KR20150101810A

KR20150101810A - 흑효모 발효를 통해 비타민 c 함량이 증가된 산자나무 발효 추출물 및 이를함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150101810A
Application number: KR1020140023555A
Authority: KR
Inventors: 장선미; 이광식; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2015-09-04
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: KR101645476B1

Abstract

본 발명은 산자나무 흑효모 발효 추출물 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물은 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

흑효모 발효를 통해 비타민 C 함량이 증가된 산자나무 발효 추출물 및 이를함유하는 화장료 조성물{Fermentative Extract of Hippophae rhamnoides with Increased Amount of Vitamin C Fermented by Aureobasidium pullulans and Cosmetic Composition containing the same}

본 발명은 산자나무 흑효모 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 산자나무 추출물을 흑효모 균사체로 발효시켜 비타민 C 함량을 증가시킨 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있다. 이런 상태가 심화되면, 생체 내에 존재하는 항산화 방어망이 파괴되고, 세포 및 조직이 손상되어 피부 노화가 촉진되게 된다. 구체적으로 설명하면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 단백질의 산화는 피부 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등을 절단시켜 심한 과다 염증반응을 일어키고, 피부 탄력에 영향을 주게 된다. 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

한편, 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다. 이러한 피부는 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분된다. 표피층은 각질세포와 멜라닌 세포로 구성되는데, 피부 최외곽의 각질세포층은 외부환경과 직접 접촉하기 때문에 물리적, 화학적 혹은 물질의 투과에 대한 강한 저항성이 요구되며, 인체로부터 외부로 수분이 손실되는 것을 막아줌과 동시에 자체로도 적당한 수분을 보유함으로써 유연성을 유지하여야 한다.

일반적으로 피부의 수분량은 진피층에서는 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 각질세포층에서는 약 10 내지 30%가 된다. 진피층에서 공급된 물은 주로 수동적 확산에 의해 각질층 상부로 이동하며 최종적으로는 외부로 배출된다. 이를 경피수분 손실(Trans Epidermal Water Loss : TEWL)이라 하며, 이러한 경피수분 손실을 적절한 수준으로 유지시켜주는 것이 각질세포층의 지질막 성분인 피지성분과 표피지질이라고 알려져 있다.

각질세포층에는 천연보습 인자(Natural Moisturizing Factor : NMF) 라고 하는 친수성의 수분 보유능을 가진 물질이 존재하여 피부의 보습에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 각질세포층은 수분이 10 내지 30% 정도가 유지되면 피부는 매끄럽고 부드러우며, 신체 보호기능을 정상적으로 발휘하게 된다. 하지만, 각질세포층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다. 예를 들어, 건성피부의 경우에는 각질세포의 결집력이 약화되어 피부표면으로부터 비늘조각과 같이 각질세포가 허옇게 벗겨져 나오는 스케일링현상이 나타난다. 이와 같이 피부가 건성화되는 것은 각질세포층의 수분함량이 정상피부에 비해 적기 때문이다. 이 외에, 건강한 피부라 할지라도 혹독한 외부환경 즉, 바람, 추운 날씨, 햇빛, 세안, 면도 등에 의해 수분 부족현상이 일어나 피부상태가 나빠지기도 한다.

따라서, 피부 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용되었다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기가 3개 이상인 글리세린, 소르비톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기가 2개인 프로필렌글리콜 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있다. 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 보습능력에 한계가 있었다.

각질층의 수분을 보유할 수 있는 능력은 피지성분과 아미노산, 젖산, 요소 및 무기염 등으로 이루어진 천연보습인자(NMF)에 의해 조절되어질 수 있는데, 피부 외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습효과가 높은 물질의 개발이 화장품에서 중요한 연구과제 중 하나이다.

한편, 최근에는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

본 발명자들은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 산자나무의 추출물을 흑효모 균사체로 발효하여 제조된 산자나무 흑효모 발효 추출물에서 항산화, 항염증, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

한국 특허등록 제1229748호에는, 비타민나무 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 개시하고 있는데, 산자나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 기재하고 있다.

본 발명자들은 피부 화장료에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 매우 뛰어난 천연 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 산자나무 추출물을 흑효모 균사체로 발효한 천연추출물 및 이를 유효성분으로 하고 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 피부 장벽 개선효과를 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하다.

바람직하게는 상기 화장료 조성물은, 항산화용, 항염증용, 피부 주름 개선용, 피부 미백용, 피부 보습용 또는 피부 장벽 개선용일 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 산자나무 흑효모 발효 추출물은, 산자나무 추출물을 흑효모균으로 20 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 1 내지 7일 동안 발효시켜 얻을 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 산자나무 흑효모 발효 추출물을 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001~30.0 중량% 포함할 수 있다.

바람직하게는 상기 화장료 조성물은, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명은 피부 화장료에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 매우 뛰어난 천연추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 산자나무추출물을 흑효모 균사체로 발효한 천연추출물 및 이를 유효성분으로 하고 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 산자나무 추출물을 흑효모로 발효하여 비타민 C의 함량이 증가된 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 산자나무 추출물의 흑효모 발효 전(a) 및 발효 후(b)의 HPLC 그래프를 도시한 것이다.

본 발명자들은 다수의 천연물을 원료로 하여 다양한 추출방법으로 추출물을 제조하였고, 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 피부 장벽 개선 효과 등의 효과가 우수한 물질을 선별하는 연구를 수행하였다. 그 결과, 산자나무의 추출물에 흑효모 균사체로 발효하여 제조된 추출물이 상술한 본 발명의 목적에 가장 부합된다는 사실을 발견하게 되었다.

산자나무(Hippophae rhamnoides)는 가뭄 한발 극심한 온도차가 심한 사풍 불모지 등 악조건 속에서 자생하는 관목이다. 예명으로 비타민 나무로 불리우며 나무 전체가 보배로 100여종의 인체에 유익한 활성물질을 포함하고 있고 항산화작용 항염증 효과가 뛰어나다. 특히 산자나무 열매의 경우 비타민 함량이 과일 중 최고로 사과의 200~800배 정도로 비타민의 보고로 알려져 있다. 또한 속성수로 1년에 1~2m 정도 자라며 야생성으로 병해충에 강하고 자생능력이 뛰어나며 무농약 재배가 가능하며 웰빙 시대에 알맞은 열매, 잎 뿌리 나무 전체를 식품 차, 의약품, 또는 화장품 원료로 사용할 수 있다.

흑효모(Aureobasidium pullulans)는 맥주, 포도주 등을 만드는데 사용되는 미생물로서, 곰팡이나 버섯 무리이지만 균사가 없고, 광합성능이나 운동성도 가지지 않는 단세포 생물의 총칭이다. 이는 5천 년 전부터 인간이 식품에 이용해 온 미생물이며, 효모 자체는 값싼 지방이나 단백질원으로 사용된다. 비타민 B군을 풍부하게 함유하고 있고, 비타민 D를 함유하는 것도 있다. 또한, 흑효모균은 베타-글루칸(β-Glucan)을 생산하는 미생물로 흑효모 발효물 자체만으로도 보습효과, 항산화, 진정효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 흑효모 베타-글루칸(β-glucan)은 항암, 인슐린 분비 억제 등의 생리 활성이 있는 것으로 알려져 있는 성분이 다량 함유되어 있다.

현재까지 산자나무의 추출물은 다른 용도로 많이 사용되고 있다. 하지만, 본 발명에서와 같이 발효 형태, 특히, 산자나무의 흑효모 발효 추출물의 효과에 대해서는 구체적으로 알려지지 않았다.

본 발명의 화장료 조성물은 산자나무 발효 추출물을 산자나무 추출물을 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균사체로 발효하여 얻는 물질을 포함하며, 뛰어난 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선 효과를 나타낸다.

본 발명에서 산자나무 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 제조될 수 있다. 구체적으로 산자나무의 열매, 잎 또는 줄기를 건조 및 분쇄한 후, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 구체적으로는, 산자나무 추출물은 물, 탄소수 1~4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하거나 산자나무의 열매, 잎 또는 줄기를 상기 용매를 이용하여 추출한 후, 이를 혼합하여 제조할 수 있다.

상기 용매로는 알코올이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에탄올이다. 이때, 에탄올은 바람직하게 70% 에탄올이다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 산자나무 건조물 중량의 1~15 배이며, 더욱 바람직하게는 5~10배이며, 가장 바람직하게는 7배이다.

한편, 본 발명의 산자나무 추출물은 상술한 용매 추출법에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 산자나무 추출물에 포함된다고 해석된다.

또한, 본 발명의 산자나무 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수도 있다.

산자나무 흑효모 발효 추출물은 상기한 산자나무 추출물을 흑효모로 발효시켜 제조할 수 있으며, 구체적으로는 다음의 방법으로 제조할 수 있다. 먼저, 산자나무 추출물에 탄소원으로 포도당 1~5 중량%를 첨가하고, 펩톤 0.1~1%, 바람직하게는 0.2~0.5 중량%를 추가로 첨가하여 멸균할 수 있다. 여기에 25g/L이 되도록 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균주 배양액을 접종하여 배양할 수 있다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 1 내지 7일간, 20 내지 40℃에서 pH 5-7로 유지하며 배양할 수 있다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 후 더 이상 배양이 되지 않도록 멸균(121℃, 15분, 1.5기압)하였다.

발효 후 배양균을 1차 제거한 산자나무 발효물을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 환류추출하고 냉침한 후, 여과할 수 있다. 여과가 완료되면 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하여 본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화장료 조성물에 첨가되는 산자나무 흑효모 발효 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~80.0 중량%이며, 바람직하게는 0.01~50.0 중량%이며, 가장 바람직하게는 0.1~30.0 중량%로 포함될 수 있다. 상기 산자나무 흑효모 발효 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선효과가 미미하다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 산자나무 흑효모 발효 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 다만, 이에 반드시 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물은 항산화 효과(참조: 실험예 2), 항염 효과(참조: 실험예 4), 콜라겐 합성 효과(참조: 실험예 5) 및 피부 미백 효과(참조: 실험예 6)를 나타낸다. 또한, 이러한 효과를 갖는 산자나무 흑효모 발효 추출물을 유효성분으로 함유하여 제조한 화장료 조성물의 경우, 피부 보습 개선 효과(참조: 실험예 7), 피부 장벽 개선 효과(참조: 실험예 8)가 뛰어난 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 제조예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기 제조예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 권리범위가 하기 제조예에만 한정되는 것은 아니다.

[ 제조예 1: 산자나무 추출물의 제조]

산자나무 열매를 정제수로 세척하고 건조한 다음 모두 분쇄한 후 100 메시의 체를 이용하여 미세하게 만들었다. 산자나무 분쇄물을 100g/L가 되도록 70% 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과 후, 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하여 산자나무 추출물을 제조하였다.

[ 제조예 2: 산자나무 흑효모 발효 추출물의 제조]

제조예 1에서 제조된 산자나무 추출물 5g에 탄소원으로 포도당 2%를 첨가하였으며, 펩톤 0.5%를 추가로 첨가하여 멸균하였다. 여기에 25g/L이 되도록 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균주 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 37℃, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 후 더 이상 배양이 되지 않도록 멸균(121℃, 15분, 1.5기압)하였다.

발효 후 배양균을 1차 제거한 산자나무 발효물을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과하였다. 여과가 완료되면 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하였다.

[비교 제조예 1]

탄소원으로 포도당 2%를 첨가하였으며, 펩톤 0.5%를 추가로 첨가하여 멸균하였다. 여기에 25g/L이 되도록 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균주 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 37℃, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 후 더 이상 배양이 되지 않도록 멸균(121℃, 15분, 1.5기압)하였다.

발효 후 배양균을 1차 제거하고, 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과하였다. 여과가 완료되면 상기 여과액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하여 산자나무 추출물을 포함하지 않는 흑효모 발효액을 제조하였다.

[ 제조예 3 내지 6]

흑효모 대신에 아래 표 1의 균사체를 사용한 것 이외에는 제조예 2와 동일한 방법으로 산사나무 발효 추출물을 제조하였다.

	균사체
제조예 3	효모균(Saccharomyces cerevisiae)
제조예 4	유산균(lactobacillus casei)
제조예 5	누룩균(asperillus oryzae)
제조예 6	고초균(bacillus subtilis)

[ 실험예 1: 비타민 C 분석]

제조예 1의 산자나무 추출물과 제조예 2의 산자나무 흑효모 발효 추출물 중의 비타민 C 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다(이동상 25mM 이포타슘포스페이트 (KH2PO4), pH 2.5). 분석컬럼은 optipack C18, 컬럼온도 30℃, 자외선 검출기 흡광도 파장은 254nm에서 분석하였다.

흑효모 발효 전(a)과 흑효모 발효 후(b)의 산자나무 추출물의 비타민 C 함량의 분석 결과는 도 1에 나타내었다. 제조예 2의 산자나무 흑효모 발효 추출물과, 제조예 3 내지 7의 산자나무 발효 추출물들의 비타민 C 함량을 측정하여 표 2에 나타내었다.

발효 전후의 비타민 C의 함량

	발효 전 (ppm)	발효 후 (ppm)
제조예 2 (흑효모 발효)	2,803.4	18,292.5
제조예 3 (효모균 발효)	2,803.4	2,805.43
제조예 4 (유산균 발효)	2,803.4	2,803.21
제조예 5 (누룩균 발효)	2,803.4	2,805.41
제조예 6 (고초균 발효)	2,803.4	2,803.25

산자나무 추출물의 흑효모 발효 전후의 비타민 C의 함량을 비교 시험한 결과, 발효 전에는 2803.4 ppm이었으나 발효 후에는 18,292.5ppm으로 함량이 증가된 것을 확인 할 수 있었다(제조예 2). 하지만 다른 균사체 발효물의 경우 비타민 C에 대한 유의한 함량 증가를 확인할 수 없었다.

[ 실험예 2: 산자나무 추출물과 산자나무 흑효모 발효 추출물의 DPPH 법을 이용한 항산화 평가]

상기 제조예 1 내지 6에서 수득한 산자나무 흑효모 발효 추출물과 산자나무 추출물의 농도별(31.5, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ㎍/ml) 자유라디칼 소거 활성(free radical scavenging acticity)을 평가하였다.

DPPH 측정법은 억제제(inhibitor)가 안정한 라디칼 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical)를 소거하여 탈색되는 정도를 540 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다. 사용한 시료는 하기 표 3에 나타내었으며, 하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다. 대조군은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, Epigallocatechin gallate)로 하였다.

	재료	대조군	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	DPPH(MeOH)	180	(180)	180	(180)
B	샘플(용매)	(20)	(20)	20	20

A: Abs of experimental group

B: Abs blank of experimental group

C: Abs of control group

D: Abs of blank of control group

자유라디칼 소거활성(%)

	제조예1	비교제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	EGG
25uM	-	-	-	-	-	-	-	54.34
0.001wt%	12.23	4.93	42.15	22.13	15.54	13.13	21.19	-
0.002wt%	22.16	6.09	68.24	30.09	22.19	24.17	28.42	-
0.005wt%	24.58	8.12	83.41	38.42	31.41	33.21	35.64	-
0.01wt%	35.24	9.09	95.58	55.19	41.28	44.42	45.24	-

상기 표 4에서 나타난 바와 같이, 산자나무 발효 추출물(제조예 2 내지 6)이 산자나무 추출물(제조예 1)에 비하여 자유라디칼 소거활성이 우수하였다. 발효 추출물 중에서는 특히 흑효모 발효 추출물(제조예 2)이 가장 높은 자유라디칼 소거활성을 나타내었다. 또한 흑효모 발효액만 포함하는 비교제조예 1과 비교하여도 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물이 산자나무 추출물에 비해 항산화 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.

[ 실험예 3: 산자나무 추출물과 산자나무 발효추출물의 세포 생존율 평가]

상기 제조예 1 내지 6 과 비교제조예 1에서 수득한 산자나무 추출물과 산자나무 발효 추출물이 세포에 미치는 독성을 측정하였다. 세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다.

HDF를 96-웰 플레이트에 1 × 10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 시료를 농도별로 처리한 배지에 24 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline) 두 번씩 세척하였다. MTT를 5 mg/mL 로 PBS에 녹여 50 μL 첨가하고 37℃, 5%의 CO₂ 에서 2 시간 동안 배양하였다. DMSO를 한 웰(well) 당 100 μL 넣고 10분 동안 교반한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과를 아래 표 5에 나타내었다. 표 5를 보면, 각 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 나타나지 않았다. 이로부터 본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물은 인체에 무해하며 안전성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

세포 생존율(%)

시료명	처리농도(ppm)	세포생존율(%)
제조예 1	50	101.3
제조예 1	100	103.5
비교제조예 1	50	99.8
비교제조예 1	100	101.6
제조예 2	50	103.5
제조예 2	100	102.5
제조예 3	50	98.7
제조예 3	100	100.5
제조예 4	50	99.8
제조예 4	100	103.5
제조예 5	50	97.5
제조예 5	100	98.6
제조예 6	50	97.6
제조예 6	100	101.5

[ 실험예 4: 산자나무 추출물과 산자나무 발효 추출물의 항염 평가(5- 리폭시게나제 저해)]

상기 제조예 1 내지 6과 비교제조예1 에서 수득한 산자나무 발효 추출물과 산자나무 추출물의 5-리폭시게나제(5-Lipoxygenase) 저해 활성 실험을 하여 항염 효과를 평가하고자 하였다.

리폭시게나제는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생체내 염증반응이나 알레르기 반응 등에 관여하는 다양한 화학적인 매개체 역할을 하는 여러 물질들을 생성한다. 따라서 리폭시게나제를 저해하는 물질은 각종 화학적 매개체(chemical mediators)의 생성을 억제하는 결과를 가져오게 되므로 알레르기에 유효할 것이라고 추정할 수 있다. 리폭시게나제의 활성정도는 기질과 효소를 이용하여 과산화물 생성정도로 측정하는 실험이다.

사용한 시료는 하기 표 6과 같이 시험하여 상기 수학식 1을 이용하여 5-리폭시게나제 저해 활성(%)을 측정하였다. 대조군은 노르디히드로구아이아레트산(NDGA, Nordihydroguaiaretic acid)로 하였다.

	재료	대조군	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	완충용액	2ml	2ml	2ml	2ml
B	Sample(용매)	(20ul)	(20ul)	20ul	20ul
C	효소(Enzyme)	40ul	-	40ul	-
D	기질(Substrate)	70ul	70ul	70ul	70ul

	제조예1	비교제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	NDGA
250 nM	-	-	-	-	-	-	-	51.55
0.001wt%	19.22	3.25	33.19	25.41	21.51	21.39	35.01	-
0.002wt%	28.49	5.03	41.84	32.01	35.21	34.15	32.54	-
0.005wt%	33.16	5.42	62.30	34.61	36.76	38.69	32.92	-
0.01wt%	32.90	5.32	74.43	49.53	41.43	43.04	41.85	-

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 산자나무 발효 추출물(제조예 2~6)이 산자나무 추출물(제조예 1)과 비교제조예 1에 비하여 5-리폭시게나제 저해능이 우수하였다. 발효 추출물 중에서는 특히 산자나무 흑효모 발효 추출물(제조예 2)이 가장 높은 5-리폭시게나제 저해능을 나타내었다. 일반적으로 5-리폭시게나제 저해능이 높을수록 항염 효과가 있으므로, 상기의 결과는 산자나무 흑효모 발효 추출물이 일반 산자나무 추출물에 비해 항염 효과가 높다는 것을 확인시켜 준 것이다.

[ 실험예 5: 산자나무 추출물과 산자나무 발효 추출물의 콜라겐 합성량 평가]

상기 제조예 1~6과 비교제조예1 에서 수득한 산자나무 발효 추출물과 산자나무 추출물의 콜라겐 생합성 증가율을 평가하였다.

HDF를 24-웰 플레이트에 5 x 10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5 %CO₂ 에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 제조예 1 내지 6과 비교제조예 1에 의해 제조된 추출물을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 산자나무 발효 추출물이나 산자나무 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드(PICP) 양을 측정하여 ng/ml 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 수학식 2에 따라 계산하였으며, 대조군은 엘-아스코르빅애씨드 (L-AA, L-ascorbic acid)로 하였다.

	제조예1	비교제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	L-AA
0.3 mM	-	-	-	-	-	-	-	131.51
0.001wt%	101.03	101.22	126.65	107.10	114.15	105.96	113.84	-
0.002wt%	106.15	102.54	162.38	115.03	115.36	114.47	126.37	-
0.005wt%	115.64	103.65	174.44	120.60	121.52	123.24	129.61	-
0.01wt%	116.22	103.74	182.35	127.48	131.64	125.82	133.52	-

상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 산자나무 발효 추출물(제조예 2~6)이 산자나무 추출물(제조예 1)과 제조비교예1에 비하여 콜라겐 합성량이 우수하였다. 발효 추출물 중에서는 특히 흑효모 발효 추출물(제조예 2)이 가장 높은 콜라겐 합성량을 나타내었다.

실험예 6: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정

실험예 6에서는 상기 제조예 1 내지 6과 비교제조예 1에서 수득한 샘플의 멜라닌 합성 억제효과를 확인하기 위해 미백제로 알려진 알부틴을 비교샘플로 사용하였고, B16F1 멜라닌 세포를 이용하였다.

실험예 6에서 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후, 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후, 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(R Lotan and D Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후, 균질화 완충액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하고, 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후, 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였다.

멜라닌 합성 저해율(%) = [(A-B)/A] ×100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B: 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

	제조예1	비교제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	알부틴
0.2 wt%	-	-	-	-	-	-	-	131.51
0.001wt%	5.03	3.22	46.65	7.10	5.15	5.96	13.84	-
0.002wt%	10.10	11.54	62.38	5.03	15.36	14.47	26.37	-
0.005wt%	15.64	20.65	74.44	16.60	21.52	23.24	29.61	-
0.01wt%	23.22	23.74	82.35	17.48	22.64	25.82	33.52	-

B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과를 표 9에 나타내었다. 제조예 2로 제조된 산자나무 흑효모 발효 추출물은 알부틴보다 우수한 효능을 확인 할 수 있었으며. 다른 제조예들보다 우수한 미백효과를 갖는 것을 확인하였다.

상기의 결과로부터 산자나무 흑효모 발효 추출물의 우수한 멜라닌 합성 저해율을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 알 수 있었다.

[ 제조예 7: 산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유하는 화장료의 제조]

제조예 1의 산자나무 흑효모 발효 추출물을 20.0 중량%가 포함된 화장료 조성물을 하기 표 10의 조성으로 제조하여 이를 처방예 1이라 하고, 산자나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 비교처방예 1로, 흑효모 발효액을 포함하는 화장료 조성물을 제조하여 비교처방예 2라 하였다.

성분	처방예 1 (중량%)	비교처방예 1 (중량%)	비교처방예 2 (중량%)
제조예 1	-	20.0	-
제조예 2	20.0	-	-
비교제조예1	-	-	20.0
1,3-BG	10.0	10.0	10.0
글리세린	5.1	5.1	5.1
프로필렌글리콜	4.2	4.2	4.2
토코페릴아세테이트	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	4.6	4.6	4.6
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.1	3.1	3.1
마카다미아너트오일	2.5	2.5	2.5
폴리아위베이트60	1.6	1.6	1.6
아위비탄세스퀴롤레이트	1.6	1.6	1.6
프로필파라벤	0.6	0.6	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5	1.5	1.5
향	미량	미량	미량
방부제	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100

[ 실험예 7: 산자나무 흑효모 발효 추출물의 피부 보습력 개선효과]

본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 피부 질환이 없는 20~40대 25명을 대상으로 1조 당 20명 씩 2개조로 나누고, 각 조별로 상기 제조예 7에서 제조한 처방예 1 및 비교처방예 1의 크림의 영양크림을 매일 2회씩 1개월간 얼굴 및 전박부에 도포하게 하였다. 미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 corneometer(CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 기본 값을 삼고, 1주, 2주, 4주 경과 후의 피부 전도도 증가율(%)을 측정하여 그 증가율을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

시료	1 주 후	2 주 후	4 주 후
처방예 1	52	56	61
비교처방예 1	28	35	39
비교처방예 2	16	19	25

상기 표 11의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유하는 화장료인 처방예 1의 경우, 비교처방예 1, 2에 비하여 피부 전도도 증가율이 매우 우수하였다. 일반적으로 피부 전도도는 피부 수분량에 비례하므로, 상기의 결과는 산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유하는 화장료가 그렇지 않은 화장료에 비해 피부 수분 함량도 높게 유지한다는 것을 확인시켜 준 것이다.

[ 실험예 8: 산자나무 흑효모 발효 추출물의 피부 장벽 개선효과]

본 발명의 산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유하는 화장료의 피부 장벽 개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 본 실험예는 제조예 7의 화장료를 사람을 대상으로 경피수분손실량(TEWL : Trans-Epidemal Water Loss)을 Tewameterr(TM300, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 비교실험을 행하여 평가하였다. 20 ~ 40대 여성 40명을 대상으로 오른쪽과 왼쪽 얼굴에 각 시료를 바르고 눈가에서 3cm 우측으로 1cm 아래로 떨어진 부위를 바르기 전과 바른 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간의 경피수분손실량을 Tewameterr(TM300, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 3회 측정하여 평균값을 사용하여 경피수분손실량을 평가하였다.

구분	1시간	2시간	4시간	6시간
처방예 1	15.2	14.8	12.4	9.2
비교처방예 1	18.1	17.0	14.2	11.9
비교처방예 2	18.7	17.1	15.5	14.6

표 12에서 나타낸 바와 같이, 경피수분손실량을 측정한 결과, 산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 경피수분손실량이 감소한 것으로 보아, 피부장벽 개선에 더 좋은 효과가 있음을 알 수 있었다.

Claims

산자나무 흑효모 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 피부 주름 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 피부 장벽 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 산자나무 흑효모 발효 추출물은, 산자나무 추출물을 흑효모균으로 20 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 1 내지 7일 동안 발효시켜 얻은 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 산자나무 흑효모 발효 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001~30.0 중량% 첨가되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.