KR20150016373A

KR20150016373A - 시미시푸가 추출물의 신규한 약학적 용도

Info

Publication number: KR20150016373A
Application number: KR1020147036537A
Authority: KR
Inventors: 게오르그 부넨
Original assignee: 막스 젤러 죈네 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2012-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2015-02-11
Also published as: US11541093B2; MX366970B; JP2015521991A; EP2874637B1; NZ702155A; EP2874637A1; JP6235579B2; AU2013285492B2; MX2014014782A; US20150125555A1; JP2017061501A; WO2014006104A1; AU2013285492A1

Abstract

본 발명은 시미시푸가 종, 바람직하게는 시미시푸가 라세모사(Cimicifuga racemosa, 액태아 라세모사 L(Actaea racemosa L); 블랙 코호시(black cohosh)라고도 명명함)의 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시미시푸가 종, 바람직하게는 시미시푸가 라세모사의 추출물이 당뇨병, 바람직하게는 제2형 진성 당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리에 사용되는 용도, 이 추출물을 포함하는 약학적 조성물들에 해당하는 약제를 제조하는 이와 같은 추출물들의 용도와, 바람직하게는 추출물 또는 약학적 조성물을 경구 투여하여 당뇨병을 치료적 또는 예방적으로 처리하는 방법을 제공한다.

Description

시미시푸가 추출물의 신규한 약학적 용도{NOVEL PHARMACOLOGICAL USE OF CIMICIFUGA EXTRACT}

본 발명은 시미시푸가 종, 바람직하게는 시미시푸가 라세모사(Cimicifuga racemosa, 액태아 라세모사 L(Actaea racemosa L); 블랙 코호시(black cohosh)라고도 명명함) 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시미시푸가 종, 바람직하게는 시미시푸가 라세모사 추출물이 당뇨병, 바람직하게는 제2형 진성 당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리에 사용되는 용도, 이 추출물을 포함하는 약학적 조성물들에 해당하는 약제를 제조하는 이와 같은 추출물의 용도와, 바람직하게는 추출물 또는 약학적 조성물을 경구 투여하여 당뇨병을 치료적 또는 예방적으로 처리하는 방법을 제공한다.

시미시푸가(Cimicifuga) 추출물, 이의 제조방법과 의학적 용도에 대해서는 공지되어 있다. 예를 들어, WO 99/47149는 심혈관 질환과 갱년기 불안증세를 선택적으로 치료하기 위한 기관선택적 에스트로겐형 약제로 사용되는 시미시푸가 추출물의 용도를 개시한다. US 6,267,994는 고용량의 항에스트로겐 화합물에서 독성이 나타나지 않는 조성물로서, 항종양 치료제로 사용되는 시미시푸가 추출물을 개시한다. WO 01/05415는 에스트로겐형 효과를 갖고 시미시푸가 추출물 또는 유도체 성분을 함유하는 약학적 조성물을 개시한다. 문헌[Phytomedicine, Vol. 19 (2012), p.846 - 853]은 레트(rat)의 체지방 축적을 감소시킬 수 있는 시미시푸가 라세모사의 특정 추출물을 개시한다.

WO 2005/002609 A1은 갱년기와 폐경 후 고통을 치료하는데 유용한, 추출제(extraction agent)와 용액 조절제(solution mediator), 예를 들어 유기 폴리머, 특히 폴리(비닐피롤리돈)을 사용하여 식물 추출물, 특히 시미시푸가 라세모사 추출물을 제조하는 방법을 교시한다.

세이드로바-부드케 등(Seidlova-Wuttke et al., Phytomedicine, 19, 2012, 846-853)은 폐경 후 상황을 모방하여 난소가 적출된(ovx) 레트에서 복부 지방 축적(고지혈증)을 감소시키고 이에 따라 대사 증후군(MB)을 방지하는 시미시푸가 라세모사 추출물의 용도를 개시한다.

키스 등(Kiss et al., J. Med. Food, 13(3) 2010, 599-604)은 Olimpiq StemXCell(Crystal Institute Ltd., Hungary)이라는 식물 추출물의 복합 식이 보충제를 섭취하여 CCl₄-유도 마우스 모델의 간 손상과 알록산-유도 당뇨 실험 레트 모델의 췌장 손상을 재생시키는 것을 교시한다. 이 보충제는 시미시푸가 라세모사와 8개의 추가 식물 성분을 포함한다. 식이 보충제의 섭취는 두 기관 모두에서 더 빠르고 효과적인 재생이 일어나게 하였고, 이것은 췌장에서의 혈당량 감소로 나타났다.

라촌 등(Rachon et al., Maturitas 60, 2008, 209-215)은 난소가 적출된 레트(ovx rat)를 이용한 폐경기 모델에서 내당(glucose tolerance) 시험(복강내 내당 시험, IPGTT), 기준 당(baseline glucose) 및 공복 혈장 인슐린(FPI)에 대한 식이 시미시푸가 라세모사 추출물 CR BNO 1055의 효과를 교시한다. 동일한 추출물과 동일한 폐경기 모델을 이용한 키스 등의 결과와는 반대로, 추출물 BNO 1055은 기준 혈당에 대하여 통계적으로 유의하지 않은 효과가 관찰되었고, 추출물은 에스트라디올(E2) 대조군과 유사하게 공복 혈장 인슐린을 낮추었다. 그리고 BNO 1055 섭취가 아닌 E2 섭취만이 IPGTT에서 글루코오스 AUC를 유의적으로 감소시켰다. 이 추출물은 난소가 적출된 레트에서 당 대사에 영향을 미치지만, 이 효과는 당(glucose)관련 질환을 치료하는데 필요한 만큼 혈당을 낮추지는 않는다.

리우 등(Liu et al., Planta medica 65, 1999, 712-714)은 시미시푸가 다후리카(Cimicifuga dahurica)의 뿌리줄기(rhizome)에서 추출한 이소페루라산(isoferulic acid)을 5 내지 10 mg/kg의 투여량으로 정맥 투여하는 경우, 당뇨병 레트에서 혈장 당 수치를 낮출 것이라고 교시하였다. 그러나, 정상 혈당을 얻을 수 없으므로 그 효과는 매우 약하다.

문헌[The Eur. J. Clin. Pharmacol., Vol. 58 (2002), 235 - 241]은 많은 의학적 징후에서 시미시푸가 라세모사의 임상적 효능의 체계적 문헌고찰을 제공한다.

케린 크레프트(Karin Kraft)의 검토 논문((Phytotherapeutische Optionen bei Diabetes mellitus Typ 2, Zeitschrift fur Phytotherapie 2013; 34: 6-11)에서, 저자는 제2형 진성 당뇨병 환자의 치료에 대한 최근 파이토테라피적 선택(phytothereapeutic option)을 요약하였으나, 시미시푸가 산물은 파이토테라피 제제의 종합 목록에 있지 않다.

본 발명의 근본적 과제는 시미시푸가 식물 생성물의 새로운 의학적 적용을 제공하는 것이다.

시미시푸가 종의 추출물이 당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리에 사용되는데 우수한 유용성을 갖는다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리에 사용되는 시미시푸가 종의 추출물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명을 실시하기 위한 추출물에서, 시미시푸가 종의 식물 물질은 시미시푸가 라세모사(Cimicifuga racemosa)의 식물 물질이다. 그리고 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 추출물은 제2형 진성 당뇨병을 치료하거나 또는 예방하는데 사용되거나, 또는 불충분하게 조절된 인슐린-의존성 제1형 당뇨병의 보조 치료에 사용된다.

보다 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 추출물은 다음의 단계를 포함하는 방법으로 제조된다:

(ⅰ) 시미시푸가 종, 바람직하게는 시미시푸가 라세모사의 식물 물질을 제공하는 단계,

(ⅱ) 추출제로 상기 식물 물질을 처리하는 단계,

(ⅲ) 추출물을 농축하는 단계.

상기 단계 (ⅱ)에 의한 추출물은 용액 조절제, 바람직하게는 추출제 내에서 콜로이드 형태로(colloidally) 분산되거나 용해될 수 있는 유기 폴리머, 보다 바람직하게는 적어도 약 1000 달톤 단위의 평균 분자량을 갖는 유기 폴리머, 가장 바람직하게는 폴리비닐피롤리돈(PVP)의 존재하에서 농축된다.

이 측면의 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명을 실시하기 위한 추출물은 시미시푸가 라세모사로부터 제조되고, 이 추출물은 경구 투여용이다.

제2 측면에서, 본 발명은 당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리를 위한 약제를 제조하기 위한 시미시푸가 종의 추출물의 용도에 관한 것이다. 이러한 용도를 위해 시피시푸가 종은 시미시푸가 라세모사인 것이 바람직하다. 청구된 용도로 치료하기 위한 질환은 제2형 진성 당뇨병 또는 불충분하게 조절된 인슐린-의존성 제1형 당뇨병인 것이 또한 바람직하고, 여기에서 본 발명의 추출물은 보조 치료로서 사용된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 이 측면은 용도에 관한 것이고, 여기에서 추출물은 시미시푸가 라세모사로부터 제조되고 추출물은 경구 투여용이다.

제3 측면에서, 본 발명은 당뇨병, 바람직하게는 진성 당뇨병 제2형 당뇨병 또는 불충분하게 조절된 인슐린-의존성 제1형 당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리를 위하여 본 발명에 따른 추출물과 선택적으로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함하고, 여기에서 본 발명의 추출물은 보조 치료용으로 사용된다. 본 발명의 약학적 조성물은 시미시푸가 종이 시미시푸가 라세모사이고 추출물이 경구 투여용인 것이 바람직하다.

제4 측면에서, 본 발명은 당뇨병, 바람직하게는 제2형 진성 당뇨병을 치료적 또는 예방적 처리하는 방법, 또는 불충분하게 조절된 인슐린-의존 제1형 당뇨병을 보조 치료하는 방법에 관한 것이며, 약학적 유효량으로 본 발명의 추출물 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 정맥, 복강내 또는 경구 투여되고, 바람직하게는 경구 투여된다.

이하에서, 실질적인 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 더 자세히 설명할 것이지만, 첨부된 청구항을 넘어서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
특별히 언급하지 않는 한 다음의 실시예들과 도면들의 퍼센트와 중량부(parts)는 중량에 기초한다.
도 1a는 배지 대조군(medium control)과 메트포민(metformin)에 대해 1, 10 및 100 ㎍/ml의 투여량에서 실시예 1의 추출물에 의한 AMPK의 투여량 의존성 활성을 나타내는 도면이다.
도 1b는 1일부터 7일에 걸쳐 체중(g)의 전체 변화를 설명하는 도면이다: 평균은 기준선(1일)에서 처리 그룹들 사이의 차이를 조정한 것이다. 평균의 표준 오차(standard errors of the mean; SEM)는 통계 모형의 잔차(residual)로부터 계산된다. 적절한 비히클(vehicle)에 대한 다중 비교는 Ze 450 PO에 대한 윌리암스의 테스트, 메트포민과 Ze 450 IP에 대한 다중 t 테스트이다.
도 2a 및 2b는 처리 6일 후의 누적된 체중의 증가를 나타내는 그래프이다. 도 2a는 Ze 450 경구(PO)와 복강내(IP) 투여 대 비히클의 경구 투여(대조군)의 체중 증가를 나타낸다. 도 2b는 메트포민의 경구 투여와 Ze 450의 IP 투여 대 각각의 대조군들을 나타낸다(유의차 vs. 각각의 대조군들: ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001).
도 3은 평균 1일 음식물 섭취량(g/day)을 나타내는 막대 그래프이다(유의차 vs. 각각의 비히클들: ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001).
도 4는 평균 1일 물 섭취량(g/day)을 나타내는 막대 그래프이다.
도 5a 및 5b는 경구 당 내성 검사(oral glucose tolerance test; OGTT) 동안 당 농도(mmol/L)를 나타내는 그래프이다. 도 5a는 Ze 450의 경구 투여 효과를 나타내고, 도 5b는 메트포민과 Ze 450의 IP 투여의 효과를 나타낸다(유의차 vs. 각각의 비히클들: ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001).
도 6a 및 6b는 경구 당 내성 검사(OGTT) 동안 인슐린 농도(ng/ml)를 나타내는 그래프이다. 도 6a는 Ze 450의 경구 투여 효과를 나타내고, 도 6b는 메트포민과 Ze 450의 IP 투여의 효과를 나타낸다(유의차 vs. 각각의 비히클들: ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001).

본 발명의 모든 측면과 관련된 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명을 실시하기 위한 추출물은 시미시푸가 라세모사의 식물 물질로부터 얻어진다. 이 후, 본 발명은 이 종과 관련하여 상세하게 설명할 것이나, 본 발명이 특정 시미시푸가 종으로 제한되지 않는다. 식물의 다양한 부분, 예를 들어 잎, 뿌리, 줄기, 가지, 또는 씨에서 얻어지고/얻어지거나 상이한 추출 방법과 추출 용매에 의해 얻어진 시미시푸가 라세모사의 추출물이 본 발명에 적합하지만, 바람직한 추출물은 뿌리 물질에서 얻어진 것이다. 또 다른 바람직한 추출물은 상기 언급된 EP 1 644 015에 개시된 방법을 통하여 제조된 것이다. 다른 방법에 의해 제조된 시미시푸가 라세모사의 추출물들도 본 발명에 적합하다.

일반적으로, 시미시푸가 라세모사 추출물을 바람직하게 제조하는 방법들은 원(raw) 추출물 또는 1차(primary) 추출물을 얻기 위해, 식물 물질을 수성 알카놀 추출제로 처리하는 것을 기초로 하고, 추출제와 추출제에 용해되는 식물 성분을 포함하는 1차 추출물을 얻기 위해, 그 이후에 미세 입자의 제거를 위한 처리, 예를 들어 침전 처리 또는 여과 처리를 선택적으로 한다.

전형적으로, 1차 추출물은 보다 휘발성인 성분, 예를 들어 알카놀 기에 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알카놀 성분을 제거하기 위해 추출제를 부분적으로 증발시켜 농축시킨 다음, 얼마의 물을 첨가하고, 일반적으로 5 내지 50 부피%의 잔류 용매, 즉 물을 포함하는 소위 농축 추출물을 형성한다. 용매를 추가로 제거한 후에, 식물 물질의 추출에 사용된 용매가 실질적으로 없는 고체, 페이스트 또는 액체 물질이 얻어진다. 다음으로 이 산물은 최종 의약품에 필요한 어떠한 보조제, 첨가제, 코팅 성분 등을 임의로 첨가하여, 특정 적용 형태, 예를 들어 알약(pill), 로션, 용액, 파우더 등으로 사용되거나 이들을 제조하기 위해 처리될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 목적에 적합한 시미시푸가 라세모사 추출물은 액테인(acteine), 23-이피아이-26-데옥시액테인(23-epi-26-deoxyactein), 27-데옥시액틴(27-deoxyactin), 시미라세모사이드 C(cimiracemoside C)를 포함할 수 있다. 액테인은 16,23:23,26:24,25-트리에폭시 곁사슬을 갖는 아세틸 액테올(acetyl acteol)의 자일로사이드(xyloside)이다. 27-데옥시액테인은 상기 언급한 화합물을 정량적으로 측정하기 위한 기준으로 사용된다. 추가의 공지된 유효 성분 그룹은 방향족 산, 예를 들어 페룰산(ferulic acid), 헤스페라틴산(hesperatinic acid) 및 아실 카페인산(acyl caffeinic acid)이다. 또한, 다음의 하이드록시 신남산(cinnamic acid)의 에스테르들은 시미시푸가 라세모사의 수성 에탄올 추출물에서 분리되었다: 푸시놀산(fucinolic acid) 및 시미시푸가산(cimicifugaic acid) A, B, E 및 F. 플라보노이드(flavonoides), 바이오카인 A(biochanine A), 포르모노네틴(formononetine) 및 캄포롤(camphorol)도 알려졌다. 다른 성분들은 탄닌(tannin), 레진(resin) 및 지방산(올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 팔미틴산(palmitinic acid))이다. 시미시푸가 라세모사 중 페룰산의 함량이 상당히 낮은 것으로 알려져 있다.

이러한 다수의 성분을 갖는 경우, 추출 조건은 최종 추출물의 조성에 실질적인 영향을 미치는 경향이 있고, 부분적 구성(proportional makeup)의 의도하지 않은 변화는 바람직하지 않다.

추출제에 용해되거나 용해되지 않는 다양한 첨가제들이 제시되었으며, 추출물의 제조시 농축 단계를 개선시기기 위해 사용되었다. 추출물을 농축할 때, 다양한 첨가제들, 예를 들어 유기산 또는 젤라틴은 의도치 않은 침전을 방지하기 위해 사용될 수 있지만, 바람직한 첨가제는 본 명세서에서 용어 "용액 조절제(solution mediator)"로 사용되었고, 상기 언급된 EP 1 644 015에서 설명된 바와 같이 폴리비닐피롤리돈이다.

추출 용매를 증발시켜 얻어진 추출물은 필수 건조 산물을 얻기 위해 임의의 잔류 추출제를 실질적으로 제거하기 위한 추가 처리, 예를 들어 스프레이 드라잉(spray drying)을 받을 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서 PVP가 대부분의 국가에서의 약학적 용도에 대한 현행 식품 규제 및 약물 규제 하에서 허용되기 때문에 PVP의 첨가는 의학적 치료에 또는 약제 성분으로 추출물을 사용하는 것을 손상시키지 않는다.

용액 조절제로서의 PVP의 유효량은 일반적으로 최종 추출물의 중량에 대하여 약 5 중량% 내지 약 50 중량%의 범위이다. 다양한 목적을 위해서는 약 15 중량% 내지 약 35 중량%가 바람직하다.

추출제는 극성 기질, 예를 들어 물 및/또는 일반적 액상 알카놀, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올이 바람직하다. 이러한 C₁ _-4 알콜들의 상호 및/또는 물과의 혼합물이 보다 바람직하다. 약 40 내지 약 80 중량%의 이러한 알카놀과의 혼합물, 바람직하게는 약 60 내지 약 20 중량%의 물과 에탄올의 혼합물이 특히 바람직하다.

추출 공정은 종래 장치에서 수행될 수 있다. 임의의 경우, 용액 조절제는 임의의 추출제의 임의의 상당한 제거 전에 첨가된다. 이러한 제거 또는 농축은 공지된 방식, 예를 들어 높은 온도에서의 증류에 의한 방식 및/또는 추출물의 성분에 영향을 주는 조건들을 피하기 위해 처리하는 압력을 감소시키는 방식에 영향을 받을 수 있다. 농축은 일정하게 또는 다양한 온도 및/또는 압력에 영향을 받을 수 있다.

추출물을 제조하는 바람직한 방식은 건조 식물 물질을 약 50 내지 60 부피%의 에탄올과 약 50 내지 40 부피%의 물을 함유하는 에탄올-물 혼합물로 추출하는 것이다. 농축시 알카놀 성분과 임의의 공비 혼합물의 물은 고체 농도가 약 25 내지 50 중량%에 도달할 때까지 제거된다. 그 다음, 얻어진 농축된 추출물은 임의의 종래 방식, 예를 들어 스프레이-드라잉을 통해 진행되어 건조 산물을 형성한다. 이러한 최종 농축 단계, 예를 들어 스프레이-드라잉 동안 용액 조절제 PVP는 스프레이-드라잉 보조제로서 추가적으로 작용한다. 일반적으로, PVP는 추출물의 균질 농도(homogeneous consistence)가 농축 공정의 모든 단계에서 유지되게 하는 효과를 갖는다.

본 발명에 따른 추출물, 약학적 조성물, 즉 약제는 결국 약학적 활성이 필요하지 않은 약제의 종래 성분과 공지된 성분을 갖거나 또는 갖지 않고 투여에 적절한 양으로 시미시푸가 종, 바람직하게는 시미시푸가 라세모사의 추출물을 일반적으로 포함한다. 다른 한편으로는, 본 발명에 따른 추출물 또는 약학적 조성물은 신규한 추출물, 예를 들어 액체 또는 고체 형태이고 희석제를 포함하거나 포함하지 않는 추출물을 실질적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 치료-예를 들어 의학적 치료 또는 약제의 제조-에 사용되는 시미시푸가 라세모사 추출물은 제2형 진성 당뇨병을 치료하거나 예방하고 불충분하게 조절된 제1형 당뇨병용 보조 치료제로서 기능하기 위한 임상적 목적을 가질 수 있다.

약제의 모든 적용 타입이 본 발명에 적절할 것으로 생각되지만, 다양한 목적을 위해서는 경구 투여가 바람직하고, 추출물은 이와 같이 또는 고체 및/또는 액체 보조제를 갖는 희석액 중에 사용될 수 있고/있거나 첨가제 또는 보조제 및/또는 기타 약학적 유효 성분을 포함할 수 있다. 약학적으로 적절한 조성물의 제조는 일반적이고 자세한 설명을 필요로 하지 않는다.

바람직한 투여량은 필요한 치료 강도 코스에 따르며, 1일 당 약 1 내지 약 1000 mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 200 mg/day, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 100 mg/day, 가장 바람직하게는 약 2 내지 50 mg/day의 추출물 범위이다.

일반적으로, 명세서에서 추가 설명이 없는 한 본 명세서에서 사용된 용어 "추출물(extract)"은 추출제를 제외하고 물리적 형태(즉, 점성체(viscous), 페이스트 또는 고체)에 상관없는 임의의 형태의 추출 산물을 가리킨다.

본 명세서에서 사용된 용어 "당뇨병(diabetes)"은 제1형(즉, 인슐린-의존성) 또는 제2형(인슐린-비-의존성) 진성 당뇨병을 포함한다.

용어 "폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)"은 음식 또는 약물 첨가제로서 투여되는 임의의 PVP 산물을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 숫자 표시와 "약"과 같은 수식어에 의한 선행사는 ± 50%, 바람직하게는 ± 20%의 오차를 포함할 의도이다.

AMP는 아데노신 모노포스페이트-활성 단백질을 나타낸다. AMP-활성화 단백질 키나아제(AMP-activated protein kinase; AMPK)는 세포 에너지 항상성과 관련된 중요한 공지된 효소(cf. PMID 10409121)이다.

실시예 1 - 추출물 제조

시미시푸가 라세모사의 건조 뿌리 물질(뿌리줄기)을 파우더가 되도록 분쇄 처리하였고, 다른 채취물들(harvest)의 물질 전하가 균일하도록 혼합하였다.

추출제는 에탄올(96 부피%)의 1'330 중량부와 탈이온수 1'170 중량부를 혼합하여 제조하였다. 추출은 시미시푸가 라세모사 500 중량부 당 추출제 2'500 중량부의 비율로 수행하였다.

상온(ambient temperature)의 물과 에탄올을 기계적 교반기와 용기의 바닥에 배출부를 구비한 용기에서 혼합하였다. 시미시푸가 라세모사 파우더는 교반하면서 첨가하였고, 교반은 300분 동안 지속되었다. 그 다음, 교반기를 멈추었고 고체들을 보통 약 180분 동안 정치시켰고(settle), 임의의 경우에는 침전물 위에 투명한 상청액이 형성될 때까지 지속하였다.

투명한 상청액은 펌프로 제거하였고 별도의 용기에 수집하였다. 침전물을 압력 여과기에 투입하여 상청액과 결합된 추가 추출액을 회수하였고, 결과 혼합물을 교반기와 계량기를 구비한 혼합 용기에 여과기를 통하여 투입하였다. 그 다음, 폴리비닐피롤리돈(PVP; Plasdone® KW 29-32)은 추출액 100 중량부 당 33 중량부의 양으로 첨가되었고 PVP가 용해되고 투명한 갈색 액체가 제1 산물로 얻어질 때까지 교반을 지속하였다.

이 산물은 표준형 이단계 농축기 식물 타입 KV 102 EX(standard-type two-stage concentrator plant type KV 102 EX (Unipektin AG, Eschenz, Switzerland))에 투입되었고, 이 안에서 PVP를 포함하는 추출액은 추출제를 증발시켜 농축되어 적어도 약 9% 고형분 농도를 갖는 어두운 갈색 농축물을 산출하였고, 그 후 추가로 농축하여 약 18 내지 26%의 고형분 함량을 갖는 스피섬(spissum) 추출물을 형성하였다. 이 농축물은 종래 스프레이-건조기에 투입되어 약 5 중량% 이하의 습기(humidity) 함량을 갖는 파우더 형태의 건조 추출물을 제조하였다.

농축된 액체 추출물("스피섬")과 건조 분말 추출물 모두는 필요에 의해 표준화될 수 있고, 예를 들어 최종 중량이 약 100 내지 200 mg을 갖는 정제를 제조하기 위하여 5 내지 50 mg 추출물과 일반적인 고체 희석제, 첨가제, 및 보조제를 포함하는 정제를 제조함으로써, 본 발명에 따른 진성 당뇨병 제1형 또는 제2형을 예방하거나 치료하기 위한 약제로 또는 약제에 사용될 수 있다.

실시예 2 - 추출물 분석

실시예 1의 건조 추출물은 특유의 냄새를 갖는 미세한 연한 갈색 분말이였다. 이것은 다양한 트리테르펜 사포닌과 다양한 트리테르펜 글리코시드와 유기산들을 함유한다.

실시예 1에 따라 제조된 세개의 배치(batch)의 분석 결과는 추출물이 시미시푸가 라세모사의 추출물의 표준화에 종래 사용되는 기질인 27-데옥시액테인을 함유한다는 것을 나타낸다.

실시예 3 - 추출물 AMPK -활성

실시예 1 추출물의 AMP 키나아제 활성에 대한 영향은 HepG2 세포에서 관찰되었다. 세포 배지는 음성 대조군으로 사용되었고, 세포 배지 내의 2mM 용액으로서의 메트포민은 양성 대조군으로 사용된 반면에, 테스트 샘플은 세포 배지 ml 당 실시예 1의 산물 1, 10 및 100 ㎍을 포함하였다(1 ㎍/ml). 결과는 아래의 도 1에 나타내었고, 여기서 세로좌표는 단백질 mg 당 활성화된 AMPK의 단위를 나타낸다. 가로좌표의 검은 막대는 순배지(1), 공지된 당뇨병 약물인 메트포민(2)의 활성 값과, 1 ㎍(3), 10 ㎍(4) 및 100 ㎍(5)에서 얻어진 활성 값을 각각 나타낸다.

도 1a에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 추출물은 진성 당뇨병의 두 형태(비-인슐린-의존성(제2형) 진성 당뇨병과 인슐린-의존성(제1형) 진성 당뇨병) 모두에 대해 항-당뇨 활성을 갖는 개선된 대사 조절을 나타내는 투여량-의존성 AMPK 활성화 효과를 일으키며(Nat Rev Drug Discov 3 (2004), 340 - 351 and Physiol Rev 89 (2009) 1025 - 1078, 참조), 이것은 두 형태의 당뇨병들이 내당성의 교란과 높은 혈당 수준을 초래하기 때문이다.

시미시푸가 라세모사 추출물을 포함하거나 또는 상기 추출물로 구성된 본 발명에 따른 약학적 조성물은 세포성 당 섭취를 개선시키고 인슐린 수용체 감도를 향상시켜 인간 환자의 혈당 항상성을 향상시키는 의학적 유용성을 갖으며, 체중 감소를 일으킨다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 교란된 내당성을 갖는 인간 환자의 혈당을 향상시키고, 확실한 진성 당뇨병으로 변하는 것을 예방하거나 지연시킨다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 불충분하게 조절된 혈당 및/또는 2차 인슐린 수용체 내성의 지표를 갖는, 인슐린-의존성 제1형 당뇨병을 앓는 인간 환자의 당뇨 증상을 치료하는데 효과적이다.

실시예 4 - 수컷 ob / ob 마우스에서의 당 조절과 체중에 따른 추출물의 생체내( in vivo ) 활성

실시예 1에 따라 제조되고 Ze 450으로 표시된 시미시푸가 라세모사 추출물의 7일 경구 투여가 체중, 1일 음식 및 물 섭취량뿐 아니라 당 조절에 미치는 영향을 수컷 ob/ob 마우스에서 다음과 같이 관찰했다. ob/ob 마우스는 포유류, 특히 인간의 비만과 당뇨병의 특성화되고 대표적인 생체내 모델이고, 여기에서 두 질병은 렙틴을 인코딩하는 ob 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. 이 연구에서 메트포민은 양성 대조군이다.

테스트 화합물 Ze 450은 1.25의 염분 요인(salt factor)을 사용하여 투여 비히클(dosig vehicle)(PEG 300) 내에 제형화되었다. 연구 시작시 제형화하였고, 분취하여 프리지(fidge)에 저장하였다. 메트포민은 1.25의 염분 요인을 이용하여 탈이온수에 제형화하였다. 메트포민은 투여 직전에 매일 새로 제조하였다. 약물들은 3 ml/kg의 적절한 투여 부피로 투여되었다. 메트포민과 D-글루코오스는 RenaSci Ltd.에서 제공되었다. 약물 투여는 유리 염기(free base)와 관련된다.

68마리의 수컷 ob/ob 마우스(대략 7/8주령; 4마리의 여유분(four spares); 프랑스 잔비에(Janvier)에서 입수)는 표준 식단(Harlan Teklad Global 2018 diet)에 자유롭게 접근할 수 있고 수돗물이 무제한 공급되는(ad libitum) 단독 거처에 있었다. 모든 마우스들은 역 주기(reverse phase) 16 시간은 명 상태/ 8 시간은 암 상태의 명암 사이클(대략 17:30-09:30 h 조명 비춤)에서 24±2℃와 55±20%의 습도가 유지되었다.

동물들을 1주차 동안 시설에 적응시켰다. 2주차 동안 기준 프로토콜을 수립하였고, 여기서 동물들은 비히클을 경구(n=50) 투여하거나 또는 하루에 한번(-6일 내지 0일) 복강내(n=18) 투여하였다. 기준 투여 전에, 동물들은 체중에 따라 통계학자에 의해 두 그룹(n=50 및 n=18)으로 나뉘었다. 동물들의 약 절반은 암 상태 전에 투여하기 위해 매일 08:45에 투여를 시작하였고, 나머지 절반은 암 상태 후(09:30)에 투여하였다. 체중, 음식 및 물 섭취량을 매일 기록하였다. 기준 주기(phase) 동안 동물들의 측면 꼬리 정맥(lateral tail vein)(30 ㎕)으로부터 혈액 샘플링을 수행하였고, 샘플을 리튬 헤파린-코팅 튜브(sarstedt CB300LH)로 넣었으며, 즉 샘플은 자유롭게 섭식하는 동물로부터 얻어진다. 혈액 샘플링은 16:00에 시작하였다. 모든 혈액 샘플들을 수집 즉시 원심분리하였고, 혈장 분획(plasma fraction)은 상업적으로 이용가능한 키트와 시약(Thermo Scientific Infinity glucose reagent TR15498, Alpco mouse ultrasensitive insulin kit 80 INSMSU-E10)을 이용하여 이어지는 혈당(2회 복제)과 인슐린(1회 복제)의 측정 전에 냉동 보관(-80℃)하였다. 그 다음 기준 처리를 지속하였다. 기준 주기의 마지막쯤 동물들을 체중, 기준 음식과 물 섭취량뿐 아니라 혈당과 인슐린에 따라 8개의 처리 그룹으로 나누었다.

체중, 음식 및 물 섭취량을 투여 6일 전부터 투여 시작 6일 후까지 매일 측정하였다. 동물들을 7일의 경구 당 내성 테스트(OGTT)를 위해 6일째에 밤새도록 금식시켰다. 또한, 동물들을 -4일과 6일째에 자유롭게 사료(bleeds)를 먹였다. 기준 주기 동안, A와 B 그룹의 동물들에게 물을 PO(경구) 투여하였다. 5% 트윈(Tween) 80, 5% PEG 400, 90% 식염수로 전환하는 경우, 0일까지 PEG 300(PO)을 C 내지 F 그룹의 동물들에게 투여하였다. 2, 4, 9, 11 및 13 동물들(G와 H 그룹)은 -6일째에 PEG300을 복강내(IP) 투여에 부정적으로 반응하여서, 이 그룹의 다른 동물들은 이 날 식염수를 IP 투여하였다. -5일부터 0일에, G와 H 그룹의 동물들은 5% 트윈 80, 5% PEG400, 90% 식염수를 IP 투여하였다. 마우스에게 비히클 또는 아래 표 1의 테스트 약물을 7일 동안 하루에 1회 경구 또는 복강내 투여하였다(첫 번째 투여시 대략 8/9 주령).

그룹	처리
A	비히클 (물 PO 3ml/kg)
B	메트포민 (물에서 200 mg/kg PO)
C	비히클 (PEG 300 PO 3 ml/kg)
D	Ze 450 (PEG300에서10 mg/kg PO)
E	Ze 450 (PEG300에서30 mg/kg PO)
F	Ze 450 (PEG300에서90 mg/kg PO)
G	비히클 (5% 트윈 80, 5% PEG400, 90% 식염수에서 PEG 300 IP 3 ml/kg)
H	Ze 450 (5% 트윈 80, 5% PEG400, 90% 식염수에서 30 mg/kg IP)

모든 처리는 튜브(gavage)를 통해 경구로 또는 복강내로 하루에 1회 투여되었다. 처리 기간 동안 음식 섭취량, 물 섭취량 및 체중은 투여 세션에 매일 기록되었다. 투여 후, 동물들을 검사하였고, 임의의 명시적 행동을 기록하였다. 투여는 모든 그룹에 대해 매일 8:45에 시작하였다. 6일 오후에 기준 주기에서 이미 설명한 바와 같이 혈액 샘플을 수집하였다. 16:00에 섭식 상태에서 동물들의 혈액 샘플링을 수행하였다. 리튬 헤파린-코팅 튜브(Sarstedt Microvette CB300 LH)로 30 ㎕ 혈액을 채취하였다. 각 샘플을 즉시 원심분리하고, 혈장을 분배 튜브(aliquot tube)에 나누었다. 모든 혈장 샘플들은 -80℃에서 냉동시켰고, 이후에 상업적으로 이용가능한 키트와 시약을 이용하여 글루코오스(2회 복제)와 인슐린(1회 복제) 함량을 분석하였다. 이후, 각 동물들의 음식을 제거하였다.

다음날 아침(7일) 마우스에 대해 OGTT를 수행하였다. 각 동물에게 비히클 또는 테스트 화합물을 투여하였고, 적당한 간격(예를 들어, 60분) 후에 동물에게 D-글루코오스를 투여하였다(2 g/kg PO). 기준 혈액 샘플들은 화합물 투여 직전(시간 = -15분) 및 당 부하(glucose load) 바로 직전(시간 = 0분)에 채취하였다. 추가 혈액 샘플들은 당 투여 15분, 30분, 45분 및 60분 후에 채취하였다. 모든 혈액 샘플들(30 ㎕)은 꼬리 정맥(tail vein)에서 채취하였다. 혈액 샘플들을 리튬 헤파린처리된 튜브(Sarstedt Microvette CB300 LH)에 넣고 원심분리기에 의해 혈장을 분리하였다. 모든 혈장 샘플들은 -80℃에서 냉동하였고, 이후에 상업적으로 이용가능한 키트와 시약을 이용하여 글루코오스(2회 복제)와 인슐린(1회 복제) 함량을 분석하였다.

OGTT의 마지막에(즉, 최종 투여 2시간 후), B, D, E, F 및 H 그룹의 모든 동물들을 스케쥴 1의 방법으로 죽이고, 마지막 혈액 샘플들을 심장천자(cardiac puncture)를 통해 채취하였다. 각각의 마지막 혈액 샘플들(0.6 ml)은 리튬 헤파린 수집 튜브(예를 들어, Sarstedt multivette® 600LH)에 넣는다. 혈액 샘플들을 원심분리하고, 혈장 일부(대략 250 ㎕)는 표시된 수집 유리병으로 이동시켰다. 혈장은 분석할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다. 모든 다른 동물들도 사망시켰다.

체중, 음식 섭취량 및 물 섭취량은 평균값 ± SEM으로 나타내었다. 체중, 증가 체중, 1일 및 평균 음식 및 물 섭취량 데이터와 누적 음식 섭취량은 공변량(covariate)을 기준으로 ANCOVA에 의해 분석한 후, 적절하게 비교(양쪽 꼬리(two-tailed))하여 적절한 대조군과의 유의적인 차이를 결정하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 생각된다. 기준은 기준 주기(baseline period) 후에 체중 또는 평균 음식 또는 물 소모량에 대한 1일 값의 세트이다.

인자와 출혈 순서(bleeding order)로서의 처리와 공변량으로서의 기준 체중과 혈당과 인슐린을 처리하여 로버스트 회귀분석(robust regression)에 의해 혈당과 인슐린 데이터를 분석한 후, 적절하게 비교(양쪽 꼬리)하여 적절한 대조군과의 유의적인 차이를 결정하였다. 적절하다면, 로그 변형을 사용하였다.

AUC 0 내지 60은 사디리꼴 공식으로 계산하였고(총 AUC와 기준으로부터의 AUC를 계산함), 동일한 방법론에 의해 분석하였다.

동물들은 모든 처리를 잘 견뎠다. 체중은 기준 주기 동안 처리 그룹들 사이에 통계적인 차이가 없었다. 처리 6일 후에, 메트포민은 전체 체중에 아무런 유의적 효과를 미치지 않았다(도 1b). 경구 대조군과 비교하면, Ze 450은 유의적이고 투여량 의존적인 체중의 감소를 일으켰다(-1.99 내지 -2.61g). 30 mg/kg Ze 450의 IP 투여는 체중의 가장 심한 감소를 나타내었다(-4.49g; p<0.001).

처리 6일 이후에 누적된 체중은 경구로 투여된 Ze 450의 유의적이고 투여량 의존적 감소를 나타낸다(도 2a 참조). 이 감소는 2개의 더 많은 PO 투여량(예를 들어, 30 mg/kg 및 90 mg/kg Ze 450)에 대해 유의적이다. Ze 450을 IP 주입한 처리 그룹에서 가장 큰 감소가 관찰되었다. 메트포민에 대해서는 대조군과 비교하여 사실상 감소되지 않았다(도 2b 참조).

음식 섭취량의 유의적인 감소와 체중의 감소가 동시에 일어났다(도 3 참조).

음식 섭취량의 가장 큰 감소는 30 mg/kg/day Ze 450을 IP 주입받은 그룹에서 관찰되었다. 이것은 PO 그룹에서 관찰된 음식 섭취량의 감소가 상부 위장관(upper GI tract)의 국부적 염증과 음식을 부정적으로 회피하는 것에 의하지 않는다는 것을 나타낸다.

항당뇨 작용에 대한 매우 민감한 마커 효과는 물 섭취량의 감소이다. 메트포민은 주간 평균 물 섭취량의 유의적인(p = 0.002) 감소를 나타낸다. PO 투여에 대한 Ze 450의 가장 많은 두개의 투여량(1일 30 mg/kg 과 90 mg/kg)에서 물 섭취량의 비교되는 감소가 관찰되었다(p = 0.022). 30 mg/kg/day Ze 450의 IP 투여 후에 가장 큰 감소가 관찰되었다.

OGTT 동안 당의 경구 볼루스(bolus)에 대한 당과 인슐린에 미치는 효과는 도 5 및 도 6에 나타냈다. Ze 450 PO 처리는 중간(10 mg/kg) 및 고(30 mg/kg) 투여량 그룹에서 OGTT의 처음 30분 동안 당 농도의 증가를 유의적으로 감소시켰다. 대조군(비히클)와 비교하여, 글루코오스 농도/시간 곡선 그래프는 연장되었고, 이것은 모든 경구 Ze 450 처리에 대해 60분에서 통계적으로 유의하다(p < 0.05)(도 5a). 이것은 또한 IP Ze 450 처리에 대한 분명한 증거이고, 여기서 평균 당 농도는 OGTT를 시작한 후에 15 내지 60분까지 실제로 변하지 않는다. 당에 대한 메트포민 효과는 Ze 450의 IP 투여에 대한 효과와 유사하다(도 5b).

인슐린 농도에 대한 처리의 효과는 도 6a와 6b에 나타내었다. Ze 450의 각각의 경구 투여는 비히클 대조군과 비교하여 당 농도를 유의적으로 감소시켰다. 감소는 투여량 의존적이지만, 투여량에 비례하지는 않는다. 30 mg/kg Ze 450의 투여는 90 mg/kg까지 투여량을 증가시켜도 유의적으로 추가로 증가되지 않는 거의 최대 효과를 나타낸다. 유사한 효과가 메트포민과 Ze 450 IP 투여에서도 나타났다.

ob/ob 마우스들에서의 상기 기술한 실험 효과들은 다음과 같이 요약한다. Ze 450은 메트포민과 질적으로 유사한 항당뇨 효과를 갖는다:

● 경구 투여된 Ze 450은 유의적이고 투여량 의존적인 체중의 감소를 일으킨다.

● 상기 감소는 유의적이고 투여량 의존적인 음식 섭취량의 감소와 동시에 일어난다. 두 효과(체중 증가의 감소와 음식 섭취량의 감소)는 Ze 450의 IP 투여에 의해 추가로 개선되고, 이것은 a) 유효 성분이 감소된 경구 생물학적 이용도를 갖는 것과 b) 음식 섭취량의 감소가 상부 위장관 내의 국부 자극과 이후 음식 기피보다 내분비계 또는 중추계의 영향의 결과라는 것을 나타낸다.

● Ze 450은 투여량 의존적인 방식으로 물의 섭취량을 유의적으로 감소시키고, 이것은 경구 항당뇨 약물의 대표적 영향과 일치한다.

● Ze 450은 OGTT에서 당의 경구 볼루스 후에 당-정상화 영향을 나타낸다: 최고 농도는 유의적으로 낮아지고, 당 농도/시간 그래프는 연장된다.

● Ze 450은 OGTT 동안 당 볼루스에 대해 인슐린을 유의적으로 감소시킨다.

● Ze 450은 OGTT 동안 당과 인슐린 반응의 조절을 유도하고, 이것은 당 대사, 항상성의 유의적인 개선과 인슐린에 대해 개선된 민감도를 나타낸다.

따라서, 생체내 당뇨병의 정립되고 대표적인 동물 모델에서, 추출물 Ze 450으로 나타낸 시미시푸가 종의 추출물이 포유류에서 유의적인 항당뇨 효과를 갖는 것이 증명되었다.

Claims

당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리에 사용되는 시미시푸가 종 추출물.
제1항에 있어서,
상기 시미시푸가 종은 시미시푸가 라세모사인, 시미시푸가 종 추출물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 당뇨병은 제2형 진성 당뇨병인, 시미시푸가 종 추출물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출물은,
(ⅰ) 시미시푸가 종, 바람직하게는 시미시푸가 라세모사의 식물 물질을 제공받는 단계,
(ⅱ) 추출제로 상기 식물 물질을 처리하는 단계, 및
(ⅲ) 추출물을 농축하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 시미시푸가 종 추출물.
제4항에 있어서,
상기 단계 (ⅱ)에 의한 추출물은 용액 조절제, 바람직하게는 추출제 내에서 콜로이드 모양으로 분산되거나 용해될 수 있는 유기 폴리머, 적어도 약 1000 달톤 단위의 평균 분자량을 갖는 유기 폴리머, 가장 바람직하게는 폴리비닐피롤리돈(PVP)의 존재하에서 농축되는, 시미시푸가 종 추출물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시미시푸가 종은 시미시푸가 라세모사이고, 상기 추출물은 경구 투여용인, 시미시푸가 종 추출물.
당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리를 위한 약제를 제조하기 위한 시미시푸가 종 추출물의 용도.
제7항에 있어서,
상기 시미시푸가 종은 시미시푸가 라세모사인, 시미시푸가 종 추출물의 용도.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 당뇨병은 제2형 진성 당뇨병인, 시미시푸가 종 추출물의 용도.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시미시푸가 종은 시미시푸가 라세모사이고, 상기 추출물은 경구 투여용인, 시미시푸가 종 추출물의 용도.
당뇨병, 바람직하게는 제2형 진성 당뇨병의 치료적 또는 예방적 처리를 위하여 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 추출물과 선택적으로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 시미시푸가 종은 시미시푸가 라세모사이고, 상기 추출물은 경구 투여용인, 약학적 조성물.
당뇨병, 바람직하게는 제2형 진성 당뇨병을 치료적 또는 예방적 처리하거나, 또는 불충분하게 조절된 제1형 당뇨병을 보조 치료하는 방법으로서,
제1항 내지 제6항에 따른 추출물 또는 제9항 또는 제10항의 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 포함하는, 당뇨병을 보조 치료하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 조성물은 정맥, 복강내 또는 경구 투여되고, 바람직하게는 경구 투여되는, 당뇨병을 보조 치료하는 방법.