KR20150005951A - 효소 변경된 대사 산물의 활성 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돌연변이 알코올 데히드로게나아제 효소, 이를 포함하는 미생물, 및 미생물 발효에 의해 하나 이상의 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돌연변이 알코올 데히드로게나아제(dehydrogenase) 효소, 이를 포함하는 미생물, 및 미생물 발효에 의한 하나 이상의 생성물의 제조 방법에 관한 것이다.
미생물을 이용한 발효에 의한 에탄올 또는 부탄올과 같은 알코올의 생성은 공지되어 있으며, 수세기 이래로 산업적으로 이용되어 왔다. 역사적으로, 에탄올 발효는 가장 큰 공정이다. 아세톤-부탄올-에탄올(ABE) 발효는 두 번째의 가장 큰 발효 공정으로 간주되며(문헌[Duerre P: Production of solvents. In: Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005: 671-696]), 중국과 같은 나라에서의 현재의 생산 능력은 1,000,000톤을 초과한다(문헌[Ni Y and Sun Z: Recent progress on industrial fermentative production of acetone-butanol-ethanol by Clostridium acetobutylicum in China. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 83: 415-423]). 일반적으로 부탄올은 용매 또는 바이오연료로서 사용되는 반면, 아세톤은 원치 않는 부산물로 간주된다(문헌[Duerre P: Production of solvents. In: Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005: 671-696]). 클로스트리듐 베이제린키이(Clostridium beijerinckii)의 몇 가지 단리체는 2차 알코올 데히드로게나아제로 인하여 아세톤 대신 이소프로판올을 생성하는 것으로 공지되어 있다(문헌[George HA, Johnson JL, Moore WEC, Holdeman LV, Chen JS: Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45: 1160-1163]). 이소프로판올은 부탄올과 유사한 특성을 가지며, 아세톤에 비하여 유익하다. 그러나, 환원은 그다지 효율적이지 않으며, 각각의 클로스트리듐 베이제린키이 주는 양호한 역치를 생성하지 않고, 유용한 생산주로 간주되지 않는다.
최근에, 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)은 씨. 베이제린키이(C. beijerinckii) 유래의 2차 알코올 데히드로게나아제를 사용한 이소프로판올 생성용으로 대사적으로 엔지니어링되었지만(문헌[Lee et al, 2012: Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824 for isopropanol-butanol-ethanol fermentation, Appl . Environ . Microbiol . 78: 1416-1423]), 고도로 효율적인 알코올 데히드로게나아제가 이 과정의 최적화에 요구된다.
ABE 발효의 난제는 모든 공지된 유기체가 당 또는 전분계 기질에 의존한다는 것이다. 아세톤 및 이소프로판올과 같은 화학적 생성물의 생성에 적합한 많은 탄수화물 공급 원료의 비용은 인간용 식품 또는 동물용 사료로서의 그의 가치에 의해 영향을 받으며, 이러한 생성을 위한 전분 또는 수크로스 생성 작물의 경작이 모든 지형에서 경제적으로 지속가능한 것은 아니다. 따라서, 더욱 낮은 비용 및/또는 더욱 풍부한 탄소 자원을 유용한 화학적 생성물, 예컨대 아세톤 및 이소프로판올로 전환시키는 기술을 개발하는 것이 관심의 대상이다.
CO는 유기 물질, 예컨대 석탄 또는 오일 및 오일 유래된 생성물의 불완전 연소의 주요한 자유 에너지 풍부 부산물이다. 예를 들어, 오스트레일리아에서의 철강 산업은 매년 500,000톤 초과의 CO를 생성하여 대기 중으로 방출하는 것으로 보고되어 있다. 아세트산 생성(acetogenic) 유기체, 예컨대 밀접하게 관련된 미생물인 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 씨. 륭달리이(C. ljungdahlii), 및 씨. 락스달레이(C. ragsdalei)는 유일한 에너지 및 탄소 공급원으로서 CO 또는 CO2/H2 함유 가스에서 화학 합성 독립 영양적으로 성장할 수 있으며, 아세테이트, 에탄올 또는 2,3-부탄디올과 같은 생성물을 합성하지만, 아세톤도 합성하지 못하고 이소프로판올도 합성하지 못한다(문헌[Munasinghe PC, Khanal SK: Biomass-derived syngas fermentation into biofuels: Opportunities and challenges. Bioresource Technol 2010, 5013-22]).
최근에, 100 L 파일럿 규모(pilot scale) 발효기에서 스위치그래스(switchgrass) 유래된 합성가스(syngas)로부터 이소프로판올을 생성하는 것이 클로스트리듐 락스탈레이 (Clostridium ragsdalei)(클로스트리듐 주 P11)에 대한 연구에서 보고되었다(문헌[[Kundiyana DK, Huhnke RL, Wilkins MR: Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor: Design and process considerations. J Biosci Bioeng 2010, 109: 492-498]). 그러나, 동일 실험실로부터의 관련 연구에 의하면, 이것은 사용된 합성가스가 20% 아세톤을 함유하는 스크러빙(scrubbing) 혼합물에 통과되었기 때문에 사용된 합성가스 중 오염물로 인한 것임이 나타났다(문헌[Ramachandriya KD: Effect of biomass generated producer gas, methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridium strain P11. Masters thesis, Oklahoma State University 2009]; 문헌[Ramachandriya KD, Wilkins MR, Delorme MJM, Zhu X, Kundiyana DK, Atiyeh HK, Huhnke RL: Reduction of acetone to isopropanol using producer gas fermenting microbes. Biofuels Environ Biotechnol, 2011, epub]). 그러나, 상기 저자는 클로스트리듐 락스탈레이(클로스트리듐 주 P11)에 의한 아세톤의 이소프로판올로의 환원을 확인하였으며, 2차 알코올 데히드로게나아제의 존재에 대하여 추측하였지만, 어떠한 증거도 찾을 수 없었다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 불리한 점들 중 하나 이상을 극복하거나, 적어도 유용한 선택을 대중에게 제공하는 것이다.
본 발명자는 예를 들어 이소프로판올 및/또는 하나 이상의 다른 생성물을 CO로부터 생성하는 데 사용되거나 아세톤-부탄올-에탄올(ABE) 발효를 이소프로판올-부탄올-에탄올(IBE) 발효로 업그레이드시키거나 MEK를 2-부탄올로 전환시키는 데 사용될 수 있고, 지정 돌연변이 유발(directed mutagenesis)에 의해 효소의 특성, 예컨대 기질 및/또는 보조 인자 특이성이 최적화된 씨. 오토에타노게눔에서의 신규한 1차:2차 알코올 데히드로게나아제를 동정하였다.
본 발명의 일 측면에서, 1 이상의 제1 기질에 대한 특이성이 1 이상의 제2 기질에 비하여 증가된 알코올 데히드로게나아제가 제공되며, 여기서, 상기 1 이상의 제1 기질 및 상기 1 이상의 제2 기질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알코올 데히드로게나아제는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 적어도 하나 이상의 돌연변이를 포함한다:
제1 기질은 아세톤이며, 제2 기질은 MEK임;
제1 기질은 아세톤이며, 제2 기질은 아세트알데히드임;
제1 기질은 아세톤이며, 제2 기질은 아세토인임;
제1 기질은 MEK이며, 제2 기질은 아세트알데히드임;
제1 기질은 MEK이며, 제2 기질은 아세토인임;
제1 기질은 아세토인이며, 제2 기질은 아세톤임;
제1 기질은 아세토인이며, 제2 기질은 MEK임;
제1 기질은 아세토인이며, 제2 기질은 아세트알데히드임;
제1 기질은 아세트알데히드이며, 제2 기질은 아세톤임;
제1 기질은 아세트알데히드이며, 제2 기질은 아세토인임; 및,
제1 기질은 아세트알데히드이며, 제2 기질은 MEK임.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 2가지 또는 3가지 제2 기질에 비하여 1가지, 2가지 또는 3가지 제1 기질에 대하여 증가된 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 1가지, 2가지 또는 3가지 제2 기질에 비하여 2가지 또는 3가지 제1 기질에 대하여 증가된 특이성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 NADPH 보조 인자에 비하여 NADH 보조 인자에 대하여 증가된 특이성을 갖는 알코올 데히드로게나아제를 제공하며, 여기서, 알코올 데히드로게나아제는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 적어도 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 보조 인자로서 NADH를 이용하는 알코올 데히드로게나아제를 제공하며, 여기서, 알코올 데히드로게나아제는 보조 인자로서 NADPH를 이용하는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 적어도 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정한 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 MEK 및/또는 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 특이성을 갖는다.
특정한 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 아세톤 및/또는 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 특이성을 갖는다.
특정한 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 아세톤 및/또는 MEK 및/또는 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 특이성을 갖는다.
특정한 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 아세톤 및/또는 MEK 및/또는 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 특이성을 갖는다.
특정한 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 기질로서 아세토인을 이용하는 능력이 실질적으로 전혀 없다. 특정한 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 기질로서 아세토인을 이용하는 능력이 실질적으로 전혀 없지만, 기질로서 아세톤, MEK 및/또는 아세트알데히드를 이용할 수 있다.
일 실시 양태에서, 상기 적어도 1개의 돌연변이는 서열 번호 36의 알코올 데히드로게나아제 서열의 Gly198, Ser199, Arg200, Pro201 및 Tyr218 위치에 상응하는 아미노산들 중 1개 또는 상기 아미노산들의 조합에서의 아미노산 치환이다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 하기 돌연변이 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: Gly198Asp, Gly198Ile, Gly198Leu, Gly198Val, Ser199Asp, Ser199Glu, Ser199Leu, Ser199Val, Arg200Glu, Pro201Asp, Pro201Glu, Tyr218Ala 및 Tyr218Phe.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 하기 돌연변이 중 1가지의 돌연변이를 포함한다: Tyr218Gly, Tyr218Ser 또는 Tyr218Val.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Asp 치환을 포함한다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Leu, 및 Pro201Glu. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ala. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Phe. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Gly. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ser. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Val.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Asp 치환을 포함하며, 1) MEK 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Asp 치환을 포함하며, MEK 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 1) MEK,아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 1) MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 1) MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들, Gly198Asp, Ser199Val, 및 Pro201Glu의 조합을 포함하며, 1) MEK에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 2) MEK,아세톤 및/또는 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여; 및/또는 3) 아세톤 및/또는 MEK에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 MEK 및 아세톤 및 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 아세톤 및 MEK에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 1) MEK에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) MEK 및 아세톤 및 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여; 및 3) 아세톤 및 MEK에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들, Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ala의 조합을 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 2) 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및/또는 3) 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 1) MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들, Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Phe의 조합을 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및/또는 3) 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 기질로서 아세토인을 이용하는 능력이 실질적으로 전혀 없다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들, Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ala의 조합을 포함하며, 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 이러한 치환 모두를 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖고, 4) 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들, Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Phe의 조합을 포함하며, 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 이러한 치환 모두를 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖고; 5) 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 38에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 42에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 50에 제공된 서열을 갖는다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 44에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 46에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 48에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 52에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 54에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 63에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 64에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 65에 제공된 서열을 갖는다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산을 제공한다.
특정한 실시 양태에서, 핵산은 서열 번호 37, 서열 번호 41, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 또는 서열 번호 70의 서열을 갖는다. 다른 실시 양태에서, 핵산은 서열 번호 39, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 또는 서열 번호 53의 서열을 갖는다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 일 실시 양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일 실시 양태에서, 제1 측면의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산은 제2 측면의 핵산이다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 또는 제3 측면의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 또는 제3 측면의 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
일 실시 양태에서, 미생물은 하기로부터 선택되는 하나 이상의 생성물, 및 임의로, 발효에 의한 하나 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있다:
이소프로판올;
2,3-부탄디올;
에탄올; 및
2-부탄올.
일 실시 양태에서, 미생물은 발효에 의해 하기로부터 선택되는 하나 이상의 생성물, 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있다:
아세토인;
아세트알데히드;
MEK; 및
아세톤.
일 실시 양태에서, 재조합 미생물은 박테리아, 고세균 및 진균류를 포함하는 미생물의 군으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 재조합 미생물은 클로스트리듐, 아세토박테륨(Acetobacterium), 무렐라(Moorella), 부티리박테륨(Butyribacterium), 블라우티아(Blautia), 옥소박터(Oxobacter), 서모언에어로박터(Thermoanaerobacter), 에스케리키아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 자이모모나스(Zymomonas), 시트로박터(Citrobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia), 로도토룰라(Rhodotorula), 리조푸스(Rhizopus), 트리코스포론(Trichosporon), 리포마이세스(Lipomyces), 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(trichoderma), 엑소필라(Exophila), 뮤코르(Mucor), 클라도스포륨(Cladosporium), 파네로카에테(Phanerochaete), 클라디오필랄로포라(Cladiophilalophora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 스케도스포륨(Scedosporium), 오피스토마(Ophistoma), 바실러스(Bacillus), 올리고트로파(Oligotropha), 슈도모나스(Pseudomonas), 카르보필루스(Carbophilus), 히드로게노파가(Hydrogenophaga), 마이코박테륨(Mycobacterium), 자바르지니아(Zavarzinia), 쿠프라비두스(Cupravidus), 세네코시스티스(Senechocystis), 클로로플렉수스(Chloroflexus), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로미크로븀(Methylomicrobium), 메틸로스페라(Methylosphera), 메틸로칼둠(Methylocaldum), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로시누스(Methylosinus), 메타노박테륨(Methanobacterium), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노게늄(Methanogenium), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노셰라(Methanoshera), 메타노서모박터(Methanothermobacter), 메타노트릭스(Methanotrix), 코리네박테륨(Corynebacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 악티노마이세스(Actinomyces), 박테리오데스(Bacteriodes), 부르콜리데리아(Burkholderia), 브레비박테륨(Brevibacterium), 파이로코커스(Pyrococcus), 지오박터(Geobacter), 지오바실러스(Geobacillus), 파에니바실러스(Paenibacillus), 마이코박테륨(Mycobacterium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 서마토가(Thermatoga), 서모언에어로박터(Thermoanaerobacter), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 로도박터(Rhodobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 비피도박테륨(Bifidobacterium), 프로피오니박테륨(Propionibacterium), 푸소박테륨(Fusobacterium), 캄필로박터(Campylobacter), 베일로넬라(Veillonella), 아쿠인콜라(Aquincola), 아트로박터(Arthrobacter), 모락셀라(Moraxella), 및 사이크로박터(Psychrobacter) 속으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 유기체는 일산화탄소 영양(carboxydotrophic) 아세트산 생성 미생물의 군, ABE 미생물의 군, 장내세균(Enterobacteria)의 군, 젖산균(Lactobacillus)의 군, 진균류 및 효모의 군, 호기성 일산화탄소 영양주의 군, 호기성 CO2 고정 유기체의 군, 메틸 영양주(methylotroph)의 군, 및 메탄 생성 미생물(methanogen)의 군으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 락스탈레이, 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리듐 코스카티이(Clostridium coskatii), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리듐 sp ., 부티리박테륨 리모숨(Butyribacterium limosum), 부티리박테륨 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 아세토박테륨 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 유박테륨 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 서모아세티카(Moorella thermoacetica), 무렐라 서모토트로피카(Moorella thermautotrophica), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii), 및 서모언에어로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)를 포함하는 군으로부터 선택되는 일산화탄소 영양성 아세토젠(acetogen)이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 륭달리이이다. 특정한 일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM10061 또는 DSM23693이다. 또 다른 특별한 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 륭달리이 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 베이제린키이, 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)을 포함하는 군으로부터 선택되는 ABE 미생물이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 또는 클로스트리듐 베이제린키이이다. 특정한 일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824 (또는 DSM792)이다. 또 다른 특별한 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 베이제린키이 NCIMB8052 (ATCC51743)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 에스케리키아, 클렙시엘라, 자이모모나스, 시트로박터, 엔테로박터, 살모넬라, 세라티아를 포함하는 군으로부터 선택되는 장내세균이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli), 자이모노나스 모빌리스(Zymononas mobilis), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 락토바실러스, 락토코커스, 엔테로코커스, 페디오코커스, 스트렙토코커스를 포함하는 군으로부터 선택되는 젖산균이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 사카로마이세스, 피키아, 칸디다, 한세눌라, 야로위아, 로도토룰라, 리조푸스, 트리코스포론, 리포마이세스를 포함하는 군, 및 아스페르길루스, 트리코데르마, 엑소필라, 뮤코르, 클라도스포륨, 파네로카에테, 클라디오필랄로포라, 파에실로마이세스, 스케도스포륨, 오피스토마를 포함하는 군으로부터 선택되는 진균류 또는 효모이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 칸디디아 트로피칼리스(Candidia tropicalis), 칸디디아 알비칸스(Candidia albicans) 또는 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica)이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 아스파르길루스 니게르(Aspargillus niger) 또는 트리크더마 레세이(Trichderma resei)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 바실러스, 올리고트로파, 슈도모나스, 카르보필루스, 히드로게노파가, 마이코박테륨, 자바르지니아를 포함하는 군으로부터 선택되는 호기성 일산화탄소 영양주이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 올리고트로파 카르복시도보란스(Oligotropha carboxydovorans), 카르보필루스 카르복시두스(Carbophilus carboxidus), 히드로게노파가 슈도플라바(Hydrogenophaga pseudoflava), 마이코박테륨 sp ., 슈도모나스 카르복시도히드로게나(Pseudomonas carboxydohydrogena), 슈도모나스 sp ., 자바르지니아 콤프란소리스(Zavarzinia compransoris) 또는 바실러스 슐레겔리이(Bacillus schlegelii)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 쿠프라비두스, 세네코시스티스, 클로로플렉수스를 포함하는 군으로부터 선택되는 호기성 CO2 고정 유기체이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 쿠프라비두스 네카토르(Cupravidus necator), 세네코시스티스 sp . 또는 클로로플렉수스 아우란티쿠스(Chloroflexus auranticus)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로미크로븀, 메틸로스페라, 메틸로칼둠, 메틸로시스티스, 메틸로시누스를 포함하는 군으로부터 선택되는 메틸 영양주이다. 일 실시 양태에서, 미생물은 메틸로코커스 캅술라투스(Methylococcus capsulatus) 또는 메틸로시누스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium)이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 메타노박테륨, 메타노코커스, 메타노게늄, 메타노사르시나, 메타노셰라, 메타노서모박터, 메타노트릭스를 포함하는 군으로부터 선택되는 메탄 생성 미생물이다.
일 실시 양태에서, 미생물은 메타노서모박터 마르부르겐시스(Methanothermobacter marburgensis) 또는 메타노사르시나 바케리(Methanosarcina bakeri)이다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제5 측면의 미생물을 이용한 기질의 미생물 발효에 의해 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올, 및 2-부탄올 중 하나 이상, 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아세토인, MEK, 아세톤 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 하나 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 생물 반응기에 기질을 제공하는 단계; 및
(b) 생물 반응기 내의 배양물을 발효시켜 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올, 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 생성하는 단계.
일 실시 양태에서, 기질은 CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 기질이다. 또 다른 실시 양태에서, 기질은 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질이다.
또 다른 실시 양태에서, 2가지 이상의 상이한 기질들의 조합물이 이용될 수 있다. 일 실시 양태에서, CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 기질과, 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질의 조합물이 이용된다.
일 실시 양태에서, 기질은 CO를 포함하는 기질이며, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 산업 공정의 결과로서 생성된 CO 함유 가스를, 상기 가스가 대기중으로 방출되기 전에 포획하는 단계;
(b) 본 발명의 하나 이상의 일산화탄소 영양성 아세트산 생성 미생물을 함유하는 배양물에 의해 CO 함유 가스를 혐기적으로 발효시켜 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올, 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 생성하는 단계.
또한, 대체로 본 발명은 개별적으로 또는 집단적으로 본 명세서에서 언급되거나 지시된 부분, 요소 및 특징, 상기 부분, 요소 또는 특징 중 2가지 이상의 것의 임의의 또는 모든 조합에 있다고 할 수 있으며, 본 발명이 관련된 기술 분야에서 등가인 것으로 공지된 특정 정수가 본원에서 언급되는 경우, 이러한 공지된 등가는 마치 개별적으로 개시되는 것처럼 본원에 포함되는 것으로 여겨진다.
본 발명의 이들 측면 및 다른 측면은 모두 본 발명의 신규한 측면으로 간주되어야 하는 것으로서, 첨부된 도면을 참고로 하여 하기 설명으로부터 자명해지는데, 이는 단지 예로서 주어진다.
도 1은 야생형 단백질이 이. 콜라이에서 발현될 때 고도로 가용성이고, 쉽게 정제될 수 있었음을 나타낸다. 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물; 가용성 용해물(lysate); 분자량 래더(래더); 컬럼 용출 분획물 1 내지 7.
도 2는 Ser199Asp(좌측 패널) 및 Arg200Gln(우측 패널) 돌연변이 단백질이 고도로 가용성이었음을 나타낸다. Ser199Asp 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물; 래더; 컬럼 세척물 1; 컬럼 세척물 2; 용출 분획물 1 내지 5. Arg200Gln 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물; 컬럼 세척물 1; 컬럼 세척물 2; 래더; 용출 분획물 1 내지 5.
도 3은 야생형 단백질 및 Ser199Asp 돌연변이체의 활성을 나타낸다. Ser199Asp 돌연변이체는 아세톤에서 야생형과 거의 같은 활성을 가졌다.
도 4는 Ser199Asp 돌연변이체의 상대적인 활성을 나타낸다.
도 5는 돌연변이체 2(패널 A), 돌연변이체 7(패널 B), 돌연변이체 10(패널 C), 돌연변이체 11(패널 D) 및 돌연변이체 13(패널 E)이 가용성이었음을 나타낸다. 돌연변이체 2의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1 내지 6), 분자량 래더, 컬럼 용출 분획물(1 내지 6). 돌연변이체 7의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물 (1 내지 5), 분자량 래더, 컬럼 용출 분획물(1 내지 7). 돌연변이체 10의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1), 분자량 래더, 컬럼 세척 분획물(2 내지 4), 컬럼 용출 분획물(1 내지 5). 돌연변이체 11의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1 내지 3), 분자량 래더, 컬럼 용출 분획물(1 내지 5). 돌연변이체 13의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1), 분자량 래더, 컬럼 세척 분획물(2 내지 3), 컬럼 용출 분획물(1 내지 5), 분자량 래더.
도 6은 보조 인자로서의 NADH 및 기질로서의 아세톤에서의 야생형 단백질 및 돌연변이체 2, 7, 10, 11 및 13의 활성을 나타낸다. 단지 돌연변이체 11만이 보조 인자로서 NADH를 사용할 경우 임의의 유의한 활성을 갖는다.
도 7은 아세톤에 대하여 정규화된(아세톤 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 8은 MEK(2-부타논)에 대하여 정규화된(MEK 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 9는 아세트알데히드에 대하여 정규화된(아세트알데히드 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 10은 아세토인에 대하여 정규화된(아세토인 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 11: 대조구(CNTL)를 포함하는, 기질로서의 아세톤 및 보조 인자로서의 NADH 및 NADPH에서의 씨. 오토에타노게눔 DSM10061 야생형 효소의 활성의 테스트.
도 12: 상이한 기질들을 이용하여 야생형 Adh 효소에 대하여 측정한 동역학적 특성, KM 값 및 활성.
도 13: pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh의 플라스미드 지도.
도 14: 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 2-부탄올 및 에탄올로의 발효 경로 및 알코올 데히드로게나아제(adh)의 역할. 다른 관계: 아세토락테이트 신타아제(als), 아세토락테이트 데카르복실라아제(aldc), 디올 데히드라타아제(pdd), 알데히드 데히드로게나아제(ald), 알데히드:페레독신 옥시도리덕타아제(aor), 포스포트랜스아세틸라아제 pta), 아세테이트 키나아제(ack), 티올라아제(thlA), CoA 트랜스퍼라아제(ctfAB), 아세토아세테이트 데카르복실라아제(adc).
서열 번호 목록의 간단한 설명
본 명세서에는 서열 번호 목록이 동반되며, 상기 서열 번호 목록에는 하기 서열이 열거되어 있다:
서열 번호 1 내지 34는 이하에 표 3, 4 및 5에 기술되어 있다.
서열 번호 35: 본 발명자에 의해 연구된 야생형 ADH의 핵산 서열.
서열 번호 36: 본 발명자에 의해 연구된 야생형 ADH의 아미노산 서열.
서열 번호 37: 본 발명자에 의해 생성된 치환 Ser199Asp를 포함하는 돌연변이 ADH의 핵산 서열.
서열 번호 38: 본 발명자에 의해 생성된 치환 Ser199Asp를 포함하는 돌연변이 ADH의 아미노산 서열.
서열 번호 39: 우드 륭달(Wood Ljungdahl) 프로모터 영역의 핵산 서열.
서열 번호 40: 본원에 추가로 기술된 플라스미드 pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh의 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 41: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 7의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 42: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 7의 핵산 서열.
서열 번호 43: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 8의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 44: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 8의 아미노산 서열.
서열 번호 45: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 9의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 46: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 9의 아미노산 서열.
서열 번호 47: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 10의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 48: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 10의 아미노산 서열.
서열 번호 49: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 11의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 50: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 11의 아미노산 서열.
서열 번호 51: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 12의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 52: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 12의 아미노산 서열.
서열 번호 53: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 13의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 54: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 13의 아미노산 서열.
서열 번호 55: 씨. 오토에타노게눔 알코올 데히드로게나아제 유전자의 5' 상동성 아암(arm)의 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 56: 씨. 오토에타노게눔 알코올 데히드로게나아제 유전자의 3' 상동성 아암의 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 57: 프라이머 Sec5f.
서열 번호 58: 프라이머 Sec5r.
서열 번호 59: 프라이머 Sec3f.
서열 번호 60: 프라이머 Sec3r.
서열 번호 61: 프라이머 SecOf.
서열 번호 62: 프라이머 SecOr.
서열 번호 63: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Gly
서열 번호 64: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ser
서열 번호 65: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Val
서열 번호 66: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Ser199Glu
서열 번호 67: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Gly
서열 번호 68: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ser
서열 번호 69: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Val
서열 번호 70: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Ser199Glu(코돈 최적화됨).
도 1은 야생형 단백질이 이. 콜라이에서 발현될 때 고도로 가용성이고, 쉽게 정제될 수 있었음을 나타낸다. 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물; 가용성 용해물(lysate); 분자량 래더(래더); 컬럼 용출 분획물 1 내지 7.
도 2는 Ser199Asp(좌측 패널) 및 Arg200Gln(우측 패널) 돌연변이 단백질이 고도로 가용성이었음을 나타낸다. Ser199Asp 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물; 래더; 컬럼 세척물 1; 컬럼 세척물 2; 용출 분획물 1 내지 5. Arg200Gln 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물; 컬럼 세척물 1; 컬럼 세척물 2; 래더; 용출 분획물 1 내지 5.
도 3은 야생형 단백질 및 Ser199Asp 돌연변이체의 활성을 나타낸다. Ser199Asp 돌연변이체는 아세톤에서 야생형과 거의 같은 활성을 가졌다.
도 4는 Ser199Asp 돌연변이체의 상대적인 활성을 나타낸다.
도 5는 돌연변이체 2(패널 A), 돌연변이체 7(패널 B), 돌연변이체 10(패널 C), 돌연변이체 11(패널 D) 및 돌연변이체 13(패널 E)이 가용성이었음을 나타낸다. 돌연변이체 2의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1 내지 6), 분자량 래더, 컬럼 용출 분획물(1 내지 6). 돌연변이체 7의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물 (1 내지 5), 분자량 래더, 컬럼 용출 분획물(1 내지 7). 돌연변이체 10의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1), 분자량 래더, 컬럼 세척 분획물(2 내지 4), 컬럼 용출 분획물(1 내지 5). 돌연변이체 11의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1 내지 3), 분자량 래더, 컬럼 용출 분획물(1 내지 5). 돌연변이체 13의 샘플(좌측에서 우측으로): 전체 세포 추출물, 가용성 용해물, 컬럼 세척 분획물(1), 분자량 래더, 컬럼 세척 분획물(2 내지 3), 컬럼 용출 분획물(1 내지 5), 분자량 래더.
도 6은 보조 인자로서의 NADH 및 기질로서의 아세톤에서의 야생형 단백질 및 돌연변이체 2, 7, 10, 11 및 13의 활성을 나타낸다. 단지 돌연변이체 11만이 보조 인자로서 NADH를 사용할 경우 임의의 유의한 활성을 갖는다.
도 7은 아세톤에 대하여 정규화된(아세톤 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 8은 MEK(2-부타논)에 대하여 정규화된(MEK 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 9는 아세트알데히드에 대하여 정규화된(아세트알데히드 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 10은 아세토인에 대하여 정규화된(아세토인 설정치 = 1), 상이한 기질들에서의 야생형 및 돌연변이 ADH 효소의 비활성을 나타낸다. 각각의 효소에 있어서, 바람직한 보조 인자가 사용되었다(즉, 야생형 ADH, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 7의 경우 NADPH; 돌연변이체 10 및 돌연변이체 11의 경우 NADH).
도 11: 대조구(CNTL)를 포함하는, 기질로서의 아세톤 및 보조 인자로서의 NADH 및 NADPH에서의 씨. 오토에타노게눔 DSM10061 야생형 효소의 활성의 테스트.
도 12: 상이한 기질들을 이용하여 야생형 Adh 효소에 대하여 측정한 동역학적 특성, KM 값 및 활성.
도 13: pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh의 플라스미드 지도.
도 14: 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 2-부탄올 및 에탄올로의 발효 경로 및 알코올 데히드로게나아제(adh)의 역할. 다른 관계: 아세토락테이트 신타아제(als), 아세토락테이트 데카르복실라아제(aldc), 디올 데히드라타아제(pdd), 알데히드 데히드로게나아제(ald), 알데히드:페레독신 옥시도리덕타아제(aor), 포스포트랜스아세틸라아제 pta), 아세테이트 키나아제(ack), 티올라아제(thlA), CoA 트랜스퍼라아제(ctfAB), 아세토아세테이트 데카르복실라아제(adc).
서열 번호 목록의 간단한 설명
본 명세서에는 서열 번호 목록이 동반되며, 상기 서열 번호 목록에는 하기 서열이 열거되어 있다:
서열 번호 1 내지 34는 이하에 표 3, 4 및 5에 기술되어 있다.
서열 번호 35: 본 발명자에 의해 연구된 야생형 ADH의 핵산 서열.
서열 번호 36: 본 발명자에 의해 연구된 야생형 ADH의 아미노산 서열.
서열 번호 37: 본 발명자에 의해 생성된 치환 Ser199Asp를 포함하는 돌연변이 ADH의 핵산 서열.
서열 번호 38: 본 발명자에 의해 생성된 치환 Ser199Asp를 포함하는 돌연변이 ADH의 아미노산 서열.
서열 번호 39: 우드 륭달(Wood Ljungdahl) 프로모터 영역의 핵산 서열.
서열 번호 40: 본원에 추가로 기술된 플라스미드 pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh의 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 41: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 7의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 42: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 7의 핵산 서열.
서열 번호 43: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 8의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 44: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 8의 아미노산 서열.
서열 번호 45: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 9의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 46: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 9의 아미노산 서열.
서열 번호 47: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 10의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 48: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 10의 아미노산 서열.
서열 번호 49: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 11의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 50: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 11의 아미노산 서열.
서열 번호 51: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 12의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 52: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 12의 아미노산 서열.
서열 번호 53: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 13의 핵산 서열(코돈 최적화됨).
서열 번호 54: 이하에 추가로 기술된 돌연변이체 13의 아미노산 서열.
서열 번호 55: 씨. 오토에타노게눔 알코올 데히드로게나아제 유전자의 5' 상동성 아암(arm)의 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 56: 씨. 오토에타노게눔 알코올 데히드로게나아제 유전자의 3' 상동성 아암의 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 57: 프라이머 Sec5f.
서열 번호 58: 프라이머 Sec5r.
서열 번호 59: 프라이머 Sec3f.
서열 번호 60: 프라이머 Sec3r.
서열 번호 61: 프라이머 SecOf.
서열 번호 62: 프라이머 SecOr.
서열 번호 63: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Gly
서열 번호 64: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ser
서열 번호 65: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Val
서열 번호 66: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 아미노산 서열: Ser199Glu
서열 번호 67: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Gly
서열 번호 68: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ser
서열 번호 69: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Val
서열 번호 70: 하기 치환을 갖는 알코올 데히드로게나아제 효소의 핵산 서열: Ser199Glu(코돈 최적화됨).
하기는 일반적인 용어로 주어진, 본 발명의 바람직한 실시 양태를 포함하는 본 발명의 설명이다. 본 발명은 이하에 "실시예"라는 제목 하에 주어진 개시 내용으로부터 추가로 설명되는데, 실시예는 본 발명을 지지하는 실험 데이터, 본 발명의 다양한 측면의 구체적인 실시예, 및 본 발명을 수행하는 수단을 제공한다.
예기치 않게도, 본 발명자(들)는 일산화탄소 영양성 아세트산 생성 미생물 유래의 알코올 데히드로게나아제 효소의 돌연변이가 기질인 아세토인, 메틸 에틸 케톤(MEK 또는 2-부타논), 아세톤 및 아세트알데히드 중 하나 이상에 대한 그의 특이성을 서로에 비하여 증가시킴을 밝혀냈다.
게다가, 본 발명자는 NADPH 대신에 또는 NADPH에 더하여, 보조 인자로서 NADH를 용인할 수 있는 돌연변이체를 동정하였다. 그와 같이, 이것은 이들 보조 인자 중 단지 1가지의 이용가능성에 의해 한정되지 않으며, 생성물 형성의 전체 효율을 증가시키는 데 있어서 더욱 풍부한 세포내 NADH 풀을 사용할 수 있다.
돌연변이(들)는 1가지의 발효 최종 생성물을 또 다른 것에 비하여 우선적으로 생성하도록 개조되며, NADPH 풀에 비하여 전형적으로 훨씬 더 큰 NADH 풀의 이용을 허용함을 의미한다(문헌[Bennett & San, 2009]). ABE 발효에서, 에탄올 및 아세톤 둘 모두가 생성되며, IBE 발효에서 이소프로판올이 생성된다(문헌[
]). 본 발명은 아세톤의 이소프로판올로의 환원이 증가되게 할 수 있거나 이 반응을 아세트알데히드의 에탄올로의 반응에 비하여 우선적으로 촉매할 수 있거나 또는 그 반대로도 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 이소프로판올 생성에 있어서의 제약의 극복을 도울 수 있으며, 그 이유는 엄격하게 NADPH 의존성이고 아세트알데히드 쪽으로의 배경(background) 활성이 높은 비변형 알코올 데히드로게나아제에 모든 주가 의존하기 때문이다. 이소프로판올 생성용으로 엔지니어링된(engineered) 이. 콜라이 주는 상기 단점 및 낮은 수율로 고통을 받고 있으며, 그 이유는 씨. 베이제린키이 유래의 상기 NADPH 의존성 알코올 데히드로게나아제 효소가 대안 없이 사용되기 때문이다(문헌[Hanai T et al (2007) Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichia coli. Applied and environmental microbiology 73:7814-8]; 문헌[Inokuma K et al (2010) Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichia coli using gas stripping. Journal of bioscience and bioengineering 110:696-701]; 문헌[Jojima T et al (2008) Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology 77:1219-24]). 이와 유사하게, 본 발명은 실행가능한 수준의 이소프로판올을 이전에는 생성할 수 없었던 일산화탄소 영양성 아세트산 생성 미생물에 의해, 일산화탄소를 포함하는 기질로부터 이소프로판올을 생성하는 수단을 제공한다. 씨. 오토에타노게눔, 씨. 륭달리이 또는 씨. 락스달레이와 같은 일부 일산화탄소 영양 유기체는 에탄올 및 2,3-부탄디올 둘 모두를 형성할 수 있다(문헌[
]). 또한 본 발명은 아세토인의 2,3-부탄디올로의 환원이 증가되게 할 수 있거나 이 반응을 아세트알데히드의 에탄올로의 반응에 비하여 우선적으로 촉매할 수 있거나 또는 그 반대로도 할 수 있다. 2,3-부탄디올은 디올 데히드라타아제에 의해 MEK로 전환될 수 있다(문헌[Toraya et al, 1976, Substrate specificity of coenzyme B12-dependent diol dehydrase - glycerol as both a good substrate and a potent inactivator. Biochem. Biophys . Res . Commun ., 69: 475-80]). 본 발명은 MEK가 2-부탄올로 효과적으로 전환되게 한다. 따라서, 본 발명은 더욱 높은 특이성으로 아세토인으로부터 2,3-부탄디올을 생성하는 그리고 MEK로부터 2-부탄올을 생성하는 해법을 또한 제공한다.
따라서, 본 발명은 특히, 아세토인, 메틸 에틸 케톤 (MEK 또는 2-부타논) 및/또는 아세트알데히드 기질과 같은 다른 기질에 비하여 아세톤 기질에 대하여, 아세트알데히드 및/또는 아세토인 기질에 비하여 MEK 기질에 대하여, MEK, 아세토인 및/또는 아세톤 기질에 비하여 아세트알데히드 기질에 대하여, 및/또는 아세톤, MEK 및/또는 아세트알데히드 기질에 비하여 아세토인 기질에 대하여 증가된 특이성을 갖는 알코올 데히드로게나아제로서, 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 적어도 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 알코올 데히드로게나아제, 이 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 핵산 벡터, 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 기질의 발효에 의해 생성할 수 있는 그리고 본 발명의 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 미생물, 및 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 기질로서 아세토인을 이용하는 능력이 실질적으로 없는 알코올 데히드로게나아제, 이러한 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산 및 핵산 벡터, 상기 핵산 또는 핵산 벡터를 포함하는 미생물 및 이러한 알코올 데히드로게나아제의 사용 방법을 제공한다.
"CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 기질"이라는 어구는 예를 들어 CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 하나 이상의 미생물 주가 성장 및/또는 발효에 이용할 수 있는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 기질은 100% CO, CO2 또는 H2를 포함할 수 있거나, 다른 가스와 비교하여 대다수의 CO, CO2 또는 H2를 포함할 수 있거나, 2가지 이상의 가스가 임의의 비로 조합될 수 있음이 인지되어야 한다. 특정 실시 양태에서, 기질은 CO와 CO2의 조합물을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 기질은 CO와 H2의 조합물을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 기질은 CO2와 H2의 조합물을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 기질은 CO, CO2 및 H2의 조합물을 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 기질은 CO2를 포함할 수 있으며, 임의의 배양, 성장 또는 발효가 광(광합성) 및/또는 전기(전기합성)의 존재 하에 수행될 수 있다. 특정한 실시 양태에서, CO2는 O2와 조합된다.
일 실시 양태에서, "CO, CO2 및 H2를 포함하는 기질"은 "일산화탄소를 포함하는 기질"이다. "CO를 포함하는 기질" 등의 용어는 예를 들어 성장 및/또는 발효에 하나 이상의 미생물 주가 일산화탄소를 이용할 수 있는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"일산화탄소를 포함하는 가스질 기질"이라는 어구 및 유사 어구 및 용어는 소정 수준의 일산화탄소를 함유하는 임의의 가스를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 기질은 적어도 약 20 부피% 내지 약 100 부피%의 CO, 20 부피% 내지 70 부피%의 CO, 30 부피% 내지 60 부피%의 CO, 및 40 부피% 내지 55 부피%의 CO를 함유한다. 특정 실시 양태에서, 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 또는 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%의 CO, 또는 약 55 부피%의 CO, 또는 약 60 부피%의 CO를 포함한다.
CO를 포함하는 기질이 임의의 수소를 함유할 필요는 없는 한편, H2의 존재는 본 발명의 방법에 따른 생성물 형성에 유해하지 않아야 한다. 특정 실시 양태에서, 수소의 존재는 전체 알코올 생성 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 특정 실시 양태에서, 기질은 대략 2:1, 또는 1:1, 또는 1:2의 비의 H2:CO를 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 기질은 약 30 부피% 이하의 H2, 20 부피% 이하의 H2, 약 15 부피% 이하의 H2 또는 약 10 부피% 이하의 H2를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 기질 스트림은 저농도의 H2, 예를 들어 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만의 H2를 포함하거나, 실질적으로 수소가 부재한다. 기질은 예를 들어 약간의 CO2 , 예컨대 약 1 부피% 내지 약 80 부피%의 CO2, 또는 1 부피% 내지 약 30 부피%의 CO2를 또한 함유할 수 있다. 일 실시 양태에서, 기질은 약 20 부피% 이하의 CO2를 포함한다. 특별한 실시 양태에서, 기질은 약 15 부피% 이하의 CO2, 약 10 부피% 이하의 CO2, 약 5 부피% 이하의 CO2를 포함하거나, CO2를 실질적으로 전혀 포함하지 않는다.
본 발명의 특별한 실시 양태에서, CO 함유 가스질 기질은 산업 배출 또는 폐기 가스이다. "산업 폐기 또는 배출 가스"는 대체로, 산업 공정에 의해 생성되는 CO를 포함하는 임의의 가스를 포함하고, 철금속 제품 제조 공정, 비철 제품 제조 공정, 석유 정제 공정, 석탄의 가스화, 바이오매스(biomass)의 가스화, 전력 생산, 카본 블랙의 제조, 및 코크스의 제조의 결과로서 생성되는 가스를 포함하도록 보아야 한다. 추가의 예가 본원의 다른 곳에 제공되어 있을 수 있다.
일 실시 양태에서, "CO, CO2 및 H2를 포함하는 기질"은 "CO2 및 H2를 포함하는 기질"이다. "CO2 및 H2를 포함하는 기질" 등의 용어는 예를 들어 이산화탄소 및 수소를 하나 이상의 미생물 주가 성장 및/또는 발효에 이용할 수 있는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
C02 및 H2 함유 기질은 전형적으로 대다수의 비율의 H2, 예컨대 약 30 부피% 이상의 H2, 또는 40 부피% 이상의 H2, 또는 50 부피% 이상의 H2, 또는 60 부피% 이상의 H2, 또는 70 부피% 이상의 H2, 또는 80 부피% 이상의 H2, 또는 85 부피% 이상의 H2를 함유한다.
가스질 기질은 전형적으로 약 10 부피% 이상의 CO2, 또는 15 부피% 이상의 CO2, 또는 20 부피% 이상의 CO2, 또는 25 부피% 이상의 CO2, 또는 30 부피% 이상의 CO2, 또는 40 부피% 이상의 CO2를 함유한다.
특정한 실시 양태에서, H2:CO2의 비는 대략 1:1, 또는 대략 2:1, 또는 대략 3:1이다.
특정 실시 양태에서, CO2 및 H2를 포함하는 기질은 산업 공정의 부산물로서 수득되는, 또는 일부 다른 소스(source)로부터의 폐기 가스이다. 전세계적으로 가장 큰 CO2 방출원은 발전소, 산업 설비 및 다른 소스에서의 석탄, 오일 및 가스와 같은 화석 연료의 연소로부터의 것이다.
가스질 기질은 산업 공정의 부산물로서 수득되거나, 자동차 배기 가스와 같은 일부 또 다른 소스로부터의 CO2 및 H2 함유 폐기 가스일 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 산업 공정은 수소 제조, 암모니아 제조, 연료의 연소, 석탄의 가스화, 및 석회석 및 시멘트의 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가스질 기질은 하나 이상의 가스질 기질을 블렌딩하여 블렌딩된 스트림을 제공한 것의 결과일 수 있다. 당업자라면, H2 풍부 또는 CO2 풍부 폐기 가스 스트림이 H2 및 CO2 둘 모두가 풍부한 폐기 가스 스트림보다 더 풍부함을 이해할 것이다. 당업자라면, 요망되는 CO2 및 H2 성분 중 1가지를 포함하는 하나 이상의 가스 스트림의 블렌딩이 본 발명의 범주 내에 있음을 이해할 것이다.
수소 풍부 가스 스트림은 탄화수소의 스팀 재생성(steam reformation), 특히 천연 가스의 스팀 재생성을 포함하는 다양한 공정에 의해 생성된다. 석탄 또는 탄화수소의 부분 산화도 수소 풍부 가스원이다. 수소 풍부 가스의 다른 소스는 물의 전기 분해, 염소의 생성에 사용되는 전해조로부의 부산물 및 다양한 정유 공장 및 화학 스트림으로부터의 부산물을 포함한다.
전형적으로 이산화탄소가 풍부한 가스 스트림은 탄화수소, 예컨대 천연 가스 또는 오일의 연소에 의한 배기 가스를 포함한다. 이산화탄소가 암모니아, 석회 또는 포스페이트의 생성으로부터의 부산물로서 또한 생성된다.
하기의 설명에서, 본 발명의 실시 양태는 "CO를 함유하는 가스질 기질" 또는 "CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 가스질 기질"의 전달 및 발효의 면에서 기술된다. 그러나, 가스질 기질은 대안적인 형태로 제공될 수 있음이 인지되어야 한다. 예를 들어, 가스질 기질은 액체 중에 용해되어 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 일산화탄소, 이산화탄소 및/또는 수소 함유 가스에 의해 포화되며, 그 후 상기 액체는 생물 반응기에 첨가된다. 이것은 표준 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예로서, 미세버블 분산 발생기(문헌[Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002])가 사용될 수 있다. 추가의 예로서, CO를 함유하는 가스질 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다. 이러한 대안적인 방법은 "CO를 함유하는 기질", "CO2 및 H2를 포함하는 기질" 및 "CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 기질"이라는 용어 및 유사 어구의 사용에 포함된다.
"하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질"이라는 어구 및 유사 용어는 예를 들어 하나 이상의 탄수화물을 하나 이상의 미생물 주가 성장 및/또는 발효에 이용할 수 있는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "탄수화물"은 대체로, 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류, 단순 및 복합 탄수화물을 포함하는 것으로 보아야 하는데, 이는 글루코스, 프룩토스, 당밀 및 전분을 포함한다.
일 실시 양태에서, "하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질"은 바이오매스로부터 얻어질 수 있다. 바이오매스는 임의의 성질의 것일 수 잇으며, 예를 들어 삼림 또는 다른 상업적 작물로부터의 잔사(예컨대 나무, 가지, 그루터기, 우드칩(wood chip), 톱밥, 클립핑(clipping)), 도시 고형 폐기물, 및 예를 들어 억새, 스위치그래스, 대마, 옥수수, 포플러, 버드나무, 수수, 사탕수수 및 대나무를 포함하는, 미생물 발효에 의해 하나 이상의 생성물을 생성하기 위한 공급 원료를 제공하도록 성장시킨 작물을 포함한다.
문맥이 달리 요구하지 않으면, 본원에서 사용될 때, "발효시키는", "발효 공정" 또는 "발효 반응"이라는 어구는 성장기 및 당해 공정의 생성물 생합성기 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 추가로 기술되는 바와 같이, 일부 실시 양태에서, 생물 반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 금속 또는 조성물을 발효 반응에 첨가하는 것은 이들 반응기 중 하나 또는 이들 반응기 둘 모두에 첨가하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"생물 반응기"라는 용어는 하나 이상의 용기 및/또는 타워(tower) 또는 배관 배치로 이루어진 발효 장치를 포함하며, 이는 연속 교반 탱크형 반응기(Continuous Stirred Tank Reactor; CSTR), 고정 셀형 반응기(Immobilized Cell Reactor; ICR), 트리클 베드 반응기(Trickle Bed Reactor; TBR), 버블 컬럼, 가스 리프트 발효기(Gas Lift Fermenter), 정적 혼합기(Static Mixer), 또는 가스-액체 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 생물 반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 기질을 생물 반응기 또는 발효 반응에 첨가하는 것을 언급할 때, 이것은 적절할 경우 이들 반응기 중 어느 하나 또는 이들 반응기 둘 모두에의 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
핵산 "구성물" 또는 "벡터"라는 용어 및 유사 용어는 대체로, 유전 물질을 세포 내로 이전시키기 위한 비히클로서 사용하기에 적합한 임의의 핵산(DNA, cDNA 및 RNA를 포함함)을 포함하는 것으로 보아야 한다. 상기 용어는 플라스미드, 바이러스(박테리오파지를 포함함), 코스미드 및 인공 염색체를 포함하는 것으로 보아야 한다. 구성물 또는 벡터는 하나 이상의 조절 요소, 복제 기점, 다중클로닝 부위 및/또는 선발가능 마커를 포함할 수 있다. 특별한 일 실시 양태에서, 구성물 또는 벡터는 그 구성물 또는 벡터에 의해 암호화되는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하도록 구성된다. 핵산 구성물 또는 벡터는 세포에의 전달을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 에이전트(agent)를 이용하여 제형화된 핵산(예를 들어, 리포좀 콘쥬게이션된(conjugated) 핵산, 이 핵산이 함유된 유기체) 뿐만 아니라 네이키드(naked) 핵산도 포함한다. 벡터는 핵산의 클로닝 또는 발현에, 그리고 미생물을 형질전환시켜 재조합 미생물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 벡터는 본 발명의 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제 효소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다.
"외인성 핵산"은 이것이 도입되는 미생물의 외부에서 비롯되는 핵산이다. 외인성 핵산은 이것이 도입될 미생물, 이것이 도입될 유기체 또는 이것이 인공적으로 또는 재조합에 의해 생성될 수 있는 유기체와는 다른 미생물의 주 또는 종을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 임의의 적절한 소스로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 외인성 핵산은 이것이 도입될 미생물 내에서는 천연적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 나타내며, 이는 미생물 내에서 천연적으로 존재하지 않는 생성물의 발현을 허용한다. 외인성 핵산은 이것이 도입될 미생물의 게놈 내에 통합되거나 과잉 염색체 상태로 잔존하도록 구성될 수 있다.
"모(parental) 미생물"은 본 발명의 미생물을 생성하는 데 사용되는 미생물이다. 모 미생물은 자연에서 나타나는 것(즉, 야생형 미생물) 또는 이전에 변형되었지만 본 발명의 요지의 효소들 중 하나 이상의 효소를 발현하지 않거나 과다발현하지 않는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 미생물은 모 미생물에서 본 발명의 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 발현하도록 변형되었다.
본원에서, 본 발명의 알코올 데히드로게나아제 효소는 1가지의 기질에 대하여 또 다른 것에 비하여 "증가된 특이성"을 갖는 것으로 언급된다. 이는 본 알코올 데히드로게나아제가 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여, 1가지의 기질에 대하여 또 다른 것에 비하여 증가된 특이성을 가짐을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 알코올 데히드로게나아제가 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 특정 기질에 대하여 더욱 높은 특이성을 가짐을 반드시 암시하는 것으로 보아서는 안되지만, 이는 일부 실시 양태에서는 그러할 수 있다. 부가적으로, 상기 용어는 본 발명의 알코올 데히드로게나아제가 특정 기질에 대하여, 또 다른 것에 비하여 절대 특이성을 가짐을 의미하는 것으로 보아서는 안되지만, 이는 일부 실시 양태에서는 그러할 수 있으며, 또 다른 기질에 비하여, 적어도 특정 기질에 대한 선호를 포함한다.
NADH 또는 NADPH 보조 인자와 관련하여 사용될 때, "증가된 특이성", "더욱 높은 특이성" 등의 용어는 반응 동안 알코올 데히드로게나아제에 보조 인자가 결합하는 친화도를 나타낸다. 알코올 데히드로게나아제 및 보조 인자는 절대 특이성을 가짐을 의미하는 것으로 보아서는 안되지만, 이는 그러할 수 있으며, 적어도, 특정 알코올 데히드로게나아제와 하나의 보조 인자 사이의 결합에 대한 선호를, 또 다른 보조 인자에 비하여 포함함을 의미하는 것으로 보아서는 안된다.
본원에서 "이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올 및 2-부탄올을 포함하는 하나 이상의 생성물"의 생성이 언급된다. 그러나, 추가의 생성물이 또한 생성될 수 있음이 인지되어야 한다.
또한, 본원에서 "아세토인, MEK, 아세트알데히드 및 아세톤을 포함하는 하나 이상의 생성물"의 생성이 언급될 수 있다. 이들 생성물이 본원에서 또한 "기질"로 칭해지지만, 특정 실시 양태에서, 본 발명의 돌연변이 알코올 데히드로게나아제의 특이성이 특정 기질에 대하여, 또 다른 것과 비교하여 감소될 경우, 이것은 감소된 수준으로 하류 생성물로 전환되거나, 실질적으로 전환이 전혀 일어나지 않으며, 이는 증가된 수준의 아세토인, MEK, 아세트알데히드 및/또는 아세톤이 축적되게 한다. 예로서, 일 실시 양태에서, 본 발명의 알코올 데히드로게나아제는 기질로서 아세토인을 이용하는 능력이 실질적으로 전혀 없으며 따라서 아세토인이 축적될 수 있다.
부가적으로, 일부 실시 양태에서, 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올 및 2-부탄올 중 하나 이상을 포함하는, 본원에 언급된 생성물들 중 하나 이상이 중간체 또는 전구체로서 사용될 수 있으며 이는 동일 발효 반응에서, 별도의 발효 반응에서, 또는 화학적 합성에 의해 하류 생성물로 추가로 전환됨이 인지되어야 한다. 이 경우, 특정 미생물에서의 생성물들 중 하나 이상의 생성을 탐지하는 것이 가능하지 않을 수 있거나 단지 적은 수준의 생성의 탐지가 가능할 수 있다. 그러나, 상기 하나 이상의 생성물의 생성은 하나 이상의 하류 생성물의 생성을 기반으로 하여 암시될 수 있다.
본 발명의 특정 실시 양태에서, 본 발명의 알코올 데히드로게나아제는 "기질로서 아세토인을 이용하는 능력이 실질적으로 전혀 없다". 이는 상기 효소가 기질로서 아세토인을 사용하는 능력이, 비록 이것이 바람직할 수 있기는 하지만, 절대적으로 없음을 반드시 암시하는 것은 아니다. 일 실시 양태에서, 상기 어구는 야생형 효소의 활성의 대략 1% 이하의 공차(tolerance) 또는 0.1 sec-1 mM-1 미만의 kcat/KM의 효소 효율을 포함하는 것으로 보아야 한다.
효소
본 발명자는 씨. 오토에타노게눔 유래의 알코올 데히드로게나아제(서열 번호 36)의 돌연변이가 다른 기질과 비교하여 다양한 기질에 대한 특이성을 증가시키고, 특정 실시 양태에서 보조 인자 특이성이 변경되거나 최적화될 수 있음을 입증하였지만, 본 발명자는 본 발명이 다른 유기체 유래의 다른 알코올 데히드로게나아제 효소, 특히 1차 또는 2차 알코올에 대한 활성을 갖고 기질로서 NADH 또는 NADPH를 이용하는 임의의 알코올 데히드로게나아제(EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2)에 널리 적용가능하다고 생각한다.
전형적으로, 본 발명을 적용할 수 있는 알코올 데히드로게나아제의 군은 서열 번호 36의 알코올 데히드로게나아제에 대하여 적어도 대략 65%의 서열 번호 동일성, 더욱 특히는 적어도 대략 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 번호 동일성을 갖는다.
예로서, 본 발명은 하기 알코올 데히드로게나아제에 적용될 수 있다: 씨. 오토에타노게눔(서열 번호 36)의 1차: 2차 알코올 데히드로게나아제, 씨. 륭달리이(YP_003780646.1)의 1차: 2차 알코올 데히드로게나아제, 씨. 베이제린키이 (P25984.2)의 1차: 2차 알코올 데히드로게나아제, 서모언에어로박터 에타놀리쿠스(Thermoanaerobacter ethanolicus)(ABC50090.1)의 1차: 2차 알코올 데히드로게나아제, 또는 서모언에어로븀 브록키이(Thermoanaerobium brockii)(P14941.1)의 1차: 2차 알코올 데히드로게나아제.
본 발명의 알코올 데히드로게나아제는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 일 실시 양태에서, 상기 적어도 1개의 돌연변이는 서열 번호 36의 알코올 데히드로게나아제 서열의 Gly198, Ser199, Arg200, Pro201 및 Tyr218 위치에 상응하는 아미노산들 중 1개 또는 상기 아미노산들의 조합에서의 아미노산 치환이다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 적어도 1개의 돌연변이를 포함하며, 여기서, 상기 적어도 1개의 돌연변이는 서열 번호 36의 알코올 데히드로게나아제 서열의 Ser199 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이다. 당업자라면, 대안적인 알코올 데히드로게나아제에서의 관련 위치(서열 번호 36의 ADH의 198, 199, 201 및 218 위치에 상응함)를, 상기 서열을 당업계에 공지된 표준 절차에 따라 서열 번호 36의 알코올 데히드로게나아제의 것에 맞추어 정렬함으로써 쉽게 인지한다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 포함한다: Gly198Asp, Gly198Ile, Gly198Leu, Gly198Val, Ser199Asp, Ser199Glu, Ser199Leu, Ser199Val, Arg200Glu, Pro201Asp, Pro201Glu, Tyr218Ala 및 Tyr218Phe.
또한 본 발명자는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 하기 돌연변이들 중 1개를 포함하는 본 발명의 알코올 데히드로게나아제를 구상한다: Tyr218Gly, Tyr218Ser 및 Tyr218Val. 이들 돌연변이는 이하에서 실시예 섹션에서 예시되는 Tyr218Ala 및 Tyr218Phe 치환과 크기 면에서 전부 가까운 치환을 나타낸다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Asp 치환을 포함한다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Leu, 및 Pro201Glu. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ala. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Phe. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Gly. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ser. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들의 조합을 포함한다: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Val.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Asp 치환을 포함하며, 1) MEK 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Asp 치환을 포함하며, MEK 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 2) 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 1) MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 Ser199Glu 치환을 포함하며, 1) MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 그리고 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들: Gly198Asp, Ser199Val, 및 Pro201Glu의 조합을 포함하며, 1) MEK에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 2) MEK, 아세톤 및/또는 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여; 및/또는 3) 아세톤 및/또는 MEK에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 MEK 및 아세톤 및 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 아세톤 및 MEK에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 1) MEK에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) MEK 및 아세톤 및 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여; 및 3) 아세톤 및 MEK에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ala의 조합을 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 2) 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및/또는 3) 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 1) MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Phe의 조합을 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및/또는 아세트알데히드 및/또는 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및/또는 3) 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 MEK 및 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 이러한 치환 조합을 포함하는 알코올 데히드로게나아제는 기질로서 아세토인을 이용하는 능력이 실질적으로 전혀 없다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Ala의 조합을 포함하며, 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 이들 치환 모두를 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖고; 4) 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 하기 치환들: Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu, 및 Tyr218Phe의 조합을 포함하며, 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 이들 치환 모두를 포함하며, 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여; 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여; 및 3) 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖고; 5) 보조 인자로서 NADH를 이용할 수 있다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 38에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 42에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 50에 제공된 서열을 갖는다.
일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 44에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 46에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 48에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 52에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 54에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 63에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 64에 제공된 서열을 갖는다. 일 실시 양태에서, 알코올 데히드로게나아제는 서열 번호 65에 제공된 서열을 갖는다.
본 발명의 알코올 데히드로게나아제는 이하에 기술된 바와 같이, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발 기술, 랜덤 돌연변이 유발 기술, 재조합적 방법 및 화학적 합성을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단에 의해 제조될 수 있다.
일부의 경우에, 본 발명의 돌연변이 알코올 데히드로게나아제는 표준 기술을 이용하여 가용성으로 만들수 있다. 예로서, 하나 이상의 샤페론의 동시 발현을 포함하는 기술이 이용될 수 있다. 특정한 일 실시 양태에서, GroEL 및/또는 GroES 샤페론의 동시 발현이 이용된다. 특정한 일 실시 양태에서, 플라스미드 pGro7(타카라 바이오, 인크.(Takara Bio, Inc); clontech.com/takara/NZ/Products/Protein_Research/Protein_Folding_and_Expression/Chaperone_Plasmid_Set)의 용도가 이용될 수 있다. 이 플라스미드는 GroEL/ES 샤페론 단백질의 아라비노스 유도성 발현을 용이하게 한다. 예시적인 기술이 이하에서 실시예 2에 또한 제공되어 있다.
다수의 공지된 방법을 이용하여 본 발명의 알코올 데히드로게나아제가 적절한 기능성을 갖는지를 평가할 수 있다. 그러나, 예로서, 이하에서 실시예에 약술된 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로, 문헌[Ismail et al., Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J Bacteriol 1993, 175: 5097-5105], 또는 문헌[Khorkin et al., NADP-dependent bacterial alcohol dehydrogenases: crystal structure, cofactor-binding and cofactor specificity of the ADHs of Clostridium beijerinckii and Thermoanaerobacter brockii . J Mol Biol .1998, 22: 278(5): 967-981]에 약술된 방법을 이용하여 효소 활성을 평가할 수 있다.
보조 인자 특이성은 표준 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 그러나, 예로서, 이하에서 "실시예" 섹션에 기술된 방법이 이용될 수 있다.
핵산
본 발명이 신규한 알코올 데히드로게나아제에 관한 것인 한, 본 발명은 이 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산 및 이러한 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 또한 제공한다.
당업자라면, 본 발명의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산의 서열을, 상기 효소의 아미노산 서열 번호 및 유전자 코드에서의 축퇴성을 유념하여 쉽게 인지한다. 그러나, 단지 예로서, 일 실시 양태에서, 핵산은 서열 번호 37의 서열을 갖는다. 다른 실시 양태에서, 핵산은 서열 번호 41 또는 서열 번호 49의 서열을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 핵산은 서열 번호 39, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69 또는 서열 번호 70의 서열을 갖는다.
본 발명의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산은 임의의 특정 미생물용으로 코돈 최적화될 수 있음이 인지되어야 한다.
본 발명의 핵산, 알코올 데히드로게나아제 및 미생물이 재조합 기술을 이용하여 제조되어 사용될 수 있다면, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 또한 제공한다.
본 발명의 핵산은 미생물의 형질전환시에 과잉 염색체로 잔존할 수 있거나 미생물의 게놈 내로의 통합용으로 개조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산은 염색체외 구성물(예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 다른 조절 서열)의 안정한 발현 및 복제, 또는 통합(예를 들어, 상동 재조합 및 숙주 게놈 내로의 표적화된 통합을 허용하는 영역)을 돕도록 구성된 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산은 상기 핵산에 의해 암호화되는 상기 하나 이상의 효소의 발현을 촉진하도록 구성된 프로모터를 포함한다. 일 실시 양태에서, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에서 바람직하게는 고도로 활성인 구성적 프로모터이다. 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 프로모터는 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 유전자 클러스트(cluster) 또는 아라비노스 유도성 pBAD 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 당업자라면, 적절한 발효 조건 하에서 발현, 바람직하게는 고수준의 발현을 지시할 수 있는 다른 프로모터가 예시된 실시 양태에 대한 대안으로서 효과적임을 인지할 것이다.
본 발명의 발현 구성물/벡터를 포함하는 핵산 구성물 및 핵산은 당업계에서 표준적인 다수의 기술을 이용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 화학적 합성, 부위 지정 돌연변이 유발, 또는 재조합 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술되어 있다. 추가의 예시적인 기술은 이하에 실시예 섹션에 기술되어 있다. 본질적으로, 개별 유전자 및 조절 요소는 유전자가 발현되어 요망되는 단백질을 형성할 수 있도록 서로에게 작동가능하게 연결된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 벡터는 당업계의 숙련자에 의해 인지된다. 그러나, 예로서, 하기 벡터: pBAD 또는 pMTL80000 벡터, 및 이하에 실시예 섹션에 예시된 플라스미드가 적합할 수 있다.
또한 본 발명은 본원에 기술된 핵산 중 임의의 하나 이상의 핵산을 포함하는 숙주 유기체, 특히 미생물을 제공하며, 이는 바이러스, 박테리아 및 효모를 포함한다.
미생물
또한 본 발명은 이소프로판올, MEK, 2,3-부탄디올 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 기질의 발효에 의해 생성할 수 있고 본 발명의 1 이상의 핵산을 포함하는 미생물을 제공한다.
본 발명의 미생물은 예를 들어 모 미생물에 대하여 천연인 알코올 데히드로게나아제 유전자 내에 요망되는 돌연변이(들)를 도입하는 부위 지정 돌연변이 기술, 또는 본 발명의 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 모 미생물 내에 도입하는 다른 재조합 기술을 포함하는, 당업계에 공지된 다수의 기술을 이용하여 모 미생물로부터 제조될 수 있다.
일 실시 양태에서, 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산이 모 미생물 내에 도입되며, 모 미생물에 대하여 천연인 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제 유전자를 대체한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산이 모 미생물에 도입되며, 모 미생물에 대하여 천연인 알코올 데히드로게나아제 유전자를 보완한다. 다른 실시 양태에서, 하나 이상의 외인성 핵산을 모 미생물 내에 도입하여 하나 이상의 요망되는 돌연변이를 모 미생물에 대하여 천연인 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제 유전자 내에 도입한다. 또 다른 실시 양태에서, 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산이 모 미생물 내에 도입되고, 하나 이상의 돌연변이가 모 미생물에 대하여 천연인 하나 이상의 알코올 데히드로게나아제 유전자에 도입되어 그의 발현 및 활성을 감소시키거나 넉아웃(knock out)시킨다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 미생물은 재조합 기술을 이용하여 모 미생물로부터 제조된다. 예를 들어, 모 미생물은 본 발명의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산으로 형질전환되거나, 하나 이상의 핵산은 모 미생물 내의 천연 알코올 데히드로게나아제 유전자에 요망되는 돌연변이를 도입하도록 구성된다. 외인성 핵산은 모 미생물의 형질전환시에 염색체외 핵산으로 잔존할 수 있거나, ((일 실시 양태에서, 천연 알코올 데히드로게나아제 유전자를 대체하거나 천연 알코올 데히드로게나아제 유전자 내에 돌연변이를 도입하도록) 모 미생물의 게놈 내에 통합될 수 있다. 따라서, 이것은 이상에서 기술된 바와 같이, 염색체외 구성물의 발현 및 복제(예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 다른 조절 요소 또는 서열) 또는 통합(예를 들어, 상동 재조합 및 숙주 게놈 내로의 표적화된 통합을 허용하는 영역)을 돕도록 구성된 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
단지 예로서, 미생물의 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공법, 초음파 처리, 폴리에틸렌 글리콜 매개된 형질전환, 화학적 또는 천연적 적격성, 또는 콘쥬게이션에 의해 달성될 수 있다. 적합한 형질전환 기술은 예를 들어 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 기술되어 있다.
하나 이상의 외인성 핵산은 네이키드 핵산으로서 모 미생물 내에 전달될 수 있거나, 형질전환 공정을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 에이전트(예를 들어, 리포좀 콘쥬게이션된 핵산, 핵산이 포함된 유기체)를 이용하여 제형화될 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산은 적절할 경우 DNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한효소 저해제가 특정 실시 양태에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Murray, N.E. et al . (2000) Microbial. Molec . Biol . Rev .64, 412.]을 참조한다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 박테리아, 고세균 및 진균류이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 클로스트리듐, 아세토박테륨, 무렐라, 부티리박테륨, 블라우티아, 옥소박터, 서모언에어로박터, 에스케리키아, 클렙시엘라, 자이모모나스, 시트로박터, 엔테로박터, 살모넬라, 세라티아, 락토바실러스, 락토코커스, 엔테로코커스, 페디오코커스, 스트렙토코커스, 사카로마이세스, 피키아, 칸디다, 한세눌라, 야로위아, 로도토룰라, 리조푸스, 트리코스포론, 리포마이세스, 아스페르길루스, 트리코데르마, 엑소필라, 뮤코르, 클라도스포륨, 파네로카에테, 클라디오필랄로포라, 파에실로마이세스, 스케도스포륨, 오피스토마, 바실러스, 올리고트로파, 슈도모나스, 카르보필루스, 히드로게노파가, 마이코박테륨, 자바르지니아, 쿠프라비두스, 세네코시스티스, 클로로플렉수스, 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로미크로븀, 메틸로스페라, 메틸로칼둠, 메틸로시스티스, 메틸로시누스, 메타노박테륨, 메타노코커스, 메타노게늄, 메타노사르시나, 메타노셰라, 메타노서모박터, 메타노트릭스, 코리네박테륨, 아시네토박터, 악티노마이세스, 박테리오데스, 부르콜리데리아, 브레비박테륨, 파이로코커스, 지오박터, 지오바실러스, 파에니바실러스, 마이코박테륨, 로도슈도모나스, 서마토가, 서모언에어로박터, 스트렙토마이세스, 로도박터, 로도코커스, 펩토코커스, 비피도박테륨, 프로피오니박테륨, 푸소박테륨, 캄필로박터, 베일로넬라, 아쿠인콜라, 아트로박터, 모락셀라, 및 사이크로박터 속으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 일산화탄소 영양성 아세트산 생성 미생물의 군, ABE 미생물의 군, 장내세균의 군, 젖산균의 군, 진균류 및 효모의 군, 호기성 일산화탄소 영양주의 군, 호기성 CO2 고정 유기체의 군, 메틸 영양주의 군, 및 메탄 생성 미생물의 군으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 일산화탄소 영양성 아세트산 생성 박테리아의 군으로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 락스탈레이, 클로스트리듐 카르복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 코스카티이, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 마그눔, 클로스트리듐 sp ., 부티리박테륨 리모숨, 부티리박테륨 메틸로트로피쿰, 아세토박테륨 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 유박테륨 리모숨, 무렐라 서모아세티카, 무렐라 서모토트로피카, 옥소박터 펜니기이, 및 서모언에어로박터 키우비를 포함하는 군으로부터 선택된다.
이들 일산화탄소 영양성 아세토젠은 혐기성 조건 하에서 에너지원으로서 일산화탄소(CO) 및/또는 수소(H2)를 이용하여 가스질 1-탄소(C1) 소스, 예컨대 일산화탄소(CO) 및 이산화탄소(CO2)를 이용하여 화학 합성 독립 영양에 의해 성장하하여 아세틸-CoA, 아세테이트 및 다른 생성물을 형성하는 그의 능력에 의해 정의된다. 상기 일산화탄소 영양성 아세토젠들은 동일한 모드의 발효, 우드-륭달 또는 환원적 아세틸-CoA 경로를 공유하며, 일산화탄소 데히드로게나아제(CODH), 히드로게나아제, 포르메이트 데히드로게나아제, 포르밀-테트라히드로폴레이트 신테타아제, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 데히드로게나아제, 포르밀-테트라히드로폴레이트 시클로히드롤라아제, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 리덕타아제, 및 일산화탄소 데히드로게나아제/아세틸-CoA 신타아제(CODH/ACS)로 이루어진 효소 세트의 존재에 의해 정의되는데, 상기 조합은 이러한 유형의 박테리아에 특징적이고 독특한 것이다(문헌[
]). 기질을 바이오매스, 2차 대사 산물 및 피루베이트 - 이로부터 생성물이 형성됨(아세틸-CoA를 통하여 또는 직접적으로) - 로 전환시키는 당 발효 박테리아의 화학 합성 유기 영양(chemoheterotrophic) 성장과는 대조적으로, 아세트산 생성 미생물에서 기질은 아세틸-CoA로 직접적으로 채널링되며(channelled), 이로부터 생성물, 바이오매스, 및 2차 대사 산물이 형성된다.
일 실시 양태에서, 미생물은 씨. 오토에타노게눔, 씨. 륭달리이, 및 "씨. 락스달레이" 종 및 관련 단리체를 포함하는 일산화탄소 영양 클로스트리듐강(Clostridia)의 클러스터로부터 선택된다. 이는 하기 주: 씨. 오토에타노게눔 JAI-1T(DSM10061)(문헌[Abrini, Naveau, & Nyns, 1994]), 씨. 오토에타노게눔 LBS1560(DSM19630)(국제 특허 공개 제WO/2009/064200호), 씨. 오토에타노게눔 LBS1561(DSM23693), 씨. 륭달리이 PETCT(DSM13528 = ATCC 55383)(문헌[Tanner, Miller, & Yang, 1993]), 씨. 륭달리이 ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 제5,593,886호), 씨. 륭달리이 C-01(ATCC 55988)(미국 특허 제6,368,819호), 씨. 륭달리이 O-52(ATCC 55989)(미국 특허 제6,368,819호), 또는 "씨. 락스달레이 P11T"(ATCC BAA-622)(국제 특허 공개 제WO 2008/028055호), 및 관련 단리체, 예컨대 "씨. 코스카티이"(미국 특허 공개 제2011/0229947호), "클로스트리듐 sp . MT351"(문헌[Tyurin & Kiriukhin, 2012]), 및 이들의 돌연변이주, 예컨대 씨. 륭달리이 OTA-1(문헌[Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010]) 또는 "클로스트리듐 sp . MT896"(문헌[Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012])을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
이들 주는 16S rRNA 유전자 수준에서 99% 이상의 동일성을 갖는, 클로스트리듐 rRNA 클러스터 I(문헌[Collins et al., 1994]) 내의 하위클러스터(subcluster)를 형성하지만, DNA-DNA 재회합 및 DNA 핑거프린팅(fingerprinting) 실험에 의해 결정할 경우 특유한 종이다(국제 특허 공개 제WO 2008/028055호, 미국 특허 공개 제2011/0229947호).
이 클러스터의 주는 유사한 유전자형 및 표현형 둘 모두를 갖는 공통 특성에 의해 정의되며, 이들 전부는 동일한 모드의 에너지 보존 및 발효 대사를 공유한다. 이 클러스터의 주는 사이토크롬이 결여되어 있으며, Rnf 복합체를 통하여 에너지를 보존한다.
이 클러스터의 모든 주는 대략 4.2 MBp의 게놈 크기(문헌[
]) 및 대략 32 몰%의 GC 조성(문헌[Abrini et al., 1994]; 문헌[
]; 문헌[Tanner et al., 1993])(국제 특허 공개 제WO 2008/028055호; 미국 특허 공개 제2011/0229947호), 및 우드-륭달 경로의 효소(일산화탄소 데히드로게나아제, 포르밀-테트라히드로폴레이트 신테타아제, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 데히드로게나아제, 포르밀-테트라히드로폴레이트 시클로히드롤라아제, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 리덕타아제, 및 일산화탄소 데히드로게나아제/아세틸-CoA 신타아제), 히드로게나아제, 포르메이트 데히드로게나아제, Rnf 복합체(rnfCDGEAB), 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타아제, 알데히드:페레독신 옥시도리덕타아제)(문헌[
, 2011])를 암호화하는 보존된 필수 핵심 유전자 오페론을 갖는다. 가스 흡수에 책임이 있는 우드-륭달 경로 유전자의 조직 및 수는, 핵산 및 아미노산 서열이 상이함에도 불구하고, 모든 종에서 동일한 것으로 밝혀졌다(문헌[
]).
상기 주 모두는 유사한 형태 및 크기를 가지며(대수적 성장 세포는 0.5-0.7 x 3-5 ㎛임), 중온성이며(최적 성장 온도:30-37℃), 엄격하게 혐기성 미생물이다(문헌[Abrini et al., 1994]; 문헌[Tanner et al., 1993])(국제 특허 공개 제WO 2008/028055호). 게다가, 이들 모두는 동일한 주요한 계통 발생학적 형질, 예컨대 동일한 pH 범위(pH 4-7.5, 이때 최적 초기 pH는 5.5-6임), CO 함유 가스에서 유사한 성장 속도로 강한 독립 영양적 성장을 함, 및 주요 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산을 포함하는 대사 프로파일로서, 이때 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산이 특정 조건 하에서 형성되는 것을 공유한다(문헌[Abrini et al., 1994]; 문헌[
]; 문헌[Tanner et al., 1993])(WO는 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘), 또는 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 기질 이용 면에서 구별된다). 상기 종들 중 일부는 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 바이오틴)에 대하여 영양 요구성인 것으로 밝혀진 반면, 다른 것은 그렇지 않았다. 카르복실산을 그의 상응하는 알코올로 환원시키는 것이 일련의 이들 미생물에서 나타났다(문헌[Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012]).
따라서, 기술된 형질은 1가지 유기체, 예컨대 씨. 오토에타노게눔 또는 씨. 륭달리이에 특이적인 것이 아니며, 오히려 일산화탄소 영양, 에탄올 합성 클로스트리듐강의 일반 형질이다. 따라서, 본 발명은 이들 주 전체에 걸쳐 작용하는 것으로 예상될 수 있지만, 성능 면에서 차이가 있을 수 있다.
일 실시 양태에서, 모 주는 그의 유일한 탄소 및 에너지원으로서 CO를 이용한다.
특정한 실시 양태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 및 클로스트리듐 락스탈레이를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 상기 군은 또한 클로스트리듐 코스카티이를 포함한다. 특정한 일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM10061 또는 DSM23693이다. 또 다른 특별한 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 륭달리이 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 ABE 발효 미생물이다. "ABE 발효 미생물" 또는 "ABE 미생물"은 그람(Gram) 양성, 클로스트리듐강 유기체이며, 이는 용매인 부탄올, 및 에탄올, 및 아세톤 또는 이소프로판올을 생성할 수 있다. 이 군의 속은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 베이제린키이, 클로스트리듐 사카로부틸리쿰, 및 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰을 포함한다. 이들 유기체는 모두 포자 형성성, 그람 양성이고, 클로스트리듐강 rRNA 클러스터 I 내에 있다. 이 군은 문헌[Keis et al., Keis, Shaheen, & Jones, 2001]에 상세하게 기술되어 있다.
특정한 일 실시 양태에서, ABE 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 베이제린키이, 클로스트리듐 사카로부틸리쿰, 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 또는 클로스트리듐 베이제린키이이다. 특정한 일 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824(DSM792) 또는 EA 2018(CCTCC M 94061)이다. 또 다른 특별한 실시 양태에서, 미생물은 클로스트리듐 베이제린키이 NCIMB8052(ATCC51743) 및 NRRL B-593(DSM 6423)이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 장내세균이다. 장내세균은 당을 발효시켜 락트산, 및/또는 에탄올, 및/또는 아세토인, 및/또는 2,3-부타베디올, 및/또는 다른 생성물을 생성할 수 있는 장내세균목(Enterobacteriacea)에 속하는 간상 그람 음성 박테리아이다.
특정한 일 실시 양태에서, 장내세균은 에스케리키아, 클렙시엘라, 자이모모나스, 시트로박터, 엔테로박터, 살모넬라, 세라티아를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 에스케리키아 콜라이, 자이모노나스 모빌리스,클렙시엘라 뉴모니아, 클렙시엘라 옥시토카, 엔테로박터 클로아카에 또는 세라티아 마르세센스이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 젖산균이다. 젖산균은 당을 발효시켜 락트산, 및/또는 2,3-부타베디올, 및/또는 MEK, 및/또는 2-부탄올, 및/또는 다른 생성물을 생성할 수 있는 락토바실러스목으로부터 선택되는 그람 양성 락트산 박테리아이다.
특정한 일 실시 양태에서, 젖산균은 락토바실러스, 락토코커스, 엔테로코커스, 페디오코커스, 스트렙토코커스를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 락토바실러스 브레비스, 엔테로코커스 패칼리스, 락토코커스 락티스이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 진균류 또는 효모이다. 진균류는 진핵 미생물이며, 효모는 이의 특정 하위세트(subset)인데, 이는 당을 에탄올 및/또는 아세토인, 및/또는 다른 생성물로 발효시킬 수 있다.
특정한 일 실시 양태에서, 진균류는 아스페르길루스, 트리코데르마, 엑소필라, 뮤코르, 클라도스포륨, 파네로카에테, 클라디오필랄로포라, 파에실로마이세스, 스케도스포륨, 오피스토마를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 아스파르길루스 니게르 또는 트리크더마 레세이이다.
특정한 일 실시 양태에서, 효모는 사카로마이세스, 피키아, 칸디다, 한세눌라, 야로위아, 로도토룰라, 리조푸스, 트리코스포론, 리포마이세스를 포함하는 군 및 아스페르길루스, 트리코데르마, 엑소필라, 뮤코르, 클라도스포륨, 파네로카에테, 클라디오필랄로포라, 파에실로마이세스, 스케도스포륨, 오피스토마를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 사카로마이세스 세레비지에, 칸디디아 트로피칼리스, 칸디디아 알비칸스 또는 야로위아 리포라이티카이다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 아스파르길루스 니게르 또는 트리크더마 레세이이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 호기성, 일산화탄소 영양 미생물이다. 호기성, 일산화탄소 영양 미생물은 자연에서 편재적으로 발견될 수 있으며 인간 뿐만 아니라 다양한 환경으로부터 단리된 박테리아이다(문헌[King and Weber, 2007]). 분류학적 수준에서, 이러한 생리학적 군은 꽤 다양하며, 이는 상이한 문, 예컨대 α-프로테오박테리아, 후벽균, 또는 방선균으로 이루어진다(문헌[King and Weber, 2007]). 모든 이들 유기체는 공기의 존재 하에 1% 초과의 CO 수준에서 성장하는 것으로 밝혀졌다(문헌[King and Weber, 2007]). 전형적인 가스 믹스는 50% CO와 50% 공기로 이루어진다(문헌[Cypionka et al., 1980]).
특별한 실시 양태에서, 모 미생물은 바실러스, 올리고트로파, 슈도모나스, 카르보필루스, 히드로게노파가, 마이코박테륨, 자바르지니아를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 올리고트로파 카르복시도보란스, 카르보필루스 카르복시두스, 히드로게노파가 슈도플라바, 마이코박테륨 sp ., 슈도모나스 카르복시도히드로게나, 슈도모나스 sp ., 자바르지니아 콤프란소리스 또는 바실러스 슐레겔리이이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 호기성 CO2 고정 유기체이다. 호기성 CO2 고정 미생물은 산소의 존재 하에 광합성을 통하여 또는 H2를 이용하여 CO2를 고정할 수 있는 박테리아이다. 호기성 CO2 고정 미생물은 쿠프라비두스, 세네코시스티스, 클로로플렉수스를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 쿠프라비두스 네카토르, 세네코시스티스 sp . 또는 클로로플렉수스 아우란티쿠스이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 메틸 영양주이다. 메틸 영양 미생물은 성장을 위하여 탄소원으로서 메탄 또는 메탄올로서의 환원된 1-탄소 기질을 이용할 수 있다. 메틸 영양주는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로미크로븀, 메틸로스페라, 메틸로칼둠, 메틸로시스티스, 메틸로시누스를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 메틸로코커스 캅술라투스 또는 메틸로시누스 트리코스포륨이다.
일 실시 양태에서, 모 미생물은 메탄 생성 미생물이다. 메탄 생성 미생물은 CO2를 메탄으로 환원시킬 수 있는 고세균이다. 메탄 생성 미생물은 메타노박테륨, 메타노코커스, 메타노게늄, 메타노사르시나, 메타노셰라, 메타노서모박터, 메타노트릭스를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 모 미생물은 메타노서모박터 마르부르겐시스 또는 메타노사르시나 바케리이다.
방법
본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 이용하여 기질의 미생물 발효에 의해 이소프로판올, 에탄올, 2,3-부탄디올 및/또는 2-부탄올 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 방법은 아세토인, MEK, 아세트알데히드 및 아세톤 중 하나 이상, 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시 양태에서, 기질은 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질이다. 또 다른 실시 양태에서, 기질은 CO, CO2, 및 H2 중 1가지 또는 이들의 조합물을 포함하는 기질이다. 특정한 실시 양태에서, 하나 이상의 탄수화물, 및 CO, CO2, 및 H2 중 1가지를 포함하는 기질 둘 모두를 포함하는 혼합 기질이 사용될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 하나 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 생물 반응기에 기질을 제공하는 단계; 및
(b) 생물 반응기에서 상기 배양물을 발효시켜 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 생성하는 단계.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 생성물은 이소프로판올을 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(c) 본 발명의 하나 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 생물 반응기에 기질을 제공하는 단계; 및
(d) 생물 반응기에서 상기 배양물을 발효시켜 아세토인, MEK, 아세트알데히드 및 아세톤 중 하나 이상 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 생성하는 단계.
본 방법은 하나 이상의 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 생성물은 하나 이상의 하류 생성물의 생성에 있어서 중간체이다. 이 실시 양태에서, 예를 들어 상기 하나 이상의 생성물은 회수되고, 그 후 별도의 발효에서 또는 화학적 합성 반응에서 기질로서 사용될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 생성물은 회수되지 않으며, 동일 발효 공정에서 하나 이상의 하류 생성물로 전환된다.
미생물의 성장 및 기질의 상기 하나 이상의 생성물(들)로의 전환이 일어나기 위해서는 기질 외에, 적합한 액체 영양 배지를 생물 반응기에 공급할 필요가 있음이 인지된다. 기질 및 배지는 연속식, 배치식 또는 유가식으로 생물 반응기에 공급될 수 있다. 영양 배지는 사용되는 미생물의 성장을 가능케 하기에 충분한 비타민 및 미네랄을 함유한다. 발효에 적합한 배지는 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 예로서, 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질의 발효에 있어서, 루리아 브로쓰(Luria Broth; LB), 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(Yeast Extract Peptone Dextrose; YEPD) 또는 클로스트리듐강용 강화 배지(reinforced clostridia media; RCM)가 사용될 수 있다. 게다가, CO를 사용한 발효에 적합한 혐기성 배지가 당업계에 공지되어 있지만, 예로서, 적합한 배지가 문헌[Biebel (2001)]에 기술되어 있다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 배지는 이하에서 실시예 섹션에 기술된 바와 같다.
바람직하게는 발효는 기질의 하나 이상의 생성물(들), 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물(들)로의 발효가 일어나게 하기에 적절한 조건 하에서 실시되어야 한다. 고려되어야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반 탱크형 반응기를 사용할 경우), 접종 수준, 기질이 제한적으로 되지 않음을 보장하는 최대 기질 농도, 및 생성물 저해를 회피하는 최대 생성물 농도를 포함한다.
상기에 나타낸 바와 같이, 발효는 적절한 배지 및 발효 조건을 이용하여 실시된다. 일 실시 양태에서, 가스질 기질이 사용될 경우, 액체상 중 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2)가 제한적으로 되지 않음을 보장하기 위하여 최대 가스 기질 농도가 고려된다.
게다가, 흔히, 기질 스트림의 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2) 농도(또는 가스질 기질 중 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2) 분압)을 증가시키고 그에 따라 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2)가 기질인 경우 발효 반응의 효율을 증가시키는 것이 바람직하다. 증가된 압력에서의 작업은 가스상으로부터 액체상으로의 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2) 이전 속도의 유의한 증가를 허용하는데, 액체상에서 이것은 하나 이상의 생성물의 생성을 위한 탄소원으로서 미생물에 의해 흡수될 수 있다. 이는 다시, 생물 반응기가 대기압이라기보다는 오히려 승압에서 유지될 때 체류 시간(생물 반응기에서의 액체 부피를 유입 가스 유량으로 나눈 것으로 정의됨)이 감소될 수 있음을 의미한다. 최적 반응 조건은 사용되는 본 발명의 특정 미생물에 부분적으로 의존한다. 그러나, 일반적으로, 발효는 주위 압력보다 더 높은 압력에서 수행되는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2)의 하나 이상의 생성물(들)로의 전환 속도는 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이며, 요망되는 체류 시간의 달성은 다시 생물 반응기의 요구되는 부피를 말해주기 때문에, 가압 시스템의 사용은 요구되는 생물 반응기의 부피를 크게 감소시킬 수 있으며, 그 결과, 발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. 미국 특허 제5,593,886호에 주어진 실시예에 따르면, 반응기 부피를 선형 비율로 감소시켜 반응기 작동 압력을 증가시킬 수 있으며, 즉, 10기압의 압력에서 작동되는 생물 반응기는 1기압의 압력에서 작동되는 것의 부피의 단지 1/10일 필요가 있다.
예로서, 승압에서 가스의 에탄올로의 발효를 행하는 것의 이익이 기술되었다. 예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 02/08438호에는 30 psig 및 75 psig의 압력 하에서 수행되는 가스의 에탄올로의 발효가 기술되어 있는데, 이는 각각 일일 150 g/l 및 369 g/l의 에탄올 생산성을 제공한다. 그러나, 유사한 배지 및 유입 가스 조성을 이용하여 대기압에서 수행된 예시적인 발효는 일일 10 내지 20배 더 적은 리터당 에탄올을 생성하는 것으로 밝혀졌다.
또한, CO(및/또는 CO2 및/또는 H2) 함유 가스질 기질의 도입 속도는 액체상 중 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2)의 농도가 제한적으로 되지 않는다는 것을 보장하도록 하는 것이 바람직하다. 이는 CO(및/또는 CO2 및/또는 H2) 제한 조건의 결과가 생성물(들)이 배양물에 의해 소비되는 것일 수 있기 때문이다.
발효 반응물의 공급에 사용되는 가스 스트림의 조성은 그 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, O2는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전 또는 후에 발효 공정의 단계에서의 원하지 않거나 불필요한 가스의 프로세싱은 이러한 단계에 대한 부담을 증가시킬 수 있다(즉, 가스 스트림이 생물 반응기에 유입되기 전에 압출될 경우, 발효에서 필요하지 않은 가스의 압축에 불필요한 에너지가 사용될 수 있다). 따라서, 기질 스트림, 특히 산업 자원으로부터 유래된 기질 스트림을 처리하여, 원하지 않는 성분을 제거하고 바람직한 성분의 농도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 미생물의 배양물은 수성 배양 배지 중에 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 최소 성장 배지이다. 적합한 배지는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,173,429호 및 미국 특허 제5,593,886호와 국제 특허 공개 제WO 02/08438호에 기술되어 있고, 이하에서 실시예 섹션에 기술된 바와 같다.
CO를 포함하는 기질의 발효를 포함하는 본 발명의 실시 양태에서, 발효는 본 발명의 재조합 미생물을 이용하여 생물 반응기에서 기질을 혐기적으로 발효시켜 하나 이상의 생성물을 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 산업 공정으로부터의 전체 대기중 탄소 방출을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 하나 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 생물 반응기에 CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계; 및
(b) 생물 반응기 내의 배양물을 혐기적으로 발효시켜 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올, 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 생성하는 단계.
또 다른 실시 양태에서, 상기 단계 (b)에서의 상기 하나 이상의 생성물은 아세토인, MEK, 아세트알데히드 및 아세톤과, 임의로, 하나 이상의 다른 생성물이다.
일 실시 양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
산업 공정의 결과로서 생성된 CO 함유 가스를, 상기 가스가 대기중으로 방출되기 전에 포획하는 단계;
본 발명의 하나 이상의 미생물을 함유하는 배양물에 의해 CO 함유 가스를 혐기적으로 발효시켜 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올, 및 2-부탄올 중 하나 이상 및 임의로, 하나 이상의 다른 생성물을 생성하는 단계.
또 다른 실시 양태에서, 상기 단계 (b)에서의 상기 하나 이상의 생성물은 아세토인, MEK, 아세트알데히드 및 아세톤과, 임의로, 하나 이상의 다른 생성물이다.
본 발명의 소정 실시 양태에서, 미생물에 의해 발효되는 가스질 기질은 CO를 함유하는 가스질 기질이다. 가스질 기질은 산업 공정의 부산물로서 수득되는, 또는 자동차 배기 가스로부터의 것과 같은 일부 다른 소스로부터의 CO 함유 폐기 가스일 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 산업 공정은 철금속 제품 제조 공정, 예컨대 강철 밀(mill), 비철 제품 제조 공정, 석유 정제 공정, 석탄의 가스화, 전력 생산, 카본 블랙의 제조, 암모니아 생성, 메탄올 생성 및 코크스의 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 실시 양태에서, CO 함유 가스는, 임의의 편리한 방법을 이용하여, 이것이 대기중으로 방출되기 전에 산업 공정으로부터 포획될 수 있다. CO는 합성가스(일산화탄소 및 수소를 포함하는 가스)의 성분일 수 있다. 산업 공정으로부터 생성된 CO는 보통 플레어 제거되어(flared off) CO2를 생성하며, 따라서 본 발명은 CO2 온실 가스 방출의 감소 및 바이오연료로서 사용하기 위한 부탄올의 제조에 특별한 유용성을 갖는다. 가스질 CO 함유 기질의 조성에 따라, 이것을 발효에 도입하기 전에 분진 입자와 같은 임의의 요망되지 않는 불순물이 제거되도록 상기 기질을 처리하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 가스질 기질은 공지된 방법을 이용하여 여과되거나 스크러빙될(scrubbed) 수 있다.
당업자라면, 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질을 이용하는 발효에서 다양한 사용 방법을 쉽게 인지할 것이다. 그러나, 예로서, 문헌[Vogel, H. C., & Todaro, C. C. (2007). Fermentation and Biochemical Engineering Handbook: Principles, process design and equipment (ISBN: 0-8155-1407-7)]; 문헌[Vogel, H. C., & Todaro, C. C. (1996). Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (ISBN: 978-0-8155-1407-7)]; 문헌[Ezeji TC, Qureshi N, Blaschek HP (2005) Industrial relevant fermentations. Handbook on Clostridia, ed 
(CRC Press, Boca Raton, FL), pp 799-814]에 기술된 방법이 이용될 수 있다.
생성물 회수
이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올, 2-부탄올, 아세토인, MEK, 아세트알데히드 및/또는 아세톤 또는 이들 생성물 중 임의의 하나 이상 및 아세톤 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 함유하는 혼합 스트림이 당업계에 공지된 방법, 예컨대 분별 증류 또는 증발, 투석증발, 가스 스트립핑(stripping) 및 예를 들어 액체-액체 추출을 포함하는 추출 발효에 의해 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 생성물은 계속적으로 상기 브로쓰의 일부분을 생물 반응기로부터 제거하고, 미생물 세포를 (편리하게는 여과에 의해) 브로쓰로부터 분리하고, 하나 이상의 생성물을 브로쓰로부터 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수된다. 알코올은 예를 들어 증류에 의해 편리하게 회수될 수 있다. 아세톤은 예를 들어 증류에 의해 회수될 수 있다. 생성된 임의의 산은 예를 들어 활성탄 상에의 흡착에 의해 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 발효 생물 반응기로 되돌려진다. 임의의 알코올(들) 및 산(들)이 제거된 후 잔존하는 세포 무함유 투과물도 바람직하게는 발효 생물 반응기로 되돌려진다. 세포 무함유 투과물이 생물 반응기로 되돌려지기 전에 추가의 영양소(예컨대 B 비타민)가 세포 무함유 투과물에 첨가되어 영양 배지를 보충할 수 있다.
또한, 브로쓰의 pH를 상기에 기술한 바와 같이 조정하여 아세트산의 활성탄에의 흡착을 향상시킬 경우, pH는 생물 반응기로 되돌려지기 전에 발효 생물 반응기 내의 브로쓰의 pH와 유사한 pH로 재조정되어야 한다.
실시예
실시예
1 - 씨.
오토에타노게눔의
야생형 알코올 데히드로게나아제의 특성화 및 단일 아미노산 치환에 의한 기질 특이성이 범위
씨. 륭달리이를 포함하는 클로스트리듐의 몇몇 종(문헌[
])은 에탄올을 최종 생성물로 하여, 유일한 탄소원으로서 CO를 이용하는 것으로 밝혀졌다. 당해 박테리아는 우드-륭달 경로를 통하여 CO를 고정하여 이것을 아세틸-CoA로 전환시킬 수 있다. 그 후 아세틸 CoA의 아세틸 모이어티(moiety)는 다양한 대사 경로에서 사용될 수 있다. 여기서 특히 관심있는 것은 카르보닐 기가 알코올 데히드로게나아제(ADH) 효소에 의해 그의 상응하는 알코올로 환원될 수 있다는 것이다(문헌[
]). 이는 CO를 상업적으로 가치있는 바이오연료 및 바이오화학물질로 전환시키는 경로를 제공한다.
씨. 오토에타노게눔 DSM10061 주의 게놈 서열 번호 결정에 의해, 씨. 베이제린키이 유래의 이전에 특성화된 효소와 86% 동일한 ADH를 동정하였다. 이 주 유래의 ADH는 아세트알데히드를 그의 기질로 이용하여 에탄올을 최종 생성물로 생성할 수 있다. 또한 이것은 아세톤의 이소프로판올로의 환원을 촉매할 수 있다.
이소프로판올은 에탄올보다 더 경제적으로 가치있는 최종 생성물이며, 그 이유는 이소프로판올이 탈수되어 프로필렌을 형성할 수 있고 이는 일반적으로 사용되는 플라스틱인 폴리프로필렌으로 중합될 수 있기 때문이다(문헌[Inokuma et al., 2010]). 프로필렌으로의 미생물에 의한 경로는 또한 석유에 대한 수요를 감소시키는데, 현재 대부분의 프로필렌이 상기 석유로부터 유도된다.
돌연변이 연구는 ADH 효소를 통한 이소프로판올 생성의 효율을 향상시키는 것을 목표로 하여 완료하였다. 하기 5가지의 돌연변이체를 구성하여 테스트하였다: Ser199Asp, Ser199Glu, Arg200Gln, Arg200Glu 및 이중 돌연변이체 Ser199Glu/Arg200Gln.
재료
미생물 및 성장 조건
이. 콜라이 DH5α-E를 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 획득하였다. 이 주의유전자형은 다음과 같다:F-80ΔlacZM15(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) gal- phoA supE44- thi-1 gyrA96 relA1.
이. 콜라이 LMG194를 인비트로겐으로부터 획득하였다. 이 주의 유전자형은 다음과 같다: F- ΔlacX74 galE thi rpsL ΔphoA (Pvu II) Δara714 leu::Tn10.
이. 콜라이 MC1061을 콜라이 제네틱 스톡 센터(Coli Genetic Stock Centre)로부터 획득하였다. 이 주의 유전자형은 다음과 같다: araD139 Δ (araA-leu)7697 Δ (lac)X74 galK16 galE15(GalS) lambda- e14- mcrA0 relA1 rpsL150(strR) spoT1 mcrB1 hsdR2.
클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM10061을 DSMZ(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 독일 38124 브라운스슈바이크 인호펜스트라쎄 7 베)로부터 획득하였다.
씨. 아세토부틸리쿰 ATCC824 및 씨. 베이제린키이 NCIMB8052를 데이비드 존스(David Jones) 교수(유니버시티 오브 오타고(University of Otago))로부터 획득하였으며, 이는 또한 공공 주 콜렉션인 DSMZ 및 ATCC로부터 각각 등록 번호 ATCC824/DSM792 및 ATCC51743으로 획득할 수 있다.
모든 이. 콜라이 주를 암피실린(100 ㎍/mL) 또는 카르베니실린(50 ㎍/mL) 중 어느 하나를 보충한 루리아 부르타니(Luria Burtani) 배지를 사용하여 호기성 조건에서 배양하였다. 고체 배지는 1.5%의 한천을 함유하였다. 달리 나타내지 않으면, 모든 주를 37℃에서 성장시켰다.
SOC 배지(20 g/L의 트립톤, 5 g/L의 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl 및 20 mM 글루코스)를 전기천공 후 이. 콜라이의 회복용으로 사용하였다.
클로스트리듐 오토에타노게눔을 pH 5.6의 PETC 배지(표 1)에서 성장시키고, 씨. 아세토부틸리쿰 및 씨. 베이제린키이를 RCM 배지(표 2)에서 성장시켰는데, 이는 표준 혐기성 기술을 이용하였다(문헌[Hungate RE: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes, in Norris JR and Ribbons DW (eds.), Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, New York, 1969: 117-132]; 문헌[Wolfe RS: Microbial formation of methane. Adv Microb Physiol 1971, 6: 107-146]).
ADH
유전자 및 단백질
씨. 오토에타노게눔 DSM10061의 야생형 ADH의 아미노산 및 핵산 서열이 각각 서열 번호 36 및 서열 번호 35에 예시되어 있다.
프라이머
플라스미드
pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh(도 8)를 씨. 오토에타노게눔 DSM10061 ADH 유전자의 증폭에 사용하였다.
플라스미드 pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh는 표준 재조합 DNA 기술 및 분자 클로닝 기술을 이용하여 구성하였다(문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989]; 문헌[Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K: Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987]). ThlA 유전자(NC_003030.1; GI: 1119056)를 씨. 아세토부틸리쿰의 게놈 DNA로부터 증폭시키고, 유전자 adc - ctfAB -adc(NC_009617; 영역: 4,400,524-4,402,656; 하기를 포함함: GI: 5294994, GI: 5294995, 및 GI: 5294996)를 씨. 베이제린키이로부터 증폭시키고, adh 유전자(도 5) 및 우드-륭달 프로모터 영역(서열 번호 39)을 씨. 오토에타노게눔 DSM10061로부터 증폭시켰다. 증폭에 사용한 올리고뉴클레오티드 서열이 표 4에 주어져 있다. 후속적으로, 모든 증폭된 단편을 제한효소 부위 NotI, NdeI, EcoRI, KpnI, BamHI, SalI, XhoI을 이용하여 플라스미드 pMTL 85141(FJ797651.1; 니겔 민톤(Nigel Minton), 유니버시티 오브 노팅엄(University of Nottingham), 영국) 내에 클로닝하였다(문헌[Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85]). 최종 플라스미드가 서열 번호 40에 주어져 있으며, 이를 서열 번호 결정하여 이것에 돌연변이가 부재함을 보장하였다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824, 씨. 베이제린키이 NCIMB8052 및 씨. 오토에타노게눔 DSM10061로부터의 게놈 DNA를 문헌[Bertram and 
, Conjugal transfer and expression of streptococcal transposons in Clostridium acetobutylicum. Arch Microbiol 1989, 151: 551-557]의 변형된 방법을 이용하여 단리하였다. 100 ml의 하룻밤 배양물을 수확하고(6,000 x g, 15분, 4℃), 인ㅅㄴ칼륨 완충제(10 mM, pH 7.5)로 세척하고, 1.9 ml STE 완충제(50 mM 트리스(Tris)-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM 수크로스; pH 8.0) 중에 현탁시켰다. 300 ㎕의 라이소자임(대략 100,000 U)을 첨가하고, 상기 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 280 ㎕의 10%(w/v) SDS 용액을 첨가하고, 추가로 10분 동안 인큐베이션하였다. RNA는 240 ㎕의 EDTA 용액(0.5 M, pH 8), 20 ㎕의 트리스-HCl(1 M, pH 7.5), 및 10 ㎕의 RNase A를 첨가함으로써 실온에서 소화시켰다. 그 후, 100 ㎕의 프로테이나아제 K(0.5 U)를 첨가하였으며, 단백질 분해가 37℃에서 1 내지 3시간 동안 일어났다. 마지막으로, 600 ㎕의 과염소산나트륨(5 M)을 첨가하고, 이어서 페놀-클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전을 행하였다. DNA의 양 및 품질을 분광광도법에 의해 검사하였다.
발현 벡터 pBAD(KpnI)-WpiMetC를 인비트로겐으로부터 획득하였다. 이 연구에서 사용한 플라스미드는 헥사히스티딘(His6) 태그를 암호화하는 단편, TEV 프로테아제 절단 부위(요망될 경우, 정제 후 ADH로부터 His6을 제거하기 위한 것), 및 관련되지 않은 박테리아(볼바키아 피피엔티스(Wolbachia pipientis) 유래의 MetC 효소를 암호화하는 유전자의 삽입에 의해, 이전에 변형시켰다.
방법
야생형
ADH
의 증폭:
씨. 오토에타노게눔 DSM10061의 야생형 ADH를 프라이머 ADH_TEV_KpnI_for 및 ADH_HindIII_Reverse를 사용하여 플라스미드 pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh(LZ)의 50 ng/㎕의 워킹 스톡(working stock)으로부터 증폭시켰다.
50 μL PCR 혼합물을 하기와 같이 제조하였다:
하기 사이클링 조건을 이용하였다:
생성물을 사이클 퓨어 키트(Cycle Pure kit)(오메가 바이오-테크(Omega Bio-Tek))로 정화시켰다.
벡터 및 인서트의 소화:
pBAD 골격은 하기 레시피(recipe)를 이용하여, 효소 KpnI-HF 및 HindIII로 pBAD(KpnI)-WpiMetC를 소화시킴으로써 제조하였다:
증폭시킨 ADH 유전자를 KpnI-HF 및 HindIII으로 유사하게 소화시켰다:
둘 모두의 소화를 37℃에서 16시간 동안 실시하였다. 소화된 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분리하고, 이를 SYBRsafe(인비트로겐)로 염색하였다. 소화된 벡터 및 인서트에 상응하는 밴드를 잘라 내고, DNA를 겔 클린업(clean-up) 키트(오메가 바이오-테크)를 사용하여 회수하였다.
pBAD
(
KpnI
)-
ADH
의 구성
벡터에 비하여 3배 몰 과량의 인서트를 포함하는 하기 반응물에서, ADH 및 pBAD 소화물로부터의 정제 DNA를, 대조구 라이게이션과 함께 라이게이션시켰다:
상기 반응물을 16℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 라이게이션 혼합물의 2 μL 분취물을 사용하여, 전기천공법에 의해 이. 콜라이 MC1061 세포의 50 μL 분취물을 형질전환시켰다. SOC에서 37℃에서 1시간 회복 후, 분취물들을 LB-암피실린 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 6개의 콜로니를 골라내고, pBAD_for 및 ADH_HindIII_rev 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 ADH 인서트의 존재에 대하여 스크리닝하였다. 700 ㎕의 배양물 및 300 ㎕의 살균 50%(v/v) 글리세롤을 이용하여 성공적인 클론으로 냉동 스톡을 만들었다. ADH 유전자의 서열을 DNA 서열 번호 결정에 의해 확인하였다.
ADH
의 부위 지정 돌연변이 유발
중첩 연장 PCR에 의해 모든 5가지의 돌연변이체를 구성하는 프로토콜은, 각각의 돌연변이체를 그의 상응하는 돌연변이 유발 프라이머를 이용하여 구성한 것을 제외하고는 동일하였다. 따라서, 단지 1가지의 돌연변이체를 생성하는 프로토콜을 제공하였다.
Ser199Asp
1차 생성물의 생성:
부위 지정 돌연변이 유발에서의 제1 단계는 2가지의 중첩 1차 생성물의 생성이었다. 이를 위한 PCR 반응물은 하기와 같다:
1차 생성물 1.0:
1차 생성물 1.1:
사이클링 조건은 하기와 같았다:
생성물을 오메가 사이클 퓨어 키트를 이용하여 정화시켰다.
Ser199Asp
2차 생성물의 생성:
부위 지정 돌연변이 유발에서의 다음 단계는, 외부 프라이머들을 이용하여 중첩 연장 PCR(문헌[Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 77, 51-59])을 사용하여 상기 두 1차 생성물을 전장 2차 생성물로 재조합시키는 것이었는데, 상기 전장 2차 생성물은 돌연변이가 도입된 전 유전자를 포함하였다. 상기 두 1차 생성물을 동일 몰 농도로 있도록 혼합한다. 하기 PCR 레시피를 사용하였다:
사이클링 조건은 야생형 ADH의 증폭에 대한 것과 동일하였다.
pBAD
(
KpnI
)-
ADH
(
Ser199Asp
)의 구성:
5가지의 ADH 돌연변이체(즉, 하기 돌연변이를 지님: Ser199Asp;Ser199Glu; Arg200Gln; Arg200Glu; 및 Ser199Glu/Arg200Gln) 각각의 클로닝을 위한 소화 및 라이게이션 프로토콜은 pBAD(KpnI)-ADH의 구성에 사용한 것과 동일하였다. 각각의 돌연변이의 존재를 DNA 서열 번호 결정에 의해 확인하였다.
ADH
효소의 발현 및 정제
발현 및 정제 프로토콜은, 나타낸 경우를 제외하고는, 야생형 뿐만 아니라 모든 돌연변이체에 대해서도 동일하였다. 야생형 ADH의 발현 및 정제 프로토콜을 하기에 제공한다.
가용성 물질의 발현의 테스트:
냉동 스톡으로부터의 5 mL의 LB-암피실린 하룻밤 배양물을 37℃에서 성장시키고, 다음날 아침에 이를 사용하여 100 mL LB-암피실린에 접종하였다. 상기 배양물은 0.8의 OD600이 도달될 때까지 37℃에서 인큐베이션하였다. 이 시점에, 1 mL의 20% 아라비노스를 첨가하고, 나머지의 발현을 위하여 배양물을 28℃에서 인큐베이션하였다. 500 μL의 샘플을 t = 0시간, 2시간, 4시간, 및 16시간(즉, 하룻밤)에 취하였다. 각각의 샘플에 있어서, 세포를 펠렛화하고, 상청액을 기울여 따라냈다. 그 후, 펠렛을 HEPES 완충제(50 mM Na-HEPES 및 0.2 mM DTT, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, 0.2 μL의 각각의 벤조나아제(Benzonase)(머크(Merck), 25 단위/μL) 및 알라이소자임(rLysozyme)(머크, 30 kU/μL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 그 후 3회 냉동(-80℃) 및 해동시켰다. 이 시점에, 10 μL를 '전체 단백질' 샘플로서 각각의 혼합물로부터 취하였다. 나머지 샘플을 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 얼음 위에 두었다. 상청액의 10 μL 분취물을 '가용성 단백질' 샘플로서 각각의 혼합물로부터 취하였다. 각각의 10 μL 전체 및 가용성 단백질 샘플에, 10 μL의 SDS 완충제를 첨가하고, 모든 혼합물을 98℃에서 5분 동안 가열하였다. 15 μL의 각각의 분취물을 12% 해상 겔 및 4% 스태킹(stacking) 겔을 포함하는 SDS-PAGE 겔 내에 로딩하였다. 상기 겔을 200 V에서 40분 동안 진행시켰다. 상기 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue)를 사용하여 하룻밤 염색시키고, 그 후 탈염색시켰다.
발현의 마지막에, 나머지 100 mL의 배양물을 50 mL 튜브에서 펠렛화하고, -80℃에서 냉동 보관하였다.
단백질 정제:
야생형 및 돌연변이 ADH 효소 모두는 그의 N-말단에 His6 태그를 지니기 때문에, 상기 효소들은 모두 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있었다. 상기에 기술된, (100 mL 배양물로부터의) 냉동 세포 펠렛을 0.5 ㎕ 알라이소자임(30 kU/㎕), 0.5 ㎕의 벤조나아제(25 U/㎕), 및 50 ㎕의 프로테아제 저해제의 칵테일(시그마(Sigma))을 포함하는 10 mL 빙냉 용해 완충제(50 mM 인산칼륨, 300 mM NaCl, pH 7.0) 중에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 초음파 처리에 의해 용해시키고, 불용성 잔사를 펠렛화하고, 상청액을 0.2 마이크로미터 필터를 사용하여 청징시켰다. 청징시킨 상청액을, 용해 완충제로 철저히 세척한 탈론(Talon) 수지(클론테크(Clontech))에 첨가하였다. 500 μL의 충진 부피를 야생형 ADH의 정제에 사용하고, 200 μL의 충진 부피를 각각의 돌연변이체의 정제에 사용하였다. 단백질을 4℃에서 1시간 동안 탈론 수지에 결합시키고, 그 후 용해 완충제로 수회 세척하였다. 150 mM 이미다졸이 보충된 용해 완충제를 사용하여 단백질을 컬럼으로부터 용출시키고, 용출물을 500 μL 분획물로 수집하였다. 정제 공정 동안 다양한 단계에서 취한 분취물 뿐만 아니라 모든 용출 분획물도 SDS page 겔 상에서 진행시켜 단백질의 존재를 확인하고 정제의 성공을 결정하였다. 아미콘 울트라-4 원심분리 필터 단위(Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit)(밀리포어( (Millipore))를 사용하여 보관 완충제(50 mM 인산칼륨, 150 mM NaCl, 10%(v/v) 글리세롤, pH 7.0)로 교환하여 넣었다.
야생형 단백질은 이. 콜라이에서 발현시킬 때 고도로 가용성이며, 쉽게 정제할 수 있었다(도 1). Ser199Asp 및 Arg200Gln 돌연변이 단백질도 고도고 가용성이었다(도 2). 다른 2가지의 점 돌연변이체(Ser199Glu 및 Arg200Glu)의 용해도는 더욱 가변적이었다(데이터를 예시하지 않음). 다소 놀랍게도, 이중 돌연변이체(Ser199Glu + Arg200Gln)는 Ser199Glu보다 더욱 가용성이었다(결과를 예시하지 않음).
Ser199Asp 돌연변이체의 서열은 서열 번호 37(핵산) 및 서열 번호 38(아미노산)에 제공되어 있다.
활성 검정
모든 활성 검정을 석영 큐벳을 갖춘 캐리(Cary) 100 UV/vis 분광광도계를 사용하여 실시하였다. 이 검정에서 사용한 모든 화학물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 공급되었다.
달리 나타내지 않으면, 검정은 0.2 mM의 보조 인자(NADPH/NADH) 농도, 3 mM의 기질(아세트알데히드, 아세틸-CoA, 아세톤, DL-아세토인, MEK) 농도 및 30 nM의 ADH 농도를 가졌다. 검정은 1 mM DTT를 포함하는 50 mM 트리스-HCl 완충제(pH 7.5)에서 실시하였다. 모든 검정은 신선하게 제조된 기질 및 보조 인자를 이용하여 3중으로 행하였다.
먼저, 씨. 오토에타노게눔의 야생형 효소를 측정하였으며, 상기 효소는 씨. 베이제린키이의 알코올 데히드로게나아제 효소에 대하여 기술된 바와 같이, 엄격하게 NADPH 의존성이었고, 이때 NADH에 의해서는 검출가능한 활성이 거의 없음이 밝혀졌다(도 11)(문헌[Ismaiel, Zhu, Colby, & Chen, 1993]).
그 후, 씨. 오토에타노게눔 DSM10061의 정제된 야생형 효소의 동역학적 특성(도 12)을 기저선으로서 결정하여, 치환을 갖는 돌연변이된 효소를 평가하였다(도 9). 몇몇 발효 경로에서 중요한 케톤(아세톤, MEK, 아세토인) 및 알데히드(아세트알데히드)를 이용하여 활성을 검출할 수 있었다(도 14).
후속적으로, 생성된 돌연변이 알코올 데히드로게나아제를 검정하고, 야생형 효소와 비교하였다. Ser199Glu 돌연변이체를 검정할 수 없었으며, 그 이유는 가용성 단백질이 전혀 없기 때문이었다. 조 세포 용해물의 검정에 의하면 ADH 활성이 전혀 나타나지 않았다. 가용성이지만, Arg200Gln 돌연변이체는 또한 검출가능한 활성을 전혀 나타내지 않았다. 당연히, 이들 둘, Ser199Glu + Arg200Gln이 조합된 돌연변이체도 불활성이었다. 3가지의 나머지 단백질 중, Arg200Glu의 활성은 단지 기질 농도를 5배(15 mM까지) 증가시키고 효소 농도를 6배(180 nM까지) 증가시켰을 때 측정가능하였다.
반면에, Ser199Asp 돌연변이체는 아세톤을 이용할 경우 거의 야생형만큼의 활성을 가졌다(도 3). 가장 흥미롭게는, Ser199Asp 돌연변이체는 아세톤에 대하여 더욱 특이적이다(도 4). 이는, 야생형 ADH를 Ser199Asp 돌연변이체로 대체하면 이소프로판올 생성이 증가될 수 있음을 나타낸다. 이 돌연변이체는 실시예 2에 기술한 바와 같이 추가의 치환을 위한 기반이었다.
실시예
2 - 다중 아미노산 치환에 의한 기질 및 보조 인자의 특이성의 변화
실시예 1로부터의 결과를 기반으로 하여, 본 발명자는 1 내지 4개의 아미노산 치환을 갖는 추가의 8가지의 알코올 데히드로게나아제 돌연변이체를 생성하여 이의 활성을 연구하였다.
재료
프라이머
플라스미드
돌연변이체 7에 대한 유전자 서열은 DNA 2.0에 의해 합성하였다. 서열은 이. 콜라이 내에서 단백질의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 합성된 유전자를 플라스미드 pJ201에 도입하였다. 상기 서열은 돌연변이체 7 ADH 유전자를 발현 벡터 pBAD(KpnI)-ADH 내에 서브클로닝하기 위한 HindIII 및 KpnI 제한효소 부위를 포함하였다.
방법
돌연변이체 7에 대한 발현 플라스미드의 구성
pBAD 골격은 pBAD(KpnI)-ADH를 제한 효소 KpnI-HF 및 HindIII-HF로 소화함으로써 제조하였다.
돌연변이체 7 유전자를 제한 효소 Kpn-HF 및 HindIII-HF로 pJ201 벡터로부터 유사하게 소화하였다.
소화된 생성물을 SYBRsafe(인비트로겐)로 염색된 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 소화된 벡터 및 인서트에 상응하는 밴드를 잘라내고, DNA를 겔 정화 키트(오메가 바이오-테크)를 사용하여 회수하였다.
정제된 인서트 및 벡터 DNA를 제조사의 표준 프로토콜에 따라 T4 DNA 리가아제(엔이비)를 사용하여 3:1 몰비의 인서트 대 벡터를 사용하여 라이게이션시켰다.
라이게이션 혼합물은 전기천공에 의해 이. 콜라이 MC 1061 세포를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환된 세포의 분취물을 LB-암피실린 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 선발하였다. 생성된 발현 플라스미드를 정제하고, 돌연변이체 7 유전자의 서열을 DNA 서열 번호 결정에 의해 확인하였다. 냉동 스톡을 성공적인 클론으로 만들었다.
ADH
의
퀵체인지
돌연변이 유발
돌연변이체 8, 9, 10, 11 및 12의 구성을 위해 사용된 주형 DNA는 pBAD(KpnI)-돌연변이체 7 ADH이었다. 돌연변이체 13의 구성을 위해 사용된 주형 DNA는 pBAD(KpnI)-ADH이었다. 상이한 주형 DNA, 및 상응하는 돌연변이 유발 프라이머 이외에, 돌연변이체 8-13을 구성하기 위한 프로토콜은 동일하였다. 각각의 돌연변이체는 그의 표준 권장 프로토콜에 따라 스트라타젠 (Stratagene)의 퀵체인지 II 부위 지정 돌연변이 유발 키트를 사용하여 구성하였다. 각각의 돌연변이체 구성을 위해 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 표 5에 제시된다.
열 충격에 의해 화학적 적격성 이. 콜라이 XL1-블루 세포를 형질전환하기 위해 퀵체인지 돌연변이 유발 반응의 생성물을 사용하였다. 단일 콜로니를 선발하였다. 생성된 발현 플라스미드를 정제하고, 각각의 돌연변이체 유전자의 서열을 DNA 서열 번호 결정에 의해 확인하였다. 냉동 스톡은 각각의 성공적인 클론으로 만들었다.
단백질 발현 및 정제
돌연변이체 2, 7, 10, 11에 대한 발현 벡터는 플라스미드 pGro7 (타카라 바이오, 인크.)로 이전에 형질전환된 이. 콜라이 LMG194를 형질전환하기 위해 사용하였다. 상기 플라스미드는 GroEL/ES 샤페론 단백질의 아라비노스 유도성 발현을 용이하게 한다. 돌연변이체 13에 대한 발현 벡터는 이. 콜라이 LMG194를 형질전환하기 위해 사용하였다.
각각의 ADH 돌연변이체의 발현은 L-아라비노스를 0.2%(w/v)의 최종 농도로 첨가함으로써 중간 로그기 배양(OD600 ≒ 0.5)으로 유도하였다. 배양물을 추가의 5시간 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 펠렛을 -80℃에서 보관하였다. 각각의 펠렛을 10 mL의 용해 완충제 (50 mM 인산칼륨, 300 mM NaCl, pH 7.0)에 재현탁하였다. 프로테아제 저해제 칵테일 (150 μL), 벤조나아제 뉴클레아제 (37.5 U) 및 라이소자임 (0.2 mg/mL, 최종 농도)를 첨가하였다. 4℃에서 20분 인큐베이션한 후, 세포를 빙상에서 초음파 처리에 의해 용해시키고, 용해물을 원심분리 (21,000g, 4℃, 30분)에 의해 청징화하였다. 청징화된 용해물을 500 μL 탈론 금속 친화성 수지(50%(w/v) 슬러리)와 혼합하고, 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 교반하여 His6-태깅된 ADH 단백질을 수지에 결합시켰다. 수지를 용해 완충제로 다회 세척한 후, 중력 유동 컬럼으로 옮겼다. 돌연변이체 7, 8, 9, 10 및 12의 정화를 위해, 5 mM ATP/MgCl2를 샤페론 단백질의 제거를 용이하게 하기 위해 상기 세척 단계에 포함시켰다. 각각 5 mM 이미다졸 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 10 충진 부피의 용해 완충제를 사용한 추가의 세척 후에, 각각의 정제된 단백질을 5배 충진 부피의 용출 완충제(50 mM 인산칼륨, 300 mM NaCl, 150 mM 이미다졸, pH 7.0)로 용출시켰다. 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 유닛 (10 kDa 분자량 컷오프(cut-off); 머크 밀리포어(Merck Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카)을, 정제된 단백질을 보관 완충제 (50 mM 인산칼륨, 150 mM NaCl, 10% (v/v) 글리세롤, pH 7.5) 내로 교환하기 위해 사용하였다. 응집체를 멸균 0.22 ㎛ 필터 (밀렉스-지브이 (Millex-GV); 밀리포어)를 통한 여과에 의해 제거하였다. 각각의 단백질은 SDS-PAGE에 의해 순도가 >95%인 것으로 판단되었다. ADH 농도는 A280 (문헌[Pace, Vajdos et al. 1995]에 따라 계산된 흡광 계수)를 측정함으로써 정량하였다. 정제된 단백질의 분취물을 -80℃에서 보관하였다. 활성 검정을 통해, 상기 보관 조건은 동결/해동 사이클에 의해 어떠한 활성의 손실을 야기하지 않았음을 확인하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 돌연변이체 2, 7 및 11은 pGro7 플라스미드와 함께 이. 콜라이에서 발현될 때 모두 고도로 가용성이었다. 돌연변이체 10에 대한 가용성 단백질의 생산량은 다른 변이체보다 낮았다. 돌연변이체 8, 9 및 12는 pGro7과 함께 공동으로 발현될 때에도 완전히 불용성이었다. 돌연변이체 13은 고도로 가용성이었고, 야생형 ADH 단백질과 동일한 조건 하에서 다량 생산될 수 있었다.
활성 검정
야생형 및 돌연변이체 ADH 활성을 문헌[Ismaiel, Zhu et al. 1993]에 기재된 방법을 기초로 한 분광광도 검정을 사용하여 측정하였다. 활성은 NADPH 또는 NADH의 산화와 연관된 340 nm에서의 흡광도 (ε340= 6,220 M-1.cm-1)의 감소를 모니터링함으로써 정량하였다. 항정 상태 운동 파라미터를 25℃에서 펠티에(Peltier) 온도 제어기가 구비된 캐리 100 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 표준 검정 혼합물은 0.2 mM로 존재하는 보조 인자 (NADPH 또는 NADH)와 함께 50 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7.5를 함유하였다. 초기 반응 속도는 5 mM의 기질 농도를 사용하여 측정하였다. 측정은 삼중으로 실시하고, 배경에 대해 보정하였다. 보조 인자 NADH 및 NADPH 및 기질 아세톤, 아세토인, MEK는 시그마-알드리치로부터 획득하였다. D-아세토인은 시판되고 있지 않기 때문에 아래에서 설명되는 바와 같이 정제하였다.
전체적으로, 돌연변이체 11은 보조 인자로서 NADH를 사용할 때 가장 높은 활성을 갖는다 (도 6). 돌연변이체 11에 대한 보조 인자 사용은 완전히 전환되었고 (야생형 ADH에 비해); 돌연변이체 11은 NADPH를 사용할 때 검출가능한 활성을 갖지 않았다.
돌연변이체 11은 4개의 돌연변이(G198D, S199V, P201E, Y218A)를 갖는다. 4개의 모든 돌연변이는 보조 인자 사용에서 관찰된 전환을 위해 필요하다. Y218A 돌연변이의 부가는 NADH를 사용한 활성에 필요하지만, 이 돌연변이 단독 (즉, 돌연변이체 13)은 보조 인자 선호도에 대한 어떠한 효과도 갖지 않았다. 이것은 도 14에 도시된 바와 같이 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 2-부탄올, 및 에탄올로의 발효 경로에서 중요한 이점을 가질 수 있다.
도 7에 도시된 바와 같이, 일부 돌연변이체는 또한 보다 큰 기질 (아세토인 및 MEK) 또는 보다 작은 기질 (아세트알데히드)에 비하여 아세톤에 보다 특이적이다. 모든 돌연변이체 (2, 7, 10 및 11)는 MEK에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 돌연변이체 2, 10 및 11은 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
도 8에 도시된 바와 같이, 일부 돌연변이체는 또한 보다 큰 기질 (아세토인) 또는 보다 작은 기질 (아세트알데히드)에 비하여 MEK에 대해 보다 특이적이다. 돌연변이체 2, 10 및 11은 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
도 9에 도시된 바와 같이, 일부 돌연변이체는 또한 보다 큰 기질 (아세톤, 아세토인 및 MEK)에 비하여 아세트알데히드에 대해 보다 특이적이다. 돌연변이체 7은 아세톤 및 MEK에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 돌연변이체 2, 7 및 10은 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다.
도 10에 도시된 바와 같이, 일부 돌연변이체는 또한 보다 작은 기질 (아세톤, 아세토인 및 MEK)에 비하여 아세토인에 대해 보다 특이적이다. 돌연변이체 7은 아세톤 및 MEK에 비하여 아세토인에 대해 증가된 기질 특이성을 갖는다. 돌연변이체 7 및 11은 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대해 증가된 기질 특이성을 갖는다. 돌연변이체 10은 아세토인에 대한 활성을 상실하지만, 다른 기질 아세톤, MEK 및 아세트알데히드에 대한 활성은 계속 보유하였다.
요약하면, 도 7-10에 도시된 결과는 다음을 보여준다:
- 돌연변이체 2는 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여, 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖고;
- 돌연변이체 7은 1) MEK에 비하여 아세톤에 대하여, 2) MEK, 아세톤 및 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여, 3) 아세톤 및 MEK에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖고;
- 돌연변이체 11은 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여, 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여, 3) 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖고;
- 돌연변이체 10은 1) MEK, 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 아세톤에 대하여, 및 2) 아세트알데히드 및 아세토인에 비하여 MEK에 대하여, 3) 아세토인에 비하여 아세트알데히드에 대하여 증가된 기질 특이성을 갖는다. 이것은 도 14에 도시된 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 2-부탄올, 및 에탄올로의 발효 경로에서 중요한 이점을 가질 수 있다.
D-
아세토인의
정제
D-아세토인 (또는 (S)-아세토인)의 입체선택적 합성:: D-아세토인을 D-(-)-2,3-부탄디올의 위치선택적(regioselective)으로 제어된 모노산화를 통해 설명된 바와 같이 합성하였다(문헌[D'Accoloti et al. 1993 J. Org. Chem. 58: 3600-1]) 필수적인 디메틸디옥시란(DMDO)-아세톤 용액을 이전에 보고된 절차의 변형에 따라 새로 조제하고, 후속적으로 요오드법에 의해 적정하였다.
DMDO-아세톤 용액의 생성: 1000 mL 3-가지 환저 플라스크에 가스 어댑터(gas adaptor) 및 이중 증류 헤드를 장치하고, 여기에 진공 어댑티드 리시버(vacuum adapted receiver)를 부착하였다. 최종 조인트(joint)는 스토퍼(stopper) 처리하였고 시약 첨가를 위해 의도된다. 환저 플라스크를 수용 단부에 고정시키고, 아세톤-드라이아이스 조 내에서 -78℃로 냉각시켰다. 진공에 따라 가염 얼음을 이용하여 -20℃로 냉각시킨 부치(Buchi)® 콜드 핑거(cold finger) 냉각기, 이어서 -196℃ 액체 질소 콜드 핑거 트랩이 연결되었다.
반응 용기에 큰 타원형 교반 막대, 물 (220 mL), 아세톤 (160 mL) 및 중탄산나트륨 (120.063 g)을 채웠다. 질소로 퍼징(purging)하면서 0℃에서 격렬한 교반을 개시하였고, 이것은 3분 간격으로 5부로 나눈 고체 오존 (250.047 g)의 첨가 동안 계속하였다. 강한 비등이 나타났고, 따라서 이것을 관리하기 위해 오존 첨가 속도를 제어하였다. 제2부의 오존의 첨가 후에, 백색 슬러리 위의 무색 용액은 분홍색을 띄었다. 오존의 첨가 완료 시에 15분 동안 계속 교반하였다. 비등의 침강 시에, 약간의 진공 (900 mbar)을 적용하였고, 비등을 모니터링하면서 이것을 약 450 mbar로 서서히 증가시켰다. 진공의 점진적인 적용 동안, 연황색 용액이 냉각된 리시버 내에 수집되었다. 일단 약 100 mL의 DMDO-아세톤 용액이 수집되면, 반응을 포화 Na2S2O3 용액으로 켄칭시키고, 생성물을 실온으로 하였다.
DMDO의 요오드법 적정: 아세톤 내의 DMDO의 새로 증류한 용액 (1.00 mL)을 아세트산-아세톤 용액 (2 mL, 3:2) 내로 피펫팅하였다. 이어서, 용액을 탈기시키기 위해 드라이아이스와 함께 포화 요오드화칼륨 수용액 (2.0 mL)을 첨가하였다. 이것을 실온에서 10분 동안 암소에 저장하면서 혼합시켰다. 혼합물을 물 (5 mL)로 희석하고, 종점 표시자로서 1% 전분 용액을 사용하여 Na2S2O3 (0.00099 mol/L) 수용액에 대해 적정하여, 29.9 mM의 농도를 생성하였다. 이어서, 플라스크를 밀봉하고, -18℃에서 저장하였다.
(R,R)-2,3- 부탄디올의 DMDO 산화. 문헌[D'Accoloti et al. 1993 J. Org. Chem. 58: 3600-1]에 보고된 방법에 따라 D-(-)-2,3-부탄디올의 (R)-3-히드록시부타논으로의 모노산화를 수행하였다.
실시예
3 - 최적화된 알코올 데히드로게나아제
를
사용하여 일산화탄소 영양 균주 내에서 에탄올보다 2.3-
부탄디올의
우선적인 생산
일산화탄소영양성 유기체 씨. 오토에타노게눔은 CO로부터 에탄올 및 2,3-부탄디올 둘 모두를 생산하는 것으로 밝혀졌다(문헌[
]) (도 14). 실시예 1에서 입증된 바와 같이, 알코올 데히드로게나아제는 각각 아세트알데히드의 에탄올로의, 아세토인의 2,3-부탄디올의 반응인 에탄올 및 2,3-부탄디올 경로 둘 모두에서의 마지막 단계를 촉매하는 씨. 오토에타노게눔에 존재한다 (도 14). 아세트알데히드에 대한 상기 야생형 효소의 활성은 아세토인에 대한 것보다 더 높고 (도 12), 따라서 에탄올이 씨. 오토에타노게눔 DSM 10061을 사용한 발효에서 2,3-부탄디올보다 우세한 생성물이 된다(문헌[
])). 실시예 2에서, 아세트알데히드에 비하여 아세토인에 대하여 개선된 기질 특이성을 갖는, 아미노산 치환 G198E, S199V, P201E를 갖는 알코올 데히드로게나아제 돌연변이체 (돌연변이체 7)가 생성되었다 (도 7). 야생형 효소와 비교하여 아세트알데히드에 비하여 아세토인을 우선적으로 사용하는 상기 효소는 야생형 균주에 비해 에탄올 생산보다 2,3-부탄디올 생산을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
돌연변이체 알코올 데히드로게나아제의 유전자(서열 번호 41)를 부위 NdeI 및 EcoRI을 사용하는 페레독신 프로모터를 보유하는 pMTL85353 셔틀 벡터(문헌[Heap, Pennington, Cartman, & Minton, 2009]) 내로 클로닝한다. 이어서, 구성물을 메틸화하고, 문헌에 설명된 바와 같은 전기천공에 의해 씨. 오토에타노게눔 내로 형질전환된다(미국 특허 공개 제2012/0252083호, 국제 특허 공개 제WO/2012/115527호). 티암페니콜 내성 콜로니를 선발하여 5 mL 액체 배지에서 성장시킨다. 형질전환된 배지를 PCR에 의해 확인하고, 발효 실험을 수행한다. 대사 최종 산물을 씨. 오토에타노게눔의 야생형과 비교할 때, 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제를 보유하는 주는 증가된 2,3-부탄디올:에탄올 비를 가질 것이다.
이와 유사하게, 다른 아세트산 생성 균주, 예컨대 씨. 륭달리이는 동일한 플라스미드를 사용하여 알코올 데히드로게나아제 돌연변이체로 변형될 수 있다. 전기천공이 몇몇 일산화탄소 영양성 아세트산 생성 미생물, 예컨대 씨. 륭달리이(문헌[Koepke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92]; 문헌[Leang, Ueki, & Lovley, 2011] PCT/NZ2011/000203; 국제 특허 공개 제2012/053905호), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii)(문헌[Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60: 1033-37]) 및 무렐라 서모아세티카(문헌[Kita et al., 2012])에 대해 설명되었다. 씨. 오토에타노게눔, 씨. 륭달리이 및 다른 아세트산 생성 균주는 에탄올 및 2,3-부탄디올을 생산할 수 있다(문헌[
]). 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제를 발현함으로써, 상기 비율은 2,3-부탄디올에 유리하게 개선될 수 있다.
실시예
4 - 최적화된 알코올 데히드로게나아제를 사용하여 일산화탄소 영양 균주 내에서 2,3-
부탄디올보다
에탄올의 우선적인 생산
실시예 3에 설명된 바와 같이, 씨. 오토에타노게눔은 CO로부터 에탄올 및 2,3-부탄디올 둘 모두를 생산할 수 있다(도 14). 그러나, 일부 공정에서, 공정 비용(예를 들어 분리)을 낮게 유지하기 위해 단지 단일 생성물만을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 일반적으로, 이것은 경로 중의 하나의 경로에서 효소를 불활성화함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 다중 경로의 반응을 촉매하는 다기능성 효소의 경우에, 상기 전략은 적용될 수 없고, 아세트알데히드의 에탄올로의 및 아세토인의 2,3-부탄디올로의 환원 둘 모두를 촉매하는 씨. 오토에타노게눔의 알코올 데히드로게나아제의 경우에 그러하다. 본 발명은 예를 들어 2,3-부탄디올의 수준이 감소되거나 존재하지 않으면서 에탄올의 생산을 달성하기 위한 대체 수단을 제공한다. 실시예 2에서, 아세토인을 환원하는 능력을 상실하였지만 아세트알데히드에 대한 활성은 계속 갖는, 아미노산 치환 G198D, S199V, P201E, Y218F를 알코올 데히드로게나아제 돌연변이체 (돌연변이체 10)가 생성되었다(도 7). 상기 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제의 유전자(서열 번호 47)를 이중 상동성 교차 통합(야생형을 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제로 교체)을 허용하기 위한 알코올 데히드로게나아제의 인접 영역과 함께 벡터 내로 클로닝한다. SecAdh 유전자의 1 kb 5' (서열 번호 55) 및 3' (서열 번호 56) 상동성 아암 (arm)을 씨. 오토에타노게눔 DSM23693 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭한다. 프라이머 Sec5f (attcatcctgcaggACAGTTAAAAAGCATATCTAACAGT (서열 번호 57)) / Sec5r (gactgcggccgcTAAATATATAAGCAAATGTTGTGCC (서열 번호 58)) 및 Sec3f (atatgctagCGTATTTTTAATTGCGAACTTAAGA (서열 번호 59)) / Sec3r (gactggcgcgcCAGTTAAAGTTAGACATCCGATTAT (서열 번호 60))을 사용하여 각각 5' 및 3' 상동성 아암을 증폭한다. 2개의 PCR 생성물을 SbfI/NotI 및 NheI/AscI 부위 사이에서 pMTL85151 플라스미드 내로 클로닝하여 pMTL85151-SecAdh-KO를 얻는다. 벡터는 상기 설명된 바와 같이 형질전환된다. 티암페니콜 플레이트 상에서 선택한 후, 형질전환체를 상동성 아암에 인접하는 프라이머 SecOf (TTGGAATTTTAGCTGTAGATAACAA (서열 번호 61)) 및 SecOr (TAAGTGATTTTCAATGGACTTTACT (서열 번호 62))을 사용하여 야생형 알코올 데히드로게나아제의 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제로의 교환에 대해 스크리닝한다. 서열 번호 결정 확인 후에, 발효 실험을 수행하고, 2,3-부탄디올의 생산이 감소하거나 생산되지 않으면서 에탄올의 생산을 확인한다. 씨. 오토에타노게눔 내에, 특정 조건 하에서 2,3-부탄디올 생산의 완전한 제거를 위해 넉아웃될 수 있는, 부탄디올에 대한 활성을 갖는 제2 효소가 존재한다.
이와 유사하게, 다른 아세트산 생성 2,3-부탄디올 생성 균주, 예컨대 씨. 륭달리이 및 씨. 락스달레이는 동일한 플라스미드를 사용하여 알코올 데히드로게나아제 돌연변이체로 변형될 수 있다. 전기천공 및 이중 상동성 교차를 위한 방법이 씨. 륭달리이에 대해 설명되었다(문헌[Koepke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92]; 문헌[Leang et al., 2011]).
실시예
5 - 최적화된 알코올 데히드로게나아제를 사용하여 일산화탄소 영양 균주 내에서 이소프로판올의 생산
씨. 오토에타노게눔은 야생형 알코올 데히드로게나아제에 따라 아세톤 생합성 유전자를 도입함으로써 CO로부터 이소프로판올 생산을 위해 변형되었다(미국 특허 공개 제2012/0252083호, 국제 특허 공개 제WO/2012/115527호). 생산을 개선하기 위해, 실시예 2에서 생성된 치환 G198D, S199V, P201E, Y218A를 갖는 고도로 아세톤 특이적인 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제(돌연변이체 11)가 도입될 수 있다. 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제 유전자(서열 번호 53)는 SalI/XhoI 제한효소 부위에 의해 아세톤 생합성 플라스미드(서열 번호 40) 내로 클로닝된다. 이어서, 플라스미드는 상기 설명된 바와 같이 씨. 오토에타노게눔 내에 형질전환된다. 형질전환된 배양물을 사용한 발효 실험은 모든 아세톤이 이소프로판올로 전환되는 증가된 이소프로판올 생산을 보일 것이다. 아세톤을 향한 증가된 특이성을 갖는 것 이외에, 유기체는 이소프로판올 합성을 위해 두 풀(pool)의 활용을 허용하기 위해 NADPH 및 NADH를 이용할 것이다.
이와 유사하게, 다른 아세트산 생성 균주, 예컨대 씨. 륭달리이는 동일한 플라스미드를 사용하여 알코올 데히드로게나아제 돌연변이체로 변형될 수 있다. 전기천공이 몇몇 일산화탄소영양성 아세토젠, 예컨대 씨. 륭달리이(문헌[Koepke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92]; 문헌[[Leang et al., 2011] PCT NZ2011/000203; 국제 특허 공개 제WO2012/053905호), 아세토박테리움 우디이(문헌[Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60: 1033-37]) 또는 무렐라 서모아세티카(문헌[Kita et al., 2012])에 대해 설명되었다. 씨. 오토에타노게눔과 같이, 씨. 륭달리이 및 다른 아세트산 생성 균주는 에탄올 및 2,3-부탄디올을 생산할 수 있다(문헌[
]). 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제를 발현함으로써, 상기 비율은 2,3-부탄디올에 유리하게 개선될 수 있다.
실시예
6 - 최적화된 알코올 데히드로게나아제를 사용하여
ABE
유기체 내에서 이소프로판올의 생산
씨. 아세토부틸리쿰은 씨. 베이제린키이로부터 2차 알코올 데히드로게나아제를 사용하여 이소프로판올 생산을 위해 대사적으로 조작될 수 있는 것으로 밝혀졌지만, 보고된 결과는 이소프로판올로 전환되지 않은 잔류 아세톤과 함께 단지 낮은 이소프로판올 수준을 보여준다(문헌[Lee et al, 2012: Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824 for isopropanol-butanol-ethanol fermentation, Appl. Environ. Microbiol. 78: 1416-1423]). 상기 공정을 개선하기 위해, 최적화된 알코올 데히드로게나아제가 상기 한계를 극복하기 위해 요구된다.
실시예 2에서, 아세토인을 향한 높은 특이성을 갖고 씨. 아세토부틸리쿰에서 NADPH보다 더 풍부한 NADH를 또한 이용할 수 있는, 치환 G198D, S199V, P201E, Y218A를 갖는 최적화된 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제(돌연변이체 11)를 생성하였다. 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제 유전자(서열 번호 53)를 부위 NdeI 및 EcoRI을 사용하여 강력한 씨. 아세토부틸리쿰 티올라아제 프로모터를 보유하는 pMTL85354 셔틀 벡터(문헌[Heap et al., 2009]) 내로 클로닝한다. 이어서, 플라스미드를 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 파지 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 생체 내에서 메틸화하고, 문헌에 설명된 바와 같이 씨. 아세토부틸리쿰 내에 형질전환하였다(문헌[Mermelstein & Papoutsakis, 1993]). 형질전환된 배양물을 사용하여 수행한 발효에서, 모든 아세토인은 높은 특이성으로 이소프로판올로 전환된다.
실시예
7 - 이.
콜라이에서
최적화된 알코올 데히드로게나아제를 사용하는 이소프로판올의 생산
이. 콜라이는 여러 연구에서 이소프로판올 생산을 위한 표적이 되어 왔다(문헌[Hanai T et al. (2007) Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichia coli. Applied and environmental microbiology 73:7814-8]; 문헌[Inokuma K et al. (2010) Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichia coli using gas stripping. Journal of bioscience and bioengineering 110:696-701]; 문헌[Jojima T et al. (2008) Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology 77: 1219-24]). 그러나, 모든 연구는 씨. 베이제린키이로부터의 바로 동일한 비-최적화된 알코올 데히드로게나아제를 사용하고, 이것은 효소의 낮은 특이성 및 NADPH 의존성 때문에 이소프로판올 생산을 제한한다. 이것은 모든 연구에서 아세톤이 이소프로판올로 효과적으로 충분히 환원되지 않아 부산물로서 축적되기 때문에 분명해진다. 이. 콜라이에서, NADH 풀은 NADPH 풀보다 몇배 더 크다(문헌[Bennett & San, 2009]).
실시예 2에서, 아세토인을 향한 높은 특이성을 갖고 NADH를 또한 이용할 수 있는, 치환 G198D, S199V, P201E, Y218A를 갖는 최적화된 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제(돌연변이체 11)를 생성하였다. 이. 콜라이는 당업계에서 사용되는 표준 기술을 이용하여 상기 돌연변이체 알코올 데히드로게나아제를 포함하도록 조작될 수 있다. 재조합 이. 콜라이는 야생형 유기체에 비해 증가된 이소프로판올 생산을 가질 것이다.
실시예
8 - 최적화된 알코올 데히드로게나아제를 사용하여 효모
에스
.
세레비지에에서
2-
부탄올의
생산
효모 사카로마이세스 세레비지에의 일부 균주는 에탄올 이외에 높은 수준의 아세토인을 생산할 수 있다(문헌[Romano, Suzzi, Mortimer, & Polsinelli, 1995]). D-아세토인 (또는 (S)-아세토인)은 실시예 1에 설명된 씨. 오토에타노게눔의 알코올 데히드로게나아제의 작용에 의해 메소-2,3-부탄디올로 전환될 수 있다. 메소-2,3-부탄디올의 MEK로의 전환은 예를 들어 에이. 아에로게네스(A. aerogenes)(문헌[Toraya T, Shirakashi T, Kosuga T, 1976]) 또는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumonia)(문헌[Bachovchin, Eagar, Moore, & Richards, 1977])의 디올 데히드라타아제 효소를 사용하여 설명되었다. 이어서, MEK는 다시 실시예 1에 설명된 씨. 오토에타노게눔의 알코올 데히드로게나아제를 사용하여 2-부탄올로 전환될 수 있다(도 14). 그러나, 알코올 데히드로게나아제는 또한 에탄올을 향한 활성도 갖기 때문에, 아세트알데히드의 에탄올로의 단지 낮은 활성을 갖지만 아세토인의 2,3-부탄디올로의 및 MEK의 2-부탄올로의 비교적 높은 활성을 갖는 효소를 갖는 것이 바람직하다. 실시예 2의 돌연변이체 11이 바로 상기 특성을 갖고, 효모에서 유리한 보조 인자로서 NADH를 이용한다.
돌연변이체 11(서열 번호 50)에 대한 코돈 최적화된 유전자 및 클렙시엘라 뉴모니아로부터의 디올 데히드라타제에 대한 코돈 최적화된 유전자(YP_002236782; YP_002236783; YP_002236784)를 문헌에 설명된 바와 같이 적절한 벡터 내에 유도가능 효모 프로모터 GAL1/10 하에 클로닝한다(문헌[Steen et al., 2008]). 모든 에스. 세레비지에 주의 형질전환은 문헌에 설명된 바와 같은 리튬 아세테이트 방법을 사용하여 수행한다(문헌[Gietz RW: RA Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. Part B. San Diego, CA: Academic Press Inc; 2002:87-96]). 성공적인 형질전환 및 30℃에서 풍부한 YPD 배지에서 에스. 세레비지에를 사용한 확인 발효를 수행하고, 2-부탄올 및 낮은 수준의 에탄올을 생성물로 얻는다.
본 발명을 과도한 실험을 실시하지 않으면서 본 발명을 실시할 수 있도록 하기 위해 바람직한 특정 실시 양태를 참고로 하여 본 발명을 설명하였다. 그러나, 당업계의 통상적인 기술을 갖는 자는 많은 성분 및 파라미터가 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 특정 정도로 변화 또는 변형되거나 공지의 균등물로 대체될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다. 상기 변형 및 균등물은 이들이 마치 개별적으로 제시되는 것처럼 본원에 포함됨을 이해하여야 한다. 제목, 표제 등은 본 명세서의 이해를 향상시키기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하지 않아야 한다.
상기 및 아래에서 언급되는 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 그러나, 본원 명세서에서 임의의 출원, 특허 및 간행물에 대한 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 또는 세계 어느 나라에서 통상적인 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 사실의 인정 또는 임의의 형태의 제안이 아니고, 그러한 것으로 간주되지 않아야 한다.
본 명세서 및 아래에 제시되는 임의의 청구항 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않으면, 단어 "포함하다", "포함하는" 등은 배타적인 의미와 반대되는 포괄적인 의미로, 즉 "포함하되, 이로 제한되지 않는"의 의미로 이해되어야 한다.
참고 문헌
SEQUENCE LISTING
<110> LanzaTech New Zealand Limited
Koepke, Michael
Gerth, Monica
Patrick, Wayne
Maddock, Danielle
<120> Enzyme-Altered Metabolite Activity
<130> LT75PCT
<150> US 61/620538
<151> 2012-04-05
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
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atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggccatgaa 180
gctgtaggtg aaatagccga agttggcagc gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240
gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatctttag aagtccaagc tggttttcag 300
cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga tggtgtattt 360
gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg ccatactccc agatgaaata 420
cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggagcagaa 480
cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600
cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660
ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720
atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780
gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840
tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900
agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960
actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020
ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056
<210> 36
<211> 352
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<213> Clostridium autoethanogenum
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<210> 37
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<213> Clostridium autoethanogenum
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<213> Clostridium autoethanogenum
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<220>
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<400> 40
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cgacgcttta tatagaaaag aagattcaac taggtaaaat cttaatatag gttgagatga 480
taaggtttat aaggaatttg tttgttctaa tttttcactc attttgttct aatttctttt 540
aacaaatgtt cttttttttt tagaacagtt atgatatagt tagaatagtt taaaataagg 600
agtgagaaaa agatgaaaga aagatatgga acagtctata aaggctctca gaggctcata 660
gacgaagaaa gtggagaagt catagaggta gacaagttat accgtaaaca aacgtctggt 720
aacttcgtaa aggcatatat agtgcaatta ataagtatgt tagatatgat tggcggaaaa 780
aaacttaaaa tcgttaacta tatcctagat aatgtccact taagtaacaa tacaatgata 840
gctacaacaa gagaaatagc aaaagctaca ggaacaagtc tacaaacagt aataacaaca 900
cttaaaatct tagaagaagg aaatattata aaaagaaaaa ctggagtatt aatgttaaac 960
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agatggtatt tgaaaaaatt gataaaaata gttggaacag aaaagagtat tttgaccact 1260
actttgcaag tgtaccttgt acctacagca tgaccgttaa agtggatatc acacaaataa 1320
aggaaaaggg aatgaaacta tatcctgcaa tgctttatta tattgcaatg attgtaaacc 1380
gccattcaga gtttaggacg gcaatcaatc aagatggtga attggggata tatgatgaga 1440
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agtgtaagtc tgactttaaa tcatttttag cagattatga aagtgatacg caacggtatg 1560
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tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 2040
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 2100
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taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 2280
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tttgttaaat atataccaaa ctagtataga tattttttaa atactggact taaacagtag 3000
taatttgcct aaaaaatttt ttcaattttt tttaaaaaat ccttttcaag ttgtacattg 3060
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aacaatattt attttctcgt taaattcaca aataatttat taataatatc aataaccaag 3240
attatactta aatggatgtt tattttttaa cacttttata gtaaatatat ttattttatg 3300
tagtaaaaag gttataatta taattgtatt tattacaatt aattaaaata aaaaataggg 3360
ttttaggtaa aattaagtta ttttaagaag taattacaat aaaaattgaa gttatttctt 3420
taaggaggga attattcata tgaaagaagt tgtaatagct agtgcagtaa gaacagcgat 3480
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ttaccacatg ggaataacag cagaaaacat agctgagaga tggaacattt caagagaaga 3960
acaagatgag tttgctcttg catcacaaaa aaaagctgaa gaagctataa aatcaggtca 4020
atttaaagat gaaatagttc ctgtagtaat taaaggcaga aagggagaaa ctgtagttga 4080
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tc 7922
<210> 41
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<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
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<210> 42
<211> 351
<212> PRT
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 42
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly Ile Asn Lys Leu Gly Trp Ile Glu
1 5 10 15
Lys Lys Asn Pro Val Pro Gly Pro Tyr Asp Ala Ile Val His Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ser Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Leu Gly Asn Arg Glu Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu
50 55 60
Ile Ala Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Val Gly Asp Arg
65 70 75 80
Val Ile Val Pro Cys Thr Thr Pro Asp Trp Arg Ser Leu Glu Val Gln
85 90 95
Ala Gly Phe Gln Gln His Ser Asn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe
100 105 110
Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Ala Asp Tyr Phe His Val Asn Asp
115 120 125
Ala Asp Met Asn Leu Ala Ile Leu Pro Asp Glu Ile Pro Leu Glu Ser
130 135 140
Ala Val Met Met Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ile Lys Met Gly Ser Ser Val Val Val Ile Gly Ile Gly
165 170 175
Ala Val Gly Leu Met Gly Ile Ala Gly Ser Lys Leu Arg Gly Ala Gly
180 185 190
Arg Ile Ile Gly Val Asp Val Arg Glu Val Cys Val Glu Thr Ala Lys
195 200 205
Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asn Gly Asp Ile Val
210 215 220
Glu Gln Ile Met Asp Leu Thr His Gly Lys Gly Val Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Met Ala Gly Gly Gly Ala Glu Thr Leu Ala Gln Ala Val Thr Met Val
245 250 255
Lys Pro Gly Gly Val Ile Ser Asn Ile Asn Tyr His Gly Ser Gly Asp
260 265 270
Thr Leu Pro Ile Pro Arg Val Gln Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys
275 280 285
Thr Ile Arg Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Met
290 295 300
Leu Arg Asp Leu Val Leu Tyr Lys Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu Val
305 310 315 320
Thr His Val Phe Asp Gly Ala Glu Asn Ile Glu Lys Ala Leu Leu Leu
325 330 335
Met Lys Asn Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ser Val Val Thr Phe
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<210> 43
<211> 1056
<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 43
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<213> Clostridium autoethanogenum
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<400> 46
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Thr Ile Arg Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Met
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Claims (20)
- 본 발명의 일 측면에 있어서, 1 이상의 제2 기질보다 1 이상의 제1 기질에 대한 특이성이 증가된 알코올 데히드로게나아제로서,
상기 1 이상의 제1 기질 및 상기 1 이상의 제2 기질이
제1 기질은 아세톤이며, 제2 기질은 MEK(methyl ethyl ketone: 메틸 에틸 케톤)임;
제1 기질은 아세톤이며, 제2 기질은 아세트알데히드임;
제1 기질은 아세톤이며, 제2 기질은 아세토인임;
제1 기질은 MEK이며, 제2 기질은 아세트알데히드임;
제1 기질은 MEK이며, 제2 기질은 아세토인임;
제1 기질은 아세토인이며, 제2 기질은 아세톤임;
제1 기질은 아세토인이며, 제2 기질은 MEK임;
제1 기질은 아세토인이며, 제2 기질은 아세트알데히드임;
제1 기질은 아세트알데히드이며, 제2 기질은 아세톤임;
제1 기질은 아세트알데히드이며, 제2 기질은 아세토인임; 및,
제1 기질은 아세트알데히드이며, 제2 기질은 MEK임
으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알코올 데히드로게나아제는 상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 적어도 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 알코올 데히드로게나아제. - 보조 인자로서 NADH를 이용하거나 NADPH 보조 인자보다 NADH 보조 인자에 대한 특이성이 증가된 알코올 데히드로게나아제로서,
상응하는 야생형 알코올 데히드로게나아제와 비교하여 적어도 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 알코올 데히드로게나아제. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 위치 Gly198, Ser199, Arg200, Pro201, Tyr218 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함하는 것인 알코올 데히드로게나아제.
- 제3항에 있어서, 아미노산 치환은 Gly198Asp, Gly198Ile, Gly198Leu, Gly198Val, Ser199Asp, Ser199Glu, Ser199Leu, Ser199Val, Arg200Glu, Pro201Asp, Pro201Glu, Tyr218Ala, Tyr218Phe, Tyr218Gly, Tyr218Ser 및 Tyr218Val 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 알코올 데히드로게나아제.
- 제4항에 있어서,
Ser199Asp 치환;
Ser199Glu 치환;
Gly198Asp, Ser199Val 및 Pro201Glu 치환의 조합;
Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu 및 Tyr218Ala 치환의 조합;
Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu 및 Tyr218Phe 치환의 조합;
Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu 및 Tyr218Val 치환의 조합;
Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu 및 Tyr218Gly 치환의 조합; 또는
Gly198Asp, Ser199Val, Pro201Glu 및 Tyr218Ser 치환의 조합을 포함하는 것인 알코올 데히드로게나아제. - 제5항에 있어서, 서열 번호 38, 서열 번호 42, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 63, 서열 번호 64 또는 서열 번호 65의 서열을 포함하는 것인 알코올 데히드로게나아제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 알코올 데히드로게나아제를 암호화하는 핵산.
- 제7항에 있어서, 서열 번호 37, 서열 번호 41, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69 또는 서열 번호 70의 서열을 포함하는 것인 핵산.
- 제7항의 핵산을 포함하는 핵산 벡터.
- 제7항 또는 제9항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제7항 또는 제9항의 핵산을 하나 이상 포함하는 재조합 미생물로서,
이소프로판올; 2,3-부탄디올; 에탄올; 2-부탄올로부터 선택되는 하나 이상의 생성물; 및 임의로 발효에 의한 하나 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있는 것인 재조합 미생물. - 제7항 또는 제9항의 핵산을 하나 이상 포함하는 재조합 미생물로서,
아세토인; MEK; 아세트알데히드; 아세톤으로부터 선택되는 하나 이상의 생성물; 및 임의로 발효에 의한 하나 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있는 것인 재조합 미생물. - 제12항에 있어서, 박테리아, 고세균 및 진균류를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
- 제13항에 있어서, 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 락스탈레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리듐 코스카티이(Clostridium coskatii), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리듐 속(Clostridium sp.), 부티리박테륨 리모숨(Butyribacterium limosum), 부티리박테륨 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 아세토박테륨 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 유박테륨 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 서모아세티카(Moorella thermoacetica), 무렐라 서모토트로피카(Moorella thermautotrophica), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii), 및 서모언에어로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)를 포함하는 군으로부터 선택되는 일산화탄소 영양성 아세토젠(carboxydotrophic acetogen)인 재조합 미생물.
- 제13항에 있어서, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이제린키이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)을 포함하는 군으로부터 선택되는 ABE(Acetone-butanol-ethanol: 아세톤-부탄올-에탄올) 발효 미생물인 재조합 미생물.
- 이. 콜라이(E. coli), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 군으로부터 선택되는 재조합 미생물.
- 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항의 미생물을 이용하는 기질의 미생물 발효에 의해, 이소프로판올, 2,3-부탄디올, 에탄올, 2-부탄올, 아세토인, MEK, 아세트알데히드 및 아세톤 중 하나 이상, 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 제조하는 방법.
- 제17항에 있어서, 적어도
(a) 본 발명의 하나 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기에 기질을 제공하는 단계; 및
(b) 생물 반응기 내의 배양물을 발효시켜 상기 하나 이상의 생성물을 생성하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제17항 또는 제18항에 있어서, 기질이 CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 기질 및/또는 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 기질로부터 선택되는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 기질이 CO를 포함하는 기질을 포함하며, 방법이
(a) 산업 공정의 결과로서 생성된 CO 함유 가스를, 상기 가스가 대기중으로 방출되기 전에 포획하는 단계; 및
(b) 하나 이상의 일산화탄소 영양성 아세트산 생성 미생물을 포함하는 배양물에 의해 CO 함유 가스를 혐기적으로 발효시켜 하나 이상의 생성물을 생성하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
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