KR20140140643A - 제대혈 줄기 세포 증식 및 성장 인자 생산에 관한 리튬 자극 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리튬 염을 포함하는 시험관내(in vitro) 세포 배양 시스템을 사용하여 제대혈 줄기 세포에서의 성장 인자 생산을 자극하는 방법 및 사람 탯줄혈 줄기 세포를 증식시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이식에 앞서 리튬 염으로 세포를 처리함으로써 이식된 제대혈 줄기 세포의 생존 및 성장을 생체내에서(in vivo) 향상시키는 방법을 제공한다. 이식 후 리튬 염을 투여함으로써 이식된 제대혈 줄기 세포에 대한 거부 반응을 생체 내에서 감소시키는 방법이 또한 제공된다.

Description

제대혈 줄기 세포 증식 및 성장 인자 생산에 관한 리튬 자극{LITHIUM STIMULATION OF CORD BLOOD STEM CELL PROLIFERATION AND GROWTH FACTOR PRODUCTION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2006년 11월 1일자로 출원된, 미국 가특허 출원 제60/856,071호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 가특허 출원의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.

본 발명은 사람 탯줄혈 줄기 세포에서의 성장 인자 생산을 자극하는 방법, 사람 탯줄혈 줄기 세포를 증식시키는 방법, 이식된 사람 탯줄혈 줄기 세포의 생존 및 성장 증강용 약제학적 조성물, 이식된 사람 탯줄혈 줄기 세포의 거부 반응 감소용 약제학적 조성물 및 척수 손상 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

발명의 배경

사람 줄기 세포의 확인, 분리, 및 생성에 관한 상당한 관심이 존재한다. 사람 줄기 세포는 전형적으로 자가 재생(renewal) 및 다양한 사람 성숙 세포 계통을 생성시킬 수 있는 전능성(totipotential) 또는 다능성(pluripotential) 전구 세포이다. 이러한 능력은 기관 및 조직 발달에 필요한 세포 분화 및 전문화(specialization)에 근간으로 역할한다. 줄기 세포 이식에서의 최근의 성공은 질병, 독성 화합물에 대한 노출, 방사선에 의한 골수제거(myeloablation) 후 골수를 재구성하고/하거나 보충시키기 위한 신규한 임상적 도구를 제공하여 왔다. 줄기 세포가, 전부는 아니지만, 많은 조직을 재군집화(repopulation)시키고 생리적 및 해부적 기능성을 회복시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증하는 추가 증거가 있다.

다수의 상이한 유형의 포유류 줄기 세포가 규명되었다. 예를 들어, 배아 줄기 세포, 배아 생식(germ) 세포, 성체 줄기 세포, 및 기타 수임(committed) 줄기 세포 또는 전구 세포가 공지되어 있다. 사실상, 특정 줄기 세포는 분리 및 규명되었을 뿐만 아니라, 소정 정도의 제한된 분화가 허여되는 조건하에서 배양되었다. 개체군내의 수천만개의 가능한 HLA 타입의 조합때문에, 개별 환자들에 매칭되는 HLA일 수 있는 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 충분한 양, 개체군, 및 다양한 HLA 타입의 사람 줄기 세포를 획득하는 것이 매우 어렵다는 점에서, 근본적인 문제점이 존재한다. 상이한 HLA 타입의 줄기 세포의 공급은 심각하게 불충분하다. 악성종양, 유전성 대사질환(inborn errors of metabolism), 이상혈색소증(hemoglobinopathies), 및 면역결핍증(immunodeficiencies)을 포함하는, 광범위하게 다양한 질병 및 병태의 치료에 있어서 이들의 중요성으로 인해, 다양한 HLA 타입의 적절한 줄기 세포 공급원을 갖는 것은 매우 유익할 것이다.

충분한 수의 사람 줄기 세포를 획득하는 것은 몇몇 이유로 문제가 있다. 첫째, 성체 조직내에서 정상적으로 생성되는 줄기 세포군의 분리는 기술적으로 어렵고 혈액 또는 부분적으로, 조직에서 발견되는 매우 제한된 양으로 인해, 비용이 많이 든다. 둘째, 낙태된 태아(fetuses)를 포함한, 배아 또는 태아 조직으로부터 이러한 세포의 획득은 유리적 논쟁을 불러일으킨다. 따라서, 배아 또는 태아 조직으로부터 획득된 세포의 사용을 요하지 않는 대체 공급원은 줄기 세포의 임상적 사용에 있어서 추후 진보에 필수적이다. 그러나, 줄기 세포, 특히 사람 줄기 세포의 실용적인 대체 공급원은 드물고, 따라서 공급이 제한된다. 더욱이, 치료 목적 및 연구 목적을 위하여 적절한 양으로 대체 공급원으로부터 줄기 세포를 수확하는 것은 일반적으로 힘들다.

예를 들어, 미국 특허 제5,486,359호는 골수에서 유래된 사람 중간엽 줄기 세포(HMSC) 조성물을 개시한다. 균질 HMSC 조성물은 조혈 세포 또는 분화된 중간엽 세포와 결합된 마커가 없는 점착성(adherent) 골수 또는 골막(periosteal) 세포의 양성 선별(positive selection)에 의해 획득된다. 분리된 중간엽 세포군은 중간엽 줄기 세포와 연관된 특성들을 나타내며, 분화없이 배지에서 재생하는 능력을 지니며, 시험관내(in vitro) 유도되거나 생체내에서(in vivo) 손상된 조직 부위에 놓여질 때 특정 중간엽 계통(lineages)으로 분화되는 능력을 지닌다. 그러나, 상기 방법들은 이들 방법들은 제일 먼저 HMSC를 연속적으로 분리하기 위해 사람 공여자로부터 침습적이고 고통스런 골수(marrow) 또는 골막 세포의 수확을 요한다는 결점이 있다.

탯줄혈(Umbilical cord blood)은 중간엽 줄기 세포를 비롯한 조혈 줄기 세포 및 전구(progenitor) 세포의 공지된 대체 공급원이다. 제대혈(Cord blood)로부터의 줄기 세포는 조혈 재구성, 골수 및 다른 관련 이식(transplantations)에 사용되는 치료 과정을 위해 통상적으로(routinely) 냉동보존(cryopreservation)된다(예를 들어, 미국 특허 제5,004,681호 및 5,192,553호를 참조하라). 제대혈의 수집을 위한 관용적인 기술은 바늘 또는 캐뉼라의 사용에 기반하는데, 상기 바늘 또는 캐뉼라는 태반으로부터 제대혈을 유출시키기 위해 중력의 보조를 통해 사용된다(예를 들어, 미국 특허 제5,004,681호, 제5,192,553호, 제5,372,581호, 및 제5,415,665호를 참조하라). 바늘 또는 캐뉼라는 일반적으로 탯줄 정맥내에 놓여 지고 태반으로부터의 제대혈 유출을 수월하게 하기 위해 상기 태반은 부드럽게 마사지된다. 그러나, 제대혈로부터 줄기 세포 획득의 주요한 제약은, 흔히 부적절한 부피의 제대혈이 획득되어, 그 결과 이식후 골수를 효과적으로 재구성시키는데 불충분한 수의 세포가 얻어진다는 것이다.

줄기 세포는 신경계 트라우마(예를 들어, 척수 손상), 악성종양, 유전질병, 이상혈색소증, 및 면역결핍증을 포함하는, 광범위하게 다양한 질병 및 손상의 치료에 사용될 수 있는 잠재력을 갖는다. 그러나, 탯줄혈로부터의 줄기 세포는 이들의 수집에 있어서 제한, 제대혈로부터 전형적으로 수집된 세포의 부적절한 수(특히, 성인 환자를 치료하기 위해 사용되는 경우), 및 거대한 재고를 구축하는데 드는 엄청난 비용 때문에 공급이 현저하게 부족하다. 그와 같은 입장에서, 이식을 위한 충분한 수로 줄기 세포를 증식시킬 수 있는 세포 배양 시스템에서 제대혈 줄기 세포를 배양하기 위한 당업계에 강한 요구가 존재한다. 이식된 줄기 세포의 성장 및 생존을 향상시키는 방법 및 수령체에세 줄기 세포 거부반응을 감소 또는 지연시키는 방법에 대한 당업계의 요구가 또한 존재한다. 본 발명은 이러한 요구 및 기타 요구들을 충족시킨다.

발명의 요약

본 발명은 리튬 염을 포함하는 생체외 세포 배양 시스템을 사용하여 사람 탯줄혈 줄기 세포에 의한 성장 인자 생산을 자극하기 위한 방법 및 제대혈 줄기 세포를 증식시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이식에 앞서 리튬 염으로 세포를 처리함으로써 이식된 제대혈 줄기 세포의 생존 및 성장을 생체내에서 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 이식후 리튬 염을 투여함으로써 이식된 제대혈 줄기 세포의 거부반응을 생체내에서 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명은, 부분적으로, 리튬이 줄기 세포에 의한 성장 인자의 생산 또는 발현을 자극시킨다는 놀라운 발견에 기초하고 있다. 임의의 특정 이론에 국한됨이 없이, 줄기 세포 증식, 생존, 및 면역 거부반응에 대한 리튬의 효과는 줄기 세포가 리튬 염에 반응하여 생산 또는 발현하는 성장 인자의 양에 의해 매개된다.

이와 같은 입장에서, 일 양상에서, 본 발명은 사람 탯줄혈 세포에 의한 성장 인자 생산을 자극하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 리튬 염을 포함하는 배지에서 상기 사람 탯줄혈 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

리튬은 전형적으로 세포 생존 인자, 항-분화 인자, 이들의 조합와 같은 성장 인자의 생산 또는 발현을 자극한다. 세포 생존 인자의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 뉴로트로핀(neurotrophins), 사이토카인, 내피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast groｗth factor, FGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin like growth factor, IGF), 헤파린 결합 내피성장인자(heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 색소 상피 유래 인자(pigment epithelium-derived factor, PEDF), 신경초종 유래 성장 인자(schwannoma-derived growth factor, SDGF), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 변형 성장 인자-α(TGF-α), 변형 성장 인자-β(TGF-β), 골 형성 단백질(bone morphogenetic proteins)(예를 들어, BMP1-BMP15), 성장 분화 인자-9(GDF-9), 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 마이오스타틴(GDF-8), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin, EPO), 트롬보포이에틴(thrombopoietin, TPO), 및 이들의 조합을 포함한다. 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor, LIF)가 바람직한 항-분화 인자이다.

뉴로트로핀의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 뉴로트로핀-1(NT-1), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뇌 유래 뉴로트로핀 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 신경교 유래 뉴로트로핀 인자(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF), 섬모 뉴로트로핀 인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF), 신경 성장 인자(nereve growth factor, NGF), 및 이들의 조합을 포함한다.

사이토카인의 비제한적 일예는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23, IL-27, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CXCL1/GRO1/GROα, CXCL2/GRO2, CXCL3/GRO3, CXCL4/PF-4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-1, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15, CXCL16, CXCL17/DMC, CCL1, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/CCL10, CCL11/이오탁신(Eotaxin), CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/MIP-5, CCL16/LEC, CCL17/TARC, CCL18/MIP-4, CCL19/MIP-3β, CCL20/MIP-3α, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF1, CCL24/이오탁신-2, CCL25/TECK, CCL26/이오탁신-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CL1, CL2, CX3CL1, 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 리튬 염의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트, 및 리튬 설페이트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 리튬 염은 리튬 클로라이드이다. 일부 구체예에서, 상기 리튬 염, 예를 들어, 리튬 클로라이드는, 약 0.5 내지 약 5 mM, 예를 들어, 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 4, 4.5, 또는 5 mM의 농도로 세포 배양 배지내에 존재한다. 바람직한 구체예에서, 상기 리튬 염은 약 3 mM의 농도로 세포 배양 배지내에 존재한다.

특별한 경우, 상기 제대혈 세포는 리튬 모방 화합물과 함께 배양될 수 있다(예를 들어, 하기 문헌들을 참조하라: Gould et al., Neuropsychopharmacology, 30:1223-1237 (2005); 및 Gould, Expert Opin. Ther. Targets, 10:377-392 (2006)). 다른 특별한 경우, 상기 제대혈 세포는 리튬과 유사한 향정신성 약물, 예를 들어, 발프로산(예를 들어, 하기 문헌 참조: Hahn et al., J. Psychiatr. Res., 39:355-363 (2005); Shao et al., Biol. Psychiatry, 58:879-884 (2005); 및 Dokucu et al., Neuropsychopharmacology, 30:2216-2224 (2005)), 디소디움 발프로에이트(예를 들어, 다음 문헌 참조: Calabrese et al., Am. J. Psychiatry, 162:2152-2161 (2005)), 및 카르바마제핀(carbamazepine)(예를 들어, 다음 문헌 참조: Bazinet et al., Biol. Psychiatry, 59:401-407 (2006))과 함께 배양될 수 있다.

일부 구체예에서, 수집된 제대혈 유닛은 제일먼저 혈장이 실질적으로 제거(depletion)되며 혈장-제거 제대혈 중에 존재하는 줄기 세포는 이후 리튬 염과 함께 배양된다. 다른 구체예에서, 수집된 제대혈 유닛은 제일먼저 적혈구가 실질적으로 제거되며 적혈구 제거 제대혈 유닛내에 존재하는 줄기 세포는 이후 리튬 염과 함께 배양된다. 제대혈 줄기 세포는 혈장 제거 또는 적혈구 제거 제대혈 유닛의 냉동보존 이전 또는 이후에 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 생체외 배양 기술을 사용하여 리튬 염을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 사람 탯줄혈 세포를 증식시키는 방법을 제공하는데, 당해 방법은 리튬 염을 포함하는 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

적당한 리튬 염의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트, 및 리튬 설페이트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 리튬 염은 리튬 클로라이드이다. 일부 구체예에서, 상기 리튬 염, 예를 들어, 리튬 클로라이드는, 약 0.5 내지 약 5 mM, 예를 들어, 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 4, 4.5, 또는 5 mM의 농도로 세포 배양 배지내에 존재한다. 바람직한 구체예에서, 상기 리튬 염은 약 3 mM의 농도로 세포 배양 배지내에 존재한다.

특별한 경우, 상기 제대혈 세포는 리튬 모방 화합물과 함께 배양될 수 있다. 특별한 다른 경우, 상기 제대혈 세포는 리튬과 유사한 향정신성 약물, 예를 들어, 발프로산, 디소디움 발프로에이트, 카르바마제핀, 이들의 조합과 함께 배양될 수 있다.

상기한 바와 같이, 수집된 제대혈 유닛은 실질적으로 혈장이 제거될 수 있으며 혈장 제거 제대혈 유닛내에 존재하는 줄기 세포는 이후 리튬 염과 함께 배양될 수 있다. 대안적으로, 수집된 제대혈 유닛은 실질적으로 적혈구가 제거될 수 있으며 적혈구 제거 제대혈 유닛내에 존재하는 줄기 세포는 이후 리튬 염과 함께 배양될 수 있다. 제대혈 줄기 세포는 혈장 제거 또는 적혈구 제거 제대혈 유닛의 냉동보존 이전 또는 이후에 당업계에 공지된 임의의 적합한 생체외 배양 기술을 사용하여 리튬 염을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다.

아직 또 다른 양상에서, 본 발명은 피검체내에서 이식된 사람 탯줄혈 세포의 생존 및 성장을 향상시키는 방법을 제공하는데, 당해 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 상기 세포를 리튬 염을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 세포를 상기 피검체에게 투여하는 단계.

이식된 제대혈 세포의 생존 및 성장을 향상시키기 위한 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 리튬 염의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트, 및 리튬 설페이트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 리튬 염은 리튬 클로라이드이다. 일부 구체예에서, 상기 리튬 염, 예를 들어, 리튬 클로라이드는, 약 0.5 내지 약 5 mM, 예를 들어, 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 4, 4.5, 또는 5 mM의 농도로 세포 배양 배지내에 존재한다. 바람직한 구체예에서, 상기 리튬 염은 약 3 mM의 농도로 세포 배양 배지내에 존재한다.

특별한 경우, 상기 제대혈 세포는 리튬 모방 화합물과 함께 배양될 수 있다. 대안적으로, 상기 제대혈 세포는 리튬과 유사한 향정신성 약물, 예를 들어, 발프로산, 디소디움 발프로에이트, 카르바마제핀, 이들의 조합과 함께 배양될 수 있다.

상기한 바와 같이, 수집된 제대혈 유닛은 실질적으로 혈장이 제거될 수 있으며 혈장 제거 제대혈 유닛내에 존재하는 줄기 세포는 이후 리튬 염과 함께 배양될 수 있다. 대안적으로, 수집된 제대혈 유닛은 실질적으로 적혈구가 제거될 수 있으며 적혈구 제거 제대혈 유닛내에 존재하는 줄기 세포는 이후 리튬 염과 함께 배양될 수 있다. 제대혈 줄기 세포는 혈장 제거 또는 적혈구 제거 제대혈 유닛의 냉동보존 이전 또는 이후에 당업계에 공지된 임의의 적합한 생체외 배양 기술을 사용하여 리튬 염을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다.

상기 피검체는 전형적으로 포유동물, 예컨대 사람이다. 상기 피검체가 척추 손상과 같은 손상을 지닌 것으로 진단된 경우, 배양된 세포는 바람직하게는 척수내로 투여된다.

특별한 경우, 본 발명의 방법은 리튬 염, 예컨대, 리튬 클로라이드를 피검체, 예를 들어, 사람과 같은 포유동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 리튬 염, 예를 들어, 리튬 클로라이드는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 일반적으로 경구(oral), 수막강내(intrathecal), 뇌실내(intraventricular), 피하(subcutaneous), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 및 근내(intramuscular)를 포함하는 경로로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 리튬 염은 약 1 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 예를 들어, 약 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 또는 150 mg/kg의 용량으로 피검체에게 투여된다. 바람직한 구체예에서, 상기 리튬 염은 약 10 mg/kg의 용량으로 투여된다.

본 발명의 배양된 세포 및 리튬 염은 단독으로 또는 투여 경로 및 표준 약제 관행에 따라 선택된 약제학적으로 허용되는 염과 혼합되어 투여될 수 있다. 비제한적 일예로서, 정상 완충된 염수(예를 들어, 약 135-150 mM NaCl)가 상기 약제학적으로 허용되는 담체로 사용될 수 있다. 기타 적합한 담체는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등을 포함한다. 본 발명의 배양된 줄기 세포 및 리튬 염을 전달하는데 사용하기에 적합한 추가 담체는, 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA, 18th ed. (1995)]에 기재되어 있다.

추가 양상에서, 본 발명은 피검체에서 이식된 사람 탯줄혈 세포의 거부반응을 감소시키는 방법을 제공하는데, 당해 방법은 세포 이식후 상기 피검체에게 리튬 염을 투여하는 단계를 포함한다.

상기 피검체는 전형적으로 포유동물, 예컨대, 사람이다. 상기 피검체가 척수 손상과 같은 손상을 지니는 것으로 진단된 경우, 상기 세포는 바람직하게는 척수내(intraspinal) 투여를 통해 이식된다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 리튬 염의 비제한적 일예는 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트, 및 리튬 설페이트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 리튬 염은 리튬 클로라이드이다. 특별한 경우, 제대혈 줄기 세포는 세포 이식에 앞서 리튬 염을 포함하는 배지에서 생체외 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 제대혈 줄기 세포는 혈장 및/또는 적혈구가 실질적으로 제거된 수집된 제대혈 유닛로부터 획득될 수 있다.

리튬 염, 예를 들어, 리튬 클로라이드는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 경구, 수막강내, 뇌실내, 피하, 복강내, 정맥내, 및 근내를 포함하는 경로로 일반적으로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 리튬 염은 약 1 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 예를 들어, 약 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 또는 150 mg/kg의 용량으로 피검체에게 투여된다. 바람직한 구체예에서, 상기 리튬 염은 약 10 mg/kg의 용량으로 투여된다. 특별한 경우, 리튬 모방 화합물 또는 리튬과 유사한 향정신성 약물(예를 들어, 발프로산, 디소디움 발프로에이트, 및/또는 카르바마제핀)이 이식된 제대혈 줄기 세포의 거부반응을 감소시키기 위해 피검체에게 투여될 수 있다.

본 명세서에 기재된 리튬 염은 단독으로 또는 투여 경로 및 표준 약제 관행에 따라 선택된 약제학적으로 허용되는 염과 혼합되어 투여될 수 있다. 비제한적 일예로서, 정상 완충된 염수(예를 들어, 약 135-150 mM NaCl)가 상기 약제학적으로 허용되는 담체로 사용될 수 있다. 기타 적합한 담체는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등을 포함한다. 본 발명의 배양된 줄기 세포 및 리튬 염을 전달하는데 사용하기에 적합한 추가 담체는, 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA, 18th ed. (1995)]에 기재되어 있다.

리튬 염은 세포 이식 후 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 및/또는 수년후 피검체에게 투여될 수 있다. 일구 구체예에서, 피검체는 세포 이식 후 동일하거나 상이한 리튬 염의 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째, 9번째, 10번째 또는 그 이상의 용량으로 치료될 수 있다. 특별한 경우, 리튬 염의 하나 이상의 용량은 또한 세포 이식 이전 및/또는 도중에 피검체에게 투여될 수 있다.

본 발명 및 이의 바람직한 구체예의 다른 특징, 목적, 및 이점은 하기한 상세한 설명, 실시예, 및 청구항으로부터 자명할 것이다.

도 1은 리튬이 시험관내에서 N01.1 세포 증식을 촉진함을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 2는 리튬이 시험관내에서 N01.1 세포 성장 인자 생산을 자극함을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 3은 정량 실시간 PCR로 측정할 때 리튬이 생체내에서 N01.1 세포 증식을 촉진함을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 4는 게노믹 PCR로 측정할 때 리튬이 N01.1 세포 증식을 촉진함을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 5는 조직학 분석으로 측정할 때 리튬이 생체내에서 N01.1 세포 생존을 촉진함을 입증하는 데이터를 보여준다. 좌, 로스트랄(rostral); 우, 코달(caudal). 스케일 = 1 mm.
도 6은 리튬이 생체내에서 N01.1 세포 성장 인자 생산을 자극함을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 7은 척수 손상후 신경보호에 대한 리튬의 효과를 입증하는 데이터를 보여준다.
도 8은 리튬이 시험관내에서 사람 탯줄혈 세포 증식을 자극함을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 9는 리튬이 시험관내에서 사람 탯줄혈 세포 성장 인자 생산을 자극함을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 10은 리튬이 시험관내에서 사람 탯줄혈 세포 성장 인자 생산을 자극함을 입증하는 데이터를 보여준다.

I. 개요

리튬은 지난 50년 이상 동안 양극성 장애(bipolar disorder) 및 기타 신경학적 병태를 치료하는데 사용되어 왔다(예를 들어, 다음 문헌 참조: Manji et al., Biol. Psychiatry, 46:929-940 (1999)). 조울병(manic depression)을 앓고 있는 사람은 종종 생애 동안 약 1 mM의 치료학적 혈액 농도를 지니는, 리튬을 복용한다. 그러한 고 농도에도 불구하고, 리튬은 비교적 무독성이다. 리튬은 세포에 대한 다수의 잠재적인 작용 메커니즘을 지닌다(Jope, Mol. Psychiatry, 4:117-128 (1999)). 예를 들어, 리튬은 GSK-3, Akt, cAMP-의존성 키나아제, 및 단백질 키나아제 C를 비롯한, 이들 참석(attendant) 제 2 메신저 및 전사 인자를 포함하는 다수의 효소 활성을 조절한다.

신경 세포에 대한 리튬의 효과에 관한 연구는 리튬이 신경 재생(Bustuoabad et al., Medicina, 40:547-552 (1980)) 및 신경 전구체 증식(Hashimoto et al., Neuroscience, 117:55-61 (2003))을 자극하고, 뇌졸중 모델에서 손상 부위 근처의 신경 및 성상아교세포(astroglial cell)의 증식을 유도하며(Chuang, Crit. Rev. Neurobiol., 16:83-90 (2004)), 뇌하수체내 아교 세포의 증식을 향상시키며 (Levine et al., Cell Prolif., 35:167-172 (2002); Levine et al., Cell Prolif., 33:203-207 (2000)), 백혈구의 이동 활성을 자극시키며(Azzara et al., Haematologica, 72:121-127 (1987); Azzara et al., Acta Haematol., 85:100-102 (1991)), 해마 신경 전구 세포의 뉴런 분화를 증가시키고(Kim et al., J. Neurochem., 89:324-336 (2004)), 마우스 해마내 신경발생을 향상시킴(Laeng et al., J. Neurochem., 91:238-251 (2004))을 밝혀내었다. 그러나, 이들 참고문헌들 중 어느 것도 사람 탯줄혈 줄기 세포에 의한 성장 인자 생산에 관한 리튬의 시험관내 및 생체내 효과를 고려하지 못하고 있다. 마찬가지로, 이들 참고문헌들은 사람 탯줄혈 줄기 세포 증식 및 생존에 관한 리튬의 시험관내 및 생체내 효과를 이해하지 못하고 있다.

또한, 골수에 대한 리튬의 효과에 관한 연구는 리튬이 집락구 자극 활성 생성을 증가시키고 과립구형성(granulopoiesis) 및 에리쓰로포이에틴형성(erythropoiesis)을 가속화하며(Labedzki et al., Klin. Wochenschr., 58:211-218 (1980)), 과립구형성 및 거대핵세포형성(megacariopoiesis)의 화학요법-유도 억제를 감소시키며(Korycka et al., Arch. Immunol. Ther. Exp., 39:501-509 (1991)), 전신 조사후 골수 회복을 가속화시키며(Johnke et al., Int. J. Cell Cloning, 9:78-88 (1991)), 에스트라디올 시클로펜틸프로피오네이트 및 디에틸스틸베스톨의 동시 투여에 의해 야기된 골수 형성저하증(hypoplasia) 및 범혈구감소증(pancytopenia)을 역전시키며(Hall, J. Am. Vet. Med. Assoc., 200:814-816 (1992)), 클로자핀-유도 과립구형성감소증(granulocytopenia)을 지니는 환자에서 정상 혈구 수를 회복시킴(Papetti et al., Encephale., 30:578-582 (2004))이 밝혀졌다. 그러나, 이들 참고문헌들 중 어느 것도 사람 탯줄혈 줄기 세포에 의한 성장 인자 생산에 대한 리튬의 생체외 및 생체내 효과를 고려하지 못하고 있다. 마찬가지로, 이들 참고문헌들은 사람 탯줄혈 줄기 세포 증식 및 생존에 관한 리튬의 생체외 및 생체내 효과를 이해하지 못하고 있다.

따라서, 본 발명은, 부분적으로, 리튬 염, 예컨대, 리튬 클로라이드를 함유하는 배지내에서 사람 탯줄혈 줄기 세포를 배양하는 것이 이들 줄기 세포에 의한 성장 인자의 생산을 자극시킬 수 있고, 그 결과 이들의 증식 및 생존이 촉진될 수 있다는 놀라운 발견에 기초하고 있다. 사실상, 본 발명의 방법에 따라 제대혈 줄기 세포를 배양하는 것은 상장 인자의 발현 양 및 줄기 세포의 수를 수배까지(예를 들어, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 또는 10배 이상) 증가시킨다. 본 발명은 또한 이식에 앞서 리튬 염으로 재대혈 줄기 세포를 처리하는 것이 이식된 줄기 세포의 생존 및 성장을 향상시키고, 제대혈 줄기 세포 이식후 리튬 염을 투여하는 것이 이식된 줄기 세포의 면역 거부반응을 감소시킨다는 놀라운 발견에 기초하고 있다. 이러한 입장에서, 본 명세서에 기재된 방법은 제대혈내에서 발견된 줄기 세포의 제한된 공급의 실질적인 확대뿐만 아니라, 예를 들어, 이식된 줄기 세포의 생존 및 성장을 증가시키고/거나 이식된 줄기 세포의 면역 반응을 감소시킴으로써, 이식 수령체의 임상적 결과에서의 현저한 개선을 제공한다.

II. 정의

본 명세서에서 사용된, 하기 용어들은 달리 명시하지 않는한 이들에 속하는 것이라고 여겨지는 의미를 갖는다.

용어 "줄기 세포"는 무한한 시간 기간 동안 분열할 수 있으며 전문화된 세포를 생성시킬 수 있는 능력을 갖는 임의의 세포를 의미한다. 줄기 세포는 모든 배엽(germinal layers)(즉, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽)으로부터 생겨 나온다. 줄기 세포의 전형적인 공급원은 배아, 골수, 말초혈, 탯줄혈, 태반혈, 근육 조직, 및 지방(adipose) 조직이다. 줄기 세포는 전능성일 수 있는데, 이는 이들 세포가 신체내의 임의의 세포로 성장 및 분화될 수 있다는 것을 의미한다. 포유동물에서, 오직 접합체 및 초기 배아 세포만이 전능성이다. 달리, 줄기 세포는 다능성일 수 있는데, 이는 이들 세포가 개체내에서 대부분의 조직을 생성시킬 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 다능성(pluripotent) 줄기 세포는 신경계, 피부, 간, 신장, 혈액, 근육, 골 등의 세포를 생성시킬 수 있다. 다능성 줄기 세포의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 제대혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 태반-유래 줄기 세포, 박락된(exfoliated) 치아-유래 줄기 세포, 및 모낭 줄기 세포를 포함한다. 대조적으로, 다기능성(multipotent) 또는 성체 줄기 세포는 전형적으로 제한된 형태의 세포를 생성시킨다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "줄기 세포"는 달리 언급하지 않는한 전구 세포를 포함한다.

용어 "전구 세포"는 계통-수임된(lineage-committed) 세포, 즉, 개개의 세포가 단일 계통으로 제한된 자손을 생성시킬 수 있음을 의미한다. 전구 세포의 비제한적 일예는 뉴런(neuronal), 간(hepatic), 신장형성(nephrogenic), 지방형성(adipogenic), 조골(osteoblastic), 파골(osteoclastic), 치조(alveolar), 심장(cardiac), 내장(intestinal), 또는 내피(endothelial) 계통에 대한 전구 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "배양하는"은 줄기세포가 증식하고 노화를 회피할 수 있는 조건하에서 줄기 세포를 유지하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에서, 줄기 세포는 리튬 염 및 선택적으로 하나 이상의 성장 인자, 즉, 성장 인자 칵테일을 함유하는 배지내에서 배양된다.

용어 "성장 인자 생산을 자극하는"은 줄기 세포로부터의 하나 이상의 성장 인자의 발현(예를 들어, mRNA, 단백질)을 증가시키는 리튬 염의 용도를 의미한다. 전형적으로, 성장 인자 발현에서의 증가는 리튬 염의 부재하에서 배양된 대조 줄기 세포와 비교된다. 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 현저하게 줄기 세포로부터의 성장 인자의 생산을 증가시킬 수 있는데, 즉, 줄기 세포가 리튬 염을 함유한 배지내에서 배양될 때 그러하다. 리튬 염과 함께 줄기 세포를 배양함으로써 자극될 수 있는 성장 인자의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 세포 생존 인자(예를 들어, 뉴로트로핀, 사이토카인, 내피성장인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 등), 항-분화 인자(예를 들어, 백혈병 억제 인자(LIF) 등), 이들의 조합을 포함한다. 뉴로트로핀의 비제한적 일예는 뉴로트로핀-1(NT-1), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뇌 유래 뉴로트로핀 인자(BDNF), 신경교 유래 뉴로트로핀 인자(GDNF), 섬모 뉴로트로핀 인자(CNTF), 신경 성장 인자(NGF)(예를 들어, NGFα, NGFβ, 및 NGFγ), 이들의 조합을 포함한다. 사이토카인의 일예는 상기한 것과 같은 인터루킨 또는 인터페론 서브패밀리에 속하는 것들을 포함한다.

용어 "시험관내 증식(in vitro expansion)"은 실험실에서 줄기 세포의 배양을 의미한다. 그러한 세포는 포유동물 및 적절한 환경, 예를 들어, 리튬 염을 함유하는 배지내에서 배양으로 생성된 추가 분량의 세포에서 추출될 수 있다. 가능한 경우, 세포의 연속적인 번식이 가능하도록 안정한 세포주가 확립된다. 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 생체외에서, 즉, 줄기 세포가 리튬 염을 함유한 배지내에서 배양되는 경우, 줄기 세포 증식을 현저하게 촉진할 수 있다.

용어 "생존 및 성장을 향상시키는”은 이식된 줄기 세포의 생존력(viability) 및 증식을 촉진시키기 위한 리튬 염의 용도를 의미한다. 전형적으로, 이식된 줄기 세포의 생존 및 성장에서의 향상은 리튬 염의 부재하에 배양 및 이식된 대조 줄기 세포와 비교된다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 이식된 줄기 세포의 생존 및 성장을 현저하게 향상시킬 수 있는데, 즉, 리튬-처리된 줄기 세포가 포유동물에 투여될 경우 그러하다. 생존가능(Viable) 세포는 살아 있으며 자주 성장 및 분열을 할 수 있는 세포이다. 당업계의 통상의 기술자는, 예를 들어, 트리판 블루 염료를 배제시키는 활성에 의해, 세포의 생존도를 측정하는 방법을 인지하고 있다.

용어 "거부반응을 감소시키는"은 이식된 줄기 세포의 면역 거부반응의 위험을 감소, 지연, 또는 폐기시키는 리튬 염의 용도를 의미한다. 전형적으로, 이식된 줄기 세포에 대한 거부반응의 감소는 리튬 염의 부재하에 배양 및 이식된 대조 줄기 세포와 비교된다. 비제한적 일예로서, 본 발명의 방법은 리튬 염, 예컨대, 리튬 클로라이드가 줄기 세포 수령체에 투여될 경우 이식된 줄기 세포의 면역 거부반응의 개시를 현저하게 지연시킬 수 있다.

용어 "탯줄혈"은 생후 남겨진 탯줄의 혈액으로부터 획득되는 다능성 및 다기능성 줄기 세포의 공급원을 의미한다. 탯줄혈에서 발견되는 줄기 세포의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 및 전구 세포를 포함한다. 중간엽 줄기 세포 및 전구 세포는 전형적으로 신경 세포, 골수 기질 세포, 연골세포, 골아세포, 지방세포, 근육세포, 건세포(tenocytes), 및 인대 세포로 분화될 수 있다. 조혈 줄기 세포는 전형적으로 림프, 골수, 및 적혈구 계통의 세포를 생성시킬 수 있다. 제대혈을 수집 및 가공하기 위한 방법에 대한 상세한 설명은 아래에 제공된다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "탯줄혈 유닛"은 단일 공여자로부터 수집된 소정 부피의 제대혈을 의미한다. 단일 탯줄혈 유닛가 전형적으로 본 발명의 방법에 사용되나, 다수의 제대혈 유닛, 예를 들어, 이중 제대혈 유닛가 또한 줄기 세포 수를 증가시키는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "혈장이 실질적으로 제거되다" 및 "혈장 제거된"은 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 초과하는 혈장 부피가 제거된 가공된 탯줄혈 유닛을 의미한다. 예를 들어, 혈장은 제대혈을 원심분리하고 혈장 분획으로부터 세포 분획을 분리시킴으로써 실질적으로 제거될 수 있다. 실질적 제거 후 잔여 혈장 부피는 전형적으로 부피 기준으로 약 0% 내지 약 30%, 바람직하게는 부피 기준으로 약 10% 내지 약 30%이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "적혈구가 비제거된" 및 "적혈구가 제거되지 않다"는 약 30%, 25,%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 부피의 적혈구가 제거된 가공된 탯줄혈 유닛을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "적혈구가 실질적으로 제거되다" 및 "적혈구-제거된"은 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 초과하는 부피의 적혈구가 제거된 가공된 탯줄혈 유닛을 의미한다.

"유핵 세포"는 핵을 지니는 세포, 즉, 염색체 DNA를 포함하는 세포소기관을 의미한다. 유핵 세포는, 예를 들어, 백혈구 및 줄기 세포를 포함한다. "무핵 세포"는, 예를 들어, 성체 적혈구를 포함한다.

용어 "리튬 염"은 임의의 약제학적으로 허용되는 리튬의 염을 의미한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 리튬 염의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트, 및 리튬 설페이트, 리튬 시트레이트, 리튬 옥시부티레이트, 리튬 오로테이트, 리튬 아세테이트, 리튬 알루미네이트, 리튬 알루미늄 하이드라이드, 리튬 아미드, 리튬 보레이트, 리튬 브로마이드, 리튬 디이소프로필아미드, 리튬 플루오라이드, 리튬 하이드라이드, 리튬 히드록시드, 리튬 아이오다이드, 리튬 메타보레이트, 리튬 몰리브데이트, 리튬 니오베이트, 리튬 니트레이트, 리튬 니트라이드, 리튬 옥사이드, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 퍼옥시드, 리튬 설피드, 리튬 탄탈레이트, 리튬 감마-리놀리네이트(linolenate), 이들의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 리튬 염은 리튬 클로라이드이다.

용어 "피검체"는 포유동물, 예컨대, 사람을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "투여하는"은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 경구, 비내(intranasal), 안내(intraocular), 정맥내, 골내(intraosseous), 복강내, 척추내(intraspinal), 근내, 관절내(intra-articular), 뇌실내, 두개내(intracranial), 병변내(intralesional), 기관내(intratracheal), 수막강내, 피하, 피부내(intradermal), 경피(transdermal), 또는 경점막(transmucosal) 투여를 포함하는, 임의의 경로에 의한 줄기 세포, 예컨대, 사람 탯줄혈 세포 또는 리튬 염, 예컨대, 리튬 클로라이드의 전달을 의미한다. 특별한 경우, 리튬 염은, 예를 들어, 알자 코포레이션(Alza Corp., Mountain View, CA)으로부터의 DUROS^® Implant를 사용하여, 피검체에 이식된 삼투 펌프에 의해 투여된다. 다른 특별한 경우, 리튬 염은 지연 방출 데포(depot) 주사로 투여된다. 줄기 세포는, 예를 들어, 질병 부위, 손상 부위(예를 들어, 척수 손상의 치료를 위한 척수내 투여), 또는 기타 표적 부위, 예컨대, 기관내로 직접 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 줄기 세포 및 리튬 염은 동시적으로(예를 들어, 동시에) 또는 순차적으로(예를 들어, 수분, 수시간, 또는 수일의 경과에 걸쳐) 피검체에게 투여될 수 있다.

III. 탯줄혈 줄기 세포

A. 탯줄혈의 수집

탯줄혈은 풍부한 줄기 세포 공급원이고 공여자에 대한 트라우마 없이 용이하게 획득될 수 있다. 대조적으로, 이식용 골수 세포의 수집은 입원기간 동안 소비되는 시간 및 비용을 고려할 때 희생이 큰 트라우마성 경험이다. 바람직하게는, 탯줄혈은 탯줄로부터 직접 배수(direct drainage)에 의해 획득된다. 이러한 입장에서, 유아의 분만후, 탯줄은 이중으로 교차하여 클램핑시키고 클램프로 뭉개진(crushed) 부분 바로 위에서 가로로 절단하고, 그 결과 얻어진 탯줄 혈관으로부터의 태아 혈류는 수집 용기내로 포집될 수 있다. 적절한 수집은 일반적으로 탯줄(milk)을 짜지 아니한체 달성될 수 있으며 태반 분리가 일어나기 전, 대략 2분내에 완료된다. 분만장내 산모 혈액, 소변, 또는 기타 체액에 의한 오염을 피하기 위해 주의가 기울여져야 한다. 탯줄혈은 또한 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 획득될 수 있다.

본 발명의 목적을 위한 공여자는 공여에 관하여 고지된(informed) 동의를 위한 공여자이며 실제 신생아 공여자의 보호권리를 갖는 산모인 산모 공여자를 포함할 수 있는데, 탯줄혈의 실제 공여자는 신생 아기이다. 산모 공여자는 전체적인 건강이 양호하며 연령이 약 16세 내지 약 50세 사이인 개인이다. 특별한 정보가 공여자 적합성 및 수혈로 이전된 감염성 질환, 유전 질환, 및 조혈계 암의 결여를 결정하기 위해 제대혈 공여 이전 또는 이후에 산모 공여자로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 산모 공여자는 의료 설문지를 부여받아 설문에 응하게 될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 산모 공여자는 공여 이전에 의료 검사를 받게 될 것이다.

탯줄혈의 수집은 멸균 조건하에서 이루어져야 한다. 일부 구체예에서, 제대혈은 수집시 즉각적으로 항응고제와 혼합될 수 있다. 일반적으로, 약 23 ml 내지 약 35 ml의 항응고제가 최대 약 255 ml의 제대혈(즉, 제대혈 한 유닛)과 혼합된다. 적합한 항응고제는, 예를 들어, CPDA(citrate-phosphate-dextrose-adenosine), CPD(citrate-phosphate-dextrose), ACD(acid-citrate-dextrose), 알서버 액(Alsever's solution)(Alsever et al., N. Y. St. J. Med., 41:126 (1941)), 드 고윈 액(De Gowin's Solution)(De Gowin et al., J. Am. Med. Assoc., 114:850 (1940)), 에드글루게이트-Mg(Edglugate-Mg)(Smith et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 38:573 (1959)), 로우스-터너 액(Rous-Turner Solution)(Rous et al., J. Exp. Med., 23:219 (1916)), 기타 글루코오스 혼합물, 헤파린, 에틸 비스코우마세테이트(ethyl biscoumacetate) 등과 같은, 당업계에 공지된 임의의 항응고제이다

제대혈 가공을 보조하고 안전도를 개선시키기 위해, 다양한 혈액 성분을 위한 가공 봉지(bags)가 멸균 혈액 봉지 시스템의 일부가 될 수 있다. 한 구체예에서, 혈장 저장액은 상기 가공 봉지 중 하나에 포함될 수 있다. 또한, 수집 봉지 및 가공 봉지 둘 모두는 포트(ports) 및 브레이크 콘넥터(break connectors)를 구비할 수 있다. 포트는 상기 봉지 내부에서 또는 이로부터 물질의 첨가 또는 추출에 사용될 수 있다. 브레이크 콘넥터는 튜브 또는 봉지의 입구를 일시적으로 근접시키는데 사용될 수 있다.

제대혈은 전형적으로, 최대 약 48시간 동안, 예를 들어, 약 0℃ 및 약 42℃ 사이 또는 약 15℃ 및 약 26℃ 사이의 온도에서 저장될 수 있다.

탯줄혈 이외에, 태반 또는 태아 혈액이 배양 및/또는 이식에 적합한 줄기 세포를 획득하는데 사용될 수 있다. 태반 또는 태아 혈액은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수집될 수 있다. 예를 들어, 태아 혈액은 초음파, 플라센토센테시스(placentocentesis), 또는 태아경검사(fetoscopy)에 의해 안내된(guided) 바늘의 사용과 함께 태반근(placental root)에서 태아 순환으로부터 획득될 수 있다. 태반혈은, 예를 들어, 근부에서 그리고 팽창된 정맥에서 운반된 태반으로부터 바늘 흡인에 의해 획득될 수 있다.

일부 구체예에서, 출산후 여성은 재대혈 및 태반혈을 기부하도록 요청받는다. 병원은 제대/태반혈 수집 프로젝트에 참여하도록 접촉 및 요청하게 된다. 유력한 공여자는 분만중이며 자연 분만 또는 제왕절개(Cesarean section)에 의해 아기를 분만할 예정인 여성들이다. 미국 특허 제5,993,387호에서, 출산후 여성들로부터 탯줄혈 및 태반혈을 획득하는 한가지 방법이 기재되어 있는데, 예를 들어, 아이가 태어나기 전에 은행에 패밀리를 등록하고 생후 수집될 제대 줄기 세포의 수집 및 저장을 위한 요금을 징수함으로써, 획득한다.

한 구체예에서, 분만후, 제대혈 및/또는 태반은 수집 및 검사된다. 일부 구체예에서, 검사는 제대혈 또는 태반혈이 추가 가공에 적합함을 명확하게 한다. 검사는 태반이 온전하며 중한 태변(meconium) 또는 화농성 분비물(purulent discharge)이 없음을 명확히 하기 위해 태반을 검사하는 것을 포함할 수 있다. 탯줄은 2개의 동맥과 1개의 정맥을 지닌체 온전하며 진결절(true knots) 또는 기타 이상이 없는지를 결정하기 위해 검사될 수 있다. 위에 기재한 바와 같이, 수집물(collection)은 임의로 항응고제, 예컨대, 시트레이트-포스페이트-덱스트로스-아데노신(CPDA) 용액을 함유하는 봉지 내에 담겨질 수 있다.

B. 혈장 제거 가공

일부 구체예에서, 수집된 제대혈의 부피는, 예를 들어, 미국 공개 특허 제20060275271호에 기재된 공정에 따라 감소될 수 있다. 비제한적 일예로서, 수집된 제대혈의 부피 감소는 제일 먼저 약 0℃ 및 약 42℃, 바람직하게는 약 15℃ 및 약 26℃ 사이의 온도에서 혼합물을 원심분리함으로써 수행될 수 있다. 원심분리는 혼합물로부터의 상당한 부피의 액체, 예를 들어, 혈장을 제거하기 위해 수행된다. 원심분리는 세포 손상을 야기시킴 없이 대부분의 세포의 침강을 초래하는데 충분한 원심력 및 시간으로, 바람직하게는, 약 5 및 약 20분 사이의 시간 동안 약 1,000 x g 내지 약 2,500 x g에서 수행된다. 원심분리후, 상당한 부피의 혈장이 제거되어 제대혈 혼합물의 부피가 감소되어 적혈구가 제거되지 않은 혈장-제거된 제대혈이 생성된다. 실질적인 제거후 남아 있는 혈장 부피는 전형적으로 부피 기준으로 약 0% 내지 약 30%, 바람직하게는 부피 기준으로 약 10% 내지 약 30%이다. 특별한 경우, 약 10 ml 이상의 혈장이 혈장-제거 제대혈 유닛내에 존재한다. 바람직하게는, 상청액 혈장내 세포의 계수(enumeration)에 의해 증명된 바와 같이, 약 5% 미만의 유핵 세포(예를 들어, 약 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만)가 상청액이 제거될 때 소실된다.

일부 구체예에서, 혈장-제거 유닛은 냉동 용기, 예를 들어, Cryocyte^® 봉지로 옮겨지고, 약 30 내지 약 60분 동안 약 2℃ 및 약 8℃ 사이의 온도로 냉각된다. 적합한 부피는 사용된 특정 CryoCyte^® 봉지의 홀딩 부피, 냉동보존될 세포의 수, 및 냉동보존 용액의 농도에 의해 결정된다. 혈장-제거 제대혈 유닛의 부피가 너무 커서 약 60 또는 약 75 ml를 초과하는 부피에 달하는 경우, 이때 더 큰CryoCyte^® 봉지가 사용되거나 샘플이 2개 이상의 CryoCyte^® 봉지 중에 나뉠 수 있다.

C. 제대혈 줄기 세포 배양

탯줄혈 유닛내에 존재하는 줄기 세포는 동결보존 이전 또는 이후에 리튬 염을 포함하는 배지에서 시험관내 배양 기술을 사용하여 배양될 수 있다. 배양시 제대혈 줄기 세포의 성장에 관한 다양한 프로토콜이 개시되었다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Smith et al., Br. J. Haematol., 63:29-34 (1986); Dexter et al., J. Cell. Physiol., 91:335 (1977); Witlock et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:3608-3612 (1982)). 당업계의 통상의 기술자는 시험관내에서 제대혈 줄기 세포군을 배양하기 위한 다른 프로토콜에 대해 알고 있을 것이다.

다양한 인자들이 배양시 제대혈 줄기 세포의 증식을 자극하기 위한 리튬 염과 연계하여 사용될 수 있다. 비제한적 일예로서, 다양한 사이토카인 및 성장 인자, 예컨대, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-6(IL-6), 및 과립구 대식세포-집락 자극 인자(GM-CSF)가 탯줄혈 유닛내에 존재하는 줄기 세포의 생체외(ex vivo) 증식을 자극시키기 위해 리튬 염과 조합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 배양된 제대혈 줄기 세포는 추가 정제없이 사용될 수 있다. 달리, 배양된 줄기 세포의 특정 개체군 또는 하위개체군(subpopulation)이 당업계에 공지된 다양한 기술, 예컨대, 면역친화역 크로마토그래피, 면역흡착, FACS 분류(sorting) 등에 의해 분리될 수 있다. 비제한적 일예로서, 제대혈 줄기 세포는 세포-표면 마커, 예컨대, CD34, c-kit, 및/또는 CXCR-4의 발현에 기초하여 분리될 수 있다.

본 발명은 세포 배양 분야의 정규 기술에 따른다. 적합한 세포 배양 방법 및 조건은 공지된 방법학을 이용하여 당업계의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 다음 문헌을 참조하라: Freshney et al., CULTURE OF ANIMAL CELL, 3rd ed. (1994)). 일반적으로, 세포 배양 환경은 세포 성장을 위한 기질, 세포 밀도 및 세포 수축(contract), 기체상, 배지 및 온도와 같은 그러한 인자들에 대한 고려조건을 포함한다.

인큐베이션은 일반적으로 세포 성장에 최적인 것으로 공지된 조건하에서 수행된다. 그러한 조건은, 예를 들어, 약 37℃의 온도와 약 5% CO₂를 함유한 습한 대기를 포함한다. 인큐베이션의 지속은 요망되는 결과에 따라서, 매우 달라질 수 있다. 증식은 3H 티미딘 통합 또는 BrdU 표지화를 사용하여 간편하에 확인될 수 있다.

플라스틱 접시, 플라스크, 롤러 병(roller bottles), 또는 현탁액 중의 마이크로캐리어(microcarriers)가 본 발명에 따른 제대혈 줄기 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 배양 용기는, 예를 들어, 멀티-웰 플레이트, 페트리 디쉬, 조직 배양 튜브, 플라스크, 롤러병 등을 포함한다. 제대혈 줄기 세포는 전형적으로 세포 유형에 실험적으로 기초하여 결정된 최적 밀도로 성장되며 세포 밀도가 최적 밀도를 초과할 때 계대된다.

배양된 제대혈 줄기 세포는, 보통, 온도의 지역적 변이(regional variations) 때문에 적당한 온도, 예를 들어, 세포가 획득된 동물의 체온을 제공하는 인큐베이터내에서 성장된다. 일반적으로, 37℃가 세포 배양에 바람직한 온도이다. 대부분의 인큐베이터는 대략적으로 대기 조건으로 습도가 유지된다.

기체상의 중요한 성분은 산소 및 이산화탄소이다. 전형적으로, 대기 산소 압력(tensions)이 세포 배양에 사용된다. 배양 용기는 기체 투과성 캡을 사용하거나 배양 용기의 밀폐를 방지함으로써 기체 교환이 가능하도록 인큐베이터 대기로 일반적으로 통기된다. 이산화탄소는 세포 배지내 버퍼와 함께, pH 안정화에 소정 역할을 하며 전형적으로 인큐베이터내에 약 1% 내지 약 10%의 농도로 존재한다. 바람직한 CO2 농도는 전형적으로 약 5%이다.

규정된 세포 배지는 패키징되고, 사전혼합된 분말 또는 사전멸균된 용액으로 활용가능하다. 흔히 사용되는 배지의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 이글 배지의 둘베코 변형 배지(Dulbecco's Modification of Eagle's Media, DMEM), DME, RPMI 1640, 이스코브의 완전 배지(Iscove's complete media), 및 맥코이(McCoy) 배지(예를 들어, 하기 문헌 참조: GibcoBRL/Life Technologies Catalog and Reference Guide; Sigma Catalog). 규정된 세포 배양 배지는 약 0.5-5 mM, 예를 들어, 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 4, 4.5, 또는 5 mM로 리튬 염, 예를 들어, 리튬 클로라이드가 보충된다. 일부 구체예에서, 리튬 염은 약 3 mM로 존재한다. 규정된 세포 배양 배지는 또한 약 5-20% 혈청, 전형적으로 열로 불활성화된 혈청, 예를 들어, 사람, 말, 송아지, 및 우태아 혈청이 보충될 수 있다. 전형적으로, 10% 우태아 혈청(FBS) 또는 사람 혈청(HS)이 본 발명의 방법에 사용된다. 배양 배지는 일반적으로 약 7.2-7.4의 pH로 세포를 유지하기 위해 완충된다. 배지를 위한 다른 보충물은, 예를 들어, 항생제, 아미노산, 당(예를 들어, 약 5.5-16.7 mM의 글루코오스), 및 성장 인자(예를 들어, EGF, FGF, 등)을 포함한다.

IV . 배양된 줄기 세포 및 리튬 염의 투여

리튬 염 및 본 발명의 방법에 따라 배양된 줄기 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 피검체에게 투여될 수 잇다. 적합한 투여 수단은, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 투여, 또는 국소 전달, 예를 들어, 질병 부위, 상처 부위, 또는 기타 표적 부위, 예컨대, 기관내로의 직접 주사 또는 주입을 포함한다.

본 명세서에 기재된 배양된 줄기 세포 및 리튬 염은 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물(예를 들어, 세포, 염 등)에 의해서 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 배양된 세포 및 리튬 염을 투여하는데 적합한 광범위하게 다양한 약제 제형이 존재한다. 비제한적 일예로서, 보통의 완충된 염수(예를 들어, 약 135-150 mM NaCl)는 약제학적으로 허용되는 담체로서 채택될 수 있다. 기타 적합한 담체는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등을 포함한다. 추가의 적합한 담체는, 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA, 18th ed. (1995)]에 기재되어 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "담체"는 임의의 또한 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 버퍼, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 어구 "약제학적으로 허용되는"은 포유동물, 예컨대, 사람에게 투여되는 경우, 알레르기 반응 또는 유사한 부적당한 반응을 생성시키지 않는 자 실체(molecular entities) 및 조성물을 의미한다.

본 발명의 줄기 세포 및 리튬 염은, 예를 들어, 항산화제, 버퍼, 정균제(bacteriostats), 및 제형이 의도된 수령체의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용해제(solubilizers), 농유제(thickening agents), 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액과 같은, 투여에 적합한 제형으로 존재할 수 있다.

주사액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 피검체에 투여되는 용량(dose)은, 소정 시간에 걸쳐 피검체에서 유익한 치료 반응을 초래하는데 충분하여야 한다. 배양된 줄기 세포와 관련하여, 용량은 채택된 특정 줄기 세포의 효능 및 피검체의 조건을 비롯한 치료될 피검체의 체중 또는 체표면적에 의해 결정될 것이다. 용량의 크기는 또한 특정 피검체내의 특정 세포 유형의 투여를 수반하는 임의의 부작용의 존재, 특성, 및 규모에 의해 결정될 것이다. 리튬 염과 관련하여, 용량은 채택된 특정 리튬 염의 효능, 피검체의 조건을 비롯한 치료될 피검체의 체중 또는 체표면적에 의해 결정될 것이다. 용량의 크기는 또한 특정 피검체내로 특정 리튬 염을 투여하는데 수반되는 임의의 부작용의 존재, 특성, 및 규모에 의해 결정될 것이다.

본 명세서에 기재된 질병 또는 손상의 치료시 투여될 배양된 줄기 세포의 유효량을 결정할 때, 의사는 세포 독성, 이식 반응, 질병의 진행(progression), 및 항-세포 항체의 생산에 대해 평가한다. 투여의 경우, 피검체의 중량(mass) 및 전반적인 건강에 적용될 때, 다양한 농도에서의 세포 유형의 부작용을 고려하여, 본 발명의 배양된 줄기 세포는 질병 또는 손상과 연관된 하나 이상의 증상을 감소 또는 경감시키는데 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 투여는 단일 용량 또는 분할된 용량을 통해 달성될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 명세서의 기재된 방법에 따라 수집, 가공 및/또는 배양된 줄기 세포를 피검체에게 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 장애(disability)(예를 들어, 척수 손상)을 앓고 있는 피검체를 치료하는 방법을 제공한다. 비제한적 일예로서, 리튬-자극 줄기 세포는 질병 또는 손상으로 인해 소실된 세포를 보충시키는데 충분한 양으로 피검체에게 투여될 수 있다.

특별한 경우, 질환 또는 질병으로 인해 대체될 세포는 혈액 세포이다. 대안적으로, 암을 위한 화학요법 또는 방사선 요법을 시술받고 있는 피검체는 그러한 요법에 의해 이들의 골수 세포가 파괴될 수 있고, 그에 따라, 발달하는 다양한 감염성 질환에 대한 민감성의 증가가 야기된다. 이러한 피검체들은 또한 본 발명의 방법에서 유래된 줄기 세포로 치료될 수 있다. 다른 특별한 경우, 줄기 세포는 척수 손상(spinal cord injury), 트라우마성 뇌 손상, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 화상, 심장병, 당뇨병, 골관절염, 류머티스 관절염 등을 앓고 있는 피검체를 치료하는데 사용될 수 있다. 줄기 세포는 또한 백혈병, 림프종, 빈혈, 다발성 골수종, 유전성 혈액 장애(inherited blood disorders), 및 질환 또는 치료(treatment) 결과 야기된 면역결핍(예를 들어, AIDS)과 같은 질병을 앓고 있는 피검체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

줄기 세포는 단독으로 또는 다른 치료 섭생과 연계하여 피검체에게 투여될 수 있다. 특별한 경우, 추가 치료 섭생은 화학요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다. 다른 특별한 경우, 추가 치료 섭생은, 예를 들어, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-7, EPO, TPO, IL-5, 또는 본 명세서에 기재된 다른 성장 인자들 중 임의의 성장인자와 같은 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. 치료제(treatments)는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

V. 줄기 세포 이식

일부 구체예에서, 줄기 세포는 HLA 타이핑(typing)없이 이식된다. 다른 구체예에서, 줄기 세포는 수령체와의 적합성을 보장하기 위해 HLA 타이핑된다. HLA 마커의 매치의 수는 사용자의 요구 및 줄기 세포의 공급원에 좌우된다. 예를 들어, 제대혈을 포함하는, 배아 또는 태아 조직에서 분리된 줄기 세포는 4/6, 5/6, 또는 6/6의 마커 매치로 사용될 수 있다. 성체로부터의 줄기 세포는 바람직하게는 6/6 HLA 마커가 적합될 수 있는 경우 사용된다. 일부 면역저하된(immunocompromised) 피검체에서, 이식편대숙주반응이 약화될 수 있으며 완전하게 매치되지 않는 줄기 세포가 사용될 수 있다.

전형적으로, 피검체내에 존재하는 정상 줄기 세포군은 치료 줄기 세포 유닛의 이식에 앞서 제거 또는 감소된다. 화학요법, 방사선, 또는 예를 들어, 미국 특허 제6,217,867호에 기재된 기술이 이식물(transplant)의 적절한 착상(engraftment)을 위하여 골수를 훈련(condition)시키는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 치료 줄기 세포 유닛은 표준 방법을 사용하여 환자에게로 이식될 수 있다.

일부 구체예에서, 줄기 세포는 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체와 함께 이식된다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충된 염수 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균되며 일반적으로 원치 않는 물질이 결여되어 있다. 치료 줄기 세포 유닛은 또한 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등(예를 들어, 소디움 아세테이트, 소디움 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소디움 락테이트, 알부민, 덱스트란, DMSO, 이들의 조합 등)과 같은 생리학적 조건에 가까워지게 하는데 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 보조 물질의 농도는 매우 다양할 수 있으며, 선택된 특정 투여 양상 및 피검체의 요구에 따라서 유체 부피, 점도, 체중 등에 주로 기초하여 선택될 것이다.

VI . 실시예

본 발명은 하기 실시예를 통해 훨씬 더 상세하게 기재될 것이다. 하기 실시예는 예시적인 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 식으로든 본 발명을 제한하기 위한 의도로 제공되지 아니한다. 당업계의 통상의 기술자는 본질적으로 동일한 결과를 산출시키기 위해 변경 또는 변형될 수 있는 다양한 비중요(noncritical) 파라미터를 용이하게 인지할 것이다.

실시예 1. 신생 래트 혈액 세포 증식 및 성장 인자 생산에 관한 리튬 자극

본 실시예는 리튬이 신생 래트 혈액으로부터 분리된 줄기 세포(N01.1 세포)의 증식 및 성장 인자 생산을 촉진함을 설명한다. 리튬은 또한 이식된 N01.1 세포의 생존 및 성장을 향상시킨다.

결과

시험관내 . 도 1은 리튬이 시험관내에서 N01.1 세포 증식을 촉진함을 보여준다. N01.1 세포를 7일 동안 3 mM 리튬 클로라이드를 함유한 성장 배지에서 배양하였다. 리튬 클로라이드 그룹내 세포의 수는 대조군 보다 359% 더 많았다. 리튬-처리된 N01.1 세포는 여전히 네스틴(Nestin) 양성이었다.

도 2는 리튬이 시험관내에서 N01.1 세포 성장 인자 생산을 자극함을 보여준다. 3 mM 리튬 클로라이드가 없이 또는 이와 함께 배양된 N01.1 LIF, BDNF, GDNF, NGFγ, 및 NGFβ와 같은 세포내 성장 인자의 mRNA 수준을 정량 실시간 PCR을 사용하여 측정하였다. LIF 및 NGFβ mRNA 수준은 대조군의 수준을 현저히 초과하였다. NGFγ, BDNF, 및 GDNF의 mRNA 수준 간의 유의미한 차이는 없었다.

생체내 . GFP-양성 N01.1 세포를 25 mm 높이에서 추 낙하 좌상(weight drop contusion)후 즉시 이식하였다. 래트에게 2주 동안 100 mg/kg의 리튬 클로라이드를 복강내로 주사하였다. 대조군에게 2주 동안 매일 염수를 주사하였다. 동물을 RT-PCR 및 조직학 검사를 위해 2주 경과시 희생시켰다.

도 3 및 4는 리튬이 생체내에서 N01.1 세포 증식을 촉진함을 보여준다. 도 3에서, 염수 또는 리튬 처리로 N01.1 세포 이식후 2주 경과시 척수내 GFP mRNA의 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 염수-처리 래트에서, GFP mRNA의 양은 검출가능하였으나, 매우 낮았다. 그러나, 리튬-처리 래트에서, GFP mRNA의 양은 염수-처리 래트에서 관찰된 양을 1000배 초과하였다. 도 4에서, 이식된 척수 조직의 게놈 DNA를 분리하였고 게놈 PCR 분석을 GFP 프라이머 세트로 수행하였다. 리튬-처리 조직에서, 증폭된 GFP DNA의 양은 대조군에서 관찰된 양을 현저하게 초과하였다.

도 5는 리튬이 생체내에서 N01.1 세포 생존을 촉진함을 보여준다. GFP-양성 N01.1 세포를 손상된 래트 척수내로 이식하였다. 2주후, 래트를 관류시키고 척수를 짜이스 스테미 해부 현미경하에서 관찰하였다. 염수-처리 래트에서, GFP 형광 강도는 낮았고 산광되었다(도 5A-B). 그러나, 리튬-처리 래트에서, GFP 형광 강도는 높았으며 2개의 거대 영역을 점유하였다(도 5C-D). GFP-N01.1 세포의 분포를 추가로 평가하기 위해, 동일한 척수를 화살모양으로 절개하였다. 염수-처리 래트에서, GFP-양성 N01.1 세포는 드물었다(도 5E). 대조적으로, 리튬-처리 래트는 좌상 중심부에 많은 수의 GFP-양성 N01.1 세포를 지녔다(도 5F).

도 6은 리튬이 생체내에서 N01.1 세포 성장 인자 생산을 자극함을 보여준다. 성장 인자 생산에 대한 리튬의 효과를 조사하기 위해, 4그룹의 척수를 정량 실시간 PCR로 분석하였다. "손상" 및 "손상/LiCl" 그룹에서, 성장 인자 mRNA 수준의 유의미한 변화는 없었다. "손상/N01.1" 그룹에서, BDNF, NT3, 및 NGF? mRNA 수준은 상승되었다. "손상/N01.1/LiCl" 그룹에서, GDNF, LIF, BDNF, NT-3, NGFβ 및 NGFγ mRNA 수준의 유의미한 증가가 있었다. 이들 결과는 리튬이 N01.1 세포 존재시 성장 인자 생산을 자극함을 입증한다

도 7은 척수 손상 후 신경보호에 관한 리튬의 효과를 보여준다. 리튬 클로라이드 또는 염수를 척수 손상후 즉시 주사하였다(ip). 병변(Lesion) 부피를 손상후 24시간 경과시 측정하였다. 리튬-처리 및 염수-처리 래트 사이의 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.

고찰

척수 손상후 줄기 세포 증식, 유전자 발현, 및 조직 보호에 대한 리튬의 효과를 시험하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)로 트랜스펙션된 신생 래트 혈액에서 분리된 네스틴-발현 세포주(N01.1)를 사용하여, 배지내 N01.1 세포 증식 및 손상된 척수내로 이식된 N01.1 세포에 대한 리튬의 효과를 측정하였다. 3 mM 리튬에서 N01.1 세포를 배양하는 것은 결과적으로 1주후 359%의 세포 수 증가를 초래하였다. N01.1 세포가 25-mm 좌상 손상후 래트 척수내로 이식된 경우, 이들 세포는 통제를 벗어나 성장하지 않았으며 척수의 회백질 경계를 침해하지 아니하였다. 이식 2주 경과후, 이식부위를 GFP mRNA 수준에 관해 검정하였다. 염수-처리 래트에서, GFP mRNA는 검출가능하였으나, 매우 낮았다. 그러나, 리튬-처리 래트에서, GFP mRNA의 양은 염수-처리 래트에서의 양을 1000배 초과하였다. 조직검사는 또한 리튬 처리된 손상된 척수내에 더 많은 GFP-양성 세포를 드러내었다. 성장 인자, 예컨대, GDNF, LIF, BDNF, NT-3, NGFβ 및 NGFγ의 mRNA의 양은 또한 리튬-처리 래트에서 월등하였다. 이러한 입장에서, 본 실시예는 리튬이 생체내에서 세포 증식을 촉진하고 성장 인자 발현을 자극함으로써 이식된 줄기 세포의 생존 및 성장을 향상시키는데 유용함을 입증한다. 따라서, 줄기 세포 이식물을 주입받은 환자에서 병용 요법에 이상적이다.

방법

세포 특성. N01 세포를 야생형 신생(P0) Sprague-Dawley(SD) 래트의 혈액에서 분리하고 DMEM, 10% FBS, EGF, 및 bFGF으로 배양하였다. 6주 경과시, 60%의 N01 세포는 네스틴 양상이었다. 클론 검정후. 100% 네스틴 양성도를 지니는 N01.1으로 명명된 서브클론을 선별하였다. N01.1 세포는 형태 또는 네스틴 마커에서의 임의의 변화 없이 장 기간의 시간 동안 배양될 수 있다. 혈청이 성장 배지로부터 제거되었을 때, N01.1 세포는 천연 줄기 세포에 의해 형성되는 신경구체(neurospheres)와 유사한 구형 구조를 형성하였다(Sun, 1st Annual Scientific Meeting on Stem Cell Research in New Jersey, 2004).

시험관내 배양. N01.1 세포에 37℃, 5% CO₂ 습한 챔버에서 DMEM, 10% FBS, bFGF, 및 EGF에서 7일 동안 3 mM 리튬 클로라이드를 처리하였다.

생체내 척수 손상/세포 이식. N01.1 세포를 녹색 형광 단백질(GFP)로 트랜스펙션시켰다. 77 + 1일령 SD 래트를 사용하였다. 좌상(MASCIS 충격기, 25 mm 높이)을 일으키고, 바로 직후 총 200,000개의 세포를 좌상 부위로부터 2 mm 이격된 2개 부위에 해밀톤(Hamilton) 주사기에 부착된 유리 마이크로피펫으로 척수내로 주사하였다(100,000개 세포/㎕).

생체내 리튬 처치. 리튬 클로라이드를 2주 동안 매일 1일당 주사당 100 mg/kg로 복강내로 투여하였다.

정량 실시간 PCR . 이식 2주 경과후 이식된 GFP-양성 N01.1 세포의 세포 생존을 평가하기 위해, GFP mRNA의 양을 Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System(Foster City, CA) 상의 SYBR 녹색 형광으로 측정하였다. N01.1 세포 이식후 척수내의 LIF, BDNF, NT3, GDNF, NGFγ, 및 NGFβ의 mRNA의 수준을 측정하였다.

병변 부피(Lesion volume, LV). 조직 보호에 관한 리튬의 효과를 평가하기 위해, 병변 부피를 하기식에 따라 손상후 24시간 경과시에 측정하였다: LV = 0.75 - ([K]t - 4)/120 x 무게(Constantini et al., J. Neurosurg., 80:97-111 (1994)).

실시예 2. 사람 탯줄혈 세포 증식 및 성장 인자 생산에 대한 리튬 자극

본 실시예는 리튬이 사람 탯줄혈로부터 분리된 줄기 세포의 증식 및 성장 인자 생산을 촉진함을 보여준다.

도 8은 리튬이 시험관내에서 사람 탯줄혈 세포 증식을 촉진함을 보여준다. 사람 단핵 세포를 신선한 사람 탯줄혈에서 분리하고 3 mM 리튬 클로라이드 없이 또는 이와 함께 우태아 혈청(FBS)을 함유한 성장 배지에서 배양하였다. 리튬-처리 배양시, 세포 수는 8주간의 연구 기간 동안 대조 배지에서 보다 더 높았다. 총 세포 수는 5주 경과후 리튬-처리 및 대조 배양 두 모두에서 감소되었으나, 8주 경과시 리튬-처리 배양에서 현저하게 더 많은 세포가 존재하였다.

도 9는 리튬이 시험관내에서 성장 인자 생산을 자극함을 보여준다. 사람 단핵 세포를 신선한 사람 탯줄혈에서 분리하였다. 세포를 3 mM 리튬 클로라이드 없이 또는 이와 함께 FBS를 함유한 성장 배지에서 배양하였다. 정량 실시간 PCR을 성장 인자 mRNA 수준을 평가하기 위해 2주 및 4주째에 실시하였다. 4주째에, 리튬-처리 배양은 대조 배양과 비교하여 성장 인자(예를 들어, GDNF, LIF, BDNF, NT-3, NGFβ 및 CNTF) mRNA 수준에서 2-5배 증가를 나타내었다.

도 10은 리튬이 시험관내에서 성장 인자 생산을 자극함을 보여준다. 사람 단핵 세포를 신선한 사람 탯줄혈로부터 분리하였다. 세포를 3 mM 리튬 클로라이드(Li) 없이 또는 이와 함께 성체 사람 혈청(HS)을 함유한 성장 배지에서 배양하였다. 정량 실시간 PCR을 1 및 2주째에 수행하여 성장 인자 mRNA 수준을 평가하였다. 두 시점에, 리튬 처리 배양은 대조 배양에 비해 성장 인자(예를 들어, BDNF, CNTF, GDNF, LIF, NGFβ 및 NT-3) mRNA 수준에서 유의미한 증가를 나타내었다.

상기 설명은 예시를 위해 의도된 것이며 제한을 의해 의도된 것이 아님이 이해되어야 한다. 다수의 구체예들은 상기 설명을 해독한 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 영역은 상기 설명을 참조하여 결정되어서는 아니되며, 오히려 첨부된 청구항과, 더불어 자격이 부여된 첨부된 상기 청구항의 전체 균등 영역을 참고하여 결정되어야 한다. 특허 출원서, 특허, PCT 공개특허, 및 유전자은행(GenBank) 접근 번호를 포함한, 모든 서평(article) 및 참고문헌의 교시내용이 모든 목적을 위해 참고문헌으로 본 명세서에 통합된다.

Claims (11)

1. (a) 리튬 염; 및
   (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 이식된 사람 탯줄혈 줄기 세포의 생존 및 성장 증강용 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 리튬 염이 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트, 및 리튬 설페이트로 구성된 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 리튬 염이 리튬 클로라이드인, 약제학적 조성물.
4. (a) 리튬 염; 및
   (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 이식된 사람 탯줄혈 줄기 세포의 거부반응 감소용 약제학적 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 리튬 염이 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트 및 리튬 설페이트로 구성된 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
6. 제 4항에 있어서, 상기 리튬 염이 리튬 클로라이드인, 약제학적 조성물.
7. (a) 리튬 염을 포함하는 배지에서 배양된 사람 탯줄혈 줄기 세포; 및
   (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 척수 손상 치료용 약제학적 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 리튬 염이 리튬 클로라이드, 리튬 카보네이트 및 리튬 설페이트로 구성된 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 리튬 염이 리튬 클로라이드인, 약제학적 조성물.
10. 제 7항에 있어서, 상기 리튬 염이 0.5 내지 5 mM의 농도로 상기 배지에 존재하는, 약제학적 조성물.
11. 제 7항에 있어서, 상기 리튬 염이 3 mM의 농도로 상기 배지에 존재하는, 약제학적 조성물.
    

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