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KR20160129967A - 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 선별방법 - Google Patents

멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 선별방법 Download PDF

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KR20160129967A
KR20160129967A KR1020150061348A KR20150061348A KR20160129967A KR 20160129967 A KR20160129967 A KR 20160129967A KR 1020150061348 A KR1020150061348 A KR 1020150061348A KR 20150061348 A KR20150061348 A KR 20150061348A KR 20160129967 A KR20160129967 A KR 20160129967A
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seq
primer
virus
melon
discriminating
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박종인
한정숙현
정희정
양기웅
황인덕
김영욱
우딘 아메드 나잘
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순천대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 멜론 괴저반점 바이러스(melon necrotic spot virus, MNSV) 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 판별방법에 관한 것으로, 본 발명의 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 멜론 괴저반점 바이러스에 대해 저항성을 나타내는 멜론 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 괴저반점 바이러스 저항성 멜론 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 멜론 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 선별방법{Primer set for selecting necrotic spot virus resistant and or susceptible melon cultivar and selection method by using same}
본 발명은 멜론 괴저반점 바이러스(melon necrotic spot virus, MNSV) 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 선별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성을 판별할 수 있는 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이, 상기 프라이머 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 멜론 괴저반점 바이러스에 대한 저항성을 가지는 품종을 선별하기 위한 키트 및 이를 이용한 선별방법에 관한 것이다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 효소면역진단법(Enzyme-linked immunosorbent assay; 이하 'ELISA'이라 한다)은 가장 일반적으로 사용하여온 진단방법이나 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.
MNSV(melon necrotic spot virus, 멜론 괴저반점)는 자연상태에서 박과 작물에 발생하고 있으며, 종자와 토양을 통하여 전염된다. MNSV는 검역대상 병원체로서 수입되는 박과 작물 종자에서 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 MNSV를 진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단 하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 MNSV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1000배 정도 높은 PCR 진단법이 필요하다. 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 됨으로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. PCR 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 PCR양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다. 한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
현재 RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용되고 있다. 병원체의 PCR 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 가장 중요하다. MNSV의 경우 프라이머, VP51-1과 VP 51-2가 공개된 종래기술(Gosalvez, B., Navarro, J. A., Lorca, A., Botella, F., Sanchez-Pina, M. A., and Pallas, V. 2003. Detection of Melon necrotic spot virus in water samples and melon plants by molecular methods. Journal of Virological Methods 113: 87-93)이 있으나, 상기 프라이머, VP 51-1과 VP 51-2는 종 공통서열이 아님으로 MNSV 전체 분리주를 진단하기는 부적합하다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머를 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프로브를 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또다른 기술적 과제는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또다른 기술적 과제는 괴저반점에 대한 저항성을 가지는 멜론 품종을 선별하기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또다른 기술적 과제는 괴저반점에 대한 저항성을 가지는 멜론 품종을 선별하기 위한 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 멜론 괴저반점에 대해 저항성을 갖는 멜론 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
바람직하게, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계와; 상기 PCR 증폭산물에 대하여 HRM 분석함으로써 멜론 괴저반점 바이러스에 대해 저항성을 가지는 멜론 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따른 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트의 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
서열명 염기서열 서열번호
mnsv-N-F1 CGT TCA ATA GTT AAT GAT TCG 서열번호 1
mnsv-N-R1 TCA GTT GAG GTT CGA GCA GTT 서열번호 2
상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시하고 수득된 PCR 증폭산물을 HRM(high resolution melting) 분석함으로써 멜론 괴저반점 바이러스에 대한 저항성 및 이병성을 판별할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질 (intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소 (예를 들어, P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 비오틴 (biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체 (hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프로브를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다. "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가 (microtiter) 플레이트, 막 (예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구 (비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링 (homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐 (hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계와; 상기 PCR 증폭산물에 대하여 HRM 분석함으로써 멜론 괴저반점 바이러스 저항성을 판단하는 단계를 포함하는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 HRM(high resolution melting) 분석은 한 개의 염기 서열 차이에 의하여 달라지는 용융(melting) 온도를 구분해 줌으로써 염기서열 분석 없이 DNA 조각의 염기서열 차이를 보여줄 수 있는 분석방법으로서, 이러한 HRM 분석 결과는 두 DNA 샘플 간 용해 곡선(melting curve)에 있어 차이를 보여줌으로써 다형성 프라이머로 사용될 수 있음을 보여준다.
이와 같이, 본 발명의 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 멜론 괴저반점 바이러스에 대해 저항성을 나타내는 멜론 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 괴저반점 바이러스 저항성 멜론 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 멜론 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 HRM (high resolution melting) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 프라이머 설계
하기 표 2에 나타낸 바와 같은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 멜론 괴저반점 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머를 합성하였다.
서열명 염기서열 서열번호
mnsv-N-F1 CGT TCA ATA GTT AAT GAT TCG 서열번호 1
mnsv-N-R1 TCA GTT GAG GTT CGA GCA GTT 서열번호 2
<실시예 2> 멜론 괴저반점 저항성 및 이병성 판별
멜론 괴저반점 저항성 및 이병성의 게놈 DNA 5㎍에 상기 실시예 1에서 설계한 멜론 괴저반점 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트(5pM), 25mM MgCl2 및 2 X 반응용액(High resolution melting master mix®)을 각각 넣고 최종 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 다음 Lightcycler(Lightcycler 480® Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)를 사용하여 하기 표 3에 나타낸 조건으로 HRM (high resolution melting) 분석을 수행하였다.
Target(℃) Acquisution mode Hold(hh:mm:ss)
95 None 0:10:00 1Cycles
Amplification
95 None 0:00:10 45Cycles
58 Single 0:00:15
72 None 0:00:15
Melting Curve
95 None 0:01:00 1Cycles
40 None 0:02:00
95 Continuous(5R/℃) 0:00:01
도 1은 본 발명의 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 HRM 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1에서 보듯이, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 HRM 분석한 결과, Homo type(저항성(RR) 및 이병성(SS)) 및 Hetero type(이병성(RS)) 간에 melting curve 및 melting peak에 있어 차이를 나타내었다. 이로부터 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 멜론 괴저반점 저항성 및 이병성 품종을 선별할 수 있음을 알 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 멜론 괴저반점 바이러스에 대해 저항성을 나타내는 멜론 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 괴저반점 바이러스 저항성 멜론 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 멜론 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
<110> Industry-academic cooperation foundation of sunchon national university <120> Primer set for selecting necrotic spot virus resistant and or susceptible melon cultivar and selection method by using same <130> PA-14-0216 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mnsv-N-F1 <400> 1 cgttcaatag ttaatgattc g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mnsv-N-R1 <400> 2 tcagttgagg ttcgagcagt t 21

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 멜론 괴저반점 바이러스(melon necrotic spot virus, MNSV) 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머.
  2. 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프로브.
  3. 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 마이크로어레이.
  4. 제 1 항에 따른 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 멜론 괴저반점에 대해 저항성을 갖는 멜론 품종을 선별하기 위한 키트.
  5. 제 1 항에 따른 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계와; 상기 PCR 증폭산물에 대하여 HRM 분석함으로써 멜론 괴저반점 바이러스에 대해 저항성을 가지는 멜론 품종을 선별하는 방법.
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