KR20150023735A

KR20150023735A - 안정화된 gp120

Info

Publication number: KR20150023735A
Application number: KR20157000850A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 카르피; 안투 데이; 아엠로 카싸; 인드레쉬 스리바스타바
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2015-03-05
Also published as: WO2013189901A1; CN104619338A; IN2014KN02740A; IL235898A0; ZA201408840B; MX2014014682A; US20150183835A1; EP2861249A1; RU2015101081A; SG11201407995RA; AU2013279456A1; CA2876762A1; JP2015521592A

Abstract

본 발명은 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프를 둘 다 노출하는 형태로 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 조성물 및 HIV로의 감염을 치료 및 방지하는 방법을 제공한다.

Description

안정화된 gp120{STABILIZED GP120}

본 특허 출원은 2012년 6월 18일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/661,050으로부터의 우선권을 주장하며, 그 출원의 완성된 내용은 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

본 발명은 HIV의 분야에 있고, 특히 HIV 백신의 분야에 있다.

전 세계적인 유행병인 HIV/AIDS는 전 세계에 걸쳐 퍼져있고, 2007년 말에는 6천만명 이상이 HIV-1으로 감염되었다[1]. 그 세계적인 유행병과 싸우는 것을 목표로 하는 수많은 자원에도 불구하고, 여전히 HIV-1에 맞서 활용할 수 있는 백신은 없다. 비록 신체가 초기 HIV-1 감염에 대항하여 왕성한 면역 반응을 생성하긴 하지만, 이들 항체는 많은 경우 바이러스를 중화하지 못한다[2]. 그 이유 중 한 가지는 중화 항체에 대항하여 바이러스를 차폐하는 다중 수준의 방어의 존재이다. 이것들은 고도의 서열 가변성, 탄수화물 은폐(masking), 다량체 형성에 의한 에피토프의 차단 및 형태상의 은폐를 포함한다[3].

고도의 가변성에도 불구하고, 바이러스는 세포 수용체를 인지하고 결합할 수 있는 보존된 상태를 유지할 필요가 있다. CD4-결합 부위 및 CD4-유도된(공동-수용체) 결합 부위를 포함하고, CD4-결합 부위 및 CD4-결합된 에피토프를 각각 포함하는 HIV-1 gp120에 있는 이들 보존된 수용체 결합 부위는 항체 중재된 중화에 대한 취약한 표적이고, 그로써 백신 생성에 대한 매력적인 표적이다. 그러나, 이들 보존된 부위 및 이들 부위에 있는 에피토프는 형태상 은폐되고, 따라서 중화 항체에 접근할 수 없다.

과거에 내부 및 외부 접촉을 안정화시킴으로써 단백질의 보존된 영역을 노출하는 형태로 gp120을 안정화시키기 위한 시도들이 이루어졌다. 예를 들어 수용체 결합된 형태로 gp120을 안정화시키기 위한 이전의 구조-안내된 시도들은 이황화 가교 및 공동 충전(cavity filling) 돌연변이[4]뿐 아니라, 안정화 전에 V1/V2 및 V3 루프와 같은 면역우세 영역의 제거[5]를 포함하는 다양한 접근법을 활용하였다. 가장 큰 정도의 안정화는 시스테인 잔기를 사용한 표적화된 치환 후에 이황화 가교의 형성에 의해 이루어졌다[6 및 7]. 그러나, 이들 이황화 결합은 gp120의 CD4-결합된 에피토프를 노출한 형태로 gp120의 구조를 안정화시킨 한편, CD4-결합 부위 항체의 친화성에 의해 측정된 바와 같이, CD4-결합 부위 에피토프를 노출시키지 못하였다. 이것 외에, 가변 루프의 제거를 포함하는 전략은 또한, 가변 루프가 gp120의 4차 구조의 조절에 포함되기 때문에 불리하다[8].

HIV-1 gp120의 내부 도메인의 구조는 공개된 gp120 구조로부터 빠져있다[4, 9 및 10]. 그러나, 내부 도메인의 층들의 상호작용은 CD4 리간드 결합시에 gp120에서 일어나는 형태 변화에 중요하다. 본 발명은 HIV-1 gp120의 내부 도메인과 가용성 HIV-1 gp140의 층간 상호작용의 안정화에 관련된다.

HIV 구조

gp120의 내부 도메인의 새롭게 해명된 구조는 CD4-결합된 상태에서, 내부 도메인이 표적 세포막을 향하여 β-샌드위치 구조로부터 돌출된 층 1, 2 및 3으로 구성된 3개 층으로 조직화되는 것을 나타낸다(도 1)[11 내지 13]. 내부 도메인은 SF162 스트레인으로부터의 HIV gp120의 아미노산 1 내지 248 및 458 내지 497에 해당하는 아미노산으로 구성된다(SEQ ID NO:2). 층 1은 SF162 스트레인으로부터의 HIV gp120의 아미노산 42 내지 76에 해당하는 아미노산으로 구성된다. 층 2는 SF162 스트레인으로부터의 HIV gp120의 아미노산 90 내지 117 및 192 내지 223에 해당하는 아미노산으로 구성된다. 층 3은 SF162 스트레인으로부터의 HIV gp120의 아미노산 239 내지 249 및 459 내지 470에 해당하는 아미노산으로 구성된다. 내부 도메인은 리간드가 없는 상태로부터 CD4-결합된 상태로의 폴리펩티드 전이와 같은 광범위한 형태 변화를 진행하는 gp120의 영역으로서 확인되었다[14, 15]. CD4 결합시 일어나는 내부 도메인의 형태 변화는 HIV 바이러스의 표적 세포에의 성공적인 융합에 필요한 두 개의 하류 사건에 기여한다. 이들 사건은 다음과 같다:

1. 초기의 약한 CD4-접촉의 안정화, 및

2. 공동-수용체 결합을 위한 gp120상의 보존된 부위의 노출, 즉 CD4-결합된 에피토프의 노출.

CD4-결합 상태에서, gp120의 내부 도메인의 3개 층은 함께 특이한 내부층 상호작용을 통하여 gp120의 CD4-결합된 형태를 안정화시킨다.

층 1과 2 사이의 상호작용은 부위-특정된 돌연변이에 의해 확인된 많은 잔기를 통해 중재된다[11, 12]. 층 1과 2 사이의 이들 상호작용은 내부 도메인 주변에서 "칼라(collar)"와 유사한 독특한 구조를 형성하고 그 영역을 안정화시킨다[8]. 이들 층간 상호작용의 파괴는 gp120의 CD4-결합된 형태의 탈안정화를 유도하여 CD4에 대한 친화성의 감소를 초래한다[11]. 유사하게, 내부 도메인의 층들 사이의 상호작용을 감소시킨 돌연변이는 또한 작은 분자 CD4-모방물, 예컨대 고친화성 상호작용을 위해 gp120의 CD4-결합된 형태를 필요로 하는 NBD-556에 대한 gp120의 결합을 방지한다[11, 16]. 항체, 예컨대 gp120 상에서 CD4-유도된 보존된 결합 부위를 인지하는 17b, 48d 및 412d의 결합[17, 18 및 27] 또한 내부 도메인의 층간 상호작용을 방지하는 돌연변이에 의해 극적으로 감소되었다[11]. 일반적으로, 감소된 층간 상호작용은 보존된 결합 부위(즉 CD4 및 공동-수용체 결합 부위)의 감소된 노출을 유도하고, 그로써 이들 부위를 인지하는 리간드의 결합을 감소시킨다.

상기에서 개시된 접근법과는 대조적으로, 본 발명자들은 내부 도메인에서 층간 접촉의 안정화가 gp120이 CD4-결합된 에피토프(또한 CD4-유도된 또는 CD4i 에피토프로도 언급됨) 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지가 모두 노출되는 형태를 취하도록 유도한다는 것을 발견하였다. 그러므로 본 발명은 다음을 제공한다:

· CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 동시에 노출시키는 형태로 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드

· HIV gp120의 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 모두 포함하는 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드의 면역원성 단편

· 세 개의 하위유닛을 포함하는 삼량체 폴리펩티드로서, 각각의 하위유닛은 독립적으로 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 동시에 노출시키는 형태로 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드, CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 동시에 노출시키는 형태로 안정화된 가용성 gp140 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드, HIV gp120의 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 모두 포함하는 HIV gp120 및 가용성 gp140 폴리펩티드의 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 모두 포함하는 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다

· 상기 열거된 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드

· 본 발명의 폴리펩티드, 면역원성 단편, 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물

· 대상에서 면역 반응을 생성시키는 방법

· HIV 감염을 치료 또는 방지하는 방법

안정화된 HIV gp120 및 가용성 gp140 폴리펩티드

본 발명은 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 동시에 노출하는 형태로 안정화된 HIV gp120 또는 가용성 gp140 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. "CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 동시에 노출하는 형태로 안정화된"이란 HIV gp120 또는 가용성 gp140의 내부 도메인이 CD4 리간드가 없을 때에도 CD4-결합된 형태를 취하는 것을 의미한다. 그로써, 야생형 gp120 또는 가용성 gp140에서 노출된 형태적으로 은폐된 에피토프는 CD4에 결합될 때에만 본 발명의 안정화된 gp120 또는 가용성 gp140 폴리펩티드에서 본질적으로 노출된다. 나아가, 본 발명의 안정화된 gp120 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 CD4가 없을 때에도 CD4-결합된 형태를 취하고, 따라서 CD4 결합 부위 에피토프는 동시에 CD4-결합된 에피토프로서 노출될 수 있다.

본 발명에 따라 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프를 동시에 노출하는 형태로 안정화된 HIV gp120 또는 가용성 gp140 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드는

(i) 항-gp120 CD4 결합 부위 항체, 즉 gp120에서 CD4 결합에 특이적인 항체,

(ii) gp120에서 CD4-유도된 보존된 결합 부위에 특이적인 항체, 및

(iii) 임의로 추가의 항-gp120 또는 항-가용성 gp140 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이다.

"특이적으로 결합한다"는 것은 항체가 본 발명의 폴리펩티드에 BSA보다 실질적으로 큰 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 바람직하게는 친화성은 BSA에 대한 것보다 본 발명에 대해서 적어도 100-배, 10³-배, 10⁴-배, 10⁵-배, 10⁶-배 등으로 더 큰 것을 의미한다.

전형적인 항-gp120 항체는 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 B12[19], F105[20], 17b[17], 48d[27], 412d[21], B13[22] 및 2G12[23]와, ATCC로부터 활용가능한 항체 46-2(CRL-2186), 46-4(CRL-2178), 46-5(CRL-2184), 55-2(CRL-2155), 55-36(CRL-2153), 55-6(CRL-2185) 및 55-83(CRL-2395)을 포함한다. 항-gp120 CD4 결합 부위(α-gp120-CD4BS) 항체는 단클론성 항체 B12, F105, JL413[24], 1795[25], 448-D(ATCC HB-10895), 558-D(ATCC HB-10894) 및 559/64-D(ATCC HB-10893)를 포함한다[26]. gp120의 CD4-유도된 보존된 결합 부위(α-gp120 CD4i)에 특이적인 항체는 참고문헌 27에서 기술된 17b, 48d, 412d 및 23e(2.3E)를 포함한다. 이들 α-gp120 CD4i 항체는 NIH AIDS Research & Reference Reagent Programme(https://www.aidsreagent.org/)으로부터 얻을 수 있다. 이들 항체의 서열은 공개되었고[28], 뉴클레오티드 서열은 IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 또는 ImMunoGeneTics information system (IMGT)(http://imgt.cines.fr/) 데이터베이스에서 활용할 수 있다.

한 구체예에서, gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 내부 도메인의 층들 사이에서 하나 또는 그것보다 많은 층간 접촉에 의해 안정화된다. 특별한 구체예에서, 안정화 접촉은 한 쌍의 비-자연적으로 코드화된 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 만들어진다.

안정화 접촉은 층 1과 2 사이, 2와 3 사이 또는 두 개 층 1 및 2와 2 및 3 사이에서 이루어질 수 있다.

두 개의 시스테인 잔기 사이에서 이황화 가교가 형성될 수 있도록 하기 위해, 측쇄는 상호 관련하여 정확한 거리에 및 정확한 방향으로 있어야 한다. 내부 도메인의 층 1, 2 및 3의 계면에 놓여있는 모든 잔기의 조사는 이황화 형성을 위해 쌍을 이룬 시스테인 잔기로 치환하기 위해 표적화될 수 있는 잔기들의 확인을 유도하였다. 적절한 잔기의 확인은 gp120의 결정 구조를 토대로 한다[13]. 잔기들의 쌍은 만약 그것들이 3.9Å 내지 5.8Å의 Cβ-Cβ 거리를 가지는 것으로 예상되었다면 적당한 것으로 간주되었다.

이것을 기초로, 다음의 잔기 쌍들이 층 사이에서 안정화 이황화 가교를 형성하기 위해 시스테인으로 치환되는 것으로 확인되었다: V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469 및/또는 H99와 R462(잔기 번호는 SF162 스트레인을 따름). SF162 스트레인으로부터의 gp120 폴리펩티드의 상기 열거된 아미노산 쌍과 동등한 다른 HIV-1 스트레인으로부터의 gp120에서의 아미노산 위치는, 예를 들면 두 번째 스트레인으로부터의 gp120 폴리펩티드 서열을 SF162 gp120 폴리펩티드 서열과 일렬로 배열함으로써 확인될 수 있다. 도 5는 HIV-1의 SF162 및 Hxb2 스트레인으로부터의 gp120의 일렬 배열을 도시한다. Hxb2 gpl20의 해당하는 잔기는 회색 넘버링으로 표시된다. 이황화 가교를 형성하기 위해 시스테인으로 치환되기 위한 잔기의 해당하는 쌍은 Hxb2의 V65와 S115, V101와 W479, V101과 R476, V101과 L483 및 H105와 R476이다.

유사하게, 가용성 gp140 폴리펩티드의 해당하는 잔기는 gp120 폴리펩티드 서열을 gp140 서열과 일렬로 배열함으로써 확인될 수 있다. SF162 가용성 gp140 아미노산 서열은 SEQ ID NO:23에 제시된다.

그로써, 본 발명은 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 동시에 노출하는 형태로 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공하고, 이때 안정화는 내부 도메인에서 층간 이황화 결합에 의해 이루어지며, 이황화 결합은 야생형 SF162 HIV gp120 폴리펩티드의 하나 또는 그것보다 많은 다음 쌍에 동등한 위치에서 시스테인 잔기에 의해 형성된다: V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469 및/또는 H99와 R462.

특정 구체예에서, 안정화된 HIV gpl20 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 표시된 내부 도메인 서열과 적어도 a% 동일한 아미노산 서열을 가지는 내부 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:2의 위치 V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469 및/또는 H99와 R462에 동등한 위치에서 하나 또는 그것보다 많은 쌍의 비-자연 발생 시스테인 잔기를 포함하며, 이때 a는 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상으로부터 선택된 값이다.

추가의 구체예에서, 안정화된 HIV gpl20 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 표시된 서열에 적어도 b% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:2의 위치 V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469 및/또는 H99와 R462에 동등한 위치에서 하나 또는 그것보다 많은 쌍의 비-자연 발생 시스테인 잔기를 포함하며, 이때 b는 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 또는 그 이상으로부터 선택된 값이다.

추가의 구체예에서, 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 22에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 안정화된 HIV gpl20 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 또한 추가로 해당 기술분야에 공지되어 있는 도메인-내 및 층간 안정화를 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드는 참고문헌 4에 기술된 것과 같은 공동 충전 돌연변이 또는 참고문헌 6 및 7에 기술된 것과 같은 이황화 결합을 포함할 수 있다. 특히 본 발명의 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 W90과 E268, I103과 Q413에 해당하는 위치에서 하나 또는 그것보다 많은 비-자연적으로 코드화된 시스테인 쌍 사이의 이황화 결합에 의해 추가로 안정화될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 단편을 제공하는데, 이때 면역원성 단편은 HIV gp120의 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프 두 가지를 모두 포함하고 동시에 노출한다. 면역원성 단편은 길이가 적어도 300, 350, 400, 450, 475, 480, 485, 490, 495 또는 497 아미노산일 수 있다. 특정 구체예에서, 면역원성 단편은 야생형 SF162 HIV gp120 폴리펩티드의 다음의 하나 또는 그것보다 많은 쌍에 동등한 위치에서 시스테인 잔기를 포함한다: V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469 및/또는 H99와 R462.

본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:23에 비교하여, 하나 또는 그것보다 많은(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 보존성 아미노산 치환뿐 아니라 하나 또는 그것보다 많은 다음의 쌍: V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469, H99와 R462에서 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 22에 비교하여, 하나 또는 그것보다 많은(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 한 아미노산의 관련된 측쇄를 가지는 다른 아미노산으로의 대체로서 정의되는데, 이때 아미노산 치환은 gp120 폴리펩티드의 안정화를 감소시키지 않는다, 즉 폴리펩티드는 여전히 동시에 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프를 노출시키는 형태로 안정화된다. 유전자-코드화된 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리로 나누어진다: (1) 산성, 즉 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성, 즉 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성, 즉 알라닌, 발린, 로이신, 아이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메싸이오닌, 트립토판; 및 (4) 전하를 띠지 않는 극성, 즉 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 쓰레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때로 방향족 아미노산으로 함께 분류되기도 한다. 일반적으로, 이들 패밀리 내에서 단일 아미노산의 치환은 생물학적 활성에 큰 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 23과 관련하여 하나 또는 그것보다 많은(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 단일 아미노산 결실을 가질 수 있다. 나아가, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 23과 관련하여 하나 또는 그것보다 많은(예컨대 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 삽입(예컨대 그것의 각각은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산임)을 포함할 수 있다. 이황화 결합에 의해 안정화된 구체예에서, 결실, 삽입 및 치환은 이황화 결합을 간섭하지 않는 어떠한 위치에서든지 있을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 많은 방법으로, 예를 들면 화학 합성에 의해(전체적으로 또는 부분적으로), 프로테아제를 사용하여 더 긴 폴리펩티드를 소화시킴으로써, RNA로부터의 번역에 의해, 세포 배양물로부터의 정제에 의해(예컨대 재조합 발현으로부터), 유기체 자체로부터(예컨대 박테리아 배양 후 또는 환자로부터 직접) 등에 의해 제조될 수 있다. <40 아미노산 길이의 펩티드의 바람직한 제조 방법은 시험관 내 화학 합성을 포함한다[29, 30]. 고체상 펩티드 합성, 예컨대 tBoc 또는 Fmoc 화학[31]을 토대로 한 방법이 특히 바람직하다. 효소적 합성[32] 또한 부분적으로나 전체적으로 사용될 수 있다. 화학 합성에 대한 대안으로서 생물학적 합성이 사용될 수 있는데, 예를 들면 폴리펩티드는 번역에 의해 생성될 수 있다. 이것은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 생물학적 방법은 일반적으로 L-아미노산을 토대로 한 폴리펩티드의 제조로 제한되지만, 번역 기계(예컨대 아미노아실 tRNA 분자)의 조작을 사용하여 D-아미노산(또는 다른 비 천연 아미노산, 예컨대 아이소타이로신 또는 메틸페닐알라닌, 아지도호모알라닌 등)의 생성도 가능할 수 있다[33]. 그러나, D-아미노산이 포함되는 경우 화학 합성을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 C-말단 및/또는 N-말단에서 공유 변형을 가질 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 실질적으로 정제된 형태로, 즉 실질적으로 다른 폴리펩티드가 없는(예컨대 자연-발생하는 폴리펩티드가 없는), 특히 다른 HIV 또는 숙주 세포 폴리펩티드가 없는 상태로 제공되고, 일반적으로 적어도 50% 순수한, 통상적으로는 적어도 90% 순수하고, 조성물의 약 50% 미만, 보다 바람직하게는 약 10% 미만(예컨대 5% 또는 그 미만)의 조성물이 다른 발현된 폴리펩티드로 구성된다.

본 발명의 폴리펩티드는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 검출가능한 표지(예컨대 방사성 또는 형광성 표지, 또는 비오틴 표지)를 포함할 수 있다.

용어 "폴리펩티드"는 어떠한 길이든지 아미노산 중합체를 말하는 것이고, 다른 변형 및 변이체 중에서도 당단백질을 포함한다. HIV gp120 및/또는 가용성 gp140은 당단백질이며 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 글리코실화될 것이다. 아미노산 중합체는 선형이거나 분지형이며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 방해될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭, 예를 들면 이황화 결합 형성, 추가의 글리코실화, 부분적이거나 완전한 탈글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 어떠한 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 포합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 이 정의에는 예를 들면 하나 또는 그것보다 많은 아미노산의 유사체(예를 들면 비천연 아미노산 등을 포함하여)뿐 아니라 해당 기술분야에 공지되어 있는 다른 변형도 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 결합된 사슬로서 발생할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 또는 비-자연적으로 글리코실화될 수 있다(즉 폴리펩티드는 해당하는 자연 발생하는 폴리펩티드에서 발견되는 글리코실화 패턴과 상이한 글리코실화 패턴을 가진다). 본 발명의 폴리펩티드는 분리되거나 정제될 수 있다.

본 발명은 서열 -X-Y- 또는 -Y-X-를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 -X-는 상기에서 규정된 것과 같은 아미노산 서열, 즉 본 발명의 폴리펩티드이고, -Y-는 상기에서 규정된 것과 같은 서열이 아니다, 즉 본 발명은 융합 단백질을 제공한다. 한 특정 구체에에서, -Y-는 인플루엔자 헤마글루타닌 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 보조하는 어떠한 적당한 단백질 또는 생물학적 분자이다.

본 발명은 또한 다량체 형태의 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 세 개의 하위유닛으로 구성된 삼량체를 제공하는데, 이때 각 하위유닛은 본 발명에 따르는 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 면역원성 단편이다. 한 구체예에서, 삼량체는 적어도 2개의 동일한 하위유닛을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 세 개의 모든 하위유닛은 동일하다. 다른 구체예에서, 세 개의 모든 하위유닛은 다르다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는데, 그 방법은 본 발명의 숙주 세포를 폴리펩티드 발현을 유도하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는데, 이때 그 폴리펩티드는 부분적으로 또는 전체적으로 화학적 수단을 사용하여 합성된다.

핵산

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 그런 핵산은 동일한 아미노산을 코드화하기 위해 대체 코돈을 사용하는 것들을 포함한다.

본 발명은 또한 이들 핵산에 혼성화할 수 있는 핵산을 제공한다. 혼성화 반응은 상이한 "엄격성"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 엄격성을 증가시키는 조건은 해당 기술분야에 널리 알려져 있고 공개되어 있다. 관련된 조건의 실례로는 다음을 포함한다(엄격성이 증가하는 순서로): 25℃, 37℃, 50℃, 55℃ 및 68℃의 인큐베이션 온도; 10x SSC, 6x SSC, 1x SSC, 0.1x SSC(SSC는 0.15M의 NaCl 및 15 mM의 시트레이트 완충액임)의 완충액 농도 및 다른 완충 시스템: 0%, 25%, 50% 및 75%의 폼아마이드 농도; 5분 내지 24시간의 인큐베이션 시간; 1, 2 또는 그것보다 많은 세척 단계; 1, 2 또는 15분의 세척 인큐베이션 시간; 및 6x SSC, 1x SSC, 0.1x SSC 또는 탈-이온수의 세척 용액을 사용하는 그것들의 동등물. 혼성화 기법 및 그것들의 최적화는 해당 기술분야에 잘 알려져 있다[예컨대 참고문헌 34 참조].

본 발명은 이들 서열에 상보하는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다(예컨대 안티센스 또는 프로빙을 위해, 또는 프라이머로서 사용하기 위해).

본 발명에 따르는 핵산은 다양한 형태(예컨대 단일-가닥, 이중-가닥, 벡터, 프라이머, 프로브, 표지된 형태등)를 취할 수 있다. 본 발명의 핵산은 원형이거나 분지형일 수 있지만, 일반적으로는 선형일 것이다. 다르게 표시되거나 요구되지 않는 한, 핵산을 활용하는 어떠한 본 발명의 구체예든지 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 두 개의 상보하는 단일-가닥 형태의 각각을 모두 활용할 수 있다. 프라이머와 프로브는 일반적으로 안티센스 핵산처럼 단일-가닥이다.

본 발명의 핵산은 바람직하게는 정제된 또는 실질적으로 정제된 형태로, 즉 실질적으로 다른 핵산이 없이(예컨대 자연-발생적인 핵산이 없이), 특히 다른 폐렴구균 또는 숙주 세포 핵산 없이, 일반적으로 적어도 약 50% 순수하게(중량으로), 통상적으로는 적어도 약 90% 순수하게 제공된다. 본 발명의 핵산은 바람직하게는 페렴구균 핵산이다.

본 발명의 핵산은 많은 방법으로, 예컨대 전체적으로 또는 부분적으로 화학 합성에 의해(예컨대 DNA의 포스포라미다이트 합성), 게놈 또는 cDNA 라이브러리 등으로부터 뉴클레아제(예컨대 제한 효소)를 사용하여 더 긴 핵산을 소화함으로써, 더 짧은 핵산 또는 뉴클레오티드를 연결함으로써(예컨대 리가제 또는 중합효소를 사용하여) 등의 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 핵산은 고체 지지체(예컨대 비드, 플레이트, 필터, 필름, 슬라이드, 미세배열 지지체, 수지 등)에 부착될 수 있다. 본 발명의 핵산은 예를 들면 방사성 또는 형광 표지, 또는 비오틴 표지로 표지될 수 있다. 이것은 특히 핵산이 검출 기법에 사용될 때, 예컨대 핵산이 프라이머로서 또는 프로브로서 사용되는 경우에 유용하다.

용어 "핵산"은 일반적으로 어떠한 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하고, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 그것들의 유사체를 함유한다. 그것은 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드를 포함한다. 그것은 또한 DNA 또는 RNA 유사체, 예컨대 변형된 골격을 함유하는 것들(예를 들면 펩티드 핵산(PAN) 또는 포스포로싸이오에이트) 또는 변형된 염기를 함유하는 것들을 포함한다. 그로써 본 발명은 mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, DNA, cDNA, 재조합 핵산, 분지된 핵산, 플라스미드, 벡터, 프로브, 프라이머 등을 포함한다. 본 발명의 핵산이 RNA의 형태일 때 그것은 5' 캡을 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

본 발명의 핵산은 벡터의 일부, 즉 하나 또는 그것보다 많은 세포 유형의 형질변환/형질전환을 위해 디자인된 핵산 구성물의 일부일 수 있다. 벡터는 예를 들면 삽입된 뉴클레오티드의 분리, 증식 및 복제를 위해 디자인된 "클로닝 벡터", 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 디자인된 "발현 벡터", 재조합 바이러스 또는 바이러스-유사 입자의 생성을 유발하기 위해 디자인된 "바이러스 벡터" 또는 하나보다 많은 유형의 벡터의 특징을 포함하는 "셔틀 벡터"일 수 있다. 바람직한 벡터는 플라스미드이다. "숙주 세포"는 외인성 핵산의 수용체일 수 있거나 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 그 자손은 자연적인, 우연한 또는 의도적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 반드시 원래의 모세포와 완전히 동일할 필요는 없다(형태학에서나 총 DNA 상보성에서). 숙주 세포는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 본 발명의 핵산으로 형질전환되거나 감염된 세포를 포함한다.

핵산이 DNA인 경우, RNA 서열에서 "U"는 DNA에서 "T"에 의해 대체될 것임이 인지될 것이다. 유사하게, 핵산이 RNA인 경우, DNA 서열의 "T"는 RNA의 "U"에 의해 대체될 것임이 인지될 것이다.

용어 "상보성" 또는 "상보하는"은 핵산과 관련하여 사용될 때 왓슨-크릭 염기쌍을 나타낸다. 그로써 C의 상보성은 G이고, G의 상보성은 C이며, A의 상보성은 T(또는 U)이고, T(또는 U)의 상보성은 A이다. 또한 예를 들어 피리미딘(C 또는 T)을 상보하기 위해 I(퓨린 이노신)와 같은 염기를 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 핵산은 예를 들면 시험관 내에서 또는 생체 내에서 폴리펩티드를 제조하기 위하여; 생물학적 샘플 중의 핵산의 검출을 위한 혼성화 프로브로서; 핵산의 추가의 복사물을 생성하기 위하여; 리보자임 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위하여; 단일-가닥의 DNA 프라이머 또는 프로브로서; 또는 올리고뉴클레오티드를 형성하는 삼중-가닥으로서 사용될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 핵산의 제조 방법을 제공하며, 이때 그 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 화학적 수단을 사용하여 합성된다.

본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터(예컨대 클로닝 또는 발현 벡터) 및 그런 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

면역원성 조성물

본 발명은 또한 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 본원에서 항원으로서 언급될 수 있는 본 발명의 폴리펩티드, 그것의 면역원성 단편, 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 삼량체 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것의 조합을 포함한다. 그런 면역원성 조성물은 백신으로서 유용할 수 있다. 이들 백신은 예방적이거나(즉 감염을 방지하기 위한) 또는 치료적(즉 감염을 치료하기 위한)일 수 있지만, 전형적으로는 예방적이다.

전형적으로, 면역원성 조성물은 그것을 약학적으로 허용되는 것으로 만들기 위하여 추가의 성분을 함유한다. 조성물은 통상적으로 항원 외의 성분을 포함할 것이다, 예를 들면 조성물은 전형적으로 하나 또는 그것보다 많은 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 그런 성분들의 철저한 논의는 참고문헌 35에서 찾아볼 수 있다.

면역원성 조성물은 일반적으로 수성 형태로 포유류에게 투여될 것이다. 그러나 투여 전에 조성물은 비-수성 형태로 존재한다. 예를 들어 비록 일부 백신은 수성 형태로 제조되지만, 그런 다음에는 충전 및 분배되고 또한 수성 형태로 투여되며, 다른 백신은 제조 중에 동결건조되고 사용 시점에서 수성 형태로 재구성된다. 그로써 본 발명의 조성물은 건조, 예컨대 동결건조된 제형일 수 있다.

면역원성 조성물은 싸이오머살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나 백신은 실질적으로 수은 물질이 없어야 한다(즉 5㎍/ml 미만), 예를 들어 싸이오머살이 없어야 한다. 수은을 함유하지 않은 조성물이 보다 바람직하다. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.

등장성을 제어하기 위하여, 생리 염, 예컨대 나트륨 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직한데, 그것은 1 내지 20mg/ml, 예컨대 약 10±2mg/ml의 NaCl로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염으로는 염화칼륨, 이수소 인산 칼륨, 인산 2나트륨 탈수화물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.

면역원성 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240 내지 360 mOsm/kg의 삼투도를 가질 것이고, 보다 바람직하게는 290 내지 310 mOsm/kg 범위에 속할 것이다.

면역원성 조성물은 하나 또는 그것보다 많은 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제는 인산염 완충제; Tris 완충제; 보레이트 완충제; 석시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(특히 알루미늄 하이드록사이드 보조제를 포함함); 또는 시트레이트 완충제를 포함한다. 완충제는 전형적으로 5 내지 20mM 범위로 포함될 것이다.

조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 보다 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예컨대 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.

조성물은 바람직하게는 멸균성이다. 조성물은 바람직하게는 발열원이 없거나, 예를 들면 용량당 1 미만의 EU(내독소 유닛, 표준 척도), 바람직하게는 용량당 0.1 미만의 EU를 함유한다. 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.

조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함하거나, 또는 다중 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있다(즉 '다용량' 키트). 보존제의 포함은 다중용량 배열에 바람직하다. 다중용량 면역원성 조성물에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서(또는 추가로), 면역원성 조성물은 물질의 제거를 위한 무균성 어댑터를 가지는 용기에 함유될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 또한 하나 또는 그것보다 많은 면역조절제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하나 또는 그것보다 많은 면역조절제는 하나 또는 그것보다 많은 보조제, 예를 들면, 참고문헌 36 및 37에 개시된 것과 같은 2, 3, 4 또는 그것보다 많은 보조제를 포함한다(예를 들어 보조제는 하나 또는 그것보다 많은 알루미늄 염을 포함하거나 마이크론 미만의 수-중-유 에멀션을 포함한다).

면역원성 조성물은 주사가능하게, 액체 용액 또는 현탁액 중 하나로서 제조될 수 있다. 주입 전 액체 비히클 중의 용액에, 또는 현탁액에 적당한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다(예컨대 동결건조된 조성물 또는 분무-냉동 건조된 조성물). 면역원성 조성물은 경구 투여를 위해, 예를 들면 정제 또는 캡슐로서, 스프레이로서, 또는 시럽으로서(임의로 향이 가미됨) 제조될 수 있다. 면역원성 조성물은 코 또는 눈 투여를 위해, 예컨대 드롭으로서 제조될 수 있다. 면역원성 조성물은 조합된 조성물이 환자에게 투여 직전에 재구성되도록 디자인된 키트 형태로 있을 수 있다. 그런 키트는 액체 형태로 하나 또는 그것보다 많은 항원 및 하나 또는 그것보다 많은 동결건조된 항원을 포함할 수 있다.

조성물이 사용 전에 즉석에서 제조되어야 하고(예컨대 성분이 동결건조된 형태로 제공되는 경우) 키트로서 제공되는 경우, 키트는 두 개의 바이알을 포함하거나, 하나의 미리 채워져 있는 주사기와 하나의 바이알을 포함할 수 있고, 이때 주사기의 내용물은 주입 전에 바이알의 내용물을 재활성화시키기 위해 사용된다.

백신으로서 사용된 면역원성 조성물은 면역학적으로 효과적인 양의 항원(들)뿐 아니라, 필요에 따라 어떠한 다른 성분을 포함한다. '면역학적으로 효과적인 양'이란 단일 용량으로나 연속적인 용량의 일부로서 개체에게 투여되는 양이 치료 또는 방지에 효과적인 것을 의미한다. 이 양은 치료하고자 하는 개체의 건강 및 신체 조건, 치료하고자 하는 개체의 연령, 분류학상의 군(예컨대 비-인간 영장류, 영장류, 등), 항체를 합성하는 개체의 면역 시스템의 능력, 원하는 보호 정도, 백신의 제형, 치료하는 의사의 의료 상태에 대한 평가 및 다른 관련된 요인들에 좌우된다. 그 양은 기본적인 실험을 통해 측정될 수 있는 상대적으로 광범위한 범위에 속할 것이다.

치료 방법

본 발명의 분리된 폴리펩티드, 그것의 면역원성 단편, 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 삼량체 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 그것들의 조합은 대상에서 면역 반응을 생성하기 위한 방법 및 대상에서 HIV에 의한 감염 및/또는 AIDS를 치료 및 방지하는 방법에 사용될 수 잇다. 바람직한 구체예에서, 대상은 인간이다.

대상에서 면역 반응을 생성하기 위한 방법은 본 발명의 분리된 폴리펩티드, 그것의 면역원성 단편, 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 삼량체 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 그것들의 조합을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법 및 사용에 의해 생성된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함할 것이다. 항체 반응, 중화 능력 및 HIV 백신처리 후 보호를 평가하기 위한 방법들은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 참고문헌 38, 39, 40, 41 및 42에 기술된다.

본 발명은 또한 대상에서 HIV로의 감염 및/또는 AIDS를 치료 또는 방지하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 본 발명의 분리된 폴리펩티드, 그것의 면역원성 단편, 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 삼량체 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 그것들의 조합을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육 내 주사(팔 또는 다리에)에 의한 것이지만, 활용할 수 있는 다른 경로는 피하 주사, 비강 내 주사[43 내지 45], 피부 내 주사[46, 47], 경구[48], 피하, 경피[49] 등을 포함한다. 피내 및 비강 내 경로가 매력적이다. 피내 투여는 예컨대 약 1.5mm 길이의 바늘이 달린 미세주입 장치를 포함할 수 있다.

치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄에 의한 것일 수 있다. 다중 용량은 일차 면역화 스케줄에서 및/또는 부스터(booster) 면역화 스케줄로 사용될 수 있다. 다중 용량 스케줄에서 다양한 용량이 동일하거나 상이한 경로에 의해 주어질 수 있는데, 예를 들면 비경구 기초 및 점막 추가 상승, 점막 기초 및 비경구 추가 상승 등일 수 있다. 1회 용량보다 많은(전형적으로는 2회 용량) 투여는 특히 면역학적으로 순진한(naive) 환자에서, 예컨대 HIV 백신을 전에 받아본 적이 없는 사람들에게 유용하다. 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주일 간격으로(예컨대 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 12주, 약 16주 등) 투여될 것이다.

본 발명의 면역원성 조성물은 환자에게 항레트로바이러스 화합물, 특히 HIV에 대한 항레트로바이러스 화합물과 실질적으로 동시에(예컨대 동일한 의료적 진찰 중에 또는 건강관리 전문가에게 방문할 때) 투여될 수 있다.

일반적 사항

용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐 아니라 "구성되는"을 포함하는데, 예를 들면 X를 "포함하는" 조성물은 독점적으로 X로 구성될 수도 있고 또는 추가의 어떤 것을 포함할 수 있다, 예를 들면 X+Y일 수 있다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다, 예컨대 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

수치 x와 관련하여 용어 "약"은 임의적이고, 예를 들면 x±10%를 의미한다.

폴리펩티드 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 MPSRCH 프로그램(Oxford Molecular)에서 시행된 Smith-Waterman 상동성 연구 알고리즘에 의해, 갭 오픈 페널티=12 및 갭 연장 페널티=1의 매개변수를 포함하는 아핀 갭 연구를 사용하여 측정된다.

도 1a는 HXBc2 스트레인으로부터의 HIV gp120의 내부 도메인의 구조 및 그것의 층 1, 2 및 3으로의 조직화를 도시한다.
도 1b는 결합된 층과 도메인을 보여주는 SF162 스트레인으로부터의 HIV-gp120의 서열(SEQ ID NO:2)을 도시한다. 내부 도메인은 검은색 문자로 표시되고, 외부 도메인은 회색 문자로 표시된다. 층 1에 기여하는 아미노산은 단일 밑줄로 표시되고 층 2에 기여하는 아미노산은 이중 밑줄로 표시되며, 층 3에 기여하는 아미노산은 파선으로 밑줄이 그어졌다.
도 2는 시스테인 치환된 및 원래의 gp120 구조를 비교한다.
도 3은 HXBc2 스트레인으로부터의 gp120 구조를 토대로 한 층 1과 2 이황화 가교화에 대한 표적을 도시한다.
도 4는 HXBc2 스트레인으로부터의 gp120 구조를 토대로 한 층 2와 3 이황화 가교화에 대한 표적을 도시한다.
도 5는 Hxb2-gp120(그것으로부터 구조적 정보가 유도된다) 및 SF162(참고 서열)의 일렬 배열에서 보여준 시스테인 치환 부위를 도시한다. 시스테인 치환 및 이황화 가교화에 대해 표적화된 부위는 서열 번호가 들어 있는 상자로 표시된다.
도 6은 포유류 세포에서 야생형 및 시스테인 치환된 gp120의 발현의 비교를 도시한다. SF162 gp120을 코드화하는 야생형, 단일 및 이중 돌연변이된 플라스미드는 293 T-세포로 형질전환되었고, 배양 후 48시간 후에 세포는 수득되고 용해되었다. 동량의 세포-용해물이 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE 상에서 이동되고, 용해물 중의 HIV-gp120은 항-gp120 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다(2G12).
도 7A는 90%보다 큰 순도의 단백질임을 나타내는, 정제된 SF162 gp120 및 이황화 안정화된 SF162 L1-SS-L2 gp120(SEQ ID NO:4)을 보여주는 전형적인 쿠마찌 염색된 PAGE 겔을 도시한다.
도 7B는 90%보다 큰 순도의 단백질임을 나타내는, 정제된 SF162 gp140 및 이황화 안정화된 SF162 L1-SS-L2 gp140(V59C 및 S109C)을 보여주는 전형적인 쿠마찌 염색된 PAGE 겔을 도시한다.
도 8은 gp120 및 gp120 L1-SS-L2의 수용체(가용성 CD4, sCD4), mAb b12(CD4-결합 부위에 결합함) 및 mAb 17b(CD4 유도된 방식으로 CD4-결합 후에 결합하는 항체)에의 결합 친화성을 측정하기 위한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 도시한다. 각각의 리간드 위에 주입된 gp120 단백질의 다양한 농도에 대한 실험 데이터뿐 아니라 1:1 맞춤 곡선이 도시된다.
도 9A는 첫 번째 면역화 후 2주 후(2wp1), 두 번째 면역화 후 2주 후(2wp2), 세 번째 면역화 후 2주 후(2wp3), 세 번째 면역화 후 4주 후(4wp3) 및 세 번째 면역화 후 8주 후(8wp3) 시간 지점에서의 항체 결합 연구 결과를 도시한다.
도 9B는 4가지의 모든 면역원에 대한 결합력 지수를 도시한다.
도 10은 TZM-b1 분석에서 위바이러스(교차-하위유형)의 중화를 도시한다. A - gp120; B - gp120 L1-SS-L2; C - gp140; D - gp140 L1-SS-L2.
도 11은 A - gp120; B - gp120 L1-SS-L2; C - gp140; D - gp140 L1-SS-L2에 의해 생성된 항체의 에피토프-특이성을 도시한다.

층간 접촉을 안정화시키기 위한 전략

시스테인 돌연변이 및 이황화 가교를 위한 부위의 확인

두 개의 시스테인 잔기 사이에 형성될 이황화 가교를 위해 측쇄는 상호 관련하여 적절한 거리에 및 정확한 방향으로 있어야 한다. 본 발명자들은 층 1, 2 및 3의 계면에 놓여있는 모든 잔기를 조사하였고, 이황화 형성을 위해 시스테인으로의 치환에 대해 표적화될 수 있는 잔기들을 확인하기 위해 시도하였다. 본 발명자들은 gp120의 결정 구조[13]를 사용하였고, 이 선택을 위해 다음의 기준을 사용하였다:

a. 이전에 용해된 gp120 구조에서 이황화 가교를 형성한 시스테인의 Cβ(탄소-베타) 원자간 평균 거리는 약 4.22Å이고, 3.9Å 내지 4.7Å 내에 있다. 그러므로, 본 발명자들은 이 범위에 속하는 Cβ-Cβ 거리를 가지는 상호작용하는 층 상에서의 잔기에 대해 선별하였다.

b. 본 발명자들은 또한 시스테인 잔기로의 치환에 의해 도입된 인공적인 이황화 가교가 그 안에 있는 gp120의 결정 구조를 조사하였다[6]. 이 구조에서, 두 쌍의 잔기 (W90-E268) 및 (I103-Q413)이 시스테인으로 치환되었다(W90C-E268C 및 I103C-Q413C). 천연 및 시스테인 치환된 잔기의 Cβ 거리는 각각 4.1Å 및 4.3Å이었다. 나아가, 시스테인 치환된 잔기의 이황화 가교를 적절하게 형성하였고, 이들 이황화 가교된 gp120의 CD4-결합된 구조는 천연 gp120-CD4 결합된 구조와 구별되지 않았다(도 2).

이들 기준을 토대로 본 발명자들은 만약 시스테인으로 치환되었다면, 층 사이에 이황화 가교를 형성할 다수의 잔기 쌍을 확인하였다(도 3, 4 및 5).

시스테인 치환 및 표적화된 이황화 결합 삽입을 위한 부위의 선택

상기에서 기술된 것과 같이, 층들의 계면에 및 근접한 거리에(대략 4 내지 5Å) 놓여 있고, 만약 시스테인으로 치환되었다면 이황화 결합을 형성할 수 있을 잔기들을 활용할 수 있는 구조적 정보[13]를 사용하여 육안으로 선택하였다. 본 발명자들은 또한 시스테인으로 치환되었다면 이황화 결합을 형성할 수 있을 정도로 충분히 가까울 것으로 추정되는 잔기들에 대한 추가의 통찰을 얻기 위해 소프트웨어 이황화물-바이-디자인(Disulfide-by-Design)을 사용하였다.

시스테인 치환에 대한 부위 특정된 돌연변이생성

일단 본 발명자들은 시스테인 치환에 대한 잔기를 결정하고, 퀵 체인지 부위 특정 돌연변이생성(Stratagene)에 따라 상보하는 프라이머를 디자인하였다. 야생형 SF162 GP120 코딩 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 각 라운드의 돌연변이생성 후에 클론들을 선택하여 정확한 돌연변이의 존재 및 의도하지 않은 돌연변이의 부재를 확실하게 하기 위해 서열화하였다. 정확한 클론을 대규모 플라스미드 DNA 제조를 위해 추가로 확대시켰다.

층 1과 층 2 가교화를 위한 표적

층 1과 층 2를 가교하기 위한 시스테인 치환을 위해 선택된 표적은 층 1로부터의 발린 59와 층 2로부터의 세린 109이다(도 3 및 5). 이 가교는 본원에서 L1-SS-L2로 언급된다. 새로운 CD4 결합된 gp120 구조에서 이들 잔기 사이의 Cβ 원자 거리는 3.7Å이고, 이것은 이황화 가교에 대한 이상적인 거리이다. 이들 두 잔기를 부위 특정 돌연변이생성에 의해 Stratagen® Quick Change 프로토콜을 사용하여 시스테인으로 돌연변이시켰고, DNA 서열화에 의해 확인하였다(표 1). 이들 잔기의 시스테인으로의 돌연변이와 결부된 120 발현 또는 처리에서의 해로운 효과의 부재는 소규모 형질전환 및 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다(도 6).

층 2와 3 가교화를 위한 표적

상기 기술된 유사한 기준을 토대로, 본 발명자들은 이황화 결합에 의해 가교될 수 있는 층 2와 층 3 상에 놓여 있는 많은 잔기를 확인하였다. 이들 잔기 및 Cβ 원자들 사이의 거리는 아래에 열거된다: V95-W465: 4.5Å, V95-R462: 5.3Å, V95-L469: 5.6Å 및 H99-R462: 5.8Å. 잔기 V95 및 W465는 층 2와 3의 시스테인 돌연변이 및 이황화 가교에 대한 일차 표적이 될 것이다(도 4 및 5). 선택된 잔기를 돌연변이시켰고, 돌연변이의 존재 및 돌연변이로부터의 유해한 효과의 부재를 상기에서 기술된 것과 같이 확인하였다(표 1 및 도 6).

조합 돌연변이생성 및 다중 이황화 결합의 삽입

추가의 안정화를 이루기 위하여, 본 발명자들은 표 1에서 표시되고 아래에서 기술되는 것과 같이 조합 돌연변이생성을 진행하였다. 이것들은 다음을 포함한다:

a. V59C와 S109C 및 V95C와 W465C 사이의 이황화 결합을 사용한 층 1과 2 및 층 2와 3의 이중 가교화의 조합

b. V59C와 S109C 사이의 이황화 결합을 사용하여 이미 공개된 이황화 가교된 gp120 구조[6](W90C & E268C; I103C & Q413C)와 층 1과 2 가교의 조합

c. V95C와 W465C; W90C와 E268C; 또는 I103C와 Q413C에서의 이황화 결합과 조합된 이미 공개된 이황화 가교된 gp120 구조[6](W90C와 E268C; I103C와 Q413C)를 가지는 층 2와 3 가교의 조합

단백질 발현 및 정제

재조합 HIV-1 엔벨로프(Env) 당단백질, gp120 및 gp140을 하위타입 B CCR5-향성 스트레인 HIV-1 SF162로부터 유도하고, HEK293T 세포의 형질전환에 의해 제조하였다. 루프 1 및 2 이황화-안정화된 gp120(gpl20 L1-SS-L2) 및 gpl40(gpl40 L1-SS-L2)도 또한 SF162로부터 유도하였고 HEK293T 세포에서 제조하였다. 4개의 모든 당단백질을 Srivastava 등에 의해 기술된 것과 같이[52], 갈란투스 니발리스-아가로스(GNA) 친화성 칼럼, 양이온 교환 DEAE 칼럼 및 최종 세라믹 하이드록시아파타이트(CHAP) 칼럼을 포함하는 3-단계 정제 과정을 사용하여 정제하였다. 정제된 당단백질을 그런 다음 SDS-PAGE(순도 수준에 대해)에 의해 및 비반응성(항-SF162 gp140다클론성 토끼 혈청에 대한)에 대해 면역블롯에 의해 분석하였다. 정제된 당단백질은 순도가 98%보다 큰 균질한 것이었다(gp120에 대해서는 >95% 단량체; gp140에 대해서는 >80% 삼량체). 당단백질 중의 내독소 수준을 Endosafe® 카트리지 및 Endosafe®-PTSTM 분광 광도계(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA)를 사용하여 측정하였고, ≤0.05 EU/면역화 용량인 것으로 나타났다.

에피토프-지도화 목적에 대해 사용된 SF162 gp120의 다른 변이체, 예컨대 gp120△V3, gpl20△VlV2, gpl20 D368R(CD4-결합 부위 돌연변이), gpl20 I420R(CD4i 부위 돌연변이)을 또한 상기에서 및 이전에 기술된 것과 같이[50] 제조하고 정제하였다. 단백질의 순도는 단백질의 쿠마찌 염색된 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯으로부터 추정된다.

도 7A는 정제된 SF162 gp120(레인 1)의 쿠마찌-염색된 SDS-PAGE 및 이황화-안정화된 SF162 L1-SS-L2 gp120(SEQ ID NO:4)(레인 2)의 쿠마찌-염색된 SDS-PAGE를 도시하는데, 이것들은 90%보다 큰 단백질 순도를 나타낸다. 화살표는 두 개의 120kDa 단백질을 나타낸다. 도 7B는 정제된 SF162 gp140(레인 3) 및 이황화-안정화된 SF162 L1-SS-L2 gp140(V59C 및 S109C)(레인 4)의 쿠마찌-염색된 SDS-PAGE를 도시하는데, 이것들은 90%보다 큰 단백질 순도를 나타낸다(패널 B). 화살표는 두 개의 140kDa 단백질을 나타낸다.

MW는 분자량 마커를 나타낸다; 마커의 각 밴드의 분자량(kDa)이 표시된다.

표면 플라스몬 공명( SPR ) 분석에 의한 단백질의 특성확인:

각 돌연변이로부터 정제된 단백질의 구조적 변화 및 형태의 고정을 SPR에 의해 분석하였는데, 그것은 특이한 리간드에의 결합의 동역학을 측정하였다. 야생형 gp120 및 이황화-안정화된 gp120, gpl20 L1-SS-L2의 결합 친화성을 측정하기 위하여 본 발명자들은 SPR-기저 BIAcore 3000을 사용하였다. 200RU의 sCD4 또는 mAb, b12 또는 17b를 직접 CM5 센서 칩 위에 아민 결합을 통해 고정시켰다. 그런 다음 야생형 또는 이황화-안정화된 gp120의 농도를 다르게 하면서 80㎕/분으로 주입하였다. 결합 분석을 25℃에서 HBS-EP 완충액을 작동 완충액으로서 사용하여 수행하였다. 그런 다음 실험 곡선을 1:1 Langmuir 결합 모델 BIAevaluation 소프트웨어 3.2(BIAcore Inc)로 조정하였다. 1:1 맞춤을 따라 유도된 결합 속도, Kon, 해리 속도, Koff 및 해리 상수 Kd를 표 2에 표시한다.

결과

gp120의 구조적 형태에 대한 이황화 결합에 의한 층간 이동성의 고정이 미치는 효과의 특성 확인을 위해, 야생형(변화하지 않음) 및 층 1-2 이황화 연결된 돌연변이(V59C와 S109C; L1-SS-L2)로부터의 단백질을 정제하였고, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 특성확인하였다. 이 분석에서, gp120의 상이한 형태에 결합하는 리간드들이 CM5 칩상에 포획되었고(방법 참조), 야생형 또는 돌연변이 가용성 gp120에 대한 결합을 비교하였다. gp120의 CD4-결합된 형태에 선택적으로 결합하는 17b 항체, CD4-유도된 항체에 대한 결합은 야생형에 비교하여 돌연변이 gp120에 대해 상당한 정도로 증가되었다. 이황화 결합에 의한 층 1과 2 사이의 상호작용의 안정화는 17b에 대한 결합 친화성에서 5배 이상의 증가를 유도하였다. 흥미롭게도, 이러한 친화성의 증가는 거의 모두 온-레이트(on-rate)의 증가로부터 유도되고(표 2 참조), 그것은 CD4-결합된 형태로 gp120의 고정을 확인해준다. 그러나, 여전히 층 1과 2 단독 사이의 이황화 결합에 의해 안정화된 gp120의 가요성이 실질적인 양으로 남아있고, 그것은 특히 가용성 CD4에 결합할 때 명백하다.

gp120 및 gpl20 L1-SS-L2의 수용체(가용성 CD4; sCD4), mAb b12(CD4-결합 부위에 결합함) 뿐 아니라 mAb 17b에 대한 결합 친화성을 측정하기 위하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 또한 사용하였다(도 8). 선들은 각 리간드에 대해 주입된 gp120 단백질들의 다양한 농도에 대한 실험 데이터를 나타내고; 곡선은 1:1 맞춤 곡선을 나타낸다. 두 개의 곡선의 거의 완전한 겹침(overlay)은 1:1 결합 모델로 맞춤(Chi2, 표 2)의 유익을 입증한다.

리간드 - 분석물	K _on (1/ Ms )	K _off (1/s)	K _d (M)
Gp120-sCD4	3.21e⁴	7.84e^-4	2.45e^-8
Gp120 L1-SS-L2-sCD4	8.02e³	7.46e^-4	9.31e^-8
Gp120-b12	1.65e⁵	7.12e^-3	4.48e^-8
Gp120 L1-SS-L2-b12	2.91e⁴	8.85e^-3	3.04e^-7
Gp120 (+sCD4)-17b	2.04e⁵	5.35e^-5	2.62e^-10
Gp120 L1-SS-L2-17b	1.05e⁶	4.64e^-4	4.42e^-10
Gp120 L1-SS-L2 (+sCD4)-17b	3.46e⁵	3.33e^-5	9.62e^-11

(wt/변형되지 않은) gp120 및 이황화 안정화된 gp120 L1-SS-L2의 결합의 동역학 분석을 비교한 결과 다음을 나타낸다:

1. CD4에 대한 결합: gp120 결합된 가용성 CD4(sCD4)의 K_d(해리 상수)는 24.5nM(2.48e^-8M)인 한편, 안정화된 gp120(gP120 L1-SS-L2)는 4-배 더 낮은 친화성(K_d = 93.1nM/9.31e^-8M)으로 결합하였다. 이 4-배 차이는 전적으로 CD4 결합된 형태의 단백질의 '잠금(locking)' 때문에 이황화-안정화된 gp120의 sCD4에 대한 더 낮은 온-레이트(K_on)에 기인한 것이었다[2열과 3열 비교].

2. b12에 대한 결합: 본 발명자들은 유사한 경향을 관찰하였지만, gp120과 gp120 L1-SS-L2 사이의 K_d에서 ≤7-배의 더 큰 배수 차이가 있었다[4열과 5열 비교].

3. 17b(+/-sCD4)에 대한 결합: 본 발명자들은 gp120이 sCD4가 없을 때에는 mAb 17b에 효과적으로 결합하지 못하는 것을 알고 있다. 그러나, sCD4가 있을 때[6열], gp120은 0.26nM의 나노몰 이하의 친화성으로 결합하였다(2.62 e^-10M). 중요하고도 결정적으로, 이황화-안정화된 gp120(gP120 L1-SS-L2)은 sCD4의 부재시에 CD4-결합된 상태(gpl20+CD4)의 gp120의 친화성과 유사한 친화성, 0.44nM(4.42e^-10M)으로 mAb 17b에 결합하였다[7열]. 안정화된 gp120에 sCD4가 첨가될 때, 친화성은 20-배 향상되고 96pM[9.62e^-11nM, 7열]의 해리상수를 나타낸다.

CD4-결합된 형태에서 gp120의 완전한 안정화를 이루기 위하여, 층 2와 3 사이의 추가의 안정화 돌연변이를 연구한다.

후보 면역원의 분석

일단 각각의 추가의 안정화된 폴리펩티드가 제조되면, 그것을 단백질 발현 수준, 적절한 접힘 및 리간드 결합에 대해 평가할 것이다. 이것들은 이전에 안정화된 구조 및 전개된 다른 변형된 gp120와 보존된 결합 부위의 증강된 노출에 대하여 비교될 것이다. gp120 상에서 보존된 결합 부위의 안정한 노출을 이룬 단백질들을 추가로 소규모 동물 실험으로 후보 면역원으로서 분석할 것이다.

보조제-카보폴971P NF + MF59[51]

카보폴® 971P NF(본 연구에서는 카보폴 971P로 언급함)를 Lubrizol로부터 분말로서 구매한 후, 멸균 조건하에서 물에 재현탁하여 0.5%의 균일한 저점도의 현탁액을 만들었다. 그 현탁액을 4℃에서 나중에 사용할 때까지 보관하였다. 모든 시험관 내 평가를 위해 gp140 단백질과 0.5%(w/v) 카보폴971P(pH≥3.0)의 1:1(v/v) 혼합물을 만들었다. 동물에게 투여하기 위해 gp140 단백질과 0.5%(w/v) 카보폴971P의 1:1(v/v) 혼합물을 먼저 만들고, gp140 단백질-카보폴971P 복합체를 30분 동안 인큐베이션한 후에 동일 부피의 MF59를 첨가함으로써, 투여된 카보폴971P 현탁액의 최종 농도를 0.125%(w/v)로 유지하였다. 모든 생체 내 연구를 위한 카보폴971P 현탁액에 대해서는, 내독소 수준을 Endosafe® 카트리지 및 Endosafe®-PTSTM 분광계(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA)를 사용하여 측정하였다.

토끼 면역화

면역화 연구를 USDA를 통해 허가받고(No. 93-R-0260) NIH로부터의 공중위생국(PHS) 보험을 가지고 있는(No. A3404-01) 연구 시설인 Josman LLC(Napa, CA)에서 수행하였다. 세 그룹의 뉴질랜드 화이트 토끼(그룹당 5마리의 어린 성숙한 암컷)를 연구에 사용하였다. 토끼들을 MF59 단독, 카보폴971P 단독 중 하나, 또는 카보폴971P+MF59로 보조된 SF162 gp140 단백질로 면역시켰다. 4가지 면역을 둔근 근육에 근육 내로(면역화당 2 부위), 0, 4, 12 및 24주에 투여하였다. 각 면역시에 단백질 단위용량은 50㎍이었다. 혈청 샘플을 첫 번째 면역화 전에 수집한 혈액(출혈 전)으로부터 제조하고 각 면역화 후 다양한 시간 지점에(2wp2, 2wp3, 2wp4, 4wp4 및 15wp4) 결합 및 중화에 대해 분석하였다.

0.125%(w/v)의 카보폴971P의 주사와 관련된 국소 반응원성의 평가를 위해, 주사 부위에서의 부종 및 홍반에 대해 피부의 육안 관찰을 투여전, 면역화 직후, 및 면역화 후 24시간 및 48시간 후에 수행하였다. 어떠한 명백한 임상적 사인에 대한 일반적인 관찰을 면역화 직후, 및 면역화-후 24시간 및 48시간째에 수행하였다. 또한 체중을 연구를 시작하기 전, 각각의 면역화 전, 및 각각의 면역화 후 24시간 및 48시간째에 기록하였다.

연구는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 ILAR 지침인 동물 복지법, 및 모든 적용가능한 지방, 주 및 연방 법 및 규정에 서술된 것과 같은 인간 돌봄 및 동물의 사용에 대한 요건에 따라 노파르티스에 있는 기관 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 전체적으로 승인받았다(승인 번호 09 NVD 044.3.3.09).

결과

본 발명자들은 카보폴과 MF59를 보조제로서 사용한 단백질 단독(25㎍) 면역화로 토끼 연구를 수행하였다. 야생형 gp120 및 gp140을 각각 gpl20 L1-SS-L2(SEQ ID NO:4) 및 gpl40 L1-SS-L2(V59C 및 S109C)와 비교하였다. 면역화를 아래의 표 3에서 표시된 것과 같이 수행하였다.

그룹 (n=5)	면역원	용량/면역화	주	보조제
1	gp120	25mg	0, 4, 12	카보폴971P + MF59
2	gp120 L1-SS-L2	25mg	0, 4, 12	카보폴971P + MF59
3	gp140	25mg	0, 4, 12	카보폴971P + MF59
4	gp140 L1-SS-L2	25mg	0, 4, 12	카보폴971P + MF59

토끼들을 제시된 면역원과 보조제로, 0, 4 및 12주의 시간 지점에 면역시켰다.

면역화할 때, 본 발명자들은 첫 번째 면역화 후 2주 후(2wp1), 두 번째 면역화 후 2주 후(2wp2), 세 번째 면역화 후 2주 후(2wp3), 4wp3 및 8wp3 시간 지점에서 결합하는 Ab를 평가하였다. 본 발명자들은 4가지의 면역화가 모두 >10e+5-6 GMT 2wp2/2wp3 면역화를 유도하였음을 관찰하였다. 그 결과를 도 9A에 나타낸다.

본 발명자들은 또한 gpl40 L1-SS-L2를 제외하고, 분석된 5개의 시간 지점에서 4가지의 모든 면역원이 유사한 수준의 결합력을 생성하였고, gpl40 L1-SS-L2는 2wp3(최종 면역화 후 2주 후)에서 상당히 더 높은 결합력 항체를 생성하였음을 관찰하였다. 그 결과는 도 9B에 나타낸다.

HIV-1 바이러스 중화

본 발명자들은 또한 TZM-b1 분석으로 위바이러스(교차-하위유형)의 중화에 대해 2wp3 혈청을 분석하였다. 바이러스 중화 역가를 이전에 설명된 것과 같이[46, 47], 위바이러스를 활용하는 잘-표준화된 분석 및 TZM-b1 세포에서의 루시페라제 리포터 유전자 분석[Dr. John C. Kappes, Dr. Xiaoyun Wu and Tranzyme, Inc. (Durham, NC)]을 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 웰당 총 200개의 TCID50 위바이러스를 희석된 혈청 샘플에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 DEAE-덱스트란-함유 배지 중의 웰당 10,000 세포를 첨가하고 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 최종 DEAE-덱스트란의 농도는 10㎍/ml이었다. 48시간 인큐베이션 후에, 100㎕의 세포를 96-웰의 검은색 고체 플레이트(Costar)에 옮겨 공급업체(Promega)에 의해 설명된 것과 같이 Bright Glo 기질 용액을 사용하여 발광을 측정하였다. 중화 역가는 상대적인 발광 유닛(RLU)이 바탕 RLU를 뺀 후의 바이러스 대조 세포와 비교하여 50% 감소된 희석률이었다. HIV-1 Env 위바이러스를, 기록된 것과 같이 FuGENE-6 HD(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)를 사용하여, env-결핍된 HIV-1 골격 벡터(pSG3Aenv)와 조합된 HIV-1 분리물의 패널로부터 분자상 클론된 전체-길이의 gp160 env 유전자를 함유하는 발현 벡터로 293T 세포를 공동-형질전환함으로써 제조하였다[Montefiori, D.C., Measuring HIV neutralization in a luciferase reporter gene assay. . HIV Protocols: Second Edition ed. G.V.K. Vinayaka R. Prasad, eds. Vol. 485. 2009: Humana Press. 395-405]. 48시간 후에 위바이러스를 함유하는 세포 배양 상층액을 0.45μm 필터를 통해 여과하고 -80℃에서 사용할 때까지 보관하였다.

본 발명자들은 4가지의 면역원이 모두 Tier la 바이러스[SHIV-Bal-P4(키메릭, 하위유형 B), MN.3(하위유형 B), SF162.LS(하위유형 B) 및 MW965.26(하위유형 C)]에 대해 Env-특이적 중화 항체를 유도하였음을 관찰하였다. 중요한 것은 이황화-안정화된 gp120 및 gp140이 둘 다 0.5 로그보다 큰 균일한 중화 역가(즉 SF162 바이러스에 대하여)를 생성하였다는 것이다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.

에피토프 특이성

본 발명자들은 2wp3 혈청을 사용하여 4가지의 면역원에 의해 면역될 때 생성된 항체의 에피토프-특이성을 평가하였다. 본 발명자들이 조사한 4개의 에피토프는 다음과 같았다 - V3 루프, V1V2 루프, CD4-결합 부위(CD4BS) 및 CD4 유도성/유도된(CD4i; CD4 결합된) 부위. MF59로 보조된 gP140 단백질, 카보폴971P로 보조된 gP140 단백질 또는 카보폴971P와 MF59로 보조된 gp140 단백질로 면역된 동물로부터의 혈청 중의 엔벨로프-특이적 총 항체 역가를, 이전에 기술된 것과 같이[52] SF162 gp140 단백질을 사용하여 표준 ELISA 분석에 의해 정량하였다. 항체 결합력 지수 측정을 다른 곳에서 기술된 것과 같이[52] 암모늄 싸이오시아네이트(NH₄SCN) 대체를 사용하여 수행하였다.

본 발명자들은 분석 시에 4개의 면역원에 의해 생성된 항체의 질에 상당한 차이가 있음을 관찰하였다. gp120은 V3(~50 내지 55%) 및 V1V2-에피토프에 대해 고수준의 항체를 유도한 반면, 보다 보존된 CD4BS 및 CD4i-부위에 대해 특정된 항체는 더 낮았다(10 내지 20%)(도 11A). 그러나, 이황화-안정화된 gp120은 V3-(<40%) 및 V1V2-(15 내지 20%) 영역에 대해 상당히 더 낮은 수준의 항체를 생성하였고, CD4BS(≥30%; gp120-면역된 arm에서는 ~20%부터) 및 CD4-부위(>30%; gp120-면역된 arm에서는 ~10%부터)에 대해서는 비교적 더 높은 수준의 항체를 생성하였다(도 11B).

gp140을 사용한 면역화는 40%보다 큰 V3-반응성 항체 및 20% 이상의 V1V2 반응성 항체를 유도하였다. 보존된 CD4BS에 대한 항체는 20% 이상이었고, CD4i-부위에 대해서는 ~10%였다(도 11C). 그러나, 이황화-안정화된 gp140으로 면역화될 때, 2wp3은 유사한 수준의 항-V3 항체(<40%)를 나타냈지만, V1V2(30 내지 35%), CD4BS(30 내지 35%) 및 CD4i-부위(≤40%)에 대해서는 상당히 더 높은 수준을 나타냈다(도 11D).

결론적으로, 이황화-안정화된 gp120 및 gp140은 상당히 더 높은 CD4i-부위 지시된 항체를 생성하였고, 이황화-안정화된 gp140은 모든 에피토프에 대해 가장 '균형잡힌' 반응을 유도하였다.

기초-추가 상승 처방 또는 보다 강력한 보조제의 사용은 반응의 폭 또는 전체적인 질의 증가를 보조할 수 있다.

본 발명은 실시예에 의해서만 기술되었고, 그것의 변형이 이루어질 수 있는 한편 본 발명의 범주 및 사상은 유지된다는 것이 인지될 것이다.

참고문헌

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Leu Trp Val Thr Val 20 25 30 Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys 35 40 45 Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala 50 55 60 Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Ile Val Leu 65 70 75 80 Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met Val Glu 85 90 95 Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro 100 105 110 Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu His Cys Thr Asn Leu 115 120 125 Lys Asn Ala Thr Asn Thr Lys Ser Ser Asn Trp Lys Glu Met Asp Arg 130 135 140 Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Lys Val Thr Thr Ser Ile Arg Asn 145 150 155 160 Lys Met Gln Lys Glu Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Val Pro 165 170 175 Ile Asp Asn Asp Asn Thr Ser Tyr Lys Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser 180 185 190 Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile 195 200 205 His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asp Lys 210 215 220 Lys Phe Asn Gly Ser Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys 225 230 235 240 Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly 245 250 255 Ser Leu Ala Glu Glu Gly Val Val Ile Arg Ser Glu Asn Phe Thr Asp 260 265 270 Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Lys Glu Ser Val Glu Ile Asn 275 280 285 Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Ile Gly Pro 290 295 300 Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln 305 310 315 320 Ala His Cys Asn Ile Ser Gly Glu Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln 325 330 335 Ile Val Thr Lys Leu Gln Ala Gln Phe Gly Asn Lys Thr Ile Val Phe 340 345 350 Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Met His Ser Phe Asn 355 360 365 Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser 370 375 380 Thr Trp Asn Asn Thr Ile Gly Pro Asn Asn Thr Asn Gly Thr Ile Thr 385 390 395 400 Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Arg Trp Gln Glu Val Gly 405 410 415 Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Arg Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser 420 425 430 Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Lys Glu Ile Ser 435 440 445 Asn Thr Thr Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn 450 455 460 Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu 465 470 475 480 Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ile Ser Ser Val Val Gln Ser Glu Lys 485 490 495 Ser Ala Val Thr Leu Gly Ala Met Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala 500 505 510 Gly Ser Thr Met Gly Ala Arg Ser Leu Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg 515 520 525 Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala 530 535 540 Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys 545 550 555 560 Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln 565 570 575 Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr 580 585 590 Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Asp Gln Ile 595 600 605 Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Asp Asn Tyr 610 615 620 Thr Asn Leu Ile Tyr Thr Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu 625 630 635 640 Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp 645 650 655 Asn Trp Phe Asp Ile Ser Lys Trp Leu Trp Tyr Ile 660 665 <210> 24 <211> 510 <212> PRT <213> HIV-1 <220> <221> misc_feature <223> HXB2 from Figure 5 <400> 24 Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg 1 5 10 15 Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu 20 25 30 Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu 50 55 60 Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Gly Val Pro Thr Asp Pro Asn 65 70 75 80 Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp 85 90 95 Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 100 105 110 Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser 115 120 125 Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser 130 135 140 Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn 145 150 155 160 Ile Ser Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe 165 170 175 Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Thr 180 185 190 Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val 195 200 205 Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala 210 215 220 Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr 225 230 235 240 Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser 245 250 255 Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile 260 265 270 Arg Ser Val Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu 275 280 285 Asn Thr Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg 290 295 300 Lys Lys Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile 305 310 315 320 Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala 325 330 335 Lys Trp Asn Ala Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gln 340 345 350 Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp 355 360 365 Pro Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr 370 375 380 Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp 385 390 395 400 Ser Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu 405 410 415 Pro Cys Arg Ile Lys Gln Phe Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys 420 425 430 Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn 435 440 445 Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Asn Asn Asn Gly 450 455 460 Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg 465 470 475 480 Ser Glu Leu Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala 485 490 495 Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg 500 505 510 <210> 25 <211> 512 <212> PRT <213> HIV-1 <220> <221> misc_feature <223> Consensus sequence from Figure 5 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(14) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (133)..(133) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (137)..(137) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (141)..(141) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (144)..(148) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (150)..(151) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (160)..(162) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (167)..(167) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (169)..(169) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (175)..(175) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (181)..(182) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (188)..(188) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (192)..(192) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (194)..(195) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (230)..(230) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (232)..(232) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (236)..(236) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (269)..(269) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (275)..(275) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (289)..(290) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (306)..(306) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (308)..(308) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (310)..(311) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (318)..(320) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (322)..(322) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (324)..(324) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (326)..(327) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (336)..(337) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (341)..(341) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (347)..(348) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (351)..(352) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (357)..(357) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (361)..(361) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (374)..(374) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (397)..(397) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (399)..(402) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (404)..(404) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (406)..(406) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (410)..(410) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (412)..(413) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (424)..(424) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (427)..(427) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (441)..(441) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (461)..(464) <223> nonconcensus amino acid <220> <221> misc_feature <222> (466)..(467) <223> nonconcensus amino acid <400> 2 Met Arg Val Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Arg 1 5 10 15 Xaa Gly Thr Xaa Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Xaa Glu 20 25 30 Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu 50 55 60 Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Xaa Val Pro Thr Asp Pro Asn 65 70 75 80 Pro Gln Glu Xaa Val Leu Xaa Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp 85 90 95 Lys Asn Xaa Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 100 105 110 Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Xaa 115 120 125 Leu Xaa Cys Thr Xaa Leu Lys Asn Xaa Thr Asn Thr Xaa Ser Ser Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Thr Ser Ile Arg Xaa Lys Xaa Gln Lys Glu Tyr Ala Xaa Phe 165 170 175 Tyr Lys Leu Asp Xaa Xaa Pro Ile Asp Asn Asp Xaa Thr Ser Tyr Xaa 180 185 190 Leu Xaa Xaa Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val 195 200 205 Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala 210 215 220 Ile Leu Lys Cys Asn Xaa Lys Xaa Phe Asn Gly Xaa Gly Pro Cys Thr 225 230 235 240 Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser 245 250 255 Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Xaa Val Val Ile 260 265 270 Arg Ser Xaa Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu 275 280 285 Xaa Xaa Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg 290 295 300 Lys Xaa Ile Xaa Ile Xaa Xaa Gly Pro Gly Arg Ala Phe Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Gly Xaa Ile Xaa Gly Xaa Xaa Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Xaa 325 330 335 Xaa Lys Trp Asn Xaa Thr Leu Lys Gln Ile Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa 340 345 350 Gln Phe Gly Asn Xaa Lys Thr Ile Xaa Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly 355 360 365 Asp Pro Glu Ile Val Xaa His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe 370 375 380 Tyr Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Xaa Asn Xaa Xaa 385 390 395 400 Xaa Xaa Thr Xaa Gly Xaa Asn Asn Thr Xaa Gly Xaa Xaa Thr Ile Thr 405 410 415 Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Xaa Ile Asn Xaa Trp Gln Glu Val Gly 420 425 430 Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Xaa Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser 435 440 445 Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Asn Xaa Xaa Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn 465 470 475 480 Trp Arg Ser Glu Leu Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly 485 490 495 Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg 500 505 510

Claims

CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프를 동시에 노출하는 형태로 안정화된 HIV gpl20 폴리펩티드 또는 가용성 gpl40 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 폴리펩티드는 내부 도메인의 층들 사이의 층간 접촉에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 폴리펩티드는 층 1과 층 2 사이의 층간 접촉에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 층 2와 층 3 사이의 층간 접촉에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 층간 접촉은 이황화 결합에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 5항에 있어서, 시스테인 잔기 사이에서 형성되는 이황화 결합은 하나 또는 그것보다 많은 쌍의 다음의 아미노산에 동등한 위치에 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드: SEQ ID NO:2의 V59C와 S109C, V95C와 W465C, V95C와 R462C, V95C와 L469C 및/또는 H99C와 R462C.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 표시된 것과 같은 내부 도메인 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:2의 V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469 및/또는 H99와 R462에 동등한 위치에 하나 또는 그것보다 많은 쌍의 비-자연 발생 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 표시된 것과 같은 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:2의 V59와 S109, V95와 W465, V95와 R462, V95와 L469 및/또는 H99와 R462에 동등한 위치에 하나 또는 그것보다 많은 쌍의 비-자연 발생 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드 또는 가용성 gp140 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 W90과 E268, I103과 Q413에 해당하는 위치에 하나 또는 그것보다 많은 비-자연적으로 코드화된 시스테인 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 안정화된 HIV gp120 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 22에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드의 면역원성 단편으로서, 그 면역원성 단편은 HIV gp120의 CD4-결합된 및 CD4-결합 부위 에피토프를 둘 다 포함하고 노출하는 것을 특징으로 하는 면역원성 단편.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩티드 또는 제 11항에 따르는 면역원성 단편 및 추가의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
제 12항에 있어서, 추가의 폴리펩티드는 인플루엔자로부터의 HA 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
세 개의 하위유닛을 포함하는 삼량체 폴리펩티드로서, 각각의 하위유닛은 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩티드, 제 11항에 따르는 면역원성 단편 및 제 12항 또는 제 13항에 따르는 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 삼량체 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩티드, 제 11항에 따르는 면역원성 단편 또는 제 12항 또는 제 13항에 따르는 융합 단백질을 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 15항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21에 표시된 것과 같은 서열에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩티드, 제 11항에 따르는 면역원성 단편, 제 12항 또는 제 13항에 따르는 융합 단백질, 제 14항에 따르는 삼량체 및/또는 제 15항 또는 제 16항에 따르는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물.
제 17항에 있어서, 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, HIV에 의한 감염 및/또는 AIDS를 치료 또는 방지하기 위한 백신으로서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
대상에서 면역 반응을 생성하기 위한 방법으로서, 그 방법은 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩티드, 제 11항에 따르는 면역원성 단편, 제 12항 또는 제 13항에 따르는 융합 단백질, 제 14항에 따르는 삼량체, 제 15항 또는 제 16항에 따르는 폴리뉴클레오티드 또는 제 17항 또는 제 18항에 따르는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
대상의 HIV로의 감염 및/또는 AIDS를 치료 또는 방지하기 위해 사용하기 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩티드, 제 11항에 따르는 면역원성 단편, 제 12항 또는 제 13항에 따르는 융합 단백질, 제 14항에 따르는 삼량체, 제 15항 또는 제 16항에 따르는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제 17항 또는 제 18항에 따르는 면역원성 조성물.
대상에서 HIV로의 감염 및/또는 AIDS를 치료 또는 방지하는 방법으로서, 그 방법은 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩티드, 제 11항에 따르는 면역원성 단편, 제 12항 또는 제 13항에 따르는 융합 단백질, 제 14항에 따르는 삼량체, 제 15항 또는 제 16항에 따르는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제 17항 또는 제 18항에 따르는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21항에 따르는 분리된 폴리펩티드, 면역원성 단편, 융합 단백질, 삼량체, 폴리뉴클레오티드 또는 면역원성 조성물 또는 제 20항 또는 제 22항에 따르는 방법에 있어서, 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드, 면역원성 단편, 융합 단백질, 삼량체, 폴리뉴클레오티드 또는 면역원성 조성물 또는 방법.