KR20160021076A

KR20160021076A - 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료를 위한 안티센스 분자

Info

Publication number: KR20160021076A
Application number: KR1020157028890A
Authority: KR
Inventors: 브렛 말론; 조슈아 브라이슨
Original assignee: 테출론 인코포레이티드
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-02-24
Also published as: SG11201507141SA; US20160177297A1; WO2014144423A2; US9909123B2; WO2014144423A3; US20180362976A1; IL241226A0; CA2906663A1; EP2970976A4; JP2016515381A; EP2970976A2

Abstract

스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료를 위한 안티센스 분자 및 조성물을 개시한다. 상기 안티센스 분자 및 조성물은 핵산 분자, 예를 들어 RNA, DNA, 또는 변형된 주쇄를 갖는 핵산 분자, 예를 들어 PNA를 포함한다. 상기 안티센스 분자 및 조성물은 스타필로코커스 아우레우스에서 유전자 발현을 억제하고; 세포 투과성 분자, 예를 들어 펩티드에 임의로 접합되며; 나노입자 조성물의 형태로 임의로 투여된다.

Description

스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료를 위한 안티센스 분자{ANTISENSE MOLECULES FOR TREATMENT OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS INFECTION}

정부의 권리

본 연구는 부분적으로 I기 SBIR 계약 번호 W911QX-12-C-0072 하에서 국방 첨단 과학기술연구소에 기반을 두고 있다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명의 분야는 리보솜 단백질 발현을 표적화하고 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염의 치료에 유용한 안티센스 폴리뉴클레오티드 시약에 관한 것이다.

발명의 요약

스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료 및 스타필로코커스 아우레우스 생육의 억제에 유용한 안티센스 분자를 제공한다. 상기 안티센스 분자는 스타필로코커스 아우레우스 리보솜 단백질을 표적화하며 천연 핵산 중합체 및 비-천연 핵산 중합체를 포함할 수 있다. 비-천연 핵산 중합체는 변형된 주쇄, 예를 들어 PNA, PMO, 및 합성적으로-변형된 DNA 및 RNA를 갖는 중합체를 포함한다. 본 발명은 천연 DNA 및 RNA에 하이브리드화하는 임의의 유형의 합성적으로-변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 염 또는 복합체의 형태이다. 하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 양이온성 중합체 분자와 복합체를 형성한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 세포 투과성 분자에 접합된다. 본 발명의 안티센스 분자를 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다.

하나의 실시태양에서 본 발명은, 스타필로코커스 아우레우스 리보솜 단백질의 암호화 영역에 안티센스이고 생리 조건하에서 상기 암호화 영역에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스의 생육을 억제하는 안티센스 분자 또는 그의 염을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 길이가 10 내지 50 핵염기이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 스타필로코커스 아우레우스 리보솜 단백질의 암호화 영역에 충분히 상보성이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 서열번호 1 내지 50으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열에 적어도 80% 일치한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 실질적으로 순수하다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 변형된 주쇄를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 주쇄는 PNA 주쇄이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 LSU 리보솜 단백질 L15p(L27Ae) 또는 SSU 리보솜 단백질 S17p(S11e)의 발현을 억제한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 세포 투과성 분자에 접합된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 세포 투과성 분자는 펩티드이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 펩티드는 세포-투과성 펩티드(CPP)이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 전달 중합체와 복합체를 형성한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 전달 중합체는 포스포늄 또는 암모늄 이온기를 포함하는 양이온성 블록 공중합체이다.

본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 안티센스 분자 또는 조성물을 스타필로코커스 아우레우스를 함유하거나 또는 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 것으로 의심되는 조직에 투여함을 포함하는, 상기 스타필로코커스 아우레우스의 생육을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 투여는 국소 투여이다.

본 발명은 또한 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료가 필요한 동물에게 유효량의 본 발명의 안티센스 분자 또는 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료 방법을 제공한다.

도 1은 MRSA 시험관내 연구를 도시한다. 항균 핵산제의 효능을 입증한다. 펩티드-PNA를 MRSA USA 300의 배양물 중의 세균에 대해 시험하였다. 반코마이신을 사용하여 추가적인 연구들에 대해 상기 결과를 표준화하였다.
도 2A 내지 2B는 a) 1 uM의 FITC-펩티드 작용제 처리 후 2시간째의 MRSA 형광 오버레이, b) 1 uM의 FITC-펩티드제 처리후 2시간째의 AcB 형광 오버레이를 도시한다. 스케일 바 = 100 um. 본 도면은 세포-투과성 펩티드가 단독으로 사용시 무-독성임을 나타낸다.
도 3은 8시간에 걸쳐 0 μM, 1 μM, 10 μM 및 20 μM 농도의 PNA-펩티드 안티센스 항생제에서 로그-기 MRSA 생육 억제를 도시한다. 좌측 기부는 양성 대조군(FmhB)을 나타내고 우측 기부는 음성 대조군을 나타낸다.

서열 목록의 간단한 설명

서열 목록에서 폴리뉴클레오티드 서열은 스타필로코커스 아우레우스 리보솜 단백질에 대한 암호화 서열을 포함한다. 서열번호 65 내지 101을 참조하시오.

상기 서열 목록에서 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 안티센스 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 변형된 핵산, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 이들 서열은 적어도 표 1에 설명된 바와 같은 하기 스타필로코커스 아우레우스 리보솜 단백질의 발현을 녹다운시킬 수 있다:

리보솜 단백질을 표적화하는 안티센스 폴리뉴클레오티드
단백질 표적	안티센스 폴리뉴클레오티드 서열
LSU 리보솜 단백질 L10p (P0)	AGACATTCAGACACC (서열번호 21)
LSU 리보솜 단백질 L11p (L12e)	TAGCCACGATGTGCA (서열번호 19)
LSU 리보솜 단백질 L13p (L13Ae)	ACGCATAATAAT (서열번호 8)
LSU 리보솜 단백질 L13p (L13Ae)	TTGACGCATAATAAT (서열번호 33)
LSU 리보솜 단백질 L14p (L23e)	GTTGGATCATTA (서열번호 13)
LSU 리보솜 단백질 L14p (L23e)	TGGATCATTAGTTAA (서열번호 42)
LSU 리보솜 단백질 L15p (L27Ae)	TTTCATTTCGGCACC (서열번호 1)
LSU 리보솜 단백질 L16p (L10e)	GGTAGTAACATTATT (서열번호 43)
LSU 리보솜 단백질 L18p (L5e)	GATCATTTCAATACT (서열번호 38)
LSU 리보솜 단백질 L19p	TGATTTGTCATTATA (서열번호 25)
LSU 리보솜 단백질 L1p (L10Ae)	TTAGCCATTTATAGT (서열번호 20)
LSU 리보솜 단백질 L20p	ACTCGTGGCATA (서열번호 6)
LSU 리보솜 단백질 L21p	AGCAAACATACTTTG (서열번호 31)
LSU 리보솜 단백질 L22p (L17e)	TTCCATTAGGATGTC (서열번호 45)
LSU 리보솜 단백질 L23p (L23Ae)	TTCCATTATCCGAGC (서열번호 48)
LSU 리보솜 단백질 L27p	AACATCGGAATG (서열번호 5)
LSU 리보솜 단백질 L27p	TAACATCGGAATGCA (서열번호 29)
LSU 리보솜 단백질 L28p	TGTTTACCCATA (서열번호 4)
LSU 리보솜 단백질 L2p (L8e)	TAGCCATTGTCG (서열번호 16)
LSU 리보솜 단백질 L2p (L8e)	AGCCATTGTCGCTTA (서열번호 47)
LSU 리보솜 단백질 L30p (L7e)	TTTAGCCATAACTAG (서열번호 36)
LSU 리보솜 단백질 L32p	TACTGCCATGATATA (서열번호 24)
LSU 리보솜 단백질 L34p	GTTTTACCATGCAAA (서열번호 50)
LSU 리보솜 단백질 L3p (L3e)	CATCGAAAGTCC (서열번호 17)
LSU 리보솜 단백질 L3p (L3e)	GGTCATCGAAAGTCC (서열번호 49)
LSU 리보솜 단백질 L5p (L11e)	CGGTTCAAAGTGGGA (서열번호 41)
LSU 리보솜 단백질 L6p (L9e)	TCATGTTATGGC (서열번호 12)
LSU 리보솜 단백질 L6p (L9e)	ACTCATGTTATGGCA (서열번호 39)
리보솜 단백질 L7Ae 계열 단백질	TATACTCATTTTGGG (서열번호 26)
SSU 리보솜 단백질 S11p (S14e)	TTACGTGCCATT (서열번호 9)
SSU 리보솜 단백질 S11p (S14e)	TTTACGTGCCATTTA (서열번호 34)
SSU 리보솜 단백질 S12p (S23e)	GTTGGCATGTGATAT (서열번호 22)
SSU 리보솜 단백질 S13p (S18e)	TACGTGCCATAT (서열번호 10)
SSU 리보솜 단백질 S13p (S18e)	TACGTGCCATATTAA (서열번호 35)
SSU 리보솜 단백질 S14p (S29e) 아연-의존성	TTTAGCCACTTAATT (서열번호 40)
SSU 리보솜 단백질 S15p (S13e)	AAATTGCCATAATCA (서열번호 27)
SSU 리보솜 단백질 S17p (S11e)	TCTTTCGCTCAC (서열번호 14)
SSU 리보솜 단백질 S17p (S11e)	CGCTCACTTTTGTAA (서열번호 2)
SSU 리보솜 단백질 S19p (S15e)	TACGAGCCATTT (서열번호 15)
SSU 리보솜 단백질 S19p (S15e)	GAGCCATTTGGGCGC (서열번호 46)
SSU 리보솜 단백질 S21p	TTTAGACATCTGTAT (서열번호 28)
SSU 리보솜 단백질 S3p (S3e)	TTGACCCACAGTATT (서열번호 44)
SSU 리보솜 단백질 S4p (S9e)	CGAGCCATAATA (서열번호 7)
SSU 리보솜 단백질 S4p (S9e)	GAGCCATAATAAGAC (서열번호 32)
SSU 리보솜 단백질 S5p (S2e)	CGAGCCATGTAT (서열번호 11)
SSU 리보솜 단백질 S5p (S2e)	CGAGCCATGTATTTG (서열번호 37)
SSU 리보솜 단백질 S6p	GTTCTCATTTTATAT (서열번호 18)
SSU 리보솜 단백질 S7p (S5e)	ACGAGGCATAAT (서열번호 3)
SSU 리보솜 단백질 S7p (S5e)	TTTACGAGGCATAAT (서열번호 23)
잠재적인 리보솜 단백질	CAGTAATCATAATAA (서열번호 30)

상기 서열 목록은 또한 tRNA-의존성 지질 II 글리신 리가제(FmhB): ttttccatgatttat(서열번호 62); 및 비암호화 음성 대조군(NC): aacattttggttttt (서열번호 63)의 대조용 서열들을 함유한다.

상기 서열 목록의 펩티드 서열은 핵산 및 나노입자를 세균 세포에 표적화하고/하거나 집중시키고 세균막 투과를 촉진하는 펩티드를 포함한다. 표 2를 참조하시오:

세포 투과성 펩티드
펩티드 명칭	아미노산 서열
KFF 펩티드	KFFKFFKFFK (서열번호 51)
RFF 펩티드	RFFRFFRFFR (서열번호 52)
마가이닌 2	GIGKWLHSAKKFGKAFVGEIMNS (서열번호 53)
트랜스포틴 10	AGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호 54)
인돌리시딘	ILPWKWPWWPWRR (서열번호 61)
TAT 펩티드	GRKKRRQRRRPQ (서열번호 60)
페네트라틴 1 펩티드	RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 59)
양친매성 펩티드	LLIILRRRIRKQAHAHSK (서열번호 58)
환상 d,l-알파-펩티드	KQRWLWLW (서열번호 57)
환상 d,l-알파-펩티드	RRKWLWLW (서열번호 56)
환상 d,l-알파-펩티드	KKLWLW (서열번호 55)

정의

본 명세에 사용된 용어들은 당해 분야에 사용되는 바와 같은 통상적인 의미를 갖는다.

중합체는 단량체라 칭하는 단위들의 선형 쇄이다. 중합체에서, 단량체 단위는 동일하거나 상이할 수 있다. 중합체는 천연(자연에서 만들어진)이거나 합성일 수 있다. 본 발명의 중합체는 핵산 중합체, 폴리펩티드, 및 합성 전달 중합체를 포함한다.

핵산은 뉴클레오티드의 선형 중합체이다. 자연에서 만들어진 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 염기 아데닌, 시토신, 구아닌, 및 티민; 또는 리보뉴클레오티드(RNA) 염기 아데닌, 시토신, 구아닌, 및 우라실을 함유한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 핵산 분자를 지칭하며 임의의 길이의 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 mRNA를 포함한다. 핵산, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드는 호환적으로 사용될 수 있는 용어들이다.

변형 핵산은 와트슨-크리크 염기쌍 규칙에 따른 서열 특이성으로 천연 DNA 및 RNA에 하이브리드화하는 비-천연 중합체이다. 변형 핵산의 예는 포스포로티오에이트-올리고데옥시뉴클레오티드(PS-ODN), 차단된 핵산(LNA), 2'-O-메틸올리고리보뉴클레오티드(2'O-Me), 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO) 및 펩티드 핵산(PNA)이다. 변형 핵산은 변형된 주쇄를 가지며 일반적으로 천연핵산보다 분해에 더 내성이다. 본 발명은 천연 DNA 및 RNA에 하이브리드화하는 임의의 유형의 합성적으로-변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. 예를 들어 미국특허 제 5,116,195, 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571, 5,786,461, 5,811,232, 5,837,459, 5,874,564, 5,891,625, 5,972,610, 5,986,053, 6,107,470, 6,174,870, 7,098,192, 7,696,345, 8,124,745, 8,354,093, 8,357,664 호, 문헌[Wagner et al ., Nucl . Acid Res . 19:5965-71 (1991)]; 및 문헌[Koshkin et al ., Tetrahedron 54:3607-30 (1998)]을 참조하시오.

본 발명의 안티센스 분자는 또한 천연 핵산에 하이브리드화하는 비-천연 중합체로 구성될 수 있다. 비전형적인 뉴클레오시드 염기, 예를 들어 다른 것들 중에서도 메틸화된 염기, 인산화된 염기, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 다이하이드로우리딘, 퀘노신, 및 와이오신을 또한 사용할 수 있다. 상기와 같은 비전형적인 염기를 포함하는 안티센스 중합체들의 예가 미국특허 제 7,875,733, 7,919,612, 7,939,677, 8,314,229, 8,372,969, 및 8,377,898 호에 개시되어 있다.

안티센스 폴리뉴클레오티드란 용어는 관심의 표적 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보성이고 생리 조건하에서 상기 표적 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하는 핵산 분자를 지칭한다. 안티센스 분자는 사전 선택된 표적 핵산을 암호화하는 하나 이상의 핵산과 특이적으로 하이브리드화한다. 표적 핵산 및 상기 표적을 암호화하는 핵산이란 용어는 상기 표적을 암호화하는 DNA, 상기와 같은 DNA로부터 전사되는 RNA(전구체-mRNA 및 mRNA 포함), 및 또한 상기와 같은 RNA로부터 유래되는 cDNA를 포함한다. 안티센스 화합물과 그의 표적 핵산과의 하이브리드화는 상기 핵산의 통상적인 기능을 방해한다. 표적 핵산에 특이적으로 하이브리드화하는 화합물에 의한 상기 핵산의 기능의 이러한 조절을 일반적으로 안티센스라 칭한다. 상기 방해되는 DNA의 기능은 복제 및 전사를 포함한다. 상기 방해되는 RNA의 기능은 모든 생명유지 기능들, 예를 들어 상기 RNA의 단백질 번역 부위로의 전좌, 상기 RNA로부터의 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 제공하는 상기 RNA의 스플라이싱, 및 상기 RNA에 의해 참여되거나 또는 촉진될 수 있는 촉매 활성을 포함한다. 표적 핵산 기능에 대한 상기와 같은 방해의 전체적인 영향은 상기 표적의 발현 조절이다. 본 발명과 관련하여, 조절은 유전자 발현의 증가(자극) 또는 감소(억제)이다. 본 발명과 관련하여, 억제는 유전자 발현 조절의 형태이다.

폴리뉴클레오티드는 2개의 단일가닥 폴리뉴클레오티드 간에 하이브리드화가 역평행 형태로 발생할 때 서로에 대해 상보적인 것으로서 개시된다.

상기 두 서열 간의 일치성 퍼센트는, 상기 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입이 필요한 틈의 수 및 각 틈의 거리를 고려하여, 상기 서열들에 의해 공유되는 일치하는 위치의 수의 함수이다. 두 서열 간의 서열 비교, 및 일치성 및 유사성 퍼센트의 측정을 수학적 연산을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]을 참조하시오). 바람직한 실시태양에서, 두 서열 간의 일치성 퍼센트를 클러스탈(Clustal) W 연산에 의해 생성된 연산에 기초하여 측정한다(문헌[Thompson, J. D. et al ., 1994, Nucleic acids Res . 22:4673-4680]). 상기 연산을 다수의 상업적인 소프트웨어 패키지, 이 경우에 벡터 NTI 스위트(버전 8.0)의 얼라인X(alignX) 소프트웨어 프로그램에 통합시킨다. 디폴트 클러스탈 W 매개변수를 사용하여 일치성 퍼센트값을 계산할 짝지은 정렬을 생성시켰다(끊김 벌점 10; 끊김 확장 벌점 0.1). 일치성 퍼센트는 총 염기 수로 나눈 일치 염기의 수에 100을 곱한 것으로서 정의된다. 상기 정렬 중의 서열들이 상이한 길이를 갖는 경우(끊김 또는 확장으로 인해), 가장 긴 서열의 길이를 계산에 사용할 것이며, 이는 전체 길이에 대한 값을 나타낼 것이다.

단백질은 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산의 하나 이상의 쇄를 함유하는 중합체이다. 단백질은 전형적으로 3차원 형태로 폴딩되어 생물학적 기능을 용이하게 한다.

폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산들의 중합체이다. 단백질 및 폴리펩티드 및 펩티드란 용어들은 일반적으로 호환 가능하게 사용되지만, 폴리펩티드 및 펩티드는 일반적으로 단백질보다 길이가 짧다.

하전된, 하전되지 않은, 양이온성 및 음이온성이란 용어들은 중성에 가까운 pH, 예를 들어 6 내지 8에서 화학적 부분의 우세한 상태를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 용어는 생리학적 pH, 즉 약 7.4에서 상기 화학적 부분의 우세한 상태를 지칭한다. 따라서, 양이온성 주쇄 결합은 pH 7.4에서 우세하게 양으로 하전된다.

실질적으로 순수한이란 용어는 상기 안티센스 분자가 다른 물질들, 예를 들어 다른 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 및 천연으로 관련될 수도 있는 다른 물질들이 실질적으로 없음을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 실질적으로 순수한 안티센스 분자는 HPLC에 의해 95-95% 동종이다. 또 다른 실시태양에서, 실질적으로 순수한 안티센스 분자는 HPLC에 의해 99-100% 동종이다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 하기 본 발명의 실시태양들 및 본 발명에 포함된 실시예들의 상세한 설명을 참고로 이해할 수 있다. 본 발명에 사용되는 용어는 본 발명의 실시태양을 개시하기 위한 것이며, 제한을 의도하지 않는다.

본 발명의 특정한 태양들은 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료 및/또는 생리 조건하에서 스타필로코커스 아우레우스 리보솜 단백질 암호화 영역에 안티센스인 안티센스 분자를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스 생육의 억제에 유용한 안티센스 분자를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 서열번호 65 내지 101로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 스타필로코커스 아우레우스 리보솜 암호화 영역에 하이브리드화한다. 하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 10-50 핵염기를 함유한다, 즉 10-50-머이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 10-25-머, 12-20-머, 12-15-머, 11-머, 12-머, 13-머, 14-머, 15-머, 16-머, 17-머, 18-머, 19-머, 20-머, 21-머, 22-머, 23-머, 24-머, 25-머, 26-머, 27-머, 28-머, 29-머, 또는 30-머이다. 상기 안티센스 분자에 대한 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 개시 코돈에 걸쳐 있는 결합 위치에서 선택된다. 독점의 소프트웨어는 개시 코돈을 포함하여 창 크기 10 염기, 11 염기, 12 염기, 13 염기, 14 염기, 15 염기, 16 염기, 17 염기, 18 염기, 19 염기 및/또는 20-40 염기(비제한적인 예로서)를 주사하고 염기 함량에 의해 자기-폴딩 잠재성을 평가한다. 상기 소프트웨어 연산을 상기 개시 코돈에 걸쳐지도록 프로그래밍할 수 있다. 한편으로, 상기 연산을 임의로 상기 개시 코돈 영역에 걸쳐지도록 프로그래밍할 수 있다. 안티센스 서열의 선택을 상기 데이터로부터 또는 실험 데이터 및 매개변수 칭량으로부터 유도된 자동화된 과정을 통해 수동으로 마무리할 수 있다. 리보솜에 의해-발현된 유전자에 대한 상기 안티센스 분자는 인간 전사체에 실질적으로 직교한다. 하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 37 ℃ 초과의 Tm, 낮은 자기-폴딩, 및 현저한 개시 코돈 중복과 같은 특징들을 나타내는 염기 길이를 갖는다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 50 중에서 선택된 서열에 적어도 80% 일치하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 구체적으로, 상기 서열은 표적 유전자 조절 활성이 실질적으로 감소되지 않도록 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드에 의한 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 변이체는 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 서열 일치성을 나타내며; 또 다른 실시태양은 서열번호 1 내지 50으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열에 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 나타낸다. 상기 일치성 퍼센트를, 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 널리 공지된 컴퓨터 연산을 사용함을 포함하는 임의의 방법을 사용하여, 상기 폴리뉴클레오티드의 서열을 표적 폴리뉴클레오티드의 상응하는 부분에 비교함으로써 쉽게 측정할 수 있다. 연산은 얼라인(Align) 또는 BLAST 연산(문헌[Altschul, 1991 J. Mol. Biol . 219:555-565]; 문헌[Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919])을 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 활성 성분을 표적화/세포 투과성 분자에 결합시킨다. 본 발명의 하나의 태양에서, 상기 표적화 분자는 펩티드를 포함한다. 상기 펩티드는 세포 투과성 펩티드(CPP)를 포함한다. 사용되는 펩티드는 세포 표적화 및/또는 막 투과를 촉진하는 하나 이상의 기능을 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 치료학적 폴리뉴클레오티드를, 펩티드를 상기 안티센스 분자에 접합시킴으로써 숙주 중의 스타필로코커스 아우레우스로 전달할 수 있다. 세균의 막 파괴를 위해 안티센스 분자를 펩티드에 접합시키는 능력은 특이성을 제공하고 독성을 감소시킨다. 세포 투과성 펩티드의 예는 서열번호 51 내지 61을 갖는 것들을 포함한다. 세포 투과성 펩티드 및 이를 안티센스 분자에 결합시키는 방법에 대한 추가의 예들이 미국특허 제 8,354,387, 8,354,093, 8,313,778, 8,299,236, 8,242,081, 8,211,468, 8,207,293, 8,138,383, 8,044,019, 8,039,587, 7,943,581, 및 7,879,813 호에 개시되어 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 세포 투과성 펩티드는 미국특허 제 8,338,366 호에 개시된 바와 같은 HIV tat, 헤르페스 바이러스 VP22, 드로스필라 안테나페디아 호메오박스 유전자 산물, 신호 서열, 융합 서열 또는 프로테그린 I으로부터 유래된다. 상기 안티센스 분자-펩티드 접합체를 고상 합성 방법에 의해 제조할 수 있으며, 이때 시스테인이 펩티드와 DNA 사이의 링커로서 제공된다. 당해 분야에 공지된 다른 방법들을 사용할 수도 있다(예를 들어 문헌[Dirksen, A., et al ., J. Am . Chem . Soc. 2006. 128, 15602-3]을 참조하시오).

본 발명에 유용한 CPP는 다양한 기원의 펩티드들이다. 양이온성 핵산-담체 팹티드는 본 발명의 합성 중합체와 혼합시 생산적인 나노입자를 형성한다. 일례는 문헌[Xie et al ., Molecular Therapy 2004, 10, 652-659]에 개시된 펩티드 KFFKFFKFFK(서열번호 51)이다. 추가적인 펩티드는 TAT 펩티드 및 페네트라틴(PENETRATIN)을 포함할 수 있다. 상기 TAT 펩티드, GRKKRRQRRRPQ(서열번호 60)는 인간 면역결핍 바이러스의 전사의 전사촉진제(TAT)로부터 유래하며 CPP이다. CPP는 세포막의 친지성 장벽을 극복하고 큰 분자 및 입자를 그들의 생물학적 작용을 위해 세포내부에 전달한다. 페네트라틴 펩티드는 안테나페디아 단백질의 호메오도메인의 세 번째 나선에 상응하는 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 59)의 16-아미노산 펩티드이다.

유용한 CPP는 또한 환상 d,l-α펩티드, 예를 들어 문헌[Fernandez-Lopez et al., Nature 2001, 412, 452-455]에 개시된 바와 같은 KQRWLWLW(서열번호 57), RRKWLWLW(서열번호 56), 및 KKLWLW(서열번호 55)을 포함한다. 이들 펩티드는 자신의 항생제 성질, 및 또한 내부 세포 전달을 위한 화물의 담체로서의 기능을 갖는다. 추가로, 문헌[Nekhotiaeva et al. FASEB J. 2010, 394-396]에 개시된 양친매성 펩티드 LLIILRRRIRKQAHAHSK(서열번호 58) 및 트랜스포틴 10(TP10), AGYLLGKINLKALAALAKKIL(서열번호 54)은 생산적인 나노입자를 형성한다. 아프리카 발톱 개구리로부터 단리된 트립토판 풍부 펩티드, 예를 들어 마가이닌 2 펩티드, GIGKWLHSAKKFGKAFVGEIMNS(서열번호 53)(문헌[Karas et al, Biochemistry 2002, 41,10723-31])는 본 발명에 유용한 추가적인 CPP이다. 더욱 또한, 소 호중구로부터 단리된 인돌리시딘, ILPWKWPWWPWRR(서열번호 61)은 본 발명에 유용한 또 다른 CPP이다. 이들 및 유사한 서열 및 성질을 갖는 다른 펩티드들은 기능적 대안으로서 당해 분야의 숙련가들에 의해 인식되고 있으며 본 발명에 포함된다. 더욱 또한, 이들 펩티드를 목적하거나 또는 필요한 기능을 개선시키기 위해 변형시킬 수도 있다.

벌크 펩티드 및 폴리뉴클레오티드 합성이 고충실도 합성기를 통한 고체-스캐폴드 보호/탈보호 합성을 포함한 표준 방법을 사용하여 계약 제조사, 예를 들어 네오 그룹 인코포레이티드(Neo Group, Inc.)(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)에 의해 수행될 수 있다. 상기 펩티드-PNA 또는 펩티드-DNA 성분은 병원체에 침입하여 그의 유전자 조절을 파괴하는 치료학적 분자이다.

하나의 실시태양에서, 안티센스 분자를 숙신이미딜-6-하이드라지노니코티네이트아세톤하이드라존 대 숙신이미딜-4-포르밀벤조에이트 결합 화학을 사용하는 널리 공지된 접합 방법을 사용하여 CPP에 접합시킨다. 이는 펩티드-DNA 결합에 대한 특이적이고, 얌전한, 고도로 효율적인 접합 방법이다. 펩티드를 핵산에 공유 결합시키기 위해서, 상기 펩티드를, N-말단을 반응성기로 변형시킴으로써 반응용으로 제조한다. 하나의 실시태양에서, 상기 펩티드의 N-말단을 S6H(숙신이미딜-6-하이드라지노니코티네이트아세톤하이드라존)로 변형시킨다. N-보호된 펩티드를 탈염시키고 무수(dry) DMF에 용해시킨다. 이어서, S6H를 2x 몰 과잉으로 교반 용액에 가하고 실온에서 2시간 동안 반응하게 한다. 후처리는 당해 분야에 공지된 과정, 예를 들어 문헌[Dirksen et al . J. Am . Chem . Soc . 2006 128, 15602-3]에 개시된 과정에 따른다. 당해 분야에 공지된 핵산에 대한 펩티드의 다른 결합 방법들을 사용할 수도 있다.

FITC 분석을 사용하여 펩티드의 세포 흡수를 모니터할 수 있다. 펩티드를 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)에 접합시켜 형광 현미경으로 흡수를 모니터하였다. 도 2A 내지 2B는 MRSA(도 2A) 및 AcB(도 2B)에서 시험된 바와 같은 여러 펩티드들에 대한 분석 결과를 도시한다(1 μM의 FITC-펩티드 작용제 처리 후 2시간째의 형광 오버레이, 스케일 바 = 100 ㎛). MRSA의 경우, KFF 및 RFF 동기를 갖는 나선형 양이온성 펩티드는 세포 침입에 유효하다. 또한, 마가이닌-FITC는 MRSA내로의 침입에 유효하다. 도 2A 내지 2B에 나타낸 현미경사진 중 어느 것에서도 시험 농도(1 μM)에서 상기 펩티드들로부터의 임의의 살균 효과는 보이지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자를 전달 중합체와 결합시킨다. 상기 중합체-기재 나노입자 약물 전달 플랫폼은 다양한 조합의 폴리뉴클레오티드 치료 양상에 적합할 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에서, 상기 전달 중합체는 양이온성이다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 전달 중합체는 포스포늄 이온 및/또는 암모늄 이온을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 안티센스 분자를 전달 중합체와 결합시키고, 상기 조성물은 용액 중에서 나노입자를 형성한다. 추가의 실시태양에서, 나노입자 폴리플렉스는 혈청 중에서 안정하며 약 30 ㎚ 내지 5000 ㎚ 범위의 직경 크기를 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 입자는 직경이 약 300 ㎚ 미만이다. 예를 들어 상기 나노입자는 직경이 약 150 ㎚ 미만이다.

하나의 실시태양에서, 상기 전달 비히클은 PCT/US12/42974에 개시된 바와 같은 포스포늄 또는 암모늄 이온기를 포함하는 양이온성 블록 공중합체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 중합체는 다이블록-폴리[(에틸렌 글리콜)₉ 메틸 에틸 메트아크랄레이트][스티릴포스포늄]이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 전달 중합체는 문헌[Tranter et al. Amer Soc Gene Cell Ther, Dec 2011]에 개시된 바와 같은 글리코아미도아민; US20090105115; 및 US20090124534에 개시된 바와 같은 폴리하이드록실아미도아민, 수지상 거대분자, 탄수화물-함유 폴리에스테르를 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 핵산 전달 비히클은 양이온성 폴리펩티드 또는 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 폴리펩티드의 일례는 폴리리신이다. 미국특허 제 5,521,291 호를 참조하시오.

하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 전달 또는 담체 단백질을 포함하는 조성물의 부분이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자는 혈청 중에서 안정성을 갖는 안티센스 분자를 운반할 수 있는 나노입자 폴리플렉스의 부분이다. 상기 폴리플렉스 조성물은 약 500 ㎚ 미만, 예를 들어 약 300 ㎚, 또는 약 200 ㎚, 바람직하게는 약 150 ㎚ 미만, 예를 들어 약 100 ㎚ 미만의 평균 직경을 갖는 입자 형태로 서로 회합된 합성 전달 중합체(담체 중합체) 및 생물 활성 화합물을 포함한다. 본 발명은 직경이 약 40 ㎚ 내지 500 ㎚의 범위인 입자를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 전달 또는 담체 중합체는 PCT/US12/42974에 개시된 바와 같은 포스포늄 또는 암모늄 이온기를 포함하는 양이온성 블록 공중합체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 전달 또는 담체 중합체는 문헌[Tranter et al. Amer Soc Gene Cell Ther, Dec 2011]에 개시된 바와 같은 글리코아미도아민; US20090105115; 및 US20090124534에 개시된 바와 같은 폴리하이드록실아미도아민, 수지상 거대분자, 탄수화물-함유 폴리에스테르를 포함한다. 독점의, 국소화되고 생분해 가능한 나노입자 시스템인 폴리글리코아미도아민(PGAA) 중합체 시스템은 또 다른 전달 또는 담체 중합체를 나타낸다. 폴리(갈락타르아미도아민)은 낮은 세포독성을 갖는 효율적인 양이온성 중합체성 비히클이다(문헌[Wongrakpanich et al . Pharmaceutical Development and Technology, January 12, 2012]). 문헌[Hemp et al . Biomacromolecules, 2012 13:2439-45]에 개시된 나노입자 전달 시스템은 본 발명에 유용한 또 다른 전달 또는 담체 중합체를 나타낸다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 전달 또는 담체 중합체는 양이온성 폴리펩티드 또는 양이온성 지질을 포함한다. 중합체, 예를 들어 폴리-L-리신(PLL), 폴리에틸렌이민(PEI), 키토산, 및 이들의 유도체가 또한 본 발명에 의해 포함된다. 이들 화합물을 사용하는 핵산 전달은 상기 유전자와 다중양이온성 전달제 간의 정전기적 상호작용에 의해 구동되는 복합체형성에 의존한다. 중합체-DNA 복합체는 60 ㎚ 내지 120 ㎚ 직경 정도의 입자로 압축된다. 중합체, 예를 들어 선형 PEI 및 PLL은 다양한 세포에서 높은 형질감염률을 갖는다.

생체내 핵산 전달은 긴 순환 시간 및 세포 흡수를 가능하게 하기에 충분히 작은 폴리플렉스를 요하는 크기 구속을 갖는다. 또한, 폴리플렉스는 염- 및 혈청-유발된 응집을 견뎌야 한다. 혈청 안정성은 일반적으로 24시간 동안 유지될 수 있는 약 150 ㎚ 이하의 유체역학적 반경 또는 그 이하의 입자 크기와 관련된다. 핵산 치료 및 전달 중합체를 포함하는 본 발명의 나노입자는 혈청 안정성을 위한 유체역학적 반경 및 물성을 갖는다. 특히, 상기 전달 중합체는 상기 핵산과 결합시 생리 조건하에서 치료학적 화물을 보호한다. 상기 전달 중합체를, 용액 중에서 폴리뉴클레오티드와 결합될 때 나노입자로 자발적으로 자기-조립되는 특성을 갖도록 설계한다.

본 발명은 또한 혈청-안정성 나노입자를 형성하는 다른 전달 중합체를 고려한다. 본 발명은 전달 중합체의 유형으로 제한되지 않으며 핵산 특성, 예를 들어 길이, 조성, 전하, 및 결합된 펩티드의 존재에 순응될 수 있다. 상기 전달 중합체는 또한 생성되는 나노입자의 물성, 예를 들어 유체역학적 반경, 숙주 혈류 중에서의 안정성, 상기 숙주에 대한 독성, 및 화물을 숙주 세포내부에 배출하는 능력에 순응될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자 또는 그의 투과성 펩티드 접합체를 염의 형태로 투여한다. 상기 염은 산 또는 염기 부가염을 포함하는 임의의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 산과의 약학적으로 허용 가능한 염의 예는 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산, 요오드화 수소산, 불화 수소산, 아인산 등과 형성된 것들을 포함한다. 또한 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 알칸디오산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등, 예를 들어 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 형성된 염들이 포함된다. 따라서 예시적인 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 나이트레이트, 포스페이트, 일수소포스페이트, 이수소포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 트라이플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 카프릴레이트, 아이소부티레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 퓨마레이트, 말리에이트, 만델레이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 다이나이트로벤조에이트, 프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 페닐아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 말레이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트 등을 포함한다. 또한 아미노산의 염, 예를 들어 알기네이트, 글루코네이트, 및 갈락튜로네이트가 고려된다(예를 들어 문헌[Berge S. M. et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Science , 66:1-19 (1997)]을 참조하시오). 염기성 안티센스 분자의 산 부가염을, 유리 염기 형태를 숙련가에게 친숙한 방법 및 기법에 따라 상기 염을 생성하기에 충분한 양의 목적하는 산과 접촉시킴으로써 제조할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 유리산에 무기 염기 또는 유기 염기를 첨가하여 형성된다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 금속 또는 아민, 예를 들어 알칼리 및 알칼리 토금속 또는 유기 아민과 형성될 수 있다. 무기 염기로부터 유도되는 염은 비제한적으로 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등을 포함한다. 유기 염기로부터 유도되는 염은 비제한적으로 1차, 2차 및 3차 아민, 천연 치환 아민을 포함한 치환 아민, 환상 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, N,N-다이벤질에틸렌다이아민, 클로로프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌다이아민, 에틸렌다이아닐린, N-메틸글루카민, 글루코스아민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등의 염을 포함한다.

상기 안티센스 분자를 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물의 부분으로서 투여한다. 적합한 희석제, 부형제 및 담체는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gernnaro Ed., 1985)]에 개시되어 있다. 주사 또는 주입에 적합한 약학적 투여형은, 임의로 리포솜 중에 캡슐화되는, 멸균 주사성 또는 주입성 용액 또는 현탁액의 즉석 제조에 적합한 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 최종적인 투여형은 제조 및 보관 조건하에서 멸균성이고, 유체이며, 안정성이어야 한다. 상기 액체 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 리포솜의 형성에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 발생될 수 있다. 다수의 경우에, 등장성제, 예를 들어 당, 완충제 또는 염화 나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 상기 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 발생될 수 있다.

멸균 주사성 용액은 상기 안티센스 분자를, 필요한 경우 상기에 열거한 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킨 다음 여과 멸균시킴으로써 제조한다. 멸균 주사성 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기법이며, 상기 기법은 앞서 멸균-여과된 용액 중에 존재하는 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공한다.

본 발명은 또한 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료 방법 및 스타필로코커스 아우레우스의 생육을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 스타필로코커스 아우레우스는 메티실린-내성(MRSA) 균주이다. 하나의 실시태양에서, 상기 스타필로코커스 아우레우스 감염에 대한 치료를 겪고 있는 동물은 스타필로코커스 아우레우스 감염의 하나 이상의 증상들, 예를 들어 감염 부위에 고름 생성, 종기, 농양, 옹, 맥립종 및/또는 봉와직염을 나타낸다. 상기 동물은 또한 패혈증 및 폐렴의 징후를 나타낼 수도 있다.

하나의 실시태양에서, 상기 안티센스 분자를 정맥내, 근육내 또는 복강내 주사에 의해 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자를 국소적으로, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스에 의해 감염된 것으로 의심되는 조직에 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자를 경구로 투여한다. 경구로 투여될 때, 상기 안티센스 분자를, 위의 산성 환경으로부터 상기 안티센스 분자를 보호하고 상부 위장관에 상기 안티센스 분자를 배출하는 장용 코팅제로 코팅된 약학 조성물의 부분으로서 제형화할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스 분자를, 일정 기간에 걸쳐 실질적으로 연속적으로 상기 안티센스 분자를 방출하는 서방성 제형의 부분으로서 제형화할 수도 있다.

본 발명에 따른 안티센스 분자로 치료될 수 있는 동물은 상기 안티센스 분자에 의한 치료가 이로울 수 있는 임의의 동물을 포함한다. 상기와 같은 동물은 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등을 포함한다.

상기 안티센스 분자를 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료 또는 스타필로코커스 아우레우스의 생육의 억제에 유효한 양으로 투여한다. 상기 량은 투여 방식, 상기 동물의 나이, 상기 동물의 체중, 및 상기 포유동물의 표면적에 따라 광범위하게 다양할 수 있다. 안티센스 분자, 그의 접합체, 염 및/또는 복합체의 양은 대체로 1 pmol/㎏ 내지 1 mmol/㎏의 범위일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 량은 1 nmol/㎏ 내지 10 mmol/㎏의 범위일 수 있다. 국소로 투여될 때, 안티센스 분자, 그의 접합체, 염 및/또는 복합체의 양은 대체로 1 내지 99 중량%의 범위일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 안티센스 분자, 그의 접합체, 염 및/또는 복합체의 양은 대체로 1 내지 10 중량%의 범위일 수 있다.

실시예 I

펩티드-PNA 접합체의 합성: 모든 PNA 작용제들을 이종의 고상 펩티드 합성 기법으로 제조하고 HPLC에 의해 정제하였다.

네이키드 폴리뉴클레오티드의 직접 투여를 사용하여 배양물 중의 MRSA의 병인을 억제하였지만, 인간에서 핵산 치료법에 대한 중요한 장벽은 세균 세포벽이다. 상기 세포벽 장벽을 극복하기 위해서, 상기 세균 세포벽을 투과할 수 있는 세균-감염 유기체로부터 유래된 펩티드를 핵산 또는 변형 핵산에 부착시켜 상기 세균내로의 핵산 침입을 증대시킬 수 있다.

DNA 서열을 네오 바이오 그룹(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)에 의해 제조된 고충실도 합성기를 사용하여 합성하였다. 이어서 상기 폴리뉴클레오티드를 세균막의 투과 및 폴리뉴클레오티드 침입을 허용하는 펩티드에 결합시켰다. 본 발명에서, 펩티드와 DNA간의 링커로서 시스테인이 제공되는 펩티드-DNA 결합을 위한 고상합성 방법이 사용되었다.

특정한 실시태양에서, 안티센스 15-머 DNA 및 PNA 유사체를 세포 배양물에서의 시험을 위해 합성하였다. 문헌으로부터의 양성 대조군(FmhB); 및 음성 대조군(NC)으로서 사용하기 위한 비암호화 서열을 또한 합성하였다. 각각의 폴리뉴클레오티드를 세포 투과성 펩티드(CPP) 동기 KFFKFFKFFK(서열번호 51)에 결합시켰다.

PNA-CPP 및 DNA-CPP 후보를 모두 합성하고 시험하였다. 각 접합체의 질량 분광분석을 수행하여 성공적인 합성을 확인하였다. 상기 PNA-펩티드 및 DNA-펩티드 후보의 순도를 HPLC를 사용하여 확립시켰다. PNA-펩티드의 경우 약 99.9%의 순도가 성취된 반면; DNA-펩티드의 경우에는 >87%가 성취되었다. DNA-펩티드는, 아마도 상기 DNA와 CPP 펩티드를 별도로 제조하고 이어서 최종 정제 단계 전에 이들을 접합시키기 위해 필요한 단계들로 인해, 보다 높은 정도의 불순도를 제공하였다. 환언하면, 상기 PNA 작용제의 합성은 약 99%의 순도 수준을 제공하였다. PNA-펩티드 치료제의 증가된 순도 및 제조 간단성은 전장에서 cGMP-순응성 제조에 관하여 DNA-펩티드 후보에 비해 이점을 제공한다.

실시예 II

FITC 분석을 사용하여 펩티드의 세포 흡수를 모니터하였다. 펩티드를 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)에 접합시켜 형광 현미경으로 흡수를 모니터하였다. 도 2A 내지 2B는 MRSA(도 2A) 및 AcB(도 2B)에서 시험된 바와 같은 여러 펩티드들에 대한 분석 결과를 도시한다(1 μM의 FITC-펩티드제 처리 후 2시간째의 형광 오버레이, 스케일 바 = 100 ㎛). MRSA의 경우, KFF 및 RFF 동기를 갖는 나선형 양이온성 펩티드는 세포 침입에 유효하다. 또한, 마가이닌-FITC는 MRSA내로의 침입에 유효하다. 도 2A 내지 2B에 나타낸 현미경사진 중 어느 것에서도 시험 농도(1 μM)에서 상기 펩티드들로부터의 임의의 살균 효과는 보이지 않는다.

실시예 III

MRSA 시험관내 연구: MRSA에 대한 PNA-펩티드 분자의 서열-특이성 효과의 증명을 MRSA USA 300에서 수행하였다. MRSA USA 300은 미국, 캐나다 및 유럽에서 사회 획득 감염의 주요 원인이다. 클론 FPR3757은 배양물(ATCC(등록상표) BAA- 1556TM) 및 게놈 DNA(ATCC(등록상표) BAA- 1556D-5) 모두로서 ATCC로부터 입수할 수 있는 다중약물-내성 USA 300 균주이다. MRSA USA 300 균주는 잘 특성화되어 있으며 신뢰할만한 벤치마킹을 허용한다. MRSA 생육 곡선을 트립틱 소이 브로쓰(TSB, 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson))에서 1:3000, 1:1500, 1:600 및 1:300 범위의 상이한 희석비로 새로 해동된 동결된 세균 스톡을 접종함으로써 생성시켰다. 흡광도 판독을 바이오메이트(Biomate) 3S 분광광도계(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 600 ㎚(A₆₀₀) 및 550 ㎚(A₅₅₀)에서 매시간 수행하여 최적의 측정 환경을 확립시키고 세균 생육 동역학을 특성화하였다. 550 ㎚에서의 판독이 약간 더 높은 감도를 제공하였다. 보다 높은 흡광도 값에 대한 보다 낮은 희석 적정 및 보다 빠른 시간과의 상관성이 존재하였다. A550이 반코마이신 적정의 전파(propagation) 및 최소 억제 농도(MIC) 분석을 평가하기 위한 최적의 측정치로서 설정되었다.

반코마이신 적정을 적합한 시험 범위의 결정을 위해 설정하였다. 800 ug/㎖ 모액을 TSB에서 80 ug/㎖로 10배 희석하고 추가로 TSB에서 각각 40, 20, 10, 5 및 2.5 ㎍/㎖로 연속 희석하였다. MRSA USA 300 균주를 0.111의 초기 로그 기 OD 550 값으로 배양하고 상기 80 내지 2.5 ㎍/㎖ 범위의 반코마이신으로 처리하였다. 550 ㎚에서 흡광도 측정을 4-시간 기간에 걸쳐 매시간 수행하였다.

최소 억제 농도(MIC) 분석을 임상 실험 표준 연구소에서 개시한 바와 같이 수행하였다(Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 7th ed.; Approved Standard M7-A7; CLSI: Wayne, PA, USA, 2006; volume 26, No. 2). 반코마이신 및 메티실린을 대조군으로서 사용하였다. MIC를 A₆₀₀에서 검출된 세균 생육을 억제하는 작용제의 최저 농도로서 측정하였다.

시간-사멸 분석을 문헌[Haste et al. J. Antibiot . 2010, 63, 219-224]에 개시된 바와 같이 수행하였다. 다양한 농도의 작용제들을 팔콘 튜브들에 분액하였다. 5E5 cfu/㎖의 세균 4 ㎖을 상기 튜브들에 가하였다. 튜브들을 37 ℃에서 진탕기에서 배양하고 후속으로 0, 2, 4 및 8시간째에 A₆₀₀을 통해 세균 생육에 대해 분석하였다.

MRSA에 대한 폴리뉴클레오티드-펩티드 작용제의 서열-특이성 효과: 광범위한 농도를 생물정보과학으로부터 측정된 PNA-펩티드 안티센스 서열에 대해 시험하였다. FmhB를 문헌[Xie et al., Molecular Therapy , 2004, 10, 652-659]으로부터의 양성 대조군으로서 사용하고 말단 (KFF)₃K 동기를 갖는 비-암호화 서열을 펩티드 막 파괴에 의해 부여된 살균 효과를 가리키는 음성 대조군(NC)으로서 사용하였다. 서열-특이성 억제를, 유도기 동안 세균을 처리하여 말기 시점들에서의 생육 억제 및 잠재적인 회복을 측정함으로써 입증하였다. 후보 작용제들 및 비-암호화 서열 대조군을 멸균 RNase-부재, DNase-부재 수로 20 μM, 5 μM, 1 μM, 250 μM, 및 25 μM의 범위로 희석하였다. MRSA 생육의 억제가 광범위한 PNA-펩티드 농도에 걸쳐 관찰되었다.

도 3에 도시된 시간적 처리를 MRSA 균주 USA 300을 사용하여 수행하였다. TSB 중에서 1:100 희석으로 새로-해동시킨 MRSA를 개별적인 PNA-펩티드 분자를 함유하는 웰에 가하였다. 추가적인 양성 대조군인 반코마이신 12.5 ug/㎖, 및 음성 대조군인 물만을 또한 가하였다. 상기 샘플들을 225 RPM 궤도 진탕시키면서 37 ℃에서 배양시키고 8-시간 시간과정에 걸쳐 2-시간 시간간격으로 측정하였다. 도 1이 예시하는 바와 같이, MRSA 생육의 억제가 5 μM 농도에서 시간에 따라 관찰되었다.

로그 증식기에서, 억제는 PNA-펩티드 접합체의 경우(도 3) ~1 μM 정도로 낮은 농도에서, 및 DNA-펩티드 접합체의 경우 ~10 μM 정도로 낮은 농도에서 관찰된다.

도 2A 내지 2B는 세포-투과성 펩티드의 비-독성을 입증한다. FITC에 접합시키고 배양물 중의 세포에 가할 때, 상기 세포는 상기 세포 배양 실험의 기간에 걸쳐 살아있는 채로 있다.

실시예 IV

상기 DNA-펩티드 접합체를 용해하기 위해서, 상기 접합체를 트리스 완충제 중에 상승된 pH = 9에서 분산시켰다. 이어서 상기 접합체를 40 ℃에서 24시간 동안 서서히 교반하였다. 이 기간 후에, 흐림이 여전히 관찰되었으며, 따라서 상기 접합체를 추가로 6시간 동안 서서히 교반하면서 80 ℃로 가열하였고, 이후에 등명한(clear) 용액이 수득되었다. 상기 초기 용액을 DLS를 통해 시험하여 상기 DNA-펩티드 접합체들 간의 잠재적인 자기-조립을 살폈다. 다수의 하전된 중합체들에 의해 나타나는 바와 같이, 용액 중에서 자기-응집이 관찰되었으며, 300 ㎚ 내지 1 마이크론 범위에서 광범위한 다중분산 응집체를 나타낸다.

입자 크기는 혈액 순환 시간 및 제거의 측정에 중요한 역할을 한다. 상기는 또한 조직 투과성, 제거 잠재력, 및 선택성의 예견인자이다. 중합체-함유 입자는 siRNA 및 DNA에 의해 확인되었으며, 핵산을 뉴클레아제 분해로부터 보호할 수 있고, 혈류 중 콜로이드 안정성을 위해 가공될 수 있다. 본 발명의 안티센스 분자-펩티드 접합체를 혈청-안정성 포스포늄-블록 공중합체와 결합시켜 폴리플렉스를 형성시켰다. 상기 다이블록 공중합체는 음으로 하전된 DNA와 초분자 조립체를 형성한다. 상기 입자는 표면상에 중성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 브러시를 갖는 코어-쉘형 형태를 형성한다. 폴리플렉스 유체역학적 직경을 제타사이저(Zetasizer)(나노 ZS) 동적 광산란(DLS) 장비(맬번 인스트루먼츠(Malvern Instruments), 영국 월세스터셔 소재)상에서 측정하였다. 크기 비교로서, 담체 중합체가 없는 DNA-펩티드 접합체(S11e-KFFKFFKFFK(서열번호 51))를 트리스 완충 용액 중에서 pH = 9에서 1 ㎎/㎖로 측정하였다. 다이블록-폴리[(에틸렌 글리콜)₉ 메틸 에틸 메트아크랄레이트][스티릴포스포늄]과의 상기 DNA-펩티드 접합체는 3개의 농도에서 40 ㎚ 내지 30 ㎚ 범위의 크기를 나타내었다.

상기 DNA-펩티드 접합체를 갖는 나노입자의 형성은 물리적 인자들에 의존한다. 상기 DNA 영역은 음으로 하전되고 상기 KFFKFFKFFK(서열번호 51) 영역은 양으로 하전되기 때문에, 상기 접합체는 용액 중에서 강한 분자간 회합을 나타낸다. 광범위한 제형 조건들을 평가하였다. 최적의 입자는 2 내지 4의 전하 대 전하 비(포스포늄 +/DNA 포스페이트 -) 및 [DNA-펩티드 접합체]≤0.5 ㎎/㎖ 이하에서 형성된다. 농도가 0.5 ㎎/㎖를 초과할 때, 동적 광산란(DLS) 분석은 큰 응집체가 형성됨을 가리킨다. 상기 DLS 데이터는 상기 예비-제형 농도가 최종 나노입자 크기 범위에 영향을 미치며, 이때 0.5 ㎎/㎖은 약 90 ㎚ 내지 100 ㎚ 덩어리의 가장 큰 나노입자를 형성하고; 0.1 ㎎/㎖는 40 ㎚ 정도로 작은 직경의 입자를 형성함을 가리킨다.

상기 DNA-펩티드 접합체를 용해시키기 위해서, 상기 접합체를 트리스 완충제 중에 상승된 pH = 9에서 분산시켰다. 이어서 상기 접합체를 40 ℃에서 24시간 동안 서서히 교반하였다. 이 기간 후에, 흐림이 여전히 관찰되었으며, 따라서 상기 접합체를 추가로 6시간 동안 서서히 교반하면서 80 ℃로 가열하였고, 이후에 등명한 용액이 수득되었다. 상기 초기 용액을 DLS를 통해 시험하여 상기 DNA-펩티드 접합체들 간의 잠재적인 자기-조립을 살핀다. 다수의 하전된 중합체들에 의해 나타나는 바와 같이, 용액 중에서 자기-응집이 관찰되었으며, 300 ㎚ 내지 1 ㎛ 범위에서 광범위한 다중분산 응집체를 나타낸다.

본 발명에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보들은 전체가 참고로 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Techulon Inc. <120> ANTISENSE MOLECULES FOR TREATMENT OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS INFECTION <130> IPA150993-US <140> PCT/US2014/028830 <141> 2014-03-14 <150> US 61/786,926 <151> 2013-03-15 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Antisense <222> (1)..(15) <400> 1 tttcatttcg gcacc 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Antisense <222> (1)..(15) <400> 2 cgctcacttt tgtaa 15 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Antisense <222> (1)..(12) <400> 3 acgaggcata at 12 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Antisense <222> (1)..(12) <400> 4 tgtttaccca ta 12 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Antisense <222> (1)..(12) <400> 5 aacatcggaa tg 12 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Antisense <222> (1)..(12) <400> 6 actcgtggca ta 12 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Antisense <222> (1)..(12) <400> 7 cgagccataa ta 12 <210> 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Staphylococcus aureus <400> 77 atggaagcaa gagatattct taagcgcccc gtaatcactg agaaatcttc tgaagcaatg 60 gctgaagaca aatacacttt cgacgttgat actcgtgtta acaaaacaca agtaaaaatg 120 gcagttgaag aaatcttcaa cgtaaaagtt gcaagtgtta atatcatgaa ttacaaacct 180 aagaaaaaac gtatgggccg ttaccaaggc tatacaaaca aaagaagaaa agcgattgta 240 actcttaaag aaggatcaat cgacttattt aactaa 276 <210> 78 <211> 285 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 78 atgttaaaat taaacttaca attcttcgca tctaaaaaag gggtaagttc tacaaaaaac 60 ggacgtgact ctgaatcaaa acgcttaggt gctaaacgtg ctgacggtca attcgtaaca 120 ggtggttcaa ttttatatcg ccaacgtggt actaaaattt accctggtga aaatgtaggt 180 cgtggtggcg atgatacatt attcgctaaa atcgacggcg ttgttaaatt cgaacgtaaa 240 ggtcgcgaca aaaaacaagt ttctgtatat gcagtagctg aataa 285 <210> 79 <211> 189 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 79 atgggtaaac aatgtttcgt aacaggtcgt aaagcttcga ctggtaacag acgttcacac 60 gctttaaact ctactaaacg tagatggaac gctaaccttc aaaaagttag aatcctagtt 120 gacggtaaac ctaaaaaagt ttgggtttct 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180 tatggaatga ctgaaagaca attccgtaac acatttgaca tcgctggtaa aaaattcggt 240 gtacacggtg aaaacttcat gattttatta gcaagtcgtt tagacgctgt tgtttattca 300 ttaggtttag ctcgtactcg tcgtcaagca cgtcaattag ttaaccacgg tcatatctta 360 gtagatggta aacgtgttga tattccatct tattctgtta aacctggtca aacaatttca 420 gttcgtgaaa aatctcaaaa attaaacatc atcgttgaat cagttgaaat caacaatttc 480 gtacctgagt acttaaactt tgatgctgac agcttaactg gtactttcgt acgtttacca 540 gaacgtagcg aattacctgc tgaaattaac gaacaattaa tcgttgagta ctactcaaga 600 taa 603 <210> 98 <211> 501 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 98 atggctcgta gagaagaaga gacgaaagaa tttgaagaac gcgttgttac aatcaaccgt 60 gtagcaaaag ttgtaaaagg tggtcgtcgt ttccgtttca ctgcattagt tgtagttgga 120 gacaaaaatg gtcgtgtagg tttcggtact ggtaaagctc aagaggtacc agaagcaatc 180 aaaaaagctg ttgaagcagc taaaaaagat ttagtagttg ttccacgtgt tgaaggtaca 240 actccacaca caattactgg ccgttacggt tcaggaagcg tatttatgaa accggctgca 300 cctggtacag gagttatcgc tggtggtcct gttcgtgccg tacttgaatt agcaggtatc 360 actgatatct 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Claims

스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 리보솜 단백질의 암호화 영역에 안티센스이고 생리 조건하에서 상기 암호화 영역에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스의 생육을 억제하는 안티센스 분자 또는 그의 염으로, 10 내지 50 핵염기의 길이인 안티센스 분자.
제1항에 있어서,
스타필로코커스 아우레우스 리보솜 단백질의 암호화 영역에 완전히 상보성인 안티센스 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서,
서열번호 1 내지 50으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열에 적어도 80% 일치하는 안티센스 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서,
서열번호 1 내지 50으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 안티센스 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드인 안티센스 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
실질적으로 순수한(substantially pure) 안티센스 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 주쇄(modified backbone)를 포함하는 안티센스 분자.
제7항에 있어서,
변형된 주쇄가 PNA 주쇄인 안티센스 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
LSU 리보솜 단백질 L15p(L27Ae) 또는 SSU 리보솜 단백질 S17p(S11e)의 발현을 억제하는 안티센스 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 투과성 분자에 접합된 안티센스 분자.
제10항에 있어서,
세포 투과성 분자가 펩티드인 안티센스 분자.
제11항에 있어서,
펩티드가 세포-투과성 펩티드인 안티센스 분자.
전달 중합체와 복합체를 형성한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 안티센스 분자를 포함하는 조성물.
제13항에 있어서,
전달 중합체가 포스포늄 또는 암모늄 이온기를 포함하는 양이온성 블록 공중합체인 조성물.
스타필로코커스 아우레우스의 생육을 억제하는 방법으로, 상기 스타필로코커스 아우레우스를 함유하거나 또는 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 것으로 의심되는 조직에 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 안티센스 분자 또는 제13항 또는 제14항의 조성물을 투여함을 포함하는 방법.
제15항에 있어서,
안티센스 분자 또는 조성물의 국소 투여를 포함하는 방법.
스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료 방법으로, 상기 치료가 필요한 동물에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 안티센스 분자 또는 제13항 또는 제14항의 조성물을 투여함을 포함하는 방법.