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KR20160113177A - 고온 핵산 합성에서 이용하기 위한 신규한 역전사효소 - Google Patents

고온 핵산 합성에서 이용하기 위한 신규한 역전사효소 Download PDF

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KR20160113177A
KR20160113177A KR1020167022831A KR20167022831A KR20160113177A KR 20160113177 A KR20160113177 A KR 20160113177A KR 1020167022831 A KR1020167022831 A KR 1020167022831A KR 20167022831 A KR20167022831 A KR 20167022831A KR 20160113177 A KR20160113177 A KR 20160113177A
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KR
South Korea
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reverse transcriptase
mutant
mlv
leu
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020167022831A
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English (en)
Inventor
제프리 로저스
제이슨 포터
Original Assignee
라이프 테크놀로지스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 라이프 테크놀로지스 코포레이션 filed Critical 라이프 테크놀로지스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 증가된 열안정성, 증가된 열반응성 및/또는 저해제에 대한 증가된 내성 등과 같은 목적으로 하는 특성을 가진 신규한 역전사효소(RT)를 제공한다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 이러한 신규한 역전사효소 효소를 함유하는 키트, 조성물 및/또는 반응 혼합물을 이용해서 핵산 분자(특히 cDNA 분자)를 생산, 증폭 및/또는 서열분석하는 방법을 제공한다.

Description

고온 핵산 합성에서 이용하기 위한 신규한 역전사효소{NOVEL REVERSE TRANSCRIPTASES FOR USE IN HIGH TEMPERATURE NUCLEIC ACID SYNTHESIS}
본 발명은, 핵산 분자의 역전사를 위한, 역전사효소(RT) 효소와, 신규한 효소를 포함하는 조성물, 방법 및 키트를 제공한다.
역전사효소는 RNA를 DNA로 전환시키는 생물공학에서의 기본 효소이다. 이들 효소는 살아있는 유기체의 다수의 기본 프로세스를 알아내는데 이용되어온 귀중한 연구 툴의 기초를 형성한다. 분자 진단학에 관하여, 이들 효소는 이러한 진단학의 중요 구성요소이고, 따라서 예를 들어 암을 비롯한 방대한 질환의 진단 및 관리를 위한 새로운 툴을 용이하게 한다. 그와 같이, 개선된 효능 등과 같은 개선된 특성을 가진 개선된 역전사효소가 요망되는데, 그 이유는 이러한 개선된 효소가 개선된 분자 진단학으로 이어질 것이기 때문이다.
역전사의 효능에 영향을 미치는 인자는 2차 구조를 형성하는 RNA의 능력이다. 이러한 2차 구조는, 예를 들어, RNA 분자의 영역이 이중 가닥 RNA를 혼성화하고 형성하도록 충분한 상보성을 지닐 경우, 형성될 수 있다. 일반적으로, RNA 2차 구조의 형성은 RNA 분자를 함유하는 용액의 온도를 상승시킴으로써 저감될 수 있다. 이와 같이 해서, 많은 경우에, 37℃ 이상의 온도에서 RNA를 역전사시키는 것이 바람직하다. 그러나, 역전사효소는 일반적으로 37℃보다 훨씬 높은 온도(예컨대, 50℃)에서 배양될 경우 활성을 잃는다.
이러한 효소를 이용하는 분자 진단 방법을 비롯한, 역전사효소를 활용하는 방법의 정확도는, 개선된 열안정성 및/또는 열반응성을 가진 역전사효소의 개발에 의해 개선될 것이다. 이러한 효소가 입수 가능하다면, 정확도를 개선시키기 위하여 다른 열안정성 효소를 이용하는 방법이 열안정성 역전사효소를 이용하는 새로운 방법을 생각해내는데 이용될 수 있었다. 예를 들어, "핫 스타트"(hot start) 접근법은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법의 정확도를 개선하기 위하여 열안정성 중합효소와 함께 이용되어 왔다. 일례에서, 미국 특허 제5,338,671호는 저온(예컨대, 70℃ 미만)에서 DNA 중합효소 활성을 저해시키기 위하여 열안정성 DNA 중합효소에 특이적인 항체의 사용을 기술하고 있다. 시트라콘산 무수물에 의한 화학적 처리는 핫 스타트 PCR이 달성된 다른 방법이다(예컨대, 미국 특허 제5,773,258호 및 미국 특허 제5,677,152호 참조). 이러한 핫 스타트 접근법의 역전사에의 적용은 도전과제인 것으로 판명되었다. 이것은, 예를 들어, 많은 역전사효소가 열 안정성이 아니기 때문이다.
게다가, 핵산이 추출되는 생물학적 샘플은 흔히 역전사에 대해서 저해성인 추가의 화합물을 함유한다. 토양, 식물 및 배설물에서의 부식산(humic acid), 핼액 내 헤마틴, 혈청 중 면역글로빈 G, 그리고 헤파린 및 시트르산염 등과 같은 각종 혈액 항응고제는 모두 이러한 저해제의 예이다. 이러한 저해제는 핵산 추출 및 정제 과정 동안 완전히 제거될 수 없으므로, 역전사의 결과로서 생산된 cDNA 산물의 감소에 의해서 반영되는 바와 같이 하류 핵산 합성에 부정적으로 영향을 미친다.
따라서, 전술한 결점의 일부를 해소하는 개선된 역전사효소와, 이러한 역전사효소를 포함하는 조성물, 키트 및 방법이 본 발명에 의해 충족된다.
본 발명은 개선된 특성을 가진 돌연변이 역전사효소 효소와, 이러한 신규한 효소를 포함하는 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 소정의 실시형태에 있어서, 증가된 열안정성, 증가된 열반응성, 및/또는 증가된 속도뿐만 아니라, 개선된 저해제 내성, 예를 들어 폴리페놀-유사 화합물에 대한 내성, 곤란한(difficult) RNA 주형에 의한 개선된 cDNA 생성 및 증가된 특이성 등과 같은 추가의 유리한 특성을 발휘하는 돌연변이 역전사효소 효소; 및 이러한 역전사효소 효소를 이용해서 핵산 분자, 예를 들어, mRNA 분자를 역전사, 증폭 또는 서열분석하는 등에 의해 생산하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 전술한 특성들 중 둘 이상을 포함한다. 기타 유리한 특성을 가진 돌연변이 역전사효소가 본 명세서에서 제공되되, 이들 중 일부는 추가의 전술한 특성들 중 하나 이상을 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에서 제공되는 돌연변이 역전사효소를 포함하는, 키트 및 조성물, 예컨대, 저장 조성물 및 반응 혼합물을 제공한다.
소정의 예시적인 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는, 특히 상승된 온도에서 수행된 역전사에 관하여, 증가된 역전사 효능을 제공한다. 따라서, 소정의 예시적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 돌연변이 역전사효소를 제공하되, 여기서 하나 이상의 아미노산 변화가 행해져 핵산 합성 반응 동안 효소에 열안정성 및/또는 열반응성을 부여한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 말로니 쥐 백혈병 바이러스(Maloney Murine Leukemia Virus: M-MLV) 역전사효소로부터 유래된 돌연변이 역전사효소에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열번호 2로 표시된 M-MLV 역전사효소의 야생형 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 개선된 열안정성을 가진 역전사효소를 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 더 높은 열안정성 및/또는 열반응성(뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 기타 특성)을 내도록 돌연변이 또는 변형을 위하여 표적화된 아미노산 위치가 표 1에 나열되어 있다. 예를 들어, 본 발명은, P51, S67, E69, T197, H204, E302, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653, 및/또는 L671로 이루어진 군으로부터 선택된 야생형 M-MLV에 대응하는 아미노산 위치에 특이적 돌연변이(또는 그의 조합)을 가진 M-MLV 역전사효소를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은 하기 돌연변이의 전부를 지닌 M-MLV 역전사효소가 제공된다: P51L, S67R, E69K, T197A, H204R, E302K, F309N, W313F, T330P, L435G, N454K, D524G, D583N, H594Q, D653N 및 L671P. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 또한 바람직하게는 저감되거나 실질적으로 저감된 RNase H 활성을 갖는다.
다른 종으로부터의 역전사효소 내의 대응하는 아미노산 위치의 유사한 또는 등가의 부위는 본 명세서에 개시된 바와 같은 열안정성 및/또는 열반응성 역전사효소를 생산하기 위하여 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 서열번호 4에 대해서 적어도 50%(예컨대, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 등)의 아미노산 서열 동일성을 가진 역전사효소를 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 야생형 M-MLV와 비교할 때 적어도 50℃(예컨대, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃ 및 75℃)의 반응 온도에서 증가된 역전사효소 활성을 발휘한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 50℃ 내지 60℃에서의 증가된 역전사효소 활성은 훨씬 낮은 반응 온도(예컨대, 37℃)에서 야생형 M-MLV에 비해서 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 100% 또는 200% 이상이다. 마찬가지로, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 50℃ 내지 60℃에서 적어도 5분 동안 적어도 50%(예컨대, 50%, 70%, 80%, 90% 등)의 역전사효소 활성을 보유한다. 다른 실시형태에 있어서, 역전사효소는 적어도 5분 동안 적어도 50℃로 가열 후 적어도 50%의 활성을 보유한다. 유사하게, 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 역전사효소는, 유사한 pH 조건 하에서 훨씬 낮은 반응 온도(예컨대, 37℃)에서의 야생형 M-MLV와 비교할 때, 약 7.3 내지 8.3 범위의 pH에서 적어도 10분(예컨대, 10분, 15분, 60분 등) 동안 적어도 50℃로 가열 후 적어도 50%(예컨대, 50%, 70%, 80%, 90% 등)의 활성을 보유한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 약 60℃의 반응 온도에서 5분 이내에 적어도 7.5kb인 cDNA를 생산할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 약 60℃의 반응 온도에서 15분 이내에 적어도 9.5kb인 cDNA를 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이 역전사효소를 암호화하는 유전자 또는 핵산 분자를 함유하는 DNA 분자(바람직하게는 벡터), 그리고 이러한 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 많은 숙주가 원핵 세포 및 진핵 세포를 비롯한 관심 대상 유전자 또는 핵산 분자를 발현하는데 이용될 수 있다. 바람직하게는, 원핵 세포가 본 발명의 중합효소를 발현하는데 이용된다. 본 발명에 따른 바람직한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli)이다.
본 발명은, 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 돌연변이 또는 변형된 역전사효소 효소 또는 폴리펩타이드를 포함하는, 핵산 분자의 역전사에 이용하기 위한 조성물 및 반응 혼합물을 제공한다. 이러한 조성물은 1종 이상의 뉴클레오타이드, 적절한 완충제, 및/또는 1종 이상의 DNA 중합효소를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 종결제(terminating agent)(예컨대, 다이데옥시뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 글리세롤 또는 계면활성제 등과 같은 안정화제를 더 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 핵산 합성 동안 원치 않는 중합 생성물을 방지 또는 저감시키기 위하여 핫 스타트 기전의 사용을 더 포함할 수 있다.
본 발명은, 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 1종 이상의 역전사효소 및 증폭 반응에 이용하기 위한 1종 이상의 DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 증폭을 위하여 적합한 1종 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 완충제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 글리세롤 또는 계면활성제 등과 같은 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 핵산 합성 동안 원치 않는 중합 생성물을 방지 또는 저감시키기 위하여 하나 이상의 핫 스타트 기전의 사용을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 1종 이상의 돌연변이 역전사효소 효소 또는 폴리펩타이드를 이용하는 핵산 분자의 합성 방법을 더 제공한다. 특히, 본 발명은, 하나 이상의 핵산 주형(바람직하게는 하나 이상의 RNA 주형 및 가장 바람직하게는 하나 이상의 전령 RNA 주형)을 본 발명의 1종 이상의 역전사효소와 혼합하는 단계 및 하나 이상의 핵산 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 제1 핵산 분자 혹은 분자들을 만드는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는 하나 이상의 핵산 분자의 제조 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 핵산 분자는 단일 가닥 cDNA이다. 본 발명의 이 양상에 따른 역전사에 적합한 핵산 주형은 임의의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 집단(바람직하게는 RNA 및 가장 바람직하게는 mRNA), 바람직하게는 세포 또는 조직으로부터 유래된 것들을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 핵산 주형의 세포 공급원은, 박테리아 세포, 진균 세포, 식물 세포 및 동물 세포를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 이중 가닥 핵산 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 하나 이상의 핵산 주형(바람직하게는 RNA 또는 mRNA, 더 바람직하게는 mRNA 주형의 집단)을 본 발명의 1종 이상의 역전사효소와 혼합하는 단계; (b) 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 제1 핵산 분자 또는 분자들을 만드는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계; 및 (c) 제1 핵산 분자 또는 분자들의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 제2 핵산 분자 또는 분자들을 만드는데 충분한 조건 하에 제1 핵산 분자 또는 분자를 배양하는 단계를 포함함으로써, 제1 및 제2 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 이중 가닥 핵산 분자를 형성한다. 이러한 방법은 하나 이상의 이중 가닥 핵산 분자를 만드는 공정의 일부로서 1종 이상의 DNA 중합효소의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 이중 가닥 핵산 분자를 만드는데 유용한 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 본 발명의 1종 이상의 역전사효소 및 임의로 1종 이상의 DNA 중합효소, 적절한 완충제, 1종 이상의 프라이머 및/또는 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 핵산 분자의 증폭 방법을 제공한다. 이러한 증폭 방법은 위에서 기재된 바와 같이 제조된 이중 가닥 핵산 분자 또는 분자들을 1종 이상의 DNA 중합효소와 혼합하는 단계 및 이중 가닥 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함한다. 제1의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은 핵산 분자의 증폭 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 (a) 하나 이상의 핵산 주형(바람직하게는 하나 이상의 RNA 또는 mRNA 주형, 더 바람직하게는 mRNA 주형의 집단)을 본 발명의 1종 이상의 역전사효소 및 1종 이상의 DNA 중합효소와 혼합하는 단계 및 (b) 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 핵산 주형, 바람직하게는 RNA 또는 전령 RNA(mRNA), 더 바람직하게는 mRNA 분자의 집단을 본 발명의 1종 이상의 역전사효소와 혼합하는 단계 및 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 핵산 분자 또는 분자들을 만드는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 주형에 상보적인 핵산 분자 또는 분자들을 만들기 위하여, 프라이머(예컨대, 올리고(dT) 프라이머) 및 1종 이상의 뉴클레오타이드는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 핵산 합성을 위하여 이용된다. 본 발명의 이 양상에 따른 역전사에 적합한 핵산 분자는 임의의 핵산 분자, 특히 원핵 또는 진핵 세포로부터 유래된 것을 포함한다. 이러한 세포는 정상 세포, 병든 세포, 형질전환 세포, 확립된 세포, 기원 세포(progenitor cell), 전구 세포(precursor cell), 태아 세포, 배아 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 동물 세포(인간 세포 포함), 조류 세포, 식물 세포 등, 또는 식물 또는 동물(예컨대, 인간, 소, 돼지, 마우스, 양, 말, 원숭이, 개, 고양이, 래트, 새, 어류, 곤충 등)로부터 단리된 조직을 포함할 수 있다. 역전사를 위하여 적합한 핵산 분자는 또한 바이러스 및/또는 바이러스 감염된 세포로부터 단리 및/또는 획득될 수 있다.
본 발명은 추가로 핵산 분자를 본 발명의 역전사효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산 분자의 증폭 또는 서열분석 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 하나 이상의 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 역전사 반응은 RT-PCR 등과 같은 PCR에 커플링된다.
본 발명은 또한 포장된 형식으로 본 발명의 역전사효소를 포함하는 역전사용 키트를 제공한다. 본 발명의 역전사용 키트는, 예를 들어, 역전사효소, 역전사에 필요한 임의의 통상의 성분, 뉴클레오타이드 프라이머, 적어도 하나의 dNTP, 및 반응 완충제, 그리고 임의로 DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 이용하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 핵산 분자(단일 또는 이중 가닥)를 제조, 서열분석 또는 증폭하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는, 내부에 폐쇄 구획을 가진 박스 또는 카톤 등과 같은 캐리어, 예컨대, 바이알, 튜브, 병 등과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 본 발명의 키트의 소정의 실시형태에 있어서, 제1 용기는 본 발명의 역전사효소 효소의 1종 이상을 수용한다. 본 발명의 키트는 또한, 동일 또는 상이한 용기에, 1종 이상의 DNA 중합효소(바람직하게는 열안정성 DNA 중합효소), 1종 이상의 핵산 합성용의 적합한 완충제 및 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트의 구성요소는 개별의 용기(예컨대, 각 효소 및/또는 성분에 대해서 하나의 용기)로 분할될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서 또는 프로토콜을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 키트에 있어서, 역전사효소는 cDNA 합성이 일어나는 온도가 증가되도록 돌연변이된다. 본 발명의 추가의 바람직한 키트에 있어서, 용기 내의 효소(역전사효소 및/또는 DNA 중합효소)는 작업 농도(working concentration)로 존재한다.
따라서, 위에서 상세히 기술된 바와 같이, 일 양상에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소가 제공된다. 이러한 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 아미노산 위치는 S67, T197 및 E302로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 하기 아미노산 치환 돌연변이로부터 선택된다: (S67R, S67N 또는 S67K), (T197A, T197S 또는 T197G), 및 (E302K, E302R 또는 E302G). 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 P51, E69, P196, D200, H204, M289, T306, F309, W313, T330, L435, N454, D524, E562, D583, H594, L603, D653 및 L671로부터 선택된 아미노산 위치에 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 추가의 돌연변이는 하기 아미노산 치환 돌연변이로부터 선택된다: P51L, E69K, P196S, D200N, H204R, M289L, T306K, (F309N, F309Y 또는 F309I), (W313F, W313L 또는 W313C), T330P, (L435G, L435V 또는 L435R), N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, (D653N 또는 D653H) 및 L671P.
다른 양상에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 6개의 돌연변이를 포함하며, 여기서 적어도 6개의 아미노산 위치는 P51, E69, P196, D200, H204, M289, T306, F309, W313, T330, L435, N454, D524, E562, D583, H594, L603, D653 및 L671로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 6개의 돌연변이는 하기의 아미노산 치환으로부터 선택된다: P51L, E69K, P196S, D200N, H204R, M289L, T306K, (F309N, F309Y 또는 F309I), (W313F, W313L 또는 W313C), T330P, (L435G, L435V 또는 L435R), N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, (D653N 또는 D653H), 및 L671P. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 S67, T197 및 E302로부터 선택된 아미노산 위치에 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 추가의 돌연변이는 하기 아미노산 치환으로부터 선택된다: (S67R, S67N 또는 S67K), (T197A, T197S 또는 T197G), 및 (E302K, E302R 또는 E302G).
몇몇 실시형태에 있어서, 하기 아미노산 위치의 각각에서 돌연변이를 가진 돌연변이 M-MLV 역전사효소가 제공된다: P51, S67, E69, T197, H204, E302, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 하기 아미노산 치환 돌연변이의 각각을 포함한다: P51L, S67R, E69K, T197A, H204R, E302K, F309N, W313F, T330P, L435G, N454K, D524G, D583N, H594Q, D653N 및 L671P.
몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 RNase H 활성을 결여한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 대응하는 야생형 M-MLV 역전사효소의 역전사효소 활성에 비해서 적어도 50℃의 반응 온도에서 증가된 역전사효소 활성을 발휘한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소 활성보다 적어도 10%(예컨대, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 100%, 200% 등) 초과인 증가된 역전사효소 활성을 발휘한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV 역전사효소의 역전사효소 활성의 적어도 25%(예컨대, 50%, 100%, 200% 등)인 60℃에서 5분 후 역전사효소 활성을 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 하기 특성들 중 하나 이상을 발휘한다: 증가된 열안정성; 증가된 열반응성; 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성; 곤란한 주형을 역전사시키는 증가된 능력, 증가된 속도/진행도(processivity); 및 증가된 특이성(예컨대, 감소된 프라이머-무함유 역전사).
다른 양상에 있어서, 서열번호 4에 대해서 적어도 50%(예컨대, 50%, 60%, 705, 80%, 90%, 95% 등)의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 돌연변이 역전사효소가 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 서열번호 4를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 서열번호 4로 이루어진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 50℃ 내지 65℃(예컨대 50℃, 52℃, 55℃, 58℃, 60℃ 및 62℃)의 온도에서 열안정성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 효소는 50℃ 내지 65℃(예컨대, 55℃, 60℃ 등)의 온도에서 적어도 1분(예컨대, 1분, 5분, 15분, 60분, 120분 등) 동안 열안정성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 50℃ 내지 65℃(예컨대 50℃, 52℃, 55℃, 58℃, 60℃ 및 62℃)의 온도에서 열반응성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 50℃ 내지 65℃(예컨대, 55℃, 60℃ 등)의 온도에서 적어도 1분(예컨대, 1분, 5분, 15분, 60분, 120분 등) 동안 열반응성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 적어도 1분(예컨대, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분 등) 동안 적어도 50℃(예컨대, 50℃, 55℃, 60℃, 62℃, 65℃ 등)로 가열 후 적어도 10%(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%) 역전사효소 활성을 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 역전사효소는 적어도 1분(예컨대, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분 등) 동안 적어도 60℃(예컨대, 60℃, 62℃, 65℃ 등)로 가열 후 적어도 10%(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%) 역전사효소 활성을 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 역전사효소는 적어도 1분(예컨대, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분 등) 동안 적어도 50℃(예컨대, 50℃, 55℃, 60℃, 62℃, 65℃ 등)로 가열 후 적어도 50%(예컨대, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%)의 역전사효소 활성을 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 역전사효소는 적어도 5분(예컨대, 5분, 10분, 15분, 30분 등) 동안 적어도 50℃(예컨대, 50℃, 55℃, 60℃, 62℃, 65℃)로 가열 후 적어도 10%(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%)의 역전사효소 활성을 보유한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 돌연변이 M-MLV 역전사효소이다. 다른 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는, 예를 들어, 계두, 멧돼지(wild boar), 코알라 및 개코원숭이를 비롯한 기타 종으로부터 얻어진 돌연변이 역전사효소이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 도 1a 내지 도 1d에 나열된 공통 서열로 표시된 것과 같은 아미노산 상동성 영역과 동일성 영역을 포함한다.
다른 양상에 있어서, 핵산 합성용 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 완충제 및 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소 중 어느 것인가를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은, 1종 이상의 뉴클레오타이드, 1종 이상의 DNA 중합효소, 1종 이상의 세정제, 1종 이상의 프라이머, 1종 이상의 핫 스타트 성분, 및/또는 1종 이상의 종결제 등과 같은, 핵산 합성에 유용한 1종 이상의 성분을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 종결제는 다이데옥시뉴클레오타이드이다.
다른 양상에 있어서, 핵산 합성(예컨대, 역전사 및 증폭) 방법이 제공된다. 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소 중 어느 하나의 이용을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 역전사효소와 함께 하나 이상의 핵산 주형을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) 하나 이상의 핵산 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 제1 핵산 분자를 만드는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은, (a) 하나 이상의 핵산 주형을 본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 역전사효소 및 하나 이상의 DNA 중합효소와 혼합하는 단계; 및 (b) 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 핵산 주형은 전령 RNA 분자 또는 mRNA 분자의 집단이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 제1 핵산 분자의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 제2 핵산 분자를 만드는데 충분한 조건 하에 하나 이상의 제1 핵산 분자를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 증폭된 핵산 분자의 전부 또는 일부의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 더 포함한다. 기재된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 배양은 약 60℃의 온도에서 수행된다.
다른 양상에 있어서, 하나 이상의 포장된 용기 내에 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 M-MLV 역전사효소를 포함하는 키트가 제공된다.
또 다른 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다.
다른 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소를 암호화하는 핵산에 조작 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
다른 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 다른 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 역전사효소 활성을 가진 돌연변이 역전사효소 또는 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태는 이하의 도면 및 본 발명의 설명 및 청구범위를 감안하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 이들 및 기타 특징, 양상 및 이점은 이하의 설명 및 첨부된 청구범위, 그리고 첨부 도면을 참조하면 더욱 이해될 것이다:
도 1a 내지 도 1d는 기타 종류의 동물(즉, 개코원숭이, 계두, 코알라 및 멧돼지)에 대해서 특이적인 바이러스 역전사효소와 야생형 M-MLV 역전사효소(MMLV) 간의 아미노산 서열 정렬을 포함하는 표를 나타낸다. 아미노산 유사성 및 동일성의 영역들이 각종 RT를 통해서 나타난다. 각종 RT 간의 공통 서열이 또한 표시되어 있다.
도 2는 야생형 M-MLV 역전사효소("WT MMLV"; 서열번호 2)뿐만 아니라 기타 상업적으로 입수 가능한 ("통상의") 돌연변이 M-MLV 역전사효소("SSII", "SSIII" 및 "Q-RT")와 비교하여 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시적인 돌연변이 M-MLV 역전사효소("Mut D9"; 서열번호 4)의 RT 활성을 나타낸 형광 이미지이다. 각 레인은 표시된 바와 같은 다양한 시간 길이(즉, 5분, 15분 또는 60분) 동안 그리고 다양한 반응 온도(즉, 37℃, 42℃, 50℃ 또는 60℃) 하에 수행된 RT 반응으로부터 얻어진 cDNA 산물을 나타낸다. 0.24 내지 9.5kb RNA 래더(ladder)가 각 반응에 대한 주형 핵산으로서 이용되었다.
도 3은 야생형 M-MLV 역전사효소("WT MMLV"; 서열번호 2)와 비교하여 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시적인 돌연변이 M-MLV 역전사효소("Mut D9"; 서열번호 4)의 RT 활성을 나타낸 형광 이미지이다. 각 레인은 표시된 바와 같은 37℃(WT MMLV에 대해서) 또는 50℃(Mut D에 대해서)에서 그리고 pH 8.3 또는 7.3 하에서 다양한 시간 길이(즉, 10분, 30분 또는 60분) 동안 수행된 RT 반응으로부터 얻어진 cDNA 산물을 나타낸다. 0.5 내지 10kb RNA 래더가 각 반응에 대한 주형 핵산으로서 이용되었다.
도 4는 야생형 M-MLV 역전사효소("WT MMLV"; 서열번호 2)뿐만 아니라 기타 상업적으로 입수 가능한("통상의") 돌연변이 M-MLV 역전사효소("SSIII" 및 "C-RT")와 비교하여 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시적인 돌연변이 M-MLV 역전사효소("Mut D9"; 서열번호 4)의 RT 활성을 나타낸 형광 이미지이다. 각 레인은 60℃에서 그리고 pH 8.3에서 다양한 시간 길이(즉, 5분, 10분, 30분 또는 60분) 동안 수행된 RT 반응으로부터 얻어진 cDNA 산물을 나타낸다. 0.5 내지 10kb RNA 래더가 각 반응에 대한 주형 핵산으로서 이용되었다.
도 5는 기타 상업적으로 입수 가능한 돌연변이 M-MLV 역전사효소("SSIII" 및 "M-RT")와 비교하여 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시적인 돌연변이 M-MLV 역전사효소("Mut D9"; 서열번호 4)의 RT 활성을 나타낸 브로민화에티듐 염색 겔의 사진이다. 각 레인은 표시된 바와 같이 그리고 실시예 4에서 더욱 상세히 설명된 바와 같이 다양한 반응 조건(즉, "비-HS-RT-rxn" 또는 "HS-RT-rxn"; HS = 핫 스타트) 하에서 상이한 프라이머: (1) 프라이머 없음; (2) 올리고(dT)20 프라이머; (3) 올리고(dT)20LNA 프라이머; 또는 (4) PolE 2.5Rve 유전자-특이적 프라이머를 이용해서 수행된 RT 반응으로부터 얻어진 (PCR을 통해서 증폭된) 산물을 나타낸다. 1kb 표적("Hela RNA")의 상이한 양(즉, 10ng, 50ng 또는 100ng)이 각 반응에 대한 주형 핵산으로서 이용되었다.
도 6은 야생형 M-MLV에 비해서 역전사효소("WT MMLV"; 서열번호 2)뿐만 아니라 기타 상업적으로 입수 가능한 ("통상의") 돌연변이 M-MLV 역전사효소("SSIII" 및 "C-RT")와 비교하여 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시적인 돌연변이 역전사효소("Mut D9"; 서열번호 4)의 RT 활성을 나타낸 형광 이미지이다. 각 레인은 표시된 바와 같이 각종 농도에서 각종 저해제의 존재 하에 그리고 50℃에서 60분 동안 수행된 RT 반응으로부터 얻어진 cDNA 산물을 나타낸다. 0.5 내지 10kb RNA 래더가 각 반응에 대한 주형 핵산으로서 이용되었다.
도 7은 도 6에 도시된 바와 같이 저해제의 존재 하에 상이한 RT의 그래픽 포맷에서의 RT 활성을 나타낸다. RT 활성은 저해제를 함유하지 않는 반응(100% 활성으로서 표시됨)에 대해서 정규화되었다. 검은 음영은 최저 RT 활성을 나타내는 한편, 밝은 음영은 최고 RT 활성(흑색에서 백색 = 최저에서 최고 활성)을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 1)에 대한 핵산 서열을 나열한다.
도 9는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 아미노산 서열을 나열한다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 예시적인 돌연변이("Mut D9") M-MLV 역전사효소(서열번호 3)에 대한 핵산 서열을 나열한다.
도 11은 본 발명의 예시적인 돌연변이("Mut D9") M-MLV 역전사효소(서열번호 4)에 대한 아미노산 서열을 나열한다.
본 명세서에서는 열안정성 및/또는 열반응성, 역전사효소 저해제 내성, ng한 RNA 주형에 의한 cDNA 생성 및 특이성을 증가시키기 위하여 돌연변이된 역전사효소가 제공된다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 대응하는 야생형 역전사효소의 특정 아미노산을 돌연변이 또는 변형시킴으로써 이러한 역전사효소를 제조하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 이러한 돌연변이 역전사효소 효소를 함유하는 조성물 및/또는 반응 혼합물을 이용해서 핵산 분자, 예시적인 실시형태에 있어서, cDNA 분자를 생산, 증폭 및/또는 서열분석하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 역전사효소는 조질의 샘플, 곤란한 RNA 주형 및 유전자 특이적 서열의 RNA 서열분석 및 역전사를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 핵산 합성 방법에 잘 적합화되어 있다.
정의
후술하는 설명에 있어서, 이하의 의미를 가진 많은 용어가 이용된다:
조작 가능하게 연결된. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 "조작 가능하게 연결된"은 핵산 요소가 구조 유전자 또는 기타 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현의 개시에 영향을 미치도록 위치된 것을 의미한다.
실질적으로 순수한. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 "실질적으로 순수한"은 목적으로 하는 물질이 사실상 목적으로 하는 물질과 회합된 오염 세포 성분이 본질적으로 없는 것을 의미한다. 바람직한 양상에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 25% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 더 바람직하게는 5% 이하, 더욱더 바람직하게는 1% 이하의 오염 세포 성분을 갖는다. 다른 양상에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 200 단위의 역전사효소가 단백질 겔(예컨대, SDS-PAGE) 상에서 유동되어 쿠마씨 블루로 염색된 경우 검출 가능한 단백질 오염물을 지니지 않는다. 오염 세포 성분은, 포스파타제, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 또는 바람직하지 않은 DNA 중합효소 효소 등과 같은 효소 활성을 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 역전사효소는 실질적으로 순수하다.
실질적으로 단리된. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 "실질적으로 단리된"은 본 발명의 폴리펩타이드가 사실상 그리고/또는 재조합 숙주에서 본 발명의 폴리펩타이드와 회합될 수 있는 오염 단백질로부터 본질적으로 없는 것을 의미한다. 일 양상에 있어서, 본 발명의 실질적으로 단리된 역전사효소는 25% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 더 바람직하게는 5% 이하, 더욱더 바람직하게는 1% 이하의 오염 단백질을 갖는다. 다른 양상에 있어서, 본 발명의 실질적으로 단리된 폴리펩타이드의 샘플에 있어서, 해당 샘플 중 75% 이상(바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상)의 단백질이 본 발명의 목적으로 하는 역전사효소이다. 샘플 내 오염 단백질 및/또는 관심 대상 단백질의 퍼센트는, 예를 들어, 단백질 겔(예컨대, SDS-PAGE)을 이용해서 단백질 염료(예컨대, 쿠마씨 블루, 은 염색 및 아미도 블랙 등)로 염색함으로써 당업계에 공지된 수법을 이용해서 결정될 수 있다. 다른 양상에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 200 단위의 역전사효소가 단백질 겔(예컨대, SDS-PAGE) 상에서 유동하고 쿠마씨 블루로 염색되는 경우 검출 가능한 단백질 오염물을 지니지 않는다.
종결제. 때때로 "종결 염기"와 호환 가능하게 사용되는 "종결제"는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 연장될 수 없는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 이러한 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 다이데옥시뉴클레오타이드(ddNTP) 또는 각종 당(sugar)-변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
역전사효소. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "역전사효소"는 역전사효소 활성을 나타내는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다.
역전사효소 활성. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "역전사효소 활성", "역전사 활성" 또는 "역전사"는 RNA를 주형으로서 이용해서 DNA 가닥(즉, 상보적 DNA 또는 cDNA)을 합성하는 효소의 능력을 나타낸다.
돌연변이. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이" 또는 "돌연변이체"는 야생형 DNA 서열 또는 야생형 아미노산 서열에서 도입된 변화 또는 변화들을 나타낸다. 돌연변이의 예는, 치환, 삽입, 결실 및 점 돌연변이를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 돌연변이는 핵산 수준에서 또는 아미노산 수준에서 이루어질 수 있다.
열안정성. 본 개시내용의 목적을 위하여, "열안정성"은, 일반적으로, 동일 처리 후 야생형 열안정성을 가진 동일한 효소에 의해 보유되는 것보다 열 처리 후의 보다 큰 그의 활성 퍼센트 또는 양을 보유하는, 효소, 예컨대, 역전사효소("열안정성 전사효소")를 지칭한다. 따라서, 증가된/증대된 열안정성을 가진 역전사효소는, 임의의 열안정성의 증가, 바람직하게는 열안정성에 대해서 야생형인 역전사효소의 활성의 저감을 초래하는데 충분한 열처리 후의 활성의 약 1.2 내지 약 10,000배, 약 1.5 내지 약 10,000배, 약 2 내지 약 5,000배, 또는 약 2 내지 약 2000배(바람직하게는 약 5배 초과, 더 바람직하게는 약 10배 초과, 더욱더 바람직하게는 약 50배 초과, 더욱더 바람직하게는 약 100배 초과, 더욱더 바람직하게는 약 500배 초과, 가장 바람직하게는 약 1000배 초과)의 유지를 가진 역전사효소로서 정의될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 열안정성의 상대적인 증대 혹은 증가를 결정하기 위하여 대응하는 미돌연변이 혹은 야생형 역전사효소와 대비된다. 예를 들어, 60℃에서 5분 동안 열처리 후, 열안정성 역전사효소는 열처리 전에 존재하는 활성의 대략 90%를 보유할 수 있는 한편, 열안정성에 대해서 야생형인 역전사효소는 그의 원래의 활성의 10%를 보유할 수 있다. 마찬가지로, 60℃에서 15분 동안 열처리 후, 열안정성 역전사효소는 그의 원래의 활성의 대략 80%를 보유할 수 있는 한편, 열안정성에 대해서 야생형인 역전사효소는 측정 가능한 활성을 갖지 않을 수 있다. 유사하게, 60℃에서 15분 동안 열처리 후, 열안정성 역전사효소는 그의 원래의 활성의 대략 50%, 대략 55%, 대략 60%, 대략 65%, 대략 70%, 대략 75%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90% 또는 대략 95%를 보유할 수 있는 한편, 열안정성에 대해서 야생형인 역전사효소는 측정 가능한 활성을 갖지 않을 수 있거나, 또는 그의 원래의 활성의 20%, 15%, 10%를 보유할 수 있거나 전혀 보유하지 않을 수 있다. 제1 경우에(즉, 60℃에서 5분 동안 열처리 후), 열안정성 역전사효소는 야생형 역전사효소보다 9배 많은(10%에 비해서 90%의) 열안정성이라고 말할 수 있다. 역전사효소와 같은 효소의 열안정성을 측정하는데 이용될 수 있는 조건의 예는 이하에 그리고 실시예에서 더욱 상세히 기술된다.
역전사효소의 열안정성은, 예를 들어, 열처리와 동일한 시간 길이 동안 실온에서 배양된 동일한 역전사효소의 대조 샘플에 대해서, 주어진 시간 기간, 예를 들어, 5분 동안 60℃에서 열처리가 실시된, 예컨대, 배양된 역전사효소의 잔류 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로 잔류 활성은 상보성 올리고리보뉴클레오타이드 주형을 이용해서 방사성표지된 데옥시리보뉴클레오타이드를 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 프라이머 내로 혼입시킴으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 폴리(리보C) 주형을 이용해서 [α-32P]-dGTP를 올리고-dG 프라이머 내로 혼입시키는 역전사효소의 능력은 역전사효소의 잔류 활성을 결정하기 위하여 검정될 수 있다. 미표지된 뉴클레오타이드를 형광-표지된 프라이머 내로 혼입시키는 등에 의해 잔류 활성을 측정하는 기타 방법이 당업자에 의해 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Nikiforov, T. T., Anal Biochem., 2011, 412(2): 229-36](이 문헌은 참고로 본 명세서에 편입됨) 참조.
다른 양상에 있어서, 열안정성 본 발명의 역전사효소는 대응하는 야생형, 미돌연변이 역전사효소에 비해서 더 높은 온도에서 비활성화되는 임의의 역전사효소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 열안정성 역전사효소에 대한 비활성화 온도는 대응하는 야생형, 미돌연변이 역전사효소에 대한 비활성화 온도보다 약 2℃ 내지 약 50℃(예컨대, 약 2℃, 약 4℃, 약 6℃, 약 8℃, 약 10℃, 약 12℃, 약 14℃, 약 16℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 26℃, 약 28℃, 약 30℃, 약 32℃, 약 34℃, 약 36℃, 약 38℃, 약 40℃, 약 42℃, 약 44℃, 약 46℃, 약 48℃ 또는 약 50℃) 높다. 더 바람직하게는, 본 발명의 역전사효소의 비활성화 온도는, 동일 조건 하에 비교할 경우, 대응하는 야생형 미돌연변이 역전사효소에 대한 비활성화 온도보다 약 5℃ 내지 약 50℃, 약 5℃ 내지 약 40℃, 약 5℃ 내지 약 30℃, 또는 약 5℃ 내지 약 25℃ 높다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는, 상승된 온도(예컨대, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃)에서 적어도 1분(예컨대, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분 등) 후의 역전사효소 활성이 보다 낮은 온도(예컨대, 50℃, 45℃, 42℃, 40℃, 37℃)에서 5분 후의 야생형 역전사효소의 역전사효소 활성의 적어도 10%(예컨대, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300% 등)이다.
본 발명의 역전사효소의 그의 대응하는 야생형, 미돌연변이 역전사효소에 대한 비활성화 온도의 차는 미리 정해진 시간 기간 동안 상이한 온도에서 이러한 역전사효소의 샘플을 처리하고 나서, 만약 있다면 샘플이 열처리된 후에 잔류 역전사효소 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 야생형, 미돌연변이 대조군에 대한 시험 역전사효소 간의 비활성화 온도의 차 또는 델타의 결정은 각 역전사효소가 비활성화되는(즉, 잔류 역전사효소 활성이 이용된 특정 검정에서 측정 가능한) 온도의 차이를 비교함으로써 결정된다. 인지되는 바와 같이, 많은 역전사효소 검정법이 시험된 임의의 역전사효소에 대한 비활성화 온도의 차 또는 델타를 결정하는데 이용될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 발명의 역전사효소의 열안정성은 관심 대상 역전사효소의 역전사효소 활성의 반감기를 측정함으로써 결정된다. 이러한 반감기는 반감기의 차(또는 델타)를 결정하기 위하여 대조군 또는 야생형 역전사효소와 대비될 수 있다. 본 발명의 역전사효소의 반감기는 바람직하게는 상승된 온도(예컨대, 37℃ 초과)에서, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃ 범위의 온도에서, 더 바람직하게는 45℃ 내지 75℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 65℃ 및 58℃ 내지 62℃ 범위의 온도에서 결정된다. 본 발명의 역전사효소의 바람직한 반감기는, 이용된 온도에 따라서, 4분 내지 10시간, 4분 내지 7.5시간, 4분 내지 5시간, 4분 내지 2.5시간, 또는 4분 내지 2시간 범위일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 역전사효소의 역전사효소 활성은 48℃, 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃, 62℃, 64℃, 66℃, 68℃ 및/또는 70℃의 온도에서 적어도 4분, 적어도 5분, 적어도 6분, 적어도 7분, 적어도 8분, 적어도 9분, 적어도 10분, 적어도 11분, 적어도 12분, 적어도 13분, 적어도 14분, 적어도 15분, 적어도 20분, 적어도 25분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 60분, 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 115분, 적어도 125분, 적어도 150분, 적어도 175분, 적어도 200분, 적어도 225분, 적어도 250분, 적어도 275분, 적어도 300분, 적어도 400분, 적어도 500분의 반감기를 가질 수 있다.
열반응성. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "열반응성" 또는 "열안정성의"는 상승된 온도에서 효소 활성을 나타내는 역전사효소의 능력을 지칭한다.
열안정성. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "열안정성" 또는 "열안정성의"는 상승된 온도에 대한 노출을 견디지만 반드시 이러한 상승된 온도에서 활성을 보일 필요는 없는 능력을 지칭한다.
진행도. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "진행도"는 핵산 주형으로부터 해리되는 일 없이 프라이머를 계속해서 연장하는 역전사효소의 능력을 지칭한다. 효소가 복제될 수 있는 주형의 길이(예컨대, "X 효소가 9kb 주형을 중합할 수 있거나" 또는 "X 효소가 약 6000개 염기 길이인 cDNA를 생산할 수 있음)는 또한 주어진 효소의 진행도를 기술하는데 이용될 수 있다.
저해제 내성. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "저해제 내성"은 역전사효소에 대해서 전형적으로 저해성인(역전사효소 활성을 방지 또는 저해하는) 화합물, 화학약품, 단백질, 완충제 등의 존재 하에 역전사를 수행하는 역전사효소의 능력을 지칭한다.
충실도(fidelity). 충실도는, 주형에 대해서 상보적인 핵산 분자를 합성할 경우 부정확한 기질(예컨대, 뉴클레오타이드)로부터 정확한 기질을 구별하는 역전사효소의 능력 또는 중합 정확도를 지칭한다. 역전사효소의 충실도가 높을수록, 역전사효소는 핵산 합성 동안 성장하는 가닥에 뉴클레오타이드를 착오혼입시키는 것을 줄일 수 있으며; 즉, 충실도의 증가 또는 증대는 감소된 에러율 또는 감소된 착오혼입율을 가진 더욱 신뢰성 있는 역전사효소를 얻게 된다.
약. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "약"은 인용된 수 + 또는 - 10%를 의미한다. 따라서 "약 100"은 90 내지 110의 범위 내의 전체 범위의 값을 포함한다.
역전사효소의 공급원
본 발명에 따르면, 돌연변이 또는 변형은 효소의 열안정성 및/또는 열반응성을 증가시키기 위하여 또는 효소에 기타 특성, 예컨대, 증가된 특이성, 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성, 및/또는 곤란한 RNA 주형으로부터 cDNA를 생성하는 증가된 능력을 부여하기 위하여 역전사효소 활성을 가진 임의의 역전사효소 또는 폴리펩타이드에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 조성물, 방법 및 키트에서 사용하기 위한 역전사효소는 역전사효소 활성을 가진 임의의 효소 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 효소는 레트로바이러스 역전사효소, 레트로트랜스포존(retrotransposon) 역전사효소, B형 간염 역전사효소, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 역전사효소, 박테리아 역전사효소, Tth DNA 중합효소, Taq DNA 중합효소(Saiki, R. K., et al., Science 239:487-491 (1988); 미국 특허 제4,889,818 및 4,965,188), Tne DNA 중합효소(WO 96/10640), Tma DNA 중합효소(미국 특허 제5,374,553) 및 이의 돌연변이, 단편, 변이체 또는 유도체(예컨대, 공동 소유인 미국 특허 제5,948,614호 및 제6,015,668호(이들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨))를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
바람직한 역전사효소는 레트로바이러스 역전사효소, 예컨대, 말로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 역전사효소, 라우스 육종 바이러스(RSV) 역전사효소, 조류 골수아구증 바이러스(AMV) 역전사효소, 라우스-관련 바이러스(RAV) 역전사효소, 및 골수아세포증-관련 바이러스(MAV) 역전사효소 또는 기타 조류 육종 백혈병 바이러스(Avian sarcoma leukosis virus: ASLV) 역전사효소를 포함한다. 본 발명의 역전사효소를 만들기 위하여 돌연변이될 수 있는 추가의 역전사효소는 박테리아 역전사효소(예컨대, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 역전사효소)(예컨대, 문헌[Mao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:489-93 (1996)] 참조) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 역전사효소(예컨대, Ty1 또는 Ty3 레트로트랜스포존의 역전사효소)(예컨대, 문헌[Cristofari et al., Jour. Biol. Chem. 274:36643-36648 (1999); Mules et al., Jour. Virol. 72:6490-6503 (1998)] 참조)를 포함한다. 기재된 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 기타 역전사효소는, 예를 들어, 개코원숭이, 계두, 코알라 곰, 및 멧돼지 종으로부터 단리된 바이러스로부터 단리된 역전사효소를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 본 발명에 포함된 역전사효소와 동일하거나 동일한 기능을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 명세서에서 어구 "동일한" 또는 "와 동일한 기능을 갖는"은 두 폴리뉴클레오타이드가 이들이 잘 알려진 컴퓨터 알고리즘에 의해 적절하게 배열된 경우 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 동일성을 발휘하는 것을 나타낸다.
본 발명은 야생형 역전사효소(예컨대, M-MLV 역전사효소 효소; 서열번호 2), AMV 역전사효소, RSV 역전사효소, HIV 역전사효소 등)에 대한 아미노산 수준과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 증가된 열안정성 및/또는 본 발명의 기타 바람직한 특성을 나타내는 역전사효소를 더 포함한다. 또한 이하에서 서열번호 4에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 역전사효소에 대한 아미노산 수준과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 증가된 열안정성 및/또는 열반응성을 나타내는 역전사효소가 본 발명 내에 포함된다.
본 발명은 또한 적어도 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 또는 700개의 아미노산 잔기를 포함하고 역전사효소와 연관된 하나 이상의 활성을 보유하는 역전사효소의 단편을 포함한다. 이러한 단편은, 결실 돌연변이에 의해, 당업계에 잘 알려지고 통상적인 재조합 수법에 의해, 또는 많은 잘 알려진 단백질분해 효소 중 임의의 것을 이용해서 관심 대상 역전사효소(들)의 효소 소하에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 역전사효소 단편은 위에서 기재된 단편들 중 하나 이상과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩타이드를 더 포함한다. 본 발명은 또한 많은 이들 단편의 각종 조합에 관한 것이다.
기준 아미노산 서열과 적어도 예를 들어 70% "동일한" 아미노산 서열을 가진 단백질 또는 단백질 단편이란, 단백질 서열이 기준 단백질의 아미노산 서열 중 각 100개의 아미노산당 30개까지의 아미노산 변형을 포함할 수 있는 것을 제외하고 단백질의 아미노산 서열이 기준 서열에 대해서 동일한 것으로 의도된다. 즉, 기준 아미노산 서열에 대해서 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 얻기 위하여, 기준 서열 내 아미노산 잔기의 30%까지가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 내 총 아미노산 잔기의 30%까지의 아미노산의 수가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변형은 기준 아미노산 서열의 아미노 (N-) 및/또는 카복시 (C-) 말단 위치에서 그리고/또는 기준 서열 내의 잔기들 중 개별적으로 개입된 이들 말단 위치 사이의 어느 곳인가에서 그리고/또는 기준 서열 내의 하나 이상의 연속 기 내에서 일어날 수 있다. 현실적으로는, 주어진 아미노산 서열이 예를 들어 기준 단백질의 아미노산 서열에 대해서 적어도 70% 동일한지의 여부는, 통상적으로 핵산 서열 동일성 판정을 위하여 위에서 기재된 것들과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하거나 또는 CLUSTAL W 프로그램을 이용해서 결정될 수 있다(Thompson, J. D., et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994)).
서열 동일성은 기준 서열 또는 기준 서열의 하위서열을 시험 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다. 기준 서열 및 시험 서열은 비교창이라 불리는 많은 잔기에 대해서 최적으로 정렬된다. 최적 정렬, 부가 또는 결실을 얻기 위하여, 예컨대, 갭이 시험 서열 내로 도입될 수 있다. 서열 동일성 퍼센트는 동일한 잔기가 두 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하고 정합 위치의 수를 비교 창 내 서열의 총 길이로 나누고 여기에 100을 곱하여 퍼센트를 부여함으로써 결정된다. 정합 위치의 수에 부가해서, 갭의 수와 크기가 또한 서열 동일성 퍼센트를 계산함에 있어서 고려된다.
서열 동일성은 전형적으로 컴퓨터 프로그램을 이용해서 결정된다. 대표적인 프로그램은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공중이 접근 가능한 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램이다. 이 프로그램은 수학의 통계학적 유의도를 결정하기 위하여 시험 서열의 세그먼트를 데이터 베이스 내의 서열과 비교하고, 이어서 역치 수준보다 더 유의한 것과 정합하는 것만을 식별하여 보고한다. BLAST 프로그램의 적절한 버전, 예를 들어, 버전 2.X(Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402, 1997)는 갭을 허용하는 것이다. 뉴클레오타이드 서열(blastn) 또는 단백질(blastp)을 검색하기 위한 표준 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다. 쿼리 서열(query sequence)이 즉 뉴클레오타이드 서열에서 단백질(blastx)로 또는 단백질에서 핵산 서열(tbblastn)로 해독되는 해독된 쿼리 검색이 또한 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이 쿼리 내의 뉴클레오타이드 쿼리 서열이 모두 6개의 해독틀 내에서 단백질 서열로 해독되고 나서, 모두 6개의 해독틀(tbblastx)에서 해독된 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스와 비교된다.
본 발명의 단백질에 대해서 서열 동일성 또는 유사성을 가진 단백질을 동정하기 위한 추가의 적절한 프로그램은 PHI-BLAST(Pattern Hit Initiated BLAST, Zhang, et al., Nucleic Acids Res. 26(17):3986-90, 1998) 및 PSI-BLAST(Position-Specific Iterated BLAST, Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402, 1997)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
프로그램은 디폴트 검색 파라미터와 함께 이용될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 검색 파라미터가 조정될 수 있다. 적절한 검색 파라미터 값을 선택하는 것은 당업자의 능력 이내이다.
본 발명에서 이용하기 위한 몇몇 역전사효소 효소는 RNase H 활성이 저감되거나 실질적으로 저감되거나 결여된 것들을 포함한다. RNase H 활성이 저감되거나 실질적으로 저감된 이러한 효소는 위에서 기재된 역전사효소 중 어느 것인가의 RNase H-유도체를 포함하며, 예를 들어, 관심 대상 역전사효소 내의 RNase H 도메인을 돌연변이시킴으로써, 예를 들어, 본 명세서의 어느 곳에선가 기재된 바와 같이, 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3,4, 5, 10, 12, 15, 20, 30 등)의 점 돌연변이, 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3,4, 5, 10, 12, 15, 20, 30 등)의 결실 돌연변이 및/또는 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3,4, 5, 10, 12, 15, 20, 30 등)의 삽입 돌연변이를 도입함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 이러한 돌연변이는 미국 특허 제8,541,219호 및 제8,753,845호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌은 그들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
"RNase H 활성이 실질적으로 저감된"이란 효소가 대응하는 야생형 또는 RNase H+ 효소, 예컨대, 야생형 말로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MLV), 조류 골수아구증 바이러스(AMV) 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 역전사효소의 RNase H 활성의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20%, 더 바람직하게는 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 7.5% 미만, 또는 약 5% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만, 약 2% 미만을 갖는 것을 의미한다. RNase H 활성의 저감은, 예를 들어, 대응하는 야생형 또는 미돌연변이 역전사효소에 비해서 활성의 임의의 저감을 의미한다. 이와 같이 해서, 일 양상에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소에 비해서 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%의 RNase H 활성을 지닐 수 있거나 이러한 활성을 지니지 않을 수 있다.
저감된, 실질적으로 저감된, 미검출 가능한 또는 결여된 RNase H 활성을 지니는 역전사효소는 이전에 기재되어 있었다(미국 특허 제5,668,005호, 미국 특허 제6,063,608호 및 PCT 공개 제WO 98/47912호 참조). 임의의 효소의 RNase H 활성은, 예를 들어, 미국 특허 제5,244,797호(Kotewicz, M. L. 등), 문헌[Nucl. Acids Res. 16:265 (1988), Gerard, G. F., et al., FOCUS 14(5):91 (1992)], PCT 공개 제WO 98/47912호 및 미국 특허 제5,668,005호에 기재된 것들과 같은 각종 검정에 의해 결정될 수 있으며, 이들 모든 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 전체적으로 편입된다.
기재된 검정법 중 하나 이상에 의해 검출 가능한 RNase H 활성이 없거나 RNase H 활성이 결여된 역전사효소가 또한 본 발명에 따라서 상정될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명에서 이용하기 위한 돌연변이 효소는, M-MLV H-역전사효소, RSV H-역전사효소, AMV H-역전사효소, RAV H-역전사효소, MAV H-역전사효소 및 HIV H-역전사효소를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 그러나 당업자라면, RNase H 활성이 저감되거나 실질적으로 저감된 리보핵산 분자(즉, 역전사효소 활성을 지님)로부터 DNA 분자를 생산할 수 있는 임의의 효소가 본 발명에 따라서 동등하게 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
대안적으로, 본 발명의 역전사효소 효소는 RNase H 활성을 저감시키는 RNase H 도메인의 어떠한 변형 또는 돌연변이도 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소와 동등한 100% RNase H 활성을 지닐 수 있다.
본 발명에서 이용하기 위한 역전사효소 효소 또는 폴리뉴클레오타이드는 또한 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 활성이 저감되었거나, 실질적으로 저감되었거나 또는 제거된 것들을 포함한다. 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 활성이 저감 또는 실질적으로 저감되거나 TdT 활성이 제거된 이러한 효소는, 예를 들어, 주형-프라이머와 근접하거나 접촉하고 있는 관심 대상 역전사효소 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써, 예를 들어, 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 20, 30 등)의 점 돌연변이, 하나 이상의 결실 돌연변이 및/또는 하나 이상의 삽입 돌연변이를 도입함으로써 얻어질 수 있다. 감소된 TdT 활성을 나타내는 역전사효소는 미국 특허 제7,056,716호(공고일: 2006년 6월 6일)(그 전체 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기술되어 있다.
본 발명에서 이용하기 위한 효소는 또한 증가된 충실도를 나타내는 것들을 포함한다. 증가된 충실도를 나타내는 역전사효소는 미국 특허 출원 제60/189,454호(출원일: 2000년 3월 15일) 및 미국 특허 제7,056,716호(공고일: 2006년 6월 6일)(이들의 전체 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기술되어 있다.
따라서, 구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 증가된 열안정성 및/또는 증가된 열반응성을 나타내는 역전사효소를 포함하고, 임의로 또한 하기 특성들 중 하나 이상을 발휘한다: (1) 저감되거나 실질적으로 저감된 RNase H 활성, (2) 저감되거나 실질적으로 저감된 TdT 활성, 및/또는 (3) 증가된 충실도.
본 발명은 위에서 기재된 돌연변이 역전사효소 및 역전사효소 단편을 암호화하는 핵산 분자를 또한 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소 및 역전사효소 단편을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 3과 적어도 80%(예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) 동일하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소 및 역전사효소 단편을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 3을 포함한다.
당업자라면 이해할 것인 바와 같이, 본 발명에 따라서 돌연변이된 역전사효소는 당업계에 충분히 공지되어 있고 통상적인 재조합 또는 유전자 공학 수법에 의해 얻어질 수 있다(예컨대, 문헌[Kotewicz, M. L., et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988); Soltis, D. A., and Skalka, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3372-3376 (1988)]; 미국 특허 제5,668,005호; 및 PCT 공개 제WO 98/47912호). 돌연변이 역전사효소는, 예를 들어, 부위-유도된 또는 무작위 돌연변이유발에 의해 위에서 기재된 것들과 같은 역전사효소 활성을 가진 역전사효소 또는 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 유전자(들) 또는 핵산 서열을 돌연변이시킴으로써 얻어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 점 돌연변이, 결실 돌연변이 및 삽입 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 점 돌연변이(예컨대, 하나 이상의 아미노산을 하나 이상의 상이한 아미노산으로 치환)가 본 발명의 돌연변이 역전사효소를 작제하는데 이용된다. 역전사효소의 단편은 당업계에 충분히 공지되어 있고 통상적인 재조합 수법에 의한 또는 충분히 공지된 단백질분해 효소의 수 중 어느 것인가를 이용해서 관심대상 역전사효소(들)의 효소 소화에 의한 결실 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명에 따라서 돌연변이되고 단리될 역전사효소를 암호화하는 유전자 또는 다른 핵산 분자를 클로닝하기 위하여, 개방 해독틀 또는 역전사효소 유전자를 포함하는 DNA가 재조합 DNA 라이브러리를 작제하는데 이용될 수 있다. 당업계에 충분히 공지된 임의의 벡터가, 관심 대상 역전사효소를 클로닝하는데 이용될 수 있다. 그러나, 이용된 벡터는 재조합 벡터가 형질전환될 숙주와 양립 가능해야 한다.
본 발명은 또한 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 형질전환체는 상기 발현 벡터를 무작위 원핵 세포 또는 진핵 세포 내로 삽입함으로써 용이하게 작제될 수 있다. 특정 벡터를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 pBAD 벡터(+/- 부가적인 무관한 서열, 예를 들어 His Tag)는 이. 콜라이 Top10 세포에 도입되어 형질전환체의 구축을 유도한다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터의 작제를 위하여 이용되는 벡터는 제한되지 않고, 원핵생물 또는 진핵생물의 형질전환을 위한 임의의 통상의 벡터가 이용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 재조합 발현 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 돌연변이 유전자를 삽입함으로써 작제된다.
플라스미드 라이브러리를 작제하기 위한 원핵 벡터는, 예를 들어, pBR322, ColE1, pSC101, pUC-벡터와 같이 이. 콜라이 중에서 복제 가능한 것들과 같은 플라스미드를 포함한다(pUC18, pUC19 등: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). 바실러스(Bacillus) 플라스미드는 pC194, pUB110, pE194, pC221, pC217 등을 포함한다. 이러한 플라스미드는 문헌[Glyczan, T., The Molecular Biology Bacilli, Academic Press, York (1982), 307-329]에 개시되어 있다. 적절한 스트렙토마이세스(Streptomyces) 플라스미드는 pIJ101을 포함한다(Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183 (1987)). 슈도모나스(Pseudomonas) 플라스미드는 John 등(Rad. Insec. Dis. 8:693-704 (1986)) 및 Igaki(Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978))에 의해 검토되어 있다. 광범위-숙주 플라스미드 또는 코스미드, 예컨대, pCP13(Darzins and Chakrabarty, J. Bacteriol. 159:9-18 (1984))이 또한 본 발명을 위하여 이용될 수 있다. 본 발명의 유전자 및 핵산 분자를 클로닝하기 위한 바람직한 벡터는 원핵 벡터이다. 바람직하게는, pBAD, pCP13 및 pUC 벡터는 본 발명의 유전자를 클로닝하는데 이용된다. 기타 적절한 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 상업적으로 입수 가능하다.
관심대상 역전사효소 유전자 및 핵산 분자를 클로닝하기 위한 적절한 숙주는 원핵 숙주이다. 원핵 숙주의 일례는 이. 콜라이이다. 그러나, 본 발명의 목적으로 하는 역전사효소 유전자 및 핵산 분자는 에세리키아, 바실러스, 스트렙토마이세스, 슈도모나스, 살모넬라, 세리티아(Serratia) 및 프로테우스(Proteus)속의 숙주를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 기타 원핵 숙주에서 클로닝될 수 있다. 특정 관심대상 박테리아 숙주는 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies, Corp.)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터 얻어질 수 있는 이. 콜라이 DH10B이다.
관심대상 역전사효소의 클로닝 및 발현을 위한 진핵 숙주는 효모, 진균 및 포유동물 세포를 포함한다. 이러한 진핵 세포에서의 목적으로 하는 역전사효소의 발현은 진핵 프로모터를 포함하는 진행 조절 영역의 사용을 필요로 할 수 있다. 진핵 세포 내 역전사효소 유전자 또는 핵산 분자의 클로닝 및 발현은 잘 알려진 진핵 벡터 시스템을 이용해서 잘 알려진 수법에 의해 달성될 수 있다.
일단 DNA 라이브러리가 특정 벡터 내에 구축되었다면, 적절한 숙주는 잘 알려진 수법에 의해 형질전환된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 형질전환 세포는 페트리접시당 대략 200 내지 300개의 형질전환된 콜로니를 생산하는 밀도로 평판배양된다. 역전사효소의 선택을 위하여, 콜로니는 이어서 당업자에게 충분히 공지된 방법을 이용해서 역전사효소 또는 열안정성 역전사효소의 발현을 위하여 선별될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 개별의 형질전환체 콜로니의 하룻밤 배양액이 용해되고 50℃에서 15분 동안 가열되고 나서 형광-표지된 줄기 루프 주형(예컨대 FRET 검정)을 이용해서 역전사효소 또는 열안정성 역전사효소 활성 및/또는 기타 바람직한 활성에 대해서 검정된다. 예를 들어, 문헌[Nikiforov, T. T., Anal Biochem., 2011, 412(2): 229-36] 참조. 몇몇 실시형태에 있어서, 열안정성 역전사효소 활성 및/또는 기타 목적으로 하는 활성이 검출되고, 돌연변이체는 아미노산이 역전사효소 활성을 유지하는지를 결정하기 위하여 서열분석된다. 본 발명의 역전사효소를 암호화하는 유전자 또는 핵산 분자는 당업자에게 공지된 수법을 이용해서 클로닝될 수 있다.
돌연변이 역전사효소
본 발명에 따라서, 많은 특정 돌연변이가 역전사효소에 대해서 이루어질 수 있고, 바람직한 양상에 있어서, 다수의 돌연변이는 증가된 열안정성, 열활성, 저해제에 대한 증가된 내성을 초래하고/하거나 기재된 바와 같은 역전사효소에 대한 기타 바라직한 특성을 부여하기 위하여 이루어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 점 돌연변이, 틀 이동 돌연변이, 결실 및 삽입을 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상아미노산 치환에 기인하는 하나 이상의 점 돌연변이는 증대된 또는 증가된 열안정성 및/또는 열반응성 또는 저해제에 대한 증가된 내성을 가진 역전사효소를 생산하는데 이용된다.
돌연변이는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용해서 본 발명의 역전사효소에 도입될 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어, 2가 금속 이온 보조인자로서 망간의 존재 하에 PCR 반응을 행함으로써 무작위로 도입될 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드 유도된 돌연변이유발은 암호화 DNA 분자를 따라 임의의 결정된 부위에서 모든 가능한 부류의 염기쌍 변화를 허용하는 돌연변이 중합효소를 작성하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 이 수법은 관심대상 역전사효소를 암호화하는 단일 가닥 뉴클레오타이드 서열에 대해서 상보적인(하나 이상의 부정합 제외) 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하는 것을 포함한다. 이어서 부정합된 올리고뉴클레오타이드는 DNA 중합효소에 의해 연장되어, 하나의 가닥에 목적으로 하는 서열의 변화를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자를 생성한다. 서열의 변화는, 예를 들어, 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입을 유발할 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 이어서 적절한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 돌연변이 폴리펩타이드가 이와 같이 해서 생산될 수 있다. 위에서 기재된 올리고뉴클레오타이드 유도 돌연변이유발은, 예를 들어, PCR을 통해서 수행될 수 있다.
일반적으로, 본 발명은, 역전사효소에 그의 미돌연변이 상대방에 비해서 더욱 열안정성 및/또는 열반응성을 부여하는 특정 아미노산 부위에서 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20 등)의 돌연변이 또는 변형을 가진 역전사효소를 부분적으로 제공한다. 본 발명은 또한 역전사효소에 대응하는 미돌연변이 역전사효소보다 더욱 효율적으로(예컨대, 증가된 속도 및/또는 진행도를 지님), 더욱 특이적으로, 역전사효소 저해제에 대한 더 많은 내성을 부여하고/하거나 곤란한 RNA 주형으로부터 cDNA를 더 양호하게 발생시킬 수 있는 하나 이상의 특정 돌연변이 또는 변형을 가진 역전사효소를 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 역전사효소의 돌연변이 또는 변형은 증가된 또는 증대된 열안정성 및/또는 열반응성을 가진 돌연변이된 역전사효소를 생산하는 방식으로 역전사효소 효소의 인식된 영역(예컨대, pol 또는 RNase H 영역)에서 이루어진다. 변형 또는 돌연변이는 또한 본 발명에 따라 기타 영역(예컨대, 효소 Kd, 열안정성, 충실도, 기질 결합 등에서 역할하는 것으로 알려진 영역들)에서 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 명세서의 어딘가에서 기재된 바와 같이, 증가된 열안정성(뿐만 아니라 기타 특성)을 발휘하고 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 등)의 특정 돌연변이 또는 변형 또는 돌연변이들 또는 변형들의 조합을 가진 역전사효소를 포함한다.
본 발명의 소정의 실시형태에 있어서, 아미노산 치환은 이하의 표 1에 나열된 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치의 하나 이상(예컨대, 아미노산 위치 51, 67, 69, 196, 197, 200, 204, 289, 302, 306, 309, 313, 435, 454, 524, 562, 583, 594, 603, 653 및 671)에서 이루어진다. 본 발명에 따라서, 이들 위치에서의 야생형 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val을 포함하는 임의의 기타 아미노산으로 치환될 수 있다. 이들 위치에서의 소정의 예시적인 아미노산은 표 1에 나열된 것들이다(예컨대, L/P51, S/R/N/K67, K/E69, S/P196, T/A/S/G197, N/D200, H/R204, L/M289, K/R/E/G302, T/K306, F/Y/I/N309, F/L/C/W313, P/T330, L/V/R/G435, N/K454 D/G524, Q/E562, N/D583, N/D594, H/Q603, H/N/D653 및 L/P671). 따라서, 증가된 열안정성 및/또는 열반응성을 나타내는 본 발명에 따른 역전사효소의 구체적인 예는 다음과 같은 M-MLV 역전사효소를 포함한다: (1) 51번 위치에서의 잔기가 프롤린(P) 또는 라이신(L)이고; (2) 67번 위치에서의 잔기가 세린(S), 아르기닌(R), 라이신(K) 또는 아스파라긴(N)이며; (3) 69번 위치에서의 잔기가 글루탐산(E) 또는 라이신(K)이고; (4) 196번 위치에서의 잔기가 프롤린(P) 또는 세린(S)이며; (5) 197번 위치에서의 잔기가 트레오닌(T), 글리신(G), 세린(S) 또는 알라닌(A)이고; (6) 200번 위치에서의 잔기가 아스파르트산(D) 또는 아스파라긴(N)이며; (7) 204번 위치에서의 잔기가 히스티딘 또는 아스파라긴(R)이고; (8) 289번 위치에서의 잔기가 메티오닌(M) 또는 류신(L)이며; (9) 302번 위치에서의 잔기가 글루탐산잔기(E), 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 글리신(G)이고; (10) 306번 위치에서의 잔기가 트레오닌(T) 또는 라이신(K)이며; (11) 309번 위치에서의 잔기가 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 아이소류신(I) 또는 아스파라긴(N)이고; (12) 313번 위치에서의 잔기가 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 류신(L) 또는 시스테인(C)이며; (13) 330번 위치에서의 잔기가 타이로신(Y) 또는 프롤린(P)이고; (14) 435번 위치에서의 잔기가 류신(L), 발린(V), 아르기닌(R) 또는 글리신(G)이며; (15) 454번 위치에서의 잔기가 아스파라긴(N) 또는 라이신(K)이고; (16) 524번 위치에서의 잔기가 아스파르트산(D) 또는 글리신(G)이며; (17) 562번 위치에서의 잔기가 글루탐산(E) 또는 글루타민(Q)이고; (18) 583번 위치에서의 잔기가 아스파르트산(D) 또는 아스파라긴(N)이며; (19) 594번 위치에서의 잔기가 히스티딘(H) 또는 글루타민(Q)이고; (20) 603번 위치에서의 잔기가 류신(L) 또는 트립토판(W)이며; (21) 653번 위치에서의 잔기가 아스파르트산(D), 히스티딘(H) 또는 아스파라긴(N)이고; 그리고 (22) 671번 위치에서의 잔기가 류신(L) 또는 프롤린(P)이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
몇몇 실시형태에 있어서, 열반응성 및/또는 열안정성 특성을 변경시키는 역전사효소의 돌연변이 또는 변형이 역전사효소(예컨대, RNase H 활성, 역전사효소 또는 중합효소 활성, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdTase) 활성 등)와 통상적으로 연관된 활성에 대한 효과를 거의 또는 전혀 갖지 않거나 또는 실질적으로 역전사효소와 통상적으로 연관된 이들 활성의 하나 이상을 변경하는 변형과 함께 존재한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 야생형 M-MLV(서열번호 2) 역전사효소의 S67, T197 및 E302 위치에 대응하거나 이와 동등한 위치에서의 하나 이상돌연변이는 목적으로 하는 결과(예컨대, 증가된 열안정성, 증가된 열반응성, 증가된 효능(속도 및 진행도), 증가된 특이성, 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성, 및 곤란한 RNA 주형으로부터 cDNA를 생성하는 증가된 능력)를 내기 위하여 행해질 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 기준 틀로서의 M-MLV 역전사효소의 아미노산 위치를 이용해서, 본 발명의 역전사효소는 하기 변형: (S67R, S67N 또는 S67K), (T197A, T197S, T197G) 및 (302K, E302R 또는 E302G) 중 하나 이상에 대해서 위치 대응하는 변형을 가진 임의의 역전사효소(예컨대, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, RSV 역전사효소, 예를 들어, 개코원숭이, 계두, 코알라 곰 및 멧돼지 종으로부터 단리된 바이러스로부터의 역전사효소)뿐만 아니라 이들 돌연변이된 단백질을 함유하는 조성물, 키트 및 반응 혼합물, 이들 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이들 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 야생형 M-MLV(서열번호 2) 역전사효소의 위치 P51, E69, P196, D200, H204, M289, T306, F309, W313, T330, L435, N454, D524, E562, D583, H594, L603, D653 및 L671에 대응하거나 이와 동등한 위치에서의 6개 이상의 돌연변이는 목적으로 하는 결과(예컨대, 증가된 열안정성, 증가된 열반응성, 증가된 효능(속도 및 진행도), 증가된 특이성, 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성, 및/또는 곤란한 RNA 주형으로부터 cDNA를 생성하는 증가된 능력)를 내기 위하여 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에 있어서, M-MLV 역전사효소의 아미노산 위치를 기준 틀로서 이용해서, 본 발명의 역전사효소는 하기 변형: P51L, E69K, P196S, D200N, H204R, M289L, T306K, (F309N, F309Y 또는 F309I), (W313F, W313L 또는 W313C), T330P, (L435G, L435V 또는 L435R), N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, (D653N 또는 D653H), 및 L671P 중 6개 이상을 가진 임의의 역전사효소(예컨대, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, RSV 역전사효소, 예를 들어, 개코원숭이, 계두, 코알라 곰 및 멧돼지 종으로부터 단리된 바이러스로부터의 역전사효소)뿐만 아니라, 이들 돌연변이된 단백질을 함유하는 조성물 및 반응 혼합물, 이들 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이들 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 야생형 M-MLV(서열번호 2) 역전사효소의 위치 S67, T197 및 E302에 대응하거나 이와 동등한 위치에서의 하나 이상의 돌연변이, 부가적으로 위치 P51, E69, P196, D200, H204, M289, T306, F309, W313, T330, L435, N454, D524, E562, D583, H594, L603, D653 및 L671에 대응하거나 이와 동등한 위치에서의 하나 이상의 돌연변이는 목적으로 하는 결과(예컨대, 증가된 열안정성, 증가된 열반응성, 증가된 효능(속도 및 진행도), 증가된 특이성, 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성, 및/또는 곤란한 RNA 주형으로부터 cDNA를 생성하는 증가된 능력)를 내기 위하여 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에 있어서, M-MLV 역전사효소의 아미노산 위치를 기준 틀로서 이용해서, 본 발명의 단백질은, 하기 변형: (S67R, S67N 또는 S67K), (T197A, T197S, T197G) 및 (302K, E302R 또는 E302G) 중 하나 이상 그리고 부가적으로 하기 변형: P51L, E69K, P196S, D200N, H204R, M289L, T306K, (F309N, F309Y 또는 F309I), (W313F, W313L 또는 W313C), T330P, (L435G, L435V 또는 L435R), N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, (D653N 또는 D653H), 및 L671P 중 하나 이상을 가진 역전사효소(예컨대, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, RSV 역전사효소, 예를 들어, 개코원숭이, 계두, 코알라 곰 및 멧돼지 종으로부터 단리된 바이러스로부터의 역전사효소)뿐만 아니라, 이들 돌연변이된 단백질을 함유하는 조성물 및 반응 혼합물, 이들 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이들 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 야생형 M-MLV(서열번호 2) 역전사효소의 위치 P51, E69, P196, D200, H204, M289, T306, F309, W313, T330, L435, N454, D524, E562, D583, H594, L603, D653 및 L671에 대응하거나 이와 동등한 위치에서의 6개 이상의 돌연변이 그리고, 부가적으로, 위치 S67, T197 및 E302에 대응하거나 이와 동등한 위치에서의 하나 이상의 돌연변이는 목적으로 하는 결과(예컨대, 증가된 열안정성, 증가된 열반응성, 증가된 효능(속도 및 진행도), 증가된 특이성, 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성, 및/또는 곤란한 RNA 주형으로부터 cDNA를 생성하는 증가된 능력)를 내기 위하여 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에 있어서, M-MLV 역전사효소의 아미노산 위치를 기준 틀로서 이용해서, 본 발명의 단백질은 하기 변형: P51L, E69K, P196S, D200N, H204R, M289L, T306K, (F309N, F309Y 또는 F309I), (W313F, W313L 또는 W313C), T330P, (L435G, L435V 또는 L435R), N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, (D653N 또는 D653H), 및 L671P 중 6개 이상, 그리고 부가적으로 하기 변형: (S67R, S67N 또는 S67K), (T197A, T197S 또는 T197G), 및 (E302K, E302R 또는 E302G) 중 하나 이상을 가진 역전사효소(예컨대, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, RSV 역전사효소, 예를 들어, 개코원숭이, 계두, 코알라 곰 및 멧돼지 종으로부터 단리된 바이러스로부터의 역전사효소)뿐만 아니라, 이들 돌연변이된 단백질을 함유하는 조성물 및 반응 혼합물, 이들 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이들 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 야생형 M-MLV(서열번호 2) 역전사효소의 위치 S67, T197 및 E302와, 부가적으로 위치 P51, E69, H204, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671에 대응하거나 이와 동등한 각 위치에서의 돌연변이는 목적으로 하는 결과(예컨대, 증가된 열안정성, 증가된 열반응성, 증가된 효능(속도 및 진행도), 증가된 특이성, 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성, 및/또는 곤란한 RNA 주형으로부터 cDNA를 생성하는 증가된 능력)를 내기 위하여 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에 있어서, M-MLV 역전사효소의 아미노산 위치를 기준 틀로서 이용해서, 본 발명의 단백질은 하기 변형: (S67R, S67N 또는 S67K), (T197A, T197S 또는 T197G) 및 (302K, E302R 또는 E302G)과, 부가적으로, P51L, E69K, H204R, (F309N, F309Y 또는 F309I), (W313F, W313L 또는 W313C), T330P, (L435G, L435V 또는 L435R), N454K, D524G, D583N, H594Q, (D653N 또는 D653H), 및 L671P를 가진 역전사효소(예컨대, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, RSV 역전사효소, 예를 들어, 개코원숭이, 계두, 코알라 곰 및 멧돼지 종으로부터 단리된 바이러스로부터의 역전사효소)뿐만 아니라, 이들 돌연변이된 단백질을 함유하는 조성물 및 반응 혼합물, 이들 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이들 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 본 명세서에서 "Mut D9"(서열번호 4)로서도 지칭되는 하기 돌연변이: P51L, S67R, E69K, T197A, H204R, E302M, F309N, W313F, T330P, L435G, N454K, D524G, D583N, H594QD653N 및 L671P를 구비한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 서열번호 4와 적어도 70%의 아미노산 서열 동일성 및 본 명세서에 기재된 특성을 가진 돌연변이 역전사효소 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 서열번호 4에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 서열번호 4를 포함하는 돌연변이 역전사효소 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소 또는 폴리펩타이드의 특성은 하기 특성들 중 하나 이상을 포함한다: (a) 증가된 열안정성; (b) 증가된 열반응성; (c) 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성; (d) 증가된 속도; (e) 감소된 프라이머-무함유 역전사; 및 (f) 증가된 진행도.
위에서 확인된 M-MLV 역전사효소의 대응하는 위치는 당업자에 의해 다른 역전사효소를 용이하게 확인될 수 있다. 따라서, 본 출원에서 기재된 검정법 및 정해진 영역을 고려해서, 당업자라면 관심대상 임의의 역전사효소의 증가된 열안정성, 증가된 열활성, 및/또는 기타 목적으로 하는 특성을 유발하는 특정 변형을 행할 수 있다. 본 발명에 따라서 돌연변이될 기타 공지된 역전사효소 및 잔기에 대한 확인된 관심대상 영역은 도 1a 내지 도 1d에 나열된 것들을 포함할 수 있다.
야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 1)에 대한 뉴클레오타이드 서열은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Shinnick et al., 1981, Nature 293:543-548; Georgiadis et al., 1995, 구조 3:879-892)](이의 개시 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨) 참고.
몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 유도 돌연변이유발은 암호화 DNA 분자에 따라 임의의 결정된 부위에서 모든 가능한 부류의 염기쌍 변화를 허용하는 돌연변이 역전사효소를 작성하는데 이용된다. 당업자라면 일단 치환된 아미노산이 재차 유사한 특성(즉, 보존적 아미노산 치환)을 가진 다른 아미노산으로 대체될 때에도, 유사한 생리적 및 생화학적 특성이 여전히 관찰되는 것을 잘 알고 있다. 각종 아미노산 특성과 단백질 구조 및 기능에 대한 아미노산 치환의 효과는 당업자에 의해 잘 연구되어 있었다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소보다 더 높은 열안정성 및/또는 열반응성을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 하기 돌연변이: P51L, S67R, E69K, T197A, H204R, E302K, F309N, W313F, T330P, L435G, N454K, D524G, D583N, H594Q, D653N 및 L671P를 가진 M-MLV 돌연변이 역전사효소는, 60℃에서 증가된 열안정성을 나타낸다. 특히, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 돌연변이 M-MLV 역전사효소는 60℃보다 훨씬 낮은 온도(즉, 각각 37℃, 42℃ 및 50℃)에서의 기타 상업적으로 입수 가능한 M-MLV 유도체 역전사효소(예컨대, Q-SS, SSII 및 SSIII)에 비해서뿐만 아니라 야생형 M-MLV 역전사효소에 비해서 60℃에서 증가된 역전사효소 활성을 나타낸다. 예를 들어, 도 2 참조.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소에 비해서 증가된 역전사효소 활성을 나타낸다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 37℃ 이상의 반응 온도에서 증가된 역전사효소 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소는 38℃, 40℃, 42℃, 45℃, 48℃, 50℃, 52℃, 55℃, 58℃, 60℃, 62℃, 65℃, 68℃, 70℃, 72℃, 75℃, 78℃ 등의 반응 온도에서 증가된 역전사효소 활성을 나타낸다. 예를 들어, 도 4 참조.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소에 비해서 적어도 10% 더 많은 증가된 역전사효소 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소에 비해서 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 등 더 많은 역전사효소 활성을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소는 야생형 역전사효소에 의해 나타내는 역전사효소 활성의 양의 110%, 115%, 120%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500% 등을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소보다 적어도 약 1.1X, 1.5X, 1.8X, 2X, 4X, 6X, 8X, 10X, 30X, 40X, 50X 등 더 많은 열반응성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 돌연변이 역전사효소의 반응 또는 배양 온도가 야생형 중합효소의 반응 또는 배양 온도에 비해서 더 높은 온도에 있을 때에도 대응하는 야생형 역전사효소에 비해서 증가된 활성을 나타낸다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 두 역전사효소가 동일한 반응 온도(예컨대, 37℃, 40℃, 42℃, 50℃, 52℃, 55℃, 58℃, 60℃, 62℃, 65℃, 70℃ 또는 75℃)에 있을 경우 대응하는 야생형 역전사효소에 비해서 개선된 또는 증가된 특성을 나타낸다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 더 낮은 온도(예컨대, 37℃, 40℃, 42℃, 50℃)에서 대응하는 야생형 역전사효소가 나타내는 동일한 특성에 비해서 상승된 반응 온도(예컨대, 52℃, 55℃, 58℃, 60℃, 62℃, 65℃, 70℃, 75℃)에서 개선된 또는 증가된 특성을 나타낸다.
다른 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 동일 pH 하에서 대응하는 야생형 역전사효소에 의해 나타나는 활성에 비해서 더 낮은 pH에서 개선된 또는 증가된 활성(예컨대, 열안정성 또는 열반응성)을 나타낸다. 예를 들어, 도 3 참조.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 더 넓은 범위의 pH에서 증가된 활성을 나타내고, 유사한 또는 동일한 조건 하에서 돌연변이되지 않은 또는 통상의 RT에 비해서 더 많은 cDNA 및 더 긴 cDNA를 생산한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 약 pH 5.5 내지 약 pH 9.0(예컨대, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 약 pH 7.4, 약 pH 7.5, 약 pH 7.6, 약 pH 7.7, 약 pH 7.8, 약 pH 7.9, 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 약 pH 8.6, 약 pH 8.7, 약 pH 8.8, 약 pH 8.9, 약 pH 9.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.7, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 7.2 내지 약 pH 7.7, 약 pH 7.3 내지 약 pH 7.7, 약 pH 7.4 내지 약 pH 7.6, 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.4, 약 pH 7.6 내지 약 pH 8.0, 약 pH 7.6 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.7 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.9 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.2 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.3 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.4 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.4 내지 약 pH 9.0, 약 pH 8.5 내지 약 pH 9.0 등)의 pH 범위에서 야생형 역전사효소에 비해서 증가된 활성을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 동일한 pH에서 야생형 RT에 비해서 적어도 10%(예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 500% 등) 더 많은 활성을 나타낸다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 동일한 pH에서 야생형 RT에 비해서 적어도 10%(예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 500% 등) 더 많은 cDNA 산물을 생산한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 동일한 pH에서 대응하는 야생형 RT에 의해 생산되는 cDNA 산물보다 적어도 10%(예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 500% 등) 더 긴 cDNA 산물을 생산한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 동일한 pH에서 대응하는 야생형 RT의 것보다 적어도 10%(예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 500% 등) 더 빠른 속도에서 cDNA 산물을 생산한다. 예를 들어, 본 발명의 돌연변이 역전사효소는 동일한 pH에서 대응하는 야생형 RT보다 적어도 2x 이상(예컨대, 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x 등)의 cDNA 산물을 생산한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 55℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다. 예를 들어, 돌연변이 역전사효소는 55℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 역전사효소 활성을 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 적어도 5분 동안 55℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다. 예를 들어, 돌연변이 역전사효소는 적어도 5분 동안 55℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 역전사효소 활성을 보유한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 50℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다. 예를 들어, 돌연변이 역전사효소는 50℃, 55℃, 58℃, 60℃, 62℃, 64℃, 68℃, 70℃, 72℃ 또는 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 적어도 5분 동안 50℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다. 예를 들어, 돌연변이 역전사효소는 적어도 5분 동안 50℃, 58℃, 60℃, 62℃, 64℃, 68℃, 70℃, 72℃ 또는 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 적어도 1분 동안 50℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다. 예를 들어, 돌연변이 역전사효소는 적어도 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분 등 동안 50℃ 내지 75℃의 온도로 가열 후 적어도 20%의 역전사효소 활성을 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 적어도 약 1분, 약 2분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분 또는 약 60분 동안 약 50℃, 약 55℃, 약 58℃, 약 60℃, 약 62℃, 약 64℃, 약 68℃, 약 70℃, 약 72℃ 또는 약 75℃의 온도로 가열 후 적어도 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100%의 역전사효소 활성을 보유한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 적어도 0.2kb 길이인 cDNA를 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 역전사효소는 0.2kb, 0.5kb, 1kb, 1.5kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 7.5kb, 8kb, 8.5kb, 9kb, 9.5kb, 10kb, 15kb 또는 20kb 등 길이인 cDNA를 생산하는 것이 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 약 0.2kb 내지 10kb 길이인 cDNA를 생산하는 것이 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 25℃ 내지 75℃의 온도에서 1 내지 60분 이내에 약 0.2kb 내지 10kb 길이인 cDNA를 생산하는 것이 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이 역전사효소는 적어도 37℃(예컨대, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 70℃ 또는 75℃)의 온도에서 1분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분 또는 60분 이내에 약 0.2kb 내지 10kb 길이인 cDNA를 생산하는 것이 가능하다.
몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 돌연변이 또는 돌연변이된 역전사효소는 대응하는 야생형 역전사효소보다 더 높은 열안정성을 발휘한다. 특히, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소는 증가된 열안정성 및/또는 증가된 열반응성을 나타낸다. 본 명세서에서 제공되는 가능한 돌연변이 역전사효소 중 몇몇 중에서, 예시적인 돌연변이 "D9"(서열번호 4)(도 11 참조)는 적어도 50℃에서 증가된 열안정성을 발휘한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 60℃에서 이 예시적인 돌연변이 역전사효소는 37℃의 온도에서 야생형 M-MLV 역전사효소보다 더 효율적으로 cDNA를 생산한다(예를 들어, 도 2 참조).
다른 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 역전사효소는, 예를 들어, 혈액, 땀, 눈물, 토양, 배설물, 타액, 소변 및 담즙을 비롯한 생물학적 샘플에서 발견되는 효소 저해제에 대해서 내성이 있다. 이러한 저해제는, 부식산, 헤파린, 에탄올, 담즙산염, 풀브산, 다당류, 금속 이온, 도데실황산나트륨(SDS), EDTA, 구아니디늄염, 폼아마이드, 피로인산나트륨 및 스퍼미딘을 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 저해제-내성 역전사효소는, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 일반적으로 반응 혼합물 중 저해제(들)의 존재 하에 적어도 10%의 역전사효소 활성을 나타내는 역전사효소를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 저해제가 없는 반응에 비해서 저해제의 존재 하에 약 90%(예컨대, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 등)까지의 역전사효소 활성을 나타낸다. 임의의 주어진 반응 혼합물 내의 저해제의 양은 분석 중인 핵산이 추출되는 생물학적 샘플 내에 존재하는 저해 물질의 종류에 따라 좌우될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소(상승된 온도에 있을 때에도)는 대응하는 야생형 역전사효소에 비해서 의 적어도 2x(예컨대, 2x, 3x, 5x, 10x, 50x, 100x) 이상의 농도의 이들 저해 물질을 허용할 수 있다. 샘플 내 저해 물질의 수준을 결정하는 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 저해제-내성은 본 명세서에 기재된 검정법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
역전사효소의 발현
본 발명의 역전사효소의 발현을 최적화하기 위하여, 유도성 또는 구성적 프로모터는 잘 알려져 있고, 재조합 숙주 내에 높은 수준의 역전사효소 구조 유전자를 발현하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 당업계에 충분히 공지된 높은 복제수 벡터가 높은 수준의 발현을 달성하기 위하여 이용될 수 있다. 유도성의 높은 복제수를 가진 벡터가 또한 재조합 숙주 내에 본 발명의 역전사효소의 발현을 증대시키기 위하여 유용할 수 있다.
원핵 세포(예컨대, 이. 콜라이, 고초균(B. subtilis), 슈도모나스 등) 내에서 목적으로 하는 구조 유전자를 발현시키기 위하여, 목적으로 하는 구조 유전자를 기능적 원핵 프로모터에 조작 가능하게 연결시키는 것이 바람직하다. 그러나, 역전사효소 유전자의 천연 프로모터는 역전사효소 유전자의 발현을 허용하는 원핵 숙주에서 기능할 수 있다. 따라서, 천연 프로모터 또는 기타 프로모터가 역전사효소 유전자를 발현하는데 이용될 수 있다. 발현을 증대시키는데 이용될 수 있는 이러한 다른 프로모터는 구성적 또는 조절 가능(즉, 유도성 또는 억제해제성(derepressible)) 프로모터를 포함한다. 구성적 프로모터의 예는 박테리오파지 λ의 int 프로모터 및 pBR322의 β-락타마제 유전자의 bla 프로모터를 포함한다. 유도성 원핵 프로모터의 예는 박테리오파지 λ(PR 및 PL), trp, recA, lacZ, lad, tet, gal, trc, ara BAD의 주된 우측 및 좌측 프로모터(Guzman, et al., 1995, J. Bacteriol. 177(14):4121-4130) 및 이. 콜라이의 tac 프로모터를 포함한다. 고초균 프로모터는 α-아밀라제(Ulmanen et al., J. Bacteriol 162:176-182 (1985)) 및 바실러스 박테리오파지 프로모터(Gryczan, T., The Molecular Biology Of Bacilli, Academic Press, New York (1982))를 포함한다. 스트렙토마이세스 프로모터는 문헌[Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468478 (1986)]에 기재되어 있다. 원핵 프로모터는 또한 문헌[Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987); Cenatiempto, Y., Biochimie 68:505-516 (1986); 및 Gottesman, Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)]에서 검토되어 있다. 원핵 세포의 발현은 또한 유전자-암호화 서열의 상류의 리보솜 결합 부위의 존재를 필요로 한다. 이러한 리보솜 결합 부위는 예를 들어 문헌[Gold et al., Ann. Rev. Microbiol. 35:365404 (1981)]에 기재되어 있다.
진핵 세포 내 본 발명의 역전사효소의 발현을 증대시키기 위하여, 잘 알려진 진핵 프로모터 및 숙주가 이용될 수 있다. 역전사효소의 증대된 발현은 원핵 숙주에서 달성될 수 있다. 본 발명과 함께 이용하기에 적합한 원핵 숙주의 일례는 에세리키아 콜라이이다.
역전사효소의 단리 및 정제
본 발명의 효소(들)는 바람직하게는 목적으로 하는 역전사효소 유전자를 함유하고 발현하는 재조합 숙주의 배양액 설장에 의해 생산된다. 그러나, 본 발명의 역전사효소는 본 발명의 역전사효소를 생산하는 임의의 균주, 유기체 또는 조직으로부터 단리될 수 있다. 역전사효소의 단편이 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 단편은 역전사효소 활성을 가진 단편 및 단백질분해 단편을 포함한다. 이러한 단편은 또한 관심 대상 역전사효소 유전자의 일부분을 클로닝하고 발현하고, 틀 이동 돌연변이를 작성하고 그리고/또는 절단된 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 위한 관심 대상 유전자 내 하나 이상의 종결 코돈(stop codon)을 첨가함으로써 생산될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는, 야생형 세포 또는 유기체 또는 재조합 세포 또는 유기체일 수 있는, 이를 발현하는 세포 또는 유기체로부터 정제 및/또는 단리될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 폴리펩타이드는 이것이 발현되는 세포 또는 유기체로부터 실질적으로 단리될 수 있다.
클로닝된 역전사효소 유전자를 함유하는 숙주에 의해 동화될 수 있는 임의의 영양분이 배양 배지에 첨가될 수 있다. 최적 배양 조건은 이용된 균주 및 배양 배지의 조성에 따라서 사례별로 선택되어야 한다. 항생제가 또한 발현될 목적으로 하는 유전자를 함유하는 벡터 DNA의 유지를 보증하기 위하여 성장 배지에 첨가될 수 있다. 배지 조성은 DSM 또는 ATCC 카탈로그 및 문헌 Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
본 발명의 역전사효소를 생산하는 재조합 숙주 세포는, 예를 들어, 원심분리에 의해 액체 배양액으로부터 분리될 수 있다. 일반적으로, 수집된 미생물 세포는 적절한 완충제에 분산되고 이어서 초음파 처리에 의해 또는 완충제 용액에 의해 효소의 추출을 허용하는 기타 잘 알려진 절차에 의해 부수고 개방된다. 초원심분리 또는 원심분리에 의한 세포 지스러기의 제거 후, 역전사효소는 추출, 석출, 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 전기영동 등과 같은 표준 단백질 정제 수법에 의해 정제될 수 있다. 정제 동안 역전사효소의 존재를 검출하는 검정법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이들 효소의 존재를 결정하기 위하여 통상의 생화학적 정제 방법 동안 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 역전사효소의 정제를 용이하게 하기 위하여 친화도 태그를 함유하도록 돌연변이될 수 있다. 적절한 친화도 태그는 당업자에게 잘 알려져 있고, 6개의 히스티딘 등과 같은 아미노산의 반복 서열, 헤마글루티닌 에피토프 및 myc 에피토프 등과 같은 에피토프, 그리고 역전사효소의 간단화된 정제를 허용하는 기타 아미노산 서열을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 (1) 역전사효소와 연관된 하나 이상의 활성을 가진 단백질, 또는 이의 단편 및 (2) 태그(예컨대, 친화도 태그)를 포함하는 융합 단백질을 더 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명은 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 등)의 태그를 가진 본 명세서에 기재된 역전사효소(예컨대, 열안정성 역전사효소)를 포함한다. 이들 태그는, 예를 들어, 역전사효소와 연관된 하나 이상의 활성을 가진 단백질, 또는 이의 단편의 (1) N-말단에, (2) C-말단에, 또는 (3) N-말단과 C-말단 둘 다에 위치될 수 있다. 태그는 또한 (예컨대, 역전사효소로부터 유도되고/되거나 아미노산 곁사슬에 부착된 아미노산 서열의 영역들 사이에) 내부적으로 위치되어 있을 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ferguson et al., Protein Sci. 7:1636-1638 (1998)]은, 친화도 태그(즉, 헥사히스티딘 서열)가 삽입된 에세리키아 콜라이로부터의 사이드로포어 수용체, FhuA를 기술하고 있다. 이 태그는 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피를 이용하는 정제 프로토콜에서 기능하는 것으로 판명되었다. 내부 태그를 가진 추가의 융합 단백질은 미국 특허 제6,143,524호에 기재되어 있고, 이 문헌의 전체 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입된다.
본 발명의 조성물을 제조하는데 이용되는 태그는 길이가 다양할 수 있지만, 전형적으로 약 5 내지 약 500, 약 5 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 15 내지 약 100, 약 20 내지 약 100, 약 25 내지 약 100, 약 30 내지 약 100 from 약 35 내지 약 100, 약 40 내지 약 100, 약 45 내지 약 100, 약 50 내지 약 100, 약 55 내지 약 100, 약 60 내지 약 100, 약 65 내지 약 100, 약 70 내지 약 100, 약 75 내지 약 100, 약 80 내지 약 100, 약 85 내지 약 100, 약 90 내지 약 100, 약 95 내지 약 100, 약 5 내지 약 80, 약 10 내지 약 80, 약 20 내지 약 80, 약 30 내지 약 80, 약 40 내지 약 80, 약 50 내지 약 80, 약 60 내지 약 80, 약 70 내지 약 80, 약 5 내지 약 60, 약 10 내지 약 60, 약 20 내지 약 60, 약 30 내지 약 60, 약 40 내지 약 60, 약 50 내지 약 60, 약 5 내지 약 40, 약 10 내지 약 40, 약 20 내지 약 40, 약 30 내지 약 40, 약 5 내지 약 30, 약 10 내지 약 30, 약 20 내지 약 30, 약 5 내지 약 25, 약 10 내지 약 25 또는 약 15 내지 약 25개의 아미노산 잔기 길이일 것이다.
본 발명의 조성물을 제조하는데 이용되는 태그는 융합 단백질의 열안정성에 기여하는 것들을 포함한다. 따라서, 이들 태그는, 예를 들어, 증가된 열안정성을 가진 특정 단백질(예컨대, 역전사효소 활성의 하나 이상의 활성을 가진 단백질)을 적어도 부분적으로 담당할 수 있다. 역전사효소(즉, M-MLV 역전사효소)의 열안정성을 증대시키는 태그의 예는, 하기 아미노산 서열: MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKH 및 MASGTGGQQMGRDLYDDDDKH를 가진 태그를 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이들 태그의 단편(3개 이상, 5개 이상, 10개 이상 또는 15개 이상의 아미노산을 가진 것)이 또한 본 발명에 따라서 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 태그를 포함하고 증대된 열안정성을 발휘하는 역전사효소, 또는 이의 단편을 부분적으로 포함한다. 잘 알려진 방법을 이용해서, 당업자라면, 역전사효소 활성을 가진 하나 이상의 RT 효소 또는 이의 단편에 위에서 언급된 태그의 하나 이상을 부착하여 열안정성 역전사효소 효소 또는 이의 단편을 생산할 수 있다.
본 발명의 실시에 이용되는 태그는 많은 목적을 제공할 수 있고 그리고 많은 태그가 하나 이상의 상이한 기능을 본 발명의 역전사효소에 부여하기 위하여 첨가될 수 있다. 예를 들어, 태그는 (1) 단백질 내에 그리고 다른 단백질 분자와 내부적으로 둘 다 단백질-단백질 상호작용에 기여할 수 있거나, (2) 이 단백질을 특정 정제 방법에 적용 가능하게 할 수 있거나, (3) 단백질이 조성물 중에 존재하는 지의 여부를 확인할 수 있게 하거나; 또는 (4) 단백질에 다른 기능적 특징을 부여할 수 있다.
본 발명의 실시에 이용될 수 있는 태그의 예는 금속 결합 도메인(예컨대, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 히스티딘 영역 등과 같은 폴리-히스티딘 세그먼트), 면역글로불린 결합 도메인(예컨대, (1) 단백질 A; (2) 단백질 G; (3) T 세포, B 세포 및/또는 Fc 수용체; 및/또는 (4) 보체 단백질 항체-결합 도메인); 당 결합 도메인(예컨대, 말토스 결합 도메인, 키틴-결합 도메인); 및 검출 가능한 도메인(예컨대, 베타-갈락토시다제의 적어도 일부분)을 포함한다. 융합 단백질은 위에서 기재된 것들과 같은 하나 이상의 태그를 함유할 수 있다. 전형적으로, 하나보다 많은 태그를 함유하는 융합 단백질은 역전사효소의 하나의 말단 또는 두 말단(즉, N-말단과 C-말단)에 이들 태그를 포함할 것이지만, 하나 이상의 태그는 말단에 존재하는 것 대신에 또는 이에 부가해서 내부에 위치되어 있을 수도 있다. 또한, 하나보다 많은 태그가 역전사효소의 하나의 말단에, 내부적으로 그리고 또는 두 말단에 존재할 수 있다. 예를 들어, 이들 연속 태그는 역전사효소의 N-말단에 말단-대-말단 연결될 수 있었다. 본 발명은 상기 융합 단백질을 함유하는 조성물 및 반응 혼합물뿐만 아니라, 이들 융합 단백질을 제조하는 방법, 이들 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자(예컨대, 벡터), 및 이들 핵산 분자를 함유하는 재조합 숙주 세포를 더 포함한다. 본 발명은 또한 본 명세서의 어느 곳에선가 기재된 바와 같은 이들 융합 단백질을 사용하는(예컨대, 핵산 분자를 역전사시키는) 방법을 포함한다.
융합 단백질이 조성물 내에 존재하는 지를 확인할 수 있게 하는 태그는, 예를 들어, 전기영동 겔 내에서 단백질을 확인하는데 이용될 수 있는 태그를 포함한다. 이러한 많은 태그가 당업계에 공지되어 있고, 웨스턴 블롯에 이용될 수 있는 에피토프 및 항체 결합 도메인을 포함한다.
본 발명에서 이용하기 위한 태그의 아미노산 조성물은 다양할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 태그는 생리적 pH에서 양전하를 가진 약 1% 내지 약 5%의 아미노산, 예컨대, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘, 또는 생리적 pH에서 양전하를 가진 약 5% 내지 약 10%의 아미노산, 또는 생리적 pH에서 양전하를 가진 약 10% 내지 약 20%의 아미노산, 생리적 pH에서 양전하를 가진 약 10% 내지 약 30%의 아미노산, 또는 생리적 pH에서 양전하를 가진 약 10% 내지 약 50%의 아미노산, 또는 생리적 pH에서 양전하를 가진 약 10% 내지 약 75%의 아미노산을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 태그는 생리적 pH에서 음전하를 가진 약 1% 내지 약 5%의 아미노산, 예컨대, 아스파르트산 및 글루탐산, 또는 생리적 pH에서 음전하를 가진 약 5% 내지 약 10%의 아미노산, 또는 생리적 pH에서 음전하를 가진 약 10% 내지 약 20%의 아미노산, 또는 생리적 pH에서 음전하를 가진 약 10% 내지 약 30%의 아미노산, 또는 생리적 pH에서 음전하를 가진 약 10% 내지 약 50%의 아미노산 또는 생리적 pH에서 음전하를 가진 약 10% 내지 약 75%의 아미노산을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 태그는 동일하거나 상이한 전하일 수 있고 동일하거나 상이할 수 있는 2 이상의 연속 하전된 아미노산을 함유하는 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 태그는 동일하거나 상이할 수 있는 일련의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 10 등의) 양하전된 아미노산을 함유할 수 있다. 태그는 동일하거나 상이할 수 있는 일련의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 10 등의) 음하전된 아미노산을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 태그는 동일하거나 상이할 수 있는 일련의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 10 등의) 양하전된 아미노산과 음하전된 아미노산을 교호로 함유할 수 있다(예컨대, 양, 음, 양, 음 등). 위에서 기재된 일련의 아미노산(예컨대, 양하전된, 음하전된 또는 교호 전하) 중 어느 하나는 하전된 아미노산들 사이에 이격된 하나 이상의 중성 극성 또는 비극성 아미노산(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 10 등)을 포함할 수 있다. 이러한 중성 아미노산은 일련의 하전된 아미노산(예컨대, 한전된, 중성, 하전된, 중성)을 통해서 균일하게 분포되어 있을 수 있거나, 또는 일련(예컨대, 하전, 복수의 중성, 하전, 중성, 복수의 하전된 등)을 통해서 균일하게 분포되어 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드에 부착되는 태그는 생리적 pH에서 전체 하전(예컨대, 양전하 또는 음전하)을 지닐 수 있다. 전체 하전의 크기는 다양할 수 있고, 예를 들어, 태그는 순(net) 플러스 1, 2, 3, 4, 5 등을 함유할 수 있거나, 또는 순 마이너스 1, 2, 3, 4, 5 등을 지닐 수 있다. 본 발명은 또한 위에서 기재된 태그 서열을 하나 이상 포함하는 역전사효소(예컨대, 열안정성 역전사효소), 이러한 역전사효소를 암호화하는 벡터, 이러한 역전사효소를 포함하는 숙주 세포 반응 혼합물, 조성물 및 반응 혼합물뿐만 아니라 이러한 역전사효소를 수용하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 태그 서열 및 역전사효소(RT) 활성을 가진 서열을 포함하는 융합 단백질로부터 태그 서열의 전부 또는 일부를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 유형의 실시형태에 있어서, 예컨대, 프로테아제 효소를 위하여 절단 부위를 형성하는 하나 이상의 아미노산이, 융합 단백질의 일차 서열에 혼입될 수 있다. 절단 부위는 그 부위에서의 절단이 융합 단백질로부터 태그의 전부 또는 일부를 제거할 수 있도록 위치되어 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 절단 부위는, 태그 서열의 전부가 절단 부위를 인식하는 프로테아제 효소에 의한 절단에 의해 제거되도록 태그 서열과 RT 활성을 가진 서열 사이에 위치되어 있을 수 있다. 적절한 절단 부위의 예는 혈액 응고 인자 Xa에 의해 인식되어 절단되는 서열 Ile-Glu-Gly-Arg을 가진 인자 Xa 절단 부위, 및 트롬빈에 의해 인식되어 절단되는 서열 Leu-Val-Pro-Arg을 가진 트롬빈 절단 부위를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 기타 적절한 절단 부위는 당업자에게 공지되어 있고, 본 발명과 함께 이용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 약 5 단위/㎎ 초과, 바람직하게는 약 50 단위/㎎ 초과, 더 바람직하게는 약 100 단위/㎎ 초과, 250 단위/㎎, 500 단위/㎎, 1000 단위/㎎, 5000 단위/㎎ 또는 10,000 단위/㎎, 가장 바람직하게는 약 15,000 단위/㎎ 초과, 약 16,000 단위/㎎ 초과, 약 17,000 단위/㎎ 초과, 약 18,000 단위/㎎ 초과, 약 19,000 단위/㎎ 초과 및 약 20,000 단위/㎎ 초과의 비활성(specific activity)(예컨대, RNA-유도 DNA 중합효소 활성 및/또는 RNase H 활성)을 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소는 약 50,000 단위/㎎ 초과, 약 100,000 단위/㎎ 초과, 약 150,000 단위/㎎ 초과, 약 200,000 단위/㎎ 초과, 약 250,000 단위/㎎ 초과 및 약 300,000 단위/㎎ 초과의 비활성을 지닐 수 있다. 본 발명의 역전사효소용의 비활성의 바람직한 범위는 약 5 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 5 단위/㎎ 내지 약 500,000 단위/㎎의 비활성, 약 5 단위/㎎ 내지 약 300,000 단위/㎎, 약 50 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 100 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 250 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 500 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 1000 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 5000 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 10,000 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 25,000 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 100 단위/㎎ 내지 약 500 단위/㎎의 비활성, 약 100 단위/㎎ 내지 약 400 단위/㎎의 비활성, 및 약 200 단위/㎎ 내지 약 500 단위/㎎의 비활성을 포함한다. 비활성의 다른 바람직한 범위는 약 200,000 단위/㎎ 내지 약 350,000 단위/㎎의 비활성, 약 225,000 단위/㎎ 내지 약 300,000 단위/㎎의 비활성, 약 250,000 단위/㎎ 내지 약 300,000 단위/㎎의 비활성, 약 200,000 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 200,000 단위/㎎ 내지 약 500,000 단위/㎎의 비활성, 약 200,000 단위/㎎ 내지 약 400,000 단위/㎎의 비활성, 약 250,000 단위/㎎ 내지 약 750,000 단위/㎎의 비활성, 약 250,000 단위/㎎ 내지 약 500,000 단위/㎎의 비활성, 및 약 250,000 단위/㎎ 내지 약 400,000 단위/㎎의 비활성을 포함한다. 바람직하게는, 비활성 범위의 하한은 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 900, 1,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000 및 80,000 단위/㎎로부터 다양할 수 있는 한편, 그 범위의 상한은 750,000, 650,000, 600,000, 550,000, 500,000, 450,000, 400,000, 350,000, 300,000, 250,000, 200,000, 150,000, 140,000, 130,000, 120,000, 110,000, 100,000 및 90,000 단위/㎎로부터 다양할 수 있다. 비활성은 당업계에 잘 알려진 효소 검정법 및 단백질 검정법을 이용해서 결정될 수 있다. DNA 중합효소 검정법 및 RNase H 검정법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,244,797호 및 제WO 98/47912호(이들의 개시 내용은 참고로 본 명세서에 전체로 편입됨)에 기술되어 있다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명에 따라서 제조된 열안정성 역전사효소의 비활성은 비-열안정성(예컨대, 야생형) 역전사효소의 비활성보다 더 높을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 열안정성 역전사효소의 비활성은 대응하는 비-열안정성 역전사효소의 비활성보다 5%, 10,%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 더 높을 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 열안정성 역전사효소의 비활성은 대응하는 비-열안정성 역전사효소의 비활성보다 30% 이상일 수 있다. 본 발명에 따라서, 비활성은 반응에 이용된 단백질 또는 효소의 총량에 대한 단백질 또는 효소의 효소 활성(단위)의 측정치이다. 비활성의 측정치는 당업자에게 충분히 공지된 표준 수법에 의해 결정될 수 있다.
역전사효소를 포함하는 조성물 및 반응 혼합물
본 교시는 각종 실시형태에 있어서 다양한 성분을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 완충염 용액 중에 1종 이상의 역전사효소를 혼합함으로써 조제된다. 1종 이상의 DNA 중합효소 및/또는 1종 이상의 뉴클레오타이드, 및/또는 1종 이상의 프라이머는 임의로 본 발명의 조성물을 제조하기 위하여 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 (예컨대, 역전사 또는 1-단계(커플링된) RT-PCR 절차를 이용해서) 핵산 분자를 생산, 분석, 정량화 및 다르게는 조작하기 위하여 본 방법에 이용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 효소는 안정적인 완충염 용액 중에 작업 농도(예컨대, 1x)에서 제공된다. 일반적으로 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "안정적인" 및 "안정성"은, 효소 또는 효소를 함유하는 조성물이 약 4℃의 온도에서 약 1주 동안, -20℃의 온도에서 약 2 내지 6개월, 그리고 약 -80℃의 온도에서 약 6개월 이상 동안 저장된 후에 조성물, 예컨대, 효소 조성물에 의한 원래의 효소 활성(단위)의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 유지를 의미한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "작업 농도"는 특정 기능(예컨대, 핵산의 역전사)을 수행하기 위하여 용액 중에서 사용되는 최적 농도에 혹은 그 부근에 있는 효소의 농도를 의미한다.
이러한 조성물은 또한 농축된 스톡 용액(예컨대, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 10x 등)으로서 조제될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물을 농축된(예컨대, 5x) 스톡 용액으로 하는 것은 (예를 들어, 조성물이 핵산 합성을 위하여 이용될 경우) 보다 많은 양의 핵산 샘플이 첨가되는 것을 허용한다.
본 발명의 조성물을 형성하는데 이용되는 물은 바람직하게는 증류, 탈이온화 및 (0.1 내지 0.2 마이크로미터 필터를 통해) 멸균 여과되고, DNase 및 RNase 효소에 의한 오염이 없다. 이러한 물은, 예를 들어, 라이프 테크놀로지즈사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 필요에 따라서 제조될 수 있다.
효소 성분에 부가해서, 본 발명의 조성물은 cDNA 분자 등과 같은 핵산 분자의 합성을 위하여 필요한 1종 이상의 완충제 및 보조인자를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물을 형성하는데 이용하기 위한 완충제는 아세트산염, 황산염, 염산염, 인산염 또는 트리스-(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS(등록상표)) 또는 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)의 유리산 형태이지만, TRIS(등록상표) 또는 HEPES와 동일한 근사한 이온 강도 및 pKa의 대안적인 완충제가 등가의 결과로 이용될 수도 있다. 예를 들어, 기재된 효소와 함께 이용하기 위한 가능한 완충제는 3-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노} 프로판설폰산(TAPS), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신(바이신), (하이드록시메틸)메틸아민(Tris), N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신(트라이신), 3-[N-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노} 에탄설폰산(TES), 3-(N-몰폴리노)프로판설폰산(MOPS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES) 및 다이메틸아르신산(카코딜레이트)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
완충염에 부가해서, 칼륨(바람직하게는 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨) 및 마그네슘(바람직하게는 염화마그네슘 또는 아세트산 마그네슘)의 것들과 같은 보조인자 염이 본 발명의 조성에 이용하기 위하여 상정된다.
조성물 및/또는 합성 반응 혼합물에 1종 이상의 탄수화물 및/또는 당의 첨가는 또한 저장 동안 조성물 및/또는 합성 동안 반응 혼합물의 증대된 안정성을 지지하므로 유리할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물 및/또는 합성 반응 혼합물에서 내포를 위한 탄수화물 또는 당은 수크로스, 트레할로스, 글리세롤 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 실시형태에 있어서, 트레할로스는 0.01M 내지 5M(예컨대, 0.01M, 0.05M, 0.1M, 0.5M, 0.75M, 1.0M, 2.0M, 3.0M, 4.0M 또는 5.0M) 범위의 농도에서 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 글리세롤은 5% 내지 60% 범위(예컨대, 5%, 10%, 15%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%)의 농도에서 제공된다. 또한, 이러한 탄수화물 및/또는 당은 본 발명의 효소 조성물 및 키트의 제조시 이용되는 효소용의 저장 완충제에 첨가될 수 있고, 액체 또는 건조 형태인(예컨대, 동결건조된) 조성물 중에 제공될 수 있다. 이러한 탄수화물 및/또는 당은 시그마사(Sigma)(미주리주의 세인트루이스시에 소재)를 비롯한 다수의 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다.
마찬가지로, 조성물 및/또는 합성 반응 혼합물에의 1종 이상의 계면활성제 및/또는 세정제의 첨가는 또한, 보존 시 조성물 및/또는 반응 혼합물의 증대된 안정성을 지지하기 위하여 유리할 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 합성 반응 혼합물 내의 혼입을 위한 바람직한 이러한 세정제는 트윈(Tween) 20, 노니뎃 P 40(Nonidet P 40: NP-40), Brij58, CHAPS, Big CHAPS, CHAPS 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 계류 중인 미국 특허 출원 제13/492,576호 및 제61/895,876호(이들의 개시 내용은 그들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 것들과 같은 기타 계면활성제 또는 세정제가 또한 본 발명의 조성물 및/또는 합성 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 나아가, 이러한 세정제는 본 발명의 효소 조성물 및 키트의 제조에 이용되는 효소용의 보존 완충제에 첨가될 수도 있다. 이러한 세정제의 예는 시그마사(미주리주의 세인트루이스시에 소재)를 비롯한 다수의 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다.
먼저 수중 작업 농도에서 완충염, 보조인자염, 탄수화물 또는 당, 또는 세정제를 용해시키고 효소의 첨가 전에 이 용액의 pH를 조정하는 것이 흔히 바람직할 수 있다. 이와 같이 해서, pH-감수성 효소가 본 발명의 조성물의 조제 동안 산- 또는 알칼리-매개 비활성화를 덜 받게 된다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 완충염 용액은, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS(등록상표))의 염 또는 이의 염산염 등과 같은 완충염을 충분한 양의 물과 배합함으로써 조제된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이 배합은 5 내지 150 밀리몰, 바람직하게는 10 내지 60 밀리몰, 가장 바람직하게는 약 20 내지 60 밀리몰의 TRIS(등록상표) 농도를 지니는 용액을 수득한다. 이 용액에 마그네슘(바람직하게는 그의 염화물 또는 아세트산염) 또는 다른 2가 양이온의 염을 첨가하여 1 내지 10 밀리몰, 바람직하게는 1.5 내지 8.0 밀리몰, 가장 바람직하게는 약 3 내지 7.5 밀리몰의 그의 작업 농도를 제공할 수 있다. 칼륨염(바람직하게는 칼륨의 염화물 또는 아세트산염), 또는 다른 1가 양이온(예컨대, Na)의 염이 또한 10 내지 100 밀리몰, 가장 바람직하게는 약 75 밀리몰의 작업 농도에서 이 용액에 첨가될 수 있다. 다이티오트레이톨과 같은 환원제가 바람직하게는 약 1 내지 100mM의 최종 농도, 더 바람직하게는 약 5 내지 50mM 또는 약 7.5 내지 20mM의 농도, 가장 바람직하게는 약 10mM의 농도에서 이 용액에 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물에 내포하기 위한 탄수화물 및/또는 당의 바람직한 농도 범위는 약 5% (w/v) 내지 약 30% (w/v), 약 7.5% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 약 10% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 약 10% (w/v) 내지 약 20% (w/v), 바람직하게는 약 10% (w/v) 내지 약 15% (w/v)이다. 본 발명의 조성물에 내포하기 위한 계면활성제 및/또는 세정제의 바람직한 농도 범위는 약 0.001% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 약 0.002% (w/v) 내지 약 2% (w/v), 약 0.004% (w/v) 내지 약 1% (w/v), 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.5% (w/v), 바람직하게는 약 0.05% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v)이다. 소량의 에틸렌다이아민테트라아세테이트(EDTA)의 염, 예컨대, 이나트륨 EDTA가 또한 첨가될 수 있다(바람직하게는 약 0.1 밀리몰). 몇몇 실시형태에 있어서, 모든 완충제 및 염의 첨가 후, 이 완충염 용액을 모든 염이 용해될 때까지 잘 혼합하고, 당업계에 공지된 방법을 이용해서 pH를 조정한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 최종 완충제 pH 범위는 약 6.0 내지 약 9.5, 약 6.9 내지 약 8.7, 또는 약 7.3 내지 약 8.3이다.
이들 완충염 용액에, 효소(역전사효소)가 본 발명의 조성물을 제조하기 위하여 첨가된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 역전사효소는 용액 중 약 1,000 내지 약 50,000 단위/밀리리터, 약 2,000 내지 약 30,000 단위/밀리리터, 약 2,500 내지 약 25,000 단위/밀리리터, 약 3,000 내지 약 22,500 단위/밀리리터, 약 4,000 내지 약 20,000 단위/밀리리터, 또는 약 5,000 내지 약 20,000 단위/밀리리터의 작업 농도에서 첨가된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 역전사효소(예컨대, M-MLV 역전사효소)는 제1 가닥 반응 혼합물(예컨대, mRNA 분자를 역전사시키는 반응물)에 그리고/또는 중합효소 연쇄 반응과 연결된 역전사에서 위에서 기재된 작업 농도에서 첨가될 수 있다. 이들 반응을 위한 본 발명의 역전사효소의 적절한 농도는 약 5,000 단위/㎖ 내지 약 50,000 단위/㎖, 약 5,000 단위/㎖ 내지 약 40,000 단위/㎖, 약 5,000 단위/㎖ 내지 약 30,000 단위/㎖, 또는 약 5,000 단위/㎖ 내지 약 20,000 단위/㎖의 역전사효소일 수 있다. 반응은 20㎕ 내지 50㎕의 용적에서 수행될 수 있고, 그러한 반응물은 50 단위, 100, 단위, 200 단위, 300 단위, 400 단위 또는 그 이상의 본 발명의 역전사효소를 함유할 수 있다. 당업자라면 부가적인 역전사효소를 첨가하는 것이 증가된 효소 이용을 희생하여 제1 가닥(예컨대, mRNA 가닥에 상보적인 DNA 가닥)의 증가된 합성을 허용하는 것을 알 수 있을 것이다. 당업자라면 허용 가능한 비용으로 목적으로 하는 양의 산물을 생산하기 위하여 반응물에 본 발명의 역전사효소의 양을 과도한 실험 없이 결정할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 돌연변이 역전사효소는 용액 중 약 100 내지 약 5000 단위/밀리리터, 약 125 내지 약 4000 단위/밀리리터, 약 150 내지 약 3000 단위/밀리리터, 약 200 내지 약 2500 단위/밀리리터, 약 225 내지 약 2000 단위/밀리리터의 작업 농도에서, 가장 바람직하게는 약 250 내지 약 1000 단위/밀리리터의 작업 농도에서 제공된다. 효소는 임의의 순서로 용액에 첨가될 수 있거나 동시에 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물은 1종 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 데옥시뉴클레오사이드 트라이포스페이트(dNTP) 또는 다이데옥시뉴클레오사이드 트라이포스페이트(ddNTP)를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물의 dNTP 성분은 중합효소의 작용에 의해 그 내에 혼입되어 있는 새롭게 합성된 핵산에 대한 "차단제"로서 작용하며, ddNTP는 본 발명에 따른 서열분석 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에서 사용하기에 적합한 뉴클레오타이드의 예는 dUTP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dITP, 7-데아자-dGTP, α-티오-dATP, α-티오-dTTP, α-티오-dGTP, α-티오-dCTP, ddUTP, ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddITP, 7-데아자-ddGTP, α-티오-ddATP, α-티오-ddTTP, α-티오-ddGTP, α-티오-ddCTP 또는 그의 유도체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니고, 이들은 모두 인비트로젠사(Invitrogen Corporation)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재), 뉴잉글랜드 바이오랩스사(New England BioLabs)(매사추세츠주의 베벌리시에 소재) 및 시그마화학사(Sigma Chemical Company)(미주리주의 세인트루이스시에 소재)를 비롯한 공급사로부터 상업적으로 입수 가능하다. 뉴클레오타이드들은 미표지되어 있을 수 있거나, 또는 이들은 당업계에 공지된 방법에 의해 이들을 방사성동위원소(예컨대, 3H, 14C, 32P 또는 35S), 비타민(예컨대, 바이오틴), 형광 모이어티(예컨대, 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드 또는 피코에리트린), 화학발광 표지(예컨대, 라이프 테크놀로지즈사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능한 PHOTO-GENE(상표명) 또는 ACES(상표명) 화학발광 시스템), 다이옥시게닌 등과 커플링시킴으로써 검출 가능하게 표지화될 수 있다. 표지된 뉴클레오타이드는 또한, 예를 들어, 라이프 테크놀로지즈사(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재) 또는 시그마화학사(미주리주의 세인트루이스시에 소재)로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 본 조성물의 몇몇 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드가 약 10 내지 4000 마이크로몰, 약 50 내지 2000 마이크로몰, 약 100 내지 1500 마이크로몰, 또는 약 200 내지 1200 마이크로몰 또는 약 1000 마이크로몰의 각 뉴클레오타이드의 작업 농도를 부여하기 위하여 첨가된다.
본 발명의 교시에 따라서, 1종 이상의 제제가 또한 핵산 제조, 단리 또는 정제에 이용되는 샘플에서 종종 발견되는 각종 화합물에 의해 RT 반응의 저해를 극복함에 있어서 원조하도록 본 조성물에 첨가될 수 있다. 이러한 저해제는, 예를 들어, 헤파린(혈액); 헤마틴(혈액); EDTA(혈액); 시트르산염(혈액); 면역글로빈 G(혈액, 혈청); 부식산(토양, 배설물); 락토페린(우유, 타액, 기타 분비 유체); 유레아(소변); 식물 다당류(식물); 멜라민(피부, 털); 미오글로빈(조직); 및 인디고 염료(텍스타일)를 포함할 수 있다. RT 저해를 극복하는데 이용하기 위한 이러한 제제는, 알부민(예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 재조합 BSA 및 기타 종으로부터 유도된 알부민), α-락트알부민, β-락토글로불린, 카제인, 아포트랜스페린, 스페르민, 젤라틴(예컨대, 인간 재조합 젤라틴, 어류 젤라틴 및 기타 종으로부터 유도된 젤라틴), 및 DNA 결합 단백질(예컨대, 파지 T4 유전자 32(T4gP32)), 또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 변이체, 이의 단편 또는 유도체 등(이들로 제한되지 않음)과 같은 단백질을 포함할 수 있다. 본 교시에서 이용하기 위한 기타 비-단백질 기반 PCR 저해제 차단제는, 예를 들어, 데페록사민 메실레이트를 포함할 수 있다. PCR 저해제 차단제로서 이용하기 위한 몇몇 바람직한 단백질은 소 혈청 알부민(BSA), 어류 젤라틴 및 T4gP32 단백질을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-RT 저해제가 약 1 ng/㎕ 내지 약 10,000 ng/㎕, 약 50 ng/㎕ 내지 약 8000 ng/㎕, 약 100 ng/㎕ 내지 약 6000 ng/㎕, 약 200 ng/㎕ 내지 약 5000 ng/㎕ 또는 바람직하게는 약 500 ng/㎕ 내지 약 3000 ng/㎕의 작업 용액 중 최종 농도를 부여하기 위하여 본 발명의 조성물에 첨가된다. 항-RT 저해제는 또한 작업 용액 중 최종 농도의 퍼센트, 예를 들어, 약 0.001% 내지 약 15%, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%로서 첨가될 수 있다. 이들 항-RT 저해제의 첨가는, 개별적으로 또는 조합하여 둘 다, 이러한 RT 저해제 오염물의 내성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 에탄올, 담즙산염, 부식산, 헤마틴 및 헤파린을 포함하는 각종 저해제에 대한 내성을 증가시키기 위하여 단독으로 혹은 조합하여 작용하는 제제를 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 성분 열화는 약 -80℃의 온도에서 (2년까지 동안) 또는 약 -20℃의 온도에서 (1년까지 동안) 시약 조성물의 저장에 의해 저감될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 조성물을 유지할 수 있는 적절한 용기 또는 베슬(vessel) 내에 포장될 수 있고, 이러한 용기는 조성물의 성분과 유의하게 상호작용하지 않을 것이다. 용기 또는 베슬은 개체에 의해 또는 액체 취급 기기에 의해 제형의 용이한 분배를 허용하도록 설계될 수 있다. 이러한 조성물의 용기 또는 베슬은 멀티-팩 단위로 더욱 포장될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 발명의 조성물 및 역전사효소는 1종 이상의 탄수화물, 당 또는 합성 중합체의 존재 하에 건조 형태로 제조되고 저장(예컨대, 동결건조)될 수 있다. 건조된 조성물 또는 역전사효소의 제조를 위한 바람직한 탄수화물, 당 또는 중합체는 수크로스, 트레할로스 및 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 미국 특허 제5,098,893호, 제4,891,319호 및 제5,556,771호 참조(이들의 개시내용은 참고로 본 명세서에 전체적으로 편입됨). 이러한 건조된 조성물 및 효소는 본 발명의 조성물의 효소 혹은 성분의 상당한 열화 없이도 연장된 시간 동안 각종 온도에서 저장될 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 건조된 역전사효소 또는 조성물은 약 -20℃ 내지 약 25℃에서 저장된다.
본 발명은 또한 핵산 분자를 역전사시키기 위한 조성물뿐만 아니라 이러한 조성물을 이용하는 역전사 방법 및 이러한 방법을 이용하는 산물인 핵산 분자를 더 포함한다. 많은 경우에, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 하기 성분을 함유할 수 있다: (1) 1종 이상의 완충제(예컨대, 인산나트륨, 아세트산나트륨, 2-(N-몰폴리노)-에탄설폰산(MES), 트리스-(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPS), 시트르산염, N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), 아세트산염, 3-(N-몰폴리노)프로판설폰산(MOPS), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설포니오산(TAPS) 등), (2) 1종 이상의 1가 양이온 염(예컨대, NaCl, KCl 등), (3) 1종 이상의 2가 양이온 염(예컨대, MnCl2, MgCl2, MgSO4, CaCl2 등), (4) 1종 이상의 환원제(예컨대, 다이티오트레이톨, β-머캅토에탄올 등), (5) 1종 이상의 이온성 또는 비이온성 세정제(예컨대, 트리톤 X-100(상표명), 노니뎃 P40(NONIDET P40)(상표명), 도데실황산나트륨 등), (6) 1종 이상의 DNA 중합효소 저해제(예컨대, 악티노마이신 D 등), (7) 뉴클레오타이드(예컨대, dNTP, 예컨대, dGTP, dATP, dCTP, dTTP 등), (8) 역전사 및/또는 증폭될 RNA, (9) 1종 이상의 RNase 저해제(예컨대, RNASEOUT(상표명), 인비트로젠사, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재, 카탈로그 번호 10777-019 등), (10) 역전사효소(예컨대, 본 발명의 역전사효소) 및/또는 (11) 1종 이상의 희석제(예컨대, 물). 기타 성분 및/또는 성분들(예컨대, 프라이머, DNA 중합효소 등)이 또한 조성물에 존재할 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 서열분석에 이용되는 조성물은 1종 이상의 하기 성분을 함유할 수 있다: (1) 단일 가닥 RNA 주형, (2) 프라이머, (3) 뉴클레오타이드, (4) 뉴클레오타이드 염기와 접합된 방사성 표지, 또는 프라이머에 접합된 형광성 표지 등과 같은 표지, 및/또는 (5) 종결제, 예컨대, 다이데옥시뉴클레오타이드(ddATP, ddGTP, ddCTP 또는 ddTTP)를 포함하는 연쇄 종결 염기.
본 발명의 조성물 내의 완충제의 농도는 사용된 특정 완충제에 따라서 변할 것이다. 전형적으로, 완충제의 작업 농도(즉, 반응 혼합물 내 농도)는 약 5mM 내지 약 500mM(예컨대, 약 10mM, 약 15mM, 약 20mM, 약 25mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 85mM, 약 90mM, 약 95mM, 약 100mM, 약 5mM 내지 약 500mM, 약 10mM 내지 약 500mM, 약 20mM 내지 약 500mM, 약 25mM 내지 약 500mM, 약 30mM 내지 약 500mM, 약 40mM 내지 약 500mM, 약 50mM 내지 약 500mM, 약 75mM 내지 약 500mM, 약 100mM 내지 약 500mM, 약 25mM 내지 약 50mM, 약 25mM 내지 약 75mM, 약 25mM 내지 약 100mM, 약 25mM 내지 약 200mM, 약 25mM 내지 약 300mM 등)일 것이다. Tris(예컨대, 트리스-HCl)가 사용된 경우, Tris 작업 농도는 전형적으로 약 5mM 내지 약 100mM, 약 5mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 25mM 내지 약 50mM 등일 것이다.
본 발명의 최종 pH는 일반적으로 설정되고 본 발명의 조성물에 존재하는 완충제에 의해 유지될 것이다. 본 발명의 조성물, 따라서 본 발명의 반응 혼합물의 pH는, 특정 용도 및 존재하는 완충제에 따라서 변할 것이지만, 흔히 약 pH 5.5 내지 약 pH 9.0(예컨대, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 약 pH 7.4, 약 pH 7.5, 약 pH 7.6, 약 pH 7.7, 약 pH 7.8, 약 pH 7.9, 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 약 pH 8.6, 약 pH 8.7, 약 pH 8.8, 약 pH 8.9, 약 pH 9.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.7, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 7.2 내지 약 pH 7.7, 약 pH 7.3 내지 약 pH 7.7, 약 pH 7.4 내지 약 pH 7.6, 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.4, 약 pH 7.6 내지 약 pH 8.0, 약 pH 7.6 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.7 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.9 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.2 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.3 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.4 내지 약 pH 8.5, 약 pH 8.4 내지 약 pH 9.0, 약 pH 8.5 내지 약 pH 9.0 등)일 것이다.
표시된 바와 같이, 1종 이상의 1가 양이온 염(예컨대, NaCl, KCl 등)이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 많은 경우에, 본 발명의 조성물에 이용되는 염은 1가인 적어도 하나의 종(예컨대, Na+, K+ 등)을 생성하기 위하여 용액 중에서 해리될 것이다. 본 발명의 조성물에 포함될 경우, 염은 흔히 약 0.5mM 내지 약 500mM(예컨대, 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 5mM, 약 10mM, 약 12mM, 약 15mM, 약 17mM, 약 20mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM, 약 25mM, 약 27mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 64mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 85mM, 약 90mM, 약 95mM, 약 100mM, 약 120mM, 약 140mM, 약 150mM, 약 175mM, 약 200mM, 약 225mM, 약 250mM, 약 275mM, 약 300mM, 약 325mM, 약 350mM, 약 375mM, 약 400mM, 약 1mM 내지 약 500mM, 약 5mM 내지 약 500mM, 약 10mM 내지 약 500mM, 약 20mM 내지 약 500mM, 약 30mM 내지 약 500mM, 약 40mM 내지 약 500mM, 약 50mM 내지 약 500mM, 약 60mM 내지 약 500mM, 약 65mM 내지 약 500mM, 약 75mM 내지 약 500mM, 약 85mM 내지 약 500mM, 약 90mM 내지 약 500mM, 약 100mM 내지 약 500mM, 약 125mM 내지 약 500mM, 약 150mM 내지 약 500mM, 약 200mM 내지 약 500mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 200mM, 약 20mM 내지 약 150mM, 약 20mM 내지 약 125mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 80mM, 약 20mM 내지 약 75mM, 약 20mM 내지 약 60mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 500mM, 약 30mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 50mM 등)의 조합된 농도로 또는 개별적으로 존재할 것이다.
표시된 바와 같이, 1종 이상의 2가 양이온 염(예컨대, MnCl2, MgCl2, MgSO4, CaCl2 등)이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 많은 경우에, 본 발명의 조성물에 이용되는 염은 2가인 적어도 하나의 종(예컨대, Mg++, Mn++, Ca++ 등)을 생성하기 위하여 용액 중에서 해리될 것이다. 본 발명의 조성물에 포함될 경우, 염은, 흔히 약 0.5mM 내지 약 500mM(예컨대, 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM, 약 10mM, 약 12mM, 약 15mM, 약 17mM, 약 20mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM, 약 25mM, 약 27mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 64mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 85mM, 약 90mM, 약 95mM, 약 100mM, 약 120mM, 약 140mM, 약 150mM, 약 175mM, 약 200mM, 약 225mM, 약 250mM, 약 275mM, 약 300mM, 약 325mM, 약 350mM, 약 375mM, 약 400mM, 약 1mM 내지 약 500mM, 약 5mM 내지 약 500mM, 약 10mM 내지 약 500mM, 약 20mM 내지 약 500mM, 약 30mM 내지 약 500mM, 약 40mM 내지 약 500mM, 약 50mM 내지 약 500mM, 약 60mM 내지 약 500mM, 약 65mM 내지 약 500mM, 약 75mM 내지 약 500mM, 약 85mM 내지 약 500mM, 약 90mM 내지 약 500mM, 약 100mM 내지 약 500mM, 약 125mM 내지 약 500mM, 약 150mM 내지 약 500mM, 약 200mM 내지 약 500mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 200mM, 약 20mM 내지 약 150mM, 약 20mM 내지 약 125mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 80mM, 약 20mM 내지 약 75mM, 약 20mM 내지 약 60mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 500mM, 약 30mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 50mM 등)의 조합된 농도로 또는 개별적으로 존재할 것이다.
본 발명의 조성물에 포함될 경우, 환원제(예컨대, 다이티오트레이톨, β-머캅토에탄올 등)는 흔히 약 0.1mM 내지 약 50mM(예컨대, 약 0.2mM, 약 0.3mM, 약 0.5mM, 약 0.7mM, 약 0.9mM, 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 10mM, 약 12mM, 약 15mM, 약 17mM, 약 20mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM, 약 25mM, 약 27mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 0.1mM 내지 약 50mM, 약 0.5mM 내지 약 50mM, 약 1mM 내지 약 50mM, 약 2mM 내지 약 50mM, 약 3mM 내지 약 50mM, 약 0.5mM 내지 약 20mM, 약 0.5mM 내지 약 10mM, 약 0.5mM 내지 약 5mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 3.4mM, 약 0.5mM 내지 약 3.0mM, 약 1mM 내지 약 3.0mM, 약 1.5mM 내지 약 3.0mM, 약 2mM 내지 약 3.0mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 2.5mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 약 2mM 내지 약 3.0mM, 약 2.5mM 내지 약 3.0mM, 약 0.5mM 내지 약 2mM, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 약 0.5mM 내지 약 1.1mM, 약 5.0mM 내지 약 10mM, 약 5.0mM 내지 약 15mM, 약 5.0mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 10mM 내지 약 20mM 등)의 조합된 농도로 또는 개별적으로 존재할 것이다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 이온성 또는 비이온성 세정제(예컨대, 트리톤 X-100(상표명), 노니뎃 P40(상표명), 트윈 20, 도데실황산나트륨 등)를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 경우, 세정제는 흔히 약 0.001% 내지 약 5.0%(예컨대, 약 0.001%, 약 0.002%, 약 0.003%, 약 0.004%, 약 0.005%, 약 0.006%, 약 0.007%, 약 0.008%, 약 0.009%, 약 0.01%, 약 0.02%,약 0.05%, 약 0.1, 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 0.001% 내지 약 5.0%, 약 0.001% 내지 약 4.0%, 약 0.001% 내지 약 3.0%, 약 0.001% 내지 약 2.0%, 약 0.001% 내지 약 1.0%, 약 0.005% 내지 약 5.0%, 약 0.01% 내지 약 3.0%, 약 0.01% 내지 약 2.0%, 약 0.01% 내지 약 1.0%, 약 0.1% 내지 약 5.0%, 약 0.1% 내지 약 4.0%, 약 0.1% 내지 약 3.0%, 약 0.1% 내지 약 2.0%, 약 0.1% 내지 약 1.0%, 약 0.1% 내지 약 0.5% 등)의 조합된 농도로 또는 개별적으로 존재할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 약 0.01% 내지 약 2.0%, 약 0.03% 내지 약 1.0%, 약 0.04% 내지 약 1.0%, 약 0.05% 내지 약 0.5%, 약 0.04% 내지 약 0.6%, 약 0.04% 내지 약 0.3% 등의 농도에서 트윈 20, NP-40 및/또는 TRITON X100(상표명)을 함유할 수 있다.
본 명세서에 개시된 것들 이외에, 역전사, 증폭, 또는 두 반응의 조합을 용이하게 하거나 증대시킬 수 있는 기타 첨가제(예컨대, RT-PCR을 용이하게 하거나 증대시키기 위한 제제)는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 따라서, 1종 이상의 이들 첨가제가 리보핵산 또는 데옥시리보핵산 주형으로부터 핵산의 생성 및 복제를 최적화시키기 위하여 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있다. 첨가제는 유기 또는 무기 화합물일 수 있다. 본 발명의 조성물, 방법 및 키트에 유용한 이러한 첨가제는 폴리펩타이드뿐만 아니라 넌폴리펩타이드 첨가제를 포함한다. 이러한 첨가제는, 예를 들어, 몇 가지 예로, RNase 저해제 단백질(RIP), 유라실 DNA 글리코실라제(UDG), 렉틴, 이. 콜라이 단일 가닥 결합(SSB) 단백질, tRNA, rRNA, 7-데아자-2'-데옥시쿠아노신(dC7GTP), 황-함유 화합물, 아세테이트-함유 화합물, 다이메틸설폭사이드(DMSO), 리보뉴클레아제 저해제(예컨대, Rnase OUT(상표명) 폼아마이드, 베타인, 염화테트라메틸암모늄(TMAC), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 엑토인, 아자이드화나트륨, 카톤(kathon) 및 폴리올을 포함할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 조성물, 방법 및 키트에 따라서 이용하기 위한 추가의 첨가제를 확인할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 또한 1종 이상의 프라이머를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 올리고(dT) 프라이머를 포함한다. 이들 프라이머는 전형적으로 대략 20개 염기 길이이고, mRNA의 폴리A 테일에 어닐링된다. mRNA 단편을 표적화함으로써, 얻어지는 cDNA 집단의 복잡성이 극적으로 저감되는데, 그 이유는 rRNA 및 tRNA 종들이 이 반응에서 주형으로 제공되지 않을 것이기 때문이다. 올리고(dT) 프라이머를 이용하는 결점은 얻어지는 cDNA 집단이 3' 바이어스를 가질 것이고, 이에 따라서 전사물의 5'말단을 표적화하는 PCR 프라이머의 효율을 상충시킨다는 점이다. 또한, 3' 바이어스로 인해, 폴리A 테일을 결여하는 단편화된 샘플이 역전사되지 않을 것이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 무작위 프라이머를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 무작위 프라이머는 특정 올리고 길이의 4개의 염기의 무작위 혼합물이다. 무작위 헥사머 믹스가 예를 들어 이용될 수 있다. 무작위 프라이머의 각각은 주어진 RNA 분자(rRNA, tRNA, mRNA, 및 이들 종류의 임의의 단편을 포함함) 내에 존재하는 어느 곳인가에서 어닐링될 수 있다. 무작위 프라이머를 이용하는 역전사는 RNA 2차 구조 및 RNA 단편에 대한 문제를 극복하며, 이 문제는, 올리고(dT) 프라이머를 이용할 경우의 보편적인 골치거리이다.
몇몇 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 잠김 핵산(LNA) 프라이머를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 내로의 LNA의 혼입은 DNA 증폭에 대한 특이성 및 주형 결합 길이를 증가시키는 것으로 판명되었다. 예컨대, 문헌[Ballantyne, K. N., et al., Genomics. 2008 Mar;91(3):301-5.doi: 10.1016/j.ygeno.2007.10.016] 참조. LN프라이머는 LNA를 포함하지 않는 것보다 더 높은 용융 온도(Tm)에서 폴리A 서열에 결합한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 서열-특이적(또는 유전자-특이적) 프라이머를 포함한다. 서열 특이적 프라이머는 전형적으로 최대 특이성을 제공하고 역전사를 위한 가장 일관된 프라이머 옵션인 것으로 판명되었다. 그러나, 이들은 올리고(dT) 및 무작위 프라이머의 가요성을 제공하지 않으며, 이는 새로운 cDNA 합성 반응이 연구될 각 유전자에 대해서 수행되어야 하는 것을 의미한다. 이것은 때로는 서열-특이적 프라이머를 제한된 조직 또는 세포 샘플을 가공처리하는데 최적이 아니게 할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상이한 유형의 프라이머의 혼합물(예컨대, 올리고(dT), 무작위, LNA 및/또는 서열-특이적 프라이머)이 사용된다.
본 발명의 조성물은 또한 1종 이상의 핫 스타트 성분을 포함할 수 있다. 핫-스타트는 실온에서 핵산 합성 반응의 조립으로 인해 비특이적 증폭을 저감시키는데 이용되는 통상의 기술이다. 더 낮은 온도에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 완전히 상보적인 아닌 주형 서열에 어닐링될 수 있다. 종종, 이들 낮은 온도에서, 역전사효소와 같은 효소는 미스어닐링된 프라이머를 연장시킬 수 있다. 이 새롭게 합성된 영역은 이어서 바람직하지 않은 핵산 합성 산물의 합성 및 프라이머 연장용의 주형으로서 작용한다. 그러나, 반응 온도가 중합이 시작되기 전에 (예컨대, 60℃ 이상의 온도로) 상승되면, 프라이머 어닐링의 엄격성이 증가되어, 바람직하지 않은 핵산 합성 산물의 생성이 회피되거나 저감될 수 있다.
핵산 합성 반응에 핫 스타트 성분의 혼입은 또한 프라이머 어닐링의 엄격성을 증가시킴으로써 합성된 프라이머-다이머의 양을 저감시킬 수 있다. 더 낮은 온도에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 예를 들어 머리핀을 형성하도록 상보적인 영역을 통해서 서로 어닐링될 수 있고, 역전사효소는 프라이머 다이머를 형성하도록 어닐링된 프라이머를 연장시킬 수 있다. 비특이적 산물 및 프라이머-다이머의 형성은 목적으로 하는 산물의 합성을 위한 시약 능력을 경쟁할 수 있다. 따라서, 핫 스타트 수법은 특정 핵산 합성 산물의 수율을 향상시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 핫 스타트 반응은 반응물이 약 60℃로 가열될 때까지(이 지점에서 누락 시약이 첨가됨) 임계 성분을 누락시킨 채로 실온에서 또는 얼음 상에서 조합된다. 이 누락은 프라이머 어닐링이 더욱 엄격해지는 보다 높은 온도에서 임계 성분이 첨가될 때까지 역전사효소가 프라이머를 연장시키는 것을 방지한다.
몇몇 다른 실시형태에 있어서, 역전사효소는 반응에서 하나 이상의 임계 성분으로부터 가역적으로 비활성이거나 또는 물리적으로 분리된다. 예를 들어, 마그네슘은 왁스 베드에서 격리될 수 있고, 이것은 반응물이 가열됨에 따라서 용융되어 단지 보다 높은 온도에서만 해당 성분을 유리시킬 수 있다(예컨대, 문헌[Carothers et al. 1989; Krishnan et al. 1991; Clark, 1988] 참조). 역전사효소는 또한 앱타머라고도 공지된 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 문헌[Lin and Jayasena, 1997; Dang and Jayasena, 1996] 참조) 또는 항체(예컨대, 문헌[Scalice et al. 1994; Sharkey et al. 1994] 참조)에 결합함으로써 비활성 상태로 유지될 수 있다. 이 결합은 이어서 보다 높은 온도에서 붕괴될 수 있어 기능적 역전사효소를 방출시킬 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 역전사효소는 화학 변형을 통해서 비활성 상태로 유지될 수 있다(예컨대, 문헌[Moretti, T. et al 1998] 참조). 몇몇 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 가역적이다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 역전사효소는 더 낮은 온도(예컨대, 약 55℃ 미만)에서 비활성 상태로 있고 상승된 온도(예컨대, 약 55℃ 초과)에서 완전히 기능적/활성이 되도록 화학적으로 변형된다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 DNA 중합효소 저해제(예컨대, 악티노마이신 D 등)를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 경우, 이러한 저해제는 흔히 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖(예컨대, 약 0.1 ㎍/㎖, 약 0.2 ㎍/㎖, 약 0.3 ㎍/㎖, 약 0.4 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖, 약 0.6 ㎍/㎖, 약 0.7 ㎍/㎖, 약 0.8 ㎍/㎖, 약 0.9 ㎍/㎖, 약 1.0 ㎍/㎖, 약 1.1 ㎍/㎖, 약 1.3 ㎍/㎖, 약 1.5 ㎍/㎖, 약 1.7 ㎍/㎖, 약 2.0 ㎍/㎖, 약 2.5 ㎍/㎖, 약 3.5 ㎍/㎖, 약 5.0 ㎍/㎖, 약 7.5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 15 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 25 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖, 약 35 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 0.75 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 1.0 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 2.0 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 3.0 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 4.0 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 5.0 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 7.5 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 15 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 20 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 5 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 2 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖, 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 5 ㎍/㎖, 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 2 ㎍/㎖, 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖ 내지 약 80 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖ 내지 약 70 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 약 60 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 약 70 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 약 80 ㎍/㎖ 등)의 조합된 농도로 또는 개별적으로 존재할 것이다.
많은 경우에, 뉴클레오타이드(예컨대, dNTP, 예컨대, dGTP, dATP, dCTP, dTTP 등)가 본 발명의 반응 혼합물에 존재할 것이다. 전형적으로, 개별적으로 뉴클레오타이드는 약 0.05mM 내지 약 50mM(예컨대, 약 0.07mM, 약 0.1mM, 약 0.15mM, 약 0.18mM, 약 0.2mM, 약 0.3mM, 약 0.5mM, 약 0.7mM, 약 0.9mM, 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 10mM, 약 12mM, 약 15mM, 약 17mM, 약 20mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM, 약 25mM, 약 27mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 0.1mM 내지 약 50mM, 약 0.5mM 내지 약 50mM, 약 1mM 내지 약 50mM, 약 2mM 내지 약 50mM, 약 3mM 내지 약 50mM, 약 0.5mM 내지 약 20mM, 약 0.5mM 내지 약 10mM, 약 0.5mM 내지 약 5mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 3.4mM, 약 0.5mM 내지 약 3.0mM, 약 1mM 내지 약 3.0mM, 약 1.5mM 내지 약 3.0mM, 약 2mM 내지 약 3.0mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1mM 내지 약 2.5mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 약 2mM 내지 약 3.0mM, 약 2.5mM 내지 약 3.0mM, 약 0.5mM 내지 약 2mM, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 약 0.5mM 내지 약 1.1mM, 약 5.0mM 내지 약 10mM, 약 5.0mM 내지 약 15mM, 약 5.0mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 10mM 내지 약 20mM 등)의 농도로 존재할 것이다. 조합된 뉴클레오타이드 농도는, 하나 보다 많은 뉴클레오타이드가 존재할 경우, 개별의 뉴클레오타이드의 농도를 함게 첨가함으로써 결정될 수 있다. 하나보다 많은 뉴클레오타이드가 본 발명의 조성물에 존재할 경우, 개별적인 뉴클레오타이드가 등몰량으로 존재할 수 없다. 따라서, 조성물은, 예를 들어, 1mM dGTP, 1mM dATP, 0.5mM dCTP 및 1mM dTTP를 함유할 수 있다.
RNA는 전형적으로 본 발명의 조성물에 존재할 것이다. 대부분의 경우에, RNA는 역전사 직전에 조성물에 첨가될 것이다. 따라서, 조성물은 RNA 없이 제공될 수도 있다. 이것은 전형적으로 조성물이 키트 내에 제공될 경우일 것이다. RNA는, 조성물 중에 존재할 경우, 1 피크그램 내지 100㎍/20㎕ 반응 혼합물(예컨대, 약 1 피코그램/20㎕, 약 10 피코그램/20㎕, 약 50 피코그램/20㎕, 약 100 피코그램/20㎕, 약 200 피코그램/20㎕, 약 10 피코그램/20㎕, 약 500 피코그램/20㎕, 약 800 피코그램/20㎕, 약 1.0 나노그램/20㎕, 약 5.0 나노그램/20㎕, 약 10 나노그램/20㎕, 약 25 나노그램/20㎕, 약 50 나노그램/20㎕, 약 75 나노그램/20㎕, 약 100 나노그램/20㎕, 약 150 나노그램/20㎕, 약 250 나노그램/20㎕, 약 400 나노그램/20㎕, 약 500 나노그램/20㎕, 약 750 나노그램/20㎕, 약 1.0㎍/20㎕, 약 5.0㎍/20㎕, 약 10㎍/20㎕, 약 20㎍/20㎕, 약 30㎍/20㎕, 약 40㎍/20㎕, 약 50㎍/20㎕, 약 70㎍/20㎕, 약 85㎍/20㎕, 약 100㎍/20㎕, 약 10 피코그램/20㎕ 내지 약 100㎍/20㎕, 약 10 피코그램/20㎕ 내지 약 100㎍/20㎕, 약 100 피코그램/20㎕ 내지 약 100㎍/20㎕, 약 1.0 나노그램/20㎕ 내지 약 100㎍/20㎕, 약 100 나노그램/20㎕ 내지 약 100㎍/20㎕, 약 10 피코그램/20㎕ 내지 약 10㎍/20㎕, 약 10 피코그램/20㎕ 내지 약 5㎍/20㎕, 약 100 나노그램/20㎕ 내지 약 5㎍/20㎕, 약 1㎍/20㎕ 내지 약 10㎍/20㎕, 약 1㎍/20㎕ 내지 약 5㎍/20㎕, 약 100 나노그램/20㎕ 내지 약 1㎍/20㎕, 약 500 나노그램/20㎕ 내지 약 5㎍/20㎕ 등)의 농도로 존재할 것이다. 당업자라면 인식할 것인 바와 같이, 상이한 역전사 반응이 20㎕ 이외의 용적에서 수행될 수도 있다. 이러한 경우에, 존재하는 RNA의 총량은 이용된 용적에 따라서 변할 것이다. 따라서, 상기 양은 RNA의 양/20㎕의 조성물의 예로서 제공된다.
본 발명의 돌연변이 역전사효소는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물(저장 조성물 및/또는 반응 혼합물)에 존재할 경우, 약 0.01 내지 약 1,000 단위의 역전사효소 활성/㎕(예컨대, 약 0.01 단위/㎕, 약 0.05 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕, 약 0.2 단위/㎕, 약 0.3 단위/㎕, 약 0.4 단위/㎕, 약 0.5 단위/㎕, 약 0.7 단위/㎕, 약 1.0 단위/㎕, 약 1.5 단위/㎕, 약 2.0 단위/㎕, 약 2.5 단위/㎕, 약 5.0 단위/㎕, 약 7.5 단위/㎕, 약 10 단위/㎕, 약 20 단위/㎕, 약 25 단위/㎕, 약 50 단위/㎕, 약 100 단위/㎕, 약 150 단위/㎕, 약 200 단위/㎕, 약 250 단위/㎕, 약 350 단위/㎕, 약 500 단위/㎕, 약 750 단위/㎕, 약 1,000 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 0.2 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 1.0 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 5.0 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 10 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 20 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 50 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 100 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 200 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 400 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 500 단위/㎕ 내지 약 1,000 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 300 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 200 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 100 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 50 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 10 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 5.0 단위/㎕, 약 0.1 단위/㎕ 내지 약 1.0 단위/㎕, 약 0.2 단위/㎕ 내지 약 0.5 단위/㎕ 등이 되는 농도로 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 최종 사용을 위한 작업 농도로 희석된 농축된 용액(예컨대, 5×용액)으로서 제조될 수 있다. 5× 조성물에 관하여, 5:1 희석은 이러한 5× 용액을 작업 농도로 만드는데 요구된다. 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10× 등의 용액으로서 제조될 수 있다. 이러한 용액의 배수 농도에 대한 하나의 제한은, 화합물이 용액 중 특정 농도에 도달할 경우 석출이 일어날 수 있다는 점이다. 따라서, 농축된 조성물은 일반적으로 각종 성분의 농도가 완충제 성분의 석출이 일어나지 않도록 충분히 낮도록 제조될 것이다. 당업자라면 인식하는 바와 같이, 각 용액에 대해서 실현 가능한 농도의 상한은 특정 용액 및 성분에 따라 변화될 것이다.
많은 경우에, 본 발명의 조성물은 멸균 형태로 제공될 것이다. 멸균화는 조성물이 제조된 후에 해당 조성물을 혼합하기 전에 또는 해당 조성물에 조성물의 개별적인 성분에 대해 수행될 수 있다. 이러한 용액의 멸균화는 오토클레이빙 또는 한외여과를 비롯한 적절한 수단에 의해서 수행될 수 있다.
역전사효소를 이용하는 방법
본 발명의 역전사효소는 하나 이상의 주형으로부터 핵산 분자를 만드는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은, 하나 이상의 핵산 주형(예컨대, DNA 또는 RNA, 예를 들어, 비암호화 RNA(ncRNA), 전령 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 및 소간섭 RNA(siRNA) 분자)을 하나 이상의 본 발명의 역전사효소와 혼합하는 단계 및 하나 이상의 핵산 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 핵산 분자를 만드는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 이러한 방법(전장 cDNA 분자일 수 있음)에 의해 생산된 핵산 분자, 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터(특히 발현 벡터) 및 이들 벡터 및 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명을 유리하게 이용할 수 있는 기타 cDNA 합성 방법은 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 핵산 주형을 본 발명의 역전사효소 중 하나와 혼합하는 단계, 및 하나 이상의 핵산 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자의 증폭 방법을 제공한다. 이러한 증폭 방법은 1종 이상의 DNA 중합효소의 사용을 더 포함할 수 있고 표준 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 반응에서와 같이 이용될 수 있다.
본 발명의 이 양상에 따른 핵산 증폭 방법은 1-단계(예컨대, 1-단계 RT-PCR) 또는 2-단계(예컨대, 2-단계 RT-PCR) 반응일 수 있다. 본 발명에 따르면, 1-단계 RT-PCR 유형 반응은 하나의 튜브에서 달성될 수 있고 이에 따라서 오염 가능성을 낮출 수 있다. 이러한 1-단계 반응은 (a) 핵산 주형(예컨대, mRNA)을 본 발명의 1종 이상의 역전사효소 및 1종 이상의 DNA 중합효소와 혼합하는 단계 및 (b) 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 증폭은 역전사효소 활성에 의해 단독으로 또는 DNA 중합효소 활성과 조합하여 달성될 수 있다. 2-단계 RT-PCR 반응은 2개의 별개의 단계에서 달성될 수 있다. 이러한 방법은 (a) 핵산 주형(예컨대, mRNA)을 본 발명의 역전사효소와 혼합하는 단계, (b) 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 핵산 분자(예컨대, DNA 분자)를 만드는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계, (c) 핵산 분자를 1종 이상의 DNA 중합효소와 혼합하는 단계 및 (d) 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 단계 (c)의 혼합물을 배양시키는 단계를 포함한다. 긴 핵산 분자(즉, 약 3 내지 5kb 길이 초과)의 증폭을 위하여, DNA 중합효소들의 조합물, 예컨대, 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 하나의 DNA 중합효소와 3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 저감된 다른 하나의 DNA 중합효소 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 따라서 이용될 수 있는 증폭 방법은, PCR(예컨대, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참조), 등온 증폭(하나 이상의 RNA 중합효소를 이용함)(예컨대, PCT 공개 제WO 2006/081222호 참조), 가닥 변위 증폭(SDA; 예컨대, 미국 특허 제5,455,166호; EP 0 684 315 참조), 및 핵산 서열-기반 증폭(NASBA; 예컨대, 미국 특허 제5,409,818호; EP 0 329 822 참조)뿐만 아니라, 더욱 복잡한 PCR-기반 핵산 핑거프린팅 수법, 예컨대, 임의 증폭 다형 DNA(RAPD) 분석(예컨대, 문헌[Williams, J. G. K., et al., Nucl. Acids Res. 18(22):6531-6535, 1990] 참조), 임의의 프라이밍 PCR(AP-PCR, 예컨대, 문헌[Welsh, J., and McClelland, M., Nucl. Acids Res. 18(24):7213-7218, 1990] 참조), DNA 증폭 핑거프린팅(DAF; 예컨대, 문헌[
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et al., Bio/Technology 9:553-557, 1991] 참조), 미세부수체(microsatellite) PCR 또는 미니부수체-영역 DNA의 유도 증폭(DAVID; 예컨대, 문헌[Heath, D. D., et al. Nucl. Acids Res. 21(24): 5782-5785 (1993)] 참조), 및 증폭 단편 길이 다형화(AFLP) 분석(예컨대, EP 0 534 858; 문헌[Vos, P., et al. Nucl. Acids Res. 23(21):4407-4414 (1995); Lin, J. J., and Kuo, J. FOCUS 17(2):66-70 (1995)] 참조)을 포함한다. 본 발명의 조성물을 이용하는 핵산 서열분석 수법은 미국 특허 제4,962,022호 및 제5,498,523호에 개시된 것들과 같은 다이데옥시 서열분석 방법을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 중합효소 연쇄 반응(PCR), 예컨대, 위에서 기재된 PCR-기반 방법들 중 어느 것인가를 포함하는 핵산 분자를 증폭 또는 서열분석하는 방법에서 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 서열분석될 하나 이상의 핵산 분자를 하나 이상의 프라이머 핵산 분자, 본 발명의 1종 이상의 역전사효소, 1종 이상의 뉴클레오타이드 및 1종 이상의 종결제와 혼합하는 단계; (b) 서열분석될 하나 이상의 핵산 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 핵산 분자의 집단을 합성하는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계; 및 (c) 서열분석될 하나 이상의 핵산 분자의 전부 혹은 일부의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 핵산 분자의 집단을 분리하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자의 서열분석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이 양상에 따른 핵산 서열분석 방법은 사이클 서열분석(증폭과 조합한 서열분석) 및 표준 서열분석 반응 둘 다를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 서열분석 방법은 (a) 서열분석될 핵산 분자를 1종 이상의 프라이머, 본 발명의 1종 이상의 역전사효소, 1종 이상의 뉴클레오타이드 및 1종 이상의 종결제와 혼합하는 단계, (b) 서열분석될 분자의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 핵산 분자의 집단을 합성하는데 충분한 조건 하에 혼합물을 배양하는 단계, 및 (c) 서열분석될 분자의 전부 또는 일부의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 핵산 분자의 집단을 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 1종 이상의 DNA 중합효소(바람직하게는 열안정성 DNA 중합효소)는 본 발명의 역전사효소와 조합하여 또는 이와 별도로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, cDNA 분자(단일 가닥 또는 이중 가닥)는 본 명세서에서 제공된 신규한 돌연변이 역전사효소를 이용해서 각종 핵산 주형 분자로부터 제조될 수 있다. 본 발명에서 이용하기 위한 바람직한 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 및 RNA 분자뿐만 아니라, 이중 가닥 DNA:RNA 혼성체를 포함한다. 더욱 바람직한 핵산 분자는 전령 RNA(mRNA), 운반 RNA(tRNA) 및 리보솜 RNA(rRNA) 분자를 포함하지만, mRNA 분자가 본 발명에 따른 바람직한 주형이다. 소정의 실시형태에 있어서, 유전자-특이적 프라이머가 이용될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 돌연변이 역전사효소의 적어도 몇몇이 잘 적합화된 소정의 다른 실시형태에 있어서, 올리고 dT 프라이머가 사용된다. 이들 dT 프라이머는 몇몇 실시형태에 있어서 LNA 프라이머일 수 있다. 또한, 예시적인 예에서, 이러한 반응을 위한 주형은 mRNA일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 cDNA 분자를 제조하는데 이용되는 핵산 분자는 당업자에게 친숙한 표준 유기 화학 합성 방법에 따라서 합성적으로 제조될 수 있다. 더 바람직하게는, 핵산 분자는 다양한 세포, 조직, 기관 또는 유기체 등과 같은 천연 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 핵산 분자의 공급원으로부터 사용될 수 있는 세포는 원핵 세포(에세리키아, 바실러스, 세리티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 클라미디아(Chlamydia), 나이세리아(Neisseria), 트레포네마(Treponema), 마이코플라스마(Mycoplasma), 보렐리아(Borrelia), 레지오넬라(Legionella), 슈도모나스, 마이코박테륨(Mycobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 에르위니아(Erwinia), 아그로박테륨(Agrobacterium), 리조븀(Rhizobium), 잔토모나스(Xanthomonas) 및 스트렙토마이세스속을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 박테리아 세포) 또는 진핵 세포(진균(특히 효모), 식물, 원생동물 및 기타 기생충, 그리고 곤충(특히 드로소피아종(Drosophila spp.) 세포), 네마토데스(nematodes)(특히 캐노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 세포), 및 포유동물(특히 인간 세포)를 포함하는 동물을 포함함)일 수 있다.
핵산의 공급원으로서 이용될 수 있는 포유동물 체세포는 혈액 세포(망상적혈구 및 백혈구), 내피세포, 외피세포, 신경 세포(중추 또는 말초 신경계), 근육 세포(골격근, 평활근 또는 심근으로부터의 근세포 및 근아세포를 포함함), 결합 조직 세포(섬유아세포, 지방세포, 연골세포, 조연골세포, 골세포 및 골아세포를 포함함) 및 기타 기질 세포(예컨대, 대식세포, 수지상 세포, 슈반 세포)를 포함한다. 포유동물의 생식세포(정모세포 및 난모세포)는, 또한 본 발명에서 이용하기 위한 핵산의 공급원으로서 사용될 수 있고, 이것은 상기 체세포 및 생식 세포에 대해서 일어나는 기원, 전구체 및 줄기 세포일 수 있기 때문이다. 또한 핵산 공급원으로서 이용하기에 적합한 것은 포유동물의 조직 또는 기관, 예를 들어, 뇌, 신장, 간, 췌장, 혈액, 골수, 근육, 신경, 피부, 비뇨생식기, 순환계, 림프구, 위장 및 결합 조직 공급원뿐만 아니라 포유동물(인간을 포함함)의 배아 또는 태아로부터 유도된 것들이다.
상기 원핵 또는 진핵 세포, 조직 및 기관의 어느 것이라도, 정상, 병든, 형질전환된, 확립된, 기원, 전구체, 태아 또는 배아 세포일 수 있다. 병든 세포는, 예를 들어, 감염성 질환(박테리아, 진균 또는 효모, 바이러스(AIDS, HIV, HTLV, 헤르페스, 간염 등을 포함) 또는 기생충에 의해 유발)에, 유전적 또는 생화학적 병리(예컨대, 낭포성 섬유증, 혈우병, 알츠하이머병, 근위축병 또는 다발성 경화증) 또는 암 진행에 연루된 것들을 포함할 수 있다. 형질전환된 또는 확립된 세포주는, 예를 들어, COS 세포, CHO 세포, VERO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, HepG2 세포, K562 세포, 293 세포, L929 세포, F9 세포 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 이용하기 위한 핵산의 공급원으로서 적합한 기타 세포, 세포주, 조직, 기관 및 유기체는 당업자에 의해 명백해질 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 게놈 핵산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 모계 핵산, 태아 핵산 또는 모계 핵산과 태아 핵산의 혼합물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 게놈 핵산의 단편을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 바이러스 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 이들의 혼합물로부터 유래된 핵산을 포함할 수 있다. 핵산 샘플은 하나 이상의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 샘플은 예를 들어 유기체, 미네랄 또는 지리적 부위(예컨대, 토양, 바위, 미네랄 퇴적물, 화석), 또는 법의학적 부위(예컨대, 범죄 장면, 밀수품 또는 의심되는 밀수품)로부터 수집될 수 있다. 따라서, 공급원은 환경적, 예를 들어, 지리학적, 농업적, 전투 장소 또는 토양 공급원일 수 있다. 공급원은 또한 임의의 식물, 진균, 원생생물, 모네라계, 바이러스 또는 동물(인간, 비인간, 포유동물, 파충류, 소(cattle), 고양이, 개, 염소, 돼지(swine), 돼지(pig), 원숭이, 유인원, 고릴라, 황소, 젖소, 곰, 말, 양, 가금류, 마우스, 래트, 어류, 돌고래, 고래 및 상어 또는 검출 가능한 핵산을 지닐 수 있는 임의의 동물 또는 유기체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아님) 등과 같은 임의의 유형의 유기체로부터 유래될 수 있다. 공급원은 또한 내부 부분, 외부 부분, 생세포 또는 비생세포, 조직, 유체 등과 같은 유기체의 상이한 부분을 지칭할 수도 있다. 따라서, 샘플은 "생물학적 샘플"일 수 있고, 이것은 살아 있는 공급원 또는 전에-살이 있는 공급원, 예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물 등과 같은 동물, 식물, 박테리아, 진균, 원생생물 또는 바이러스로부터 얻어진 임의의 물질을 지칭한다. 공급원은, 제한 없이, 조직, 세포, 세포 펠릿, 세포 추출물 또는 검시 또는 생물학적 유체, 예컨대, 소변, 혈액, 타액, 양수, 감염 또는 염증 영역으로부터의 삼출물, 협측 세포를 포함하는 구강 세척액, 모발, 뇌 척수액 및 관절 낭액 및 기관을 포함하는 임의의 형태일 수 있다. 샘플은 또한 기타 샘플에 비해서 상이한 시점에서 단리될 수 있고, 여기서 샘플의 각각은 동일 또는 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 핵산은, 예를 들어, cDNA 또는 RNA 라이브러리 등과 같은 핵산 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 핵산은 샘플로부터 핵산 정제 또는 핵산 분자의 단리 및/또는 증폭의 결과일 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열 분석 과정을 제공하는 핵산은 하나의 샘플로부터의 핵산 또는 2 이상의 샘플(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 또는 그 이상의 샘플)로부터의 핵산을 함유할 수 있다. 핵산은 각종 방식으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 크기가 저감(예컨대, 뉴클레아제 또는 제한 효소에 의해 소화, 탈인산화, 탈메틸화), 크기의 증가(예컨대, 인산화, 메틸화-특이적 시약과 반응, 검출 가능한 라벨에 부착), 핵산 절단의 저해제로 처리될 수 있는 등이다.
핵산은 소정의 실시형태에 있어서 가공처리 없이 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위하여 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 핵산은 가공처리 후 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위하여 제공된다. 예를 들어, 핵산은 샘플로부터 추출, 단리, 정제 또는 증폭될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 용어 "단리된"은 그의 원래의 환경(예컨대, 천연 유래라면 자연 환경, 또는 외인적으로 발현된 경우 숙주 세포)으로부터 제거되어 그의 원래의 환경으로부터 "인간의 손에 의해" 변경된 핵산을 지칭한다. 단리된 핵산은 일반적으로 공급원 샘플에 존재하는 성분의 양보다 적은 비-핵산 성분(예컨대, 단백질, 지질)으로 제공된다. 단리된 핵산을 포함하는 조성물은 실질적으로 단리될 수 있다(예컨대, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 이상의 비-핵산 성분이 없음). 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 용어 "정제된"은 핵산이 유래되는 샘플 공급원에서보다 적은 핵산종을 함유하는 제공된 핵산을 지칭한다. 핵산을 포함하는 조성물은 실질적으로 정제될 수 있다(예컨대, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 기타 핵산종이 없음).
핵산은, 소정의 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 과정을 위하여 핵산을 제공하기 전에, 핵산 단편을 생성하는 방법에 의해 처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단편화 또는 절단이 시행된 핵산은, 약 5 내지 약 10,000 염기쌍, 약 100 내지 약 1,00개의 염기쌍, 약 100 내지 약 500개의 염기쌍, 또는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000개의 염기쌍의 공칭, 평균 또는 중앙 길이를 가질 수 있다. 단편은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생성될 수 있고, 핵산 단편의 평균, 중앙 또는 공칭 길이는 적절한 단편-생성 절차를 선택함으로써 제어될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 비교적 더 짧은 길이의 핵산이 적은 서열 변형을 포함하고/하거나 비교적 대량의 공지된 뉴클레오타이드 서열 정보를 포함하는 서열을 분석하는데 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비교적 더 긴 길이의 핵산이 더 많은 서열 변형을 포함하고/하거나 비교적 소량의 미지의 뉴클레오타이드 서열 정보를 포함하는 서열을 분석하는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "표적 핵산" 또는 "표적 핵산종"이란 샘플 내 관심 대상인 임의의 핵산 종을 지칭한다. 표적 핵산은, 제한 없이, (i) 2개 이상의 가능한 대립유전자 중에서 특정 대립유전자, 및 (ii) 특정 돌연변이, 뉴클레오타이드 치환, 서열 변형, 반복 서열, 마커 또는 구별 서열을 지니거나 지니지 않는 핵산을 포함한다.
일단 출발 세포, 조직, 기관 또는 기타 샘플이 얻어지면, 핵산 분자(예컨대 mRNA)는 당업계에 충분히 공지된 방법에 의해 이들로부터 단리될 수 있다(예컨대, 문헌[Maniatis, T., et al., Cell 15:687-701 (1978); Okayama, H., and Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2:161-170 (1982); Gubler, U., and Hoffman, B. J., Gene 25:263-269 (1983)] 참조). 이와 같이 해서 단리된 핵산 분자는 이어서 본 발명에 따라서 cDNA 분자 및 cDNA 라이브러리를 제조하는데 이용될 수 있다.
키트
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 핵산 분자의 역전사 또는 증폭에서 이용하기 위한 키트 내로, 또는 핵산 분자의 서열분석에 이용하기 위한 키트 내로 조립될 수 있다. 본 발명의 이 양상에 따른 키트는 캐리어 수단, 예컨대, 내부에 폐쇄 구획을 가진 박스, 카톤, 튜브 등, 하나 이상의 용기 수단, 예컨대, 바이알, 튜브, 앰플, 병 등을 포함하되, 여기서 제1 용기는 역전사효소 활성을 가진 본 발명의 1종 이상의 폴리펩타이드를 수용한다. 역전사효소 활성을 가진 1종보다 많은 폴리펩타이드가 이용될 경우, 이들은 단일 용기에 2종 이상의 폴리펩타이드로서, 또는 개별의 용기에 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 (동일 또는 별개의 용기에) 1종 이상의 DNA 중합효소, 적절한 완충제, 1종 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 1종 이상의 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 핵산(예컨대 벡터를 포함하는 DNA 분자)을 흡수하는데 적격인 것들을 포함하는 1종 이상의 숙주 또는 세포를 포함할 수 있다. 바람직한 숙주는 이. 콜라이(DH5, DH5α, DH10B, HB101, Top 10, 및 기타 K-12 균주뿐만 아니라 이. 콜라이 B 및 이. 콜라이 W 균주를 포함) 등과 같은 화학적 적격 또는 전기천공적격(electrocompetent) 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 양상에 있어서, 본 발명의 키트(예컨대, 역전사 및 증폭 키트)는 본 발명의 역전사효소 활성을 가진 1종 이상의 폴리펩타이드, 핵산 분자의 합성에 이용되는 1종 이상의 뉴클레오타이드(그 중 1종 이상이 표지 또는 형광 표지되어 있을 수 있음) 및/또는 1종 이상의 프라이머(예컨대, 역전사용의 올리고(dT))를 포함하는 1종 이상의 성분을 (혼합물로 또는 개별적으로) 포함할 수 있다. 이러한 키트(역전사 및 증폭 키트를 포함)는 1종 이상의 DNA 중합효소를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 서열분석 키트는 본 발명의 역전사효소 활성을 가진 1종 이상의 폴리펩타이드, 및 임의로 1종 이상의 DNA 중합효소, 핵산 분자의 서열분석에 이용되는 1종 이상의 종결제(예컨대, 다이데옥시뉴클레오사이드 트라이포스페이트 분자), 1종 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 1종 이상의 프라이머를 포함할 수 있다. 역전사효소 활성을 가진 바람직한 폴리펩타이드, DNA 중합효소, 뉴클레오타이드, 프라이머 및 본 발명의 역전사, 증폭 및 서열분석 키트에 사용하기에 적합한 기타 성분은 위에 기재된 것들을 포함한다. 본 발명의 이 양상에 의해 포괄되는 키트는 표준 핵산 역전사, 증폭 또는 서열분석 프로토콜을 수행하는데 필요한 추가의 시약 및 화합물을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 역전사효소 활성을 가진 이러한 폴리펩타이드, DNA 중합효소, 뉴클레오타이드, 프라이머 및 추가의 시약, 성분 또는 화합물은 하나 이상의 용기에 수용될 수 있고, 상기 언급된 성분들 중 둘 이상의 혼합물로 이러한 용기 내에 수용될 수 있거나 또는 본 발명의 키트에서 개별적인 용기에 수용될 수 있다. 이러한 키트는 또한 (예컨대, 본 발명에 따라 핵산 분자를 표지하기 위한 등과 같은 본 발명의 방법을 수행하기 위한) 설명서를 포함할 수 있다.
소정의 예시적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 키트는 분자 진단 검정을 위하여 바람직하다. 이 키트는 인간 진단, 동물 진단, 환경 진단 및/또는 식품 안전을 위한 진단 제품의 판매를 조절하기 위한 정부 규제 기관에 의해 승인될 수 있다. 본 발명의 역전사효소는 이러한 키트 내에 현재의 역전사효소 대신에 제공될 수 있다. 게다가, 본 발명의 신규한 역전사효소의 유리하고도 놀라운 특성은 이들을 이러한 응용을 위하여 특히 충분히 적합하게 한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 키는 내부 및/또는 외부 양성 대조군, 표적 유전자(예컨대, 프라이머 및/또는 프로브)의 검출용의 올리고뉴클레오타이드의 세트, 용해 완충액, 유라실 DNA 글리코실라제(UDG), 마스터 믹스 및 검출 염료를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 1종 이상의 성분을 포함한다.
관련된 분야의 당업자에게 본 명세서에 기재된 방법들에 대한 다른 적절한 변형 및 적응이 자명하고 본 발명의 범위 또는 그의 임의의 실시형태를 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있음이 용이하게 명백할 것이다. 이하에 제공된 부문의 제목은 단지 편의를 위한 것이다. 이제 본 발명을 상세히 기재하였지만, 동일한 것은 하기 실시예들을 참조하여 더욱 명확하게 이해될 것이고, 이는 단지 예시의 목적으로 이와 함께 포함된 것으로 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
각종 역전사효소의 열안정성 및 진행도의 비교
2㎍의 0.24 내지 9.5kb RNA 래더(인비트로젠사, 카탈로그 번호 15620016) 및 5μM의 5' 표지된 올리고(dT)20 프라이머(Alexa-647)를 19㎕의 1X 제1 가닥 cDNA 합성 완충제의 최종 반응 용적(pH 8.4(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 Y02321))에 첨가하고 10mM DTT, 500μM의 각 dNTP(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP), 및 2U RNaseOuT(인비트로젠사, 카탈로그 번호 10777-019)로 보충하고 얼음 상에서 배양하였다. 이어서 반응은 1㎕의 역전사효소(200U/㎕)를 (최종 용적 20㎕로) 첨가하고 나서 60℃, 37℃, 42℃ 또는 50℃(도 2에 나타낸 바와 같음)에서 각종 시간 길이(즉, 5분, 15분 및 60분) 동안 배양함으로써 개시시켰다. 각 시점의 말기에, 반응은 10㎕의 알칼리성 장입 염료(300mM NaOH, 2mM EDTA, 20% 글리세롤, 10% 포화 티몰 블루)의 첨가에 의해 종결시키고 완충제(30mM NaOH, 2mM EDTA pH 7.5) 중 1% 알칼리성 아가로스 겔(30mM NaOH, 2mM EDTA pH 7.5) 상에서 30볼트에서 2 내지 4시간 동안 전기영동에 의해 가시화하였다. 겔은 이어서 이미지콴트(ImageQuant) 소프트웨어를 이용해서 몰리큘러 다이나믹스 타이푼 8600 가변 모드 이미저(Molecular Dynamics Typhoon 8600 Variable Mode Imager)(하로우 사이언티픽사(Harlow Scientific))에 의해 분석하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에서의 교시를 이용해서 작제된 예시적인 돌연변이 M-MLV인 돌연변이 M-MLV RT("Mut D9")(서열번호 4)를 포함하는 반응은 배양 후 5분처럼 조기에 7.5kb까지의 cDNA와 60℃에서 단지 15분의 배양 후 9.5kb까지의 cDNA를 생성하였다. 이것은 필적할 만한 양의 7.5kb cDNA를 생산하는데 60분까지를 필요로 하는 37℃에서 배양된 야생형 M-MLV RT를 포함하는 반응과 대조적이다. 유사하게, 7.5kb cDNA는 42℃ 또는 50℃에서 각각 5분 초과의 배양까지 SuperScript(상표명) II("SSII") 또는 SuperScript(상표명) III("SSIII") RT를 포함하는 반응에서 검출되지 않았다. 조사된 기타 상업적으로 입수 가능한 RT("Q-RT")는 37℃에서 60분의 배양 후에도 임의의 유사한 cDNA를 생산하지 못하였다. 이것은 돌연변이 M-MLV("Mut D9") RT는 고도로 진행성이었고 그리고 60℃의 높은 온도에서 수행된 역전사 반응에서 증가된 열안정성뿐만 아니라, 열반응성을 나타낸 것을 입증한다.
실시예 2
낮은 pH에서의 돌연변이 역전사효소 안정성
야생형 M-MLV RT(인비트로젠사의 카탈로그 번호 28025-013)("WT MMLV")와 예시적인 돌연변이 M-MLV RT("Mut D9")의 비교는 다양한 pH에서 합성된 cDNA의 속도와 길이를 평가하기 위하여 수행되었다. 이들 검정은 0.5 내지 10kb RNA 래더(Ambion(등록상표) 카탈로그 번호 15623-200) 및 Alexa Fluor(등록상표) 647 올리고(dT)20을 함유하였고, 표준 pH 8.3 완충제(50mM 트리스-HCl pH 8.3, 72.5mM KCl 및 3mM MgCl2) 또는 pH 7.3 완충제(50mM Tris-HCl pH 7.3, 72.5mM KCl, 및 3mM MgCl2)에서 수행되었다. 반응 온도는 야생형 M-MLV에 대해서 37℃이고 Mut D9에 대해서 50℃였고, RT 반응은 다양한 시간 길이(즉, 도 3에 나타낸 바와 같이 10분, 30분 또는 60분) 동안 수행되었다. 생산된 제1 가닥 cDNA는 알칼리성 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해시키고 Cy5 형광 모드에서 설정된 몰리큘러 다이나믹스 타이푼 8600 가변 모드 이미저(하로우 사이언티픽사)를 이용해서 가시화하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, pH 8.3에서, Mut D9는 10분에 4kb에 도달한 반면, 야생형 M-MLV는 동일한 시간량에서 단지 3kb에 도달한다. pH 7.3에서, 돌연변이 D9는 30분에 4kb에 도달할 수 있는 반면, 야생형 M-MLV는 60분 RT 반응 시간 후에도 3kb를 넘는 cDNA를 생산할 수 없다. 따라서 Mut D9는, 야생형 M-MLV보다 더 높은 온도에 있을 경우에도, 더 넓은 pH 범위에서 야생형 M-MLV보다 더 활성이고, pH 8.3 및 pH 7.3 둘 다에서 더 많은 cDNA를 그리고 더 긴 cDNA를 생산한다.
실시예 3
돌연변이 역전사효소 열안정성
실시예 2에 기재된 실험은 또한 야생형 M-MLV("WT MMLV") 및 기타 상업적으로 입수 가능한 RT("SSIII" 및 "C-RT")에 비해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 예시적인 돌연변이 RT("Mut D9")의 열안정성을 평가하기 위하여 다양한 시간 길이(즉, 도 4에 나타낸 바와 같이 5분, 10분, 30분 또는 60분) 동안 60℃에서 수행되었다. 이 온도에서, 표준 올리고(dT)20은 용융 온도가 50℃ 부근이기 때문에 RNA 표적의 폴리아데닐화 테일에 어닐링될 수 없다. 대신에 50% LNA를 함유하는 LNA(상표명) 올리고-T20(엑시콘 라이프 사이언시즈사(Exiqon Life Sciences))이 이용되었다. 실험에서의 다른 차이는 완충제, RNA 표적 및 프라이머를 함유하는 반응 믹스를 먼저 RT 효소의 부가 전에 60℃에서 가열한("매뉴얼 핫 스타트") 점이다. 매뉴얼 핫 스타트는 반응 셋업 및 온도 램프 업 시간 동안 cDNA 합성을 제거하기 위하여 수행되었다. pH 8.3 및 60℃에서, Mut D9를 제외한 모든 효소는 비기능성이다. Mut D9 속도, cDNA 수율 및 cDNA 길이 성능은 50℃(도 3 비교)에 비해서 60℃에서 변하지 않은 채로 있다(도 4 참조). 이와 같이 해서, Mut D9는 열안정성 및 열반응성 둘 다이며 - 이것은 cDNA보다 높은 온도에서(열반응성) 합성될 뿐만 아니라 더 높은 온도로 가열(열안정성)된 후에 활성 효소로 재폴딩(refold)될 수 있다(예컨대, 도 4 참조).
실시예 4
역전사 감도 및 열안정성의 평가
모든 반응에 대해서, 20㎕ 반응 당 100, 50 또는 10ng의 Hela RNA(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 AM7852, 자궁경부 선암(Hela-S3) 총 RNA)를 이하에 나타낸 온도 및 시간에서 배양하였다: (1) 프라이머의 부재 하, (2) 올리고(dT)20 프라이머의 존재 하; (3) LNA T20 프라이머(엑시콘사)의 존재 하; 및 (4) 유전자 특이적 프라이머(PolE 2.5kb-rev 프라이머 서열: GACCAGGTCCTGCAGGGTGAAGGC)의 존재 하. 각 반응 혼합물은 표시된 양의 Hela RNA(도 5에 나타낸 바와 같음), 1mM의 각각의 dNTP(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP)(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 10297018), 5mM DTT(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 Y00147), 1X 제1 가닥 완충제(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 Y02321), 1μM 프라이머(1, 2, 3 또는 4, 위에서 기재되고 도 5에 나타낸 바와 같음), 40 U RNaseOut(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 10777019) 및 100U의 기타 상업적으로 입수 가능한 돌연변이 M-MLV 역전사효소("SSIII" 및 "M-RT") 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시적인 돌연변이 M-MLV 역전사효소("Mut D9")를 함유하였다.
넌-핫 스타트("비-HS-RT") 반응 조건, 반응 혼합물 -(마이너스) 단백질(역전사효소 및 RNaseOut)을 65℃에서 5분 동안 배양하고 나서 얼음 위에서 10분간 배양하였다. RNaseOut 및 역전사효소 효소를 각 반응물에 첨가하고, 이어서 이 반응물을 실온에서 10분 동안 배양하였다. 이것은 이어서 50℃에서 50분 동안 추가의 배양을 실시하고 나서, 모든 반응물을 95℃에서 10분 동안 열 사멸시켰다.
매뉴얼 핫 스타트("HS-RT") 반응 조건을 위하여, 반응 혼합물 -(마이너스) 단백질(역전사효소 및 RNaseOut)을 65℃에서 5분 동안 배양하고 나서, 얼음 위에서 10분간 배양하였다. RNaseOut을 각 반응물에 첨가하고, 이 반응물을 역전사효소의 부재 하에 60℃에서 10분 동안 배양하였다. 역전사효소 효소를 이어서 이 반응물에 직접 첨가하는 한편 60℃에서 배양하고, 이 반응물을 60℃에서 50분간 진행시켰다. 이어서 모든 반응물을 95℃에서 10분 동안 열 사멸시켰다.
위에서 언급된 역전사 반응물로부터의 cDNA 산물을 사용해서, PCR 혼합물을 제조하였다. 요약하면, 1㎕의 상기 RT 반응물을 24㎕의 PCR 혼합물에 첨가하였다. PCR 반응물을 플래티넘 타크 DNA 폴리머라제 하이 충실도(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 11304102)를 이용해서 제조사에 의해 권장되는 바와 같이 셋업하고 30 사이클 동안 증폭시켰다. pol E 유전자에 대한 유전자-특이적 프라이머를 PCR을 위하여 이용하여 1kb 단편을 얻었다. 프라이머 서열은 다음과 같았다: 순방향(AGCGCCAGACATCGAGGGCGTATATGAGAC) 및 역방향(TGGTGAGACTGGAGAATGGTGTTG). 겔 산물은 2% E-겔(라이프 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 G501802) 상에서 10㎕의 각 PCR 반응물을 이용해서 가시화하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 모두 3가지 역전사효소는 임의의 프라이머의 부재 하에서도(1), 실온 및 50℃("비-HS-RT" 반응)에서 배양된 경우 10 내지 100ng 주형 DNA를 이용해서 전사물을 생산하고, (2) 올리고(dT)20 프라이머; (3) 잠금 핵산(LNA) T20 프라이머, 및 (4) 50 내지 100ng 주형 DNA를 구비한 유전자 특이적 프라이머를 이용해서 마찬가지 양의 1kb cDNA를 생산하였다. "HS-RT" 반응에 대하여, 1kb cDNA는 프라이머의 부재 하에 또는 프라이머(2, 3 또는 4) 중 어느 것인가의 부가로 10, 50 또는 100ng 주형 DNA에 대해서 SSIII을 생산하지 못하였다. 기타 상업적으로 입수 가능한 RT("M-RT")는 또한 프라이머의 부재 하에 어떠한 cDNA도 생산하지 못했고, LNA T20 프라이머 또는 유전자 특이적 프라이머가 이용된 경우 10, 50 또는 100ng 주형 DNA에 대해서 흔적량의 cDNA를 생산할 뿐이었다. 다른 한편, 돌연변이 M-MLV Mut D9(서열번호 4)는 LNA T20 프라이머 또는 유전자 특이적 프라이머가 이용된 경우에 10ng 주형 DNA에 대해서 상당량의 cDNA를 생산하였고, 또한 시험된 3가지 프라이머(2, 3 및 4) 모두에 대해서 50 및 100ng의 주형 DNA에 대해서 상당량의 cDNA를 생산하였다. 이것은 Mut D9가 60℃에서 기능할 뿐만 아니라, 비특이적(예컨대, dT 또는 LNA) 프라이머뿐만 아니라 특이적 프라이머 유형을 이용해서 주형 DNA를 역전사시킬 수 있는 것을 나타낸다. 야생형 M-MLV 역전사효소 또는 기타 상업적으로 입수 가능한("통상의") 돌연변이 M-MLV RT의 어느 것인가보다 단지 10ng의 투입 RNA로 더 많은 산물을 생산하는 Mut D9의 능력은 또한 감도 증가를 나타낸다.
게다가, 보다 높은 온도에서, 예컨대, 60℃에서 역전사 반응을 수행하는 능력은 "비-HS-RT"반응에서 시험된 모든 RT에 대해서 가시적이었던 프라이머 없는 cDNA 합성을 방지하는 것을 돕는다. 이와 같이 해서, 본 명세서에 개시된 것들과 같이 60℃에서 효율적으로 수행될 수 있는 RT는, 흔히 RT 반응 동안 일어날 수 있는 자체-프라이밍 이벤트로 인해 비특이적 프라이밍의 양을 저감시키는 유익을 제공한다. 프라이머 없는 cDNA의 이러한 저감은 상승된 온도에서(예컨대, 50℃, 55℃, 60℃ 등에서) 크게 증대된다.
실시예 5
저해제의 존재 하의 돌연변이 역전사효소 성능
실시예 2에 기재된 것과 유사한 검정이 각종 저해제의 존재에서 수행되었다. RT 반응 온도는 야생형 M-MLV에 대해서 37℃인 반면, 기타 상업적으로 입수 가능한 돌연변이 M-MLV RT("SSIII" 및 "C-RT") 및 Mut D9에 대한 반응 온도는 50℃였다. 각 RT 반응은 60분 동안 수행되었다. 시험된 RT 저해제는 SDS(0.006 내지 0.01%), 에탄올(26 내지 30%), 부식산(21 내지 25 ng/㎕), 담즙산염(0.16 내지 0.2%), 헤파린(0.0031 내지 0.0042 U/㎕) 및 헤마틴(46 내지 50μM)을 포함한다. 도 6이 입증하는 바와 같이, 야생형 M-MLV는 SDS, 부식산, 담즙산염 및 헤마틴의 모든 농도에서 기능하지 않는다. 이것은 에탄올에서 약간 기능하지만 전장 0.5kb cDNA를 합성할 수 없다. 그러나, 헤파린의 존재 하에, 야생형 M-MLV는 0.5kb cDNA를 합성하는 것이 가능하다. SSIII은 SDS, 부식산 및 헤마틴의 모든 농도에서 기능하지 않는다. 이것은 에탄올 및 담즙산염에서 약간 기능하지만 전장 0.5kb cDNA를 합성할 수 없다. 이것은 헤파린이 존재할 경우 1.5kb까지 역전사시킬 수 있다. Mut D9는 시험된 저해제의 모든 농도에서 야생형 M-MLV와 SSIII 둘 다에서보다 큰 활성을 나타낸다. 기타 상업적으로 입수 가능한 RT(즉, C-RT)에 비해서 Mut D9는 활성이 대략 동등한 에탄올과 헤파린을 제외하고 시험된 저해제의 모든 농도에서 보다 큰 활성을 나타낸다.
위에서 기재된 바와 같은 각종 저해제의 존재에서 시험된 RT의 활성 %는 TotalLab TL100 소프트웨어를 이용해서 밀도계에 의해 정량화되었다. 각 밴드의 용적 강도는 각 레인에서 합산되었다. 무저해제 레인의 용적 강도는 100%로 설정되었고, 저해제를 가진 레인은 무저해제의 %로서 정규화하여 활성 %를 부여하였다. 도 7은 도 6에 나타낸 상이한 RT의 RT 활성의 비교를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION <120> NOVEL REVERSE TRANSCRIPTASES FOR USE IN HIGH TEMPERATURE NUCLEIC ACID SYNTHESIS <130> LT00877PCT <140> PCT/US2015/012534 <141> 2015-01-22 <150> 61/930,395 <151> 2014-01-22 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2031 <212> DNA <213> Maloney murine leukemia virus <400> 1 accctaaata tagaagatga gcatcggcta catgagacct caaaagagcc agatgtttct 60 ctagggtcca catggctgtc tgattttcct caggcctggg cggaaaccgg gggcatggga 120 ctggcagttc gccaagctcc tctgatcata cctctgaaag caacctctac ccccgtgtcc 180 ataaaacaat accccatgtc acaagaagcc agactgggga tcaagcccca catacagaga 240 ctgttggacc agggaatact ggtaccctgc cagtccccct ggaacacgcc cctgctaccc 300 gttaagaaac cagggactaa tgattatagg cctgtccagg atctgagaga agtcaacaag 360 cgggtggaag acatccaccc caccgtgccc aacccttaca acctcttgag cgggctccca 420 ccgtcccacc agtggtacac tgtgcttgat ttaaaggatg cctttttctg cctgagactc 480 caccccacca gtcagcctct cttcgccttt gagtggagag atccagagat gggaatctca 540 ggacaattga cctggaccag 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Val Arg Gln Ala Pro Leu 35 40 45 Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr 50 55 60 Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg 65 70 75 80 Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr 85 90 95 Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val 100 105 110 Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr 115 120 125 Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln 130 135 140 Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu 145 150 155 160 His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu 165 170 175 Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe 180 185 190 Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala 195 200 205 Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp 210 215 220 Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr 225 230 235 240 Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg 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His Cys Lys Gly 625 630 635 640 His Gln Lys Asp Asp Ala Pro Thr Ser Thr Gly Asn Arg Arg Ala Asp 645 650 655 Glu Val Ala Arg Glu Val Ala Ile Arg Pro Leu Ser Thr Gln Ala Thr 660 665 670 Ile Ser <210> 19 <211> 673 <212> PRT <213> Phascolarctos cinereus <400> 19 Met Val Leu Asn Leu Glu Glu Glu Tyr Arg Leu His Glu Lys Pro Val 1 5 10 15 Pro Pro Ser Ile Asp Pro Ser Trp Leu Gln Leu Phe Pro Met Val Trp 20 25 30 Ala Glu Lys Ala Gly Met Gly Leu Ala Asn Gln Val Pro Pro Val Val 35 40 45 Val Glu Leu Lys Ser Asp Ala Ser Pro Val Ala Val Arg Gln Tyr Pro 50 55 60 Met Ser Lys Glu Ala Arg Glu Gly Ile Arg Pro His Ile Gln Arg Phe 65 70 75 80 Leu Asp Leu Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr Pro 85 90 95 Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val Gln 100 105 110 Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Gln Asp Ile His Pro Thr Val 115 120 125 Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Ser Leu Pro Pro Ser His Thr Trp 130 135 140 Tyr Ser Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Lys Leu His 145 150 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365 Val Asp Glu Lys Glu Gly Val Ala Arg Gly Val Leu Thr Gln Thr Leu 370 375 380 Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp Pro 385 390 395 400 Val Ala Ser Gly Trp Pro Thr Cys Leu Lys Ala Ile Ala Ala Val Ala 405 410 415 Leu Leu Leu Lys Asp Ala Asp Lys Leu Thr Leu Gly Gln Asn Val Leu 420 425 430 Val Ile Ala Pro His Asn Leu Glu Ser Ile Val Arg Gln Pro Pro Asp 435 440 445 Arg Trp Met Thr Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ser Leu Leu Leu 450 455 460 Asn Glu Arg Val Ser Phe Ala Pro Pro Ala Ile Leu Asn Pro Ala Thr 465 470 475 480 Leu Leu Pro Val Glu Ser Asp Asp Thr Pro Ile His Ile Cys Ser Glu 485 490 495 Ile Leu Ala Glu Glu Thr Gly Thr Arg Pro Asp Leu Arg Asp Gln Pro 500 505 510 Leu Pro Gly Val Pro Ala Trp Tyr Thr Asp Gly Ser Ser Phe Ile Met 515 520 525 Asp Gly Arg Arg Gln Ala Gly Ala Ala Ile Val Asp Asn Thr Arg Thr 530 535 540 Val Arg Ala Ser Asn Leu Pro Glu Gly Thr Ser Ala Gln Lys Ala Glu 545 550 555 560 Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg Leu Ala Glu Gly Lys Ser Ile 565 570 575 Asn Ile Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His Val His 580 585 590 Gly Ala Ile Tyr Lys Gln Arg Gly Leu Leu Thr Ser Ala Gly Lys Asp 595 600 605 Ile Lys Asn Lys Glu Glu Ile Leu Ala Leu Leu Glu Ala Ile His Leu 610 615 620 Pro Lys Arg Val Ala Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Arg Gly Thr 625 630 635 640 Asp Pro Val Ala Thr Gly Asn Arg Lys Ala Asp Glu Ala Ala Lys Gln 645 650 655 Ala Ala Gln Ser Thr Arg Ile Leu Thr Glu Thr Thr Lys Asn Gln Glu 660 665 670 His <210> 20 <211> 677 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 20 Met Thr Leu Gln Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Leu Tyr Ser Pro Leu Val 1 5 10 15 Lys Pro Asp Gln Asn Ile Gln Phe Trp Leu Glu Gln Phe Pro Gln Ala 20 25 30 Trp Ala Glu Thr Ala Gly Met Gly Leu Ala Lys Gln Val Pro Pro Gln 35 40 45 Val Ile Gln Leu Lys Ala Ser Ala Thr Pro Val Ser Val Arg Gln Tyr 50 55 60 Pro Leu Ser Lys Glu Ala Gln Glu Gly Ile Arg Pro His Val Gln Arg 65 70 75 80 Leu Ile Gln Gln Gly Ile Leu Val Pro Val Gln Ser Pro Trp Asn Thr 85 90 95 Pro Leu Leu Pro Val Arg Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val 100 105 110 Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Gln Asp Ile His Pro Thr 115 120 125 Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Cys Ala Leu Pro Pro Gln Arg Ser 130 135 140 Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu 145 150 155 160 His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Gly 165 170 175 Thr Gly Arg Thr Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe 180 185 190 Lys Asn Ser Pro Thr Ile Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala 195 200 205 Asn Phe Arg Ile Gln His Pro Gln Val Thr Leu Leu Gln Tyr Val Asp 210 215 220 Asp Leu Leu Leu Ala Gly Ala Thr Lys Gln Asp Cys Leu Glu Gly Thr 225 230 235 240 Lys Ala Leu Leu Leu Glu Leu Ser Asp Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala 245 250 255 Lys Lys Ala Gln Ile Cys Arg Arg Glu Val Thr Tyr Leu Gly Tyr Ser 260 265 270 Leu Arg Asp Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Lys Thr Val 275 280 285 Val Gln Ile Pro Ala Pro Thr Thr Ala Lys Gln Met Arg Glu Phe Leu 290 295 300 Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Thr Leu 305 310 315 320 Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Glu Lys Gly Glu Phe Ser Trp 325 330 335 Ala Pro Glu His Gln Lys Ala Phe Asp Ala Ile Lys Lys Ala Leu Leu 340 345 350 Ser Ala Pro Ala Leu Ala Leu Pro Asp Val Thr Lys Pro Phe Thr Leu 355 360 365 Tyr Val Asp Glu Arg Lys Gly Val Ala Arg Gly Val Leu Thr Gln Thr 370 375 380 Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp 385 390 395 400 Pro Val Ala Ser Gly Trp Pro Ile Cys Leu Lys Ala Ile Ala Ala Val 405 410 415 Ala Ile Leu Val Lys Asp Ala Asp Lys Leu Thr Leu Gly Gln Asn Ile 420 425 430 Thr Val Ile Ala Pro His Ala Leu Glu Asn Ile Val Arg Gln Pro Pro 435 440 445 Asp Arg Trp Met Thr Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ser Leu Leu 450 455 460 Leu Thr Glu Arg Val Thr Phe Ala Pro Pro Ala Ala Leu Asn Pro Ala 465 470 475 480 Thr Leu Leu Pro Glu Glu Thr Asp Glu Pro Val Thr His Asp Cys His 485 490 495 Gln Leu Leu Ile Glu Glu Thr Gly Val Arg Lys Asp Leu Thr Asp Ile 500 505 510 Pro Leu Thr Gly Glu Val Leu Thr Trp Phe Thr Asp Gly Ser Ser Tyr 515 520 525 Val Val Glu Gly Lys Arg Met Ala Gly Ala Ala Val Val Asp Gly Thr 530 535 540 Arg Thr Ile Trp Ala Ser Ser Leu Pro Glu Gly Thr Ser Ala Gln Lys 545 550 555 560 Ala Glu Leu Met Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg Leu Ala Glu Gly Lys 565 570 575 Ser Ile Asn Ile Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His 580 585 590 Val His Gly Ala Ile Tyr Lys Gln Arg Gly Leu Leu Thr Ser Ala Gly 595 600 605 Arg Glu Ile Lys Asn Lys Glu Lys Ile Leu Ser Leu Leu Glu Ala Val 610 615 620 His Leu Pro Lys Arg Leu Ala Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys 625 630 635 640 Ala Lys Asp Leu Ile Ser Arg Gly Asn Gln Met Ala Asp Arg Val Ala 645 650 655 Lys Gln Ala Ala Gln Gly Val Asn Leu Leu Pro Ile Ile Glu Met Pro 660 665 670 Lys Ala Pro Glu Pro 675

Claims (106)

  1. 야생형 M-MLV(Maloney Murine Leukemia Virus) 역전사효소(서열번호 2)의 S67, T197 및 E302로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단리된 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  2. 제1항에 있어서, S67R, S67N, S67K, T197A, T197S, T197G, E302K, E302R 및 E302G로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)의 P51, E69, P196, D200, H204, M289, T306, F309, W313, T330, L435, N454, D524, E562, D583, H594, L603, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  4. 제3항에 있어서, P51L, E69K, P196S, D200N, H204R, M289L, T306K, F309N, F309Y, F309I, W313F, W313L, W313C, T330P, L435G, L435V, L435R, N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, D653N, D653H 및 L671P로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  5. 제3항에 있어서, 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)의 P51, S67, E69, T197, H204, E302, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 아미노산 위치에 돌연변이를 가진, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  6. 제5항에 있어서, 이하의 돌연변이들: P51L, S67R, E69K, T197A, H204R, E302K, F309N, W313F, T330P, L435G, N454K, D524G, D583N, H594Q, D653N 및 L671P를 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  7. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 RNase H 활성을 결여하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  8. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 하기 특성들 중 하나 이상을 가진, 돌연변이 M-MLV 역전사효소:
    a. 열안정성;
    b. 열반응성;
    c. 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성;
    d. 곤란한 주형(difficult template)을 역전사시키는 증가된 능력;
    e. 증가된 속도;
    f. 증가된 진행도(processivity);
    g. 증가된 특이성; 또는
    h. 증가된 감도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 열반응성인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  10. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 50% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  11. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 75% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  12. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 100% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  13. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 200% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  14. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 상기 야생형 M-MLV 역전사효소의 역전사효소 활성에 비해서 60℃의 반응 온도에서 증가된 역전사효소 활성을 발휘하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  15. 제14항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 50% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  16. 제14항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 75% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  17. 제14항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 100% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  18. 제14항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 200% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  19. 야생형 M-MLV(서열번호 2)의 P51, E69, P196, D200, H204, M289, T306, F309, W313, T330, L435, N454, D524, E562, D583, H594, L603, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 적어도 6개의 돌연변이를 포함하는, 단리된 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  20. 제19항에 있어서, P51L, E69K, P196S, D200N, H204R, M289L, T306K, F309N, F309Y, F309I, W313F, W313L, W313C, T330P, L435G, L435V, L435R, N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, D653N, D653H 및 L671P로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 6개의 돌연변이를 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  21. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 야생형 M-MLV(서열번호 2)의 S67, T197 및 E302로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  22. 제21항에 있어서, 상기 역전사효소는 S67R, S67N, S67K, T197A, T197S, T197G, E302K, E302R 및 E302G로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  23. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 RNase H 활성을 결여하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  24. 제19항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 하기 중 하나 이상을 포함하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소:
    a. 증가된 열안정성;
    b. 증가된 열반응성;
    c. 역전사효소 저해제에 대한 증가된 내성;
    d. 곤란한 주형을 역전사시키는 증가된 능력;
    e. 증가된 속도;
    f. 증가된 진행도;
    g. 증가된 특이성; 및
    h. 증가된 감도.
  25. 제24항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 열반응성인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  26. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 50% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  27. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 75% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  28. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 100% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  29. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 37℃에서 5분 후 야생형 M-MLV에 의해 합성된 역전사효소 산물의 양보다 60℃에서 5분 내에 적어도 200% 초과의 역전사효소 산물을 합성하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  30. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 상기 야생형 M-MLV 역전사효소의 역전사효소 활성에 비해서 60℃의 반응 온도에서 증가된 역전사효소 활성을 발휘하는, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  31. 제19항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 50% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  32. 제19항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 75% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  33. 제19항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 100% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  34. 제19항에 있어서, 상기 증가된 역전사효소 활성은 야생형 M-MLV 역전사효소 활성에 비해서 적어도 200% 초과인, 돌연변이 M-MLV 역전사효소.
  35. 단리된 돌연변이 역전사효소로서, 서열번호 4에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는, 단리된 돌연변이 역전사효소.
  36. 제35항에 있어서, 서열번호 4를 포함하는, 돌연변이 역전사효소.
  37. 제35항에 있어서, 서열번호 4로 이루어진, 돌연변이 역전사효소.
  38. 제35항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 열안정성인, 돌연변이 역전사효소.
  39. 제35항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 적어도 5분 동안 열안정성인, 돌연변이 역전사효소.
  40. 제35항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 적어도 5분 동안 열반응성인, 돌연변이 역전사효소.
  41. 제40항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 적어도 15분 동안 열반응성인, 돌연변이 역전사효소.
  42. 야생형 M-MLV 역전사효소에 비해서 열안정성을 증가 또는 증대시키도록 돌연변이된 단리된 M-MLV 역전사효소로서, 상기 돌연변이 역전사효소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단리된 M-MLV 역전사효소:
    a. S67R;
    b. T197A; 및
    c. E302K.
  43. 제42항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는, 역전사효소:
    a. P51L;
    b. E69K;
    c. H204R;
    d. F309N;
    e. W313F;
    f. T330P;
    g. L435G;
    h. N454K;
    i. D524G;
    j. D583N;
    k. H594Q;
    l. D653N; 및
    m. L671P.
  44. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 45℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  45. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  46. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 55℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  47. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  48. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 70%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  49. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 80%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  50. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 90%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  51. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 5분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  52. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 15분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  53. 제42항에 있어서, 상기 역전사효소는 60분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  54. 야생형 M-MLV 역전사효소에 비해서 열안정성을 증가 또는 증대시키도록 돌연변이된 단리된 M-MLV 역전사효소로서, 상기 돌연변이 역전사효소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 6개의 돌연변이를 포함하는, 단리된 M-MLV 역전사효소:
    a. P51L;
    b. E69K;
    c. H204R;
    d. F309N;
    e. W313F;
    f. T330P;
    g. L435G;
    h. N454K;
    i. D524G;
    j. D583N;
    k. H594Q;
    l. D653N; 및
    m. L671P.
  55. 제54항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는, 역전사효소:
    a. S67R;
    b. T197A; 및
    c. E302K.
  56. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 45℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  57. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  58. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 55℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  59. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  60. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 70%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  61. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 80%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  62. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 1분 동안 60℃로 가열 후 적어도 90%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  63. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 5분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  64. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 15분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  65. 제54항에 있어서, 상기 역전사효소는 60분 동안 50℃로 가열 후 적어도 50%의 역전사효소 활성을 보유하는, 역전사효소.
  66. 단리된 돌연변이 역전사효소로서, 60℃에서 5분 이내에 적어도 7.5kb인 cDNA를 생산할 수 있는, 단리된 돌연변이 역전사효소.
  67. 단리된 돌연변이 역전사효소로서, 60℃에서 15분 이내에 적어도 9.5kb인 cDNA를 생산할 수 있는, 단리된 돌연변이 역전사효소.
  68. 단리된 돌연변이 역전사효소로서, 60℃에서 적어도 5분 동안 열안정성인, 단리된 돌연변이 역전사효소.
  69. 제68항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 적어도 15분 동안 열안정성인, 돌연변이 역전사효소.
  70. 제68항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 적어도 30분 동안 열안정성인, 돌연변이 역전사효소.
  71. 단리된 돌연변이 역전사효소로서, 60℃에서 적어도 5분 동안 열반응성인, 단리된 돌연변이 역전사효소.
  72. 제71항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 적어도 15분 동안 열반응성인, 돌연변이 역전사효소.
  73. 제71항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 60℃에서 적어도 30분 동안 열반응성인, 돌연변이 역전사효소.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 역전사효소는 돌연변이 M-MLV 역전사효소인, 돌연변이 역전사효소.
  75. 돌연변이 M-MLV 역전사효소 및 완충제를 포함하는 핵산 합성용 조성물로서, 상기 돌연변이 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 상기 적어도 하나의 아미노산 위치는 S67, T197 및 E302로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 합성용 조성물.
  76. 제75항에 있어서, 상기 조성물은 1종 이상의 뉴클레오타이드, 1종 이상의 DNA 중합효소, 1종 이상의 세정제, 1종 이상의 프라이머, 1종 이상의 핫 스타트 성분(hot start component) 및 1종 이상의 종결제(terminating agent)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 더 포함하는, 핵산 합성용 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 종결제는 다이데옥시뉴클레오타이드인, 핵산 합성용 조성물.
  78. 돌연변이 M-MLV 역전사효소 및 완충제를 포함하는 핵산 합성용 조성물로서, 상기 돌연변이 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 6개의 돌연변이를 포함하되, 상기 적어도 6개의 아미노산 위치는 P51, E69, H204, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 합성용 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 조성물은 1종 이상의 뉴클레오타이드, 1종 이상의 DNA 중합효소, 1종 이상의 세정제, 1종 이상의 프라이머, 1종 이상의 핫 스타트 성분 및 1종 이상의 종결제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 더 포함하는, 핵산 합성용 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 종결제는 다이데옥시뉴클레오타이드인, 핵산 합성용 조성물.
  81. 돌연변이 M-MLV 역전사효소 및 완충제를 포함하는 핵산 합성용 조성물로서, 상기 돌연변이 역전사효소는 서열번호 4에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는, 핵산 합성용 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 상기 조성물은 1종 이상의 뉴클레오타이드, 1종 이상의 DNA 중합효소, 1종 이상의 세정제, 1종 이상의 프라이머, 1종 이상의 핫 스타트 성분 및 1종 이상의 종결제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 더 포함하는, 핵산 합성용 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 상기 종결제는 다이데옥시뉴클레오타이드인, 핵산 합성용 조성물.
  84. 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 가진 돌연변이 M-MLV 역전사효소의 사용을 포함하되, 상기 적어도 하나의 아미노산 위치는 S67, T197 및 E302로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 합성 방법.
  85. a. 1종 이상의 역전사효소와 함께 하나 이상의 핵산 주형을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및
    b. 상기 하나 이상의 핵산 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 제1 핵산 분자를 만드는데 충분한 조건 하에 상기 혼합물을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 1종 이상의 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 상기 적어도 하나의 아미노산 위치는 S67, T197 및 E302로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 핵산 주형은 전령 RNA 분자 또는 mRNA 분자의 집단인, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  87. 제85항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 핵산 분자의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 제2 핵산 분자를 만드는데 충분한 조건 하에 상기 하나 이상의 제1 핵산 분자를 배양하는 단계를 더 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  88. 제85항에 있어서, 상기 배양은 약 60℃의 온도에서 수행되는, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  89. a. 하나 이상의 핵산 주형을 1종 이상의 역전사효소 및 1종 이상의 DNA 중합효소와 혼합하는 단계; 및
    b. 상기 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 상기 혼합물을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 1종 이상의 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 상기 적어도 하나의 아미노산 위치는 S67, T197 및 E302로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 핵산 분자의 증폭 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 배양은 약 60℃의 온도에서 수행되는, 하나 이상의 핵산 분자의 증폭 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 상기 증폭된 핵산 분자의 전부 또는 일부의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 더 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자의 증폭 방법.
  92. 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 가진 돌연변이 M-MLV 역전사효소의 사용을 포함하되, 상기 적어도 6개의 아미노산 위치는 P51, E69, H204, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 합성 방법.
  93. a. 1종 이상의 역전사효소와 함께 하나 이상의 핵산 주형을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및
    b. 상기 하나 이상의 핵산 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 제1 핵산 분자를 만드는데 충분한 조건 하에 상기 혼합물을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 1종 이상의 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 6개의 돌연변이를 포함하며, 상기 적어도 6개의 아미노산 위치는 P51, E69, H204, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 핵산 주형은 전령 RNA 분자 또는 mRNA 분자의 집단인, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 핵산 분자의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 제2 핵산 분자를 만드는데 충분한 조건 하에 상기 하나 이상의 제1 핵산 분자를 배양하는 단계를 더 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  96. 제93항에 있어서, 상기 배양은 약 60℃의 온도에서 수행되는, 하나 이상의 핵산 분자의 역전사 방법.
  97. a. 하나 이상의 핵산 주형을 1종 이상의 역전사효소 및 1종 이상의 DNA 중합효소와 혼합하는 단계; 및
    b. 상기 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 하나 이상의 핵산 분자를 증폭시키는데 충분한 조건 하에 상기 혼합물을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 1종 이상의 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 6개의 돌연변이를 포함하며, 상기 적어도 6개의 아미노산 위치는 P51, E69, H204, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 핵산 분자의 증폭 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 배양은 약 60℃의 온도에서 수행되는, 하나 이상의 핵산 분자의 증폭 방법.
  99. 제97항에 있어서, 상기 하나 이상의 주형의 전부 또는 일부에 대해서 상보적인 상기 증폭된 핵산 분자의 전부 또는 일부의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 더 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자의 증폭 방법.
  100. 하나 이상의 포장된 용기 내에 돌연변이 M-MLV 역전사효소를 포함하는 키트로서, 상기 돌연변이 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하되, 상기 적어도 하나의 아미노산 위치는 S67, T197 및 E302로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  101. 하나 이상의 포장된 용기 내에 돌연변이 M-MLV 역전사효소를 포함하는 키트로서, 상기 돌연변이 역전사효소는 야생형 M-MLV 역전사효소(서열번호 2)에 대한 서열에 대응하는 아미노산 위치에 적어도 6개의 돌연변이를 포함하되, 상기 적어도 6개의 아미노산 위치는 P51, E69, H204, F309, W313, T330, L435, N454, D524, D583, H594, D653 및 L671로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  102. 역전사효소 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  103. 제102항의 핵산을 포함하는 벡터.
  104. 제102항의 핵산에 조작 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
  105. 제102항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  106. 제35항의 돌연변이 역전사효소를 포함하는 숙주 세포.
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