KR20160010391A

KR20160010391A - Cd20 및 cd95에 결합하는 재조합 이중특이성 항체

Info

Publication number: KR20160010391A
Application number: KR1020157015548A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 허먼; 루드거 그로세-호베스트
Original assignee: 발리오팜 아게
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2033-11-19
Also published as: EP2920210A1; JP6475631B2; WO2014076292A1; ES2649991T3; CN105229029A; CA2891764A1; US10590202B2; CN105229029B; US20150274833A1; EP2920210B1; JP2016500061A; KR102168562B1

Abstract

a) 제1 항원에 대한 제1 결합 부위를 포함하는 Fab 단편; b) 제2 항원에 대한 제2 결합 부위를 포함하는 scFv 단편; 및 c) CH2 도메인을 포함하고, 상기 Fab 단편 및 scFv 단편이 상기 CH2 도메인을 통해 결합되며, 상기 제1 항원이 CD95이고 상기 제2 항원이 CD20이거나; 또는 상기 제1 항원이 CD20이고 상기 제2 항원이 CD95인 이중특이성 항체 포맷.

Description

CD20 및 CD95에 결합하는 재조합 이중특이성 항체{RECOMBINANT BISPECIFIC ANTIBODY BINDING TO CD20 AND CD95}

본 발명은 CD20 및 CD95에 결합하는 신규의 이중특이성 항체 포맷에 관한 것이다.

CD95/Fas/Apo-1은 인간 세포의 세포사멸사를 유도할 수 있는 세포 표면 수용체이다. 상기 수용체의 생리학적 리간드, CD95L과 유사하게, 작용성 항-CD95 항체는 CD95에 대한 결합이 다량체성 포맷으로, 예를 들어 오량체성 IgM 또는 자기-응집성 IgG3으로서 발생하는 경우 세포사멸을 유도할 수 있다. 한편으로, 항-CD95 항체는 이웃하는 세포상의 Fc 수용체에 의해 또는 2차 항체에 의해 가교결합되어 작용물질 활성을 성취할 수 있다.

다수의 종양 세포들이 CD95를 발현하기 때문에, 종양 치료법에 대한 작용성항-CD95 항체의 사용이 원형 CD95 항체의 초기 특성화 후 강력히 추구되었다. 그러나, 곧, 환자에 대한 적어도 그의 가장 단순한 형태의 작용성 항-CD95 항체 또는 재조합 CD95L의 적용은, 많은 정상 세포 유형들이 기능성 CD95를 발현하고 작용성 항체에 의해 사멸될 수 있기 때문에 실패가 분명해졌다.

CD20은 다수의 림프종 및 자가면역 질병, 예를 들어 다발성 경화증(MS), 류마티스성 관절염(RA) 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)와 관련된 B-세포의 마커이다.

상기 B-세포 관련된 CD20 표면 항원에 대한 항체는 악성 B 세포뿐만 아니라 정상 B 세포도 표적화할 수 있다. 상기 항체는 B-세포 유래 백혈병 및 림프종 및 항체 매개된 자가면역 질환 각각의 치료에 성공적으로 사용된다. 리툭시맵(상표명 리툭산(Rituxan) 및 맵테라(MabThera))은 단백질 CD20에 대한 키메릭 단클론 항체이다. 리툭시맵은 B 세포를 파괴하며, 따라서 과도한 수의 B 세포, 과잉활성 B 세포, 또는 기능이상 B 세포를 특징으로 하는 질병들의 치료에 사용된다. 상기 질병은 다수의 림프종, 백혈병, 이식 거부, 및 일부 자가면역 질환들을 포함한다.

그러나, 리툭시맵은 CD20-양성 세포를 비특이적으로 죽이며, MS에서 임상적으로 유효한 것으로 나타났지만, 부작용(예를 들어 진행성 다병소성 백질뇌증, PML)이 문제가 된다.

앞서, CD95 및 림프종 세포상의 상이한 표적 항원들, 예를 들어 CD20 및 CD40에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 F(ab')₂ 단편(bs-F(ab')₂)이 CD95 및 각각의 표적 항원에 대해 양성인 세포의 세포사멸을 유도함이 입증되었다. CD95를 발현하지만 표적 항원은 발현하지 않는 림프종 세포는 죽이지 못했다((Jung et al. Cancer Research 61, 1846-1848 (2001)).

헐만(Hermann) 등(Cancer Research 68 (4): 1221-7 (2008))은 종양 세포에서 선택적인 CD95 매개된 세포사멸에 대한 항체 포맷의 영향 및 표적 항원의 성질을 평가하였다.

US2003/0232049A1은 세포 표면 수용체를 선택적으로 자극하기 위한 다중특이성 시약을 개시한다. 세포 표면 수용체, 예를 들어 사멸 수용체, 예를 들어 CD95에 대한 제1 결합 부위, 및 동일한 세포의 표적 항원, 예를 들어 CD20 또는 CD40에 대한 제2 결합 부위를 갖는 항원-결합 항체 단편으로 이루어지는 이중특이성 항체가 암세포를 죽이는 것으로 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 개선된 생물 활성을 갖는 CD20 및 CD95에 대한 이중특이성 항체 포맷을 제공하는 것이다.

상기 목적은 특허청구된 바와 같은 주제에 의해 해결된다.

본 발명에 따라

a) 제1 항원에 대한 제1 결합 부위를 포함하는 Fab 단편;

b) 제2 항원에 대한 제2 결합 부위를 포함하는 scFv 단편;

c) 임의의 링커 서열(들); 및

d) CH2 도메인

을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 상기 Fab 단편 및 scFv 단편이 상기 CH2 도메인을 통해 결합되고, 여기에서

-상기 제1 항원이 CD95이고 상기 제2 항원이 CD20이거나; 또는

-상기 제1 항원이 CD20이고 상기 제2 항원이 CD95인

이중특이성 항체 포맷을 제공한다.

구체적으로, 상기 항체 포맷은 도 1에 묘사된 바와 같은 구조를 포함한다. 이를 예를 들어 NA-C20 또는 노보탈그(Novotarg)라 칭한다.

특정한 실시태양에 따라, 상기 포맷은

a) VL/VH 도메인 쌍 및 CL/CH1 도메인 쌍으로 이루어지고 제1 결합 부위를 포함하는 Fab 단편;

b) 서로 결합된 VH/VL 도메인으로 이루어지는 scFv;

c) 임의의 링커 서열(들); 및

d) a)의 Fab 단편의 CH1 도메인을 b)의 scFv의 VH 도메인에 결합시키는 CH2 도메인

을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고,

-제1 항원이 CD95이고 제2 항원이 CD20이거나; 또는

-제1 항원이 CD20이고 제2 항원이 CD95인

구조물이다.

상기 구조는 링커 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 특이적인 항체 도메인을 기본으로 한다.

본 발명의 항체 포맷은 바람직하게는 상기 항체 포맷을 발현하는 이종 서열을 포함하는 재조합 핫(hot) 세포에 의해 생산된 재조합 항체 포맷이다.

바람직하게, 본 발명의 항체 포맷은 단클론 항체 포맷이며, 고유 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 예를 들어 표적에 대한 결합의 특이성, 친화성 및/또는 결합활성을 개선시키거나 또는 상기 포맷의 안정성을 개선시키거나, 또는 상기 재조합 분자의 생산성을 증가시키기 위한 상기 아미노산 서열, 3차 구조 및 임의로 글리코실화의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 항체 도메인은 포유동물 기원, 예를 들어 설치류, 예를 들어 쥐, 또는 인간 기원의 것이거나, 또는 인간 이외의 포유동물 기원의 키메릭 또는 인간화된 항체 도메인, 예를 들어 인간화된 쥐 또는 카멜리드 항체 도메인이다.

특정한 태양에 따라, CD20에 결합하는 결합 부위는 항체 가변 도메인의 6개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6):

A) i) CDR1은 아미노산 서열 RASSSVSYM (서열번호 12)을 포함하고;

ii) CDR2는 아미노산 서열 APSNLAS (서열번호 13)을 포함하고;

iii) CDR3은 아미노산 서열 QQWSFNPPT (서열번호 14)을 포함하고;

iv) CDR4는 아미노산 서열 SYNMH (서열번호 16)을 포함하고;

v) CDR5는 아미노산 서열 AIYPGNGDTSYNQKFKG (서열번호 17)을 포함하고; 및

vi) CDR6은 아미노산 서열 VVYYSNSYWYFDV (서열번호 18)을 포함한다; 또는

B) 하기 중 적어도 하나인 그의 기능 활성 변이체:

i) CDR1은 아미노산 서열 RASSSVSYM (서열번호 12)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

ii) CDR2는 아미노산 서열 APSNLAS (서열번호 13)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

iii) CDR3은 아미노산 서열 QQWSFNPPT (서열번호 14)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

iv) CDR4는 아미노산 서열 SYNMH (서열번호 16)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

v) CDR5는 아미노산 서열 AIYPGNGDTSYNQKFKG (서열번호 17)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는

vi) CDR6은 아미노산 서열 VVYYSNSYWYFDV (서열번호 18)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다

를 포함한다.

본 발명은 구체적으로 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 조합, 또는 상기 CDR4, CDR5 및 CDR6 서열의 조합을 포함하는 단일 가변 도메인, 또는 상기와 같은 단일 가변 도메인들의 쌍, 예를 들어 VH, VHH 또는 VH/VL 도메인 쌍을 포함하는, 상기 서열 A i) 내지 vi)로부터 유래한 CD20 결합 부위, 예를 들어 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및/또는 중쇄 가변 영역의 CDR4, CDR5 및 CDR6 서열을 포함하는 임의의 항체 포맷의 용도를 고려한다.

특정한 실시태양은 A의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 및 B의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 항체 포맷에 관한 것이다.

추가의 특정한 실시태양은 B의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 및 A의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 항체 포맷에 관한 것이다.

특정한 실시태양은 A i)의 CDR1 서열, A ii)의 CDR2 서열 및 A iii)의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 A iv) 또는 B iv)의 CDR4 서열, A v) 또는 B v)의 CDR5 서열 및 A vi) 또는 B vi)의 CDR6 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 CDR4, CDR5 및 CDR6 서열 중 적어도 하나는 B의 기능 활성 변이체를 포함한다.

추가의 특정한 실시태양은 A iv)의 CDR4 서열, A v)의 CDR5 서열 및 A vi)의 CDR6 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 A i) 또는 B i)의 CDR1 서열, A ii) 또는 B ii)의 CDR2 서열 및 A iii) 또는 B iii)의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 적어도 하나는 B의 기능 활성 변이체를 포함한다.

B의 변이체는, 예를 들어 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 화학적 유도체화에 의한 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이를 함유하는, 나열된 바와 같은 특정한 CDR 서열을 임의로 포함한다.

CD20 결합제의 변이체는 CD20, 구체적으로 인간 CD20에, 특히 높은 친화성, 예를 들어 Kd<10^-8M의 친화성으로 결합하는 경우 기능 활성 변이체로 간주된다.

특정한 실시태양에 따라, 상기 이중특이성 항체 포맷은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VL 도메인 및/또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함한다.

구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VL 도메인 및/또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 인간화된 변이체이다.

특정한 태양에 따라, CD95에 결합하는 결합 부위는 가변 항체 도메인의 6개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6):

A) i) CDR1은 아미노산 서열 RASESVEYYGTSLMQ (서열번호 2)을 포함하고;

ii) CDR2는 아미노산 서열 VASNVES (서열번호 3)을 포함하고;

iii) CDR3은 아미노산 서열 QQSTKVPWT (서열번호 4)을 포함하고;

iv) CDR4는 아미노산 서열 TNAMN (서열번호 6)을 포함하고;

v) CDR5는 아미노산 서열 RIRSKSNNYATYYAESVKD (서열번호 7)을 포함하고;

vi) CDR6은 아미노산 서열 DGYY (서열번호 8)을 포함한다; 또는

B) 하기 중 적어도 하나인 그의 기능 활성 변이체:

i) CDR1은 아미노산 서열 RASESVEYYGTSLMQ (서열번호 2)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

ii) CDR2는 아미노산 서열 VASNVES (서열번호 3)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

iii) CDR3은 아미노산 서열 QQSTKVPWT (서열번호 4)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

iv) CDR4는 아미노산 서열 TNAMN (서열번호 6)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

v) CDR5는 아미노산 서열 RIRSKSNNYATYYAESVKD (서열번호 7)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 ;

vi) CDR6은 아미노산 서열 DGYY (서열번호 8)과 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다

를 포함한다.

본 발명은 구체적으로 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 조합, 또는 상기 CDR4, CDR5 및 CDR6 서열의 조합을 포함하는 단일 가변 도메인, 또는 상기와 같은 단일 가변 도메인들의 쌍, 예를 들어 VH, VHH 또는 VH/VL 도메인 쌍을 포함하는, 상기 서열 A i) 내지 vi)로부터 유래한 CD95 결합 부위, 예를 들어 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및/또는 중쇄 가변 영역의 CDR4, CDR5 및 CDR6 서열을 포함하는 임의의 항체 포맷의 용도를 고려한다.

B의 변이체는, 예를 들어 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 화학적 유도체화에 의한 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이를 함유하는, 나열된 바와 같은 특이적인 CDR 서열을 임의로 포함한다.

CD95 결합제의 변이체는 CD95, 구체적으로 인간 CD95에, 특히 높은 친화성, 예를 들어 Kd<10^-8M의 친화성으로 결합하는 경우 기능 활성 변이체로 간주된다.

특정한 실시태양에 따라, 상기 이중특이성 항체 포맷은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VL 도메인 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함한다.

구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VL 도메인 및/또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 인간화된 변이체이다.

또 다른 특정한 실시태양에 따라, 상기 이중특이성 항체 포맷은 서열번호 21의 경쇄 서열 및 서열번호 23의 중쇄 서열, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.

구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VL 도메인 및/또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 인간화된 변이체이다.

본 발명에 따른 이중특이성 항체 포맷은 구체적으로 쥐, 키메릭, 인간화된 및/또는 인간 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 이중특이성 항체 포맷은 CD20과 Kd<10^-8M로 결합하고/하거나 CD95와 Kd<10^-8M로 결합하는 것이 바람직하다.

예시적인 구조물은 도 1에 도식적으로 개시된 CD20XCD95-특이성을 갖는 재조합 이중특이성 Fab-단일 쇄(bsFabXsc)이다. 이를 예를 들어 NA-20 또는 노보탈그라 칭한다.

구체적으로, 상기 포맷은, 구체적으로 인간 IgG 항체로부터 유래한 항체 도메인 또는 서열을 포함하는 IgG 부류의 항체, 특히 IgG1, IgG2 또는 IgG4 하위부류의 항체로부터 유래할 수 있다.

구체적으로 상기 포맷은 인간 IgG 항체로부터 유래할 수 있다.

또 다른 특정한 태양에 따라, 상기 항체 포맷을 의학적 용도에, 바람직하게는 B-세포 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 제공한다.

특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체 포맷을 바람직하지 못한 수준 또는 상향조절된 B-세포, 예를 들어 과잉 또는 악성 B-세포와 관련된 질병 상태, 또는 이상, 과잉 또는 바람직하지 못한 면역 반응에 의해 유발되는 면역 질환의 치료를 위한 의학적 용도를 위해 제공한다. 예시적인 질병 상태는 자가면역 질병, 또는 백혈병 또는 림프종을 포함한 암이다.

본 발명에 따라 치료 유효량의 이중 특이성 항체 포맷을 B-세포 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 질환의 치료 또는 예방 방법을 추가로 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, B-세포를 본 발명의 이중특이성 항체 포맷을 포함하는 조성물과 접촉시킴을 포함하는, 상기 세포의 치료 방법을 제공한다. 상기와 같은 치료 방법은 생체내 또는 생체외일 수 있다.

구체적으로, 상기 세포에 의해 발현되는 사멸 수용체 CD95 및 세포 표면 항원 CD20은 상기 이중특이성 항체 포맷에 의해 표적화되며, 이에 의해 상기 세포의 세포사멸 및/또는 억제가 일어난다.

구체적으로, 본 발명의 이중특이성 항체 포맷을 상기 포맷이 필요한 개체에게 치료 유효량으로 투여하며, 상기 포맷은 바람직하게는 비경구용 제형, 예를 들어 정맥내 또는 피하 제형 중에서, 특히 상기 항체 포맷 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 제제 중에서 제공된다.

본 발명에 따라 본 발명의 항체 포맷 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다.

구체적으로, 상기 약학 조성물을 B-세포 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 제공한다.

본 발명에 따라, 치료 유효량의 상기 약학 조성물을 B-세포 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 질환의 치료 또는 예방 방법을 추가로 제공한다.

또 다른 태양에 따라, 샘플 중의 B-세포를 표적화하기 위해 본 발명의 항체 포맷을 포함하고, B-세포 질환을 유발하는 B-세포의 양 및/또는 성질을 측정하기 위해 진단 시약 또는 도구, 예를 들어 표지를 임의로 추가로 포함하는 진단 시약 또는 키트를 추가로 제공한다. 적합한 분석은 면역흡착성 분석, 예를 들어 ELISA이다. 본 발명에 따른 항체를, 예를 들어 결합 분석(예를 들어 ELISA) 및 결합 연구에서 접합체의 간단한 검출을 허용하는 다른 분자에 접합시킬 수도 있다.

더욱이, 특정한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 항체 포맷을, 예를 들어 유기 분자, 효소 표지, 방사성 표지, 착색된 표지, 형광 표지, 발색 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시제닌, 비오틴, 금속 착체, 금속, 콜로이드성 금 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 표지 또는 리포터 분자에 접합시킨다. 표지 또는 리포터 분자에 접합된 항체를 예를 들어 분석 시스템 또는 진단 방법에 사용할 수 있다.

추가의 태양에 따라, 본 발명의 항체 포맷을 사용하는 진단 방법, 즉 샘플 중 B-세포를 측정하기 위한 방법을 제공한다.

상기 샘플은 혈액, 혈청 또는 소변을 포함하는 체액 샘플일 수 있다.

또 다른 태양에 따라, 본 발명의 항체 포맷을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 제공한다.

또 다른 태양에 따라, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.

또 다른 태양에 따라, 본 발명의 핵산 서열 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.

또 다른 태양에 따라, 본 발명의 숙주 세포가 본 발명의 항체 포맷을 생산하도록하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하거나 유지시킴을 포함하는, 상기 항체 포맷의 생산 방법을 추가로 제공한다.

도 1: 링커로서 단량체성 CH₂ 도메인을 사용하는 scFv에 결합된 Fab를 함유하는 재조합 이중특이성 Fab-단일 쇄(본 발명에서 또한 키메릭 버전의 경우 bsFabXsc 또는 NA-C20이라 칭하고 인간화된 버전의 경우에는 노보탈그라 칭한다).
본 발명의 예시적인 항체 포맷의 도식적 묘사: 이중특이성 CD20 X CD95 항체 포맷이 CD20 및 CD95 모두를 발현하는 정상, 활성화, 또는 악성 B 세포의 표면상에서 사멸 수용체 CD95의 선택적인 자극을 위해 제공된다.
CD20(2H7, 쥐, 키메릭 및 인간화된) 및 CD95 항체(쥐, 키메릭 및 인간화된)의 서열들을 포함한, 상기 항체의 서열을 도 2e에 제공한다. 상기 항체를 암호화하는 유전자 구조물을 표준 기법을 사용하여 Sp2/0 세포에 안정하게 형질감염시켰다. 상기 단백질을, 영국 셸폰트 세인트 길스 소재의 GE-헬쓰케어로부터 구입한, 카파셀렉트(KappaSelect) 수지를 갖는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 형질감염된 세포의 상등액으로부터 정제하였다.
도 2: 실시예들에서 지칭된 바와 같은 예시적인 항체 포맷들의 서열.
도 2a: CD95에 대한 결합 부위를 갖는 항체 포맷의 마우스 VL 및 VH 서열(각각 서열번호 1 및 5), CDR 서열들을 밑줄 그었다(VL의 CDR1, CDR2, CDR3: 서열번호 2 내지 4; VH의 CDR1, CDR2, CDR3: 서열번호 6 내지 8).
도 2b: CD95(인간화된)에 대한 결합 부위를 갖는 항체 포맷의 VL 및 VH 서열(각각 서열번호 9 및 10), CDR 서열들을 밑줄 그었다.
도 2c: CD20(쥐, 문헌[Liu et al. The Journal of Immunology139, 3521-3526 (1987)]에 개시된 바와 같은 항체 2H7로부터 유래함, NCBI 수탁 M17953 및 M17954)에 대한 결합 부위를 갖는 항체 포맷의 VL 및 VH 서열(각각 서열번호 11 및 15), CDR 서열들을 밑줄 그었다(VL의 CDR1, CDR2, CDR3: 서열번호 12 내지 14; VH의 CDR1, CDR2, CDR3: 서열번호 16 내지 18).
도 2d: CD20(인간화된, 상기 항체 2H7로부터 유래함)에 대한 결합 부위를 갖는 항체 포맷의 VL 및 VH 서열(각각 서열번호 19 및 20), CDR 서열들을 밑줄 그었다.
도 2e: 예시적인 이중특이성 항체 포맷 CD95xCD20, 키메릭 및 인간화된 버전들:
서열번호 21: 키메릭 버전, 경쇄의 아미노산 서열;
서열번호 22: 키메릭 버전, 경쇄의 뉴클레오티드 서열;
서열번호 23: 키메릭 버전 중쇄의 아미노산 서열;
서열번호 24: 링커 서열;
서열번호 25: 키메릭 버전, 중쇄의 뉴클레오티드 서열;
서열번호 26: 인간화된 버전 경쇄의 아미노산 서열;
서열번호 27: 인간화된 버전, 경쇄의 뉴클레오티드 서열;
서열번호 28: 인간화된 버전 중쇄의 아미노산 서열;
서열번호 29: 인간화된 버전, 중쇄의 뉴클레오티드 서열.
도 3: CD20 및 CD95에 대한 NA-CD20의 결합 특이성
지시된 농도의 정제된 NA-C20(키메릭 CD95XCD20 항체 유도체)과의 배양 후 CD95^-/CD20⁺다우디(Daudi) 세포(●) 및 CD95⁺/CD20^- LN-18(○) 세포의 유식 세포측정 분석. 이를 클론 5B12(NA-20을 발현하는)로부터의 희석되지 않은 상등액 중에서의 상기 항체의 결합과 비교하였다. 검출 항체: 염소 α 인간 Fcγ-PE, 잭슨 임뮤노 리써치(Jackson Immuno Research) 109-116-098.
도 4: CD20 및 CD95에 대한 노보탈그의 결합 특이성
지시된 농도의 정제된 노보탈그(인간화된 CD95XCD20 항체 유도체)와의 배양 후 CD95^-/CD20⁺다우디 세포(●) 및 CD95⁺/CD20^- LN-18 세포(○)의 유식 세포측정 분석. 이를 클론 25-CHO-S/BV004/K44(노보탈그를 발현하는)로부터의 지시된 희석 상등액들 중에서의 상기 항체의 결합과 비교하였다. 검출 항체: 염소 α 인간 Fcγ-PE, 잭슨 임뮤노 리써치 109-116-098.
도 5: 키메릭 CD95XCD20 항체 유도체의 생체내 반감기
C57BL6(수컷, 6주된 것)에게 50 ㎍의 NA-C20을 주사하고 혈액 샘플을 0.5h, 1.0h, 2.0h 및 4.0h에서 채혈하였다. 혈청을 SKW 6.4 세포와 배양하고, 이어서 유식 세포측정에서 결합된 항체에 대해 분석하였다(검출 항체: PE-염소 항인간 Fcγ, 잭슨 임뮤노 리써치).
도 6: CD95⁺/CD20⁺ 세포에서 CD95를 활성화시키는 NA-C20 및 노보탈그의 능력
지시된 농도의 NA-C20(●) 또는 노보탈그(○)와의 배양 후 CD95⁺/CD20⁺ SWK 6.4 세포에 대한 티미딘 결합 분석. 비-처리된 세포는 음성 대조군(컬럼 세포만)으로서 제공되었고, Apo-1에 대한 마우스 mAb(염소 항 마우스 Ab에 의해 가교결합됨)와 배양된 세포는 양성 대조군(컬럼 GaM + Apo)으로서 제공되었다.
도 7: SCID 마우스 모델에서 NA-C20의 시험
8마리의 SCID 마우스에게 0일째에 치사 용량의 CD20⁺/CD95⁺ B-림프아구 세포주 SKW 6.4를 주사하였다. 다음에, 마우스에게 종양 세포 접종 후 1, 2 및 3일째에 20 ㎍의 NA-C20(○), NA-CMeI(▼) 또는 100 ㎕ PBS(●)를 반복적으로, 또는 종양 세포 접종 후 1일째에 60 ㎍의 CD20에 대한 키메릭 항체(■,▽) 및 EGFR(상피 성장 인자 수용체, □)에 대한 항체를 1회 각각 주사하였다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "항체 포맷"이란 용어는 링커 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로서 이해되는 항체 도메인으로 이루어지거나 상기 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 것이다. 본 발명의 항체 포맷은 특정한 구조를 가지며, 구체적으로 VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인, 예를 들어 CL/CH1 도메인으로 이루어지는 Fab 단편의 결합 부위를 포함하고, CH2 도메인에 의해 scFv에 결합하는, scFv의 결합 부위를 추가로 포함한다.

파파인에 의해 절단된 항체는 3개의 단편: 2개의 Fab 단편 및 하나의 Fc 단편을 제공한다. 본 발명에서 "Fab"란 용어는 힌지 영역을 포함할 수도, 포함하지 않을 수도 있는 Fab, F(ab) 또는 F(ab')를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 Fab 단편은, 항원에 여전히 결합하지만 Fc 부분 없이 1가인 항체 구조물이다.

항체 도메인은 고유의 구조를 갖거나, 또는 예를 들어 항원 결합 성질 또는 임의의 다른 성질, 예를 들어 안정성 또는 기능성, 예를 들어 Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fc감마 수용체에 대한 결합을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형될 수도 있다. 폴리펩티드 서열은, 고리 서열에 의해 연결되는 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타-가닥으로 이루어지는 베타-배럴 구조를 포함하는 경우, 항체 도메인인 것으로 간주된다.

"항체 포맷"이란 용어는 특히 이중특이성-결합 성질, 즉 표적 항원 CD20 및 CD95에 대해 상기 성질을 나타내는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 것이다.

예시적인 항체 포맷은 도 1에 묘사된 바와 같은 특정한 구조를 갖는다. 상기 포맷은 Fab 단편, CH2 도메인 및 단일 쇄 Fv(scFv) 단편, 특히 VH/VL 배향의 scFv로 구성될 수 있다. 상기 항체 분자는, CH2 도메인이 그의 N-말단을 통해 Fab 단편의 중쇄 CH1 및 VH 도메인 및 그의 C-말단을 통해 scFv 단편에 결합된 주쇄를 가질 수 있다.

상기는 또한 CH2 도메인이 Fab 단편의 경쇄에 결합된, 즉 주쇄가 VL 및 CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 단일 쇄 Fv 단편을 포함하는 주쇄를 포함할 수 있다.

추가의 예는 상기 주쇄가 VL 및 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 scFv 단편을 포함하는 항체 포맷을 지칭한다. 보다 적은 중량의 제2 쇄는 VH 및 CL 도메인을 포함한다. 상기와 같은 항체 포맷에서 상기 Fab 단편은, 상기 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인이 그들 각각의 불변 도메인(각각 CL 또는 CH1)에 융합되는 "고전적인(천연)" Fab 단편이 아니라, 가변 도메인이 "반대 쇄"의 불변 도메인에 융합되는 "하이브리드" Fab 단편이다. 즉 상기 VH 도메인은 CL 도메인에 융합되고 상기 VL 도메인은 CH1 도메인에 융합된다.

추가의 예에 따라, 상기 항체 포맷은 상기 CH2 도메인이 CL 및 VH 도메인에 결합된 주쇄를 갖는 분자를 포함한다. 보다 적은 중량의 제2 쇄는 VL 및 CH1 도메인을 포함한다.

더욱이, 추가의 예에 따라, 상기 항체 포맷은, 예를 들어 단량체성 CH2 도메인, 예를 들어 상기 CH2 도메인 및/또는 힌지 영역 중의 아미노산이 변형된, 예를 들어 쇄-간 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기(인간 IgG-항체에서 C226 및또는 C229, 본 발명에 제공된 바와 같은 아미노산의 넘버링은 카밧 넘버링[EU-인덱스]에 따른다)가 이량체의 형성을 방지하도록 교환된 CH2 도메인을 획득하기 위해서 상기 힌지 및 CH2 도메인에 변형을 포함하는 분자를 포함한다. 예시적인 점 돌연변이는 C226S 및 C229S이다. 하나의 실시태양에서 상기 제1 주쇄의 힌지 도메인과 제2 주쇄의 힌지 도메인 사이의 다이설파이드 결합은, 카밧 넘버링[EU-인덱스]에 따라, 상기 힌지 도메인들 중 하나의 서열 위치 226의 시스테인 잔기 및 서열 위치 229의 시스테인 잔기 중 적어도 하나에 의해 한정된다.

예시적인 항체 포맷은 서열번호 26(경쇄) 및 서열번호 28(중쇄)의 아미노산 서열을 포함한다.

추가의 예는, 예를 들어 E233P 및/또는 L234V 및/또는 L235A 및/또는 G236 결실에 의한, 예를 들어 IgG1에서 IgG2 하위유형으로의 전환에 의한, 가능한 ADCC 및/또는 CDC 활성의 감소를 획득하기 위한 변형에 관한 것이다.

추가의 예는 Fc-수용체, 예를 들어 D265G 및/또는 A327Q 및/또는 A330A에 대한 감소된 결합에 의해 전신 활성화를 감소시키는 변형에 관한 것이다.

추가의 예는 예를 들어 렉틴 수용체에 대한 손상된 결합을 제공하는, K.O. 글리코실화 부위, 예를 들어 N297Q에 의해 면역원성을 감소시키는 변형에 관한 것이다.

"항체 포맷"이란 용어는 구체적으로, 본 발명에서 상이한 표적 항원들에 대한 다른 항체 포맷이 실질적으로 없거나 또는 항체 도메인들의 상이한 구조 배열을 포함하는 것으로 이해되는, 단리된 형태의 항체 포맷을 포함할 것이다. 더욱이, 본 발명에 따라 사용되는 단리된 항체 포맷은, 상기 단리된 항체 포맷과, 예를 들어 적어도 하나의 다른 항체 포맷, 예를 들어 상이한 특이성을 갖는 단클론 항체 또는 항체 단편과의 조합을 함유하는 복합 제제 중에 포함될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 항체 포맷은 재조합 이중특이성 항체 포맷일 수 있으며, 상기 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리되는 모든 항체 포맷, 예를 들어 상이한 기원의 유전자 또는 서열을 포함하는 동물, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물로부터 기원하는 항체, 예를 들어 키메릭, 인간화된 항체, 또는 하이브리도마 유래된 항체를 포함한다. 추가의 예는 항체 포맷을 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체 포맷, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합 복합 라이브러리로부터 단리된 항체 포맷, 또는 다른 DNA 서열에 항체 유전자 서열을 연접시킴을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체 포맷에 관한 것이다.

"항체 포맷"이란 용어는 그의 유도체를 포함하는 것으로 생각된다. 유도체는 본 발명의 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 포맷의 임의의 조합, 및/또는 본 발명의 항체 포맷의 임의의 도메인이 하나 이상의 다른 단백질, 예를 들어 다른 항체 또는 항체 포맷, 예를 들어 CDR 고리를 포함하는 결합 구조, 수용체 폴리펩티드, 또한 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등의 임의의 위치에서 융합될 수 있는 융합 단백질이다. 본 발명의 모듈별 항체의 유도체를 또한 다양한 화학적 기법, 예를 들어 공유 결합, 정전기 상호작용, 다이설파이드 결합 등에 의해 다른 물질에 회합 또는 결합시킴으로써 수득할 수 있다. 상기 면역글로불린에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 PEG, 전구약물 또는 약물)일 수 있다. 본 발명의 특정한 실시태양에서, 본 발명의 항체 포맷은 생물학적으로 허용 가능한 화합물과의 특이적인 상호작용을 허용하는 추가의 태그를 포함하는 유도체이다. 상기 항체 포맷의 그의 표적에의 결합에 대해 부정적인 영향이 없거나 허용 가능한 한, 본 발명에 사용될 수 있는 태그에 관해 특별한 제한은 없다. 적합한 태그의 예는 His-태그, Myc-태그, FLAG-태그, 스트렙(Strep)-태그, 칼모듈린(Calmodulin)-태그, GST-태그, MBP-태그, 및 S-태그를 포함한다.

유도체란 용어는 또한 항체 포맷의 단편, 변이체, 유사체 또는 상동체, 또는 예를 들어 당공학에 의해 생성되는 특정한 글리코실화 패턴을 갖는 항체 포맷을 포함하며, 이들은 기능성이고, 예를 들어 특정한 표적에 결합하고 기능성, 예를 들어 B-세포를 표적화하는 활성, 예를 들어 세포사멸 활성을 갖는 기능성 등가물로서 작용할 수 있다. 더욱이, 바람직한 유도체는 항원 결합에 관하여 기능 활성이고, 바람직하게는 세포사멸 활성을 갖는다.

항체 서열에 관하여 "당공학처리된(glycoengineered)"이란 용어는 당공학의 결과로서 변형된 면역원성 성질, ADCC 및/또는 CDC를 갖는 글리코실화 변이체를 지칭한다. 모든 항체는 중쇄 불변 영역 중의 보존된 위치에서 탄수화물 구조를 함유하며, 이때 각각의 아이소타입은 단백질 조립, 분비 또는 기능 활성에 가변적으로 영향을 미치는 N-결합된 탄수화물 구조의 독특한 배열을 갖는다. IgG1 유형 항체는 각 CH2 도메인 중의 Asn297에 보존된 N 결합된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. 상기 Asn297에 부착된 2개의 복합 2-안테나 올리고사카라이드가 상기 CH2 도메인 사이에 묻혀있으며, 이는 상기 폴리펩타이드 주쇄와 광범위한 접촉을 형성하고, 이들의 존재는 상기 항체가 항체 의존적인 세포 세포독성(ADCC)과 같은 효과기 기능을 매개하는데 필수적이다(Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5 : 813-822 (1995)). N297에서, 예를 들어 N297의, 예를 들어 A 또는 T299로의 돌연변이를 통해, N-글리칸의 제거는 전형적으로 감소된 ADCC와 함께 아글리코실화된(aglycosylated) 항체 포맷을 생성시킨다.

항체 글리코실화에서 큰 차이는 세포주들간에 발생하며, 심지어 작은 차이조차 상이한 배양 조건하에서 증식된 주어진 세포주에 대해 관찰된다. 세균 세포에서 발현은 전형적으로 아글리코실화된 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 항체 포맷은 구체적으로 활성 Fc 부분이 없으며, 따라서 상기는 FCGR 결합 부위를 갖지 않는 항체 도메인들(구체적으로 CH2 및 CH3 도메인의 쇄가 없는 임의의 항체 포맷을 포함한다)로 구성되거나, 또는 예를 들어 Fc 효과기 기능을 감소시키기 위한, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 없애거나 감소시키기 위한 변형에 의해 Fc 효과기 기능이 결여된 항체 도메인을 포함한다. 상기와 같은 변형은 돌연변이 유발, 예를 들어 상기 FCGR 결합 부위에서의 돌연변이에 의해서 또는 항체 포맷의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 방해하는 유도체 또는 작용제에 의해서 수행되어, Fc 효과기 기능의 감소 또는 Fc 효과기 기능의 결여(이는 전형적으로 ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정시, 변형되지 않은(야생형) 포맷의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 효과기 기능을 지칭하는 것으로 이해된다)를 성취할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "B-세포 질환"이란 용어는 다양한 질환들, 예를 들어 비제한적으로 B-세포 암, 자가면역 질환, B-세포 림프종, B-세포 백혈병, 및 다른 질환들을 지칭한다. 자가면역 질환의 구체적인 예는 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 경피증, 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 이식편대 숙주병, 피부근염, I형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 애디슨병, 셀리악병, 크론병, 악성 빈혈, 심상성 천포창, 백반증, 자가면역 용혈성빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반증, 거대세포 동맥염, 중증 근무력증, 다발성 경화증(MS), 바람직하게는 재발 완화형 MS(RRMS), 사구체신염, 굳파스쳐 증후군, 수포성 유사천포창, 궤양성 대장염, 길랑-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초화 다발성신경병증, 항인지질 증후군, 기면증, 유육종증, 및 베게너 육아종증으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명에 따른 항체 포맷은 B 세포 레퍼토리를 조절하여 B 세포의 자가반응성을 감소시킨다. 상기 조절은 단일특이성 항체에 의해 성취되는 경우보다 더 특이적인데, 그 이유는 CD95를 발현하는 활성화된 B 세포에만 영향을 미치고 이것이 결여된 휴지 B 세포에는 영향을 미치지 않기 때문이다. 본 발명에 따른 항체 포맷은 활성화된 B-세포의 세포사멸을 유도하고, 추가로 억제된 활성은 IgG 생산을 유도하고 활성화된 B-세포의 IgG 합성을 억제함이 입증될 수 있었다. 따라서, 자가면역 표적, 예를 들어 자가-항원에 대한 IgG 항체를 생산하는 자가-반응성 B-세포가 유효하게 감소될 수 있다.

본 발명의 이중특이성 항체 포맷에 의해, 악성 B 세포뿐만 아니라, CD95 사멸 수용체를 발현하는 활성화된 정상(양성) B 세포도 표적화되고 고갈될 수 있었다. 대조적으로, 휴지 B 세포는 표적화되지 않았으며, 상기와 같은 정상 B 세포에 대해서는 효과를 관찰할 수 없었다. 이는 활성화된 B 세포가 본 발명의 항체 포맷과 배양 후 세포사멸성 세포사를 겪는데 민감한 CD95임을 가리킨다.

활성화된 B 세포의 고갈은 항체 생산을 억제한다. 이는, 말단 분화된 항체-생산 세포, 즉 혈장 세포가 CD20을 발현하지 않기 때문에 놀라운 것이었다. 상기 활성화된 전구체 B 세포의 억제는 항체 생산의 억제에 명백히 충분하다.

본 발명의 이중특이성 항체 포맷에 의한 항체 생산의 억제는 정상 또는 휴지 B 세포로부터 자가반응성 또는 활성화된 B 세포의 분화 없이, B 세포를 발현하는 모든 CD20을 고갈시키는 리툭시맵(리툭산(등록상표))과 같은 확립된 단일특이성 CD20 항체의 사용에 비해 바람직하다.

본 발명에 따른 항체 또는 항체 포맷에 관하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "결합 부위"란 용어는 항원과 결합 상호작용할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 전형적으로 상기 결합 부위는 다양한 항원들에 대해 결합 기능을 부여하는 다양한 구조를 갖는 특이적인 영역인 항체의 상보성 결정 영역(CDR)(본 발명에서 또한 "CDR 결합 부위"라 칭한다)내에 위치한다. 상기 다양한 구조는 항체의 천연 레퍼토리, 예를 들어 쥐 또는 인간 레퍼토리로부터 유래하거나, 또는 예를 들어 돌연변이 유발 및 구체적으로 무작위화 기법에 의해 재조합적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. 이들은 돌연변이된 CDR 영역, 가변 항체 도메인의 고리 영역, 특히 항체의 CDR 고리, 예를 들어 VL 및/또는 VH 항체 도메인 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 고리를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 항체 포맷은 전형적으로, 각각 항원에 특이적인 하나 이상의 CDR 결합 부위를 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "특이성" 또는 "이중특이성"이란 용어는 분자의 이종 집단에서 관심 동족 리간드를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건, 예를 들어 면역분석 조건 하에서, 특정한 표적에 특이적으로 결합하는 항체 포맷은 샘플 중에 존재하는 다른 분자에는 유의수준의 양으로 결합하지 않는다.

특이적인 결합 부위는 전형적으로는 다른 표적과 교차-반응하지 않는다. 더욱이, 상기 특이적인 결합 부위는 상기 표적의 하나 이상의 에피토프, 동형 또는 변이체에 특이적으로 결합하거나, 또는 다른 관련된 표적 항원, 예를 들어 상동체 또는 유사체에 교차 반응성일 수 있다.

상기 특이적인 결합은 결합이 선택시, 표적 동일성, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화성 또는 결합활성에 관해 선택성임을 의미한다. 선택성 결합은 대개 상기 결합 상수 또는 결합 역학이 적어도 10배 상이한 경우, 바람직하게는 상기 차이가 적어도 100배, 보다 바람직하게는 적어도 1000배인 경우 성취된다.

본 발명의 이중특이성 항체 포맷은 구체적으로 특이적인 결합 성질을 갖는 2개의 부위를 포함하며, 여기에서 2개의 상이한 표적 항원이 상기 항체 포맷에 의해 인식된다. 따라서, 예시적인 이중특이성 항체 포맷은 2개의 결합 부위를 포함하며, 여기에서 상기 결합 부위는 각각 상이한 항원, 예를 들어 B-세포의 사멸 수용체 및 세포 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.

항체 또는 항체 포맷의 결합 부위에 관하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "1가"란 용어는 표적 항원에 대해 단지 하나의 결합 부위만을 포함하는 분자를 지칭한다. "결합가"란 용어는 따라서, 항원의 동일하거나 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 동일한 표적 항원에 대한 결합 부위의 수로서 이해된다.

본 발명의 항체 포맷은 사멸 수용체 표적에 특이적으로 결합하는 1가 결합 부위 및 B-세포, 특히 자가반응성 B-세포상에서 발현된 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 또 다른 1가 결합 부위를 포함하는 것으로 이해된다.

"표적" 또는 "표적 항원"에 관하여 본 발명에서 호환적으로 사용되는 바와 같은 "항원"이란 용어는 항체 결합 부위에 의해 인식되는 전체 표적 분자 또는 상기와 같은 분자의 단편을 지칭할 것이다. 구체적으로, 면역학적으로 관련된 항원의 하위구조들, 예를 들어 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조(일반적으로 "에피토프", 예를 들어 B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프라 지칭된다)가 상기와 같은 결합 부위에 의해 인식될 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "에피토프"란 용어는 특히 본 발명의 항체 포맷의 결합 부위에 대한 특이적인 결합 짝을 전적으로 구성하거나 또는 특이적인 결합 짝의 일부일 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드 구조, 지방산, 유기, 생화학 또는 무기 물질 또는 이들의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩티드 구조물, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 중에 포함되는 경우, 상기는 대개 적어도 3 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40 아미노산, 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 20 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형이거나 또는 형태적인 에피토프일 수있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물 쇄의 1차 서열의 단일 분절로 구성된다. 선형 에피토프는 연속적이거나 중복될 수 있다. 형태적인 에피토프는 상기 폴리펩티드를 접어 3차 구조를 형성시킴으로써 함께 묶인 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며 선형 서열에서 서로 인접할 필요는 없다.

본 발명에 사용된 바와 같은 B-세포에 관하여 "세포 표면 항원"이란 용어는 결합되는 길항물질에 의해 표적화될 수 있는 B-세포, 바람직하게는 성숙하거나, 활성화되거나 또는 자가-반응성인 B-세포의 표면상에서 발현되는 항원을 지칭할 것이다. CD20은 본 발명의 항체 포맷에 의해 표적화되는 예시적인 B-세포 표면 마커로 간주된다.

CD20에 특이적으로 결합하는 결합 부위는 상기 항원에 대한 상업적으로 입수할 수 있는 단클론 항체, 예를 들어 CD20에 대한 리툭시맵 또는 오크렐리주맵으로부터 유래할 수 있다. 구체적으로 도 2에 예시된 바와 같은 항-CD20 항체 포맷 중 어느 하나로부터 유래한 결합 부위를 사용할 수 있다.

"CD20"이란 용어는 CD20 유전자로 형질감염된 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 또는 상기 세포 상에서 발현된 인간 CD20의 임의의 변이체, 동형 및 종 상동체를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같은 "CD95"란 용어와 호환적으로 사용되는 "사멸 수용체"란 용어는 본 발명에서 하나 이상의 세포사멸 경로에 의해 프로그램화된 세포사를 도출하는 세포의 표면상의 수용체로부터 유래한 항원을 지칭한다. 활성화된 B 세포와 대조적으로, CD95는 정상 휴지 B 세포 상에서는 발현되지 않는 것으로 밝혀졌다.

CD95는 또한 Fas 또는 Apo-1, 및 종양 괴사인자 수용체 상과의 일원으로서 공지되어 있다. CD95에 특이적으로 결합하는 결합 부위는, 예를 들어 독일 헤르포트 소재의 아크리스 안티바디스(Acris Antibodies)에 의해 배급된 클론 APO-1 또는 LT95 및 DX2와 같은, CD95에 대한 항체로부터 유래할 수 있다. 구체적으로 도 2에 예시된 바와 같은 항-CD95 항체 포맷 중 어느 하나로부터 유래한 결합 부위를 사용할 수 있다.

"CD95"란 용어는 CD95 유전자로 형질감염된 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 또는 상기 세포 상에서 발현된 인간 CD95의 임의의 변이체, 동형 및 종 상동체를 포함한다.

"변이체"란 용어는, 예를 들어 부위-지향 돌연변이유발 방법에 의해 수득된, 특히 항체 효과기 기능 또는 반감기를 조작하기 위해 불변 도메인에서, 또는 항원-결합 성질을 개선시키기 위해 가변 도메인에서, 예를 들어 친화성 성숙화 기법에 의해 아미노산 서열이 결실되거나, 교환되거나, 특정한 항체 영역내로 삽입되거나 또는 화학적으로 유도체화된 돌연변이체를 지칭한다. 상기 공지된 돌연변이유발 방법 중 어느 하나, 예를 들어 무작위화 기법에 의해 획득되는, 목적하는 위치에서의 점 돌연변이를 사용할 수 있다. 일부의 경우에 위치를, 예를 들어 가능한 아미노산 중 어느 하나에 의해서, 또는 항체 서열을 무작위화하기 위한 바람직한 아미노산의 선택에 의해서 무작위로 선택한다. "변이체"란 용어는 구체적으로 기능 활성 변이체를 포함할 것이다.

분자, 예를 들어 본 발명에 사용되는 바와 같은 항체의 "기능 활성 변이체"란 용어는 서열내에서 또는 상기 서열의 원위 단부들 중 어느 하나 또는 둘 모두에서 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 유도체화에 의해 상기 서열(모 서열)의 변형으로부터 생성되는 서열을 의미하며, 상기 변형은 상기 서열의 활성에 영향(특히 손상)을 미치지 않는다. 선택된 표적 항원에 대한 특이성을 갖는 결합 부위의 경우에, 분자의 기능 활성 변이체는, 예를 들어 특정한 에피토프에 대한 높은 특이성, 친화성, 결합 활성, Kon 또는 Koff율 등이 변할 수 있지만, 여전히 소정의 결합 특이성을 가질 것이다.

기능 활성 변이체는 모 항체 포맷의 서열, 예를 들어 도 2의 서열들 중 어느 하나, 예를 들어 도 2e i) 또는 ii)의 NA-C20 또는 노보탈그 서열을 변화시킴으로써 수득될 수 있으며, 각 서열에 의해 나타나는 활성, 예를 들어 CD20 및/또는 CD95에 결합하거나 또는 활성화된 또는 자가-반응성 B-세포를 표적화하는 능력과 유사한 생물 활성을 가짐으로써 특성화된다.

상기 항체 포맷의 기능 활성 변이체는 바람직하게는 활성화된 또는 자가-반응성 B-세포를 표적화하는 특정한 결합 분석 또는 기능 시험에 의해 측정된 바와 같이, 실질적으로 동일한 생물 활성을 갖는다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 동일한 생물 활성"이란 용어는 상기 실질적으로 동일한 활성에 의해 나타나는 바와 같은 활성이, 모 항체 포맷, 예를 들어 도 2e의 재조합 이중특이성 항체 포맷 NA-C20 또는 노보탈그에 대해 측정된 바와 같은 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 100%, 또는 적어도 110%, 또는 적어도 120%, 또는 적어도 130%, 또는 적어도 140%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 160%, 또는 적어도 170%, 또는 적어도 180%, 또는 적어도 190%, 예를 들어 200% 이하임을 지칭한다.

바람직한 실시태양에서 상기 기능 활성 변이체는

a) 상기 분자의 생물 활성 단편이며, 상기 단편은 상기 분자의 서열의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%를 포함하고;

b) 적어도 하나의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 상기 분자로부터 유래하며, 여기에서 상기 기능 활성 변이체는 상기 분자 또는 그의 부분, 예를 들어 항체에 대해 적어도 50%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;

c) 상기 분자 또는 그의 기능 활성 변이체 및 추가로 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 이종성인 적어도 하나의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어지며, 바람직하게는 여기에서 상기 기능 활성 변이체는 천연 또는 재조합 항-CD19, 항-CD20, 항-CD40 및/또는 항-CD95 항체 중 어느 하나로부터 유래한다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체의 기능 활성 변이체는 상술한 변이체와 필수적으로 동일하지만, 상이한 종의 상동성 서열로부터 유래한다는 점에서, 각각 그의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열과 상이하다. 이들을 천연 변이체라 칭한다.

본 발명은 구체적으로 키메릭, 인간화된 또는 인간 서열 및 상기와 같은 키메릭, 인간화된 또는 인간 서열을 포함하는 모 항체 포맷의 기능 활성 변이체를 제공한다.

본 발명의 항체 포맷에 관하여 사용되는 바와 같은 "키메릭"이란 용어는 중쇄 및 경쇄의 각 아미노산 서열들의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 특정 부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 상동성인 반면, 상기 쇄의 나머지 분절은 또 다른 종 또는 부류 중의 상응하는 서열과 상동성인 항체들을 지칭한다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 포유동물의 한 종으로부터 유래한 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 또 다른 것으로부터 유래한 항체의 서열에 상동성이다. 예를 들어, 상기 가변 영역은 쉽게 입수할 수 있는 B-세포, 또는 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래한 불변 영역과 함께 비-인간 숙주 유기체로부터의 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 유래할 수 있다.

본 발명의 항체 포맷에 관하여 사용되는 바와 같은 "인간화된"이란 용어는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기에서 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 기본으로 한다. 상기 항원 결합 부위는 불변 도메인상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나 또는 오직 상기 가변 도메인 중의 적합한 프레임워크 영역상에 그래프트화된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 또는 상기 부위를 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형시킬 수 있고, 바람직하게는 인간 면역글로불린에 보다 가깝게 닮도록 변형시킬 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열들(예를 들어 마우스 항체로부터의 6개 CDR을 모두 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태는 원래 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR을 갖는다.

본 발명의 항체 포맷에 관하여 사용되는 바와 같은 "인간"이란 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 인간 항체 포맷은, 예를 들어 CDR 중의 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수도 있다. 본 발명의 인간 항체 포맷은 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 트랜스제닉인 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.

"기능 활성 변이체"란 용어는 또한 천연 대립유전자 변이체뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비천연 변이체를 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 (폴리)펩티드의 생물 기능을 필수적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 가짐을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드의 또 다른 형태이다.

기능 활성 변이체를, 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 중의 서열 변경에 의해서, 예를 들어 하나 이상의 점 돌연변이에 의해서 수득할 수 있으며, 여기에서 상기 서열 변경은 본 발명과 함께 사용될 때, 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 유지한다. 상기와 같은 서열 변경은 비제한적으로 (보존적인) 치환, 첨가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있다.

CDR 변이체는 하나 이상의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 상기 변형은 상기 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적 변경일 수 있고, 상기 변형은 상기 변이체가 변형되지 않은 서열의 생물학적 특성을 유지하게 한다. 예를 들어, 상기 변이체는 CD19, CD20, CD40 또는 CD95에 결합하는 기능 변이체이다. 상기 CDR 아미노산 서열의 부분적인 변경은 1 내지 7개 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 1 내지 7개 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 첨가 또는 삽입, 또는 1 내지 7개 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 화학적 유도체화, 또는 이들의 조합에 의할 수 있다. 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환일 수 있다. 예를 들어 하나의 소수성 아미노산의 또 다른 소수성 아미노산에 대한 치환일 수 있다.

보존적 치환은 측쇄 및 화학적 성질과 관련하여 아미노산 계열내에서 발생하는 것들이다. 상기와 같은 계열의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비극성 지방족 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 하전되지 않은 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산들이다.

점 돌연변이는 특히, 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 단일(비-연속적인) 또는 한 쌍의 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입이, 조작되지 않은 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열의 발현을 생성시키는 폴리뉴클레오티드의 조작으로서 이해된다.

바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산들의 교환을 지칭한다. 이에 관하여, 아미노산은 64개의 트리플렛 코돈에 의해 암호화되는 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이들 20개 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 것들로 분류될 수 있다:

"중성" 아미노산들을 하기에 이들 각각의 3-문자 및 단-문자 코드 및 극성과 함께 나타낸다:

알라닌: (Ala,A) 비극성, 중성;

아스파라진: (Asn,N) 극성, 중성;

시스테인: (Cys,C) 비극성, 중성;

글루타민: (Gln,Q) 극성, 중성;

글리신: (Gly,G) 비극성, 중성;

아이소류신: (Ile,I) 비극성, 중성;

류신: (Leu,L) 비극성, 중성;

메티오닌: (Met,M) 비극성, 중성;

페닐알라닌: (Phe,F) 비극성, 중성;

프롤린: (Pro,P) 비극성, 중성;

세린: (Ser,S) 극성, 중성;

쓰레오닌: (Thr,T) 극성, 중성;

트립토판: (Trp,W) 비극성, 중성;

타이로신: (Tyr,Y) 극성, 중성;

발린: (Val,V) 비극성, 중성; 및

히스티딘: (His,H) 극성, 양성(10%) 중성(90%).

"양으로" 하전된 아미노산은

아르기닌: (Arg,R) 극성, 양성; 및

리신: (Lys,K) 극성, 양성이다.

"음으로" 하전된 아미노산은

아스파트산: (Asp,D) 극성, 음성; 및

글루탐산: (Glu,E) 극성, 음성이다.

본 발명에서 나타낸 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 일치 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대 서열 일치 퍼센트를 성취하도록 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 특정한 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 상기 서열 동일성의 부분으로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않는다. 당해 분야의 숙련가들은 비교하는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 포함하여, 정렬을 측정하기에 적합한 매개변수들을 측정할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "개체"란 용어는 온혈 포유동물, 특히 인간을 지칭한다. 특히 본 발명의 의학적 사용 포맷 또는 각각의 치료 방법을 B-세포 질환 또는 B-세포 질환과 관련된 질병 상태의 예방 또는 치료가 필요한 개체에게 적용한다. 상기 개체는 초기 또는 말기 질병을 앓는 환자이거나 또는 달리, 예를 들어 유전적 소인에 의해 상기와 같은 질병에 걸리기 쉬운 개체일 수 있다.

특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체 포맷은 세포사멸 활성, 즉 면역-효과기 세포, 예를 들어 NK 세포와 독립적으로 표적 B-세포에 대해 직접적인 세포독성 활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 항체 포맷은 표준 세포사멸 분석에서 측정시, 예를 들어 표준 DNA 단편화 분석에서 측정시 세포사멸 활성을 갖는다.

상기 세포사멸 활성을 바람직하게는 죽어가는 및/또는 죽은 세포의 표준 측정 방법을 사용하여 측정한다. 세포사멸을 측정하기 위해서, 세포독성 분석을 사용할 수 있다. 이들 분석은, 죽어가는 세포는 새게(leaky) 되기 때문에 혈장 막 투과성의 증가를 측정하는 방사성 및 비-방사성 분석, 또는 미토콘드리아의 대사 활성의 감소를 측정하는 비색 분석일 수 있다. 죽은 세포의 미토콘드리아는 염료를 대사할 수 없는 반면, 살아있는 세포에서 미토콘드리아는 대사할 수 있다.

또한, 세포 표면의 밖에서 포스파티딜세린을 출현시키는 막 비대칭의 변경과 같은 세포사멸에 대한 조기 지표를 측정할 수 있다(아넥신(Annexin) V 기본 분석). 한편으로, 보다 늦은 세포사멸 단계, 예를 들어 카스파제의 활성화가 세포 집단에서 또는 개별적인 세포에서 측정될 수 있다. 또한, 미토콘드리아 또는 염색체 DNA의 단편화에 의한 세포질내로의 시토크롬 C 및 AIF의 방출 측정을 측정할 수 있다.

말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 표지화(TUNEL)가 세포사멸 신호전달 캐스케이드로부터 생성되는 DNA 단편화를 측정하는 통상적인 방법이다. 상기 분석은 특정한 표지된 항체에 의해 부차적으로 검출되는 브로몰화된 dUTP의 첨가를 촉매화하는 효소인 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제에 의해 확인될 수 있는 NDA 중의 닉의 존재에 따른다.

본 발명에 따른 항체 포맷의 바람직한 세포사멸 활성은, 예를 들어 유식 세포측정에 의해 이중특이성 항체와 배양 후의 B 세포의 생존을 측정하는 각각의 생체외 세포 살해 분석에서 측정시, 세포용해의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 50%에 달한다.

구체적으로, 본 발명의 항체 포맷은 Fc 효과기 기능이 없으며, 예를 들어 세포 표면상에서 수용체 표적을 발현하는 세포를 사용하는 표준 ADCC 또는 CDC 분석에서 측정시, 면역-효과기 세포의 존재 하에서 그다지 세포독성 활성을 갖지 않을 것이다.

대조군에 비해 세포용해의 백분율의 현저한 증가가 없는 경우 본 발명의 임의의 항체 포맷에 대해 ADCC 또는 CDC 분석에 의해 측정된 바와 같은 낮은 세포독성 활성이 나타날 수 있다. Fc 효과기 기능의 결여는 전형적으로, 상기 ADCC 및/또는 CDC 활성의 절대 증가 백분율에 의해 측정된 바와 같은 세포독성 활성이 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 3% 미만인 경우 결정된다.

바람직하게, 표적 항원 중 하나 또는 2개 모두에 높은 친화성, 특히 높은 온 및/또는 낮은 오프율, 또는 높은 결합 활성으로 결합하는 항체 포맷이 사용된다. 항체의 결합 친화성은 대개, 항원 결합 부위의 절반이 점유되는, 해리 상수(Kd, 또는 KD)로서 공지된 항체의 농도에 의해 특성화된다. 대개 결합제는 Kd<10^-8M, 바람직하게는 Kd<10^-9M, 훨씬 더 바람직하게는 Kd<10^-10M을 갖는 높은 친화성 결합제가 고려된다.

더욱이, 한편으로 바람직한 실시태양에서 상기 개별적인 항원 결합 친화성은, 예를 들어 적어도 2개의 항원에 결합시, 중간 친화성, 예를 들어 10^-6M 미만 및 10^-8M 이하의 Kd를 갖는다.

본 발명의 이중특이성 단클론 항체 포맷을 다양한 기법들, 예를 들어 임의로 하이브리드마 또는 인간 항체 서열들의 라이브러리를 사용하는 재조합 항체 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 재조합 항체 기술이 형질감염된 세포에 의한 재현 가능한 생산 및 단순화된 정제를 허용하기 때문에 바람직하다.

본 발명의 항체 포맷은 구체적으로 약학 조성물 중에서 제공된다. 본 발명의 항체 포맷 및 하나 이상의 치료 활성제를 제형화시킨 약학 조성물이 고려된다. 본 발명의 항체 포맷의 안정한 제형을, 목적하는 순도의 항체 포맷을 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 함께 혼합함으로써, 동결건조된 제형, 수용액 또는 수중 유적형 유화액의 형태로 보관용으로 제조한다.

전형적으로 상기와 같은 조성물은 허용 가능한 약학적 관행에 공지되고 상기 관행에 의해 요구되는 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어 문헌[Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co.]을 참조하시오. 상기와 같은 담체의 예는 멸균 담체, 예를 들어 5 내지 8 범위의 pH로 적합한 완충제로 임의로 완충된 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균이 필요할 것이다. 이는 멸균 여과 멤브레인 또는 다른 적합한 방법을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다.

본 발명의 항체 포맷을 포함하는 약학 조성물의 투여를 다양한 방식으로, 예를 들어 전신 또는 비경구 투여로, 바람직하게는 멸균 수용액의 형태로, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 경로에 의해서, 또한 경구, 비내, 안내, 경피, 점막, 국소(예를 들어 젤, 연고, 로션, 크림 등), 복강내, 근육내, 폐내, 질, 비경구, 직장 또는 안내로 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기와 같은 사용에 적합한 각각의 제형 중의 상기 항체 포맷을 제공한다.

본 발명은 활성 물질로서 본 발명의 항체 포맷을 치료 유효량으로 함유하는 약학 제제를 포함한다. 특히, 상기 항체 포맷의 약학적으로 허용 가능한 제형은 상기 제형이 필요한 개체의 치료에 적합하다.

본 발명에서 본 발명의 항체 포맷의 "유효량" 또는 "충분량"이란 용어들 중 어느 하나와 호환가능하게 사용되는 "치료 유효량"이란 용어는, 개체에게 투여시, 임상 결과를 포함하여 이롭거나 또는 목적하는 결과를 성취하기에 충분한 양 또는 활성이며, 유효량 또는 그의 유의어는, 그 자체로서, 상기가 적용되는 상황에 따라 변한다. 질병과 관련하여, 상기 항체 포맷의 치료 유효량을 사용하여, 예를 들어 자가면역 반응의 억제를 위해 과잉 B-세포의 하향 조절 또는 감소가 이로운 질병 또는 상태, 예를 들어 자가-반응성 B-세포 질환과 관련된 급성 또는 만성 염증성 질병을 치료, 조절, 약화, 역전시키거나 상기 질병에 영향을 미칠 수 있다. 유효량은 상기와 같은 질병 또는 질환의 치료, 예방 또는 억제에 충분한 화합물의 양을 의미하고자 한다. 상기와 같은 양에 상응하는 상기 항체 포맷의 양은 다양한 인자들, 예를 들어 제공되는 약물 또는 화합물, 약학 제형, 투여 경로, 질병 또는 질환의 유형, 치료되는 개체 또는 숙주의 정체 등에 따라 변할 것이나, 그럼에도 불구하고 상기 량은 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 결정될 수 있다.

더욱이, 치료 유효량의 본 발명의 항체 포맷에 의한 개체의 치료 또는 예방 섭생은 단일 투여로 이루어지거나, 또는 한편으로 일련의 적용을 포함한다. 예를 들어, 상기 항체 포맷을 1년에 적어도 1회, 반년에 적어도 1회 또는 한 달에 적어도 1회 투여할 수 있다. 그러나, 또 다른 실시태양에서, 상기 항체 포맷을 상기 개체에게 주어진 치료를 위해 주당 약 1회 내지 매일 약 1회 투여할 수 있다. 상기 치료 기간의 길이는 다양한 인자들, 예를 들어 질병의 중증도, 환자의 연령, 상기 항체 포맷의 농도 및 활성에 따라 변한다. 또한, 상기 치료 또는 예방에 사용되는 유효 투여량을 특정한 치료 또는 예방 섭생의 과정에 걸쳐 증가시키거나 감소시킬 수 있음을 알 것이다. 투여량의 변화를 생성시킬 수 있으며, 상기 변화는 당해 분야에 공지된 표준 진단 분석에 의해 자명해질 것이다. 일부 예에서, 만성 투여가 필요할 수도 있다.

상기 항체 포맷이 필요한 인간 환자에게 제공되는 바와 같은 상기 항체 포맷의 치료 유효량은 구체적으로 0.5 내지 500 ㎎, 바람직하게는 1 내지 400 ㎎, 훨씬 더 바람직하게는 300 ㎎ 이하, 200 ㎎ 이하, 100 ㎎ 이하 또는 10 ㎎ 이하의 범위일 수 있지만, 예를 들어 급성 질병 상태의 치료를 위해서 보다 높은 용량이 지시될 수도 있다.

비경구 투여를 위해 사용되는 바와 같은 예시적인 제형은, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액으로서 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 것들을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체 포맷은, 예를 들어 질병 개질 단독요법으로서, 환자에게 투여되는 유일한 치료 활성제이다.

한편으로, 본 발명에 따른 항체 포맷을 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어 비제한적으로 표준 치료, 예를 들어 악성 질병의 경우 화학요법제, 또는 MS의 경우 인터페론-베타 또는 스테로이드, 또는 ITP의 경우 고 용량 면역글로불린과 함께 투여한다.

복합 요법은 특히, 예를 들어 RRMS의 치료에 사용되는 바와 같은 표준 섭생을 사용한다. 이는 인터페론-베타 또는 스테로이드를 포함할 수 있다.

복합 요법에서, 상기 항체 포맷을 혼합물로서, 또는 하나 이상의 다른 치료 섭생과 동반하여, 예를 들어 동반 요법 전에, 상기 요법과 동시에, 또는 상기 요법 후에 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 항체 포맷의 생물학적 성질들을 세포, 조직 및 전체 유기체 실험에서 생체외에서 특성화할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 약물을 종종, 질병 또는 질병 모델에 대한 약물의 치료 효능을 측정하거나 또는 약물의 약동학, 약역학, 독성 및 다른 성질들을 측정하기 위해서, 동물, 예를 들어 비제한적으로 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이에서 생체내에서 시험한다. 상기 동물을 질병 모델이라 칭할 수 있다. 치료제들을 종종 마우스, 예를 들어 비제한적으로 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스, 및 트랜스제닉 마우스(녹인 및 녹아웃 포함)에서 시험한다. 상기와 같은 실험은 적합한 반감기, 효과기 기능, 세포사멸 활성 및 IgG 억제 활성을 갖는 치료제로서 사용되는 상기 항체 포맷의 가능성의 결정을 위해 의미있는 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물을 시험에 사용할 수 있다. 예를 들어 인간과의 유전적 유사성 때문에, 영장류인 원숭이가 적합한 치료 모델일 수 있으며, 따라서 상기를 본 발명에 따른 항체 포맷의 효능, 독성, 약동학, 약역학, 반감기 또는 다른 성질의 시험에 사용할 수 있다. 인간에서의 물질 시험은 약물로서의 승인을 위해 최종적으로는 요구되며, 이들 실험을 본 발명에서 고려한다. 따라서 본 발명의 항체 포맷을 그의 치료 효능, 독성, 면역원성, 약동학 및/또는 다른 임상 성질의 측정을 위해서 동물 모델 또는 인간에서 시험할 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 생산 및 특성화 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체 변이체를 생성시키고 본 발명의 항체 포맷을 발현하는 세포를 사용하는 하나 이상의 세포-기본 분석 또는 생체내 분석을 사용하여 사전 정의된 성질들에 대해 선별한다. 상기와 같은 분석은 종종 상기 항체에 대한 세포의 반응, 예를 들어 세포 생존, 세포사, 세포 형태의 변화, 또는 전사 활성화, 예를 들어 천연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포 발현을 모니터함을 포함한다.

이들 분석은 전형적으로 상기 항체 포맷의 기능; 즉, 본 발명의 항체의 존재 또는 부재 하에서, 예를 들어 동일한 세포상에서 표적 항원에 결합하고 일부 생화학적 사건을 매개하는, 예를 들어 경쟁 결합 분석에서 상기 세포의 세포사멸 또는 억제, B-세포 결합 억제 또는 IgG 발현의 감소를 매개하는 상기 항체 포맷의 능력에 근거한다.

세포사 또는 생육력을 모니터하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 염료, 면역화학, 세포화학 및 방사성 시약의 사용을 포함한다. 예를 들어, 카스파제 염색 분석은 세포사멸을 측정할 수 있게 하며, 방사성 기질 또는 형광 염료, 예를 들어 알라마르 블루의 흡수 또는 방출은 세포 성장 또는 활성화를 모니터할 수 있게 한다.

전사 활성화가 또한 세포-기본 분석에서 기능의 분석 방법으로서 소용될 수 있다. 이 경우에, 상향조절될 수 있는 천연 유전자 또는 면역글로불린을 분석함으로써 반응을 모니터할 수 있다. 예를 들어 몇몇 인터류킨의 방출을 측정하거나, 또는 한편으로 리포터 구조물을 통해 판독을 수행할 수 있다. 세포-기본 분석은 또한 본 발명에 따른 항체의 존재에 대한 반응으로서 세포의 형태 변화의 측정을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 포맷의 재조합 생산은 바람직하게는 발현 시스템, 예를 들어 상기 항체 포맷을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구조물 또는 벡터를 사용한다.

"발현 시스템"이란 용어는 목적하는 암호화 서열 및 조절 서열을 작동가능한 결합으로 함유하여, 이들 서열로 형질전환되거나 형질감염된 숙주가 상기 암호화된 단백질을 생산할 수 있도록 하는 핵산 분자를 지칭한다. 형질전환을 수행하기 위해서, 상기 발현 시스템은 벡터상에 포함될 수 있으나; 이어서 관련 DNA를 또한 숙주 염색체에 통합시킬 수도 있다. 한편으로, 발현 시스템을 시험관내 전사/번역에 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 "발현 구조물" 또는 "벡터"는 적합한 숙주 유기체에서 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 그의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로서 정의된다. 발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 추가로 대개는 숙주 세포 또는 게놈 통합 부위에서 자율 복제를 위한 기원, 하나 이상의 선택성 마커(예를 들어 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 가나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결자(이들 성분은 함께 작동적으로 연결된다)를 포함한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "플라스미드" 및 "벡터"란 용어는 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 뉴클레오티드 서열을 갖는 게놈을 포함한다.

구체적으로 상기 용어는 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어 외래 유전자), 예를 들어 본 발명의 항체 포맷을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포내에 도입시켜, 상기 숙주를 형질전환시키고 상기 도입된 서열의 발현(예를 들어 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다. 플라스미드가 본 발명의 바람직한 벡터이다.

벡터는 전형적으로 외래 DNA가 삽입되는 전달제의 DNA를 포함한다. DNA의 한 분절을 DNA의 또 다른 분절내로 삽입하는 통상적인 방식은, DNA를 제한 부위라 칭하는 특정한 부위(뉴클레오티드의 특정한 기)에서 절단하는, 제한 효소라 칭하는 효소의 사용을 수반한다. "카세트"는 한정된 제한 부위에서 벡터내에 삽입시킬 수 있는 발현 산물을 암호화하는 DNA의 DNA 암호화 서열 또는 분절을 지칭한다. 상기 카세트 제한 부위는 적합한 판독 프레임 중에 상기 카세트가 확실히 삽입되도록 설계된다. 일반적으로, 외래 DNA는 상기 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에서 삽입되고, 이어서 상기 벡터에 의해 전달성 벡터 DNA와 함께 숙주 세포내로 운반된다. 삽입되거나 첨가된 DNA를 갖는 DNA의 분절 또는 서열, 예를 들어 발현 벡터를 또한 "DNA 구조물"이라 칭할 수 있다. 통상적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로 추가적인(외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포내로 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자립 분자이다. 본 발명의 벡터는 종종 암호화 DNA 및 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터 DNA를 함유하며, 외래 DNA의 삽입에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 암호화 DNA는 특정한 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 본 발명의 항체 포맷에 대한 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 상기 암호화 DNA의 발현을 개시하거나, 조절하거나, 또는 달리 매개하거나 관리하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 암호화 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 있을 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 있을 수 있다. 본 발명의 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.

DNA 서열들을 연결시키는데 사용되는 과정들, 예를 들어 본 발명의 인자들 및/또는 POI, 프로모터, 종결자 및 추가의 서열을 각각 제공하거나 암호화하고, 이들을 통합 또는 숙주 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터에 삽입하는데 사용되는 과정들은 예를 들어 문헌[J. Sambrook et al., "Molecular Cloning 2nd ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 개시된 바와 같이, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "세포주"란 용어는 연장된 기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. "숙주 세포주"란 용어는 폴리펩티드, 예를 들어 본 발명의 재조합 항체 포맷을 생산하도록 내인성 또는 재조합 유전자를 발현시키는데 사용되는 세포주를 지칭한다. "생산 숙주 세포주" 또는 "생산 세포주"는 생산 과정의 산물, 본 발명의 재조합 항체 포맷을 수득하기 위해 생물반응기에서 배양시킬 준비가 된 세포주인 것으로 통상적으로 이해된다.

숙주 세포는 구체적으로 발현 구조물, 예를 들어 본 발명에 따른 벡터로 형질감염된 제조합 세포 또는 세포주로서 이해된다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합"은 "유전 공학에 의해 제조됨" 또는 "유전 공학의 결과", 예를 들어 구체적으로 재조합 벡터 또는 재조합 숙주 세포에 통합된 이종 서열을 사용함을 의미할 것이다.

본 발명의 이중특이성 단클론 항체 포맷은 임의의 공지되고 잘-확립된 발현 시스템 및 재조합 세포 배양 기술을 사용하여, 예를 들어 세균 숙주(원핵생물계) 또는 진핵생물계, 예를 들어 효모, 진균, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서의 발현에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 항체 분자를 트랜스제닉 유기체, 예를 들어 염소, 식물 또는 제노마우스(XENOMOUSE) 트랜스제닉 마우스, 인간 면역글로불린 유전자 좌의 큰 단편을 갖고 마우스 항체 생산에 결함이 있는 조작된 마우스 계통에서 생성시킬 수 있다. 항체를 또한 화학 합성에 의해서 생성시킬 수도 있다.

특정한 실시태양에 따라, 상기 숙주 세포는 CHO, PerC6, CAP, HEK, HeLa, NS0, SP2/0, 하이브리도마 및 주르캣(Jurkat)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포의 생산 세포주이다. 보다 구체적으로, 상기 숙주 세포를 CHO-K1, CHO-DG44 또는 CHO-S 세포로부터 수득한다.

중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 항체 생산에 가장 통상적으로 사용되어 왔다. 상기 세포는 적합한 글리코실화 패턴을 제공하는 것 외에, 유전적으로 안정하고, 고도로 생산성인 클론성 세포주의 일관된 발생을 허용한다. 상기 세포를 무혈청 배지를 사용하여 간단한 생물반응기에서 높은 밀도로 배양할 수 있으며 상기 세포는 안전하고 재생산성인 생물공정의 개발을 허용한다.

본 발명의 숙주 세포를 특히, 예를 들어 혈청에 대한 대안으로서 다른 성분들, 예를 들어 혈장 단백질, 호르몬 및 성장 인자를 포함하는 무혈청 배양물 중에서 배양하거나 유지시킬 수 있다.

숙주 세포는 무혈청 조건하에서 및 임의로 동물 기원의 어떠한 단백질/펩티드도 없는 배지에서 확립되고, 적응되고, 완전하게 배양될 때 가장 바람직하다.

상기 설명은 하기의 실시예들을 참고로 보다 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이와 같은 실시예들은 단지 본 발명의 하나 이상의 실시태양을 실시하는 방법을 나타낼 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 판단해서는 안 된다.

실시예

실시예 1: CD20 및 CD90에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 항체 형성의 생성

키메릭 버전(NA-20이라 칭함)

키메릭 경쇄(마우스 항CD95-VJ/인간 CL; 서열번호 21) 및 키메릭 중쇄(마우스 항CD95-VDJ/인간 CH1/힌지/변형된 CH2/항 CD20 VHVL; 서열번호 23)를 암호화하는 아미노산 서열을 SP2/0 세포주에서 성공적으로 발현시켰다. 상기 단백질은 상기 이중특이성 항 CD95XCD20 항체 유도체로부터 정확하게 조립된 뉴클레오티드 서열 서열번호 22 및 서열번호 25에 의해 암호화된다. 이를 웨스턴 블럿에서 인간 IgG1 및 인간 카파 경쇄에 특이적인 항체에 의한 검출에 의해 확인하였다. 추가의 특성화를 위한 단백질을 친화성 크로마토그래피(캡톨(CaptoL), GE 헬쓰케어)에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.

인간화된 버전(노보탈그라 칭함)

인간화된 CD95-VJ/인간 CL(서열번호 26) 및 인간화된 CD95-VDJ-CH1-H-CH/인간화된 CD20scFv(서열번호 28)를 암호화하는 아미노산 서열을 nt 서열로 역 번역하였으며 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)에 대해 코돈-최적화하였다. 상응하는 뉴클레오티드 서열을 서열번호 27 및 서열번호 29로서 나열한다. 합성 유전자를 설계하고, 합성하고, 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포주의 형질감염을 위해 적합한 발현 벡터내로 클로닝하였다. 상기 두 서열 모두 성공적으로 발현되고 조립되어 상기의 이중특이성 항체 유도체를 형성하였다. 이를 웨스턴 블럿에서 인간 IgG1 및 인간 카파 경쇄에 특이적인 항체에 의한 검출에 의해 확인하였다. 추가의 특성화를 위한 단백질을 친화성 크로마토그래피(캡톨, GE 헬쓰케어)에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.

실시예 2: CD20 및 CD90에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 항체 형성의 특성화

CD95 및 CD20에 대한 키메릭 CD95XCD20 항체 유도체의 결합 친화성

표적에 대한 키메릭 CD95XCD20 항체 유도체의 성공적인 결합을 유식 세포측정(BD FACS 칼리버(Calibur))에 의해 확인하였다. CD20⁺/CD95^- B 림프아구 세포주(다우디) 및 CD20^-/CD95⁺ 신경교종 세포주(LN-18)를 각각 일련의 상기 키메릭 항체 유도체의 희석물(PBS 1% FCS 0.01% NaN₃ 중의 2 x 10⁶ 세포/샘플, 4 ℃에서 1시간)과 함께 배양하였다. 결합된 단백질을 PE-표지된 염소 항 인간 Fcγ-특이성 항체(잭슨 임뮤노 리써치 카탈로그 번호 109-116-098, 1:200, 4 ℃에서 30분)로 검출하였다. 평균 형광 강도(MFI)의 농도-의존적인 증가는 CD95뿐만 아니라 CD20에 대한 상기 키메릭 이중특이성 항체의 성공적인 결합을 입증하였다(도 3).

CD95 및 CD20에 대한 인간화된 CD95XCD20 항체 유도체의 결합 친화성

표적에 대한 인간화된 CD95XCD20 항체 유도체의 성공적인 결합을 유식 세포측정(BD FACS 칼리버)에 의해 확인하였다. CD20⁺/CD95^- B 림프아구 세포주(다우디) 및 CD20^-/CD95⁺ 신경교종 세포주(LN-18)를 각각 일련의 상기 키메릭 항체 유도체의 희석물(PBS 1% FCS 0.01% NaN₃ 중의 2 x 10⁶ 세포/샘플, 4 ℃에서 1시간)과 함께 배양하였다. 결합된 단백질을 PE-표지된 염소 항 인간 Fcγ-특이성 항체(잭슨 임뮤노 리써치 카탈로그 번호 109-116-098, 1:200, 4 ℃에서 30분)로 검출하였다. 평균 형광 강도(MFI)의 농도-의존적인 증가는 CD95뿐만 아니라 CD20에 대한 상기 인간화된 이중특이성 항체의 성공적인 결합을 입증하였다(도 4).

키메릭 CD95XCD20 항체 유도체의 생체내 반감기

C57BL6 마우스(수컷, 6주 된 것, n = 3)에게 50 ㎍의 키메릭 CD95XCD20 항체 유도체(NA-C20)를 정맥내(꼬리 정맥)로 제공하였다. 혈액 샘플을 주사후 0.5h, 1.0h, 2.0h 및 4.0h 째에 채혈하였다. 혈청 항체 농도를 유식 세포측정을 통해 CD20⁺/CD95⁺ B-림프아구 세포주 SKW 6.4에 결합된 항체의 검출에 의해 측정하였다.

실시예 3: CD20 및 CD90에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 항체 형성에 대한 개념의 시험관내 증거

CD95XCD20 항체 유도체의 효능

CD20⁺/CD95⁺ B-세포상의 CD95를 활성화시키는 효능이 CD20⁺/CD95⁺ B-림프아구 세포주 SKW 6.4 상의 키메릭(NA-C20) 및 인간화된 변이체(노보탈그) 모두에 대해 입증되었다. 세포를 일련의 CD95XCD20 항체 유도체의 희석물과 함께 배양하고 세포 증식을 티미딘 결합 분석에 의해 측정하였다. 간단히, 웰당 3x10⁴ 세포를 96-웰 편평-바닥 미세적정 플레이트내에 시딩하고 상기 항체 유도체를 각각의 농도로 가하였다. 24h 후에, [³H]메틸-티미딘(하트만 어낼리틱스(Hartman analytics)로부터 구입, 카탈로그 번호 MT6035/3)을 상기 세포에 가하여 0.5 μCi/웰의 최종 농도를 달성하였다. 추가로 20h의 배양 후에, 세포를 수확하였으며 3중 수소 결합을 액체 섬광 분광분석(퍼킨엘머(PerkinElmer) 액체 섬광 분석기 마이크로베타(MicroBeta)2)에 의해 분석하였다. 증식에 있어서 용량 의존적인 억제가 관찰될 수 있었으며, 이는 CD20 및 CD95를 모두 발현하는 세포에서 사멸 수용체 CD95를 선택적으로 자극하는 NA-20 및 노보탈그의 능력을 입증한다.

실시예 4: CD20 및 CD90에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 항체 형성에 대한 개념의 생체내 증거

생체내 림프종 SCID 마우스 모델

4 내지 5주된 SCID 마우스(Bosma et al., Nature 1983 Feb 10;301(5900):527-30)에게 치사 용량의 1 x 10⁷ 세포의 CD20⁺/CD95⁺ B-림프아구 세포주 SKW 6.4(n = 8)를 정맥내(꼬리 정맥)로 주사하였다. 주사후 1, 2 및 3일째에, 8 마리의 마우스에게 20 ㎍의 키메릭 CD95XCD20 항체 유도체(NA-C20)를 제공한 반면 대조군에게는 PBS 또는 20 ㎍의 NA-CMeI를 각각(i.p.) 제공하였다. NA-CMeI는 CD95 및 제2의, 관련없는 표적(흑색종 관련된 프로테오글리칸)에 대해 특이성을 갖는 이중특이성 항체 유도체이다. 결과를 도 7에 나타낸다. 40일 후에, 상기 대조군의 마우스는 모두 죽은 반면 상기 NA-C20 처리된 그룹으로부터는 7마리의 마우스가 생존하였다. 상기 그룹 중 6마리의 마우스는 120일 후에도 여전히 살아있었다. 이는 이들 마우스에서 상기 CD20⁺/CD95⁺ SKW 6.4 세포의 유효한 고갈을 가리킨다. 차례로, 상기 NA-CMeI 처리된 대조군의 8마리의 마우스 증 7마리가 40일째에 죽었다. NA-CMeI는 명백히 효과기 종양 세포를 고갈시킬 수 없다. NA-C20과 대조적으로, NA-CMeI는 SKW6.4 세포상에서 발현되는 단백질들에 대해서 CD95(상기와 1가로 결합한다) 외에 다른 표적 특이성을 갖지 않았다. 이는, 유효한 CD95 활성화 및 세포사멸 유도에 필수적인 수용체 가교결합을 방지한다. NA-CMeI는 CD95에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 항체 유도체의 표적 세포-제한된 작용 방식을 입증한다. 따라서 NA-C20은 CD95⁺/CD20⁺ 세포에 대해서만 유효한 것으로 예상되며, 이는 CD95⁺/CD20^-세포, 예를 들어 병들지 않은 간세포를 남긴다. 이는 선택적인 표적화 및 감소된 표적-외 효과를 보장한다(Jung et al., Cancer Res . 2001 March 1;61(5):1846-8).

<110> Baliopharm AG <120> RECOMBINANT BISPECIFIC ANTIBODY BINDING TO CD20 AND CD95 <130> IPA150507-AT <150> EP 12193196.8 <151> 2012/11/19 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL Sequence <400> 1 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR Sequence <400> 2 Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln 1 5 10 15 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR Sequence <400> 3 Val Ala Ser 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Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 218 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC Sequence <400> 21 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 22 <211> 657 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LC Sequence <400> 22 gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagagccacc 60 atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca caagtttaat gcaatggtac 120 caacagaagc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ttgcatccaa cgtagaatct 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccac 240 cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtacgaa ggttccttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 657 <210> 23 <211> 585 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC Sequence <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Thr Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser 210 215 220 Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 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Lys Pro Trp Ile Tyr Ala 515 520 525 Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 530 535 540 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 545 550 555 560 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe 565 570 575 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 580 585 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Linker <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 1095 <212> DNA <213> artificial <220> <223> HC Sequence <400> 25 gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60 tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat accaatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 180 tactatgccg aatcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240 ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaagct gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgact 300 gatggttact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagggca gccctccgga 360 caggcttatc tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcctc agtgaagatg 420 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 480 cctagacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 540 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 600 atgcagctca gcagcctgac ctctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagagtggtg 660 tactatagta actcttactg gtacttcgac gtctggggca cagggaccac ggtcaccgtc 720 tcctcaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacatcgtt 780 ctctcccagt ctccagctat cttgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacttgc 840 agagccagtt caagtgttag ttacatgcac tggtaccagc agaagccagg atcctccccc 900 aaaccctgga tttatgcccc atccaacctg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 960 agtgggtctg ggacctctta ctctctcaca atcagcagag tggaggctga agatgctgcc 1020 acttattact gccagcagtg gagttttaac ccacccacgt tcggtgctgg gaccaagctg 1080 gagctgaaat gataa 1095 <210> 26 <211> 218 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC Sequence <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 27 <211> 717 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LC Sequence <400> 27 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccaccggc 60 gacatcgtga tgacccagtc ccccgactcc ctggccgtgt ccctgggcga gagggccacc 120 atctcctgca gggcctccga gtccgtggag tactacggca cctccctgat gcagtggtac 180 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg tggcctccaa cgtggagtcc 240 ggcgtgcccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc 300 tccctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac ttctgccagc agtccaccaa ggtgccctgg 360 accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagcgtacgg tggccgcccc ctccgtgttc 420 atcttccccc cctccgacga gcagctgaag tccggcaccg cctccgtggt gtgcctgctg 480 aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagtcc 540 ggcaactccc aggagtccgt gaccgagcag gactccaagg actccaccta ctccctgtcc 600 tccaccctga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtctacgc ctgcgaggtg 660 acccaccagg gcctgtcctc ccccgtgacc aagtccttca acaggggcga gtgctga 717 <210> 28 <211> 585 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC Sequence <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Thr Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser 210 215 220 Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Ser Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 340 345 350 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 355 360 365 Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 370 375 380 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr 385 390 395 400 Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr 405 410 415 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 420 425 430 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr 435 440 445 Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 465 470 475 480 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 485 490 495 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 500 505 510 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ala 515 520 525 Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 530 535 540 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 545 550 555 560 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe 565 570 575 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 580 585 <210> 29 <211> 1818 <212> DNA <213> artificial <220> <223> HC Sequence <400> 29 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccaccggc 60 gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggctc cctgaggctg 120 tcctgcgccg cctccggctt caccttcaac accaacgcca tgaactgggt gaggcaggcc 180 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccagg atcaggtcca agtccaacaa ctacgccacc 240 tactacgccg agtccgtgaa ggacaggttc accatctcca gggacgactc caagaacacc 300 ctgtacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgtgacc 360 gacggctact actggggcca gggcaccacc ctgaccgtgt cctccgcctc caccaagggc 420 ccctccgtgt tccccctggc cccctcctcc aagtccacct ccggcggcac cgccgccctg 480 ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa ctccggcgcc 540 ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 600 tcctccgtgg tgaccgtgcc ctcctcctcc ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aaccacaagc cctccaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagtc ctgcgacaag 720 acccacacct cccccccctc ccccgccccc cccgtggccg gcccctccgt gttcctgttc 780 ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc tccaggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg 840 gtgggcgtgt cccacgagga ccccgaggtg aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagggag gagcagtacc agtccaccta cagggtggtg 960 tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 1020 tccaacaagc agctgccctc ccccatcgag aagacgatat ccaaggccaa gggccagccc 1080 tccggccagg tgcagctggt gcagtccggc gccgaggtga agaagcccgg cgcctccgtg 1140 aaggtgtcct gcaaggcctc cggctacacc ttcacctcct acaacatgca ctgggtcagg 1200 caggcccccg gccagggcct ggagtggatc ggcgccatct accccggcaa cggcgacacc 1260 tcctacaacc agaagttcaa gggcagggtg accatcacca gggacacctc cgcctccacc 1320 gcctacatgg agctgtcctc cctgaggtcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccagg 1380 gtggtgtact actccaactc ctactggtac ttcgacgtgt ggggccaggg caccctggtg 1440 accgtgtcct ccggcggcgg cggctccggc ggcggcggat ccggcggcgg cggctccgac 1500 atccagatga cccagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgacag ggtgaccatc 1560 acctgcaggg cctcctcctc cgtgtcctac atgcactggt accagcagaa gcccggcaag 1620 gcccccaagc ccctgatcta cgccccctcc aacctggcct ccggcgtgcc ctccaggttc 1680 tccggctccg gctccggcac cgacttcacc ctgaccatct cctccctgca gcccgaggac 1740 ttcgccacct actactgcca gcagtggtcc ttcaaccccc ccaccttcgg ccagggcacc 1800 aagctggaga tcaagtga 1818

Claims

이중특이성 항체 포맷으로,
a) 제1 항원에 대한 제1 결합 부위를 포함하는 Fab 단편;
b) 제2 항원에 대한 제2 결합 부위를 포함하는 scFv 단편; 및
c) CH2 도메인
을 포함하고, 상기 Fab 단편 및 scFv 단편이 상기 CH2 도메인을 통해 결합되며,
-상기 제1 항원이 CD95이고 상기 제2 항원이 CD20이거나; 또는
-상기 제1 항원이 CD20이고 상기 제2 항원이 CD95인
이중특이성 항체 포맷.
제1항에 있어서,
CD20에 결합하는 결합 부위가 항체 가변 도메인의 6개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6):
A) i) CDR1은 아미노산 서열 RASSSVSYM (서열번호 12)을 포함하고;
ii) CDR2는 아미노산 서열 APSNLAS (서열번호 13)을 포함하고;
iii) CDR3은 아미노산 서열 QQWSFNPPT (서열번호 14)을 포함하고;
iv) CDR4는 아미노산 서열 SYNMH (서열번호 16)을 포함하고;
v) CDR5는 아미노산 서열 AIYPGNGDTSYNQKFKG (서열번호 17)을 포함하고; 및
vi) CDR6은 아미노산 서열 VVYYSNSYWYFDV (서열번호 18)을 포함한다; 또는
B) 하기 중 적어도 하나인 그의 기능 활성 변이체:
i) CDR1은 아미노산 서열 RASSSVSYM (서열번호 12)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
ii) CDR2는 아미노산 서열 APSNLAS (서열번호 13)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
iii) CDR3은 아미노산 서열 QQWSFNPPT (서열번호 14)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
iv) CDR4는 아미노산 서열 SYNMH (서열번호 16)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
v) CDR5는 아미노산 서열 AIYPGNGDTSYNQKFKG (서열번호 17)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
vi) CDR6은 아미노산 서열 VVYYSNSYWYFDV (서열번호 18)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다
를 포함하는, 이중특이성 항체 포맷.
제1항 또는 제2항에 있어서,
서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 이중특이성 항체 포맷.
제3항에 있어서,
상기 변이체가 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 인간화된 변이체인 이중특이성 항체 포맷.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
CD95에 결합하는 결합 부위가 가변 항체 도메인의 6개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6):
A) i) CDR1은 아미노산 서열 RASESVEYYGTSLMQ (서열번호 2)을 포함하고;
ii) CDR2는 아미노산 서열 VASNVES (서열번호 3)을 포함하고;
iii) CDR3은 아미노산 서열 QQSTKVPWT (서열번호 4)을 포함하고;
iv) CDR4는 아미노산 서열 TNAMN (서열번호 6)을 포함하고;
v) CDR5는 아미노산 서열 RIRSKSNNYATYYAESVKD (서열번호 7)을 포함하고; 및
vi) CDR6은 아미노산 서열 DGYY (서열번호 8)을 포함한다; 또는
B) 하기 중 적어도 하나인 그의 기능 활성 변이체:
i) CDR1은 아미노산 서열 RASESVEYYGTSLMQ (서열번호 2)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
ii) CDR2는 아미노산 서열 VASNVES (서열번호 3)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
iii) CDR3은 아미노산 서열 QQSTKVPWT (서열번호 4)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
iv) CDR4는 아미노산 서열 TNAMN (서열번호 6)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
v) CDR5는 아미노산 서열 RIRSKSNNYATYYAESVKD (서열번호 7)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
vi) CDR6은 아미노산 서열 DGYY (서열번호 8)과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다
를 포함하는 이중특이성 항체 포맷.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 이중특이성 항체 포맷.
제6항에 있어서,
상기 변이체가 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 인간화된 변이체인 이중특이성 항체 포맷.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 21의 경쇄 서열 및 서열번호 23의 중쇄 서열, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 이중특이성 항체 포맷.
제8항에 있어서,
상기 변이체가 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 또는 이들의 기능 활성 변이체를 포함하는 인간화된 변이체인 이중특이성 항체 포맷.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
쥐, 키메릭 및/또는 인간화된 서열을 포함하는 이중특이성 항체 포맷.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
CD20과 Kd<10^-8M로 결합하고/하거나 CD95와 Kd<10^-8M로 결합하는 이중특이성 항체 포맷.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
의학적 용도를 위한 이중특이성 항체 포맷.
B-세포 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 포맷을 투여함을 포함하는, B-세포 질환의 치료 또는 예방 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 포맷 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제14항에 있어서,
B-세포 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
B-세포 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 치료 유효량의 제14항에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함하는, B-세포 질환의 치료 또는 예방 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 포맷을 암호화하는 핵산 서열.
제17항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제17항에 따른 핵산 서열 또는 제18항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제19항에 따른 숙주 세포가 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 포맷을 생산하도록 하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하거나 유지시킴을 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 포맷의 생산 방법.