KR20150134004A - Nucleic acid test based avian influenza virus detection kit with improved detection accuracy - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 특징지어지는 특이 프라이머들이 적용되고, 또한 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자증폭에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피하기 위하여 8개의 튜브로 구성된 다중튜브 방식이 적용된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형을 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 있어 유용하게 활용될 수 있다.The present invention relates to nucleic acid assay-based avian influenza virus detection and H5-type, H7-type, and H9-type simultaneous differentiation detection kits that can provide improved detection accuracy. The detection of avian influenza viruses according to the present invention and the simultaneous differentiation detection kits H5, H7 and H9 can be carried out in the same manner as in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16, which can overcome the short storage sequence problem in the target gene of avian influenza virus The present invention is characterized in that a multi-tube system composed of 8 tubes is applied in order to avoid the problem of sensitivity lowering and false negative in the case of multiple gene amplification for detection of existing avian influenza virus. The simultaneous discrimination detection of avian influenza viruses of the present invention and detection of H5, H7 and H9 types simultaneously detects avian influenza viruses and simultaneous differential detection of clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 It can be usefully applied to.
Description
본 발명은 개선된 검출(진단) 정확성(detection accuracy; diagnostic accuracy)을 제공해 줄 수 있는 핵산검사(nucleic acid test) 기반의 조류 인플루엔자 바이러스(avian influenza virus; AIV) 검출 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자(target gene)에서의 짧은 보존 서열(conserved sequence)로 인한 문제점을 극복할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 특징지어지는 특이 프라이머(primer)들이 적용되고, 또한 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자증폭(multiplex amplification)에서의 민감도(sensitivity) 저하 및 위음성(false negative) 발생 문제를 회피하기 위하여 8개의 튜브로 구성된 다중튜브(multi-tube) 방식이 적용된 조류 인플루엔자 바이러스 탐색(screening)과 더불어 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스인 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형, 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형을 동시감별검출 할 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a nucleic acid test-based avian influenza virus (AIV) detection kit capable of providing improved detection accuracy (diagnostic accuracy) Specific primers characterized by SEQ ID Nos. 1 to 16 capable of overcoming the problem caused by a short conserved sequence in the target gene of avian influenza virus In order to avoid sensitivity degradation and false negative occurrence in multiplex amplification for detection of existing avian influenza virus, a multi-tube-based multi-tube avian influenza virus In addition to screening, the clinically important avian influenza virus, avian influenza H5 type, H7 type, and H9 type simultaneous differentiation detection kits based on nucleic acid tests capable of simultaneously detecting virus H5 type, avian influenza virus type H7, and avian influenza virus type H9.
조류 인플루엔자는 조류 독감이라고 불리는 전염성 호흡기 질병으로 닭, 칠면조, 오리, 철새 등 여러 종류의 조류들에게서 발병하고 전파속도도 매우 빠르다. 조류 인플루엔자의 원인체(pathogen)는 조류 인플루엔자 바이러스이며, 이 조류 인플루엔자 바이러스는 병원성 정도에 따라 고병원성 조류 인플루엔자(highly pathogenicity avian influenza; HPAI) 바이러스와 저병원성 조류 인플루엔자(low pathogenicity avian influenza; LPAI) 바이러스로 구분된다. 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 명칭에서 알 수 있듯이 높은 병원성을 가지고 있는데 이러한 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 의한 감염은 전염성과 폐사율이 높아 가축전염병예방법에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있다. 조류 인플루엔자에 의한 축산분야에서의 피해는 최근 상당히 심각한 실정이다. 이러한 조류 인플루엔자에 의한 피해를 줄이기 위해서는 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 상시 예찰(monitoring) 및 철저한 방역이 필요하다. 이를 위해서는 조류 인플루엔자 바이러스를 용이하게 검출할 수 있는 기술 및 이에 활용될 수 있는 적절한 제품의 개발이 요구된다.Avian influenza is an infectious respiratory disease called avian influenza, which affects many species of birds such as chickens, turkeys, ducks and migratory birds and has a very fast rate of transmission. The pathogen of avian influenza is the avian influenza virus, which is classified as highly pathogenic avian influenza virus (HPAI) and low pathogenicity avian influenza virus (LPAI) according to the degree of pathogenicity . Highly pathogenic avian influenza viruses have high pathogenicity, as the name implies. These infections caused by the highly pathogenic avian influenza viruses are highly contagious and have a high mortality rate, so they are classified as the first livestock epidemic by the Livestock Epidemic Prevention Act. The damage caused by avian influenza in the livestock sector is a serious problem in recent years. In order to reduce the damage caused by avian influenza, it is necessary to monitor and thoroughly prevent the avian influenza virus infection. For this purpose, it is required to develop a technology capable of easily detecting avian influenza virus and a suitable product to be used therefor.
조류 인플루엔자 바이러스는 사람에게도 감염할 수 있어 특히 문제가 된다. 조류 인플루엔자 바이러스는 종(species)에 특이적이기 때문에 일반적으로는 사람에게 감염되지 않는다고 알려져 있으나, 전 세계적으로 조류 인플루엔자 바이러스의 인체감염 사례가 증가하고 있다(조류인플루엔자 인체감염 예방 및 관리지침, 질병관리본부, 발간등록번호 11-1352159-000016-14, 2011년 12월; N Engl J Med 352(4): 333-340, 2005). 이러한 이유로 동물 감염 단계에서부터의 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 철저한 예찰, 방역 및 관리가 요구되어진다. 이러한 이유로 인하여서도 조류 인플루엔자 바이러스를 용이하게 검출할 수 있는 기술 및 이에 활용될 수 있는 적절한 제품의 개발이 필요하다. The avian influenza virus is particularly problematic because it can infect humans. Although avian influenza viruses are known to be infectious to humans in general because they are species-specific, there have been increasing instances of human avian influenza virus infection worldwide (guidance for the prevention and management of human avian influenza infection, , Publication No. 11-1352159-000016-14, December 2011; N Engl J Med 352 (4): 333-340, 2005). For this reason, thorough monitoring, prevention and control of avian influenza virus infection from the stage of animal infection is required. For this reason, it is necessary to develop a technology that can easily detect avian influenza virus and a suitable product that can be utilized for the virus.
인플루엔자 바이러스는 A형, B형, 및 C형으로 구분되고, 조류 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A형에 속한다. 인플루엔자 바이러스 A형은 표면의 주요 당단백질 항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA)과 뉴라미니다제(neuraminidase; NA)의 구조에 따라 다시 몇 가지의 H형 및 N형으로 분류된다. 조류 인플루엔자 바이러스 중 특별히 동물이나 사람에게 피해 초래가 심각하여 보다 심각하게 관리해야 하는 조류 인플루엔자 바이러스로는 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형, 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형이 알려져 있다. 이런 이유로 조류 인플루엔자 바이러스 검출에 있어, 이들 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형, 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형을 감별하면서 검출할 수 있다면 보다 바람직하다. Influenza viruses are classified into types A, B, and C, and avian influenza virus belongs to influenza A virus type. Influenza virus type A is again divided into several H-type and N-type depending on the structure of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), which are major glycoprotein antigens on the surface. Among the avian influenza viruses, avian influenza virus type H5, avian influenza virus type H7, and avian influenza virus type H9 are known to be particularly serious due to serious damage to animals and people. For this reason, it is more preferable to detect these types of avian influenza virus H5, avian influenza virus type H7, and avian influenza virus type H9 while discriminating them.
조류 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법으로는 주로 바이러스 자체를 직접 검출하는 항원(antigen) 검사방법이 이용되고 있다. 조류 인플루엔자 바이러스 항원 검사방법으로 가장 대표적인 것이 면역진단을 이용하는 신속 간이 진단 키트를 사용하는 방법이다. 신속 간이 진단 키트를 사용하는 방법은 현장에서 검사를 실시할 수 있고 또한 결과 분석 및 판단에 있어 매우 신속하다는 장점이 있으나, 진단 정확성이 낮다는 단점을 가지고 있다. As a method for detecting avian influenza virus, an antigen test method for directly detecting the virus itself has been used. One of the most representative methods for testing avian influenza virus antigen is the use of a rapid diagnostic kit that uses immunodiagnosis. The use of the Rapid Simplified Diagnostic Kit has the advantage of being able to conduct field tests and being very quick in analyzing and judging results, but it has the disadvantage of low diagnostic accuracy.
이러한 단점을 해결하기 위해 제안된 기술이 핵산검사를 이용하는 방법이다. 이 핵산검사 기반의 방법에서는 먼저 검체로부터 핵산(RNA)을 분리하고, 분리된 핵산을 주형(template)으로 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 실시한 다음에 얻어진 증폭산물(amplicon)을 분석하여 검체에서의 조류 인플루엔자 바이러스 존재유무를 판단한다. 이 방법은 기존 신속 간이 진단 키트를 사용하는 방법에 비교하여 보다 정확하다는 장점을 가지며, 분석에 소요되는 시간도 1일 이내로 비교적 짧아 기존 신속 간이 진단 키트를 사용하는 방법의 새로운 대체방법으로 주목을 받고 있다. To overcome these drawbacks, the proposed technique uses nucleic acid probes. In this method, the nucleic acid (RNA) is first separated from the sample, and the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is performed using the separated nucleic acid as a template The obtained amplicon is analyzed to determine the presence or absence of avian influenza virus in the sample. This method has advantages in that it is more accurate than the method of using the existing rapid simple diagnostic kit, and the time required for the analysis is relatively short within one day, attracting attention as a new alternative method of using the existing rapid simple diagnostic kit have.
그런데, 실제의 질병 예찰, 방역 및 관리에 활용하기 위해서는 조류 인플루엔자 바이러스의 검출에 더하여 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형, 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 동시감별검출도 필요하기 때문에 이를 구현하기 위해서 다중유전자(multiplex) RT-PCR을 일반적으로 사용한다. 다중유전자 RT-PCR은 하나의 튜브에서의 여러 개의 목적 유전자들의 동시증폭을 구현할 수 있는 PCR 방식으로서 다수의 프라이머들을 하나의 튜브에 첨가하여 유전자 증폭을 실시하는 당분야에서는 잘 알려진 방법이다. However, in order to be used for actual disease observation, prevention and management, it is necessary to simultaneously detect the avian influenza virus H5, the avian influenza virus type H7, and the avian influenza virus type H9 at the same time in addition to the detection of avian influenza virus. Multiplex RT-PCR is commonly used. Multi-gene RT-PCR is a PCR method capable of realizing simultaneous amplification of several target genes in a single tube, and is a well-known method in the art to perform gene amplification by adding a plurality of primers to one tube.
그런데, 기존의 조류 인플루엔자 바이러스 동시감별검출에 사용되던 다중유전자 RT-PCR 방법은 다음과 같은 심각한 단점을 갖고 있다. 하나는 조류 인플루엔자 바이러스 각 형(type)의 유전자에 공통으로 존재하는 보존 서열을 기반으로 설계된 프라이머를 사용할 경우에 검출(진단) 민감도와 특이도가 크게 떨어진다는 점이다. 이는 조류 인플루엔자 바이러스의 경우에 여러 숙주에 감염하면서 유전자 재배열 과정 등으로 인하여 보존적인 서열을 유지하는 구간이 매우 짧기 때문에 발생한다 (BMC Evol Biol 14: 16, 2014; J Virol 86(3): 1750-1757, 2012). 또 하나는 다수의 프라이머들이 사용됨에 따라 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁이 초래되어 검출의 민감도와 특이도가 떨어질 뿐만 아니라 위음성 결과까지도 초래된다는 점이다. 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스의 경우에는 보다 정확한 감별검출을 위해서 각각의 H형을 결정짓는 헤마글루티닌 유전자 상의 서로 다른 2가지의 특정 영역에 대한 증폭을 통한 교차 검증을 하는 것이 필요한데, 이를 실시하려고 할 경우에는 앞의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 문제가 일반적으로 수반된다. 즉, 하나의 Segment 상에 4개의 프라이머가 작동하게 되어 이러한 문제가 발생되는 것이다. However, the multiple gene RT-PCR method used for simultaneous detection of avian influenza viruses has the following serious drawbacks. One is that the sensitivity and specificity of detection are greatly reduced when using primers designed based on conserved sequences that are common to the avian influenza virus genotype. This is because of the very short interval in which avian influenza virus infects several hosts and maintains a conserved sequence due to the rearrangement of the gene (BMC Evol Biol 14: 16, 2014; J Virol 86 (3): 1750 -1757, 2012). Another is that the use of multiple primers results in mutual interference and competition between the primers, resulting in poor detection sensitivity and specificity as well as false negative results. In the case of clinically important avian influenza viruses, cross-validation through amplification of two distinct regions of the hemagglutinin gene, which determine each H-type, is required for more accurate differential detection. There is generally a problem due to mutual interference and competition among the above primers. That is, four primers operate on one segment, which causes this problem.
조류 인플루엔자 바이러스 검출 결과에 따라 대량의 살처분과 같은 후속 작업이 수반된다는 점을 고려할 때 이는 결코 간과되어서는 안 될 문제이고, 또한 이러한 문제를 해결해 줄 수 있는 새로운 기술적 방법 및 이에 적합한 제품의 개발이 필요하다. Considering that the detection of avian influenza virus is accompanied by subsequent work such as mass disposal, this should not be overlooked. Also, new technological methods to solve these problems and development of suitable products need.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referred to throughout this specification and the citations are indicated in parentheses. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
이에, 본 발명자들은 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 동시감별검출 목적의 다중유전자 RT-PCR에서의 문제점을 해결하고자 노력한 끝에, 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 특징지어지는 특이 프라이머들이 적용되고, 또한 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피하기 위하여 8개의 튜브로 구성된 다중튜브 방식이 적용되어 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 더불어 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스인 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 유용한 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트를 개발하고, 이 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트가 조류 인플루엔자 바이러스의 검출과 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 동시감별검출에 매우 효과적이라는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have tried to solve the problems in conventional RT-PCR for the detection and simultaneous differentiation of avian influenza viruses, and have found that the sequence of avian influenza viruses overcoming short- In order to avoid problems of mutual interference between primers and degradation of sensitivity due to competition and generation of false negatives in the multi-gene RT-PCR for detection of existing avian influenza virus, specific primers characterized by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16 are applied. A multi-tube system consisting of four tubes is applied to detect nucleic acid probes that are useful for simultaneous differentiation detection of avian influenza virus H5, avian influenza type H7, and avian influenza type H9, which are clinically important avian influenza viruses The H5, H7 and H9 simultaneous detection kits have been developed and the H5, H7 and H9 simultaneous detection kits have been developed for the detection of influenza virus and avian influenza virus H5 , The avian influenza virus type H7 and the avian influenza virus type H9 at the same time.
따라서 본 발명의 목적은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있어 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 있어 효과적으로 활용될 수 있는 특이 프라이머들을 제공하는 것이다.
Therefore, it is an object of the present invention to overcome the problem caused by the short storage sequence in the target gene of avian influenza virus, so that the detection of avian influenza virus and the clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 And to provide specific primers that can be effectively utilized for simultaneous discrimination detection.
본 발명의 또 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있는 특이 프라이머들이 적용되고, 또한 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피할 수 있는 다중튜브 방식이 적용되어 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 있어 유용한 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트를 제공하는 것이다.
It is a further object of the present invention to provide a method for detecting avian influenza virus by applying specific primers capable of overcoming the problem due to short storage sequence in the target gene of avian influenza virus, A multi-tube method that avoids the occurrence of the virus is used to detect avian influenza viruses and avian influenza-based avian influenza viruses useful for the simultaneous detection of the clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 Virus detection, and simultaneous differentiation detection kit of H5 type, H7 type and H9 type.
본 발명의 또 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있는 특이 프라이머들이 적용되고, 또한 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피할 수 있는 다중튜브 방식이 적용되어 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 있어 유용한 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트를 사용하여 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출을 실시하는 방법을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for detecting avian influenza virus by applying specific primers capable of overcoming the problem due to short storage sequence in the target gene of avian influenza virus, A multi-tube method that avoids the occurrence of the virus is used to detect avian influenza viruses and avian influenza-based avian influenza viruses useful for the simultaneous detection of the clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 Detection of viruses and simultaneous detection of avian influenza viruses and simultaneous differential detection of clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 using simultaneous discrimination detection kit of H5 type, H7 type and H9 type To provide All.
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있어 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 있어 효과적으로 활용될 수 있는 특이 프라이머들을 제공한다.The present invention can overcome the problem due to the short storage sequence in the target gene of avian influenza virus, so that the detection of avian influenza virus and simultaneous differentiation detection of clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 Specific primers that can be effectively utilized in the present invention.
본 발명의 프라이머들은 조류 인플루엔자 바이러스(보다 정확하게는 인플루엔자 바이러스 A형)에 공통적인 유전자 영역 각 2군데를 증폭하는 데에 사용되는 특이 프라이머 2쌍 (서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 특이 프라이머 쌍, 및 서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 특이 프라이머 쌍), 조류 인플루엔자 바이러스 H5형에 공통적인 유전자 영역 각 2군데를 증폭하는 데에 사용되는 특이 프라이머 2쌍 (서열번호 5과 서열번호 6로 구성되는 특이 프라이머 쌍, 및 서열번호 7과 서열번호 8로 구성되는 특이 프라이머 쌍), 조류 인플루엔자 바이러스 H7형에 공통적인 유전자 영역 각 2군데를 증폭하는 데에 사용되는 특이 프라이머 2쌍 (서열번호 9와 서열번호 10로 구성되는 특이 프라이머 쌍, 및 서열번호 11과 서열번호 12로 구성되는 특이 프라이머 쌍), 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형에 공통적인 유전자 영역 각 2군데를 증폭하는 데에 사용되는 특이 프라이머 2쌍 (서열번호 13과 서열번호 14로 구성되는 특이 프라이머 쌍, 및 서열번호 15와 서열번호 16로 구성되는 특이 프라이머 쌍)이다. The primers of the present invention comprise two pairs of specific primers (a pair of specific primers consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) used to amplify two sites of each of the gene regions common to avian influenza virus (more precisely influenza virus type A) , And a pair of specific primers consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 2 pairs of specific primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) used to amplify two sites of each common gene region in avian influenza virus type H5 And a specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8), 2 pairs of specific primers (SEQ ID NO: 9) used for amplifying each of two sites of the gene region common to avian influenza virus type H7 And a specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and a specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12), and Two pairs of specific primers (a pair of a specific primer consisting of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, and a pair of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, which are used for amplifying two sites of each gene region common to the influenza virus type H9) Specific primer pair).
보다 구체적으로는 본 발명의 특이 프라이머들은 조류에 감염되는 모든 조류 인플루엔자 바이러스(인플루엔자 바이러스 A형)의 segment 5-nucleocapsid protein (NP) gene에 공통적으로 존재하는 유전자 단편의 RT-PCR 증폭용 특이 프라이머 쌍(서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 특이 프라이머 쌍)과 모든 조류 인플루엔자 바이러스(인플루엔자 바이러스 A형)의 segment 7matrix protein (M) gene에 공통적으로 존재하는 유전자 단편에 대한 RT-PCR 증폭용 특이 프라이머 쌍(서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 특이 프라이머 쌍)을 비롯하여 조류 인플루엔자 바이러스 H5형의 유전자의 segment 4에 해당하는 헤마글루티닌 각각에 특이적으로 존재하는 각각 2개의 유전자 단편에 대한 RT-PCR 증폭용 특이 프라이머 쌍(서열번호 5와 서열번호 6로 구성되는 특이 프라이머 쌍; 및 서열번호 7과 서열번호 8로 구성되는 특이 프라이머 쌍), 조류 인플루엔자 바이러스 H7형의 유전자의 segment 4에 해당하는 헤마글루티닌 각각에 특이적으로 존재하는 각각 2개의 유전자 단편에 대한 RT-PCR 증폭용 특이 프라이머 쌍(서열번호 9와 서열번호 10로 구성되는 특이 프라이머 쌍; 및 서열번호 11과 서열번호 12로 구성되는 특이 프라이머 쌍), 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 유전자의 segment 4에 해당하는 헤마글루티닌 각각에 특이적으로 존재하는 각각 2개의 유전자 단편에 대한 RT-PCR 증폭용 특이 프라이머 쌍(서열번호 13과 서열번호 14로 구성되는 특이 프라이머 쌍; 및 서열번호 15와 서열번호 16로 구성되는 특이 프라이머 쌍)으로 구성된다.
More specifically, the specific primers of the present invention comprise a specific primer pair for RT-PCR amplification of a gene fragment commonly present in the segment 5-nucleocapsid protein (NP) gene of all avian influenza viruses (influenza virus A type) Specific primers for RT-PCR amplification of gene fragments that are commonly present in the
따라서 상기 특이 프라이머들은 조류 인플루엔자 바이러스의 검출에 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 이에 더하여 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스인 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형, 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 단순검출 및 동시감별검출에도 활용될 수 있다. Therefore, the above-mentioned specific primers can be used not only for the detection of avian influenza virus but also for the simple detection of clinically important avian influenza viruses such as avian influenza virus type H5, avian influenza virus type H7 and avian influenza virus type H9 It can also be used for simultaneous discrimination detection.
이들 상기 특이 프라이머들은 특징적으로 프라이머의 5’-말단에 4-5개의 염기가 주형의 프라이밍(priming) 서열에 관계없이 부가되어 있는데, 이 부가된 염기 서열은 이것에 바로 이어지는 실제 프라이밍 서열로 구성된 프라이머 서열의 5’-말단 부위 서열의 역반복 형태이다. 이러한 특이 구조의 도입은 특별한 효과를 제공해 준다. 첫 번째는 상온에서의 비특이 증폭 억제이다. 도입된 특이 구조로 인하여 상온에서는 프라이머가 이합체(프라이머끼리 결합한 것)를 형성하게 되고 이로 인하여 상온에서는 프라이머로 작동할 수 없게 되어 상온에서의 증폭 반응이 억제 되게 된다. 실제 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 RT-PCR에서는 상온에서도 그 온도에서부터 활성이 조금 있는 효소들의 작용으로 인하여 유전자 증폭이 일어날 수 있고 이러한 유전자 증폭은 특이성이 매우 떨어져 최종적인 PCR의 특이도를 크게 훼손하기 때문에 가급적 억제 되어야 한다. 두 번째는 통상의 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 RT-PCR에서 발견되는 짧은 보존 영역을 기반으로 하여 설계 제작된 프라이머이기 때문에 피할 수 없었던 PCR 증폭산물들과의 약한 결합 문제를 개선시켜 준다. RT-PCR은 역전사 반응 후에 연속하여 PCR이 수행되는데, PCR의 첫 번째 회(round)에서는 RNA를 주형으로 하여 역전사 반응을 통해 합성된 cDNA가 주형이 된다. 그렇지만 그 다음의 회부터는 cDNA에 더불어 PCR을 통하여 새롭게 합성된 PCR 증폭산물들도 PCR의 주형으로 작용한다. 실제 PCR이 진행됨에 따라 cDNA 양보다 이러한 PCR 증폭산물들의 양이 훨씬 많게 되어 이러한 PCR 증폭산물들의 주형으로서의 역할이 보다 중요하게 된다. 본 발명에 따른 특이 프라이머를 사용하면 PCR의 두 번째 회부터 특이 프라이머들과 PCR 증폭산물들과의 결합에서 기존 프라이머를 사용했을 때와 비교하여 특이 프라이머에 부가된 염기 수만큼 프라이밍 자리를 추가로 제공해 줄 수 있어 특이 프라이머와 PCR 증폭산물 간의 결합이 일반 프라이머와 일반 프라이머를 사용하여 합성된 PCR 증폭산물 간의 결합에 비교하여 보다 강해진다. 따라서 보다 높은 온도에서의 PCR 수행이 가능하며 이는 보다 엄격한(stringent) PCR 조건을 형성한다. 즉, 본 발명의 특이 프라이머는 특이 프라이머에 도입된 특이 구조로 인하여 짧은 프라이밍 서열에 따른 문제가 개선될 수 있고 PCR 반응의 민감도와 특이도를 개선시켜 줄 수 있다. These specific primers are characterized in that 4-5 bases at the 5'-end of the primer are added regardless of the priming sequence of the template, and this added base sequence has a primer sequence consisting of the actual priming sequence immediately following thereto Lt; RTI ID = 0.0 > 5'-terminal < / RTI > The introduction of this specific structure provides a special effect. The first is non-specific amplification inhibition at room temperature. Due to the introduced specific structure, the primer forms a dimer (bonded with primers) at room temperature, and as a result, it can not operate as a primer at room temperature, thereby suppressing the amplification reaction at room temperature. In real-world RT-PCR for avian influenza virus detection, gene amplification can occur due to the action of enzymes that have little activity from the temperature even at room temperature. Since such gene amplification is highly specific and greatly impairs the final PCR specificity, Should be suppressed. The second is a primer designed on the basis of a short conserved region found in RT-PCR for the detection of avian influenza virus, which improves the weak binding problem with unavoidable PCR amplification products. In RT-PCR, the PCR is performed continuously after the reverse transcription. In the first round of PCR, cDNA synthesized through reverse transcription with RNA as a template becomes a template. However, PCR amplification products newly synthesized through PCR in addition to cDNA also serve as templates for PCR from the following times. As the actual PCR proceeds, the amount of these PCR amplification products becomes much larger than the amount of cDNA, and the role of these PCR amplification products as a template becomes more important. The use of the specific primer according to the present invention provides a priming site as many as the number of bases added to the specific primer in comparison with the case of using the existing primer in the combination of the specific primers and the PCR amplification products from the second PCR The binding between the specific primer and the PCR amplification product is stronger than the binding between the PCR amplification product synthesized using the common primer and the common primer. PCR can therefore be performed at higher temperatures, which results in more stringent PCR conditions. That is, the specific primer of the present invention can improve the problem according to the short priming sequence due to the specific structure introduced into the specific primer, and can improve the sensitivity and specificity of the PCR reaction.
상기 특이 프라이머들은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16으로 제시된 염기서열로 구성되는 것이 바람직하다. Wherein said specific primers are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 225 bp의 특징적 크기의 증폭산물이, 서열번호 3 및 서열번호 4의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 378 bp의 특징적 크기의 증폭산물이, 서열번호 5 및 서열번호 6의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 311 bp의 특징적 크기의 증폭산물이, 서열번호 7 및 서열번호 8의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 563 bp의 특징적 크기의 증폭산물이, 서열번호 9 및 서열번호 10의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 329 bp의 특징적 크기의 증폭산물이, 서열번호 11 및 서열번호 12의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 628 bp의 특징적 크기의 증폭산물이, 서열번호 13 및 서열번호 14의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 252 bp의 특징적 크기의 증폭산물이, 서열번호 15 및 서열번호 16의 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때는 498 bp의 특징적 크기의 증폭산물이 생성된다. When a specific primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 was used, an amplification product of a characteristic size of 225 bp was used. When a specific primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was used, amplification products of a characteristic size of 378 bp The amplification product of the characteristic size of 311 bp when the specific primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 was used and the amplified product of the characteristic size of 563 bp when the specific primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: , A 329 bp amplification product with a specific primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 and a 628 bp amplification product with a characteristic size of 628 bp when the specific primer pair of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 was used , SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 were used, amplification products of characteristic size of 252 bp were used to amplify the specific primer pairs of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 The amplification products characteristic of the size of 498 bp is generated when we.
한편, 조류 인플루엔자 바이러스의 병원성은 헤마글루티닌 단백질과 관련이 있으며 이 헤마글루티닌 단백질 분절부위(cleavage site)는 병원성에 관련된 특정한 유전자 배열을 가진다. 이런 이유로 이 헤마글루티닌 단백질 분절부위에 해당하는 유전자 배열을 조사하여 이를 기준으로 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 여부를 확진한다. 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트에서의 조류 인플루엔자 바이러스 H5형에 대한 증폭산물 (서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때의 증폭산물과 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때의 증폭산물)과 조류 인플루엔자 바이러스 H7형에 대한 증폭산물 (서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때의 증폭산물과 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때의 증폭산물)은 상기한 헤마글루티닌 단백질 분절부위에 해당하는 유전자들의 증폭산물들이므로 이들의 유전자 서열을 조사하면 해당 조류 인플루엔자 바이러스의 고병원성 여부도 확인할 수 있다. 기존 다중유전자 RT-PCR에서는 다수의 증폭산물들이 혼재되어 있어 이들의 유전자 서열 분석을 수행하기 위해서는 증폭산물의 분리 및 정제가 필요하고 이를 위해서는 복잡한 과정이 수행되어야만 했었는데, 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트에서는 단일 종의 증폭산물만이 있는 상태에서 증폭산물을 회수하면 되기 때문에 상대적으로 매우 단순한 과정을 통하여 증폭산물을 확보할 수 있어 결과적으로 용이하게 증폭산물의 유전자 서열 분석을 실시할 수 있다. On the other hand, the pathogenicity of avian influenza virus is related to the hemagglutinin protein, and the hemagglutinin protein cleavage site has a specific gene sequence related to pathogenicity. For this reason, the sequence of the gene corresponding to the hemagglutinin protein segment is investigated and confirmed as a highly pathogenic avian influenza virus. The amplification product of the avian influenza virus H5 type (the amplification product using the specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) in the H5 type, H7 type and H9 type simultaneous discrimination detection kit of the present invention And the amplification product for the avian influenza virus H7 type (the amplification product when the specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 was used) and the amplification product for the avian influenza virus H7 type The amplification product and the amplification product using the specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) are the amplification products of the genes corresponding to the hemagglutinin protein segment, It is also possible to confirm whether the avian influenza virus is highly pathogenic. In the conventional multi-gene RT-PCR, a large number of amplification products are mixed. In order to perform the gene sequence analysis, it is necessary to isolate and purify the amplified products, and a complicated process has to be performed. For the detection of the avian influenza virus In the H5, H7 and H9 simultaneous detection kit, amplification products are recovered in the presence of only a single species of amplification product. Therefore, amplification products can be obtained through a relatively simple process. As a result, Can be performed.
본 발명의 상기 각 특이 프라이머들은 구성염기 서열의 일부가 변경될 수 있다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 일부결실, 부가, 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 구성염기 서열의 일부 변경은 특이 프라이머들의 주형(cDNA 또는 PCR 증폭산물들)과의 특이적 결합을 훼손할 수 있기 때문에 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 한편, 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 여러 숙주를 거치면서 유전자의 재배열을 통한 변이가 매우 활발하기 때문에 주기적으로 최신의 유행하는 조류 인플루엔자 바이러스의 유전자 서열을 탐색하여 특이 프라이머들에 반영하여야 하며, 이에 따라 필요시 특이 프라이머들의 구성염기 서열의 일부 변경이 불가피하다. 이때에는 반드시 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적으로 조사되어 변경되어야 한다.
In the specific primers of the present invention, some of the constitutive base sequences may be changed. Such modifications may be accomplished by partial deletion, addition, substitution, or a combination thereof, of the constitutive nucleotide sequence, but some modifications of such constitutive nucleotide sequences are specific for the template (cDNA or PCR amplification products) of the specific primers It requires considerable care in application because it can damage the bond. On the other hand, in the case of avian influenza virus, since mutation through gene rearrangement is very active through several hosts, it is necessary to periodically search for the latest avian influenza virus gene sequence and reflect it in specific primers, A partial modification of the constitutive base sequence of the siRNA specific primers is inevitable. At this time, it must be experimentally investigated and changed to the extent that the specificity is not impaired.
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있는 특이 프라이머들이 적용되고, 또한 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피할 수 있는 다중튜브 방식이 적용된 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 있어 유용한 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트를 제공한다. The present invention relates to a method for preventing the problem of low sensitivity and false negativity in multigenic RT-PCR for detection of existing avian influenza virus by applying specific primers capable of overcoming the problem caused by short storage sequences in the target gene of avian influenza virus Detection of avian influenza viruses based on nucleic acid probes useful for simultaneous detection of avian influenza virus detection using the multi-tube method and clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 , H7 type and H9 type simultaneous discrimination detection kit.
본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트는 전술한 특이 구조가 도입된 특이 프라이머들이 사용되었을 뿐만 아니라 이에 더하여 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피할 수 있게 다중튜브 방식이 적용되어 있다. 하나의 키트에 이러한 다중튜브 방식이 적용되어 있어 사용자는 하나의 키트를 사용하여 한 번의 반응을 통하여 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출을 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 다중튜브 방식은 특이 프라이머 쌍이 구분하여 적용된 8개의 튜브로 구성되는 1개의 스트립(strip) 형태를 지칭한다. The detection of the avian influenza viruses of the present invention and the simultaneous differentiation detection kits H5, H7 and H9 not only used the specific primers introduced with the above-mentioned specific structure, but also used the multiple gene RT-PCR for detection of avian influenza virus A multi-tube method is applied so as to avoid problems of low sensitivity and false negative. One kit is applied to this multi-tube method, so users can use one kit to detect the avian influenza viruses and the clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 Simultaneous discrimination detection can be performed. The multi-tube system according to the present invention refers to one strip form composed of eight tubes divided into specific primer pairs.
본 발명에 따르면 상기 각 튜브에는 특이 프라이머가 구분되어 수용되어 진다. 튜브 1에는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 2에는 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 3에는 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 4에는 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 5에는 서열번호 9 및 서열번호 10로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 6에는 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 7에는 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 8에는 서열번호 15 및 서열번호 16로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용된다.
According to the present invention, specific primers are separately housed in each tube. In
이렇게 특이 프라이머 쌍을 튜브별로 구분하여 수용함으로써 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 다수의 프라이머들의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 및 특이도 저하 문제나 위음성 결과 초래 문제가 상당 부분 해소되게 된다. 이에 더하여 본 발명을 따르면 일반 조류 인플루엔자 바이러스 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하고, 조류 인플루엔자 바이러스 H5형 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하고, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하고, 조류 인플루엔자 바이러스 H9형 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하여 교차 검증이 가능하게 함에도 불구하고 하나의 segment 상에 다수의 프라이머들이 작동하여 초래되던 기존 다중유전자 RT-PCR에서의 문제들을 회피할 수 있다는 장점을 얻을 수 있다. 전술한 바 대로 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스의 경우에는 보다 정확한 감별검출을 위해서 각각의 H형을 결정짓는 헤마글루티닌 유전자 상의 서로 다른 2가지의 진단 영역에 대한 증폭을 통한 교차 검증을 실시하는 것이 필요한데, 본 발명을 따르면 이를 특별한 문제 없이 용이하게 구현할 수 있게 된다. In this way, the differential pair of primers can be divided into tubes. Thus, mutual interference between primers of multiple primers in RT-PCR for detection of existing avian influenza virus, competition, sensitivity and specificity decrease, Partly solved. In addition, according to the present invention, two specific diagnostic regions are amplified for general avian influenza virus detection purposes, two specific diagnostic regions are amplified for the purpose of detecting avian influenza virus type H5, and two specific types of avian influenza virus type H7 are detected PCR amplification was performed by amplifying the diagnostic region and amplifying two specific diagnostic regions for the detection of H9 strain of avian influenza virus, thereby enabling cross-validation. However, in the existing multi-gene RT-PCR Can be avoided. As described above, in the case of clinically important avian influenza virus, cross-validation is carried out by amplification of two different diagnostic regions on the hemagglutinin gene, which determines each H type for more accurate discrimination detection However, according to the present invention, it can be easily implemented without any particular problem.
각 튜브에는 특이 프라이머 쌍뿐만 아니라 RT-PCR에 필요한 모든 성분들이 포함된다. 포함되는 성분들로는 이에 국한되지 않지만, 역전사 효소, DNA 중합효소, Tris-HCl, MgCl2, KCl, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, RNase Inhibitor, DTT, 8-MOP 등을 제시할 수 있다. 이들은 적절한 농도 범위에서 포함되어야 하는데, 0.1-10 unit의 역전사 효소, 1-10 unit의 DNA 중합효소, 10-300 mM의 Tris-HCl, 1-50 mM의 MgCl2, 1-100 mM의 KCl, 1-5 mM의 dATP, 1-5 mM의 dTTP, 1-5 mM의 dGTP, 1-5 mM의 dCTP, 1-10 unit의 RNase Inhibitor, 0.001-0.1 M의 DTT, 0.5-5 μg의 8-MOP을 포함하는 것이 바람직하다.Each tube contains all the components required for RT-PCR as well as specific primer pairs. But are not limited to, reverse transcriptase, DNA polymerase, Tris-HCl, MgCl 2 , KCl, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, RNase inhibitor, DTT and 8-MOP. These should be included in the appropriate concentration range, including 0.1-10 units of reverse transcriptase, 1-10 units of DNA polymerase, 10-300 mM Tris-HCl, 1-50 mM MgCl 2 , 1-100 mM KCl, 1-5 mM dATP, 1-5 mM dTTP, 1-5 mM dGTP, 1-5 mM dCTP, 1-10 units of RNase inhibitor, 0.001-0.1 M DTT, 0.5-5 μg of 8- It is preferable to include MOP.
한편, 각 튜브에 첨가된 성분들은 액상 형태로 제조할 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성(stability)을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조할 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이에 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조가 사용되어질 수 있고, 이들의 복합 공정도 사용되어질 수 있다.
On the other hand, the components added to each tube may be prepared in a liquid form or in a dried form in order to improve the stability of the product by lowering the degree of freedom of contained components. In order to produce such a dried form, it is necessary to apply a drying step, and it is possible to use a method such as warm-drying, natural drying, vacuum drying and freeze-drying.
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있는 특이 프라이머들이 적용되고, 또한 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피할 수 있는 다중튜브 방식이 적용된 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 있어 유용한 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트를 사용하여 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출을 실시하는 방법을 제공한다. The present invention relates to a method for preventing the problem of low sensitivity and false negativity in multigenic RT-PCR for detection of existing avian influenza virus by applying specific primers capable of overcoming the problem caused by short storage sequences in the target gene of avian influenza virus Detection of avian influenza viruses based on nucleic acid probes useful for simultaneous detection of avian influenza virus detection using the multi-tube method and clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 , Simultaneous differentiation detection of avian influenza virus detection and clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza type H7 and avian influenza type H9 using the simultaneous discrimination kit of type H7 and type H9.
본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형을 동시감별검출 방법은 The detection method of avian influenza virus of the present invention and simultaneous discrimination detection methods of H5 type, H7 type and H9 type
(1) 검체(시료)로부터 조류 인플루엔자 바이러스 RNA를 추출하는 단계; (1) extracting avian influenza virus RNA from a specimen (sample);
(2) 추출된 상기 RNA를 주형으로 하여 다중튜브 RT-PCR을 실시하는 단계;(2) performing multi-tube RT-PCR using the extracted RNA as a template;
(3) 상기 단계 (2)로부터 얻어진 다중튜브 RT-PCR 산물의 아가로즈 젤 전기영동 분석을 통하여 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형을 감별검출 하는 단계를 포함한다.(3) detecting the avian influenza virus and detecting the H5, H7 and H9 types by agarose gel electrophoresis analysis of the multi-tube RT-PCR products obtained from the step (2).
보다 상세히 설명하면, 먼저 검체에서 공지의 방법에 따라 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA를 함유한 추출액을 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트의 각 튜브들에 첨가한다. 다음으로, 다중튜브 RT-PCR을 실시한다. 다중튜브 RT-PCR을 실시한 후에 얻어진 산물(반응액)에 대하여 통상적인 방법으로 아가로즈 젤 전기영동 분석을 실시하여 증폭산물의 생성 여부 및 그 크기에 근거하여 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출 한다. 판정에 대하여 구체적 설명하면, 1번 튜브 내지는 2번 튜브에 해당하는 225 bp 내지 378 bp 크기의 증폭산물이 관찰되면 이는 조류 인플루엔자 바이러스에 공통적으로 존재하는 유전자로 인한 증폭산물이 확인된 것이므로 검체 내에 조류 인플루엔자 바이러스가 존재한다는 것을 의미한다. 또한 3번 튜브 내지는 4번 튜브에 해당되는 311 bp 내지 563 bp의 크기의 증폭산물이 관찰되면 조류 인플루엔자 바이러스 H5형에 공통적으로 존재하는 유전자로 인한 증폭산물이 확인된 것이므로 검체 내에 조류 인플루엔자 바이러스 H5형이 존재한다는 것을 의미한다. 또한, 5번 튜브 내지는 6번 튜브에 해당되는 329 bp 내지 628 bp의 크기의 증폭산물이 관찰되면 조류 인플루엔자 바이러스 H7형에 공통적으로 존재하는 유전자로 인한 증폭산물이 확인된 것이므로 검체 내에 조류 인플루엔자 바이러스 H7형이 존재한다는 것을 의미한다. 유사하게, 7번 튜브 내지는 8번 튜브에 해당되는 252 bp 내지 498 bp의 크기의 증폭산물이 관찰되면 조류 인플루엔자 바이러스 H9형에 공통적으로 존재하는 유전자로 인한 증폭산물이 확인된 것이므로 검체 내에 조류 인플루엔자 바이러스 H9형이 존재한다는 것을 의미한다. 이와 같이 8개 튜브의 결과를 종합적으로 검토함으로써 검체 내의 조류 인플루엔자 바이러스 유무와 더불어 조류 인플루엔자 바이러스가 조류 인플루엔자 바이러스 H5형인지, 또는 조류 인플루엔자 바이러스 H7형인지, 또는 조류 인플루엔자 바이러스 H9형인지를 감별검출 할 수 있다.
More specifically, first, RNA is extracted from a specimen according to a known method, and then an extract containing the extracted RNA is subjected to detection of avian influenza virus of the present invention and to each tube of H5 type, H7 type and H9 type simultaneous discrimination detection kits Lt; / RTI > Next, multi-tube RT-PCR is performed. Agarose gel electrophoresis analysis was performed on the obtained product (reaction solution) after performing multi-tube RT-PCR to detect the presence of avian influenza virus and clinically important algae Influenza virus type H5, avian influenza type H7, and avian influenza type H9 are detected simultaneously. Specifically, when an amplification product of 225 bp to 378 bp corresponding to the first or second tube was observed, it was confirmed that the amplification product due to the gene common to avian influenza virus was confirmed, Means that influenza virus is present. In addition, when amplification product of the size of 311 bp to 563 bp corresponding to the No. 3 tube or the No. 4 tube was observed, the amplification product due to the gene common to the avian influenza virus type H5 was confirmed. Therefore, the influenza virus type H5 Is present. In addition, when the amplified product of the size of 329 bp to 628 bp corresponding to the 5th or 6th tube was observed, the amplification product due to the gene commonly present in the avian influenza virus type H7 was confirmed, so that the avian influenza virus H7 It means that the form exists. Similarly, when amplification product of the size of 252 bp to 498 bp corresponding to the 7th tube or the 8th tube was observed, the amplification product due to the gene commonly present in the avian influenza virus type H9 was confirmed, so that the avian influenza virus H9 type is present. As a result of comprehensive examination of the results of the 8 tubes, the presence or absence of the avian influenza virus in the sample and whether the avian influenza virus was of the avian influenza virus type H5, avian influenza virus type H7, or avian influenza virus type H9 .
본 명세서에서 사용된 “민감도”는 PCR 반응에서 주형 농도에 대한 의존성을 나타내는 것으로 민감도가 개선되었다는 것은 보다 낮은 주형 농도에서도 PCR이 성공적으로 구현됨을 지칭한다. 또한, 본 명세서에 사용된 “특이도”는 목적 유전자에 대한 선택적 증폭 정도를 나타내는 것으로 특이도가 개선되었다는 것은 전체 증폭된 산물 중에 목적하는 특정 증폭이 차지하는 비율이 높아졌음을 지칭한다. 그리고 본 명세서에 사용된 “검출(진단) 정확성”은 전술한 민감도와 특이도 모두에 관련되는 총괄적 의미로 검출(진단) 정확성이 개선되었다는 것은 민감도 또는 특이도가 개선되거나, 또는 이 둘 모두가 개선되는 것을 의미한다. As used herein, " sensitivity " indicates dependence on template concentration in a PCR reaction, and the improved sensitivity indicates that PCR is successfully achieved even at lower template concentrations. The term " specificity " used herein refers to the degree of selective amplification of the target gene. Specificity improvement means that the percentage of the specific amplification of the total amplified product is increased. &Quot; Diagnostic accuracy ", as used herein, means that improved detection (diagnostic) accuracy in the overall sense associated with both the sensitivity and specificity described above may improve sensitivity or specificity, or both .
본 발명은 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR 방법에 비하여 개선된 특이도와 민감도로 한 번의 반응으로 조류 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있게 해 주며, 또한 이에 더하여 질병 관리 및 방역 측면에서 중요한 조류 인플루엔자 바이러스인 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형, 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형을 검출 및 동시감별검출 할 수 있게 해 준다. 구체적으로, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 민감도 및 특이도 저하 문제를 개선시켜 주고, 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피하면서도 조류 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있게 해 주고 이에 더하여 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형을 동시감별검출 할 수 있게 해 준다. 즉, 본 발명은 일반 조류 인플루엔자 바이러스 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하고, 조류 인플루엔자 바이러스 H5형 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하고, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하고, 조류 인플루엔자 바이러스 H9형 검출 목적에 2군데 특정 진단 영역을 증폭하여 교차 검증을 가능하게 함에도 불구하고 하나의 segment 상에 다수의 프라이머들이 작동하여 초래되던 기존 다중유전자 RT-PCR에서의 문제들을 회피할 수 있게 하는 장점을 제공한다. 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스의 경우에는 보다 정확한 감별검출을 위해서 각각의 H형을 결정짓는 헤마글루티닌 유전자 상의 서로 다른 2가지의 진단 영역에 대한 증폭을 통한 교차 검증을 실시하는 것이 필요한데, 본 발명을 따르면 이를 특별한 문제 없이 용이하게 구현할 수 있게 된다. 또한 증폭산물에 대한 유전자 서열 분석을 통한 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 확진에도 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에 비교하여 보다 용이하게 활용될 수 있다. 따라서 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 예찰, 방역 및 관리에 일차적으로 활용될 수 있으며, 조류 인플루엔자 진단용 제품으로도 활용될 수 있다.The present invention enables detection of avian influenza virus in a single reaction with improved specificity and sensitivity as compared with the multiple gene RT-PCR method for detection of existing avian influenza virus. In addition, the avian influenza virus It allows detection and simultaneous detection of the viruses, the avian influenza virus type H5, the avian influenza virus type H7, and the avian influenza virus type H9. Specifically, the present invention improves sensitivity and specificity degradation due to short-term conserved sequences in the target gene of avian influenza virus, and reduces susceptibility and false negativity in multi-gene RT-PCR for detection of existing avian influenza virus It also allows the detection of avian influenza virus while avoiding it. In addition, it allows simultaneous detection of avian influenza virus type H5, avian influenza virus type H7 and avian influenza virus type H9. That is, the present invention amplifies two specific diagnostic regions for the purpose of detection of common avian influenza virus, amplifies two specific diagnostic regions for the purpose of detecting avian influenza virus type H5, RT-PCR, in which multiple primers were activated on one segment, despite amplification of the region and amplification of two specific diagnostic regions for the detection of H9 type of avian influenza virus, enabling cross-validation It provides the advantage of being able to avoid problems. In the case of clinically important avian influenza viruses, it is necessary to carry out cross-validation by amplification of two different diagnostic regions on the hemagglutinin gene, which determines each H type for more accurate differential detection. According to the invention, it can be easily implemented without any particular problem. In addition, identification of the highly pathogenic avian influenza virus by gene sequence analysis of the amplified product can be more easily utilized than the multi-gene RT-PCR for detecting avian influenza virus. Therefore, the detection of avian influenza viruses of the present invention and the H5, H7, and H9 type simultaneous detection kits can be used primarily for the prediction, prevention and management of avian influenza virus, and can also be used as a product for avian influenza diagnosis.
도 1은 본 발명에 따른 특이 프라이머로 증폭되는 조류 인플루엔자 바이러스 유전자 부위를 표시한 그림이다.
도 2는 본 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트의 사용방법을 보여주는 순서도이다.
도 3은 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트의 구성을 도식적으로 보여주는 그림이다. 아랫부분의 그림은 각각의 튜브에서의 증폭산물의 크기를 보여주는 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형 및 H9형 동시감별검출 키트의 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 검출 민감도를 조사한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다. 제시한 logEID50의 값은 실험에 사용한 각각의 바이러스 표준주의 희석 전 농도를 나탄낸다. 레인 1은 희석 전 시료를 사용한 경우이며, 레인 2는 레인 1을 10배 희석한 시료를 사용한 경우이며, 레인 3은 레인 2을 10배 희석한 시료를 사용한 경우이며, 레인 4는 레인 3을 10배 희석한 시료를 사용한 경우이며, 레인 5는 레인 4를 10배 희석한 시료를 사용한 경우이며, 레인 6은 레인 5를 10배 희석한 시료를 사용한 경우이다. 또한 레인 N은 음성대조구에 해당하며, 레인 P는 양성대조구에 해당하며, 레인 M은 DNA 마커이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing an avian influenza virus gene region amplified by a specific primer according to the present invention. FIG.
FIG. 2 is a flow chart showing the use of the avian influenza virus detection and simultaneous detection type H5, H7 and H9 detection kits according to the present invention.
FIG. 3 is a diagram schematically showing the structure of the detection system for avian influenza viruses of the present invention and the H5-type, H7-type and H9-type simultaneous detection kit. The bottom image shows the size of the amplification product in each tube.
FIG. 4 is an electrophoresis image showing the detection sensitivity of avian influenza viruses and H5-type, H7-type and H9-type simultaneous detection kits according to the present invention to avian influenza viruses. The value of logEID 50 given is the pre-dilution concentration of each virus standard used in the experiment.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are merely examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1: 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출에 유효한 특이 프라이머들의 제작Example 1: Detection of avian influenza virus and production of specific primers effective for simultaneous detection of H5, H7 and H9 types
조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형의 동시감별검출 목적의 RT-PCR에 적합한 특이 프라이머를 표 1과 같이 설계하여 제작하였다. 이들 특이 프라이머들은 조류 인플루엔자 바이러스의 목적 유전자에서의 짧은 보존 서열로 인한 문제점을 극복할 수 있게 프라이밍 서열로 구성되는 프라이머의 5’-말단에 추가의 4-5개의 염기가 부가되어 있는데, 이 추가된 염기서열은 이에 바로 이어지는 프라이머 서열의 5’-말단 일부 서열의 역반복 형태이다. 부가된 염기는 표 1에 제시된 특이 프라이머 서열에서 소문자로 표시하였다.
Specific primers suitable for RT-PCR for the detection of avian influenza virus and simultaneous differentiation detection of H5, H7, and H9 were designed and constructed as shown in Table 1. These specific primers add an additional 4-5 bases to the 5'-end of the primer consisting of the priming sequence to overcome the short storage sequences in the target gene of avian influenza virus, The nucleotide sequence is an inverted repeat of the 5'-terminal partial sequence of the primer sequence immediately following it. The added bases are indicated in lower case in the specific primer sequences shown in Table 1. < tb >< TABLE >
표 1의 특이 프라이머의 서열을 나타냄에 있어 IUB 중의성(ambiguity) 코드(code)를 사용했다. 따라서 특이 프라이머 서열에서 A는 아데닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타내고, R은 아데닌과 구아닌 둘 다 가능한 자리를 나타내고, Y는 시토신과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 제시한 모든 서열들에 동일하게 적용하였다. The ambiguity code in the IUB was used to represent the sequences of the specific primers in Table 1. Thus, in the specific primer sequence, A represents adenine, G represents guanine, C represents cytosine, T represents thymine, R represents a possible site for both adenine and guanine, Y represents a possible site for both cytosine and thymine. This applies equally to all sequences presented herein.
또한, 표 1의 특이 프라이머의 정보를 제시함에 있어 위치는 증폭 대상 유전자에서의 증폭 부위의 위치를 나타내는 것으로, 서열번호 1과 서열번호 2의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 segment 5-nucleocapsid protein gene(NCBI accession number: EU735797.1)을 기준으로 나타낸 것이고, 서열번호 3과 서열번호 4의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 segment 7-matrix protein gene(NCBI accession number: KJ484603.1)을 기준으로 나타낸 것이고, 서열번호 5와 서열번호 6의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 H5형의 segment 4-hemagglutinin gene(NCBI accession number: CY015089.1)을 기준으로 나타낸 것이고, 서열번호 7과 서열번호 8의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 H5형의 segment 4-hemagglutinin gene(NCBI accession number: CY015089.1)을 기준으로 나타낸 것이고, 서열번호 9와 서열번호 10의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 H7형의 segment 4-hemagglutinin gene(NCBI accession number: CY077016.1)을 기준으로 나타낸 것이고, 서열번호 11과 서열번호 12의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 H7형의 segment 4-hemagglutinin gene(NCBI accession number: CY077016.1)을 기준으로 나타낸 것이고, 서열번호 13과 서열번호 14의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 segment 4-hemagglutinin gene(NCBI accession number: EF154942.1)을 기준으로 나타낸 것이고, 서열번호 15와 서열번호 16의 경우에는 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 segment 4-hemagglutinin gene(NCBI accession number: EF154942.1)을 기준으로 나타낸 것이다.
In the case of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, the sequence of the 5-nucleocapsid protein gene (NCBI accession) in the case of avian influenza virus (NCBI accession number: KJ484603.1), and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 4, respectively. In the case of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, they are based on the avian influenza virus segment 7-matrix protein gene In the case of SEQ ID NO: 6, it is based on the segment 4-hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY015089.1) of the avian influenza virus type H5, and in the case of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, -hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY015089.1), and in the case of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12), the segment 4-hemagglutinin gene of the H7 strain of the avian influenza virus H7 (NCBI accession number: CY077016.1) : SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 are based on the segment 4-hemagglutinin gene (NCBI accession number: EF154942.1) of the avian influenza virus H9 type, and SEQ ID NO: And SEQ ID NO: 16 are based on the segment 4-hemagglutinin gene (NCBI accession number: EF154942.1) of the avian influenza virus H9 type.
실시예 2: 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 제작Example 2: Detection of avian influenza virus and production of H5, H7 and H9 simultaneous detection kit
실시예 1에서 제작한 특이 프라이머들을 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트를 제작하였다. 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 스트립을 구성하는 각 튜브에 RT-PCR에 필요한 모든 성분들(3 unit의 역전사 효소, 5 unit의 DNA 중합효소, 50 mM의 Tris-HCl, 25 mM의 MgCl2, 10 mM의 KCl, 2.5 mM의 dATP, 2.5 mM의 dTTP, 2.5 mM의 dGTP, 2.5 mM의 dCTP, 5 unit의 RNase Inhibitor, 0.01 M의 DTT, 1 μg의 8-MOP)을 첨가한 다음에, 추가하여 튜브 1에는 서열번호 1 및 서열번호 2의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였고, 튜브 2에는 서열번호 3 및 서열번호 4의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였고, 튜브 3에는 서열번호 5 및 서열번호 6의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였고, 튜브 4에는 서열번호 7 및 서열번호 8의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였고, 튜브 5에는 서열번호 9 및 서열번호 10의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였고, 튜브 6에는 서열번호 11 및 서열번호 12의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였고, 튜브 7에는 서열번호 13 및 서열번호 14의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였고, 튜브 8에는 서열번호 15 및 서열번호 16의 특이 프라이머들을 각각 10 pmole씩 첨가하였다. 그 다음으로는 동결건조하여 건조제형으로 제작하였다. 대조 실험을 위하여 모든 다른 성분들은 같으면서 프라이머만을 특이 구조가 도입되지 않게 제작된 프라이머를 첨가하여 제작한 것도 준비하였다. 이를 본 명세서에서는 대조 키트라 지칭한다.
Using the specific primers prepared in Example 1, avian influenza virus detection and H5, H7 and H9 type simultaneous discrimination detection kits were constructed. All the components required for RT-PCR (3 units of reverse transcriptase, 5 units of DNA polymerase, 50 mM) were added to each tube constituting the strip of the H5, H7, and H9 type simultaneous discrimination detection kits of avian influenza virus detection Tris-HCl, 25 mM MgCl 2 , 10 mM KCl, 2.5 mM dATP, 2.5 mM dTTP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, 5 units RNase inhibitor, 0.01 M DTT, 8-MOP), followed by addition of 10 pmoles of the specific primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to Tube 1, and 10 pmole of the specific primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, 10 pmole of each of the specific primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 was added to the tube 3, 10 pmole of the specific primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 were added to the tube 4, The specific primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 were introduced at 10 pmoles each 10 and 10 pmoles of the specific primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 were added to the tube 6, 10 pmole of the specific primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 were added to the tube 7, 15 and SEQ ID NO: 16 were added at 10 pmoles each. And then lyophilized to form a dry formulation. For the control experiment, primers prepared by adding primers designed so that only the primers were not introduced with all the other components were prepared. This is referred to herein as a control kit.
실시예 3: 검체 바이러스주 및 RNA 시료 준비Example 3: Preparation of sample virus strain and RNA sample
검체 바이러스주로는 농림축산검역본부에서 보유하고 있는 조류 인플루엔자 바이러스 표준주 및 국내 분리주 등을 사용하였다. 주형으로 사용할 RNA 시료를 준비하기 위한 RNA 추출은 해당 바이러스주 혹은 검체(유제액) 150 μl로부터 Viral Gene-spinTM DNA/RNA Extraction Kit ((주)인트론바이오테크놀로지)를 사용하여 제품사용설명서에 따라 실시하였다. 이렇게 하여 준비된 RNA 시료는 RT-PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
The sample viruses were mainly used for the avian influenza virus standard stocks and the domestic isolates from the Agriculture, Forestry and Livestock Quarantine Headquarters. RNA extraction for preparation of RNA samples to be used as template is performed by using Viral Gene-spin ™ DNA / RNA Extraction Kit (Intron Biotechnology Co., Ltd.) from 150 μl of the virus strain or sample (emulsion solution) Respectively. The prepared RNA samples were used as a template for RT-PCR reaction.
실시예 4: 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 유효성 조사Example 4: Detection of avian influenza virus and investigation of effectiveness of simultaneous differentiation detection kit of H5 type, H7 type, and H9 type
본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 유효성을 다음과 같이 조사하였다. 실시예 2에서 제조한 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 각 튜브에 실시예 3에서 준비한 RNA 시료(RNA 추출액) 2 μl와 분자생물학 실험용 물 18 μl를 첨가하여 RT-PCR 반응액을 준비하였다. 그 다음으로 RT-PCR 반응액을 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR의 첫 번째 단계는 RT-PCR 반응액을 45℃에서 30분간 유지시켜 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되게 하였다. 그 다음 단계로는 94℃에서 5분간 유지해 주어 역전사 효소의 활성을 제거시켰다. 그 후 94℃에서 30초, 55℃에서 60초, 72℃에서 60초로 구성된 PCR 주기를 총 40회 반복시키는 방식으로 PCR 반응을 실시하였다. 40회의 PCR 반응이 완료된 후에는 PCR 반응액을 72℃에서 5분간 유지시켜 PCR을 종료하였다. The avian influenza virus detection of the present invention and the effectiveness of the H5-type, H7-type, and H9-type simultaneous differentiation detection kits were investigated as follows. 2 μl of the RNA sample (RNA extract) prepared in Example 3 and 18 μl of water for molecular biological experiments were added to each tube of the avian influenza virus detection and H5-type, H7-type and H9-type simultaneous detection kit prepared in Example 2 To prepare an RT-PCR reaction solution. Then, RT-PCR was performed using RT-PCR reaction solution. In the first step of RT-PCR, the RT-PCR reaction solution was maintained at 45 ° C for 30 minutes to synthesize cDNA using RNA as a template. The next step was to maintain the reverse transcriptase activity at 94 ° C for 5 minutes. Thereafter, the PCR reaction was carried out in such a manner that PCR cycles consisting of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 60 seconds, and 72 ° C for 60 seconds were repeated 40 times in total. After completion of 40 PCR reactions, the PCR reaction was maintained at 72 ° C for 5 minutes to terminate the PCR.
상기와 같은 과정의 수행을 통하여 얻어진 RT-PCR 산물을 사용하여 아가로즈 젤 전기영동 분석을 실시하였다. 이를 간략히 설명하면, 핵산 염색 시약인 RedSafe Nucleic Acid Staining Solution(㈜인트론바이오테크놀로지)이 1×의 농도로 포함된 2% 아가로즈 겔에 RT-PCR 산물을 적하(loading)하여 전기영동을 실시하였고, 전기영동이 종료되면 PCR 산물을 분석하여 그 결과를 판독하였다. 그 결과는 도 3에 제시되어 있다. 도 3에 제시된 실험의 경우, 1-4번 튜브는 조류 인플루엔자 바이러스 H5형을 사용하여 준비한 RNA 시료를 주형으로 사용한 경우이고, 5-6번 튜브는 조류 인플루엔자 바이러스 H7형을 사용하여 준비한 RNA 시료를 주형으로 사용한 경우이고, 7-8번 튜브는 조류 인플루엔자 바이러스 H9형을 사용하여 준비한 RNA 시료를 주형으로 사용한 경우이다. 도 3에서 확인할 수 있듯이 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형, 및 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 감별검출에 유효하였다. Agarose gel electrophoresis analysis was performed using the RT-PCR product obtained through the above process. In brief, the RT-PCR product was loaded onto a 2% agarose gel containing 1 × concentration of a nucleic acid staining reagent, RedSafe Nucleic Acid Staining Solution (Intron Biotechnology Co., Ltd.) Upon completion of the electrophoresis, PCR products were analyzed and the results were read. The results are shown in FIG. In the case of the experiment shown in Fig. 3, the tube 1-4 was used as a template for RNA prepared using avian influenza virus type H5, and the tube 5-6 was used as an RNA sample prepared using avian influenza virus type H7 And as the template, the RNA samples prepared using the H9 strain of avian influenza virus strain 7-8 were used as a template. As can be seen from FIG. 3, the avian influenza virus detection and simultaneous differentiation detection kit for H5, H7 and H9 of the present invention can be used for differential detection of avian influenza virus type H5, avian influenza virus type H7, and avian influenza virus type H9 Effective.
참고로 대조 실험으로 실시한, 특이 구조가 도입되지 않은 프라이머를 첨가하여 제작한 대조 키트를 사용한 경우에는 증폭산물이 확인되지 않거나 증폭산물의 양이 상대적으로 매우 적었다(결과 미제시).
For reference, amplification products were not detected or the amounts of amplified products were relatively small when using a control kit prepared by adding a primer to which no specific structure was introduced.
실시예 5: 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 민감도 측정Example 5: Detection of avian influenza virus and sensitivity measurement of simultaneous differentiation detection kits of H5, H7, and H9 types
본 발명에 따라 제작된 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 민감도를 다음과 같이 조사하였다. The sensitivity of the detection of avian influenza virus and the simultaneous detection of H5, H7, and H9 type kits produced according to the present invention was investigated as follows.
조류 인플루엔자 바이러스 H5형의 경우에는 logEID50 = 6.7의 값으로 측정된 표준 바이러스주로부터 추출한 RNA 시료를 십진희석 하여 이를 각각 2 μl씩 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 튜브에 첨가한 다음에 실시예 4의 방법과 유사하게 RT-PCR 및 결과 분석을 실시하여 민감도를 조사하였다. 조류 인플루엔자 바이러스 H7형의 경우에는 logEID50 = 7.7의 값으로 측정된 표준 바이러스주로부터 추출한 RNA 시료를 십진희석 하여 이를 각각 2 μl씩 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 튜브에 첨가한 다음에 실시예 4의 방법과 유사하게 RT-PCR 및 결과 분석을 실시하여 민감도를 조사하였다. 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 경우에는 logEID50 = 6.8의 값으로 측정된 표준 바이러스주로부터 추출한 RNA 시료를 십진희석 하여 이를 각각 2 μl씩 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 튜브에 첨가한 다음에 실시예 4의 방법과 유사하게 RT-PCR 및 결과 분석을 실시하여 민감도를 조사하였다. 이에 대한 결과는 도 4에 제시되어 있다. 민감도 조사 결과로, 조류 인플루엔자 바이러스 H5형의 경우에서는 0.7 logEID50, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형의 경우에서는 3.7 logEID50, 조류 인플루엔자 바이러스 H9형의 경우에서는 1.8 logEID50의 민감도가 조사되었다. 참고로 대조 실험으로 실시된, 특이 구조가 도입되지 않은 프라이머를 첨가하여 제작한 대조 키트를 사용한 경우에는 증폭산물이 확인되지 않아 민감도 조사가 불가능하거나 민감도가 상대적으로 매우 높게 나타났다(결과 미제시). In the case of avian influenza virus type H5, the RNA samples extracted from the standard virus strain measured at logEID 50 = 6.7 were decanted and 2 μl each was detected by avian influenza virus and H5 type, H7 type, and H9 type simultaneously detected After addition to the kit's tube, RT-PCR and results analysis were performed similarly to the method of Example 4 to investigate the sensitivity. In the case of avian influenza virus type H7, the RNA samples extracted from the standard virus strain measured at logEID 50 = 7.7 were diluted decisively with 2 μl each and detected by avian influenza virus and H5, H7, and H9 simultaneously detected After addition to the kit's tube, RT-PCR and results analysis were performed similarly to the method of Example 4 to investigate the sensitivity. In the case of avian influenza virus type H9, the RNA samples extracted from the standard virus strain measured at a logEID 50 value of 6.8 were decanted and 2 μl each of them was detected by avian influenza virus and simultaneously detected by H5, H7, and H9 After addition to the kit's tube, RT-PCR and results analysis were performed similarly to the method of Example 4 to investigate the sensitivity. The results are shown in Fig. As a result of the sensitivity study, the sensitivity of 0.7 logEID 50 for avian influenza virus type H5, 3.7 logEID 50 for avian influenza virus type H7, and 1.8 logEID 50 for avian influenza virus type H9 were investigated. For reference, in the case of using the control kit prepared by adding the primer without specific structure, the amplification product was not confirmed and the sensitivity was not investigated or the sensitivity was relatively high (no result).
상기 결과를 근거로 판단할 때, 본 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 검출과 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스 H5형, 조류 인플루엔자 H7형 및 조류 인플루엔자 H9형의 동시감별검출에 활용되기에 충분한 정도의 민감도를 제공해 줄 수 있으며 기존의 방식에 비교하여 현저하게 개선된 민감도를 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있다.
When judged based on the above results, the avian influenza virus detection and H5, H7, and H9 simultaneous detection kits according to the present invention can be used for the detection of avian influenza virus and clinically important avian influenza virus type H5, avian influenza virus H7 Type and H9 type of avian influenza, and it can provide significantly improved sensitivity compared to the conventional method.
실시예 6: 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 실제 야외 시료에 대한 유효성 조사Example 6: Detection of avian influenza virus and the validation of H5, H7, and H9 type simultaneous discrimination detection kits on actual outdoor samples
본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 실제 야외 시료에 대한 유효성을 다음과 같이 조사하였다. The effectiveness of the detection of avian influenza viruses of the present invention and the H5, H7 and H9 simultaneous discrimination detection kits on actual outdoor samples was investigated as follows.
실제 야외 시료에 대한 유효성 조사에는 129개의 국내 분리주 시료가 사용되었다. 129개의 국내 분리주는 각각 조류 인플루엔자 바이러스 H5형이 24개, 조류 인플루엔자 바이러스 H7형이 4개, 조류 인플루엔자 바이러스 H9형이 101개로 구성되어 있다. 각각의 야외 시료에 대하여 실시예 3에서와 같이 RNA를 추출하여 RNA 시료를 준비하였고, 이렇게 준비된 RNA 시료 2 μl씩을 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트의 튜브에 첨가하였고(2 반복), 또한 분자생물학 실험용 물 18 μl를 첨가하여 RT-PCR 반응액을 준비하였다. 그 다음으로 실시예 4에서와 같은 방식으로 RT-PCR 및 아가로즈 젤 전기영동 분석을 실시하였다. 실험 결과는 표 2에 제시하였다. 129 domestic samples were used for the validation of actual outdoor samples. Each of the 129 domestic strains has 24 avian influenza virus type H5, 4 avian influenza virus type H7, and 101 avian influenza virus type H9. RNA samples were prepared by extracting RNA from each of the outdoor samples as in Example 3, and 2 μl of each of the RNA samples thus prepared was subjected to the avian influenza virus detection of the present invention and H5, H7, and H9 type simultaneous discrimination detection kits (2 replicates), and 18 μl of Molecular Biology Lab water was added to prepare RT-PCR reaction solution. Next, RT-PCR and agarose gel electrophoresis analysis were carried out in the same manner as in Example 4. The experimental results are shown in Table 2.
표 2에서 알 수 있듯이 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트는 100%의 검출 정확성을 나타내었다. 이 결과로부터 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 H5형, H7형, 및 H9형 동시감별검출 키트는 높은 검출(진단) 정확도를 가지고 있으며, 실제 야외 시료들에도 효과적으로 적용 가능함을 확인할 수 있었다.
As shown in Table 2, the avian influenza virus detection and H5, H7, and H9 type simultaneous detection kit of the present invention showed 100% detection accuracy. From these results, it was confirmed that the avian influenza virus detection and H5-type, H7-type, and H9-type simultaneous discrimination detection kits of the present invention have high detection accuracy and can be effectively applied to actual outdoor samples.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Nucleic acid test based avian influenza virus detection kit with improved detection accuracy <130> KP090348 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 1 gctcgagctc ttgttctctg ataggtg 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 2 ggatatccca gtgctgggaa rgayccta 28 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 3 gttagctaac cgaggtcgaa acgta 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 4 gccagctggc aagtgcacca gttga 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 5 ggcatgccta taaaattgtc aagaa 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 6 atggccatac catccatcta ccatt 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 7 gtgtacacat gcycargaca tact 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 8 aragctytgr ttyagtgttg atgtc 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 9 catagatcta tgggaattca gagt 24 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 10 aaaattttgt aatctgcagc 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 11 aaagtaaaca cattaactga aag 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 12 tgacgtcaat ycttccagat tg 22 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 13 tgactagyca yggaagaatc ctgaa 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 14 ggttgcaacc tccytctatg aaycc 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 15 agcatgctyc acacagarca caat 24 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer sequences <400> 16 tgacgtcaca cttgttgttg trtcag 26 ≪ 110 > iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Nucleic acid test based avian influenza virus detection kit with improved detection accuracy <130> KP090348 <160> 16 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 1 gctcgagctc ttgttctctg ataggtg 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 2 ggatatccca gtgctgggaa rgayccta 28 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 3 gttagctaac cgaggtcgaa acgta 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 4 gccagctggc aagtgcacca gttga 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 5 ggcatgccta taaaattgtc aagaa 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 6 atggccatac catccatcta ccatt 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 7 gtgtacacat gcycargaca tact 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 8 aragctytgr ttyagtgttg atgtc 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 9 catagatcta tgggaattca gagt 24 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 10 aaaattttgt aatctgcagc 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 11 aaagtaaaca cattaactga aag 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 12 tgacgtcaat ycttccagat tg 22 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 13 tgactagyca yggaagaatc ctgaa 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 14 ggttgcaacc tccytctatg aaycc 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 15 agcatgctyc acacagarca caat 24 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Specific primer sequences <400> 16 tgacgtcaca cttgttgttg trtcag 26
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