KR20150114497A

KR20150114497A - 섬유증 및 암의 치료방법

Info

Publication number: KR20150114497A
Application number: KR1020157021736A
Authority: KR
Inventors: 레미 앙프; 딘 움; 로버트 왈크작; 브누와 노엘
Original assignee: 장피트
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2015-10-12
Anticipated expiration: 2034-01-20
Also published as: EA201591345A1; SI2948137T1; JP2016506913A; LT2948137T; US10792277B2; CY1121156T1; EP2948137A1; CN105120855B; EA031718B1; SG11201505281PA; IL239715A0; MX361565B; WO2014111584A1; MX2015009251A; PT2948137T; US20170239213A1; PH12015501566A1; ES2702038T3; CA2897258A1; MD4629B1

Abstract

본 발명은 섬유성 질병 및 암을 치료하기 위한 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온의 용도에 관한 것이다.

Description

섬유증 및 암의 치료방법{METHODS OF TREATMENT OF FIBROSIS AND CANCERS}

본 발명은 섬유성 질병(fibrotic disease) 및 암을 치료하기 위한, 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온의 용도에 관한 것이다.

타이로신 키나제는 외부 및 내부 자극에 대해 반응하여 성장, 분화, 물질대사 및 세포자멸사와 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 결정하는, 시그널링 캐스케이드(signaling cascade)의 중요한 매개인자이다. 최근의 진전은 섬유증 또는 암의 병리생리학에서 타이로신 키나제의 역할과 관련되어 있다.

섬유증과 관련하여, 상이한 타이로신 키나제가 질병 진행의 결정인자 및 항-섬유증 치료요법에 대한 잠재적인 표적(potential target)으로 확인되었다. 이는 수용체 타이로신 키나제(예를 들면, PDGF 수용체, VEGF 수용체, EGF 수용체, 및 JAK 키나제) 및 비-수용체 타이로신 키나제(예를 들면, c-Abl, c-Kit, 및 Src 키나제) 둘 다를 포함한다[1]. 모든 섬유성 질병에서, 별 세포(stellate cell)를 포함하는 섬유모세포는 증식하여 근섬유모세포로 활성화된다. 근섬유모세포는 과다증식을 겪는 기본적인 콜라겐-생산 세포 유형이다[2]. PDGF는 간엽성 기원의 세포에 대한 주요 미토겐(mitogen: 유사분열촉진물질)이다. PDGF의 과도한 활성은 기관 섬유증 및 종양형성을 포함하는, 수개의 사람 질환과 관련되어 왔다[3]. 상승된 PDGF 수준 또는 활성은 특히 폐 섬유증, 간 섬유증[2], 피부경화증[4-6], 신장 섬유증식성 질병[7, 8], 특발성 골수섬유증과 같은 골수증식 질병[9, 10], 특히 골수섬유증을 나타내는 급성 거핵아구성 백혈병[11] 및 만성 거핵아구성 백혈병[12-14]의 진행 동안 골수의 백혈구 세포에서의 백혈병 세포에서 보고되어 왔다.

섬유증을 치료하기 위한 가장 유망한 약물은 PDGF 수용체 타이로신 키나제 억제제이다. PDGFR 타이로신 키나제 억제제의 투여는 금속-유도된 폐 손상의 랫트(rat) 모델에서 폐 섬유증[15]을 감소시키고, 랫트에서 만성 동종이식 신장병증을 완화시키는 것으로 밝혀져 왔다[16]. 만성 골수성 백혈병을 갖는 환자에서, 비 선택성 PDGFR 억제제, 이마티니브(Gleevec)는 골수 섬유증의 퇴행을 유도하는 것으로 밝혀졌다[17]. 함께 취하는 경우, 이들 동물 및 예비 임상 연구는, PDGF 수용체 타이로신 키나제의 억제는 다양한 조직에서 섬유성 질병을 위한 실행가능한 치료 전략을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.

PDGFR 경로의 활성을 차단하는 제제 외에도, 기타 타이로신의 비정상적인 활성을 차단하는 모노클로날 항체 및 소-분자 억제제 둘 다는 각종 섬유성 질병(예를 들면, 특발성 폐 섬유증, 신장 섬유증, 간 섬유증, 및 피부 섬유증)의 예비 임상 모델에서 시험되었다. 이러한 연구들의 결과는 섬유성 질병에서 상이한 화합물과 함께 촉망되고 즉각적인 임상 시험이었다. 지금까지, 특발성 폐 섬유증에서 인테다니브 및 특발성 폐 섬유증에서 이마티니브를 사용한 연구로부터의 결과가 보고되어 왔다. 이러한 연구들 중의 어느 것도 긍정적인 초기 결과를 보고하지 못했지만, 항-섬유증 효능에서의 촉망되는 경향은 새로운 부류의 효과적인 항-섬유증의 표적화된 치료요법에 대해 본 발명자들에게 희망을 주었다[1].

암과 관련하여, 성장 인자의 과발현 및 PDGFRβ, VEGFR과 같은 특정한 수용체 타이로신 키나제의 후속적인 활성화는 Raf/MEK/ERK 미토겐-활성화된 단백질(MAP) 키나제 시그널링 경로의 과-활성화를 유발할 수 있다[18, 19]. Raf/MEK/ERK 미토겐-활성화된 단백질(MAP) 키나제 시그널링 경로의 활성화는 세포 증식 및 생존을 직접적으로 증가시키는 것으로 공지되어 있으며, VEGF 및 PDGF의 생산을 증가시킴으로써 혈관형성을 간접적으로 자극할 수 있다. 이러한 과정들은 종양 성장을 위해 필요하며, 이에 따라 Raf/MEK/ERK 시그널링 경로의 분자 성분은 암, 특히 간세포 암종(HCC)을 치료하기 위한 잠재적인 치료학적 표적이다[20].

항암 약물 소라페니브는 VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFRβ, 및 키트 및 Raf 세린/트로오닌 키나제 동형(예를 들면, Raf-1 및 B-Raf)을 포함하는, 혈관형성에서 중요한 상류(upstream) 수용체 타이로신 키나제를 억제한다. 따라서, 소라페니브는 종양 세포 사멸을 유도하고 혈관형성을 억제한다. 소라페니브는 또한 잘 확립되지 않은 기전을 통해 수개의 종양 세포주에서 세포자멸사를 유도하는 것으로 밝혀져 왔다[20, 21]. 소라페니브는 외과적 절개 또는 간 이식에 의한 치료를 받을 수 없는 진보된 HCC를 갖는 환자를 위한 첫번째 FDA-승인된 전신 치료요법이다.

이는 모두, 섬유성 질병 또는 암을 치료하기 위한, 타이로신 키나제에 작용하는 새로운 치료제를 확인하는 관심을 나타낸다.

발명의 요약

본 발명은 섬유성 질병 및 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조 시 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온의 신규한 용도를 제공한다. 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온은 수용체 및 비-수용체 타이로신 키나제의 억제 및/또는 섬유증에서 이들의 세포내 시그널링 경로의 억제를 통해 항섬유증 및 항암 특성을 갖는다.

도면 및 표의 설명

도면, 표 및 본문에 사용된 약어:

- Col1a1 = 콜라겐, 제I형, 알파 1

- Col4a1 = 콜라겐, 제4형, 알파 1

- Cpm = 분당 카운트

- Ctrl = 대조군 또는 비히클(vehicle)

- EGFR = 표피 성장 인자 수용체

- ERK = 세포외 시그널 조절된 키나제

- FBS = 태아 소 혈청

- FCS = 태아 송아지 혈청

- FDA = 식품 의약국

- FGFR = 섬유모세포 성장 인자 수용체

- GIST = 위장관 간질성 종양

- HCC = 간세포 암종

- HGFR = 간세포 성장 인자 수용체

- hHSC = 사람 원시 간 별세포

- JAK = 야누스 키나제(Janus Kinase)

- MAP = 미토겐-활성화된 단백질

- MEK = 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제

- PDGFR = 혈소판-기원한 성장 인자 수용체

- RCC = 신장 세포 암종

- RT-PCR= 역전사 폴리머라제 쇄 반응

- TGFβ = 형질전환 성장 인자 베타 수용체

- VEGFR = 혈관 내피 성장 인자 수용체

도 1. PDGF - BB 에 의해 유도된 hHSC 세포 증식을 방해하는 화학식 I의 화합물

사람 원시 간 별세포(hHSC)의 증식은 간엽세포에 대한 주요 미토겐인, PDGF-BB(10ng/mL)로 시험관내에서 자극되었다. 강력한 PDGFR 억제제인 크레놀라니브는 양성 대조군으로서 사용되었다. 크레놀라니브 및 화학식 I의 화합물은 혈청을 함유하지 않는 배지(serum free medium) 속에서 PDGF-BB로 자극하기 1시간 전에 세포 배양물에 첨가되었다. 세포 증식은 브로모덱시우리딘(BrdU)의 혼입을 측정함으로써 항온처리 24시간 후에 평가하였다.

실험 결과는 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타내었으며 막대 그래프로 도시하였다. 통계적 분석은 Sigma Plot 11.0 소프트웨어를 사용하여, 일원 변량 분석(one-way ANOVA)에 이은 본페로니 사후 검증(Bonferroni post-hoc test)을 사용하여 수행하였다.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001(PDGF-BB 10ng/mL 그룹에 대한 비교)]

도 2. 혈청에 의해 유도된 hHSC 세포 증식을 방해하는 화학식 (I)의 화합물

사람 원시 간 별 세포(hHSC)의 증식을 태아 소 혈청, FBS(0.5%)로 시험관내에서 자극하였다. 강력한 PDGFR 억제제인 크레놀라니브를 양성 대조군으로서 사용하였다. 크레놀라니브 및 화학식 I의 화합물을 FBS로 자극하기 1시간 전에 세포 배양물에 가하였다. 세포 증식을 브로모데옥시우리딘(BrdU)의 혼입을 측정함으로써 항온처리 48시간 후에 평가하였다.

실험 결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며 막대 그래프로 도시하였다. 통계적 분석은 Sigma Plot 11.0 소프트웨어를 사용하여, 일원 변량 분석(one-way ANOVA)에 이은 본페로니 사후 검증(Bonferroni post-hoc test)을 사용하여 수행하였다.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001(FBS 0.5% 그룹에 대한 비교)]

도 3. PDGF - BB 유도된 PDGFR β 인산화를 방해하는 화학식 I의 화합물

PDGFRβ의 인산화를 혈청을 함유하지 않은 조건하에서 PDGF-BB를 사용하여 hHSC에서 유도하였다. HSC를 우선 크레놀라니브(PDGFR 억제제) 또는 화학식 I의 화합물로 60분 동안 처리한 후 PDGF-BB(30ng/mL)와 함께 10분 동안 항온처리하였다. 이후에, 타이로신 751에서 PDGFRβ 인산화의 정도를 배양 웰 속에 고정시킨 후, 사람 포스포-PDGFRβ(Y751) 세포계 ELISA 키트(제조원: R&D Systems)을 사용하여 측정하였다.

실험 결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며 막대 그래프로 도시하였다. 통계적 분석은 Sigma Plot 11.0 소프트웨어를 사용하여, 일원 변량 분석에 이은 본페로니 사후 검증을 사용하여 수행하였다.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001(PDGF-BB 30ng/mL 그룹에 대한 비교)]

도 4. 염증성 창자병의 모델에서 결장 섬유증의 유도를 예방하는 화학식 I의 화합물을 사용한 치료

TNBS-유도된 결장염에서 섬유성 반응의 인지된 생물마커인, α-SMA의 발현은 화학식 I의 화합물의 투여에 의해 부분적으로 예방되었다.

실험 결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며 막대 그래프로 도시하였다. 통계적 분석은 t-시험을 사용하여 수행하였다[*: p<0.05].

도 5. 활성화된 hHSC 에서 중간의 전구세포자살 반응( proapoptotic response )을 유도하고 스타우로스포린의 전구세포자살 효과를 유의적으로 강화시키는 화학식 I의 화합물을 사용한 치료

단독으로 또는 광범위한 스펙트럼의 단백질 키나제 억제제인, 스타우로스포린과 조합된 화학식 I의 화합물의 전구세포자살 특성을 hHSC에서 평가하였다. 우선 HSC를 혈청 고갈에 16시간 동안 노출시킨 후 화학식 I의 화합물 단독 또는 화학식 I의 화합물과 스타우로스포린의 조합물을 사용하여 후속적으로 치료하였다. 이들 치료의 전구세포자살 효과를 Caspase-Glo^® 3/7 활성 검정 키트를 사용함으로써 평가하였다.

실험 결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며 막대 그래프로 도시하였다. 통계적 분석은 Sigma Plot 11.0 소프트웨어를 사용하여, 쌍을 이루지 않은 이원 변량 분석(unpaired two-way ANOVA)에 이은 본페로니 사후 검증을 사용하여 수행하였다.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001("스타우로스포린 0.3μM" 그룹에 대한 비교)

‡: p<0.05; ‡‡: p<0.01; ‡‡‡: p<0.001("w/o 스타우로스포린" 그룹의 비교)]

발명의 상세한 설명

본 발명은 섬유증 및 암을 치료하기 위한 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온의 용도에 관한 것이며, 상기 화합물은 세포외 매트릭스 및 섬유증의 형성에 관여하는 주요 세포 유형인 별 세포를 포함하는 사람 섬유모세포의 예측하지 않은 방식의 증식 및 활성화를 감소시킬 수 있는 화합물이다.

본 발명에 따라 사용될 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온은 다음의 화학식 I을 갖는다:

[화학식 I]

선행 기술에서는, 항-섬유증 또는 항암 효과가 수용체 타이로신 키나제의 직접적이고/이거나 간접적인 억제로 인하여 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온과 관련되어 있다고 교시하지 않고 있다.

따라서, 본 발명은 섬유성 질병의 치료 또는 예방용, 또는 타이로신 키나제 관련 암의 치료 또는 예방용 방법에서 사용하기 위한 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온에 관한 것이며, 여기서 섬유성 질병은 간 섬유증은 아니다.

추가의 국면에서, 본 발명은 콜라겐 섬유의 생산에 관여하고/하거나 세포외 매트릭스의 생산에 관여하는 세포의 증식 및/또는 활성화의 억제시 사용하기 위한 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 콜라겐 섬유의 생산에 관여하고/하거나 세포의 매트릭스의 생산에 관여하는 세포의 세포자멸사를 촉진하는데 사용하기 위한 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.

본 발명에 따라서, 용어 "섬유증"은 특히 폐, 심장, 근육, 피부, 연조직(예를 들면, 종격(mediastinum) 또는 후복막강), 골수, 창자, 및 관절(예를 들면, 무릎, 어깨 또는 다른 관절) 섬유증을 포함한다. 특히, 용어 "섬유증"은 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 심내막심근 섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 거대 섬유증(탄광부 진폐증의 합병증), 신성 전신 섬유증(nephrogenic systemic fibrosis), 크론병(Crohn's disease,) 켈로이드(keloid), 오래된 심근경색, 피부경화증/전신 섬유증, 관절섬유증(arthrofibrosis) 및 일부 형태의 유착 관절낭염을 포함한다. 용어 "섬유증"은 본 발명의 내용에서 간 섬유증을 포함하지 않는다.

수용체 타이로신 키나제는 암에서 광범위하게 풍부하며 조절되지 않고(dysregulate), 소 분자 또는 항체를 사용하여, 수십년 동안 표적화된 치료요법에 초점이 맞추어져 왔다[22-24].

수용체 타이로신 키나제-표적화된 암 치료요법의 선택된 예

암의 유형	표적	참조
유방 암	HER2, EGFR, PDGFR, FGFR, IGFR, VEGFR, SRC	[25-28]
만성 골수성 백혈병	BCR-ABL, SRC, TEC	[29-31]
직장결장 암	EGFR, VEGFR	[32-34]
피부섬유육종	c-KIT, PDGFR, VEGFR	[35-38]
GIST	PDGFR, c-KIT, VEGFR, HER2	[39-42]
신장암	VEGFR, PDGFR, c-KIT	[43-46]
폐암	EGFR, VEGFR, ALK	[47-49]
비만세포증	BCR-ABL, PDGFR, c-KIT	[50-52]
신경섬유종증 제2형	PDGFR, EGFR, VEGFR	[53-57]
췌장암	VEGFR, mTOR	[58, 59]
전립샘암	VEGFR, PDGFR, FGFR, EGFR, IGF1R	[28, 60]
갑상선암	VEGFR, EGFR, c-met, RET	[61, 62]

본 발명에 따르면, 용어 "타이로신 키나제-관련 암"은 단일의 타이로신 키나제 수용체 또는 타이로신 키나제 수용체의 그룹의 조절되지 않는 활성 또는 발현에 의존하는 암의 어떠한 형태도 의미한다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 타이로신 키나제는 수용체 타이로신 키나제, 보다 특히 PDGFR, VEGFR, FGFR, EGFR, c-키트, 또는 JAK 키나제 또는 비-수용체 타이로신 키나제, 보다 특히 c-Abl, 또는 Src 키나제이다. 특수한 구현예에 따라서, 용어 암은 간세포 암종, 신장 세포 암종, 위장 기질 종양(GIST), 위암, 신경섬유종과 관련된 수막종, 신경내분비 췌장 종양, 외분비 췌장 종양, 백혈병, 골수증식성/골수형성장애병(myelodisplastic disease), 비만세포증, 피부섬유육종, 유방, 폐, 갑상샘 및 직장결장암, 전립샘암을 포함하는 고형 종양을 포함한다.

특수한 국면에서, 본 발명은 간암, 특히 간세포 암종의 치유적 치료에 관한 것이다.

다른 국면에서, 본 발명은 간암과는 상이한 암의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 특히 당해 암은 신장세포 암종, 위장 기질 종양(GIST), 신경섬유종과 관련된 수막종, 신경내분비 췌장 종양, 외분비 췌장 종양, 백혈병, 골수증식성/골수형성장애병, 비만세포증, 피부섬유육종, 유방, 폐, 갑상샘 및 직장결장암을 포함하는 고형 종양, 전립샘암을 포함한다. 특수한 구현예에서, 예방되거나 치료된 암은 섬유성 암이다.

치료 또는 예방은 화합물 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물을 언급된 질환을 가진 환자에게 투여하여 이의 진행을 치유하거나, 지연시키거나 둔화시킴으로써, 환자의 상태를 개선시키거나 건강한 피검자, 특히 섬유성 질병으로 진행될 위험이 있는 피검자에게 투여함을 포함한다.

본 발명에 따라 치료될 피검자는 앞서의 약물 치료와 같은 섬유성 질병 또는 암과 관련되거나, 병리학, 유전형, 위험 인자에 대한 노출, 바이러스 감염, 및 영상화 방법과 관련된 수개의 기준, 및 영상화 방법 및 면역학적, 생화학적, 효소적, 화학적, 또는 핵산 검출에 의해 평가될 수 있는 어떠한 다른 관련된 생물마커를 기준으로 선택될 수 있다.

1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온은 상이한 안정한 이성체 형태를 가질 수 있다.

화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온의 합성은 예를 들면, 제WO2004/005233호의 화합물(29)에 대해 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

화학식 I의 화합물은 화학식 I의 화합물의 유기 또는 무기 염기 또는 산으로부터 수득된 약한- 또는 비-독성 염인 약제학적으로 허용되는 염으로 제형화될 수 있다. 이들 염은 화합물의 최종 정제 단계 동안에 또는 염을 앞서의 정제된 화합물내로 혼입함으로써 수득될 수 있다.

섬유성 질병 또는 암의 치료를 위한 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 맥락에서 허용되는 하나 또는 수개의 부형제 또는 비히클(예를 들면, 약제학적 용도와 혼용성이고 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된 염수 용액, 생리학적 용액, 등장성 용액 등)을 포함할 수 있다. 이들 조성물은 분산제, 가용화제, 안정화제, 방부제 등 중에서 선택된 1개 또는 수개의 제제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 이들 제형에 유용한 제제 또는 비히클(액체 및/또는 주사가능한 및/또는 고체)은 특히 메틸셀룰로즈, 하이드록시메틸셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈, 폴리소르베이트 80, 만니톨, 젤라틴, 락토즈, 야채 오일, 아카시아, 리포좀 등이다. 이들 조성물은 궁극적으로 연장되고/되거나 지연된 방출을 보증하는 생약 형태 또는 장치를 이용하여, 주사가능한 현탁제, 겔제, 유제, 환제, 좌제, 산제, 겔 캡제(gel cap), 캅셀제, 에어로졸제 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 종류의 제형을 위하여, 셀룰로즈, 카보네이트 또는 전분과 같은 제제를 유리하게 사용할 수 있다.

화학식 I의 화합물은 위에서 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 사용함으로써 유효량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "유효량"은 바람직한 치료학적 결과를 생산하기에 충분한 화합물의 양을 말한다.

화학식 I의 화합물은 상이한 방식 및 상이한 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 이는 전신계 방식으로, 경구로, 비경구적으로, 흡입에 의해, 또는 예를 들면, 정맥내, 근육내 경로, 피하 경로, 경피 경로, 동맥내 경로 등과 같은 주사로 투여될 수 있다. 경구 투여가 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 대한 바람직한 투여 경로이다.

투여와 관련된 빈도 및/또는 투여량은 환자의 기능, 병리학, 투여 형태 등에 있어서, 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 조정될 수 있다. 전형적으로, 화학식 I의 화합물은 투여당 0.01mg 내지 1g, 바람직하게는 투여당 1mg 내지 100mg으로 변하는 투여량에서 섬유성 질병 또는 암의 치료를 위해 투여될 수 있다. 투여는 경우에 따라 매일 또는 심지어 수회 수행될 수 있다.

특수한 구현예에에서, 본 발명은 적어도 하나의 다른 치료학적으로 활성인 제제와 함께, 섬유성 질병 또는 암의 치료를 위한 화학식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다. 다른 활성제는 특히 다른 항-섬유성 제제 또는 다른 항암제, 예를 들면, 소라페니브로부터 선택될 수 있다. 본 발명자들은, 화학식 I의 화합물이 전구세포자살성 화합물의 전구세포자살성 활성을 강화시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 또한 전구세포자살성 약물과 조합된 화학식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 화학식 I의 화합물은 스타우로스포린과 같은, 섬유아세포에서 전구세포자살성 효과를 갖는 키나제 억제제와 함께 사용될 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물, 특히 당해 화합물을 함유하는 약제학적 조성물 형태의 투여를 포함하는, 섬유성 질병 또는 암의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예를 참조로 추가로 설명된다.

실시예들

물질 및 방법

화합물은 디메틸 설폭사이드(DMSO, Fluka 제품 번호 41640) 속에 용해하였다.

hHSC 배양 및 처리 조건

사람 원시 간 별세포(hHSC)(제조원: ScienCell)를 2% 태아 소 혈청(FBS, ScienCell 제품 번호 0010), 1% 페니실린/스트렙토마이신(ScienCell 제품 번호 0503) 및 별 세포 성장 보충물(SteCGS; ScienCell 제품 번호 5352)로 보충된 STeCM 배지(ScienCell 제품 번호 5301) 속에서 배양하였다. 배양 플라스틱을 폴리-L 라이신(Sigma 제품 번호 P4707)으로 피복시켰다. hHSC를 1.2 x 10⁴개의 세포/웰(well)의 밀도에서 96-웰 플레이트내로 플레이팅하고 밤새 37℃ 및 5% CO₂에서 배양한 후, 세포를 PBS(Invitrogen 제품 번호 14190)로 세척하고 성장 배지를 혈청을 함유하지 않고 SteCGS를 함유하지 않는 배지로 추가로 24시간 동안 교체하였다.

PDGF -유도된 증식의 측정

세포 증식은 브로모데옥시우리딘(BrdU) 혼입에 의해 BrdU 표지화 및 검출 키트(Roche 제품 번호 11647229001)를 사용하여 측정하였다. BrdU 표지화 용액을 세포에 가한 후, 고정 전 다른 4시간 동안 항온처리하고, 뉴클레아제를 첨가하고, 항-BrdU-POD 및 퍼옥시다제 기질을 첨가하였다. 405nm(690nm에서 참조 파장 사용)에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기(제조원: Tecan)를 사용하여 측정하였다.

PDGF -유도된 PDGFR β 인산화 검정

hHSCs에서 PDGFRβ 인산화를 세포계 ELISA 키트(R&D Systems 제품 번호 KCB1767)를 사용하여 제조업자의 지시사항에 따라 측정하였다. 간단하게는, PDGF로 자극한 후, 세포를 고정시키고 웰 속에서 투과시켰다. 이후에, PDGFRβ 인산화를 이중 면역효소 표지화 공정을 사용함으로써 측정하였다. 세포를 2개의 주요 항체: 타이로신 751에서 PDGFRβ의 인산화를 검출하는 포스포-특이적인 항체, 및 PDGFRβ의 인산화 형태 및 비-인산화 형태 둘 다를 인지하는 대조군 항체와 함께 동시에 항온처리하였다. 서양 고추냉이-퍼옥시다제(HRP) 또는 알칼린 포스파타제(AP)로 표지된 2개의 제2 항체, 및 HRP 또는 AP에 대한 2개의 분광학적으로 명백한 형광원성 기질을 검출에 사용하였다. 인산화된 PDGFRβ의 형광성을 팬-단백질(pan-protein)의 것으로 표준화하였다. 형광성을 ELISA 플레이트 판독기(제조원: Tecan)를 사용하여 측정하였다.

TGF -β1을 사용한 HSC 의 활성화

사람 원시 간 별 세포(hHSC)(제조원: ScienCell)을 위에서 기술한 바와 같은 표준 조건 하에서 배양하였다. 유전자 발현 양식을 측정하기 위한 실험을 위해, hHSC를 1.4 x 10⁵개의 세포/웰의 밀도에서 플레이팅(plating)하고 밤새 배양하였다. 다음날, 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS(Invitrogen 제품 번호 14190)로 세척하고 혈청을 함유하지 않고 SteCGS를 함유하지 않는 배지를 추가로 16시간 동안 첨가하였다. 세포를 화합물과 TGFβ1(1ng/mL)으로 혈청을 함유하지 않고 SteCGS를 함유하지 않는 배지 속에서 처리하였다.

유전자 발현

전체 RNA를 RNeasy^® 미니 키트(제조원: Qiagen)를 사용하여 제조업자의 지시사항에 따라 분리하였다. 250ng의 전체 RNA를 cDNA 속에서 M-MLV RT(몰로니 설치류 백혈병 바이러스 리버스 트랜스퍼라제(Moloney Murine Leukemia Virus reverse Transcriptase)(Invitrogen 제품 번호 28025)) 속에서 RT 완충액 1x(제조원: Invitrogen), 1mM DTT(제조원: Invitrogen), 0.18mM dNTP(제조원: Promega), 200ng pdN6(제조원: Amersham) 및 30U의 RNase 억제제(제조원: Promega)를 사용하여 역 전사시켰다.

이후에, 적량적인 PCR을 MyiQ 단색상 실시간 PCR 검출 또는 iCycler iQ 다중 실시간 PCR 검출 시스템(둘 다의 제조원: Biorad)을 사용하여 수행하였다. 요약하면, PCR 반응을 96 웰 플레이트에서 5μL의 5x 희석된 역 전사 혼합물 상에서 iQ SYBR 그린 슈퍼믹스 키트(Green Supermix kit)를 사용하여 수행하였다. 실험 조건은 다음과 같았다: 25μL의 용적 반응, 3mM의 MgCl₂, 및 0.5μL의 각각의 역방 및 전방 프라이머(10pMol).

발현 수준을 참조물로서 36B4 유전자의 발현을 사용하여 표준화하였다.

각각의 유전자의 경우, 표준 곡선을 가장 우수한 점(적어도 3개의 점)을 선택함으로써 그려서 100%에 근접한 PCR 반응 효율 및 1에 근접한 상관 계수를 갖도록 하였다. 발현 수준을 살림유전자(housekeeping gene) 및 표적 유전자(각각의 표적 유전자의 특이적인 PCR 효율을 고려함)에 대한 표준 곡선 방정식을 사용하여 측정하였다.

유도 인자 대 TGFβ1은 다음과 같이 측정하였다:

유도 인자 =

여기서,

A는 시험한 그룹에서 연구된 유전자의 발현 수준이고,

B는 TGFβ1 1ng/mL 그룹에서 연구된 유전자의 발현 수준이다.

따라서, 유도 인자가 낮을 수록 목적 화합물은 hHSC의 TGFβ1 활성화를 보다 더 억제한다. 실험 결과는 유도 인자의 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타내었다.

카스파제 3/7 활성화의 측정에 의한 세포자멸사의 평가

사람 원시 간 별 세포(hHSC)(제조원: ScienCell)를 위에서 기술한 바와 같이 표준 조건 하에서 배양하였다. 세포자멸사 검정을 위해, hHSC를 1.2 x 10⁴개의 세포/웰의 밀도로 흑색 96-웰 플레이트내로 플레이팅하고 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 배양한 후, 세포를 PBS(Invitrogen 제품 번호 14190)로 세척하고 성장 배지를 혈청을 함유하지 않고 SteCGS를 함유하지 않는 배지로 추가로 16시간 동안 교체하였다. 세포를 화학식 I의 화합물 단독 또는 스타우로스포린의 조합물로, 혈청을 함유하지 않고 SteCGS을 함유하지 않는 배지 속에서 24시간 동안 처리하였다. 카스파제-3 및 -7 활성을 프로메가(Promega)(Promega 제품 번호 G8093)로부터의 검정을 사용하여 제조업자의 지시사항에 따라서 측정하였다. 항온처리 기간 말기에, 100μL의 Caspase-Glo^® 3/7 시약을 100μL의 블랭크, 음성 대조군 세포 또는 배양 배지 속에서 처리된 세포를 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 세포 분해 후, 활성화된 카스파제 3 및 7에 의한 기질(DEVD 서열 함유)의 분해를 테칸(Tecan)으로부터 전통적인 플레이트 판독기 속에서 발광성 시그널을 측정함으로써 측정하였다. 발광성은 처리된 세포속에 존재하는 카스파제의 양에 비례하였다.

FGFR , PDGFR , VEGFR 및 c- Kit 단백질 키나제 활성 억제의 측정

화학식 I의 화합물에 의한 키나제 억제를 하기 표에 나타낸 바와 같이 10개의 선택된 키나제에서 10μM 농도로 시험하였다. 방사측정 단백질 키나제 검정(³³PanQinase^® 활성 검정)을 키나제 활성을 측정하기 위해 사용하였다. 모든 단백질 키나제에 대한 검정은 70 mM HEPES-NaOH pH 7.5, 3 mM MgCl₂, 3 mM MnCl₂, 3μM Na-오르토바나데이트, 1.2mM DTT, ATP(다양한 양, 각각의 키나제의 명백한 ATP-Km에 상응, 참조: 표 1), [γ-³³P]-ATP(웰당 대략 8 x 10⁵ cpm), 단백질 키나제(가변량, 참조: 표 1), 및 기질(가변량, 참조: 하기 표)을 함유하였다.

시험한 단백질 키나제에 대한 검정 매개변수

반응 콕테일(cocktail)을 30℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 반응을 50μl의 2% (v/v) H₃PO₄로 정지시키고, 플레이트를 통기시키고 200μL의 0.9%(w/v) NaCl로 2회 세척하였다. ³³P의 혼입을 미세플레이트 신틸레이션 카운터(microplate scintillation counter)(제조원: Microbeta, Wallac)로 측정하였다.

각각의 키나제에 대해, 완전한 반응 콕테일이 들어있으나, 키나제가 없는 3개 웰의 cpm의 중간 값을 "저 대조군"으로 정의하였다. 당해 값은 단배질 키나제의 부재하에서 그러나 기질의 존재하에서 플레이트에 대한 방사활성의 비특이적인 결합을 반영한다. 또한, 각각의 키나제의 경우 완전한 반응 콕테일을 함유하나 어떠한 화합물도 함유하지 않는 3개의 다른 웰의 cpm의 중간값을 "고 대조군", 즉 어떠한 억제제의 부재하에서도 완전한 활성으로 취하였다. 고 대조군과 저 대조군 사이의 차이는 각각의 키나제에 대해 100% 활성으로 취하였다.

데이타 평가의 일부로서, 각각의 키나제의 저 대조군 값을 고 대조군 값 및 또한 상응하는 "화합물 값"으로부터 감하였다. 각각의 화합물에 대한 잔류 활성(%)을 다음 식을 사용하여 계산하였다:

잔류 활성(%) = 100 X [(화합물의 cpm - 저 대조군) / (고 대조군 - 저 대조군)]

사람 종양 세포주 증식의 억제의 평가

당해 실험은, 화학식 I의 화합물의 시험관내 암 세포 증식에 있어서의 직접적인 억제 효과를 입증하였다. 22개의 사람 종양 세포주를 항온처리기 속에서 5% CO₂ 속에서 37℃에서 10% FBS를 함유하는 ATCC로부터의 완전 배지 속에서 배양하였다. 대수기(log-phase) 세포를 증식 검정에 사용하였다. 세포를 수집하고, 계수한 후, 96-웰 플레이트 속에서 적합한 밀도로 씨딩(seeding)하고 16 내지 24시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 다양한 농도의 화학식 I의 화합물을 첨가(8개 농도, 100μM로부터 출발하여 강하되는 3배 희석)하였다. 처리 배지를 72시간의 증식 검정 동안에 매 24시간마다 새롭게 하였다. 약물-처리된 세포 및 대조군 세포를 CellTiter-Glo^® 키트(제조원: Promega)를 사용하여 분석하였다. 간략하게, CellTiter-Glo^® 시약을 각각의 시험 웰에 가하고 오비탈 진탕기(orbital shaker)에서 2분 동안 혼합하였다. 플레이트를 90g에서 짧게 원심분리하고 실온에서 추가로 10분 동안 항온처리하여 발광성 시그널을 안정화시켰다. 발광성 시그널을 PHERAstar Plus 상에서 검출하였다.

대장염 모델에서 대장 벽 섬유증 발달의 평가

화학식 I의 화합물을 30mg/kg/일에서 스프라그 다울리 랫트(Sprague Dawley rat)에게 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS)에 의한 대장염 유도 5일 전부터 출발하여 안락사까지 경구 제공하였다.

대장염의 유도를 위해, 스프라그 다울리 랫트를, 펜토바르비탈을 복강내 주사하여 2시간 동안 마취하였다. 대장염을 항문으로부터 8cm 부위에 TNBS(40% 에탄올 중 80mg/kg)을 직장내 주사하여 유도하였다. 동물을 TNBS 투여 후 4일째에 희생시키고 화학식 I의 화합물의 예방 효과를 유전자 발현 검정을 사용하여 평가하였다.

대장 시료 속에서 α- SMA 유전자 발현 연구

전체 RNA를 RNeasy^® 미니 키트(제조원: Qiagen)를 사용하여 제조업자의 지시사항에 따라 분리하였다. 1㎍의 전체 RNA를 cDNA 속에서 M-MLV RT(몰로니 설치류 백혈병 바이러스 리버스 트랜스크립타제)(Invitrogen 제품 번호 28025)를 사용하여 RT 완충액 1x(제조원: Invitrogen), 1mM DTT(제조원: Invitrogen), 0.18mM dNTP(제조원: Promega), 200ng pdN6(제조원: Amersham) 및 30U의 RNase 억제제(제조원: Promega)의 존재 하에 역 전사시켰다. 이후에, 정량적 PCR을 CFX96 Touch^TM 실시간 PCR 검출 시스템(제조원: Biorad)을 사용하여 수행하였다. 요약하면, PCR 반응을 96웰 플레이트 속에서 5μL의 5x 희석된 역 전사 혼합물 상에서 iQ SYBR 그린 슈퍼믹스 키트(Green Supermix kit)를 사용하여 수행하였다. 실험 조건은 다음과 같았다: 25μL의 용적 반응, 3mM의 MgCl₂, 및 0.5μL 각각의 역방 및 전방 프라이머(10pMol).

각각의 유전자에 대해, 표준 곡선을 가장 우수한 지점(적어도 3개의 지점)을 선택함으로써 그려서 PCR 반응 효율이 100%에 근접하도록 하고 상관 계수가 1에 근접하도록 하였다. 발현 수준을 살림유전자 및 표적 유전자(각각의 표적 유전자의 특이적인 PCR 효능을 고려함) 둘 다에 대한 표준 곡선 식을 사용하여 측정하였다.

유도 인자 대 TNBS-처리된 랫트를 다음과 같이 측정하였다:

유도 인자 =

여기서, A는 TNBS + 30 mg/kg/일 그룹에서 화학식 I의 화합물내 연구된 유전자의 발현 수준이고

B는 TNBS 그룹에서 연구된 유전자의 발현 수준이다.

따라서, 유도 인자가 낮을 수록 목적 화합물은 결장 벽의 TNBS-유도된 섬유증을 더 잘 억제한다. 실험 결과는 유도 인자의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현하였다.

결과 및 결론:

PDGF의 과도한 활성은 기관 섬유증 및 종양생성을 포함하는 수개의 사람 질환과 관련되어 있다. PDGF는 이들의 증식, 이주 및 생존을 자극함으로써 근섬유증의 확장에 있어 중요한 역할을 한다.

기대하지 않게, 본 발명자들의 실험 데이타는, 화학식 I의 화합물이, 투여량-의존적인 방식으로, PDGF를 사용한 치료(도 1) 또는 혈청을 사용한 치료(도 2)에 의해 유도되었던 hHSC의 증식을 억제함을 나타내었다. 도 1 및 2에서 입증되는 바와 같이, 화학식 I의 화합물의 효능은 선택적인 PDGFR 억제제, 크레놀라니브의 효능과 비교가능하다. 화학식 I의 화합물은 항-증식 특성을 가지며 PDGFR 시그널링 경로의 기능적 활성화를 방해한다. 리간드-유도된 수용체 동종- 또는 이종이량체화는 PDGFR의 세포질성 도메인내에서 특수한 타이로신 잔기의 자가인산화 및 포스파티딜이노시톨 3 키나제(PI3K), Ras-MAPK, Src 계열 키나제 및 포스포리파제 Cγ(PLCγ)를 포함하는 일부 시그널 형질유도 경로의 활성화를 초래한다. 이는 세포 증식 및 생존의 자극을 생성한다.

기대하지 않게, 본 발명자들의 실험 데이타는, 화학식 I의 화합물이 PDGF-BB에 의한 hHSC에서 유도되었던 PDGFRβ에서 타이로신 751의 인산화를 억제함을 나타내었다. 화학식 I의 화합물에 의한 억제는 투여량-의존적이며 선택적인 PDGFR 억제제, 크레놀라니브를 사용하여 수득된 억제와 같이 효과적이다(도 3).

섬유증과 관련하여, 상이한 수용체 타이로신 키나제가 질병 진행의 결정인자 및 항-섬유증 치료요법에 대한 잠재적인 표적으로 이미 확인되었다. 최근의 전임상 결과는, PDGFR, VEGFR 및 FGFR 활성화된 경로의 동시 억제가 PDGFR 경로를 보다 선택적으로 억제하는 치료와 비교하여 폐 섬유증 모델에서 향상된 항-섬유증 활성을 생성하였음을 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 발명자들은, 화학식 I의 화합물이 섬유증 및 암 발달 둘 다에 관여하는 수용체 타이로신 키나제, PDGFR, VEGFR, FGFR을 포함하는, 선택된 키나제의 키나제 활성을 억제할 수 있었음을 기대하지 않게 발견하였다.

생화학적 키나제 활성 검정에서 측정된 바와 같은 선택된 수용체 타이로신 키나제의 키나제 활성을 억제하는 화학식 I의 화합물. 보고된 결과는 10μmole/L의 농도에서 수득되었다 .

	억제률(%)
FGFR1	20%
FGFR2	61%
FGFR3	42%
FGFR4	41%
VEGFR1	47%
VEGFR2	70%
VEGFR3	28%
c-KIT	74%
PDGFRα	4%
PDGFRβ	61%

표 3에 나타낸 바와 같이, 발명자들은, 키나제 억제 특성을 지시하는 것 외에도, 화학식 I의 화합물이 TGFβ1 처리시 유도되는 αSMA, Col1α1, Colα1, TGFβR1과 같은 전통적인 전구섬유증 유전자 및, 이미 발표된 문헌[63]으로부터 판단된 것으로서 섬유증의 발달과 관련된 VEGFR1, VEGFR2, FGFR1, 타이로신 키나제 수용체의 둘 다의 발현을, 활성화된 hHSC에서, 억제할 수 있었던 것을 기대하지 않게 발견하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 화학식 I의 화합물의 유전자 억제 프로파일은 PDGFR, VEGFR, RAF 및 KIT를 표적하는 타이로신 키나제 억제제인, 소라페니브를 사용하여 수득된 것과 매우 유사하였다. 소라페니브는 전임상 모델에서 중요한 항-섬유증 활성 및 간세포 암종(HCC) 및 신장 세포 암종(RCC)으로서의 이러한 암의 치료시 임상 효능이 이미 입증되어 왔다[64-66].

전섬유 및 암 관련된 유전자의 발현은 혈청이 함유되지 않은 조건에서 TGFβ1(1ng/mL)을 사용한 치료에 의해 주요 사람 간 별 세포(hHSC)에서 유도되었다. 항-섬유증 및 항암 특성을 발휘하는 다중 수용체 타이로신 키나제 억제제인 소라페니브(네박사(Nevaxar))를 참조 화합물로서 사용하였다. 처리된 및 처리되지 않은 hHSC 둘 다에서 목적 유전자의 발현은 TGFβ1에 대한 24시간 노출 후, 정량적 RT-PCR 기술로 측정하였다.

실험 결과는 10μmole/L의 농도에서 수득된, 최대 억제를 나타내는 Emax 값으로 표시하였다. 통계적 분석을 Sigma Plot 11.0 소프트웨어를 사용하여 일원 변량 분석에 이은 본페로니 사후 검증을 사용하여 수행하였다.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001(TGFβ1 1ng/mL 그룹에 대한 비교)

TGF β1을 사용한 치료에 의한 hHSC 에서 유도된 동일한 표적 유전자의 발현으로 둘 다 방해되는, 화학식 I의 화합물 및 소라페니브

	TGF β1(1 ng / mL ) 단독으로 치료된 hHSC 세포와 비교하여 표적 유전자 발현에 있어서의 감소
	화학식 I의 화합물에 의해 유도된 감소			소라페니브에 의해 유도된 감소
표적 유전자	농도	Emax	p값	농도	Emax	p값
αSMA	10μM	-90%	***	10μM	-95%	***
Col1α1	10μM	-56%	***	3μM	-93%	***
Col4α1	10μM	-41%	**	10μM	-93%	***
TGFβR1	10μM	-44%	**	10μM	-80%	***
VEGFR1	10μM	-90%	***	10μM	-95%	***
VEGFR2	10μM	-45%	*	3μM	-73%	***
HGFR	10μM	-47%	*	10μM	-79%	***
FGFR1	1μM	-33%	*	3μM	-43%	**
c-KIT	10μM	-98%	***	ND

장 섬유증은 염증성 창자명(IBD)의 병리학적 특징이며[67] 당해 질병의 전임상 모델에 존재한다. 지금까지, IBD에서 섬유증 발달을 예방하거나 확립된 섬유증을 치료하기 위한 치료가 확인되어 있지 않았다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 발명자들은, 결장에서 섬유증 마커(α-SMA) 발현에 있어서의 대장염-유도된 증가가 IBD의 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS) 유도된 전임상 모델에서 화학식 I의 화합물 투여에 의해 부분적으로 예방되었음이 기대하지 않게 밝혀내었다. 이는, 화학식 I의 화합물이 상이한 기관 및 상이한 질환에서 섬유증 발달을 예방하고/하거나 치료할 수 있음을 제안하고 있다.

선택된 유형의 암으로부터 기원한 실험 세포주의 증식을 억제하는 화학식 I의 화합물. 억제율은 물질 및 방법에서 기술된 바와 같이 실험 데이타의 곡선 핏팅에 의해 계산된 μmole/l의 EC50 값으로 표시한다.

암의 유형	종양 세포주	EC₅₀(μM)
신장 세포 암종	786-O	28
신경섬유종증과 관련된 수막종	T98G	4
신경섬유종증과 관련된 수막종	U-87 MG	17
백혈병	CCRF-CEM	2
백혈병	MOLT-4	≥ 5
비-소세포 폐암에서 고형 종양	A549	≥ 34
비-소세포 폐암에서 고형 종양	NCI-H460	≥ 29
결장직장암에서 고형 종양	SW480	3
결장직장암에서 고형 종양	Caco-2	≥ 43
위장 기질 종양(GIST)	AGS	≥ 27
위장 기질 종양(GIST)	MKN-45	11
췌장 신경내분비 종양	BxPC-3	14
췌장 신경내분비 종양	AsPc-1	16
척수증식성/골수이형성 질병	RPMI 8226	11
피부섬유육종	A431	≥ 31
피부섬유육종	A375	≥ 44
유방암에서 고형 종양	MDA-MB-468	22
유방암에서 고형 종양	MCF7	16
갑상선 암에서 고형 종양	HTC-C3	6
전립샘 암	LNCaP	≥ 14
전립샘 암	PC-3	5

항암 활성을 지닌 치료학적 화합물의 대부분은 암성 세포 증식을 방해한다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 발명자들은, 화학식 I의 화합물이 상이한 유형의 종양에 상응하는 다양한 암 세포주의 증식을 억제하였음을 예상치못하게 발견하였다.

활성화된 hHSC 세포자멸사를 유도하는 능력은 섬유성 질병에서 중요한 목적이다. 본 발명자들은, 화학식 I의 화합물이 도 5에 나타낸 바와 같이, 보통의 전구-세포자살 특성을 가지지만, 이것은 투여량-의존적인 방식으로 광범위한 스펙트럼의 키나제 억제제인, 스타우로스포린의 전구-세포자살 활성을 예상치못하게 강화시킴을 예상치못하게 발견하였다.

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SEQUENCE LISTING <110> GENFIT <120> METHODS OF TREATMENT OF FIBROSIS AND CANCERS <130> IP20152811FR <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 1 actgccttgg tgtgtgacaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 2 tggtgatgat gccatgttct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 3 aatggtgctc ctggtattgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 4 accaggttca ccgctgttac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 5 gttggtctac cgggactcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 6 gttcacctct gatcccctga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 7 tgttggtacc caaggaaagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 8 cactctgtgg tttggagcaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 9 tgtcaatgtg aaaccccaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 10 gtcacacctt gcttcggaat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 11 agcgatggcc tcttctgtaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 12 acacgactcc atgttggtca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 13 caggcagtgc agcatgtagt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 14 gatgattccc tcggtcagaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 15 gaagttcaaa tgcccttcca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 16 ccagctggta tgtgtggttg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 17 gtctccacca tccatccatc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 18 gttggtgcac gtgtatttgc 20 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 19 catgctcaac atctccccct tctcc 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 20 gggaaggtgt aatccgtctc cacag 25

Claims

간 섬유증이 아닌 섬유성 질병의 치료 또는 예방, 또는 타이로신 키나제 관련 암의 치료 또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온.
제1항에 있어서,
상기 섬유성 질병이 폐, 심장, 근육, 피부, 연조직, 골수, 장, 및 관절 섬유증인 화합물.
제1항에 있어서,
상기 섬유성 질병이 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 심내막심근 섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 신성 전신 섬유증(nephrogenic systemic fibrosis), 크론병(Crohn's disease,) 켈로이드(keloid), 오래된 심근경색, 피부경화증/전신 섬유증, 관절섬유증(arthrofibrosis) 및 유착 관절낭염인 화합물.
제1항에 있어서,
상기 타이로신 키나제 관련 암이 PDGFR-, VEGFR- 또는 KIT-관련 암인 화합물.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 암이 신장 세포 암종, 위장 기질 종양(GIST), 위암, 신경섬유종과 관련된 수막종, 신경내분비 췌장 종양, 외분비 췌장 종양, 백혈병, 골수증식성/골수형성장애병(myelodisplastic disease), 비만세포증, 피부섬유육종, 유방, 폐, 갑상샘 또는 직장결장암을 포함하는 고형 종양, 또는 전립샘 암인 화합물.
간암의 치유성 치료방법에서 사용하기 위한 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온.
제6항에 있어서,
상기 간암이 간세포 암종인 화합물.
콜라겐 섬유의 생산에 관여하고 및/또는 세포외 매트릭스의 생산에 관여하는 세포의 증식 및/또는 활성화의 억제 시 사용하기 위한 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온.
콜라겐 섬유의 생산에 관여하고 및/또는 세포외 매트릭스의 생산에 관여하는 세포의 세포자멸사를 촉진하는데 사용하기 위한 화합물 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온.