KR20150013232A

KR20150013232A - 골형성 및 헤지호그 신호전달을 유도하고 지방생성을 억제하는 옥시스테롤 유사체 oxy133

Info

Publication number: KR20150013232A
Application number: KR1020147033925A
Authority: KR
Inventors: 파하드 파하미; 마이클 이. 정; 프랭크 스타펜벡
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-02-04
Also published as: JP2015518493A; EP2847206A4; WO2013169399A1; AU2013260059B2; CA2872751A1; US9717742B2; RU2014149164A; JP6262723B2; EP2847206A1; HK1207649A1; RU2632191C2; AU2013260059A1; CN104395331A; US20150118277A1; IN2014DN09805A; CN104395331B

Abstract

본 발명은 예컨대 하기 화학식 I의 구조를 갖는 합성 화합물 Oxy133, 또는 Oxy133 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 생물활성 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 예컨대 골 장애, 비만, 심혈관 장애 및 신경계 장애를 비롯한 다양한 장애를 치료하기 위해 상기 화합물 또는 생물활성 또는 제약 조성물을 사용하는 방법을 또한 개시한다.
<화학식 I>

Description

골형성 및 헤지호그 신호전달을 유도하고 지방생성을 억제하는 옥시스테롤 유사체 OXY133 {OXYSTEROL ANALOGUE OXY133 INDUCES OSTEOGENESIS AND HEDGEHOG SIGNALING AND INHIBITS ADIPOGENESIS}

본 출원은 2012년 5월 7일 출원된 미국 가출원 61/643,746의 출원일의 이점을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 부여된 보조금 번호 AR059794의 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.

생물학적 제제는 일반적으로 골절 치유 및 척추 장애의 외과적 관리를 비롯한 의료학상 적용에서 골 성장을 촉진시키는 데 사용된다 (1-4). 척추 유합술은 흔히, 요추 및 경추에서 이환되는 퇴행성 디스크 질환 및 관절염을 다루는 것과 같이, 정형외과 의사 및 신경 외과 의사에 의해 시술된다. 역사상, 일반적으로 환자의 장골능으로부터 채취되는 자가 골 이식편이 척추 분절 사이의 유합을 증강시키는 데 사용되어 왔다. 그러나, 관련된 공여부 이환율, 수술 시간 연장, 및 자가 골 이식편 수거와 관련된 골 손실 증가 (5-7)가, 안전하고 효과적인 대체 방안을 찾도록 하는 동기를 부여하였다.

재조합 인간 골 형태형성 단백질-2 (rhBMP-2)는 일반적으로 인간에서 척추 유합을 촉진시키는 데 사용된다. 단분절 전방 요추 체간 유합술을 위한 그의 용도에 대해 2002년 미국 식품 의약국(FDA: US Food and Drug Administration)으로부터 승인을 받았다 (8). 그의 사용 시간과 사용될 수 있는 적응증이 후방 요추 유합술 뿐만 아니라, 경추 유합술을 포함하는 것으로 확장되었는 바, 이에 rhBMP-2의 사용은 현저히 증가하여 왔다. rhBMP-2의 효능에도 불구하고, 최근 보고에서는 rhBMP-2가 척추 유합 수술 동안 사용될 때, 그의 안전성에 있어 문제가 있는 것으로 의문이 제기되었다. 보고된 합병증으로는 혈청종 형성, 연조직 팽윤, 척추 골 용해, 이소성 골 형성, 정액 역류증, 및 발암성을 포함하였다 (9-12). 또한, 경추에 사용된 경우에는 기도 부종이 관찰되었고, 이로 인해 FDA는 경추 수술에서의 그의 사용에 대해 경고하는 공중 보건 공고문(Public Health Notification)을 즉각적으로 발행하게 되었다. 현재까지는 rhBMP-2의 역효과 없이 유합을 유도하는 데 있어 유사한 효능을 발휘할 수 있는 적합한 대체 방안을 확인하지 못한 상태이다 (12).

옥시스테롤은 인간 및 동물 조직에, 그리고 순환에 존재하는 콜레스테롤의 산소화된 유도체의 큰 패밀리를 형성한다. 옥시스테롤은 아테롬성동맥경화성 병변에 존재하고, 다양한 생리학적 과정, 예컨대 세포 분화, 염증, 아폽토시스 및 스테로이드 생산에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 앞서 본 발명자들 중 일부는 특정의 자연 발생 옥시스테롤이 강력한 골 형성 특성을 가진다고 보고한 바 있다 (13). 가장 강력한 골형성능을 가진 자연 발생 옥시스테롤인 20(S)-히드록시콜레스테롤 ("20S") (14)은 골모세포 및 지방세포로 분화될 수 있는 다분화능 중간엽 세포에 적용될 때, 골 형성 및 항-지방생성 특성 둘 모두를 나타낸다. 앞서 20S에 대한 구조적 변형이 수행되었고, 이를 통해 Oxy34 및 Oxy49를 비롯한, 더욱 큰 효력을 가진 20S의 유사체가 합성되었으며, 이들은 헤지호그 (Hh) 신호전달의 활성화를 통해 골 형성을 유도하고, 골수 기질 세포 (MSC)의 지방생성 분화를 억제시키는 것으로 나타났다 (15). 추가로, Oxy34 및 Oxy49는 후측방 척추 유합술을 받은 래트 모델의 생체내에서 척추 유합을 자극시켰다 (15). 종래 옥시스테롤 분자는 매우 광범위하고 예측불가능하게 다른 특성을 가진다. 효력을 증가시키고, 효능을 증진시키며, 합성을 용이하게 하고, 제조 비용이 더욱 저렴한, rhBMP-2 및 종래 옥시스테롤과 비교하여 개선된 신규의 옥시스테롤이 여전히 요구되고 있다. 신규의 옥시스테롤은, 예를 들어 장기간의 골절, 척추 장애 및 골다공증을 치료하는 의사를 위해 실현 가능성이 더욱 큰 임상적 옵션을 제공할 수 있다.

도 1은 골형성 옥시스테롤의 분자 구조를 보여주는 것이다. 20(S)-히드록시콜레스테롤 (20S), Oxy34, Oxy49, 및 Oxy133의 분자 구조가 제시되어 있다. Oxy34는 C6 상에 추가의 OH 기를 가지고, C5와 C6 사이의 이중 결합이 제거되었다는 점에서 20S와 상이하다. Oxy49는 Oxy34와 유사한 구조를 가지고, C25와 C27 사이에 이중 결합을 가진다. Oxy133은 C27이 결실되어 있고, 측쇄 길이가 탄소 1개만큼 연장되어 있다는 점에서 Oxy34 및 49와 상이하다.
도 2는 옥시스테롤에 의한 알칼리성 포스파타제 활성의 용량 의존성 활성화를 보여주는 것이다. 전면생장 상태인 (도 2a) C3HT101/2 세포 또는 (도 2b) M2-10B4 세포를 대조군 비히클 또는 0.125-10 μM의 Oxy133으로 처리하였다. Oxy133과 직접 비교하기 위해, C3H 세포 또한 Oxy34 및 Oxy49로 처리하였다 (도 2a). 4일 경과 후, 전세포 추출물에서 알칼리성 포스파타제 (ALP) 활성을 측정하였다. 3개의 개별 실험의 대표로부터 얻은 데이터를 3중 측정치의 평균 + SD로서 기록하고, 단백질 농도에 대해 정규화하였다 (0.25 μM 이상인 용량의 모든 옥시스테롤로 처리된 세포 대 대조군 비히클로 처리된 세포에 대한 p < 0.0001).
도 3은 oxy133이 골형성 분화를 유도한다는 것을 보여주는 것이다. (도 3a) 전면생장 상태인 C3HT101/2 세포를 골형성 배지 중에서 대조군 비히클 또는 2.5 μM Oxy133으로 처리하였다. 처리 후 48시간 (48h), 4, 7, 및 14일 경과하였을 때, 정량적 실시간 PCR에 의해 골 형성 유전자 Runx2, ALP, BSP, OSX, 및 OCN의 발현을 측정하였다. 대표 실험으로부터 얻은 결과를 3중 측정치의 평균 ± SD로서 기록하였다 (ALP, BSP 및 OSX의 경우, 모든 시점에서, 및 Runx2 및 OCN의 경우, 4, 7, 및 14일째에, 대조군 대 Oxy133에 대한 p < 0.005). (도 3b) C3H10T1/2 세포를 3주 동안 대조군 비히클 또는 2.5 μM Oxy133으로 처리하였다. 세포외 무기질화를 조사하기 위해, 본 코사(von Kossa) 염색법을 수행하였고, 무기질화된 기질은 광학 현미경법하에서 진한 검은색 염색으로 나타났다 (10X). (도 3c) (b)에 기술된 것과 유사한 배양물에서, 45Ca 혼입 검정법을 사용하여 무기질화를 정량화하였다 (대조군 대 모든 농도의 Oxy133에 대한 p < 0.005). (도 3d) 1차 인간 MSC를 골형성 배지 중에서 4주 동안 대조군 비히클 또는 5 μM Oxy133으로 처리하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해 골 형성 유전자 OSX, BSP, 및 OCN의 발현을 측정하였다. 대표 실험으로부터 얻은 결과를 3중 측정치의 평균 ± SD로서 기록하였다 (대조군 대 Oxy133으로 처리된 세포에서의 모든 유전자에 대한 p < 0.05). (도 3e) 1차 인간 MSC를 골형성 배지 중에서 5주 동안 대조군 비히클 또는 0.5, 1, 및 5 μM Oxy133으로 처리하였다. 세포외 무기질화를 조사하기 위해, 본 코사 염색법을 수행하였고, 무기질화된 기질은 광학 현미경법하에서 진한 검은색 염색으로 나타났다 (10X).
도 4는 Oxy133 유도성 골형성 분화에서 헤지호그 경로의 역할을 보여주는 것이다. (도 4a) 전면생장 상태인 C3H10T1/2 세포를 골형성 배지 중에서 4 μM 시클로파민 (Cyc)의 존재 또는 부재하에 대조군 비히클 또는 Oxy133으로 처리하였다. 4일 경과 후, ALP 활성을, 및 7일 경과 후, 골 형성 유전자 ALP, BSP, 및 OSX의 발현을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다 (ALP 활성 및 제시된 유전자 모두의 발현에 대하여 대조군 대 Oxy133 및 Oxy133 대 Oxy133+Cyc에 대한 p < 0.001). (도 4b) C3H10T1/2 세포를 대조군 플라스미드 (pGL3b) 또는 8X-Gli 루시페라제 리포터를 함유하는 플라스미드로 형질감염시키고, 대조군 비히클 또는 Oxy133으로 처리하고, 48시간 경과 후, 루시페라제 활성을 측정하였다. 대표 실험으로부터 얻은 결과를 3중 측정치의 평균 ± SD로서 기록하였다 (대조군 대 100 nM, 250 nM, 및 1 μM Oxy133의 Oxy133에 대한 p < 0.001). (도 4c) 경쟁자를 함유하지 않거나, 또는 50 μM의 유리 경쟁자 스테롤 (20S, Oxy133 또는 Oxy16)을 함유하는 샘플 중에서 20S 비드 또는 대조군 비드에 의해 포획된 YFP-Smo의 양을 비교하였다. 비드에 의해 포획된 YFP-Smo를 웨스턴 블롯에 의해 측정하고 (상단), 경쟁자를 함유하지 않는 경우에서의 결합 반응에서 포획된 양에 대한 상대적인 값으로 플롯팅하였다 (하단).
도 5는 BMP2 및 Oxy133에 의해 형성된 유합 매스(fusion mass)의 단순 방사선사진을 보여주는 것이다. 수술 후 8주째의 명시된 군으로부터의 2마리 대표 동물에 대한 팩시트론(Faxitron) 영상이 제시되어 있다. 화살촉 표시는 골 형성 결핍을 나타내는 것이다; 화살표 표시는 골 형성을 나타내는 것이다. I군 (대조군); 가로 돌기간 공간에 골 형성은 이루어지지 않음. II군 (BMP2); L4-L5에서 골 매스 가교 연결 및 양측 유합. III군 (Oxy133-20 mg); L4-L5에서 골 매스 가교 연결 및 양측 유합. IV군 (Oxy133-2 mg); Oxy133에 의한 유합 유도를 보인 동물에서, L4-L5 골 매스 가교 연결 및 양측 유합.
도 6은 BMP2 및 Oxy133에 의해 형성된 유합 매스의 마이크로CT를 보여주는 것이다. 명시된 군으로부터의 2마리 대표 동물에 대한 마이크로CT가 제시되어 있다. 화살촉 표시는 골 형성 결핍을 나타내는 것이다; 화살표 표시는 골 형성을 나타내는 것이다. I군 (대조군); 가로 돌기간 공간에 골 형성은 이루어지지 않음. II군 (BMP2); L4-L5에서 가로 돌기간 공간을 가교 연결하는 골 매스 및 양측 유합. III군 (Oxy133-20 mg); L4-L5에서 가로 돌기간 공간을 가교 연결하는 골 매스 및 양측 유합. IV군 (Oxy133-2 mg); Oxy133에 의한 유합 유도를 보인 동물에서, L4-L5에서 가로 돌기간 공간을 가교 연결하는 골 매스 및 양측 유합. V군 (Oxy133-0.2 mg); 가장 우측에 있는 화살표 표시는 L5 가로 돌기로부터의 소량의 골 형성이 있었음을 나타내는 것이다.
도 7은 Oxy133이 척추 유합에 미치는 효과에 대한 조직학적 분석을 보여주는 것이다. (도 7a) 각 군으로부터의 다른 2마리의 대표 동물의 조직학적 관상 섹션이 제시되어 있다 (10X). I군 (대조군)에서는 가로 돌기간 공간에 어떤 유의한 골 형성도 없었다 (화살촉 표시). II군 (BMP2)에서는 유합 매스를 형성하는 해면골 및 피질골을 통해 뚜렷이 입증되는 바, L4-L5에서 골 가교 연결이 나타났다 (화살표 표시). III군 (Oxy133-20 mg) 및 IV군 (Oxy133-2 mg) 표본에서는 BMP2에 의해 유도된 것과 유사한 해면골 및 피질골 형성으로 보여지는 바와 같이, 가로 돌기간 공간에서 유의한 골 형성이 나타났다 (화살표 표시). (도 7b) II군 (BMP2) 및 III군 (Oxy133-20 mg)에서 각각 2마리씩의 동물로부터 얻은 조직학적 관상 섹션에서, BMP2로 처리된 동물의 유합 매스에서는 유의한 지방세포 형성이 보였고, 옥시스테롤로 처리된 동물로부터의 유합 매스에서의 유의하게 그보다는 더 적은 지방세포가 보였다 (화살표 표시, 확대 배율 20X).

본 발명자들은 본원에서 다양한 임상적 용도에 적절한 골 형성 옥시스테롤인 Oxy133을 확인하고, 시험관내에서 골형성 분화를 촉진시키고, 래트 모델에서의 생체내 척추 유합을 촉진시킬 수 있는 그의 능력을 기술한다. 합성되고 시험된 다수의 옥시스테롤 유사체들 중에서 Oxy133이 예상외로 특히 효과적이었고, 합성이 용이하였다. Oxy133은 C3H10T1/2 마우스 배아 섬유모세포에서 골 형성 마커인 Runx2, 오스테릭스 (OSX), 알칼리성 포스파타제 (ALP), 골 시알로프로테인 (BSP), 및 오스테오칼신 (OCN)의 발현을 유의하게 유도하였다. 8X-Gli 루시페라제 리포터의 Oxy133 유도성 활성화, 그의 스무슨드(Smoothened)에의 직접 결합, 및 헤지호그 (Hh) 경로 억제제인 시클로파민에 의한 Oxy133 유도성 골 형성 효과의 억제가 Oxy133에 대한 골 형성 반응을 매개하는 Hh 경로의 역할을 입증하였다. 추가로, Oxy133은 OSX, BSP, 및 OCN의 발현을 유도하였고, 1차 인간 중간엽 줄기 세포에서 강력한 무기질화를 자극시켰다. 생체내에서, 유합 부위에서 Oxy133으로 처리된 동물에서는 단 4일 경과한 후에도 X선 상에서 양측 척추 유합이 관찰되었고, 8주 경과 후에는 수동 평가, 마이크로CT, 및 조직학적 방법으로 확인되었고, 그 효능은 골 형태형성 단백질-2 (BMP2)와 동일하였다. 그러나, BMP2와 달리, Oxy133은 유합 매스에서 지방생성을 유도하지 않았고, BV/TV 비가 더 크고, 해면골 분리가 더 작은 것으로 입증되는 바와 같이, 뼈가 더욱 조밀하게 형성되도록 만들었다. 따라서, Oxy133은 예컨대, 척추 유합술, 골절 수복, 골 재생/조직 공학 응용, 치아 이식물을 위한 턱 골 밀도 증강, 골다공증 등을 비롯한, 골 형성의 국소 자극이 도움이 되는 병증을 치료하는 데 유용하다.

본 발명자들은 또한 Oxy133이 다능성 MSC 세포의 지방생성을 억제시킨다는 것도 입증하였다. 따라서, Oxy133은 병증, 예컨대 황색종 형성, 지방 패드의 국소 축적 및 비만을 치료하는 데 유용하다.

Oxy133의 이점으로는 예컨대, 본 발명자들에 의해 연구된 다른 골 형성 옥시스테롤에 비하여 합성이 더욱 용이하고, 유합까지의 소요 시간이 개선되었다는 점을 포함한다. Oxy133은 Hh 경로 활성 자극이 도움이 되는 병증을 비롯한, 각종의 다른 병증을 치료하는 데 유용한 작용제로서 뿐만 아니라, 차세대 골 동화 작용성 치료제의 구성원으로서의 역할도 할 수 있는 소분자 골 형성 옥시스테롤이다.

본 발명의 한 측면은 Oxy133으로 명명되는 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물이다:

<화학식 I>

본 발명의 또 다른 측면은 Oxy133 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 생물활성 또는 제약 조성물이다. "생물활성" 조성물 또는 "제약" 조성물이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 두 용어 모두 대상체에게 투여될 수 있거나, 대상체 내로 도입되는 의료 장치를 코팅하는 데 사용될 수 있거나, 또는 그에 존재할 수 있는 조성물 등을 의미한다. 상기 생물활성 또는 제약 조성물은 종종 본원에서 "본 발명의 제약 조성물 또는 생물활성 조성물"로도 지칭된다. 종종, "Oxy133 투여"라는 어구는 본원에서 (예컨대, 대상체를 상기 화합물과 접촉시키는 것과 같이) 대상체에게 상기 화합물을 투여하는 것과 관련하여 사용된다. 상기 용도의 화합물은 일반적으로 Oxy133을 포함하는 제약 조성물 또는 생물활성 조성물 형태일 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

본 발명의 또 다른 측면은 세포 또는 조직을 유효량 (예컨대, 치료 유효량)의 Oxy133과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 또는 조직에서 헤지호그 (Hh) 경로 매개 반응을 유도하는 (자극하는, 증진시키는) 방법이다. 세포 또는 조직은 시험관내 또는 대상체내, 예컨대 포유동물 (예컨대, 인간) 내에 존재하는 것일 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 헤지호그 (Hh) 경로 매개 반응은 골모세포 분화, 골형태형성(osteomorphogenesis), 및/또는 골증식(osteoproliferation) 자극이거나; 또는 상기 반응은 모발 성장 및/또는 연골 형성의 자극이거나 (예컨대, 탈모증을 갖는 대상체, 또는 골관절염을 갖는 대상체에게 유효량의 본 발명의 생물활성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 각각 탈모증을 갖는 대상체, 또는 골관절염을 갖는 대상체를 치료하는 방법); 또는 상기 반응은 허혈성 조직으로의 혈액 공급을 증진시킴으로써 이루어지는 신생혈관증식, 예컨대 혈관신생의 자극이거나 (예컨대, 심혈관 장애, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 말초 혈관 질환 및/또는 졸중을 갖는 대상체에게 유효량의 본 발명의 생물활성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 장애, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 말초 혈관 질환 및/또는 졸중을 갖는 대상체를 치료하는 방법); 또는 상기 반응은 지방세포 분화, 지방세포 형태형성 및/또는 지방세포 증식의 억제이거나 (예컨대, 황색종 형성, 지방 패드의 국소 축적, 및/또는 비만을 갖는 대상체에게 유효량의 본 발명의 생물활성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 황색종 형성, 지방 패드의 국소 축적, 및/또는 비만을 갖는 대상체를 치료하는 방법); 또는 상기 반응은 전구 세포에서 신경발생 (뉴런 분화)이 이루어지도록 하는 자극이다 (예컨대, 신경계 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법). Hh 매개 반응은 재생 의학에서 사용하기 위한 다양한 유형의 조직들 중 임의 조직의 재생을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 골 장애, 골감소증, 골다공증 또는 골절을 갖는 대상체에게 Oxy133을 포함하는 생물활성 조성물 또는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 골 장애, 골감소증, 골다공증 또는 골절을 갖는 대상체를 치료하는 방법이다. 대상체는 예컨대, 골 질량을 증가시키거나, 골다공증 증상을 호전시키거나, 아테롬성동맥경화성 병변을 감소시키거나, 제거하거나, 예방하거나 또는 치료하기 위해 선택 간격으로 유효 투여 형태의 생물활성 조성물 또는 제약 조성물을 치료 유효 용량으로 투여받을 수 있다. 대상체는 골다공증 증상을 호전시키기기 위해 선택 간격으로 유효 투여 형태의 생물활성 조성물 또는 제약 조성물을 치료 유효 용량으로 투여받을 수 있다. 한 실시양태에서, (예컨대, 대상체로부터, 또는 적합한 포유동물로부터, 또는 조직 또는 세포 은행으로부터) 포유동물 중간엽 줄기 세포를 수거하고, 포유동물 중간엽 세포를 Oxy133으로 처리하여 세포의 골모세포 분화를 유도하고, 분화된 세포를 대상체에게 투여함으로써 대상체는 골 형성을 유도하는 치료를 받게 된다.

본 발명의 방법 중 임의의 것에서, Oxy133은 국소 투여에 의해 세포, 조직 또는 기관에 투여될 수 있다. 예를 들어, Oxy133은 크림 등을 사용하여 국소 적용될 수 있거나, 세포, 조직 또는 기관에 직접 주사되거나, 또는 다르게 도입될 수 있거나, 또는 적합한 의료 장치 (예컨대, 이식물)와 함께 도입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 방법들 중 하나 이상의 방법을 수행하기 위한 키트이다. 키트는 임의로 용기 내에 유효량의 (예컨대, 치료 유효량의) Oxy133을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 표면을 갖는 기재를 포함하는, 대상체 (예컨대, 동물, 예컨대 인간)의 체내에서 사용하기 위한 이식물이다. 이식물의 표면 또는 내면은 주변 골 조직에서 골 형성을 유도하는 데 충분한 양으로 Oxy133을 포함하는 생물활성 조성물 또는 제약 조성물을 포함한다.

임의로, 본 발명의 생물활성 조성물, 방법, 키트 또는 의료 장치는 하나 이상의 다른 적합한 치료제, 예컨대 부갑상선 호르몬, 플루오린화나트륨, 인슐린-유사 성장 인자 I (ILGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II (ILGF-II), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 시토크롬 P450 억제제, 골형성 프로스타노이드, BMP2, BMP4, BMP7, 및/또는 BMP14를 포함할 수 있다.

Oxy133은 하기 구조를 가진다:

<화학식 I>

그의 화학명은 (3S,5S,6S,8R,9S,10R,13S,14S,17S) 17-((S)-2-히드록시옥탄-2-일)-10,13-디메틸헥사데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,6-디올이다.

실시예 II에는 Oxy133의 디자인, 및 상기 분자를 합성하는 방법이 기술되어 있다.

화학식 I로 제시된 바와 같은 화합물 Oxy133 이외에도, 본 발명의 다른 실시양태는 본 화합물의 부분입체이성질체, 라세미체, 거울상이성질체, 및 다른 이성질체를 비롯한, 화학식에 제시된 입체 중심 중 임의의 것에서의 임의의 모든 개별 입체이성질체를 포함한다. 본 발명의 실시양태에서, "Oxy133" 또는 "화학식 I을 갖는 화합물" 또는 "Oxy133 또는 그의 제약상 허용되는 염"은 화합물의 모든 다형체 및 용해화물, 예컨대 수화물, 및 유기 용매로 형성된 것을 포함할 수 있다. "용해화물"은 용질, 예컨대 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 하나 이상의 분자, 및 용매의 하나 이상의 분자에 의해 형성된 착물 또는 응집체이다. 상기 용해화물은 실질적으로 고정된 몰비로 용질 및 용매를 포함하는 결정질 고체일 수 있다. 적합한 용매, 예컨대 물, 에탄올은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 상기 이성질체, 다형체, 및 용해화물은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 위치특이적 및/또는 거울상이성질체선택적 합성 및 분할에 의해 제조될 수 있다.

염 제조 능력은 화합물의 산도 또는 염기도에 따라 달라진다. 화합물의 적합한 염으로는 산 부가 염, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 과염소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 카르본산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔 술폰산, 시클로헥산술팜산, 살리실산, p-아미노살리실산, 2-페녹시벤조산, 및 2-아세톡시벤조산으로 제조된 염; 사카린으로 제조된 염; 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨 및 칼륨 염; 알칼리토 금속 염, 에컨대, 칼슘 및 마그네슘 염; 및 유기 또는 무기 리간드로 형성된 염, 예컨대 4급 암모늄 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

추가의 적합한 염으로는 화합물의 아세테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 비카르보네이트, 비술페이트, 비타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 칼슘 에데테이트, 캄실레이트, 카르보네이트, 클로라이드, 클라블라네이트, 시트레이트, 디히드로클로라이드, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헥실레소르시네이트, 히드라바민, 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 히드록시나프토에이트, 아이오다이드, 이소티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸브로마이드, 메틸니트레이트, 메틸술페이트, 뮤케이트, 납실레이트, 니트레이트, N-메틸글루카민 암모늄 염, 올레이트, 파모에이트 (엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 술페이트, 수바세테이트, 숙시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드 및 발레레이트 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 "Oxy133"을 언급하는 것은 그의 제약상 허용되는 염 또는 용해화물을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명의 방법, 조성물, 또는 키트 중 임의의 것에서, 특히 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 것에서, 본 발명의 조성물은 임의로 하나 이상의 다른 적합한 치료제와 함께 조합될 수 있다. 특정 병증을 치료하는 데 적합한 임의의 치료제가 사용될 수 있다. 상기와 같은 적합한 작용제 또는 약물은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 골 장애 치료를 위해, 종래 치료 약물이 본 발명의 조성물과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 일부 상기와 같은 작용제로는 예컨대, 부갑상선 호르몬, 플루오린화나트륨, 인슐린-유사 성장 인자 I (ILGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II (ILGF-II), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 시토크롬 P450 억제제, 골형성 프로스타노이드, BMP2, BMP4, BMP7, 및/또는 BMP14를 포함한다. 심혈관 또는 지질 장애 치료를 위해, 스타틴 또는 혈압 약물이 본 발명의 조성물과 함께 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 화합물은 본 발명의 조성물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. "제약상 허용되는 담체"란 생물학상 또는 다르게 비바람직한 것이 아닌 물질을 의미하는 것으로, 즉 상기 물질은 임의의 비바람직한 생물학적 효과를 유발하지 않거나, 또는 유해한 방식으로 제약 조성물 중에 함유되어 있는 그의 다른 성분들 중 임의의 것과 상호작용하지 않으면서, 대상체에게 투여될 수 있다. 당업자에게 주지되어 있는 바와 같이, 담체는 당연히 활성 성분의 임의의 분해를 최소화시키고, 대상체에서 임의의 유해한 부작용을 최소화시키는 것으로 선택된다. 제약상 허용되는 담체 및 제약 조성물의 다른 성분들에 대한 논의를 위해, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^thed., Mack Publishing Company, 1990]을 참조할 수 있다. 일부 적합한 제약 담체는 당업자에게 자명할 것이며, 이는 예컨대, 물 (멸균수 및/또는 탈이온수 포함), 적합한 완충제 (예컨대, PBS), 생리 염수, 세포 배양 배지 (예컨대, DMEM), 인공 뇌 척수액, 디메틸술폭시드 (DMSO), 에탄올 등을 포함한다.

본 발명의 특정 제제는 적어도 부분적으로는 사용되는 특정 작용제 또는 작용제의 조합, 및 선택된 투여 경로에 따라 달라지게 된다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물의 적합한 제제는 다양하게 달라질 수 있다. 일부 대표적인 제제는 하기에서 논의된다. 다른 것도 당업자에게 자명할 것이다. 일반적으로, Oxy133은 치료를 필요로 하는 세포, 조직 또는 기관에 국소 또는 직접 투여될 수 있다. 치료되는 조직 또는 기관에서 바람직한 결과가 달성된다면, 전신 투여 또한 사용될 수 있다.

경구 투여에 적합한 제제 또는 조성물은 액상 용액, 예컨대 희석제, 예컨대 물, 염수, 또는 과즙 중에 용해되어 있는 유효량의 Oxy149; 각각 사전 결정된 양으로 활성 성분을 함유하는 것인 캡슐, 사쉐 또는 정제, 고체로서, 과립제, 또는 동결 건조된 셀; 수성 액체 중 용액 또는 현탁액; 및 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼으로 구성될 수 있다. 정제 형태는 하나 이상의 락토스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 미세결정질 셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카르멜로스 소듐, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 희석제, 완충화제, 습윤제, 보존제, 향미제, 및 약리학상 상용성인 담체를 포함할 수 있다. 경구 전달용으로 적합한 제제는 또한 합성 및 천연 중합체 미소구, 또는 본 발명의 작용제가 위장관 내에서 분해되지 못하도록 보호하는 다른 수단 내로 도입될 수 있다.

비경구적 투여 (예컨대, 정맥내)에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 및 제제가 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 만드는 용질을 포함할 수 있는, 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제제는 단일 용량 또는 다회 용량으로 실링된 용기, 예컨대 앰플 및 바이알에 존재할 수 있고, 사용 직전 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만이 요구되는 냉동 건조된 (즉, 동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사액 및 현탁액은 앞서 기술된 것과 유사한 멸균 분말, 과립제, 및 정제로부터 제조될 수 있다.

Oxy133은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 조합하여 흡입에 의해 투여되는 에어로졸 제제로 제조될 수 있다. 상기 에어로졸 제제는 가압식으로 허용되는 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 배치될 수 있다.

국부 투여에 적합한 제제로는 향미제, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 중 활성 성분을 포함하는 로젠지; 불활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중 활성 성분을 포함하는 파스틸(pastille); 적합한 액체 담체 중 활성 성분을 포함하는 구강세정제; 또는 크림, 에멀젼, 현탁액, 용액, 겔, 크림, 페이스트, 발포제, 윤활제, 분무제, 좌제 등을 포함한다.

적합한 다른 제제는 예컨대, Oxy133이 지효성 방출에 적합한 히드로겐 및 중합체, 또는 저용량의 Oxy133을 전달하기 위한 나노입자를 포함한다. 상기 제제는 당업자에게 주지되어 있다.

특정 적용에 기초하여 적합하거나, 적절한 제제를 쉽게 선택하거나, 적합화시키거나, 또는 개발할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 추가로, 본 발명의 제약 조성물은 각종의 다른 경로에 의해 투여하기 위한 것으로 제제될 수 있다. 국소 또는 직접 투여 예로는 동맥내로, 두개내로, 진피내로, 간내로, 근육내로, 안구내로, 복강내로, 경막내로, 정맥내로, 피하로, 경피적으로 또는 골 영역의 아테롬성동맥경화성 부위로 직접, 예컨대 직접 주사에 의해, 카테터 또는 다른 의료 장치를 이용한 도입에 의해, 국부 적용, 직접 적용, 및/또는 동맥 또는 다른 적절한 조직 부위 내로 장치를 삽입함으로써 실시되는 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

Oxy133은 수술용 또는 의료 장치 또는 이식물 내에 함유되도록 제제화할 수 있거나, 또는 그에 의해 방출되도록 적합화될 수 있다. 특정 측면에서, 이식물은 Oxy133으로 코팅되거나, 다르게는 그로 처리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 이식물을 코팅하는 데 히드로겔, 또는 다른 중합체, 예컨대 생체적합성 및/또는 생체분해성 중합체가 사용될 수 있다 (즉, 조성물은 히드로겔, 또는 다른 중합체를 사용함으로써 의료 장치와 함께 사용될 수 있도록 적합화될 수 있다). 작용제로 의료 장치를 코팅하기 위한 중합체 및 공중합체는 당업계에 주지되어 있다. 이식물의 예로는 혈관확장술 풍선, 스텐트, 약물 용리 스텐트, 봉합사, 보철, 혈관 카테터, 투석 카테터, 혈관 이식편, 골 이식편, 인공 심장 판막, 심장 박동 조율기, 삽입형 제세동기 또는 IV 니들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단지 일례로서, 스텐트 또는 스텐트 이식편은 전형적으로 가는 직물 관형 이식부를 포함하고, 보통 체내 통로 중의, 예컨대 혈관내의 취약 지점을 증강시키거나, 강화시키는 데 사용된다. 스텐트 이식편 삽입은 카테터 사용에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 풍선 혈관확장술을 시술하는 동안, 또는 그 이후에 풍선 확장에 의해서 용이하게 배치될 수 있거나, 또는 별법으로, 스텐트 이식편이 자가 확장형일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, Oxy133의 "유효량"이란 적어도 검출가능한 효과를 초래할 수 있는 양을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "치료 유효량"은 적당한 기간 동안에 걸쳐 치료받은 대상체에서 적어도 검출가능한 치료학적 반응 (예컨대, 하나 이상의 증상의 호전)을 초래할 수 있는 양을 의미한다.

본 발명의 실시양태에서, Oxy133은 다양한 종래 검정법 중 임의의 것으로 측정된 바, 치료학적 반응을 처리되지 않은 대조군 샘플에서의 것에 대해 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 150%, 200% 또는 그 초과만큼 자극시키거나, 또는 억제시킬 수 있다. 상기 범위의 중간 값 또한 포함된다.

Oxy133에 대한 투여량은 단위 투여 형태로, 예컨대 정제 또는 캡슐로 존재할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "단위 투여 형태"라는 용어는 각 단위가 제약상 허용되는 희석제, 담체, 또는 비히클과 함께 원하는 효과를 보이는 데 충분하는 양인 것으로 계산된 사전 결정된 양으로 본 발명의 작용제를 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 조합하여 함유하는 것인, 동물 (예컨대, 인간) 대상체에 대해 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다.

당업자는 통상적으로 개별 환자에서 작용제의 원하는 유효량 또는 유효 농도를 달성하기 위해 사용되는 조성물의 정확한 제제화를 위한 적절한 용량, 스케줄, 및 투여 방법을 결정할 수 있다. 당업자는 또한 질환, 장애 또는 병증의 적절한 임상적 증상을 분석하는 것 이외에도, 적절한 환자 샘플 (예컨대, 혈액 및/또는 조직)을 직접 또는 간접적으로 분석함으로써 화합물, 예를 들어 Oxy133의 "유효 농도"에 대한 적절한 지표를 쉽게 결정할 수 있고, 사용할 수 있다.

본 발명과 관련하여 동물, 예컨대 인간에게 투여되는 Oxy133 또는 그의 조성물의 정확한 용량은 대상체의 종, 연령, 체중 및 일반적인 상태, 치료되는 임의의 장애의 중증도 또는 기전, 사용되는 특정 작용제 또는 비히클, 그의 투여 모드, 환자가 복용하고 있는 다른 약물 및 특정 환자에 적절한 개별 요법 및 용량 수준을 결정할 때, 주치의가 보통 고려하는 다른 인자들에 따라, 대상체마다 달라질 것이다. 생체내에서 원하는 농도를 달성하는 데 사용되는 용량은 Oxy133 형태의 효력, 숙주 내에서 Oxy133과 관련된 약력학적 성질, 추가의 작용제 사용 여부, 감염된 개체의 질환 상태의 중증도 뿐만 아니라, 전신 투여하는 경우, 개체의 체중 및 연령에 의해 결정될 것이다. 용량 크기 또한 사용되는 특정 작용제 또는 그의 조성물이 동반할 수 있는 임의의 유해한 부작용의 존재 여부에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로는 가능하면, 유해한 부작용은 최소 수준으로 유지시키는 것이 바람직할 수 있다.

예를 들어, 용량은 약 5 ng (나노그램) 내지 약 1,000 mg (밀리그램), 또는 약 100 ng 내지 약 600 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 500 mg, 또는 약 20 mg 내지 약 400 mg의 범위로 투여될 수 있다. 예를 들어, 용량은 약 0.0001 mg/kg 내지 약 1,500 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 1,000 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 또는 약 20 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 체중 대비 용량 비를 달성할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 투여 단위는 약 1 ng 내지 약 5,000 mg, 또는 약 5 ng 내지 약 1,000 mg, 또는 약 100 ng 내지 약 600 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 500 mg, 또는 약 20 mg 내지 약 400 mg, 또는 약 40 mg 내지 약 200 mg 범위의 Oxy133, 또는 Oxy133을 포함하는 조성물일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기와 같이 Oxy133의 양 (예컨대, 수 그램 정도)이 예컨대, 스캐폴드의 일부로서 척추 유합 수술에서 국소 투여된다.

용량은 원하는 치료학적 효과를 유도하는 데 필요에 따라 1일 1회, 1일 2회, 1일 4회, 또는 1일 4회 초과로 투여될 수 있다. 예를 들어, 용량 투여 요법은 본 발명의 화합물의 혈액 혈청 농도를 약 0.01 내지 약 1,000 nM, 또는 약 0.1 내지 약 750 nM, 또는 약 1 내지 약 500 nM, 또는 약 20 내지 약 500 nM, 또는 약 100 내지 약 500 nM, 또는 약 200 내지 약 400 nM 범위로 달성하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 용량 투여 요법은 약 1 ㎍/L (리터당 마이크로그램) 내지 약 2,000 ㎍/L, 또는 약 2 ㎍/L 내지 약 1,000 ㎍/L, 또는 약 5 ㎍/L 내지 약 500 ㎍/L, 또는 약 10 ㎍/L 내지 약 400 ㎍/L, 또는 약 20 ㎍/L 내지 약 200 ㎍/L, 또는 약 40 ㎍/L 내지 약 100 ㎍/L 범위로 본 발명의 화합물의 최대 용량의 절반을 이용하여 평균 혈액 혈청 농도를 달성하도록 선택될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태는 또한 독립적으로 작용하거나, 또는 Oxy133과 함께 상승작용적으로 작용함으로써 치료 결과를 개선시키는 추가의 작용제를 이용하는 치료법을 포함할 수 있다. 조합 요법으로 제공되는 경우, 원하는 대로, Oxy133 이외의 작용제는 Oxy133과 동시에 제공될 수 있거나, 또는 투여는 시차를 두고 진행될 수 있다. 2개 (또는 그 이상의) 약물이 또한 조성물 중에서 조합될 수 있다. 각각의 용량은 그가 단독으로 사용될 때보다 조합하여 사용될 때에 더 적을 수 있다. 적합한 용량은 표준 투여 파라미터를 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나("a," "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "대상체"란 Oxy133으로 치료될 수 있는 병증의 증상을 보이는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체 (환자)로는 실험실용 동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 또는 기니아 피그), 농경용 가축, 및 가축 또는 애완 동물 (예컨대, 고양이, 개 또는 말)을 포함한다. 인간 환자를 비롯한 비-인간 영장류가 포함된다. 전형적인 대상체로는 헤지호그 신호전달에 의해 자극을 받은 비정상적인 양 ("정상" 또는 "건강한" 대상체보다 더 낮은 양)의 하나 이상의 생리학적 활성을 보이는 동물을 포함한다. 비정상적인 활성은 헤지호그 활성의 활성화를 비롯한, 다양한 기전들 중 임의의 것에 의해 조절될 수 있다. 비정상적인 활성으로 생리학적 병증이 유발될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태는 시험관내 또는 생체내의, 본원에 개시된 방법 중 임의의 것에 유용한 키트이다. 상기 키트는 Oxy133 또는 생물활성 또는 그의 제약 조성물을 포함하고, 하나 이상의 다른 옥시스테롤, 예컨대 Hh 경로 매개 활성을 증가시킬 수 있는 것, 또는 다른 적합한 치료제를 포함할 수 있다. 임의로, 키트는 방법 수행 설명서를 포함한다. 본 발명의 키트의 임의적 요소로는 적합한 완충제, 제약상 허용되는 담체 등, 용기 또는 포장재를 포함한다. 키트의 시약은 시약이 예컨대, 동결건조된 형태 또는 안정화된 액체로 안정한 상태에 있게 하는 용기 중에 존재할 수 있다. 시약은 또한 1회용 형태, 예컨대 단일 투여 형태로 존재할 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법 중 임의의 것을 수행하는 데 적합한 키트의 성분을 이해할 것이다.

다양한 병증이 Oxy133 단독으로, 또는 다른 치료제와 함께 조합하여 치료될 수 있다.

본원 실시예에 제시된 바와 같이, Oxy133을 통해 헤지호그 경로 활성은 증가된다. 임의의 특정 기전으로 제한하고자 하지 않으면서, 이러한 증가는, 세포외 구획으로부터 세포내 구획으로의 헤지호그 경로의 조기 매개 인자인 스무슨드 수용체에의 Oxy133의 직접적인 결합에 기인하는 것으로 제안된다.

Oxy133의 한 효과는 다능성 세포를 표적화하여 다양한 세포 유형, 예컨대 골모세포로의 그의 계통 특이 분화를 유도하는 것이다. 예를 들어, 실시예에 제시되어 있는 바와 같이, Oxy133으로 처리된 중간엽 줄기 세포는 골모세포 분화의 마커 분화가 유도된 것으로 나타났다. 임의의 특정 기전으로 제한하고자 하지 않으면서, 이러한 계통 특이 분화는 상기 세포에서 헤지호그 신호전달의 유도에 기인하는 것으로 제안된다. 그러나, 본원에서 논의되는 치료 방법은 Oxy133의 작용 기전과는 상관없이 본 발명에 포함된다. Oxy133은 골 형성, 골모세포 분화, 골형태형성 및/또는 골증식이 도움이 되는 병증을 치료하는 데 유용하다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 상기 병증 또는 치료에는 예컨대, 척추 유합술 또는 골다공증에서 국소 골 형성 자극을 위한 골유도 요법, 골절 수복 또는 치유, 턱의 골 형성 증가가 임상적으로 도움이 되는 치아 수술, 외상 또는 선천적 결함, 예컨대 구개열/구순열에 의해 유도된 두개안면골 결함 수복, 및 천연 골 성장이 부적절한 다수의 다른 근골격 장애들이 있다. 개방 골절 및 유착 결여의 위험이 높은 골절을 치료하는 데, 및 척추 유합술 (예컨대, 전방 요추 체간 유합술, 후방 요추 유합술, 및 경추 유합술)을 필요로 하는 대상체, 또는 요추 및 경추에서 이환된 퇴행성 디스크 질환 또는 관절염을 갖는 대상체를 비롯한, 척추 장애가 있는 대상체에서 치료는 수행될 수 있다. 추가로, Oxy133은 특히, 노인 집단에서, 골모세포에 의한 골 형성 감소와 동시에 파골세포에 의한 골 재흡수 증가로부터 유발되는 골다공증을 치료하는 데 사용될 수 있다.

더욱 특히, 하기와 같은 유형의 골 관련 치료가 수행될 수 있다:

1. Oxy133은, 상용성 분자, 예컨대 제한하는 것은 아니지만 콜라겐 I로 구성된 스캐폴드로서, Oxy133을 흡수한 후 이어서 이를 체내에 배치하는 것인 스캐폴드를 사용하는 국소 골 형성을 자극하기 위해 체내에서 국소 전달되는 골형성제로서 사용된다. 예를 들어, Oxy133을 함유하는 스캐폴드는 예를 들어, 척추 유합, 가관절, 및 유착 결여 유합에서 둘 이상의 척추의 유합술이 지시되는 가로 돌기 사이에, 또는 추간판에 배치될 수 있다. 다른 실시양태에서, Oxy133을 함유하는 스캐폴드는 골 형성을 자극하기 위해, 및 골절 치유를 위해 골절된 뼈에 배치되거나; Oxy133에 의한 골 재생이 지시되는 골 결함, 예컨대 두개골 또는 악안면골 결함에 배치되거나; 또는 치아 수술, 예컨대 치아 이식물 이전에 골 재생의 수단으로서 골 형성을 자극하기 위해 턱 뼈에 배치된다.

2. Oxy133은 시험관내에서 골형성제로서 사용된다. 예를 들어, 정형 외과 수술 및 국소 골 형성을 자극시키기 위한 목적으로 상기 1)에서 지시된 것과 같은 다른 수술에서 골전구 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포를 적용시키기 이전에 그의 골형성 분화를 자극시키기 위하여 상기 세포에 투여된다.

3. Oxy133은 시험관내에서 골전구 세포에서 헤지호그 신호전달 경로를 자극시켜 시험관내 또는 생체내에서 세포의 골형성 분화를 유도하는 데 사용된다.

Oxy133의 또 다른 효과는 지방세포 분화, 지방세포 형태형성 및/또는 지방세포 증식을 억제시키는 것이다. 이와 같은 Oxy133의 효과에 의해 치료될 수 있는 병증 중에는 예컨대 황색종 형성, 지방 패드의 국소 축적 및 비만이 있다.

Oxy133의 국소 투여가 직접 또는 간접적으로 도움이 되는 다른 병증으로는 모발 성장, 신경발생, 연골 형성 등이 요구되는 병증, 또는 심혈관 장애를 포함하는데, 이들 병증은 각 적응증과 관련된 세포, 조직, 또는 기관에 작용함으로써 이루어지는 헤지호그 경로 활성 자극과 관련이 있다.

상기 내용 및 하기의 실시예에서, 온도는 보정되지 않은 섭씨 온도로 기재되었고; 달리 명시되지 않는 한, 모든 부 및 비율(%)은 중량부 및 중량%이다.

실시예

실시예 I - 물질 및 방법

세포 배양물 및 시약

마우스 다분화능 골수 기질 세포 (MSC) 세포주인 M2-10B4 (M2), 및 배아 섬유모세포 세포주 C3H10T1/2 (C3H)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: 미국 메릴랜드주 로크빌)으로부터 구입하였고, 본 발명자들에 의해 앞서 보고된 바와 같이 배양하였다 (14,15). 5% 우태아 혈청, 50 ㎍/ml 아스코르베이트, 및 3 mM β-글리세로포스페이트 (βGP)를 함유하는, M2 세포용 RPMI 또는 C3H 세포용 DMEM (분화 배지)에서 골형성 분화를 유도하는 처리를 수행하였다. 시클로파민을 EMD 바이오사이언시즈 인코퍼레이티드(EMD Biosciences, Inc.: 미국 캘리포니아주 라호야)로부터 구입하였다. 1차 인간 중간엽 줄기 세포 (HMSC)는 론자(Lonza: 미국 메릴랜드주 워커스빌)로부터 구입하고, 스템셀 테크놀러지즈(StemCell Technologies: 캐나다 밴쿠버)로부터 입수한 성장 배지 중에서 제조사의 설명서에 따라 배양하고, 계대접종하였다. HMSC의 골형성 분화는 항생제 및 10% 열 불활성화된 FBS, 10-8 M 덱사메타손, 10 mM βGP, 및 0.2 mM 아스코르베이트를 함유하는, 글루코스 저함유 DMEM 중에서 세포를 처리함으로써 유도하였다.

알칼리성 포스파타제 활성 및 본 코사 염색법

전세포 추출물에 대한 알칼리성 포스파타제 (ALP) 활성 검정법 (13,14), 및 무기질화에 대한 세포 단일층의 본 코사 염색법 (16)을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다.

정량적 RT - PCR

암비온 인코퍼레이티드(Ambion, Inc.: 미국 텍사스주 오스틴)로부터 입수한 RNA 단리용 트리졸(Trizol) 시약을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 전체 RNA를 추출하였다. 바이오-래드(Bio-Rad: 미국 캘리포니아주 허큘리스)로부터 입수한 역전사 효소를 이용하여 RNA (1 ㎍)를 역전사시킴으로써 단일 가닥 cDNA를 제조하였다. iQ SYBR 그린 슈퍼믹스(iQ SYBR Green Supermix) 및 i사이클러 RT-PCR 디텍션 시스템(iCycler RT-PCR Detection System) (바이오-래드)을 사용하여 Q-RT-PCR 반응을 수행하였다. 마우스 유전자 Gli-1, 패치드1(Patched1) (Ptch1), 알칼리성 포스파타제 (ALP)의 골-간-신장 이소자임, 골 시알로프로테인 (BSP), Runx2, 오스테릭스 (OSX), 오스테오칼신 (OCN) 및 GAPDH에 대한 프라이머 서열을 앞서 기술된 바와 같이 사용하였다 (14). 인간 프라이머 서열은 GAPDH 5'-CCT CAA GAT CAT CAG CAA TGC CTC CT (서열 1) 및 3'-GGT CAT GAG TCC TTC CAC GAT ACC AA (서열 2), BSP 5'-AGA AGA GGA GGA GGA AGA AGA GG (서열 3) 및 3'-CAG TGT TGT AGC AGA AAG TGT GG (서열 4), OSX 5'-GCG GCA AGA GGT TCA CTC GTT CG (서열 5) 및 3'-CAG GTC TGC GAA ACT TCT TAG AT (서열 6)였고; 상대적인 발현 수준은 앞서 기술된 바와 같은 2ΔΔCT 방법을 이용하여 계산하였다 (15).

일시적 형질감염 및 Gli -의존성 리포터 검정법

본 발명자들에 의해 앞서 기술된 바와 같이 (17,18), 24웰 플레이트 중의 70% 전면생장 상태인 세포를 Gli-의존성 반딧불이 루시페라제 및 레닐라(Renilla) 루시페라제 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. FuGENE 6 형질감염 시약 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))을 뉴클레아제를 함유하지 않는 물과 함께 3:1의 비로 사용하였고, 웰당 전체 DNA는 500 ng을 초과하지 않았다. 세포를 48시간 동안 처리한 후, 듀얼 루시페라제 리포터 어세이 시스템(Dual Luciferase Reporter Assay System) (프로메가 코포레이션(Promega Corporation: 미국 위스콘신주 매디슨))을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 루시페라제 활성을 평가하였다.

Oxy133 합성 및 분자 특징 규명

물질은 상업적 공급업체로부터 입수하였고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 오븐 건조된 유리 제품 및 표준 시린지/격벽 기법을 사용하여 아르곤 분위기하에서 대기 감응성 또는 감습성 반응을 수행하였다. UV 광 (254 nm) 하에서 실리카 겔 TLC 플레이트 상에서 반응을 모니터링한 후, 하네시안(Hanessian) 염색액을 이용하여 시각화하였다. 실리카 겔 60 상에서 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. CDCl3에서 1H NMR 스펙트럼을 측정하였다. 수득된 데이터는 하기와 같이 내부 표준 (TMS, 0.0 ppm)으로부터 ppm으로 기록하였다: 화학적 이동 (다중도, 적분, 결합 상수 (Hz)). 중간체 및 최종 생성물에 대한 합성 프로토콜 및 특징 규명에 관한 단계식의 상세한 설명은 보충 자료(Supplemental Material)에 제공되어 있다.

스무슨드 결합 검정법

본 발명자들에 의해 앞서 보고된 바와 같이 (19), 옥시스테롤과 스무슨드 (Smo) 사이의 상호작용을 조사하였다. Smo-/-: YFP-Smo 세포 (20)를 저장성 SEAT 완충제 (250 mM 수크로스, 1 mM EDTA, 10 mM 아세트산, 10 mM 트리에탄올아민, 10 mg/mL 류펩틴-펩스타틴-키모스타틴 (LPC) 프로테아제 억제제 믹스 및 시그마패스트 EDTA-프리(SigmaFast EDTA-Free) 프로테아제 칵테일) 중에서 용해시켰다. 원심분리 (500xg, 5 min)에 의해 핵을 제거한 후, 30 min 동안 95,000xg로 원심분리하여 막을 펠릿화하였다. 4℃에서 4시간 동안 n-도데실-b-D-말토피라노시드 (DDM) 추출용 완충제 (50 mM 트리스 (pH 7.4), 500 mM NaCl, 10% v/v 글리세롤, 0.1% w/v DDM 및 시그마패스트 EDTA-프리 프로테아제 칵테일) 중에서 막을 추출한 후, 원심분리 (100,000xg, 30 min)에 의해 불용성 물질을 제거하였다. nat-20(S)-yne에 커플링된 자기 비드 또는 대조군 자기 비드를 첨가하기 전에, 상기 막 추출물을 50 uM 유리 20(S) 또는 Oxy133 또는 Oxy16 (Hh 신호전달을 활성화시키지 않는 옥시스테롤 유사체; 문헌 [Parhami et al.], 관찰 결과는 공개되지 않음)과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다 (19). 결합 반응물을 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 모든 실험에서는 주의를 기울여 각 샘플 중 용매의 양이 같아지도록 만들었다. 철저하게 세척한 후, 비드 상에 포획된 단백질을 환원 SDS 샘플 완충제로 용리시켰다. 항-GFP 항체 (노부스(Novus), NB600-308, 1:5,000)를 이용하는 정량적 면역블롯팅 및 적외선 영상화 (Li-코르 오딧세이(Li-Cor Odyssey) 시스템)에 의해 상기 용리액 중 YFP-Smo의 존재를 측정하였다.

동물

8주령된 수컷 루이스(Lewis) 래트 38마리를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories: 미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 구입하고, UCLA 오피스 오브 프로텍션 오브 리서치 서브젝츠(UCLA Office of Protection of Research Subjects)에 의해 제시된 규칙에 따라 UCLA 동물 사육장에서 유지시키고, 하우징하였다. UCLA 애니멀 리서치 커미티(UCLA Animal Research Committee: ARC)에 의해 승인받은 프로토콜 하에서 연구를 수행하였다. 모든 동물을 척추 유합 수술 후 8주 경과하였을 때 표준 CO2 챔버를 사용하여 안락사시키고, 그의 척추를 절개하여 40% 에틸 알콜 중에 보관하였다.

외과적 처치

수술 30분 전에 부프레노르핀을 지속적으로 방출시킴으로써 동물을 사전 약물 처리하고, 산소 중에 투여된 2% 이소플루란으로 마취시켰다 (1 L/min). 수술 부위를 면도하고, 베타딘(Betadine) 및 70% 에탄올을 이용하여 소독하였다. 종래 연구에서와 같이 (21,22), L4-L5에서 후측방 가로 돌기간 척추 유합술을 수행하였다. 표식물로서 장골능을 이용하여 L6 척추체를 확인하였다. 요배근막 아래로 L4-L5에 걸쳐 피부 및 피하 조직을 통해 4 cm의 종방향 정중선 절개를 실시하였다. 이어서, L4-L5의 가로 돌기가 양측으로 노출될 수 있도록 척추 주위 근육에서 2 cm의 종방향 중막 주위 절개를 실시하고, 고속 버어(burr)를 이용하여 피질을 제거하였다. 이어서, 수술 부위를 멸균 염수로 세척하고, 디메틸 술폭시드 (DMSO) 대조군, rhBMP-2, 또는 Oxy133을 함유하는 5 mm x 5 mm x 13 mm짜리 콜라겐 스폰지 조각 (헬리스타트(Helistat), 인테그라 라이프 사이언시즈(Integra Life Sciences))을 양측으로 배치하여 각 이식물은 가로 돌기에 걸쳐 있도록 하였다. 이어서, 이식물을 덮여 있던 척추 주위 근육 및 요배근막으로 덮고, 피부를 4-0 프롤렌(Prolene) 봉합사 (에티콘 인코퍼레이티드(Ethicon, Inc.: 미국 뉴저지주 소머빌))로 봉합하였다. 동물을 수술 후 즉시 임의대로 이동, 섭식, 및 음용할 수 있게 하였다.

방사선사진 분석

수술 4, 6, 및 8주째에 팩시트론 LX60 캐비넷 방사선 촬영 시스템을 이용하여 각 동물에서 요추 후전위 방사선사진 촬영을 하고, 하기 표준화된 척도를 이용하여 2명의 독립된 관찰자를 통해 맹검 방식으로 평가하였다: 0, 유합 없음; 1, 편측 유합; 및 2, 완전한 양측 유합. 관찰자로부터의 점수를 합산하였고, 점수가 4인 경우만을 완전하게 유합된 것으로 간주하였다.

유합에 대한 수동 평가

수술 후 8주 경과하였을 때, 동물을 안락사시키고, 척추를 외과적으로 제거하고, 2명의 맹검화된 독립 관찰자를 통해 분절 사이의 운동에 대해 평가하였다. 양측 관절면 또는 가로 돌기 사이에서 운동이 관찰되었다면, 유착 결여인 것으로 기록하였다. 양측에서 어떤 운동도 관찰되지 않았다면, 완전 유합인 것으로 기록하였다. 유합 또는 비유합으로 척추 점수를 매겼다. 만장일치인 경우에만 완전 유합인 것으로 간주하도록 하였다.

마이크로컴퓨터 단층촬영

본 발명자들이 앞서 보고한 바와 같이 (15), 3D 화소 등방성 해상도 20 ㎛ 및 X선 에너지 55 kVp 및 181 mA를 이용하여 스카이스캔(SkyScan) 1172 스캐너 (스카이스캔: 벨기에)를 사용함으로써 고해상도 마이크로컴퓨터 단층촬영 (마이크로CT)에 의해 각각의 제거된 척추를 분석하여 유합률을 추가로 평가하고, 유합 매스를 관찰하였다. 노출 시간 220 msec/슬라이스로 하여 각도 범위 180 °에 걸쳐 0.5씩 단계적으로 360개의 투영도를 획득하였다. 우수한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 각 회전 단계마다 5개 프레임의 평균을 구하였다. 아티팩트를 조장하는 빔을 최소화하기 위한 목적으로 X선 빔 주파수를 좁히기 위해 0.5 mm 알루미늄 필터를 사용하였다. 펠드캠프(Feldkamp) 알고리즘 (스카이스캔)에 기초한 콘 빔형 재구성 소프트웨어 버전 2.6을 사용하여 허상 슬라이스를 재구성하였다. 상기 설정 환경으로 일련의 횡단면 1024x 1024 픽셀 영상을 수득하였다. 데이터뷰어(DataViewer) (스카이스캔)를 이용하여 샘플 재배향 및 2D 시각화를 수행하였다. 돌핀 이미징(Dolphin Imaging) 버전 11 (돌핀 이미징 & 매니지먼트 솔루션즈(Dolphin Imaging & Management Solutions: 미국 캘리포니아주 채츠워스))을 이용하여 3D 시각화를 수행하였다. L4와 L5 가로 돌기 사이의 골 가교 연결이 양측으로 존재하는 것을 유합으로 정의하였다. 숙련된 2명의 독립 관찰자를 통해 유합 여부에 관하여 재구성된 영상을 판단하였다. 각 유합 매스 내에서 형성된 골의 밀도를 정량화하기 위해 매스의 조직 부피 (TV), 매스 내의 해면골 부피 (BV), BV/TV 비, 해면골 두께, 및 해면골 분리를 계산하였다. 이는 L4-5의 척추체간 분절 중앙에 위치하는 각 유합 매스 내의 축 방향의 501개의 슬라이스 (슬라이스당 20 um, 길이 10.02 mm)에 걸쳐 측정하면서, 데이터뷰어 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

조직학적 방법

마이크로CT를 수행한 후, 본 발명자들에 의해 앞서 보고된 바와 같이 (15,23), 각각의 수술 군으로부터의 2개의 대표 표본을 크실렌 중에서 세정하고, 메틸 메타크릴레이트 중에 포매시키면서, 탈수시킴으로써 탈회시키지 않고 프로세싱하였다. 일련의 관상 섹션을 5 um 두께로 절단하고, 톨루이딘 블루 (pH 6.4)로 염색하였다. 앞서 보고된 바와 같이 스캔스코프 XT 시스템(ScanScope XT System) (아페리오 테크놀러지즈 인코퍼레이티드(Aperio Technologies, Inc.: 미국 캘리포니아주 비스타))을 이용하여 10X (도 7a) 및 20X (도 7b) 확대 배율로 섹션의 현미경 사진을 얻었다 (24).

통계학적 분석

스테이트뷰(StatView) 5 프로그램을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 모든 p 값은 ANOVA 및 피셔 추정 최소 유의차(Fisher's projected least significant difference: PLSD) 유의성 검정을 사용하여 계산하였다. p < 0.05인 값은 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 II - Oxy133 합성 및 화학적 특징 규명

하기는 Oxy133의 화학 구조이다:

물질은 상업적 공급업체로부터 입수하였고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 오븐 건조된 유리 제품 및 표준 시린지/격벽 기법을 사용하여 아르곤 분위기하에서 대기 감응성 또는 감습성 반응을 수행하였다. UV 광 (254 nm) 하에서 실리카 겔 TLC 플레이트 상에서 반응을 모니터링한 후, 하네시안 염색액을 이용하여 시각화하였다. 실리카 겔 60 상에서 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. CDCl3에서 1H NMR 스펙트럼을 측정하였다. 수득된 데이터는 하기와 같이 내부 표준 (TMS, 0.0 ppm)으로부터 ppm으로 기록하였다: 화학적 이동 (다중도, 적분, 결합 상수 (Hz)). 하기는 프로토콜에 관한 단계식 설명이다. Oxy34 및 Oxy49의 구조, 본 발명자들에 의해 앞서 보고된 합성법 (문헌 [Johnson et al., (2011), Journal of Cellular Biochemistry 112, 1673-1684])은 Oxy133의 구조와의 비교를 위해 제시한다.

1-((3 S ,5 S ,6 S ,8 R ,9 S ,10 R ,13 S ,14 S ,17 S )-3,6- 비스 (( tert - 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) - 10,13-디 메틸헥사데카 히드로-1 H - 시클로펜타[a]페난트렌 -17-일) 에타논 (1)

공개된 특허 방법에 따라 제조된 것이다 (문헌 [Parhami et al., WO 2009/07386, p.52]).

( R )-2-((3 S ,5 S ,6 S ,8 R ,9 S ,10 R ,13 S ,14 S ,17 S )-3,6-비스(( tert - 부틸디메틸실릴 )옥시)-10,13- 디메틸헥사데카히드로 -1 H - 시클로펜타[a]페난트렌 -17-일) 옥트 -3-일-2-올 (2)

THF (6 mL) 중의 n-헥신 (1.5 mL, 12 mmol) 용액 (냉 용액 (0℃))에 헥산 (3.75 mL) 중의 1.6 M의 n-부틸리튬 용액을 첨가하였다. THF (10 mL) 중의 화합물 1 용액 (1.27 g, 2.2 mmol)을 캐뉼라를 통해 첨가할 때까지 생성된 용액을 30 min 동안 교반하였다. 혼합물을 3 h 동안에 걸쳐 실온으로 가온시키고, 물 (40 mL)로 희석시키고, 조 생성물을 에틸 아세테이트 추출 (3 x 30 mL)에 의해 단리시켰다. 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축시켜 오일성 생성물을 수득하고, 실리카겔 (헥산, 에틸 아세테이트, 구배) 상에서 정제하여 1.30 g의 생성물 2 (92%)를 수득하였다.

( S )-2-((3 S ,5 S ,6 S ,8 R ,9 S ,10 R ,13 S ,14 S ,17 S )-3,6-비스(( tert - 부틸디메틸실릴 )옥시)-10,13- 디메틸헥사데카히드로 -1 H - 시클로펜타[a]페난트렌 -17-일)옥탄-2-올 (3)

화합물 2 (1.3 g, 2.0 mmol)를 에틸 아세테이트 (5 mL) 중에 용해시키고, 메탄올 (5 mL) 및 Pd/C (10%, 0.1 g)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 진공하에서 반복적으로 탈기시킨 후, 대기압 하에서 (풍선) 수소 가스에 노출시켰다. 실온에서 18 h 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 (20 mL)로 희석시키고, 셀라이트(Celite)를 통해 여과시켜 촉매를 제거하였다. 여과물을 에틸 아세테이트로 세척하고, 혼합된 여과물을 증발시켜 1.3 g의 환원된 생성물 3을 수득하고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

(3 S ,5 S ,6 S ,8 R ,9 S ,10 R ,13 S ,14 S ,17 S )-17-(( S )-2-히드록시옥탄-2-일)-10,13- 디메틸헥사데카히드로 -1 H - 시클로펜타[a]페난트렌 -3,6- 디올 ( OXY133 )

THF 중 1 M의 TBAF 용액 (8 mL, 8 mmol, 4 당량)을 화합물 3 (1.3 g, 2.0 mmol, 1.0 당량)에 직접 첨가하고, 생성된 용액을 THF (1 mL)로 희석하고, 실온에서 72 h 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 물 (50 mL)로 희석시키고, 에틸 아세테이트 (4 x 40 mL)를 사용하여 반복적으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 실리카겔 크로마토그래피 (헥산, 에틸 아세테이트, 구배, 이어서 에틸 아세테이트 중 10% 메탄올)에 의해 조 생성물을 정제함으로써 백색 고체 (0.6 g, 70%)를 수득하고, 이를 수성 아세톤 (아세톤, 물, 3:1) 중에서 연화처리하여 0.5 g의 순수한 Oxy133을 수득하였다.

실시예 III - 실험 결과: 생체내 골 형성 및 척추 유합을 위한 골형성 자극

Oxy133 은 골수 기질 세포, 배아 섬유모세포 , 및 인간 중간엽 줄기 세포의 골형성 분화를 유도한다.

골전구 세포의 골형성 분화를 유도할 수 있는 분자를 개발하고자 하는 목적 달성을 위해, 본 발명자들은 앞서 합성된 100여 개의 유사체에서 관찰된 구조 활성 관계에 관한 본 발명자들의 이해에 기초하여 가장 강력한 골형성능을 가진, 골형성 자연 발생 옥시스테롤인 20(S)-히드록시콜레스테롤 (20S)의 분자 구조를 변형시켰다. 20S의 두 구조 유도체인 Oxy34 및 Oxy49를 사용함으로써 강력한 골형성 분화를 달성하였다고 본 발명자들은 앞서 보고한 바 있다 (15). 상기 분자들은 Oxy34 및 49 둘 모두에서는 탄소 6 (C6) 상에 α 히드록실 (OH) 기를 첨가함으로써, 및 Oxy49에서는 C25와 C27 사이에 이중 결합을 첨가함으로써 형성되었다 (도 1) (15). 여기서 보고된 연구에서, 본 발명자들은 각각 큰 동물 및 인간에서의 추후 임상전 및 임상 연구를 위해 대량으로 규모 확장하는 데 적합한, 합성이 더욱 용이하고, 더욱 강력한 효력을 가진 유사체를 개발함으로써 상기 두 분자를 추가로 개선시키고자 시도하였다. 상기 분자는 국소적으로는 척추 유합 및 골절 치유의 자극을 위해 골 형성을 증가시키고, 아마도 심지어 전신적으로는 장애, 예컨대 골감소증 및 골다공증을 처리하는 치료제 개발 및 임상적 용도를 위한 후보 물질이 될 수 있다. 구조 활성 관계 연구를 통해 신규한 유사체인 Oxy133을 실시예 II에 기술되어 있는 프로토콜에 따라 합성하였고, 골유도 활성에 대해 시험하였다. Oxy133은 C27이 결실되어 있고, 측쇄 길이가 탄소 1개만큼 연장되어 있다는 점에서 Oxy34 및 49와 상이하다 (도 1). 중요하게는, Oxy133는 Oxy34 및 Oxy49에 비하여 저렴한 상업적으로 이용가능한 출발 물질을 통해 유의하게 더 저렴한 생성물을 제조하기 때문에 대규모로 더욱 쉽게 제조될 수 있다. 또한, Oxy133의 제조에서 사용되는 알킨 첨가는 Oxy34 및 Oxy49의 합성에서 사용되는 그리냐르(Grignard) 화학법보다 수율, 생성물 순도 (부분입체선택성), 및 규모가변성 면에서 있어서 더 우수하다.

20S의 다른 구조 유사체와 비교하였을 때, C3H 및 M2 세포에서 알칼리성 포스파타제 (ALP) 활성 검정법으로 측정된 바, Oxy133은 놀랍게도 ALP 효소 활성을 유도하는 데 있어서 개선된 효력을 보였다. 본 발명자들이 앞서 다른 옥시스테롤 유사체에 대해서도 보고한 바와 같이 (15), 이는 골 형성 활성에 유용한 모델이다. Oxy133이 낮은 마이크로몰 (μM) 농도일 때, ALP 활성은 용량에 의존하여 증가하는 것으로 관찰되었다 (도 2a, b). Oxy133에 대한 EC50은 C3H 세포에서는 대략 0.5 uM이고 (도 2a), M2 세포에서는 0.44 μM인 것으로 나타났다 (도 2b). C3H 세포에서 Oxy34 및 Oxy49의 EC50은 각각 0.8 및 0.9 μM로, M2 세포에서 앞서 보고된 값과 유사한 것으로, 및 Oxy133의 EC50보다는 유의하게 더 높은 것으로 나타났다 (도 2a). 또한, C3H 세포에서 Oxy133은 고용량일 때, 유사한 용량의 Oxy34 및 Oxy49보다 더 높은 수준의 ALP 활성을 유도하였다 (도 2a). 골형성 분화 마커 유전자 Runx2, 오스테릭스 (OSX), ALP, 골 시알로프로테인 (BSP), 및 오스테오칼신 (OCN)의 발현 분석을 통해 Oxy133은 세포의 골형성 분화를 유도하는 데 있어 다른 유익한 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. C3H 세포에서, 2.5 μM Oxy133으로 처리하였을 때, 처리 후 4 및 7일째 Runx2 발현은 각각 2 및 3.2배 유도되었고, 이는 14일째에는 기준선 수준으로 복귀되었다 (도 3a). OSX 발현은 2일 후에는 유의하게 3배 유도되었고, 실험 전 기간 동안 높게 유지되었으며, 4.5배로 최대 유도에 도달하였다 (도 3a). Oxy133으로 C3H 세포를 처리하였을 때, ALP의 발현은 2일 후 18배 유도되었고, 4일 후에는 120배로 최대치에 도달하였으며, 이어서 7 및 14일 후에는 각각 22배로 하락하였다 (도 3a). BSP 발현은 4일째 9배로 최대로 유도되었고, 세포의 Oxy133에의 보다 장시간의 노출로 하락하였음에도 불구하고, 실험 지속 기간 동안 유도된 상태 그대로 유지되어 있다 (도 3a). Oxy133 처리는 또한 골모세포-특이 유전자인 오스테오칼신의 발현을 4일 후에는 2.8배 유도하였고, 처리 후 14일째에는 4.2배로 최대치에 도달하였다 (도 3a). Oxy133은 본 코사 염색법 (도 3b), 및 처리 후 21일째 정량적 세포외 기질 45Ca 검정법 (도 3c)으로 측정된 바, C3H 세포 배양물 중에서 강력한 기질 무기질화를 유도하였다. 상기 데이터를 통해 Oxy133의 골유도 옥시스테롤로서의 효능 및 효력이 입증되었다.

처리 후 1주, 2주 및 4주째에 골 형성 유전자의 발현을 평가함으로써 1차 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)에서 Oxy133의 골 형성 효과 또한 조사하였다. 미처리 세포에서는 ALP 발현이 모든 시점에서 높았고, Oxy133 처리시에는 어떤 변화도 없었다 (데이터 나타내지 않음). 1주 경과 후, BSP 발현은 2배로 유의하게 증가한 것으로 관찰되었고, 이는 2 및 4주 후에는 4배까지 추가로 증가하였다 (도 3d). Oxy133은 또한 4주 후 OSX (3배) 및 OCN (2배)의 유의한 유도를 유도하였다 (도 3d). 추가로, 본 코사 염색법으로 입증된 바, Oxy133은 처리 후 5주째에 1차 인간 MSC 세포의 배양물 중에서 강력한 세포외 기질 무기질화를 자극하였다 (도 3e).

Oxy133 은 헤지호그 경로 신호전달의 활성화를 통해 골형성 분화를 유도한다

종래 연구를 통해 20S 및 그의 구조 유사체인 Oxy34 및 Oxy49가 Hh 경로 신호전달의 활성화를 통하여 골형성 분화를 유도하는 것으로 입증되었다 (15). 그러나, Hh 경로 신호전달의 골 형성 옥시스테롤-매개 활성화에 대한 분자 기전에 대해서는 앞서 알려진 바 없었다. Oxy133은 그의 골 형성 활성이 더 크다고 가정할 때, 반-합성 옥시스테롤에 의해 Hh 경로 활성화 및 골 형성을 달성할 수 있게 하는 분자 기전을 확인하는 데 있어 유용한 도구가 된다. Oxy133이 Hh 경로를 통해 골형성 분화를 유도하는지 여부, 및 그와 같이 유도하는 방법을 측정하기 위해, 선택적 Hh 경로 억제제인 시클로파민이 Oxy133 유도성 ALP 활성, 및 골형성 분화 마커인 ALP, BSP, 및 OSX의 발현에 미치는 효과를 조사하였다. 시클로파민은 C3H 세포 (도 4a)에서 뿐만 아니라, M2 세포에서도 (데이터 나타내지 않음) Oxy133 유도성 ALP 활성 및 골 형성 마커인 ALP, BSP, 및 OSX의 발현을 완전히 억제시켰는데, 이는 Oxy133이 Hh 신호전달 경로를 통해 작용한다는 것을 시사하는 것이다. Oxy133에 의한 Hh 신호전달의 활성화를 추가로 분석하기 위해, 앞서 보고된 방법을 사용하여 (15,17), C3H 세포 내로 형질감염된 Gli-의존성 루시페라제 리포터의 활성화를 조사하였다. Oxy133은 Gli-의존성 리포터 활성의 용량-의존성 증가를 유도하였고, 100 nM Oxy133에서는 5배 유도 및 1 μM Oxy133에서는 17배 유도에 도달하였다 (도 4b).

Oxy133 은 스무슨드 수용체에의 결합에 의해 헤지호그 신호전달 경로를 활성화시킨다

본 발명자들은 앞서 20S이 Smo 수용체에의 결합에 의해 Hh 신호전달을 선택적으로 활성화시킨다고 보고하였다 (19). Oxy133도 같은 기전에 의해 Hh 신호전달을 활성화시키는지 여부를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 자기 비드에 커플링된 20S 유사체와 결합하는 YFP-태그부착된 Smo (YFP-Smo)에 대해 경쟁할 수 있는 Oxy133의 능력에 대해 시험하였다. 본 발명자들이 앞서 보고한 바와 같이, 상기 유사체, nat-20S-yne은 이소-옥틸 쇄 상에 알킨 모이어티를 함유하고, 이를 통해 자기 비드 (20S-비드)에의 클릭 화학 매개 커플링이 이루어질 수 있었다 (19). 스테롤-결합 검정을 위해 상기와 같은 비드를 사용하여, 비-경쟁자 샘플에 대해 상대적인, 비드 상에 남아있는 YFP-Smo의 양을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 20S와 같은 부위에서 Smo에 결합하는 화합물은 20S-비드와 경쟁하고, 용리액 중 단백질의 양을 감소시킨다. 본 발명자들은 Smo 결합 검정법 및 Hh 신호전달 검정법 둘 모두로 다수의 다른 스테롤을 시험하였고, 모든 경우에서, Smo에의 결합은 Hh 경로 활성 변화와 상관관계가 있었다 (19). 양성 대조군인 Oxy133 및 20S 둘 모두 20S-커플링된 비드 상에 포획된 YFP-Smo의 양을 감소시켰다 (도 4c). 중요 대조군에서, Hh 신호전달 또는 골 형성을 활성화시킬 수 없는 구조상 관련된 유사체인 Oxy16 (문헌 [Parhami et al.], 관찰 결과는 공개되지 않음)은 YFP-Smo와 20S-비드 사이의 상호작용을 막지 못했다 (도 4c). 유리 Oxy133의 존재하에서 20S-비드에 의해 포획된 YFP-Smo의 양이 상기와 같이 감소하였다는 것은 Oxy133이 20S와 같은 Smo 상의 부위에 결합한다는 것을 시사한다. 주로 본 발명자들은 추출물 중 YFP-Smo의 농도 및 비드 상에 생산적으로 고정화된 20S의 양에 대해 알지 못하는 바, 본 발명자들의 검정법은 반-정량적인 것이며, 상호작용에 대한 Kd를 도출하는 데에는 사용될 수 없다는 것을 강조하는 것이 중요하다.

Oxy133 은 생체내에서 골 형성 및 척추 유합을 자극한다

오직 수술 부위에의 콜라겐 스폰지 내에 함유되는 시약만을 달리하는 5개의 처리군으로 8주령된 루이스 래트를 나누었다: I 군 - 대조군 비히클 (DMSO) 단독 (n=7), II군 - 5 ㎍ rhBMP-2 (n=8), III 군 - 20 mg Oxy133 (n=7), IV군 - 2 mg Oxy133 (n=8), 및 V군 - 0.2 mg Oxy133 (n=8). 방사선사진 분석을 통해 수술 후 다양한 시점에, 및 희생시에는 수동 평가, 마이크로컴퓨터 단층촬영, 및 조직학적 방법을 사용하여 골 형성 및 척추 유합을 평가하였다. 희생시의 유합률이 하기 표 1에 요약되어 있다.

방사선사진 분석

수술 후 4주째에 1차 방사선사진 세트 분석을 수행하였다. 이 시점에, BMP2 군에서는 8마리 동물 중 8마리에서, Oxy133-20 mg 군에서는 7마리 동물 중 6마리에서, Oxy133-2 mg 군에서는 8마리 동물 중 3마리에서, 양측 유합이 관찰되었고, 대조군 및 Oxy133-0.2 mg 군에서는 어떤 유합도 관찰되지 않았다. Oxy133-20 mg으로 처리된 동물 중 나머지 동물, 및 Oxy133-2 mg으로 처리된 동물 중 3마리 동물에서 편측 유합이 관찰되었다. 이는, 시점 4주째에 어떤 유합도 관찰되지 않았던 Oxy34 및 49를 이용한 종래 연구와 대조를 이룬다 (15). 6주째까지, Oxy133-20 mg 군의 모든 동물에서는 양측 유합이 이루어졌다. 8주째, BMP2 및 Oxy133-20 mg 군에서는 모든 동물에서 유합이 관찰되었고, Oxy133-2 mg 군에서는 8마리 중 4마리에서 관찰되었다 (도 5). 마지막 8주째의 방사선사진에서 DMSO 또는 Oxy133-0.2 mg 군에서는 어떤 유합 매스도 관찰되지 않았다 (데이터를 나타내지 않음) (도 5).

골 형성에 대한 수동 평가 및 육안 평가

희생 후, 각 동물로부터 척추를 이식시키고, 본 발명자들이 앞서 기술한 바와 같이 (15,25-27), 수동 평가하였다. 육안 평가 및 수동 평가 결과는 8주째의 방사선사진 소견과 유사하였다. DMSO 또는 Oxy133-0.2 mg 군에서는 어떤 편측 또는 양측 유합도 관찰되지 않았다. Oxy133-0.2 mg 군 중 2마리에서 일부 골 형성이 관찰되었다. BMP2 군 중 모든 동물에서, 및 Oxy133-20 mg 군 중 7마리의 동물 중 6마리에 양측 유합이 관찰되었다. Oxy133-20 mg 군 중 나머지 동물에서는 상당한 양측 유합 매스에도 불구하고 편측 운동이 있는 것으로 나타났다. Oxy133-2 mg 군 중 절반 (8마리 중 4마리)의 동물에서는 수동 촉진을 통해 양측 유합을 확인할 수 있었고, 동시에 추가로 2마리의 동물에서는 편측 유합이 관찰되었고, 2마리 동물에서는 어떤 유합도 보이지 않았다.

마이크로컴퓨터 단층촬영 및 조직학적 평가

방사선사진, 육안 관찰 결과, 및 수동 촉진으로 관찰되 결과를 마이크로CT 분석을 이용한 해면골 가교 연결에 대한 평가를 통해 확인하였다 (도 6). 비록 Oxy133-0.2 mg 군 중 2마리의 동물에서 일부 골 형성이 관찰되기는 하였지만, 상기 군 또는 DMSO 군에서는 어떤 양측 유합도 관찰되지 않았다. BMP2 군 및 Oxy133-20 mg 군의 모든 동물에서 양측 해면골 가교 연결이 관찰되었다. 또한, Oxy133-2 mg 군에서는 8마리의 동물 중 4마리에서 양측 유합이 관찰되었고, 추가로 2마리의 동물에서는 편측 유합이 관찰되었다. 마이크로CT 영상으로부터의 미세구조 분석 결과는 하기 표 2에 제시되어 있다. BMP2 유합 매스의 전체 부피는 Oxy133-2 mg 및 20-mg 샘플 둘 모두에서의 것보다 유의하게 더 컸다. 그러나, Oxy133-2 mg 및 20-mg의 유합 매스의 평균 BV/TV 비는 BMP2 군보다 유의하게 더 컸으며, 이는 매스 내의 골이 더욱 조밀하다는 것을 나타낸다. BMP2와, Oxy133-2 mg 또는 Oxy133-20 mg 사이에 해면골 두께에 있어서는 어떤 유의한 차이는 없었다. Oxy133-2 mg 및 Oxy133-20 mg와 비교하여 BMP2 유합 매스에서 해면골 분리가 유의하게 더 컸으며, 이 또한 BMP2 유합 매스에서의 골 밀도가 더 작다는 것을 나타낸다.

이어서, DMSO 군, BMP2 군, Oxy133-20 mg 군, 및 Oxy133-2 mg 군 중 2마리의 대표 동물에서 조직학적 분석을 수행하였다. BMP2로, 또는 2 또는 20 mg 용량의 Oxy133으로 처리된 래트에서 유합 매스 내의 해면골 형성 및 완전하게 유합된 요추의 가로 돌기를 연결하는 연속 피질골 형성이 조직학적 평가를 통해 입증되었다 (도 7a). 대조군 래트로부터의 표본에서 골 형성은 없었다. 20 mg 또는 2 mg의 Oxy133과 비교하여 BMP2로 처리된 래트에서 유합 매스의 크기는 증가되었다. 그러나, 조직학적 표본에 대한 육안 검사 결과, BMP2는 또한 유합 매스 내에 지방세포의 형성도 강력하게 유도한 것으로 나타났는데, 이는 Oxy133으로 처리된 군에서는 유의하게 더 적었던 것이다 (도 7b). 추가로, 해면골 형성은 BMP2 군과 비교하여 Oxy133-20 mg 군에서 더욱 강력하게 이루어졌다는 것이 육안 검사를 통해 제안되었다.

실시예 IV - 지방생성 억제

종래 방법을 사용하여 C3H10T1/2 골-지방-전구 세포를, 지방세포 형성을 유도하는 것으로 보고된 바 있는 PPAR감마 활성제인 트로글리타존 ("Tro")으로 처리하였다. 2주 후, 오일 레드 O(Oil Red O) 염색법에 의해 Tro로 처리된 웰에서의 지방생성을 시각화하고, 광학 현미경법으로 지방세포를 정량화하였다. 골형성 분화 및 Hh 신호전달 둘 모두를 유도하는 용량에서 Oxy133은 지방세포 형성을 완전하게 억제시킨 것으로 명확하게 나타났다. 하기는 데이터이다 (관측 시야당 지방세포의 평균값≠SD):

관측 시야≠SD):

대조군: 2.5≠2

Tro: 28≠4

Tro + Oxy133 (5 uM): 0.5≠1

Oxy133 (5 uM): 0.8≠1

대조군 대 Tro 대 Tro + Oxy133에 대한 p 값은 < 0.01의 유의도에 도달하였다.

상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징들을 쉽게 확인할 수 있고, 그의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이, 다양한 용법 및 조건에 맞게 적합화시키기 위하여, 및 본 발명을 충분히 이용하기 위하여 본 발명을 변형 및 수정할 수 있다. 상기의 바람직한 구체적인 실시양태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 2012년 5월 7일 출원된 미국 가출원 61/643,746을 비롯한, 상기 인용된 모든 출원, 특허, 및 공개 문헌의 전체 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함되며, 특히 본 출원에서 인용된 개시내용에 대해서 그러하다. 또한, WO/2008/115469, WO/2008/082520, WO/2007/098281, WO/2007/028101, WO/2006/110490, WO/2005/020928, 및 WO/2004/019884로서 공개된 특허 협력 조약 (PCT) 국제 출원을 비롯한, 옥시스테롤에 관한 본 발명자들의 실험으로부터의 다른 출원들 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> OXYSTEROL ANALOGUE OXY133 INDUCES OSTEOGENESIS AND HEDGEHOG SIGNALING AND INHIBITS ADIPOGENESIS <130> PC147332 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <220> <223> Inventor: PARHAMI, Farhad; JUNG, Michael, E.; STAPPENBECK, Frank <400> 1 cctcaagatc atcagcaatg cctcct 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 aaccatagca ccttcctgag tactgg 26 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 agaagaggag gaggaagaag agg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 ggtgtgaaag acgatgttgt gac 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 gcggcaagag gttcactcgt tcg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 tagattcttc aaagcgtctg gac 23

Claims

하기 화학식 I을 갖는 화합물 Oxy133 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
<화학식 I>
화합물 Oxy133 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 생물활성 조성물.
제2항에 있어서, 부갑상선 호르몬, 플루오린화나트륨, 인슐린-유사 성장 인자 I (ILGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II (ILGF-II), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 시토크롬 P450 억제제, 골형성 프로스타노이드, BMP2, BMP4, BMP7 및 BMP14로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 작용제를 추가로 포함하는 생물활성 조성물.
골 장애, 골다공증 또는 골절을 갖는 대상체에게 유효량의 제2항의 생물활성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골 장애, 골다공증 또는 골절을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
제4항에 있어서, 골 질량을 증가시키기기 위해 선택 간격으로 유효 투여 형태의 생물활성 조성물을 치료 유효 용량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 골다공증의 증상을 호전시키기기 위해 선택 간격으로 유효 투여 형태의 생물활성 조성물을 치료 유효 용량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
골형태형성(osteomorphogenesis) 및/또는 골증식(osteoproliferation)의 증가를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제2항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골형태형성 및/또는 골증식의 증가를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
골 질량을 증가시키기기 위해 선택 간격으로 유효 투여 형태의 제2항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골 형성을 유도하도록 대상체를 치료하는 방법.
포유동물 중간엽 줄기 세포를 유효량의 제2항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 포유동물 중간엽 줄기 세포가 대상체의 골수 기질 세포인, 포유동물 중간엽 줄기 세포의 골모세포 분화를 유도하고/거나 지방세포 분화를 억제시키는 방법.
황색종 형성, 지방 패드의 국소 축적 및 비만을 갖는 대상체에게 유효량의 제2항의 생물활성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 황색종 형성, 지방 패드의 국소 축적 및 비만을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
세포 또는 조직을 유효량의 제2항의 생물활성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 또는 조직에서 헤지호그 (Hh) 경로 매개 반응을 자극시키는 방법.
제11항에 있어서, 헤지호그 (Hh) 경로 매개 반응이 골모세포 분화, 골형태형성, 골증식의 자극, 및/또는 지방세포 분화, 지방세포 형태형성 및/또는 지방세포 증식의 억제인 방법.
제11항에 있어서, 헤지호그 (Hh) 경로 매개 반응이 모발 성장의 자극인 방법.
제11항에 있어서, 헤지호그 (Hh) 경로 매개 반응이 혈관신생의 자극인 방법.
제14항에 있어서, 심혈관 장애, 동맥경화증, 심근경색, 말초 혈관 질환 및/또는 졸중을 치료하기 위한 방법.
제11항에 있어서, 헤지호그 (Hh) 경로 매개 반응이 연골 형성의 자극인 방법.
제16항에 있어서, 골관절염을 치료하기 위한 방법.
포유동물 중간엽 줄기 세포를 수거하고;
포유동물 중간엽 세포를 제2항의 생물활성 조성물로 처리하여 세포의 골모세포 분화를 유도하고;
분화된 세포를 대상체에게 투여하는 것
을 포함하는, 골 형성을 유도하도록 대상체를 치료하는 방법.
제4항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 생물활성 조성물이 대상체의 세포, 조직 또는 기관에 국소 투여되는 것인 방법.
포유동물 세포를 유효량의 제1항의 화합물에 노출시키는 것을 포함하는, 미처리 세포에서의 골모세포 분화의 생물학적 마커의 수준보다 더 높은 수준으로 상기 생물학적 마커를 발현하도록 포유동물 세포를 자극시키는 방법.
제20항에 있어서, 생물학적 마커가 알칼리성 포스파타제 활성, 칼슘 혼입, 무기질화 및/또는 오스테오칼신 mRNA의 발현인 방법.
제20항에 있어서, 포유동물 세포가 중간엽 줄기 세포, 골전구 세포, 또는 두개골 기관 배양물 내의 세포인 방법.
제20항에 있어서, 세포 또는 조직이 시험관내 존재하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 세포 또는 조직이 생체내 존재하는 것인 방법.
표면을 갖는 기재를 포함하는 이식물이며, 여기서 이식물의 표면 또는 내부는 주변 골 조직에서 골 형성을 유도하는 데 충분한 양의 제2항의 생물활성 조성물을 포함하는 것인, 인간 또는 동물 체내에서 사용하기 위한 이식물.
제25항에 있어서, 기재가 핀, 스크류, 플레이트 또는 인공 관절의 형상으로 형성된 것인 이식물.