (CR_g _{. max}; 시간 당 리터 당 g)의 25 % 초과, 바람직하게는 50 % 초과, 보다 바람직하게는 75 % 초과, 보다 더 바람직하게는 90 % 초과 및 가장 바람직하게는 95 % 초과인 것이 바람직하다. 예를 들어, 글리세롤에 대한 최대 소모율이 1 g/L/h일 경우, 소모율은 0.5 g/L/h (50 %) 초과, 바람직하게는 0.75 g/L/h (75 %) 초과, 보다 바람직하게는 0.9 g/L/h (90 %) 초과 및 가장 바람직하게는 0.95 g/L/h (95 %) 초과일 것이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에 따르면, 적어도 30분, 바람직하게는 적어도 1시간, 보다 바람직하게는 적어도 6시간, 보다 더 바람직하게는 적어도 12시간 및 가장 바람직하게는 적어도 20시간의 배양 기간 동안

- 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)은 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_c _{.c. max}; 시간 당 리터 당 g)의 50 % 이하, 보다 바람직하게는 25 % 이하, 보다 바람직하게는 10 % 이하 및 가장 바람직하게는 5 % 이하이고,

이와 동시에,

- 글리세롤의 소모율 (CR_g _.; 시간 당 리터 당 g)은 글리세롤의 최대 이론적 소모율 (CR_g _{. max}; 시간 당 리터 당 g)의 25 % 초과, 바람직하게는 50 % 초과, 보다 바람직하게는 75 % 초과, 보다 더 바람직하게는 90 % 초과 및 가장 바람직하게는 95 % 초과이다.

추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 CR_c _{.c. max} 및 글리세롤의 최대 이론적 소모율 CR_g _{. max}의 결정을 위해 세포는 각각 과량의 추가의 탄소질 화합물 및 글리세롤의 존재 하에 인큐베이션된다. 과량의 추가의 탄소질 화합물 및 글리세롤은, 적어도 특정 기간 동안, 아직 소비되지 않은 기질 (즉, 추가의 탄소질 화합물 또는 글리세롤)의 특정 최소량이 배양 배지 중에서 검출될 수 있는 경우, 바람직하게는 적어도 1 g/L, 보다 바람직하게는 적어도 2.5 g/L의 양으로 존재한다.

추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 CR_c _{.c. max} 결정을 위해 세포는, CR_c.c의 결정 (즉, 탄소질 화합물이 제한된 양으로 존재할 때의 탄소질 화합물의 실제 소모율의 결정)의 경우와 정확하게 동일한 배양 조건 하에, 그러나 리터 당 적어도 5 g의 탄소질 화합물의 초기량을 사용하고 배양 배지 중의 아직 소모되지 않은 탄소질 화합물의 농도가 항상 1 g/L 초과이도록 하는 양으로 탄소질 화합물을 추가로 연속 첨가하면서 1시간 동안 배양된다. 또한, 본원에 사용된 CR_c _{.c. max}의 결정과 관련하여 표현 "정확하게 동일한 배양 조건 하"는 CR_c _{.c. max}의 결정이 CR_c _.c를 결정할 때 존재하는 것과 동일한 양의 글리세롤의 존재 하에, 그러나 과량의 탄소질 화합물을 사용하여 일어난다는 것을 나타낸다. 글리세롤의 최대 이론적 소모율 C_{g. max} 결정을 위해 세포는 또한 CR_g _. (즉, 글리세롤의 실제 소모율)의 결정의 경우와 정확하게 동일한 배양 조건 하에, 그러나 리터 당 적어도 5 g의 유일한 탄소 공급원로서의 글리세롤의 초기량을 사용하고 배양 배지 중의 아직 소모되지 않은 글리세롤의 농도가 항상 1 g/L 초과이도록 하는 양으로 글리세롤을 추가로 연속 첨가하면서 1시간 동안 배양된다. 본원에 사용된 CR_g _{. max}의 결정과 관련하여 표현 "정확하게 동일한 배양 조건 하"는 CR_g _{. max}의 결정이 CR_g _.를 결정할 때 존재하는 것과 동일한 양의 추가의 탄소질의 존재 하에, 그러나 과량의 글리세롤을 사용하여 일어난다는 것을 나타낸다.

탄소 공급원 (즉, 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물)은 배양의 시작시에 1회 배양 시간에 첨가될 수 있거나, 주기적으로 또는 연속적으로 첨가될 수 있다. 물론, 예를 들어, 하나의 탄소 공급원 (예를 들어 글리세롤)을 배양 시작시에 1회 및 다른 탄소 공급원 (예를 들어 추가의 탄소질 화합물)을 주기적으로 또는 연속으로 첨가하는 것이 또한 가능하다. 탄소 공급원이 발효 배지에 첨가되는 방식과 상관없이, 추가의 탄소질 화합물의 제한적 공급 및 바람직하게는 글리세롤의 비-제한적 공급을 위한 상기 기재된 조건이 적어도 30분, 바람직하게는 적어도 1시간, 보다 바람직하게는 적어도 6시간, 보다 더 바람직하게는 적어도 12시간 및 가장 바람직하게는 적어도 24시간의 배양 기간 동안 유지되는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물은 적어도 5 : 1, 보다 바람직하게는 적어도 7.5 : 1 및 가장 바람직하게는 적어도 10 : 1의 글리세롤 : 추가의 탄소질 화합물 총 중량 비로 배양 배지 내로 공급된다. 본원에 사용된 용어 "총 중량 비"는 방법 단계 I)에 첨가되는 추가의 탄소질 화합물의 총량 및 글리세롤의 총량의 비를 규정한다.

본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에 따르면 추가의 탄소질 화합물은 발효 배지 중 추가의 탄소질 화합물의 농도가 0.1 g/l/h 미만, 바람직하게는 0.01 g/l/h 미만만큼 증가하는 양으로 발효 배지 내로 공급된다. 가장 바람직하게는, 발효 배지 중 추가의 탄소질 화합물의 농도는 (첨가된 탄소질 화합물이 즉시 소모되기 때문에) 전혀 증가하지는 않는다. 이와 관련하여 배양 배지 중 추가의 탄소질 화합물의 농도가 0 내지 1 g/L, 바람직하게는 0.6 g/L 미만, 보다 바람직하게는 0.3 g/L 미만, 보다 더 바람직하게는 0.1 g/L 미만인 것이 또한 바람직하며, 여기서 가장 바람직하게는 배양 배지 중 추가의 탄소질 화합물의 농도는 미생물에 의한 추가의 탄소질 화합물의 빠른 소모로 인해, 적합한 표준 검정으로 (본원의 실험 파트에 기재된 바와 같이 바람직하게는 HPLC에 의해) 측정시 (예를 들면 배양 배지 중 잔류 농도로서 결정됨) 검출 한계 미만이다.

추가의 탄소질 화합물은 바람직하게는 글리세롤을 제외한 탄수화물, 보다 바람직하게는 수크로스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및 그의 혼합물 또는 상기 화합물 중 적어도 1종을 함유하는 조성물로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 탄수화물이다. 가장 바람직하게는, 추가의 탄소질 화합물은 수크로스 및 D-글루코스, 가장 바람직하게는 수크로스, D-글루코스 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

동화가능한 탄소 공급원으로서 사용되는 글리세롤은 순수한 글리세롤의 형태로 또는 예를 들어, 사전 정제 없이 바이오 디젤 또는 바이오 에탄올 생산으로부터 수득된 조 글리세롤의 형태로 사용될 수 있다.

동화가능한 탄소 공급원 (즉, 글리세롤 및 적어도 하나의 추가의 탄소질 화합물의 합)의 초기 농도는 바람직하게는 0 내지 100 g/l, 바람직하게는 0 내지 75 g/l, 보다 바람직하게는 0 내지 50 g/l, 보다 더 바람직하게는 0 내지 25 g/l의 범위의 값으로 조정되고, 배양 동안 상기 범위로 유지될 수 있다 (추가의 탄소질 화합물이 이것이 세포 배양물 내로 공급되는 것보다 빠르게 소모되면 동화가능한 탄소 공급원의 초기 농도는 0 g/l일 수 있음). 반응 배지의 pH는 적합한 염기, 예를 들어 기체상 암모니아, NH₄HCO₃, (NH₄)₂CO₃, NaOH, Na₂CO₃, NaHCO₃, KOH, K₂CO₃, KHCO₃, Mg(OH)₂, MgCO₃, Mg(HCO₃)₂, Ca(OH)₂, CaCO₃, Ca(HCO₃)₂, CaO, CH₆N₂O₂, C₂H₇N 및/또는 그의 혼합물의 첨가에 의해 제어될 수 있다. 이러한 알칼리 중화 작용제는 특히 발효 방법의 과정 중에 형성되는 유기 산이 카르복실산 또는 디카르복실산인 경우에 요구된다. 유기 산으로서 숙신산의 경우에, Mg(OH)₂ 및 MgCO₃이 특히 바람직한 염기이다.

본 발명에 따른 발효 단계 I)은, 예를 들어 교반된 발효기, 버블 칼럼 및 루프 반응기에서 수행될 수 있다. 교반기 유형 및 기하학적 설계를 포함하는 가능한 방법 유형의 포괄적인 개관은 문헌 [Chmiel: "Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik", Volume 1]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 이용가능한 전형적인 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 예를 들어, 문헌 [Chmiel, Hammes and Bailey: "Biochemical Engineering"]에서 설명된 하기 변형, 예컨대 바이오매스의 재활용을 포함하는 및 포함하지 않는, 배치식, 유가식, 반복 유가식 또는 연속식 발효이다. 생산 균주에 따라, 공기, 산소, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 적절한 기체 혼합물을 사용하는 살포가 우수한 수율 (YP/S)을 달성하기 위해 실시될 수 있다.

유기 산, 특히 숙신산을 방법 단계 I)에서 생산하기 위한 특히 바람직한 조건은 다음과 같다:

동화가능한 탄소 공급원: 글리세롤 + D-글루코스, 글리세롤 + 수크로스

온도: 30 내지 45℃

pH: 5.5 내지 8.0

공급 기체: CO₂

방법 단계 I)에서 동화가능한 탄소 공급원 (즉, 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물)이 적어도 0.75 g/g, 바람직하게는 적어도 0.85 g/g 및 가장 바람직하게는 적어도 1.0 g/g의 탄소 수율 YP/S (유기 산/탄소, 바람직하게는 숙신산/탄소)로 유기 산, 바람직하게는 숙신산으로 전환되는 것이 또한 바람직하다.

방법 단계 I)에서 동화가능한 탄소 공급원 (즉, 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물)이 적어도 0.6 g g DCW^-1h^-1 유기 산, 바람직하게는 숙신산, 또는 적어도 0.65 g g DCW^-1h^-1, 적어도 0.7 g g DCW^-1h^-1, 적어도 0.75 g g DCW^-1h^-1 또는 적어도 0.77 g g DCW^-1h^-1 유기 산, 바람직하게는 숙신산의 비생산성 수율로 유기 산, 바람직하게는 숙신산으로 전환되는 것이 또한 바람직하다.

방법 단계 I)에서 동화가능한 탄소 공급원 (즉, 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물)이 유기 산, 바람직하게는 숙신산에 대해 적어도 2.2 g/(Lxh) 또는 적어도 2.5 g/(Lxh), 적어도 2.75 g/(Lxh), 적어도 3 g/(Lxh), 적어도 3.25 g/(Lxh), 적어도 3.5 g/(Lxh), 적어도 3.7 g/(Lxh), 적어도 4.0 g/(Lxh), 적어도 4.5 g/(Lxh) 또는 적어도 5.0 g/(Lxh)의 유기 산, 바람직하게는 숙신산 공간 시간 수율로 유기 산, 바람직하게는 숙신산으로 전환되는 것이 또한 바람직하다. 본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면 방법 단계 I)에서 미생물은 적어도 20 g/L, 보다 바람직하게는 적어도 25 g/l 및 보다 더 바람직하게는 적어도 30 g/l의 동화가능한 탄소 공급원 (즉, 글리세롤 및 적어도 하나의 추가의 탄소질 화합물의 합)을 적어도 20 g/l, 보다 바람직하게는 적어도 25 g/l 및 보다 더 바람직하게는 적어도 30 g/l의 유기 산, 바람직하게는 숙신산으로 전환시킨다.

본원에 기재된 여러 수율 파라미터 ("탄소 수율" 또는 "YP/S"; "비생산성 수율"; 또는 "공간-시간-수율 (STY)")는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Song and Lee, 2006]에 의해 기재된 바와 같이 결정된다. "탄소 수율" 및 "YP/S" (각각은 생산된 유기 산의 질량/소모된 동화가능한 탄소 공급원의 질량으로 표현됨)는 본원에서 동의어로서 사용된다. 비생산성 수율은 h 당 생산되는 숙신산과 같은 생성물의 양 및 건조 바이오매스 g 당 발효 브로쓰 L을 기재한다. DCW로서 언급되는 건조 세포 중량은 생화학적 반응에서의 생물학적 활성 미생물의 양을 기재한다. 값은 h 당 DCW g 당 생성물 g으로서 주어진다 (즉, g g DCW^-1h^-1). 공간-시간-수율 (STY)은 전체 배양 시간에 걸쳐, 배양물의 부피에 대한 발효 방법에서 형성된 유기 산의 총량의 비로서 규정된다. 공간-시간 수율은 또한 "부피 생산성"으로서 공지된다.

방법 단계 II)에서 유기 산, 바람직하게는 숙신산 또는 그의 염은 방법 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 회수된다.

통상적으로, 회수 방법은 미생물을 "바이오매스"로도 불리는 발효 브로쓰로부터 분리하는 단계를 포함한다. 바이오매스를 분리하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 여과, 침강, 부유 또는 그의 조합을 포함한다. 따라서, 바이오매스는, 예를 들어 원심분리, 분리기, 디켄터, 필터로 또는 부유 장치에서 분리될 수 있다. 가치있는 생성물의 최대 회수를 위해, 바이오매스의 세척은 종종, 예를 들어 투석여과의 형태로 종종 권장될 수 있다. 방법의 선택은 발효 브로쓰 중 바이오매스 함량 및 바이오매스의 특성, 및 또한 바이오매스와 유기 산 (즉, 가치있는 생성물)의 상호작용에 좌우된다. 한 실시양태에서, 발효 브로쓰는 멸균되거나 저온살균될 수 있다. 추가 실시양태에서, 발효 브로쓰는 농축된다. 요구사항에 따라, 이 농축은 배치식 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 압력 및 온도 범위는 첫째로 어떠한 생성물 손상도 발생시키지 않고, 둘째로 장치 및 에너지의 최소 사용이 요구되도록 선택되어야 한다. 다단계 증발을 위한 압력 및 온도 수준의 숙련된 선택은 특히 에너지 절약을 가능하게 한다.

회수 방법은 유기 산, 바람직하게는 숙신산이 추가로 정제되는 추가의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 유기 산이 하기에 기재된 바와 같은 화학 반응에 의해 2차 유기 생성물로 전환되는 경우, 반응의 종류 및 반응 조건에 따라 유기 산의 추가 정제가 반드시 요구되는 것은 아니다. 방법 단계 II)에서 수득된 유기 산의 정제, 바람직하게는 숙신산의 정제를 위해, 예를 들어, 결정화, 여과, 전기투석 및 크로마토그래피 방법과 같은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유기 산으로서 숙신산의 경우, 숙신산은 침전물의 중화 및 여과를 위해 칼슘 히드록시드, -옥시드, -카르보네이트 또는 히드로겐 카르보네이트를 사용하여 이를 칼슘 숙시네이트 생성물로서 침전시킴으로써 단리될 수 있다. 숙신산은 황산을 사용한 산성화에 이어서 침전하는 황산칼슘 (석고)을 제거하기 위한 여과에 의해 침전된 칼슘 숙시네이트로부터 회수된다. 생성된 용액은 원치 않는 잔류 이온을 제거하기 위해 이온 교환 크로마토그래피의 수단에 의해 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 수산화마그네슘, 탄산마그네슘 또는 그의 혼합물이 발효 브로쓰를 중화시키는데 사용되는 경우, 방법 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰는 배지에 함유된 마그네슘 숙시네이트를 산 형태 (즉, 숙신산)로 변형시키기 위해 산성화되고, 이는 후속적으로 산성화된 배지를 냉각시킴으로써 결정화될 수 있다. 추가의 적합한 정제 방법의 예는 EP-A-1 005 562, WO-A-2008/010373, WO-A-2011/082378, WO-A-2011/043443, WO-A-2005/030973, WO-A-2011/123268 및 WO-A-2011/064151 및 EP-A-2 360 137에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에 따르면 방법은 방법 단계:

III) 방법 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰에 함유된 유기 산 또는 방법 단계 II)에서 수득된 회수된 유기 산을, 적어도 하나의 화학 반응에 의해 유기 산과는 상이한 2차 유기 생성물로 전환시키는 단계

를 추가로 포함한다.

유기 산으로서 숙신산의 경우에 바람직한 2차 유기 생성물은 숙신산 에스테르 및 그의 중합체, 테트라히드로푸란 (THF), 1,4-부탄디올 (BDO), 감마-부티로락톤 (GBL) 및 피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

THF, BDO 및/또는 GBL의 생산을 위한 바람직한 실시양태에 따르면 이 방법은 다음을 포함한다:

b1) 방법 단계 I) 또는 II)에서 수득된 숙신산의 THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL로의 직접 촉매 수소화 또는

b2) 방법 단계 I) 또는 II)에서 수득된 숙신산 및/또는 숙신산 염의 그의 상응하는 디-저급 알킬 에스테르로의 화학적 에스테르화 및 상기 에스테르의 THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL로의 후속 촉매 수소화.

피롤리돈의 생산을 위한 바람직한 실시양태에 따르면 이 방법은 다음을 포함한다:

b) 그 자체로 공지된 방식으로의 방법 단계 I) 또는 II)에서 수득된 숙신산 암모늄 염의 피롤리돈으로의 화학적 전환.

이러한 화합물을 제조하는 것의 세부사항을 위한 참조는 US-A-2010/0159543 및 WO-A-2010/092155에 대해 이루어진다.

본 발명은 이제 도면 및 비-제한적 실시예의 도움에 의해 더욱 상세히 설명된다.

도 1은 플라스미드 pSacB (서열식별번호: 9)의 개략적 지도를 보여준다.
도 2는 플라스미드 pSacB ΔldhA (서열식별번호: 10)의 개략적 지도를 보여준다.
도 3은 플라스미드 pSacB ΔpflA (서열식별번호: 11)의 개략적 지도를 보여준다.
도 4는 플라스미드 pSacB ΔpflD (서열식별번호: 12)의 개략적 지도를 보여준다.

실시예

실시예 1: 바스피아 숙시니시프로두센스의 형질전환을 위한 일반적 방법

표 1: 실시예에서 언급된 DD1-야생형 및 돌연변이체의 명명법

바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 (야생형)을 하기 프로토콜을 사용하여 전기천공에 의해 DNA로 형질전환시켰다:

예비-배양물 제조하기 위해 DD1을 동결 스톡으로부터 100 ml 진탕 플라스크 내의 40 ml BHI (뇌심장즙; 벡톤, 디킨슨 앤드 캄파니 (Becton, Dickinson and Company))에 접종하였다. 인큐베이션을 37℃; 200 rpm에서 밤새 수행하였다. 주-배양물을 제조하기 위해 100 ml BHI를 250 ml 진탕 플라스크에 넣고, 예비-배양물로 0.2의 최종 OD (600 nm)로 접종하였다. 인큐베이션을 37℃, 200 rpm에서 수행하였다. 세포를 대략 0.5, 0.6 및 0.7의 OD에서 수거하고, 펠릿을 10% 차가운 글리세롤로 4℃에서 1회 세척하고, 2 ml 10% 글리세롤 (4℃) 중에 재현탁시켰다.

100 μl의 적격 세포를 2-8 μg 플라스미드-DNA와 혼합하고, 0.2 cm의 폭을 갖는 전기천공 큐벳에서 2분 동안 얼음 상에 두었다. 하기 조건 하의 전기천공: 400 Ω; 25 μF; 2.5 kV (진 펄서(Gene Pulser), 바이오-라드(Bio-Rad)). 1 ml의 냉각된 BHI를 전기천공 직후에 첨가하고, 인큐베이션을 37℃에서 대략 2시간 동안 수행하였다.

세포를 5 mg/L 클로람페니콜을 포함하는 BHI 상에 플레이팅하고, 형질전환체의 콜로니가 보일 때까지 37℃에서 2-5일 동안 인큐베이션하였다. 클론을 단리하고, 순수한 클론을 수득할 때까지 5 mg/l 클로람페니콜을 포함하는 BHI 상에 재스트리킹하였다.

실시예 2: 결실/돌연변이 구축물의 생성

결실 구축물의 생성:

결실 플라스미드를 벡터 pSacB (서열식별번호: 9)에 기초하여 구축하였다. 도 1은 플라스미드 pSacB의 개략적 지도를 보여준다. 결실되어야 할 염색체 단편의 5'- 및 3'- 플랭킹 영역 (각각 대략 1500 bp)을 바스피아 숙시니시프로두센스의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 표준 기술을 사용하여 상기 벡터에 도입하였다. 보통, ORF의 적어도 80 %를 결실을 위해 표적화하였다. 이러한 방식으로, 락테이트 데히드로게나제 ldhA, pSacB_델타_ldhA (서열식별번호: 10), 피루베이트 포르메이트 리아제 활성화 효소 pflA, pSacB_델타_pflA (서열식별번호: 11) 및 피루베이트 포르메이트 리아제 pflD , pSacB_델타_ pflD (서열식별번호: 12)에 대한 결실 플라스미드를 구축하였다. 도 2, 3 및 4는 각각 플라스미드 pSacB_델타_ldhA, pSacB_델타_pflA 및 pSacB_델타_pflD의 개략적 지도를 보여준다.

pSacB의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 9)에서 sacB-유전자는 염기 2380-3801로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 3802-4264로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 526-984로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 1477-2337로부터 함유된다 (도 1 참조).

pSacB_델타_ldhA의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 10)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동인 ldhA 유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1519-2850으로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동인 ldhA-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 62-1518로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5169-6590으로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 6591-7053으로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3315-3773으로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4266-5126으로부터 함유된다 (도 2 참조).

pSacB_델타_pflA의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 11)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동인 pflA-유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1506-3005로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동인 pflA-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 6-1505로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5278-6699로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 6700-7162로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3424-3882로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4375-5235로부터 함유된다 (도 3 참조).

pSacB_델타_pflD의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 12)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동인 pflD-유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1533-2955로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동인 pflD-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 62-1532로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5256-6677로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 6678-7140으로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3402-3860으로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4353-5213으로부터 함유된다 (도 4 참조).

실시예 3: 개선된 숙시네이트 생산 균주의 생성

결실 돌연변이체의 생성:

a) 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1을 상기 기재된 바와 같이 pSacB_델타_ldhA 및 "캠벨드 인(Campbelled in)"으로 형질전환시켜 "캠벨 인(Campbell in)" 균주를 수득하였다. 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈 내로의 형질전환 및 통합은 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈 내로의 플라스미드의 통합 사건에 대한 밴드를 생성한 PCR에 의해 확인하였다.

이어서, "캠벨 인" 균주를 역 선택 배지로서 수크로스를 함유하는 한천 플레이트를 사용하여 "캠벨드 아웃(Campbelled out)"하여, sacB -유전자의 (기능의) 손실에 대해 선택하였다. 따라서, "캠벨 인" 균주를 37℃, 220 rpm에서 밤새 25-35 ml의 비 선택 배지 (항생제를 함유하지 않는 BHI) 중에 인큐베이션하였다. 이어서, 밤샘 배양물을 새로 제조된 수크로스 함유 BHI 플레이트 (10%, 항생제 무함유) 상에 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다 ("제1 수크로스 수송"). 제1 수송으로부터 수득된 단일 콜로니를 다시 새로 제조된 수크로스 함유 BHI 플레이트 (10%) 상에 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다 ("제2 수크로스 수송"). 이 절차를 수크로스 중 5회 수송 ("제3, 제4, 제5 수크로스 수송")의 최소 완료까지 반복하였다. 용어 "제1 내지 제5 수크로스 수송"은 sacB-유전자 및 주변 플라스미드 서열의 손실을 갖는 균주를 선택하기 위한 목적을 위해 수크로스 및 성장 배지 함유 한천 플레이트 상으로의 sacB-레반-수크라제 유전자를 함유하는 벡터의 염색체 통합 후의 균주의 수송을 지칭한다. 제5 수송 플레이트로부터의 단일 콜로니를 25-35 ml의 비 선택 배지 (항생제를 함유하지 않는 BHI)에 접종하고, 37℃, 220 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤샘 배양물을 연속 희석시키고 BHI 플레이트 상에 플레이팅하여, 단리된 단일 콜로니를 수득하였다.

ldhA-유전자좌의 야생형 환경 또는 ldhA-유전자의 돌연변이/결실을 함유하는 "캠벨드 아웃" 균주를 클로람페니콜 감수성에 의해 확인하였다. 이 균주 사이의 돌연변이/결실 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 ldhA-결실 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA가 생성되었다.

b) 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA를 상기 기재된 바와 같이 pSacB_델타_pflA로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 형질전환 및 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 이전에 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"하였다. 이 균주 사이의 결실 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 ldhA pflD-이중 결실 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflA가 생성되었다.

c) 바스피아 숙시니시프로두센스 ΔldhA를 상기 기재된 바와 같이 pSacB_델타_pflD로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 형질전환 및 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 이전에 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"하였다. 이 균주 사이의 결실 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 ldhA pflD-이중 결실 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflD가 생성되었다.

실시예 4: DD1 ΔldhA ΔpflA에 대한 글루코스 또는 글리세롤 소모율의 결정

1. 배지 제조

시드 배양물에 사용된 배양 배지의 조성은 표 1에 기재된다. 본배양물 발효를 위해, 사용된 배지는 표 2에 기재된다.

표 1: 시드 배양물의 배양을 위한 배지 조성

표 2: 본배양물의 배양을 위한 배지 조성

2. 배양 및 분석

본배양물을 1회의 시드 배양 단계 후에 접종하였다. 시드 배양을 위해, 표 1에 기재된 배지를 2L 병에서 물, MgCO₃ 및 Na₂CO₃를 오토클레이빙함으로써 제조하였다. 다른 성분은 제조하여, 멸균 분리하고, 그 후 멸균 방식으로 병에 첨가하였다. 1%의 동결 스톡을 상기 기재된 액체 배지 1800 mL를 함유하는 2L 병에 접종하였다. CO₂ 분위기를 병에 적용하였다. 배지의 시작 pH는 MgCO₃의 존재 및 CO₂ 분위기로 인해 7.5 내지 8.0의 범위였다. 인큐베이션을 12시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃, 170 rpm에서 수행하였다 (진탕 직경: 2.5 cm). 배양은 21의 OD_600nm에 도달하였다.

상기 기재된 시드 배양물의 총 5%를 본배양물을 접종하는데 사용하였다. 본배양을 표 2에 기재된 액체 배지 500 mL의 초기 부피를 함유하는 1L-발효기에서 수행하였다. 배지를 발효기에서 물, Na₂CO₃ 및 소포제를 오토클레이빙함으로써 제조하였다. 다른 성분은 제조하여, 용액으로 분리하고, 그 후 멸균 방식으로 발효기에 첨가하였다. 글루코스를, 숙신산 생산 균주에 의한 그의 소모율을 결정하기 위해 이러한 발효에 탄소 공급원으로서 사용하였다. 45 g/L의 글루코스를 배지 중에 배칭하고, 또한 2 g/L/h의 비율로 첨가되는 공급에 의해 발효에 제공하였다. 공급은 발효 시작 4시간 후에 시작하였다. 글루코스는 전체 발효 시간 동안 과량이었고, 이를 다음 섹션에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 측정하였다 (과량의 글루코스는 발효 중 검출가능한 글루코스 농도가 항상 1 g/L 초과라는 사실에 의해 확인됨). pH 6.5를 발효 동안 일정하게 유지하였고, 이를 수산화마그네슘 15 중량-%의 첨가에 의해 제어하였다. CO₂를 발효기에 0.1 vvm의 유량으로 적용하였고, 스티어링 속도는 500 rpm이었다. 시드 배양물 및 본배양물의 분석은 다음 섹션에 기재된다.

3. 분석

카르복실산의 생산을 HPLC를 통해 정량화하였다. 적용된 HPLC 방법에 관한 세부사항은 표 3 및 4에 기재된다. 세포 성장을 분광광도계 (울트로스펙(Ultrospec)3000, 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences), 스웨덴 웁살라)를 사용하여 600 nm에서의 흡광도 (OD_600nm)를 측정함으로써 측정하였다.

표 3: 글리세롤, 글루코스 및 숙신산의 분석을 위한 HPLC 방법 (ZX-THF50)

4. 결과

글루코스 소모율을 계산하기 위해, 배칭된 글루코스로 발효를 수행하였다. 이 발효에서, 글루코스는 시간 경과에 따른 글루코스 소모율의 계산을 허용하도록 과량이었다. 글루코스의 농도를 발효 동안 HPLC에 의해 오프라인으로 확인하였고, 글루코스는 항상 배지에서 검출되었다. 측정값은 글루코스가 배지 중에 항상 과량이었음을 확인시켜 주었다. 이 실험에서 45 g/L의 글루코스를 배칭하고, 2 g/L/h의 공급률을 4시간 후에 적용하였다.

표 5: 상기 기재된 바스피아 DD1 ΔldhA ΔpflD에 의한 숙신산 발효의 상이한 시간 간격에 대한 글루코스 소모율

소모율을 계산하기 위해, 특정 시간 간격에서 소모된 글루코스의 양을 결정하였다.

실시예 5: 제한 또는 비제한된 글루코스와 함께 글리세롤을 사용하는, DD1 ΔldhA ΔpflA에 의한 발효의 비교

5. 배지 제조

시드 배양 및 본배양에 사용되는 배양 배지의 조성은 이전 섹션 (실시예 4)에 기재된다.

6. 배양 및 분석

본배양물을 하나의 시드 배양물로 이루어진 시드 트레인으로부터 접종하였다. 시드 배양을 위해 1%의 동결 스톡을 CO₂ 분위기 하에 표 1에 기재된 액체 배지 1800 ml를 함유하는 2L 병에 접종하였다. 배지의 시작 pH는 MgCO₃의 존재 및 CO₂ 분위기로 인해 7.5 내지 8.0의 범위였다. 인큐베이션은 12시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃ 및 170 rpm (진탕 직경: 2.5 cm)에서 밤새 진행하였다 (21의 OD_600nm).

시드 배양물의 총 5%를 표 2에 기재된 액체 배지 500 mL의 초기 부피를 함유하는 1L-발효기에서 본배양물을 접종하는데 사용하였다. 글리세롤 및 글루코스는 탄소 공급원이었다. 54 g/L의 글리세롤 및 8 g/L의 글루코스를 발효 시작 전에 배치식으로 제공하였다. 글리세롤을 전체 발효 동안 과량으로 유지하였고, 글루코스는 세포에 제한 또는 비-제한된 양의 글루코스를 공급하는 비율로 공급하였다. 공급은, 공급률이 이전에 결정되었던 글루코스의 소모율보다 낮은 경우 제한적인 것으로 간주된다. 공급은 발효 4시간 후에 시작하였고, 글루코스의 공급률은 2.5 g/L/h (비제한적) 또는 0.25 g/L/h (제한적)이었다. 사용된 염기는 수산화마그네슘 15 중량-%였다. CO₂를 발효기에 0.1 vvm의 유량으로 적용하고, 스티어링 속도는 500 rpm이었다. 시드 배양물 및 본배양물의 분석을 이전 섹션에 기재된 바와 같이 수행하였다 (표 3). 글루코스의 농도를 발효 동안 HPLC에 의해 오프라인으로 확인하였고, 글루코스는 2.5 g/L/h로 공급되는 경우 항상 배지에서 검출되었다. 글루코스의 제한적 공급이 적용된 경우 (0.25 g/L/h), 당은 특정 시간 간격 동안 배양 상청액에서 검출되지 않았다.

7. 결과

7a. 글루코스 소모율의 결정

이 실험에서 8 g/L의 글루코스 및 54 g/L의 글리세롤을 발효 시작 전에 배칭하였고, 글루코스의 2.5 g/L/h의 공급률을 발효 4시간 후에 적용하였다. 글루코스 소모율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 계산하였고, 이 특정한 실험 설정에서 각 시간 간격에 대한 결과는 표 6에 기재된다. 이 실험에서 발효에서 검출가능한 글루코스 농도는 항상 1 g/L 초과였다. 따라서 표 6에 주어진 글루코스의 소모율은 주어진 배양 조건 하에 "추가의 탄소질 화합물에 대한 최대 이론적 소모율 CR_c _{.c. max}"을 나타낸다.

표 6: 비. 숙시니시프로두센스(B. succiniciproducens) DD1 ΔldhA ΔpflD에 의한 숙신산 발효의 상이한 시간 간격에 대한 글루코스 소모율

7b. 비. 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflD에 의한 발효의 숙신산 역가 및 공간 시간 수율에서의 글루코스의 제한적 및 비제한적 공급 사이의 비교

상기 기재된 글루코스 소모율의 결정 후, 글루코스의 제한적 또는 비제한적 공급을 발효에 적용하였다. 제한 및 비제한된 글루코스 농도를 제공하기 위한 여러 공급률은 표 7에 제시된다. 숙신산 역가 및 공간 시간 수율이 또한 표 7에 제시된다.

표 7: 숙신산의 생산에서의 글루코스의 제한적 및 비제한적 공급 사이의 비교

글루코스를 0.25 g/L/h (제한적 공급)의 비율로 공급하는 경우, 발효에서의 글루코스 농도는 항상 검출 한계 미만이었다.

결과는 글루코스가 제한적 방식으로 첨가될 때 생산된 숙신산의 역가에서의 증가 및 보다 높은 공간 시간 수율을 보여준다.

실시예 6: 비. 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflD에 의한 발효에서의 글루코스의 상이한 제한적 공급 사이의 비교

8. 배지 제조

시드 배양 및 본배양에 사용되는 배양 배지의 조성은 섹션 1 (실시예 4)에 기재된다.

9. 배양 및 분석

시드 배양물의 총 5%를 표 2에 기재된 액체 배지 500 mL의 초기 부피를 함유하는 1L-발효기에서 본배양물을 접종하는데 사용하였다. 글리세롤 및 글루코스는 탄소 공급원이었다. 50 g/L의 글리세롤 및 8 g/L의 글루코스를 발효 시작 전에 배치식으로 제공하였다. 글리세롤을 전체 발효 동안 과량으로 유지하였고, 글루코스는 세포에 대해 제한된 양의 글루코스를 공급하는 비율로 공급하였다. 공급은, 공급률이 이전에 결정되었던 글루코스의 소모율보다 낮은 경우 제한적인 것으로 간주된다. 공급은 발효 4시간 후에 시작하였고, 글루코스의 공급률은 표 8에 기재된다. 사용된 염기는 수산화마그네슘 15 중량-%였다. CO₂를 발효기에 0.1 vvm의 유량으로 적용하고, 스티어링 속도는 500 rpm이었다. 시드 배양물 및 본배양물의 분석을 이전 섹션에 기재된 바와 같이 수행하였다 (표 3). 글루코스의 농도를 발효 동안 HPLC에 의해 오프라인으로 확인하였고, 글루코스는 특정 시간 간격 동안 배양 상청액에서 검출되지 않았다.

10. 결과

실시예 1에 기재된 바와 같이 글루코스 소모율을 계산한 후, 글루코스의 소모율보다 낮은 공급률로 발효 (제한적 공급)를 수행하였다. 글리세롤은 발효에서 과량이었다. 숙신산 역가 및 공간 시간 수율은 직접적으로 발효기 내로 공급된 글루코스의 양에 의해 영향을 받는다 (표 8). 표 8에 관찰된 결과는 글리세롤이 주요 탄소 공급원인 발효에서 숙신산의 양 및 공간 시간 수율이 제한된 양의 글루코스에 의해 개선된다는 것을 확인시켜준다. 글루코스의 공급률이 낮을수록, 숙신산 역가 및 공간 시간 수율은 높아진다.

표 8: 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflA에 의한 숙신산 발효의 역가 및 공간 시간 수율에 대한 과량의 글리세롤과 합해진 글루코스의 제한적 공급률의 영향.

실시예는 숙신산 발효를 위해 글리세롤을 주요 C-공급원으로서 사용하는 경우에 제한된 양의 글루코스가 유익하다는 것을 보여준다.

서열

서열식별번호: 1 (균주 DD1의 16 S rDNA의 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 2 (균주 DD1의 23 S rDNA의 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 3 (균주 DD1로부터의 ldhA-유전자의 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 4 (균주 DD1로부터의 LdhA의 아미노산 서열)

서열식별번호: 5 (균주 DD1로부터의 pflA-유전자의 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 6 (균주 DD1로부터의 PflA의 아미노산 서열)

서열식별번호: 7 (균주 DD1로부터의 pflD-유전자의 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 8 (균주 DD1로부터의 PflD의 아미노산)

서열식별번호: 9 (플라스미드 pSacB의 완전 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 10 (플라스미드 pSacB_델타_ldhA의 완전 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 11 (플라스미드 pSacB_델타_pflA의 완전 뉴클레오티드 서열)

서열식별번호: 12 (플라스미드 pSacB_델타_pflD의 완전 뉴클레오티드 서열)

SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> The use of glycerol with limited feed of carbohydrates for fermentation <130> 0000075743WO01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1517 <212> DNA <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1517) <223> 16 S rDNA of strain DD1 <400> 1 tttgatcctg gctcagattg aacgctggcg gcaggcttaa cacatgcaag tcgaacggta 60 gcgggaggaa agcttgcttt ctttgccgac gagtggcgga cgggtgagta atgcttgggg 120 atctggctta tggaggggga taacgacggg aaactgtcgc taataccgcg taatatcttc 180 ggattaaagg gtgggacttt cgggccaccc gccataagat gagcccaagt gggattaggt 240 agttggtggg gtaaaggcct accaagccga cgatctctag ctggtctgag aggatgacca 300 gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360 cacaatgggg ggaaccctga tgcagccatg ccgcgtgaat gaagaaggcc ttcgggttgt 420 aaagttcttt cggtgacgag gaaggtgttt gttttaatag gacaagcaat tgacgttaat 480 cacagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcgagc 540 gttaatcgga ataactgggc gtaaagggca tgcaggcgga cttttaagtg agatgtgaaa 600 gccccgggct taacctggga attgcatttc agactgggag tctagagtac tttagggagg 660 ggtagaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaatac cgaaggcgaa 720 ggcagcccct tgggaagata ctgacgctca tatgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccacg cggtaaacgc tgtcgatttg gggattgggc tttaggcctg 840 gtgctcgtag ctaacgtgat aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact 900 caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg 960 cgaagaacct tacctactct tgacatccag agaatcctgt agagatacgg gagtgccttc 1020 gggagctctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt 1080 aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag catgtaaaga tgggaactca 1140 aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc 1200 ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggtgcataca gagggcggcg ataccgcgag 1260 gtagagcgaa tctcagaaag tgcatcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1320 gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcaaatca gaatgttgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380 tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgtacc agaagtagat agcttaacct 1440 tcgggggggg cgtttaccac ggtatgattc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtaac 1500 cgtaggggaa cctgcgg 1517 <210> 2 <211> 3008 <212> DNA <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3008) <223> 23 S rDNA of strain DD1 <400> 2 agtaataacg aacgacacag gtataagaat acttgaggtt gtatggttaa gtgactaagc 60 gtacaaggtg gatgccttgg caatcagagg cgaagaagga cgtgctaatc tgcgaaaagc 120 ttgggtgagt tgataagaag cgtctaaccc aagatatccg aatggggcaa cccagtagat 180 gaagaatcta ctatcaataa ccgaatccat aggttattga ggcaaaccgg gagaactgaa 240 acatctaagt accccgagga aaagaaatca accgagatta cgtcagtagc ggcgagcgaa 300 agcgtaagag ccggcaagtg atagcatgag gattagagga atcggctggg aagccgggcg 360 gcacagggtg atagccccgt acttgaaaat cattgtgtgg tactgagctt gcgagaagta 420 gggcgggaca cgagaaatcc tgtttgaaga aggggggacc atcctccaag gctaaatact 480 cctgattgac cgatagtgaa ccagtactgt gaaggaaagg cgaaaagaac cccggtgagg 540 ggagtgaaat agaacctgaa accttgtacg tacaagcagt gggagcccgc gagggtgact 600 gcgtaccttt tgtataatgg gtcagcgact tatattatgt agcgaggtta accgaatagg 660 ggagccgaag ggaaaccgag tcttaactgg gcgtcgagtt gcatgatata gacccgaaac 720 ccggtgatct agccatgggc aggttgaagg ttgggtaaca ctaactggag gaccgaaccg 780 actaatgttg aaaaattagc ggatgacctg tggctggggg tgaaaggcca atcaaaccgg 840 gagatagctg gttctccccg aaatctattt aggtagagcc ttatgtgaat accttcgggg 900 gtagagcact gtttcggcta gggggccatc ccggcttacc aacccgatgc aaactgcgaa 960 taccgaagag taatgcatag gagacacacg gcgggtgcta acgttcgtcg tggagaggga 1020 aacaacccag accgccagct aaggtcccaa agtttatatt aagtgggaaa cgaagtggga 1080 aggcttagac agctaggatg ttggcttaga agcagccatc atttaaagaa agcgtaatag 1140 ctcactagtc gagtcggcct gcgcggaaga tgtaacgggg ctcaaatata gcaccgaagc 1200 tgcggcatca ggcgtaagcc tgttgggtag gggagcgtcg tgtaagcgga agaaggtggt 1260 tcgagagggc tgctggacgt atcacgagtg cgaatgctga cataagtaac gataaaacgg 1320 gtgaaaaacc cgttcgccgg aagaccaagg gttcctgtcc aacgttaatc ggggcagggt 1380 gagtcggccc ctaaggcgag gctgaagagc gtagtcgatg ggaaacgggt taatattccc 1440 gtacttgtta taattgcgat gtggggacgg agtaggttag gttatcgacc tgttggaaaa 1500 ggtcgtttaa gttggtaggt ggagcgttta ggcaaatccg gacgcttatc aacaccgaga 1560 gatgatgacg aggcgctaag gtgccgaagt aaccgatacc acacttccag gaaaagccac 1620 taagcgtcag attataataa accgtactat aaaccgacac aggtggtcag gtagagaata 1680 ctcaggcgct tgagagaact cgggtgaagg aactaggcaa aatagcaccg taacttcggg 1740 agaaggtgcg ccggcgtaga ttgtagaggt atacccttga aggttgaacc ggtcgaagtg 1800 acccgctggc tgcaactgtt tattaaaaac acagcactct gcaaacacga aagtggacgt 1860 atagggtgtg atgcctgccc ggtgctggaa ggttaattga tggcgttatc gcaagagaag 1920 cgcctgatcg aagccccagt aaacggcggc cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaaa 1980 ttccttgtcg ggtaagttcc gacctgcacg aatggcataa tgatggccag gctgtctcca 2040 cccgagactc agtgaaattg aaatcgccgt gaagatgcgg tgtacccgcg gctagacgga 2100 aagaccccgt gaacctttac tatagcttga cactgaacct tgaattttga tgtgtaggat 2160 aggtgggagg ctttgaagcg gtaacgccag ttatcgtgga gccatccttg aaataccacc 2220 ctttaacgtt tgatgttcta acgaagtgcc cggaacgggt actcggacag tgtctggtgg 2280 gtagtttgac tggggcggtc tcctcccaaa gagtaacgga ggagcacgaa ggtttgctaa 2340 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aatgtgcttt ttaccggtca tcaggcgttt ttaacggaag aagcgctgaa taatatcgcc 960 gatgtgactt tatcgaatat tcaggcggtt tccaaaaatg caacgtgcga aaatagcgtt 1020 gaaggctaa 1029 <210> 4 <211> 342 <212> PRT <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of LdhA from strain DD1 <400> 4 Met Thr Lys Ser Val Cys Leu Asn Lys Glu Leu Thr Met Lys Val Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ser Thr Lys Asn Tyr Asp Arg Lys His Leu Asp Leu Ala Asn 20 25 30 Lys Lys Phe Asn Phe Glu Leu His Phe Phe Asp Phe Leu Leu Asp Glu 35 40 45 Gln Thr Ala Lys Met Ala Glu Gly Ala Asp Ala Val Cys Ile Phe Val 50 55 60 Asn Asp Asp Ala Ser Arg Pro Val Leu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly 65 70 75 80 Val Lys Ile Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn Asn Val Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Lys Val Val Arg Val Pro Ala Tyr 100 105 110 Ser Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Ile Gly Leu Met Leu Thr Leu 115 120 125 Asn Arg Arg Ile His Lys Ala Tyr Gln Arg Thr Arg Asp Ala Asn Phe 130 135 140 Ser Leu Glu Gly Leu Val Gly Phe 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succiniciproducens <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of PflA from strain DD1 <400> 6 Met Ser Val Leu Gly Arg Ile His Ser Phe Glu Thr Cys Gly Thr Val 1 5 10 15 Asp Gly Pro Gly Ile Arg Phe Ile Leu Phe Leu Gln Gly Cys Leu Met 20 25 30 Arg Cys Lys Tyr Cys His Asn Arg Asp Thr Trp Asp Leu His Gly Gly 35 40 45 Lys Glu Ile Ser Val Glu Glu Leu Met Lys Glu Val Val Thr Tyr Arg 50 55 60 His Phe Met Asn Ala Ser Gly Gly Gly Val Thr Ala Ser Gly Gly Glu 65 70 75 80 Ala Ile Leu Gln Ala Glu Phe Val Arg Asp Trp Phe Arg Ala Cys His 85 90 95 Lys Glu Gly Ile Asn Thr Cys Leu Asp Thr Asn Gly Phe Val Arg His 100 105 110 His Asp His Ile Ile Asp Glu Leu Ile Asp Asp Thr Asp Leu Val Leu 115 120 125 Leu Asp Leu Lys Glu Met Asn Glu Arg Val His Glu Ser Leu Ile Gly 130 135 140 Val Pro Asn Lys Arg Val Leu Glu Phe Ala Lys Tyr Leu Ala Asp Arg 145 150 155 160 Asn Gln Arg Thr Trp Ile Arg His Val Val Val Pro Gly Tyr Thr Asp 165 170 175 Ser Asp Glu Asp Leu His Met Leu Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met Lys 180 185 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atcgatgaga aaaatggtat gcaagtcggt 1380 cctaaaactg cgccgattac agacgaagta ttgaatttcg ataccgtaat cgaacgtatg 1440 gacagtttca tggactggtt ggcgactcaa tatgtaaccg cattgaacat catccacttc 1500 atgcacgata aatatgcata tgaagcggca ttgatggcgt tccacgatcg cgacgtattc 1560 cgtacaatgg cttgcggtat cgcgggtctt tccgtggctg cggactcatt atccgcaatc 1620 aaatatgcga aagttaaacc gattcgcggc gacatcaaag ataaagacgg taatgtcgtg 1680 gcctcgaatg ttgctatcga cttcgaaatt gaaggcgaat atccgcaatt cggtaacaat 1740 gatccgcgtg ttgatgattt agcggtagac ttagttgaac gtttcatgaa aaaagttcaa 1800 aaacacaaaa cttaccgcaa cgcaactccg acacaatcta tcctgactat cacttctaac 1860 gtggtatacg gtaagaaaac cggtaatact ccggacggtc gtcgagcagg cgcgccattc 1920 ggaccgggtg caaacccaat gcacggtcgt gaccaaaaag gtgcggttgc ttcacttact 1980 tctgtggcta aacttccgtt cgcttacgcg aaagacggta tttcatatac cttctctatc 2040 gtaccgaacg cattaggtaa agatgacgaa gcgcaaaaac gcaaccttgc cggtttaatg 2100 gacggttatt tccatcatga agcgacagtg gaaggcggtc aacacttgaa tgttaacgtt 2160 cttaaccgtg aaatgttgtt agacgcgatg gaaaatccgg aaaaataccc gcaattaacc 2220 attcgtgttt caggttacgc ggttcgtttc aactcattaa ctaaagagca acaacaagac 2280 gtcatcactc gtacgtttac acaatcaatg taa 2313 <210> 8 <211> 770 <212> PRT <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid of PflD from strain DD1 <400> 8 Met Ala Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Lys Ala Trp Glu Gly Phe Val 1 5 10 15 Pro Gly Glu Trp Gln Asn Gly Val Asn Leu Arg Asp Phe Ile Gln Lys 20 25 30 Asn Tyr Thr Pro Tyr Glu Gly Asp Glu Ser Phe Leu Ala Asp Ala Thr 35 40 45 Pro Ala Thr Ser Glu Leu Trp Asn Ser Val Met Glu Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Glu Asn Lys Thr His Ala Pro Leu Asp Phe Asp Glu His Thr Pro Ser 65 70 75 80 Thr Ile Thr Ser His Lys Pro Gly Tyr Ile Asn Lys Asp Leu Glu Lys 85 90 95 Ile Val Gly Leu Gln Thr Asp Ala Pro Leu Lys Arg Ala Ile Met Pro 100 105 110 Tyr Gly Gly Ile Lys Met Ile Lys Gly Ser Cys Glu Val Tyr Gly Arg 115 120 125 Lys Leu Asp Pro Gln Val Glu Phe Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr 130 135 140 His Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Pro 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cgatttaaat c 7161

Claims

방법 단계
I) 미생물을 동화가능한 탄소 공급원으로서 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물이 공급되는 배양 배지에서 배양하여, 미생물이 유기 산을 생산하도록 하고, 그에 따라 유기 산을 포함하는 발효 브로쓰를 수득하는 단계;
II) 방법 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 유기 산 또는 그의 염을 회수하는 단계
를 포함하며, 여기서 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_c _{.c. max}; 시간 당 리터 당 g)보다 낮은 것인, 유기 산을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 적어도 30분의 배양 기간 동안 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_{c.c. max}; 시간 당 리터 당 g)보다 낮은 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 추가의 탄소질 화합물의 소모율 (CR_c _.c.; 시간 당 리터 당 g)이 추가의 탄소질 화합물의 최대 이론적 소모율 (CR_c _{.c. max}; 시간 당 리터 당 g)의 50 % 이하인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 방법 단계 I)에서 글리세롤 및 추가의 탄소질 화합물이 적어도 5 : 1의 글리세롤 : 추가의 탄소질 화합물 총 중량 비로 배양 배지 내로 공급되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 산이 숙신산인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 탄소질 화합물이 탄수화물인 방법.
제6항에 있어서, 탄수화물이 수크로스, D-글루코스 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 방법 단계 I)에 사용되는 미생물이 변형된 미생물인 방법.
제8항에 있어서, 변형된 미생물이 유래된 야생형이 파스테우렐라세아에(Pasteurellaceae) 과에 속하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 변형된 미생물이 유래된 야생형이 바스피아(Basfia) 속에 속하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 방법 단계 I)에 사용되는 미생물이 바스피아 숙시니시프로두센스(Basfia succiniciproducens) 종에 속하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 변형된 미생물이 유래된 야생형이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 1과 적어도 96 %의 서열 상동성을 나타내는 서열의 16S rDNA를 갖는 것인 방법.
제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 미생물이 그의 야생형과 비교하여
i) 감소된 피루베이트 포르메이트 리아제 활성,
ii) 감소된 락테이트 데히드로게나제 활성, 또는
iii) 감소된 피루베이트 포르메이트 리아제 활성 및 감소된 락테이트 데히드로게나제 활성
을 갖는 것인 방법.
제13항에 따른 변형된 미생물이며, 여기서 미생물이
A) ldhA -유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA -유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 ldhA -유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;
B) pflD -유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflD -유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD -유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;
C) pflA -유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflA -유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflA -유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;
D) ldhA -유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA -유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 ldhA -유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입
및
pflD -유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflD -유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD -유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입;
또는
E) ldhA -유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA -유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 ldhA -유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입
및
pflA -유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflA -유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflA -유전자 내로의 적어도 하나의 돌연변이의 도입
을 포함하는 것인 변형된 미생물.
제1항 내지 제13항에 있어서, 방법 단계
III) 방법 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰에 함유된 유기 산 또는 방법 단계 II)에서 수득된 회수된 유기 산을, 적어도 하나의 화학 반응에 의해 유기 산과는 상이한 2차 유기 생성물로 전환시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 유기 산이 숙신산이고, 2차 유기 생성물이 숙신산 에스테르 또는 그의 중합체, 테트라히드로푸란 (THF), 1,4-부탄디올 (BDO), 감마-부티로락톤 (GBL) 및 피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.